JP2976406B2 - 核酸プローブ - Google Patents
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、生物学的試料およ
びその他の試料中の生物を検出、同定、定量するための
核酸プローブに関するものである。すなわち本発明は、
リボソームRNA(以後rRNA)、転位RNA(以後
tRNA)、或いはその他のRNAを含むあらゆる生
物、そのような生物を含む大小さまざまなカテゴリー又
は分類学的群に属するあらゆる生物、そしてrRNA又
はtRNAを含む未知の生物を特異的且つ鋭敏に検出し
定量するための核酸プローブに関するものである。この
核酸プローブによれば、rRNA又はtRNAを含む1
個の生物の存在ですら検出することができる。
びその他の試料中の生物を検出、同定、定量するための
核酸プローブに関するものである。すなわち本発明は、
リボソームRNA(以後rRNA)、転位RNA(以後
tRNA)、或いはその他のRNAを含むあらゆる生
物、そのような生物を含む大小さまざまなカテゴリー又
は分類学的群に属するあらゆる生物、そしてrRNA又
はtRNAを含む未知の生物を特異的且つ鋭敏に検出し
定量するための核酸プローブに関するものである。この
核酸プローブによれば、rRNA又はtRNAを含む1
個の生物の存在ですら検出することができる。
【0002】本発明は又、RNAの1種、mRNA若し
くはhnRNAもしくはsnRNAの特定の配列、又は
mRNA,rRNA,tRNA,hnRNA若しくはs
nRNAの前駆体分子にのみ存在し、成熟形態のmRN
A,rRNA,tRNA,hnRNA若しくはsnRN
A分子には存在しないRNA配列(以後、前駆体特異的
RNA配列又はpsRNAと呼ぶ)に相補的になるよう
に作成した特定の生物、生物群、真核細胞群又は細胞内
ウイルスを検出し、同定し、定量するための核酸プロー
ブを含む。
くはhnRNAもしくはsnRNAの特定の配列、又は
mRNA,rRNA,tRNA,hnRNA若しくはs
nRNAの前駆体分子にのみ存在し、成熟形態のmRN
A,rRNA,tRNA,hnRNA若しくはsnRN
A分子には存在しないRNA配列(以後、前駆体特異的
RNA配列又はpsRNAと呼ぶ)に相補的になるよう
に作成した特定の生物、生物群、真核細胞群又は細胞内
ウイルスを検出し、同定し、定量するための核酸プロー
ブを含む。
【0003】本発明並びにその新規性、有用性および進
歩性は、当該分野の背景技術に関する以下の説明によ
り、明確に理解されよう。
歩性は、当該分野の背景技術に関する以下の説明によ
り、明確に理解されよう。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】ウイルスを除くあらゆ
る細胞はリボソームを含み、従って、リボソームRNA
を含む。1個のリボソームは大、中、小3種の1本鎖R
NA分子を含む。大きい方の2本のrRNA分子は、生
物の種類によって大きさが異なる。
る細胞はリボソームを含み、従って、リボソームRNA
を含む。1個のリボソームは大、中、小3種の1本鎖R
NA分子を含む。大きい方の2本のrRNA分子は、生
物の種類によって大きさが異なる。
【0005】rRNAは、遺伝子から直接生産される分
子であり、rRNA遺伝子によってコードされる。この
DNA配列は、rRNA分子を合成するための鋳型とし
て用いられる。rRNAサブユニット1個ずつに、個別
の遺伝子が存在する。大部分の生物において多数のrR
NA遺伝子が存在し、高等生物の多くは核とミトコンド
リアのrRNA遺伝子を含有する。植物およびその他の
ある種の生物は、核、ミトコンドリアおよびクロロプラ
ストのrRNA遺伝子をもっている。議論を簡単にする
ために、以後は、これら3種のrRNA遺伝子をすべ
て、rRNA遺伝子ということにする。
子であり、rRNA遺伝子によってコードされる。この
DNA配列は、rRNA分子を合成するための鋳型とし
て用いられる。rRNAサブユニット1個ずつに、個別
の遺伝子が存在する。大部分の生物において多数のrR
NA遺伝子が存在し、高等生物の多くは核とミトコンド
リアのrRNA遺伝子を含有する。植物およびその他の
ある種の生物は、核、ミトコンドリアおよびクロロプラ
ストのrRNA遺伝子をもっている。議論を簡単にする
ために、以後は、これら3種のrRNA遺伝子をすべ
て、rRNA遺伝子ということにする。
【0006】あらゆる細胞には多数のリボソームが存在
する。通常の細胞では全RNAの約85〜90パーセン
トがrRNAである。大腸菌(E.coli)のような細菌は
細胞1個当り約104 個のリボソームを含み、哺乳類の
肝細胞は約5×106 個のリボソームを含む。各リボソ
ームは各々のrRNAサブユニット1個を含むから、細
菌細胞および哺乳類の細胞は、それぞれ104 および5
×106 個の各rRNAサブユニットを含む。
する。通常の細胞では全RNAの約85〜90パーセン
トがrRNAである。大腸菌(E.coli)のような細菌は
細胞1個当り約104 個のリボソームを含み、哺乳類の
肝細胞は約5×106 個のリボソームを含む。各リボソ
ームは各々のrRNAサブユニット1個を含むから、細
菌細胞および哺乳類の細胞は、それぞれ104 および5
×106 個の各rRNAサブユニットを含む。
【0007】当業者には周知の方法である核酸ハイブリ
ダイゼーションが、従来から、関連のない配列が極度に
過剰に存在する場合においてさえ、極端に少量又は大量
の特定の核酸配列を特異的に検出するために用いられて
いる。従来の核酸ハイブリダイゼーションの利用例は、
例えば、細胞およびウイルスの分子遺伝学、細胞および
ウイルスの遺伝子発現、生命形態の遺伝子解析、生物お
よび核酸配列の進化および分類、疾病過程の分子メカニ
ズム、細胞および生物中におけるウイルスおよび細菌の
検出を始めとする特殊な目的のための診断法に関する文
献に認められる。
ダイゼーションが、従来から、関連のない配列が極度に
過剰に存在する場合においてさえ、極端に少量又は大量
の特定の核酸配列を特異的に検出するために用いられて
いる。従来の核酸ハイブリダイゼーションの利用例は、
例えば、細胞およびウイルスの分子遺伝学、細胞および
ウイルスの遺伝子発現、生命形態の遺伝子解析、生物お
よび核酸配列の進化および分類、疾病過程の分子メカニ
ズム、細胞および生物中におけるウイルスおよび細菌の
検出を始めとする特殊な目的のための診断法に関する文
献に認められる。
【0008】最もよく特徴づけられ最も多く研究された
遺伝子および遺伝子産物はrRNA遺伝子およびrRN
Aであろう。そして従来、生物およびリボソーム遺伝子
配列の遺伝子解析、進化および分類に、rRNAおよび
リボソーム遺伝子のハイブリダイゼーションが利用され
ている。遺伝子解析には、例えば、種々の生物における
rRNA遺伝子の数の決定、細胞内に存在する多数のr
RNA遺伝子間の類似性の分析、細胞中におけるrRN
A合成の速度および程度の決定並びにそれらをコントロ
ールする要素・因子の決定が含まれる。進化および分類
学的研究においては、近縁関係の生物および種々異なる
生物のrRNA遺伝子塩基配列を比較する。
遺伝子および遺伝子産物はrRNA遺伝子およびrRN
Aであろう。そして従来、生物およびリボソーム遺伝子
配列の遺伝子解析、進化および分類に、rRNAおよび
リボソーム遺伝子のハイブリダイゼーションが利用され
ている。遺伝子解析には、例えば、種々の生物における
rRNA遺伝子の数の決定、細胞内に存在する多数のr
RNA遺伝子間の類似性の分析、細胞中におけるrRN
A合成の速度および程度の決定並びにそれらをコントロ
ールする要素・因子の決定が含まれる。進化および分類
学的研究においては、近縁関係の生物および種々異なる
生物のrRNA遺伝子塩基配列を比較する。
【0009】rRNA遺伝子の塩基配列が、種々様々の
生物において少なくとも部分的には類似しており、大腸
菌rRNA遺伝子のDNAが植物、哺乳類、その他様々
な細菌等に由来するrRNAとよくハイブリダイズする
ことは公知である。このように他の種にハイブリダイズ
する大腸菌遺伝子の割合は、その生物の近縁性の程度に
よって変わる。ほとんどすべてのrRNA遺伝子配列
は、非常に近い関係の細胞に由来するrRNAとハイブ
リダイズするが、遠い関係の細菌種に由来するrRNA
とはそれほどよくハイブリダイズせず、まして哺乳類r
RNAとはあまりハイブリダイズしない。
生物において少なくとも部分的には類似しており、大腸
菌rRNA遺伝子のDNAが植物、哺乳類、その他様々
な細菌等に由来するrRNAとよくハイブリダイズする
ことは公知である。このように他の種にハイブリダイズ
する大腸菌遺伝子の割合は、その生物の近縁性の程度に
よって変わる。ほとんどすべてのrRNA遺伝子配列
は、非常に近い関係の細胞に由来するrRNAとハイブ
リダイズするが、遠い関係の細菌種に由来するrRNA
とはそれほどよくハイブリダイズせず、まして哺乳類r
RNAとはあまりハイブリダイズしない。
【0010】rRNAと同様、tRNAはすべての細
胞、並びにある種のウイルスに存在する。tRNA遺伝
子は、原核細胞の染色体およびプラスミドDNAに、そ
して核、ミトコンドリア、葉緑体のDNAを含む真核細
胞のDNAに存在する。単一の細胞において、1種類の
tRNAに対して異なるtRNA遺伝子が複数種存在す
ることがよくある。ミトコンドリア、核および葉緑体の
tRNA遺伝子は全く異なる。多くのウイルスゲノム
は、そのウイルスに特異的なtRNAの遺伝子を含む。
胞、並びにある種のウイルスに存在する。tRNA遺伝
子は、原核細胞の染色体およびプラスミドDNAに、そ
して核、ミトコンドリア、葉緑体のDNAを含む真核細
胞のDNAに存在する。単一の細胞において、1種類の
tRNAに対して異なるtRNA遺伝子が複数種存在す
ることがよくある。ミトコンドリア、核および葉緑体の
tRNA遺伝子は全く異なる。多くのウイルスゲノム
は、そのウイルスに特異的なtRNAの遺伝子を含む。
【0011】tRNA分子は、遺伝子から直接生産され
る分子であり、細胞中で鋳型としてtRNA遺伝子を用
いて合成される。tRNAは、しばしばより大きいRN
A分子の一部分として合成され、その後、そのtRNA
部分はこの前駆体分子から切り出される。合成後、tR
NA分子の塩基の一部分は細胞によって化学的に修飾さ
れる。典型的tRNA分子は、75〜85個の塩基を含
む。
る分子であり、細胞中で鋳型としてtRNA遺伝子を用
いて合成される。tRNAは、しばしばより大きいRN
A分子の一部分として合成され、その後、そのtRNA
部分はこの前駆体分子から切り出される。合成後、tR
NA分子の塩基の一部分は細胞によって化学的に修飾さ
れる。典型的tRNA分子は、75〜85個の塩基を含
む。
【0012】生存しているすべての細胞には多数のtR
NA分子が存在する。普通は、細胞の全RNAの約10
%がtRNA分子から成り、典型的な細菌細胞はあらゆ
るタイプのtRNA分子を約1.5×105 個含む。細
菌細胞中で各々異なる種類のtRNAが等しく発現され
るとすると、各細胞にはそれぞれ異なるtRNA分子が
2500個存在する。典型的な哺乳類肝細胞は約108
のtRNA分子を含み、或いは、それぞれ異なる種類の
tRNAのコピーを細胞1個につき平均して約106 個
含む。
NA分子が存在する。普通は、細胞の全RNAの約10
%がtRNA分子から成り、典型的な細菌細胞はあらゆ
るタイプのtRNA分子を約1.5×105 個含む。細
菌細胞中で各々異なる種類のtRNAが等しく発現され
るとすると、各細胞にはそれぞれ異なるtRNA分子が
2500個存在する。典型的な哺乳類肝細胞は約108
のtRNA分子を含み、或いは、それぞれ異なる種類の
tRNAのコピーを細胞1個につき平均して約106 個
含む。
【0013】蛋白合成中、個々のアミノ酸は種々の特異
的tRNAによって正しい順序で一列に整列させられ
る。その時、各アミノ酸は異なるtRNA種によって導
かれる。いくつかのアミノ酸は2種類以上のtRNAに
よって導かれる。
的tRNAによって正しい順序で一列に整列させられ
る。その時、各アミノ酸は異なるtRNA種によって導
かれる。いくつかのアミノ酸は2種類以上のtRNAに
よって導かれる。
【0014】ある種のウイルスはゲノム中にtRNA遺
伝子を含む。これらの遺伝子は、ウイルスゲノムが細胞
中で活性である時、ウイルスに特異的なtRNAを生産
する。これらのtRNAは、各感染細胞中で多数コピー
されて存在することもある。
伝子を含む。これらの遺伝子は、ウイルスゲノムが細胞
中で活性である時、ウイルスに特異的なtRNAを生産
する。これらのtRNAは、各感染細胞中で多数コピー
されて存在することもある。
【0015】tRNA遺伝子およびtRNAと同様に、
先行技術は、生物およびtRNA遺伝子配列の遺伝子解
析、進化および分類学的研究におけるtRNAおよびt
RNA遺伝子のハイブリダイゼーションの利用を開示し
ている。遺伝子解析としては例えば、種々の生物におけ
るtRNA遺伝子数の決定、細胞中に存在する多数のt
RNA遺伝子間の類似性の決定、細胞中におけるtRN
Aの合成の速度および程度並びにそれらをコントロール
する要素・因子の決定がある。進化および分類学的研究
では、近縁関係の生物および非常に異なる生物に由来す
るtRNA遺伝子の塩基配列を比較する。
先行技術は、生物およびtRNA遺伝子配列の遺伝子解
析、進化および分類学的研究におけるtRNAおよびt
RNA遺伝子のハイブリダイゼーションの利用を開示し
ている。遺伝子解析としては例えば、種々の生物におけ
るtRNA遺伝子数の決定、細胞中に存在する多数のt
RNA遺伝子間の類似性の決定、細胞中におけるtRN
Aの合成の速度および程度並びにそれらをコントロール
する要素・因子の決定がある。進化および分類学的研究
では、近縁関係の生物および非常に異なる生物に由来す
るtRNA遺伝子の塩基配列を比較する。
【0016】またtRNA遺伝子の塩基配列と同様に、
個々のtRNA遺伝子の塩基配列は異なる生物において
も少くとも部分的に類似していることが知られている。
全tRNAはこれと同じタイプの関係を示し、或る種の
生物に由来する全tRNAは、遠い関係の生物のtRN
A遺伝子とかなりの程度ハイブリダイズする。ラットミ
トコンドリアのロイシル−tRNAは、ニワトリおよび
酵母のミトコンドリアDNAと有意にハイブリダイズし
た(Biochemistry(1975)14,#10,p.2037)。またtR
NA遺伝子は、Enterobacteriaceae科の生物間で高度に
保存されていることも示されている。大腸菌から得た全
tRNA遺伝子は、異なる遺伝子をもつ種から単離した
tRNAとよくハイブリダイズする(J.Bacteriology(1
977)129,#3,p.1435−1439)。このように他の種にハ
イブリダイズする大腸菌tRNA/遺伝子の割合は、生
物の近縁性の程度によって変わる。大腸菌tRNA遺伝
子配列が近い関係に由来するtRNAとハイブリダイズ
する割合は大きいが、遠い関係の種に由来するtRNA
とはずっと少なくしかハイブリダイズしない。
個々のtRNA遺伝子の塩基配列は異なる生物において
も少くとも部分的に類似していることが知られている。
全tRNAはこれと同じタイプの関係を示し、或る種の
生物に由来する全tRNAは、遠い関係の生物のtRN
A遺伝子とかなりの程度ハイブリダイズする。ラットミ
トコンドリアのロイシル−tRNAは、ニワトリおよび
酵母のミトコンドリアDNAと有意にハイブリダイズし
た(Biochemistry(1975)14,#10,p.2037)。またtR
NA遺伝子は、Enterobacteriaceae科の生物間で高度に
保存されていることも示されている。大腸菌から得た全
tRNA遺伝子は、異なる遺伝子をもつ種から単離した
tRNAとよくハイブリダイズする(J.Bacteriology(1
977)129,#3,p.1435−1439)。このように他の種にハ
イブリダイズする大腸菌tRNA/遺伝子の割合は、生
物の近縁性の程度によって変わる。大腸菌tRNA遺伝
子配列が近い関係に由来するtRNAとハイブリダイズ
する割合は大きいが、遠い関係の種に由来するtRNA
とはずっと少なくしかハイブリダイズしない。
【0017】進化の過程におけるtRNA遺伝子配列の
保存程度は、rRNA遺伝子配列の保存程度ほど大きく
はない。それにもかかわらず、tRNA遺伝子配列は細
胞中に存在する膨大な数のDNA配列よりずっと高度に
保存されている。
保存程度は、rRNA遺伝子配列の保存程度ほど大きく
はない。それにもかかわらず、tRNA遺伝子配列は細
胞中に存在する膨大な数のDNA配列よりずっと高度に
保存されている。
【0018】特定の生物群のrRNA又はtRNAに特
異的なプローブを用いてその生物群に属する生物を検出
する際の感度および容易さは、各細胞中に存在するrR
NA分子およびtRNA分子の数が多いことによって著
しく高まっている。その上、細胞中に存在するRNA分
子は1本鎖であるため、ハイブリダイゼーションテスト
は著しく容易に行われる。したがって、細胞DNAを検
出するハイブリダイゼーションテストでは使用しなけれ
ばならないような変性段階は、標的分子がRNAである
場合には不必要になる。rRNA又はtRNA以外に、
他の種類の細胞核酸に特異的なプローブを用いても、核
酸ハイブリダイゼーションによって特定の群の生物又は
細胞を特異的に検出、同定および定量することができ
る。例えば、原核細胞中の他のRNA種には、メッセン
ジャーRNA(以後mRNA)、および種々の前駆体分
子の一部であるRNA配列が含まれる。例えば、rRN
Aは、大腸菌中で塩基約6000個の長さの前駆体分子
として合成される。この前駆体分子はその後プロセッシ
ングを受けてrRNAサブユニット(塩基約4500
個)となり、このサブユニットはリボソームに組み込ま
れ、余分のRNA配列(総計1500塩基)は捨てられ
る。tRNA分子および5srRNAも同様に合成さ
れ、プロセッシングを受ける。
異的なプローブを用いてその生物群に属する生物を検出
する際の感度および容易さは、各細胞中に存在するrR
NA分子およびtRNA分子の数が多いことによって著
しく高まっている。その上、細胞中に存在するRNA分
子は1本鎖であるため、ハイブリダイゼーションテスト
は著しく容易に行われる。したがって、細胞DNAを検
出するハイブリダイゼーションテストでは使用しなけれ
ばならないような変性段階は、標的分子がRNAである
場合には不必要になる。rRNA又はtRNA以外に、
他の種類の細胞核酸に特異的なプローブを用いても、核
酸ハイブリダイゼーションによって特定の群の生物又は
細胞を特異的に検出、同定および定量することができ
る。例えば、原核細胞中の他のRNA種には、メッセン
ジャーRNA(以後mRNA)、および種々の前駆体分
子の一部であるRNA配列が含まれる。例えば、rRN
Aは、大腸菌中で塩基約6000個の長さの前駆体分子
として合成される。この前駆体分子はその後プロセッシ
ングを受けてrRNAサブユニット(塩基約4500
個)となり、このサブユニットはリボソームに組み込ま
れ、余分のRNA配列(総計1500塩基)は捨てられ
る。tRNA分子および5srRNAも同様に合成さ
れ、プロセッシングを受ける。
【0019】ウイルスに感染した原核細胞には、ウイル
ス特異的mRNAも存在する。或る種の原核細胞ウイル
スのmRNAもまた、後に切り取られすてられる余分な
RNA配列を含有する前駆体分子として合成される。
ス特異的mRNAも存在する。或る種の原核細胞ウイル
スのmRNAもまた、後に切り取られすてられる余分な
RNA配列を含有する前駆体分子として合成される。
【0020】原核細胞mRNAおよびウイルスmRNA
の多くは、1つの細胞につき数百倍まで存在する。一
方、rRNA又はtRNA前駆体分子に存在する余分な
RNA配列は、各細胞に数千個存在し得る。
の多くは、1つの細胞につき数百倍まで存在する。一
方、rRNA又はtRNA前駆体分子に存在する余分な
RNA配列は、各細胞に数千個存在し得る。
【0021】真核細胞も、前駆体mRNA分子、並びに
最終的なrRNAまたはtRNA分子よりも大きい前駆
体rRNAおよびtRNA分子を含有する。原核細胞と
は対照的に、多くの合成されたばかりの真核細胞mRN
A分子は最終的なmRNA分子よりずっと大きく、切り
取られてすてられる余分なRNA配列を含んでいる。真
核細胞中に存在する他のRNA種はヘテロ数RNA(以
後hnRNA)であり、これは、mRNA前駆体分子
(これは核から出て、蛋白合成がおこる細胞質へ向か
う)と、核から出ることのない大量のRNAとを含む様
々なRNAの集団である。これには2本鎖RNAも小量
含まれる。さらに、真核細胞の核は、100〜200塩
基の長さの核内低分子RNA(以後snRNA)と呼ば
れる小さいRNA分子も含んでいる。
最終的なrRNAまたはtRNA分子よりも大きい前駆
体rRNAおよびtRNA分子を含有する。原核細胞と
は対照的に、多くの合成されたばかりの真核細胞mRN
A分子は最終的なmRNA分子よりずっと大きく、切り
取られてすてられる余分なRNA配列を含んでいる。真
核細胞中に存在する他のRNA種はヘテロ数RNA(以
後hnRNA)であり、これは、mRNA前駆体分子
(これは核から出て、蛋白合成がおこる細胞質へ向か
う)と、核から出ることのない大量のRNAとを含む様
々なRNAの集団である。これには2本鎖RNAも小量
含まれる。さらに、真核細胞の核は、100〜200塩
基の長さの核内低分子RNA(以後snRNA)と呼ば
れる小さいRNA分子も含んでいる。
【0022】異なるmRNA分子の量、又は細胞あたり
のコピー数は著しく変る。これは、細胞あたり1〜2倍
だけ存在する複雑なmRNA分子種から、細胞毎に数百
倍存在する中位に豊富なRNA分子種、そして、細胞あ
たり104 倍又はそれ以上存在し得るきわめて豊富なR
NA分子種まで変化する。また、hnRNA中に存在す
るRNA配列の多くも、各細胞に非常に豊富に存在す
る。rRNA、tRNAおよび多くのmRNAの前駆体
RNA分子中に存在するRNA配列も、各細胞中で非常
に豊富である。個々のsnRNA配列は極めて豊富で、
細胞あたり104から106 倍存在し得る。
のコピー数は著しく変る。これは、細胞あたり1〜2倍
だけ存在する複雑なmRNA分子種から、細胞毎に数百
倍存在する中位に豊富なRNA分子種、そして、細胞あ
たり104 倍又はそれ以上存在し得るきわめて豊富なR
NA分子種まで変化する。また、hnRNA中に存在す
るRNA配列の多くも、各細胞に非常に豊富に存在す
る。rRNA、tRNAおよび多くのmRNAの前駆体
RNA分子中に存在するRNA配列も、各細胞中で非常
に豊富である。個々のsnRNA配列は極めて豊富で、
細胞あたり104から106 倍存在し得る。
【0023】真核細胞もウイルスに感染し、ウイルス特
異的mRNA、および多くの場合成熟mRNA分子には
ないRNA配列を含むウイルス特異的前駆体mRNA分
子を産出する。個々のウイルス特異的mRNAおよび前
駆体RNA分子の存在量は、複雑なもの(1細胞につき
1〜2コピー)から、極めて豊富なもの(1細胞につき
約104 コピー)まで変化する。
異的mRNA、および多くの場合成熟mRNA分子には
ないRNA配列を含むウイルス特異的前駆体mRNA分
子を産出する。個々のウイルス特異的mRNAおよび前
駆体RNA分子の存在量は、複雑なもの(1細胞につき
1〜2コピー)から、極めて豊富なもの(1細胞につき
約104 コピー)まで変化する。
【0024】従って本発明はまた、細胞中に存在する生
物並びにウイルスを特異的かつ鋭敏に検出し、同定し、
定量するための核酸プローブにも関係している。より詳
細に述べると、本発明の核酸プローブは、異なる大きさ
のカテゴリーの生物、真核細胞、ウイルス、そして場合
によっては、mRNA,hnRNA,snRNA又はr
RNA,tRNA,mRNA若しくはhnRNA分子中
に存在する余分なRNA分子を含むこれまでに知られて
いない生物を感度良く検出し、同定し、定量するのに有
用である。
物並びにウイルスを特異的かつ鋭敏に検出し、同定し、
定量するための核酸プローブにも関係している。より詳
細に述べると、本発明の核酸プローブは、異なる大きさ
のカテゴリーの生物、真核細胞、ウイルス、そして場合
によっては、mRNA,hnRNA,snRNA又はr
RNA,tRNA,mRNA若しくはhnRNA分子中
に存在する余分なRNA分子を含むこれまでに知られて
いない生物を感度良く検出し、同定し、定量するのに有
用である。
【0025】そこで本発明は、生きている生物または細
胞内ウイルスの存否、生物、細胞、細胞内ウイルス又は
原核生物若しくは真核生物の細胞群の遺伝子発現状態を
決定することが重要な問題となるあらゆる分野に広く応
用しうる。その種の領域は、医学的、獣医学および農業
上の診断並びに工業的および製薬時の品質管理を含む。
胞内ウイルスの存否、生物、細胞、細胞内ウイルス又は
原核生物若しくは真核生物の細胞群の遺伝子発現状態を
決定することが重要な問題となるあらゆる分野に広く応
用しうる。その種の領域は、医学的、獣医学および農業
上の診断並びに工業的および製薬時の品質管理を含む。
【0026】本発明は、rRNAおよびtRNAに相補
的であるのみならず、RNAの一種であるmRNA若し
くはhnRNA若しくはsnRNAの特定の配列、また
は、mRNA,tRNA,hnRNA又はsnRNAの
前駆体分子にのみ存在していて成熟形態のmRNA,r
RNA,tRNA,hnRNA若しくはsnRNA分子
には存在しないRNA配列(以後、前駆体特異的RNA
配列又はpsRNAと記す)の特定の配列にもの相補的
である特別に作製された核酸プローブを用いて、核酸ハ
イブリダイゼーション法によって、特定の生物、生物
群、真核細胞群又は細胞内ウイルスを検出し、同定し、
定量する方法に関するものである。
的であるのみならず、RNAの一種であるmRNA若し
くはhnRNA若しくはsnRNAの特定の配列、また
は、mRNA,tRNA,hnRNA又はsnRNAの
前駆体分子にのみ存在していて成熟形態のmRNA,r
RNA,tRNA,hnRNA若しくはsnRNA分子
には存在しないRNA配列(以後、前駆体特異的RNA
配列又はpsRNAと記す)の特定の配列にもの相補的
である特別に作製された核酸プローブを用いて、核酸ハ
イブリダイゼーション法によって、特定の生物、生物
群、真核細胞群又は細胞内ウイルスを検出し、同定し、
定量する方法に関するものである。
【0027】本発明、およびその新規性、有用性および
非自明性は、以下に述べる当該分野に関する背景技術を
参照すれば明確に理解できるであろう。
非自明性は、以下に述べる当該分野に関する背景技術を
参照すれば明確に理解できるであろう。
【0028】(1)mRNAおよびpsRNAはすべて
の生物および細胞に存在し、hnRNAおよびsnRN
Aは真核細胞にのみ存在する。DNAを含有する細胞小
器官(ミトコンドリア、葉緑体を含む)は、mRNA,
psRNA,rRNAおよびtRNAも含有している。
の生物および細胞に存在し、hnRNAおよびsnRN
Aは真核細胞にのみ存在する。DNAを含有する細胞小
器官(ミトコンドリア、葉緑体を含む)は、mRNA,
psRNA,rRNAおよびtRNAも含有している。
【0029】(2)典型的な細菌細胞は1000個以上
の遺伝子を含み、その大部分が特異的な蛋白質をコード
している。哺乳類の細胞は10000個以上の遺伝子を
含み、その各々がRNAを生産する。その遺伝子も細胞
内で多数のRNAコピーを生産する能力を有する。生産
された各々の特異的RNA分子は、遺伝子の直接的な産
物である。
の遺伝子を含み、その大部分が特異的な蛋白質をコード
している。哺乳類の細胞は10000個以上の遺伝子を
含み、その各々がRNAを生産する。その遺伝子も細胞
内で多数のRNAコピーを生産する能力を有する。生産
された各々の特異的RNA分子は、遺伝子の直接的な産
物である。
【0030】(3)多数の異なるmRNA配列が、各生
物又は細胞中に存在し得る。多細胞生物の個々の細胞
は、個々の細胞毎に又は異なる細胞群毎に異なるmRN
A配列をもつかも知れない。
物又は細胞中に存在し得る。多細胞生物の個々の細胞
は、個々の細胞毎に又は異なる細胞群毎に異なるmRN
A配列をもつかも知れない。
【0031】真核生物の各細胞又は細胞群には、多くの
異なるhnRNA,psRNAおよびsnRNA配列が
存在し得る。
異なるhnRNA,psRNAおよびsnRNA配列が
存在し得る。
【0032】あるウイルスが感染した細胞の中には、種
々の異なるタイプのウイルス特異的mRNAおよびps
RNAが存在することがある。
々の異なるタイプのウイルス特異的mRNAおよびps
RNAが存在することがある。
【0033】(4)原核細胞中におけるあるmRNAの
コピー数(以後は単に存在量と記す)はゼロから数百ま
で変化する。原核生物又は原核細胞中のあるpsRNA
配列の存在量は、10〜20倍になり得る。
コピー数(以後は単に存在量と記す)はゼロから数百ま
で変化する。原核生物又は原核細胞中のあるpsRNA
配列の存在量は、10〜20倍になり得る。
【0034】真核細胞中のあるmRNA分子の存在量
は、細胞あたり1〜2個から104 個以上までの範囲で
ある。
は、細胞あたり1〜2個から104 個以上までの範囲で
ある。
【0035】真核細胞中のあるhnRNA配列の存在量
は、細胞あたり1〜2個から104個以上までの範囲で
ある。
は、細胞あたり1〜2個から104個以上までの範囲で
ある。
【0036】真核細胞中のあるsnRNA分子の存在量
は、細胞あたり104 から106 個まで変化する。
は、細胞あたり104 から106 個まで変化する。
【0037】真核細胞中のあるpsRNA配列の存在量
は、細胞あたり1〜2個から104個以上まで変化す
る。
は、細胞あたり1〜2個から104個以上まで変化す
る。
【0038】(5)多くの真核細胞では、種々のタイプ
のRNAがDNAの反復配列部分からつくられる。この
結果、配列が互いに似てはいるが同一ではない多くのR
NA分子の集団が生ずる。しかし、これらRNA分子の
一つに相補的なプローブは、類似した他のRNA分子す
べてとハイブリダイズすると思われる。
のRNAがDNAの反復配列部分からつくられる。この
結果、配列が互いに似てはいるが同一ではない多くのR
NA分子の集団が生ずる。しかし、これらRNA分子の
一つに相補的なプローブは、類似した他のRNA分子す
べてとハイブリダイズすると思われる。
【0039】(6)ウイルスおよび生物の種々のmRN
A,psRNA,hnRNAおよびsnRNAをコード
する遺伝子配列は、進化の過程で種々の程度に保存され
てきた。これら配列の大部分は、tRNA配列に比べれ
ば保存度がずっと少ない。しかし、その配列の若干は高
度に保存されている。例えば、ヒストンmRNAをコー
ドする遺伝子は進化の間非常に高度に保存され、ヒスト
ン遺伝子配列は非常に異なる生物においても良く類似し
ている。
A,psRNA,hnRNAおよびsnRNAをコード
する遺伝子配列は、進化の過程で種々の程度に保存され
てきた。これら配列の大部分は、tRNA配列に比べれ
ば保存度がずっと少ない。しかし、その配列の若干は高
度に保存されている。例えば、ヒストンmRNAをコー
ドする遺伝子は進化の間非常に高度に保存され、ヒスト
ン遺伝子配列は非常に異なる生物においても良く類似し
ている。
【0040】これらのRNAの多くのDNA配列におけ
る保存性の欠如は、非常に近い関係の生物又はウイルス
同士を容易に見分けることのできるプローブの作成を可
能にする。
る保存性の欠如は、非常に近い関係の生物又はウイルス
同士を容易に見分けることのできるプローブの作成を可
能にする。
【0041】種々のmRNA,hnRNA,snRNA
およびpsRNAについて、非常に多数の研究が行われ
ている(B.Lewin, Gene Expression1巻および2巻参
照)。これらの研究は、原核生物および真核生物並びに
ウイルスにおける遺伝子の解析、調節および進化に関す
るものであり、これらRNAのハイブリダイゼーション
を行っている。
およびpsRNAについて、非常に多数の研究が行われ
ている(B.Lewin, Gene Expression1巻および2巻参
照)。これらの研究は、原核生物および真核生物並びに
ウイルスにおける遺伝子の解析、調節および進化に関す
るものであり、これらRNAのハイブリダイゼーション
を行っている。
【0042】先行技術におけるハイブリダイゼーション
法 従来、二つの基本的な核酸ハイブリダイゼーション法が
開示されている。その一つ、溶液内ハイブリダイゼーシ
ョン法では、プローブも試料の核酸分子も両方共溶液中
に遊離している。もう一つの方法では試料は個体支持体
に固定され、プローブは溶液中に遊離している。これら
の方法は、両方共広く用いられ、文献にも十分に記載さ
れている。溶液内ハイブリダイゼーション法の一例を、
後述の実施例に示す。Thomas等の論文(Proc. Natl. Aca
d, Sci. USA(1980), 77, p.520)には、固定法の一例が
ある。
法 従来、二つの基本的な核酸ハイブリダイゼーション法が
開示されている。その一つ、溶液内ハイブリダイゼーシ
ョン法では、プローブも試料の核酸分子も両方共溶液中
に遊離している。もう一つの方法では試料は個体支持体
に固定され、プローブは溶液中に遊離している。これら
の方法は、両方共広く用いられ、文献にも十分に記載さ
れている。溶液内ハイブリダイゼーション法の一例を、
後述の実施例に示す。Thomas等の論文(Proc. Natl. Aca
d, Sci. USA(1980), 77, p.520)には、固定法の一例が
ある。
【0043】核酸ハイブリダイゼーションテストの基本
成分は、次の如くである。
成分は、次の如くである。
【0044】(1)プローブ
検出するべき核酸配列(即ち標的配列)に相補的な標識
1本鎖核酸配列。ここで用いるように、標的配列はrR
NA,tRNA又はその他のRNAの全配列又は部分配
列である。
1本鎖核酸配列。ここで用いるように、標的配列はrR
NA,tRNA又はその他のRNAの全配列又は部分配
列である。
【0045】プローブの長さは特定のテストに依り5個
〜数万塩基の間で変動し得る。プローブ分子の一部だけ
が、検出すべき核酸配列(以後は標的配列と記す)に相
補的であればよい。その上、プローブと標的配列との間
の相補性は完全である必要はない。ハイブリダイゼーシ
ョンは不完全な相補的分子間でもおこり、その場合、ハ
イブリダイズした領域内にある塩基の一部分は、正確に
相補的な塩基とは対にならない。プローブは、RNAか
又はDNAから成ることができる。核酸プローブの形態
は、単一の極性をもつ標識1本鎖分子であっても、両方
の極性をもつ標識1本鎖分子であってもよい。プローブ
の形態は、その長さと同様、行うべきハイブリダイゼー
ションテストのタイプによって定まる。
〜数万塩基の間で変動し得る。プローブ分子の一部だけ
が、検出すべき核酸配列(以後は標的配列と記す)に相
補的であればよい。その上、プローブと標的配列との間
の相補性は完全である必要はない。ハイブリダイゼーシ
ョンは不完全な相補的分子間でもおこり、その場合、ハ
イブリダイズした領域内にある塩基の一部分は、正確に
相補的な塩基とは対にならない。プローブは、RNAか
又はDNAから成ることができる。核酸プローブの形態
は、単一の極性をもつ標識1本鎖分子であっても、両方
の極性をもつ標識1本鎖分子であってもよい。プローブ
の形態は、その長さと同様、行うべきハイブリダイゼー
ションテストのタイプによって定まる。
【0046】(2)試料
試料は、標的分子(即ち、対象とする生物)を含むかも
知れないし、含まないかも知れない。試料の形態は種々
様々であり、水又は血清のような液体でもよいし、埃
塵、土壌又は組織試料のように個体でもよい。試料核酸
は、プローブと標的分子のハイブリダイゼーションがほ
んの少しでもおこる前に、プローブと接触できるように
しておかなければならない。従って、生物のRNAはハ
イブリダイゼーションがおこる前に細胞から遊離され、
正しい条件下に置かなければならない。先行技術の溶液
内ハイブリダイゼーション法では、試料rRNAとプロ
ーブとのハイブリダイゼーションが可能となるために
は、RNAの精製が必要である。この意味するところ
は、試料中の標的配列を検出するべく溶液内法を用いる
ためには、試料の核酸をまず精製して、蛋白質、脂質そ
の他の細胞成分を除去した後ハイブリダイゼーション条
件下でプローブと接触させなければならないということ
である。試料核酸の精製には最低数時間はかかり、試料
の種類および量によっては、1日かかることもある。
知れないし、含まないかも知れない。試料の形態は種々
様々であり、水又は血清のような液体でもよいし、埃
塵、土壌又は組織試料のように個体でもよい。試料核酸
は、プローブと標的分子のハイブリダイゼーションがほ
んの少しでもおこる前に、プローブと接触できるように
しておかなければならない。従って、生物のRNAはハ
イブリダイゼーションがおこる前に細胞から遊離され、
正しい条件下に置かなければならない。先行技術の溶液
内ハイブリダイゼーション法では、試料rRNAとプロ
ーブとのハイブリダイゼーションが可能となるために
は、RNAの精製が必要である。この意味するところ
は、試料中の標的配列を検出するべく溶液内法を用いる
ためには、試料の核酸をまず精製して、蛋白質、脂質そ
の他の細胞成分を除去した後ハイブリダイゼーション条
件下でプローブと接触させなければならないということ
である。試料核酸の精製には最低数時間はかかり、試料
の種類および量によっては、1日かかることもある。
【0047】(3)ハイブリダイゼーション法
プローブと試料とは、核酸ハイブリダイゼーションが可
能になる条件下で混合しなければならない。即ち、正し
い濃度および温度条件下で、無機又は有機の塩の存在下
プローブと試料とを接触させる。プローブおよび試料核
酸は、プローブと試料核酸間の可能なハイブリダイゼー
ションがおこるのに十分長い時間、接触させなければな
らない。
能になる条件下で混合しなければならない。即ち、正し
い濃度および温度条件下で、無機又は有機の塩の存在下
プローブと試料とを接触させる。プローブおよび試料核
酸は、プローブと試料核酸間の可能なハイブリダイゼー
ションがおこるのに十分長い時間、接触させなければな
らない。
【0048】混液中のプローブ又は標的の濃度はハイブ
リダイゼーションがおこるのに必要な時間を決定する。
プローブ又は標的濃度が高ければ高い程、ハイブリダイ
ゼーションに必要なインキュベーション時間はみじかく
なる。
リダイゼーションがおこるのに必要な時間を決定する。
プローブ又は標的濃度が高ければ高い程、ハイブリダイ
ゼーションに必要なインキュベーション時間はみじかく
なる。
【0049】プローブおよび試料核酸から成る核酸ハイ
ブリダイゼーションインキュベーション混液は、特定の
温度でハイブリダイゼーションがおきるのに十分長い時
間インキュベーションしなければならない。ハイブリダ
イゼーションが完了するのに必要な時間の長さは、ブロ
ーブ核酸の濃度、ブローブに相補的な試料核酸の濃度、
そして用いたハイブリダイゼーション条件によって特徴
づけられるハイブリダイゼーションの基本的速度によっ
て決まる。ハイブリダイゼーションの基本的速度は、イ
ンキュベーション混液中の塩の種類、その濃度そしてイ
ンキュベーション温度によって決まる。塩化ナトリウ
ム、燐酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムがハイブリダ
イゼーション用に最もよく使われる塩であり、用いる塩
濃度は1Mを越えることはほとんどないが、時には1.
