JP2638652B2

JP2638652B2 - カケクチンと反応するモノクロナール抗体

Info

Publication number: JP2638652B2
Application number: JP1508080A
Authority: JP
Inventors: クオ，ジョージ
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1988-07-18
Filing date: 1989-07-12
Publication date: 1997-08-06
Anticipated expiration: 2012-08-06
Also published as: FI101937B; DK69890D0; WO1990000902A1; EP0351789B1; PT91201B; AU3970389A; DE68928857T2; NZ229922A; US5658803A; ES2124209T3; ZA895372B; NO901247D0; IL90990A; NO179615B; CA1340018C; EP0351789A3; IL90990A0; DE68928857D1; PT91201A; NO901247L

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、免疫学的手法を用いて診断および治療（特
に、細菌感染症の診断・治療）に有用な新規物質を生産
すること、より詳細には、ヒト・カケクチンと特異的に
反応しうる改良されたモノクローナル抗体および該抗体
を生産および使用することに関する。

発明の背景寄生生物、細菌またはウイルス感染のような侵入的刺
激の導入、あるいは腫瘍細菌は、感受性宿主に有意な代
謝的変化を引き起こす。重症である場合、これらの変化
は最後には正常なホメオスタシス機構を局所的にまたは
全身的に破壊して、消耗性疾患（悪液質）へ進行する宿
主エネルギー貯蔵の枯渇、組織損傷、多重器官系不全、
ショックおよび死へと導く。

最近まで、臨床医学者はその体系的パターンが主とし
て侵入物質それ自体の作用によるものであると信じてい
た。しかしながら、現在では、侵入的刺激によって宿主
が各種のサイトカインを生産し、これらのサイトカイン
の作用が合わさって大部分の望ましくない生物学的反応
を誘発することが知られている。これらの宿主により誘
導される炎症媒介物質は、多種多様の炎症疾患に対する
治療法を開発するための新たな機会を提供する。

最も効力のあるサイトカインの１つは、適切な刺激の
後に主にマクロファージによって放出されるカケクチン
（cachectin）である。カケクチン（腫瘍壊死因子また
はTNFとも呼ばれる）は157個のアミノ酸から成るタンパ
ク質であり、通常生体内ではダイマーまたは他のマルチ
マーとして存在している。ヒトTNFモノマーの計算分子
量は約17000ダルトンである。

カケクチンは数種類の脂肪細胞特異的タンパク質（例
えば、リポタンパク質リパーゼ）の全合成を抑制するよ
うに作用する。また、これは多数の他のタンパク質（ク
ラスＩ主要組織適合抗原、顆粒球−マクロファージ−コ
ロニー形成刺激因子、およびインターロイキン１を含
む）の生合成または放出を誘導するように作用する（一
般的に、Beutler and Cerami,New Eng.J.of Med.，316:
379−385（1987）を参照されたい。この技術内容は参照
によりここに引用するものとする）。

カケクチンの各種疾患に対する広範な影響が認識され
たために、その作用を制御しようとする試みがなされ
た。例えば、実験により、カケクチンと特異的に反応す
る抗体は、カケクチンと関係のあることが知られている
免疫調節反応を制御するために治療上有用であることが
分かった（米国特許第4603106号および同第4684623号を
参照されたい。これらの技術内容は参照によりここに引
用するものとする）。特に、ヒト・カケクチンの種々の
エピトープと高親和結合しうる中和抗体は、過剰カケク
チンレベルの有毒な作用を中和する能力をもっていると
思われる。

従って、in vivoにおいてカケクチンの毒性作用を中
和しうる改良された抗体の必要性が存在している。本発
明はこれらの必要性を満たすものである。

発明の要約新規な細胞系列が提供され、前記細胞系列はin vivo
においてヒト・カケクチンのエピトープに結合しうる増
強された中和能力をもつモノクローナル抗体を生産する
ことができる。さらに、予防または治療量のモノクロー
ナル抗体もしくはその結合断片少なくとも１種と、好ま
しくは生理学的に許容しうる抗体と、を含む組成物を投
与することから成る、菌血症や敗血症にかかりやすいヒ
トまたは内毒素保有細菌にすでに感染しているヒトの治
療方法が提供され、前記モノクローナル抗体およびその
結合断片はヒト・カケクチンと反応する能力を有し、か
つL929細胞溶解検定において200ng未満、一般には約50
〜200ng未満で中和活性を示すことができる。前記組成
物はさらに１種以上の次の成分を含むことができる：す
なわち、細菌内毒素または外毒素と反応しうる別のモノ
クローナル抗体；内毒素を保有する特定菌株の血清型抗
原決定基と反応しうるモノクローナル抗体；ヒト血漿か
らのγ−グロブリン画分；最近内毒素と反応する免疫グ
ロブリを高レベルで含むヒト血漿からのγ−グロブリン
画分；および１種またはそれ以上の抗菌剤。さらに、診
断用キットの製造を含むモノクローナル抗体の臨床使用
が提供される。

