JP2952750B2

JP2952750B2 - モノクローナル抗体

Info

Publication number: JP2952750B2
Application number: JP7058240A
Authority: JP
Inventors: 敏夫國方; 睦子谷口; 恵三河野; 雅司栗本
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1995-02-23
Filing date: 1995-02-23
Publication date: 1999-09-27
Anticipated expiration: 2014-09-27
Also published as: US6509449B1; US6268486B1; US20030129184A1; JPH08231598A; US7405048B2; US6197297B1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は新規なモノクローナル
抗体に関するものであり、詳細には、免疫担当細胞にお
いてインターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」と略
記する。）の産生を誘導するポリペプチドに特異的なモ
ノクローナル抗体に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ＩＦＮ−γは、抗ウイルス作用、抗腫瘍
作用、免疫調節作用を有する蛋白質として知られ、抗原
やマイトジェンによる刺激を受けた免疫担当細胞が産生
すると云われている。これら生物作用ゆえに、ＩＦＮ−
γはその発見当初より抗腫瘍剤としての実用化が鶴首さ
れ、現在では脳腫瘍を始めとする悪性腫瘍一般の治療剤
として精力的に臨床試験が進められている。現在入手し
得るＩＦＮ−γは免疫担当細胞が産生する天然型ＩＦＮ
−γと、免疫担当細胞から採取したＩＦＮ−γをコード
するＤＮＡを大腸菌に導入してなる形質転換体が産生す
る組換え型ＩＦＮ−γに大別され、上記臨床試験におい
ては、これらのうちのいずれかが「外来ＩＦＮ−γ」と
して投与されている。

【０００３】このうち、天然型ＩＦＮ−γは、通常、培
養株化した免疫担当細胞をＩＦＮ−γ誘導剤を含む培養
培地で培養し、その培養物を精製することにより製造さ
れる。この方法では、ＩＦＮ−γ誘導剤の種類がＩＦＮ
−γの産生量や精製のし易さ、さらには、製品の安全性
等に多大の影響を及ぼすと云われており、通常、コンカ
ナバリンＡ、レンズ豆レクチン、アメリカヤマゴボウレ
クチン、エンドトキシン、リポ多糖などのマイトジェン
が頻用される。しかしながら、これら物質は、いずれも
分子に多様性があり、給源や精製方法に依って品質が変
動し易く、誘導能の一定したＩＦＮ−γ誘導剤を所望量
入手し難いという問題がある。くわえて、上記物質の多
くは生体に投与すると顕著な副作用を示したり、物質に
依っては毒性を示すものすらあり、生体に直接投与して
ＩＦＮ−γの産生を誘導するのが極めて困難であった。

【０００４】本発明者らが、哺乳類の細胞が産生するサ
イトカインにつき研究していたところ、マウスの肝臓中
にＩＦＮ−γの産生を誘導する物質が存在することを見
出した。カラムクロマトグラフィーを中心とする種々の
精製方法を組合せてこの物質を単離し、その性質・性状
を調べたところ、その本質は蛋白質であり、次のような
理化学的性質を有していることが判明した。（１）分子量ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又はゲル濾
過法で測定すると、分子量１９，０００±５，０００ダ
ルトンを示す。（２）等電点クロマトフォーカシング法で測定すると、４．８±１．
０に等電点を示す。（３）部分アミノ酸配列配列表における配列番号４及び５に示す部分アミノ酸配
列を有する。（４）生物作用免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する。

【０００５】斯かる理化学的性質を有する蛋白質は未だ
知られておらず、新規物質であると判断される。そこ
で、本発明者らが、引続き、マウス肝細胞を鋭意検索し
たところ、このＤＮＡは４７１塩基対からなり、配列表
における配列番号６に示すアミノ酸配列をコードしてい
ることが判明した。

【０００６】これら知見に基づき、ヒト肝細胞を引続き
検索したところ、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産
生を誘導するさらに別の新規物質をコードするＤＮＡが
得られた。この物質の本質はポリペプチドであり、ＤＮ
Ａを解読したところ、配列表における配列番号１に示す
アミノ酸配列を含んでなることが判明した。その後、こ
のＤＮＡを大腸菌に導入し、発現させたところ、培養物
中にポリペプチドが好収量で産生した。以上の知見は、
同じ特許出願人による特願平６−１８４１６２号明細書
及び特願平６−３０４２０３号明細書に開示されてい
る。

【０００７】上述のとおり、当該ポリペプチドは免疫担
当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する性質を具備
しており、汎用ＩＦＮ−γ誘導剤、さらには、抗ウイル
ス剤、抗腫瘍剤、抗菌剤、免疫調節剤、血小板増加剤な
どとして多種多様な用途が期待される。一般に、生理活
性ポリペプチドを医薬品に配合使用しようとすると、そ
のポリペプチドを高度且つ効率的に精製し得る方法や、
数多くの被検試料を一度にアッセイする方法の開発が不
可欠となる。斯かる精製及びアッセイを可能ならしめる
最良の材料はモノクローナル抗体であるが、当該ポリペ
プチドに特異的なモノクローナル抗体は未だ樹立されて
いない。

