JP3122846B2

JP3122846B2 - キャピラリー電気泳動による生体分子の分離のためのポリマー

Info

Publication number: JP3122846B2
Application number: JP07516796A
Authority: JP
Inventors: マダブシ，ラマクリシュナ，エス; メンチェン，スティーブン，エム; エフカビッチ，ジェイ，ウイリアム; グロッスマン，ポール，ディ
Original assignee: パーキン−エルマーコーポレーション
Priority date: 1993-12-17
Filing date: 1994-12-06
Publication date: 2001-01-09
Anticipated expiration: 2016-01-09
Also published as: JPH09504375A; US5916426A; WO1995016910A1; US5552028A; AU677495B2; EP0734521B1; CA2179013C; DE69432267T2; WO1995016911A1; EP0734521A1; US5567292A; AU1254295A; DE69432267D1; AU1299495A; CA2179013A1; ATE234463T1

Description

【発明の詳細な説明】関連する米国出願これは現在係属中の、1993年12月17日に出願した出願
番号08/170,078の一部継続出願であり、ここに参考文献
として加える。

発明の技術分野本発明は一般にキャピラリー電気泳動の分野に関し、
さらに特にキャピラリー電気泳動によって、生体分子、
特にポリヌクレオチドの分離中に電気浸透流および分析
物−壁の相互作用を抑制するための物質および方法に関
するものである。

背景キャピラリー電気泳動は幾つかの技術的利点があるの
で分析技術として広く応用されてきた：（ｉ）キャピラ
リーは、一層有効な熱散逸を可能にし、また、一層迅速
に分離するために使用されるように高い電場を可能にす
る、高い表面対容量比を有し；（ii）その技術は最少の
試料容量を必要とし；（iii）大抵の分析物の優れた分
解能を達成でき；そして（iv）この技術は自動化しやす
い、例えばCamilleri,編集者,Capillary Electrophores
is:Theory and Practice（CRC Press.Boca Raton,199
3）；およびGrossman et al,編集者,Capillary Electro
phoresis（Academic Press,San Diego,1992）。これら
の利点のため、特に核酸分析において、キャピラリー電
気泳動を生体分子の分離に応用することに大きい関心が
あった。核酸、特にデオキシリボ核酸（DNA）を迅速に
正確に分離するための要求は、ポリメラーゼ鎖反応（PC
R）生成物の分析およびDNA配列分析断片の分析で生じ
た、例えば、Williams,Methods 4:227−232（1992）;Dr
ossman et al,Anal.Chem.,62:900−903（1990）;Huang
et al,Anal.Chem.,64:2149−2154（1992）；およびSwer
dlow et al,Nucleic Acids Research,18:1415−1419（1
990）。

電荷対摩擦牽引比がフリー溶液中の異なる大きさのポ
リヌクレオチドでは同じであるから、電気泳動分離には
篩分け媒質が存在することが必要である。初期に選択す
る篩分け媒質はゲルであったが、安定性や製造可能性の
問題で非ゲル液体重合篩分け媒質、例えば線形ポリアク
リルアミド、ヒドロキシアルキルセルロース、アガロー
ス、および酢酸セルロース等を検査しなけれなばらなか
った、例えば、Bode,Anal.Biochem.,83:204−210（197
7）;Bode,Anal.Biochem.,83:364−371（1977）;Bode,An
al.Biochem.,92:99−110（1979）;Hjerten et al,J.Liq
uid Chromatography,12:2471−2477（1989）;Grossman,
米国特許5,126,021;Zhu et al,米国特許5,089111;Tietz
et al,Electrophoresis,13:614−616（1992）。

キャピラリー電気泳動による分離を面倒にする他の因
子は電気浸透（electroendoosmosis）の現象である。こ
の現象は、電気浸透（electroosmosis）とよばれること
もあり、電場により引き起こされるキャピラリー中の流
体流である。DNA配列の断片の分析のような、高い分解
能の分離を必要とする状態でキャピラリー電気泳動を応
用することを妨げていた。この現象はキャピラリー電気
泳動においてキャピラリーの内壁がカウンターイオンの
移動層を形成させる固定化された電荷を含むとき、ま
た、大半の液体流を生じるように電場の存在で移動する
ときに生じた。不幸にも、電気浸透流の大きさは、電荷
の分布における変化、分析物および／または分離媒質の
成分の選択的吸着、分離媒質のpH等を含む多数の因子に
依存して変化することができる。この変化は間隔が密な
バンドの分析物の分解能を減らす傾向にあるため、直接
的または間接的にこの種の流れをコントロールするよう
に多くの試みがなされた。これらの試みには、荷電基を
抑制するようにキャピラリーの内壁を電子対共有に変更
すること、高粘度のポリマーの使用、緩衝液のpHおよび
／または濃度の調整、キャピラリー内壁に共有結合した
ゲル分離媒質の使用、および電場放射部のキャピラリー
軸への適用が含まれる、例えばHayes et al,Anal.Che
m.,65:2010−2013（1993）:Drossman et al,（上記）;H
jerten,米国特許4,680,201;Van Alstine et al,米国特
許4,690,749;Wiktorowicz et al,Electrophoresis,11:7
69−773（1990）;Belder et al,J.High Resolution Chr
omatography,15:686−693（1992）。

これらのアプローチの多くは種々うまく行き、あるい
は化学的には核酸とは全く異なる分析物の分離にのみ使
用されていた。特に、DNA分離のためにキャピラリーゲ
ルを使用することは製造の問題および使用中の安定性や
信頼性の問題が障害になっていた、例えばSwerdlow et
al,Electrophoresis,13:475−483（1992）。

種々の生体分子、特にポリヌクレオチドを手軽に正確
に分離できることに科学的産業的に大きい関心があるこ
とから、電気浸透流を抑制し分析物−壁の相互作用を減
らすことができる低粘度の電気泳動分離媒質を入手する
ことが望まれている。

発明の概要本発明はキャピラリー電気泳動において電気浸透流を
抑制し分析物−壁の相互作用を減らすための荷電してい
ない水溶性シリカ吸着ポリマーの使用に関する。本発明
は一局面では、１またはそれ以上のこの種のポリマーが
生体分子、好ましくはポリヌクレオチド類をキャピラリ
ー電気泳動によって分離するための分離媒質の成分とし
て用いられる。一般に、この種のポリマーは、（ｉ）約
20℃ないし約50℃の温度範囲にわたる水溶解性、（ii）
約0.001％ないし約10％（重量／容量）の範囲の分離媒
質における濃度、（iii）約５×10³ないし約１×10⁶ダ
ルトンの範囲の分子量、および（iv）約６ないし約９の
範囲のpHを有する水性媒質中の荷電基の不在を特徴とす
る。好ましくは、この種の本発明のポリマーは実質的に
ヒドロキシル基がない。一具体例では、本発明のポリマ
ーはポリビニルラクタム、例えばポリビニルピロリド
ン;N,N−二置換ポリアクリルアミド類；およびＮ−置換
ポリアクリルアミド類からなる群から選ばれる。さらに
好ましくは、本発明のこの種のポリマーはポリ（N,N−
ジメチルアクリルアミド）である。

本発明の方法によれば、十分な分量のポリマーはシリ
カ表面に吸着し、電場下の電気二重層の移動を妨げ壁か
ら分析物を遮蔽するシリカ表面を高粘度帯にする。

本発明は、キャピラリー電気泳動によって、生体分
子、特にポリヌクレオチドを分離するため本発明のポリ
マーを使用する方法、キャピラリー中の生体分子を電気
泳動により分離するための本発明のポリマーからなる組
成物；およびDNAの配列分析のため本発明の分離媒質を
使用する方法を含む。

