JP2952572B2 - ヒト血漿の分別中に得られる画分から免疫グロブリンを回収する方法 - Google Patents
ヒト血漿の分別中に得られる画分から免疫グロブリンを回収する方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、免疫グロブリンの
調製、より詳細には高力価免疫グロブリン製剤の製造方
法に関する。この方法は、いままで通常のプラズマ分別
法では使用されなかったか、少なくとも免疫グロブリン
製剤の製造には使用されなかった画分から免疫グロブリ
ンを回収するのに利用できる。
調製、より詳細には高力価免疫グロブリン製剤の製造方
法に関する。この方法は、いままで通常のプラズマ分別
法では使用されなかったか、少なくとも免疫グロブリン
製剤の製造には使用されなかった画分から免疫グロブリ
ンを回収するのに利用できる。
【０００２】
【従来の技術】ヒト血漿には１００種類を超える種々の
タンパク質が存在する。それらのあるものは、ドナープ
ラズマのプールから分別することにより精製して、以下
に示す例のようにして治療生成物として使用できる：ア
ルブミンは、抵タンパク血症又は血液量減少における膨
張欠陥を補うのに使用され；血液凝固因子ＶＩＩ及びＩ
Ｘは、それぞれ血友病Ａ及びＢにおける出血予防及び治
療に使用され；免疫グロブリンは、抗体欠乏症だけでな
く突発性血小板減少性紫斑病の感染予防及び治療に使用
され；高力価の特異的免疫グロブリンを有する選択され
たドナーからの免疫グロブリンは、Ａ型肝炎やＢ型肝炎
等の特異的感染の予防及び治療用高度免疫グロブリン製
剤として使用される。
タンパク質が存在する。それらのあるものは、ドナープ
ラズマのプールから分別することにより精製して、以下
に示す例のようにして治療生成物として使用できる：ア
ルブミンは、抵タンパク血症又は血液量減少における膨
張欠陥を補うのに使用され；血液凝固因子ＶＩＩ及びＩ
Ｘは、それぞれ血友病Ａ及びＢにおける出血予防及び治
療に使用され；免疫グロブリンは、抗体欠乏症だけでな
く突発性血小板減少性紫斑病の感染予防及び治療に使用
され；高力価の特異的免疫グロブリンを有する選択され
たドナーからの免疫グロブリンは、Ａ型肝炎やＢ型肝炎
等の特異的感染の予防及び治療用高度免疫グロブリン製
剤として使用される。
【０００３】治療に使用できる血漿タンパク質は、例え
ば、エタノール分別からなる公知の方法により単離でき
る（Ｃｏｈｎ，Ｅ．Ｇ．等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．、６８、４５９、１９４６；Ｋｉｓｔｌｅｒ，
Ｐ．，及びＮｉｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｈ．、Ｖｏｘ Ｓａ
ｎｇ、７、４１４、１９６２）。両方の方法を用いて、
適当な処方により経済的に臨床利用できるアルブミン又
は免疫グロブリン等の機能性血漿タンパク質を多量に単
離することができる。しかしながら、これらの方法によ
れば、通常の処理では使用することができない沈澱物及
び上清が生じる。これらの画分の組成は、大きく異な
る。
ば、エタノール分別からなる公知の方法により単離でき
る（Ｃｏｈｎ，Ｅ．Ｇ．等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．、６８、４５９、１９４６；Ｋｉｓｔｌｅｒ，
Ｐ．，及びＮｉｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｈ．、Ｖｏｘ Ｓａ
ｎｇ、７、４１４、１９６２）。両方の方法を用いて、
適当な処方により経済的に臨床利用できるアルブミン又
は免疫グロブリン等の機能性血漿タンパク質を多量に単
離することができる。しかしながら、これらの方法によ
れば、通常の処理では使用することができない沈澱物及
び上清が生じる。これらの画分の組成は、大きく異な
る。
【０００４】例えば、血漿を１９％エタノールによりｐ
Ｈ５．８で沈澱させると、ヒトアポリポタンパクＡ−１
（ａｐｏＡ−１）が、ほぼ等しい部で、上清ａ（血漿ａ
ｐｏＡ−１の約５０％）と沈澱物Ａ（約４０％）に見ら
れるのに対して、同様のタンパク質が、Ｋｉｓｔｌｅｒ
及びＮｉｔｓｃｈｍａｎｎに準じた次の分別工程後にも
見られ、これらの画分はいままで工業的には使用されな
かった：沈澱物ＩＶ及び沈澱物Ｂ（各々約４０％）（Ｌ
ｅｒｃｈ等、Ｐｒｏｔｉｄｅｓ ｏｆ ｔｈｅＢｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄｓ、３６、４と０９、１９８
９）。
Ｈ５．８で沈澱させると、ヒトアポリポタンパクＡ−１
（ａｐｏＡ−１）が、ほぼ等しい部で、上清ａ（血漿ａ
ｐｏＡ−１の約５０％）と沈澱物Ａ（約４０％）に見ら
れるのに対して、同様のタンパク質が、Ｋｉｓｔｌｅｒ
及びＮｉｔｓｃｈｍａｎｎに準じた次の分別工程後にも
見られ、これらの画分はいままで工業的には使用されな
かった：沈澱物ＩＶ及び沈澱物Ｂ（各々約４０％）（Ｌ
ｅｒｃｈ等、Ｐｒｏｔｉｄｅｓ ｏｆ ｔｈｅＢｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄｓ、３６、４と０９、１９８
９）。
【０００５】銅結合タンパク質セルロプラスミンについ
ても同様な分配パターンが得られる。分別後，原料の２
０％が沈澱物ＩＶに見られ、４０％が沈澱物Ｂに見られ
る。トランスフェリンは、血漿タンパク質の一例である
が、これは、同様な分別法において、沈澱物ＩＶに実質
的に１００％濃縮されるのに対して、８０％のアルブミ
ンは現在使用されている沈澱物Ｃに見られる。
ても同様な分配パターンが得られる。分別後，原料の２
０％が沈澱物ＩＶに見られ、４０％が沈澱物Ｂに見られ
る。トランスフェリンは、血漿タンパク質の一例である
が、これは、同様な分別法において、沈澱物ＩＶに実質
的に１００％濃縮されるのに対して、８０％のアルブミ
ンは現在使用されている沈澱物Ｃに見られる。
【０００６】免疫グロブリンの５０〜６０％は、Ｋｉｓ
ｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ又はＣｏｈｎ分別によ
り沈澱ＧＧで回収できる。残りの３０〜４０％は、これ
らの方法では、沈澱物ＩＶ（５％）、沈澱物Ｂ（３０
％）及び濾液ＧＧ（５％）に分配される。上記した％
は、分配の大きさの順番を示すためのものであり、これ
らの値には限定されず、使用条件や方法によって異なる
ことがある。
ｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ又はＣｏｈｎ分別によ
り沈澱ＧＧで回収できる。残りの３０〜４０％は、これ
らの方法では、沈澱物ＩＶ（５％）、沈澱物Ｂ（３０
％）及び濾液ＧＧ（５％）に分配される。上記した％
は、分配の大きさの順番を示すためのものであり、これ
らの値には限定されず、使用条件や方法によって異なる
ことがある。
【０００７】これらの例は、場合によっては、かなりの
量の治療に使用できるタンパク質が画分沈澱物ＩＶ、沈
澱物Ｂ、上清ｃ及び上清ＧＧや、Ｃｏｈｎに準じた血漿
分別の対応画分（画分ＩＶ−１、画分ＩＩ＋ＩＩＩ、上
清Ｖ及びＩＩ−１、２）に見出されることを示してい
る。倫理的な面だけでなく、ヒト血漿及びある種の血漿
成分が世界的に不足していることから、いままでそれほ
ど高くなかった免疫グロブリンの収率を向上させる必要
がある。
量の治療に使用できるタンパク質が画分沈澱物ＩＶ、沈
澱物Ｂ、上清ｃ及び上清ＧＧや、Ｃｏｈｎに準じた血漿
分別の対応画分（画分ＩＶ−１、画分ＩＩ＋ＩＩＩ、上
清Ｖ及びＩＩ−１、２）に見出されることを示してい
る。倫理的な面だけでなく、ヒト血漿及びある種の血漿