【０００８】

【発明により解決すべき課題】斯かる状況に鑑み、この
発明の目的は、斯かるポリペプチドに特異的なモノクロ
ーナル抗体を提供することにある。

【０００９】この発明の別の目的は、斯かるモノクロー
ナル抗体を産生し得るハイブリドーマを提供することに
ある。

【００１０】この発明のさらに別の目的は、斯かるモノ
クローナル抗体の製造方法を提供することにある。

【００１１】この発明のさらに別の目的は、斯かるモノ
クローナル抗体による当該ポリペプチドの精製方法を提
供することにある。

【００１２】この発明のさらに別の目的は、斯かるモノ
クローナル抗体による当該ポリペプチドの検出方法を提
供することにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】この発明は、前記第一の
課題を、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列
又はそれに相同的なアミノ酸配列（ただし、符号「Ｘａ
ａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレ
オニンを表わすものとする。）を有し、免疫担当細胞に
おいてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドに特異
的なモノクローナル抗体により解決するものである。

【００１４】この発明は、前記第二の課題を、斯かるモ
ノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマにより解
決するものである。

【００１５】この発明は、前記第三の課題を、斯かるモ
ノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマを生体外
又は生体内で培養する工程と、その培養物又は体液から
モノクローナル抗体を採取する工程を含んでなるモノク
ローナル抗体の製造方法により解決するものである。

【００１６】この発明は、前記第四の課題を、斯かるモ
ノクローナル抗体を当該ポリペプチドと夾雑物質を含む
混合物に接触させてモノクローナル抗体にポリペプチド
を吸着させる工程と、吸着したポリペプチドをモノクロ
ーナル抗体から脱着させる工程を含んでなるポリペプチ
ドの精製方法により解決するものである。

【００１７】この発明は、前記第五の課題を、被検試料
に斯かるモノクローナル抗体を接触せしめ、免疫反応に
より当該ポリペプチドを検出するポリペプチドの検出方
法により解決するものである。

【００１８】

【作用】この発明のモノクローナル抗体は、特定のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に反応する。

【００１９】この発明のハイブリドーマは、生体内外で
培養すると、斯かるモノクローナル抗体を産生する。

【００２０】この発明による製造方法によるときには、
斯かるモノクローナル抗体の所望量が容易に得られる。

【００２１】この発明による精製方法によるときには、
当該ポリペプチドと夾雑物質を含む混合物から、当該ポ
リペプチドが高純度且つ効率的に採取される。

【００２２】この発明による検出方法によるときには、
被検試料中の当該ポリペプチドのみが免疫反応を呈する
ので、適宜手法によりその免疫反応を測定することによ
り、被検試料中の当該ポリペプチドを定性的又は定量的
に検出することができる。

【００２３】以下、実施例等に基づきこの発明を説明す
るに、この発明でいうモノクローナル抗体とは、配列表
における配列番号１に示すアミノ酸配列又はそれに相同
的なアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的なモノ
クローナル抗体全般を包含するものとし、その出所・由
来、クラスは問わない。配列表における配列番号１に示
すアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列とは、免疫担当
細胞におけるＩＦＮ−γの産生を誘導する性質が実質的
に失われない範囲で、その配列番号１のアミノ酸配列に
おけるアミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置
換したもの、配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端
及び／又はＣ末端にアミノ酸が１又は２個以上付加した
もの及びそのＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸が１個
又は２個以上欠失したものを包含する。

【００２４】この発明のモノクローナル抗体は、斯かる
ポリペプチド又はその抗原性フラグメントを抗原として
用いることにより得ることができる。具体的には、例え
ば、斯かる抗原で免疫感作しておいた哺乳動物より採取
した抗体産生細胞と無限増殖可能な哺乳類由来の細胞と
のハイブリドーマを作製し、これよりこの発明のモノク
ローナル抗体を産生し得るハイブリドーマのクローンを
選択し、これを生体内外で培養することにより得ること
ができる。

【００２５】抗原となり得るポリペプチドは、特願平６
−３０４２０３号明細書に開示したように、例えば、配
列表における配列番号１に示すアミノ酸配列又はそれに
相同的なアミノ酸配列をコードするＤＮＡを導入した形
質転換体を培養することにより得ることができ、それら
は、通常、完全精製又は部分精製した状態で使用され
る。抗原性フラグメントを得るには、これら完全精製品
又は部分精製品を化学的又は酵素的に分解するか、配列
表における配列番号１に示すアミノ酸配列に基づきペプ
チド合成すればよい。

【００２６】免疫感作は慣用の方法によればよく、例え
ば、上記のごとき抗原を単独又は適宜アジュバントとと
もに哺乳動物の静脈、皮内、皮下又は腹腔内に注射接種
し、一定期間飼育する。哺乳動物に特に限定はなく、所
期の抗体産生細胞が得られるかぎり、種類、大きさ、雌
雄は問わない。通常はラット、マウス、ハムスターなど
のげっ歯類が用いられ、後記無限増殖可能な哺乳類由来
の細胞との適合性も勘案しながら、最適のものが選択さ
れる。用いる哺乳動物の種類や大きさにも依るが、抗原
の接種量は、通常、総接種量を約５乃至５００μｇ／匹
とし、これを約１乃至２週間の間隔を置いて２乃至５回
に分けて接種する。そして、最終接種から３乃至５日後
に脾臓を摘出し、分散して抗体産生細胞としての脾細胞
を得る。

