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JP2844263B2 - 磁気応答性ポリマー粒子の製造方法及びその用途 - Google Patents

磁気応答性ポリマー粒子の製造方法及びその用途

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JP2844263B2
JP2844263B2 JP5501047A JP50104793A JP2844263B2 JP 2844263 B2 JP2844263 B2 JP 2844263B2 JP 5501047 A JP5501047 A JP 5501047A JP 50104793 A JP50104793 A JP 50104793A JP 2844263 B2 JP2844263 B2 JP 2844263B2
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DEIDO INTERN Inc
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、磁気応答性ポリマー粒子の製造方法及びそ
れらのイムノアッセイ、生物医学的及び産業的用途にお
ける使用に関する。
発明の背景 イムノアッセイ、アフィニティー精製等のような多く
の生物学的技術が、遊離の画分からの結合した画分の分
離を必要とする。磁性粒子が、望ましい分離を効率化す
るために使用されてきた。
磁性粒子は、種々の方法を用いて、種々の粒子性及び
磁性の材料から形成され、種々の特徴を有する。例え
ば、池田等の米国特許第4,582,622号は、ゼラチン、水
溶性多糖類、リン酸ナトリウム及び強磁性体物質よりな
る磁性粒子を開示し、米国特許第4,628,037号及び4,55
4,088号はポリマー性シランによって取り囲まれた磁性
金属酸化物コアよりなる磁性粒子を開示し、米国特許第
4,452,773号は、水溶性多糖類又は官能基を有するその
誘導体で被覆された強磁性体鉄酸化物（Fe3O4）のコア
を有する離散コロイド的サイズの粒子を開示し、そして
Mansfieldの米国特許第4,297,337号は、粒子担体として
磁性のガラス又は結晶含有材料を開示している。
発明の概要 本発明は、磁気応答性ポリマー粒子（以下、「磁性粒
子」という。）を、形状及び組成にかかわりなく直径約
１乃至100μｍの平均サイズを有するポリマー性粒子か
ら製造する新規の方法を提供する。本発明の磁性粒子
は、先ず平均サイズ約１μｍ以下の磁気応答性金属酸化
物（以下「金属酸化物」という。）を製造し、次いでポ
リマー性コア粒子を金属酸化物を含有するポリマー層で
被覆することによって製造できる。これらの磁性粒子の
表面は、所望の表面特性を与えるために、もう一層のポ
リマー又は官能基付きポリマー層で更に被覆することが
できる。
本発明によって製造される磁性粒子は、サイズにおい
て単分散性で粗い表面を有し、約５％乃至50％、好まし
くは10％乃至25％の磁性金属酸化物含有量を有する。こ
れらの特徴を有する粒子は、イムノアッセイ及び広汎な
各種の生物医学的用途において有用であることが見出さ
れた。これらの磁性粒子は、抗原、抗体、酵素又はDNA/
RNAのような生物学的材料の受動的又は共有結合的な結
合のために使用でき、種々のタイプのイムノアッセイ、
DNA/RNAハイブリダイゼーションプローブアッセイ、ア
フィニティー精製、細胞分離及び他の生物医学的な用途
のために固相として使用できる。該磁性粒子はまた、産
業廃棄物の処理のような産業的用途のためにも使用でき
る。
目的及び利点 本発明の目的は： 容易に入手できるポリマー粒子から粒子から容易に磁
気応答性ポリマー粒子を製造する方法を開発すること。
中等度の沈降性及び迅速な磁気的分離を備えた磁気応
答性ポリマー粒子を製造する方法を開発すること。
生物学的材料の受動的又は共有結合的な結合のための
種々の表面電荷及び官能基を有する磁気応答性ポリマー
粒子を製造する方法を開発すること。
これらの磁気応答性ポリマー粒子を使用する医学的、
生物学的、診断及び産業的用途を開発することである。
本発明の利点に含まれるのは： 約１乃至100μｍのサイズを有する広汎な各種のポリ
マー性コア粒子を、容易に磁気応答性粒子に変えること
ができること。
金属酸化物含量を用途に応じて変化させることができ
ること。
、表面を、共有結合的な結合のための種々の官能基へ
と誘導体化できること。
得られるポリマーの種々の表面特性を与えるための最
終被覆のために、広汎な各種のモノマーが使用できるこ
と。
架橋を有し又は架橋を有しない磁気応答性ポリマー粒
子の双方が製造できること。
単分散性の磁気応答性ポリマー粒子が製造できるこ
と。
発明の詳細な説明 本発明の磁性粒子は、先ず約１μｍ以下の平均サイズ
を有する金属酸化物を製造することによって調製でき
る。該金属酸化物は、２価及び３価の金属塩の混合物、
好ましくは硫酸（又は塩化）第１鉄及び第二鉄と水酸化
ナトリウムとの混合物を加熱しそして沈殿させることに
よって製造される。２価/3価の金属塩のモル比は、金属
酸化物の所望のサイズ及び磁気特性を得るために、0.5
乃至2.0、好ましくは0.5乃至1.0の範囲で変化させるこ
とができる。２価/3価の金属塩のモル比は、金属酸化物
のサイズに影響する。すなわち、２価/3価の金属塩のモ
ル比が小さい程、金属酸化物のサイズは小さくなる。２
価/3価の金属塩のモル比はまた、得られる磁性粒子の色
にも影響する。すなわち、モル比が小さい程、得られる
磁性粒子の茶色がかった色は明るくなる。強磁性体金属
酸化物も使用できるが、洗浄に際して磁気的分離の代わ
りに遠心が使用されるのなら、好ましくは超常磁性体又
は常磁性体のいずれかである。マンガン、マグネシウ
ム、コバルト、ニッケル、亜鉛及び銅塩のような他の２
価の遷移金属塩が、第一鉄塩に置き換えられることがで
きる。
強磁性体を沈殿させた後、上澄のpHが中性となるまで
250×ｇでの遠心により数回洗浄する。金属酸化物を脱
イオン水に再懸濁させ、高速で機械的に撹拌して金属酸
化物結晶の凝集物を粉砕する。250×ｇでの更なる遠心
は、金属酸化物の全てをぺレットにすることはないであ
ろう。より小さいサイズの金属酸化物結晶を含有する上
澄を回収し、ペレットは脱イオン水に再懸濁する。この
工程を少なくとも３回、又は殆どの金属酸化物がもはや
250×ｇではペレット化できなくなるまで繰り返す。こ
の方法で得られる金属酸化物は通常、2.0μｍ未満のサ
イズを有する。一層大きい結晶を除去するための100×
ｇでの低速遠心は、サイズを0.8μｍ未満まで減少させ
るであろう。
図１に示したように電子顕微鏡法による試験におい
て、上澄の金属酸化物結晶が、激しく撹拌したにも拘わ
らず依然として部分的に凝集していることが明らかであ
る。本発明により製造される金属酸化物の顕著な特徴
は、最も小さい粒子は、小さい結晶の房の形態へと、そ
れらを結合している沈殿した無定形の物質と共に集合し
ているということである。洗浄及び撹拌工程は該粒子を
完全には解離させず、それらを無定形の物質によって一
つに接着された、集合した小さい結晶の房の形態のま
ま、解離することなく残す。このことは、最終の常磁性
