JP2864277B2

JP2864277B2 - 光学活性アミノ酸類の製造方法

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Publication number: JP2864277B2
Application number: JP15566190A
Authority: JP
Inventors: 明子若木; 彰三浦; 治高橋; 敬三古橋
Original assignee: Japan Energy Corp
Current assignee: Eneos Corp
Priority date: 1989-06-15
Filing date: 1990-06-14
Publication date: 1999-03-03
Anticipated expiration: 2014-03-03
Also published as: JPH03117493A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、微生物を利用してニトリル化合物、特にラ
セミ体のα−アミノニトリル化合物並びにα−（Ｎ−ア
ルキリデンアミノ）ニトリル化合物から光学活性アミノ
酸類を製造する方法に関する。

光学活性アミノ酸類は、食品、飼料、医薬および化粧
品等の分野に利用される重要な化学物質である。

従来技術従来、光学活性アミノ酸類を製造する方法としては、
発酵法、合成法、酵素法及び抽出法が知られている。こ
れらの方法のうち、合成法による光学活性アミノ酸の製
造は、ストレッカー法或はその変法を用いてDL−α−ア
ミノ酸を合成し、次いで該アミノ酸を光学分割して光学
活性アミノ酸を製造するものであつて、光学分割の方法
としてアミノアシラーゼを用いる酵素法等を採用してい
る（「化学」誌増刊「不斉合成と光学分割の進歩」昭和
57年10月15日発行、第175頁）。

しかし、上記合成法による光学活性アミノ酸の製造法
は、光学分割段階においてコスト高となるため、経済的
理由から近年、アミノ酸の製造に占める割合が徐々に低
下してきている。

また、上記ストレッカー法によるα−アミノ酸の合成
における合成中間体であるDL−α−アミノニトリルから
微生物を利用してα−アミノ酸を製造しようとする試み
も報告されている〔Y.Fukuda et al.、「ジヤーナル
オブフアーメンテーシヨンテクノロジイ」（J.Ferm
ent.Tehnol.）49、1011（1971）〕。しかし、この報告
では、コリネバクテリウム（Corynebacterium sp.）に
属する微生物を用いてDL−α−アミノプロピオニトリル
並びにDL−α−アミノイソバレロニトリルを加水分解し
てDL−アラニン並びにDL−バリンを製造するものであつ
て、Ｌ−α−アミノ酸は直接得られない。また、ブレビ
バクテリウム属（Brevibacterim sp.）の菌株R312を用
いてDL−α−アミノニトリルを加水分解してアミノ酸を
製造する報告〔J.C.Jallagas et al.「アドバンスオ
ブバイオケミカルエンジニアリング」（Adv.Bioche
m.Engineer.,）14、１（1980）〕においても、DL−α−
アミノニトリルからはDL−α−アミノ酸しか得られてい
ない。因に、上記報告は、ブレビバクテリウム属の菌株
R312から得られた変異株であるブレビバクテリウムsp.A
4を用いることによりDL−α−アミノニトリルからＬ−
α−アミノ酸とＤ−α−アミノ酸アミドとを生成し得る
ことを開示しているが、DL−α−アミノニトリルからＬ
−α−アミノ酸のみを直接得ることに関しては、報告し
ていない。

また、DL−α−アミノニトリルの鏡像異性混合物の溶
液をエナンチオ選択的なニトリラーゼで処理し、光学活
性なアミノ酸及びアミノ酸アミドを調製する方法が開示
されている（特表昭63−500004）。上記報告は、ニトリ
ラーゼを生産する株第311号を用いることによりDL−α
−アミノニトリルから40％e.e.のＬ−アミノ酸アミドを
得ることを開示しているが、一方Ｌ−アミノ酸を得るた
めには、反応液から酵素を除去し、2Mの水酸化ナトリウ
ム溶液を加えてpHを11に調整することを反応６時間の間
に５回繰り返すという、化学的なＬ−アミノ酸アミドの
加水分解を行わなければならないという問題点を有して
いた。

一方、本発明者は、α−アミノニトリル化合物及びα
−（Ｎ−アルキリデンアミノ）ニトリル化合物から特定
の微生物を用いて光学活性アミノ酸を直接得る方法を提
案した（特開平１−317392号公報、特開平１−317393号
公報及び特開平１−317394号公報）。

しかし、ノカルディオプシス属又はバチルス属の微生
物を利用して加水分解して光学活性なα−アミノ酸を製
造する方法は未だ知られていない。

発明が解決しようとする課題本発明は、特定な属から選択されるニトリルの加水分
解能を有する微生物を利用して、DL−α−アミノニトリ
ル類から直接光学活性アミノ酸類を製造するための方法
を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段本発明は、ノカルディオプシス属又はバチルス属に属
するニトリル加水分解能を有する微生物を、DL−α−ア
ミノ酸類に作用させると光学活性アミノ酸類を選択的に
産生することの知見に基いてなされたものである。

したがって、本発明は、下記に示す一般式（Ｉ）乃至（IV）で表わされる１種
又は２種以上のニトリル化合物に、ノカルディオプシス
属又はバチルス属に属するニトリル加水分解能を有する
微生物を作用させて光学活性アミノ酸類を産生すること
を特徴とする光学活性アミノ酸類の製造方法、（ただし、式（Ｉ）および（II）中Ｒはアルキル基、置
換アルキル基、フェニル基、置換フェニル基、イミダゾ
リル基、置換イミダゾリル基、インドリル基、置換イン
ドリル基、フリル基、置換フリル基、ピリジル基、置換
ピリジル基、チアゾリル基、置換チアゾリル基を示す）（ただし、式（III）および（IV）中R₁及びＲはアルキ
ル基、置換アルキル基、フェニル基、置換フェニル基、
イミダゾリル基、置換イミダリゾリル基、インドリル
基、置換インドリル基、フリル基、置換フリル基、ピリ
ジル基、置換ピリジル基基、チアゾリル基、置換チアゾ
リル基を示し、R₁及びR₂はそれぞれ同じ基でも、異なる
基でも良い）。