【００２７】つぎに、斯くして得られた抗体産生細胞と
無限増殖可能な哺乳類由来の細胞とを融合させて、目的
のハイブリドーマを含む細胞融合産物を得る。無限増殖
可能な哺乳類由来の細胞には、通常、Ｐ３−ＮＳ１−Ａ
ｇ４−１細胞（ＡＴＣＣＴＩＢ１８）、Ｐ３−Ｘ６３
−Ａｇ８細胞（ＡＴＣＣＴＩＢ９）及びＳＰ２／０−
Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）などのマウ
ス骨髄腫由来の細胞株又はその変異株が用いられる。細
胞融合は、例えば、ポリエチレングリコールやセンダイ
ウイルスを始めとする融合促進剤や電気パルスによる慣
用の方法が用いられ、一例を挙げると、融合促進剤を含
む融合培地に抗体産生細胞と無限増殖可能な哺乳類由来
の細胞を約１：１乃至１：１０の割合で浮遊させ、この
状態のまま、約３０乃至４０℃で約１乃至５分間インキ
ュベートする。融合培地には、例えば、ＭＥＭ培地、Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地及びイスコフ改変ダルベコ培地を始
めとする通常一般のものを用い得るが、ウシ血清などの
血清類は除いておくのが望ましい。

【００２８】目的のハイブリドーマを選択するには、ま
ず、上記のようにして得た細胞融合産物をＨＡＴ培地な
どの選択用培地に移し、約３０乃至４０℃で約３日乃至
３週間培養してハイブリドーマ以外の細胞を死滅させ
る。つぎに、ハイブリドーマを常法により培養し、培養
物中に分泌された抗体につき、当該ポリペプチドとの反
応性を試験する。試験には、エンザイムイムノアッセ
イ、ラジオイムノアッセイ及びバイオアッセイなどの抗
体を検出するための慣用の方法が用いられ、例えば、富
山朔二・安東民衛編『単クローン抗体実験マニュア
ル』、１９９１年、講談社サイエンティフィク発行、第
１０５乃至１５２頁にはそのための方法が種々詳述され
ている。当該ポリペプチドに特異的な抗体を産生するハ
イブリドーマは、限界希釈法などにより、直ちにクロー
ニングされ、単一クローン化されたこの発明によるハイ
ブリドーマを得る。

【００２９】この発明のモノクローナル抗体は、斯かる
ハイブリドーマを生体内外で培養することにより得るこ
とができる。培養には、哺乳類由来の細胞を培養するた
めの慣用の方法が用いられ、例えば、生体外の培養培地
で培養するときには、その培養物から、一方、ヒト以外
の温血動物に移植して生体内で培養するときには、その
腹水及び／又は血液からモノクローナル抗体を採取す
る。後述のハイブリドーマＨ−１及びＨ−２はモノクロ
ーナル抗体の産生能高く、しかも、生体内外における培
養が容易であるという特徴がある。培養物又は腹水若し
くは血液からモノクローナル抗体を採取するには、抗体
一般を精製するための斯界における慣用の方法が用いら
れる。個々の方法としては、例えば、塩析、透析、濾
過、濃縮、遠心分離、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、
ゲル電気泳動及び等電点電気泳動が挙げられ、これらは
必要に応じて組合せて適用される。精製したモノクロー
ナル抗体は、その後、濃縮・乾燥し、用途に応じて液状
又は固状とする。

【００３０】この発明のモノクローナル抗体は、イムノ
アフィニティークロマトグラフィーによる当該ポリペプ
チドの精製にきわめて有用である。斯かる精製方法は、
この発明のモノクローナル抗体を当該ポリペプチドと当
該ポリペプチド以外の夾雑蛋白質を始めとする夾雑物質
との混合物に接触させてモノクローナル抗体に当該ポリ
ペプチドのみを吸着させる工程と、吸着したポリペプチ
ドをモノクローナル抗体から脱着させる工程を含んでな
り、両工程は、通常、水性媒体中で行なわれる。この発
明のモノクローナル抗体は、通常、ゲル状の水不溶性担
体に結合した状態で用いられ、その水不溶性担体を円筒
管などにカラム状に充填し、これに、例えば、形質転換
体の培養液又はそれらの部分精製品を通液すると、実質
的に当該ポリペプチドのみが水不溶性担体上のモノクロ
ーナル抗体に吸着する。吸着したポリペプチドはモノク
ローナル抗体周囲の水素イオン濃度を変えることにより
容易に脱着させることができ、例えば、ＩｇＧのクラス
に属するモノクローナル抗体を用いる場合は酸性側のｐ
Ｈ、通常、ｐＨ２乃至３で、一方、ＩｇＭのクラスに属
するモノクローナル抗体を用いる場合はアルカリ側のｐ
Ｈ、通常、ｐＨ１０乃至１１で脱着・溶出させる。

【００３１】この発明の精製方法によるときには、当該
ポリペプチドを最少限の労力と時間で高度に精製でき
る。前述のとおり、当該ポリペプチドは、免疫担当細胞
においてＩＦＮ−γの産生を誘導する性質を具備するの
で、得られた精製ポリペプチドは細胞培養法によりＩＦ
Ｎ−γを製造する際の誘導剤として、さらには、ＩＦＮ
−γに感受性を有する疾患、例えば、エイズや尖圭コン
ジロムなどのウイルス性疾患、腎臓癌、肉芽腫、菌状息
肉症、脳腫瘍などの悪性腫瘍、関節リウマチやアレルギ
ー症などの免疫疾患に対する治療剤・予防剤として有用
である。当該ポリペプチドがキラー細胞による細胞障害
性を増強する性質を兼備する場合には、インターロイキ
ン２や腫瘍壊死因子と適宜併用することにより、養子免
疫療法による肺癌、腎臓癌、乳癌などの固形癌を含む悪
性腫瘍の治療における治療効果や副作用の改善に著効が
得られる。

