JPS6247520B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は含燐アミノ酸の光学分割法に関するも
のである。 更に詳しくは、下記の一般式： （式中、Ｒは非置換又はハロゲン置換アシル基を
表わす）で表わされるＮ―アシル―Ｄ，Ｌ―２―
アミノ―４―メチルフオスフイノ酪酸にシユード
モナス属に属する細菌、ストレプトミセス属に属
する放線菌及びアスペルギルス属に属する糸状菌
から選ばれた前記化合物中のアシル基分解能を有
する微生物の培養菌体又はその処理物を水性媒体
下に作用させ、Ｌ―２―アミノ―４―メチルフオ
スフイノ酪酸とＮ―アシル―Ｄ―２―アミノ―４
―メチルフオスフイノ酪酸との混合物に変換して
光学分割を行ない、Ｌ―２―アミノ―４―メチル
フオスフイノ酪酸とＮ―アシル―Ｄ―２―アミノ
―４―メチルフオスフイノ酪酸を分別採取するこ
とを特徴とする含燐アミノ酸の光学分割法に関す
る。 Ｄ，Ｌ―２―アミノ―４―メチルフオスフイノ
酪酸（以下、Ｄ，Ｌ―MPGAと略称する）又はそ
の金属及び有機塩基との塩は農園芸用殺菌剤とし
有用である（特開昭49―14644号、特開昭49―
14641号及び特開昭49―26430号公報）のみなら
ず、除草剤、特に多年生雑草及び雑かん木防除用
除草剤として優れた効力を発揮する有用な化合物
である（特開昭52―139727号公報）。 しかしながら、本物質のその後の除草作用の研
究において、Ｌ―MPGAの除草効力はラセミ体、
即ちＤ，Ｌ―MPGAのそれよりも約２倍強いこと
が明らかになり、主たる除草作用の本質はＬ―
MPGAに起因するものでＤ―MPGAに起因するも
のでないことが認められた。 Ｌ―MPGAの製造に当つては抗菌剤として見出
されたSF―1293物質、即ちＬ―MPGA―アラニ
ル―アラニン（特開昭48―22688号公報、
Helvetica Chimica Acta、Vol、55、Fase1、第
224〜239頁、1972年）を酸分解する（特開昭48―
85538号公報）か、あるいは微生物酵素で分解し
て得る方法（特開昭49―31890号公報）が知られ
ている。一方化学的合成法（特開昭48―91019号
及び特開昭52―139727号公報）でもMPGAが得ら
れるが、この場合はラセミ体、即ち光学異性体で
あるＤ―体とＬ―体の混合物として得られる。 本発明者等は化学合成法で得られたＤ，Ｌ―
MPGAの光学分割法について鋭意研究を重ねた結
果、化学的に合成されるＮ―アシル―Ｄ，Ｌ―
MPGAの微生物酵素、アシラーゼによる光学分割
法を発見して本発明を完成させ、こゝにその方法
を提供せんとするものである。 以下にその概要を述べる。 化学的合成法で得られるＮ―アシル―MPGAの
ラセミ体、即ちＮ―アシル―Ｄ―MPGAとＮ―ア
シル―Ｌ―MPGAの混合物に対し、そのＤ―体に
は作用せず、そのＬ―体アシル基のみを特異的に
酵素水解し得る微生物アシラーゼを広く自然界に
求め探索した結果、シユードモナス属に属する細
菌、ストレプトミセス属に属する放線菌及びアス
ペルギルス属に属する糸状菌が目的アシラーゼを
生産することを見出した。この微生物アシラーゼ
をＮ―アシルーMPGAのラセミ体に作用させ、Ｌ
―MPGAとＮ―アシルーＤ―MPGAとの混合物に
導き、それぞれを分別採取することができる。 本酵素の基質となるＮ―アシルーＤ，Ｌ―
MPGAのアシル基は本微生物酵素で分解されてＬ
―MPGAを生成し得るアシル基であればどんな基
であつてもよいが、通常工業的に用いられるアシ
ル基はアルカノイル基及びアロイル基で、その中
でも、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチ
リル及びペンタノイルのような炭素数１〜５個の
アルカノイル基及びベンゾイル基等が有利であ
り、またこれらの基の水素原子がハロゲン原子と