本発明は、キャピラリー表面に本発明の荷電していな
いポリマーを吸着させることによる壁−分析物の相互作
用および電気浸透流を動的に抑制して、キャピラリー中
の電気泳動による生体分子の分離の精度を高める。抑制
は分離工程を通じて本発明のポリマーが、分離媒質中の
溶液中のポリマーと平衡にキャピラリーの表面に吸着し
そこから脱着するという意味で動的である。従って、抑
制の一定度は分離行程中だけでなく、分離行程から分離
行程まで維持される。

図面の簡単な説明図１はキャピラリー電気泳動を行うための装置の概略
図である。

図２はグリシルグリシン緩衝液中の３％ポリ（ジメチ
ルアクリルアミド）溶液（RM8）で分離された100塩基対
DNAラダーの電気泳動図である。

図３はグリシルグリシン緩衝液中の３％ポリ（ジメチ
ルアクリルアミド）溶液（RM18）で分離された100塩基
対DNAラダーの電気泳動図である。

図４はTBE緩衝液中の３％ポリ（ジメチルアクリルア
ミド）溶液（RM18）で分離された100塩基対DNAラダーの
電気泳動図である。

図５はグリシルグリシン緩衝液中の３％ポリアクリル
アミドと0.05％ポリ（ジメチルアクリルアミド）（RM1
8）からなる２成分ポリマー溶液中で分離された100塩基
対DNAラダーの電気泳動図である。

図6Aないし6Fは種々の２成分ポリマー溶液で分離され
た100塩基対DNAラダーの電気泳動図である。

図7Aないし7Jはポリ（ジメチルアクリルアミド）の6.
5％溶液を含む分離媒質中で分離された市販品として入
手できるDNA配列分析断片標準品の電気泳動図である。

図８はポリ（ジメチルアクリルアミド）の6.5％溶液
を含む分離媒質中での４色配列分析標準品の分離と配列
分析を示す電気泳動図である。ピーク上の数字は配列中
の塩基数を示し、各ピーク上の文字は塩基の同一性を示
す。

定義ここで使用される“キャピラリー”の語は電気泳動を
行うため分離装置の容量を支持することができるチュー
ブまたはチャネルまたは他の構造を意味する。キャピラ
リーの外形は広く変えることができ、円形、矩形または
正方形の断面をもつチューブ、チャネル、溝、プレート
等を含み、広範囲の科学技術によって製造することがで
きる。本発明に使用するキャピラリーの重要な特徴は分
離媒質の容量と接触する表面の表面対容量比である。こ
の比の高い値は電気泳動中に分離媒質からの熱伝達を良
くすることができる。好ましくは、約0.4ないし0.4の範
囲の値が用いられる。これらは内径が約10μｍないし約
100μｍの範囲の円形断面をもつ環状キャピラリーの表
面対容量比に相当する。好ましくは、本発明で使用する
キャピラリーはシリカ、溶融シリカ、石英、シリケート
をベースとしたガラス、例えばボロシリケートガラス、
ホスフェートガラス、アルミナ含有ガラス等、または他
のシリカ様物質から作られる。

“生体分子”の語は水溶性で約６ないし９のpH範囲で
荷電される生物学上の有機物によって一般的に合成され
る分子を意味する。好ましくは、この生体分子の語は蛋
白質類、糖蛋白質類、天然および合成ペプチド類、アル
カロイド類、多糖類、ポリヌクレオチド類等を含む。さ
らに特に、生体分子の語はポリヌクレオチドを示す。

ここで用いられる“ポリヌクレオチド”の語は、二本
および一本鎖のデオキシリボヌクレオチド類、リボヌク
レオチド類、それらのα−アノメリック形態等を含む、
天然または改変したヌクレオチド単量体を示す。通常ヌ
クレオチド単量体はホスホジエステル結合またはその類
似体によって結合されて、数単量体単位、例えば８〜40
から、数千の単量体単位までの大きさの範囲のポリヌク
レオチドを形成する。ポリヌクレオチドが“ATGCCTG"の
ような配列文字によって示されるときは常に、ヌクレオ
チドは左から右へ５′−＞３′の順であり、他に示され
なければ“A"はデオキシアデノシン、“C"はデオキシシ
チジン、“G"はデオキシグアノシン、そして“T"はチミ
ジンを示すことであると解される。ホスホジエステル結
合の類似体はホスホロチオエート、ホスホロジチオエー
ト、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、
ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホ
スホルアミデート等を含む。

ここで使用されるように、“ヌクレオシド”は、２′
−デオキシおよび２′−ヒドロキシ形態を含む天然のヌ
クレオシドを含み、例えばKornberg and Baker,DNA Rep
lication,2nd Ed.（Freeman,San Francisco,1992）に記
載がある。ヌクレオシドに関して“類似体”は改変され
た塩基部分および／または改変された糖部分を有する合
成ヌクレオシドを含み、例えば一般にScheit,Nucleotid
e Analogs（John Wiley,New York,1980）によって記載
されている。

ここで使用される“電気浸透”または“電気浸透流”
の語は、キャピラリー壁のような、表面の固定または不
動の電荷に近接した移動カウンターイオンの層の電界の
影響による液体のバルク流を示す。電気浸透流は一般的
に、例えば緩衝液の濃度および種類、チューブの長さ、
電界強度等を決定する一組の標準状態下にキャピラリー
チューブを通るテスト分析物の移動度（cm²/sec−volt
s）として測定される。

“ポリマー”の語は特徴ある方法で共に共役結合した
さらに小さい単量体サブユニットからなる大きい分子で
ある。“ホモポリマー”は１種類のみの単量体サブユニ
ットから作られたポリマーである。“コポリマー”は２
種類またはそれ以上の単量体サブユニットから作られた
ポリマーを示す。ここで使用されるように“ポリマー”
の語はホモポリマーおよびコポリマーを含む。“単分
散”ポリマー溶液は溶液中のポリマー分子が実質的に同
じ分子量を有することを意味する。“多分散”ポリマー
溶液は溶液中のポリマー分子が分散した分子量を有する
ことを意味する。

ポリマーに関してここで使用される“ヒドロキシル基
がない”の語はポリマーの合成に使用される単量体がヒ
ドロキシル置換基を含まないことを意味する。

発明の詳細な説明本発明は生体分子、特にDNAを、キャピラリー電気泳
動によって分離する間に電気浸透流および壁−分析物の
相互作用を抑制するための手軽な手段を提供する。ここ
で使用されるように、“分離媒質”の語は分析物成分の
分離が行われるキャピラリー中の媒質を示す。分離媒質
は一般的に複数の成分からなり、その少なくともひとつ
は電荷運搬成分、即ち電解質である。電荷運搬成分は通
常一定のpHで分離媒体を維持するための緩衝液系の一部
である。ポリヌクレオチド、または異なる大きさである
がフリー溶液中で同じ電荷−摩擦抵抗比を有する他の生
体分子を分離するための媒質は、さらに篩分け成分を含
む。この種の従来の成分に加えて、本発明の分離媒質は
表面相互作用成分からなる。ポリヌクレオチド分離の場
合には、この篩分け成分は表面相互作用成分と同じかま
たは異なってもよいが、通常は異なる。表面相互作用成
分は上記の物理的性質を有する１またはそれ以上の荷電
していない水溶性シリカ吸着ポリマーからなる。好まし
くは、この種の１またはそれ以上の荷電していない水溶
性シリカ吸着ポリマーはヒドロキシル基がない。ポリヌ
クレオチド分離についてさらに言及すると、本発明の分
離媒体の篩分け成分は１またはそれ以上の架橋されてい
ない、特に線状の、ポリマーからなる。好ましくは、本
発明の分離媒質の成分はその粘度が分離行程間にキャピ
ラリーを迅速に再充填できるように十分に低くなるよう
に選ばれる。典型的なキャピラリーは、例えば内径が20
〜100μｍで長さが40〜60cmで、篩分け成分が存在せ
ず、粘度が好ましくは1000センチポアズ以下であり、さ
らに好ましくは約１〜300センチポアズである。篩分け
成分が存在すると、粘度は好ましくは5000センチポアズ
以下であり、さらに好ましくは、1000センチポアズ以下
である。