【００３２】この発明のモノクローナル抗体は、当該ポ
リペプチドの検出を必要とする諸分野にも広範な用途を
有する。すなわち、この発明のモノクローナル抗体にラ
ジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光
イムノアッセイなどの標識イムノアッセイを適用すると
きには、被検試料中の当該ポリペプチドを迅速且つ正確
に定性又は定量分析することができる。斯かる分析にお
いて、この発明のモノクローナル抗体は、例えば、放射
性物質、酵素及び／又は蛍光物質により標識して用いら
れる。この発明のモノクローナル抗体は当該ポリペプチ
ドに特異的に反応し、免疫反応を呈するので、その免疫
反応をこれら標識物質を指標に測定すれば、被検試料中
のごく微量の当該ポリペプチドを精度良く検出すること
ができる。標識イムノアッセイは、バイオアッセイと比
較して、一度に数多くの被検試料を分析できるうえに、
分析に要する時間と労力が少なくてすみ、しかも、分析
が高精度であるという特徴がある。したがって、この発
明による検出方法は、当該ポリペプチドを製造する際の
工程管理や製品の品質管理にきわめて有用である。な
お、この発明はモノクローナル抗体の標識や標識アッセ
イそのものに係わるものではないので詳細な説明は省く
が、例えば、ピー・ティッセン著、石川栄治訳『エンザ
イムイムノアッセイ』、１９８９年、東京化学同人発
行、第１９６乃至３４８頁などにはそのための方法が種
々詳述されている。

【００３３】以下、実施例に基づきこの発明を説明する
が、斯界の技術水準においては、斯かる実施例は多種多
様に改変可能である。斯かる技術水準に鑑み、この発明
がこれら実施例のみに限定されるべきでないことは云う
までもない。

【００３４】

【実施例１ハイブリドーマＨ−１の調製】

【００３５】

【実施例１−１形質転換体ＫＧＦＨＨ２の作製】０．
５ｍｌ容反応管に２５ｍＭ塩化マグネシウムを８μｌ、
１０×ＰＣＲ緩衝液を１０μｌ、２５ｍＭｄＮＴＰミ
ックスを１μｌ、２．５単位／μｌアンプリタックＤＮ
Ａポリメラーゼを１μｌ、特願平６−３０４２０３号明
細書に記載された方法にしたがってファージＤＮＡクロ
ーンから調製した配列表における配列番号２に示す塩基
配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列のポリペプ
チドをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを１ｎｇ、
配列表の配列番号１におけるＮ末端及びＣ末端付近のア
ミノ酸配列に基づき化学合成した５´−ＡＴＡＧＡＡＴ
ＴＣＡＡＡＴＧＴＡＣＴＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡ
ＴＣ−３´及び５´−ＡＴＡＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＣ
ＴＴＣＧＴＴＴＴＧＡＡＣ−３´で表わされる塩基配列
のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの適量
を加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした。常法により、
この混合物を９４℃で１分間、４３℃で１分間、７２℃
で１分間、この順序でインキュベートするサイクルを３
回繰返した後、さらに、９４℃で１分間、６０℃で１分
間、７２℃で１分間、この順序でインキュベートするサ
イクルを４０回繰返してＰＣＲ反応させた。

【００３６】このＰＣＲ産物とストラタジーン製プラス
ミドベクター『ｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋）』
を常法にしたがってＤＮＡリガーゼにより連結して組換
えＤＮＡとし、これをコンピテントセル法によりストラ
タジーン製大腸菌株『ＸＬ−１ＢｌｕｅＭＲＦ´Ｋ
ａｎ』に導入して形質転換した。形質転換体を５０μｇ
／ｍｌアンピシリンを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．
２）に接種し、３７℃で１８時間振盪培養した後、培養
物を遠心分離して形質転換体を採取し、通常のアルカリ
−ＳＤＳ法を適用して組換えＤＮＡを単離した。この組
換えＤＮＡの一部をとり、ジデオキシ法により分析した
ところ、配列表の配列番号２に示す塩基配列における５
´末端及び３´末端にそれぞれＥｃｏＲＩ切断部位及
びＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を、また、その配列番号２に
併記したアミノ酸配列におけるＮ末端及びＣ末端のそれ
ぞれ直前及び直後に対応する部位にポリペプチド合成開
始のためのメチオニンコドン及びポリペプチド合成終止
のためのＴＡＧコドンを有するＤＮＡを含んでいた。

【００３７】そこで、常法にしたがって残りの組換えＤ
ＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切
断後、宝酒造製ＤＮＡライゲーションキット『ＤＮＡラ
イゲーション・キット・バージョン２』を使用して、得
られたＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡ断片
０．１μｇと予め同じ制限酵素で切断しておいたファル
マシア製プラスミドベクター『ｐＫＫ２２３−３』１０
ｎｇを１６℃で３０分間反応させて連結して複製可能な
組換えＤＮＡ『ｐＫＧＦＨＨ２』を得た。コンピテント
セル法により、この組換えＤＮＡｐＫＧＦＨＨ２で大
腸菌Ｙ１０９０株（ＡＴＣＣ３７１９７）を形質転換
し、得られた形質転換体『ＫＧＦＨＨ２』を５０μｇ／
ｍｌアンピシリンを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）
に接種し、３７℃で１８時間振盪培養した。培養物を遠
心分離して形質転換体を採取し、その一部に通常のＳＤ
Ｓ−アルカリ法を適用して組換えＤＮＡｐＫＧＦＨＨ
２を抽出した。ジデオキシ法により分析したところ、図
１に示すように、組換えＤＮＡｐＫＧＦＨＨ２において
は、配列表における配列番号２に示す塩基配列を含むＫ
ＧＦＨＨ２ｃＤＮＡがＴａｃプロモータの下流に連結
されていた。