5〜2Mにもなることがある。上記の塩類は、同じ濃度
および温度で用いた場合、同等の核酸ハイブリダイゼー
ション速度を与える。カリウム、リチウム、ルビジウム
およびセシウム塩も同様である。Britten 等(1974) M
ethods in Enzymology, XXIX巻、Part E, Grossman &Mo
ldave編、Academic Press、ニューヨーク、 364ページ
および Wetmur およびDavidson(1968)、J.Molecular
Biology 31巻、 349ページには、一般に使用される塩で
達せられるハイブリダイゼーション標準的速度のデータ
が示されている。DNAとRNAとのハイブリダイゼー
ション速度はDNAとDNAとのハイブリダイゼーショ
ン速度とは若干異なる。その変化の大きさは、10倍以
上になることはほとんどないが、例えば過剰のDNA又
はRNAが用いられるかどうか等によって変わる。Gala
u et al.(1977)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74巻、
6号、2306ページを参照されたい。
ブリダイゼーションインキュベーション混液は、特定の
温度でハイブリダイゼーションがおきるのに十分長い時
間インキュベーションしなければならない。ハイブリダ
イゼーションが完了するのに必要な時間の長さは、ブロ
ーブ核酸の濃度、ブローブに相補的な試料核酸の濃度、
そして用いたハイブリダイゼーション条件によって特徴
づけられるハイブリダイゼーションの基本的速度によっ
て決まる。ハイブリダイゼーションの基本的速度は、イ
ンキュベーション混液中の塩の種類、その濃度そしてイ
ンキュベーション温度によって決まる。塩化ナトリウ
ム、燐酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムがハイブリダ
イゼーション用に最もよく使われる塩であり、用いる塩
濃度は1Mを越えることはほとんどないが、時には1.
5〜2Mにもなることがある。上記の塩類は、同じ濃度
および温度で用いた場合、同等の核酸ハイブリダイゼー
ション速度を与える。カリウム、リチウム、ルビジウム
およびセシウム塩も同様である。Britten 等(1974) M
ethods in Enzymology, XXIX巻、Part E, Grossman &Mo
ldave編、Academic Press、ニューヨーク、 364ページ
および Wetmur およびDavidson(1968)、J.Molecular
Biology 31巻、 349ページには、一般に使用される塩で
達せられるハイブリダイゼーション標準的速度のデータ
が示されている。DNAとRNAとのハイブリダイゼー
ション速度はDNAとDNAとのハイブリダイゼーショ
ン速度とは若干異なる。その変化の大きさは、10倍以
上になることはほとんどないが、例えば過剰のDNA又
はRNAが用いられるかどうか等によって変わる。Gala
u et al.(1977)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74巻、
6号、2306ページを参照されたい。
【0050】或る条件は、DNA:DNAハイブリダイ
ゼーションの加速をおこす。フェノールと塩との乳濁液
は、その混合物を振盪した時、DNAハイブリダイゼー
ションを非常に速くする。その速度は、この系の標準D
NAハイブリダイゼーション速度の数千倍も速くなる。
Kohne 等、Biochemistry(1977)16巻、532aページ参
照。中性および陰イオン性デキストランポリマーを、溶
液中で1本鎖DNAと混合した時にも、標準速度を50
〜100倍上まわるDNAハイブリダイゼーション速度
促進が認められた。Wetmet, Biopolymers(1975)14巻、
2517ページ参照。これらのDNA加速条件のどれも、D
NA:RNAハイブリダイゼーションを加速するという
ことは報告されなかった。本発明者は、DNA:RNA
ハイブリダイゼーションの加速条件を記した公知文献を
知らない。
ゼーションの加速をおこす。フェノールと塩との乳濁液
は、その混合物を振盪した時、DNAハイブリダイゼー
ションを非常に速くする。その速度は、この系の標準D
NAハイブリダイゼーション速度の数千倍も速くなる。
Kohne 等、Biochemistry(1977)16巻、532aページ参
照。中性および陰イオン性デキストランポリマーを、溶
液中で1本鎖DNAと混合した時にも、標準速度を50
〜100倍上まわるDNAハイブリダイゼーション速度
促進が認められた。Wetmet, Biopolymers(1975)14巻、
2517ページ参照。これらのDNA加速条件のどれも、D
NA:RNAハイブリダイゼーションを加速するという
ことは報告されなかった。本発明者は、DNA:RNA
ハイブリダイゼーションの加速条件を記した公知文献を
知らない。
【0051】(4)ハイブリダイゼーションアッセイ
標的分子とハイブリダイズしたプローブ分子の存在を検
出する方法が必要である。そのような方法は、標的分子
とハイブリダイズしたプローブが標的分子とハイブリダ
イズしなかったブローブから分離することができるとい
う事実に基づいている。溶液内ハイブリダイゼーション
混合物をアッセイする従来の方法は、まず精製して、次
にハイブリダイゼーションインキュベーション混合液中
でプローブと接触させた試料核酸に対して行われてい
る。
出する方法が必要である。そのような方法は、標的分子
とハイブリダイズしたプローブが標的分子とハイブリダ
イズしなかったブローブから分離することができるとい
う事実に基づいている。溶液内ハイブリダイゼーション
混合物をアッセイする従来の方法は、まず精製して、次
にハイブリダイゼーションインキュベーション混合液中
でプローブと接触させた試料核酸に対して行われてい
る。
【0052】溶液内ハイブリダイゼーション混合液中の
ハイブリダイズしたプローブの存在をアッセイする標準
法としてヒドロキシアパタイト(HA)が使用されてい
る。適当な条件下でHAは、ハイブリダイズしたDNA
プローブと選択的に結合するが、ハイブリダイズしてい
ないプローブとは結合しない。ハイブリダイズしたプロ
ーブをアッセイするには他の方法も利用できる。その中
には、S1 又クレアーゼ法がある。これは、ある種の特
異的酵素がもっているハイブリダイズしていないプロー
ブを分解して小さいサブユニットにしてしまう能力に依
存しており、その際、ハイブリダイズしているプローブ
はその酵素によって分解されず、大きいままである。分
解したプローブは、その後サイズ−分離法により、ハイ
ブリダイズしているプローブから分離することができ
る。溶液内でハイブリダイズした核酸をアッセイする種
々の方法が、Britten 等(1974)(上掲)によって記さ
れている。
ハイブリダイズしたプローブの存在をアッセイする標準
法としてヒドロキシアパタイト(HA)が使用されてい
る。適当な条件下でHAは、ハイブリダイズしたDNA
プローブと選択的に結合するが、ハイブリダイズしてい
ないプローブとは結合しない。ハイブリダイズしたプロ
ーブをアッセイするには他の方法も利用できる。その中
には、S1 又クレアーゼ法がある。これは、ある種の特
異的酵素がもっているハイブリダイズしていないプロー
ブを分解して小さいサブユニットにしてしまう能力に依
存しており、その際、ハイブリダイズしているプローブ
はその酵素によって分解されず、大きいままである。分
解したプローブは、その後サイズ−分離法により、ハイ
ブリダイズしているプローブから分離することができ
る。溶液内でハイブリダイズした核酸をアッセイする種
々の方法が、Britten 等(1974)(上掲)によって記さ
れている。
【0053】固定した試料核酸のハイブリダイゼーショ
ン法では、ハイブリダイゼーションアッセイが、ハイブ
リダイゼーション法に組み込まれている。これらの方法
は、試料核酸を不活性支持体上に固定し、それからこの
固定された核酸を溶液中に遊離している標識プローブ
と、ハイブリダイズさせるというものである。プローブ
と固定化試料核酸をハイブリダイゼーションさせると、
プローブが試料核酸に結合し、従って、プローブが不活
性支持体に結合する。ハイブリダイズしないプローブは
溶液中に遊離して残り、不活性支持体並びにハイブリダ
イズしたプローブから洗浄によって除去することができ
る。このような方法では、核酸ハイブリダイゼーション
用の試料調製のために最低数時間、そして洗浄に1〜2
時間かかり、大量のプローブを必要とする。この方法の
利点は、複数の試料を同じ不活性支持体に固定し、すべ
ての試料を一度にハイブリダイズさせて処理することが
できることである。このような固定化試料法の例は、An
alytical Biochemistry(1983)128 巻、 415ページ、お
よびJ. of Infectious Disease(1982) 145巻、6号、
863ページに出ている。
ン法では、ハイブリダイゼーションアッセイが、ハイブ
リダイゼーション法に組み込まれている。これらの方法
は、試料核酸を不活性支持体上に固定し、それからこの
固定された核酸を溶液中に遊離している標識プローブ
と、ハイブリダイズさせるというものである。プローブ
と固定化試料核酸をハイブリダイゼーションさせると、
プローブが試料核酸に結合し、従って、プローブが不活
性支持体に結合する。ハイブリダイズしないプローブは
溶液中に遊離して残り、不活性支持体並びにハイブリダ
イズしたプローブから洗浄によって除去することができ
る。このような方法では、核酸ハイブリダイゼーション
用の試料調製のために最低数時間、そして洗浄に1〜2
時間かかり、大量のプローブを必要とする。この方法の
利点は、複数の試料を同じ不活性支持体に固定し、すべ
ての試料を一度にハイブリダイズさせて処理することが
できることである。このような固定化試料法の例は、An
alytical Biochemistry(1983)128 巻、 415ページ、お
よびJ. of Infectious Disease(1982) 145巻、6号、
863ページに出ている。
【0054】ハイブリダイゼーションに利用できる核酸
の調製 溶液内核酸ハイブリダイゼーション法には、常に他の細
胞成分を除去して精製した核酸を用いる。細胞およびウ
イルス中の核酸は、他の細胞成分、一般には蛋白質とし
っかり結合しているのが普通であり、この形ではハイブ
リダイゼーションにつかえない。細胞又はウイルスを単
純に破壊して成分を放出しても、ハイブリダイゼーショ
ンに使える核酸は得られない。核酸は細胞から放出され
た後でも他の細胞又はウイルス成分と複合したままにな
っており、実際には、同じく放出され得るヌクレアーゼ
によって分解されることもある。その上、そのような混
合物に添加された標識プローブは、「粘着性」の細胞又
はウイルス成分と結合し、ハイブリダイゼーションには
役に立たなくなるかも知れないし、プローブもヌクレア
ーゼの作用によって分解するかも知れない。
の調製 溶液内核酸ハイブリダイゼーション法には、常に他の細
胞成分を除去して精製した核酸を用いる。細胞およびウ
イルス中の核酸は、他の細胞成分、一般には蛋白質とし
っかり結合しているのが普通であり、この形ではハイブ
リダイゼーションにつかえない。細胞又はウイルスを単
純に破壊して成分を放出しても、ハイブリダイゼーショ
ンに使える核酸は得られない。核酸は細胞から放出され
た後でも他の細胞又はウイルス成分と複合したままにな
っており、実際には、同じく放出され得るヌクレアーゼ
によって分解されることもある。その上、そのような混
合物に添加された標識プローブは、「粘着性」の細胞又
はウイルス成分と結合し、ハイブリダイゼーションには
役に立たなくなるかも知れないし、プローブもヌクレア
ーゼの作用によって分解するかも知れない。
【0055】核酸精製のためには従来種々の方法があ
り、その中のいくつかはManiatis等(上掲)によって記
述されている。これらの方法はすべて時間がかかり(1
時間かかるものは、非常に速いと見なされる)、しか
も、いろいろな操作を必要とする。
り、その中のいくつかはManiatis等(上掲)によって記
述されている。これらの方法はすべて時間がかかり(1
時間かかるものは、非常に速いと見なされる)、しか
も、いろいろな操作を必要とする。
【0056】本発明者の知る限り、従来、核酸をハイブ
リダイゼーションに使えるようにするための何らかの予
備的精製段階を必要としないで溶液内核酸ハイブリダイ
ゼーションを実施する方法はない。
リダイゼーションに使えるようにするための何らかの予
備的精製段階を必要としないで溶液内核酸ハイブリダイ
ゼーションを実施する方法はない。
【0057】固定化核酸ハイブリダイゼーション法は試
料核酸を不活性支持体に固定する段階と、この固定され
た核酸を溶液中に遊離している標識プローブとハイブリ
ダイズさせる段階とを含む。
料核酸を不活性支持体に固定する段階と、この固定され
た核酸を溶液中に遊離している標識プローブとハイブリ
ダイズさせる段階とを含む。
【0058】核酸を不活性支持体上に固定するプロセス
は、固定された核酸をハイブリダイゼーションに使える
ようにするのに十分効果的な精製段階となる。核酸以外
の細胞又はウイルス成分の大部分は不活性支持体とは結
合しない。また、結合したとしても、核酸が結合した場
所とは異なる場所に結合する。このような方法は、ハイ
ブリダイゼーション用の試料核酸をつくるのに最低数時
間を必要とする。この方法の利点は、複数の試料を不活
性支持体上に固定化し、ハイブリダイゼーションおよび
ハイブリダイゼーションアッセイ段階を通じてこれらを
全部一緒に処理できることである。ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイでは、ハイブリダイゼーション混合物から
不活性支持体を取り出す。固定試料とハイブリダイズし
たプロセスは不活性支持体と共に残り、ハイブリダイズ
していないプローブは溶液中に遊離したまま残る。
は、固定された核酸をハイブリダイゼーションに使える
ようにするのに十分効果的な精製段階となる。核酸以外
の細胞又はウイルス成分の大部分は不活性支持体とは結
合しない。また、結合したとしても、核酸が結合した場
所とは異なる場所に結合する。このような方法は、ハイ
ブリダイゼーション用の試料核酸をつくるのに最低数時
間を必要とする。この方法の利点は、複数の試料を不活
性支持体上に固定化し、ハイブリダイゼーションおよび
ハイブリダイゼーションアッセイ段階を通じてこれらを
全部一緒に処理できることである。ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイでは、ハイブリダイゼーション混合物から
不活性支持体を取り出す。固定試料とハイブリダイズし
たプロセスは不活性支持体と共に残り、ハイブリダイズ
していないプローブは溶液中に遊離したまま残る。
【0059】このように、生物の存在は非常に多くの先
行技術の方法のいずれかによって検出し得るが、これら
の方法には何らかの理由で完全に満足の行くものは一つ
もない。そのような方法には、以下に示すように、例え
ば、増殖法、光学的検出法、血清学的および免疫化学的
方法が含まれる。
行技術の方法のいずれかによって検出し得るが、これら
の方法には何らかの理由で完全に満足の行くものは一つ
もない。そのような方法には、以下に示すように、例え
ば、増殖法、光学的検出法、血清学的および免疫化学的
方法が含まれる。
【0060】増殖テスト
多数の異なる増殖テストが存在し、それぞれ特定の生物
又は生物群の増殖に有用である。増殖テストは、1個の
生物を検出する潜在感度を有する。しかし実際には、多
くの生物は増殖させるのが困難であるかまたは不可能で
ある。これらのテストは時間がかかるのが普通であり、
完了するまでに1日から数ケ月もかかる。その上、大き
な生物群(例えば細菌全体)に属するいずれかの生物の
存在を検出するには、その群のすべての生物の増殖条件
がわかっていると仮定して、膨大な数のテストが必要で
ある。
又は生物群の増殖に有用である。増殖テストは、1個の
生物を検出する潜在感度を有する。しかし実際には、多
くの生物は増殖させるのが困難であるかまたは不可能で
ある。これらのテストは時間がかかるのが普通であり、
完了するまでに1日から数ケ月もかかる。その上、大き
な生物群(例えば細菌全体)に属するいずれかの生物の
存在を検出するには、その群のすべての生物の増殖条件
がわかっていると仮定して、膨大な数のテストが必要で
ある。
【0061】光学的検出法
検鏡法と鑑分染色法とを組み合わせると、非常に強力
な、多くの場合非常に迅速な検出法となる。この方法の
主要な問題は、大量の他生物の存在下における特定生物
の検出である。例えば、多くの種々のグラム陰性桿菌の
存在下で特定のグラム陰性桿菌を同定する場合である。
その上、大きな生物群(細菌全体の群のような)に属す
るすべての生物の存在を検出するためには、多数のテス
トを行わなければならない。
な、多くの場合非常に迅速な検出法となる。この方法の
主要な問題は、大量の他生物の存在下における特定生物
の検出である。例えば、多くの種々のグラム陰性桿菌の
存在下で特定のグラム陰性桿菌を同定する場合である。
その上、大きな生物群(細菌全体の群のような)に属す
るすべての生物の存在を検出するためには、多数のテス
トを行わなければならない。
【0062】血清学的および免疫化学的方法並びに生化
学的テスト これらのテストには、多数の異なる種類がある。これら
のテストは通常定性的であり、感度が非常に良いわけで
はなく、しばしば増殖段階を必要とする。大きな生物群
に属するすべての生物を検出するには、これらテストを
多数行う必要がある。
学的テスト これらのテストには、多数の異なる種類がある。これら
のテストは通常定性的であり、感度が非常に良いわけで
はなく、しばしば増殖段階を必要とする。大きな生物群
に属するすべての生物を検出するには、これらテストを
多数行う必要がある。
【0063】Falkow等による米国特許第4358535
号明細書は、遺伝物質即ち遺伝子又はゲノムの検出法を
開示している。この米国特許の発明では、病原体を含ん
でいるのではないかと疑いをもたれる臨床試料又は単離
物を不活性の多孔性支持体(例えばニトロセルロースフ
ィルター)上に移し、細胞が局在化されるように処理す
る。その後、細胞DNAが放出されて支持体に結合する
ように細胞を処理する。その後の処理で、ゲノムの個々
のDNA鎖の分離がおきる。それから、そのDNA鎖を
ハイブリダイゼーション条件下で特徴的ポリヌクレオチ
ド配列に特異的な標識プローブと接触させる。病原体由
来の1本鎖ポリヌクレオチドとプローブとのハイブリダ
イゼーションは、標識によって検出される。
号明細書は、遺伝物質即ち遺伝子又はゲノムの検出法を
開示している。この米国特許の発明では、病原体を含ん
でいるのではないかと疑いをもたれる臨床試料又は単離
物を不活性の多孔性支持体(例えばニトロセルロースフ
ィルター)上に移し、細胞が局在化されるように処理す
る。その後、細胞DNAが放出されて支持体に結合する
ように細胞を処理する。その後の処理で、ゲノムの個々
のDNA鎖の分離がおきる。それから、そのDNA鎖を
ハイブリダイゼーション条件下で特徴的ポリヌクレオチ
ド配列に特異的な標識プローブと接触させる。病原体由
来の1本鎖ポリヌクレオチドとプローブとのハイブリダ
イゼーションは、標識によって検出される。
【0064】この米国特許発明の遺伝子又はゲノムを検
出する方法は、前述の他の方法と同様、本発明による方
法のような特異性、感度、迅速性又は簡便性をもたな
い。米国特許に開示されたFalkow等の方法と、以下に開
示する本発明の方法との比較をまとめて次に示す。
出する方法は、前述の他の方法と同様、本発明による方
法のような特異性、感度、迅速性又は簡便性をもたな
い。米国特許に開示されたFalkow等の方法と、以下に開
示する本発明の方法との比較をまとめて次に示す。
【0065】
【表1】
【0066】特定起源に由来するrRNA配列に相補的
な選択された標識核酸分子を用いる核酸ハイブリダイゼ
ーションを利用して、特定の生物群に特徴的なrRNA
又はtRNAの存否を検出する本発明の方法を教示して
いる先行技術を本発明者は知らない。又、特定の起源に
由来するrRNA又はtRNAサブ配列のすべてに相補
的な標識核酸分子を用いる核酸ハイブリダイゼーション
によって、特定起源に由来する一般にはrRNA又はt
RNAの存否を検出する本発明の方法を開示する先行技
術も本発明者は知らない。
な選択された標識核酸分子を用いる核酸ハイブリダイゼ
ーションを利用して、特定の生物群に特徴的なrRNA
又はtRNAの存否を検出する本発明の方法を教示して
いる先行技術を本発明者は知らない。又、特定の起源に
由来するrRNA又はtRNAサブ配列のすべてに相補
的な標識核酸分子を用いる核酸ハイブリダイゼーション
によって、特定起源に由来する一般にはrRNA又はt
RNAの存否を検出する本発明の方法を開示する先行技
術も本発明者は知らない。
【0067】又、特定起源に由来するmRNA,hnR
NA,snRNA又はpsRNAのサブ配列(1ケ又は
複数)、配列(1ケ又は複数)又は配列若しくはサブ配
列の集団に相補的な選択された標識核酸分子を用いる核
酸ハイブリダイゼーションを利用して、mRNA,ps
RNA,hnRNA又はsnRNAの特定の配列又は種
々の特定配列の集団の存否を検出して特定の生物、生物
群、真核細胞群又は特定の細胞内ウイルス又は特定の細
胞内ウイルス群を検出、同定および定量するという本発
明の方法を教示する先行技術も本発明者は知らない。
NA,snRNA又はpsRNAのサブ配列(1ケ又は
複数)、配列(1ケ又は複数)又は配列若しくはサブ配
列の集団に相補的な選択された標識核酸分子を用いる核
酸ハイブリダイゼーションを利用して、mRNA,ps
RNA,hnRNA又はsnRNAの特定の配列又は種
々の特定配列の集団の存否を検出して特定の生物、生物
群、真核細胞群又は特定の細胞内ウイルス又は特定の細
胞内ウイルス群を検出、同定および定量するという本発
明の方法を教示する先行技術も本発明者は知らない。
【0068】更に又、特定の生物群又はウイルス群に特
徴的な核酸の存否を検出する本発明の検出法、何らかの
目的で或る特定の生物群又はウイルス群の核酸を標識特
異的プローブとの溶液内核酸ハイブリダイゼーションに
使用できるように迅速に処理する本発明の方法、特定の
生物群の核酸を特異的相補的プローブとのハイブリダイ
ゼーションに使用可能にするための迅速な方法と、或る
生物又はウイルスの核酸とその生物又はウイルスの核酸
に相補的な標識プローブとの溶液内ハイブリダイゼーシ
ョンの速度を著しく加速することによってその生物の核
酸を検出する方法とを組み合わせた溶液内核酸ハイブリ
ダイゼーション法を利用する本発明の方法、特定の生物
群又はウイルス群の抗菌剤に対する感受性又は抗ウイル
ス剤に対する感受性を測定する本発明の方法、血液、尿
その他の体液若しくはその他の試料中における抗菌性或
いは抗ウイルス性物質の存在を検定する本発明の方法、
細胞の増殖状態を調べる方法、微生物又はウイルス感染
を検知する方法、又はハイブリダイゼーション混合物中
に、所定の条件下で前記混合物とヒドロキシアパタイト
とを接触させて生成した溶液を特殊な方法で処理するこ
とにより、ハイブリダイズしたプローブが存在するかど
うかを迅速に検定する本発明の方法を教示する先行技術
を本発明者は知らない。
徴的な核酸の存否を検出する本発明の検出法、何らかの
目的で或る特定の生物群又はウイルス群の核酸を標識特
異的プローブとの溶液内核酸ハイブリダイゼーションに
使用できるように迅速に処理する本発明の方法、特定の
生物群の核酸を特異的相補的プローブとのハイブリダイ
ゼーションに使用可能にするための迅速な方法と、或る
生物又はウイルスの核酸とその生物又はウイルスの核酸
に相補的な標識プローブとの溶液内ハイブリダイゼーシ
ョンの速度を著しく加速することによってその生物の核
酸を検出する方法とを組み合わせた溶液内核酸ハイブリ
ダイゼーション法を利用する本発明の方法、特定の生物
群又はウイルス群の抗菌剤に対する感受性又は抗ウイル
ス剤に対する感受性を測定する本発明の方法、血液、尿
その他の体液若しくはその他の試料中における抗菌性或
いは抗ウイルス性物質の存在を検定する本発明の方法、
細胞の増殖状態を調べる方法、微生物又はウイルス感染
を検知する方法、又はハイブリダイゼーション混合物中
に、所定の条件下で前記混合物とヒドロキシアパタイト
とを接触させて生成した溶液を特殊な方法で処理するこ
とにより、ハイブリダイズしたプローブが存在するかど
うかを迅速に検定する本発明の方法を教示する先行技術
を本発明者は知らない。
【0069】
【課題を解決するための手段】本発明は、生物学的試
料、およびその他の試料中の生物を検出し、同定し、定
量するための核酸プローブを提供する。より詳細に言え
ば、リボソームRNA(以後rRNA)、トランスファ
ーRNA(以後tRNA)又はその他のRNAを含むあ
らゆる生物、そのような生物の大、小さまざまなカテゴ
リー又は分類学的群に属するあらゆる生物、そして、r
RNA又はtRNAを含むこれまで未知の生物を特異的
かつ鋭敏に検出し、定量するための核酸プローブに関す
るものである。この核酸プローブは、rRNA又はtR
NAを含む1個の生物でも、その存在を検出することが
できる。
料、およびその他の試料中の生物を検出し、同定し、定
量するための核酸プローブを提供する。より詳細に言え
ば、リボソームRNA(以後rRNA)、トランスファ
ーRNA(以後tRNA)又はその他のRNAを含むあ
らゆる生物、そのような生物の大、小さまざまなカテゴ
リー又は分類学的群に属するあらゆる生物、そして、r
RNA又はtRNAを含むこれまで未知の生物を特異的
かつ鋭敏に検出し、定量するための核酸プローブに関す
るものである。この核酸プローブは、rRNA又はtR
NAを含む1個の生物でも、その存在を検出することが
できる。
【0070】本発明は、RNAの一種であるmRNA,
hnRNA、若しくはsnRNAの特異的配列、又はm
RNA,rRNA,tRNA,hnRNA若しくはsn
RNAの前駆体分子にのみ存在していて成熟したmRN
A,tRNA,hnRNA若しくはsnRNAの分子に
は存在しないRNA配列(以後は前駆体特異的RNA配
列又はpsRNAと呼ぶ)に相補的である特別に作製さ
れた核酸を用いて、特定の生物、生物群、真核細胞群又
は細胞内ウイルスを検出、同定そして定量する方法をも
提供する。
hnRNA、若しくはsnRNAの特異的配列、又はm
RNA,rRNA,tRNA,hnRNA若しくはsn
RNAの前駆体分子にのみ存在していて成熟したmRN
A,tRNA,hnRNA若しくはsnRNAの分子に
は存在しないRNA配列(以後は前駆体特異的RNA配
列又はpsRNAと呼ぶ)に相補的である特別に作製さ
れた核酸を用いて、特定の生物、生物群、真核細胞群又
は細胞内ウイルスを検出、同定そして定量する方法をも
提供する。
【0071】また本発明は、(a)或る特定の生物の遺
伝子発現のパターンに関係なく働く1回のアッセイ操作
で多数の異なる生物のいずれかの一つの存在を特異的に
検出でき、(b)対象とする群に属しない生物が存在し
ていても特定種類の生物のみを検出できるように試験法
を修正することができ、(c)極めて高い検出感度を有
していて一個体の生物又は一個の細胞の存在を検出で
き、(d)存在する生物又は細胞の数を定量することが
でき、かつ、(e)増殖段階を必要としない方法および
手段をも提供する。
伝子発現のパターンに関係なく働く1回のアッセイ操作
で多数の異なる生物のいずれかの一つの存在を特異的に
検出でき、(b)対象とする群に属しない生物が存在し
ていても特定種類の生物のみを検出できるように試験法
を修正することができ、(c)極めて高い検出感度を有
していて一個体の生物又は一個の細胞の存在を検出で
き、(d)存在する生物又は細胞の数を定量することが
でき、かつ、(e)増殖段階を必要としない方法および
手段をも提供する。
【0072】本発明は、特定の生物群又はウイルス群の
抗菌剤又は抗ウイルス剤に対する感受性を検知するため
の手段、血液、尿、その他の体液、又は組織若しくはそ
の他の試料中の抗菌物質又は抗ウイルス性物質の存在を
アッセイするための手段、細胞の増殖状態を調べるため
の手段、微生物またはウイルス感染を検出するための手
段、ハイブリダイゼーション混合物中におけるハイブリ
ダイズしたプローブの存在を迅速にアッセイするための
手段を提供する。
抗菌剤又は抗ウイルス剤に対する感受性を検知するため
の手段、血液、尿、その他の体液、又は組織若しくはそ
の他の試料中の抗菌物質又は抗ウイルス性物質の存在を
アッセイするための手段、細胞の増殖状態を調べるため
の手段、微生物またはウイルス感染を検出するための手
段、ハイブリダイゼーション混合物中におけるハイブリ
ダイズしたプローブの存在を迅速にアッセイするための
手段を提供する。
【0073】既に述べたように、rRNA塩基配列は非
常に広範囲の生物において部分的に類似している。二種
の生物の関係が近ければ近い程、全rRNAにおいて二
つの種で類似する部分(割合)は大きくなる。いかなる
生物種のrRNA配列も、短いrRNAサブ配列のひと
つながりと見なされ、その中の一つのサブ配列はほとん
どすべての生体で類似している。従って、ほとんどすべ
ての生体のrRNAはこのサブ配列を含むに違いない。
別のサブ配列はその生物が属する種のメンバーのrRN
Aにおいてのみ類似している。その他のサブ配列は、そ
の種が属する目(もく)の生物に依存する。
常に広範囲の生物において部分的に類似している。二種
の生物の関係が近ければ近い程、全rRNAにおいて二
つの種で類似する部分(割合)は大きくなる。いかなる
生物種のrRNA配列も、短いrRNAサブ配列のひと
つながりと見なされ、その中の一つのサブ配列はほとん
どすべての生体で類似している。従って、ほとんどすべ
ての生体のrRNAはこのサブ配列を含むに違いない。
別のサブ配列はその生物が属する種のメンバーのrRN
Aにおいてのみ類似している。その他のサブ配列は、そ
の種が属する目(もく)の生物に依存する。
【0074】非常に異なる生物のrRNA配列は少くと
も一部が類似しているから、非常に異なる生物で類似し
ているrRNA配列を検出するプローブを用いる本発明
の方法は、試料中のこれら生物の1つ又はそれ以上の存
否を検知することができる。遠い関係の生物において類
似するrRNA配列に相補的な標識核酸配列(1つ又は
複数)を、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおい
てそのようなプローブとして用いることができる。
も一部が類似しているから、非常に異なる生物で類似し
ているrRNA配列を検出するプローブを用いる本発明
の方法は、試料中のこれら生物の1つ又はそれ以上の存
否を検知することができる。遠い関係の生物において類
似するrRNA配列に相補的な標識核酸配列(1つ又は
複数)を、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおい
てそのようなプローブとして用いることができる。
【0075】近い関係の生物のrRNA配列は、遠い関
係の生物のそれよりもよく似ているから、特定の狭い生
物群において類似するrRNA配列のみを検出するプロ
ーブを用いる本発明の方法は、試料中のこれら特定の生
物の1つ又はそれ以上の存否を多くの(近縁関係のな
い)生物の存在下においてさえ検知することができるこ
れらの群特異的プローブは、種々の異なる大きさのカテ
ゴリーに対して特異的なものとすることができる。或る
プローブは分類学上の特定の属に特異的であり得、又別
の或るプローブは特定の科又は他の属に特異的である。
係の生物のそれよりもよく似ているから、特定の狭い生
物群において類似するrRNA配列のみを検出するプロ
ーブを用いる本発明の方法は、試料中のこれら特定の生
物の1つ又はそれ以上の存否を多くの(近縁関係のな
い)生物の存在下においてさえ検知することができるこ
れらの群特異的プローブは、種々の異なる大きさのカテ
ゴリーに対して特異的なものとすることができる。或る
プローブは分類学上の特定の属に特異的であり得、又別
の或るプローブは特定の科又は他の属に特異的である。
【0076】群特異的プローブは或る生物群のrRNA
とハイブリダイズする能力をもつが、他のいかなる生物
群のrRNAともハイブリダイズしない。そのような群
特異的相補配列は、その特定の群に属さない多くの生物
に由来する大量のrRNAが存在していても、その特定
の群のいずれかの生物に由来するrRNAの存在を検出
する。
とハイブリダイズする能力をもつが、他のいかなる生物
群のrRNAともハイブリダイズしない。そのような群
特異的相補配列は、その特定の群に属さない多くの生物
に由来する大量のrRNAが存在していても、その特定
の群のいずれかの生物に由来するrRNAの存在を検出
する。
【0077】試料中のrRNA分子の総数は、rRNA
に相補的な標識配列(1つ又は複数)と、過剰プローブ
又は過剰試料RNAを利用する標準的な核酸ハイブリダ
イゼーション法とを用いて測定される。
に相補的な標識配列(1つ又は複数)と、過剰プローブ
又は過剰試料RNAを利用する標準的な核酸ハイブリダ
イゼーション法とを用いて測定される。
【0078】種々様々な生物の細胞のrRNA含有量は
当業者には公知である。類似生物の非常に大きい群、例
えば細菌群では、細胞あたりのrRNA量はざっと2〜
5倍に変化する。従って、もし試料中のrRNA分子の
数がわかり、そのrRNAの起源となった生物が属する
広い意味での群が特定されれば、試料中に存在する細胞
数の正しい推定値が計算できる。もし、その群が特定さ
れていないならば、その試料を、各々が特定の広い生物
カテゴリーに特異的であるように選択した一連のrRN
Aに相補的なプローブにハイブリダイズすることによっ
てその群(クラス)を決定することができる。
当業者には公知である。類似生物の非常に大きい群、例
えば細菌群では、細胞あたりのrRNA量はざっと2〜
5倍に変化する。従って、もし試料中のrRNA分子の
数がわかり、そのrRNAの起源となった生物が属する
広い意味での群が特定されれば、試料中に存在する細胞
数の正しい推定値が計算できる。もし、その群が特定さ
れていないならば、その試料を、各々が特定の広い生物
カテゴリーに特異的であるように選択した一連のrRN
Aに相補的なプローブにハイブリダイズすることによっ
てその群(クラス)を決定することができる。
【0079】現在、1回のアッセイ操作による検出およ
び定量範囲は、104 個のrRNA分子(1個の細菌又
は10-2個の哺乳類細胞)から約1012個のrRNA分
子(108 個の細菌又は106 個の哺乳類細胞)までで
あり、細胞数では108 個に及ぶ。一回のテストを、1
03 個から1010個の細菌までを定量するような方法で
行うこともできる。このテストは、このように極めてフ
レキシブルである。
び定量範囲は、104 個のrRNA分子(1個の細菌又
は10-2個の哺乳類細胞)から約1012個のrRNA分
子(108 個の細菌又は106 個の哺乳類細胞)までで
あり、細胞数では108 個に及ぶ。一回のテストを、1
03 個から1010個の細菌までを定量するような方法で
行うこともできる。このテストは、このように極めてフ
レキシブルである。
【0080】rRNAに対するテストは特異的であり、
非常に少い生物の存在を検出することができるから、増
殖段階によって生物数を増幅する必要はない。
非常に少い生物の存在を検出することができるから、増
殖段階によって生物数を増幅する必要はない。
【0081】rRNAを含む生物がそのような生物を含
むかも知れない試料中に存在するかどうかを決める本発
明は、基本的に、次のように実施する。
むかも知れない試料中に存在するかどうかを決める本発
明は、基本的に、次のように実施する。
【0082】(a)試料又はその試料から単離した核酸
を、すべての生物のrRNAに相補的な標識核酸分子か
ら成るプローブと一緒にする。
を、すべての生物のrRNAに相補的な標識核酸分子か
ら成るプローブと一緒にする。
【0083】(b)生成した混合物を、所定のハイブリ
ダイゼーション条件下で所定時間インキュベートする。
ダイゼーション条件下で所定時間インキュベートする。
【0084】(c)その後、生成した混合物について、
プローブのハイブリダイゼーションをアッセイする。
プローブのハイブリダイゼーションをアッセイする。
【0085】本発明により、rRNAを含む特定のカテ
ゴリーに属する生物がそのような生物を含むかも知れな
い試料中に存在するかどうかを決定する場合には、次の
ように実施する。
ゴリーに属する生物がそのような生物を含むかも知れな
い試料中に存在するかどうかを決定する場合には、次の
ように実施する。
【0086】(a)試料又はその中の核酸を、特定のカ
テゴリーの生物のrRNAにのみ相補的であって関連の
ない生物由来のrRNAには相補的でない標識核酸分子
からなるプローブと接触させる。
テゴリーの生物のrRNAにのみ相補的であって関連の
ない生物由来のrRNAには相補的でない標識核酸分子
からなるプローブと接触させる。
【0087】(b)そのプローブと試料又はその単離核
酸とをインキュベートする。
酸とをインキュベートする。
【0088】(c)インキュベートした混合物につい
て、上記プローブのハイブリダイゼーションをアッセイ
する。
て、上記プローブのハイブリダイゼーションをアッセイ
する。
【0089】本発明は又、被検試料中の生物の数を決定
するためにも用いられる。そのためには、上記2番目の
方法において、プローブハイブリダイゼーションがおこ
った場合、試料中のrRNA量を特定の群に属する個々
の生物に通常存在するrRNA分子の数と比較する。
するためにも用いられる。そのためには、上記2番目の
方法において、プローブハイブリダイゼーションがおこ
った場合、試料中のrRNA量を特定の群に属する個々
の生物に通常存在するrRNA分子の数と比較する。
【0090】勿論、使用し得る本発明の範囲内の変更と
して、上述の2番目の方法における段階(a)の単一プ
ローブの代わりに、複数の異なるプローブを1組含む方
法も含まれる。そのような場合には、各別個のプローブ
は特定の生物群のrRNAのみに相補的な標識核酸分子
から成り、各プローブは異なる生物群に対して特異的で
ある。段階(a)の後、各プローブ試料混合物を所定の
ハイブリダイゼーション条件下で所定の時間インキュベ
ートし、その後、各混合物についてプローブのハイブリ
ダイゼーションのアッセイを行う。
して、上述の2番目の方法における段階(a)の単一プ
ローブの代わりに、複数の異なるプローブを1組含む方
法も含まれる。そのような場合には、各別個のプローブ
は特定の生物群のrRNAのみに相補的な標識核酸分子
から成り、各プローブは異なる生物群に対して特異的で
ある。段階(a)の後、各プローブ試料混合物を所定の
ハイブリダイゼーション条件下で所定の時間インキュベ
ートし、その後、各混合物についてプローブのハイブリ
ダイゼーションのアッセイを行う。
【0091】既述のように、tRNA塩基配列は、非常
に異なる生物において部分的に類似している。2種の生
物がより近い関係にあるならばある程、tRNA配列に
おける関連づけられる割合はより大きくなる。各々のt
RNA遺伝子配列は、一連の短いtRNAサブ配列がつ
ながったものと考えられる。或るサブ配列は関連のある
生物を含む大きい群において類似している。又別のサブ
配列は、関連のある生物が属する中位の大きさの群にお
いて類似しており、第三のサブ配列は、関連のある生物
の小さい群において類似している。
に異なる生物において部分的に類似している。2種の生
物がより近い関係にあるならばある程、tRNA配列に
おける関連づけられる割合はより大きくなる。各々のt
RNA遺伝子配列は、一連の短いtRNAサブ配列がつ
ながったものと考えられる。或るサブ配列は関連のある
生物を含む大きい群において類似している。又別のサブ
配列は、関連のある生物が属する中位の大きさの群にお
いて類似しており、第三のサブ配列は、関連のある生物
の小さい群において類似している。
【0092】非常に異なる生物のtRNA配列も少なく
とも一部は類似しているから、非常に異なる生物におい
て類似するtRNA配列を検出するプローブを用いる場
合の本発明の方法は、試料中にこれら生物が1種類か又
はそれ以上存在するかどうかを検出することができる。
したがって、遠く離れた生物において類似のtRNA配
列に相補的な標識核酸配列(1個又は複数)を、核酸ハ