分離媒質の表面相互作用成分として使用するポリマー
は、次の参考文献に記載されているような、種々の化学
分類に属することができる、Molyneux,Water−Soluble
Synthetic Polymers:Properties and Behavior,Volumes
I and II（CRC Press,Boca Raton,1982）;Davidson,Ed
itor,Handbook of Water−Soluble Gums and Resins（M
cGraw−Hill,New York,1980）;Franks,edutor,Water:A
Comprehensive Treatise（Plenum Press,New York,197
3）等。好ましくは、本発明の荷電されていない水溶性
シリカ吸着ポリマーは、制限されないが、N,N−二置換
ポリアクリルアミド類、Ｎ−モノ置換ポリアクリルアミ
ド類、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン等
を含む。ポリアクリルアミド類の例示的置換基はC₁ない
しC₁₂アルキル；ハロ置換C₁ないしC₁₂アルキル；メトキ
シ置換C₁ないしC₁₂アルキル；ヒドロキシル置換C₁ない
しC₁₂アルキル等を含む。好ましくは、ハロゲン置換基
はフルオロであり、そしてヒドロキシル−置換C₁ないし
C₁₂アルキルはモノ置換されている。上記単量体置換基
は得られるポリマーが水溶性であるように選択されるこ
とと理解される。例えば、C₁₂アルキル含有単量体はコ
ポリマーの小さい分別成分として存在出来るのみである
ことは明らかである。さらに好ましくは、例示的な置換
基はC₁ないしC₃アルキル；ハロ置換C₁ないしC₃アルキ
ル；メトキシ置換C₁ないしC₃アルキル；およびヒドロキ
シル置換C₁ないしC₃アルキルからなる群から選ばれる。

この種のポリマーは、例えばOdian,Principles of Po
lymerization,Third Edition（John Wiley,New York,19
91）に記載されているような従来技術によって合成され
る。本発明の重要な特徴は表面相互作用成分のポリマー
が荷電されていないことである。好ましくは、本発明の
ポリマーは、荷電されていない開始剤を使用できるよう
な無水条件下に合成される。この種の条件はまた、荷電
した開始剤が生成物に混入することをを防ぐ。分離媒質
の表面相互作用成分からなるポリマーは約0.001％ない
し約10％（w:v）の濃度で存在することができる。好ま
しくは、この種のポリマーは約0.1％ないし約６％の範
囲の濃度で存在する。

好ましくはポリマーのシリカ吸着の品質は多くの良く
知られた方法、例えば偏光解析方、吸着テスト粒子の流
体力学的性質の変化の測定、吸着等温線の測定または類
似の方法によって測定することができる。この種の技術
はMalmsten et al,Macromolecules,25:2474−2481（199
2）;Rob and Smith,European Polmer J.,10:1005−1010
（1974）;Vincent et al Surf.Colloid Sci.,12:1−117
（1982）;Takahashi et al,Advances in Polymers Scie
nce,46:1−65（1982）等に記載されている。吸着等温度
は一定の温度で所定の物質の溶液の吸着剤によって及ぼ
される吸着をグラフで示す。吸着等温線の測定は、その
吸着を測定することになっている物質（被吸着体）の既
知濃度の溶液を調製する必要がある。この被吸着体の溶
液はこの被吸着剤が表面に付着する既知の分量の物質
（吸着剤）と混合する。溶液中の被吸着剤と吸着剤の表
面の被吸着剤との間が一旦平衡になると、被吸着剤溶液
の濃度が測定される。溶液の濃度の減少は標準状態での
被吸着剤の吸着の度合を測定する。

吸着の度合はまた次のパラメーター：緩衝液のタイプ
および濃度、温度、電界強度、キャピラリーのタイプ、
直径、および長さ、およびテスト分析物の一組の標準値
の下に電気泳動流の減少を観察して直接測定することも
できる。この種の測定のための例示的な標準法は次の通
りである：全長40cmのコーティングされていない溶融シ
リカキャピラリー、検出器（UV）まで20cm、内径75μ
ｍ、0.1Μのグリシルグリシン緩衝液（pH8.0）;0.92mΜ
のメシチルオキシドと1mΜのｐ−トルエンスルホン酸
（ｐ−TSA）のマーカー溶液;10kV以下に30℃での電気泳
動。テストされるポリマーを緩衝液に添加する。表面相
互作用成分がないと、電気浸透流は約６×1^-4cm²/秒−
ボルトである。好まくは、この種の分離媒質では、十分
な濃度の本発明のポリマーを用いて約２×10^-5cm²/秒−
ボルトまで電気浸透流を減らす。

ポリヌクレオチド分離については、本発明のポリマー
のシリカ吸着の品質は好ましくは一組の標準条件の下に
選ばれたポリヌクレオチド“ラダー”に対する分解能と
ポリヌクレオチドの長さとの間の関係を特徴とする。分
解能は都合のよいことには、テスト装置の理論プレート
の数、Ｎで表される。Ｎ＝（L/σ）^２（式中、Ｌは注入
口から検出器までのピーク下（通常ピーク最大値の位
置）のテスト分析物の平均路長であり、σはピークの分
散である。好ましくは、本発明のポリマーは理論プレー
トの数と、約100ないし約500のヌクレオチドの範囲にわ
たるポリヌクレオチドの大きさとの間で実質的に直線関
係を与える；さらに好ましくは、その関係は約20ないし
約600のヌクレオチドの範囲にわたって直線である。ポ
リヌクレオチド長の曲線に対する理論的プレートを生じ
るための条件の標準組を以下に記載する。

上述の大きさの範囲において異なる大きさのポリヌク
レオチドの例示的ラダーは市販されているキット、例え
ば、BRL−GIBCOから市販されている100塩基対二本鎖DNA
ラダー、アプライド・ハイオシステムズ社から販売され
ているTaqDNA Sequencing Standard等が入手可能であ
る。標準分離媒質は次のようにして調製することができ
る:0.06gのアクリルアミド（きわめて純粋、ICN,Costa
Mesa,CA）を10ml 1×TBE,30％ホルムアミド、3.5Mの尿
素緩衝液に溶解し、濾過し（0.2μｍの孔径）、そして
脱気する。単量体溶液は、１μｌの100％N,N,N′,N′−
テトラメチルエチレンジアミン（TEMED）および２μｍ
の過硫酸アンモニウムを、単量体溶液1mlにつき（0.02
％w:vのAPSおよび0.1％v:vのTEMEDの最終濃度を与える
ように）水に溶解した10％w:v（APS）、を添加して室温
で重合する。