【００３８】

【実施例１−２形質転換体ＫＧＦＨＨ２によるポリペ
プチドの産生】オートクレーブによりアンピシリン５０
μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）を滅菌
し、３７℃に冷却後、実施例１−１で作製した形質転換
体ＫＧＦＨＨ２を接種し、振盪下、同じ温度で１８時間
種培養した。２０ｌ容ジャーファーメンタに新鮮な同一
培地を１８ｌとり、同様に滅菌し、３７℃に冷却後、上
記で得た種培養物を１％（ｖ／ｖ）接種し、同じ温度で
８時間通気撹拌培養した。培養物を遠心分離して菌体を
採取し、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１６ｍＭ燐酸水素
二ナトリウム及び４ｍＭ燐酸二水素ナトリウムを含む混
液（ｐＨ７．３）に浮遊させ、超音波破砕後、遠心分離
により菌体破砕物を除去し、上清を採取した。

【００３９】この上清に氷冷下で硫酸アンモニウムを４
０％（ｗ／ｖ）まで加え、均一に溶解し、暫時静置し、
遠心分離後、上清を採取した。この上清を予め１．５Ｍ
硫酸アンモニウムを含む１５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ
６．６）に溶解し、溶液を予め１．５Ｍ硫酸アンモニウ
ムを含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）により平衡
化しておいたファルマシア製『フェニル・セファロー
ス』のカラムに負荷し、カラムを新鮮な同一緩衝液で洗
浄後、１．５Ｍから０Ｍに下降する硫酸アンモニウムの
濃度勾配下、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）を通液
した。

【００４０】つぎに、硫酸アンモニウム濃度１．０Ｍ付
近で溶出した画分をプールし、膜濃縮後、１０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ６．５）に対して４℃で１８時間透析し、
予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）により平衡化し
ておいた東ソー製『ＤＥＡＥ５ＰＷ』のカラムに負荷
し、カラムを新鮮な同一緩衝液で洗浄後、０Ｍから０．
２Ｍに上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、１０ｍＭ
燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）を通液し、塩化ナトリウム濃
度０．０５Ｍ付近で溶出した画分を採取した。

【００４１】その後、この画分を膜濃縮し、予め燐酸食
塩緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と云う。）により平衡化し
ておいたファルマシア製『スーパー・デックス７５』の
カラムに負荷し、新鮮なＰＢＳを通液して溶出した分子
量１８，５００ダルトン付近の画分を採取したところ、
精製蛋白質を約５．２ｍｇ含む水溶液が得られた。全精
製工程を通じての収率は約１０％であった。

【００４２】特願平６−３０４２０３号明細書に記載し
た方法に準じて分析したところ、精製蛋白質は次のよう
な理化学的性質を有していた。すなわち、非還元条件下
でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動すると、分
子量１８，５００±３，０００ダルトンに相当する位置
にＩＦＮ−γ誘導能ある主たるバンドを示す一方、クロ
マトフォーカシングすると、４．９±１．０に等電点を
示した。また、そのＮ末端は、配列表の配列番号１に示
すアミノ酸配列におけるＮ末端にメチオニンが結合した
配列番号３に示すアミノ酸配列を有していた。

【００４３】

【実施例１−３ハイブリドーマＨ−１の調製】１０週
齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に実施例１−２の方法に
より得た精製ポリペプチドを完全フロイントアジュバン
トともに２０μｇ／匹の割合で注射接種した。その後、
２週間おきに同一量を２回接種し、最後の接種から１週
間後に同一量をさらに静脈注射し、３日後に脾臓を摘出
し、分散して脾細胞を得た。

【００４４】この脾細胞とマウス骨髄腫由来のＳＰ２／
０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）を３７
℃に予温しておいた血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地
（ｐＨ７．２）にそれぞれ細胞密度３×１０⁴個／ｍｌ
及び１×１０⁴個／ｍｌになるように浮遊させ、遠心分
離後、沈澱部を採取した。この沈澱に平均分子量１，５
００ダルトンの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコー
ルを含む血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．
２）１ｍｌを１分間かけて滴々加え、３７℃で１分間イ
ンキュベートした後、全量が５０ｍｌになるまで血清無
含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）を滴々加
え、遠心分離後、沈澱部を採取した。この沈澱をＨＡＴ
培地に浮遊させ、９６ウェルマイクロプレートに２００
μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で１週間インキュベー
トしてハイブリドーマを選択した。

【００４５】各ウェルにおける培養上清中に分泌された
抗体につき、実施例１−２の方法により得た精製ポリペ
プチドとの反応性をエンザイムイムノアッセイにより調
べ、同精製ポリペプチドに反応性を示す抗体を産生する
ハイブリドーマを選別した。引続き、このハイブリドー
マに常法にしたがって限界希釈を繰返し適用し、この発
明のモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマの
クローンＨ−１を得た。

【００４６】

【実施例２モノクローナル抗体Ｈ−１ｍＡｂの調製と
ウェスタンブロッテイング分析】

【００４７】

【実施例２−１モノクローナル抗体Ｈ−１ｍＡｂの調
製】実施例１−３の方法により得たハイブリドーマＨ−
１を細胞密度約１×１０⁶個／ｍｌになるように５％
（ｖ／ｖ）ウシ血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地
（ｐＨ７．２）に浮遊させ、培養規模を拡大しながら、
５％ＣＯ₂インキュベータ中、３７℃で培養した。所期
の細胞密度に達した時点で、ハイブリドーマＨ−１を予
めプリスタンを０．５ｍｌ／匹腹腔内注射しておいた８
週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に１×１０⁷個／匹
注射接種し、通常の方法で１週間飼育した。