粒子の調製における被覆段階には決定的であるように思
われる。なぜなら、均一に且つ完全に分散された金属酸
化物対照粒子は被覆できず、重大な凝集を引き起こす粒
子架橋に寄与するからである。
1.0μｍ以下の平均サイズを有する金属酸化物は、モ
ノマーと混合され、そして開始剤の存在下、ポリマー性
コア粒子、好ましくは、１乃至100μｍのサイズを有す
るポリスチレン粒子に被覆される。少量の乳化剤の添加
は、粒子が凝集するのを防止するのに役立つであろう。
水相からポリスチレン粒子の表面において重合を受けて
いるモノマーの有機相へと、金属酸化物の房状の集合物
の移動が起こる。その結果は、該粒子の表面に同時に被
覆されたポリマー中に埋め込まれた金属酸化物の房状の
集合物を含有する、顕著に不均一な、不均一に分布した
層である。この層は、図2a及び2bに示した断面走査型電
子顕微鏡写真に見られる。驚くことに、実施例で実証す
るように、この形状の常磁性粒子は、常磁性層を有しな
い同じサイズのポリスチレン粒子に比して、抗原結合に
対する異常な能力を有する。官能基を有する磁性粒子を
所望する場合には、生物学的材料の共有結合的な結合の
ためのカルボキシル基、アミノ基又はヒドロキシル基の
ような官能基を与えるために、官能基を有するポリマー
の更なる層で磁性粒子を更に被覆することができる。図
IIIは、本発明に従って調製した、6.8μｍの磁性粒子の
走査型電子顕微鏡写真を示す。図III aは、1000倍、図I
II bは5000倍拡大である。
本発明において有用なポリマー性コア粒子は、小さい
粒子の分散として得ることができ且つモノマーを吸収で
きてそれによってコア粒子の表面上に金属酸化物とモノ
マーとの混合物の被覆を引き起こすことのできる、いか
なるポリマーよりなるものでもよい。コア粒子はいかな
るサイズ及び形状でもよく、好ましくはサイズで１乃至
100μｍ、形状は球状である。単分散性コア粒子が使用
された場合には、得られる磁性粒子もまた、サイズにお
いて単分散性であろう。コア粒子は、乳化重合、懸濁重
合又は、ジビニルベンゼンのような架橋剤を含む若しく
は含まない他の重合手段によって得ることができる。コ
ア粒子を調製するために使用できるモノマーのうちに
は、スチレン、メタクリル酸メチル、ビニルトルエンそ
の他がある。モノマーの混合物もまた使用できる。磁性
金属酸化物被覆又は保護被覆のために使用されるモノマ
ーは、コア粒子と同じでも同じでなくてもよい。金属酸
化物被覆に用いるモノマーのコア粒子に対する重量比
は、所望の金属酸化物／ポリマー層の厚みに依存して、
0.1乃至12、好ましくは0.2乃至６であろう。第一鉄及び
第二鉄塩の混合物から調製された金属酸化物を被覆に使
用する場合は、約0.1乃至0.5のモノマー／コア粒子の重
量比を用いるのが好ましい。しかしながら、マンガン
（II）と第二鉄塩との混合物から調製された金属酸化物
を被覆に使用する場合には、モノマーのコア粒子に対す
る重量比は0.1乃至12であろう。結果として、慣用の有
機溶媒に不活性である架橋磁性粒子を望む場合には、マ
ンガン（II）と第二鉄塩との混合物を、２乃至10重量
％、好ましくは３乃至10重量％の架橋剤を含有するモノ
マーと共に、モノマー／コア粒子重量比を３乃至12、好
ましくは４乃至６として使用するのが好ましい。金属酸
化物／ポリマー被覆に際して一層低いモノマー／コア粒
子重量比（すなわち、0.1乃至0.5）が用いられた場合に
は、磁性粒子の表面に金属酸化物を更に装着させるため
に、得られた磁性粒子をポリマー被覆の保護層で保護被
覆するのが好ましい。しかしながら、一層高いモノマー
／ポリマー比率（すなわち３乃至12）が用いられた場合
には、保護的ポリマー被覆の必要はない。重合温度は、
50℃乃至90℃、好ましくは55℃乃至65℃であろう。重合
開始剤は、過硫酸カリウム等のように水溶性であって
も、又は過酸化ベンゾイル等のように水不溶性であって
もよい。放射、イオン化等のような他の重合開始手段も
また使用できる。意外にも、マンガン（II）と第二鉄塩
との混合物から調製される金属酸化物を被覆に使用する
場合には、いかなる乳化剤も用いることなく磁性粒子が
製造できるころが見出されている。しかしながら、第一
及び第二鉄塩の混合物から調製された金属酸化物を被覆
に用いる場合には、金属酸化物／ポリマーに際して粒子
を過度の凝集を防止するのに、ドデシル硫酸ナトリウ
ム、Aerosol22、Tween20又はNonidet P−40のような乳
化剤の少量が、有用であることが判明している。同じ能
力を有する他の乳化剤もまた使用できる。磁性金属酸化
物含量は、金属酸化物／ポリマー被覆に際して異なる量
の金属酸化物を使用することによって、５％乃至50％、
好ましくは10％乃至25％の範囲で変化させることができ
る。金属酸化物／ポリマーの多重被覆もまた、金属酸化
物含有量を高めるために用いることができる。重合にお
いて慣用的に使用される他の成分もまた、所望の特性を
有する磁性粒子を得ることができる限り添加できる。金
属酸化物／ポリマー被覆のための成分は、金属酸化物／
ポリマー被覆工程の最初に一度に加えても、段階的に加
えてもよい。第一鉄及び第二鉄塩の混合物から調製され
た金属酸化物を使用する場合には、成分を段階的に加え
るのが好ましい。成分は、機械的撹拌、回転又は他の撹
拌手段によって、減圧下又はアルゴンのような不活性ガ
ス下において混合することができる。官能基は、金属酸
化物／ポリマー被覆に際してモノマーと官能基を有する
モノマーとの混合物を使用するか、又は磁性粒子を官能
基を有するモノマーの薄層で最後に保護被覆することに
より、磁性粒子の表面上に導入することができる。使用
される官能基を有するモノマーは、次のうちの一つ又は
混合物から選択できる：メタクリル酸２−ヒドロキシエ
チル、メタクリル酸２−アミノエチル、トリメチルアン
モニウムエチルメタクリレートメトサルフェート、メタ
クリル酸ジメチルアミノエチル、メタクリル酸、ウンデ
シレン酸、メチルプロペンスルホン酸、ウンデシレンア
ルコール、オレイルアミン、メタクリル酸グリシジル、
アクロレイン、グルタルアルデヒドその他。磁性粒子は
また、ポリマーの表面特性を取り込むために、金属酸化
物／ポリマー被覆又は保護被覆に使用したのとは異なる
ポリマーの層で被覆することもできる。
磁性粒子の用途 蛍光イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、エンザ
イムイムノアッセイ、細胞分離、酵素固定化及びアフィ
ニティー精製のような種々の用途のための固相としての
広汎な種類の磁性粒子の用途は、以下の論文によって例
示されるように文献において評価されている:Hirshbein
et al., Chemical Technology,March 1982,172−179
（1982）;Pourfarzaneh,The Ligand Quarterly,5
（１）:41−47（1982）;Halling and Dunnill,Enzyme M
icrobe Technology,2:2−10（1980）;Mosbach and Ande
rson,Nature,270:259−261（1977）;Guesdon et al.,J.