上記分離媒質は55cmのコーティングしていない溶融シ
リカキャピラリーチューブ、50μｍの内径、検出器まで
40cm、に装填される。キャピラリーは螢光検出キャピラ
リーを有する市販品のキャピラリー電気泳動装置中で使
用できる。キャピラリー中で螢光標識の分析物を検出す
るための螢光検出装置は当該分野では良く知られてい
る、例えばMathies et al,米国特許5,091,652;Mathies
et al,国際出願番号PCT/US93/01607;Ruiz−Martinez et
al,Anal.Chem,65:2851−2858（1993）等。標準物から
のDNA断片は次のように変性され動電学的に装填され
る：乾燥した試料は5mMのEDTA水溶液（0.5μｌ）および
ホルムアミド（６μｌ）の混合物に再懸濁させる。懸濁
液を90℃で２分間加熱し次いで氷浴に移す。ラダーはキ
ャピラリーの陰極と陰極端を上記溶液に入れ次いで５秒
間チューブに6kVを印加して装填される。ラダー中のDNA
断片の分離はキャピラリーの陰極と陰極端を陰極貯蔵器
に戻して12kVのランニングボルトを印加して開始する。

キャピラリー電気泳動を行うための装置は既知であり
本発明の重要な特徴ではない。基本装置を記載する多く
の参考文献が入手可能であり、幾つかのキャピラリー電
気泳動装置が市販されている、例えばアプライド・ハイ
オシステムズ（Foster City,CA）モデル270A機器があ
る。キャピラリー電気泳動装置とそれらの操作を記載す
る具体的な参考文献はJorgenson,Mehtods,4:179−190
（1992）;Colburn et al,Applied Biosystems Research
News,issue 1（1990冬）;Grossman et al（上記）等を
含む。図１は本発明を実施するために適した例示的なキ
ャピラリー電気泳動装置20を示す概略図である。しかし
ながら、上述のように、図に示されるものの他に本発明
で使用するために広範囲の装置が吟味できる、例えばHa
rrison et al,Science,261:895−897（1993）;Pace,米
国特許4,908,112;Kambara et al,米国特許5,192,412;Se
iler et al,Anal.Chem.,65:1481−1488（1993）等に記
載されている。図において、キャピラリーチューブ22は
好ましくは長さが約10ないし200cmの間にあり、典型的
には約100cm以下であり、好ましい直径は約10ないし200
μｍの範囲にあり、さらに典型的には約50ないし75μｍ
の範囲にあり、例えばPolymicro Technologies（Phoeni
z,AZ）から入手できる。好ましくは、チューブの内面に
はコーティングがない。装置20の陰極貯蔵器26は、さら
に下記のように、分離媒質28を含む。キャピラリーチュ
ーブ22の陰極端22aは貯蔵器26内に密閉されて電気泳動
中に分離媒質中に浸漬される。貯蔵器26中の第二のチュ
ーブ30は、例えば正圧によってキャピラリーチューブに
分離媒質を装填するため、分離媒質上の頭部空間で圧力
を制御するために使用できる細かく制御された空気圧装
置に連結される。試料貯蔵器31はキャピラリー22の陰極
端に装填されるための試料混合物を含む。キャピラリー
22の陽極端22bは陽極貯蔵器34に含まれる分離媒質32に
浸漬される。貯蔵器34中の第二のチューブ36は分離媒質
32上の圧を制御するために含ませることができる。高ボ
ルト供給器40は陰極および陽極貯蔵器の電極41および42
によって連結される。高ボルト供給器40は数キロボルト
（kV）ないし60kV、典型的には約10ないし30kVの電位の
範囲で電極を横切って一定の電位を生じる。キャピラリ
ーを通る電流は一般にミクロアンペア、典型的には数μ
Ａないし100μＡ、典型的には20μＡの範囲である。キ
ャピラリー22に接近した位置の検出器44はキャピラリー
の光学検出帯45を通って移動する試料ピークを監視す
る。典型的には、光学検出帯45は、通常のポリイミドコ
ーティングがUVおよび／または可視光、例えば螢光、分
離した分析物の検出を可能にするように移動したキャピ
ラリー22の領域からなる。UV吸収、螢光発光、コンダク
タンス、放射性発光等を含めて、広範囲の検出計画が本
発明とともに用いるために吟味できる。例えば、螢光分
析物のための検出システムはZare et al,米国特許4,67
5,300およびFolestad et al,米国特許4,548,498に記載
されている。

上述のように、本発明の分離媒質は一般に３成分から
なる：電荷運搬成分、篩分け成分、および表面相互作用
成分である。ポリヌクレオチド中の二重または第二の構
造の形成を避けることが望ましい場合には変性剤のよう
な、追加の成分もまた特定例において含めることができ
る。好ましい変性剤にはホルムアミド、例えば40〜90
％、尿素、例えば６〜８Μ、ピロリドンのような、市販
品のラクタム等を含む。電気泳動にそれらを使用するた
めのガイダンスは既知の分子生物学の参考文献、例えば
Sambrook et al,Molecular Cloning:A Laboratory Manu
al,Second Edition（Cold Spring Harbor Laboratory,N
ew York,1989）に見出すことができる。

典型的には、pHを制御するための緩衝液システムは電
荷運搬成分として用いられる。例示的な緩衝液は有機
酸、例えばクエン酸、酢酸、または蟻酸；両性イオン、
例えばTES（Ｎ−トリス〔ヒドロキシメチル〕−２−ア
ミノエタンスルホン酸、BICINE（N,N−ビス〔２−ヒド
ロキシエチル〕グリシン、ACES（２−〔２−アミノ−２
−オキソエチル）−アミノ〕エタンスルホン酸）または
グリシルグリシン；無機酸、例えば燐酸；および有機塩
基、例えばシグマ社から入手できるトリス（トリス〔ヒ
ドロキシメチル〕アミノメタン）緩衝液の水溶液を含
む。緩衝液の濃度は広く変えられ、例えば約1mΜないし
１Μの間であるが、典型的には約20mΜである。従来の
キャピラリー電気泳動用の例示的な緩衝液溶液には次の
ものを含む：（ｉ）一本鎖ポリヌクレオチドの分離に対
して0.1Μトリス、0.25Μ硼酸、７Μ尿素および7.6のp
H;または（ii）二本鎖ポリヌクレオチド分離に対して0.
089Μトリス、0.089Μ硼酸、0.005Μ EDTA。非両性イオ
ン緩衝液システムに対しては、好ましくはPDMAまたはポ
リビニルピロリドンが表面相互作用成分として用いられ
る。

電気泳動分離媒質の篩分け成分は当該分野で良く知ら
れており、Zhu et al,米国特許5,089,111;Ruiz−Martin
ez et al,Anal.Chem.,65:2851−2858（1993）;William
s,Methods,4:227−232（1992）；および同様の参考文献
に開示されている。好ましくは、本発明の分離媒質の篩
分け成分はグロッスマンの米国特許5,126,021によって
教示されるような低粘度のからみ合ったポリマー溶液で
ある。例えば大規模のDNA配列分析に応用するために、
キャピラリーを自動化システムで再充填することができ
るように低粘度の分離媒質が好ましい。キャピラリーを
通る溶液流の速度は逐次分析の間に分離媒質を取り替え
るためにどのくらいの時間が必要であるかを決定する。
DNA篩分けの応用に適する粘度範囲のからみ合ったポリ
マーを合成するためのガイダンスはグロッスマンによっ
て提供され、これを参考文献として加える。一般に、ポ
リマー、またはコポリマー、溶液の粘度は分離媒質のポ
リマーまたはコポリマー成分の分子量（MW）および濃度
によって決定される。ポリマーまたはコポリマーの分子
量は当該分野で良く知られている多くの方法で合成中に
調整することができる、例えばOdian,Principles of Po
lymerization,Third Edition（John Wiley,New York,19
91）、または同様の参考文献に概説がある。