成分が世界的に不足していることから、いままでそれほ
ど高くなかった免疫グロブリンの収率を向上させる必要
がある。
【０００８】免疫グロブリンは、感染防止に重要な役割
を果たしている。ウイルス特異的中性抗体は細胞レセプ
ターへのウイルスの吸着をブロックして感染を防止し、
バクテリア特異的抗体は病原体を食菌して、それを好中
球及びマクロファージにより除去し且つ殺生する。数千
のドナーからのプラズマプールは、極めて数多くの異な
る特異性を有する免疫グロブリンを含有し、したがっ
て、このようなプールから免疫グロブリン製剤も、ウイ
ルス、バクテリア及びトキシンのエピトープだけでなく
自己抗原に対しても測定可能な力価を有する免疫グロブ
リンを含有する。したがって、これらは、数多くの感染
に対してや、極めて多種多様な病態においても効果があ
る。しかしながら、現在においては、ある種の状況下に
おいて、高力価の特異的抗体を有する免疫グロブリン製
剤（いわゆる、高度免疫グロブリン製剤）を使用するこ
とが望ましい。いままで、このような製剤は、多くの時
間と費用をかけて力価の増加した特異的抗体を有するド
ナーの特殊なプラズマプールから調製されてきた。種々
の理由から、これには困難が伴う。もし、抗Ｂ型肝炎製
剤のように、認められたワクチン法がある場合には、ド
ナーへの接種及び選択を行い、且つドナーからの血を別
個に処理しなければならない。しかしながら、数多くの
他の適用の場合には、倫理上の理由から、ドナーの免疫
化は行うことができない。ここで可能なことは、例外的
にしかないが、関与するドナーを選択して（例えば、特
定の疾病から回復した後のドナー）高力価の血液を得
て、これらのドナーから得た血液を処理して製剤を得る
しかない。
を果たしている。ウイルス特異的中性抗体は細胞レセプ
ターへのウイルスの吸着をブロックして感染を防止し、
バクテリア特異的抗体は病原体を食菌して、それを好中
球及びマクロファージにより除去し且つ殺生する。数千
のドナーからのプラズマプールは、極めて数多くの異な
る特異性を有する免疫グロブリンを含有し、したがっ
て、このようなプールから免疫グロブリン製剤も、ウイ
ルス、バクテリア及びトキシンのエピトープだけでなく
自己抗原に対しても測定可能な力価を有する免疫グロブ
リンを含有する。したがって、これらは、数多くの感染
に対してや、極めて多種多様な病態においても効果があ
る。しかしながら、現在においては、ある種の状況下に
おいて、高力価の特異的抗体を有する免疫グロブリン製
剤（いわゆる、高度免疫グロブリン製剤）を使用するこ
とが望ましい。いままで、このような製剤は、多くの時
間と費用をかけて力価の増加した特異的抗体を有するド
ナーの特殊なプラズマプールから調製されてきた。種々
の理由から、これには困難が伴う。もし、抗Ｂ型肝炎製
剤のように、認められたワクチン法がある場合には、ド
ナーへの接種及び選択を行い、且つドナーからの血を別
個に処理しなければならない。しかしながら、数多くの
他の適用の場合には、倫理上の理由から、ドナーの免疫
化は行うことができない。ここで可能なことは、例外的
にしかないが、関与するドナーを選択して（例えば、特
定の疾病から回復した後のドナー）高力価の血液を得
て、これらのドナーから得た血液を処理して製剤を得る
しかない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、工業的な血漿分別の実施中に得られるいままで
ほとんど利用されていなかった上記した画分及び沈澱物
から単離でき、それから有価な免疫グロブリン製剤を製
造できる免疫グロブリンの回収方法を提供することであ
る。この方法は、続いて、高度免疫グロブリンに相当す
るこれらの製剤を処理して、十分に許容されるとりわけ
静脈内（ＩＶ）にできる、ウイルス耐性、液状又は凍結
乾燥製剤にできるものでなければならない。
目的は、工業的な血漿分別の実施中に得られるいままで
ほとんど利用されていなかった上記した画分及び沈澱物
から単離でき、それから有価な免疫グロブリン製剤を製
造できる免疫グロブリンの回収方法を提供することであ
る。この方法は、続いて、高度免疫グロブリンに相当す
るこれらの製剤を処理して、十分に許容されるとりわけ
静脈内（ＩＶ）にできる、ウイルス耐性、液状又は凍結
乾燥製剤にできるものでなければならない。
【００１０】
【課題を解決するための手段】今般、従来法とは異なる
方法により高度免疫グロブリン製剤又は高力価免疫グロ
ブリン製剤を製造できることが分かった。この新規な方
法によれば、一般的なプラズマプールから得た免疫グロ
ブリンが使用され、「廃」画分の使用による有価原料血
漿の探索性が向上し、さらには、従来の製剤よりも特異
的活性のはるかに高い高度免疫グロブリンを製造でき
る。このことは、少量ＩＶ投与及び少量ＩＶ投与タンパ
ク質により、即ち、対応してレシピエントへの負担が低
い状態で、高ドースの特異的免疫グロブリンを短時間で
得ることができることを意味する。これは、本発明にお
いて、固定化抗原への吸着による特異的免疫グロブリン
の濃縮、即ち、処理された「廃」画分をアフィニティー
クロマトグラフィーに使用することにより可能となる。
方法により高度免疫グロブリン製剤又は高力価免疫グロ
ブリン製剤を製造できることが分かった。この新規な方
法によれば、一般的なプラズマプールから得た免疫グロ
ブリンが使用され、「廃」画分の使用による有価原料血
漿の探索性が向上し、さらには、従来の製剤よりも特異
的活性のはるかに高い高度免疫グロブリンを製造でき
る。このことは、少量ＩＶ投与及び少量ＩＶ投与タンパ
ク質により、即ち、対応してレシピエントへの負担が低
い状態で、高ドースの特異的免疫グロブリンを短時間で
得ることができることを意味する。これは、本発明にお
いて、固定化抗原への吸着による特異的免疫グロブリン
の濃縮、即ち、処理された「廃」画分をアフィニティー
クロマトグラフィーに使用することにより可能となる。
【００１１】このため、本発明による高度免疫グロブリ
ン製剤の製造方法は、プラズマプールから血漿を分別す
ることにより、ポリクローナル免疫グロブリンＧを含有
する少なくとも一つの画分を分離し、少なくとも一つの
残留画分を得る工程と；前記工程（ａ）で得られた残留
画分又はそのサブ画分に含有されるタンパク質成分から
タンパク質溶液を調製する工程と；得られたタンパク質
溶液を少なくとも一種のリガンドからなる固定化リガン
ドを用いたアフィニティークロマトグラフィーに少なく
とも一回附して、特異的血漿タンパク質を天然若しくは
組み換え抗原、ウイルス抗原、バクテリア抗原又は細胞
抗原からなる群から選択される該固定化リガンドに結合
させ、そして結合血漿タンパク質を取り出す工程；及び
得られた血漿タンパク質から高度免疫グロブリン製剤を
調製する工程とを含んでなる。
ン製剤の製造方法は、プラズマプールから血漿を分別す
ることにより、ポリクローナル免疫グロブリンＧを含有
する少なくとも一つの画分を分離し、少なくとも一つの
残留画分を得る工程と；前記工程（ａ）で得られた残留
画分又はそのサブ画分に含有されるタンパク質成分から
タンパク質溶液を調製する工程と；得られたタンパク質
溶液を少なくとも一種のリガンドからなる固定化リガン
ドを用いたアフィニティークロマトグラフィーに少なく
とも一回附して、特異的血漿タンパク質を天然若しくは
組み換え抗原、ウイルス抗原、バクテリア抗原又は細胞
抗原からなる群から選択される該固定化リガンドに結合
させ、そして結合血漿タンパク質を取り出す工程；及び
得られた血漿タンパク質から高度免疫グロブリン製剤を
調製する工程とを含んでなる。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明においては、プラズマ分別