置換されていることは本酵素反応を妨げないかぎ
り何等制限されない。 本発明において、この目的に叶うアシラーゼ生
産能を有する細菌の例としては、本発明者らが愛
知県知多半島の土壌より分離したシユードモナ
ス・マルトフイリアBN―233があり、放線菌の例
としては滋賀県の土壌より新たに分離したストレ
プトミセス・ビオラスセンスSF―2072及びスト
レプトミセス・デイアスタトクロモゲネスSF―
2073があり、又糸状菌の例としては横浜市の土壌
より分離したアスペルギルス・エスピ―KS―101
及びアスペルギルス・エスピ―KS―102がある。 これら菌株の菌学的性状を示せば、以下の通り
である。 シユードモナス・マルトフイリアBN―233の菌学
的性状 (a) 形態的性質 肉汁寒天上で培養した細胞は、0.5〜0.7×1.0
〜2.0ミクロンの桿菌であり、極毛性のベン毛
で運動する。胞子は作らず多形性も示さない。
グラム染色性は陰性である。 (b) 培養的性質 (1) 肉汁寒天培養：菌体は黄茶色を呈して増殖
する。拡散性色素の生産、シワ様増殖、粘稠
性、遊走性は認められない。 (2) 肉汁培養：培地全体が濁り、菌膜形成は認
められない。 (3) 肉汁ゼラチン穿刺培養：液化される。 (4) ミルク培養：アルカリ性を呈しながら液化
される。 (c) 生理的性質 (1) 硝酸塩の還元 ：陰性 (2) 脱窒反応 ：陰性 (3) MRテスト ：陰性 (4) VPテスト ：陰性 (5) インドール生成：陰性 (6) 硫化水素の生成：鉛糖紙を黒変するが、
TSI培地は黒変しない。 (7) デンプンの加水分解：陰性 (8) クエン酸の利用：陽性 (9) アンモニウム塩を唯一のＮ源として利用す
るが、硝酸塩は唯一のＮ源にはならない。 (10) キングＡ、Ｂ培地で顕著な水溶性色素の生
成は認められない。 (11) 栄養要求性：メチオニンだけを要求する。 (12) ポリベーターハイドロキシブチレートの菌
体内蓄積：陰性 (13) オキシダーゼ：陰性 (14) 15〜37℃で生育するが、５℃、42℃では
生育しない。 (15) 嫌気条件下で生育できない。 (16) O.Fテスト：Ｏ型 (17) 炭素源の利用性 (i) 次の炭素化合物を唯一の炭素源として生
育できる。グルコース、マルトース、セロ
ビオース、ラクトース。 (ii) 次の炭素化合物を唯一の炭素源として生
育できない。グリセリン、グルタール酸 以上の菌学的性質を有するBN―233株をバージ
ーズ・マニユアル・オブ・デターミネイテイブ・
バクテリオロジー８版（Bergey′s manual of
Determinative Bacteriology、8th Fdition
1974）に従つて同定し、次の結論に至つた。 (i) グラム陰性桿菌で胞子を作らず、極毛に
よつて運動するという形態的性質を有し、
絶対好気性であることから、この菌株はシ
ユードモナス（Pseudomonas）属に所属
すると判定した。 (ii) メチオニンを要求し、オキシダーゼ陰
性、ゼラチン液化陽性及び糖の利用スペク
トルから、この菌株はシユードモナス属の
中でもシユードモナスマルトフイリア
（Pseudomonas maltophilia）の種に所属
するものと判定した。 以上の理由から、この菌株をシユードモナスマ
ルトフイリアBN―233（Pseudomonas
maltophilia BN―233）と命名した。なお本菌株
は、工業技術院微生物工業技術研究所に微生物受
託番号微工研菌寄第4487号として寄託されてい
る。 ストレプトミセス・ビオラスセンスSF―2072の
菌学的性状 (a) 形態的性質 気菌糸着生は一般に貧弱であるが、スターチ
寒天では良好に着生し、胞子形成も豊富であ
る。分枝は単純分枝で車軸分枝は見られない。
気菌枝の先端はらせん状（主にコンパクトなら