本発明で使用されるポリマーまたはコポリマーの平均
MWを制御するための第二のアプローチは多分散のポリマ
ー生成物を異なるMW画分に分別し精製することである。
典型的な分別技術はゲル透過クロマトグラフィー、特定
のMW切断部をもつ膜を使用する透析、メタノールのよう
な水混和性溶媒中の分別沈澱等を含む。

従来のキャピラリーチューブを用いる装置について、
ポリマーまたはコポリマーMWの上限および／または濃度
はチューブに押し出すまたは引き出すことができる上部
の粘度によって最初書き取られる。例えば、大きい内径
（IDs）（例えば約0.01cmの半径）の短いキャピラリー
（約20cmの長さ）を用いる場合には、38,000センチポア
ズだけの粘度の溶液を30分で高圧、例えば100psiにてキ
ャピラリーに押し出すことができる。さらに従来のキャ
ピラリーチューブ、例えば50μm IDおよび50cm長では、
約10〜1000の範囲の粘度で約50〜100psiのチューブ内の
圧差を用いて約30分以内で分離媒質が取り替えられる。

例示的な篩分けポリマーは線状ポリオキシド類；ポリ
エチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシドのよう
なポリエーテル類；ポリアクリルアミド；ポリメタクリ
ルアミド；ポリビニルピロリドン；ポリビニルオキサゾ
リドン；および種々の水溶性ヒドロキシルポリマー、例
えばデキストランのような水溶性天然ガム；メチルセル
ロースおよびヒドロキシエチルセルロースのような水溶
性セルロース成分、およびコポリマーおよびこれらのポ
リマーのブレンドを含む。好ましくは、このようなポリ
マーは約.5％と10％w:vの範囲の濃度で使用される。

二本鎖ポリヌクレオチド、例えばPCRまたはLCR増幅物
からのDNA断片、酵素消化物等は標準プロトコル、また
は市販のキャピラリー電気泳動器具、例えばモデル270
−HT器具（Applied Biosystems,Inc.,Foster City）が
用いられている製造業者が提案したプロトコルによって
分離される。このような標準プロトコルまたは提案され
たプロトコルの唯一の例外は本発明の分離媒質を用いる
ことである。

本発明によるDNA配列分析はDNA配列分析プロトコルに
よって調製される一本鎖ポリヌクレオチドの分離を必要
とし、例えばSambrook et al,Molecular Cloning:A Lab
oratory Manual,Second Edition（Cold Spring Harbor
Laboratory,New York,1989）;Ausubel et al,Current P
rotocols in Molecular Biology（John Wiley ＆ Sons,
Media,PA）等に記載されている。

現在入手できるDNA配列分析プロトコルの重要な特徴
は、大きさによって分離しなければならない一本鎖ポリ
ヌクレオチドの“ネストシリーズ”または“ラダー”、
またはDNA配列分析断片の生成である。DNA配列分析への
鎖終端のアプローチの基本ステップは（１）サブシーケ
ンスとして、配列を決定すべき標的核酸を含む鋳型核酸
およびオリゴヌクレオチドプライマーを用意し、（２）
オリゴヌクレオチドプライマーを鋳型核酸にハイブリッ
ド形成し、（３）プライマーを核酸ポリメラーゼ、例え
ばT7DNAポリメラーゼ、Sequenase（登録商標）、リバー
ストランスクリプターゼ等を用いて、ヌクレオチドトリ
ホスフェート前駆体および少なくとも一つの鎖終止ヌク
レオチドを含む反応混合物中で伸長して、DNA断片集合
のネストシリーズを形成し、一層短い各DNA断片が一層
長い各DNA断片のサブシーケンスであるようにし、そし
て同じ大きさの各DNA断片が同じ鎖終止ヌクレオチドで
終結するようにし、（４）大きさによってDNA断片集合
を分離し、そして（５）各DNA断片集合と結合した鎖終
止ヌクレオチドを同定することである。ここで使用され
る“ヌクレオチドトリホスフェート前駆体”の語は、デ
オキシアデノシントリトリホスフェート（ATP）、デオ
キシシチジントリホスフェート（CTP）、デオキシグア
ノシントリホスフェート（GTP）、およびチミジントリ
ホスフェート（TTP）、またはそれらの類似体、例えば
デオキシイノシントリホスフェート（ITP）、７−デア
ザデオキシグアノシントリホスフェート等を示す。

鋳型はこの分野の教示により準備される、例えばTech
nical Manual for Model370A DNAシーケンサー（Applie
d Biosystems,Inc.,Foster City,CA）。例えば、標的シ
ーケンスはM13クローニングベクターの複製形態のよう
な適当なクローニングベクターに挿入でき、次に標的シ
ーケンスのコピーの数を増幅するように増殖される。M1
3の一本鎖形態は鋳型として使用するため単離される。
あるいは、鋳型はこの分野で教示されているようなポリ
メラーゼ鎖反応（PCR）によって提供できる、例えばInn
is et al（上記）;Wilson et al,Biotechniques,Vol.8,
184−189頁（1990）;Gyllensten,Biotechniques,Vol.7,
700−708頁（1989）等。増幅後、鋳型は液相中でまたは
固相支持体に結合させて重合反応で使用でき、例えばSt
ahl et al,Nucleic Acids Research,Vol.16,3025−3038
頁（1988）Hultman et al,Nucleic Acids Research,Vo
l.17,4937−4946（1989）等に教示されている。

一旦ネストシリーズDNA断片が生成すると、本発明の
分離媒質を用いるキャピラリー電気泳動によって分離さ
れる。

実施例１ AIBNを使用するジオキサン中のPDMAの合成ポリ（N,N−ジメチルアクリルアミド）（pDMA）は、
例えばTrossarelli et al,J.Polymer Sci.,57:445−452
（1962）に開示されているように、従来技術を用いて合
成される。既知量のジメチルアクリルアミド（DMA）、
ジオキサン、およびアゾビスイソブチロニトリル（AIB
N）をエルレンマイヤーフラスコ中で混合し、アルゴン
ガスを室温で10分間溶液に通して泡立たせた。重合は温
度を55℃まであげて開始した。重合時間は単量体の濃度
に依存して10ないし25分の範囲であった。重合後、得ら
れたポリマーを３サイクルのヘキサンによる沈澱とCH₂C
l₂中の溶解によって精製した。最後に、ヘキサン沈澱物
を夜通し真空デシケーターで乾燥させて次に凍結乾燥さ
せた。下表に種々の実験の反応条件をまとめる。

実施例２ AIBNを使用するｔ−ブチルアルコール中のPDMAの合成次のプロトコルを用いてｔ−ブチルアルコール（ｔ−
BuOH）でさらに重合を行った：既知量のDMA単量体、ｔ
−ブチルアルコール、およびAIBNを混合して、アルゴン
ガスを20分間溶液に通して泡立てた。混合物を55℃まで
加熱して15分間重合させた。得られたポリマーを実施例
１に記載したように単離した。下表に種々の実験の反応
条件をまとめる。