特定の実施態様の説明本発明によれば、希望する親和力の中和モノクローナ
ル抗体および該抗体を生産しうる新規細胞、並びにこの
種の抗体を含む組成物が提供され、前記組成物はヒト・
カケクチンに存在するエピトープを選択的に認識するこ
とができる。前記細胞は、それら由来のまたは前駆細胞
由来の生殖系列DNAがヒト・カケクチンの希望エピトー
プと結合する部位をもつ抗体をコードするように組み換
えられた、同定可能な染色体を含んでいる。これらのモ
ノクローナル抗体は、診断や治療のほかにも、いろいろ
な面で利用することができる。

このようにして得られたモノクローナル抗体は、従来
の抗体と比較して、菌血症、敗血症、悪液質、高レベル
のカケクチンと関連した他の疾患などの重い病気の治療
もしくは予防に特に有用である。従って、これらの抗体
は一般的に、L929細胞溶解検定において、200ng未満、
好ましくは約50〜200ng未満で中和活性をもつであろ
う。この比較的高レベルの活性のために、有意に低い投
与量レベルでの治療が可能である。

モノクローナル抗体の生産は、ヒト・カケクチンの希
望エピトープに特異的な抗体をコードする核酸配列を発
現しうる細胞系列を不滅化することによって達成され
る。不滅化細胞系列は腫瘍形成を経て、またはトランス
フェクションや突然変位などによって、系質転換された
哺乳動物細胞系列でありうる。このような細胞には骨髄
腫系列、リンパ腫系列、またはin vitroで免疫グロブリ
ンもしくはその結合断片の発現・分泌を支持しうる他の
細胞系列が含まれる。免疫グロブリンまたはその断片
は、リンパ球（特に、脾細胞）の形質転換により、ウイ
ルスにより、またはハイブリッド細胞系列をつくるため
のリンパ球と腫瘍細胞（例．骨髄腫細胞）との融合によ
り得られた、好適なマウスまたはヒト源以外の哺乳動物
の天然に存在する免疫グロブリンでありうる。一般に、
脾細胞はカケクチン関連抗原またはそのエピトープ部位
を含む断片に対して免疫した動物から得られるであろ
う。免疫法プロトコールはよく知られており、効果を保
持したままで相当に変更することが可能である（Godin
g,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,2d
Ed.,Academic Press,N.Y.［1986］を参照されたい。こ
の技術内容は参照によりここに引用するものとする）。

ハイブリッド細胞系列は慣用技術を用いてクローニン
グおよびスリクリーニングを行い、そして適当な親和力
で希望のヒト・カケクチン抗原決定基に結合しうる細胞
上清中の抗体を検出する。適当なハイブリッド細胞系列
はその後大規模培養で増殖させるか、あるいは抗体腹水
の生産のために適当な宿主の腹腔内に注入される。

ヒト・カケクチンタンパク質に特異的な本発明抗体を
利用することによって、いくつかの場合には、希望の抗
ヒト・カケクチンモノクローナル抗体（いわゆる“阻止
抗体”）の別の例を同定する手段として本発明モノクロ
ーナル抗体を用いる競合検定において、後続の実験の上
清をスクリーニングすることができる。従って、ハイブ
リッド細胞系列は、特定のカケクチン抗原決定基に特異
的な適切な親和力の抗体の利用可能性に基づいて、いろ
いろな源から容易につくることができる。

また、対象のエピトープ部位に特異的な抗体を生産す
るハイブリッド細胞系列が利用可能である場合、これら
のハイブリッド細胞系列は他の腫瘍Ｂ細胞（抗体をコー
ドするゲノムDNAの受容細胞として役立つ）と融合させ
ることができる。これらの抗体は細胞表面で機能する
が、例えばレセプターとしては機能しない。齧歯類（特
に、ネズミ）の腫瘍Ｂ細胞が最も一般的に利用される
が、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、トリのような
他の動物種も用いられる。

