JP2761513B2 - 組換え繊維芽細胞成長因子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は、組織治癒の際に、
循環系を形成するために重要な成長因子の組換え生産に
関する。特に、本発明は、ウシおよびヒトの、塩基性お
よび酸性の繊維芽細胞成長因子（FGF)をコードする遺伝
子をクローニングし、そして発現させる。 【０００２】 【従来の技術】組織が創傷または火傷のような外傷を受
けた場合の修復過程は極めて複雑であるが、多数のタン
パク因子により仲介されることが知られている。これら
の因子は、破壊された組織を置換するように働く細胞の
増殖および分化に必須である。数多くの候補となる因子
は、脳、脳下垂体、および視床下部などのいろいろな組
織の抽出物が培養細胞系の有糸分裂を促進する能力を基
準として同定されている。多数の短縮名がこれらの抽出
物中の活性因子に与えられている。これらの活性因子に
は、血小板由来成長因子（PDGF）、マクロファージ由来
成長因子（MDGF）、表皮成長因子（EGF)、腫瘍脈管形成
因子（TAF)、内皮細胞成長因子（ECGF）、繊維芽細胞成
長因子（FGF)、視床下部由来成長因子（HDGF）、網膜由
来成長因子（RDGF）、およびヘパリン結合成長因子（HG
F)が含まれる。（例えば、Hunt, T.K., J Trauma (198
4) 24 : S39-S49 ; Lobb,R.R., et al, Biochemistry
(1984)23 : 6295-6299を参照）。 【０００３】Folkman, J.,ら，Science (1983) 221 : 7
19-725は、創傷治癒に関与する過程の１つ、すなわち血
管の形成は、腫瘍においてヘパリンにより強く影響され
ることを報告した。このことおよび他の研究から、ヘパ
リンが、多数のこのような成長因子活性に関連するタン
パクに対して特異的に結合することは明らかである。従
って、ヘパリンが精製手段として用いられてきた。ヘパ
リンが正および負に荷電した両方の因子に結合すること
から、成長因子のヘパリンに対する親和性は、全体のイ
オン電荷に無関係であることが示されている（Maciag,
T., et al, Science (1984) 225 : 932-935 ; Shing,
Y., et al, Science (1984) 223 : 1296-1299 ; Klagsb
run, M., et al, Proc Natl Acad Sci (USA) (1985) 82
: 805-809）。ヘパリンに対する結合能力または非結合
能力は、いろいろな抽出物における活性を区別する１つ
の尺度である。例えば、EGFおよびPDGFはヘパリンに強
く結合しない；実際には、EGFはヘパリンに全く結合し
ない。上述の他の因子は強いヘパリン結合性を示す。し
かしながら、酸性の脳FGF、ECGF、RDGFおよびHGF-α
は、実際には、同一因子であると考えられている。同様
に、脳下垂体FGF、陽イオン性の脳FGF、TAFおよびHGF-
βも同一タンパクであると考えられている（Lobb, R.
R., et al,（前出））。ヘパリン親和性を用いて精製さ
れた13の内皮成長因子の要約および比較が、Lobb, R.,
ら，J BiolChem (1986) 261 : 1924-1928に示されてい
る。 【０００４】ヘパリン−アフィニティークロマトグラフ
ィーを用いて、毛細血管内皮に対して強い有糸分裂活性
を示す塩基性の繊維芽細胞成長因子が、ラットの軟骨肉
腫（Shing, Y., et al, 前出）およびウシの軟骨（Sull
ivan, R., et al, J Biol Chem(1985) 260 : 2399-240
3）から単離されている。Thomas, K.A.,ら，Proc NatlA
cad Sci (USA) (1984) 81 : 357-361, 米国特許第4,44
4,760号は、16,600および16,800ダルトンの分子量を有
する酸性のウシの脳繊維芽細胞成長因子の２つの異種型
を精製した。Gospodarowiczおよび協同研究者らは、ウ
シの脳および脳下垂体の両方に塩基性の繊維芽細胞成長
因子活性が存在することを示し、そしてヘパリン−アフ
ィニティークロマトグラフィーを他の精製技術と組合せ
て、これらのタンパクを精製した（Bohlen, P., et al,
Proc Natl AcadSci (USA) (1984)81 : 5364-5368 ; Go
spodarowicz, D., et al,（同）6963-6967)。これらの
因子の分子量も、ヒトの胎盤から単離された同様の因子
の分子量のように約16kdである（Gospodarowicz, D., e
t al, Biochem Biophys Res Comm(1985) 128：554-56
2）。 【０００５】ウシの脳下垂体由来の塩基性FGFに対する
完全な配列が決定されている（Esch,F., et al, Proc N
atl Acad Sci (USA)(1985) 82 : 6507-6511）。均一な
調製物が得られ、そして内皮細胞を用いたインビトロ分
析で強い有糸分裂活性を示した（塩基性FGFは、60pg／m
lのED₅₀を有する）。 【０００６】酸性FGFは、約6,000pg／mlのED₅₀を有す
る。ウシの脳組織由来の酸性FGFのＮ末端配列は、Bohle
n, P.,ら，EMBO J (1985) 4 : 1951-1956により決定さ
れた。Gimenez-Gallego,G,らは、ヒトの脳から調製され
た酸性FGFおよび塩基性FGF両方のＮ末端配列を決定し、
そしてそれらをウシのFGFの配列と比較した（Biochem B
iophys Res Comm (1986) 135 : 541-548)。彼らの結果
は、ここに開示された結果と一致している。また、ウシ
の脳由来の酸性FGFの全アミノ酸配列が、単離されたタ
ンパクから決定された（Gimenez-Gallego, G, et al, S
cience (1985) 230 : 1385-1388 ; Esch, F, et al, Bi
ochemBiophys Res Comm (1985) 133 : 554-562)。これ
ら２つの決定は、１つのアミノ酸を除いて一致してい
る。ここでの多くの研究の後に、ヒトの酸性FGFの全ア
ミノ酸配列が、その遺伝子から推定された（Jaye, M.,
et al,印刷中）。 【０００７】上述のFGFタンパクおよび他の成長因子
は、外傷を受けた組織の治癒を促進する際、明らかに有
効である（例えば、Sporn,M.B., et al, Science (198
3) 219：1329-1331 ; Davidson, J.M., et al, J.C.B.
(1985) 100 : 1219-1227 ; Thomas, K.A., et al, Proc
Natl Acad Sci (USA) (1985) 82 : 6409-6413を参
照）。Davidsonら（前出）は、特に創傷治癒におけるFG
Fの有効性を開示している。塩基性FGFの天然タンパク
は、心筋梗塞の治療に有用であると言われている（Svet
-Moldavsky, G.J., et al, Lancet (1977年４月23日）9
13 ; 米国特許第4,296,100号および第4,378,347号）。
さらに、ヒトの塩基性FGFが、ラット胎児の海馬体神経
細胞における神経細胞の生存および神経突起の伸長を増
大させることが見出されている（Walicke, P., et al,
Proc Natl Acad Sci (USA)(1986) 83:3012-3016）。こ
のことは、この因子がアルツハイマー病およびパーキン
ソン病のような退化神経学的疾病の治療にも有用であり
得ることを示唆している。 【０００８】 【発明が解決しようとする課題】従って、これらのFGF
タンパクを大量に、かついかなる毒性不純物あるいは感
染性不純物を含まない形で利用し得ることを保証するこ
とが望ましい。治療に用いるには、このタンパクのヒト
型のものが好ましく、そして恐らく必要とされる。純粋
な調製物を得るには約35,000倍に精製しなければならな
いので、天然のヒト起源のものを用いることは、明らか
に実用的ではない。たとえヒトの死体が実用的な起源で
あるとしても、エイズ、肝炎あるいは他の病気の伝染の
可能性があるため完全な精製は、困難である。最近のク
ロイツフェルト−ヤコブ症候群（Powell-Jackson et a
l, Lancet (1985) ii :244-246)の経験からヒトの脳下
垂体を起源として用いることはできない。従って、組換
え技術は、特にこれらのタンパクの生産への応用に適し
ている。本発明は、ここに酸性FGFおよび塩基性FGFを実
用的な量で、かつ純粋であって、汚染されていない形で
得る方法を与える。 【０００９】本発明は、創傷、骨折、火傷組織、創傷心
筋組織、退化神経組織または他の外傷の治癒を効果的に
促進させるのに有用な繊維芽細胞成長因子の合成および
操作の手段を与える。これらの因子をコードする遺伝子
のクローニングおよび発現は、本発明の方法および材料
によって与えられる。 【００１０】ある様相において、本発明は、ウシおよび
ヒトの、酸性および塩基性のFGF（酸性bFGF、酸性hFG
F、塩基性BFGFおよび塩基性hFGF）をコードする組換えD
NA配列に関する。特に、これらはヒトまたはウシのゲノ
ム配列を包含する。他の様相において、本発明は、これ
らのDNA配列を有する組換えベクター、このようなベク
ターを用いて形質転換され、そしてこれらのDNA配列を
保持する宿主細胞、およびこれらの形質転換された細胞
により生産される組換えタンパクに関する。他の様相に
おいて、本発明は、組換え技術を用いたこれらの繊維芽
細胞成長因子の生産方法に関する。 【００１１】 【課題を解決するための手段】 Ａ．繊維芽細胞成長因子 ２つの異なったウシ（および類似のヒト）繊維芽細胞成
長因子は、他の人々により均一にまで精製され、そして
部分的にあるいは完全に配列決定されている。両因子
は、ウシの脳および副腎皮質由来の毛細血管内皮細胞、
ヒトの臍静脈内皮細胞、ウシの副腎皮質細胞、顆粒膜細
胞および脈管平滑筋細胞などの培養細胞を用いたインビ
トロ分析において有糸分裂活性を示す。これらの細胞培
養を用いるインビトロ分析は、Gospodarowicz, D.,ら，
J Cell Physiol (1985) 122 : 323-332 ; およびGospod
arowicz, D.,ら，J Cell Biol (1983) 97 : 1677-1685
によって述べられている。ごく最近、別のインビトロ分
析が、Eschら，Proc Natl Acad Sci (USA)(1985) 82 :
6507-6511; およびGospodarowicz, D.,ら，J Cell Phys
iol(1986) 127 : 121-136により報告された。精製され
た塩基性bFGFは、ニワトリの漿尿膜分析においてインビ
ボで脈管形成能があることが示されている（Gospodarow
icz, D. ホルモン性タンパクおよびペプチドXII : 205-
230(アカデミックプレス））。精製された酸性bFGFは、
同じ分析においてインビボで脈管形成能があることが示
されている（Thomas, K.A., et al, Proc Natl Acad Sc
i（前出））。 【００１２】ウシの脳下垂体の塩基性FGFは、完全に配
列決定されており、それを第７図に示す；ゲノムおよび
cDNAからここで決定されたヒトのFGFの配列を第８図に
示す。一次配列は、146個のアミノ酸を含んでおり、図
中の“１”番のプロリン残基で始まっている。この一次
配列は、Giminez-Gallegoら，Biochem Biophys Res Com
m（前出）により報告された、天然のウシのタンパクの
Ｎ末端配列、およびEsch,Proc Natl Acad Sci（前出）
により報告された天然タンパクの全配列と一致してい
る。より大きな分子量を有するヒトの塩基性FGFは、ヒ
トの肝細胞系列、SK-Hep-1について、Sullivan, R.J.