Allergy Clinical Immunology,61（１）,23−27（197
8）．幾つかの用途はまた、酵素固定化に関して米国特
許第4,152,210号及び4,343,901号に、細胞分離に関して
米国特許第3,970,518号、4,230,685号及び4,267,234号
に、イムノアッセイに関して米国特許第4,554,088号、
4,728,037号及び3,933,997号に開示されている。
磁性粒子によっては、ある用途に有用であるが、他の
用途にはそうではない。例えば、一般的にポリマー性シ
ランによって包まれた超常磁性体金属酸化物コアよりな
る米国特許第4,554,088号及び4,628,037号に開示されて
いる磁性粒子は、広い表面積及び一層遅い沈降速度のた
めに、イムノアッセイ及びアフィニティー精製には有用
であろうが、骨髄洗浄のような細胞分離用途には適当で
ない。これら２つの特許に開示された磁性粒子の小さい
サイズのために、細胞懸濁液から全ての磁性粒子を効果
的に除去するのは非常に困難である。更に、小さい磁性
粒子の正常細胞への非特異的結合は高いであろう。骨髄
洗浄のための磁性粒子の使用においては、磁性粒子はヒ
ツジ抗マウスIgGのような抗体で被覆されており、骨髄
は、癌細胞表面抗原に対する数種のモノクローナル抗体
の混合物で処理される。磁性粒子は癌細胞にのみ結合
し、強力な磁場を通すことによって、それらを正常細胞
から分離するであろう。洗浄された細胞は次いで患者に
戻される。
本発明の方法を使用することにより、磁性粒子は、広
汎な各種の生物医学的用途のために、サイズ、表面積、
金属酸化物含量及び表面特性によって至適化されること
ができる。本発明によって製造される磁性粒子は、エン
ザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、ラジオイ
ムノアッセイ、DNA/RNAハイブリダイゼーションアッセ
イ、及び他の診断的用途のために固相として使用でき
る。イムノアッセイは、当業者に自明の、サンドイッチ
アッセイ及び競合結合アッセイのような種々の形態を用
いることによって実施できる。DNA/RNAハイブリダイゼ
ーションもまた、固相ハイブリダイゼーション又は液相
ハイブリダイゼーションのような種々の形態を用いるこ
とによって実施できる。固相ハイブリダイゼーションの
形態ににおいては、DNA又はRNAプローブ（キャッチャー
プローブ）は、磁性粒子に最初に固定化される。固定化
されたキャッチャープローブは、次いでサンプルからの
DNAの相補的鎖（サンプルDNA）とハイブリダイゼーショ
ンさせるために使用される。最後に、蛍光、放射性又は
酵素トレーサーで標識した、DNAの他の部分とハイブリ
ダイゼーションできる他のプローブ（シグナルプロー
ブ）が、シグナル発生のために使用される。液相ハイブ
リダイゼーションの形態においては、キャッチャープロ
ーブ及びシグナルプローブは、サンプルDNAと液相にお
いて最初にハイブリダイゼーションさせられ、次いで磁
性粒子に固定化される。
代わりに、シグナルプローブは１つ又は数個のビオチ
ン基で標識され、シグナルは、アッセイの感度を高める
ために、アビジン標識した蛍光、放射性又は酵素トレー
サーとビオチン基の結合によって検出される。
イムノアッセイ及びDNA/RNAハイブリダイゼーション
アッセイは、薬物、ホルモン、抗体、ペプチド、DNA、R
NA、ヌクレオチド、ウイルス抗原及び炭水化物のよう
な、生物学的なサンプル中の広汎な各種の化合物を測定
するのに使用することができる。
本発明によって製造される磁性粒子はまた、アフィニ
ティー精製、細胞分離、酵素固定化及び他の生物医学的
用途のために使用することができる。細胞分離において
は、磁性粒子は、免疫学的反応又は非免疫学的反応によ
って、望まない細胞の除去（ネガティブ選択）又は所望
の細胞リッチにする（ポジティブ選択）のいずれにも使
用される。この原理は、癌細胞を骨髄細胞から除去し
（骨髄洗浄）、細胞培養のためのポジティブ又はネガテ
ィブ選択によって細胞集団を精製し、及び種々の細胞イ
ムノアッセイを実施する等のために使用できる。アフィ
ニティー精製においては、磁性粒子は、ポリアクリルア
ミドゲル、セファロースゲル又は他のセルロースビーズ
のような慣用の固相に代えて、抗体、抗原、酵素、阻害
因子、補因子、単鎖DNA、結合蛋白質、ハプテン及び炭
水化物のような広汎な種類の生物学的材料の精製のため
に使用できる。アフィニティー精製に類似の他の用途に
おいては、磁性粒子は、抗血清又臨床サンプルから望ま
ない蛋白質成分を交差吸着して除去するために使用でき
る。酵素固定化においては、酵素は、酵素活性を保持し
固定化された酵素の再使用を許容するように結合する種
々の手段によって、磁性粒子上に固定化される。固定化
された酵素を有する磁性粒子は、炭水化物、アミノ酸及
び蛋白質のような広汎な各種の材料を製造するための固
定化酵素システムにおいて慣用的に使用されている、ガ
ラスビーズ、制御されたポアのガラス、シリカゲル及び
セルロースビーズのような他の固相に代えて使用でき
る。
本発明によって製造される磁性粒子は、産業材料から
有害な化学物質、すなわち有機又は無機の溶媒を除去す
るために、産業廃棄物の処理のような産業的用途に使用
できる。
これらの用途は、磁性粒子の殆どに共通の分離の容易
さ、反応速度の速さ、及び広い表面積によって能率化さ
れる。以下の実施例は、本発明の多能性及び利点を更に
説明するために掲示される。その精神及び範囲から外れ
ることなく種々の均等物、変更及び修正がなし得、その
ような均等な具体例はここに含まれることが意図されて
いるから、その詳細を限定とみなしてはならない。
金属酸化物の調製のための一般的手順 実施例１ 機械的撹拌機、冷却機、温度計、滴下ロート及び加熱
マントルを備えた三つ口丸底フラスコに、400mlの脱イ
オン水中の0.361molの硫酸第一鉄と0.369molno硫酸第二
鉄との混合物（Fe++/Fe+++比＝１）を加えた。混合物を
撹拌しつつ85乃至90℃に加熱し、850mlの6N水酸化ナト
リウムを90分間かけて滴下した。混合物を85乃至90℃に
て更に１時間撹拌し、室温まで冷却した。金属酸化物の
沈殿を250×ｇで10分間遠心した。澄んだ上澄をデカン
テーションし、機械的撹拌機を用いペレットを900mlの
脱イオン水に再懸濁した。この洗浄工程を６回又は上澄
が殆ど中性のpHになるまで繰り返した。上澄をデカンテ
ーションし、200mlの脱イオン水で再懸濁した。250×ｇ
での更なる遠心は、金属酸化物の全てを沈殿させること
はないであろう。一層小さいサイズの金属酸化物結晶を
含有する上澄を集め、ペレットは200mlの脱イオン水に
再懸濁した。この工程を少なくとも３回又は殆どの金属
酸化物がもはや250×ｇでペレット化しなくなるまで繰
り返した。この方法で得られる金属酸化物は通常2.0μ
ｍ未満のサイズを有する。合わせた金属酸化物懸濁液を
100×ｇで10分間遠心した。上澄を集め800mlの8.6％w/v
の、0.8μｍ未満のサイズを有する磁性金属酸化物懸濁
液を得た。
実施例２ 400mlの脱イオン水中の0.235molの硫酸第一鉄、0.297
molの硫酸第二鉄（Fe++/Fe+++＝0.79）及び480mlの6N水
酸化ナトリウムを使用した以外は、実施例１に記載した
のと同じ手順を行い、2000mlの2.86％w/vの磁性金属酸
化物懸濁液を得た。
実施例３ 400mlの脱イオン水中の0.178molの硫酸第一鉄、0.298
molの硫酸第二鉄（Fe++/Fe+++＝0.59）及び520mlの6N水
酸化ナトリウムを使用した以外は、実施例１に記載した
のと同じ手順を行い、1500mlの2.98％w/vの磁性金属酸
化物懸濁液を得た。
実施例４ 400mlの脱イオン水中の0.15molの硫酸第一鉄、0.276m
olの硫酸第二鉄（Fe++/Fe+++＝0.54）及び520mlの6N水
酸化ナトリウムを使用した以外は、実施例１に記載した
のと同じ手順を行い、700mlの6.88％w/vの磁性金属酸化
物懸濁液を得た。
実施例５ 225mlの脱イオン水中の0.116molの硫酸マンガン、0.1
46molの硫酸第二鉄（Mm++/Fe+++＝0.79）及び240mlの6N
水酸化ナトリウムを使用した以外は、実施例１に記載し
たのと同じ手順を行い、1700mlの1.8％w/vの磁性金属酸
化物懸濁液を得た。
実施例６ 600mlの脱イオン水中の0.6mlのスチレン及び実施例１
に記載したようにして調製した8.6％w/vの磁性金属酸化