また、本発明は、上記一般式（Ｉ）又は（II）で表わ
される１種又は２種以上のα−アミノニトリル化合物を
出発物質として用いる場合、下記に示す一般式（Ｖ）も
しくは（VI）で表わされるアルデヒドの存在下に、上記
微生物を作用させて光学活性アミノ酸を産生することも
特徴とする。

Ｒ−CHO （Ｖ）または、下記一般式（VI）Ｒ−CH₂CHO （VI）（ただし、式中Ｒは上記一般式（Ｉ）又は（II）と同
じ）。

本発明において利用される微生物は、上述のごとく、
ノカルディオプシス属又はバチルス属に属する群から選
択されるニトリル加水分解能を有するものであって、下
記表１に示すものが例示し得る。

表１にみられるとおり、これらの微生物は、工業技術
院微生物研究所に受託されている。

次に、上掲の各微生物の菌学的性状及び化学的性状を
次に示す。尚、本ノカルディオプシス属菌株の同定は主
としてShirling,E.B.,とGottlieb,D.,によりInternatio
nal Journal of Systematic Bacteriology16,313−340,
1966に記載されている方法に従い行った。

ノカルディオプシス属 A 10−12株 1. 形態 A 10−12株は光学顕微鏡下で、よく分枝した網目状の
基中菌糸を伸長する。基中菌糸から伸長した気菌糸は真
直〜曲状（Rectiflexibiles）、或いは釣針状〜ループ
状（Retinaculiaperti）の形態を示し、しばしばZig−z
ag状に生育し、培養時間にともない桿菌様に分断する。
輸生枝、菌核、胞子のう等の特殊な器官は認められな
い。成熟した胞子は通常10個以上の胞子を連鎖し、その
大きさは0.5〜0.8×1.0〜2.0ミクロン位で、表面は平滑
である。胞子の運動性は観察されない。

2. 各種培地上での生育状態色調の記載は日本色彩研究所“色の標準"1951年、ま
た、〔〕内に記載した記号および色調はコンテイナー
・コーポレーション・オブ・アメリカ（Container Corp
oration of America）のカラー・ハーモニー・マニュア
ル（Color harmony manual）をそれぞれ用いた。

１）リンゴ酸石灰寒天培地（27℃培養）生育が遅く接種後２週間目で無色の発育を形成する。
３週間目にはうす黄〔2ca,Lt Ivory〕の発育上に白色の
気菌糸をうっすらと着生し、可溶性色素は認められな
い。

２）グルコース・硝酸塩寒天培地（27℃培養）うす黄茶〔2ec,Biscuit〕の発育上に茶臼〔3ca,Shel
l〕の気菌糸を着生し、可溶性色素は認められない。

３）グルコース・アスパラギン寒天培地（27℃培養）無色の発育上に僅かに白色の気菌糸を着生し、可溶性
色素は認められない。

４）スターチ・合成寒天培地（27℃培養）無色からうす黄〔2ca,Lt Ivory〕の発育上にうっすら
と白色の気菌糸を着生し、可溶性色素の生産は認められ
ない。

５）シュクロース・硝酸塩寒天培地（27℃培養）うす黄茶〔2ca〜2gc,Lt Ivory〜Bamboo〕の発育上に
茶灰〔2ba,Pearl〕の粉状の気菌糸を豊富に着生し、可
溶性色素は認められない。

６）イースト・麦芽寒天培地（27℃培養）うす黄茶〔2ic,Honey Gold〕の発育上に白色の気菌糸
を着生し、可溶性色素は観察されない。

７）オートミール寒天培地（ISP3）（27℃培養）うす黄〔2gc,Bamboo〕の発育上に白色の気菌糸を着生
し、可溶性色素は観察されない。

８）スターチ無機塩寒天培地（ISP4）（27℃培養）うす黄〔2ea〜2gc,Lt Wheat〜Bamboo〕の発育上に白
色からうす黄〔2ca,Lt Ivory〕の気菌糸を着生し、可溶
性色素は観察されない。

９）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP5）（27℃
培養）うす黄〔2gc,Bamboo〕の発育上に白色の気菌糸を着生
し、可溶性色素は観察されない。

10）チロシン寒天培地（ISP7）（27℃培養）うす黄〔2ea〜2gc,Lt Wheat〜Bamboo〕の発育上に白
から黄味灰〔2ec,Biscuit〕の気菌糸を着生し、可溶性
色素は認められない。

11）栄養寒天培地（27℃培養）うす黄〔2ca,Lt Ivory〕の発育上に白色の気菌糸を豊
富に着生し、可溶性色素の生産は認められない。

3. 生理学的性質１）生育温度範囲イーストエキストラクト・スターチ寒天培地を用いて
10℃、20℃、25℃、31℃、36℃、40℃、45℃、50℃の各
温度で培養した結果、A 10−12株は10℃から36℃までい
ずれの温度でも生育したが、40℃、45℃、50℃では発育
しなかった。生育最適温度は25℃から31℃付近と思われ
る。

２）ゼラチンの液化（15％単純ゼラチン20℃培養、グル
コース・ペプトン・ゼラチン27℃培養）いずれの培地においても液化は認められなかった。

３）スターチの加水分解性（スターチ無機塩寒天培地27
℃培養）培養後14日目頃からわずかに水解性が認められ、その
作用は弱いほうである。

４）脱脂牛乳の凝固およびペプトン化（脱脂牛乳37℃培養）培養後10日目頃から凝固が始まり、21日目頃に完了、
ペプトン化は14日目頃から始まり、21日目にほぼ完了し
た。その作用は弱いほうである。

５）リンゴ酸石灰の利用（リンゴ酸石灰寒天培地27℃培養）リンゴ酸石灰の溶解は認められない。

６）硝酸塩の還元反応（1.0％硝酸ソーダ含有ペプトン
水 ISP8 27℃培養）陽性である。

７）セルロースの分解（27℃培養）陰性である。

８）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・ブ
ロス ISP1、ペプトン・イースト・鉄寒天培地 ISP6、
チロシン寒天培地 ISP7 いずれも27℃培養）いずれの培地に於いても、メラニン様色素の生産は認
められない。

９）炭素源の資化性（プリードハム・ゴトリーブ寒天培
地 ISP9、27℃培養）Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フラクトー
ス、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンニトールおよびＬ−ラ
ムノースを資化してよく生育し、シュクロースも資化す
る。イノシトールはおそらく資化しないものと思われ、
ラフィノースは資化しない。