イブリダイゼーションアッセイにおいてそのようなプロ
ーブとして用いることができる。
とも一部は類似しているから、非常に異なる生物におい
て類似するtRNA配列を検出するプローブを用いる場
合の本発明の方法は、試料中にこれら生物が1種類か又
はそれ以上存在するかどうかを検出することができる。
したがって、遠く離れた生物において類似のtRNA配
列に相補的な標識核酸配列(1個又は複数)を、核酸ハ
イブリダイゼーションアッセイにおいてそのようなプロ
ーブとして用いることができる。
【0093】そして、関係の近い生物のtRNA配列
は、関係の遠い生物のそれよりもよく似ているから、特
定の狭い生物群において類似するtRNA配列のみを検
出するプローブを使用する場合の本発明の方法では、試
料中のこれら特定生物の1つ又はそれ以上の存否を、関
連性のない多くの生物の存在下においてさえ検出するこ
とができる。そのような群特異的プローブは、種々の大
きさのカテゴリーに特異的である。例えば、あるプロー
ブは分類学上の特定の属に対して特異的であるかもしれ
ないが、別の或るものは特定の科又は別の属に対して特
異的である。
は、関係の遠い生物のそれよりもよく似ているから、特
定の狭い生物群において類似するtRNA配列のみを検
出するプローブを使用する場合の本発明の方法では、試
料中のこれら特定生物の1つ又はそれ以上の存否を、関
連性のない多くの生物の存在下においてさえ検出するこ
とができる。そのような群特異的プローブは、種々の大
きさのカテゴリーに特異的である。例えば、あるプロー
ブは分類学上の特定の属に対して特異的であるかもしれ
ないが、別の或るものは特定の科又は別の属に対して特
異的である。
【0094】群特異的プローブは、或る生物群のtRN
Aとはハイブリダイズできるが別の生物群のtRNAと
はハイブリダイズできないという物質を有する。そのよ
うな群特異的相補配列は、その特異的生物群のいずれか
のメンバーのtRNAの存在を(その特異的群に属さな
い多くの生物に由来するtRNAが大量存在する場合で
さえ)検出する。
Aとはハイブリダイズできるが別の生物群のtRNAと
はハイブリダイズできないという物質を有する。そのよ
うな群特異的相補配列は、その特異的生物群のいずれか
のメンバーのtRNAの存在を(その特異的群に属さな
い多くの生物に由来するtRNAが大量存在する場合で
さえ)検出する。
【0095】tRNAを含む特定のカテゴリーの生物が
そのような生物を含むかも知れない試料中に存在するか
どうかを決定することを目的とする本発明を実施するに
は(a)試料又はその中の核酸を、特定のカテゴリーの
生物のtRNAにのみ相補的であって関連のない生物に
由来するtRNAには相補的でない標識核酸分子から成
るプローブと接触させる、(b)プローブと試料又はそ
の単離された核酸とをインキュベートし、(c)インキ
ュベートした混合物について、上記プローブのハイブリ
ダイゼーションのアッセイを行う。
そのような生物を含むかも知れない試料中に存在するか
どうかを決定することを目的とする本発明を実施するに
は(a)試料又はその中の核酸を、特定のカテゴリーの
生物のtRNAにのみ相補的であって関連のない生物に
由来するtRNAには相補的でない標識核酸分子から成
るプローブと接触させる、(b)プローブと試料又はそ
の単離された核酸とをインキュベートし、(c)インキ
ュベートした混合物について、上記プローブのハイブリ
ダイゼーションのアッセイを行う。
【0096】本発明は又、被検試料中に存在する生物の
数を調べるために用いることもできる。それには、上記
の2番目の方法において、プローブハイブリダイゼーシ
ョンがおこった場合、アッセイの後、試料中のtRNA
の量を、上記特定の群に属する個々の生物に通常存在す
るtRNA分子の数と比較する。
数を調べるために用いることもできる。それには、上記
の2番目の方法において、プローブハイブリダイゼーシ
ョンがおこった場合、アッセイの後、試料中のtRNA
の量を、上記特定の群に属する個々の生物に通常存在す
るtRNA分子の数と比較する。
【0097】勿論、本発明の範囲内で使用し得る変更と
して、上記の2番目の方法における段階(a)の単一プ
ローブの代わりに、複数の異なるプローブを1組用いて
もよい。そのような場合、各別個のプローブは、特定の
生物群のtRNAのみに相補的である標識核酸分子から
成り、各プローブは異なる生物群に対して特異的であ
る。段階(a)の後、各プローブ試料混合物を所定のハ
イブリダイゼーション条件下で所定の時間インキュベー
トし、その後各混合物についてプローブのハイブリダイ
ゼーションアッセイを行う。
して、上記の2番目の方法における段階(a)の単一プ
ローブの代わりに、複数の異なるプローブを1組用いて
もよい。そのような場合、各別個のプローブは、特定の
生物群のtRNAのみに相補的である標識核酸分子から
成り、各プローブは異なる生物群に対して特異的であ
る。段階(a)の後、各プローブ試料混合物を所定のハ
イブリダイゼーション条件下で所定の時間インキュベー
トし、その後各混合物についてプローブのハイブリダイ
ゼーションアッセイを行う。
【0098】
【発明の実施の形態】本発明の方法および手段は、本発
明に従うテスト方法を特徴づける次の記述によってより
明確に理解しうる。
明に従うテスト方法を特徴づける次の記述によってより
明確に理解しうる。
【0099】RNAの検出および定量のための核酸ハイ
ブリダイゼーションテスト手順 好ましい検出法は、(a)迅速で、(b)容易に使用で
き、(c)高度に鋭敏で、(d)1回の実験室アッセイ
で検出および定量できるものでなければならない。
ブリダイゼーションテスト手順 好ましい検出法は、(a)迅速で、(b)容易に使用で
き、(c)高度に鋭敏で、(d)1回の実験室アッセイ
で検出および定量できるものでなければならない。
【0100】Legionella属のメンバー由来のrRNAに
はハイブリダイズするが他の生物に由来するrRNAに
はハイブリダイズしない核酸プローブがあれば、核酸を
試料から精製する必要なく、例えばLegionella菌をたっ
た1回の実験室アッセイで検出並びに定量する迅速で使
用し易く鋭敏な溶液内検出テストが可能になる。
はハイブリダイズするが他の生物に由来するrRNAに
はハイブリダイズしない核酸プローブがあれば、核酸を
試料から精製する必要なく、例えばLegionella菌をたっ
た1回の実験室アッセイで検出並びに定量する迅速で使
用し易く鋭敏な溶液内検出テストが可能になる。
【0101】この溶液内ハイブリダイゼーションテスト
法の基礎的な面を、次に記述する。ここに記述する方法
はLegionella属のメンバーを検出するようになっている
が、その他の多くの生物群又はウイルスを検出する適当
なプローブを用いてこの同じテスト方法を使用できるこ
とは当然である。
法の基礎的な面を、次に記述する。ここに記述する方法
はLegionella属のメンバーを検出するようになっている
が、その他の多くの生物群又はウイルスを検出する適当
なプローブを用いてこの同じテスト方法を使用できるこ
とは当然である。
【0102】段階1 試料の調製
試料を、界面活性剤(洗浄剤)と蛋白分解酵素を含む溶
液を混ぜる。界面活性剤は細菌を溶解して細胞成分を可
溶化するのに役立ち、酵素は(その中には、RNA及び
DNAを分解する酵素も含まれる)細胞蛋白質を破壊す
る。界面活性剤−酵素混合物の組成は、使用する界面活
性剤および蛋白分解酵素の種類並びに検査する試料の量
および種類によって定まる。使用される界面活性剤とし
ては、ラウリル硫酸ナトリウム、サルコシル、ツヴィッ
タージェント(Zwittergent) があり、使用される酸素と
してはプロティナーゼKおよびプロナーゼがある。非常
に種々様々の酵素、カオトロピック・エージェント(Cha
otropic agents) のような溶解補助剤を用いることがで
きる。プローブは、試料に加える界面活性剤−酵素混合
物中に入っていてもよい。
液を混ぜる。界面活性剤は細菌を溶解して細胞成分を可
溶化するのに役立ち、酵素は(その中には、RNA及び
DNAを分解する酵素も含まれる)細胞蛋白質を破壊す
る。界面活性剤−酵素混合物の組成は、使用する界面活
性剤および蛋白分解酵素の種類並びに検査する試料の量
および種類によって定まる。使用される界面活性剤とし
ては、ラウリル硫酸ナトリウム、サルコシル、ツヴィッ
タージェント(Zwittergent) があり、使用される酸素と
してはプロティナーゼKおよびプロナーゼがある。非常
に種々様々の酵素、カオトロピック・エージェント(Cha
otropic agents) のような溶解補助剤を用いることがで
きる。プローブは、試料に加える界面活性剤−酵素混合
物中に入っていてもよい。
【0103】酵素−界面活性剤は、試料中のLegionella
菌に非常に速かに作用する。大抵の場合は、rRNAを
プローブとの溶液内ハイブリダイゼーションが可能にな
るようにするために混合物をインキュベートする必要は
ない。特定の場合には、短時間のインキュベーションが
必要である。
菌に非常に速かに作用する。大抵の場合は、rRNAを
プローブとの溶液内ハイブリダイゼーションが可能にな
るようにするために混合物をインキュベートする必要は
ない。特定の場合には、短時間のインキュベーションが
必要である。
【0104】場合によっては、蛋白分解酵素を含ませる
必要がなく、界面活性剤のみでもrRNAとプローブと
の溶液内ハイブリダイゼーションが可能になる。
必要がなく、界面活性剤のみでもrRNAとプローブと
の溶液内ハイブリダイゼーションが可能になる。
【0105】このアプローチにより、試料rRNAを、
溶液内アッセイにおいてプローブとハイブリダイズし得
る状態にするための非常に迅速かつ容易な方法が得られ
る。その上、このアプローチによれば、試料rRNAを
精製せずに溶液中でハイブリダイゼーションをおこすこ
とができる。この方法の鍵は、プローブがLegionellar
RNAを検出するということである。rRNAは細胞中
で1本鎖であり、リボソーム蛋白質がrRNAから除去
されればすぐにプローブとハイブリダイズする。これに
対して、rRNA DNA(即ちrRNAの遺伝子)又
はその他のDNA配列を直接検出するためには、プロー
ブがDNAとハイブリダイズする前に、2本鎖のrRN
A遺伝子を分離させて2本の1本鎖にする操作を行わな
ければならない。
溶液内アッセイにおいてプローブとハイブリダイズし得
る状態にするための非常に迅速かつ容易な方法が得られ
る。その上、このアプローチによれば、試料rRNAを
精製せずに溶液中でハイブリダイゼーションをおこすこ
とができる。この方法の鍵は、プローブがLegionellar
RNAを検出するということである。rRNAは細胞中
で1本鎖であり、リボソーム蛋白質がrRNAから除去
されればすぐにプローブとハイブリダイズする。これに
対して、rRNA DNA(即ちrRNAの遺伝子)又
はその他のDNA配列を直接検出するためには、プロー
ブがDNAとハイブリダイズする前に、2本鎖のrRN
A遺伝子を分離させて2本の1本鎖にする操作を行わな
ければならない。
【0106】本発明者の知る限りでは、一般の生物又は
特定の群の生物の存否を検出して定量する目的でrRN
A,tRNA、一般のRNA又はDNAをプローブとの
溶液内ハイブリダイゼーションが可能になるようにする
ために上記のような酵素−界面活性剤−試料法を用いた
先行技術はない。
特定の群の生物の存否を検出して定量する目的でrRN
A,tRNA、一般のRNA又はDNAをプローブとの
溶液内ハイブリダイゼーションが可能になるようにする
ために上記のような酵素−界面活性剤−試料法を用いた
先行技術はない。
【0107】段階2 ハイブリダイゼーションインキュ
ベーション混合物の調製 試料−酵素−界面活性剤混合物に、プローブとハイブリ
ダイゼーションをおこすのに十分な塩とを加え、生成し
た混合物を適当な温度でインキュベートする。塩濃度と
ハイブリダイゼーションインキュベーション温度の組合
せによって規準(criterion)が決定される。インキュベ
ーション条件の規準は、プローブの選択の際に用いた基
準と等しくなければならない。さもないとプローブの特
異性が変化し得る。
ベーション混合物の調製 試料−酵素−界面活性剤混合物に、プローブとハイブリ
ダイゼーションをおこすのに十分な塩とを加え、生成し
た混合物を適当な温度でインキュベートする。塩濃度と
ハイブリダイゼーションインキュベーション温度の組合
せによって規準(criterion)が決定される。インキュベ
ーション条件の規準は、プローブの選択の際に用いた基
準と等しくなければならない。さもないとプローブの特
異性が変化し得る。
【0108】インキュベーション混合物は、ハイブリダ
イゼーションがおこるのに十分な時間インキュベートし
なければならない。塩の種類および濃度により、達し得
るハイブリダイゼーション速度が決まる。例えば、或る
種の塩は適切な濃度で使用すると、非常に速いハイブリ
ダイゼーションをおこす。そのような塩の一例は燐酸ナ
トリウムである。Legionella特異的プローブを、3.0
M燐酸ナトリウム緩衝液(pH=6.8)(以後PBと
記す)中で精製LegionellarRNAと混ぜ76℃でイン
キュベートすると、0.72M NaCl、76℃とい
う標準条件(これら二つの条件は規準としては等しい)
下でインキュベートした同量のLegionellaプローブおよ
びrRNAの場合より100倍以上速くハイブリダイズ
する。このハイブリダイゼーション速度を上昇させるた
めにその他の塩を用いることもできる。この中には、大
部分のナトリウム塩、アンモニウム塩、ルビジウム塩、
カリウム塩、セシウム塩、リチウム塩が含まれる。
イゼーションがおこるのに十分な時間インキュベートし
なければならない。塩の種類および濃度により、達し得
るハイブリダイゼーション速度が決まる。例えば、或る
種の塩は適切な濃度で使用すると、非常に速いハイブリ
ダイゼーションをおこす。そのような塩の一例は燐酸ナ
トリウムである。Legionella特異的プローブを、3.0
M燐酸ナトリウム緩衝液(pH=6.8)(以後PBと
記す)中で精製LegionellarRNAと混ぜ76℃でイン
キュベートすると、0.72M NaCl、76℃とい
う標準条件(これら二つの条件は規準としては等しい)
下でインキュベートした同量のLegionellaプローブおよ
びrRNAの場合より100倍以上速くハイブリダイズ
する。このハイブリダイゼーション速度を上昇させるた
めにその他の塩を用いることもできる。この中には、大
部分のナトリウム塩、アンモニウム塩、ルビジウム塩、
カリウム塩、セシウム塩、リチウム塩が含まれる。
【0109】3MのPB中76℃で、Legionella特異的
プローブと、PB−酵素−界面活性剤−試料−プローブ
混合物中に存在するLegionellarRNAとのハイブリダ
イゼーション速度も、標準インキュベーション条件で見
られるハイブリダイゼーション速度を100倍以上上ま
わる。標準塩濃度条件下でも、プローブと酵素−界面活
性剤−試料混合物中のrRNAとの間でハイブリダイゼ
ーションがおこる。
プローブと、PB−酵素−界面活性剤−試料−プローブ
混合物中に存在するLegionellarRNAとのハイブリダ
イゼーション速度も、標準インキュベーション条件で見
られるハイブリダイゼーション速度を100倍以上上ま
わる。標準塩濃度条件下でも、プローブと酵素−界面活
性剤−試料混合物中のrRNAとの間でハイブリダイゼ
ーションがおこる。
【0110】本発明の特徴の一つは、前にも指摘したよ
うに、生物のrRNAを検出することにより、非常に少
数の生物を検出することができるということである。こ
れは、各細胞中に多数のrRNA分子が存在するために
可能なのである。Legionella様生物では、個々の細菌細
胞中に、5000〜10000個のrRNA分子があ
る。核酸ハイブリダイゼーションで到達し得る検出感度
を決定する主な要因の一つは、達成することができるハ
イブリダイゼーション速度である。rRNAの検出と前
述の加速インキュベーション条件の使用とを組み合わせ
ると、非常に少量の試料およびプローブの使用で非常に
短い時間内に細菌およびその他の生物を検出する極端に
高い感度を得ることができる。この実例を後に記す。
うに、生物のrRNAを検出することにより、非常に少
数の生物を検出することができるということである。こ
れは、各細胞中に多数のrRNA分子が存在するために
可能なのである。Legionella様生物では、個々の細菌細
胞中に、5000〜10000個のrRNA分子があ
る。核酸ハイブリダイゼーションで到達し得る検出感度
を決定する主な要因の一つは、達成することができるハ
イブリダイゼーション速度である。rRNAの検出と前
述の加速インキュベーション条件の使用とを組み合わせ
ると、非常に少量の試料およびプローブの使用で非常に
短い時間内に細菌およびその他の生物を検出する極端に
高い感度を得ることができる。この実例を後に記す。
【0111】本発明者の知る限りでは、或る生物又は生
物群が存在するかどうかを、その生物のrRNA,tR
NA、その他のRNA又はDNAを検出することによっ
て決定するための溶液内ハイブリダイゼーションテスト
において上記のような加速系を使用した先行技術はな
い。又本発明者の知る限り、特定の生物又はウイルス又
は生物群又はウイルス群が存在するかどうかを、その特
定の生物又は生物群のrRNA,tRNA又はその他の
RNA又はDNAを検出することによって決定するため
に、上記のような加速系と酵素−界面活性剤−試料−プ
ローブ混合物とを組み合わせて使用した先行技術もな
い。
物群が存在するかどうかを、その生物のrRNA,tR
NA、その他のRNA又はDNAを検出することによっ
て決定するための溶液内ハイブリダイゼーションテスト
において上記のような加速系を使用した先行技術はな
い。又本発明者の知る限り、特定の生物又はウイルス又
は生物群又はウイルス群が存在するかどうかを、その特
定の生物又は生物群のrRNA,tRNA又はその他の
RNA又はDNAを検出することによって決定するため
に、上記のような加速系と酵素−界面活性剤−試料−プ
ローブ混合物とを組み合わせて使用した先行技術もな
い。
【0112】段階3 インキュベーション混合物におけ
るプローブと標的rRNAとのハイブリダイゼーション
アッセイ 試料が標的rRNA分子(従って標的生物)を含んでい
るというシグナルは、インキュベーション混合物中にハ
イブリダイズしたプローブが存在することである。そこ
で、インキュベーションの終了後に、インキュベーショ
ン混合物中に、ハイブリダイズしたプローブがあるかど
うかアッセイしなければならない。そのようなアッセイ
は、簡単に行えて迅速であるのが好ましい。このアッセ
イのために、インキュベーション混合物をヒドロキシア
パタイト(HA)を用いて処理する。適切な条件下で、
HAはrRNAと速かにかつ完全に結合するが、ハイブ
リダイズしてないプローブ分子とは結合しない。プロー
ブ分子が標的rRNAとハイブリダイズしているなら
ば、プローブはrRNAに物理的に結合しているのであ
るから、プローブもHAと結合する。
るプローブと標的rRNAとのハイブリダイゼーション
アッセイ 試料が標的rRNA分子(従って標的生物)を含んでい
るというシグナルは、インキュベーション混合物中にハ
イブリダイズしたプローブが存在することである。そこ
で、インキュベーションの終了後に、インキュベーショ
ン混合物中に、ハイブリダイズしたプローブがあるかど
うかアッセイしなければならない。そのようなアッセイ
は、簡単に行えて迅速であるのが好ましい。このアッセ
イのために、インキュベーション混合物をヒドロキシア
パタイト(HA)を用いて処理する。適切な条件下で、
HAはrRNAと速かにかつ完全に結合するが、ハイブ
リダイズしてないプローブ分子とは結合しない。プロー
ブ分子が標的rRNAとハイブリダイズしているなら
ば、プローブはrRNAに物理的に結合しているのであ
るから、プローブもHAと結合する。
【0113】当該生物のrRNAの検出によって、生物
を検出することが本発明の特徴である。HAが数秒でr
RNA又は一般のRNAに結合でき、プローブとは全然
結合しないという性質を利用することによって、フレキ
シビリティーが大きく、数分間しかかからず、しかも多
数の試料をうまく処理できるハイブリダイゼーション法
が開発できる。その上、試料−界面活性剤−酵素−プロ
ーブインキュベーション混合物は、適当な緩衝液で希釈
し、直接処理してハイブリダイズしたプローブの存在を
アッセイすることができる。
を検出することが本発明の特徴である。HAが数秒でr
RNA又は一般のRNAに結合でき、プローブとは全然
結合しないという性質を利用することによって、フレキ
シビリティーが大きく、数分間しかかからず、しかも多
数の試料をうまく処理できるハイブリダイゼーション法
が開発できる。その上、試料−界面活性剤−酵素−プロ
ーブインキュベーション混合物は、適当な緩衝液で希釈
し、直接処理してハイブリダイズしたプローブの存在を
アッセイすることができる。
【0114】HAは、プローブのハイブリダイゼーショ
ンをアッセイするために用いる物質として当業者に知ら
れている。ここに記載したアッセイ法は、先行技術によ
るHAの使用(Brennet et al., Analytical Biochem
(1969)28、477)に比べて遥かに有利であり、室温で行
うことができ、約15℃から約90℃までの温度範囲で
有効に機能する。必要な段階数は少なく、各遠沈段階で
加熱する必要がない。また、Zwittergent(Calbiochem,
サンディエゴ、カリフォルニア)およびラウリル硫酸ナ
トリウムのような界面活性剤の存在下でも不存在下でも
行うことができる。さらに、先行技術の方法より3〜5
倍も速く、1回のアッセイが3〜5分で行える。必要な
HAは約5分の1ですむ。アッセイの種類によって、界
面活性剤の濃度は0〜10%の範囲で、燐酸塩濃度は
0.1M〜0.2Mの範囲で変え得る。またこの方法
は、多数の試料の処理にも容易に適用できる。
ンをアッセイするために用いる物質として当業者に知ら
れている。ここに記載したアッセイ法は、先行技術によ
るHAの使用(Brennet et al., Analytical Biochem
(1969)28、477)に比べて遥かに有利であり、室温で行
うことができ、約15℃から約90℃までの温度範囲で
有効に機能する。必要な段階数は少なく、各遠沈段階で
加熱する必要がない。また、Zwittergent(Calbiochem,
サンディエゴ、カリフォルニア)およびラウリル硫酸ナ
トリウムのような界面活性剤の存在下でも不存在下でも
行うことができる。さらに、先行技術の方法より3〜5
倍も速く、1回のアッセイが3〜5分で行える。必要な
HAは約5分の1ですむ。アッセイの種類によって、界
面活性剤の濃度は0〜10%の範囲で、燐酸塩濃度は
0.1M〜0.2Mの範囲で変え得る。またこの方法
は、多数の試料の処理にも容易に適用できる。
【0115】HA以外の方法も、プローブのハイブリダ
イゼーションアッセイに使用できる。これらには、S1
酵素法のような酵素アッセイ、サイズ分離法、そして種
々の試料固定化法が含まれる。ここに言うプローブは、
ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション
アッセイを行うこれらの方法およびその他の方法と共に
効果的に用いることができる。
イゼーションアッセイに使用できる。これらには、S1
酵素法のような酵素アッセイ、サイズ分離法、そして種
々の試料固定化法が含まれる。ここに言うプローブは、
ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション
アッセイを行うこれらの方法およびその他の方法と共に
効果的に用いることができる。
【0116】rRNAに対する群特異的プローブの調製
方法 群特異的プローブをつくるには、種々のアプローチをと
ることができる。これらのアプローチは、1つを除いて
すべて、群特異的プローブ配列を同定して精製するため
に種々の核酸ハイブリダイゼーション法を使用する。
方法 群特異的プローブをつくるには、種々のアプローチをと
ることができる。これらのアプローチは、1つを除いて
すべて、群特異的プローブ配列を同定して精製するため
に種々の核酸ハイブリダイゼーション法を使用する。
【0117】方法A
rRNAに対する群特異的プローブをつくる最も有用な
方法は、組換えDNA技術を用いることである。この方
法に含まれる段階は次の通りである。(標準DNA組換
え技術の詳細は、Molecular Cloning, A Laboratory,
T.Maniatis 等、Cold Spring Harbor Publication(198
2)に記されている。) (1)対象とする特定の生物から核酸を単離する。標準
的単離法を用いる。
方法は、組換えDNA技術を用いることである。この方
法に含まれる段階は次の通りである。(標準DNA組換
え技術の詳細は、Molecular Cloning, A Laboratory,
T.Maniatis 等、Cold Spring Harbor Publication(198
2)に記されている。) (1)対象とする特定の生物から核酸を単離する。標準
的単離法を用いる。
【0118】(2)この単離したDNAを用いて、この
生物のrRNA遺伝子をクローン化し、Maniatis等(上
掲)が示した標準的DNA組換え技術を用いてリボソー
ム遺伝子DNAを大量につくる。
生物のrRNA遺伝子をクローン化し、Maniatis等(上
掲)が示した標準的DNA組換え技術を用いてリボソー
ム遺伝子DNAを大量につくる。
【0119】(3)制限酵素を用いてrRNA遺伝子D
NAを短い断片にし、ついで、Maniatis等(上掲)が示
した標準的DNA組換え法を用いてこれら短いDNA断
片のライブラリーをつくる。
NAを短い断片にし、ついで、Maniatis等(上掲)が示
した標準的DNA組換え法を用いてこれら短いDNA断
片のライブラリーをつくる。
【0120】(4)ライブラリーをスクリーニングし
て、対象とする特定の生物のみならず、その生物と分類
学上の同じ群に属する他の生物(例えば、対象とする特
定の生物が、ある「種」に属するものである場合には、
同じ「種」に属し「株」の異なる他の生物)のrRNA
にのみハイブリダイズし、その生物の群には属していな
いいかなる生物のrRNAにもハイブリダイズしない、
短いrRNA遺伝子配列を含むクローンを同定する。こ
のクローンを単離する。このクローンは、対象とする生
物が属する特定の種のrRNAにのみ相補的な種特異的
DNA配列を含むライブラリーを更にスクリーンし、次
のクローンを同定し、単離する。
て、対象とする特定の生物のみならず、その生物と分類
学上の同じ群に属する他の生物(例えば、対象とする特
定の生物が、ある「種」に属するものである場合には、
同じ「種」に属し「株」の異なる他の生物)のrRNA
にのみハイブリダイズし、その生物の群には属していな
いいかなる生物のrRNAにもハイブリダイズしない、
短いrRNA遺伝子配列を含むクローンを同定する。こ
のクローンを単離する。このクローンは、対象とする生
物が属する特定の種のrRNAにのみ相補的な種特異的
DNA配列を含むライブラリーを更にスクリーンし、次
のクローンを同定し、単離する。
【0121】(a)対象とする生物が属する分類学上の
属の生物に由来するrRNAにのみハイブリダイズする
rRNAに相補的なDNA配列を含むクローン。
属の生物に由来するrRNAにのみハイブリダイズする
rRNAに相補的なDNA配列を含むクローン。
【0122】(b)対象とする生物が属する分類学上の
目の生物に由来するrRNAにのみハイブリダイズする
rRNAに相補的なDNA配列を含むクローン。
目の生物に由来するrRNAにのみハイブリダイズする
rRNAに相補的なDNA配列を含むクローン。
【0123】(c)対象とする生物が属する分類学上の
科の生物に由来するrRNAにのみハイブリダイズする
rRNAに相補的なDNA配列を含むクローン。
科の生物に由来するrRNAにのみハイブリダイズする
rRNAに相補的なDNA配列を含むクローン。
【0124】(d)対象とする生物が属する分類学上の
網の生物に由来するrRNAにのみハイブリダイズする
rRNAに相補的なDNA配列を含むクローン。
網の生物に由来するrRNAにのみハイブリダイズする
rRNAに相補的なDNA配列を含むクローン。
【0125】(e)できるだけ多くの異なる生体に由来
するrRNAにハイブリダイズするrRNAに相補的な
DNA配列を含むクローン。
するrRNAにハイブリダイズするrRNAに相補的な
DNA配列を含むクローン。
【0126】上述のクローン選択の図式は、多数の可能
な図式の一つに過ぎない。
な図式の一つに過ぎない。
【0127】Maniatis等(前出)が論じた標準的クロー
ニングおよびスクリーニング法が用いられる。
ニングおよびスクリーニング法が用いられる。
【0128】(5)(a)各クローンのDNAを大量に
生産する。各クローンのDNAから、rRNAに相補的
なDNA配列だけを単離して精製する。このためには、
例えばManiatis等の方法のような多くの既存法の中から
一方法を選んで行う。
生産する。各クローンのDNAから、rRNAに相補的
なDNA配列だけを単離して精製する。このためには、
例えばManiatis等の方法のような多くの既存法の中から
一方法を選んで行う。
【0129】(b)場合によっては、クローン中に存在
する全DNAがプローブとして有用である。このような
場合には、クローニングベクターから単離した全DNA
を用いる。
する全DNAがプローブとして有用である。このような
場合には、クローニングベクターから単離した全DNA
を用いる。
【0130】(c)別のある場合には、rRNAに相補
的なDNA配列を含むクローニングベクターの1本鎖D
NAが、プローブとして用いられる。そのような場合に
は、Maniatis等が記載したような多くの方法の中の一つ
を用いて、この鎖を単離して精製しなければならない。
的なDNA配列を含むクローニングベクターの1本鎖D
NAが、プローブとして用いられる。そのような場合に
は、Maniatis等が記載したような多くの方法の中の一つ
を用いて、この鎖を単離して精製しなければならない。
【0131】(6)(5a)(5b)(5c)で得られ
たプローブDNAには、アッセイ混合物中で同定できる
ように、何らかの方法で標識をつけなければならない。
多くの種類のマーカーを用いることができるが、最もよ
く使われるマーカーは、放射能である。その他のものと
して、蛍光、酵素、ビオチンがある。DNAにマーカー
をつけるためには、Maniatis等(前出)が示したような
標準法が用いられる (7)クローニングベクターにある群特異的rRNA遺
伝子配列は、2本鎖の状態で存在する。これらの鎖の1
本はrRNAに相補的であってそれとハイブリダイスす
る。もう1本の鎖は、rRNAにはハイブリダイズしな
いが、rRNAに相補的な標識群特異的配列を作成する
のに用いることができる。このためには、DNA又はR
NAポリメラーゼおよび標識された核酸前駆体分子を利
用する。この酵素はその標識前駆体を利用し、鋳型とし
てそのDNA鎖を用いてDNA又はRNAを合成する。
新たに合成された標識分子はrRNAに相補的であり、
群特異的プローブとして用いることができる。鋳型DN
Aは種々の確立された手段によって除去することがで
き、1本鎖の標識核酸のみが残る。これは、Maniatiset
al.(前出)およびTaylor等の論文Biochemica & Biophy
s. Acta(1976) 442,p.324 に記載されている。
たプローブDNAには、アッセイ混合物中で同定できる
ように、何らかの方法で標識をつけなければならない。
多くの種類のマーカーを用いることができるが、最もよ
く使われるマーカーは、放射能である。その他のものと
して、蛍光、酵素、ビオチンがある。DNAにマーカー
をつけるためには、Maniatis等(前出)が示したような
標準法が用いられる (7)クローニングベクターにある群特異的rRNA遺
伝子配列は、2本鎖の状態で存在する。これらの鎖の1
本はrRNAに相補的であってそれとハイブリダイスす
る。もう1本の鎖は、rRNAにはハイブリダイズしな
いが、rRNAに相補的な標識群特異的配列を作成する
のに用いることができる。このためには、DNA又はR
NAポリメラーゼおよび標識された核酸前駆体分子を利
用する。この酵素はその標識前駆体を利用し、鋳型とし
てそのDNA鎖を用いてDNA又はRNAを合成する。
新たに合成された標識分子はrRNAに相補的であり、
群特異的プローブとして用いることができる。鋳型DN
Aは種々の確立された手段によって除去することがで
き、1本鎖の標識核酸のみが残る。これは、Maniatiset
al.(前出)およびTaylor等の論文Biochemica & Biophy
s. Acta(1976) 442,p.324 に記載されている。
【0132】方法B
いくつかの酵素は、全rRNA配列に相補的な標識DN
Aを合成するための鋳型として任意の起源のrRNAを
利用することができる。特定種類の生物のrRNAのみ
に相補的な群特異的配列は、ハイブリダイゼーション選
択プロセスによって単離することができる。合成した標
識DNAのうち、特定の種類の生物のメンバー由来のr
RNAのみにハイブリダイズするものは、標準的ハイブ
リダイゼーション法によって単離できる。このプロセス
の一例を後に記す。このようなプローブは、方法Aに記
述したようにクローン化するのに十分な量で作成するこ
とができる。このクローンの塩基配列は標準化によって
決定でき、その配列は、標準法を使用する化学的合成に
よってプローブを調製するために用いることができる。
Aを合成するための鋳型として任意の起源のrRNAを
利用することができる。特定種類の生物のrRNAのみ
に相補的な群特異的配列は、ハイブリダイゼーション選
択プロセスによって単離することができる。合成した標
識DNAのうち、特定の種類の生物のメンバー由来のr
RNAのみにハイブリダイズするものは、標準的ハイブ
リダイゼーション法によって単離できる。このプロセス
の一例を後に記す。このようなプローブは、方法Aに記
述したようにクローン化するのに十分な量で作成するこ
とができる。このクローンの塩基配列は標準化によって
決定でき、その配列は、標準法を使用する化学的合成に
よってプローブを調製するために用いることができる。
【0133】方法C
種々異なる生物から得たrRNAのヌクレオチド配列が
すでに決定されている。特定の生物群に類似している群
特異的配列は、これら既知の配列を比較することによっ
て同定できる。その後、この群特異的rRNA配列に相
補的な配列を、標準法によって化学合成して標識するこ
とができる。
すでに決定されている。特定の生物群に類似している群
特異的配列は、これら既知の配列を比較することによっ
て同定できる。その後、この群特異的rRNA配列に相
補的な配列を、標準法によって化学合成して標識するこ
とができる。
【0134】tRNAに相補的な特異的プローブの調製
tRNAに対する特異的プローブを作るためにはいろい
ろなアプローチをとることができ、rRNAに対するプ
ローブ作成のための上記基本的アプローチを、tRNA
に対するプローブ調製のために用いることができる。個
々のtRNA種および遺伝子を単離するためには標準法
が利用でき、これは当業者には公知である。プローブの
形態はDNAでもRNAでもよく、プローブの長さは1
2〜数千塩基にできる。プローブは、それが特異的であ
る核酸(即ち標的核酸)に完全に相補的である必要はな
い。また、プローブの全長が標的分子に相補的である必
要はない。
ろなアプローチをとることができ、rRNAに対するプ
ローブ作成のための上記基本的アプローチを、tRNA
に対するプローブ調製のために用いることができる。個
々のtRNA種および遺伝子を単離するためには標準法
が利用でき、これは当業者には公知である。プローブの
形態はDNAでもRNAでもよく、プローブの長さは1
2〜数千塩基にできる。プローブは、それが特異的であ
る核酸(即ち標的核酸)に完全に相補的である必要はな
い。また、プローブの全長が標的分子に相補的である必
要はない。
【0135】mRNA,hnRNA,snRNA又はp
sRNAに相補的な特異的プローブの調製 rRNAに相補的な特異的プローブを作成するのに用い
た同じ基本的アプローチを用いて特定種類のmRNA,
hnRNA,snRNA又はpsRNAに対して特異的
なプローブを調製することができる。それぞれの種類の
RNAを単離し、それを更に分画する方法は当業者には
公知である。ここでも、プローブの形態はDNAでもR
NAでもよく、プローブの長さは、約12〜数千塩基の
範囲で変えられる。また、プローブの相補的領域は標的
核酸に完全に相補的である必要はなく、プローブの全長
が標的分子に相補的である必要はない。
sRNAに相補的な特異的プローブの調製 rRNAに相補的な特異的プローブを作成するのに用い
た同じ基本的アプローチを用いて特定種類のmRNA,
hnRNA,snRNA又はpsRNAに対して特異的
なプローブを調製することができる。それぞれの種類の
RNAを単離し、それを更に分画する方法は当業者には
公知である。ここでも、プローブの形態はDNAでもR
NAでもよく、プローブの長さは、約12〜数千塩基の
範囲で変えられる。また、プローブの相補的領域は標的
核酸に完全に相補的である必要はなく、プローブの全長
が標的分子に相補的である必要はない。
【0136】試料核酸の単離
先行技術の標準法を用いて、アッセイすべき試料から核
酸を単離することができる。核酸の単離および精製の標
準法の一つを後述の実施例で示す。これは、Maniatis e
t al.(前出)も論じられている。
酸を単離することができる。核酸の単離および精製の標
準法の一つを後述の実施例で示す。これは、Maniatis e
t al.(前出)も論じられている。
【0137】精製段階を行うことなく核酸を溶液内ハイ
ブリダイゼーションに使用可能にする新しい技法を次に
述べる。
ブリダイゼーションに使用可能にする新しい技法を次に
述べる。
【0138】核酸ハイブリダイゼーションの実施
標識プローブの適当量を試料核酸と混ぜる。この混合物
を特定の塩濃度に調節する(普通はNaClが使われ
る)。混合物全体を一定温度で一定時間インキュベート
する。この時間の終わりに、混合物をハイブリダイゼー
ションアッセイにより分析する。核酸ハイブリダイゼー
ションをおこす塩、溶媒、核酸濃度、容量、温度の多数
の異なる組み合わせが存在する。好ましい組み合わせ
は、そのアッセイの実施状況による。しかし重要なこと
は、ハイブリダイゼーション段階の基準(「定義」参
照)が群プローブを同定し選択する時に用いた基準と一
致することである。もし、ハイブリダイゼーション段階
の基準が異なるならば、プローブの特異性は変るかも知
れない。Britten とKohne 「Repeated Sequences in D
NA」Science(1968) 161, p.529、WetmurとDavidson
「Kinetics of Renaturationof DNA」J. Mol. Biol.
(1968) 31, p.349 、Kohne とBritten 「Hydroxyapatit
e Techniques for Nucleic Acid Reassociation」、Har
perとRow 、「核酸研究法」(1971) Cantoni & Davies
編、2巻、 500ページ参照。
を特定の塩濃度に調節する(普通はNaClが使われ
る)。混合物全体を一定温度で一定時間インキュベート
する。この時間の終わりに、混合物をハイブリダイゼー
ションアッセイにより分析する。核酸ハイブリダイゼー
ションをおこす塩、溶媒、核酸濃度、容量、温度の多数
の異なる組み合わせが存在する。好ましい組み合わせ
は、そのアッセイの実施状況による。しかし重要なこと
は、ハイブリダイゼーション段階の基準(「定義」参
照)が群プローブを同定し選択する時に用いた基準と一
致することである。もし、ハイブリダイゼーション段階
の基準が異なるならば、プローブの特異性は変るかも知
れない。Britten とKohne 「Repeated Sequences in D
NA」Science(1968) 161, p.529、WetmurとDavidson
「Kinetics of Renaturationof DNA」J. Mol. Biol.