ら，J CellBiol (1985) 101 : 108a; およびKlagsbrun,
M.ら，Proc Natl Acad Sci (USA) (1986) 83 : 2448-2
452、により報告されている。ヒトおよびウシのDNAにお
いて、第７図および第８図の上流側配列を元のATG開始
コドンまで翻訳することは、第７図および第８図におい
て残基１で示されるプロリンの上流側のアミノ酸を含
む、各タンパクの別の型のものも生産され得ることを示
す。これらのDNAには、ATGを含め９つの上流側コドンが
存在する。遺伝子が真核系で発現する場合、ATGにより
コードされるメチオニンが、プロセッシングを受けるこ
とはかなり確かである。遺伝子が組換えによって細菌系
で発現する場合、このようなプロセッシングは、起こり
得る場合も、起こり得ない場合もある。従って、タンパ
クの長い型のものは、さらに８つのアミノ酸プロ−配列
または合計154個のアミノ酸を含む。SK-HEP-1細胞から
単離された、この伸長したFGFは、そのＮ末端がブロッ
クされていることも示されている（Klagsbrun, M., et
al,(前出））。 【００１３】上述のインビトロ分析においてFGF活性を
有し、そして第７図（146個のアミノ酸型）に示されて
いるウシの脳下垂体の塩基性FGFと類似していると推定
されるＮ末端配列を有するタンパクも、ウシの脳、副
腎、黄体、網膜、腎臓、およびヒトの胎盤から単離され
ている。これらの組織のあるものから得られた天然のタ
ンパクは、不均一である--推定される15個のＮ末端アミ
ノ酸を欠く第２の型は、活性を保持している（Gospodar
owicz, D., Meth Enz (1986), 印刷中）。従って、ウシ
およびヒトの塩基性FGFは、３つの型が存在する--これ
らは第７図および第８図に成熟型として示されている。
ここに示されている推定の成熟型配列のうち、長い型は
Ｎ末端にさらに８個のアミノ酸を含んでおり、短い型は
15個のアミノ酸を欠いている。従って、天然で生産され
る“長い（long)"塩基性FGFは、154個のアミノ酸を含
み、“基本型（primary)”塩基性FGFは、146個のアミノ
酸を含み、そして“短い（short)”塩基性FGFは、131個
のアミノ酸を含んでいると考えられている。これらのFG
Fは、非常に多くの塩基性アミノ酸残基（リジン、アル
ギニン、ヒスチジン）を含んでおり、従って中性pHの下
で陽イオン性であるので、“塩基性”FGFと呼ばれる。 【００１４】あるタンパクが前述の分析でFGF活性を有
し、ヘパリンに結合し、中性pHの下で陽イオンであり、
そしてウシの血清アルブミン（もし適当なら）、あるい
はウシ（またはヒト）のFGFもしくはそれの合成ペプチ
ドまたは天然ペプチドに対する他の抗体に結合した、ア
ミノ末端配列〔tyr¹⁰〕FGF（1-10）の合成類似体を用い
て調製された抗体と免疫的に反応する場合、このタンパ
クをここでは塩基性FGFと定義する。Baird,A.ら，Regul
atory Peptides (1985) 10 : 309-317を参照されたい。 【００１５】酸性FGFは、他の人々によりウシの脳から
単離され、そして始めの34個のアミノ酸残基が決定され
ている。ウシおよびヒトの酸性FGFに対する、ここでの
遺伝子のクローニングにより、酸性bFGFに対してアミノ
酸配列１−34に付加的なアミノ酸配列が第１図に示した
ように推定され、そして第３図に示されるように、酸性
hFGFの部分配列が得られた。以下に記述される多くの研
究により、酸性bFGFに対する完全なアミノ酸配列が、第
２図に示すように、Eschら, Biochem BiophysRes Comm
（前出）、および Gimenez-Gallego, G., ら，Science
（前出）、により開示された。大部分のこの研究の結果
として、酸性hFGFに対する完全なコード配列が、第４図
に示されるように、マキアグ（Maciag）グループにより
決定された。 【００１６】この酸性タンパクはまた２つの活性型が知
られており、第１の型は図の“１”番のフェニルアラニ
ン残基で始まる140アミノ酸配列を有しており、そして
第２の型はアミノ酸７−140に対応する短い型である。
ウシおよびヒトのタンパクは、いずれもＮ末端伸長型で
存在し得る。図の“１”番のアミノ酸に対するコドンの
上流側のDNAの（括弧で示す−15のATG開始コドンへ戻
る）翻訳によって、伸長したタンパクの付加的配列が示
される。塩基性FGFの場合のように、Ｎ末端のメチオニ
ンは、遺伝子が細菌で発現する場合にはあり得ないが、
真核発現宿主ではほとんど確実にプロセッシングされ
る。従って、上述の塩基性FGFのように、天然の酸性タ
ンパクは、３つの型で存在し得る：１つは、切形型（tr
uncated）FGF、すなわち134個のアミノ酸を含む“短
い”酸性FGF；１つは、Ｎ末端伸長型、すなわち154個の
アミノ酸を含む“長い型”；そして残りの１つは、図の
“１”番の残基で始まる140個のアミノ酸を含む“基本
型”酸性FGF。Burgess, W.H.,ら，（印刷中）により、
ウシの脳の長い型はアセチル残基でブロックされている
ことが示された。これらのタンパクは、不均衡な数の酸
性アミノ酸残基、すなわちグルタミン酸およびアスパラ
ギン酸を含んでおり、従って中性pHの下で陰イオンであ
る。 【００１７】あるタンパクがインビトロ分析でFGF活性
を示し、ヘパリンに結合し、中性pHの下で陰イオンであ
り、そしてヒトまたはウシの酸性FGFあるいはそれの合
成ペプチドまたは天然ペプチドに対して調製された抗体
と免疫的に反応する場合、このタンパクをここでは酸性
FGFと定義する。 【００１８】酸性FGFおよび塩基性FGFは、上述のタンパ
ク、または第１図〜第８図に示されるアミノ酸配列を有
するタンパクを示すために、ここで用いられる。もちろ
ん、これらの定義は、示された特定の配列に限定される
ものでなく、前述のインビトロおよび免疫的分析によっ
て測定した生物学的活性、および中性pHの下でのそれぞ
れの陰イオン性または陽イオン性が変化しない限り、ア
ミノ酸残基の欠失、付加または交換のような、偶然の変
化あるいは計画的に誘導した変化を含むタンパクを包含
する。もちろん、修飾型は若干変化した定量的活性およ
び特異性を有し得る。 【００１９】“精製した”または“純粋の”とは、天然
の状態で見られる、通常それに付随する物質を含まない
ものを意味する。従って、例えば“純粋の”酸性hFGF
は、ヒトの脳または脳下垂体における本来の環境下で通
常付随している物質を含んでいない酸性hFGFを意味す
る。もちろん、“純粋”の酸性hFGFは、グリコシド残基
のような、それと共有結合によって結合している物質を
含み得る。 【００２０】“動作可能に連結した”とは、成分がその
通常の機能を果たすように位置している連結部を意味す
る。従って、コード配列に動作可能に連結した、制御配
列またはプロモーターは、このコード配列の発現に効果
的である。 【００２１】“制御配列”とは、DNA配列、あるいは所
望のコード配列に適切に連結した場合、このような配列
に適合した宿主においてその発現を有効にし得る配列を
意味する。このような制御配列には、少なくとも原核お
よび真核宿主におけるプロモーターが含まれるが、任意
に転写終止シグナルも含まれる。発現を効果的にするの
に必要な他の因子または補助的な他の因子もまた同定さ
れ得る。ここで用いられるように、“制御配列”とは、
単に、用いられる特定の宿主において発現を効果的にす
るのに要求されるどのようなDNA配列をも意味する。 【００２２】“細胞”または“細胞培養”、もしくは
“組換宿主細胞”または“宿主細胞”とは、内容から明
らかであるので、しばしば互換性をもって用いられる。
これらの用語は、直接の対象細胞を包含するが、もちろ
ん、その子孫をも包含する。偶然の変異あるいは環境の
変化により、必ずしもすべての子孫が親細胞と正確に同
一でないことが理解されている。しかしながら、このよ
うな変化した子孫は、その子孫が初めの形質転換細胞に
与えられた性質に関連した性質を保持している限り、こ
れらの用語に包含される。この場合、例えばこのような
性質は、組換えFGFを生産する能力であり得る。 【００２３】Ｂ．一般的記載 用途および投与 本発明は成長因子タンパクをコードするDNAを提供す
る。成長因子タンパクは、傷の治癒を促進するのに有効
であり、そして、さらに成長因子タンパクに特異的な阻
害剤の設計を行うために充分な量が純粋に提供され得
る。精製された成長因子は一般に、血管新生や治癒を促
進するために、傷ついた組織に局所的に適用される。適
当な対象としては、火傷、骨折、成形外科で扱われるよ
うな外科的擦過傷、または治療を要する他のものがあ
る。これら因子の適用は治癒を促進するので、それらは
また、感染の危険を減少させる。 【００２４】FGFが血管の新生を促進するということに
おいて価値がある適応症には、骨折、靱帯および腱の治
療、腱炎、および滑液嚢炎のような筋骨格の状態；火
傷、切傷、裂傷、褥瘡、および糖尿病患者に見られるよ
うな遅治癒性潰瘍のような皮膚の状態；および虚血症お
よび心筋梗塞症時の組織治療時、が包含される。 【００２５】入手可能な賦形剤および担体を用い組換え
技術により生産される成長因子の処方は、当該分野で既
知の標準的な方法により調製される。このタンパクは、
所望であれば、制御された放出システムの一部として、
ローション、ゲル、または抗生物質のような付加的な活
性成分を有する軟膏、として処方され得る。 【００２６】表面の障害に関して最も適当である局所的
な投与においては、例えば、0.1〜1.0％溶液を用いる標
準的な局所的処方が採用される。そのような溶液は患部
に、１日あたり３〜６回適用される。もちろん軟膏また
は他の処方物の濃度は、傷の程度および患者の性質に依
存する。ほとんどの処方（プロトコル）においては、用
量は時間が経過して傷跡が残る可能性が減少するにつれ
て減じられる。例えば、第３度の火傷のような最も重症
の傷は典型的には10％組成物で処置される。しかし、治
癒が始まると、用量は傷が治癒するにつれて徐々に約0.
1％またはそれ以下にまで下げられる。BSAを担体とした
EGFの局所的処方は、Franklin, J.D.,ら，Plastic and
Reconstruc Surg (1979) 64 : 766-770, に開示されて
いる。 【００２７】骨および組織の治療には、投与は局所的に
なされることが好ましいが、皮下注入または標的の近傍
に直接的に移入した遅延放出性の処方によることができ
る。外科手術は骨の損傷のような状況に対しては必要と
なることもあり得るので、直接的な注入が有利である。
遅延放出型は、Hydron (Langer, R., et al, Nature(19
76) 263 : 797-799)またはElvax 40P(Dupont)(Murry,
J.B., et al, In Vitro (1983) 19 : 743-747)のような
ポリマーに処方され得る。他の持続的放出系は、Hsieh,
D.S.T.ら，J Pharm Sci (1983) 72 : 17-22により示唆
されている。本発明では望ましくはないが、特に上皮成
長因子の処方がBuckley, A., Proc NatlAcad Sci USA
(1985) 82 : 7340-7344に示唆されている。 【００２８】局所的投与で、持続的な放出の送達につい
ては、処方物中のFGF濃度は、状態の程度および該ポリ
マーからのFGFの放出速度を含む多くの因子に依存す
る。一般的に、その処方は、Buckleyら（Proc Natl Aca
d Sci USA (前出））により記載されているように、ホ
ルモンが血清レベルの約100倍、または、組織濃度の10
倍の、定常的な局部的濃度を達成するように構成され
る。５〜50ng／ｇ湿潤重量の組織中のFGF濃度（60ng／
ｇ湿潤重量でのEGFに比べて）を基準として、１時間あ
たり50〜5000μgFGFの放出が許容され得る。もちろん、
その初期濃度は傷の程度に依存する。 【００２９】FGFは、上皮成長因子（EGF)、形質転換成
長因子（TGF-αまたはTGF-β）、インシュリン様成長因
子（IGF-１またはIGF-２）、および／または血小板由来
成長因子（PDGF）のような他の成長因子と、協奏的に、
そして共働的にも働き得ると期待される。さらに、骨の
治療に関しては特に、それは副甲状腺ホルモンの拮抗薬
と共働して働き得る。なぜなら、副甲状腺ホルモンは骨
の再吸収を促進するからである。従って、所望の組織の
治療をより効果的に達成するために、本発明のFGFが前
述の因子の１もしくはそれ以上と同じ組成でもしくは同
じ処方で投与される実施態様もまた、本発明の組成物お
よび投与処方内に包含される。 【００３０】FGFは、軸索の成長、神経再生、および神
経単位の生存を促進させることに効果的であるので、そ
れは、アルツハイマー病およびパーキンソン病のような
ある種の神経性の疾患、筋萎縮性側索硬化症、および神
経系の一般的老化の処置；そして脊髄および末梢神経の
外傷に有効であり得る。 【００３１】これらの症状に対して薬剤を投与するとき
には、傷の治癒に関連して上に述べた処方と同様の処方
で注入することによるのが好ましい。この薬剤はまた、
移植に先立ち本発明のFGF調製物で培養物を処理するこ
とによる移植治療のときのように、細胞培養物の注入と
いう手段を用いて送達され得る。さらに、このFGFは髄
液に直接注入され得、または、系統的に適用され得る。
系統的処方は一般に当該技術分野で既知であり、緩衝液
または生理学的食塩水、または他の適当な賦形剤中での
処方を包含する。用量レベルは、傷を治癒させ得る程度
のレベルである。しかし、組織培養または体外移植組織
の維持については、それは、血清または培地の0.1〜1.0
ng／mlで供給され得る。 【００３２】FGFタンパクも、外科手術中に損傷した組
織の再形成および治療を促進させることにおいて、特に
有用である。この用途のために、外科用ステープルとし
て用いるポリマー中にFGFタンパクを埋めこむことが有
用であり得る。このタンパクはこのように、ステープル
により行われる機械的縫合を生物学的に補うことがで
き、そして、治療した組織における“自然の”治癒過程
を増大させ促進させることができる。 【００３３】さらに、ここで述べているFGFタンパクに
より供給されるような脈管形成刺激により、インビトロ
における、組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA)およ
びコラゲナーゼの放出が起こる（Gross, J.L., et al,
Proc Natl Acad Sci USA (1983) 80 : 2623-2627）。従
って、本発明のFGFタンパクもまた、これらの酵素に応
答する状況の処置に有用である。急性な状況（発作また
は心臓発作に関連する血液凝固物が存在するような状
況）では、塞栓症を形成する慢性的傾向に対する処置の
ために、凝固物を溶解するために大用量のtPAを直接投
与することが必要であり得るが、血流のtPAの適当なレ
ベルを維持するためにFGFを投与することが望ましいか
もしれない。従って、この症状に対して、筋肉内または