4. 細胞壁成分 Lechevalier,M.P.,Lechevalier,H.A.,Actinomycete T
axonomy Workshop,Soc.Ind.Microbiol.Aug.13 1978のテ
キストの方法に従い、全菌体の細胞壁タイプを調べたと
ころIII型を示した。また、全菌株の糖成分タイプはリ
ボースのみが検出されるＣ型を示し、ムラミン酸のアシ
ルタイプはアセチル型であった。

以上の性状を要約するとA 10−12株は寒天培地上で基
中菌糸は良く分枝して網目状に伸長する。培養初期にジ
グザグ状に生育する気菌糸が観察され、生育と共に菌糸
の分断が認められる。気菌糸は真直から曲状（Rectifle
xibiles）、或いは釣針状からループ状（Retinaculiape
rti）に生育する。胞子は0.5〜0.8×1.0〜2.0ミクロン
の大きさを示し、通常10個以上連鎖し、その表面は平滑
（Smooth）である。

各種寒天培地上で、胞子のう、車軸分枝、菌核などの
特殊な器官は認められない。A 10−12株は各種寒天培地
でうす黄茶の発育上に白色の気菌糸を着生し、可溶性色
素の生産は認められない。

A 10−12株の硝酸塩の還元性、ミルクの凝固、ミルク
のペプトン化、リンゴ酸石灰の利用性は陽性を示した
が、澱粉の水解、ゼラチンの液化、セルロースの分解、
メラニン様色素の生産（ISP1、ISP6、ISP7）は陰性であ
った。また、本菌株は7.5％以上〜10％以下の耐塩性を
示す、中性塩の放線菌である。

A 10−12株の全菌体を用いた細胞壁タイプはIII型、
糖成分タイプはＣ型、ムラミン酸のアシルタイプはアセ
チル型を示した。

これらの性状をBergey's manual of determinative b
acteriology（第８版）および“放線菌の同定実験法”
日本放線菌学会編1985年において検索したところ、A 10
−12株は細胞壁タイプがIII型、20個以上の胞子を連鎖
する点からActinomadura、Excellospora、Actinosynnem
a、Nocardiopusisの各属の何れかに属すると推察した。
しかし、Actinomadura、Excellospora属とはA 10−12株
が細胞壁中にmaduroseを含まない点で、また、Actinosy
nnema属は気菌糸に運動性細胞が形成される点でＡ株と
は異なる。

A 10−12株は（１）気菌糸を形成し、胞子が10個以上
連鎖、（２）気菌糸がZig−zag状に生育し、時間の経過
とともに分断する、（３）細胞壁タイプがIII型、
（４）細胞壁に含まれる糖がriboseのみであるタイプ
Ｃ、（５）うす黄茶の発育上に白から黄味灰の気菌糸、
等の特徴を持つ点から、J.Meyerが提唱したNocardiopus
is属（Nocardiopsis、a new genus of the order Actin
omycetes.Int.J.Syst.Bacteriol.,26（４）,487−493,1
976）に所属させるのが妥当と考える。

Nocardiopusis属にはN.alba,N.atra,N.coeruleofusc
a,N.flava,N.longispora,N.mutabilis、N.syringae,N.d
assonvillei,N.antarticus,N.trehalosei,N.africane,
N.streptosporusなどの“種”が知られているが、A 10
−12株は炭素源の資化性、および、菌体中の糖成分とし
てriboseのみが検出される点でおそらくN.dassonvillei
に近似する種であると考える。

以上A 10−12株は形態学的、生理学的、および細胞壁
の成分等の特徴からNocardiopusis属に属する放線菌で
あると判定する。

B 9−47株 1. 形態 B 9−47株は光学顕微鏡下で、よく分枝した網目状の
基中菌糸を伸長する。基中菌糸から伸長した気菌糸は真
直〜曲状（Rectiflexibiles）、或いは釣針状〜ループ
状（Retinaculiaperti）の形態を示し、しばしばZig−z
ag状に生育し、培養時間にともない桿菌様に分断する。
輸生枝、菌核、胞子のう等の特殊な器官は認められな
い。成熟した胞子は通常10個以上の胞子を連鎖し、その
大きさは0.5〜0.8×1.0〜2.0ミクロン位で、表面は平滑
である。胞子の運動性は観察されない。

１）リンゴ酸石灰寒天培地（27℃培養）無色の発育上に白色の気菌糸を着生し、可溶性色素は
認められない。

２）グルコース・硝酸塩寒天培地（27℃培養）うす黄茶〔2ec,Biscuit〕の発育上に白色の気菌糸を
着生し、可溶性色素は茶味を帯びる。

３）グルコース・アスパラギン寒天培地（27℃培養）殆ど生育は認められなかった。

４）スターチ・合成寒天培地（27℃培養）うす黄茶〔2gc,Bamboo〕の発育上に白色の気菌糸を着
生し、可溶性色素は黄味を帯びる。

５）シュクロース・硝酸塩寒天培地（27℃培養）無色の発育上に白色の気菌糸を着生し、可溶性色素は
認められない。

６）イースト・麦芽寒天培地（27℃培養）無色の発育上に白色の気菌糸を着生し、可溶性色素は
観察されない。

７）オートミール寒天培地（ISP3）（27℃培養）無色の発育上に白色の気菌糸を着生し、可溶性色素は
観察されない。

８）スターチ無機塩寒天培地（ISP4）（27℃培養）うす黄茶〔2ea,Lt Wheat〕の発育上にうす黄だいだい
〔3ca,Shell〕の気菌糸を着生し、可溶性色素は観察さ
れない。

10）チロシン寒天培地（ISP7）（27℃培養）うす黄〔3ec,Bisque〕の発育上に白色の気菌糸を着生
し、赤味をおびた可溶性色素を認める。

11）栄養寒天培地（27℃培養）うす黄〔3ec,Bisque〕の発育上に白色の気菌糸を豊富
に着生し、可溶性色素の生産は認められない。

3. 生理学的性質１）生育温度範囲イーストエキストラクト・スタータ寒天培地を用いて
10℃、20℃、25℃、31℃、36℃、40℃、45℃、50℃の各
温度で培養した結果、B 9−47株は10℃から36℃までい
ずれの温度でも生育したが、40℃、45℃、50℃では発育
しなかった。生育最適温度は25℃から31℃付近と思われ
る。