【００４８】マウスから腹水を採取し、ＰＢＳで３倍希
釈した後、硫酸アンモニウムを５０％飽和になるように
加え、４℃で２４時間静置し、遠心分離後、沈澱部を採
取した。この沈澱を２０ｍＭ燐酸二水素カリウム水溶液
（ｐＨ６．７）に対して４℃で一晩透析した後、予め新
鮮な同一水溶液で平衡化しておいたヒドロキシアパタイ
トカラムに負荷し、濃度が２０ｍＭから３００ｍＭに直
線的に上昇する燐酸二水素カリウム水溶液（ｐＨ６．
７）を通液したところ、この発明のモノクローナル抗体
Ｈ−１ｍＡｂを含む水溶液が得られた。収量は、マウス
１匹当たり、約５ｍｇであった。常法にしたがって分析
したところ、このモノクローナル抗体Ｈ−１ｍＡｂはＩ
ｇＧ₁のクラスに属していた。

【００４９】

【実施例２−２ウェスタンブロッティング分析】ジチ
オトレイトール１００ｍｇ、１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ水
溶液０．５ｍｌ及びグリセロール１ｍｌからなる混液に
実施例１−２の方法により得た精製ポリペプチドを１μ
ｇ加え、３７℃で１時間インキュベートした後、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した。常法によりゲ
ルをニトロセルロース膜に移し、ニトロセルロース膜を
ハイブリドーマＨ−１の培養上清に１時間浸漬した後、
０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む５０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄して過剰の抗体を
除いた。ニトロセルロース膜を西洋ワサビパーオキシダ
ーゼで標識したウサギ由来の抗マウスＩｇ抗体を含むＰ
ＢＳに１時間浸漬して反応させ、０．０５％（ｖ／ｖ）
ツイーン２０を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で洗浄後、０．００５％（ｖ／ｖ）過酸化水素
と０．３ｍｇ／ｍｌジアミノベンジジンを含む５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に浸漬して発色させ
た。

【００５０】同時に、精製ポリペプチドに代えて組換え
型ヒトインターロイキン１２を用いる系を設け、上記と
同様に処置して対照とした。なお、分子量マーカには、
ウシ血清アルブミン（６７，０００ダルトン）、オボア
ルブミン（４５，０００ダルトン）、カルボニックアン
ヒドラーゼ（３０，０００ダルトン）、トリプシンイン
ヒビター（２０，１００ダルトン）及びα−ラクトアル
ブミン（１４，４００ダルトン）を用いた。結果を図２
に示す。

【００５１】図２の結果に見られるように、モノクロー
ナル抗体Ｈ−１ｍＡｂは、実施例１−２の方法により得
た精製ポリペプチド（レーン１）にのみ特異的に反応
し、ヒトインターロイキン１２（レーン２）には全く反
応しなかった。このことは、この発明のモノクローナル
抗体が特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異
的に反応することを裏付けている。

【００５２】

【実施例３ハイブリドーマＨ−２及びモノクローナル
抗体Ｈ−２ｍＡｂの調製】

【００５３】

【実施例３−１ハイブリドーマＨ−２の作製】実施例
２−１において、ＳＰ／０−１４Ａｇ細胞に代えてマウ
ス骨髄腫由来のＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８細胞（ＡＴＣＣ
ＴＩＢ９）を用いた以外、同様に処置して単一クローン
化されたハイブリドーマＨ−２を得た。

【００５４】

【実施例３−２モノクローナル抗体Ｈ−２ｍＡｂの調
製】実施例３−１で得たハイブリドーマＨ−２を実施例
２−１と同様にして培養し、培養物を精製したところ、
ＢＡＬＢ／ｃマウス１匹当たり、約５．６ｍｇのモノク
ローナル抗体Ｈ−２ｍＡｂが得られた。常法により分析
したところ、このモノクローナル抗体Ｈ−２ｍＡｂはＩ
ｇＭのクラスに属していた。また、実施例２−２と同様
にしてウェスタンブロッティング分析したところ、実施
例１−２の方法により得た精製ポリペプチドにのみ特異
的に反応した。

【００５５】

【実施例４イムノアフィニティークロマトグラフィー
によるポリペプチドの精製】

【００５６】

【実施例４−１イムノアフィニティークロマトグラフ
ィー用ゲルの調製】実施例２−１の方法により得たモノ
クローナル抗体Ｈ−１ｍＡｂを８０ｍｇとり、０．５Ｍ
塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ硼酸緩衝液（ｐＨ８．
５）に対して４℃で一晩透析した。水不溶性担体として
ファルマシア製『ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ』
４ｇを１ｍＭ塩酸水溶液中で膨潤させ、新鮮な同一塩酸
水溶液、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ硼酸緩
衝液（ｐＨ８．５）の順序で洗浄した後、上記のモノク
ローナル抗体水溶液約１０ｍｌを加え、室温下で２時
間、４℃でさらに一晩緩やかに撹拌した。その後、ゲル
を１Ｍエタノールアミン水溶液（ｐＨ８．０）で洗浄
し、さらに、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ硼
酸緩衝液（ｐＨ８．５）及び０．５Ｍ塩化ナトリウムを
含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）をこの順序で用
いて洗浄する工程を５回繰返し、最後にＰＢＳで洗浄し
てイムノアフィニティークロマトグラフィー用ゲルを得
た。常法により分析したところ、ゲル１ｍｌ当たり、約
６ｍｇのモノクローナル抗体Ｈ−１ｍＡｂが結合してい
た。