物の80mlを含む混合物を密封した瓶に加えた。瓶を排気
し、55℃のオーブン中にて約60rpmで１時間回転した。
混合物に12gの過硫酸カリウム及び850mlの５％w/v、4.0
μｍポリスチレン粒子を加えた。瓶を再密封し、排気
し、１時間回転し、そして50mlの２％ドデシル硫酸ナト
リウムを加えた。更に５時間の後、6mlのスチレン及び1
0gの過硫酸カリウムを混合物に加えた。混合物を更に15
時間回転し、二層にしたチーズ布を通して濾過し、磁気
的に分離し、脱イオン水で上澄が澄明になるまで数回洗
浄した。得られた磁性粒子を脱イオン水で1.6に再懸
濁し、約11％の磁性金属酸化物含量と4.3μｍの平均サ
イズを有する2.5％w/vの懸濁液を得た。
実施例７ 実施例６に記述したように調製した磁性粒子、2.5％w
/vの1.6を、1gのドデシル硫酸ナトリウム、10gの過硫
酸カリウム、及びメタノール4ml中に0.98mlのウンデシ
レン酸及び0.02mlのジビニルベンゼンを含有する溶液を
加えることによって、カルボキシル化した。混合物を密
封した瓶内に加え、排気し、55℃のオーブン中において
約60rpmにて５時間回転した。得られたカルボキシル化
された磁性粒子を磁気的に分離し、脱イオン水で上澄が
澄明になるまで数回洗浄した。カルボキシル化された磁
性粒子を脱イオン水で680mlに再懸濁し、11％の磁性金
属酸化物含量と4.3μｍの平均サイズを有する5.8％w/v
の懸濁液を得た。
実施例８ 600mlの脱イオン水、6mlのスチレン及び実施例１に記
載したようして調製した8.6％w/vの磁性金属酸化物の80
mlを含む混合物を密封した瓶に加えた。瓶を排気し、55
℃のオーブン中にて約60rpmで１時間回転した。混合物
に12gの過硫酸カリウム及び850mlの4.78％w/v、6.1μｍ
ポリスチレン粒子を加えた。瓶を再密封し、排気し、５
時間回転し、そし6mlのスチレン及び10gの過硫酸カリウ
ムを混合物に加えた。混合物を更に15時間回転し、二層
にしたチーズ布を通して濾過し、磁気的に分離し、脱イ
オン水で上澄が澄明になるまで数回洗浄した。得られた
磁性粒子を脱イオン水で1.5に再懸濁し、そして1gの
ドデシル硫酸ナトリウム、10gの過硫酸カリウム、及び4
mlのメタノール中0.98mlのウンデシレン酸、及び0.02ml
のジビニルベンゼンを含有する溶液を加えることによっ
てカルボキシル化した。混合物を密封した瓶内に加え、
排気し、55℃のオーブン中において約60rpmにて５時間
回転した。得られたカルボキシル化された磁性粒子を磁
気的に分離し、脱イオン水で上澄が澄明になるまで数回
洗浄した。カルボキシル化された磁性粒子を脱イオン水
で680mlに再懸濁し、11.6％の磁性金属酸化物含量と、
6.8μｍの平均サイズを有する4.3％w/vの懸濁液を得
た。
実施例９ 600mlの脱イオン水、6mlのスチレン及び実施例１に記
載したようして調製した8.6％w/vの磁性金属酸化物の60
mlを含む混合物を三つ口丸底フラスコに加え、アルゴン
下67℃にて１時間撹拌した。混合物に12gの過硫酸カリ
ウム及び470mlの５％w/v、2.7μｍポリスチレン粒子を
加えた。混合物を67℃にて１時間撹拌し、そして30mlの
２％ドデシル硫酸ナトリウムを加えた。アルゴン67℃に
て更に５時間撹拌の後、6mlのスチレン及び6gの過硫酸
カリウムを混合物に加えた。アルゴン下混合物を67℃に
て更に15時間回転し、二層にしたチーズ布を通して濾過
し、磁気的に分離し、脱イオン水で上澄が澄明になるま
で数回洗浄した。得られた磁性粒子を脱イオン水で900m
lに再懸濁し、そして0.6gのドデシル硫酸ナトリウム、1
0gの過硫酸カリウム、及び2.4mlのメタノール中0.598ml
のウンデシレン酸、及び0.012mlのジビニルベンゼンを
含有する溶液を加えることによってカルボキシル化し
た。混合物を密封した瓶内に加え、排気し、55℃のオー
ブン中において約60rpmにて５時間回転した。得られた
カルボキシル化された磁性粒子を磁気的に分離し、脱イ
オン水で上澄が澄明になるまで数回洗浄した。カルボキ
シル化された磁性粒子を脱イオン水で500mlに再懸濁
し、14％の磁性金属酸化物含量と4.0μｍの平均サイズ
を有する6.5％w/vの懸濁液を得た。
実施例10 600mlの脱イオン水、6mlのスチレン及び実施例１に記
載したようして調製した8.6％w/vの磁性金属酸化物の60
mlを含む混合物を密封した瓶に加えた。瓶を排気し、55
℃のオーブン中にて約60rpmで１時間回転した。混合物
に12gの過硫酸カリウム及び470mlの５％w/v、2.7μｍポ
リスチレン粒子を加えた。瓶を再密封し、排気し、１時
間回転し、そして30mlの２％ドデシル硫酸ナトリウムを
加えた。更に５時間の後、6mlのスチレン及び10gの過硫
酸カリウムを混合物に加えた。混合物を更に15時間回転
し、二層にしたチーズ布を通して濾過し、磁気的に分離
し、脱イオン水で上澄が澄明になるまで数回洗浄した。
得られた磁性粒子を脱イオン水で500mlに再懸濁して約1
4％磁性金属酸化物含量と4.0μｍの平均サイズを有する
6.8％w/vの懸濁液を得た。
実施例11 180mlの脱イオン水、2mlのスチレン及び実施例１に記
載したようして調製した8.6％w/vの磁性金属酸化物の20
mlを含む混合物を密封した瓶に加えた。瓶を排気し、55
℃のオーブン中にて約60rpmで１時間回転した。混合物
に4gの過硫酸カリウム及び、実施例10に記載したように
して調製した160mlの6.8％w/vの磁性粒子（3.0μｍ、金
属酸化物含量14％）を加えた。瓶を再密封し、排気し、
１時間回転し、そして10mlの２％ドデシル硫酸ナトリウ
ムを加えた。更に５時間の後、2mlのスチレン及び2gの
過硫酸カリウムを混合物に加えた。混合物を更に15時間
回転し、二層にしたチーズ布を通して濾過し、磁気的に
分離し、脱イオン水で上澄が澄明になるまで数回洗浄し
た。得られた磁性粒子を脱イオン水で160mlに再懸濁し
て約19％の金属酸化物含量と4.2μｍの平均サイズを有
する7.78％w/vの懸濁液を得た。
実施例12 90mlの脱イオン水、1mlのスチレン及び実施例１に記
載したようして調製した8.6％w/vの磁性金属酸化物の10
mlを含む混合物を密封した瓶に加えた。瓶を排気し、55
℃のオーブン中にて約60rpmで１時間回転した。混合物
に1gの過硫酸カリウム及び、実施例11に記載したように
して調製した80mlの7.78％w/vの磁性粒子（3.2μｍ、金
属酸化物含量19％）を加えた。瓶を再密封し、排気し、
４時間回転し、そして5mlの２％ドデシル硫酸ナトリウ
ムを加えた。更に５時間の後、1mlのスチレン及び1gの
過硫酸カリウムを混合物に加えた。混合物を更に15時間
回転し、二層にしたチーズ布を通して濾過し、磁気的に
分離し、脱イオン水で上澄が澄明になるまで数回洗浄し
た。得られた磁性粒子を脱イオン水で160mlに再懸濁し
て約23％の金属酸化物含量と4.5μｍの平均サイズを有
する4.5％w/vの懸濁液を得た。
実施例13 400mlの脱イオン水、1.92mlのスチレン、0.08mlのジ
ビニルベンゼン、4gの過硫酸カリウム、20gの200−400
メッシュの４％ジビニルベンゼン架橋ポリスチレンビー
ズ及び、実施例１に記載したようにして調製した10mlの
8.6％w/vの磁性金属酸化物を含有する混合物を、密封し
た瓶内に加えた。瓶を排気し、55℃のオーブン内にて約
60rpmにて15時間回転した。混合物を沈降させ、上澄を
デカンテーションした。得られた磁性ビーズを脱イオン
水200ml中に再懸濁し、再度沈降させた。上澄が澄明と
なるまでこの工程を数回繰り返した。得られた磁性ビー
ズを脱イオン水200ml中に際懸濁し、0.1gのドデシル硫
酸ナトリウム、2.0gの過硫酸カリウム、0.48mlのスチレ
ン及び0.02mlのジビニルベンゼンを加えた。瓶を再密封
し、排気し、55℃のオーブン中にて約60rpmで１時間回
転し、そして、0.4mlのメタノール中0.098mlのウンデシ
レン酸と0.02mlのジビニルベンゼンを含有する溶液を加
えた。混合物を更に４時間回転し、前述のように重力に
よる沈降によって澄明化させた。濾過により水を除き、
カルボキシル化されたビーズを乾燥して、20gの200−40
0メッシュのカルボキシル化された磁性ビーズを得た。
実施例14 100mlの脱イオン水、0.5mlのスチレン、2gの過硫酸カ
リウム、75mlの５％w/vの4.0μｍポリスチレン粒子及
び、実施例４に記載したと同様にして調製した10mlの6.