２）ゼラチンの液化（15％単純ゼラチン20℃培養、グル
コース・ペプトン・ゼラチン27℃培養）いずれの培地においても液化は認め、その作用は中程
度である。

３）スタータの加水分解性（スターチ無機塩寒天培地27
℃培養）培養後14日目頃からわずかに水解性が認められ、その
作用は弱いほうである。

７）セルロースの分解（27℃培養）陰性である。

９）炭素源の資化性（プリードハム・ゴトリーブ寒天培
地 ISP9、27℃培養）Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フラクトー
ス、Ｌ−アラビノース、およびＤ−マンニトールを資化
してよく生育し、イノシトール、シュクロース、Ｌ−ラ
ムノースおよびラフィノースは資化しない。

4. 細胞壁成分 Lechevalier,M.P.,Lechevalier,H.A.,Actinomycete T
axonomy Workshop,Soc.Ind.Microbiol.Aug.13 1978のテ
キストの方法に従い、全菌体の細胞壁タイプを調べたと
ころIII型を示した。また、全菌体の糖成分タイプはリ
ボースと若干のグルコースが検出されるＣ型を示し、ム
ラミン酸のアシルタイプはアセチル型であった。

以上の性状を要約するとB 9−47株は寒天培地上で基
中菌糸は良く分枝して網目状に伸長する。培養初期にジ
グザグ状に生育する気菌糸が観察され、生育と共に菌糸
の分断が認められる。気菌糸は真直から曲状（Rectifle
xibiles）、或いは釣針状からループ状（Retinaculiape
rti）に生育する。胞子は0.5〜0.8×1.0〜2.0ミクロン
の大きさを示し、通常20個以上連鎖し、その表面は平滑
（Smooth）である。

各種寒天培地上で、胞子のう、車軸分枝、菌核などの
特殊な器官は認められない。B 9−47株は各種寒天培地
でうす黄〜うす黄茶の発育上に、白色の気菌糸を着生
し、可溶性色素は赤味〜茶味が認められる。

B 9−47株の硝酸塩の還元性、ミルクの凝固、ミルク
のペプトン化、ゼラチンの液化は陽性を示したが、リン
ゴ酸石灰の利用性、澱粉の水解、セルロースの分解、メ
ラニン様色素の生産（ISP1、ISP6、ISP7）は陰性であっ
た。また、本菌株は7.5％以上〜10％以下の耐塩性を示
す、中性塩の放線菌である。

B 9−47株の全菌体を用いた細胞壁タイプはIII型、糖
成分タイプはＣ型でリボースおよび若干のグルコースを
含む。ムラミン酸のアシルタイプはアセチル型を示し
た。

これらの性状をBergey's manual of determinative b
acteriology（第８版）および“放線菌の同定実験法”
日本放線菌学会編1985年において検索したところ、B 9
−47株は細胞壁タイプがIII型、20個以上の胞子を連鎖
する点からActinomadura、Excellospora、Actinosynnem
a、Nocardiopusisの各属の何れかに属すると推察した。
しかし、Actinomadura、Excellospora属とはB 9−47株
が細胞壁中にmaduroseを含まない点で、また、Actinosy
nnema属は気菌糸に運動性細胞が形成される点でB 9−47
株とは異なる。

B 9−47株は（１）気菌糸がジクザグ状に生育し時間
の経過とともに分断する、（２）細胞壁タイプがIII
型、（３）細胞壁に含まれる糖がriboseのみである等の
特徴を持つ点から、J.Meyerが提唱したNocardiopusis属
（Nocardiopsis、a new genus of the order Actinomyc
etes.Int.J.Syst.Bacteriol.,26（４）,487−493,197
6）に所属させるのが妥当と考える。

Nocardiopusis属にはN.alba,N.atra,N.coeruleofusc
a,N.flava,N.longispora,N.mutabilis、N.syringae,N.d
assonvillei,N.antarticus,N.trehalosei,N.africane,
N.streptosporusなどの“種”が知られているが、B 9−
47株は炭素源の資化性、および、菌体中の糖成分として
リボースおよび若干のグルコースが検出される点でおそ
らくN.dassonvillei,N.antarticus,N.trehalosei,のい
ずれかに近似する種であると考える。

以上B 9−47株は形態学的、生理学的、および細胞壁
の成分等の特徴からNocardiopusis属に属する放線菌で
あると判定する。

次にバチルス属の菌株の菌学的性状及び化学的性状を
示す。

本発明において、上記各微生物を利用して光学活性ア
ミノ酸を生産するのに用いる基質であるDL−α−アミノ
ニトリル化合物（以下原料ニトリルと略記する）は、例
えば〔「オルガニツクシンセシスコレクテイブボ
リウム（Org.Syn.Col.Vol.）I,p.21、及びIII,P.84」〕
並びに〔Y.Fukuda et al.,「ジヤーナルオブフアー
メンテーシヨンテクノロジイ」（J.Ferment.Techno
l.,）49、1011（1971）〕等に記載された方法に従つて
容易に合成し得る。

本発明の基質として用いるα−アミノニトリル化合物
の、一般式（Ｉ）、（II）におけるＲには特に制限がな
いが、置換アルキル基等のそれぞれに含まれる置換基は
例えばヒドロキシ、メトキシ、メルカプト、メチルメル
カプト、アミノ、ハロゲン、カルボキシル、カルボクサ
ミド、フェニル、ヒドロキシフェニルあるいはグアニル
などである。