【００５７】

【実施例４−２イムノアフィニティークロマトグラフ
ィーによるポリペプチドの精製】実施例４−１で得たイ
ムノアフィニティークロマトグラフィー用ゲル１０ｍｌ
をプラスチック製円筒管内部にカラム状に充填し、ＰＢ
Ｓで洗浄後、実施例１−２の方法により得た当該ポリペ
プチドを約０．１ｍｇ／ｍｌ含むフェニルセファロース
溶出画分１０ｍｌを負荷した。新鮮なＰＢＳで洗浄した
後、カラムに１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍグリシ
ン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）を通液し、ＩＦＮ−γ誘
導能ある画分を採取した。採取した画分をプールし、Ｐ
ＢＳに対して４℃で一晩透析し、濃縮後、ＩＦＮ−γ誘
導活性及び蛋白質含量を測定したところ、純度９５％以
上の精製ポリペプチドが、原料当たり、ほぼ１００％の
収量で得られていた。

【００５８】

【実施例５エンザイムイムノアッセイによるポリペプ
チドの検出】常法にしたがって、実施例１−２の方法に
より得た精製ポリペプチドでウサギを免疫感作した後、
血液を採取し、ＩｇＧ抗体を単離した。このＩｇＧ抗体
をＰＢＳに２０μｇ／ｍｌになるように溶解し、９６ウ
ェルマイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し
た。マイクロプレートを室温下で３時間インキュベート
した後、ＩｇＧ溶液を除き、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清ア
ルブミンを含むＰＢＳを２００μｌ／ウェルずつ加え、
４℃で一晩静置した。

【００５９】マイクロプレートからＰＢＳを除き、０．
０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄後、
実施例１−２の方法により得た精製ポリペプチドを０．
５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにより
適宜濃度に希釈して１００μｌ／ウェルずつ加え、振盪
下、室温下で２時間反応させた。０．０５％（ｖ／ｖ）
ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄し、ビオチン標識した
モノクローナル抗体Ｈ−１ｍＡｂを１００μｌ／ウェル
ずつ加え、振盪しながら室温下で２時間反応させ、０．
０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄した
後、西洋ワサビパーオキシダーゼとストレプトアビジン
との複合体を１００μｌ／ウェルずつ加え、振盪しなが
ら室温下でさらに２時間反応させた。０．０５％（ｖ／
ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄後、精製ポリペプ
チドに結合した西洋ワサビパーオキシダーゼの活性をｏ
−フェニレンジアミンを基質に波長４９２ｎｍにおける
吸光度として測定した。結果を表１に示す。

【００６０】

【表１】

【００６１】表１の結果から明らかなように、本検出方
法によるときには、少なくとも約５０乃至１，０００ｐ
ｇ／ｍｌの当該ポリペプチドを精度良く検出し得る。

【００６２】

【実施例６ラジオイムノアッセイによるポリペプチド
の検出】常法にしたがって、実施例１−２の方法により
得た精製ポリペプチドでウサギを免疫感作した後、血液
を採取し、ＩｇＧ抗体を単離した。このＩｇＧ抗体を常
法によりラジオイムノアッセイ用ポリスチレンビーズに
吸着させ、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰ
ＢＳ中、４℃で一晩静置して固相抗体を得た。

【００６３】試験管にこの固相抗体を１個ずつとり、実
施例１−２の方法により得た精製ポリペプチドを０．５
％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにより適
宜濃度に希釈して０．２ｍｌずつ加え、４℃で４時間静
置した。固相抗体を０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０
と０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ
で洗浄した後、実施例３−２の方法により得たモノクロ
ーナル抗体Ｈ−２ｍＡｂを常法により¹²⁵Ｉ標識して
０．２ｍｌ（１×１０⁵ｃｐｍ）ずつ加え、４℃で一晩
静置した。過剰の標識抗体を除去し、０．０５％（ｖ／
ｖ）ツイーン２０と０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブ
ミンを含むＰＢＳで洗浄した後、ガンマカウンタにより
ビーズの放射能を測定した。結果を表２に示す。

【００６４】

【表２】

【００６５】表２の結果から明らかなように、本検出方
法によるときには、少なくとも約１００乃至１，０００
ｐｇ／ｍｌの当該ポリペプチドを精度良く検出できる。

【００６６】

【発明の効果】以上説明したごとく、この発明のモノク
ローナル抗体は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産
生を誘導するポリペプチドに特異的に反応する。したが
って、この発明のモノクローナル抗体は、斯かるポリペ
プチドの精製及び検出に多種多様の用途を有することと
なる。斯くも有用なこの発明のモノクローナル抗体は、
ハイブリドーマを用いる製造方法により、所望量を容易
に得ることができる。

【００６７】この発明は、斯くも顕著な作用効果を発揮
するものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義の
ある発明であると云える。

【００６８】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：157 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチド配列 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn Asp 1 5 10 15 Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp Met Thr 20 25 30 Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met 35 40 45 50 Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys 55 60 65 Glu Lys Ile Ser Xaa Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu 70 75 80 85 Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe 90 95 100 Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser 105 110 115 Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu 120 125 130 135 Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val 140 145 150 Gln Asn Glu Asp 155

【００６９】配列番号：2 配列の長さ：471 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：ヒト組織の種類：肝臓配列の特徴特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：1..471 特徴を決定した方法：S 配列 TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA AGA AAT TTG AAT 48 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGG CCT CTA TTT GAA GAT 96 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 ATG ACT GAT TCT GAC TGT AGA GAT AAT GCA CCC CGG ACC ATA TTT ATT 144 Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGC CAG CCT AGA GGT ATG GCT GTA ACT ATC 192 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 TCT GTG AAG TGT GAG AAA ATT TCA AYT CTC TCC TGT GAG AAC AAA ATT 240 Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Xaa Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 ATT TCC TTT AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC AAG GAT ACA AAA 288 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 AGT GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA CAT GAT AAT AAG 336 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT CTA GCT TGT GAA 384 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAA AAA GAG GAT GAA TTG 432 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTT CAA AAC GAA GAC 471 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155