モノクローナル抗体はIgM、IgD、IgA、IgEのような免
疫グロブリンのいずれのクラスまたはサブクラスであっ
てもよく、また、それぞれの動物種において知られてい
るIgGのいずれのサブクラスであってもよい。一般に、
モノクローナル抗体は完全なままで、またはFv、Fab、
Ｆ（ab‘）_２のような結合断片として用いられるが、通
常は完全なままで用いられる。

本発明の細胞系列にはモノクローナル抗体の直接生産
以外の他の用途がある。細胞系列を他の細胞（例えば、
適当には薬物でマークしたヒト骨髄腫、マウス骨髄腫ま
たはヒトリンパ芽球様細胞）と融合させて、ハイブリド
ーマまたはトリオーマをつくり、これによりモノクロー
ナル抗体をコードする遺伝子を転移させることができ
る。また、本発明の細胞系列を免疫グロブリンをコード
する染色体源として用いて、染色体の分離後、融合以外
の技術を使って細胞に転移させることができる。さら
に、モノクローナル抗体をコードする遺伝子は、分離
後、いろいろな宿主による特定の免疫グロブリンの生産
のために組換えDNA技術に従って使用される。特に、メ
ッセンジャーRNAからcDNAライブラリーを作製すること
により、免疫グロブリンをコードしかつイントロンを含
まない単一のcDNAクローンを単離し、これを適当な原核
または真核発現ベクターに挿入し、続いて最終的な大量
生産のために宿主に形質転換することができる。（一般
的には、米国特許第4172124;4350683;4363799;4381292;
4423147号を参照されたい。また、Kennett,et al.,Mono
clonal Antibodies,Plenum,New York［1980］を参照さ
れたい。これらの文献の技術内容はすべて参照によりこ
こに引用するものとする。）より詳細には、ハイブリッドDNA技術に従って、本発
明の免疫グロブリンまたはその断片は細胞または酵母に
より生産される。（Boss,et al.,Nucl.Acid.Res.,12:37
91およびWood,et al.,Nature 314:446を参照されたい。
両文献の技術内容は参照によりここに引用するものとす
る。）例えば、本発明の細胞系列により生産されるモノ
クローナル抗体の軽鎖および重鎖をコードする遺伝子か
ら転写されたメッセンジャーRNAは、当該クローン以外
のBALB/cリンパ球由来のcDNAを使って分画cDNAハイブリ
ダイゼーションにより単離しうる。ハイブリダイズしな
いmRNAは目的の免疫グロブリン鎖をコードするメッセー
ジに富んでいるだろう。必要な場合は、目的のmRNAレベ
ルをさらに上げるために、この方法を繰り返し行うこと
ができる。その後、分画されたmRNA組成物を逆転写し
て、目的の配列について濃縮されたcDNA混合物を得る。
RNAは適当なRNAアーゼで加水分解しssDNAはDNAポリメラ
ーゼＩおよびランダムプライマー（例えば、ランダムに
断片化したウシ胸腺DNA）を用いて二本鎖とする。得ら
れたdsDNAはその後適当なベクター（例えば、ラムダベ
クターのようなウイルスベクター、またはpBR322、pACY
C184などのプラスミドベクター）に挿入してクローン化
する。軽鎖および重鎖の不変部の既知配列に基づいたプ
ローブを用いて、目的の軽鎖および重鎖をコードする遺
伝子を含むcDNAクローンをハイブリダイゼーションによ
り同定する。その後、遺伝子はプラスミドから切り出
し、開始コドンの上流にある余分のDNAまたは不変部のD
NAを遺伝子操作により除き、そして宿主の形質転換およ
び遺伝子の最終発現のために適当なベクターに導入す
る。