α−アミノニトリル化合物としては、２−アミノプロ
パンニトリル、２−アミノブタンニトリル、２−アミノ
−３−メチルブタンニトリル、２−アミノ−４−メチル
ペンタンニトリル、２−アミノ−３−メチルペンタンニ
トリル、２−アミノ−３−ヒドロキシプロパンニトリ
ル、２−アミノ−３−ヒドロキシブタンニトリル、２−
アミノ−５−グアニジノペンタンニトリル、２−アミノ
−３−メチルカプトプロパンニトリル、2,7−ジアミノ
−4,5−ジチアオクタンジニトリル、２−アミノ−４−
メチルチオブタンニトリル、２−アミノ−３−フェニル
プロパンニトリル、３−（４−ヒドロキシフエニル）プ
ロパンニトリル、３−アミノ−３−シアノプロパン酸、
４−アミノ−４−シアノブタン酸、３−アミノ−３−シ
アノプロパンアミド、４−アミノ−４−シアノブタンア
ミド、2,6−ジアミノヘキサンニトリル、2,6−ジアミノ
−５−ヒドロキシヘキサンニトリル、２−アミノ−３−
（３−インドリル）プロパンニトリル、２−アミノ−３
−（４−イミダゾイル）プロパンニトリル、２−シアノ
ピロリジン、２−シアノ−４−ヒドロキシピロリジン、
２−アミノ−２−フエニルエタンニトリル等を例示し得
る。

また、上記各原料ニトリルは、２種以上を混合して用
いても何ら支障がないことは云うまでもない。

なお、本発明で原料基質として用いる前記一般式（II
I）および（IV）で表わされるα−（Ｎ−アルキリデン
アミノ）ニトリル化合物は、例えばストレッカー法の第
１段目の反応であるα−アミノニトリル化合物の合成
〔例えば、ジャーナルオブファーメンテーション
テクノロジイ（J.Ferment.Technol.），49,1011（197
1）あるいはケミストリーレターズ（Chem.Lett.）,687
（1987）〕において、原料アルデヒドの消失がガスクロ
マトグラフィー等による分析において確認されたなら
ば、ただちに濾過あるいは抽出等の操作で無機塩を分離
し、濃縮することにより得ることができる。

このようにして得られる粗生成物は、前記一般式（II
I）および（IV）で表わされるα−（Ｎ−アルキリデン
アミノ）ニトリル化合物の部分加水分解物であるα−ア
ミノニトリルと、その合成原料であるアルデヒドを不純
物として含むことがあり、これらを分留等の操作で除去
した後、基質として用いる。しかし、上記粗生成物をそ
のまま基質として用いることも可能である。なお、α−
（Ｎ−アルキリデンアミノ）ニトリル化合物としては前
掲の各ニトリル化合物と、これらのα−アミノニトリル
の合成原料であるアルデヒドとのシッフベース体を例示
し得る。

本発明においては、上述したニトリル化合物（以下原
料ニトリルという）に、ノカルディオプシス属又はバチ
ルス属に属するニトリルの加水分解能を有する微生物、
例えばノカルディオプシスsp.A10−12、ノカルディオプ
シスsp.B 9−47、バチルスsp.B9−40又はバチルスsp.A9
−１を作用させて光学活性アミノ酸を生産するには、下
記（ａ）乃至（ｃ）として例示したいずれかの方法を適
用するとよい。

すなわち、（ａ）微生物を、ニトリル化合物、例えば
プロピオニトリルを含む培地中で培養して増殖して得ら
れた菌体を、対応するアルデヒドの存在下に原料ニトリ
ルを接触させて反応させる方法、（ｂ）微生物を予め培
養し、増殖して得られた菌体をニトリル化合物、例えば
プロピオニトリルに接触させた後、該菌体に原料ニトリ
ルおよび対応するアルデヒドを加えて反応させる方法、
及び（ｃ）微生物を予め培養し、増殖して得られた菌体
に原料ニトリルおよびアルデヒドを直接接触させて反応
させる方法を適用する。これらの反応方法では、微生物
として増殖後の菌体の破砕物、乾燥菌体、あるいは分離
精製されたニトリルの加水分解酵素などの菌体処理物、
あるいは常法に従つて固定化した菌体および菌体処理物
を用いることもできる。

上記（ａ）及び（ｂ）の方法で用いるニトリル化合物
としては、プロピオニトリルのほかに、アセトニトリ
ル、ｎ−ブチロニトリル、ｎ−カプロニトリル、メタク
リロニトリル、イソブチルニトリル、グルタロニトリ
ル、トリアクリロニトリル、クロトノニトリル、ラクト
ニトリル、サクシノニトリル、アクリロニトリル、ベン
ゾニトリル及びフェニルアセトニトリル等を例示し得
る。

上記（ａ）の方法では、ニトリル化合物のほかに、炭
素源としてグルコース、シュクロース、糖蜜、澱粉加水
分解物のような糖質、もしくは酢酸等のごとき菌体増殖
作用を有する物質を培地に添加し、更に、塩化アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸ア
ンモニウム、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、ア
ミノ酸及びその他の資化性有機窒素化合物のような窒素
源、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシ
ウム、硫酸マンガン、硫酸第１鉄、塩化第２鉄、塩化カ
ルシウム、塩化マンガンのごとき無機塩類、及びホウ
素、銅、亜鉛などの塩、すなわち、いわゆる微量元素、
更には必要に応じてビタミン類、酵母エキス、コーンス
テープリカーの如き成長促進物質を添加した培地に、上
記各微生物の種菌を接種し、好気的条件下で培養して菌
体を増殖させる。このようにして得られた菌体培養物、
又は該培養物から分離した菌体の懸濁液あるいは菌体処
理物に、原料ニトリルおよびアルデヒドを供給して反応
させる。

反応は、pH5〜12、好ましくはpH8〜12の範囲で１〜６
日間行う。反応には種々の緩衝液を用い得るが、アンモ
ニア系の緩衝液がよく、アンモニア水と塩化アンモニウ
ム水溶液の混合物、アンモニア水と硫酸アンモニウム水
溶液との混合物、アンモニア水と酢酸アンモニウム水溶
液との混合物、アンモニア水と燐酸アンモニウム水溶液
との混合物等が好ましい。また、pH調節用のアルカリと
してアンモニア水を用いることが好ましい。

なお、原料ニトリルの加水分解をアルデヒドの存在下
で行う場合には、原料ニトリルに対するアルデヒドの添
加割合は原料ニトリル１モルに対し、アルデヒド0.1モ
ル〜10モルを適用し得るが、0.5モル〜３モルを用いる
ことが好ましい。反応温度は20〜70℃の範囲が好まし
く、また、反応中に菌体増殖に用いた上記炭素源、窒素
源、その他の成分を適宜添加して菌体濃度や菌体のニト
リル加水分解能を維持し、かつ高めることができる。ま
た、原料ニトリルおよびアルデヒドの供給方法として
は、反応の開始時に添加する方法、間けつ的に添加する
方法、連続的に添加する方法のいずれも用い得る。