88％w/v磁性金属酸化物を、密封した瓶内に加えた。瓶
を排気し、55℃のオーブン内にて約60rpmで15時間回転
した。混合物を、二層にしたチーズ布を通して濾過し、
磁気的に分離し、脱イオン水で上澄が澄明になるまで数
回洗浄した。得られた磁性粒子を脱イオン水で150mlに
再懸濁して、約14％の金属酸化物含量と4.3μｍの平均
サイズを有する2.5％w/vの懸濁液を得た。
実施例15 実施例４に記載されたと同様にして調製された20mlの
6.88％w/vの磁性金属酸化物を使用した以外は実施例４
に記載したと同じ手順を行い、約18％の金属酸化物含量
と4.3μｍの平均サイズを有する2.5％w/vの懸濁液160ml
を得た。
実施例16 2000mlの脱イオン水、13mlのスチレン及び実施例３に
記載したようにして調製した2.98％w/vの磁性金属酸化
物の550mlを含む混合物を密封した瓶に加えた。瓶を排
気し、55℃のオーブン中にて約60rpmで１時間回転し
た。混合物に20gの過硫酸カリウム及び950mlの10％w/
v、3.0μｍのポリスチレン粒子を加えた。瓶を再密封
し、排気し、１時間回転し、そして60mの２％ドデシル
硫酸ナトリウムを加えた。更に５時間の後、8mlのスチ
レン及び10gの過硫酸カリウムを混合物に加えた。混合
物を更に15時間回転し、二層にしたチーズ布を通して濾
過し、磁気的に分離し、脱イオン水で上澄が澄明になる
まで数回洗浄した。得られた磁性粒子を脱イオン水で30
00mlに再懸濁して約12％の磁性金属酸化物含量と3.2μ
ｍの平均サイズを有する3.38％w/vの懸濁液を得た。
実施例17 実施例16に記載のようにして精製した150mlの磁性粒
子（3.2μｍ、3.38％w/v、磁性金属酸化物含量12％）、
2mlの１％NP40、0.5mlのメタクリル酸メチル又はスチレ
ン、1gの過硫酸カリウム、及び21mlの官能基を有するモ
ノマーすなわちトリメチルアンモニウムエチルメタクリ
レートメトサルフェート（40％水性溶液）を含有する混
合物を、密封した瓶に加えた。瓶を55℃のオーブン中に
て約60rpmで４時間回転した。混合物を、二層にしたチ
ーズ布を通して濾過し、磁気的に分離し、脱イオン水で
上澄が澄明になるまで数回洗浄した。得られた磁性粒子
を脱イオン水で200mlで再懸濁して、トリメチルアンモ
ニウム官能基を表面上に有する磁性粒子の2.5％w/vの懸
濁液を得た。
実施例18 官能基を有するモノマーであるメタクリル酸２−アミ
ノエチルの1mlを使用した実施例17に記載したと同じ手
順を行い、アミノ基を表面上に有する磁性粒子の2.5％w
/vの懸濁液200mlを得た。
実施例19 官能基を有するモノマー、メタクリル酸２−ヒドロキ
シエチルの1mlを使用した以外は実施例17に記載したと
同じ手順を行い、ヒドロキシル基を表面上に有する磁性
粒子の2.5％w/vの懸濁液200mlを得た。
実施例20 モノマー、１−ビニル−２−ピロリジノンの1mlを使
用した以外は実施例17に記載したと同じ手順を行い、ポ
リビニルピロリジノンを表面上に有する磁性粒子の2.5
％w/vの懸濁液200mlを得た。
実施例21 官能基を有するモノマー、メチルプロペンスルホン酸
の1gを使用した以外は実施例17に記載したと同じ手順を
行い、スルホン酸基を表面上に有する磁性粒子の2.5％w
/vの懸濁液200mlを得た。
実施例22 官能基を有するモノマー、メタクリル酸ジメチルアミ
ノエチルの1mlを使用した以外は実施例17に記載したと
同じ手順を行い、ジメチルアミノ基を表面上に有する磁
性粒子の2.5％w/vの懸濁液200mlを得た。
実施例23 20mlの7.0％w/v、2.11μｍのポリスチレン粒子、実施
例５に記載したようにして調製した1.8％w/vの金属酸化
物の100ml、50mlの脱イオン水及び、7.5mlのスチレン中
に0.15gの過酸化ベンゾイルを含む溶液を含有する混合
物を、密封した瓶内にいれた。瓶を排気し、55℃のオー
ブン中にて約60rpmで15時間回転した。混合物を、二層
にしたチーズ布を通して濾過し、磁気的に分離し、脱イ
オン水で上澄が澄明になるまで数回洗浄した。得られた
磁性粒子を脱イオン水で200mlに再懸濁して約16.8％の
金属酸化物含量と3.6μｍの平均サイズを有する5.0％w/
vの懸濁液を得た。
実施例24 20mlの7.0％w/v、2.11μｍのポリスチレン粒子、実施
例５に記載したようにして調製した1.8％w/vの金属酸化
物の100ml、50mlの脱イオン水及び、6.75mlのスチレン
中に0.15gの過酸化ベンゾイルと0.75mlのジビニルベン
ゼンとを含む溶液を含有する混合物を、密封した瓶内に
いれた。瓶を排気し、55℃のオーブン中にて約60rpmで1
5時間回転した。混合物を、二層にしたチーズ布を通し
て濾過し、磁気的に分離し、脱イオン水で上澄が澄明に
なるまで数回洗浄した。得られた架橋された磁性粒子を
脱イオン水で200mlに再懸濁して約16.8％の金属酸化物
含量と3.6μｍの平均サイズを有する5.0％w/vの懸濁液
を得た。こうして調製された架橋磁性粒子は、サイズが
均一であり、アセトン、アセトニトリル及びジメチルホ
ルムアミドのような通常の有機溶媒に対して不活性であ
ることが判明した。
実施例25 20mlの7.0％w/v、2.11μｍのポリスチレン粒子、実施
例５に記載したようにして調製した1.8％w/vの金属酸化
物の150ml、50mlの脱イオン及び、6.75mlのスチレン中
に0.15gの過酸化ベンゾイルと0.75mlのジビニルベンゼ
ンとを含む溶液を含有する混合物を、密封した瓶内にい
れた。瓶を排気し、55℃のオーブン中にて約60rpmで15
時間回転した。混合物を、二層にしたチーズ布を通して
濾過し、磁気的に分離し、脱イオン水で上澄が澄明にな
るまで数回洗浄した。得られた架橋された磁性粒子を脱
イオン水で200mlに再懸濁して約23％の金属酸化物含量
と4.0μｍの平均サイズを有する5.4％w/vの懸濁液を得
た。こうして調製された架橋磁性粒子は、サイズが均一
であり、アセトン、アセトニトリル及びジメチルホルム
アミドのような通常の有機溶媒に対して不活性であるこ
とが判明した。
実施例26 15mlの9.16％w/v、3.2μｍのポリスチレン粒子、実施
例５に記載したようにして調製した1.8％w/vの金属酸化
物の100ml、55mlの脱イオン水及び、6.75mlのスチレン
中に0.15gの過酸化ベンゾイルと0.75mlのジビニルベン
ゼンとを含む溶液を含有する混合物を、密封した瓶内に
加えた。瓶を排気し、55℃のオーブン中にて約60rpmで1
5時間回転した。混合物を、二層にしたチーズ布を通し
て濾過し、磁気的に分離し、脱イオン水で上澄が澄明に
なるまで数回洗浄した。得られた架橋された磁性粒子を
脱イオン水で200mlに再懸濁して約16.8％の金属酸化物
含量と5.5μｍの平均サイズを有する4.7％w/vの懸濁液
を得た。こうして調製された架橋磁性粒子は、サイズが
均一であり、アセトン、アセトニトリル及びジメチルホ
ルムアミドのような通常の有機溶媒に対して不活性であ
ることが判明した。
実施例27 30mlの4.5％w/v、4.1μｍのポリスチレン粒子、実施
例５に記載したようにして調製した1.8％w/vの金属酸化
物の100ml、40mlの脱イオン水及び、6.75mlのスチレン
中に0.15gの過酸化ベンゾイルと0.75mlのジビニルベン
ゼンとを含む溶液を含有する混合物を、密封した瓶内に
加えた。瓶を排気し、55℃のオーブン中にて約60rpmで1
5時間回転した。混合物を、二層にしたチーズ布を通し
て濾過し、磁気的に分離し、脱イオン水で上澄が澄明に
なるまで数回洗浄した。得られた架橋された磁性粒子を
脱イオン水で200mlに再懸濁して約16.9％の金属酸化物
含量と6.7μｍの平均サイズを有する4.5％w/vの懸濁液
を得た。こうして調製された架橋磁性粒子は、サイズが
均一であり、アセトン、アセトニトリル及びジメチルホ
ルムアミドのような通常の有機溶媒に対して不活性であ
ることが判明した。
実施例28 20mlの7.0％w/v、2.11μｍのポリスチレン粒子、実施
例５に記載したようにして調製した1.8％w/vの金属酸化