皮下注射のような従来の方法を用いて、薬剤の系統的投
与を行うことが好ましい。 【００３４】本発明は、上記の症状に関連した用途に、
純粋なFGF成長因子の実際的な量を提供する。４つの特
異的な内皮成長因子が例示されており、その各々は３つ
の形（ウシの酸性および塩基性FGF、およびそれらのヒ
トに相当するもの）について明らかに活性がある。酸性
および塩基性因子はいずれも、ここで述べているよう
に、長型、基本型、そして短型で発現すると考えられ
る。長型のＮ末端メチオニンは、真核細胞系において該
タンパクが生産されると切り離されること、そして、続
くアミノ酸残基が転写後におそらくアセチル化により誘
導されると考えられる。 【００３５】種々の型のFGFは認識されるシグナル配列
を持たないが、それは何らかの方法で分泌されているに
違いない。なぜなら、それを産生している細胞の外の、
膜結合受容体で、作用するからである。従って、たぶん
認識される構造分泌経路によっては分泌されないので、
その分泌は、細胞溶解による、またはエキソサイトシス
（開口分泌）によるような他の方法で達成される。FGF
が自然に誘導されるほとんどの組織においては、そして
多くの哺乳類の発現系においては、そのような放出は、
通常に用いられているA23187（CalBiochem）のようなカ
ルシウムイオノフォアでのエキソサイトシスを行うこと
により達成され得る。インビトロの状態においては、カ
ルシウムイオノフォアは、１mM CaCl₂の存在下で１〜10
μMとなるように培地に加えられる。マクロファージま
たは単球に由来する発現系では、リポポリ多糖（LPS)を
10μg／mlで添加するような、または大腸菌エンドトキ
シン（Difco)（300ng／ml）を加えるような他の活性化
法が効果的であることが示されている。これらの刺激
は、マクロファージ由来の類似因子インターロイキン１
を放出することが示されている（March,C.J., et al, N
ature (1985) 315 : 641-647)。これらの手法もまた、
以下で述べるように、付加的なシグナル配列なしで細胞
内で生産されると、組換えにより生産されるFGFタンパ
クを放出させるのに採用され得る。細胞内で産生したタ
ンパクの放出を起こさせる刺激には、ホルボールエステ
ルおよびトリグリセリドが包含される。 【００３６】遺伝子回収 例示したFGFをコードしている配列がここで得られるよ
うな一般的な戦略は以下のようである。ウシの酸性FGF
の既知のＮ末端配列を、ファージに連結したウシのゲノ
ムライブラリーとともに使用するための一連のプローブ
を設計するのに用いた。プローブにハイブリダイズした
ファージ組換体をライブラリーより単離し、“天然の”
プローブを得るために、M13クローニングベクターにク
ローニングするのに適したより小さな断片にまで分解し
た。これにより、ウシの酸性タンパクの一部分に相当す
る250bpの配列を含むM13プローブが得られた。このプロ
ーブは、これらの種の中の塩基性型の遺伝子を得るため
だけでなく、ウシとヒトの両起源の酸性型に対し完全に
コードしている配列を回収するための中心である。 【００３７】簡単には、ファージにクローン化した選抜
された酸性bFGF遺伝子断片のAluI分解により得られた断
片を、ショットガン法でM13にクローン化した。適当な
プローブDNAにハイブリダイズされた250bp断片を選抜
し、配列決定した。上記のものを250／AluIと表すが、
それをpBR322に転写し、そしてウシの脳、視床下部、あ
るいは脳下垂体のcDNAライブラリーを探索するため（イ
ントロンで中断されていない完全な酸性bFGF配列を得る
ため）、およびヒトのゲノムライブラリーを探索するた
め（ヒトの酸性FGFゲノム配列の最初のエキソンを得る
ため）、に用いた。酸性FGFをコードしているヒト遺伝
子の中央部および第三番目のエキソンを、以下の実施例
に記述のように、オリゴマーのプローブを用いて得た。
これらのプローブを、合成したヒトの酸性FGF遺伝子を
もとにして設計した。加えて、この同じ250bpの断片
を、酸性型よりもむしろ塩基性型に相応するDNAを変え
るために、入手可能なアミノ酸配列の情報を有効に利用
して、塩基性型のプローブを設計するのに用いた。それ
ゆえ、酸性型bFGFのＮ末端をコードしている配列と塩基
性型のbFGFのアミノ酸配列との比較をもとにして設計し
た修飾プローブを、塩基性型bFGF cDNAに対して、同じ
ウシの脳下垂体cDNAライブラリーを探索するために用い
た。回収されたウシのクローンを、次いでヒトの塩基性
型FGFをコードしているDNAをコードするゲノム配列を回
収するために、ヒトのゲノムおよびcDNAライブラリーを
探索するのに用いた。選択的には、ウシのcDNAクローン
λBB2を、塩基性型FGFタンパクのヒト型をコードするも
のにDNA配列を変換させるために変異させた。酸性型お
よび塩基性型の両FGFに対して、下記のcDNAクローンお
よびゲノムクローンは、このような哺乳類のライブラリ
ーから類似のコード配列を得るために、種々の種から調
製したDNAライブラリーを探索するのに有効である。加
えて、このゲノムクローンは哺乳類系で発現させること
ができ、かつ相当するcDNA以上のよい結果を与えること
もある。脳下垂体、脳、視床下部、あるいは腎臓のよう
な種々の組織から調製したcDNAライブラリーもこのよう
にして選抜され得る。 【００３８】FGF遺伝子の発現 このクローン化したゲノムあるいはcDNA配列は、適当な
発現系で発現され得る。もちろん、ここで開示したDNA
に対しても、それらを回収するための前述のプロトコル
を繰り返す必要はなく、従来の化学合成法が適当に用い
られ得る。このことは、DNAを調節することにより、あ
らゆる所望の形のタンパクを得ることを可能にする。cD
NA配列は、バクテリア、酵母、あるいは真核細胞を含む
どのような宿主にでも適した適当な制御を供給し得る。
ヒトの酸性FGFのゲノム配列の再構築を、３つのエキソ
ンを含む３つの寄託されたλファージから得ることがで
きる。イントロンを含むゲノム配列は、真核細胞の制御
配列、および転写物のスプライシングが可能な真核細胞
宿主を用いて発現させ得る。ワクシニアをもとにした発
現も用い得る。典型的な制御配列DNAsおよび宿主を以下
のＣ．１．節で与えている。 【００３９】特に、完全長のFGFをコードする完全なDNA
は、例えば、酸性あるいは塩基性FGFの長型、基本型、
あるいは短型のどれでも得るために、組換え方法および
合成方法を組合せて用いながら構築され得る。異種のシ
グナル配列をこれらに融合することも可能であり、所望
形態でタンパクを得るために、開裂部位に対するシグナ
ル配列の既知の関係を考慮に入れることも利用可能であ
る。細胞内で産生された形態のタンパクは細胞溶解によ
り得られる、あるいは細胞からのそれらタンパクの遊離
は、上で述べたように刺激され得る。細胞に関係した形
態、もしくは分泌されシグナル配列に融合されると推定
される形態（この形態は、CHO細胞のような哺乳類細胞
と和合可能な制御系を利用する）の発現系は、特に好ま
しい。また、ワクシニアをもとにしたシステムがより好
ましい。このシステムは、感染しやすい細胞中にて、安
定な、あるいは一時的な発現に使用可能である。 【００４０】このように産生された組換えFGFタンパク
を、次いで、天然起源からFGFを精製するために用いら
れる方法と同様の方法で精製する。しかし、このタンパ
クは出発材料の極めて大部分を占めているので、精製は
かなり簡単である。 【００４１】多形性 ヒトのゲノムDNAは、遺伝子の第二のエキソンの領域に
多形性があることがすでに示されている。この多形性の
存在は、FGFが腫瘍により分泌されるので、充実性腫瘍
になる傾向を予想させる。そして、多形性は腫瘍への滋
養物の流れを保つ血管の成長を促進するので、それらが
生存するためにおそらく必要である。 【００４２】この多形性を検出するために、ヒトのゲノ
ムDNAが、例えば、血液サンプルから従来の方法により
得られ、そしてポリアクリルアミドゲル上でサイズによ
る分離に供され、そして標準的なサザンブロット操作を
用いて探索される。効果的なプローブは、以下で述べる
λBB2への2.1kbの挿入から得られた1.4kb EcoRI断片で
ある。このようなプローブあるいはそれと同等物を、単
離されたヒトDNAのHindIII分解物を含むゲルにハイブリ
ダイズさせるべく用いると、2.7kbの断片が通常検出さ
れる。いくつかの個体では、付加的な2.9kb断片も見い
出される。これらの断片は、第２１図に示すように、エ
キソン２の周辺の遺伝子領域に地図化される。 【００４３】検査した３つの個体のうちで、２つは2.7k
b断片だけを示した。１つは2.7断片および2.9kb断片の
両方を示した。ハイブリダイゼーションの強度は、両断
片を持つ個体が両対立形質を含むことを示した。このこ
とは、マウス／ヒトハイブリッド細胞系由来のDNAのサ
ザンブロット分析により得られた結果によって、支持さ
れる。このようなハイブリッド（ここでは１つの染色体
のみが転写される）では、２つの断片のうちの１つだけ
が各系に現れる。 【００４４】Ｃ．標準的方法 細胞の形質転換、ベクターの構築、メッセンジャーRNA
の抽出、cDNAライブラリーの調製などに用いる技術の大
部分は、当該分野で広く実施されている。そして、ほと
んどの従業者は、特異的条件および方法を記載している
標準資料に通じている。しかしながら、便宜上、以下の
節にその概要を示す。 【００４５】Ｃ．１．宿主および制御配列 原核生物および真核生物の両方の系を用いて、FGFをコ
ードする配列を発現し得る；原核生物の宿主は、もちろ
ん、クローニングに最も便利である。最も頻繁に使われ
る原核生物は、大腸菌のいろいろな株で代表される；し
かしながら、他の微生物の株も使用し得る。宿主に適合
した種より導かれる複製部位、選択可能なマーカーおよ
び制御配列を含むプラスミドベクターが用いられる；例
えば、大腸菌は、典型的には、pBR322の誘導体、すなわ
ちBolivar,らGene (1977) 2 : 95、によって大腸菌種よ
り誘導されたプラスミドの誘導体、を用いて形質転換さ
れる。pBR322は、アンピシリン耐性およびテトラサイク
リン耐性の遺伝子を含んでいる。従って、所望のベクタ
ーを構築する際に保持され得るかあるいは分解され得る
ような、複数の選択可能なマーカーを与える。一般に用
いた原核生物制御配列（ここでは、リボソーム結合部位
配列に加えて、任意にオペレーターを伴った、転写開始
のためのプロモーターを含むと定義される）は、β−ラ
クタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（la
c）プロモーター系（Chang, et al, Nature (1977) 198
: 1056）およびトリプトファン（trp）プロモーター系
（Goeddel, et al, Nucleic Acids Res (1980) 8 : 405
7)およびラムダ由来のPLプロモーターおよびＮ遺伝子リ
ボソーム結合部位（Shimatake, et al, Nature (1981)
292 : 128)のような一般に用いられるプロモーターを含
む。 【００４６】細菌に加え、酵母のような真核微生物も宿
主として、用いられ得る。数多くの他の株または種を一
般に利用し得るにもかかわらず、サッカロマイセス・セ
レビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の実験用菌株、
ベーカー酵母（Baker's yeast)が最もよく用いられる。
例えば、Broach, J.R., Meth Enz (1983) 101 : 307
の、２μの複製起点、または他の酵母の適合した複製起
点（例えば、Stinchcomb,et al, Nature (1979) 282 :
39, Tschumper, G., et al, Gene (1980) 10 : 157およ
びClarke, L, et al, Meth Enz (1983) 101 : 300を参
照）を用いるベクターが用いられ得る。酵母ベクターに
対する制御配列は、解糖酵素の合成に対するプロモータ
ー（Hess, et al, J Adv Enzyme Reg (1968) 7 : 149 ;
Holland,et al, Biochemistry (1978) 17 : 4900)を含
む。当該分野に既知の他のプロモーターには、３−ホス
ホグリセレートキナーゼのプロモーター（Hitzeman, et
al,J Biol Chem (1980) 255 : 2073）が含まれる。転
写が増殖条件および／または遺伝的背景により制御され
るという付加的利点を有する他のプロモーターとして
は、アルコール脱水素酵素２、イソチトクロームＣ、酸
性リン酸水解酵素、窒素代謝に関連する分解酵素、アル
ファー因子系、マルトースおよびガラクトース利用に応
答する酵素に対するプロモーター領域がある。また、タ
ーミネーター配列は、コード配列の3'末端に存在するこ
とが望ましいと考えられている。このようなターミネー
ターは、酵母由来の遺伝子においてコード配列に続く3'
未翻訳領域に見い出される。 【００４７】もちろん、多細胞生物由来の真核生物の宿
主細胞培養中で、ポリペプチドをコードする遺伝子を発
現させることも可能である。例えば、Axelら，4,399,21
6を参照されたい。これらの系は、イントロンをスプラ
イシングし得るという付加的な利点を有し、従って、直
接用いることによってゲノム断片を発現させ得る。有用
な宿主細胞系列には、VEROおよびHeLa細胞、そしてチャ
イニーズハムスターの卵巣（CHO)細胞が含まれる。この
ような細胞に対する発現ベクターには、普通、例えば、
サルウイルス40（SV40）由来の初期および後期プロモー
ター（Fiers, et al, Nature (1978) 273 : 113)、ある
いはポリオーマ、アデノウイルス２、ウシの乳頭腫ウイ
ルスまたはトリの肉腫ウイルス由来のプロモーターのよ
うなウイルスプロモーターなどの、哺乳類の細胞に適合
するプロモーターおよび制御配列が含まれる。制御可能
なプロモーター、hMT〓（Karin, M., et al, Nature (1
982) 299 : 797-802)もまた使用し得る。哺乳類の細胞
宿主系における形質転換の一般的な様相は、Axel（前
出）により記述されている。現在では、“エンハンサー
（enhancer)"領域も発現を最適化する際に重要であるこ
とは明らかである；これらは、一般に、非コードDNA領
域におけるプロモーター領域の上流側または下流側に見
られる配列である。必要に応じて、ウイルスを起源とし
て、複製起点を得ることができる。しかしながら、染色
体への組込みが、真核生物におけるDNA複製における共
通の機構である。 【００４８】Ｃ．２．形質転換 使用する宿主細胞に依存して、そのような細胞に適した
標準的技術を用いることにより、形質転換が行われる。
Cohen,S.N., Proc Natl Acad Sci (USA) (1972) 69 : 2
110)によって記述されたような塩化カルシウムを用いた
カルシウム処理、またはManiatisら，分子クローニン