有利には、完全な免疫グロブリンを生産させるため
に、さらに、所望により、リーダー配列を含まない免疫
グロブリンを分泌させるために、鎖のプロセッシング
（例えば、重鎖と軽鎖の結合）を行う哺乳動物宿主
（例．マウス細胞）が用いられる。これとは別に、単細
胞微生物を用いて２本の鎖を生産させることもでき、こ
の場合は、重鎖をコードする配列の５‘末端に開始コド
ンが存在するので、プロセッシングシグナルおよび分泌
リーダーをコードするDNA配列を除去するための遺伝子
操作がさらに必要になる。この方法では、免疫グロブリ
ンは哺乳動物細胞以外の細胞において構成およびグリコ
シル化されるように生産され、プロセッシングされる。
所望により、それぞれの鎖は少なくとも可変部を保持す
るように切断することができ、この可変部はその後カケ
クチンエピトープに特異的な他の免疫グロブリンまたは
断片をつくるために遺伝子操作される。（例えば、欧州
特許公開第0239400号および同第0125023号を参照された
い。これらの技術内容は参照によりここに引用するもの
とする。）本発明のモノクローナル抗体は、ヒト・カケクチンの
エピトープに対するそれらの高い親和性ゆえに、特に有
用である。また、モノクローナル抗体の一部はin vivo
において防御的であり、医薬品（例えば、細菌感染症用
の抗体組成物）へのそれらの配合が可能である。

本発明のモノクローナル抗体はさらに、in vitroにお
いていろいろに利用される。例えば、モノクローナル抗
体は天然のまたは組換えヒト・カケクチンを精製するた
めに、あるいは不均質なタンパク質混合物に含まれるヒ
ト・カケクチンを選択的に取り出すために利用できる。

診断目的のために、モノクローナル抗体は標識されて
もされなくてもよい。一般に、診断検定はモノクローナ
ル抗体とタンパク質から形成された複合体の検出を伴
う。抗体が標識されていない場合、それは凝集検定で利
用される。さらに、非標識抗体はモノクローナル抗体と
反応する他の標識抗体（第二抗体；例えば、免疫グロブ
リンに特異的な抗体）との組合せで用いることもでき
る。これとは別に、モノクローナル抗体は直接標識され
てもよい。多種多様の標識が使用でき、例えば、放射性
核種、蛍光物質、酵素、酵素基質、酵素コファクター、
酵素阻害剤、リガンド（特に、ハプテン）などがある。
いろいろなタイプのイムノアッセイが利用でき、例え
ば、米国特許第3817827;3850752;3901654;3935074;3984
533;3996345;4034074;4098876号に記載されるものが含
まれる（これらの特許の技術内容は参照によりここに引
用するものとする）。

一般に、本発明のモノクローナル抗体は酵素イムノア
ッセイで利用され、その場合当該抗体または異なる種か
らの第二抗体が酵素に結合される。ヒト・カケクチンを
含む試料（例えば、ヒト血液またはその溶解液）を当該
抗体と混合すると、抗体と目的のエピトープを示す分子
との間で結合が起こる。このような複合体を未結合試薬
類から分離し、第二抗体（酵素で標識したもの）を加え
る。その後、細胞に特異的に結合された抗体−酵素複合
体の存在を調べる。当分野で知られたその他の技法も利
用できる。

また、溶液中のヒト・カケクチンを検出するために、
または組換え体画分中のヒト・カケクチンエピトープの
存在を検出するために、当該抗体を含むキットが供給さ
れる。こうして、本発明のモノクローナル抗体組成物
は、通常凍結乾燥された形で、モノクローナル抗体単独
または内毒素、外毒素もしくはグラム陰性菌に特異的な
抗体との組合せで提供される。抗体（標識されていても
されていなくてもよい）は緩衝液（例．トリス、リン酸
塩、炭酸塩）、安定剤、殺生物剤、不活性タンパク質
（例．ウシ血清アルブミン）などと共にキット内に収め
られる。一般に、これらの物質は活性抗体の量に基づい
て約５重量％以下で存在し、通常抗体濃度に基づいて約
0.001重量％以上の合計量で存在するだろう。往々にし
て、活性成分を希釈するために不活性増量剤または賦形
剤を加えることが望ましい。その場合、賦形剤は全組成
物の約１〜99重量％の量で存在するだろう。モノクロー
ナル抗体と結合しうる第二抗体を用いる場合、それは通
常別のバイアルに入れられる。第二抗体は一般に標識に
結合され、先に述べた抗体組成物と同様な方法で配合さ
れる。