(1968) 31, p.349 、Kohne とBritten 「Hydroxyapatit
e Techniques for Nucleic Acid Reassociation」、Har
perとRow 、「核酸研究法」(1971) Cantoni & Davies
編、2巻、 500ページ参照。
【0139】ハイブリダイゼーション混合物中のプロー
ブおよび試料核酸の量に関して、2つの異なるアプロー
チが用いられる。その一つ、過剰プローブ法では、試料
核酸(この場合RNA)より多量のプローブが存在す
る。もう一つの方法、過剰RNA法では、プローブより
多量のrRNAが存在する。過剰プローブ法は、未知の
試料中のRNAの存在を検出するすぐれた方法であり、
以下の述べるようないくつかの利点を有する。この二つ
のアプローチの詳細については後記表2および表3を参
照されたい。過剰プローブ法を用いると、もし適切なR
NAプローブが使えるならば、検出および定量は一回の
実験室アッセイで行うことができる。ハイブリダイゼー
ションが完了したなら、ハイブリダイズしたプローブの
量が試料中に存在するRNA量の直接の尺度となる。
ブおよび試料核酸の量に関して、2つの異なるアプロー
チが用いられる。その一つ、過剰プローブ法では、試料
核酸(この場合RNA)より多量のプローブが存在す
る。もう一つの方法、過剰RNA法では、プローブより
多量のrRNAが存在する。過剰プローブ法は、未知の
試料中のRNAの存在を検出するすぐれた方法であり、
以下の述べるようないくつかの利点を有する。この二つ
のアプローチの詳細については後記表2および表3を参
照されたい。過剰プローブ法を用いると、もし適切なR
NAプローブが使えるならば、検出および定量は一回の
実験室アッセイで行うことができる。ハイブリダイゼー
ションが完了したなら、ハイブリダイズしたプローブの
量が試料中に存在するRNA量の直接の尺度となる。
【0140】プローブが少しでもハイブリダイズすると
いう事実はRNAが存在することを示しており、ハイブ
リダイズしたプローブの量は試料中にあるRNAの量を
示す。
いう事実はRNAが存在することを示しており、ハイブ
リダイズしたプローブの量は試料中にあるRNAの量を
示す。
【0141】ハイブリダイゼーションが或る既知の時間
内に完了したことを確かめることは、RNAの定量のた
めに重要である。これは、ハイブリダイゼーションが所
定の時間内に確実に完了するように十分な量のプローブ
を加えることによって、容易に達成される。プローブを
多く加えれは加える程、ハイブリダイゼーションが速く
完了する。このように、過剰プローブ法は、ハイブリダ
イゼーションを確実に完了させ、これがいつおこったか
を知る手段を提供する。
内に完了したことを確かめることは、RNAの定量のた
めに重要である。これは、ハイブリダイゼーションが所
定の時間内に確実に完了するように十分な量のプローブ
を加えることによって、容易に達成される。プローブを
多く加えれは加える程、ハイブリダイゼーションが速く
完了する。このように、過剰プローブ法は、ハイブリダ
イゼーションを確実に完了させ、これがいつおこったか
を知る手段を提供する。
【0142】これに対して、過剰rRNA法を用いる
と、一回の実験室アッセイではRNAの検出および定量
が行えない。過剰RNA法では、いつテストポイントを
とるべきかを予想することができない。少量のRNAを
含む未知の試料は、多量のRNAを含む試料よりずっと
ゆっくりハイブリダイズする。
と、一回の実験室アッセイではRNAの検出および定量
が行えない。過剰RNA法では、いつテストポイントを
とるべきかを予想することができない。少量のRNAを
含む未知の試料は、多量のRNAを含む試料よりずっと
ゆっくりハイブリダイズする。
【0143】ハイブリダイゼーションアッセイ
特定の群のRNAが試料中に存在するというシグナル
は、2本鎖標識プローブの存在である。文献中でよく論
じられている多くの種々の方法がハイブリダイゼーショ
ン混合物中の2本鎖型の標識プローブの存在をアッセイ
するのに用いられる。方法の選択は、ハイブリダイゼー
ション段階のために選ばれた方法、ハイブリダイゼーシ
ョン混合物の組成、プローブ上のマーカーの種類および
その他の要因に依存する。一般に用いられる方法の一つ
を後述する。ここでも又、WetmurとDavidson、Kohne と
Britten 、およびThomas等の文献(前出)も参照された
い。又、Flavell 等の論文「Eur. J.Biochem. 」(1974)
47, p.535)、Maxwell 等の論文「Nucleic Acids Resear
ch」 (1978), 5, 2033ページも参照されたい。
は、2本鎖標識プローブの存在である。文献中でよく論
じられている多くの種々の方法がハイブリダイゼーショ
ン混合物中の2本鎖型の標識プローブの存在をアッセイ
するのに用いられる。方法の選択は、ハイブリダイゼー
ション段階のために選ばれた方法、ハイブリダイゼーシ
ョン混合物の組成、プローブ上のマーカーの種類および
その他の要因に依存する。一般に用いられる方法の一つ
を後述する。ここでも又、WetmurとDavidson、Kohne と
Britten 、およびThomas等の文献(前出)も参照された
い。又、Flavell 等の論文「Eur. J.Biochem. 」(1974)
47, p.535)、Maxwell 等の論文「Nucleic Acids Resear
ch」 (1978), 5, 2033ページも参照されたい。
【0144】しかし、すべての場合に重要なことは、ハ
イブリダイゼーション反応のために用いたと同じ基準
か、ハイブリダイゼーションがおこり得ない基準のどち
らかでアッセイを行うことである。
イブリダイゼーション反応のために用いたと同じ基準
か、ハイブリダイゼーションがおこり得ない基準のどち
らかでアッセイを行うことである。
【0145】核酸ハイブリダイゼーションによる核酸配
列の定量 試料中にある核酸の量は、当業者によく知られている方
法を用いて核酸ハイブリダイゼーションによるいくつか
の方法で測定することができる。2つの方法を、rRN
Aの定量例により後に開示する。
列の定量 試料中にある核酸の量は、当業者によく知られている方
法を用いて核酸ハイブリダイゼーションによるいくつか
の方法で測定することができる。2つの方法を、rRN
Aの定量例により後に開示する。
【0146】本発明の方法は、RNA又はDNAを含む
生物の存否を決定することが必要な場合に広く一般に用
いられ、略痰、血清、その他の動物体液および組織のよ
うな生物学的試料や、工業的または製剤的試料および水
にも適用できるものと理解されたい。このアプローチの
詳細はRNAを定量するのかDNAを定量するのかによ
って変るが、一般的アプローチはDNA、RNA両方共
同じである。
生物の存否を決定することが必要な場合に広く一般に用
いられ、略痰、血清、その他の動物体液および組織のよ
うな生物学的試料や、工業的または製剤的試料および水
にも適用できるものと理解されたい。このアプローチの
詳細はRNAを定量するのかDNAを定量するのかによ
って変るが、一般的アプローチはDNA、RNA両方共
同じである。
【0147】
【表2】
【0148】
【表3】
【0149】特定の起源から得たrRNA配列の特定の
部分のみに相補的な選択プローブを使用してrRNAを
検出することと、特定の起源から得たrRNA配列の全
体に相補的な非選定プローブを使用してrRNAを検出
することとの対比 rRNAを検出し、定量し、同定するためにrRNA配
列の特定の部分のみに相補的な特別に選択したプローブ
を使用する場合の本発明は、rRNAを検出するために
全rRNA配列に相補的な(特別には)選択されていな
いプローブ又は配列を使用する場合の本発明と比べて、
重要な能力と利点を有する。過剰rRNA及び過剰プロ
ーブを用いるハイブリダイゼーション法で、選択された
プローブを使用することの利点を下記に示す。配列全体
を利用するプローブを使用することの問題も示した。
部分のみに相補的な選択プローブを使用してrRNAを
検出することと、特定の起源から得たrRNA配列の全
体に相補的な非選定プローブを使用してrRNAを検出
することとの対比 rRNAを検出し、定量し、同定するためにrRNA配
列の特定の部分のみに相補的な特別に選択したプローブ
を使用する場合の本発明は、rRNAを検出するために
全rRNA配列に相補的な(特別には)選択されていな
いプローブ又は配列を使用する場合の本発明と比べて、
重要な能力と利点を有する。過剰rRNA及び過剰プロ
ーブを用いるハイブリダイゼーション法で、選択された
プローブを使用することの利点を下記に示す。配列全体
を利用するプローブを使用することの問題も示した。
【0150】過剰プローブハイブリダイゼーション及び
過剰rRNAハイブリダイゼーションに関して、配列全
体に対応するプローブを用いる場合と比較して、選択し
たプローブを用いることの利点を下記に示す。
過剰rRNAハイブリダイゼーションに関して、配列全
体に対応するプローブを用いる場合と比較して、選択し
たプローブを用いることの利点を下記に示す。
【0151】A 過剰プローブハイブリダイゼーション
法 1 rRNAの全配列に対応するプローブについての問
題点 (1)過剰プローブ法によって試料中のrRNAを検出
することはできる。しかし、存在するrRNAの型を決
定する手段はない。従って、このプローブは、過剰プロ
ーブハイブリダイゼーション法によって未知試料中の特
定rRNAの存在を特異的に検出し、定量するためには
使えない。
法 1 rRNAの全配列に対応するプローブについての問
題点 (1)過剰プローブ法によって試料中のrRNAを検出
することはできる。しかし、存在するrRNAの型を決
定する手段はない。従って、このプローブは、過剰プロ
ーブハイブリダイゼーション法によって未知試料中の特
定rRNAの存在を特異的に検出し、定量するためには
使えない。
【0152】(2)上述のように、このプローブで試料
中の特定のrRNAの存在を検出し定量するためには、
過剰プローブ法は使えない。この目的のためには、この
プローブは過剰rRNA法で使用しなければならない。
中の特定のrRNAの存在を検出し定量するためには、
過剰プローブ法は使えない。この目的のためには、この
プローブは過剰rRNA法で使用しなければならない。
【0153】過剰rRNA法は過剰プローブ法よりずっ
と多くの時間と作業を必要とし、複雑である。
と多くの時間と作業を必要とし、複雑である。
【0154】2 選択されたプローブを使用することの
利点 (1)選択されたプローブ過剰ハイブリダイゼーション
法によって未知試料中の特定rRNAの存在を敏感かつ
特異的に検出し、定量するために使用することができ
る。これは他の生物のrRNAが存在していても一回の
実験室アッセイで行いうる。
利点 (1)選択されたプローブ過剰ハイブリダイゼーション
法によって未知試料中の特定rRNAの存在を敏感かつ
特異的に検出し、定量するために使用することができ
る。これは他の生物のrRNAが存在していても一回の
実験室アッセイで行いうる。
【0155】(2)選択されたプローブを使用すると、
未知試料中の特定のrRNAの存在を検出して定量する
ために、過剰プローブ法を使用することができる。この
ことは仕事を非常に単純化する。
未知試料中の特定のrRNAの存在を検出して定量する
ために、過剰プローブ法を使用することができる。この
ことは仕事を非常に単純化する。
【0156】B 過剰rRNAハイブリダイゼーション
法 1 全配列に対応するプローブについての問題点 (1)このプローブを用いて未知試料中のrRNAを検
出することはできる。しかし、多くの場合、存在するr
RNAの型又は量を決定するための手段はない。従っ
て、このプローブは、未知試料中の特定のrRNAの存
在を特異的に検出し、定量するためには使えない場合が
多い。
法 1 全配列に対応するプローブについての問題点 (1)このプローブを用いて未知試料中のrRNAを検
出することはできる。しかし、多くの場合、存在するr
RNAの型又は量を決定するための手段はない。従っ
て、このプローブは、未知試料中の特定のrRNAの存
在を特異的に検出し、定量するためには使えない場合が
多い。
【0157】(2)特定のrRNAを検出する感度は他
の生物のrRNAが存在することにより限定される場合
が多い。
の生物のrRNAが存在することにより限定される場合
が多い。
【0158】(3)特定のrRNAの存在を検出し、定
量することが可能な多くの場合、この方法では多くの作
業が必要となる。
量することが可能な多くの場合、この方法では多くの作
業が必要となる。
【0159】2 選択されたプローブを使用することの
利点 (1)選択されたプローブは、全ての状況で未知試料中
の特定rRNAの存在を特異的に検出し、定量するため
に用いることができる。これは他の生物のrRNAが多
量に存在していても実施できる。
利点 (1)選択されたプローブは、全ての状況で未知試料中
の特定rRNAの存在を特異的に検出し、定量するため
に用いることができる。これは他の生物のrRNAが多
量に存在していても実施できる。
【0160】(2)選択されたプローブを用いると、他
の生物のrRNAが存在していても、特定のrRNAの
検出感度は下がらない。
の生物のrRNAが存在していても、特定のrRNAの
検出感度は下がらない。
【0161】(3)選択されたプローブを用いると特定
rRNAの検出と定量がずっと容易になる。
rRNAの検出と定量がずっと容易になる。
【0162】
【実施例】実施例による具体的説明
試料が特定の群のメンバーの菌を含むかどうかを決定す
るために、本発明は使用できる。下記に具体的に示す本
発明方法は、特定の群のメンバーでない多数の生物が存
在しても試料中の特定の群の細菌の存在を検出し、定量
化し得る方法である。
るために、本発明は使用できる。下記に具体的に示す本
発明方法は、特定の群のメンバーでない多数の生物が存
在しても試料中の特定の群の細菌の存在を検出し、定量
化し得る方法である。
【0163】実施例に記載されているように、本発明の
方法は、先ず特定の基準においては、関心のある特定群
のどのメンバーからのrRNAともハイブリダイズ化す
るが他の生物から得られたrRNAとはハイブリダイズ
化しないrRNAに対する群特異的プローブを調製する
ことである。核酸ハイブリダイゼーション試験にそのよ
うなプローブを使用すると、他の生物が多量に存在して
も特定群のメンバーを検出できる。
方法は、先ず特定の基準においては、関心のある特定群
のどのメンバーからのrRNAともハイブリダイズ化す
るが他の生物から得られたrRNAとはハイブリダイズ
化しないrRNAに対する群特異的プローブを調製する
ことである。核酸ハイブリダイゼーション試験にそのよ
うなプローブを使用すると、他の生物が多量に存在して
も特定群のメンバーを検出できる。
【0164】下記に本発明の実施例を示す。各々の例
は、特定群の生物のRNAとのみハイブリダイズする標
識核酸プローブを調製することを含む。
は、特定群の生物のRNAとのみハイブリダイズする標
識核酸プローブを調製することを含む。
【0165】各々のプローブを調製する方法の基礎的な
概略は次の通りである。
概略は次の通りである。
【0166】1 関心のある群のrRNAに相補的な標
識核酸を調製する。
識核酸を調製する。
【0167】2 このDNAをプローブが特異的な生物
群に進化的に非常に近接した生物群から得たrRNAと
ハイブリダイズさせ、特異的な基準下では最も近接した
関連群の生物から得たrRNAとはハイブリダイズしな
い標識核酸フラクションを選択する。このフラクション
は関心ある生物群のrRNAに特異的であり、多くの近
接した群又は他の生物から得たrRNAとはハイブリダ
イズしない。
群に進化的に非常に近接した生物群から得たrRNAと
ハイブリダイズさせ、特異的な基準下では最も近接した
関連群の生物から得たrRNAとはハイブリダイズしな
い標識核酸フラクションを選択する。このフラクション
は関心ある生物群のrRNAに特異的であり、多くの近
接した群又は他の生物から得たrRNAとはハイブリダ
イズしない。
【0168】[実施例1]いかなる細菌のrRNAともハイブリダイズするプロー
ブの調製 代表的な状況では、組織培養用プレート上1回に106
〜107 個の哺乳動物の細胞が成育する。細菌、特にMo
llicutes網のメンバーは組織培養細胞を汚染する。他の
多くの細菌と異なり、Mollicutes網の細菌は抗生物質に
よっては容易に除去されず、組織培養上の困難な汚染菌
である。組織培養細胞中に多くのMollicutes種も検出さ
れてきた。組織培養用プレートにこれらの生物が1個で
も存在すれば、抗生物質が存在しても、増殖し、細胞あ
たり数百個の生物が作られる可能性がある。そのような
生物は細胞の活性を変化させる能力があり、その際、多
くの試験結果と組織培養の市場性に影響する。
ブの調製 代表的な状況では、組織培養用プレート上1回に106
〜107 個の哺乳動物の細胞が成育する。細菌、特にMo
llicutes網のメンバーは組織培養細胞を汚染する。他の
多くの細菌と異なり、Mollicutes網の細菌は抗生物質に
よっては容易に除去されず、組織培養上の困難な汚染菌
である。組織培養細胞中に多くのMollicutes種も検出さ
れてきた。組織培養用プレートにこれらの生物が1個で
も存在すれば、抗生物質が存在しても、増殖し、細胞あ
たり数百個の生物が作られる可能性がある。そのような
生物は細胞の活性を変化させる能力があり、その際、多
くの試験結果と組織培養の市場性に影響する。
【0169】これらの生物を検出するための先行技術
は、増殖試験、鑑別染色試験及び免疫学的アッセイのよ
うな基本的に定性的な試験を含んでいる。
は、増殖試験、鑑別染色試験及び免疫学的アッセイのよ
うな基本的に定性的な試験を含んでいる。
【0170】増殖試験の感受性はきわめて高いが、3〜
6週間かかる。増殖試験は、多くの生物の増殖が困難で
あるか又は不可能であるという別の不便さもある。
6週間かかる。増殖試験は、多くの生物の増殖が困難で
あるか又は不可能であるという別の不便さもある。
【0171】染色法の実際の検出上の感度は知られてい
ないが、細胞あたり数個以上の生物が存在しているはず
であることが知られている。
ないが、細胞あたり数個以上の生物が存在しているはず
であることが知られている。
【0172】免疫学的試験は定性的であり、特定の種に
対する抗体を用いる。免疫学的試験は迅速に行うことが
できるが感度は高くない。さらに、全てのタイプのMoll
icutesを検出するためには、多くの異なる抗体が必要で
ある。
対する抗体を用いる。免疫学的試験は迅速に行うことが
できるが感度は高くない。さらに、全てのタイプのMoll
icutesを検出するためには、多くの異なる抗体が必要で
ある。
【0173】下記に示される本発明方法の実施はMollic
utesを含む全ての細菌群の菌の存在を検出し、定量し、
組織培養中Mollicutesの存在を検出し、通常は細菌を含
まない組織中の細菌の存在を検出し、多数の哺乳動物の
細胞が存在しても細菌を検出するために用いる試験であ
る。
utesを含む全ての細菌群の菌の存在を検出し、定量し、
組織培養中Mollicutesの存在を検出し、通常は細菌を含
まない組織中の細菌の存在を検出し、多数の哺乳動物の
細胞が存在しても細菌を検出するために用いる試験であ
る。
【0174】実施例に示すように、本発明方法は先ず第
1に何らかの細胞由来rRNAに相補的であるが、哺乳
類細胞のrRNAには相補的でないrRNAに対する特
異的プローブを作ることを含む。核酸ハイブリダイゼー
ションテストにおけるそのようなプローブの使用は、多
量の哺乳類細胞の存在下でもあらゆるタイプの細菌の検
出を可能にする。
1に何らかの細胞由来rRNAに相補的であるが、哺乳
類細胞のrRNAには相補的でないrRNAに対する特
異的プローブを作ることを含む。核酸ハイブリダイゼー
ションテストにおけるそのようなプローブの使用は、多
量の哺乳類細胞の存在下でもあらゆるタイプの細菌の検
出を可能にする。
【0175】次に本発明のこの実施例の詳細をあげる。
【0176】哺乳類細胞および細菌細胞からのrRNA
の分離 哺乳類細胞を、0.3M NaCl、0.02Mトリス
pH=7.4に再懸濁する。サルコシルを最終濃度1%
になるように加えて、細胞を溶解する。
の分離 哺乳類細胞を、0.3M NaCl、0.02Mトリス
pH=7.4に再懸濁する。サルコシルを最終濃度1%
になるように加えて、細胞を溶解する。
【0177】溶解後直ちに、フェノール/クロロホルム
1/1混液を同量加え、生成した混液を2分間烈しく振
盪する。その後、混液を遠沈し(8000×g、10分
間)水相と有機相とを分離する。水相を回収し、これに
又別のフェノール/クロロホルムの同量を加える。
1/1混液を同量加え、生成した混液を2分間烈しく振
盪する。その後、混液を遠沈し(8000×g、10分
間)水相と有機相とを分離する。水相を回収し、これに
又別のフェノール/クロロホルムの同量を加える。
【0178】上のように振盪、遠沈した後、水相を再び
回収する。これに2倍量の95%エタノールを加え、こ
の混合物を−20℃で2時間放置して、核酸の沈澱を容
易ならしめる。
回収する。これに2倍量の95%エタノールを加え、こ
の混合物を−20℃で2時間放置して、核酸の沈澱を容
易ならしめる。
【0179】それから、混合物で遠沈し(8000×
g、10分間)、沈降物をチューブの底に沈澱させる。
液は除去する。ペレットとなった核酸を水に再溶解す
る。この溶液に、その後、0.2M NaCl、5×1
0-3M MgCl2 、5×10-3M CaCl2 、0.
02Mトリス(pH=7.4)50マイクログラム/m
lのデオキシリボヌクレアーゼIを加え、37℃で1時
間インキュベートする。
g、10分間)、沈降物をチューブの底に沈澱させる。
液は除去する。ペレットとなった核酸を水に再溶解す
る。この溶液に、その後、0.2M NaCl、5×1
0-3M MgCl2 、5×10-3M CaCl2 、0.
02Mトリス(pH=7.4)50マイクログラム/m
lのデオキシリボヌクレアーゼIを加え、37℃で1時
間インキュベートする。
【0180】それから、上のように、等量のフェノール
/クロロホルムを加えて振盪する。上記のように遠沈し
水相を回収する。エタノールは、上記のようにRNAを
沈澱させる。上記のように沈降物を遠沈し、ペレットR
NAを水に再溶解する。
/クロロホルムを加えて振盪する。上記のように遠沈し
水相を回収する。エタノールは、上記のようにRNAを
沈澱させる。上記のように沈降物を遠沈し、ペレットR
NAを水に再溶解する。
【0181】この溶液を2M LiClにする。そして
4℃で10〜20時間放置し、高分子量RNAの沈澱を
容易にする。これからこの溶液に遠沈し、沈澱物を回収
し、水に再溶解する。
4℃で10〜20時間放置し、高分子量RNAの沈澱を
容易にする。これからこの溶液に遠沈し、沈澱物を回収
し、水に再溶解する。
【0182】このRNA標本は、95%以上のrRNA
を含む。
を含む。
【0183】細菌のrRNAは、下記の事項を除けば、
同様にして分離される。界面活性剤のみでは細菌が溶解
されない場合、その他の手段を用いる。これには一般的
には、細菌がサルコシルによる溶解を受けやすくするた
めに細菌を酵素(リゾチーム)で前処理すること等であ
る。細菌溶解後は、分離操作は前述の通りである。
同様にして分離される。界面活性剤のみでは細菌が溶解
されない場合、その他の手段を用いる。これには一般的
には、細菌がサルコシルによる溶解を受けやすくするた
めに細菌を酵素(リゾチーム)で前処理すること等であ
る。細菌溶解後は、分離操作は前述の通りである。
【0184】精製rRNAを、−70℃で貯える。
【0185】モレキュート網生物のrRNAに相補的な
放射性DNA( 3H−cDNA)の調製 Mycoplasma hominis(M.hominis 種)(分類学的には、
モレキュート網のメンバーである)に由来するrRNA
を鋳型として用いて、マイコプラズマ・ホミニスrRN
Aに相補的な放射性cDNAを合成する。
放射性DNA( 3H−cDNA)の調製 Mycoplasma hominis(M.hominis 種)(分類学的には、
モレキュート網のメンバーである)に由来するrRNA
を鋳型として用いて、マイコプラズマ・ホミニスrRN
Aに相補的な放射性cDNAを合成する。
【0186】このcDNAは、鋳型としてrRNAを利
用し、rRNAの相補的な(cDNA)、 2H−cDN
Aをつくることができる逆転写酵素の性質を利用するこ
とによって生産される。
用し、rRNAの相補的な(cDNA)、 2H−cDN
Aをつくることができる逆転写酵素の性質を利用するこ
とによって生産される。
【0187】逆転写酵素反応混合物は、次のものを含
む。
む。
【0188】50mMトリス・HCl(pH=8.
3)、8mM MgCl2 、0.4mMジチオトレイト
ール、50mM KCl、0.1mM 3H−デオキシチ
ミジン三燐酸(50curies/mmole)0.2mMデオキシ
アデノシン三燐酸、0.2mMデオキシシチジン三燐
酸、0.2mMデオキシグアノシン三燐酸、E.coliD
NAからつくられたオリゴデオキシリボヌクレオタイド
プライマ200ミリグラム/ml、50マイクログラム
/mlのマイコプラズマ・ホミニスrRNA、50単位
/mlAMVの逆転写酵素。
3)、8mM MgCl2 、0.4mMジチオトレイト
ール、50mM KCl、0.1mM 3H−デオキシチ
ミジン三燐酸(50curies/mmole)0.2mMデオキシ
アデノシン三燐酸、0.2mMデオキシシチジン三燐
酸、0.2mMデオキシグアノシン三燐酸、E.coliD
NAからつくられたオリゴデオキシリボヌクレオタイド
プライマ200ミリグラム/ml、50マイクログラム
/mlのマイコプラズマ・ホミニスrRNA、50単位
/mlAMVの逆転写酵素。
【0189】この混合物を、40℃で30分間インキュ
ベートする。それから、エチレンジアミン四酢酸(ED
TA)(pH=7.3)、ドデシル硫酸ナトリウム(S
DS)、NaClおよびグリコーゲンを最終濃度がそれ
ぞれ10-2M、1%、0.3M、100μg/mlにな
るように加える。
ベートする。それから、エチレンジアミン四酢酸(ED
TA)(pH=7.3)、ドデシル硫酸ナトリウム(S
DS)、NaClおよびグリコーゲンを最終濃度がそれ
ぞれ10-2M、1%、0.3M、100μg/mlにな
るように加える。
【0190】その溶液を、フェノール/クロロホルム
(1:1)の1容量と混合し、2分間烈しく振盪し、そ
れから遠沈して(8000×g、10分間)、水相を回
収する。
(1:1)の1容量と混合し、2分間烈しく振盪し、そ
れから遠沈して(8000×g、10分間)、水相を回
収する。
【0191】2.5容量の95%エタノールを加えて、
核酸を沈澱させる。遠沈により沈澱物を回収し、H2 O
に再溶解する。この溶液は、鋳型rRNAと新たに合成
された 3H−cDNAとを含む。
核酸を沈澱させる。遠沈により沈澱物を回収し、H2 O
に再溶解する。この溶液は、鋳型rRNAと新たに合成
された 3H−cDNAとを含む。
【0192】この溶液をそれから0.3M NaOHに
して、50℃で45分間インキュベートする。水冷し、
0.3M HClで中和する。それに2.5容量の95
%エタノールを加えて、残る核酸を沈澱させ、生成した
沈澱を水に再溶解する。
して、50℃で45分間インキュベートする。水冷し、
0.3M HClで中和する。それに2.5容量の95
%エタノールを加えて、残る核酸を沈澱させ、生成した
沈澱を水に再溶解する。
【0193】この溶液を、0.3M NaCl、0.1
%サルコシルで平衡状態にしたSephadexG−100カラ
ムを通過させ、出てきた液を回収した。この液をエタノ
ールで沈澱させ、生成した沈澱物を少量の水に溶解す
る。
%サルコシルで平衡状態にしたSephadexG−100カラ
ムを通過させ、出てきた液を回収した。この液をエタノ
ールで沈澱させ、生成した沈澱物を少量の水に溶解す
る。
【0194】ここで述べたプロセスは、鋳型rRNAと
3H−cDNA製造に由来するその他の前駆物質を除去
するためのものである。
3H−cDNA製造に由来するその他の前駆物質を除去
するためのものである。
【0195】それから 3H−cDNAをマイコプラズマ
・ホミニスrRNAにハイブリダイズする。これは、そ
れが本当にこのrRNAに相補的であることを確認する
ためである。
・ホミニスrRNAにハイブリダイズする。これは、そ
れが本当にこのrRNAに相補的であることを確認する
ためである。
【0196】このハイブリダイゼーション混合物は、1
mlにつき0.05マイクログラム1本鎖 3H−cDN
A、20マイクログラムのマイコプラズマ・ホミニスr
RNAそして、0.48M PB(燐酸緩衝液)から成
る。この混合物を65℃で0.2時間インキュベート
し、これから0.14M PBに希釈して0.14MP
Bで平衡状態にしたヒドロキシアパタイト(HA)カラ
ムに65℃で通過させる。