グ：実験の手引き（1982) コールドスプリングハーバー
プレス、P.254、およびHanahan,D., J Mol Biol (1983)
166 : 557-580によって記述されたようなRbCl₂法は、
原核生物または実質的な細胞壁障害を有する他の細胞に
対して用いられ得る。このような細胞壁を持たない哺乳
類細胞に対しては、Grahamおよびvander Eb, Virology
(1978) 52 : 546）のリン酸カルシウム沈澱法、が用い
られ得るが、任意にはWigler,M.ら Cell (1979) 16：77
7-785により修正された方法が用いられ得る。酵母への
形質転換は、Beggs,J.D.,Nature (1978) 275 : 104-109
の方法またはHinnen,A.ら（Proc Natl Acad Sci(USA)
(1978) 75 : 1929)の方法に従って実施し得る。 【００４９】Ｃ．３．ベクターの構築 所望のコード配列および制御配列を含む適当なベクター
の構築には、当該分野に既知の標準的な連結技術および
制限酵素技術を採用する。単離されたプラスミド、DNA
配列または合成オリゴヌクレオチドを所望の形に、切断
し、整え、そして再連結する。 【００５０】ベクターを形成するDNA配列は、数多くの
供給源から利用し得る。もとになるベクターおよび制御
系は、一般に、構築の際に配列の大部分として用いられ
る、利用可能な“宿主”ベクター上に見い出される。典
型的な配列は、上記の節Ｃ．１．に示されている。適切
なコード配列に対して、最初の構築は、通常、cDNAライ
ブラリーまたはゲノムDNAライブラリーから適当な配列
を回収することである。しかしながら、この配列が開示
されれば、それぞれのヌクレオチド誘導体から出発し
て、インビトロで全遺伝子配列を合成し得る。例えば、
500〜1000bpというかなりの長さの遺伝子に対する全遺
伝子配列は、それぞれに重複した相補オリゴヌクレオチ
ドを合成し、そして一本鎖の重複していない部分をデオ
キシリボヌクレオチド３リン酸の存在下でDNAポリメラ
ーゼを用いて充填することにより、調製し得る。この方
法は、配列が既知であるいくつかの遺伝子の構築におい
て成功裏に用いられた。例えば、Edge,M.D., Nature (1
981) 292：756 ; Nambair,K.P.ら，Science (1984) 223
: 1299 ; Jay, Ernest, J Biol Chem (1984) 259：631
1を参照されたい。 【００５１】合成オリゴヌクレオチドは、EdgeらNature
（前出）およびDuckworthら Nucleic Acids Res (1981)
9 : 1691によって記述されたようなホスホトリエステ
ル法、あるいはBeaucage,S.L.,およびCaruthers,M.H.,
Tet Letts (1981) 22 :1859およびMatteucci,M.D.,およ
びCaruthers,M.H., J Am Chem Soc (1981) 103 : 3185
によって記述されたようなホスホアミダイト法のいずれ
かによって調製される。また、この合成オリゴヌクレオ
チドは市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて
調製し得る。アニーリング前のリン酸化（kinasing）あ
るいはラベルのためのリン酸化（kinasing）は、50mM T
ris（pH 7.6）、10mM MgCl₂、５mMジチオスレイトー
ル、１〜２mM ATP、1.7pmoleγ³²p-ATP (2.9mCi/mmol
e)、0.1mMスペルミジン、0.1mM EDTAの存在下で、過剰
量、例えば約10単位のポリヌクレオチドキナーゼを用い
ることによって行われる。 【００５２】所望のベクターの成分が利用可能な場合に
は、それらを標準的な制限方法および連結方法を用いて
切断し、そして連結し得る。 【００５３】部位特異的なDNAの切断は、当該分野に既
知の条件下で、適当な１つの制限酵素（または複数の制
限酵素）を用いて処理することにより行われるが、特別
なものでは、これらの市販の制限酵素の生産者によって
指定された条件下において行われる。例えば、ニューイ
ングランドバイオラボの製品カタログを参照されたい。
一般に、約１μgのプラスミドまたはDNA配列を、約20μ
ｌの緩衝液中で、１単位の酵素によって切断する；実施
例においては、典型的には、過剰量の制限酵素を用いて
DNA基質を確実に完全分解する。変更することも可能で
あるが、約37℃にて約１〜２時間にわたってインキュベ
ーションし得る。各インキュベーションの後、フェノー
ル／クロロホルムで抽出することにより、タンパクを除
去する。さらに、引き続いてエーテル抽出を行い得る。
エタノールを用いて沈澱させることにより、水層から核
酸を回収する。必要に応じて、標準的な技術を用いてポ
リアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動を
行うことにより、切断された断片を大きさによって分離
し得る。大きさによる分離に関する一般的な記述は、Me
thods in Enzymology (1980) 65：499-560に見い出され
る。 【００５４】制限酵素で切断した断片は、４つのデオキ
シヌクレオチド三リン酸（dNTP）の存在下で、大腸菌DN
AポリメラーゼＩの大きな断片（クレノー(Klenow)）で
処理することによって平端な末端（blunt end)にするこ
とが可能である。インキュベーションは、50mMトリス
（pH7.6）、50mM NaCl,６mM MgCl₂, ６mM DTTおよび0.1
〜１mM dNTP中、20〜25℃にて15〜25分間にわたって行
う。クレノー断片は、5'一本鎖の突出部分を充填する
が、たとえ４つのdNTPが存在しても、突出した3'一本鎖
を元に戻す（chuw back)。必要に応じて、突出部分の性
質によって受ける制限内で、唯一のdNTP、または選択さ
れたdNTPを与えることにより、選択的に修復し得る。ク
レノー断片で処理した後、混合物をフェノール／クロロ
ホルムで抽出し、エタノール沈澱させる。適当な条件下
で、S1ヌクレアーゼまたはBAL-31で処理することによ
り、どのような一本鎖部分をも加水分解し得る。 【００５５】連結は、15〜50μｌの容量で、以下の標準
的な条件および温度の下で行う：例えば、20mMトリス−
Cl（pH7.5）、10mMMgCl₂, 10mM DTT, 33μg／ml BSA, 1
0mM〜50mM NaCl、そして（“粘着末端”の連結に対して
は）０℃にて40μM ATP, 0.01〜0.02（ワイス）単位のT
4 DNAリガーゼ、あるいは（“平端な末端”の連結に対
しては）14℃にて１mM ATP, 0.3〜0.6（ワイス）単位の
T4 DNAリガーゼ。分子間の“粘着末端”の連結は、通
常、33〜100μg／mlの全DNA濃度（５〜100nMの全末端濃
度）で行う。分子間の“平端な末端”の連結は、１μM
の全末端濃度で行う。 【００５６】“ベクター断片”を用いたベクターの構築
においては、5'リン酸を除去し、ベクターの自己連結を
防ぐため、一般にベクター断片を細菌アルカリホスファ
ターゼ（BAP)またはウシ腸アルカリホスファターゼ（CI
P)で処理する。分解は、約10mMトリス−HCl,１mM EDTA
中、pH８にてベクター１μgあたり、約１単位のBAPまた
はCIPを60℃にて、約１時間にわたって用いることによ
って行う。核酸断片を回収するために、調製物をフェノ
ール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ
る。あるいは、別の制限酵素で分解し、不要な断片を分
離することによって二重に分解されているベクターにお
いても再連結を防止し得る。 【００５７】配列の修正を必要とする、cDNAまたはゲノ
ムDNA由来のベクター上の部分に対しては、部位特異的
なプライマーによって導かれる突然変異誘発を用い得る
（Zoller, M.J.,およびSmith,M. Nucleic Acids Res (1
982) 10 : 6487-6500およびAdelman,J.P., et al, DNA
(1983) 2 : 183-193)。これは、突然変異させるべき一
本鎖ファージDNAに対して、限られた不一致以外は、相
補的であって、所望の変異を示す合成オリゴヌクレオチ
ドのプライマーを用いて行う。簡単に言えば、この合成
ヌクレオチドをプライマーとして用い、ファージに相補
的なDNA鎖の合成を導き、そして得られた部分的に、あ
るいは全体が二本鎖のDNAを、ファージを補助する宿主
細菌に形質転換させる。形質転換した細菌の培養液を上
層寒天に注ぎ、ファージを含む単一細胞からプラークを
形成させる。 【００５８】理論的には、新しいプラークの50％は、一
本鎖として変異型を有するファージを含み；50％はもと
の配列を有する。得られたプラークをリン酸化した合成
プライマーとハイブリダイゼーションさせた後、正確に
一致するものは結合し得るが、もとのDNA鎖と一致しな
いものは結合が阻止されるのに十分な、洗浄温度で洗浄
する。次いで、プローブとハイブリダイズするプラーク
を選択し、培養し、そしてDNAを回収する。 【００５９】Ｃ．４．構築の確認 以下に示した構築において、プラスミド構築に対する正
しい連結は、まずM.Casadaban博士から提供された大腸
菌株MC1061（Casadaban,M., et al, J Mol Biol(1980)
138 : 179-207)または他の適当な宿主をライゲーション
混合液で形質転換することによって確認する。好結果の
形質転換体は、アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐
性または他の抗生物質耐性により選択するか、あるいは
当該分野に既知のプラスミド構築の方法に依存した他の
マーカーを用いて選択する。この形質転換体由来のプラ
スミドは、Clewell,D.B.ら Proc Natl Acad Sci (USA)
(1969) 62 : 1159の方法に従って、また任意にクロルア
ンフェニコール増幅（Clewell,D.B., J Bacteriol (197
2) 110 : 667）を行った後、調製される。いくつかの小
規模のDNA調製法が一般に用いられる（例えば、Holmes,
D.S., et al, AnalBiochem (1981) 114 : 193-197およ
びBirnboim,H.C., et al, Nucleic Acids Res (1979) 7
: 1513-1523)。単離されたDNAは、制限処理によって分
析され、および／またはSanger,F.ら Proc Natl Acad S
ci (USA) (1977) 74 : 5463のジデオキシヌクレオチド
法であって、さらにMessingら Nucleic Acids Res (198
1) 9 :309によって記述されているようなジデオキシヌ
クレオチド法、あるいはMaxamら（Methods in Enzymolo
gy (1980) 65 : 499）の方法によって塩基配列を決定す
る。 【００６０】Ｃ．５．例示される宿主 ここで、クローニングおよび原核生物の発現に用いた宿
主株は、以下のとおりである：クローニングおよび塩基
配列の決定に対して、そしてほとんどの細菌のプロモー
ターの制御下における構築物の発現に対して、MC1061,
DH1, RR1, C600hfl, K803, HB101, JA221およびJM101の
ような大腸菌株を用いた。 【００６１】Ｄ．例示的な方法 以下の実施例は、本発明を例証することを意図したもの
であって、本発明を限定することを意図したものではな
い。図示したFGF配列をコードするDNAは、まずウシのゲ
ノムライブラリーをスクリーニングし、そして中枢プロ
ーブを得、次いで、付加的なDNAの修復を行うことによ
って得られる。しかしながら、中枢プローブの配列が、
現在、既知であり、従って、インビトロで科学的に構築
し得るので、この方法を繰り返す必要はない。さらに、
４つの図示した配列を保持するバクテリオファージは、
アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されて
いる。 【００６２】 【実施例】実施例１ 250/AluIプローブの構築；酸性bFGFゲノムDNAの調製 図示した酸性FGFタンパクに対する完全なコード配列を
得るために、ウシの250bp AluIゲノム断片をプローブと
して用いてヒトおよびウシの両方のライブラリーを調べ
た。250/AluIと呼ばれるこのプローブは、以下のように
して得た。 ウシの酸性FGFの残基１〜34に対するＮ末
端アミノ酸配列は既知である。コドンの選択性（Anders
on,S., et al, Proc Natl Acad Sci (USA) (1983) 80 :
6838-6842 ; Jaye,M.ら，Nucleic Acids Res (1983) 1
1 : 2325-2335）に基づき、自動合成機およびホスホア
ミダイトカップリング試薬を用いて、３つの長いプロー
ブを調製した。このヌクレオチドプローブの配列を第９
図に示す。プローブ891は、アミノ酸１−16に対応する4
8-merである；プローブ889および890は、アミノ酸18−3
4に対応する51-merであり、24位のアルギニンに対する
コドンを除いて等しい２つのオリゴヌクレオチドの50：
50混合物として用いた。これらのプローブは、部分的な
MboI分解物として調製し、BamHIで処理したファージベ
クター、シャロン28（Woychik,R.F., et al, Nucleic A
cids Res (1982) 10 : 7197-7210）にクローニングし
た。これらのプローブは、Fritz Rottman博士（ケース
ウェスターンリザーブ）から提供されたウシのゲノムラ
イブラリーをスクリーニングするのに用いた。 【００６３】ハイブリダイゼーションは、Ullrich,A.ら
EMBO J (1984) 3 : 361-364によって述べられた方法の
変法を用い、フィルター上に複製された変性DNAに関し
て行った；そして洗浄条件は、Wood,W.I.ら Nature (19
84) 312 : 330-337の洗浄条件に従った。プレハイブリ
ダイゼーション／ハイブリダイゼーション緩衝液には、
20％ホルムアミド、５×デンハート溶液（100×デンハ
ート溶液は、２％ウシ血清アルブミン、２％ポリビニル
ピロリドン、２％フィコルに等しい）；６×SSC(20×SS
Cは、３M NaCl, 0.3Mクエン酸ナトリウムに等しい）；5
0mMリン酸ナトリウム（pH6.8）； 100μg／mlニシン精
子DNAが含まれていた；ハイブリダイゼーション緩衝液
には、さらに10％デキストラン硫酸および約10⁵〜10⁶cp
m／mlのリン酸化されたプローブ891または889／890が含
まれていた。プレハイブリダイゼーションおよびハイブ
リダイゼーションは、42℃にてそれぞれ１時間および16
時間にわたって行った。次いで、フィルターを１×SSC,
0.1％SDSで22℃にて15分間、２度洗浄し、その後１×S