また、本発明のモノクローナル抗体は、治療または予
防量の本発明モノクローナル抗体少なくとも１種（しか
し、一般的には２種以上から成る混合物）を製剤学的に
有効な担体と共に含有する薬剤組成物の成分として配合
される。製剤学的担体はモノクローナル抗体を患者に投
与するのに適した相溶性の無毒性物質であるべきであ
る。担体としては滅菌水、アルコール、脂肪、蝋、不活
性固体などが用いられる。製剤学的に許容しうるアジュ
バント（緩衝剤、分散剤）も薬剤組成物に配合すること
ができる。この種の組成物はヒト・カケクチンに対して
のみ特異的なモノクローナル抗体を含みうる。また、薬
剤組成物は細菌と直接反応するモノクローナル抗体
（“カクテル”に利用できるもの）を含むこともでき
る。例えば、ヒト・カケクチンエピトープに対するモノ
クローナル抗体および敗血症を引き起こす種々の菌株群
（例えば、異なる血清型）に対するモノクローナル抗体
を含むカクテルは、病気の原因となる大多数の臨床単離
物に対して活性のある万能薬となるであろう。

種々のモノクローナル抗体成分のモル比は、一般に10
倍より大きく相異することはなく、より一般的には５倍
より大きくは異ならず、通常他の抗体成分のそれぞれに
対して約1:1−２のモル比で用いられるだろう。本発明
のモノクローナル抗体は、併用する場合、一般に等モル
比で用いられるだろう。

本発明のモノクローナル抗体は、現在使用されている
血液血漿製剤、例えばヒト細菌敗血症の予防または治療
に用いられている市販のガンマグロブリンおよび免疫グ
ロブリン製剤と併用することもできる。好ましくは、免
疫グロブリン製剤の場合、血漿は内毒素保有細菌と反応
する免疫グロブリンの高レベルを示す提供者から得られ
るであろう。（一般的に、概説“静脈内免疫グロブリン
および処置宿主（Intravenous Immune Globulin and th
e Compromised Host）",Amer.J.Med.,76（3a）,March3
0,1984,p.1−231を参照されたい。この文献は参照によ
りここに引用するものとする。）また、モノクローナル抗体は抗生物質または抗菌剤と
共に投与される別個の組成物として使用することもでき
る。一般に、抗菌剤はアミノグリコシド（例．ゲンタマ
イシン、トブラマイシンなど）と共にペニシリンを含む
が、当分野で知られた多くの他の抗菌剤（例．セファロ
スポリン）も利用できる。

本発明のモノクローナル抗体およびその薬剤組成物は
経口または非経口投与に適している。好ましくは、薬剤
組成物は非経口的に、すなわち皮下、筋肉内、動脈内ま
たは静脈内に投与される。従って、本発明は、許容しう
る担体（好ましくは、水性担体）中のモノクローナル抗
体またはそのカクテルの溶液から成る非経口投与用の薬
剤組成物を提供する。例えば、水、緩衝水、0.4％食塩
水、0.3％グリシンのような水性担体が使用できる。こ
れらの溶液剤は無菌であり、一般に粒状物質を含まな
い。これらの組成物は慣用の滅菌法により滅菌される。
本組成物は生理学的条件に近づけるために、pH調節剤、
緩衝剤、毒性調節剤のような製剤学的に許容しうる補助
物質（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化
カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど）を含
むことができる。これらの組成物中の抗体の濃度は広い
範囲で変化し、すなわち約0.5重量％以下から、一般に
は約１重量％以上から15または20重量％程度までの範囲
であり、主として液体の容量、粘度などに基づいて、好
ましくは選ばれた特定の投与方式により決定されるであ
ろう。

従って、筋肉注射用の代表的な薬剤組成物は1mlの滅
菌緩衝水および500mgのモノクローナル抗体を含むよう
に調製される。静脈内輸液用の代表的組成物は250mlの
滅菌リンゲル液150mgのモノクローナル抗体を含むよう
に調製されるだろう。非経口投与用の薬剤組成物の調製
のための実際的方法は当分野で知られており、例えばRe
mington‘s Pharmaceutical Science,15 Ed.,Mack Publ
ishing Company,Easton,Pennsylvania（1980）により詳
細に記載されている。

本発明のモノクローナル抗体は保存のために凍結乾燥
することができ、適当な担体により用時調製される。こ
の技術は通常の免疫グロブリンに有効であることが分か
り、当分野で知られた凍結乾燥法および用時調製法が使
用できる。当業者は、凍結乾燥および用時調製が抗体活
性の低下へ導くこと（例えば、通常の免疫グロブリン製
剤の場合、IgM抗体はIgG抗体よりも活性の低下が著しい
傾向にある）、およびこれを補償するために使用量を調
整しなければならないことを理解するであろう。