工程で得られた画分、特に廃画分を、まずアフィニティ
ークロマトグラフィーに利用できるように処理する。画
分の由来に応じて、この処理は大きく異なってよい。即
ち、例えば、上清ＧＧは、沈降濃縮させ、適当な緩衝液
に対して透析し、濾過できる。一方、沈澱物又は濾過ケ
ーキ（このような原料は、以下の表１及び２に挙げられ
ている）は、まず適当に懸濁させる。即ち、イオン強
度、ｐＨ及び／又は温度を変化させたり、洗浄剤及び塩
を添加することにより懸濁して、免疫グロブリンが特異
的に可溶化されるようにする。これらは、例えば、ｐＨ
３〜９、コンダクタンス５〜２０ｍＳ／ｃｍ、４℃の条
件で一晩攪拌後、遠心分離及び／又は濾過により清澄化
する。上清と懸濁液の両方とも、この段階で、Ｈｏｒｏ
ｗｉｔｚ（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄＨａｅｍｏｓ
ｔａｓｉｓ、６５、１１６３、１９９１）の溶媒−洗浄
剤法、メチレンブルー法（Ｍｏｈｒ等、Ｉｎｆｕｓｉｏ
ｎｓｔｈｅｒ．Ｉｎｆｕｓｉｏｎｓｍｅｄ．２０、１９
〔１９９３〕）又は他の方法により、ウイルス不活性化
する。また、懸濁後に、免疫グロブリンを、カラム中か
適当な濾過助剤若しくは水酸化アルミニウム等の吸着剤
を用いた処理によるマトリックスへの予備吸着による予
備精製や、タンパク質Ａ又はＧを用いたクロマトグラフ
ィーによる濃縮や、硫酸アンモニウム、ポリエチレング
コール若しくはエタノール沈澱からなる一般的な方法に
よる一種以上の沈澱、又はそれらを組み合わせた精製、
濃縮又は妨害成分の減少操作に附することができる。
工程で得られた画分、特に廃画分を、まずアフィニティ
ークロマトグラフィーに利用できるように処理する。画
分の由来に応じて、この処理は大きく異なってよい。即
ち、例えば、上清ＧＧは、沈降濃縮させ、適当な緩衝液
に対して透析し、濾過できる。一方、沈澱物又は濾過ケ
ーキ（このような原料は、以下の表１及び２に挙げられ
ている）は、まず適当に懸濁させる。即ち、イオン強
度、ｐＨ及び／又は温度を変化させたり、洗浄剤及び塩
を添加することにより懸濁して、免疫グロブリンが特異
的に可溶化されるようにする。これらは、例えば、ｐＨ
３〜９、コンダクタンス５〜２０ｍＳ／ｃｍ、４℃の条
件で一晩攪拌後、遠心分離及び／又は濾過により清澄化
する。上清と懸濁液の両方とも、この段階で、Ｈｏｒｏ
ｗｉｔｚ（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄＨａｅｍｏｓ
ｔａｓｉｓ、６５、１１６３、１９９１）の溶媒−洗浄
剤法、メチレンブルー法（Ｍｏｈｒ等、Ｉｎｆｕｓｉｏ
ｎｓｔｈｅｒ．Ｉｎｆｕｓｉｏｎｓｍｅｄ．２０、１９
〔１９９３〕）又は他の方法により、ウイルス不活性化
する。また、懸濁後に、免疫グロブリンを、カラム中か
適当な濾過助剤若しくは水酸化アルミニウム等の吸着剤
を用いた処理によるマトリックスへの予備吸着による予
備精製や、タンパク質Ａ又はＧを用いたクロマトグラフ
ィーによる濃縮や、硫酸アンモニウム、ポリエチレング
コール若しくはエタノール沈澱からなる一般的な方法に
よる一種以上の沈澱、又はそれらを組み合わせた精製、
濃縮又は妨害成分の減少操作に附することができる。
【００１３】
【表１】
【００１４】
【表２】
【００１５】本発明のアフィニティークロマトグラフィ
ーのリガンドとして使用可能なものの例を以下に示す：ヘモフィルス インフルエンザｂ（ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｂ）、黄色ブドウ状球菌 、スタフィロコッカス エピデルミディス（ Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス アガラクティエ（ Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、スタフィロコッカス ニューモニエ（ Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、スタフィロコッカス ピオゲネス（ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、 及び他の病原性菌株； 破傷風毒素、黄色ブドウ状球菌トキシックショックトキシン（ｔｏｘ
ｉｃ ｓｈｏｃｋ ｔｏｘｉｎ） 、 及びさらなる病原性バクテリア又は他の毒素； Ａ型肝炎ウイルス、 Ｂ型肝炎ウイルス、 Ｃ型肝炎ウイルス、 水痘−帯状疱疹ウイルス、 サイトメガロウイルス、ＲＳウイルス、 Ｂ１９パルボウイルス、 １型単純ヘルペスウイルス、 ２型単純ヘルペスウイルス、 狂犬病ウイルス、 及び他の病原性ウイルス； ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、 ＣＤ５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ７２、 ＩＣＡＭ、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＤＮＡ、 及び他の潜在ヒト自己抗原、の抗原決定基。
ーのリガンドとして使用可能なものの例を以下に示す：ヘモフィルス インフルエンザｂ（ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｂ）、黄色ブドウ状球菌 、スタフィロコッカス エピデルミディス（ Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス アガラクティエ（ Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、スタフィロコッカス ニューモニエ（ Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、スタフィロコッカス ピオゲネス（ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、 及び他の病原性菌株； 破傷風毒素、黄色ブドウ状球菌トキシックショックトキシン（ｔｏｘ
ｉｃ ｓｈｏｃｋ ｔｏｘｉｎ） 、 及びさらなる病原性バクテリア又は他の毒素； Ａ型肝炎ウイルス、 Ｂ型肝炎ウイルス、 Ｃ型肝炎ウイルス、 水痘−帯状疱疹ウイルス、 サイトメガロウイルス、ＲＳウイルス、 Ｂ１９パルボウイルス、 １型単純ヘルペスウイルス、 ２型単純ヘルペスウイルス、 狂犬病ウイルス、 及び他の病原性ウイルス； ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、 ＣＤ５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ７２、 ＩＣＡＭ、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＤＮＡ、 及び他の潜在ヒト自己抗原、の抗原決定基。
【００１６】自体公知の方法により変性又は未変性リガ
ンド（このようなリガンドの例は、上記に挙げてある）
を固定化して調製したアフィニティーゲルに、濃縮形態
又は希釈形態の処理上清及び懸濁液をローディングし、
必要に応じて、フローを繰り返しローディングする。所
望ならば、種々のアフィニティーゲルを、同じ懸濁液で
順次活性化してもよい。その後、ゲルを、非特異的結合
タンパク質がほとんど又は十分な程度に除去されるよう
に洗浄する。これは、例えば、生理食塩水濃度の増加、
洗浄剤の添加及び／又は洗浄液のｐＨを変えることによ
り行うことができる。この時点で、結合タンパク質を、
リガンドから、例えば、低ｐＨ若しくは高ｐＨでの溶
出、チオシアン酸ナトリウム若しくは塩化マグネシウム