SC, 0.1％SDS中で55℃にて10分間、１度洗浄した。洗浄
後、これらのフィルターは、増感紙を用いて１日、感光
した。 【００６４】スクリーニングされたウシのゲノムライブ
ラリーには、両方のプローブにハイブリダイズした10⁶
個の組換え体の中、50個のファージが含まれていた。こ
れらの50個のファージは、さらにプローブ853−856の混
合物でスクリーニングされた。このスクリーニングにお
いて、プレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼー
ション緩衝液には、６×SSC、１×デンハート溶液、0.1
％SDS、0.05％ピロリン酸ナトリウムおよび100μg/mlサ
ケ精子DNAが含まれていた；ハイブリダイゼーション緩
衝液には、さらに10⁵〜10⁶cpm／mlのプローブが含まれ
ていた。 【００６５】プローブ853−856は、16の配列からなる４
つのプールであって、64個（全体）の17-merの各々はア
ミノ酸７−12に対応しており、ホスホトリエステル法を
用いて合成される。しかしながら、50個のクローンのう
ち46個は、より短いプローブにさらにハイブリダイズさ
せた。このハイブリダイゼーションは、65℃から35℃の
間で16時間にわたって行った。そして50℃にてテトラメ
チルアンモニウムクロリドを用いる、塩基組成に依存し
ない洗浄法を採用した（Wood,W.I., Proc Natl Acad Sc
i (USA) (1985) 82 : 1585-1588）。 【００６６】確実にハイブリダイズする２つのファージ
（λBA2およびλBA3）を選択し、ファージ挿入部分の制
限地図を第１０図に示されているように作製し、そして
第１図に示されるように部分的に配列決定した。この推
定されたアミノ酸配列を、天然のウシの酸性FGFタンパ
クのＮ末端34残基に対して公表されているアミノ酸配列
と比較したところ、これらのクローンは正確であった。
コード配列の性質から、アミノ酸残基１−41（第１図に
示されている）は、これらのクローンにコードされてい
ることは明らかである；直後のヌクレオチドは、イント
ロンを表しているようである。このイントロンの長さ
は、現在のところ、明らかではないが、完全な酸性bFGF
コード配列は、これらのλBA2およびλBA3 DNA上に存在
し得る。しかしながら、このタンパクに対する完全なコ
ード配列を得るために必要な他のDNAは、“ウォーキン
グ（walking)”技術にλBA2またはλBA3を用いて、同一
の遺伝子ライブラリーから得ることが可能である。Ｎ末
端残基より上流側のコドンは、指摘された15アミノ酸の
プロ配列または、先に考察したような単離された“基
本”型に比較して、Ｎ末端において15個のアミノ酸（Ｎ
末端のメチオニンが開裂する場合は、14個のアミノ酸）
だけ伸長した天然のタンパクの“長”型をコードすると
考えられている。 【００６７】250/AluIプローブを調製するために、λBA
２をAluIで部分的に分解し、M13へのショットガンクロ
ーニングを行った（Messing,J., et al, Gene (1982) 1
9 :269-276）。M13プラークをプローブ853−856および8
89／890と２通りにハイブリダイズさせた。両方のプロ
ーブにハイブリダイズするファージの配列を決定した。
得られた250bp AluIプローブは、対応する推定アミノ酸
配列とともに第１１図に示す；第１０図のλBA2および
λBA3の挿入部分の位置は、プローブ889／890および891
の部位と一致する。250／AluIプローブは、酸性bFGFタ
ンパクのＮ末端部分と一致する。 【００６８】実施例２ 酸性bFGF cDNAの回収 酸性bFGFをコードするcDNA配列を回収するために250／A
luIプローブを用いる。Huynh,V.T.,ら DNAクローニング
技術：実用の手引き（IRLプレス，オックスフォード，1
984）のλgt10ベクターを用いてウシの脳下垂体、脳ま
たは視床下部のmRNAからcDNAライブラリーが得られる。
得られハイブリダイジングクローンにより、酸性bFGFを
コードする全配列を回収する。他の哺乳類由来の類似mR
NAを用いて構築された同様のcDNAライブラリーを、250
／AluIプローブを用いて調べて、例えば、ラット、ヒツ
ジ、ウシ、ネコ、イヌ、ウマまたはブタの塩基性FGFが
得られる。 【００６９】実施例３ 酸性hFGFゲノムDNAの調製 Charon 4A（Lawn,R.M., et al, Cell (1978) 15 : 1157
-1174）のヒト胎児の肝臓のゲノムライブラリーをヒト
の配列の起源として用いた。ニックトランスレーション
した250／AluIプローブを用いてこのライブラリーを調
べた。プレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼー
ションの条件は、40％ホルムアミドを用いること以外は
実施例１のプローブ889／890および891に対する条件と
同一であった。ハイブリダイゼーションは、42℃にて16
時間にわたって行った。次いで、フィルターを室温にて
１×SSC, 0.1％SDSで洗浄し、そしてさらに同じ緩衝液
で50℃にて15分間、２度洗浄した。確実にハイブリダイ
ズしたクローンを培養したところ、λHAG-9.1と呼ばれ
るものは、所望の酸性hFGF配列を含んでいた。このクロ
ーンの部分的な制限地図を第１２図に示す；ヌクレオチ
ドおよびアミノ酸配列に関する情報は、第３図に示す。
アミノ酸１−41をコードするヌクレオチド配列を同定し
得る；この配列には、ゲノム酸性bFGFにおけるように、
イントロンが続いていた。酸性hFGFおよび酸性bFGFのア
ミノ酸配列は、５位、21位および35位において異なって
いる。 【００７０】ヒトの酸性FGFをコードするDNAは、これに
対応する単離されたウシのタンパクのＮ末端の上流に、
さらに15個のコドンを含んでいる。これらのコドンは、
ウシのタンパクのＮ末端の延長部分と高い相同性を有す
るアミノ酸配列をコードする。この翻訳配列は、第３図
の括弧内に示されている。ウシのDNAと比較すると、−
３位、−６位、−９位および−12位のコドンにはヌクレ
オチド置換が存在するが、翻訳されたタンパクは存在し
ない。−10位のコドンにおけるヌクレオチド置換によっ
て、ウシのタンパクのThr残基はヒトのタンパクではIle
残基となる。ウシの酸性FGFと同様に、このＮ末端延長
部分は、プロ配列または単離された“基本”型タンパク
の“長”型を表し得るが、このいずれかはメチオニンの
開裂に依存して、14もしくは15のアミノ酸のＮ末端延長
部分を含んでいる。 【００７１】ヒトの酸性FGFをコードするゲノムDNAのエ
キソンであって、中間エキソン、およびＣ末端をコード
するエキソンに対応するヌクレオチド配列を含むλファ
ージクローンも得た。上述のλHAG-9.1とともに、これ
らのファージは完全なタンパクコード配列を与える。 【００７２】Wyman,A.R.ら Proc Acad Natl Sci (USA)
(1985) 82 : 2880-2884によって述べられているように
調製したヒトのゲノムライブラリーから中間エキソンを
有するファージを得た。これは、ヒトのゲノムをSau3AI
で部分分解し、得られた断片をλシャロン30ファージの
ポリリンカー領域のBamHI部位へ挿入することによって
調製されるライブラリーである。この挿入部分は、容易
に除去され得るので、ライブラリー中の２つのEcoRI制
限部位の間に位置している。 【００７３】このゲノムライブラリーは、２つのオリゴ
ヌクレオチドをプローブとして調べられた。これらのオ
リゴヌクレオチドは、次の実施例４に記述され、第１３
図に示されているようにヒトの合成酸性FGF遺伝子を構
築するために用いられていた。この図で“３”および
“４”と示されたオリゴヌクレオチドが、プローブとし
て用いられたものである。λHG-3と呼ばれる、回収され
たファージのコード領域を第４図に示すこのコード配列
は、Jaye配列のアミノ酸42−48をコードするが、塩基性
FGFタンパクをコードする遺伝子のエキソン／イントロ
ン境界に対応している。 【００７４】同様に、第３のエキソンは、上述のように
調製されたシャロン−4AにおけるLawn,ら（前出）のマ
ニアチス（Maniatis）のヒトゲノムライブラリーから得
られた。そして、第１３図に示されている合成遺伝子の
“６”および“７”をラベルしたオリゴヌクレオチドを
プローブとして、この第３のエキソンを調べた。λHAG-
3と呼ばれる、回収されたλファージクローンは、部分
的に配列決定されており、その結果を第５図に示す。こ
の配列情報から、λHAG-3挿入部分中にＣ末端エキソン
配列の存在することが確かめられる。 【００７５】前述の３つの挿入部分は、再結合させるこ
とにより完全なヒトの酸性FGFゲノム配列を再構築し得
るが、これはEcoRIによって各ファージを切断してこの
挿入断片を取り出し、そして得られた断片を連結して遺
伝子を再構築することによってなし得る。このゲノム配
列を用いれば、以下の実施例７においてcDNA配列につい
て述べた方法に類似した方法により、発現ベクターを構
築し得る。特に、この再構築された遺伝子は、合成型−
酸性hFGF NcoI（平端（blunt)）／HindIII（平端（blun
t)）について述べた方法と同様の方法により、EcoRI
（平端（blunt)）断片として挿入し得る。 【００７６】実施例４ 酸性hFGFコード配列の調製 ヒトの脳下垂体、胸部癌腫、脳、脳幹、SK-HEP-1または
視床下部のmRNAから、実施例２においてウシのmRNAに対
して述べたようなHuynhの方法によって調製されたcDNA
ライブラリーを、実施例３において述べた条件下で250
／AluIをプローブとして用いて調べ、酸性hFGFをコード
するcDNAを得る。第１のエキソンを含むスプライシング
されていないcDNAは、胸部癌腫のライブラリーから得ら
れた。 【００７７】別の方法として、Jaye,M.ら Science (198
6)，印刷中、によって得られたcDNA配列の情報（第６図
参照）を酸性hFGFをコードする遺伝子の合成のガイドと
して用いた。Jayeらによって報告されたcDNAクローン
は、ヒトの脳幹由来のメッセンジャーRNAを用いて得ら
れ、酸性hFGFをコードするが、この酸性hFGFの推定され
るアミノ酸配列は第４図に示されている。 【００７８】実施例３において述べたゲノムλ HAG-9.1
クローンを用いて遺伝子の5'部を得た。この部分を調製
するために、1.9kb BamHI断片をλHAG-9.1から単離し、
そしてpUC13中へサブクローニングしてpCBI-101を得
た。次いで、この中間体プラスミドをNcoI／BamHIで切
断し、そして成熟“基本”型の酸性hFGFの最初の25個の
アミノ酸とともに、プロ配列の15個のアミノ酸に対する
コドンを含む118bp断片を５％ポリアクリルアミドゲル
を用いて単離した。主配列の開始点から−15のアミノ酸
において開始コドンを形成していると考えられるATGを
含むNcoI部位の位置は、第１３図に示されている。この
図は合成遺伝子を図示したものである。 【００７９】コード配列の残りの部分は、第１３図にお
ける１〜20番の合成オリゴヌクレオチドを用いて合成さ
れた。各オリゴヌクレオチドの合成は、簡便な自動化技
法を用いて行う。オリゴヌクレオチドは、Jayeら（上
記）によって報告されたものと２つの例外を除いて同一
のヌクレオチド配列を与えるように設計した：オリゴヌ
クレオチド４および14は、星印によって示されるよう
に、コドン66のアラニンをコードするGCCをGCTに変更す
ることによって、コドン67まで拡がっているNcoI部位を
こわすように構築した；さらに、オリゴヌクレオチド19
および20は、TGA終結コドンに続くHindIIIおよびEcoRI
切断部位を付加するように修飾した。前記の変化は、い
ずれもコードされたアミノ酸配列に影響を与えない。 【００８０】標準反応条件を用いて５μgの各オリゴヌ
クレオチド（＃１および＃20を除く）をリン酸化し、10
個の異なる相補的オリゴヌクレオチド対（１＋11、２＋
11、など）をアニーリングし、次いで10個のオリゴヌク
レオチド対を３つの断片に連結することによって、合成
オリゴヌクレオチドを連結し、第１３図に示される配列
を得た。これらの断片は、標準条件下でT4リガーゼを用
いて連続的に形成される。断片Ａを得るために、対１／
11を対２／12と連結し、次いで対３／13と連結し、さら
に対４／14と連結させる。断片Ｂは、対５／15を対６／
16と連結し、次いで対７／17に連結させることによって
形成する。断片Ｃは、対８／18を対９／19と連結し、次
いでこの生成物を対10／20と連結させることによって得
られる。３つの連結した副断片（Ａ＝144bp, Ｂ＝108bp
およびＣ＝106bp）は、ゲル電気泳動を用いて精製し、
次いで標準条件下でT4リガーゼを用いてＢおよびＣを混
合することによって連続的に連結し、その後Ａを添加す
る。最終反応液は、フェノールで抽出し、エタノールで
沈澱させる。エタノール沈澱物は、５％アクリルアミド
ゲルで電気泳動し、358bp断片Ａ＋Ｂ＋Ｃを溶出させ
る。この断片は、第１３図に示されるように、BamHI／E
coRI部位に及んでおり、そしてその配列は、この断片を
M13mp19中へサブクローニングすることによって、ジデ
オキシ配列決定法を用いて、確かめられる。 【００８１】コード配列を完成させるために、合成358b
p BamHI／EcoRI断片をファージまたはポリアクリルアミ
ドゲルから単離し、その末端を必要に応じてリン酸化
し、そしてpCBI-101由来の118bp NcoI／BamHI断片に連
結する。酸性hFGFをコードする、得られた部分合成ヌク
レオチド配列を第１３図に示し、そして合成型−酸性hF
GFと名付ける。 【００８２】もちろん、酸性FGFの“基本”型および
“短”型が、ATG開始コドンから始まり、そして最適な
制限部位を含む、付加的な構築物をも構築し得る。 【００８３】実施例５ 塩基性bFGFのゲノムおよびcDNAクローンの回収 次いで250/AluIプローブを用いて、対応する塩基性bFGF
配列を得るために適当なプローブを設計した。Esch,F.,
ら（前出）が見出した、酸性bFGFのアミノ酸4-29が塩基
性bFGF配列のアミノ酸13-38と整列しているという利点
が得られた。プローブは、塩基性bFGFの残基18-36およ
び酸性bFGFの残基9-27に基づいて設計したが、どちらの
領域も19アミノ酸残基のうち14個が相同的である。 【００８４】プローブ1097および1098は、この領域をコ
ードするように設計されている40-merであり、自動合成
装置で、ホスホアミダイト法を用いて調製した。これら
のプローブは第１４図に示されている；それらは塩基性
配列のアミノ酸23-31の領域で重複している。これらの
プローブを設計する際、250/AluI配列を用いたが、その
アミノ酸配列は同一であった。またコードされた配列に
おいては、必要な変化を与えるための最小限のヌクレオ
チドの相違が含まれていた。 【００８５】実施例２において述べたようなHuynh,V.T.