mlにつき0.05マイクログラム1本鎖 3H−cDN
A、20マイクログラムのマイコプラズマ・ホミニスr
RNAそして、0.48M PB(燐酸緩衝液)から成
る。この混合物を65℃で0.2時間インキュベート
し、これから0.14M PBに希釈して0.14MP
Bで平衡状態にしたヒドロキシアパタイト(HA)カラ
ムに65℃で通過させる。
【0197】rRNAにハイブリダイズした 3H−cD
NAはヒドロキシアパタイト(HA)カラムに吸着し、
非ハイブリダイズ 3H−cDNAはカラムを通過する。
その後HAカラムを0.3M PBで溶出して、ハイブ
リダイズ 3H−cDNAを回収する。
NAはヒドロキシアパタイト(HA)カラムに吸着し、
非ハイブリダイズ 3H−cDNAはカラムを通過する。
その後HAカラムを0.3M PBで溶出して、ハイブ
リダイズ 3H−cDNAを回収する。
【0198】このフラクションをその後透析してPBを
除去し、エタノールで沈澱させて核酸を濃縮し、遠沈
し、核酸を水に再溶解する。この溶液を上記のようにN
aOHで処理し、rRNAを取り除く。
除去し、エタノールで沈澱させて核酸を濃縮し、遠沈
し、核酸を水に再溶解する。この溶液を上記のようにN
aOHで処理し、rRNAを取り除く。
【0199】中和し、グリコーゲン担体を添加し、エタ
ノール沈澱による濃縮後、 3H−cDNAを少量の水に
再溶解する。この溶解は、マイコプラズマ・ホミニスr
RNAに相補的な 3H−cDNAのみを含む。
ノール沈澱による濃縮後、 3H−cDNAを少量の水に
再溶解する。この溶解は、マイコプラズマ・ホミニスr
RNAに相補的な 3H−cDNAのみを含む。
【0200】マイコプラズマ・ホミニスには相補的で、
ヒトrRNAには相補的でない 3H−cDNAの選択 精製 3H−cDNAを、これを大過剰のヒトrRNA
と、ハイブリダイズすることにより更に分画化する。こ
のハイブリダイゼーション混合物は、0.48MPB1
mlあたり、0.05マイクログラム 3H−cDNAと
40マイクログラムヒトrRNAとから成る。
ヒトrRNAには相補的でない 3H−cDNAの選択 精製 3H−cDNAを、これを大過剰のヒトrRNA
と、ハイブリダイズすることにより更に分画化する。こ
のハイブリダイゼーション混合物は、0.48MPB1
mlあたり、0.05マイクログラム 3H−cDNAと
40マイクログラムヒトrRNAとから成る。
【0201】これを、68℃で1時間インキュベート
し、0.14M PBに希釈し55℃、0.14M P
Bで、平衡状態にしたHAを通す。HAに吸着しないフ
ラクション(全体の約50%)(即ちヒトrRNAにハ
イブリダイズしない 3H−cDNA)を収集する。
し、0.14M PBに希釈し55℃、0.14M P
Bで、平衡状態にしたHAを通す。HAに吸着しないフ
ラクション(全体の約50%)(即ちヒトrRNAにハ
イブリダイズしない 3H−cDNA)を収集する。
【0202】このフラクションを同じ条件で新しいHA
カラムを再び通過させる。ここでも、吸着しないフラク
ションを集める。このフラクションを透析してPBを除
き、エタノールで沈澱させて核酸を濃縮し、水に再溶解
する。この溶液を既述のようにNaOHで処理し、ヒト
rRNAを除去する。
カラムを再び通過させる。ここでも、吸着しないフラク
ションを集める。このフラクションを透析してPBを除
き、エタノールで沈澱させて核酸を濃縮し、水に再溶解
する。この溶液を既述のようにNaOHで処理し、ヒト
rRNAを除去する。
【0203】中和し、グリコーゲン担体を添加し、エタ
ノール沈澱による濃縮後、 3H−cDNAを少量の水に
再溶解する。この 3H−cDNA標本は、マイコプラズ
マ・ホミニスrRNAには相補的であるが、ヒトrRN
Aには相補的でない。
ノール沈澱による濃縮後、 3H−cDNAを少量の水に
再溶解する。この 3H−cDNA標本は、マイコプラズ
マ・ホミニスrRNAには相補的であるが、ヒトrRN
Aには相補的でない。
【0204】選択 3H−cDNAと、異なる起源からの
rRNAとのハイブリダイゼーション 選択 3H−cDNAプローブの調製は、核酸ハイブリダ
イゼーションにより細菌rRNAの存在を検出すること
によって哺乳類組織培養細胞および哺乳類組織にあるモ
リキュート網のメンバーを含む細菌を検出することを可
能にする。
rRNAとのハイブリダイゼーション 選択 3H−cDNAプローブの調製は、核酸ハイブリダ
イゼーションにより細菌rRNAの存在を検出すること
によって哺乳類組織培養細胞および哺乳類組織にあるモ
リキュート網のメンバーを含む細菌を検出することを可
能にする。
【0205】そのようなテストに必要な要件は、選択プ
ローブが細菌を含まない哺乳類細胞からのrRNAにハ
イブリダイズしてはいけないということである。この要
求が合うことは表4Vに示されている。
ローブが細菌を含まない哺乳類細胞からのrRNAにハ
イブリダイズしてはいけないということである。この要
求が合うことは表4Vに示されている。
【0206】表4のIIおよびIII は、プローブがモリキ
ュート網のすべてのメンバーを検出し、あらゆるタイプ
の細菌を検出する筈であることを示している。
ュート網のすべてのメンバーを検出し、あらゆるタイプ
の細菌を検出する筈であることを示している。
【0207】例えば、LegionellaおよびE.coliおよびBa
cillus subtilis は非常に異なる細胞のタイプの代表で
ある。そしてプローブは、これらタイプの各々からのr
RNAとハイブリダイズする。
cillus subtilis は非常に異なる細胞のタイプの代表で
ある。そしてプローブは、これらタイプの各々からのr
RNAとハイブリダイズする。
【0208】進化論的考案は、このプローブがほとんど
全ての既知又は未知の細菌に由来するrRNAにハイブ
リダイズすることを示す。これは、進化を通じてrRN
Aヌクレオチド配列が非常によく保存されているためで
ある。
全ての既知又は未知の細菌に由来するrRNAにハイブ
リダイズすることを示す。これは、進化を通じてrRN
Aヌクレオチド配列が非常によく保存されているためで
ある。
【0209】この選択プローブは、組織培養細胞中に細
菌の特異的な網、モリキュートの存在を検出するために
役に立つ。大部分の組織培養細胞では増殖培地に抗生物
質が存在し、これがモリキュート網のメンバー以外のほ
とんどすべての細菌の増殖を阻止する。
菌の特異的な網、モリキュートの存在を検出するために
役に立つ。大部分の組織培養細胞では増殖培地に抗生物
質が存在し、これがモリキュート網のメンバー以外のほ
とんどすべての細菌の増殖を阻止する。
【0210】従って、組織培養標本の汚染はモリキュー
ト網のメンバーによることはほとんど確実である。
ト網のメンバーによることはほとんど確実である。
【0211】重要な点は、存在する生物の数を測定する
ことができることである。
ことができることである。
【0212】先行技術の方法では、大抵の場合、細胞が
汚染されていることがわかると、細胞系およびその産物
は捨てられる。これら微生物を定量できれば、その汚染
による影響のひどさについて、判断を下すことができ
る。
汚染されていることがわかると、細胞系およびその産物
は捨てられる。これら微生物を定量できれば、その汚染
による影響のひどさについて、判断を下すことができ
る。
【0213】汚染は、非常に軽度で、1000個につき
たった1個の微生物であるかも知れない。この汚染レベ
ルならば細胞にほとんど影響を与えないであろうし、多
くの場合細胞産物を捨てる必要はない。それらがもっと
ひどく汚染されるまでは、貴重な細胞ラインをとってお
くような決定を下しうるかも知れない。何らかの種類の
細胞汚染の重大性を判断するためには、定量的考察が重
要である。
たった1個の微生物であるかも知れない。この汚染レベ
ルならば細胞にほとんど影響を与えないであろうし、多
くの場合細胞産物を捨てる必要はない。それらがもっと
ひどく汚染されるまでは、貴重な細胞ラインをとってお
くような決定を下しうるかも知れない。何らかの種類の
細胞汚染の重大性を判断するためには、定量的考察が重
要である。
【0214】
【表4】
【0215】過剰rRNAハイブリダイゼーションは、
68℃、0.48M PBで行われる。
68℃、0.48M PBで行われる。
【0216】ハイブリダイゼーションアッセイは、67
℃で、0.14M PB、0.005%ドデシル硫酸ナ
トリウム中で行われる。ハイブリダイズさせることは、
核rRNA又はミトコンドリアrRNAと 3H−cDN
Aの反応を完了させるだけで十分である。哺乳類および
鳥の場合には、非細菌性rRNAのCot値は最低2×
103 に達する。1〜2%の非特異的シグナルは、上記
のハイブリダイゼーション値からさし引いた。
℃で、0.14M PB、0.005%ドデシル硫酸ナ
トリウム中で行われる。ハイブリダイズさせることは、
核rRNA又はミトコンドリアrRNAと 3H−cDN
Aの反応を完了させるだけで十分である。哺乳類および
鳥の場合には、非細菌性rRNAのCot値は最低2×
103 に達する。1〜2%の非特異的シグナルは、上記
のハイブリダイゼーション値からさし引いた。
【0217】核酸ハイブリダイゼーションによるrRN
Aの定量 選択 3H−cDNAプローブと、組織から分離したRN
Aとのハイブリダイゼーションの動態を既知の標準混合
物のそれと比較することにより、試料中にある細菌rR
NAの量を測定できる。
Aの定量 選択 3H−cDNAプローブと、組織から分離したRN
Aとのハイブリダイゼーションの動態を既知の標準混合
物のそれと比較することにより、試料中にある細菌rR
NAの量を測定できる。
【0218】これは、哺乳類細胞の大過剰が存在してい
ても可能である。なぜならば、プローブはこのrRNA
とはハイブリダイズしないからである(表4V参照)。
ても可能である。なぜならば、プローブはこのrRNA
とはハイブリダイズしないからである(表4V参照)。
【0219】動態を測定するためには、ハイブリダイゼ
ーション混合物は、10-5〜10-4マイクログラムのH
−cDNAと1〜103 マイクログラムの精製RNA試
料とを、0.01〜0.1mlの0.48M PB中に
含む。
ーション混合物は、10-5〜10-4マイクログラムのH
−cDNAと1〜103 マイクログラムの精製RNA試
料とを、0.01〜0.1mlの0.48M PB中に
含む。
【0220】この混合物を68℃でインキュベートし、
一部をとり、0.14M PBに希釈して反応開始後の
種々の時間にハイブリダイゼーションアッセイを行う。
ハイブリダイゼーションアッセイは、既述のようにヒド
ロキシアパタイトを用いて行う。
一部をとり、0.14M PBに希釈して反応開始後の
種々の時間にハイブリダイゼーションアッセイを行う。
ハイブリダイゼーションアッセイは、既述のようにヒド
ロキシアパタイトを用いて行う。
【0221】得られた結果を既知量の細菌rRNAを含
む標準RNAと反応したプローブのハイブリダイゼーシ
ョンと比較する。
む標準RNAと反応したプローブのハイブリダイゼーシ
ョンと比較する。
【0222】これらの標準は、哺乳類細胞RNAと既知
量の特異的細菌rRNAとの混合物である。
量の特異的細菌rRNAとの混合物である。
【0223】組織培養細胞中のMollicutes網のメンバー
の検出および定量 表5は、選択プローブと3種類の組織培養細胞試料から
分離した(既述のようにして)RNAとをハイブリダイ
ズすることによって得られたデータである。
の検出および定量 表5は、選択プローブと3種類の組織培養細胞試料から
分離した(既述のようにして)RNAとをハイブリダイ
ズすることによって得られたデータである。
【0224】細胞系ナンバー3のみが検出可能程度に汚
染され、反応の動態は約5×107個の細菌細胞が組織
培養細胞に存在することを示している。
染され、反応の動態は約5×107個の細菌細胞が組織
培養細胞に存在することを示している。
【0225】
【表5】
【0226】過剰rRNAハイブリダイゼーションを、
68℃で0.48M PB、0.01〜0.04ml容
量で行う。各混合物は、2×105 マイクログラムの 3
H−cDNAプローブと50〜200マイクログラムの
試料RNAとを含む。
68℃で0.48M PB、0.01〜0.04ml容
量で行う。各混合物は、2×105 マイクログラムの 3
H−cDNAプローブと50〜200マイクログラムの
試料RNAとを含む。
【0227】次の実施例は、多数の血球の存在下で非常
に少数のたった1個のトリパノソーマの検出に用いられ
る、本発明の方法のもう一つの実施例である。
に少数のたった1個のトリパノソーマの検出に用いられ
る、本発明の方法のもう一つの実施例である。
【0228】原虫類Trypanosoma の或るメンバーは、人
に対して病原性を有し、東アフリカ睡眠症、西アフリカ
睡眠症、南アメリカトリパノソーマ症を含む病気を発生
させるから、トリパノソーマの検出は重要である。
に対して病原性を有し、東アフリカ睡眠症、西アフリカ
睡眠症、南アメリカトリパノソーマ症を含む病気を発生
させるから、トリパノソーマの検出は重要である。
【0229】これらの生物は大きく、生活環の段階によ
って変る特徴的な形を示す。先行技術の方法は、これら
生物をヒトに検出する場合、主として血清学的方法、鑑
別染色法を検鏡検査、動物接種法と組み合わせて利用し
ている。
って変る特徴的な形を示す。先行技術の方法は、これら
生物をヒトに検出する場合、主として血清学的方法、鑑
別染色法を検鏡検査、動物接種法と組み合わせて利用し
ている。
【0230】血清診断法は感度および特異性が変化し、
解釈がむずかしいかも知れない。検鏡法が最も多く用い
られるが、大量の血球の存在下で少数のトリパノソーマ
を見出すのは、しばしば困難である。動物接種は時間と
費用のかかる方法である。
解釈がむずかしいかも知れない。検鏡法が最も多く用い
られるが、大量の血球の存在下で少数のトリパノソーマ
を見出すのは、しばしば困難である。動物接種は時間と
費用のかかる方法である。
【0231】次の例で示す発明の実施例は、多量の血球
と共存する場合でも1個のトリパノソーマを比較的容易
に検出できる方法である。
と共存する場合でも1個のトリパノソーマを比較的容易
に検出できる方法である。
【0232】[実施例2]トリパノソーマrRNAに相補的な放射性DNAの調製
Trypanosoma brucei rRNAに相補的な放射性DNA
( 3H−cDNA)を前に詳述したM. hominis 3H−c
DNAと同じ方法で調製する。但し、Trypanosoma b.r
RNAを鋳型として用いる。
( 3H−cDNA)を前に詳述したM. hominis 3H−c
DNAと同じ方法で調製する。但し、Trypanosoma b.r
RNAを鋳型として用いる。
【0233】トリパノソーマrRNAに相補的である
が、ヒトrRNAには相補的でないトリパノソーマ 3H
−cDNAの選択 これはTrypanosoma b. 3H−cDNAをヒトrRNAに
ハイブリダイズさせることを除けば、M. hominisについ
て既述したものと同じ方法で行われる。
が、ヒトrRNAには相補的でないトリパノソーマ 3H
−cDNAの選択 これはTrypanosoma b. 3H−cDNAをヒトrRNAに
ハイブリダイズさせることを除けば、M. hominisについ
て既述したものと同じ方法で行われる。
【0234】ヒト組織、又は体液中のトリパノソーマの
検出および定量に、選択トリパノソーマ 3H−cDNA
の使用 選択 3H−cDNAプローブの調製により、トリパノソ
ーマrRNAの存在の検出によるヒト試料中のトリパノ
ソーマの検出および定量が可能になる。
検出および定量に、選択トリパノソーマ 3H−cDNA
の使用 選択 3H−cDNAプローブの調製により、トリパノソ
ーマrRNAの存在の検出によるヒト試料中のトリパノ
ソーマの検出および定量が可能になる。
【0235】そのようなテストに必要な要件は選択プロ
ーブは、トリパノソーマを含まないヒト細胞に由来する
rRNAにはハイブリダイズしてはいけないということ
である。表6はこの要求が満たされることを示す。
ーブは、トリパノソーマを含まないヒト細胞に由来する
rRNAにはハイブリダイズしてはいけないということ
である。表6はこの要求が満たされることを示す。
【0236】
【表6】
【0237】過剰rRNAハイブリダイゼーションを6
5℃で0.48M PB中で行う。反応は24時間続
き、そのハイブリダイゼーション時間はヒトrRNA又
はミトコンドリアrRNAと細菌rRNAとの反応が確
実に完了するために十分である。
5℃で0.48M PB中で行う。反応は24時間続
き、そのハイブリダイゼーション時間はヒトrRNA又
はミトコンドリアrRNAと細菌rRNAとの反応が確
実に完了するために十分である。
【0238】ハイブリダイゼーションアッセイは、ヒド
ロキシアパタイトで72℃、0.14M PB、0.0
05%ドデシル硫酸ナトリウム中で行われる。
ロキシアパタイトで72℃、0.14M PB、0.0
05%ドデシル硫酸ナトリウム中で行われる。
【0239】本発明者がつくったある例証的プローブ
は、Legionella属のメンバーに対してのみ特異的であ
る。そのプローブは、Legionella属の種々のメンバーか
らの核酸と50%以上ハイブリダイズし、哺乳類、酵母
および種々の広く異なる細菌株からの核酸とは明白には
ハイブダイズしない(表7)。
は、Legionella属のメンバーに対してのみ特異的であ
る。そのプローブは、Legionella属の種々のメンバーか
らの核酸と50%以上ハイブリダイズし、哺乳類、酵母
および種々の広く異なる細菌株からの核酸とは明白には
ハイブダイズしない(表7)。
【0240】プローブはLegionella pnuemophilaおよび
Legionella micdadei のようなほとんど又は全然集団D
NA近縁度を示さないLegionella種ともよくハイブリダ
イズする。
Legionella micdadei のようなほとんど又は全然集団D
NA近縁度を示さないLegionella種ともよくハイブリダ
イズする。
【0241】その他の既知のLegionella種は表7で用い
られており、表8に列挙したこのプローブで検出するこ
とができる。
られており、表8に列挙したこのプローブで検出するこ
とができる。
【0242】既知のLegionella種(23種類もの種)の
すべてを調べた。すべては、表7で用いられたプローブ
によって特異的に検出することができた。
すべてを調べた。すべては、表7で用いられたプローブ
によって特異的に検出することができた。
【0243】このプローブの特異性は、関連性のない細
菌又は哺乳類細胞の多量の存在下でさえもLegionella種
の検出および定量を可能にする。例えば、Legionella p
nuemophilaに感染したハムスターの肝細胞について、特
異的プローブと十分に確立された核酸ハイブリダイゼー
ション操作法を用いて、Legionella菌の存在並びに数を
検出した。
菌又は哺乳類細胞の多量の存在下でさえもLegionella種
の検出および定量を可能にする。例えば、Legionella p
nuemophilaに感染したハムスターの肝細胞について、特
異的プローブと十分に確立された核酸ハイブリダイゼー
ション操作法を用いて、Legionella菌の存在並びに数を
検出した。
【0244】その肝は、微生物学的増殖試験により、あ
らかじめ検査した。それは、感染した肝臓1gあたり約
107 個のLegionellaがあることを示した。
らかじめ検査した。それは、感染した肝臓1gあたり約
107 個のLegionellaがあることを示した。
【0245】核酸ハイブリダイゼーションアッセイで
は、肝1gにつき約1〜2×108 個のLegionella菌が
示された。この結果は、増殖試験におけるプレーティン
グ効率は約5〜10%であることを示唆する。
は、肝1gにつき約1〜2×108 個のLegionella菌が
示された。この結果は、増殖試験におけるプレーティン
グ効率は約5〜10%であることを示唆する。
【0246】特異的プローブは、多量の哺乳類細胞の存
在下においてさえLegionella菌の高度に鋭敏かつ迅速な
検出を可能にする。
在下においてさえLegionella菌の高度に鋭敏かつ迅速な
検出を可能にする。
【0247】1日もかからないアッセイで、そのプロー
ブは0.4mg肝(約2×105 個の細胞)と混ぜ合わ
せた約400個のLegionella菌の存在を容易に検出し
た。
ブは0.4mg肝(約2×105 個の細胞)と混ぜ合わ
せた約400個のLegionella菌の存在を容易に検出し
た。
【0248】
【表7】
【0249】過剰rRNAハイブリダイゼーションを7
6℃、0.47M PBで行う。ハイブリダイゼーショ
ンアッセイは、72℃で0.14M PB、0.005
%ドデシル硫酸ナトリウム中で行う。
6℃、0.47M PBで行う。ハイブリダイゼーショ
ンアッセイは、72℃で0.14M PB、0.005
%ドデシル硫酸ナトリウム中で行う。
【0250】ハイブリダイゼーション時間は 3H−cD
NAと核rRNA又はミトコンドリアrRNAとの反応
を確実に完了させるに十分である。哺乳類および鳥の場
合には、非細菌性rRNAのCot値は最低2×103
に達する。
NAと核rRNA又はミトコンドリアrRNAとの反応
を確実に完了させるに十分である。哺乳類および鳥の場
合には、非細菌性rRNAのCot値は最低2×103
に達する。
【0251】
【表8】
【0252】[実施例3]Legionella属のメンバーのrRNAにのみ、ハイブリダ
イズするプローブの調製 Legionella rRNAに相補的な放射性DNAの調製 Legionella pneumophila種に由来するrRNAを鋳型と
して用いて、Legionella pneumophila rRNAに相補
的な標識(放射性)cDNAを合成する。
イズするプローブの調製 Legionella rRNAに相補的な放射性DNAの調製 Legionella pneumophila種に由来するrRNAを鋳型と
して用いて、Legionella pneumophila rRNAに相補
的な標識(放射性)cDNAを合成する。
【0253】このcDNAの調製は逆転写酵素がrRN
Aを鋳型として利用でき、rRNAに相補的な 3H−c
DNAを調製できる能力を利用したものである。
Aを鋳型として利用でき、rRNAに相補的な 3H−c
DNAを調製できる能力を利用したものである。
【0254】これは、Legionella pneumophila由来のr
RNAを鋳型として用いるということを除けば、Mycopl
asma hominis 3H−cDNAの生産に関して記載したと
同じ方法で行われる。
RNAを鋳型として用いるということを除けば、Mycopl
asma hominis 3H−cDNAの生産に関して記載したと
同じ方法で行われる。
【0255】Legionella属のメンバーからのrRNAに
のみ、ハイブリダイズする放射性プローブの選択 精製 3H−cDNAをE.coli、Acholeplasma laidlawai
i およびProvidentiastuartiiに由来する大過剰のrR
NAとハイブダイズさせることにより、分画化する。
のみ、ハイブリダイズする放射性プローブの選択 精製 3H−cDNAをE.coli、Acholeplasma laidlawai
i およびProvidentiastuartiiに由来する大過剰のrR
NAとハイブダイズさせることにより、分画化する。
【0256】ハイブリダイゼーション混合物は、0.4
8M PB1ml中に0.05〜1マイクログラム 3H
−cDNAと20マイクログラムずつの細菌rRNAを
含んで成る。この混合物を、76℃で1時間インキュベ
ートし、その混合物を0.14M PBに希釈して72
℃、0.14M PBで平衡状態にしたHAカラムを通
す。
8M PB1ml中に0.05〜1マイクログラム 3H
−cDNAと20マイクログラムずつの細菌rRNAを
含んで成る。この混合物を、76℃で1時間インキュベ
ートし、その混合物を0.14M PBに希釈して72
℃、0.14M PBで平衡状態にしたHAカラムを通
す。
【0257】HAに吸着しない 3H−cDNA(即ち、
そのrRNAにハイブリダイズしない 3H−cDNA)
のフラクションを集める。このフラクションを上記と同
じ条件でHAを通し、再び吸着されなかったフラクショ
ンを集める。
そのrRNAにハイブリダイズしない 3H−cDNA)
のフラクションを集める。このフラクションを上記と同
じ条件でHAを通し、再び吸着されなかったフラクショ
ンを集める。
【0258】この 3H−cDNAを濃縮し、再び上述の
ように細菌rRNAとハイブリダイズさせる。吸着しな
いフラクションを集めて濃縮し、さらに上記のように、
3回目として細菌rRNAとハイブリダイズさせ、上の
ようにHAで分画化する。
ように細菌rRNAとハイブリダイズさせる。吸着しな
いフラクションを集めて濃縮し、さらに上記のように、
3回目として細菌rRNAとハイブリダイズさせ、上の
ようにHAで分画化する。
【0259】吸着しないフラクションを集める。塩基で
処理して、存在するrRNAを取り出し水中に濃縮す
る。この 3H−cDNA標本は、Legionella属のいかな
るメンバーにもハイブリダイズするが、他の起源のrR
NAにはハイブリダイズしない。
処理して、存在するrRNAを取り出し水中に濃縮す
る。この 3H−cDNA標本は、Legionella属のいかな
るメンバーにもハイブリダイズするが、他の起源のrR
NAにはハイブリダイズしない。
【0260】Legionella特異的 3H−cDNAプローブ
と、異なる起源のrRNA、およびrRNA遺伝子との
ハイブリダイゼーション選択プローブを用いれば、核酸
ハイブリダイゼーションによってLegionellarRNAの
存在を検出することにより、試料中のLegionella属のメ
ンバーを検出することができる。
と、異なる起源のrRNA、およびrRNA遺伝子との
ハイブリダイゼーション選択プローブを用いれば、核酸
ハイブリダイゼーションによってLegionellarRNAの
存在を検出することにより、試料中のLegionella属のメ
ンバーを検出することができる。
【0261】そのようなテストに必要な要件は、Legion
ella特異的プローブが他の起源に由来するrRNAにハ
イブリダイズしてはいけないということである。
ella特異的プローブが他の起源に由来するrRNAにハ
イブリダイズしてはいけないということである。
【0262】核酸のハイブリダイゼーション過剰rRN
A法によるLegionella rRNAの定量 試料中にある細菌rRNAの量は、選択 3H−cDNA
プローブと組織試料から分離したRNAとのハイブリダ
イゼーションの動態を測定し、これらの動態を既知の標
準混合物のそれと比較することによって決定することが
できる。
A法によるLegionella rRNAの定量 試料中にある細菌rRNAの量は、選択 3H−cDNA
プローブと組織試料から分離したRNAとのハイブリダ
イゼーションの動態を測定し、これらの動態を既知の標
準混合物のそれと比較することによって決定することが
できる。
【0263】これは、哺乳類細胞のrRNAの大過剰が
存在していても可能である。なぜならば、そのプローブ
はこのrRNAはハイブリダイズしないからである。
存在していても可能である。なぜならば、そのプローブ
はこのrRNAはハイブリダイズしないからである。
【0264】動態を測定するためには、ハイブリダイゼ
ーション混合物は0.01〜0.1mlの0.48M
PB中に例えば、10-5〜10-4マイクログラム 3H−
cDNAと0.01〜103 マイクログラム精製試料R
NAを含む。
ーション混合物は0.01〜0.1mlの0.48M
PB中に例えば、10-5〜10-4マイクログラム 3H−
cDNAと0.01〜103 マイクログラム精製試料R
NAを含む。
【0265】この混合物を76℃でインキュベートし、
一部をとり、0.14M PBに希釈し、反応開始後の
種々の時間にハイブリダイゼーションアッセイを行う。
ハイブリダイゼーションアッセイは、既述のように、ヒ
ドロキシアパタイトを用いて行う。
一部をとり、0.14M PBに希釈し、反応開始後の
種々の時間にハイブリダイゼーションアッセイを行う。
ハイブリダイゼーションアッセイは、既述のように、ヒ
ドロキシアパタイトを用いて行う。
【0266】得られた結果を、既知量の細菌rRNAを
含む標準RNAと反応させたプローブのハイブリダイゼ
ーション動態と比較する。これらの標準は、哺乳類細胞
RNAと既知量の特異的細菌rRNAとの混合物であ
る。
含む標準RNAと反応させたプローブのハイブリダイゼ
ーション動態と比較する。これらの標準は、哺乳類細胞
RNAと既知量の特異的細菌rRNAとの混合物であ
る。
【0267】表9は、水試料中および感染ハムスター肝
試料中にあるLegionella pneumophilaの定量に関するデ
ータを示す。
試料中にあるLegionella pneumophilaの定量に関するデ
ータを示す。