モノクローナル抗体またはそのカクテルを含む組成物
は、いろいろな細菌感染症の予防および／または治療の
ために投与しうる。治療用途において、本組成物は、１
種以上の細菌にすでに感染した患者に、その感染症およ
びその合併症を治療もしくは少なくとも部分的に抑制す
るのに十分な量で投与される。これを達成するに足る量
は“治療上有効な量”として定められる。このために有
効な量は感染症の重症度および患者自身の免疫系の一般
状態に左右されるが、通常約１〜200mg抗体/kg体重の範
囲であり、好ましくは５〜25mg/kgの投与量が用いられ
る。本発明の物質は一般に重い症状、すなわち命に危険
があるかまたはありうる状態、特に菌血症および内毒血
症、に対して用いられることに留意すべきである。

予防用途において、モノクローナル抗体またはそのカ
クテルを含む組成物は、まだ感染していない患者に、感
染症に対する患者の抵抗性を高めるために投与される。
このような量は“予防上有効な量”として定められる。
この場合の正確な量もやはり患者の健康状態や一般的な
免疫レベルにより左右されるが、通常0.1〜25mg/kg、特
に0.5〜2.5mg/kgの範囲であるだろう。

本組成物の１回または数回投与を行うことができ、投
与量および投与方式は治療にあたっている医師により選
ばれる。いずれの場合においても、薬剤組成物は患者を
効果的に治療または予防するに足る量の本発明抗体を与
えるべきである。

実験カケクチンの生産および精製組換えヒト・カケクチン（Pennica,et al.,Neture，3
12:724−729（1984）およびShirai,et al.,Nature，31
3:803−806（1985）を参照されたい。両文献の技術内容
は参照によりここに引用するものとする）は、開始メチ
ニオンおよび成熟カケクチンの配列をコードする合成遺
伝子から、酵母により細胞内タンパク質として発現され
た。その際合成遺伝子のコドンは、標準技術に従って、
高度に発現される酵母遺伝子のコドンを反映するように
選ばれた。この合成配列はハイブリッド・アルコール脱
水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素
（ADH2/GAPDH）プロモーターの下流に配置した。カケク
チン合成はサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyce
s cerevisiae）の形質転換培養物を用いてグルコース欠
乏により誘導した。全酵母タンパク質の約５〜10％がカ
ケクチンであった。

カケクチンは粗製酵母抽出物から（ａ）硫安分画、
（ｂ）Ｑ−セファロース高速カラムクロマトグラフィ
ー、（ｃ）Ｓ−セファロース高速カラムクロマトグラフ
ィー、および（ｄ）セファクリルＳ−200（HR）カラム
クロマトグラフィーにより精製した。

この方法は、アクチノマイシンＤ処理L929細胞を用い
て検定したとき、カケクチン活性の約80％の回収を与え
た（Ruff and Gifford,（1981）Tumor Necrosis Facto
r, Lymphokines，２:235−272）。精製カケクチンの比
活性は２−４×10⁸単位/mgであり、純度はSDSポリアク
リルアミドゲル電気泳動で調べて98％以上であった。

カケクチンに対するモノクローナル抗体の生産 BALB/cマウスは５〜25μｇフロインド完全アジュバン
トて腹腔内に免疫し、その後３週間おきにフロインド不
完全アジュバント中の同一容量で２回追加免疫した。最
後に、水溶液中の同一用量で腹腔内に追加免疫し、３〜
４日後に細胞融合を実施した。

免疫したマウスからの脾細胞（約10⁸細胞）は、Kohle
r and Milstein （Nature256:495（1979））に従ってポ
リエチレングリコールにより約２×10⁷個の骨髄腫細胞
（P3−X63−Ag8.653）（Kearney etal.,J.Immunol（197
9）123:1548−1550）と融合させた。これらの細胞をマ
イクロタイタープレートにまき、ヒポキサンチン・アミ
ノプテリン・チミジン（HAT）培地によりハイブリッド
を選別した。

カケクチンで免疫したマウス５匹からの脾細胞を用い
て５回の融合を実施した。固相酵素結合免疫吸着検定法
を用いることにより、カケクチンに対するモノクローナ
ル抗体を生産する60個の陽性クローンが得られた。

陽性ウェルからのハイブリッドは、それぞれが真のク
ローンであることを確かめるために、限界希釈法により
３回クローン化した。カケクチンに対して陽性のハイブ
リドーマ14個がクローン化され、性状決定がなされた。