の方法により得られたウシの脳下垂体cDNAライブラリー
をプローブ1098でスクリーニングした。ハイブリダイゼ
ーションに対する適切な条件は、サザンブロットにゲノ
ムDNA（実施例１）を用いて次のように決定した。 【００８６】もちろん、プローブ1097および1098は、そ
れほど厳しくない条件の下で酸性FGFをコードするDNAと
クロスハイブリダイゼーションし得ることが期待され
た。サザンブロット分析を行ったところ、55℃の洗浄温
度でプローブ1097および1098にハイブリダイゼーション
する酸性bFGFをコードすることが知られているゲノムの
配列は、65℃ではハイブリダイゼーションできなかった
（プレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーショ
ン緩衝液および条件は、実施例１におけるプローブ889/
890および891に対するものと同様であった）。従って、
65℃という洗浄温度を選んだ。この温度では、EcoRI分
解物における10kb断片およびPstI分解物における3.4kb
断片がプローブ1097および1098にハイブリダイゼーショ
ンした。 【００８７】cDNAライブラリーを65℃の洗浄温度を用い
て上述のようにプローブで調べたところ、EcoRIリンカ
ーを有する2.1kb cDNAを表す、λBB2と名付けられた単
一クローンが回収された。このファージの制限地図を第
１５図に示す。λBB2における挿入部分の副断片を、配
列決定を行うためにM13に移した。1.4kb EcoRI分解副断
片は、ウシの塩基性FGFの（完全な“一次”配列の）ア
ミノ酸1-146をコードすることがわかった。Ｎ末端コド
ンより上流側の配列は、９アミノ酸のプロ配列あるいは
活性を保持してる天然のタンパクのＮ末端伸長“長”型
のいずれかをコードすると考えられている。Ｎ末端の伸
長部分は、単に８つの残基しか含み得ないが、これはも
ちろんメチオニンが翻訳後のプロセッシング中に切断さ
れるかどうかに依存している。塩基性bFGFをコードする
この副断片の部分は、第７図に示されている；位置１を
始まりとするアミノ酸の番号付けは、単離された“一
次”タンパクのＮ末端に対応している。上流側の９コド
ンは、括弧内に翻訳されている。この伸長部分が天然の
活性タンパクの必須部分を表している可能性は、肝細胞
から調製されたヒトの塩基性FGFの、より分子量が大き
な型によって示唆されている（Klagsbrun, et al, Proc
Natl Acad Sci (前出））。 【００８８】次いで1.4kbの副断片をニックトランスレ
ーションし、そして塩基性bFGFゲノム配列に対する実施
例１の方法と同様に、構築されたウシのゲノムライブラ
リーのスクリーニングに用いた。 【００８９】1.4kbの塩基性bFGFをコードするcDNA断片
は、ラット、ブタ、あるいはウシ、ネコ、イヌ、ウマあ
るいはネズミを起源とするような、別の哺乳類のcDNAラ
イブラリーをプローブで調べ、上記の種の配列であっ
て、塩基性bFGFをコードする配列を得るためにも用いら
れる。 【００９０】実施例６ ヒトの塩基性FGFのゲノムクローンおよびcDNAクローン
の調製 ヒトの腎臓のmRNAから調製されたλgt10cDNAライブラリ
ーを、ウシの1.4kb塩基性副断片を用いて調べた。プレ
ハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーション緩衝
液には、40％ホルムアミド、５mMリン酸ナトリウム（pH
6.5）、５×デンハート溶液、５×SSC、および50μg/ml
ニシン精子DNAが含まれていた；ハイブリダイゼーショ
ン緩衝液には、さらに、10％硫酸デキストランおよび10
⁴〜10⁵cpm/mlのプローブが含まれていた。３つのクロー
ンを単離し、そして特徴を調べるために１つを選択し
た。このクローンは、λKB7と呼ばれ、約1.4kb EcoRI断
片を含んでいた。この断片を部分的に配列決定したとこ
ろ、推定のアミノ酸配列とともに、第８図に示したデー
タが得られた。配列決定されたコード領域によって、図
中に示したアミノ酸1-50が推定された；下流側に直ちに
続く配列は、スプライシングされていないmRNAのcDNAコ
ピーを表しているようであり、このことはイントロン
が、塩基性FGF遺伝子において、ウシおよびヒトの酸性F
GF遺伝子におけるアミノ酸41の後のイントロンに対して
相同的な位置に存在することを示している。λKB7クロ
ーンも、示した長型の９アミノ酸のＮ末端の伸長部分を
コードする上流側のDNAを与える。 【００９１】付加的なゲノムライブラリーおよびcDNAラ
イブラリーを、上述のヒトの腎臓のλgt10ライブラリー
に対して用いた条件と正確に同じハイブリダイゼーショ
ン条件下で、1.4kb塩基性bFGFをコードする同じ断片を
用いてスクリーニングした。さらに４つのクローンを得
たが、それらの間では、第８図に示すような単離された
塩基性bFGFに対応する完全な146アミノ酸のタンパクを
コードする。上述のλKB7に含まれている９つの上流側
のコドンは、ウシの塩基性FGFクローンにおいて翻訳さ
れた上流側のコドンと完全に相同的な配列へ翻訳する
が、コドン−８には発現しないヌクレオチド置換があ
る。この翻訳されたＮ末端の伸長部分を第４図の括弧内
に示す；そしてこの伸長部分は、上述のように、Ｎ末端
の伸長した活性タンパクのプロ配列または付加的なアミ
ノ酸を表し得る。 【００９２】より詳細には、Lawn,R.M.ら（前出）によ
って記述されたように調製した、λシャロン4Aにおける
ヒトのゲノムライブラリーに由来する２つの確実にハイ
ブリダイゼーションするクローンをλMG4およびλMG10
と名付けた。λMG4は、アミノ酸（−９）−51をコード
し；λMG10は、アミノ酸86-146をコードする。このこと
は、３つのエキソンのうち第３のエキソンが遺伝子の成
熟型タンパクをコードする領域内に含まれることを示し
ている。（エキソン／イントロン境界の位置は、ウシの
配列との相同性によって決定した。）E. Fritschから得
た、λシャロン28における少し異なったゲノムライブラ
リーは、第２の成熟型タンパクのエキソンを含み、アミ
ノ酸51-85をコードするλHT1を与えた。最終的には、上
述のようにλgt10で調製したヒト胎児の肝臓のライブラ
リーから得られたcDNAクローン、すなわちλHFL1は、ア
ミノ酸56-146をコードする。そしてこのことから関連の
あるイントロン／エキソン接合点の位置が確認される。 【００９３】塩基性bFGFおよびhFGFは２つのアミノ酸が
相違しているだけである。位置112においてウシのタン
パクがセリンを有するのに対し、ヒトのタンパクはスレ
オニンを有する。また位置128においては、ウシのタン
パクがプロリンを有するのに対し、ヒトのタンパクはセ
リンを有する。これらの相違は、各々の場合の単一のヌ
クレオチドの相違によるものである；従って、ウシのcD
NAを以下に述べるように突然変異を導く部位により、便
宜的に修飾してヒトのタンパクをコードし得るが、実際
には、標準的な部位特異的変異技法を用いてこれらのコ
ドンを変更した。実施例５のλBB2クローンをEcoRIで分
解し、そしてbFGFタンパクをコードする部分にまで及ぶ
1.4kbの領域をM13mp8のEcoRI部位に連結した。インビト
ロ変異を３つのオリゴヌクレオチドの存在下で実施し
た：“共通”プライマー、17-mer；変異16-mer、5'-GAA
ATACACCAGTTGG-3'、これはコドン112のコード配列を変
更する；そして、変異17-mer, 5'-ACTTGGATCCAAAACAG-
3'、これはコドン128の配列を変更する。変異させたフ
ァージは、さらにインビトロでプライマーによって導か
れる変異を２度行い、変異25-mer、5'-TTTTACATGAAGCTT
TATATTTCAG-3'を用いて翻訳終結コドンより34bp下流側
にHindIII部位を創造した。得られた変異DNAは、ジデオ
キシ配列決定法により配列決定を行い、所望の変異が生
じたことを確認した。そして、FGFコード領域に及ぶ約6
30bpの断片をHindIIIで切断し、そしてpUC13へ連結して
中間体プラスミドpJJ15-1を得た。 【００９４】もちろん、塩基性FGFの３つの既知のＮ末
端修飾体のうちのいずれをもコードするコード領域の修
飾型は、やはり標準的合成技術を用いることによって調
製し得る。 【００９５】実施例７ 発現ベクターの構築および哺乳動物細胞中でのFGFの安
定な発現 FGFをコードするcDNAクローンは、上のC.1節で述べたよ
うに、種々の宿主中で組換えタンパクを生産するため
に、最も都合よく用いられる。しかし、哺乳動物系での
発現は、その宿主が、本来生産されるタンパクで見られ
るプロセッシングに類似した翻訳後プロセッシングを行
い得る場合、およびcDNA配列あるいはゲノム配列のいず
れの配列を用いたとしても、宿主がイントロンのプロセ
ッシングをも行い得る場合には、有利である。 【００９６】それゆえ、全長cDNAあるいはゲノムFGFを
コードするクローンは、以下に述べる宿主ベクターによ
り例示されるような（しかしこれに限定されないが）宿
主ベクターに挿入するために、調製される。 【００９７】このベクターを構築するために、このクロ
ーン化されたFGFをコードする挿入断片は、EcoRIで（挿
入断片自体がEcoRI部位を含むなら、部分分解による）
切断されるか、または他の適当な酵素で切断され、EcoR
Iリンカーまたは必要であれば他の適当なリンカーが付
けられる。そしてこの挿入断片は、次いで、pHS1や、以
下に記述のようなその誘導体といった適当な宿主ベクタ
ーに挿入される。 【００９８】宿主ベクターの構築 pHS1 このプラスミドpHS1は、哺乳動物宿主中での挿入DNAの
発現に適している。このプラスミドは、p84H（Karin,
M., et al, Nature (1982) 299 : 297-802)からの840bp
のhMT−II配列を含む。この配列は、hMT−II遺伝子の−
765の位置のHindIII部位から、＋70のBamHI開裂部位に
わたっている。pHS1を構築するために、プラスミドp84H
をBamHIで完全なまでに分解し、末端のヌクレオチドを
除去するべくエキソヌクレアーゼBAL-31で処理し、次い
でHindIIIで分解した。所望の840bp断片をpUC8（Vieir
a,J., et al, Gene (1982) 19 : 259-268) に連結し
た。このpUC8はHindIIIおよびHincIIの分解により、開
いている。この連結混合物は、大腸菌HB101をAmp^Rに形
質転換するために用いられた。pHS1と名付けられた１つ
の候補プラスミドは単離され、ダイデオキシ配列法によ
り、配列決定された。pHS1は、好都合な制限部位を含む
ポリリンカーの上流側に、hMT−II制御配列を含む。 【００９９】使用可能な宿主プラスミドpHS1は、メタロ
チオネインプロモーターのほかに、付加的な制御要素を
含有させて、さらに改変され得る。特に、SV40のような
ウイルス系のエンハンサー要素だけでなく、hGHのよう
な他のタンパクの3'非翻訳領域に結合した終結シグナル
も包含され得る。 【０１００】ウイルスエンハンサー MT−IIプロモーターに動作可能に連結された状態にある
SV40エンハンサーを含む一対の宿主発現ベクターは、pH
S1のMT−IIプロモーター配列の前方にあるHindIII部位
に、1120bpのSV40 DNA断片を挿入することにより、構築
された。このSV40 DNA断片は、SV40の複製起点まで及
び、5171番目のヌクレオチドから5243番目のヌクレオチ
ド（起点）と、107−250番目のヌクレオチドの72bp反復
構造とを含んでおり、そして後期ウイルスmRNAの5'末端
を含む起点側の1046番目のヌクレオチドにまで至る。こ
の1120bpからなるHindIII断片は、SV40 DNA（Buchman,
A.R.,et al, DNA Tumor Viruses, 2d ed (J.Tooze, e
d.), Cold Spring Harbor Laboratory, New York (198
1), pp.799-841）のHindIIIによる分解から得られ、増
幅のためにpBR322にクローン化される。このクローニン
グベクターをHindIIIで切断し、そしてこの1120bpのSV4
0 DNA断片をゲル電気泳動法により単離し、そしてpHS1
（これはHindIIIにより分解し、CIP処理した）に連結し
た。得られたベクター（これは、pHS1-SV(9)およびpHS1
-SV(10)と名付けられた）は、それぞれ反対方向に、MT
−IIプロモーターを生じる断片を含む。pHS1-SV(9)で
は、エンハンサーは、5'mRNAの転写開始部位から約1600
bpのところにあり、また反対方向には、このエンハンサ
ーは、5'mRNAの転写開始部位からは、およそ980bpのと
ころにある。両方向とも動作可能であるが、エンハンサ
ー配列が転写開始部位に近い方向では、より高いレベル
の発現を示す。 【０１０１】転写開始部位の250-400bp上流側にエンハ
ンサーを置くことを避けることは、最適であると考えら
れている。 【０１０２】さらに、MTプロモーターのTATAボックスの
5'−末端から上流側に、それぞれ、190bp、250bpおよび
360bpに、SV40エンハンサーの3'末端を置いたベクター
が構築された。この構築は、ヒトMTプロモーター上流側
の制御領域の地図化に基づいてなされた。このことは、
Karin,M.,ら，Nature (1984) 308 : 513-519に記述され
ている。全ての構築物は、重金属による制御のための反
復部位を含む配列を保持している。しかし、190bpと250
bpとに分離した構築物は、これらの部位からさらに上流
側にあるグルココルチコイドによる制御のための配列を
保持していない。 【０１０３】これらのベクター（これは、pHS'-SV190、
pHS'-SV250およびpHS'-SV360と名付けられた）は、以下
のように調製される：全ての構築物は、メタロチオネイ
ンプロモーターおよび上流領域を含む配列の長さ以外は
一致している。このプロモーターおよび上流領域は、pH
S1から切断された断片として供される。 【０１０４】pHS'-SV190に対し、pHS1がSacIIで分解さ
れ、平滑化され、そしてKpnIリンカーに連結される。次
いで、このDNAは、MT−II制御配列の適当な部分を遊離
させるために、EcoRIおよびKpnIで分解される。同様
に、pHS'-SV250では、pHS1がHgaIで分解され、平滑化さ
れ、KpnIリンカーに連結された後、EcoRIおよびKpnIで
分解される。pHS'-SV360に対して、最初の分解において
DdeIが用いられる。 【０１０５】このSV40エンハンサーを含む中間ベクター
は、SV40のHindIII／KpnI断片（これは、5171番目の位
置から294番目の位置にまで及んでおり、また、KpnI部
位から50bpのところにエンハンサー要素を含んでいる）
を、KpnI／HindIIIで分解されたpUC-SVに挿入すること
により調製され、pUC-SVが得られる。（pUC19は、ポリ
リンカー領域に、順番にHindIII、KpnIおよびEcoRIの３
つの好都合な制限部位を含む）。この完成したベクター
は、上で記述のように調製されるKpnI／EcoRI断片を、K
pnI／EcoRIで分解されたpUC-SVに挿入することにより、
得られる。 【０１０６】それゆえ、先に改変された全てのベクター
は、SV40のエンハンサー要素を利用している。もちろ
ん、他のウイルスのエンハンサーであれば、同様の方法
で用いられるだろう。 【０１０７】転写終結配列 転写終結制御配列を供与するために、このコード配列、
およびヒト成長ホルモンの3'非翻訳配列を表すDNAをpHS
1に連結した。この中間ベクターは、hGHコード配列に代
えてこのベクターに続けて連結されたコード配列に対
し、hGH3'非翻訳配列を供与し得る。 【０１０８】このゲノム配列をコードするhGHを、BamHI
およびEcoRIで分解し、続いてポリアクリルアミドゲル
精製することにより、p2.6-3（DeNoto, et al, Nuclei
c Acids Res (1981)19: 3719）から単離した。このBamH
Iは最初のエキソンの5'末端で切断する。EcoRIは機能遺
伝子の3'位で切断する。この単離された断片を、BamHI
／EcoRIで分解されたpHS1に連結した。この連結混合物
を大腸菌MC1061のAmp^Rに形質転換した。成功した形質転
換体は、制限分析により選抜し、所望のプラスミドpMT-
hGHgを含む株をさらに増殖させて、多量のプラスミドDN
Aを調製した。 【０１０９】pHS1-SV(9)またはpHS1-SV(10)を構築する
ためではあるが、pHS1を代用するために、先に記述の方
法と同様の方法で、MTプロモーターの制御下にあるhGH
遺伝子を含み、SV40エンハンサーと動作可能に連結さ
れ、そしてそれぞれ、pHGHg-SV(9)およびphGHg-SV(10)
と名付けられた一対のベクター（pMT-hGHg）を得た。そ
の連結混合物は大腸菌1061をAmp^Rに形質転換するために
用いられた。そして適切な構造が確認された。 【０１１０】発現ベクターの構築 次いで、合成の酸性hFGFに適応する宿主ベクターとし
て、phGHg-SV(10)を用いた。phGHg-SV(10)をBamHIおよ
びSmaIで分解し、クレノーで平滑化し、そしてhGHコー
ド配列を切断するためにCIPで処理した。この開かれた
ベクターをNcoI（平滑末端）／EcoRI(平滑末端）合成の
酸性hFGF断片に連結し、所望の発現ベクターpahFGF-SV
(10)を得た。ここで、合成の酸性hFGF断片のNcoI部位は
再生されている。 【０１１１】同様に、上で記述の残留FGFをコードする
断片をphGHg-SV(10)に連結して、ウイルスエンハンサ
ー、MT−IIプロモーターおよびhGH 3'非翻訳領域の制御
下にて、これらのコード配列を含む類似ベクターを調製
する。例えば、実施例６のpJJ15-1からの500bpまでのNc
oI（平滑末端）／HindIII（平滑末端）断片を、BamHI
（平滑末端）／SmaIで分解したphGH-SV(10)にうまく挿
入して、pJJ16-2を得る。 【０１１２】さらに、pHS1、および上で記述のような、
SVエンハンサーの種々の配置を含むべく改変されたpHS1
を包含するこれらの配列の発現を得るために、他の宿主
ベクターが用いられてもよい。挿入は、この宿主ベクタ
ーのBamHI／EcoRI分解を用いての、類似の方法による。