せん糸）である。菌核は観察されない。 電子顕微鏡での観察による胞子の表面構造は
有刺型である。胞子は主に円筒型で、大きさは
0.6〜0.7×1.1〜1.3ミクロンで通常10胞子以上
連鎖する。 (b) 各種培地上の生育状態 色の記載について〔 〕内に示す標準はコン
テイナー・コーポレーシヨン・オブ・アメリカ
社製のカラー・ハーモニイー・マニユアルを用
いた。 培養は28℃で行ない、観察は14〜21日培養後
に行なつた。

【表】

【表】 (c) 生理的性質 (1) 生育温度範囲：スターチ寒天において15〜
38℃の温度範囲で生育し、25〜30℃で良好に
生育する。 (2) ゼラチンの液化：20℃にて21日培養で液化
する。 (3) スターチの加水分解：陽性（28℃） (4) 脱脂乳の凝固：陰性（28℃） 脱脂乳のペプトン化：陰性（28℃） (5) メラニン様色素の生成：陽性 (d) 炭素源の利用性（プリードハム・ゴツトリー
ブ寒天培地、28℃） (1) 利用する：Ｄ―グルコース、Ｄ―フラクト
ース、Ｄ―キシロース、Ｉ―イノシトール、
Ｌ―アラビノース、シユクロース、ラフイノ
ース (2) 利用しない：Ｄ―マンニトール、ラムノー
ス 以上の性状を要約するとSF―2072株はストレ
プトミセス属に属し、気菌糸先端はらせん状で、
胞子表面構造は有刺型の形態となる。気菌糸はう
すいライラツク色でトレスナー及びバツカス
（H.D.TRESNER and E.J.BACKUS：Appl.
Aicrobiol 第11巻、第335〜338頁、1963年）の
“Violet”シリーズに属する。裏面は淡黄褐色で
特殊な色調は見られない。メラニン様色素は生成
するが、それ以外の可溶性色素は生成しない。 SF―2072株のこのような性状は既知菌種の中
でストレプトミセス・ビイオラスセンス
（Streptomyces violascens）の性状と最も近似
している。 ISP（International Streptomyces Project）
の記載によるストレプトミセス・ビイオラスセン
ス（International Journal of Systematic
Bactariology 第18巻、第380〜382頁、1968年）
とSF―2072株とを比較すると、細部においても
よく一致している。従つて、SF―2072株はスト
レプトミセス・ビイオラスセンスの種に属させる
のが妥当と考え、本菌株をストレプトミセス・ビ
イオラスセンスSF―2072（Streptomyces
violascens SF―2072）と命名した。 本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微
生物受託番号微工研菌寄第4617号として寄託され
ている。 ストレプトミセスSF―2073株の菌学的性状 (a) 形態的性状 気菌糸はスターチ寒天、オートミール寒天及
びチロシン寒天で良好に着生し、胞子形成も豊
富である。分枝は単純分枝で車軸分枝は見られ
ない。気菌糸の先端はらせん状（コンパクトな
らせん糸）である。菌核は観察されない。 電子顕微鏡での観察による胞子の表面構造は
平滑型である。胞子は楕円ないし短円筒型で、
大きさは0.8〜1.1×1.0〜1.3ミクロンで通常10
胞子以上連鎖する。 (b) 各種培地上の生育状態 培養は28℃で行ない、観察は14〜21日培養後
に行なつた。

【表】

【表】 (c) 生理的性質 (1) 生育温度範囲：スターチ寒天において15〜
38℃の温度範囲で生育し、25〜30℃で良好に
生育する。 (2) ゼラチンの液化：20℃にて21日培養で液化
する。 (3) スターチの加水分解：陽性（28℃） (4) 脱脂乳の凝固：陰性（28℃） 脱脂乳のペプトン化：陽性（28℃） (5) メラニン様色素の生成：陽性 (d) 炭素源の利用性（プリードハム・ゴツトリー
ブ寒天培地、28℃）Ｄ―グルコース、Ｄ―フラ