等のカオトロピー生理食塩水、ＳＤＳ若しくは尿素等の
変性剤、エチレングリコール等の溶媒の添加、温度の変
更又は上記の手法の組み合わせにより分離する。
ンド（このようなリガンドの例は、上記に挙げてある）
を固定化して調製したアフィニティーゲルに、濃縮形態
又は希釈形態の処理上清及び懸濁液をローディングし、
必要に応じて、フローを繰り返しローディングする。所
望ならば、種々のアフィニティーゲルを、同じ懸濁液で
順次活性化してもよい。その後、ゲルを、非特異的結合
タンパク質がほとんど又は十分な程度に除去されるよう
に洗浄する。これは、例えば、生理食塩水濃度の増加、
洗浄剤の添加及び／又は洗浄液のｐＨを変えることによ
り行うことができる。この時点で、結合タンパク質を、
リガンドから、例えば、低ｐＨ若しくは高ｐＨでの溶
出、チオシアン酸ナトリウム若しくは塩化マグネシウム
等のカオトロピー生理食塩水、ＳＤＳ若しくは尿素等の
変性剤、エチレングリコール等の溶媒の添加、温度の変
更又は上記の手法の組み合わせにより分離する。
【００１７】場合によっては、固定化されるリガンドを
突然変異誘発又は化学的若しくは物理的方法により、特
異的免疫グロブリンがそれらのエピトープにまだ結合で
きるが親和性が減少するように変性して、溶出が未変性
リガンドを用いたときよりも穏やかな条件下で行うこと
ができるようにするのが望ましいことがある。また、リ
ガンドの変性は、それらの固定化及び／又はエピトープ
の提供を容易にしたり向上させたりするために行っても
よい。アフィニティークロマトグラフィーの技術的な詳
細及び基本原理については、一般的に、Ｃｕａｔｒｅｃ
ａｓａｓ，Ｐ．，ａｎｄ Ａｎｆｉｎｓｅｎ，Ｃ．Ｂ．
（１９７１）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４
０、２５９；Ｋｕｌｌ，Ｆ．Ｃ．，及びＣｕａｔｒｅｃ
ａｓａｓ，Ｐ．（１９８１）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
２６、１２７９；Ｌｉｅｂｉｎｇ等、（１９９４）、Ｖ
ｏｘ Ｓａｎｇ．６７、１１７に記載されている。
突然変異誘発又は化学的若しくは物理的方法により、特
異的免疫グロブリンがそれらのエピトープにまだ結合で
きるが親和性が減少するように変性して、溶出が未変性
リガンドを用いたときよりも穏やかな条件下で行うこと
ができるようにするのが望ましいことがある。また、リ
ガンドの変性は、それらの固定化及び／又はエピトープ
の提供を容易にしたり向上させたりするために行っても
よい。アフィニティークロマトグラフィーの技術的な詳
細及び基本原理については、一般的に、Ｃｕａｔｒｅｃ
ａｓａｓ，Ｐ．，ａｎｄ Ａｎｆｉｎｓｅｎ，Ｃ．Ｂ．
（１９７１）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４
０、２５９；Ｋｕｌｌ，Ｆ．Ｃ．，及びＣｕａｔｒｅｃ
ａｓａｓ，Ｐ．（１９８１）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
２６、１２７９；Ｌｉｅｂｉｎｇ等、（１９９４）、Ｖ
ｏｘ Ｓａｎｇ．６７、１１７に記載されている。
【００１８】特異的な分離免疫グロブリンは、必要に応
じてさらに濾過によりウイルスを除去後、処理して、好
ましくはＩＶで投与でき、且つ発熱物質を含有せず、耐
ウイルス性であり、アルブミン、アミノ酸又は炭水化物
等の安定化剤の添加状態若しくは添加することなく安定
である液状又は凍結乾燥形態の最終生成物とする。
じてさらに濾過によりウイルスを除去後、処理して、好
ましくはＩＶで投与でき、且つ発熱物質を含有せず、耐
ウイルス性であり、アルブミン、アミノ酸又は炭水化物
等の安定化剤の添加状態若しくは添加することなく安定
である液状又は凍結乾燥形態の最終生成物とする。
【００１９】
【実施例】以下、本発明の好ましい実施態様を実施例に
より説明するが、本発明はこれらの実施例には限定され
ない。 実施例１ 組み換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ、Ａｂ
ｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）５ｍｇを、製造業
者（スエーデン、ＵｐｐｓａｌａにあるＰｈａｒｍａｃ
ｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）記載の方法に準じて活性化Ｃ
Ｈ−セファロースの１ｍｌに第一アミノ基のカプリング
を介して固定することにより、ＨＢｓＡｇ−セファロー
スを調製した。ＨＢｓＡｇを添加することなく別のゲル
アリコットを用いて同様のカプリング法を実施すること
により、「プラセボ」−セファロースを調製した。完成
したゲルを、０．０２％ＮａＮ3 含有ＰＢＳに４℃で保
存した。
より説明するが、本発明はこれらの実施例には限定され
ない。 実施例１ 組み換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ、Ａｂ
ｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）５ｍｇを、製造業
者（スエーデン、ＵｐｐｓａｌａにあるＰｈａｒｍａｃ
ｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）記載の方法に準じて活性化Ｃ
Ｈ−セファロースの１ｍｌに第一アミノ基のカプリング
を介して固定することにより、ＨＢｓＡｇ−セファロー
スを調製した。ＨＢｓＡｇを添加することなく別のゲル
アリコットを用いて同様のカプリング法を実施すること
により、「プラセボ」−セファロースを調製した。完成
したゲルを、０．０２％ＮａＮ3 含有ＰＢＳに４℃で保
存した。
【００２０】Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎプ
ラズマ分別（ＮＢロット４．０３０．２１６）から得ら
れた沈澱物Ｂ７０ｇを、Ｒｏｔａｒｙ Ｍｉｘ装置を用
いて、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ４．０、０．２５％Ｔ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭ Ｎ−エチルマレイ
ミド（ＮＥＭ）、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフル
オリド（ＰＭＳＦ）（４℃）２１０ｍｌに一晩懸濁し
た。遠心分離（５０００ｇ、４℃、１０分間）及び濾過
（孔サイズ：１．２μｍ）により不溶分を分離後、Ｈｏ
ｒｏｗｉｔｚ等（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａ
ｅｍｏｓｔａｓｉｓ、６５、１１６３、１９９１）に準
じて、中性ｐＨで１％トリ−ｎ−ブチルホスフェート
（ドイツ国ダームシュタットにあるＭｅｒｃｋ社）及び
１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加し、攪拌しながら
３０℃で４時間インキュベーションした。次に、３７℃
で一晩相分離し、透明下相を除去し、０．４５μｍフィ
ルターにより濾過し、４℃で保存した。
ラズマ分別（ＮＢロット４．０３０．２１６）から得ら
れた沈澱物Ｂ７０ｇを、Ｒｏｔａｒｙ Ｍｉｘ装置を用
いて、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ４．０、０．２５％Ｔ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭ Ｎ−エチルマレイ