【0268】水試料および肝試料について、ジョージア
州アトランタ市の疾病コントロールセンターで、標準定
量的増殖試験により、Legionella pneumophilaの存在を
調べた。
州アトランタ市の疾病コントロールセンターで、標準定
量的増殖試験により、Legionella pneumophilaの存在を
調べた。
【0269】
【表9】
【0270】過剰プローブ法
試料中にある細菌rRNAの量は、存在するLegionella
rRNAの量に比較して、Legionella特異的 3H−c
DNAプローブが過剰にあるという条件下で、ハイブリ
ダイゼーションを行うことにより、測定することができ
る。
rRNAの量に比較して、Legionella特異的 3H−c
DNAプローブが過剰にあるという条件下で、ハイブリ
ダイゼーションを行うことにより、測定することができ
る。
【0271】この混合物を、最後までハイブリダイズさ
せる。この時点で、試料中にある各Legionella rRN
Aはプローブ分子で飽和させられる。rRNAはハイブ
リダイズしたプローブの量を、正確に作成された標準検
量曲線と比較することによって試料中のrRNA量を測
定することができる。
せる。この時点で、試料中にある各Legionella rRN
Aはプローブ分子で飽和させられる。rRNAはハイブ
リダイズしたプローブの量を、正確に作成された標準検
量曲線と比較することによって試料中のrRNA量を測
定することができる。
【0272】それからLegionella pneumophila細菌1個
あたりのrRNA分子の平均数を知ることによって、試
料中にある該細菌の総数を計算できる。
あたりのrRNA分子の平均数を知ることによって、試
料中にある該細菌の総数を計算できる。
【0273】表10は、後章に詳述する過剰プローブハ
イブリダイゼーション加速−酵素−界面活性剤試料法に
より測定した水試料中のLegionella pneumophilaの定量
に関するデータを示す。
イブリダイゼーション加速−酵素−界面活性剤試料法に
より測定した水試料中のLegionella pneumophilaの定量
に関するデータを示す。
【0274】水試料について、標準定量増殖法により、
Legionella pneumophilaの存在を調べた。これらの試験
法は完了するまでに数日かかるが、ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイは約1時間ですむ。
Legionella pneumophilaの存在を調べた。これらの試験
法は完了するまでに数日かかるが、ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイは約1時間ですむ。
【0275】
【表10】
【0276】
【表11】
【0277】水および肝試料中のLegionella pneumophi
laを検出する核酸ハイブリダイゼーション試験の詳細を
以下に示す。
laを検出する核酸ハイブリダイゼーション試験の詳細を
以下に示す。
【0278】[実施例4]水性試料中のLegionella菌の迅速、鋭敏な検出法(加速
法) (1)次の諸成分をできるだけ速く次の順序で混合す
る。
法) (1)次の諸成分をできるだけ速く次の順序で混合す
る。
【0279】(a)1mlに対して約105 個のレジオ
ネラ・ニューモフィラ(Legionellapneumophila)菌を
含む水性試料45μl。水中の細菌数は米国アトランタ
の疾病コントロールセンターで増殖試験により測定し
た。
ネラ・ニューモフィラ(Legionellapneumophila)菌を
含む水性試料45μl。水中の細菌数は米国アトランタ
の疾病コントロールセンターで増殖試験により測定し
た。
【0280】(b)Aに記載の酵素−界面活性剤溶液1
μl (c)Legionella特異的プローブ0.5μl 7.5×10-6μg相当量のプローブ (d)4.8M PB 10μl ハイブリダイゼーション混合物を約2分間アセンプリン
グ。
μl (c)Legionella特異的プローブ0.5μl 7.5×10-6μg相当量のプローブ (d)4.8M PB 10μl ハイブリダイゼーション混合物を約2分間アセンプリン
グ。
【0281】(2)ハイブリダイゼーション混合物を3
6分間、76℃でインキュベートする。
6分間、76℃でインキュベートする。
【0282】(3)Aに記載のようにハイブリダイゼー
ションアッセイを行う。これには約5分かかる。
ションアッセイを行う。これには約5分かかる。
【0283】(4)フラクションについて、プローブの
存在をアッセイする。これには、約10分間かかる。
存在をアッセイする。これには、約10分間かかる。
【0284】ハイブリダイゼーション混合物中にあるLe
gionella菌の数は、約500個であった。この微生物数
を検出し定量するのに、始めから終りまで約1時間かか
り、10-5マイクログラム以下のプローブを使用した。
gionella菌の数は、約500個であった。この微生物数
を検出し定量するのに、始めから終りまで約1時間かか
り、10-5マイクログラム以下のプローブを使用した。
【0285】過剰プローブハイブリダイゼーションテス
トとして計画されたこの試験では、プローブの23%が
Legionella rRNAとハイブリダイズした。
トとして計画されたこの試験では、プローブの23%が
Legionella rRNAとハイブリダイズした。
【0286】同条件で、細菌を加えない一つの試料、ハ
イブリダイゼーション混合物に105 個の大腸菌(E.co
li)を存在させた他試料をそれぞれ用いて対照試験を行
った。
イブリダイゼーション混合物に105 個の大腸菌(E.co
li)を存在させた他試料をそれぞれ用いて対照試験を行
った。
【0287】どちらの場合も、ハイブリダイズしたよう
に振舞ったプローブは1〜2%に過ぎなかった。
に振舞ったプローブは1〜2%に過ぎなかった。
【0288】上記試験を変形して、より大きな容量中の
Legionella菌の存在をアッセイすることができる。
Legionella菌の存在をアッセイすることができる。
【0289】例えば、1ml中に、104 個のLegionel
la菌を含む水試料1mlを30分間遠沈して、細菌をペ
レットにする。少量の酵素−界面活性剤をペレットに加
え、この混合物について加速法を用いてハイブリダイゼ
ーションテストを行ったら、Legionella菌が容易に検出
された。
la菌を含む水試料1mlを30分間遠沈して、細菌をペ
レットにする。少量の酵素−界面活性剤をペレットに加
え、この混合物について加速法を用いてハイブリダイゼ
ーションテストを行ったら、Legionella菌が容易に検出
された。
【0290】更に多量の試料を遠沈することもできる
し、細菌を濃縮するその他の方法(膜濾過を含む)を使
うこともできる。これらの変形は、大量の試料中の少量
の細菌の検出を可能にする。
し、細菌を濃縮するその他の方法(膜濾過を含む)を使
うこともできる。これらの変形は、大量の試料中の少量
の細菌の検出を可能にする。
【0291】大気試料も膜濾過法を含む種々の方法によ
って濃縮することができ、大量の大気試料中の少数の細
菌を検出することができる。
って濃縮することができ、大量の大気試料中の少数の細
菌を検出することができる。
【0292】[実施例5]ハムスター肝試料中のLegionella菌の迅速、鋭敏な検出
(1)次の諸成分をできるだけ早くつぎの順序で混合す
る。
る。
【0293】(a)Legionella pneumophilaに感染した
ハムスター肝の10%肝ホモジネート4μl。これは、
肝臓400マイクログラム、又は約6×104 個肝細胞
に相当する。この試料には約750個のLegionella pne
umophilaが存在した。
ハムスター肝の10%肝ホモジネート4μl。これは、
肝臓400マイクログラム、又は約6×104 個肝細胞
に相当する。この試料には約750個のLegionella pne
umophilaが存在した。
【0294】(b)次のものから成る酵素−界面活性剤
溶液4μl。45μg/mlプロティナーゼK、8%S
DS、4%サルコシン酸ナトリウム、0.5Mトリス
(pH=8.2)、0.008M EDTA、0.00
8M EGTA、0.25MNaCl。
溶液4μl。45μg/mlプロティナーゼK、8%S
DS、4%サルコシン酸ナトリウム、0.5Mトリス
(pH=8.2)、0.008M EDTA、0.00
8M EGTA、0.25MNaCl。
【0295】(c)Legionella特異的プローブ4μl。
プローブ量は、約10-5マイクログラムである。
プローブ量は、約10-5マイクログラムである。
【0296】(2)ハイブリダイゼーション混合物を7
6℃で3時間インキュベートする (3)Aに記載の通り、ハイブリダイゼーションアッセ
イを行う。
6℃で3時間インキュベートする (3)Aに記載の通り、ハイブリダイゼーションアッセ
イを行う。
【0297】(4)生じたフラクションについて、Legi
onella rRNAにハイブリダイズしたプローブの存在
をアッセイする。
onella rRNAにハイブリダイズしたプローブの存在
をアッセイする。
【0298】ハイブリダイゼーション混合物中にあるLe
gionella菌の数は約750個である。この数のLegionel
la細胞中にあるrRNA量は約1.1×10-5マイクロ
グラムである。存在する肝細胞の数は約6×104 個
で、存在する肝rRNA量は約1マイクログラムであ
る。Legionella特異的プローブの10%が、ハイブリダ
イズした。
gionella菌の数は約750個である。この数のLegionel
la細胞中にあるrRNA量は約1.1×10-5マイクロ
グラムである。存在する肝細胞の数は約6×104 個
で、存在する肝rRNA量は約1マイクログラムであ
る。Legionella特異的プローブの10%が、ハイブリダ
イズした。
【0299】対照試験は感染しない肝臓で同様にして行
われ、プローブの1%以下がハイブリダイズしているよ
うに振舞った。実施例4および5はそのような試験の多
くのあり得る形態の中の2つだけを示しているに過ぎな
い。
われ、プローブの1%以下がハイブリダイズしているよ
うに振舞った。実施例4および5はそのような試験の多
くのあり得る形態の中の2つだけを示しているに過ぎな
い。
【0300】種々の容量、塩、界面活性剤、プローブ、
試料の型、蛋白分解酵素、HA量、インキュベーション
時間、生物の種類、プローブ量、インキュベーション温
度、ハイブリダイゼーション速度加速系を用いる試験
が、ここに記した試験の一般的状況において、成功裡に
利用される。
試料の型、蛋白分解酵素、HA量、インキュベーション
時間、生物の種類、プローブ量、インキュベーション温
度、ハイブリダイゼーション速度加速系を用いる試験
が、ここに記した試験の一般的状況において、成功裡に
利用される。
【0301】rRNAに対するプローブのどれでも、上
述のシステムに匹敵するシステムでは用いることができ
る。rRNAを標的としないプローブも、若干の明白な
変形を施したこれらのシステムで、有効に用いることが
できる。
述のシステムに匹敵するシステムでは用いることができ
る。rRNAを標的としないプローブも、若干の明白な
変形を施したこれらのシステムで、有効に用いることが
できる。
【0302】例えば、特定の生物又は生物群の特定のD
NA配列に特異的な試験を、もし2本鎖DNAを1本鎖
型に変える段階を入れるならば、正に上述のように行う
ことができる。その他の場合には、又異なる変形を施し
た方法を用いなければならない。
NA配列に特異的な試験を、もし2本鎖DNAを1本鎖
型に変える段階を入れるならば、正に上述のように行う
ことができる。その他の場合には、又異なる変形を施し
た方法を用いなければならない。
【0303】MycobacteriaおよびBacilli のような細菌
は破壊されにくい。上記の方法に関連して、これら細菌
を破壊する段階を用いなければならない。例えば、界面
活性剤なしで酵素リゾチームを用いて1回インキュベー
ションすると、大部分のBacillus菌は、界面活性剤によ
り溶解し易くなる。
は破壊されにくい。上記の方法に関連して、これら細菌
を破壊する段階を用いなければならない。例えば、界面
活性剤なしで酵素リゾチームを用いて1回インキュベー
ションすると、大部分のBacillus菌は、界面活性剤によ
り溶解し易くなる。
【0304】他方、マイコバクテリアは非常に溶解しに
くく、それらは試験する前に物理的に破壊する必要があ
るかも知れない。
くく、それらは試験する前に物理的に破壊する必要があ
るかも知れない。
【0305】上記方法の変形をtRNAに対するプロー
ブ又は生物中に存在する他のRNAに特異的なプローブ
に関連しても用いることができる。
ブ又は生物中に存在する他のRNAに特異的なプローブ
に関連しても用いることができる。
【0306】大きな容量の試料、例えば大気又は液体か
ら、少数の細菌又はその他の細胞を濃縮するための段階
をその他の細菌生物又はその他の種類の生物の大部分を
見出すハイブリダイゼーションテストに関連して用いる
ことができる。
ら、少数の細菌又はその他の細胞を濃縮するための段階
をその他の細菌生物又はその他の種類の生物の大部分を
見出すハイブリダイゼーションテストに関連して用いる
ことができる。
【0307】以上、Legionella属のメンバーに由来する
核酸にのみハイブリダイズする核酸プローブの生産およ
び使用について詳しく述べてきたが、この実施例および
他の実施例から、上に例証せる操作法を基にして、その
他のプローブも生産できるということは当業者には容易
に理解できる。
核酸にのみハイブリダイズする核酸プローブの生産およ
び使用について詳しく述べてきたが、この実施例および
他の実施例から、上に例証せる操作法を基にして、その
他のプローブも生産できるということは当業者には容易
に理解できる。
【0308】そのような他のプローブを生産するために
用いる方法は、次のようである。
用いる方法は、次のようである。
【0309】(1)関心のある群のメンバーのrRNA
に相補的な標識核酸をつくる。
に相補的な標識核酸をつくる。
【0310】(2)このDNAを、プローブが特異的で
ある生物群に進化論的に最も近い生物群のメンバーから
のrRNAにハイブリダイズさせる。
ある生物群に進化論的に最も近い生物群のメンバーから
のrRNAにハイブリダイズさせる。
【0311】特異的なクリテリオンにおいて、この一番
近い生物群のメンバーからのrRNAにハイブリダイズ
しない標識核酸の1部分を選択する。この部分が関心の
ある生物群に特異的である。
近い生物群のメンバーからのrRNAにハイブリダイズ
しない標識核酸の1部分を選択する。この部分が関心の
ある生物群に特異的である。
【0312】これらの例を、次にあげる。
【0313】(a)Legionella科の菌のメンバーに由来
するrRNAとのみハイブリダイズし、他の起源のrR
NAとはハイブリダイズしない標識プローブの生産。
するrRNAとのみハイブリダイズし、他の起源のrR
NAとはハイブリダイズしない標識プローブの生産。
【0314】(b)Mycoplasma科の菌のメンバーに由来
するrRNAとのみハイブリダイズし、その他の起源に
由来するrRNAとは、ハイブリダイズしない標識プロ
ーブの生産。
するrRNAとのみハイブリダイズし、その他の起源に
由来するrRNAとは、ハイブリダイズしない標識プロ
ーブの生産。
【0315】(c)Enterobacteriaceae科の菌のメンバ
ーに由来するrRNAとのみハイブリダイズし、その他
の起源に由来するrRNAとは、ハイブリダイズしない
標識プローブの生産。
ーに由来するrRNAとのみハイブリダイズし、その他
の起源に由来するrRNAとは、ハイブリダイズしない
標識プローブの生産。
【0316】(d)嫌気的細菌群のメンバーとのみハイ
ブリダイズし、その他の起源由来のrRNAとはハイブ
リダイズしない、標識プローブの生産。
ブリダイズし、その他の起源由来のrRNAとはハイブ
リダイズしない、標識プローブの生産。
【0317】(e)菌類(Fungi)のメンバーに由来する
rRNAとのみハイブリダイスし、その他の起源に由来
するrRNAとはハイブリダイズしない標識プローブの
生産。
rRNAとのみハイブリダイスし、その他の起源に由来
するrRNAとはハイブリダイズしない標識プローブの
生産。
【0318】(f)Chlamydia 群のメンバーに由来する
rRNAとのみハイブリダイズし、その他の起源に由来
するrRNAとはハイブリダイズしない標識プローブの
生産。
rRNAとのみハイブリダイズし、その他の起源に由来
するrRNAとはハイブリダイズしない標識プローブの
生産。
【0319】(g)Mycobacteriaceae科のメンバーに由
来するrRNAとのみハイブリダイズし、その他の起源
に由来するrRNAとはハイブリダイズしない標識プロ
ーブの生産。
来するrRNAとのみハイブリダイズし、その他の起源
に由来するrRNAとはハイブリダイズしない標識プロ
ーブの生産。
【0320】(h)生きている生物に由来するrRNA
にハイブリダイズする標識プローブの生産。
にハイブリダイズする標識プローブの生産。
【0321】(i)哺乳類に由来するrRNAとのみハ
イブリダイズし、その他の起源のrRNAとはハイブリ
ダイズしない標識プローブの生産。
イブリダイズし、その他の起源のrRNAとはハイブリ
ダイズしない標識プローブの生産。
【0322】生物を検出、定量、同定するために、tR
NAに対するプローブを使用する例証的実施例 tRNAに対するプローブをrRNAに対するプローブ
の場合と同様に用いて、生物、そして或る場合には、ウ
イルスを検出、同定、定量することができる。
NAに対するプローブを使用する例証的実施例 tRNAに対するプローブをrRNAに対するプローブ
の場合と同様に用いて、生物、そして或る場合には、ウ
イルスを検出、同定、定量することができる。
【0323】例えば、Legionellaに特異的なtRNAに
対するプローブをLegionellaにのみ特異的なrRNAに
対するプローブに関して記載した方法と同じやり方で生
産し、用いることができる。
対するプローブをLegionellaにのみ特異的なrRNAに
対するプローブに関して記載した方法と同じやり方で生
産し、用いることができる。
【0324】こうして、Legionella特異的rRNAのた
めに、記述した例証的実施例は、Legionella特異的tR
NAに対するプローブの例証としても役立つ。
めに、記述した例証的実施例は、Legionella特異的tR
NAに対するプローブの例証としても役立つ。
【0325】多くのDNAおよびRNAウイルスに存在
する遺伝子は、そのウイルスに特異的であるtRNA遺
伝子を含む。
する遺伝子は、そのウイルスに特異的であるtRNA遺
伝子を含む。
【0326】mRNA,hnRNA,snRNA又はp
sRNAに特異的なプローブを使用して、生物および細
胞中ウイルスを検出、定量、同定する例証的実施例 mRNA,hnRNA,snRNA又はpsRNAに特
異的なプローブ、rRNAおよびtRNAの場合と同様
なやり方で用いて特異性の大きい又は小さい生物群、細
胞又は細胞中のウイルスを検出、同定、定量することが
できる。
sRNAに特異的なプローブを使用して、生物および細
胞中ウイルスを検出、定量、同定する例証的実施例 mRNA,hnRNA,snRNA又はpsRNAに特
異的なプローブ、rRNAおよびtRNAの場合と同様
なやり方で用いて特異性の大きい又は小さい生物群、細
胞又は細胞中のウイルスを検出、同定、定量することが
できる。
【0327】これらの種々のRNAsを生産する個々の
遺伝子の進化的保存は非常に変化するから、非常に大き
い生物クラスのメンバーを検出するプローブと、比較的
小さい生物クラスのメンバー、細胞又は細胞中のウイル
スを検出するプローブを生産することは可能である。
遺伝子の進化的保存は非常に変化するから、非常に大き
い生物クラスのメンバーを検出するプローブと、比較的
小さい生物クラスのメンバー、細胞又は細胞中のウイル
スを検出するプローブを生産することは可能である。
【0328】高度に保存されている遺伝子配列の一例
は、ヒストン遺伝子、真核細胞に存在する一族の遺伝子
である。ヒストンは、すべての真核細胞にある核−構造
蛋白質である。ヒストンDNA配列は、広く異なった生
物においてさえ非常に似ている。
は、ヒストン遺伝子、真核細胞に存在する一族の遺伝子
である。ヒストンは、すべての真核細胞にある核−構造
蛋白質である。ヒストンDNA配列は、広く異なった生
物においてさえ非常に似ている。
【0329】例えば、ウニと人とのヒストン遺伝子はよ
く似ていて、ハイブリダイズし合う。特定のヒストンm
RNA又はヒストンmRNA集団に特異的なプローブ
は、広く異なる生物から成る大きな群のメンバーの存在
又は不存在を検出し、定量することができる。
く似ていて、ハイブリダイズし合う。特定のヒストンm
RNA又はヒストンmRNA集団に特異的なプローブ
は、広く異なる生物から成る大きな群のメンバーの存在
又は不存在を検出し、定量することができる。
【0330】細胞又は生物の検出感度は、ヒストンmR
NA量が多いと高まる。増殖するためには、細胞又は生
物はヒストンmRNAを大量に合成しなければならな
い。
NA量が多いと高まる。増殖するためには、細胞又は生
物はヒストンmRNAを大量に合成しなければならな
い。
【0331】別の実施例はpsRNAを規定し、真価の
過程で保存されない或る遺伝子配列を含む。
過程で保存されない或る遺伝子配列を含む。
【0332】或るタイプの生物に由来するそのような遺
伝子配列は、遠い関係の種に由来するDNAにはハイブ
リダイズしない。
伝子配列は、遠い関係の種に由来するDNAにはハイブ
リダイズしない。
【0333】或る一つの特定のpsRNA配列又は、1
生物タイプ又はウイルスタイプに由来する種々のpsR
NA配列の集団に特異的なプローブを用いて近い関係の
生物から成る小さい群又は、細胞中の近い関係のウイル
スの小群のメンバーを検出、定量、同定することができ
る。
生物タイプ又はウイルスタイプに由来する種々のpsR
NA配列の集団に特異的なプローブを用いて近い関係の
生物から成る小さい群又は、細胞中の近い関係のウイル
スの小群のメンバーを検出、定量、同定することができ
る。
【0334】別の実施例は、特定の細胞損傷および破壊
を検討するために体液の検査に用い得るmRNA,hn
RNA,snRNA又はpsRNAの配列(1ケ又は複
数)に特異的なプローブの開発である。
を検討するために体液の検査に用い得るmRNA,hn
RNA,snRNA又はpsRNAの配列(1ケ又は複
数)に特異的なプローブの開発である。
【0335】或る種の病気では細胞が破壊され、細胞核
酸を含むその内容物が循環血液中にもれる。肝炎による
肝損傷はそのような状態の一つであり、肝細胞からのD
NAもRNAも両方共、細胞損傷の結果として循環血液
中へ入ることが知られている。
酸を含むその内容物が循環血液中にもれる。肝炎による
肝損傷はそのような状態の一つであり、肝細胞からのD
NAもRNAも両方共、細胞損傷の結果として循環血液
中へ入ることが知られている。
【0336】肝細胞にのみ特徴的であり、他の正常細胞
タイプには存在しないRNA配列(1又は複数)に特異
的なプローブを生産することができる。そのようなRN
Aの存在はよく知られている。
タイプには存在しないRNA配列(1又は複数)に特異
的なプローブを生産することができる。そのようなRN
Aの存在はよく知られている。
【0337】それから、このプローブを用いて本文中に
記載の核酸ハイブリダイゼーション法によって血液試料
中の肝−特異的−mRNA,hnRNA,snRNA又
はpsRNAの配列を検出し、同定し、定量することが
できる。
記載の核酸ハイブリダイゼーション法によって血液試料
中の肝−特異的−mRNA,hnRNA,snRNA又
はpsRNAの配列を検出し、同定し、定量することが
できる。
【0338】血液中にあるRNAの量は細胞損傷の程度
を反映するから、肝損傷の存在およびその大きさの程度
範囲を決めることができる。
を反映するから、肝損傷の存在およびその大きさの程度
範囲を決めることができる。
【0339】特殊なタイプの肝細胞にのみ存在する特定
のmRNA,hnRNA,snRNA又はpsRNAの
配列(1又は複数)に特異的なプローブも生産すること
ができる。それを使って特殊な肝細胞タイプの損傷の結
果、血液中に存在するRNA配列を検出、定量すること
ができる。明らかに、肝細胞中の特異的RNA配列が豊
富であればある程RNA検出感度は高くなる。
のmRNA,hnRNA,snRNA又はpsRNAの
配列(1又は複数)に特異的なプローブも生産すること
ができる。それを使って特殊な肝細胞タイプの損傷の結
果、血液中に存在するRNA配列を検出、定量すること
ができる。明らかに、肝細胞中の特異的RNA配列が豊
富であればある程RNA検出感度は高くなる。
【0340】体組織又は器官(心、腎、脳、筋肉、膵、
脾等々を含む)の損傷も、この方法で検出、定量でき
る。脊髄液および尿を含むその他の体液も、これらの特
異的RNAの存在をアッセイすることができる。
脾等々を含む)の損傷も、この方法で検出、定量でき
る。脊髄液および尿を含むその他の体液も、これらの特
異的RNAの存在をアッセイすることができる。
【0341】rRNAに特異的なプローブを利用し、血
液又はその他の体液について、rRNA又はtRNA配
列の存在を試験することによって、いかなる起源の組織
損傷があるかについて有用な初期スクリーニングをする
ことができる。
液又はその他の体液について、rRNA又はtRNA配
列の存在を試験することによって、いかなる起源の組織
損傷があるかについて有用な初期スクリーニングをする
ことができる。
【0342】存在するrRNA又はtRNAの定量は、
起源を確認することなく組織損傷の程度の大きさを示
す。
起源を確認することなく組織損傷の程度の大きさを示
す。
【0343】核酸ハイブリダイゼーションテストおよび
ここに記載されたアプローチを使用する又別の例は大腸
菌(E.coli)腸毒素蛋白質を規定するプラスミド遺伝子
を含む大腸菌細胞の検出および定量である。
ここに記載されたアプローチを使用する又別の例は大腸
菌(E.coli)腸毒素蛋白質を規定するプラスミド遺伝子
を含む大腸菌細胞の検出および定量である。
【0344】そのようなテストは、腸毒素蛋白質mRN
Aを含む大腸菌の存在を検出および定量するために腸毒
素蛋白質mRNAに相補的な標識核酸プローブを使用す
ることを含む。
Aを含む大腸菌の存在を検出および定量するために腸毒
素蛋白質mRNAに相補的な標識核酸プローブを使用す
ることを含む。
【0345】これは、この明細書中に記載の溶液内ハイ
ブリダイゼーション法を利用することによって達せられ
る。
ブリダイゼーション法を利用することによって達せられ
る。
【0346】既述したように、核酸ハイブリダイゼーシ
ョン法を用いることにより大腸菌(E.coli)腸毒素を生
産し、従って腸毒素mRNAを含む大腸菌の存在を検
出、定量するための手段として、大腸菌腸毒素mRNA
に相補的なプローブを使用することは前に論じたフアル
コウ等の米国特許に記載されているような方法に比べて
著しくすぐれている。
ョン法を用いることにより大腸菌(E.coli)腸毒素を生
産し、従って腸毒素mRNAを含む大腸菌の存在を検
出、定量するための手段として、大腸菌腸毒素mRNA
に相補的なプローブを使用することは前に論じたフアル
コウ等の米国特許に記載されているような方法に比べて
著しくすぐれている。
【0347】前述のものと同じアプローチを用いて、特
定の抗生物質又はその他の抗菌剤に対する耐性を与え
る、特定の微生物の特異的遺伝産物を検出することがで
きる大部分の抗生物質に対する耐性を与える遺伝子は、
ほとんど常に細胞中のプラスミドに存在する。生物が耐
性を伝える因子に生産するためには、その因子のための
遺伝子およびその因子のためのmRNAが細胞中に存在
しなければならない。
定の抗生物質又はその他の抗菌剤に対する耐性を与え
る、特定の微生物の特異的遺伝産物を検出することがで
きる大部分の抗生物質に対する耐性を与える遺伝子は、
ほとんど常に細胞中のプラスミドに存在する。生物が耐
性を伝える因子に生産するためには、その因子のための
遺伝子およびその因子のためのmRNAが細胞中に存在
しなければならない。
【0348】そこで、核酸ハイブリダイゼーション法に
よって、その因子のmRNAに特異的なプローブはその
因子を生産する生物を検出、同定、定量することができ
る核酸ハイブリダイゼーション法によって、例えば、m
RNA,hnRNA,snRNA又はpsRNA配列を
含む生物、細胞又は細胞中のウイルスの特定群を検出、
同定、定量する目的でmRNA,hnRNA,snRN
A又はpsRNAの特定配列又は配列集団に特異的な核
酸プローブを使用する上記の例は例証的であるに過ぎ
ず、限定するものではない。
よって、その因子のmRNAに特異的なプローブはその
因子を生産する生物を検出、同定、定量することができ
る核酸ハイブリダイゼーション法によって、例えば、m