上記反応により生成した光学活性アミノ酸は、相分
離、濾過、抽出、カラムクロマトグラフイー等の公知の
手段を適用して分離、採取する。

次に、前記（ｂ）の方法では、上記（ａ）の方法にお
ける菌体の培養増殖時にニトリル化合物を加えずに、菌
体の増殖後にニトリル化合物を加えて該菌体微生物のニ
トリル加水分解能を活性化した後、原料ニトリルにおよ
びアルデヒドを加えて反応させて光学活性アミノ酸を生
産させる。

また、前記（ｃ）の方法は、上記（ｂ）の方法におけ
る菌体の増殖後に直ちに原料ニトリルおよびアルデヒド
を加えて反応させて光学活性アミノ酸を生産させるもの
である。

なお、上記（ｂ）及び（ｃ）のいずれの方法において
も、培養条件、反応条件及び生成した光学活性アミノ酸
の分離、採取には、前記（ａ）の方法におけるものを適
用し得る。

上述のごとくして本発明に従つて得られる光学活性ア
ミノ酸は、食品、飼料、医薬及び化粧品等の種々の分野
において利用される。

以下実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例１培地の調製ブイヨン〔Nutrient Broth（OXOID）〕25gとグルコー
ス10gをイオン交換水900mlに加えて撹拌し、これをＡ液
とする。Ａ液を坂口フラスコに90mlずつ加え、120℃で2
0分間オートクレーブで殺菌する。NaCO₃・12H₂O27gをイ
オン交換水100mlに加え、120℃で20分間オートクレーブ
で殺菌し、これをＢ液とする。クリーンベンチ中で坂口
フラスコにＢ液を10mlずつ加え、これを培地とする。

菌体の培養増殖上記培地に下記の２種の菌株の３白金耳をそれぞれ摂
取し、30℃の温度に、140rpmで48時間振とう培養を行っ
た。

使用菌株：菌株名 FERM−BP No. ノカルディオプシスA 10−12 2422 （Nocardiopsis sp.）ノカルディオプシスB 9−47 2423 （Nocardiopsis sp.）上記培養により得られた菌糸を遠心分離で分離し、NH
₄Cl−NH₃の0.1M緩衝液（pH10）で２回洗浄後、光学的濃
度（OD）が10にとなるようにNH₄Cl−NH₃の0.1M緩衝液に
再懸濁した。

反応上述のようにして得られる各菌体懸濁液5mlを、φ24m
mの試験管に収容し、これにDL−２−アミノ−３−メチ
ルブタンニトリル50μを加えて密栓し、30℃の温度
に、300rpmで48時間振とう培養を行った。

反応終了後、反応液をエーテル5mlを用いて２回抽出
し、得られた水相を高速液体クロマトグラフイーで分析
した。

生成したＬ−バリンの定量はカラム充填剤としてAsah
ipakイナートシルODS（旭化成社製）を用いて行い、そ
の絶対配置と光学純度の決定には同じくCHIRALPAK WH
（ダイセル化学工業社製）を用いて行った。結果は表２
に示すとおりである。

実施例２実施例１に記載した方法で調製した懸濁液5mlをφ24m
mの試験管に収容し、これにDL−２−アミノ−４−メチ
ルペンタンニトリル50μを加えて密栓し、30℃の温度
に、300rpmで48時間振とう培養を行った。

反応終了後、反応液をエーテル5mlを用いて２回抽出
し、得られた水相を高速液体クロマトグラフィーで分析
した。

生成したＬ−ロイシンの定量はカラム充填剤としてAs
ahipakイナートシルODS（旭化成社製）を用いて行い、
その絶対配置と光学純度の決定には同じくCHIRALPAK WE
（ダイセル化学工業社製）を用いて行った。結果は表３
に示すとおりである。

実施例３実施例１に記載した方法で調製した菌懸濁液5mlをφ2
4mmの試験管に収容し、これにDL−２−アミノ−メチル
ペンタンニトリル50μを加えて密栓し、30℃の温度
に、300rpmで48時間振とう培養を行った。

生成したＬ−ノルバリンの定量はカラム充填剤として
AsahipakイナートシルODS（旭化成社製）を用いて行
い、その絶対配置と光学純度の決定には同じくCHIRALPA
K WE（ダイセル化学工業社製）を用いて行った。結果は
表４に示すとおりである。

実施例４実施例１に記載した方法で調製した菌懸濁液5mlをφ2
4mmの試験管に収容し、これにDL−２−アミノ−４−ヘ
キサンニトリル50μを加えて密栓し、30℃の温度に、
300rpmで48時間振とう培養を行った。

生成したＬ−ノルロイシンの定量はカラム充填剤とし
てAsahipakイナートシルODS（旭化成社製）を用いて行
い、その絶対配置と光学純度の決定には同じくCHIRALPA
K WE（ダイセル化学工業社製）を用いて行った。結果は
表５に示すとおりである。

実施例５実施例１に記載した方法で調製した菌懸濁液5mlをφ2
4mmの試験管に収容し、これにDL−２−アミノ−３−メ
チルブタンニトリル50μおよびイソブチルアルデヒド
60μを加えて密栓し、30℃の温度に、300rpmで48時間
振とう培養を行った。

生成したＬ−バリンの定量はカラム充填剤としてAsah
ipakイナートシルODS（旭化成社製）を用いて行い、そ
の絶対配置と光学純度の決定には同じくCHIRALPAK WH
（ダイセル化学工業社製）を用いて行った。結果は表６
に示すとおりである。

実施例６実施例１に記載した方法で調製した菌懸濁液5mlをφ2
4mmの試験管に収容し、これにDL−２−アミノ−４−メ
チルペンタンニトリル50μおよびイソバレルアルデヒ
ド60μを加えて密栓し、30℃の温度に、300rpmで48時
間振とう培養を行った。