実施例３種々のポリ（ジメチルアクリルアミド）溶液によるテス
ト系の電気浸透流の変化テスト系の電気浸透流でのPDMAの種々の配合の効果を
測定した。このテスト系は次の方法で形成されるアプラ
イド・バイオシステムズ・モデル270HTキャピラリー電
気泳動機器からなる：全長が40cm、検出器（UV）まで20
cm、内径が75μｍのコーティングされていない溶融シリ
カキャピラリーを設置し；分離媒質は添加されるテスト
PDMAポリマーと共に0.1Mのグリシルグリシン緩衝液（pH
8.0）からなり；マーカー溶液は0.92mMのメシチルオキ
シドがらなり；上記のように動電学的装填後に10kVで30
℃にて電気泳動を行った。PDMA 濃度電気浸透流^＊ RM8 0.1％（W:v） 7.38×10^-5 RM16 0.1％（W:v） 2.73×10^-5 RM18^＊＊ 0.01％（W:v） 1.98×10^-5 ＊ cm²/sec−volts ＊＊ｐ−TSA（1mM in H₂O）マーカーとして使用。

実施例４ 0.1Μグリシルグリシン緩衝液中３％RM8を使用する100
塩基対DNAラダーの電気泳動 0.1Μのグリシルグリシン緩衝液中３％（W:v）のRM8P
DMAポリマーを使用して市販の二本鎖DNAラダー（100bp
DNAラダー、GIBCO−BRL）の成分を分離した。アプライ
ド・バイオシステムズ・モデル270HTに全長が60cmで試
料注入口から検出器までが40cmで内径が75μｍのコーテ
ィングされていない溶融シリカキャピラリーを取りつけ
た。10kVと13μＡの下に30℃で電気泳動を行った。5kV
と６μＡの下に５秒間動電学的に試料を注入した。分析
物の電気泳動図（260nmでUV吸収を示す）を図２に示
す。

実施例５ 0.1Μグリシルグリシン緩衝液中３％RM18を使用する100
塩基対DNAラダーの電気泳動 0.1Μのグリシルグリシン緩衝液pH8.0中３％（w:v）
のRM18PDMAポリマーを使用して実施例４の二本鎖DNAラ
ダーの成分を分離した。アプライド・バイオシステムズ
・モデル270HTに全長が60cmで試料注入口から検出器ま
でが40cmで内径が75μｍのコーティングされていない溶
融シリカキャピラリーを取りつけた。10kVと13μＡの下
に30℃で電気泳動を行った。5kVと７μＡの下に５秒間
動電学的に試料を注入した。分析物の電気泳動図（260n
mでUV吸収を示す）を図３に示す。

実施例６ 90mΜのTBE緩衝液中３％RM18を使用する100塩基対DNAラ
ダーの電気泳動 90mMのTBE緩衝液pH8.3中３％（w:v）のRM18PDMAポリ
マーを使用して実施例４の二本鎖DNAラダーの成分を分
離した。アプライド・バイオシステムズ・モデル270HT
に全長が60cmで試料注入口から検出器までが40cmで内径
が75μｍのコーティングされていない溶融シリカキャピ
ラリーを取りつけた。10kVと８μＡの下に30℃で電気泳
動を行った。5kVと８μＡの下に５秒間動電学的に試料
を注入した。分析物の電気泳動図（260nmでUV吸収を示
す）を図４に示す。

実施例７ 0.1Μグリシルグリシン緩衝液中３％ポリアクリルアミ
ドを使用し0.05％PDMA（RM18）を使用しない100塩基対D
NAラダーの電気泳動 0.1Μのグリシルグリシン緩衝液pH8.0中３％（w:v）
の線状ポリアクリルアミド溶液を使用して実施例４の二
本鎖DNAラダーの成分を分離した。アプライド・バイオ
システムズ・モデル270HTに全長が60cmで試料注入口か
ら検出器までか40cmで内径が75μｍのコーティングされ
ていない溶融シリカキャピラリーを取りつけた。10kVと
17μＡの下に30℃で電気泳動を行った。5kVと８μＡの
下に５秒間動電学的に試料を注入した。30分後にピーク
は検出されずラダー成分の分離がないことを示した。

使用したポリマー溶液が３％の線状ポリアクリルアミ
ドと0.05％のPDMF（RM18）の混合物であった他は、同じ
条件で２回目の分離を行った。分析物の電気泳動図（26
0nmでUV吸収を示す）を図５に示す。

実施例８ 0.1Μグリシルグリシン緩衝液中ポリエチレンオキシド
とポリ−Ｎ−ビニルピロリドンのポリマー溶液を使用す
る100塩基対DNAラダーの電気泳動ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン（PVP）（平均MW 360k
D）の３％（w:v）溶液とポリエチレンオキシド（PEO）
（平均MW35kD）の５％（w:v）溶液を0.1Μグリシルグリ
シン緩衝液pH8.0中で調製した。異なるポリマー溶液を
使用した他は実施例４〜７に使用したものと同じ装置を
使用し同じ条件下に６つの分離実験で実施例４のDNAラ
ダーを電気泳動により分離した。完了した分離割合を示
す図に関連して下表にポリマー溶液を列挙する。使用し
たポリ（ジメチルアクリルアミド）はRM18であった。ポリマー溶液分離図３％PVP あり 6A ６％PVP あり 6B ３％PVP＋0.5％PDMA あり 6C ５％PEO なし図なし５％PEO＋0.5％PDMA あり 6D 0.5％PDMA あり 6E ５％PEO＋0.05％PDMA あり 6F 実施例９キャピラリー電気泳動によるポリ（ジメチルアクリルア
ミド）中のDNA配列分析断片の分離螢光標識をつけたDNA配列分析断片をアプライド・バ
イオシステムズ・インコーポレイテッド（Foster City,
CA）から入手した（使用した断片はアプライド・バイオ
システムズのPart No.400993によって与えられる４色配
列分析標準物、Taq DNA配列分析標準物をつくるために
使用される“C"末端断片であった）。末端がジデオキシ
シシチジンでありフルオレセインで標識を付けた断片
（FAM−Ｃ断片）を含む混合物８μｌを500μｌの遠心分
離チューブに加え穏和に加熱しながら急速真空で乾燥さ
せた。0.5mlの50m MEDTA溶液と6mlの再結晶ホルムアミ
ドを乾燥したFAM−Ｃ断片に加えた後、混合物を95℃で
２分間加熱して氷上に置いた。

電気泳動用の分離媒質を次のように調製した:20mlの
メタノール、110mlの水および2.8gのトリスを混合し、
次に85％リン酸で滴定しpH8.0にして貯蔵緩衝液を調製
した。分離媒質は全量が約10mlとなるように3.6mlのス
トック緩衝液、3.6mlの水、4.8gの尿素、そして上記の
ように調製した0.65gのポリ（ジメチルアクリルアミ
ド）（RM21）を混合して調製した。得られた混合物を３
時間攪拌し0.45μｍのシリンジフィルターに通して濾過
した。

全長が54cmのコーティングしていない50μｍの内径の
ポリミクロテクノロジイの溶融シリカキャピラリー（Ca
t.No.2000017）を、注入口と検出帯との間が40cmとなる
ように調製した。最初の使用前に、キャピラリーを20カ
ラム容量の1.0M NaOH、20カラム容量の水で洗い流し、
次に分離媒質で充填した。同じキャピラリーを用いて次
の行程では、使用前に、キャピラリーを20カラム容量の
水、20カラム容量のテトラヒドロフラン（THF）、20カ
ラム容量の1M NaOH、20カラム容量の水で洗い流し、次
に分離媒質で充填した。