RNA,hnRNA,snRNA又はpsRNA配列を
含む生物、細胞又は細胞中のウイルスの特定群を検出、
同定、定量する目的でmRNA,hnRNA,snRN
A又はpsRNAの特定配列又は配列集団に特異的な核
酸プローブを使用する上記の例は例証的であるに過ぎ
ず、限定するものではない。
【0349】抗菌剤に対する微生物の感受性の測定
多数の異なる臨床的情況は、種々の細菌の抗菌剤および
抗生物質に対する感受性の測定を必要とするV.Lorian著
「Antibiotics in Laboratory Medicine」、Williams &
Wilkens社米国バルチモア.1980参照)。
抗生物質に対する感受性の測定を必要とするV.Lorian著
「Antibiotics in Laboratory Medicine」、Williams &
Wilkens社米国バルチモア.1980参照)。
【0350】これらの情況は、すべての特異的微生物ク
ラスを検出、定量する方法を利用する。これらの情況の
多くにおいては、既述の核酸ハイブリダイゼーションテ
ストの使用が抗菌剤感受性の測定を著しくスピードアッ
プする。
ラスを検出、定量する方法を利用する。これらの情況の
多くにおいては、既述の核酸ハイブリダイゼーションテ
ストの使用が抗菌剤感受性の測定を著しくスピードアッ
プする。
【0351】試料中の生物が成長し、分割するにつれて
培地中のRNA量は増加する。生物が2倍になると培地
中にある異なるタイプのRNAの量も2倍になる。
培地中のRNA量は増加する。生物が2倍になると培地
中にある異なるタイプのRNAの量も2倍になる。
【0352】こうして、生物の増殖は増殖培養開始後種
々の時間に、培地中のRNA量を測定することによっ
て、モニターできる。
々の時間に、培地中のRNA量を測定することによっ
て、モニターできる。
【0353】RAN量が時間と共に増加すれば、それは
生物の増殖を示す。その増加の大きさは増殖の程度を示
す。増殖速度は時間あたりの増殖程度である。rRN
A,tRNA,psRNA,pstRNA、或る種のm
RNAs、又はpsmRNAs、ある種のsnRNA又
はpssnRNAs又はhnRNA又はpshnRNA
に対して特異的なプローブを、個々に、又は組み合せて
用いて生物の増殖を測定することができる。なぜならば
微生物が増殖するにつれて、培地中のこれらのRNAの
各々の量が増加するからである。
生物の増殖を示す。その増加の大きさは増殖の程度を示
す。増殖速度は時間あたりの増殖程度である。rRN
A,tRNA,psRNA,pstRNA、或る種のm
RNAs、又はpsmRNAs、ある種のsnRNA又
はpssnRNAs又はhnRNA又はpshnRNA
に対して特異的なプローブを、個々に、又は組み合せて
用いて生物の増殖を測定することができる。なぜならば
微生物が増殖するにつれて、培地中のこれらのRNAの
各々の量が増加するからである。
【0354】完全に増殖を阻止する1種類又はそれ以上
の薬剤の存在下で特定のカテゴリーの生物を培養しても
RNAは時間につれて増加しない。一方、そのような薬
剤で部分的に阻害される培養菌はより遅いRNA蓄積を
示す。
の薬剤の存在下で特定のカテゴリーの生物を培養しても
RNAは時間につれて増加しない。一方、そのような薬
剤で部分的に阻害される培養菌はより遅いRNA蓄積を
示す。
【0355】阻害されない培養菌は、その薬剤を含まな
い対照培養菌と同じ速度のRNA増加を示す。
い対照培養菌と同じ速度のRNA増加を示す。
【0356】この一例は、臨床的喀痰試料中のヒト型結
核菌Mycobacterium tuberculosisの感受性の測定であ
る。
核菌Mycobacterium tuberculosisの感受性の測定であ
る。
【0357】そのような試料を診断する第1段階は、抗
酸菌を検出するための染色用にその喀痰の直接塗沫標本
をつくることである。陽性の直接塗沫標本を得るには、
喀痰1mlにつき、最低104 〜105 個のヒト型結核
菌が必要であると推定される。しかし、増殖培養法では
たった10〜100個のこれら微生物が回収される。
酸菌を検出するための染色用にその喀痰の直接塗沫標本
をつくることである。陽性の直接塗沫標本を得るには、
喀痰1mlにつき、最低104 〜105 個のヒト型結核
菌が必要であると推定される。しかし、増殖培養法では
たった10〜100個のこれら微生物が回収される。
【0358】もし、その喀痰標本が塗沫陽性を示すなら
ばその標本を処理して、マイコバクテリア以外のすべて
の細菌を殺し、処理標本の希釈物を抗菌剤を含む寒天培
地と薬剤を含まない対照寒天上で平板培養する。
ばその標本を処理して、マイコバクテリア以外のすべて
の細菌を殺し、処理標本の希釈物を抗菌剤を含む寒天培
地と薬剤を含まない対照寒天上で平板培養する。
【0359】生活力のある個々の細菌は、対照寒天上で
はコロニーを形成するが、特定の抗菌剤を含む寒天上で
は増殖が阻止される。対照寒天上の数と薬剤処理寒天上
の数に対する比が、その抗菌剤の有効性の尺度である。
はコロニーを形成するが、特定の抗菌剤を含む寒天上で
は増殖が阻止される。対照寒天上の数と薬剤処理寒天上
の数に対する比が、その抗菌剤の有効性の尺度である。
【0360】小コロニーは最低106 個の細菌を含む。
これは、1ケの細菌からコロニーを形成するには最低2
0回分の分割が必要であることを意味し、そして、各分
割には最低12時間かかるから、全部で240時間又は
10日間が最低必要である。大抵の場合にはコロニー出
現までにこの長さの2〜4倍(3〜6週間)かかるLegi
onellaについて前に記述した方法は、抗菌剤−感受性の
測定のために必要な時間を著しく短縮する。
これは、1ケの細菌からコロニーを形成するには最低2
0回分の分割が必要であることを意味し、そして、各分
割には最低12時間かかるから、全部で240時間又は
10日間が最低必要である。大抵の場合にはコロニー出
現までにこの長さの2〜4倍(3〜6週間)かかるLegi
onellaについて前に記述した方法は、抗菌剤−感受性の
測定のために必要な時間を著しく短縮する。
【0361】Mycobacterium 属のメンバーに由来するr
RNAにのみ特異的なプローブをそのようなテストに用
いることができる。そのようなプローブを用いれば、Le
gionellaについて前述したものと等しい定量並びに検出
感度を得ることができる。
RNAにのみ特異的なプローブをそのようなテストに用
いることができる。そのようなプローブを用いれば、Le
gionellaについて前述したものと等しい定量並びに検出
感度を得ることができる。
【0362】加速ハイブリダイゼーション条件と過剰プ
ローブ法を用いる核酸ハイブリダイゼーションテスト
は、約200個のMycobacteria細胞の容易な検出を可能
にする。
ローブ法を用いる核酸ハイブリダイゼーションテスト
は、約200個のMycobacteria細胞の容易な検出を可能
にする。
【0363】rRNAが遊離してハイブリダイズするよ
うにMycobacteria細胞の崩壊を確実にするための段階を
加える。Mycobacteriaは、酵素−界面活性剤溶液の存在
下で容易には崩壊しない。
うにMycobacteria細胞の崩壊を確実にするための段階を
加える。Mycobacteriaは、酵素−界面活性剤溶液の存在
下で容易には崩壊しない。
【0364】上述のように、最小の陽性喀痰標本(酸性
染色で測定)は、1mlにつき約104 〜105 個のMy
cobacteria細胞を含みそしてこれらの10〜102 個の
細胞は、コロニー形成単位として検出される。
染色で測定)は、1mlにつき約104 〜105 個のMy
cobacteria細胞を含みそしてこれらの10〜102 個の
細胞は、コロニー形成単位として検出される。
【0365】寒天上の薬剤感受性試験では、抗菌剤が存
在しない対照寒天上に、40〜50個のコロニーが出現
するのを確実にするために十分量のMycobacteriaを対照
および実験寒天表面に加える。
在しない対照寒天上に、40〜50個のコロニーが出現
するのを確実にするために十分量のMycobacteriaを対照
および実験寒天表面に加える。
【0366】もし、核酸ハイブリダイゼーションアッセ
イを用いてこれを実施すると、これは培養が約50個の
Mycobacteriaで出発し、検出可能レベルの細胞を得るた
めには約3〜4回の細胞分割又は約2〜3日かかること
を意味する。
イを用いてこれを実施すると、これは培養が約50個の
Mycobacteriaで出発し、検出可能レベルの細胞を得るた
めには約3〜4回の細胞分割又は約2〜3日かかること
を意味する。
【0367】もしも、薬剤による顕著な増殖阻害がおき
たならば、対照は陽性で、薬剤を含む培地は陰性にな
る。高感度核酸ハイブリダイゼーション法の使用は、感
受性測定のために要する時間を5〜10倍短縮すること
ができる。
たならば、対照は陽性で、薬剤を含む培地は陰性にな
る。高感度核酸ハイブリダイゼーション法の使用は、感
受性測定のために要する時間を5〜10倍短縮すること
ができる。
【0368】上記のものは、Legionellaについて記した
ような核酸ハイブリダイゼーションテストを抗菌剤感受
性の測定のために使用する一例である。
ような核酸ハイブリダイゼーションテストを抗菌剤感受
性の測定のために使用する一例である。
【0369】どんな微生物の感受性も、標準増殖法と核
酸ハイブリダイゼーションに基づく微生物アッセイとの
組み合わせを用いて測定することができる。
酸ハイブリダイゼーションに基づく微生物アッセイとの
組み合わせを用いて測定することができる。
【0370】その上、多くの場合では、微生物に対する
核酸ハイブリダイゼーションテストの特異性および感受
性のために、他の微生物および真核細胞が大過剰に存在
している場合でも、特定生物の抗生物質感受性の測定が
可能である。
核酸ハイブリダイゼーションテストの特異性および感受
性のために、他の微生物および真核細胞が大過剰に存在
している場合でも、特定生物の抗生物質感受性の測定が
可能である。
【0371】同じアプローチを用いて、血液、尿その他
の体液および組織およびその他の試料中の抗微生物活性
の存在を測定できることは明らかである。
の体液および組織およびその他の試料中の抗微生物活性
の存在を測定できることは明らかである。
【0372】この場合、本発明核酸ハイブリダイゼーシ
ョン法を用いて、もし抗菌活性がなければ増殖がおこる
という条件下で、血液、尿又はその他の試料と接触して
置かれている特定の微生物群の増殖に、その血液、尿又
はその他の試料が与える影響をモニターし定量すること
ができる。
ョン法を用いて、もし抗菌活性がなければ増殖がおこる
という条件下で、血液、尿又はその他の試料と接触して
置かれている特定の微生物群の増殖に、その血液、尿又
はその他の試料が与える影響をモニターし定量すること
ができる。
【0373】細胞の増殖状態を測定する方法
細胞内における蛋白合成の全体的速度を細胞あたりのリ
ボソームの数によって測定する。tRNA合成速度もま
た細胞あたりのリボソーム数に関連する。細胞内の蛋白
合成の阻害は、細胞によるrRNA合成を停止させる結
果になる。実際に、何らかの手段により細胞増殖が止ま
るとrRNA合成の停止がおこり、細胞増殖をスローダ
ウンすると、rRNA合成はスローダウンするという結
果になる。
ボソームの数によって測定する。tRNA合成速度もま
た細胞あたりのリボソーム数に関連する。細胞内の蛋白
合成の阻害は、細胞によるrRNA合成を停止させる結
果になる。実際に、何らかの手段により細胞増殖が止ま
るとrRNA合成の停止がおこり、細胞増殖をスローダ
ウンすると、rRNA合成はスローダウンするという結
果になる。
【0374】合成されたばかりのrRNA分子は、リボ
ソームにある成熟rRNA分子サブユニットの集合より
も大きい。
ソームにある成熟rRNA分子サブユニットの集合より
も大きい。
【0375】例えば大腸菌(E.coli)のrRNAの長さ
が6000塩基対という前駆体分子として合成される。
前駆体は、それから処理を受けてrRNAサブユニット
(合計約4500塩基)を生じる。それはその後、リボ
ソームおよび「エキストラ(extra)」又は前駆体特異的
rRNA(psrRNA)配列に組み込まれる。これら
は、結局は細胞によって分解される。
が6000塩基対という前駆体分子として合成される。
前駆体は、それから処理を受けてrRNAサブユニット
(合計約4500塩基)を生じる。それはその後、リボ
ソームおよび「エキストラ(extra)」又は前駆体特異的
rRNA(psrRNA)配列に組み込まれる。これら
は、結局は細胞によって分解される。
【0376】rRNAは、増殖していない細胞中では合
成されない。従って、前駆体特異的rRNA配列もこれ
ら細胞には存在しない。この場合、多数のrRNA分子
は細胞中に存在するが、psrRNA配列は存在しな
い。
成されない。従って、前駆体特異的rRNA配列もこれ
ら細胞には存在しない。この場合、多数のrRNA分子
は細胞中に存在するが、psrRNA配列は存在しな
い。
【0377】ゆっくり増殖する細胞では少量のrRNA
前駆体が合成され、少量のpsrRNAが存在する。
前駆体が合成され、少量のpsrRNAが存在する。
【0378】速く増殖する細胞では大量のrRNA前駆
体が合成され、数千のpsrRNA配列が存在する。
体が合成され、数千のpsrRNA配列が存在する。
【0379】細胞中にpsrRNAがないのは、細胞が
増殖していないという信号である。細胞内のpsrRN
Aに対するrRNAの比は、細胞の増殖速度の指標であ
る抗菌剤は細胞増殖を阻害する。その薬剤によって増殖
を阻害されない細胞は、大量のpsrRNAを含む。部
分的に増殖を阻害される細胞では、psrRNAはより
少量存在する。rRNA:psrRNAの比は阻害程度
の尺度である。
増殖していないという信号である。細胞内のpsrRN
Aに対するrRNAの比は、細胞の増殖速度の指標であ
る抗菌剤は細胞増殖を阻害する。その薬剤によって増殖
を阻害されない細胞は、大量のpsrRNAを含む。部
分的に増殖を阻害される細胞では、psrRNAはより
少量存在する。rRNA:psrRNAの比は阻害程度
の尺度である。
【0380】特定の微生物群のpsrRNA配列に特異
的な核酸プローブを核酸ハイブリダイゼーションテスト
に用いて、特定の抗微生物剤又はそのような薬剤群の存
在および不存在下で生物が成長する場合のこれら微生物
中のpsrRNAの存在又は不在を決定し定量すること
ができる。
的な核酸プローブを核酸ハイブリダイゼーションテスト
に用いて、特定の抗微生物剤又はそのような薬剤群の存
在および不存在下で生物が成長する場合のこれら微生物
中のpsrRNAの存在又は不在を決定し定量すること
ができる。
【0381】これは、関心のある微生物群に関係のない
大量の生物が存在する場合でも可能である。
大量の生物が存在する場合でも可能である。
【0382】又、この核酸ハイブリダイゼーション法を
用いて血液、尿その他の体液および組織およびその他の
試料中に、抗微生物活性をもった物質が存在するかどう
かを決定することも当然である。
用いて血液、尿その他の体液および組織およびその他の
試料中に、抗微生物活性をもった物質が存在するかどう
かを決定することも当然である。
【0383】この細胞増殖測定方法を用いてrRNAを
合成するあらゆる細胞の増殖状態を決定することができ
る。上記の例はそのような方法に用いられる多くの例の
1つに過ぎない。
合成するあらゆる細胞の増殖状態を決定することができ
る。上記の例はそのような方法に用いられる多くの例の
1つに過ぎない。
【0384】特定の生物群又は細胞群のpstRNA配
列に特異的なプローブを用いる方法を利用して、これら
生物又は細胞の増殖状態を決定することもできる。
列に特異的なプローブを用いる方法を利用して、これら
生物又は細胞の増殖状態を決定することもできる。
【0385】又、速く増殖する生物には豊富にあり、増
殖しないかゆっくり増殖する細胞には存在しないか少量
しかない或る種のmRNA,psmRNA,hnRN
A,pshnRNA,snRNA、又はpssnRNA
に特異的なプローブの利用に基づく方法を用いてこれら
生物又は細胞の増殖状態を測定することもできる。
殖しないかゆっくり増殖する細胞には存在しないか少量
しかない或る種のmRNA,psmRNA,hnRN
A,pshnRNA,snRNA、又はpssnRNA
に特異的なプローブの利用に基づく方法を用いてこれら
生物又は細胞の増殖状態を測定することもできる。
【0386】例えば、速やかに増殖する細胞には、RN
Aポリメラーゼという蛋白質に対するmRNAが豊富
に、即ち1細胞あたり数百コピー存在する。増殖してい
ない細胞ではほんの少しのRNAが合成され、mRNA
はほとんど存在しない。
Aポリメラーゼという蛋白質に対するmRNAが豊富
に、即ち1細胞あたり数百コピー存在する。増殖してい
ない細胞ではほんの少しのRNAが合成され、mRNA
はほとんど存在しない。
【0387】上記ウイルスが細胞中で速やかに増殖して
いる時には豊富にあり、ウイルスが細胞にはあるが増殖
していない時にはない或る種のウイルスmRNA又はp
smRNAに特異的なプローブの利用に基づく方法を用
いて細胞内のウイルスの増殖状態を測定することもでき
る。
いる時には豊富にあり、ウイルスが細胞にはあるが増殖
していない時にはない或る種のウイルスmRNA又はp
smRNAに特異的なプローブの利用に基づく方法を用
いて細胞内のウイルスの増殖状態を測定することもでき
る。
【0388】こうして或る特定カテゴリーに属する生物
のメンバーが試料中にあることがわかっている状態で
は、単一のプローブを用いて上記生物の増殖状態を測定
することができる。
のメンバーが試料中にあることがわかっている状態で
は、単一のプローブを用いて上記生物の増殖状態を測定
することができる。
【0389】例えば、その生物にpsrRNAが検出で
きなければ、それは増殖していない状態にある。もしp
srRNAがその生物に検出されはしたが、そこにある
生物の数に比べて相対的に少量である場合には、その生
物はゆっくり増殖している。もしそこにある生物の数に
比して多量のpsRNAが検出されるならば、その生物
は速やかに増殖している。
きなければ、それは増殖していない状態にある。もしp
srRNAがその生物に検出されはしたが、そこにある
生物の数に比べて相対的に少量である場合には、その生
物はゆっくり増殖している。もしそこにある生物の数に
比して多量のpsRNAが検出されるならば、その生物
は速やかに増殖している。
【0390】特定の生物又は生物クラスの増殖状態を測
定する又は別のアプローチは2つのプローブの利用に基
づく。その各々は、特定カテゴリーの生物に由来するR
NAにのみハイブリダイズし、1つのプローブは、増殖
しない生物又は細胞でも、速やかに増殖する生物又は細
胞でも大体同量前記生物中に存在する安定RNA(rR
NA又はtRNA)に特異的である。他のプローブは速
やかに増殖する細胞には豊富にあり、増殖しない生物又
は細胞には存在しないかもしくは少量存在する特定のm
RNA,psmRNA,pstRNA,pssnRN
A,hnRNA,pshnRNA又はpsrRNA又は
psrRNA配列(1又は複数)に特異的である。これ
らのプローブは、それぞれに特異的で試料中に存在する
RNA量を検出、同定及び定量するために用いられる。
これらのRNAの量比は、その生物又は細胞の増殖状態
の指標を示す。
定する又は別のアプローチは2つのプローブの利用に基
づく。その各々は、特定カテゴリーの生物に由来するR
NAにのみハイブリダイズし、1つのプローブは、増殖
しない生物又は細胞でも、速やかに増殖する生物又は細
胞でも大体同量前記生物中に存在する安定RNA(rR
NA又はtRNA)に特異的である。他のプローブは速
やかに増殖する細胞には豊富にあり、増殖しない生物又
は細胞には存在しないかもしくは少量存在する特定のm
RNA,psmRNA,pstRNA,pssnRN
A,hnRNA,pshnRNA又はpsrRNA又は
psrRNA配列(1又は複数)に特異的である。これ
らのプローブは、それぞれに特異的で試料中に存在する
RNA量を検出、同定及び定量するために用いられる。
これらのRNAの量比は、その生物又は細胞の増殖状態
の指標を示す。
【0391】本発明の特定の実施例として、試料中に存
在するrRNAおよびpsrRNAを検出、同定、定量
するために2種のプローブを使用する。一方のプローブ
は特定のカテゴリーの生物又は細胞のrRNAに特異的
であり、他方のプローブは同一カテゴリーの生物又は細
胞のpsrRNAに特異的である。
在するrRNAおよびpsrRNAを検出、同定、定量
するために2種のプローブを使用する。一方のプローブ
は特定のカテゴリーの生物又は細胞のrRNAに特異的
であり、他方のプローブは同一カテゴリーの生物又は細
胞のpsrRNAに特異的である。
【0392】試料中にあるpsRNA:rRNAの量の
比は、その生物又は細胞の増殖状態の指標である。速や
かに増殖する細胞ではpsrRNAの数千のコピーがあ
りpsrRNA/rRNAの比は最大である。ゆっくり
増殖する細胞では比較的少量のpsrRNAがあり、p
srRNA/rRNAの比はずっと小さくなる。
比は、その生物又は細胞の増殖状態の指標である。速や
かに増殖する細胞ではpsrRNAの数千のコピーがあ
りpsrRNA/rRNAの比は最大である。ゆっくり
増殖する細胞では比較的少量のpsrRNAがあり、p
srRNA/rRNAの比はずっと小さくなる。
【0393】増殖していない細胞ではpsrRNAはな
い筈であり、psrRNA/rRNAの比は最小であ
る。
い筈であり、psrRNA/rRNAの比は最小であ
る。
【0394】この同じ2プローブ法は、上記のプローブ
の異なる種々の組み合わせで用いられる。プローブで検
出される前記の特殊のカテゴリーのメンバーではない生
物又は細胞の存在下で行われ得る。
の異なる種々の組み合わせで用いられる。プローブで検
出される前記の特殊のカテゴリーのメンバーではない生
物又は細胞の存在下で行われ得る。
【0395】ここに述べた特殊カテゴリーの生物の増殖
状態を測定するための方法の明白な応用は、血液、尿そ
の他の体液又は組織又はその他の試料中の抗菌剤の存在
を決定するために、又、特定の抗菌剤又はそのような薬
剤群に対する、特定カテゴリーの生物の感受性を決定す
るためにこれらの方法を使用することである。
状態を測定するための方法の明白な応用は、血液、尿そ
の他の体液又は組織又はその他の試料中の抗菌剤の存在
を決定するために、又、特定の抗菌剤又はそのような薬
剤群に対する、特定カテゴリーの生物の感受性を決定す
るためにこれらの方法を使用することである。
【0396】例えば、特定の薬剤によって増殖を完全に
阻害される細菌は最小のpsrRNA/rRNA比をも
つ。
阻害される細菌は最小のpsrRNA/rRNA比をも
つ。
【0397】ウイルスの検出、同定および定量
特定のウイルス又はウイルス群が試料中にあるかどうか
を速やかに決定できることは、しばしば重要である。こ
れは、ここに記載の核酸ハイブリダイゼーションテスト
により達せられる。
を速やかに決定できることは、しばしば重要である。こ
れは、ここに記載の核酸ハイブリダイゼーションテスト
により達せられる。
【0398】(a)溶液内ハイブリダイズに使える核酸
を速くつくる方法、(b)核酸ハイブリダイズの速度を
著しく促進する方法、(c)ハイブリダイズしたプロー
ブの存在をアッセイする迅速な方法を組み合わせた迅速
な核酸ハイブリダイゼーションテストが、関心のウイル
ス群に相補的な核酸プローブの使用によって試料中にあ
るDNA又はRNAウイルス群の検出、同定および定量
に直接応用できる。
を速くつくる方法、(b)核酸ハイブリダイズの速度を
著しく促進する方法、(c)ハイブリダイズしたプロー
ブの存在をアッセイする迅速な方法を組み合わせた迅速
な核酸ハイブリダイゼーションテストが、関心のウイル
ス群に相補的な核酸プローブの使用によって試料中にあ
るDNA又はRNAウイルス群の検出、同定および定量
に直接応用できる。
【0399】その上、そのようなウイルスアッセイ法を
用いて特定の抗ウイルス剤の効力を測定したり、血液、
尿およびその他の試料中の抗ウイルス活性の存在を測定
することができる。
用いて特定の抗ウイルス剤の効力を測定したり、血液、
尿およびその他の試料中の抗ウイルス活性の存在を測定
することができる。
【0400】生物の食細胞の検査によって微生物感染を
検出する方法 上述のrRNAに特異的な核酸ハイブリダイゼーション
テストの特徴である検出の極端に高い感受性および特異
性は、微生物診断用の適切な臨床標本を得ることに関し
ておこる問題に簡単な解決を与える。
検出する方法 上述のrRNAに特異的な核酸ハイブリダイゼーション
テストの特徴である検出の極端に高い感受性および特異
性は、微生物診断用の適切な臨床標本を得ることに関し
ておこる問題に簡単な解決を与える。
【0401】多くの場合、白血球(以後WBCと記す)
フラクションを含む簡単な血液テスト試料で十分であ
る。
フラクションを含む簡単な血液テスト試料で十分であ
る。
【0402】このWBCアプローチを用いる一つのやり
方は、まず、WBC試料をすべての細菌群のメンバーか
ら分離したrRNAにハイブリダイズし、その他の起源
に由来するrRNAには、ハイブリダイズしない標識プ
ローブとハイブリダイズさせることである。そのような
プローブは、どんな細菌にとっても一般的スクリーニン
グ手段として役立つ。
方は、まず、WBC試料をすべての細菌群のメンバーか
ら分離したrRNAにハイブリダイズし、その他の起源
に由来するrRNAには、ハイブリダイズしない標識プ
ローブとハイブリダイズさせることである。そのような
プローブは、どんな細菌にとっても一般的スクリーニン
グ手段として役立つ。
【0403】細菌rRNAにポジティブである試料は、
それから更にその存在する細菌を同定するために、その
他のプローブで段階的にアッセイを受ける。
それから更にその存在する細菌を同定するために、その
他のプローブで段階的にアッセイを受ける。
【0404】例えば、エンテロバクター(Enterobacte
r)科のメンバー由来のrRNAにはハイブリダイズす
るが、その他のあらゆる起源に由来するrRNAにはハ
イブリダイズしないプローブを用いてエンテロバクター
(Enterobacter)菌を検出又は除外することができる。
一方、嫌気菌のrRNAにのみ特異的なプローブは、嫌
気菌を見出すために用いられる。
r)科のメンバー由来のrRNAにはハイブリダイズす
るが、その他のあらゆる起源に由来するrRNAにはハ
イブリダイズしないプローブを用いてエンテロバクター
(Enterobacter)菌を検出又は除外することができる。
一方、嫌気菌のrRNAにのみ特異的なプローブは、嫌
気菌を見出すために用いられる。
【0405】上記の例証は、核酸ハイブリダイゼーショ
ンによって微生物感染を速やかに診断するための最初の
臨床試験としてWBCを用いる多くの可能な方法の中の
一つに過ぎない。例えば、診断のためには、患者の臨床
症状によってプローブの異なる組み合わせが用いられ
る。
ンによって微生物感染を速やかに診断するための最初の
臨床試験としてWBCを用いる多くの可能な方法の中の
一つに過ぎない。例えば、診断のためには、患者の臨床
症状によってプローブの異なる組み合わせが用いられ
る。
【0406】以下に列挙する出版物は、本発明の種々の
面と関係があるので、開示の一部としてかかげる。
面と関係があるので、開示の一部としてかかげる。
【0407】1 Repeated Sequences in DNA, R.J.Bri
tten and D.E.Kohne, Science(1968) 161 p529。
tten and D.E.Kohne, Science(1968) 161 p529。
【0408】2 Kinetics of Renaturation of DNA,
J.G.Wetmur and N.Davidson, J.Mol.Biol.(1968) 31 p3
49 。
J.G.Wetmur and N.Davidson, J.Mol.Biol.(1968) 31 p3
49 。
【0409】3 Hydroxyapatite Techniques for Nucl
eic Acid Reassociation, D.E.Kohne and R.J.Britten,
in Procedures in Nucleic Acid Research(1971), eds
Cantoni and Davies, Harper and Row, Vol, 2, p500
。
eic Acid Reassociation, D.E.Kohne and R.J.Britten,
in Procedures in Nucleic Acid Research(1971), eds
Cantoni and Davies, Harper and Row, Vol, 2, p500
。
【0410】4 Hybridization of Denatured RNA and
Small Fragments Transferred toNitrocellulose, P.