ミド（ＮＥＭ）、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフル
オリド（ＰＭＳＦ）（４℃）２１０ｍｌに一晩懸濁し
た。遠心分離（５０００ｇ、４℃、１０分間）及び濾過
（孔サイズ：１．２μｍ）により不溶分を分離後、Ｈｏ
ｒｏｗｉｔｚ等（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａ
ｅｍｏｓｔａｓｉｓ、６５、１１６３、１９９１）に準
じて、中性ｐＨで１％トリ−ｎ−ブチルホスフェート
（ドイツ国ダームシュタットにあるＭｅｒｃｋ社）及び
１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加し、攪拌しながら
３０℃で４時間インキュベーションした。次に、３７℃
で一晩相分離し、透明下相を除去し、０．４５μｍフィ
ルターにより濾過し、４℃で保存した。
【００２１】このようなＮＢ懸濁液１３０ｍｌをＰＢＳ
（リン酸緩衝生理食塩水：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０
ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．１）２８０ｍｌで希釈
し、ポンプを用いて４℃でプラセボ−セファロースカラ
ムを通過させた後、ＨＢｓＡｇ−セファロースカラムを
通過させ、カラム通過後貯蔵容器に戻るようにした。流
量８ｍｌ／時間で１４４時間行った。このようにして、
ＮＢ懸濁液を、ポンプを用いて、カラムを合計３回通過
させた。９０時間後、ローディングを中断し、カラムを
個々にまずＰＢＳで洗浄後、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で、洗液の光学濃度
が２８０ｎｍ（ＯＤ280 ）で０．０１未満となるまで洗
浄した。活性化完了後、ＰＢＳ及び２００ｍＭ ＮａＣ
ｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を用いて再び
洗浄した。結合タンパク質を、２００ｍＭグリセリン−
ＨＣｌ、ｐＨ２．５ ５ｍｌを用いて分離し、直ちに中
和し、処理した。
（リン酸緩衝生理食塩水：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０
ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．１）２８０ｍｌで希釈
し、ポンプを用いて４℃でプラセボ−セファロースカラ
ムを通過させた後、ＨＢｓＡｇ−セファロースカラムを
通過させ、カラム通過後貯蔵容器に戻るようにした。流
量８ｍｌ／時間で１４４時間行った。このようにして、
ＮＢ懸濁液を、ポンプを用いて、カラムを合計３回通過
させた。９０時間後、ローディングを中断し、カラムを
個々にまずＰＢＳで洗浄後、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で、洗液の光学濃度
が２８０ｎｍ（ＯＤ280 ）で０．０１未満となるまで洗
浄した。活性化完了後、ＰＢＳ及び２００ｍＭ ＮａＣ
ｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を用いて再び
洗浄した。結合タンパク質を、２００ｍＭグリセリン−
ＨＣｌ、ｐＨ２．５ ５ｍｌを用いて分離し、直ちに中
和し、処理した。
【００２２】
【表３】
【００２３】実施例２ Ｃｏｈｎ画分ＩＩ＋ＩＩＩ（原料としての血漿の代わ
り）から、Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ分別
を実施した。このＫｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎ
ｎ分別から得た沈澱物Ｂ（ＮＢロット４．０４４．４８
８）７０ｇを、Ｒｏｔａｒｙ Ｍｉｘ装置を用いて、１
００ｍＭクエン酸、ｐＨ４．０、０．２５％Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００、１０ｍＭ ＮＥＭ、１ｍＭ ＰＭＳＦ
（４℃）２１０ｍｌに一晩懸濁した。超遠心分離による
清澄化及び部分脱脂後（１００，０００ｇ、３時間、４
℃：透明相を、チューブの側面からシリンジを突き刺し
て取り出した）、上清を濾過（０．４５μｍ）し、４℃
で保存した。
り）から、Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ分別
を実施した。このＫｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎ
ｎ分別から得た沈澱物Ｂ（ＮＢロット４．０４４．４８
８）７０ｇを、Ｒｏｔａｒｙ Ｍｉｘ装置を用いて、１
００ｍＭクエン酸、ｐＨ４．０、０．２５％Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００、１０ｍＭ ＮＥＭ、１ｍＭ ＰＭＳＦ
（４℃）２１０ｍｌに一晩懸濁した。超遠心分離による
清澄化及び部分脱脂後（１００，０００ｇ、３時間、４
℃：透明相を、チューブの側面からシリンジを突き刺し
て取り出した）、上清を濾過（０．４５μｍ）し、４℃
で保存した。
【００２４】このＮＢ懸濁液１２５ｍｌを３７５ｍｌの
ＰＢＳ（０．１Ｍ ＮａＯＨでｐＨを７．１に調整）で
希釈し、濾過し、実施例１と同様にして、ポンプを用い
て、まず実施例３と同様にして調製したプラセボ−セフ
ァロースゲルにローディング後、ＨＢｓＡｇ−セファロ
ースゲルにローディングした。次に、ぞれぞれのゲルを
別個に、ＰＢＳ及び２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭト
リス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄した。結合タンパク質
を、２００ｍＭグリセリン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５ ５ｍ
ｌを用いて分離した。データを、表４にまとめて示す。
ＰＢＳ（０．１Ｍ ＮａＯＨでｐＨを７．１に調整）で
希釈し、濾過し、実施例１と同様にして、ポンプを用い
て、まず実施例３と同様にして調製したプラセボ−セフ
ァロースゲルにローディング後、ＨＢｓＡｇ−セファロ
ースゲルにローディングした。次に、ぞれぞれのゲルを
別個に、ＰＢＳ及び２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭト
リス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄した。結合タンパク質
を、２００ｍＭグリセリン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５ ５ｍ
ｌを用いて分離した。データを、表４にまとめて示す。
【００２５】
【表４】
【００２６】実施例３ 上清ＧＧ（ロット番号：Ｘ９５．３１．２８６．１）３
０リットルをＰＢＳでダイアフィルトレーションし、５
００ｍｌに濃縮した。実施例１と同様にして、濃縮液
を、プラセボ及びＨＢｓＡｇカラムに流量２１ｍｌ／時
間で１１８時間ポンプでローディングした。カラム洗浄
及び結合タンパク質の分離を実施例１と同様にして行っ
たが、但し、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−
ＨＣｌ、ｐＨ７．４を用いた追加の洗浄工程を実施し
た。結果を、表５に示す。
０リットルをＰＢＳでダイアフィルトレーションし、５
００ｍｌに濃縮した。実施例１と同様にして、濃縮液