クトース、Ｄ―キシロース、Ｄ―マンニトー
ル、Ｌ―アラビノース、Ｉ―イノシトール、シ
ユクロース、ラフイノース、ラムノースを全て
よく利用し、良好に生育する。 以上の性状を要約するとSF―2073株はストレ
プトミセス属に属し、気菌糸先端はらせん状で胞
子表面構造は平滑型の形態となる。気菌糸は褐灰
色、裏面は淡褐色ないし灰褐色で特殊な色調はみ
られない。メラニン様色素は生成するが、それ以
外の可溶性色素はほとんど生成しない。 SF―2073株にこのような性状は既知菌種の中
でストレプトミセス・デイアスタトクロモゲネス
（Streptomyces diastatochromogenes）の性状と
最も近似している。 ISPの記載（International Journal of
Systematic Bacteriology第22巻、第290〜294
頁、1972年）によるストレプトミセス・デイアス
タトクロモゲネスと本菌株とを比較すると、スタ
ーチ寒天及びオートミル寒天での裏面色調がISP
株では淡黄色ないし灰黄色であるのに対し、本菌
株では灰褐色となる点及びISP株の気菌糸先端は
らせん状のほか波状や直状も見られるのに対し、
本菌株ではほとんどらせん状である点において若
干の相違が認められる。しかしながらその他の性
状では両者は極めてよく一致している。 このようにSF―2073株は細部において若干の
相違点はみられるが、基本的性状においてよく一
致することからストレプトミセス・デイアスタト
クロモゲネスの種に属させるのが妥当である。 従つて、本発明者らは本菌株をストレプトミセ
ス・デイアスタトクロモゲネスSF―2073
（Streptomyces diastatochromogenes SF―
2073）と命名した。 本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微
生物受託番号微工研菌寄第4618号として寄託され
ている。 アスペルギルス・エスピ―KS―101の菌学的性状 バレイシヨ・ブドウ糖寒天シヤーレ上で28℃10
日培養した時の集落の径は65mmで、白色菌糸が綿
毛様を呈し、黒褐色の胞子を無数に着生する。サ
ペツク寒天シヤーレ上で同様に培養した集落の径
は70mmとなり、胞子を着生して黒褐色のビロード
様生育を呈する。またマルトエキス寒天シヤーレ
上で同様に培養した集落の径は90mmとなり、短か
い綿毛様菌糸に無数の黒褐色胞子を形成する。 顕微鏡下の形態は成熟した分生子頭が40〜60μ
の球形となり、黒褐色の分生子を密に着生する。
分生子柄はスムースで先端に径10〜15μのほぼ球
形の頂のうをつける。梗子は２段であり分生子は
３〜４μの球形で著るしい小突起を有する。 培養温度は15〜37℃でよく生育するが42℃では
生育しない。以上の菌学的性質から本菌はアスペ
ルギルス属に属し、いわゆるアスペルギルス・ニ
ガー（Aspergillus niger）群に所属すると判定
した。 本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微
生物受託番号微工研菌寄第4614号として寄託され
ている。 アスペルギルス・エスピ―KS―102の菌学的性状 バレイシヨ・ブドウ糖寒天シヤーレ上で28℃10
日培養した時の集落の径は13mmでビロード様に生
育し、周返は白く、中央がわずかに盛り上つて横
緑色を呈する。サペツク寒天シヤーレ上で同様に
培養すると集落の径は50mmとなり、深緑色のビロ
ード様生育を呈し、その中に径約１mmの黒いかた
まりが点々と形成される。マルトエキス寒天シヤ
ーレ上で同様に培養すると集落は90mmとなり、深
緑色の胞子を無数に着生し、ビロード様生育を呈
する。 顕微鏡下の形態は若い時期の分生子頭がホウキ
状を呈し頂のうも卵形であるが、成熟すると分生
子頭は40〜60μ、頂のう径15〜20μのほぼ球形を