物の100ml、50mlの脱イオン水及び、6mlのスチレン中に
0.15gの過酸化ベンゾイルと0.75mlのウンデシレニルア
ルコールと0.75mlのジビニルベンゼンとを含む溶液を含
有する混合物を、密封した瓶内に加えた。瓶を排気し、
55℃のオーブン中にて約60rpmで15時間回転した。混合
物を、二層にしたチーズ布を通して濾過し、磁気的に分
離し、脱イオン水で上澄が澄明になるまで数回洗浄し
た。得られた架橋された、ヒドロキシル基を有する磁性
粒子を濾過し乾燥して、16.8％の金属酸化物含量と3.9
μｍの平均サイズを有する9gの粉末を得た。こうして調
製された架橋された、ヒドロキシル基を有する磁性粒子
は、サイズが均一であり、アセトン、アセトニトリル及
びジメチルホルムアミドのような通常の有機溶媒に対し
て不活性であることが判明した。
磁性粒子への生物学的材料の結合 実施例29 80mlの瓶に、実施例７に記載したようにして調製した
30mlの4.3μｍ、5.0％w/vのカルボキシル磁性粒子を加
えた。粒子を磁気的に分離し、50mlのリン酸緩衝液（0.
1M、pH5.5）に再懸濁した。懸濁液に、20mgのウシ血清
アルブミン及び1090mgの１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−カルボジイミド（ECD）を加え
た。混合物を端から端へと室温にて２時間回転させそし
て磁気的に分離した。粒子を80mlのリン酸緩衝液で一回
洗浄し、リン酸緩衝食塩水（0.1M、pH7.0）で75mlに再
懸濁し、2.0％w/vの懸濁液を得た。
ウシ血清アルブミンを磁性粒子に受動的吸着によって
結合させるためには、EDCを使用しない以外は同じ手順
を行った。
実施例30 4mlのバイアルに、実施例７に記載したようにして調
製した1mlの4.3μｍ、5.0％w/vのカルボキシル磁性粒子
を加えた。粒子を磁気的に分離し、2mlのリン酸緩衝液
（0.1M、pH5.5）で１回洗浄し、同じ緩衝液で2mlに再懸
濁した。粒子懸濁液に、140mglの1.4mg/mlのヤギ（Gt）
抗マウス（Ms）IgG及び10mgの１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ECD）を
加えた。バイアルを端から端へと室温にて２時間混回転
させた。粒子を磁気的に分離し、2mlのリン酸緩衝液で
１回洗浄し、リン酸緩衝食塩水（0.1M、pH7.0）で2mlに
再懸濁し、2.5％w/vのヤギ抗マウスIgG被覆磁性粒子を
得た。他の種類の、モノクローナルな又はポリクローナ
ルな抗体もまた、同じ手順を用いてカルボキシル磁性粒
子に結合させることができよう。
ヤギ抗マウスIgG又は他の種類の抗体を磁性粒子に受
動的吸着によって結合させるためはに、EDCを使用しな
い以外は同じ手順を行った。
実施例31 4mlの瓶バイアルに、実施例29に記載したようにして
調製した2.5mlのウシ血清アルブミン被覆磁性粒子（4.3
μｍ、２％w/v）を加えた。粒子を磁気的に分離し、2ml
のリン酸緩衝液（0.1M、pH5.5）に再懸濁した。混合物
に、10μのマウス抗Ｂ赤血球表面抗原（20mg/ml）及
び1mgの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミドを加えた。混合物を端から端へと
室温にて２時間回転させた。粒子を磁気的に分離し、リ
ン酸緩衝液で１回洗浄し、リン酸緩衝食塩水（0.1M、pH
7.0）で2mlに再懸濁し、2.5％w/vの懸濁液を得た。
実施例32 40μのマウス抗Ａ赤血球表面抗原（5mg/ml）を使用
した以外は実施例31に記載した手順を行い、2mlの2.5％
w/vの懸濁液を得た。
磁性粒子を使用した血液型判定 実施例23 Ａと表示した5mm×65mmの試験管に、実施例32に記載
したようにして調製した25μの2.5％w/vのマウス抗Ａ
被覆磁性粒子を加えた。Ｂと表示した他の試験管に、実
施例31に記載したようにして調製した25μの2.5％w/v
のマウス抗Ｂ被覆磁性粒子を加えた。双方の試験管に、
パック赤血球を等張緩衝食塩水で1/100に希釈すること
によって調製した50μの１％のパック赤血球を加え
た。指で軽くたたくことによって試験管を振り、磁石の
上に置いた。結果は以下に要約した。
血液型 Ａ Ｂ Ｏ AB 試験管Ａ ＋ − − ＋ 試験管Ｂ − ＋ − ＋ ここに、＋は陽性反応を表し、対応する抗体被覆磁性
粒子によって赤血球が膠着し、結果として磁気分離の後
に試験管中の上澄が澄明になったことを意味する。他
方、陰性反応の上澄は、赤血球と抗体被覆磁性粒子との
間の膠着がないため、磁気分離の後も濁ったままであ
る。
磁性粒子を使用したイムノアッセイ 実施例34 2mlのミクロ遠心管内に1mlの６％w/vの３μｍカルボ
キシル磁性粒子を加えた。粒子を10000rpmで３分間遠心
した。上澄を吸引し、粒子は酢酸緩衝液中の５乃至100
μ/mlの組換えHBcAgの1mlの撹拌することにより再懸
濁させた。管を室温にて２時間回転させ、前述のように
遠心した。上澄を吸引し、粒子は酢酸緩衝剤及び２乃至
10％の正常動物血清を含有する保護被覆溶液の1ml中に
再懸濁させた。管を室温にて２乃至16時間回転させ、前
述のように遠心した。上澄を吸引し、粒子は、遠心及び
再懸濁により1mlの等張緩衝食塩水（IBS）で３回洗浄し
た。最後に、粒子を1mlのIBSに再懸濁させ、２乃至８℃
に貯蔵した。
実施例35 96ウェルのミクロタイタープレートの最初の２列に、
実施例34に記載したようにして調製した0.25％w/vのＢ
型肝炎コア抗原（HBcAg）被覆磁性粒子20μを加え
た。サンプル調製は、HBcAb陽性血清の陰性血漿中への
種々の希釈、次いで各サンプルの標本希釈緩衝液（SD
B）中への1:100希釈より構成された。SDBは、リン酸緩
衝液、蛋白質安定化剤、界面活性剤及び抗菌剤を含ん
だ。粒子を含有するウェルに、50μの各最終希釈サン
プルを加えた。37℃における30分間のインキュベーショ
ンの後、磁気分離機上で粒子を２分間分離し、塩類及び
界面活性剤を含有する200μの洗浄緩衝液で３回洗浄
した。粒子を含有する各ウェルに、塩類、蛋白質安定化
剤、グリセロール、界面活性剤及び抗菌剤を含有する希
釈剤中のヤギ抗ヒトIgG−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ接
合体（0.5μg/ml）の50μを加えた。37℃にて15分間
インキュベーションした後、上述のように粒子を分離し
て３回洗浄し、そして30μのIBSに再懸濁させた。粒
子を黒色ミクロタイタープレート（Dynatech）の最初の
２列に移し替えた。粒子を含有する各ウェルに、４−メ
チルウンベリフェリル−β−ガラクトピラシド（MUG,Si
gma）を含有する溶液100μを加えた。プレートを37℃
にてインキュベートし、365nmの励起及び450nmの放射フ
ィルターを備えたFluorescence Concentration Analyze
r（FCA,Pandex）を用い、５分間隔で10倍利得に設定し
て、蛍光強度を測定した。５分間隔での蛍光強度の増大
は任意蛍光単位（AFU）で記録し、表１に示した。
表１ 陽性標本の希釈 AFU（５分） ２個のウェルの平均 1:100 22687 1:1000 5933 1:5000 1516 1:8000 835 1:10000 639 1:15000 495 1:20000 427 1:25000 307 実施例36 マウス抗HBsAgのカルボキシル磁性粒子への結合実施
例30と同様であった。
96ウェルの黒色ミクロタイタープレート（Dynatech）
に、実施例34に記載したようにして調製した0.25％w/
v、3.2μｍのマウス抗HBsAg被覆カルボキシル磁性粒子
の20μを２検体ずつ加えた。磁性粒子を含有するウェ
ルに、種々の量のHBsAgを含有する血漿又はHBsAg陰性血
漿100μをそのまま加えた。37℃における30分間のイ
ンキュベーションの後、磁気分離機上で粒子を２分間分
離し、塩類及び界面活性剤を含有する100μの洗浄緩
衝液で１回洗浄した。粒子を含有する各ウェルに、塩
類、蛋白質安定剤、グリセロース、界面活性剤及び抗菌