また、酸性または塩基性FGFの“長い”形態、“基本
の”形態あるいは“短い”形態のいずれをもコードする
べく改変されたDNAも用いられ得る。 【０１１３】これらのベクターは、以下で論じる目的の
ために、一般的にpMT-FGFと呼ばれる。 【０１１４】哺乳動物の組換え体によるFGFの生産 チャイニーズハムスター卵巣(CHO)-K1細胞を、F12培地
およびDME培地の１：１混合物から構成される培地上
で、12％ウシ胎児血清とともに生長させた。このコンピ
テント細胞は、pMT-FGFおよびpSV2 : NEO (Southern,
P., et al, J Mol Appl Genet (1982) 1：327-341)で共
形質転換した。pSV2：NEOは、ネオマイシン類似体G418
に耐性を与える機能遺伝子を含む。この形質転換では、
500ngのpSV2-NEOおよび５μgのpMT-FGFを、Wigler,M.,
ら，Cell (1979) 16 : 777- 785 、のプロトコルに従っ
て、リン酸カルシウム−DNA共沈澱物中で、16mmディシ
ュの細胞に適用した。それとともに、これらをDNAに４
時間さらした後、15％グリセロールで２分間“ショッ
ク”を加えた。１日後、G418耐性コロニーのプールを与
えるために、この細胞を１mg／mlのG418にさらした。こ
れらの耐性コロニーはFGF生産のために分析され、次い
でクローン化され得る。 【０１１５】成功した形質転換体（これらはまたpMT-FG
Fの安定な遺伝形質を有する）を、クローン単離体の精
製のため、低密度でプレート上にまく。これらの単離体
の少量を、FGF生産をうまく分析するために、10^-4Mの塩
化亜鉛にさらした後、多孔プレート上で生長させる。FG
Fの定量は通常の方法を用いて、適当なFGFタンパクに対
し調製される抗血清に対して、標準的なELISAまたはラ
ジオイムノアッセイにより行われる。所望のFGFを大量
に生産するクローン分離体が選抜される。 【０１１６】適当な条件下にてFGFを生産するべく示さ
れる細胞を、10％のウシ胎児血清で補足された基本培地
に1/10集密度でまき、一夜インキュベートし、次いで、
１×10^-4M〜３×10^-4Mの濃度範囲の塩化亜鉛を加えるこ
とにより、FGFの生産を誘導する。２×10^-4M ZnCl₂の最
適の誘導条件下で、７〜10日間にわたりFGFのレベルが
上昇する。 【０１１７】特定の実験では、実施例６のpJJ15-1に由
来のヒト塩基性FGFをコードする約500bpのNcoI(平滑末
端）／HindIII（平滑末端）断片を含むpMT-FGFを用い
て、CHO細胞が形質転換された。上に記述のように、pMT
-FGFのこの特別な形（上ではpJJ16-2と名付けた）を得
るために、この断片をBamHI（平滑末端）／SmaIで分解
されたphGH-SV(10)に挿入した。このベクター（pSV-neo
およびpHS1-MT）で、この細胞を共形質転換した。G418
選抜の後、このプールされた耐性コロニーは、10⁶細胞
当たり約500pgのヒト塩基性FGFを生産した。 【０１１８】生産されたFGFの量は、ヘパリン−セファ
ロースを用いて、溶解した細胞から塩基性FGFをアフィ
ニティー精製により定量し、続いて組織培養中の内皮細
胞の生長促進のための分析を行った。このヘパリンアフ
ィニティー精製は、以下に記述の方法のような標準的な
方法により、達成される。この方法は、例えば、Sulliv
an,R.,ら，J Biol Chem (1985)260 : 2399-2403 、ある
いはShing,ら，Science (1984)223 : 1296-1299であ
る。また、活性の分析はGospodarowicz,D.,ら，JCell P
hysiol (1985) 122 : 323-332 、あるいはGospodarowic
z,D.,ら，J CellBiol (1983)97 : 1677-1685に記述のよ
うに行われる。 【０１１９】500pg/10⁶細胞のレベルで生産する先のプ
ールを、次いで、誘発物質としての100μM ZnCl₂ととも
に10μM CdCl₂の存在下にて生長させることにより、カ
ドミウム耐性体を選抜した。耐性クローンのプールを、
次いで、上で記述のように分析した。5.6ng/10⁶細胞の
生産レベルが１回の分析で見出された。 【０１２０】望むなら、FGFがこの溶解した細胞から得
られ、そして天然タンパクに対する先に述べた方法によ
るか、または当業者に公知の他の標準方法により、精製
され得る。 【０１２１】さらに、先に論じたように、前述の構築物
により生産されるFGFタンパクの分泌は、カルシウムイ
オノフォアや他の適当な刺激剤によって開始されるエキ
ソサイトシスにより、達成され得る。CHO細胞により生
産されるタンパクが、特に、LPSやホルボールエステル
の刺激により、放出されるということは期待できないも
のの、例えば、CHO細胞に代えて、組換え宿主としてマ
クロファージ由来の細胞系を用いることにより、このよ
うな分泌が行われ得る。また、以下に例示するようなhG
H由来のシグナル配列を与えるために、その構築を変え
ることにより、通常の構築経路を用いる分泌も、CHOや
他の哺乳動物細胞の宿主を用いて行われるだろう。もち
ろん、分泌を生じることは、タンパク精製作業がずっと
簡単になるので有利である。 【０１２２】合成した酸性hFGFの部分合成配列を含むpM
T-FGFベクターでのトランスフェクションにより、成熟
した基本型の140アミノ酸の上流側にある14アミノ酸の
前部領域を含む“長い型”FGFの生産が行われるだろ
う。それにより、処理されたMet残基はまた、アセチル
基のようなブロッキング基と置き換えられてもよい。プ
ロセッシングはまた、哺乳動物細胞中で行われ、その結
果成熟型になる。しかし、最初のMetを欠き、アセチル
化されたＮ末端アラニン残基を有するリーダー配列を含
む長い型のものが、分裂促進因子としての活性を有する
ことがわかっている。 【０１２３】いずれの場合にも、FGFは、ヘパリン／セ
ファロースに適し、酸性FGFには1.2MNaClでそして塩基
性FGFには2M NaClで溶出することにより、一部精製され
る。この溶出物は、SDS-PAGE、および内皮細胞や3T3細
胞に対する分裂促進活性により、酸性または塩基性FGF
の存在について分析される。 【０１２４】実施例８ ヒトFGFに対するワクシニアベクターの構築，およびCV-
1細胞の一時的な発現 基本のhFGFをコードする配列は、BamHIおよびSmaIでphG
H-SV(10)（前出）を分解し、クレノーを用いて平滑化
し、そしてpJJ15-1からこのFGFにわたる約500bpのNcoI
（平滑末端）／HindIII（平滑末端）断片を挿入するこ
とにより、hGHから3'非翻訳領域と共に供給された。得
られたプラスミド、pJJ16-2は、上に記述の発現ベクタ
ーとして直接用いられ得る。 【０１２５】しかしながら、基本のbFGFをコードする領
域およびhGHpolyA付加シグナルを含むNcoI／EcoRI断片
（約1.1kb）を、５％アクリルアミドゲル上で精製し、
溶出し、クレノーで平滑化し、そしてSmaIで分解したホ
スファターゼ化pGS20に連結した（Mackett et al, J Vi
rol (1984)49 : 857-864）。得られたプラスミド（pJV1
-1と命名された）は、大腸菌MC1061中で増幅された。そ
してこのプラスミドDNAは、セシウムクロライド濃度勾
配を用い単離された。 【０１２６】実施例４で合成された合成の酸性hFGF DNA
断片も、ワクシニアの一時的な発現ベクターpGS20の中
に連結される。第１３図に示される合成の酸性hFGF遺伝
子は、NcoIおよびEcoRIで切断され、クレノーで平滑化
され、そしてSmaIで切断されたホスファターゼ化pGS20
に連結される。得られたプラスミドの調製物は、セシウ
ムクロライド中で平衡状態に遠心分離することにより精
製され、pJV1-2と命名された組換えプラスミドが回収さ
れる。 【０１２７】このpJV1-1ベクターおよびpJV1-2ベクター
は、Cochran,M.A.,ら，Proc Natl Acad Sci (USA) (198
5) 82 : 19-23によって記述されるように、ワクシニア
に感染するCV-1細胞に形質転換される。 【０１２８】pJV1-1またはpGS20にトランスフェクトさ
れたCV-1細胞は、SDS-PAGEオートラジオグラフィーを用
いる基本のFGFを生産するために、分析された。この結
果は、第１６図に示される。レーン１およびレーン２
は、それぞれpJV1-1およびpGS20でトランスフェクトさ
れた細胞の培地である。レーン３およびレーン４は、対
応する細胞溶解産物のサンプルであり、レーン５および
レーン６は、以下のこと以外は、レーン３およびレーン
４と同じである。溶解産物のサンプルを、0.6M塩化ナト
リウムの存在下にてヘパリンセファロースに結合し、10
mMリン酸塩、pH7.4／1.1M塩化ナトリウムで洗い、そし
て同じ緩衝液中で２M塩化ナトリウムを用いてカラムか
ら溶出した（この溶出物は、ゲル上に載せる前にTCAで
沈澱させた）。レーン７は、146アミノ酸型にて¹²⁵Iで
ラベルされた基本のFGFである。レーン５中の約18kdの
所のバンド（これはFGFの標準よりも少し高い分子量を
もっている）によると、ウシ配列のその“長い”型が、
組織から得られた“基本の”タンパクよりも多く形成さ
れていることがわかる。 【０１２９】レーン５およびレーン６に示すように調製
されたサンプル（TCA沈澱を除く）も、ウシの脳の毛細
管内皮細胞の分裂促進活性について検査された（実施例
９参照）。pGS20サンプルには活性は全くなかったが、p
JV1-1サンプルは、20pg FGF／μｌに相当する活性を含
んでいた。 【０１３０】実施例９ FGFに対するインビトロ分析 この分析は、Eschら，Proc Natl Acad Sci (USA) (198
5) 82 : 6507-6511：およびGospodarowiczら，J Cell P
hysiol(1985)122 : 323-332に記述のように実質的に行
われた。 【０１３１】簡単に言うと、ウシの脳の毛細管内皮細胞
は、10％ウシ血清で補われたDMEMの存在下で維持され
た。複数の単層が、0.9％塩化ナトリウム、0.01Mリン酸
ナトリウム、pH7.4, 0.05％トリプシン、そして0.02％E
DTAを含む溶液に、室温にて２〜３分間さらすことによ
って、解離された。この細胞を集めた後、それらを、DM
EMおよび10％ウシ血清中に再懸濁させ、そして細胞懸濁
液のアリコートをコルターカウンター（Coulter counte
r)で計測した。この細胞を、２mlDMEMに10％ウシ血清を
加えた全体を含む各皿に、35mm皿あたり２×10⁴細胞の
初期密度で植えつけた。６〜12時間後、２通り作成した
プレート１セットをトリプシン処理し、そして細胞を計
測してプレート化効果を測定した。 【０１３２】FGF活性について検査され得るサンプルの
アリコートを、0.5％ BSAを加えたDMEMを用いて1:2、1:
4、そして1:8に希釈し、そして、この希釈液の10μｌを
３通りの検査プレートに０日目および２日目に加えた。
４日目に、各サンプル希釈液に対する３通りのプレート
をトリプシン処理し、そしてこの細胞密度をコルターカ
ウンターにより測定した。 【０１３３】実施例10 シグナル配列融合の発現 FGFの組換え型は、CHO細胞またはCV-1細胞の培地中では
見出されなかったので、このFGFをコードするDNA配列
も、組換えFGFタンパクの分泌を起こすために、異種シ
グナル配列に連結される。次いで、この融合した配列
は、ワクシニアで感染させたCV-1細胞中での一時的な発
現および分泌を生じるようなワクシニアにもとづくベク
ターに連結されるか、またはCHO細胞での発現および分
泌のためのベクターにもとづくpHS1に連結される。 【０１３４】ヒトの成長ホルモンからのシグナル配列
を、コード配列全部を含む800bpのHindIII断片として、
Martial,J.A.,ら，Science (1979)205 : 602-607のcDNA
ベクターchG H800/pBR322から得た。NaeI制限部位は、
部位特異的な突然変異によって、26番目のアミノ酸シグ
ナルをコードするDNAの3'位にすぐに配置される。その
結果、NaeIによる次の開裂は、このシグナル配列のＣ末
端でのアラニン残基に対するコドンのすぐあとに平滑末
端を有する断片になる。要約すると、このHindIII断片
をM13mp19に連結し、そしてプライマー：5'-ATGGTTGGGC
CGGCACTGCC-3'を用いて突然変異させる。そして、この
突然変異した配列は、回収され、BamHIおよびNaeIで分
解されてシグナル配列を含む断片を与える。 【０１３５】（β−ラクタマーゼのシグナル配列の正し
く合わせた型も、類似の構築物中に用いられるだろう
（Lingappa,V.R.,ら，Proc Natl Acad Sci (USA) (198
4) 81 :456-460)。） 基本のhFGFの４つの型をコードするDNAは、上に記述の
改変されたλBB２クローンからの一定のＣ末端断片、お
よび可変的な合成のＮ末端部分をそれぞれ含む部分的に
合成された断片として供給される。このＣ末端の位置に
対し、この改変されたλBB２クローンは、3'非翻訳領域
のHindIII部位に及ぶ377bpの副断片を得るために、HhaI
およびHindIIIで分解される。このHhaIは、開始メチオ
ニンコドンから122bp下流側を切断する。HhaI部位から
上流側の欠けている部分は、合成のオリゴヌクレオチド
を用いて供給される。 【０１３６】この合成オリゴヌクレオチドは、第１７図
に示される。それらは、合成の酸性hFGFの産生に関連し
て上述された方法と類似の方法で合成され、そして連結
される。この個々のオリゴヌクレオチドは、標準の自動
核酸合成器を用いて合成され、アニーリングされる。そ
してこの２重鎖部分は、その3'末端にHhaI部位を含む適
切な全体の上流側部分を形成するように、連結される。
次いで、これらの合成の上流側断片は、完全なFGF遺伝
子を得るように、T4リガーゼを用いて、下流側のHhaI／
HindIII断片に連結された後、hGHシグナル配列をコード
する領域を加えるために、hGH BamHI−NdeI断片に連結
される。 【０１３７】この合成の上流側部分によってコードされ
るhGH／基本のFGFタンパクの結合は、第１８図に示され
る。タンパクＡは、再構築された上流側部分および連結
されたＣ末端コドンを含む。このＣ末端コドンは、それ
ゆえ、−９〜146のアミノ酸（第８図に示す）をコード
している。つまり、このコドンは、ヒトFGFの長い型を
コードするアミノ酸全部である。タンパクＢは、−９位
のＮ末端メチオニンがアラニン残基によって置き換えら
れていること以外は、同じ配列を含む。タンパクＣは、
第８図の12-146のアミノ酸をコードしている。そして、
タンパクＤは、このタンパクの16-146のアミノ酸、つま
りヒトの基本のFGFの“短い”型をコードしている。こ
の短い型は分裂促進活性を示すことが既に知られてい
る。 【０１３８】第１８図も、von Heijne, G., Eur J Bioc
hem (1983)133 : 17-21によって示された規則によれ
ば、直接の発現産物に対する予測されたシグナル配列の
開裂部位（太い矢印）を示す。 【０１３９】構築を完全にするために、第１８図で示さ
れるhGHシグナル配列に融合された４つのタンパクをコ
ードする断片は、BamHI（部分）／HindIII配列として増
幅するため、キャリアープラスミドpUC9中に挿入され
る。正しい構築はダイデオキシシーケンス法により確立
される。この配列断片を確認するBamHI（部分）／HindI
IIは、次いで、キャリアープラスミドから削除され、ク
レノーにより平滑化され、そしてpGS20（前述）のSmaI
部位に連結される。連結された組換えプラスミドは、上
に記述のように、ワクシニアに感染したCV-1細胞中で発
現される。 【０１４０】同様に、構築物は、同じ発現系での分泌の
ために、酸性hFGFから作られる。このFGFをコードする
配列は、合成された酸性のhFGF DNA断片から誘導され、
修飾されて、第１９図におけるタンパクE, FおよびGを
生産する。第１９図は、第４図の−15残基から140残基
に及ぶ酸性FGFの長い型、第４図の１〜140残基によって
表される基本型、そして、その図の７〜140残基に及ぶ
短い型のhGH／酸性FGFタンパク結合領域を表す。全て
は、この図に示されているように、このFGFのアミノ末
端に少しの変化をもたらす。 【０１４１】これらのFGFをコードする配列を構築する
ために、このNcoI／EcoRIの合成の酸性FGFを、NcoI部位
にて、クレノーにより平滑化し、そしてSmaI／EcoRIで
分解されたM13mp19に連結する。得られたファージは、
オリゴヌクレオチド：5'-GTAATTCCCGGGAGGCAGAT-3'で突
然変異を誘発され、それゆえ、グリシンに対するコドン
のすぐ前に、第１３図の核酸位置62にてSmaI部位を作
る。このグリシンは、主要な酸性hFGFの残基６である。
SmaIおよびEcoRIを有する突然変異された断片の分解に
より、414bpの断片が生じ、この断片は、第１９図中の
タンパクＧのように示される組換え型をコードするDNA
を得るために、BamHI／NaeI hGHシグナルをコードする
断片に直接連結される。または、この断片は、合成した
オリゴヌクレオチド（第２０図に示される）にまず連結
され、次いで、第１９図のＥおよびＦと命名されるペプ
チドをコードする配列を得るために、BamHI／NaeI断片
に連結される。 【０１４２】ヒト塩基性FGFに対して先に述べた方法に
全く類似の方法にて、このシグナル配列を進行させる酸
性FGFのDNA断片を、pGS20中に配置し、そしてワクシニ
アに感染したCV-1細胞中にトランスフェクトして、酸性
FGFの分泌型の一時的な発現を分析する（この処理され
たタンパクの予期されるシグナル開裂部位を、von Heij
neからも推測されるように、第１９図の太い矢印により
指示する）。 【０１４３】このFGF配列は、伝統的なシグナル配列を
含んでおらず、したがって構築条件下にてシグナルの仮
定的な機構により、それらの配列自体の分泌を生じさせ
る性能を有することは、注目されるべきである。正常な
細胞質タンパクに外来シグナル配列を融合することによ
り、それらの分泌を生じ得るかどうかということは、当
該技術分野からは明らかでない（malEシグナル配列に融
合されるβ−ガラクトシダーゼは、細菌中ではペリプラ
ズムに達しないことが示された。しかし、Lingappa、V.