電極とキャピラリー端部をできるだけ離して置くよう
に注意しながら、25秒間0.69μＡにて1.8kVの下に動電
学的にFAM−Ｃ断片試料をキャピラリーに装填した。こ
の断片を4.41μＡにて220V/cmで分離した。試料注入と
電気泳動は22℃で行った。1.5mWにて操作するアルゴン
イオンレーザー（モデル221−40MLA,Cyonics,San Jose,
CA）からの励起ビームを用いて検出窓で断片バンドを照
射した。励起ビームを0.5光学密度中和密度フィルター
（＃FNG 085,Melles Groit,Irvine,CA）を通って焦点距
離が64mmで直径が7mmのポジティブレンズと焦点距離が8
5mmで直径が5mmのネガティブレンズからなる一組の焦点
調節オプチックスに通し、キャピラリー検出窓に約100
μｍのビーム直径で集束させた。螢光発光は焦点距離が
12mmで直径が14mmの非球面のコレクターレンズによって
直角に集め、53nmのRDFバンドパスフィルター（Omega O
ptical,Brattleboro,VT）を通って焦点距離が48mmで直
径が19mmの非球面ファブリイレンズに次に焦点距離が17
mmで直径が10mmの非球面ファブリイレンズからなる一組
のファブリイに通した。次いで検出するため光電子増倍
管（＃R98−21,Hamamatsu,San Jose,CA）に光を映し
た。分離した断片の電気泳動図を図7A−7Jに示す。ピー
ク近くの数字は断片の大きさを示す。

実施例10 キャピラリー電気泳動によるポリ（ジメチルアクリルア
ミド）の４色DNA配列分析螢光により標識をつけたDNA配列分析断片はアプライ
ド・バイオシステムズ（Foster City,CA）（Part No.40
0993,Taq DNA配列分析標準物）から得た。乾燥した配列
分析標準物に、水−ピロリドン（75:25（vol:vol））溶
媒に溶解した0.15％ヒドロキシエチルセルロース（QP10
0MH Union Carbide）から作った試料装填試薬30μｌを
添加した。次いで試料をふたつの15μｌアリコートに分
けて、２分間95℃で加熱し、氷上に置いた。

分離媒質は、上記のように調製した0.65gのポリ（ジ
メチルアクリルアミド）（RM21）と4.8gの尿素を1.0ml
の1.0Μ TAPS（Ｎ−トリス〔ヒドロキシメチル〕メチル
−３−アミノプロパンスルホン酸）、pH8.0および6.2ml
の水の溶液に溶解して調製した。ポリマー溶液を夜通し
攪拌し、次いで0.45μｍのシリンジフィルターに通して
濾過した。最終ポリマー溶液の粘度は、約50rpmの速度
でスピンドル＃00を使用するブルックフィールド粘度計
モデルDV−II（Brookfield Engineering Laboratories,
Stoughton,MA）で測定すると25℃で約75cpであった。

注入口と検出ゾーンとの間が40cmとなるように全長が
51cmのコーティングしていない内径が50μｍの溶融シリ
カキャピラリー（Polymicro Technologies,Tucson,AZ C
at.No.2000017）を用意した。最初の使用の前に、キャ
ピラリーを20カラム容量以上の水、20カラム容量以上の
0.1M NaOH、次に20カラム容量以上の水で洗い流し、次
に分離媒質で充填した。

ここで使用する４色検出装置はDNA分析の技術で良く
知られている装置に似たものであるが、本発明の決定的
な特徴ではない、例えばKarger et al,Nucleic Acids R
esearch 19（18）:4955−62（1991）。この４色検出装
置は488と514nmの波長で発光する螢光励起光源としてア
ルゴンイオンレーザーを使用する。代表的にはレーザー
は9.9mWの全レーザー力で操作した。レーザー光はバン
ドパスフィルターを通過してレーザーチューブのカソー
ドグローを移動させ、フィルターを通過する光の波長は
約485nmと515nmとの間である。次に、平凸のレンズは光
線を発散させ、このレンズは焦点距離が100mmで直径が8
mmである、例えば、（Melles Griot part no.01LPK041/
078（Melles Griot,Irvine,CA）。次いでレーザー光は
波長が約485nmと515nmの間の光を通す二色性の鏡を通過
し、次に顕著鏡目標物を通過し、分離キャピラリーの検
出領域に入る。放射光は二色性の境から反射して分光器
に向けられる。分光器に入る散乱レーザー光の量を減ら
すため、放射光はカットオフが約520nmのロングパスフ
ィルターを通過し、次いで焦点距離が85mmの再映像レン
ズによって分光器の入口スリットに焦点を合わせる、例
えば、Melles Griot part no.01LPK035。分光器は17nm/
mmの分散をもつ405g/mmの450nm閃光回折格子を使用す
る。分光器を通過した後、次に光は帯電連結デバイス検
出器（CCD）に入る。CCDからの出力信号は次のデーター
分析と提示のために電算機に伝送される。データー分析
に使用されるソフトウェアはSequencing Analysisバー
ジョン2.1.0B1であり、これは市販品で使用される配列
分析のソフトウェア（Appled Biosystems Model 373 DN
A Sequencer）に似ており、その基本的計算法は一般に
いずれかに記載されている。例えば、Smith et al.Meth
ods in Enzymology Vol.155 260−301頁、Academic Pre
ss（1991）。

試料は25秒間60V/cmの電場を用いるキャピラリーに動
電学的に装填した。断片は42℃の温度で3.0μＡにて160
V/cmの電場の下で分離した。行程は約２時間で行わせ
た。

得られた電気泳動図は図８に示される。

実施例11 キャピラリー電気泳動によるポリビニルピロリドン中の
４色DNA配列分析分離媒質は、1.0mlの1.0M TAPS（Ｎ−トリス〔ヒドロ
キシメチル〕メチル−３−アミノプロパンスルホン
酸）,pH8.0の溶液および6.2mlの水に1.0gのポリビニル
ピロリドン（Povidone,United States Pharmacopia,BAS
F,Kollidon90F）および4.8gの尿素を溶解して調製し
た。ポリマー溶液を夜通し攪拌し、次に0.45μｍのシリ
ンジフィルターに通して濾過した。

DNA配列分析断片、断片試料調製、電気泳動キャピラ
リー、４色検出装置、試料注入プロトコル、および電気
泳動行程条件はすべて基本的に実施例10で使用したもの
と同じであった。