生成したＬ−ロイシンの定量はカラム充填剤としてAs
ahipakイナートシルODS（旭化成社製）を用いて行い、
その絶対配置と光学純度の決定には同じくCHIRALPAK WE
（ダイセル化学工業社製）を用いて行った。結果は表７
に示すとおりである。

実施例７実施例１に記載した方法で調製した菌懸濁液5mlをφ2
4mmの試験管に収容し、これにDL−２−アミノペンタン
ニトリル50μおよびｎ−ブチルアルデヒド60μを加
える以外は実施例１に記載した方法で反応を行った。

生成したＬ−ノルバリンの定量はカラム充填剤として
AsahipakイナートシルODS（旭化成社製）を用いて行
い、その絶対配置と光学純度の決定には同じくCHIRALPA
K WE（ダイセル化学工業社製）を用いて行った。結果は
表８に示す。

実施例８実施例１に記載した方法で調製した菌懸濁液5mlをφ2
4mmの試験管に収容し、これにDL−２−アミノヘキサン
ニトリル50μおよびバレルアルデヒド60μを加える
以外は実施例１に記載した方法で反応を行った。

生成したＬ−ノルロイシンの定量はカラム充填剤とし
てAsahipakイナートシルODS（旭化成社製）を用いて行
い、その絶対配置と光学純度の決定には同じくCHIRALPA
K WE（ダイセル化学工業社製）を用いて行った。結果は
表９に示す。

実施例９実施例１に記載した方法で調製した菌懸濁液5mlをφ2
4mmの試験管に収容し、これにDL−３−メチル−２−
（Ｎ−２−メチルプロピリデン）アミノペンタンニトリ
ル50μを加えて密栓し、30℃の温度に、300rpmで48時
間振とう培養を行った。

生成したＬ−バリンの定量はカラム充填剤としてAsah
ipakイナートシルODS（旭化成社製）を用いて行い、そ
の絶対配置と光学純度の決定には同じくCHIRALPAK WH
（ダイセル化学工業社製）を用いて行った。結果は表10
に示すとおりである。

実施例10 実施例１に記載した方法で調製した菌懸濁液5mlに、
４−メチル−２−（Ｎ−３−メチルブチリデンアミノ）
ペンタンニトリル50μを加える以外は実施例９に記載
した方法で反応を行った。

生成したＬ−ロイシンの定量はカラム充填剤としてAs
ahipakイナートシルODS（旭化成社製）を用いて行い、
その絶対配置と光学純度の決定には同じくCHIRALPAK WE
（ダイセル化学工業社製）を用いて行った。結果は表11
に示すとおりである。

実施例11 実施例１に記載した方法で調製した菌懸濁液5mlに、
２−（Ｎ−ブチリデンアミノ）ペンタンニトリル50μ
を加える以外は実施例１に記載した方法で反応を行っ
た。

生成したＬ−ノルバリンの定量はカラム充填剤として
AsahipakイナートシルODS（旭化成社製）を用いて行
い、その絶対配置と光学純度の決定には同じくCHIRALPA
K WE（ダイセル化学工業社製）を用いて行った。その結
果は表12に示す。

実施例12 実施例１に記載した方法で調製した菌懸濁液5mlに、
２−（Ｎ−ペンチリデンアミノ）ペンタンニトリル50μ
を加える以外は実施例１に記載した方法で反応を行っ
た。

なお、Ｌ−ノルロイシンの定量はカラム充填剤として
AsahipakイナートシルODS（旭化成社製）を用いて行
い、その絶対配置と光学純度の決定には同じくCHIRALPA
K WE（ダイセル化学工業社製）を用いて行った。その結
果は表13に示す。

実施例13 培地の調製ブイヨン〔Nutrient Broth（OXOID）〕25gとグルコー
ス10gをイオン交換水900mlに加えて攪拌し、これをＡ液
とする。Ａ液を坂口フラスコに90mlずつ加え、120℃で2
0分間オートクレーブで殺菌するる。Na₂CO₃・12H₂O27g
をイオン交換水100mlに加え、120℃で20分間オートクレ
ーブで殺菌し、これをＢ液とする。クリーンベンチ中で
坂口フラスコにＢ液を10mlずつ加え、これを培地とす
る。

培地の培養増殖上記培地に下記の２種の菌株の３白金耳をそれぞれ採
取し、30℃の温度に、140rpmで48時間振とう培養を行っ
た。

使用菌株：菌株名 FERM−P No. バチルス B9−40（Bacillus sp.）Ｐ−11478 バチルス A9−１（Bacillus sp.）Ｐ−11477 上記培養により得られた菌糸を遠心分離で分離し、NH
₄Cl−NH₃の0.1M緩衝液（pH10）で２回洗浄後、光学的濃
度（OD）が10となるように、NH₄Cl−NH₃の0.1M緩衝液に
再懸濁した。

反応上述のようにして得られる各菌体懸濁液5mlを、φ24m
mの試験管に収容し、これにDL−２−アミノ−４−メチ
ルペンタンニトリル50μを加えて密栓し、30℃の加温
に、300rpmで48時間振とう培養を行った。

生成したＬ−ロイシンの定量はカラム充填剤としてAs
ahipakイナートシルODS（旭化成社製）を用いて行い、
その絶対配置と光学純度の決定には同じくCHIRALPAK WE
（ダイセル化学工業社製）を用いて行った。結果は表14
に示すとおりである。

実施例14 実施例13に記載した方法で調製した懸濁液5mlをφ24m
mの試験管に収容し、これにDL−２−アミノ−メチルペ
ンタンニトリル50μを加えて密栓し、30℃の温度に、
300rpmで48時間振とう培養を行った。

生成したＬ−ノルバリンの定量はカラム充填剤として
AsahipakイナートシルODS（旭化成社製）を用いて行
い、その絶対配置と光学純度の決定には同じくCHIRALPA
K WE（ダイセル化学工業社製）を用いて行った。結果は
表15に示すとおりである。

実施例15 実施例13に記載した方法で調製した菌体懸濁液5mlを
φ24mmの試験管に収容し、これにDL−２−アミノ−４−
ヘキサンニトリル50μを加えて密栓し、30℃の温度
に、300rpmで48時間振とう培養を行った。