を、プラセボ及びＨＢｓＡｇカラムに流量２１ｍｌ／時
間で１１８時間ポンプでローディングした。カラム洗浄
及び結合タンパク質の分離を実施例１と同様にして行っ
たが、但し、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−
ＨＣｌ、ｐＨ７．４を用いた追加の洗浄工程を実施し
た。結果を、表５に示す。
【００２７】
【表５】
【００２８】実施例４ ＤＥＡＥ濾過ケーキ１７．５ｇ（ロット４．４２２．０
０６．０）を、実施例１に準じて懸濁緩衝液５２．５ｍ
ｌに懸濁し、処理した。懸濁液４０ｍｌを、ＰＢＳ１６
０ｍｌで希釈し、ｐＨを７．１に調整後、濾過した。実
施例３と同様にして、懸濁液を、プラセボ及びＨＢｓＡ
ｇカラムに流量２１ｍｌ／時間で９７時間ポンプでロー
ディングした。カラム洗浄及び結合タンパク質の分離
を、実施例１と同様にして行った。結果を、表６に示
す。
０６．０）を、実施例１に準じて懸濁緩衝液５２．５ｍ
ｌに懸濁し、処理した。懸濁液４０ｍｌを、ＰＢＳ１６
０ｍｌで希釈し、ｐＨを７．１に調整後、濾過した。実
施例３と同様にして、懸濁液を、プラセボ及びＨＢｓＡ
ｇカラムに流量２１ｍｌ／時間で９７時間ポンプでロー
ディングした。カラム洗浄及び結合タンパク質の分離
を、実施例１と同様にして行った。結果を、表６に示
す。
【００２９】
【表６】
【００３０】実施例５ 精製破傷風トキシド（ＴＴ）１１．５ｍｇを、ＥＡＨ−
セファロース（スエーデンＵｐｐｓａｌａにあるＰｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）１ｍｌに製造業者記
載の方法に準じて０．１Ｍ Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−
ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド−ＨＣｌを
用いてカルボキシ基のカプリングを介して固定すること
により、破傷風トキソイドＣ−セファロースを調製し
た。完成したゲルを、０．０２％ＮａＮ3 含有ＰＢＳに
４℃で保存した。
セファロース（スエーデンＵｐｐｓａｌａにあるＰｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）１ｍｌに製造業者記
載の方法に準じて０．１Ｍ Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−
ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド−ＨＣｌを
用いてカルボキシ基のカプリングを介して固定すること
により、破傷風トキソイドＣ−セファロースを調製し
た。完成したゲルを、０．０２％ＮａＮ3 含有ＰＢＳに
４℃で保存した。
【００３１】上清ＧＧの濃縮液を実施例３と同様にして
調製し、ＴＴ−セファロースを用いて、実施例２と同様
のアフィニティークロマトグラフィーに附した。活性化
は、４℃、流量２３．５ｍｌ／時間、１５９時間で生じ
た。結果を、表７に示す。
調製し、ＴＴ−セファロースを用いて、実施例２と同様
のアフィニティークロマトグラフィーに附した。活性化
は、４℃、流量２３．５ｍｌ／時間、１５９時間で生じ
た。結果を、表７に示す。
【００３２】
【表７】
【００３３】実施例６ 精製破傷風トキソイド（ＴＴ）を、製造業者（スエーデ
ン、ＵｐｐｓａｌａにあるＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ社）記載の方法に準じて活性化ＣＨ−セファロ
ース１ｍｌに第一アミノ基のカプリングを介して固定す
ることにより、破傷風トキソイドＮ−セファロースを調
製した。ＴＴを添加することなく別のゲルアリコットを
用いて同様のカプリング法を実施することにより、「プ
ラセボ」−セファロースを調製した。完成したゲルを、
０．０２％ＮａＮ3 含有ＰＢＳに４℃で保存した。
ン、ＵｐｐｓａｌａにあるＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ社）記載の方法に準じて活性化ＣＨ−セファロ
ース１ｍｌに第一アミノ基のカプリングを介して固定す
ることにより、破傷風トキソイドＮ−セファロースを調
製した。ＴＴを添加することなく別のゲルアリコットを
用いて同様のカプリング法を実施することにより、「プ
ラセボ」−セファロースを調製した。完成したゲルを、
０．０２％ＮａＮ3 含有ＰＢＳに４℃で保存した。
【００３４】沈澱物Ｂを実施例２に準じて懸濁した。濾
過（１．２μｍ）後、この懸濁液１１５ｍｌを、ＰＢＳ
２００ｍｌで希釈し、ｐＨを７．１に調整し、ポンプを
用いてまずプラセボ−セファロースカラムに流量３．５
ｍｌ／時間で１６５時間ローディングした。この際、プ
ラセボ−セファロースカラムを通過したフローを直ちに
ＴＴＮ−セファロースカラムを通過させ、その後、貯蔵
容器に戻るようにした。カラムを個々にまずＰＢＳで洗
浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、
ｐＨ７．１で、フローのＯＤ28 0 が０．０１未満となる
まで洗浄した。結果を、表８に示す。
過（１．２μｍ）後、この懸濁液１１５ｍｌを、ＰＢＳ
２００ｍｌで希釈し、ｐＨを７．１に調整し、ポンプを
用いてまずプラセボ−セファロースカラムに流量３．５
ｍｌ／時間で１６５時間ローディングした。この際、プ
ラセボ−セファロースカラムを通過したフローを直ちに
ＴＴＮ−セファロースカラムを通過させ、その後、貯蔵
容器に戻るようにした。カラムを個々にまずＰＢＳで洗
浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、
ｐＨ７．１で、フローのＯＤ28 0 が０．０１未満となる
まで洗浄した。結果を、表８に示す。
【００３５】
【表８】
【００３６】実施例７ 沈澱物Ｂを、実施例２に準じて懸濁した。濾過（１．２
μｍ）後、この懸濁液１１５ｍｌを、ＰＢＳ２００ｍｌ
で希釈し、ｐＨを７．１に調整し、ポンプを用いてまず
ＨＢｓＡｇ−セファロースカラムに流量５ｍｌ／時間で
１６５時間ローディングした。この際、ＨＢｓＡｇ−セ
ファロースカラムを通過したフローを直ちにＴＴ−セフ
ァロースカラムを通過させ、その後、貯蔵容器に戻るよ
うにした。カラムを個々にまずＰＢＳで洗浄後、０．５
Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．１
で、フローのＯＤ280が０．０１未満となるまで洗浄し
た。結果を、表９に示す。
μｍ）後、この懸濁液１１５ｍｌを、ＰＢＳ２００ｍｌ
で希釈し、ｐＨを７．１に調整し、ポンプを用いてまず
ＨＢｓＡｇ−セファロースカラムに流量５ｍｌ／時間で
１６５時間ローディングした。この際、ＨＢｓＡｇ−セ
ファロースカラムを通過したフローを直ちにＴＴ−セフ
ァロースカラムを通過させ、その後、貯蔵容器に戻るよ
うにした。カラムを個々にまずＰＢＳで洗浄後、０．５
Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．１
で、フローのＯＤ280が０．０１未満となるまで洗浄し
た。結果を、表９に示す。
【００３７】
【表９】
【００３８】実施例８ Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ分別（ロット番
号：５．０４３．３０３）から得られた沈澱物Ｂ １５
ｋｇを、ビブロミキサーを用いて、０．１Ｍクエン酸、
ｐＨ４．０、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１
０ｍＭ ＮＥＭ、１ｍＭ ＰＭＳＦ（４℃）４５リット