得られた電気泳動図は図９に示される。

図９に示されるデーターには染料移動度の補正はしな
かった。DNA配列分析伸長生成物に螢光染料を添加する
と会合したDNA断片の電気泳動移動度が変わるから、そ
して異なる染料が異なる移動度のシフトの原因となるか
ら、“移動度の補正”は異なる染料を含む断片の電気泳
動移動度を標準化するために必要である。図９のデータ
ーはこれらの移動度のシフトを補正していないので、ピ
ークの程度はいくらか偏っている。しかしながら、隣接
する断片の必須の分解能はポリビニルピロリドン物質を
用いて得られたことが認められる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 27/26 ３３１Ｇ (72)発明者メンチェン，スティーブン，エムアメリカ合衆国カリフォルニア州 94536 フレモント，バンダウェイ 768 (72)発明者エフカビッチ，ジェイ，ウイリアムアメリカ合衆国カリフォルニア州 94401 サンマテオ，パームアベニュ 960 アパートメント＃３ (72)発明者グロッスマン，ポール，ディアメリカ合衆国カリフォルニア州 94010 バーリンゲーム，ブルームフィールドロード 116 (56)参考文献特開昭59−126236（ＪＰ，Ａ) 特表平５−504299（ＪＰ，Ａ) 特表平５−503989（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 27/447 C08F 122/38 C08F 126/10 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】（ｉ）約20℃ないし約50℃の温度範囲の水
溶解性、（ii）約0.001％ないし約10％（重量／容量）
の範囲の分離媒質における濃度、（iii）約５×10³ない
し約１×10⁶ダルトンの範囲の分子量、および（iv）約
６ないし約９の範囲のpHを有する水性媒質中の荷電基の
不在を特徴とする１またはそれ以上の荷電していない水
溶性シリカ吸着ポリマーを含有し、約5000センチポアズ
よりも小さい粘度を有する分離媒質を提供することから
なる、キャピラリー電気泳動において電気浸透流を抑制
する方法。
【請求項２】前記１またはそれ以上の荷電していない水
溶性シリカ吸着ポリマーが実質的にヒドロキシル基がな
い請求項１記載の方法。
【請求項３】前記１またはそれ以上の荷電していない水
溶性シリカ吸着ポリマーの少なくとも１がポリラクタム
である請求項２記載の方法。
【請求項４】前記１またはそれ以上の荷電していない水
溶性シリカ吸着ポリマーの少なくとも１がポリビニルピ
ロリドンである請求項３記載の方法。
【請求項５】前記１またはそれ以上の荷電していない水
溶性シリカ吸着ポリマーの少なくとも１がN,N−二置換
ポリアクリルアミドまたはＮ−置換ポリアクリルアミド
であり、前記窒素置換基がC₁ないしC₃アルキル；ハロ置
換C₁ないしC₃アルキル；メトキシ置換C₁ないしC₃アルキ
ル；およびヒドロキシル置換C₁ないしC₃アルキルからな
る群から選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項６】前記窒素置換基がC₁ないしC₃アルキル；ハ
ロ置換C₁ないしC₃アルキル；およびメトキシ置換C₁ない
しC₃アルキルからなる群から選ばれる請求項５記載の方
法。
【請求項７】前記１またはそれ以上の荷電していない水
溶性シリカ吸着ポリマーの少なくとも１がポリ（ジメチ
ルアクリルアミド）である請求項６記載の方法。
【請求項８】前記電気浸透流が約２×10^-5cm²/秒−ボル
トよりも小さい請求項７記載の方法。
【請求項９】前記１またはそれ以上の荷電していない水
溶性シリカ吸着ポリマーが理論プレートの数と、約100
ないし約500のヌクレオチドの大きさの範囲のポリヌク
レオチドの大きさとの間で実質的に直線関係を与える請
求項７記載の方法。
【請求項１０】（ｉ）約20℃ないし約50℃の温度範囲の
水溶解性、（ii）約0.001％ないし約10％（重量／容
量）の範囲の分離媒質における濃度、（iii）約５×10³
ないし約１×10⁶ダルトンの範囲の分子量、および（i
v）約６ないし約９の範囲のpHを有する水性媒質中の荷
電基の不在を特徴とする１またはそれ以上の荷電してい
ない水溶性シリカ吸着ポリマーを含有し、約5000センチ
ポアズよりも小さい粘度を有する分離媒質を提供するこ
とからなる、キャピラリー電気泳動において壁−分析物
の相互作用を抑制する方法。
【請求項１１】前記１またはそれ以上の荷電していない
水溶性シリカ吸着ポリマーが実質的にヒドロキシル基が
ない請求項10記載の方法。
【請求項１２】前記１またはそれ以上の荷電していない
水溶性シリカ吸着ポリマーの少なくとも１がポリラクタ
ムである請求項11記載の方法。
【請求項１３】前記１またはそれ以上の荷電していない
水溶性シリカ吸着ポリマーの少なくとも１がポリビニル
ピロリドンである請求項12記載の方法。
【請求項１４】前記１またはそれ以上の荷電していない
水溶性シリカ吸着ポリマーの少なくとも１がN,N−二置
換ポリアクリルアミドまたはＮ−置換ポリアクリルアミ
ドであり、前記窒素置換基がC₁ないしC₃アルキル；ハロ
置換C₁ないしC₃アルキル；メトキシ置換C₁ないしC₃アル
キル；およびヒドロキシル置換C₁ないしC₃アルキルから
なる群から選ばれる請求項10記載の方法。
【請求項１５】前記窒素置換基がC₁ないしC₃アルキル；
ハロ置換C₁ないしC₃アルキル；およびメトキシ置換C₁な
いしC₃アルキルからなる群から選ばれる請求項14記載の
方法。
【請求項１６】前記１またはそれ以上の荷電していない
水溶性シリカ吸着ポリマーの少なくとも１がポリ（ジメ
チルアクリルアミド）である請求項15記載の方法。
【請求項１７】前記電気浸透流が約２×10^-5cm²/秒−ボ
ルトよりも小さい請求項16記載の方法。
【請求項１８】前記１またはそれ以上の荷電していない
水溶性シリカ吸着ポリマーが理論プレートの数と、約10
0ないし約500のヌクレオチドの大きさの範囲のポリヌク
レオチドの大きさとの間で実質的に直線関係を与える請
求項16記載の方法。
【請求項１９】電荷運搬成分；篩分け成分；および（ｉ）約20℃ないし約50℃の温度範囲の水溶解性、（i
i）約0.001％ないし約10％（重量／容量）の範囲の分離
媒質における濃度、（iii）約５×10³ないし約１×10⁶
ダルトンの範囲の分子量、および（iv）約６ないし約９
の範囲のpHを有する水性媒質中の荷電基の不在を特徴と
する１またはそれ以上の荷電していない水溶性シリカ吸
着ポリマーからなる表面相互作用成分からなり、分離媒質が約5000センチポアズよりも小さい
粘度を有するキャピラリー電気泳動によってポリヌクレ
オチドを分離するための組成物。
【請求項２０】約5000センチポアズよりも小さい粘度を
有する請求項19記載の組成物。
【請求項２１】コーティングしていないシリカキャピラ
リーにおいて電気泳動によって異なる大きさのポリヌク
レオチドを分離する方法が：第一端部と第二端部を有するコーティングしていないシ
リカキャピラリーを用意し、このコーティングしていな
いシリカキャピラリーが（ｉ）約20℃ないし約50℃の温
度範囲の水溶解性、（ii）約0.001％ないし約10％（重
量／容量）の範囲の分離媒質における濃度、（iii）約
５×10³ないし約１×10⁶ダルトンの範囲の分子量、およ
び（iv）約６ないし約９の範囲のpHを有する水性媒質中
の荷電基の不在を特徴とする１またはそれ以上の荷電し
ていない水溶性シリカ吸着ポリマーを含み、そして分離
媒質が約5000センチポアズよりも小さい粘度を有し；コーティングしていないシリカキャピラリー中に異なる
大きさのポリヌクレオチドの試料を装填し；そしてコーティングしていないシリカキャピラリーを通って試
料中の異なり大きさのポリヌクレオチドが移動するよう
に、コーティングしていないシリカキャピラリーの第一
と第二の端部間に電場を印加する、各工程からなる方法。