生成したＬ−ノルロイシンの定量はカラム充填剤とし
てAsahipakイナートシルODS（旭化成社製）を用いて行
い、その絶対配置と光学純度の決定には同じくCHIRALPA
K WE（ダイセル化学工業社製）を用いて行った。結果は
表16に示すとおりである。

実施例16 実施例13に記載した方法で調製した菌懸濁液5mlをφ2
4mmの試験管に収容し、これにDL−２−アミノ−４−メ
チルペンタンニトリル50μおよびイソバレルアルデヒ
ド60μを加えて密栓し、30℃の温度に、300rpmで48時
間振とう培養を行った。

生成したＬ−ロイシンの定量はカラム充填剤としてAs
ahipakイナートシルODS（旭化成社製）を用いて行い、
その絶対配置と光学純度の決定には同じくCHIRALPAK WE
（ダイセル化学工業社製）を用いて行った。結果は表17
に示すとおりである。

実施例17 実施例13に記載した方法で調製した菌体懸濁液5mlを
φ24mmの試験管に収容し、これにDL−２−アミノペンタ
ンニトリル50μおよびｎ−ブチルアルデヒド60μを
加える以外は実施例13に記載した方法で反応を行った。

生成したＬ−ノルバリンの定量はカラム充填剤として
AsahipakイナートシルODS（旭化成社製）を用いて行
い、その絶対配置と光学純度の決定には同じくCHIRALPA
K WE（ダイセル化学工業社製）を用いて行った。結果は
表18に示す。

実施例18 実施例13に記載した方法で調製した菌体懸濁液5mlを
φ24mmの試験管に収容し、これにDL−２−アミノヘキサ
ンニトリル50μおよびバレルアルデヒド60μを加え
る以外は実施例13に記載した方法で反応を行った。

生成したＬ−ノルロイシンの定量はカラム充填剤とし
てAsahipakイナートシルODS（旭化成社製）を用いて行
い、その絶対配置と光学純度の決定には同じくCHIRALPA
K WE（ダイセル化学工業社製）を用いて行った。結果は
表19に示す。

実施例19 実施例13に記載した方法で調製した菌懸濁液5mlをφ2
4mmの試験管に収容し、これに４−メチル−２−（Ｎ−
３−メチルブチリデンアミノ）ペンタンニトリル50μ
を加える以外は実施例13に記載した方法で反応を行っ
た。

生成したＬ−ロイシンの定量はカラム充填剤としてAs
ahipakイナートシルODS（旭化成社製）を用いて行い、
その絶対配置と光学純度の決定には同じくCHIRALPAK WE
（ダイセル化学工業社製）を用いて行った。結果は表20
に示すとおりである。

実施例20 実施例13に記載した方法で調製した菌懸濁液5mlに、
２−（Ｎ−３−ブチリデンアミノ）ペンタンニトリル50
μを加える以外は実施例13に記載した方法で反応を行
った。

生成したＬ−ノルバリンの定量はカラム充填剤として
AsahipakイナートシルODS（旭化成社製）を用いて行
い、その絶対配置と光学純度の決定には同じくCHIRALPA
K WE（ダイセル化学工業社製）を用いて行った。その結
果を表21に示す。

実施例21 実施例13に記載した方法で調製した菌体懸濁液5ml
に、２−（Ｎ−ペンチリデンアミノ）ペンタンニトリル
50μを加える以外は実施例13に記載した方法で反応を
行った。

なお、Ｌ−ロイシンの定量はカラム充填剤としてAsah
ipakイナートシルODS（旭化成社製）を用いて行い、そ
の絶対配置と光学純度の決定には同じくCHIRALPAK WE
（ダイセル化学工業社製）を用いて行った。その結果を
表22に示す。

発明の効果以上述べたとおり、本発明によると、微生物を利用し
てDL−α−アミノニトリル化合物から直接光学活性アミ
ノ酸類を選択的に製造しうるので、上記種々の分野にお
いて利用される光学活性アミノ酸類の製造上有益であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者古橋敬三埼玉県戸田市新曽南３丁目17番35号日本鉱業株式会社内 (56)参考文献特開平４−166091（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 13/06

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記に示す一般式（Ｉ）乃至（IV）で表わ
される１種又は２種以上のニトリル化合物に、ノカルデ
ィオプシス属又はバチルス属に属するニトリル加水分解
能を有する微生物を作用させて光学活性アミノ酸類を産
生することを特徴とする光学活性アミノ酸類の製造方
法、（ただし、式（Ｉ）および（II）中Ｒはアルキル基、置
換アルキル基、フェニル基、置換フェニル基、イミダゾ
リル基、置換イミダゾリル基、インドリル基、置換イン
ドリル基、フリル基、置換フリル基、ピリジル基、置換
ピリジル基、チアゾリル基、置換チアゾリル基を示す）（ただし、式（III）および（IV）中R₁及びR₂はアルキ
ル基、置換アルキル基、フェニル基、置換フェニル基、
イミダゾリル基、置換イミダゾリル基、インドリル基、
置換インドリル基、フリル基、置換フリル基、ピリジル
基、置換ピリジル基、チアゾリル基、置換チアゾリル基
を示し、R₁及びR₂はそれぞれ同じ基でも、異なる基でも
よい）。
【請求項２】下記一般式（Ｉ）又は（II）（ただし、式（Ｉ）および（II）中Ｒはアルキル基、置
換アルキル基、フェニル基、置換フェニル基、イミダゾ
リル基、置換イミダゾリル基、インドリル基、置換イン
ドリル基、フリル基、置換フリル基、ピリジル基、置換
ピリジル基、チアゾリル基、置換チアゾリル基を示す）
で表わされる１種又は２種以上のα−アミノニトリル化
合物に下記一般式（Ｖ）Ｒ−CHO （Ｖ）または、下記一般式（VI）Ｒ−CH₂CHO （VI）（ただし、式中Ｒは上記一般式（Ｉ）又は（II）と同
じ）で表わされる対応するアルデヒドの存在下に、ノカ
ルディオプシス属又はバチルス属に属するニトリル加水
分解能を有する微生物を作用させて光学活性アミノ酸類
を産生することを特徴とする光学活性アミノ酸類の製造
方法。