剤を含有する希釈剤のマウス抗HBsAg−β−ガラクトシ
ダーゼ接合体（0.5μg/ml）の20μを加えた。37℃に
て15分間インキュベーションした後、上述のように粒子
を分離して５回洗浄した。粒子を含有する各ウェルに、
４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド（MUG,Sigma）を含有する溶液50μを加えた。プ
レートを37℃にてインキュベートし、365nmの励起及び4
50nmの放射フィルターを備えたFluorescence Concentra
tion Analyzer（FCA,Pandex）を用、５分間隔で10倍利
得に設定して、蛍光強度を測定した。５分間隔で蛍光強
度の増大は任意蛍光単位（AFU）で記録し、表２に示し
た。
表２ HBsAg濃度 AFU（５分） （ng） ２個のウェルの平均 1.0 1149 0.5 455 0.25 218 0.125 118 陰性 14 実施例37 HTLV−III B/H−９細胞（Gallo Strain）からのHIV−
１抗原を、3.6μｍカルボキシル磁性粒子に実施例34に
記載したと類似の手順により結合させた。
96ウェルのミクロタイタープレートに、0.25％w/vのH
IV被覆磁性粒子の20μを２検体ずつ加えた。粒子を含
有するウェルに、リン酸緩衝剤、蛋白質算定化剤、界面
活性剤及び抗菌剤を含有する標本希釈緩衝液（SDB）で
1:100に希釈した、陽性、ボーダーライン及び陰性の標
本50μを加えた。37℃における30分間のインキュベー
ションの後、磁気分離機上で粒子を２分間分離し、塩類
及び界面活性剤を含有する100μの洗浄緩衝液で３回
洗浄した。粒子を含有する各ウェルに、塩類、蛋白質安
定化剤、グリセロール、界面活性剤及び抗菌剤を含有す
る希釈剤中のヤギ抗ヒトβ−ガラクトシダーゼ（約0.5
μg/ml）接合体の50μを加えた。37℃にて15分間イン
キュベーションした後、上述のように粒子を４回洗浄し
た。粒子を黒色のミクロタイタープレート（Dynatech）
に移し替えた。粒子を含有する各ウェルに、４−メチル
ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（MUG,
Sigma）を含有する溶液100μを加えた。プレートを37
℃にてインキュベートし、365nmの励起及び450nmの放射
フィルターを備えたFluorescence Concentration Analy
zer（FCA,Pandex）を用い、５分間隔で25倍利得に設定
して、蛍光強度を測定した。５分間隔での蛍光強度の増
大は任意蛍光単位（AFU）で記録し、表３に示した。
表３ 抗HIV標本 AFU（５分） ２個のウェルの平均 陽性対照 9462 ボーダーライン標本 527 陰性対照 86 磁性粒子を使用した細胞分離 実施例38 実施例７に記述したようにして調製した4.3μｍのカ
ルボキシル磁性粒子をリン酸緩衝食塩水（PBS、pH7.7）
中で洗浄し超音波処理し、70％エタノールで10分間滅菌
し、PBSで３回洗浄し、アフィニティー精製した0.5mg/m
lそして3.3mg/100mg粒子の比率のヒツジ抗マウスイムノ
グロブリン抗体（SAM）と共に４℃にてインキュベート
した。使用前に、該抗体被覆磁性粒子をPBSで洗浄し、P
BSに所望の濃度に再懸濁させた。
ヒト組織培養cALLa陽性NALM−16白血病細胞を洗浄しP
BSに懸濁させた。一つの画分は抗体で処理しなかった
（−MoAb）。他の画分は２つの抗CD10及び１つのCD9モ
ノクローナル抗体で（＋MoAb）４℃にて30分間処理し、
PBS中で洗浄し、PBSで3.5×106個/mlに調製した。、一
方は抗体処理細胞を（＋MoAb）含み、他方は無処理細胞
（−MoAb）を含むものである２本の管に、SAM被覆磁性
粒子を、粒子の開始時細胞に対する比率を45として加え
た。管を４℃にて30分間回転させた。粒子を磁気分離機
で分離した。上澄を収集し、残存細胞を収集するために
遠心した。ペレットを100μのトリパンブルー中に再
懸濁させ、層細胞数をカウントした。結果を表４に示し
た。
実施例39 本発明の常磁性粒子を市販の粒子と次の通りに比較し
た。
Pfalts ＆ Bauer,第一鉄第二鉄酸化物懸濁液 平均サイズ:2μｍ未満、pH7; Pfalts ＆ Bauer,第一鉄第二鉄酸化物懸濁液 平均サイズ:2μｍ未満、pH11; Ferro Fluides,鉄酸化物懸濁液 平均サイズ:1μｍ未満。
64mlの脱イオン水、32mlの3.0％w/v磁性金属酸化物、
及び1.0mlのスチレンを含有する混合物を、密封した瓶
中に加えた。瓶を排気し、60℃のオーブン中にて約60rp
mで１時間回転した。混合物に47mlの10％の４μｍポリ
スチレン粒子及び2.0gの過硫酸カリウムを加えた。瓶を
再密封し、排気しそして60℃のオーブン中で１時間回転
し、その後、5.0mlの２％ドデシル硫酸ナトリウムを加
えた。更に５時間の後、1.0mlのスチレン及び1.0gの過
硫酸カリウムを加えた。混合物を更に15時間回転し、二
層にしたチーズ布を通して濾過し、そして顕微鏡下に検
査した。
全ての場合において、粒子は、我々のアルカリ沈殿法
に従って作られた磁性鉄酸化物粒子を利用した対照に比
し、コア粒子に貧弱に被覆していた。また市販粒子の実
質的な凝集もあった。この実験に従って調製された粒子
の光学顕微鏡写真が下に添付されている。図3a乃至3c
は、上に挙げた３つのタイプの開始時の材料（上から順
にＡ乃至Ｃ）に対応している。
実施例40 この実験においては、本工程の反応産物が、コア粒子
の存在及び不存在において比較された。コア粒子を一つ
の反応において省略した他は、実施例39で用いたのと同
じの手順を行った。
対照（コア粒子を備える）は、図4aの顕微鏡写真に示
したように、卓越した被覆粒子を与えた。コア粒子なし
で作られたサンプルは、非常な凝集を示し（図4b）、ス
チレンが粒子相内に容易に移動することを示している。
この結果はまた、コア粒子への磁性鉄酸化物粒子の接着
が、凝集が効果的に防止されるに十分に速く起こるとい
点において粒子の被覆が必須の一段階であることを示唆
している。これらは、かなりな量の凝集の蓄積を伴った
競合反応であることが通常予想される。従って、90％の
磁性粒子が凝集することなく被覆していることは驚くべ
きことである。
実施例41 この実験においては、磁性粒子を作り出すために加え
ることのできるスチレン量の除外限界を試験した。我々
は約2.8μｍのコア粒子を約４μｍのものへと拡大する
ために必要なスチレン量を計算した。
27mlの2.5％w/v金属酸化物、40mlの10％の2.8μｍポ
リスチレン粒子、10.8mlのスチレン、0.96gの過硫酸カ
リウム及び74mlの脱イオン水を含有する混合物を、密封
した瓶中に加えた。瓶を排気し60℃のオーブン中で60rp
mにて16時間回転し、そして光学顕微鏡下に検査した。
結果は、過剰のスチレンの使用は、１μｍ未満のサイ
ズのポリスチレン粒子の乳白色の懸濁液からの単一の大
きい塊への大規模な凝集を引き起こし、重量比パラメー
ターが、第一鉄第二金属酸化物を用いて適当な被覆を得
る上で重要であることを示している。これらの結果はま
た、コア粒子の使用が、磁性材料の均一な沈着に必須で
あり、全部磁性材料から構成されているものまたは磁性
材料が完全に分散しているものに比べて、潜在的に低い
密度を有する粒子が偶発的にしか産生されないことを示
している。
実施例42 この実験においては、親油性の磁性的酸化物粒子が、
先ず、アルカリ沈殿によって作られた我々の粒子及び商
業的入手限より得た粒子の双方を利用して調製された。
標準的被覆手順が次いで、コア粒子の存在下に実施され
た。
14mlの20％w/vの水性オレイン酸カリウム溶液を、3.4
gの各鉄酸化物粒子を含有する水34mlに加えた。得られ
た混合物を90℃にて30分間撹拌した。混合物を冷却の
後、0.5N塩酸でpHを６に調製した。集合した粒子を磁気
分離機上で分離することによって収集し、80℃の水の各
10mlで２回洗浄し、続いてエタノールの各10mlで２回洗
浄し、減圧下に乾燥した。
そのようにして調製された金属酸化物を使用して、0.