呈するようになる。分生子柄はスムースで梗子は
一段、分生子の径は４〜６μの長円形から球形を
呈し、小突起は認められない。 培養温度は15〜40℃でよく生育する。 以上の菌学的性質から本菌はアスペルギルス属
に属し、いわゆるアスペルギルス・フラブスーオ
リザエ（Aspergillus flavus―oryzae）群に所属
すると判定した。 本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微
生物受託番号微工研菌寄第4615号として寄託され
ている。 上記に示した菌株は、他の一般微生物の菌株に
見られるようにその性状が変化しやすく、例えば
紫外線、高周波、放射線や化学変異剤等を用いる
人工変異の手段で変異し得るものであり、このよ
うな変異株であつても目的のアシラーゼ生産能を
有する菌株は全て本発明の方法に使用することが
できる。 Ｎ―アシル―MPGAのラセミ分割を行ないＬ―
MPGA及びＮ―アシル―Ｄ―MPGAを製造するた
め本発明の方法を実施するに当つては、まず前述
のアシラーゼ生産菌を培養し、得られる培養物ま
たはそれらの処理物を原料化合物（Ｎ―アシル―
Ｄ，Ｌ―MPGA）に適当な条件下で水性媒体中で
作用させるのがよい。微生物の培養物を得るため
の培養方法としては、通常微生物が利用し得る栄
養物を含有する培地で培養することができる。栄
養源としては一般微生物に利用される公知のもの
が使用できる。例えば炭素源としてグルコース、
蔗糖、澱粉、グリセリン、水飴、糖蜜、植物油等
を使用し得る。また窒素源としては大豆粉、小麦
胚芽、肉エキス、ペプトン、コーンステイープリ
カー、乾燥酵母、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリ
ウム等を使用し得る。その他必要に応じて食塩、
塩化カリ、炭酸カルシウム、燐酸塩その他の無機
塩のほか、菌の発育を助け、前記アシラーゼの生
産促進に必要な添加物を適宜組合せ使用すること
ができる。培養方法としては微生物一般に用いら
れる培養法、即ち固型培養法ならびに液体培養法
が可能であり、工業的には深部培養法が適してい
る。培養は好気的条件で行なわれ、培養温度は25
〜37℃の範囲で選ばれるが、多くの場合28℃付近
で行なうのが適当である。培養時間は培養条件、
特に培養装置、培地組成、培地温度などによつて
異なるが、アシラーゼ活性が最大になる時点に培
養を終了するのが良い。例えば培地の種類や濃度
によつて多少異なるが培養１日目からアシラーゼ
活性が見られ、２〜３日でその活性は最大とな
り、それ以後活性は低下し消失する。従つて通常
２〜４日培養が適当である。 上記の方法で得られた培養物またはその処理物
がＮ―アシル―MPGAの光学分割に用いられる
が、ここでいう培養処理物とは培養物に適当な処
理を加えて目的とするアシル分解の能率を高め、
目的物Ｌ―MPGA及びＤ―MPGAの製造に有利な
形にしたものを指す。例えば培養物から集菌洗浄
された菌体、菌体の超音波処理、細胞破砕やその
他の処理でアシラーゼを抽出精製したものや、菌
体や抽出精製酵素に更に固形化処理を施したもの
等を指す。 本法において脱アシル化酵素反応によつてＬ―
MPGAを製造する場合、通常反応は水性媒体中で
行なわれる。その場合の反応条件としては酵素の
性質を最大限に生かす条件が選ばれる。本法で用
いられる菌体含有の状態でアシラーゼ酵素のおよ
その性質を示せば、細菌、放線菌、糸状菌の各ア
シラーゼには大差なく反応はPH６〜8.5でアシラ
ーゼ活性が高く、PH５以下又は９以上では活性が
低下するか又は認められない。作用温度は20〜45
℃であるが、三者の酵素作用は28〜35℃で最も効
率的であり、50℃以上では失活する。 従つて、反応PHは6.5〜8.0、反応温度は25〜40
℃が好適である。本酵素はＮ―アシル―Ｌ―