ルに一晩懸濁した。濾過助剤を添加し、濾過（孔サイ
ズ：１．２μｍ）により不溶分を分離後、Ｈｏｒｏｗｉ
ｔｚ等に準じて、中性ｐＨで１％トリ−ｎ−ブチルホス
フェート及び１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加して
脱脂及びウイルス不活性化し、攪拌しながら３０℃で４
時間インキュベーションした。その後、３７℃で一晩相
分離し、透明下相をポンプで取り出し、０．４５μｍフ
ィルターにより濾過し、４℃で保存した。
号：５．０４３．３０３）から得られた沈澱物Ｂ １５
ｋｇを、ビブロミキサーを用いて、０．１Ｍクエン酸、
ｐＨ４．０、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１
０ｍＭ ＮＥＭ、１ｍＭ ＰＭＳＦ（４℃）４５リット
ルに一晩懸濁した。濾過助剤を添加し、濾過（孔サイ
ズ：１．２μｍ）により不溶分を分離後、Ｈｏｒｏｗｉ
ｔｚ等に準じて、中性ｐＨで１％トリ−ｎ−ブチルホス
フェート及び１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加して
脱脂及びウイルス不活性化し、攪拌しながら３０℃で４
時間インキュベーションした。その後、３７℃で一晩相
分離し、透明下相をポンプで取り出し、０．４５μｍフ
ィルターにより濾過し、４℃で保存した。
【００３９】このＮＢ懸濁液４０リットルのｐＨをＮａ
ＯＨで７．１に調整し、ポンプを用いて４℃でＨＢｓＡ
ｇカラム及び破傷風トキソイドＡｆｆｉｐｒｅｐカラム
にローディングした。この際、カラムからのフローは、
貯蔵容器に戻るようにした。Ａｆｆｉｐｒｅｐカラム
（５０×１３ｍｍ）は、２５０ｍｇの組み換えＨＢｓＡ
ｇと破傷風トキソイドをそれぞれＡｆｆｉｐｒｅｐゲル
（米国、９４５４７、カルホルニア州ヘラキュレスにあ
るＢｉｏ Ｒａｄ Ｌａｂ社）でカプリングすることに
より調製した。流量６リットル／時間で６２時間行っ
た。このようにして、ＮＢ懸濁液を、ポンプを用いて、
カラムを合計３回通過させた。活性化完了後、カラムを
個々にまずＰＢＳで洗浄後、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で、洗液の光学濃度
が２８０ｎｍ（ＯＤ280 ）で０．０１未満となるまで洗
浄した。結合タンパク質を、２００ｍＭグリシン−ＨＣ
ｌ、ｐＨ２．５を用いて分離し、画分をのｐＨを直ちに
５．２に調整した。結果を、表１０にまとめて示す。Ｉ
ｇＧ含有画分をプールし、ダイアフィルトレーション
し、濃縮し、２０ｍＭ ＮａＣｌで１００ＩＵ／ｍｌ及
び２．５ｍｇ抗−ＴＴ−ＩｇＧ／ｍｌの溶液とすること
により、免疫グロブリンを処理して安定な製剤とした。
１０％ショ糖を添加し、溶液を、２００ＩＵ単位及び５
ｍｇの抗−ＴＴ−ＩｇＧに凍結乾燥した。 実施例９ Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎプラズマ分別か
ら得た沈澱物ＩＶ ５０ｇを、水５００ｍｌに懸濁し
た。ｐＨをクエン酸で５．０に調整し、ＮａＣｌコンダ
クタンスを１３ｍＳに調整した。４℃で一晩攪拌後、３
０，０００ｇで３０分間遠心分離することにより清澄化
及び部分脱脂した。分離したタンパク質、ＩｇＭ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＧ、トランスフェリン及びセルロプラスミンの
懸濁液中含量を測定した。結果を、表１１に示す。
ＯＨで７．１に調整し、ポンプを用いて４℃でＨＢｓＡ
ｇカラム及び破傷風トキソイドＡｆｆｉｐｒｅｐカラム
にローディングした。この際、カラムからのフローは、
貯蔵容器に戻るようにした。Ａｆｆｉｐｒｅｐカラム
（５０×１３ｍｍ）は、２５０ｍｇの組み換えＨＢｓＡ
ｇと破傷風トキソイドをそれぞれＡｆｆｉｐｒｅｐゲル
（米国、９４５４７、カルホルニア州ヘラキュレスにあ
るＢｉｏ Ｒａｄ Ｌａｂ社）でカプリングすることに
より調製した。流量６リットル／時間で６２時間行っ
た。このようにして、ＮＢ懸濁液を、ポンプを用いて、
カラムを合計３回通過させた。活性化完了後、カラムを
個々にまずＰＢＳで洗浄後、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で、洗液の光学濃度
が２８０ｎｍ（ＯＤ280 ）で０．０１未満となるまで洗
浄した。結合タンパク質を、２００ｍＭグリシン−ＨＣ
ｌ、ｐＨ２．５を用いて分離し、画分をのｐＨを直ちに
５．２に調整した。結果を、表１０にまとめて示す。Ｉ
ｇＧ含有画分をプールし、ダイアフィルトレーション
し、濃縮し、２０ｍＭ ＮａＣｌで１００ＩＵ／ｍｌ及
び２．５ｍｇ抗−ＴＴ−ＩｇＧ／ｍｌの溶液とすること
により、免疫グロブリンを処理して安定な製剤とした。
１０％ショ糖を添加し、溶液を、２００ＩＵ単位及び５
ｍｇの抗−ＴＴ−ＩｇＧに凍結乾燥した。 実施例９ Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎプラズマ分別か
ら得た沈澱物ＩＶ ５０ｇを、水５００ｍｌに懸濁し
た。ｐＨをクエン酸で５．０に調整し、ＮａＣｌコンダ
クタンスを１３ｍＳに調整した。４℃で一晩攪拌後、３
０，０００ｇで３０分間遠心分離することにより清澄化
及び部分脱脂した。分離したタンパク質、ＩｇＭ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＧ、トランスフェリン及びセルロプラスミンの
懸濁液中含量を測定した。結果を、表１１に示す。
【００４０】
【表１０】
【００４１】
【表１１】
【００４２】実施例１０ Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎプラズマ画分
（ロット番号：４０３０．２０４．０）から得た沈澱物
Ｂ５０ｇを１００ｍＭクエン酸に添加したものを、種々
のｐＨ及び温度４℃で一晩攪拌し、１００，０００ｇ、
４℃で３時間超遠心分離して清澄化し、部分脱脂した。
透明な中央相を取り出し、その分離したタンパク質、Ｉ
ｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、トランスフェリン及びセルロプ
ラスミン含量を測定した（表１２）。
（ロット番号：４０３０．２０４．０）から得た沈澱物
Ｂ５０ｇを１００ｍＭクエン酸に添加したものを、種々
のｐＨ及び温度４℃で一晩攪拌し、１００，０００ｇ、
４℃で３時間超遠心分離して清澄化し、部分脱脂した。
透明な中央相を取り出し、その分離したタンパク質、Ｉ
ｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、トランスフェリン及びセルロプ
ラスミン含量を測定した（表１２）。
【００４３】
【表１２】
【００４４】一定のウイルス抗原（表１３）及びバクテ
リア抗原（表１４）に対するＩｇＧの力価を測定し、原
料プラズマ及び既存の免疫グロブリン製剤における力価
と比較した。
リア抗原（表１４）に対するＩｇＧの力価を測定し、原
料プラズマ及び既存の免疫グロブリン製剤における力価
と比較した。
【００４５】
【表１３】
【００４６】
【表１４】
【００４７】
【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
によれば、免疫グロブリン、特に高度免疫グロブリン
が、通常の工業的な血漿分別の実施中に得られるが、い
ままで廃画分として使用されなかったが、少なくとも免
疫グロブリン製材の製造には使用されなかった画分から
製造できる。本発明の方法によれば、続いて、高度免疫
グロブリンに相当するこれらの製剤を処理して、十分静
脈内（ＩＶ）投与でき、ウイルス耐性、液状又は凍結乾