96gの親油性粒子を1mlのスチレン中に分散させた。この
分散溶液に、64mlの脱イオン水を加えた。分散を補助す
るため混合物を10分間超音波処理し、そして瓶を密封し
た。手順の残り部分は実施例39と同じである。
アルカリ沈殿材料から誘導された該親油性粒子を利用
して、少量の被覆が観察された。しかしながら、コア粒
子のかなりの凝集並びに相当量の凝集した磁性金属酸化
物粒子も見られた。親油性市販鉄酸化物粒子の場合に
は、金属酸化物の塊への凝集及びコア粒子の凝集が見ら
れた。この結果は、磁性粒子が有機相モノマーと適合性
にされたときには本方法が機能しないということを示し
ている。
実施例43 この実験は、ポリスチレン粒子、本方法によって作ら
れた酸化鉄を含有する凸凹のある外側層を有するポリス
チレン粒子、及び本酸化鉄を含有する平滑な外側層を有
するポリスチレン粒子に対する、ペプチド抗原（アビジ
ン）の受動的吸着の量を比較する。粒子はいずれも同じ
最終直径に作られた。
10mlの2.5％w/vの各タイプの粒子を2000rpm、10分間
の遠心によってペレット化した。上澄を除去し、ペレッ
トを10mlの0.1mlの0.1Mリン酸緩衝液、pH5.5に再懸濁さ
せた。粒子を再ペレット化し、そして上澄を除いた。
凍結乾燥したアビジンを、0.5mg/mlの濃度に0.1Mのリ
ン酸緩衝液、pH5.5に懸濁させた。このペプチド溶液の4
mlを、次いで各粒子ペレットに移した。粒子をペプチド
溶液中で再懸濁させ、室温にて12時間転がした。受動的
に吸着されたアビジン被覆粒子を、次いで2000rpmでペ
レット化した。上澄を注意深く収集した。粒子を更に２
回洗浄し、各上澄を最初の液に加えた。次いで上澄を0.
2nmのフィルターで濾過し、光学密度を測定した。結果
は次の通りであった。
光学密度 素ポリスチレン粒子 0.6103 平滑ポリスチレン粒子 0.4717 凸凹ポリスチレン粒子 0.4380 0.5％アビジン対照 0.7103 データは、コア粒子表面に重合した、無定形の鉄酸化
物析出物によって一つに結合された小さい結晶よりなる
酸化鉄が埋め込まれているものであるポリスチレンの外
層を含む凸凹及び平滑な表面のいずれの粒子も、同じサ
イズの素ポリスチレン粒子に比して高度のペプチド吸着
を示した。
酸化鉄の完全な埋め込みを保証するために十分なモノ
マーによってなされた、粗い粒子の被覆と実質的に同一
の平滑な粒子の被覆は、この一層大きい能力が、主とし
て表面積又表面のトポロジーによるものではないことを
示唆している。出願人はこの現象については説明できな
い。

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】常磁性微粒子であって、 直径１乃至100μｍの内部の非蛍光性ポリマーコア粒
    子、及び 該コア粒子の表面において重合した外側のポリマー層よ
    りなり、該層が無定形の金属酸化物析出物によって約1.
    0μｍ以下の不均一なサイズの集団へ凝集した金属酸化
    物結晶を含有するものである、微粒子。
  2. 【請求項２】前記ポリマーコア粒子及び外側のポリマー
    層がポリスチレンである、請求項１に記載の微粒子。
  3. 【請求項３】無定形金属酸化物析出物が凝集した金属酸
    化結晶よりなる前記集団が、二価及び三価の遷移金属塩
    の、二価塩の三価に対するモル比0.5乃至2.0の混合物を
    含有する水性溶液を、アルカリ性条件下に加熱して沈殿
    を生成させ、該集団を洗浄し、金属酸化物結晶の凝塊を
    粉砕し、そして１μｍ未満の小さい粒子を収集すること
    によって製造されるものである、請求項１に記載の微粒
    子。
  4. 【請求項４】分析対象の存在又は濃度を決定するための
    方法であって、該分析対象に特異的なリガンドで請求項
    １の微粒子を被覆し、該被覆された微粒子を該分析対象
    を含有する水性溶液と接触させ、 該溶液をインキュベートし、 前記微粒子を該溶液から分離し、 前記分析対象に特異的な第２の標識されたリガンドを水
    性溶液中に含まれた該微粒子に加えて該微粒子を懸濁さ
    せ、 該溶液をインキュベートし、 前記微粒子を該溶液から分離し、 該微粒子に関連した標識されたリガンドの量を測定する
    ことによりなるものである方法。
  5. 【請求項５】該酸標的分子中の特異的核酸配列の存在又
    は濃度を決定するための方法であって、 請求項１の微粒子に該標的分子の該核酸配列に相補的な
    核酸を取り付け、 該微粒子を該相補的核酸を含んだ液体標本と接触させて
    懸濁液を形成させ、 該懸濁液をハイブリダイゼーション条件下にハイブリダ
    イゼーションを許容するに十分な時間インキュベート
    し、 前記微粒子を該懸濁液から分離し、 該微粒子に取り付けられている核酸の配列とは異なる配
    列を有する、前記標的に相補的な第２の標識された核酸
    を加え、 該懸濁液をハイブリダイゼーション条件下にハイブリダ
    イゼーションを許容するに十分な時間インキュベート
    し、 前記微粒子を前記溶液から分離し、 該微粒子上の二重鎖部分の形成を前記標識を測定するこ
    とによって検出することよりなるものである方法。
  6. 【請求項６】望まない生物物質を除去するための方法で
    あって、 該生物物質に特異的なリガンドを請求項１の微粒子に被
    覆し、 該微粒子を該生物物質を含有する溶液と接触させて懸濁
    液を形成させ、 該生物物質が前記リガンドと反応するまで該懸濁液をイ
    ンキュベートし、そして 前記微粒子を該懸濁液から分離することよりなるもので
    ある方法。
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