MPGA以外の基質、例えば他の一般のＬ―アミノ
酸のＮ―アシル体に対しては作用が弱いかほとん
ど作用しない。 洗浄菌体を用いる場合、基質溶液中に菌体を分
散し、懸濁液の中で反応が実施されるのが好まし
いが、この際適当な振盪又は撹拌を伴なわせるの
が効果的である。あるいは培養物またはその処理
物を一旦カラムに充填し、基質溶液がこのカラム
内を通過する際に脱アシル化反応が連続して行な
われるような形で実施することも可能である。反
応時間は基質濃度、脱アシル活性の強さや反応温
度などに左右されるが、通常２〜40時間であつ
て、目的のＬ―MPGAが最高に生成される時間を
検討し、適当な時間で反応を終了すればよい。基
質濃度は主として脱アシル化活性の強さとの関係
で決められるが0.1〜10％の範囲で適当に選ばれ
る。一方、反応中反応液が他の微生物で汚染され
ることを防ぐ目的で適当な汚染防止剤を用いるこ
とも可能である。 以上のごとく生成されたＬ―MPGAとＮ―アシ
ル―Ｄ―MPGAを分別し、採集するには、反応終
了混液を別又は遠心分離等の操作により菌体又
はその処理物を除き、反応液を強酸性樹脂、例
えばダウエツクス50（ダウケミカル社）のカラム
を通すと末反応のＮ―アシル―Ｄ―MPGAは素通
り画分に含まれ、カラムを更に水で展開するとニ
ンヒドリン反応陽性物質であるＬ―MPGAが溶出
される。これを必要に活性炭又は弱塩基性樹脂、
例えばダウエツクス１（ダウケミカル社）で処理
するとほぼ純粋状態の溶液が得られ、更に濃縮し
て結晶化するか又は凍結乾燥すればＬ―MPGAの
結晶又は白色粉末が得られる。 一方、先に分画されたＮ―アシル―Ｄ―MPGA
は、公知の方法で容易にラセミ化され、再び原料
化合物のＮ―アシル―Ｄ，Ｌ―MPGAに変えるこ
とができる。たとえばこのＮ―アシル―Ｄ―
MPGAの画分を苛性ソーダ水溶液となし、大過剰
の無水酢酸を加えるか、又はケテンガスを通じる
ことも可能であるし、或いはＮ―アシル―Ｄ体を
氷酢酸中に保ち、等モルないし等モル以下の無水
酢酸を加え加熱することによりラセミ化が達成さ
れる。得られたラセミ体に再びアシラーゼ作用を
施し光学分割を行なう操作をくり返すことによ
り、ほゞ完全にＬ―MPGAを得ることができる。 なお、酵素反応、即ちアシラーゼ反応の進行状
態は以下に示す測定法によりＬ―MPGAの生成量
を測定し、反応の終了点を知ることができる。Ｌ
―MPGAの測定法： Ｌ―MPGAはE.W.YemmとE.C.Cocking
（Analyst、第80巻、第209頁、1955年）のニンヒ
ドリン比色法により測定でき、あらかじめＬ―
MPGAの標準検量線を求め、その検量線より定量
することができる。 試薬類： Ａ液：4M酢酸緩衝液（PH、5.0） Ｂ液：0.01Mシアン化カリ溶液５mlとメチルセ
ロソルブ245mlを混合した溶液 Ｃ液：ニンヒドリン2.5ｇをメチルセロソルブ
50mlに溶解した溶液 Ｄ液：Ｂ液250mlとＣ液50mlの混合液 Ｅ液：60％エタノール溶液 測定操作： 検液1.0mlを試験管に取り、Ａ液0.5mlとＤ液1.2
mlを加え混合して沸騰浴中で15分間保つた後、冷
水中で５分間冷却する。次にＥ液3.0mlを加えよ
く混合した後、分光光度計にて570nmの吸光度を
測定する。 L₄MPGAは１μｇ／mlから50μｇ／mlの濃度
範囲で直線関係が得られ、これにより検液の含有
量を知ることができる。 つぎに本発明を実施例によつて、さらに説明す
る。 実施例 １ グルコース0.5％、肉エキス0.3％、ペプトン0.5
％、グルタミン酸ナトリウム0.2％、塩化コバル
ト0.001％及び硫酸第一鉄0.001％の組成からなる
減菌培地200mlにシユードモナス・マルトフイリ
アBN―233（微工研菌寄第4487号）のスラントか
ら１エーゼを植菌し、28℃で42時間振盪培養し