R.,ら，Proc Natl Acad Sci (前述）は、β−ラクタマ
ーゼシグナルに融合されるβ−グロビンが、インビトロ
でイヌの脾臓のミクロソームにより処理され、そしてこ
の処理されたタンパクが、トリプシンの分解から保護さ
れることを示している）。 【０１４４】この連結されたシグナル／FGFをコードす
る配列も、上述されたMT-IIプロモーターを含む宿主ベ
クターの中に挿入され得、そしてCHO細胞中で発現され
得る。 【０１４５】実施例11 FGFの細菌での発現 FGFをコードするcDNA配列（これはイントロンによって
分断されていない）も、細菌系にて発現可能である。発
現のために都合のよい宿主ベクターはpKT52であり、そ
れは、“trc”プロモーターおよびそれに続くATG開始コ
ドンを含んでいる。 【０１４６】この“trc”プロモーターは、trpプロモー
ターの上流部分および下流部分、オペレーターを含む部
分、lacプロモーターの領域、を含む。このプロモータ
ーを含むpKT52は、pKK233-2の簡単な操作により構築さ
れた。それは、Amman,E.,ら，Gene (1985) 40 : 183-19
0により、記述されている。pKK233-2は、EcoRIおよびPv
uIIで分解され、dATPおよびdTTPで満たされ、そして所
望のベクターを得るべく再連結された。 【０１４７】pKT52は、所望のtrcプロモーターおよび下
流側のATG開始コドンに加えて、下流側のNcoI部位、Pst
I部位、およびHindIII部位を含む。 【０１４８】発現ベクターを構築するために、このFGF
をコードするcDNAは、EcoRIまたは他の適当な酵素で分
解すること、単離すること、およびもし必要ならば、適
当な断片を修飾することにより、得られる。この3'末端
は、ある都合のよい制限酵素部位にて終止コドンの下流
側を切断し、そしてPstIリンカーまたはHindIIIリンカ
ーを与えることにより、pKT52中に導入するために、調
製される。この5'末端は、このコード配列の内側の部位
にて切断し、そしてこの欠けているコドンおよびNcoI部
位を合成DNAを用いて与えることによるか、または変異
操作によって適当に配置されたNcoI部位を供給すること
により、調製される。得られるNcoI／HindIIIまたはNco
I／PstI断片は、次いで、NcoI／HindIIIで分解されるpK
T52か、またはNcoI／PstIで分解されるpKT52に連結さ
れ、読み枠中にて、このATG開始コドンとともに、FGFを
コードするcDNAを供給する。このNcoI／HindIIIを境界
とする合成の酸性hFGF DNAは、この方法で直接に挿入さ
れる。同様のベクターは、ヒトの塩基性FGFをコードす
るDNAを用いて構築される。 【０１４９】細菌での発現では、得られた発現ベクター
は大腸菌MC1061または他の適当な宿主細胞をAmp^Rに形質
転換するために用いられ、次いで形質転換された細胞
は、O.D.が0.2〜0.5になる３〜５時間の間、１mMのIPTG
を含むM9培地上で生長される（IPTGは、lacオペレータ
ーによって制御される制御配列に対する標準の誘導物質
である）。次いで、細胞を集め、細胞破砕または５％ト
リクロロ酢酸での処理により溶菌し、そしてこの細胞抽
出物を、所望のFGFについて分析する。FGFは、天然タン
パクに対して用いられる方法、または当該技術分野に既
知の他の操作によって、抽出物から精製され得る。 【０１５０】実施例１２ 傷害の修復を促進するＦＧＦの活性 傷害の修復を促進するFGF活性を、対照としてのGospoda
rowiczらの方法（ProcNatl Acad Sci (USA) (1984) 81
: 6963-6967）により、ウシの脳下垂体から精製した純
粋な塩基性FGFを用い分析した。分析され得る対照のFGF
は、Davidson,J.M.,ら，J.C.B. (1985) 100 : 1219-122
7の手順によれば、ネズミへのポリビニルアルコールス
ポンジの皮下注入に適用された。代わりの方法として、
ゴルテックスホローファイバーも、用いられ得る（Good
son,W.H., et al, J Surg Res (1982) 33 : 394-40
1）。 【０１５１】標準的な手法では、全部で４匹のネズミ
を、それぞれ２つの同一の処理をしたスポンジで処理し
た。このスポンジは、ヘパリンセファロースビーズによ
る処理、スポンジあたり５μgのFGFを用いてヘパリンセ
ファロースビーズに結合されたFGFによる処理、または
溶液中にて５μg FGFで処理を施す、のいずれかであっ
た。このスポンジを、６日後に回収し、そして、傷害修
復を示している肉芽組織について組織構造的に調べた。 【０１５２】FGFを含むスポンジは、高い量の肉芽組織
を示した。そして、この肉芽組織は、スポンジの場合に
は、ヘパリンセファロースビーズのまわりに集まってい
た。このスポンジのところでは、FGFは、これらのビー
ズに結合して供給された。 【０１５３】同様の結果により、FGFが天然源によるか
または組換え体によるものか、そしてFGFが塩基性か酸
性かについて観察される。 【０１５４】1985年９月９日またはそれ以前に、出願人
は、American Type Culture Collection (ATCC), Rockv
ille, MD, USAにλファージのλBA2，λBA3，λHAG-9.
1，λBB2およびλKB-7を寄託した。これらは、ATCC受託
番号40195，40194，40197，40196および40198をそれぞ
れ割り当てられた。これらの寄託は、特許目的のための
培養菌寄託に関するATCCの承認のもとで与えられるよう
な状況下にてなされた。1986年９月12日またはそれ以前
に、λBB2（ATCC 40196）およびλHAG-9.1（ATCC4019
7）の寄託条件は、微生物の寄託に対する国際的な承認
（ブダペスト条約）に関するブダペスト条約で明記され
た条件に適合するように変えられた。1986年９月12日ま
たはそれ以前に、λHG-3およびλHAG-3と命名されたλ
ファージは、ブダペスト条約の条件下でATCCに寄託さ
れ、ATCC受託番号40257および40258を、それぞれ割り当
てられた。寄託された株の有用性は、その特許法に従っ
て、いかなる政府の権威の下で許された権利にも違反し
て、その発明を実施するためのライセンスとして解釈さ
れるべきではない。 【０１５５】 【発明の効果】

【図面の簡単な説明】 【図１】酸性のウシFGFに対する部分配列を表す。 【図２】酸性ウシＦＧＦタンパクの完全なアミノ酸配列
を表す。 【図３】λファージλHAG-9.1に含まれるヒトの酸性FGF
の遺伝子の第１エキソンに対応するヌクレオチド配列お
よび推定されるアミノ酸配列を表わす。 【図４】λファージλHG-3に含まれるヒトの酸性ＦＧＦ
の遺伝子の第２エキソンに対応するヌクレオチド配列お
よび推定されるアミノ酸配列を表わす。 【図５】λファージλHAG-3に含まれるヒトの酸性ＦＧ
Ｆの遺伝子の第３エキソンに対応するヌクレオチド配列
および推定されるアミノ酸配列を表わす。 【図６】Jayeらにより開示された、完全なアミノ酸配列
およびヒトの酸性ＦＧＦをコードするcDNA配列を表わ
す。 【図７】塩基性ウシＦＧＦをコードするDNA配列、およ
び推定されたこれらのアミノ酸配列を表す。 【図８】塩基性ヒトＦＧＦをコードするDNA配列、およ
び推定されたこれらのアミノ酸配列を表す。 【図９】酸性bFGFのＮ末端配列から設計されたオリゴヌ
クレオチドプローブ889/890、891および853-856を表
す。 【図１０】ゲノムの酸性bFGFクローンλBA2およびλBA3
に対する挿入部分の制限地図を表す。 【図１１】ウシの酸性FGFゲノムプローブ250／AluIのDN
A配列を表す。 【図１２】酸性hFGFゲノムクローンλHAG-9.1における
挿入部分の制限地図を表す。 【図１３】酸性hFGFの部分合成遺伝子、すなわち“合成
型−酸性hFGF”を表す。 【図１４】塩基性FGFプローブ1097／1098を表す。 【図１５】塩基性bFGF cDNAクローンλBB2の制限地図を
表す。 【図１６】CV-1細胞における塩基性hFGFの一時的な発現
の結果を表す。 【図１７】塩基性hFGFを構築するためにhGHシグナル配
列への融合物として用いた合成オリゴヌクレオチドを表
す。 【図１８】いくつかの塩基性hFGF組換えタンパクに対す
るhGH／FGF融合連結部におけるアミノ酸配列を表す。 【図１９】いくつかの酸性hFGF組換えタンパクに対する
hGH／FGF融合連結部におけるアミノ酸配列を表す。 【図２０】図１５のタンパクのいくつかの部分をコード
するために用いたDNA配列を表す。 【図２１】ヒトの塩基性FGFをコードする遺伝子の地図
を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/36 ＡＤＡ // Ｃ１２Ｎ 1/21 ＡＤＴ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (73)特許権者 593215117 2450 ＢＡＹＳＨＯＲＥ ＰＡＲＫＷＡ Ｙ，ＭＯＵＮＴＡＩＮ ＶＩＥＷ，ＣＡ ＬＩＦＯＲＮＩＡ 94043，Ｕ．Ｓ．Ａ. (56)参考文献 ＦＥＢＳ ＬＥＴＴ．ＶＯＬ．185 （1985．６） Ｐ．177−181 ＢＩＯＣＨＥＭ．ＢＩＯＰＨＹＳ．Ｒ ＥＳ．ＣＯＭＭＵＮ．，ＶＯＬ．128 （1985．４） Ｐ．554−562

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．ヒト塩基性ＦＧＦタンパク質をコードするＤＮＡを
   哺乳動物細胞または細菌の組換え宿主細胞で発現させて
   得られる組換えヒト塩基性ＦＧＦタンパク質であって、 該組換えヒト塩基性ＦＧＦタンパク質は、以下のアミノ
   酸配列Ｉ、II、IIIおよびIVを含有するタンパク質群か
   ら選択されるアミノ酸配列を有し、該アミノ酸配列の２
   ５、６９、８７、および９２番目の部位に４つのシステ
   イン残基を有する： 【化１】【化２】【化３】【化４】２．前記細菌宿主がE.coliである、請求項１に記載の組
   換えヒト塩基性ＦＧＦタンパク質。 ３．組換えヒト塩基性ＦＧＦタンパク質と、薬学的に許
   容される少なくとも１つの賦形剤との混合物を含有する
   傷の治癒のための薬学的組成物であって、 該組換えヒト塩基性ＦＧＦタンパク質は、ヒト塩基性Ｆ
   ＧＦタンパク質をコードするＤＮＡを哺乳動物細胞また
   は細菌の組換え宿主細胞で発現させて得られるヒト塩基
   性ＦＧＦタンパク質であり、以下のアミノ酸配列Ｉ、I
   I、IIIおよびIVを含有するタンパク質群から選択される
   アミノ酸配列を有し、該アミノ酸配列の２５、６９、８
   ７、および９２番目の部位に４つのシステイン残基を有
   する、組成物： 【化５】【化６】【化７】【化８】