【００７０】配列番号：3 配列の長さ：11 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：N末端フラグメント

【００７１】配列番号：4 配列の長さ：25 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Ile Ile Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln 1 5 10 15 Ser Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys 20 25

【００７２】配列番号：5 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Gln Pro Val Phe Glu Asp Met Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro 1 5 10 15 Gln

【００７３】配列番号：6 配列の長さ：471 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列の特徴起源生物名：マウス組織の種類：肝臓配列の特徴配列を表わす記号：mat peptide 存在位置：1..471 特徴を決定した方法：S 配列 AAC TTT GGC CGA CTT CAC TGT ACA ACC GCA GTA ATA CGG AAT ATA AAT 48 Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn 1 5 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC GTT GAC AAA AGA CAG CCT GTG TTC GAG GAT ATG 96 Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met 20 25 30 ACT GAT ATT GAT CAA AGT GCC AGT GAA CCC CAG ACC AGA CTG ATA ATA 144 Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile 35 40 45 TAC ATG TAC AAA GAC AGT GAA GTA AGA GGA CTG GCT GTG ACC CTC TCT 192 Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser 50 55 60 GTG AAG GAT AGT AAA AYG TCT ACC CTC TCC TGT AAG AAC AAG ATC ATT 240 Val Lys Asp Ser Lys Xaa Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile 65 70 75 80 TCC TTT GAG GAA ATG GAT CCA CCT GAA AAT ATT GAT GAT ATA CAA AGT 288 Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser 85 90 95 GAT CTC ATA TTC TTT CAG AAA CGT GTT CCA GGA CAC AAC AAG ATG GAG 336 Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu 100 105 110 TTT GAA TCT TCA CTG TAT GAA GGA CAC TTT CTT GCT TGC CAA AAG GAA 384 Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu 115 120 125 GAT GAT GCT TTC AAA CTC ATT CTG AAA AAA AAG GAT GAA AAT GGG GAT 432 Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140 AAA TCT GTA ATG TTC ACT CTC ACT AAC TTA CAT CAA AGT 471 Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser 145 150 155

【図面の簡単な説明】

【図１】組換えＤＮＡｐＫＧＦＨＨ２の構造を示す図
である。

【図２】この発明によるモノクローナル抗体Ｈ−１ｍＡ
ｂと精製ポリペプチド及びヒトインターロイキン１２と
の反応性を示すウェスタンブロッティング図である。

【符号の説明】ＫＧＦＨＨ２ｃＤＮＡポリペプチドをコードする
ｃＤＮＡＰｔａｃｔａｃプロモータｒｒｎＢＴ１Ｔ２リボソームＲＮＡオペロン
の転写終止領域ＡｍｐＲアンピシリン耐性遺伝子ｐＢＲ３２２ｏｒｉ大腸菌における複製開始点

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 1/30 Ｃ０７Ｋ 1/30 1/34 1/34 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 ＺＮＡＧ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｐ 21/08 33/577 ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｕ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 15/00 ＺＮＡＣ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 16/24 C12P 21/08 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表における配列番号１に示すアミノ
酸配列又は、そのアミノ酸配列において、１若しくは複
数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸
配列（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸
は、イソロイシン又はトレオニンを表わすものとす
る。）を有し、免疫担当細胞においてインターフェロン
−γの産生を誘導するポリペプチドと免疫反応するモノ
クローナル抗体。
【請求項２】ＩｇＧ又はＩｇＭのクラスに属する請求
項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】請求項１又は２に記載のモノクローナル
抗体を産生し得るハイブリドーマ。
【請求項４】請求項１又は２に記載のモノクローナル
抗体を産生し得るハイブリドーマを生体外又は生体内で
培養する工程と、その培養物又は体液からモノクローナ
ル抗体を採取する工程を含んでなるモノクローナル抗体
の製造方法。
【請求項５】培養物又は体液からモノクローナル抗体
を塩析、透析、濾過、濃縮、遠心分離、分別沈澱、ゲル
濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動
及び／又は等電点電気泳動により採取する請求項４に記
載のモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項６】請求項１又は２に記載のモノクローナル
抗体を、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列
又は、そのアミノ酸配列において、１若しくは複数個の
アミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列
（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、
イソロイシン又はトレオニンを表わすものとする。）を
有し、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産
生を誘導するポリペプチドと夾雑物質を含む混合物に接
触させてモノクローナル抗体にポリペプチドを吸着せし
める工程と、吸着したポリペプチドをモノクローナル抗
体から脱着させる工程を含んでなるポリペプチドの精製
方法。
【請求項７】モノクローナル抗体が水不溶性担体に結
合している請求項６に記載のポリペプチドの精製方法。
【請求項８】請求項１又は２に記載のモノクローナル
抗体を被検試料に接触せしめ、免疫反応により配列表に
おける配列番号１に示すアミノ酸配列又は、そのアミノ
酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、
置換若しくは付加したアミノ酸配列（ただし、符号「Ｘ
ａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はト
レオニンを表わすものとする。）を有し、免疫担当細胞
においてインターフェロン−γの産生を誘導するポリペ
プチドを検出するポリペプチドの検出方法。
【請求項９】モノクローナル抗体が放射性物質、酵素
及び／又は蛍光物質により標識されている請求項８に記
載のポリペプチドの検出方法。