カケクチン/TNFバイオアッセイ:L−929細胞の細胞毒性 TNF活性はRuff and Gifford,Lymphokines ２:235.
（1981）に記載の通りにアクチノマイシンＤ処理L929細
胞を用いる細胞溶解検定により測定した。

L929細胞（CCL1,アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション，ロックビル,MD）は、10mMヘペスおよび1
0％ウシ胎児血清（またはDME＋10％FBS）を補給したRPM
I 1640に維持した。集密的培養物（３−４×10⁷細胞/75
cmフラスコ）は5mM EDTAおよび10mMヘペスを含む生理食
塩水（pH7.4）中での短時間のトリプシン処理（0.05％
トリプシンで洗う）により解離させ、アクチノマイシン
Ｄ（１μg/ml）を含む新鮮な培地に再び浮遊させた。そ
の後、細胞を96ウェルのマイクロタイター培養皿にまい
た（５−７×10⁴細胞／ウェル）。

培養の２時間後、段階的希釈を行った試料をウェルに
加え（10−20％以下の血清）、プレートを一晩（５％CO
₂;37℃）インキュベートした。試料は４通りずつ検定し
た。翌日、顕微鏡で観察した後、培地をデカントし、ウ
ェルに0.2％クリスタルバイオテット、10％ホルマリン
および0.01リン酸塩の溶液（pH7−7.5）を５分間満た
し、水で十分に洗い、乾かした。溶解の程度はマイクロ
タイタープレート読取り機で分光学的に（550−570nM）
定量した。検定結果はU/mlとして表し、１単位（Ｕ）は
50％の細胞を溶解させるカケクチンの量と規定した。

in vitro中和検定組換えヒト・カケクチン（0.02MトリスHCl、pH8.0、
0.15M NaCl、1mg/ml BSA 1mlあたり20lng）は等容量の
希釈抗体と混合し、37℃で60分間インキュベートした。
この混合物をアクチノマイシンＤ（μg/ml）を含む新鮮
培地1:10に希釈した。４通りの段階的希釈（２倍）試料
0.1mlをマイクロタイタープレートウェルに加えた。残
存する細胞溶解活性はL929−細胞の細胞毒性検定により
測定した。

モノクローナル抗体の性状決定カケクチンに対して陽性のハイブリドーマ14個を同定
し、サブクローニングした。これらのハイブリドーマに
よって生産された抗体は、ELISAでカケクチン結合に関
してモノクローナル抗体18−１−１（Tracey,et al., N
ature 330:662−664（1987）、参照によりここに引用
するものとする）と競合するそれらの能力について調べ
た。表１に示すように、モノクローナル抗体は３つのク
ラス：すなわち18−１−１競合しないもの；競合するも
の；および中間競合を示すものに分類される。18−１−
１と競合しないモノクローナル抗体がカケクチンに特異
的であることを証明するために、カケクチン捕捉検定を
行った。カケクチンを捕捉するモノクローナル抗体を固
相に結合させ、そしてモノクローナル抗体18−１−１を
標識抗体として使用した。この検定では、すべてのモノ
クローナル抗体がカケクチンに対して特異的であった。

また、カケクチンのMAb中和された細胞毒性活性の程
度を調べるために、ハイブリドーマ細胞からの調整倍地
を用いた実験を行った。14のモノクローナル抗体はすべ
て性状決定のためにマウス腹水中で生産した。カケクチ
ンの毒性に対してL929細胞を防御する精製モノクローナ
ル抗体の効力が測定された。MAb1−２−4B1の中和活性
はその精製物質により確かめた。MAb2−２−3E3（50ng/
ml）と等容量のヒト組換えカケクチン（20ng/ml）との3
7℃、60分間のインキュベーションは、L929細胞毒性検
定で調べたとき、カケクチンの細胞溶解活性の50％が中
和されたことを示した。表１に示すように、MAb18−１
−１と同じエピトープを認識するMAb2−２−3E3は、細
胞防御に要する量が18−１−１の量の1/8であった。ま
た、表１に示すように、18−１−１と同じ特異性をもつ
抗体の大部分はL929細胞毒性検定においてカケクチンを
中和（100％）した。18−１−１と異なるエピトープ特
異性をもつ１−２−4B1のような他の抗体も有意な中和
活性を有していた。