燥形態の製剤とすることができる。
によれば、免疫グロブリン、特に高度免疫グロブリン
が、通常の工業的な血漿分別の実施中に得られるが、い
ままで廃画分として使用されなかったが、少なくとも免
疫グロブリン製材の製造には使用されなかった画分から
製造できる。本発明の方法によれば、続いて、高度免疫
グロブリンに相当するこれらの製剤を処理して、十分静
脈内（ＩＶ）投与でき、ウイルス耐性、液状又は凍結乾
燥形態の製剤とすることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ペーター・レルヒ スイス国 ベルン、ローゼンヴェーク 20 (72)発明者 ジャン−ジャック・モルゲンターラー スイス国 ボール、エーシヴェーク ９ (56)参考文献 特開 昭60−1134（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−118718（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 39/395 B01D 15/08 C07K 1/22 C07K 16/18 ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (15)
- 【請求項１】以下の工程からなることを特徴とする高度
免疫グロブリン製剤の製造方法： （ａ）プラズマプールから血漿を分別することにより、
ポリクローナル免疫グロブリンＧを含有する少なくとも
一つの画分を分離し、少なくとも一つの残留画分を得る
工程； （ｂ）前記工程（ａ）で得られた残留画分又はそのサブ
画分に含有されるタンパク質成分からタンパク質溶液を
調製する工程； （ｃ）得られたタンパク質溶液を少なくとも一種のリガ
ンドからなる固定化リガンドを用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーに少なくとも一回附して、特異的血漿
タンパク質を天然若しくは組み換え抗原、ウイルス抗
原、バクテリア抗原又は細胞抗原からなる群から選択さ
れる該固定化リガンドに結合させ、そして結合血漿タン
パク質を取り出す工程；及び （ｄ）得られた血漿タンパク質から高度免疫グロブリン
製剤を調製する工程。 - 【請求項２】血漿の分別を工業的規模で行い、残留画分
が廃画分である請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記工程（ａ）による残留画分が沈澱物又
は濾過ケーキであり、前記沈澱物又は濾過ケーキをイオ
ン強度＜５Ｍ、ｐＨ３．０〜９．０の水性緩衝液で処理
することにより前記タンパク質成分を溶液状態として、
溶液又は懸濁液を形成する請求項１又は２に記載の方
法。 - 【請求項４】前記緩衝液がリン酸緩衝液、トリス−ＨＣ
ｌ緩衝液又はクエン酸緩衝液である請求項３に記載の方
法。 - 【請求項５】前記緩衝液が洗浄剤、一種以上のプロテア
ーゼインヒビター及び／又は塩を含有する請求項３又は
４に記載の方法。 - 【請求項６】前記溶液又は懸濁液を濾過するか、水酸化
アルミニウム吸着剤又はＤＥＡＥ含有吸着剤で前処理す
る請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】前記溶液又は懸濁液を硫酸アンモニウム、
ポリエチレングリコール又はエタノールと反応させて沈
澱物を生成し、上清又は沈澱物をさらに処理する請求項
３〜５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】工程（ａ）による残留画分が上清であり、
前記タンパク質溶液を、ダイアフィルトレーションによ
る濾過及び濃縮により調製する請求項１又は２に記載の
方法。 - 【請求項９】前記上清を濾過するか、水酸化アルミニウ
ム吸着剤又はＤＥＡＥ含有吸着剤で前処理する請求項８
に記載の方法。 - 【請求項１０】前記リガンドが、ヘモフィルス インフ
ルエンザｂ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎ
ｚａ ｂ）、黄色ブドウ状球菌、スタフィロコッカス
エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅ
ｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス アガラ
クティエ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａ
ｃｔｉａｅ）、スタフィロコッカス ニューモニエ（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、
スタフィロコッカス ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、破傷風毒素、黄色ブド
ウ状球菌トキシックショックトキシン（ｔｏｘｉｃ ｓ
ｈｏｃｋ ｔｏｘｉｎ）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎
ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、水痘−帯状疱疹ウイル
ス、サイトメガロウイルス、ＲＳウイルス、Ｂ１９パル
ボウイルス、１及び２型単純ヘルペスウイルス、狂犬病
ウイルス、潜在ヒト自己抗原ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、
ＣＤ５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ７２、ＩＣＡＭ、Ｌ
ＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＤＮＡ、及びリン脂質の抗原決
定基から選択される請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】前記リガンドが突然変異誘発又は化学的
若しくは物理的方法により変性されたものである請求項
１０に記載の方法。 - 【請求項１２】得られた前記高度免疫グロブリン製剤
が、クラスＧ、Ａ若しくはＭ又はそれらの組み合わせの
免疫グロブリンのみからなる請求項１〜１１のいずれか
１項に記載の方法。 - 【請求項１３】得られた前記高度免疫グロブリン製剤を
ウイルス不活性化し、必要に応じて安定化し、アルブミ
ン、アミノ酸又は炭水化物から選択される安定剤を添加
し、及び／又は得られた生成物を凍結乾燥する請求項１
〜１２のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１４】得られた前記高度免疫グロブリン製剤
を、静脈内、筋肉内又は局所投与できる製剤から選択さ
れる薬学的に許容される生成物に転化する請求項１〜１
３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１５】高力価免疫グロブリン製剤の製造方法で
あって、以下の工程を順次実施することを特徴とする製
造方法： （ａ）血漿の分別中に得られる残留画分又はそのサブ画
分のタンパク質成分からタンパク質溶液を調製する工
程； （ｂ）得られたタンパク質溶液を少なくとも一種のリガ
ンドからなる固定化リガンドを用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーに少なくとも一回附して、特異的血漿
タンパク質をリガンドに結合させ、そして結合血漿タン
パク質を分離し、得られた血漿タンパク質を活性成分と
して高力価免疫グロブリン製剤に転化させる工程。
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