た。培養混液を8000rpm、20分の遠心分離操作に
て集菌し、菌体を50mlの生理食塩水で洗浄して、
洗浄菌体５ｇ（湿潤重量）を得た。 この菌体1.6ｇをPH7.0、0.05Mリン酸緩衝液５
mlに懸濁し、Ｎ―アセチル―Ｄ，Ｌ―MPGA240
mgを加え、200ml容量の三角フラスコで28℃、18
時間振盪反応させた。反応終了後、反応混液を遠
心分離して、菌体と上澄液に分け、菌体は５mlの
水で２回洗浄し上澄液と合わせた。この液をダウ
エツクス１×２（CH₃COO^-）のカラム（径1.6
cm、高さ12cm）に掛け、水を十分通した後、0.3
規定の酢酸で展開した。溶出液フラクシヨンのニ
ンヒドリン反応陽性画分90mlを集めて減圧濃縮乾
固し、更に真空乾燥してＬ―MPGAの白色粉末84
mgを得た。このものは純度85％、〔α〕^２２ _Ｄ、21.7゜
（ｃ＝１、1NHCl）、収率68％であつた。 実施例 ２ 可溶性澱粉１％、酵母エキス0.2％及びペプト
ン0.2％の組成からなる滅菌培地200ml（滅菌前PH
7.0）にストレプトミセス・ビオラスセンスSF―
2072（微工研菌寄第4617号）のスラントから１エ
ーゼを植菌し、28℃で72時間振盪培養を行つた。
培養液を東洋紙No.２を用いて吸引過し、菌体
を50mlの生理食塩水で洗浄して、洗浄菌体6.5ｇ
（湿潤重量）を得た。この菌体３ｇを0.05Mリン
酸緩衝液（PH7.0）、200mlによく懸濁し、Ｎ―ア
セチル―Ｄ，Ｌ―MPGA400mgを加え、30℃で16
時間振盪反応させた。反応終了後、反応混液を東
洋紙No.２により菌体を別し、更に菌体を20ml
の水で洗浄し、液と洗液を併せてダウエツクス
50×２（H⁺）のカラム（直径1.2cm、高サ15cm）
に掛け、水で展開した。この溶出液のニヒドリン
陽性フラクシヨン160mlを集めて減圧濃縮乾固
し、更に真空乾燥してＬ―MPGAの白色粉末158
mgを得た。このものは純度92％、〔α〕^２２ _Ｄ、23゜
（ｃ＝１、1N HCl）、収率88.6％であつた。 実施例 ３ 実施例２におけるダウエツクス50×２（H⁺）カ
ラムの素通り区分250mlを集め、１規定苛性ソー
ダ溶液にて中和後、減圧濃縮乾固し、このものに
酢酸２ml、無水酢酸0.11mlを加え、100℃で18時
間還流を行ない、得られた反応液を減圧濃縮乾固
した。得られた固形物を実施例２と同じ方法で酵
素的脱アセチル化を行さい、Ｌ―MPGAの白色粉
末55mgを得た。〔α〕^２２ _Ｄ、22゜（ｃ＝１、1N
HCl）。 実施例 ４ Ａ：シユードモナス・マルトフイリアBN―233
（微工研菌寄第4487号） Ｂ：ストレプトミセス・ビオラスセンスSF―
2072（微工研菌寄第4617号） Ｃ：ストレプトミセス・デイアスタトクロモゲネ
スSF―2073（微工研菌寄第4618号） Ｄ：アスペルギルス・エスピーKS―101（微工研
菌寄第4614号） Ｅ：アスペルギルス・エスピーKS―102（微工研
保管委託申請番号第4615号） 上記５株の洗浄培養菌体100mg（湿潤重量）を
0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）１mlに懸濁し、下
記の基質５mgを加え、28℃で６時間チユーブシエ
ーカーで振盪反応を行ない、各反応液につい
て、アシル分解を受けて生ずるＬ―MPGAの生成
率をニンヒドリン比色法にて測定し、下表の結果
を得た。

【表】 Ａは実施例１の方法で、Ｂ及びＣは実施例２の
方法で洗浄培養菌体を得、Ｄ及びＥはペプトン１
％、酵母エキス0.2％、グルコース２％、塩化コ
バルト0.001％の組成の培地（殺菌前PH7.0）に、
それぞれ28℃、68時間振盪培養を行ない、培養菌
体を別して洗浄菌体を得た。 実施例 ５ 実施例２と全く同じ方法で得られたストレプト
ミセス・ビオラスセンスSF―2072（微工研菌寄