S.Thomas, Proc. Natl. Acad Sci. USA(1980) 77 p520
1。
Small Fragments Transferred toNitrocellulose, P.
S.Thomas, Proc. Natl. Acad Sci. USA(1980) 77 p520
1。
【0411】5 DNA-DNA Hybridization on Nitrocell
ulose Filters General Considerations and Non-Ideal
Kineteics, Wur. J.Biochem.(1974) 47 p535 。
ulose Filters General Considerations and Non-Ideal
Kineteics, Wur. J.Biochem.(1974) 47 p535 。
【0412】6 Assay of DNA-DNA Hybrids by S1 Nu
clease Digestion and Adsorptionto DEAE-Cellulose F
ilters, I.Maxwell et al., Nucleic Acids Research
(1978) 5 p2033。
clease Digestion and Adsorptionto DEAE-Cellulose F
ilters, I.Maxwell et al., Nucleic Acids Research
(1978) 5 p2033。
【0413】7 Molecular cloning, A Laboratory Ma
nual, T. Maniatis et al., ColdSpring Harbor Publi
cation, (1982) 。
nual, T. Maniatis et al., ColdSpring Harbor Publi
cation, (1982) 。
【0414】8 Efficent Transcription of RNA into
DNA by Avian Sarcoma Virus Polymerase, J. Taylor
et al., Biocimica et Biophys. Acta(1976) 442 p32
4 9 Use of Specific Radioactive Probes to Study Tr
anscription and Replication of the Influenze Virus
Genome, J.Taylor et al., J.Virology (1977) 21 #2
p530。
DNA by Avian Sarcoma Virus Polymerase, J. Taylor
et al., Biocimica et Biophys. Acta(1976) 442 p32
4 9 Use of Specific Radioactive Probes to Study Tr
anscription and Replication of the Influenze Virus
Genome, J.Taylor et al., J.Virology (1977) 21 #2
p530。
【0415】10 Virus Detection by Nucleic Acid Hy
bridization : Examenation of Normal and ALs Tissue
for the Presence of Poliovirus, D. Kohne et al.,
Journal of General Virology (1981) 56 p223-233 。
bridization : Examenation of Normal and ALs Tissue
for the Presence of Poliovirus, D. Kohne et al.,
Journal of General Virology (1981) 56 p223-233 。
【0416】11 Leukemogenesis by Bovine Leukemia
Virus, R.Kettmann et al., Proc.Natl. Acad. Sci. US
A (1982) 79 #8 p2465-2469。
Virus, R.Kettmann et al., Proc.Natl. Acad. Sci. US
A (1982) 79 #8 p2465-2469。
【0417】12 Prenatal Diagnosis of a Thalassemi
a : Clinical Application of Molecular Hybridizatio
n, Y. Kan et al., New England Journal of Medicine
(1976) 295 #21 p1165-1167 。
a : Clinical Application of Molecular Hybridizatio
n, Y. Kan et al., New England Journal of Medicine
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【0418】13 Gene Deletions in a Thalassemia Pr
ove that the 5' Locus is Functional, L.Pressley et
al., Proc. Natl, Acad, Sci. USA (1980) 77 #6 p358
6-3589。
ove that the 5' Locus is Functional, L.Pressley et
al., Proc. Natl, Acad, Sci. USA (1980) 77 #6 p358
6-3589。
【0419】14 Use of Synthetic Oligonucleotides
as Hybridization Probes, S.V.Suggs et al., Proc.
Natl. Acad. Sci, USA (1981) 78 p6613。
as Hybridization Probes, S.V.Suggs et al., Proc.
Natl. Acad. Sci, USA (1981) 78 p6613。
【0420】15 Identification of Enterotoxigenic
E.coli by Colony HybridizationUsing 3 Enterotox i
n Gene Probes, S.L.Mosely et al., J. of Infect. D
iseases (1982) 145 #6 p863。
E.coli by Colony HybridizationUsing 3 Enterotox i
n Gene Probes, S.L.Mosely et al., J. of Infect. D
iseases (1982) 145 #6 p863。
【0421】16 DNA Reassociation in the Taxonomy
of Enteric Bacteria, D.Brenner,Int. J. Systematic
Bacteriology (1973) 23 #4 p298-307。
of Enteric Bacteria, D.Brenner,Int. J. Systematic
Bacteriology (1973) 23 #4 p298-307。
【0422】17 Comparative Study of Ribosomal RNA
Cistons Enterobacteria and Myxobacteria, R.Moore
et al., J.Bacteriology (1967) 94 p1066-1074 。
Cistons Enterobacteria and Myxobacteria, R.Moore
et al., J.Bacteriology (1967) 94 p1066-1074 。
【0423】18 Ribosomal RNA Similarities in the
Classification of Rhodococcus and Related Taxa, M.
Mordarski et al., J.General Microbiology (1980) 11
8 p313-319 。
Classification of Rhodococcus and Related Taxa, M.
Mordarski et al., J.General Microbiology (1980) 11
8 p313-319 。
【0424】19 Retention of Common Nucleotide Seq
uences in the Ribosomal RNA DNAof Eukaryotes and S
ome of their Physical Characteristics, J.Sinclair
etal., Biochemistry (1971) 10 p2761。
uences in the Ribosomal RNA DNAof Eukaryotes and S
ome of their Physical Characteristics, J.Sinclair
etal., Biochemistry (1971) 10 p2761。
【0425】20 Homologies Among Ribosomal RNA and
Messenger RNA Genes in Chloroplasts, Mitochondri
a and E.coli, H.Bohnert et al., Molecular and Gene
ralGenetics (1980) 179 p539-545 。
Messenger RNA Genes in Chloroplasts, Mitochondri
a and E.coli, H.Bohnert et al., Molecular and Gene
ralGenetics (1980) 179 p539-545 。
【0426】21 Heterogeneity of the Conserved Rib
osomal RNA Sequences of Bacillussubtilis, R.Doe e
t al., J.Bacteriology (1966) 92 #1 p88 。
osomal RNA Sequences of Bacillussubtilis, R.Doe e
t al., J.Bacteriology (1966) 92 #1 p88 。
【0427】22 Isolation and Characterization of
Bacterial Ribosomal RNA Cistrons, D.Kohne, Biophys
ical Journal (1968) 8 #10 p1104-1118 。
Bacterial Ribosomal RNA Cistrons, D.Kohne, Biophys
ical Journal (1968) 8 #10 p1104-1118 。
【0428】23 Taxonomic Relations Between Archae
bacteria Including 6 Novel Genera Examined by Cros
s Hybridization of DNAs and 16S R-RNAs, J.Tu et a
l.,J.Mol.Evol (1982)18 p109 。
bacteria Including 6 Novel Genera Examined by Cros
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A with Excess DNA, G.Galau et al., Proc. Natl. Aca
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sing the rate of DNA Reassociation by Many Thousan
dfold : The Phenol Emulsion Reassociation Techniqu
e,D.Kohne et al., Biochemistry Vol.16 #24 (1977) p
5349。
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einhold Co. (New York) 1983 。
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【0441】36 Gene Expression 2, B.Lewin, J.Wile
y & Sons, Wiley-Interscience Publication (1980) Ne
w York。
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【0442】37 Gene Expression 1, B.Lewin, Wiley
& Sons, Wiley-Interscience Publication (1974) New
York。
& Sons, Wiley-Interscience Publication (1974) New
York。
【0443】明細書および請求の範囲中に用いられてい
る用語の定義を、次に記す。
る用語の定義を、次に記す。
【0444】用語の定義
塩基:下記ヌクレオチドの項参照。
【0445】不適性塩基対:下記不完全相補的な塩基配
列の項参照。
列の項参照。
【0446】塩基配列(ヌクレオチド配列又は遺伝子配
列又はポリヌクレオチド配列又は1本鎖核酸配列):複
数の塩基から成るDNA又はRNA分子。
列又はポリヌクレオチド配列又は1本鎖核酸配列):複
数の塩基から成るDNA又はRNA分子。
【0447】相補的塩基対:或る塩基は、互いに化学的
親和性を有し、対を形成する。この場合、塩基は互いに
相補的であるという。相補的塩基対は、DNAではA:
TとG:C、RNAではA:Uである。
親和性を有し、対を形成する。この場合、塩基は互いに
相補的であるという。相補的塩基対は、DNAではA:
TとG:C、RNAではA:Uである。
【0448】相補的鎖又は相補的塩基配列:完全に相補
的な核酸分子とは、1分子中の各塩基が他の鎖中の相補
的な塩基と対になって、安定な2重らせん分子を形成す
る核酸分子をいう。その個々の鎖を相補的鎖という。
的な核酸分子とは、1分子中の各塩基が他の鎖中の相補
的な塩基と対になって、安定な2重らせん分子を形成す
る核酸分子をいう。その個々の鎖を相補的鎖という。
【0449】クリテリオン:最も正確には、2本鎖核酸
の融解温度と、ハイブリダイゼーションが行われる温度
との差と定義される。2本鎖核酸の融解温度は、主とし
て、溶液の塩濃度によって定まる。クリテリオンは、2
本の1本鎖が安定な2本鎖分子を形成するために必要な
相補性の程度を定める。クリテリオンは、ストリンジェ
ントであるとか、ストリンジェントではない、と記載さ
れる。高度ストリンジェントなクリテリオンでは、2本
の相互作用する相補的配列が高度に相補的であって、安
定な2本鎖分子が形成されることが要求される。ストリ
ンジェントでないクリテリオンとは、比較的似ていない
相補的鎖が相互に作用して2本鎖分子を形成することを
可能とするクリテリオンである。高度なストリンジェン
トでは、2本鎖分子中に少量の不適性塩基対の存在しか
許されない。あまりストリンジェントでないクリテリオ
ンでは、ハイブリダイゼーション産物中に多量の不適性
塩基対が許される。
の融解温度と、ハイブリダイゼーションが行われる温度
との差と定義される。2本鎖核酸の融解温度は、主とし
て、溶液の塩濃度によって定まる。クリテリオンは、2
本の1本鎖が安定な2本鎖分子を形成するために必要な
相補性の程度を定める。クリテリオンは、ストリンジェ
ントであるとか、ストリンジェントではない、と記載さ
れる。高度ストリンジェントなクリテリオンでは、2本
の相互作用する相補的配列が高度に相補的であって、安
定な2本鎖分子が形成されることが要求される。ストリ
ンジェントでないクリテリオンとは、比較的似ていない
相補的鎖が相互に作用して2本鎖分子を形成することを
可能とするクリテリオンである。高度なストリンジェン
トでは、2本鎖分子中に少量の不適性塩基対の存在しか
許されない。あまりストリンジェントでないクリテリオ
ンでは、ハイブリダイゼーション産物中に多量の不適性
塩基対が許される。
【0450】核酸の変性又は解離:2本鎖核酸分子中の
塩基対間の結合が切れ、2本の1本鎖分子を生成し、こ
れらがその後拡散して互いに離れる。
塩基対間の結合が切れ、2本の1本鎖分子を生成し、こ
れらがその後拡散して互いに離れる。
【0451】2本鎖核酸:細胞中でみられるように、大
部分のDNAは2本鎖の状態にある。DNAは、らせん
状に互いに巻きついた2本のDNA分子又は鎖から成
る。塩基は内側に向き合って、互いに、別の鎖の相補的
塩基に特異的に結合する。例えば1本の鎖のAは常に他
の鎖のTと対になり、1本の鎖のGは他の鎖のCと対に
なる。細菌細胞では、2本鎖分子は約5×106 塩基対
の長さである。この分子の1本の鎖の塩基の各々は、他
の鎖のそれに相補的な塩基と対になる。個々の2鎖分子
の塩基配列は相補的鎖と称される。
部分のDNAは2本鎖の状態にある。DNAは、らせん
状に互いに巻きついた2本のDNA分子又は鎖から成
る。塩基は内側に向き合って、互いに、別の鎖の相補的
塩基に特異的に結合する。例えば1本の鎖のAは常に他
の鎖のTと対になり、1本の鎖のGは他の鎖のCと対に
なる。細菌細胞では、2本鎖分子は約5×106 塩基対
の長さである。この分子の1本の鎖の塩基の各々は、他
の鎖のそれに相補的な塩基と対になる。個々の2鎖分子
の塩基配列は相補的鎖と称される。
【0452】ハイブリダイゼーション:下記核酸ハイブ
リダイゼーションの項参照。
リダイゼーションの項参照。
【0453】不完全相補的な塩基配列(不適性塩基
対):2本の鎖の間で安定な2本鎖分子が形成される
が、一方の鎖のある塩基部分が、他の鎖の非相補的塩基
と対になっている場合をいう。
対):2本の鎖の間で安定な2本鎖分子が形成される
が、一方の鎖のある塩基部分が、他の鎖の非相補的塩基
と対になっている場合をいう。
【0454】標識プローブ又は標識配列:核酸ハイブリ
ダイゼーションによって他の核酸を検出するのに用いる
1本鎖核酸分子。プローブ分子は、特異的に検出され得
るように標識されている。これは、特定の標識分子を核
酸に取り込ませるとか、特定の標識を核酸に結合させる
ことによって達せられる。
ダイゼーションによって他の核酸を検出するのに用いる
1本鎖核酸分子。プローブ分子は、特異的に検出され得
るように標識されている。これは、特定の標識分子を核
酸に取り込ませるとか、特定の標識を核酸に結合させる
ことによって達せられる。
【0455】最も有効なプローブは、それ自身はハイブ
リダイズしないが、検出すべき核酸が存在する場合のみ
ハイブリダイズすることのできる、標識した1本鎖核酸
配列である。非常に多種類の異なる標識が使える。これ
らの中には、放射性物質、蛍光物質、および化学発光物
質などが含まれる。
リダイズしないが、検出すべき核酸が存在する場合のみ
ハイブリダイズすることのできる、標識した1本鎖核酸
配列である。非常に多種類の異なる標識が使える。これ
らの中には、放射性物質、蛍光物質、および化学発光物
質などが含まれる。
【0456】核酸ハイブリダイゼーション又はハイブリ
ダイゼーション(再対合又は復元):2本鎖分子の2本
の鎖間の結合が切れて、2本の1本鎖が互いに完全に分
離することがある。適当な条件下では、これらの相補的
な1本鎖は衝突し、互いを認識し、2重らせん分子を再
形成し得る。このような相補的1本鎖分子から2本鎖分
子が形成されるプロセスを核酸ハイブリダイゼーション
という。核酸ハイブリダイゼーションは、部分的に相補
的なRNAおよびDNAの1本鎖間でもおこり得る。
ダイゼーション(再対合又は復元):2本鎖分子の2本
の鎖間の結合が切れて、2本の1本鎖が互いに完全に分
離することがある。適当な条件下では、これらの相補的
な1本鎖は衝突し、互いを認識し、2重らせん分子を再
形成し得る。このような相補的1本鎖分子から2本鎖分
子が形成されるプロセスを核酸ハイブリダイゼーション
という。核酸ハイブリダイゼーションは、部分的に相補
的なRNAおよびDNAの1本鎖間でもおこり得る。
【0457】ヌクレオチド、ヌクレオチド塩基又は塩
基:大部分のDNAは、たった4種類の窒素含有塩基の
配列から成る。即ちアデニンA、チミンT、グアニン
G、シトシンCである。これらの塩基が組み合わさって
遺伝アルファベットを形成し、それらの長い規則正しい
配列は、遺伝暗号の形で遺伝子情報を数多く含む。大部
分のRNAもまた4種類だけの塩基の配列から成る。し
かし、RNAではチミンの変わりにウリジンUが入る。
基:大部分のDNAは、たった4種類の窒素含有塩基の
配列から成る。即ちアデニンA、チミンT、グアニン
G、シトシンCである。これらの塩基が組み合わさって
遺伝アルファベットを形成し、それらの長い規則正しい
配列は、遺伝暗号の形で遺伝子情報を数多く含む。大部
分のRNAもまた4種類だけの塩基の配列から成る。し
かし、RNAではチミンの変わりにウリジンUが入る。
【0458】再対合:上記核酸ハイブリダイゼーション
の項参照。
の項参照。
【0459】復元:上記核酸ハイブリダイゼーションの
項参照。
項参照。
【0460】リボソームRNAすなわちrRNA:リボ
ソーム中にあるRNA。ほとんどすべてのリボソーム
は、3種類の1本鎖RNAサブユニットを含む。その1
つは大きく、1つは中位で、1つは小さい リボソーム:蛋白合成に必要な細胞内粒子(RNAと蛋
白質とを含む)。ウイルス以外のすべての生命体はリボ
ソームを含む rRNA DNA又はrRNA遺伝子:リボソームRN
AをコードするDNA中の塩基配列。各rRNAサブユ
ニットは別個の遺伝子によってコードされる。
ソーム中にあるRNA。ほとんどすべてのリボソーム
は、3種類の1本鎖RNAサブユニットを含む。その1
つは大きく、1つは中位で、1つは小さい リボソーム:蛋白合成に必要な細胞内粒子(RNAと蛋
白質とを含む)。ウイルス以外のすべての生命体はリボ
ソームを含む rRNA DNA又はrRNA遺伝子:リボソームRN
AをコードするDNA中の塩基配列。各rRNAサブユ
ニットは別個の遺伝子によってコードされる。
【0461】rRNAプローブ:rRNAに相補的で、
rRNAにハイブリダイズして安定な2本鎖分子を形成
する標識核酸配列。
rRNAにハイブリダイズして安定な2本鎖分子を形成
する標識核酸配列。
【0462】mRNA:mRNAは、特定の蛋白質を規
定するのに必要な情報を含む直接の遺伝産物である。細
胞の機序によって、mRNAの配列が特定の蛋白質に変
換される。各細胞には多くの異なるmRNAが存在す
る。
定するのに必要な情報を含む直接の遺伝産物である。細
胞の機序によって、mRNAの配列が特定の蛋白質に変
換される。各細胞には多くの異なるmRNAが存在す
る。
【0463】hnRNA:真核細胞の核中に存在するR
NA配列の複雑な一群であって、前駆体mRNA分子を
含む。殆どのhnRNA配列は核からでることはない。
これらの分子の大部分は機能がわかっていない。
NA配列の複雑な一群であって、前駆体mRNA分子を
含む。殆どのhnRNA配列は核からでることはない。
これらの分子の大部分は機能がわかっていない。
【0464】snRNA:主として真核細胞の核中にて
大量に存在する比較的安定な小さい核RNAの一群。
大量に存在する比較的安定な小さい核RNAの一群。
【0465】前駆体RNA:原核生物及び真核生物にお
ける多くのRNA分子は大きいRNA分子の一部として
合成され、それから種々のタイプの成熟RNA分子とそ
の他のより小さい配列(これは明らかにすてられる)が
形成される。
ける多くのRNA分子は大きいRNA分子の一部として
合成され、それから種々のタイプの成熟RNA分子とそ
の他のより小さい配列(これは明らかにすてられる)が
形成される。
【0466】前駆体特異的RNA(psRNA):前駆
体mRNA,tRNA,rRNA,snRNA,hnR
NAに存在し、成熟rRNA,tRNA,mRNA,s
nRNA、およびhnRNA分子には存在しないRNA
配列。
体mRNA,tRNA,rRNA,snRNA,hnR
NAに存在し、成熟rRNA,tRNA,mRNA,s
nRNA、およびhnRNA分子には存在しないRNA
配列。
【0467】2本鎖核酸分子の熱安定性:熱安定性、す
なわち2本鎖分子集団の半分が1本鎖形に変化する融解
温度。
なわち2本鎖分子集団の半分が1本鎖形に変化する融解
温度。
【0468】制限酵素:異種核酸に対する制限−修飾細
胞防御システムの成分。これらの酵素は、非修飾(例え
ばメチル化)2本鎖DNAをある一点で、二重対称を示
す特定配列のところで切断する。
胞防御システムの成分。これらの酵素は、非修飾(例え
ばメチル化)2本鎖DNAをある一点で、二重対称を示
す特定配列のところで切断する。
【0469】トランスファーRNA(tRNA):蛋白
合成が行われている間、個々のアミノ酸は種々の特異的
アダプター分子すなわちtRNA分子によって正しい順
序に並ばされる。各アミノ酸は、異なるtRNA種によ
って配列させられる。
合成が行われている間、個々のアミノ酸は種々の特異的
アダプター分子すなわちtRNA分子によって正しい順
序に並ばされる。各アミノ酸は、異なるtRNA種によ
って配列させられる。
【0470】以上本発明を詳細に例を挙げて説明した
が、この発明の精神に反することなく、種々の変更、同
等物および別法の使用が可能であり、そのような変更、
同等物および別法のすべては、添附の請求の範囲内に含
まれることは明らかである。
が、この発明の精神に反することなく、種々の変更、同
等物および別法の使用が可能であり、そのような変更、
同等物および別法のすべては、添附の請求の範囲内に含
まれることは明らかである。
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フロントページの続き
(56)参考文献 米国特許4358535(US,A)
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ber 1981
(58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名)
C12Q 1/68 A
C12N 15/00 A
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 1.試料中の非ウイルス性生物を核酸ハイブリダイゼー
ションにより検出、同定または定量する方法において使
用される核酸プローブであって、当該核酸プローブが、
実質的に、非ウイルス性生物または生物群の(a)rR
NAもしくはtRNAまたは(b)rRNAもしくはt
RNAをコードするDNAの2本鎖のうちのいずれか1
本、の当該生物または生物群に特異的な部分配列にのみ
相補的かつハイブリダイズするように選択されているこ
とを特徴とするプローブ。 2.当該核酸ブローブがDNAの1本鎖である請求項1
に記載のプローブ。 3.当該核酸プローブがRNAの1本鎖である請求項1
に記載のプローブ。 4.当該核酸プローブが標識されている請求項1のプロ
ーブ。 5.標識が、放射性同位元素、蛍光、酵素及びビオチン
からなる群より選択される請求項4に記載のプローブ。 6.標的非ウイルス性生物群が、種、属、科、目、鋼、
門及び界からなる群から選択される分類群に属するもの
である請求項1に記載のプローブ。 7.標的非ウイルス性生物群と非標的生物群とが同じ分
類群に属するものである請求項6に記載のプローブ。 8.標的生物あるいは生物群のrRNA又はtRNAの
部分配列に実質的に相補的である塩基配列を有するクロ
ーンで、かつ、ハイブリダイゼーション条件下で該標的
生物あるいは生物群に特異的にハイブリダイズするクロ
ーンを同定することにより選択される請求項1に記載の
プローブ。 9.核酸プローブがハイブリダイゼーション選択により
選択される請求項1に記載のプローブ。 10.核酸プローブが異なる生物のrRNA又はtRN
Aの塩基配列を比較し、標的生物または生物群に特異的
な1以上のrRNA又はtRNAの部分配列を同定する
ことよって選択される請求項1に記載のプローブ。 11.核酸プローブの塩基配列が化学的に合成されたも
のである請求項1ないし10に記載のプローブ。 12.核酸プローブが、当該プローブの塩基配列に相補
的な核酸分子を含まないプローブ混合物中に提供され
る、請求項1に記載のプローブ。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US45672983A | 1983-01-10 | 1983-01-10 | |
US456729 | 1983-01-10 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59500696A Division JPS60501339A (ja) | 1983-01-10 | 1984-01-09 | 生物を検出、同定又は定量する方法およびキット |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH08266299A JPH08266299A (ja) | 1996-10-15 |
JP2976406B2 true JP2976406B2 (ja) | 1999-11-10 |
Family
ID=23813907
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59500696A Granted JPS60501339A (ja) | 1983-01-10 | 1984-01-09 | 生物を検出、同定又は定量する方法およびキット |
JP3315062A Expired - Lifetime JPH0771519B2 (ja) | 1983-01-10 | 1991-11-28 | 微生物の感受性測定法 |
JP8028340A Expired - Lifetime JP2976406B2 (ja) | 1983-01-10 | 1996-02-15 | 核酸プローブ |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59500696A Granted JPS60501339A (ja) | 1983-01-10 | 1984-01-09 | 生物を検出、同定又は定量する方法およびキット |
JP3315062A Expired - Lifetime JPH0771519B2 (ja) | 1983-01-10 | 1991-11-28 | 微生物の感受性測定法 |
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Country | Link |
---|---|
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EP (3) | EP0531798B2 (ja) |
JP (3) | JPS60501339A (ja) |
AT (3) | ATE167524T1 (ja) |
AU (3) | AU2490284A (ja) |
CA (1) | CA1215904A (ja) |
DE (4) | DE3486467T3 (ja) |
DK (1) | DK430384A (ja) |
FI (1) | FI843529A0 (ja) |
NO (1) | NO843574L (ja) |
WO (1) | WO1984002721A1 (ja) |
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