第4617号）の洗滌菌体３ｇを0.05Mリン酸緩衝液
（PH7.0）100mlに懸濁し、フレンチプレツシヤー
セル（大兵製作所製）を用いて1500psiで菌体破
壊処理を行ない、処理液を遠心分離
（15000rpm）して上澄液を取り、これを酵素液と
して以下の実験を行なつた。 酵素液20mlにＮ―アセチル―Ｄ，Ｌ―
MPGA120mgを加え30℃で16時間静置反応させ
た。反応終了後、ダウエツクス50×２（H⁺）のカ
ラム（直径1.2cm、高サ10cm）に掛け、水で展開
した。この溶出液のニンヒドリン反応陽性画分24
mlを集め、活性炭100mgを加え、室温で30分間撹
拌し、別して活性炭は更に５mlの水で２回洗浄
した。液と洗液を合せて減圧濃縮乾固し、更に
真空乾燥してＬ―MPGAの白色粉末48mgを得た。 純度91％、〔α〕^２２ _Ｄ、21.5゜（ｃ＝１、1N
HCl）。収率は88.7％であつた。 実施例 ６ 実施例５で得られた酵素液50mlを１規定塩酸で
PH5.5に調節し、これに水で十分膨潤させた
DEAE―セフアセル（Sephacel）（OH型、フア
ルマシア製）20mlを加え、５℃で３時間撹拌し
て、アシラーゼ酵素をDEAE―セフアセルに十分
吸着させる。次にこれを遠心分離（3000rpm、20
分）してゲル状のDEAE―セフアセルを分離し、
0.05Mのリン酸緩衝液（PH7.0）50mlで２回洗浄
した。得られたDEAE―セフアセルゲル１mlにＮ
―アセチル―Ｄ，Ｌ―MPGA50mgを0.05Mリン酸
緩衝液（PH7.0）50mlに溶解して加え、30℃にて
マグネテイツクスターラーで撹拌を与えながら16
時間作用させた。反応終了後、遠心分離
（3000rpm、20分）し、DEAE―セフアセルゲル
を分離し、ゲルを更に５mlの同緩衝液で洗浄し、
上澄液と併せる。洗浄したDEAE―セフアセルに
再び0.1％Ｎ―アセチル―Ｄ，Ｌ―MPGAリン酸
緩衝溶液50mlを加え、全く同様に反応をくり返し
た。この反応を同一のDEAE―セフアセル―酵素
ゲルを用いて計３回行ない、得られた反応上澄液
をそれぞれニンヒドリン比色定量を行ない、Ｌ―
MPGAの生成率（％）を求めた結果は次の通りで
あつた。 第１回 86.1％ 第２回 85.0％ 第３回 81.2％

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式： （式中、Ｒは非置換又はハロゲン置換アシル基を
   表わす）で表わされるＮ―アシル―Ｄ，Ｌ―２―
   アミノ―４―メチルホスフイノ酪酸に、シユード
   モナス属に属する細菌、ストレプトミセス属に属
   する放線菌及びアスペルギルス属に属する糸状菌
   から選ばれた前記化合物中のアシル基分解能を有
   する微生物の培養菌体又はその処理物を水性媒体
   下に作用させ、Ｌ―２―アミノ―４―メチルフオ
   スフイノ酪酸とＮ―アシル―Ｄ―２―アミノ―４
   ―メチルフオスフイノ酪酸との混合物に変換して
   光学分割を行ない、Ｌ―２―アミノ―４―メチル
   フオスフイノ酪酸とＮ―アシル―Ｄ―２―アミノ
   ―４―メチルフオスフイノ酪酸を分別採取するこ
   とを特徴とする含燐アミノ酸の光学分割法。 ２ 微生物がシユードモナス・マルトフイリア
   BN―233である特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ３ 微生物がストレプトミセス・ビオラスセンス
   SF―2072又はストレプトミセス・デイアスタト
   クロモゲネスSF―2073である特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ４ 微生物がアスペルギルス・エスピ―KS―101
   又はアスペルギルス・エスピ―KS―102である特
   許請求の範囲第１項記載の方法。