ヒヒ敗血症の有害作用の阻止における抗TNFモノクロー
ナル抗体断片による処置後の効力ヒヒに大腸菌（E.coli）の２時間LD₁₀₀輸液を投与し
た。動物は10時間監視し、その後死亡するまで、または
最高７日間観察した。アミノグリコシド抗生物質、ゲン
タマイシン、を大腸菌の２時間輸液後指定された回数で
投与した。抗TNFモノクローナル抗体２−２−3E3 Ｆ
（ab′）_２断片（10mg/kg）のボーラス注入は、Ｔ＋30
分（細菌輸液期間の４分の１、すなわち“処置後”）に
４匹のヒヒに対して行った。別の１匹のヒヒには同量の
大腸菌＋ゲンタマイシンを与え、無関係のＦ（ab′）_２
断片のアイソタイプ対照を用いて治療した。

（１）生存データ（２）死後観察ヒヒ＃１、２、５に対して実施した死後試験の要約
（生存動物を用いた以前の研究が組織学的な悪影響を示
さなかったので、生存ヒヒ＃３、４に対しては死後試験
を行わなかった）。動物＃１、２、５に対する全体的な
死後観察は互いに非常に似通っており、次の通りであ
る：肺：出血（3⁺⁺）腎臓：充血、壊死（3⁺⁺⁺）副腎：出血、壊死（4⁺⁺）肝臓：充血（2⁺）脾臓：うっ血および充血腸：外見は正常であるが、動物＃１、２において小腸に
腸重責が観察された。

心臓、すい臓、胃、結腸：外見は正常。

（３）10時間監視したときの生理学的およびその他のパ
ラメーター（ａ）ヒヒ＃３、４の生存利益と関連し、非生存ヒヒ
（＃１、２、５）と異なるパラメーターは：↑平均全身
動脈圧（MSAP）、↑pH、↓乳酸塩、↓BUN、↓クレアチ
ニン、↓SGPT、↓コルチゾル、↑グルコース、↓FDP、
および↑フィブリノーゲンであった。

（ｂ）生存（＃３、４）および非生存（＃１、２、５）
ヒヒ間に差がないパラメーターは：心拍数および呼吸
数、WBS、血小板、pCO₂、pO₂、CPK、ヘマトクリット、
コロニー（大腸菌）血中濃度、および体温であった。

完全な抗体を用いて実験を繰り返したが、有為な差は
認められなかった。従って、結合断片および完全抗体は
ともに本発明において利用できる。

前述のことから、本発明の細胞系列は低い中和量でヒ
ト・カケクチンと対応するモノクローナル抗体およびそ
の断片を得るための手段を提供する。これにより、多く
の内毒素保有細菌が原因の感染症に有効であり、しかも
安全に投与しうる予防および治療用組成物の開発がより
経済的にできるようになった。さらに、本発明抗体はい
ろいろな診断法や他の治療法においても利用されるであ
ろう。

本発明は理解しやすくするために、例示や実施例を用
いて詳しく開示されているが、いくつかの変更・修飾が
添付の請求の範囲内で可能であることが明らかだろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト・カケクチンと特異的に反応するモノ
クローナル抗体であって、ATCC寄託番号HB9736またはHB
9737の細胞系列により生産されるモノクローナル抗体。
【請求項２】請求項１記載のモノクローナル抗体または
その結合断片からなるカケクチン活性遮断剤。
【請求項３】ヒト・カケクチンの異なるエピトープと反
応することができ、少なくとも１種のモノクローナル抗
体が請求項１記載のモノクローナル抗体である、２種以
上のモノクローナル抗体またはそれらの結合断片を含む
組成物。
【請求項４】抗生物質またはヒト血漿からのγ−グロブ
リン画分をさらに含む、請求項２または３記載の組成
物。
【請求項５】請求項２または３記載の組成物、および生
理学的に許容しうる担体を含むカケクチン活性遮断用薬
剤組成物。
【請求項６】請求項１記載のモノクローナル抗体、抗菌
剤、ヒト血漿からのγ−グロブリン画分、および生理学
的に許容しうる担体を含む、感染症治療または予防用薬
剤組成物。
【請求項７】ヒト血漿からのγ−グロブリン画分は、内
毒素保有細菌と反応する免疫グロブリンの高レベルを示
すヒトから得られる、請求項６記載の薬剤組成物。
【請求項８】菌血症および／または敗血症にかかりやす
いヒト以外の動物に、予防または治療量の請求項２、３
または６記載の組成物を投与することから成る、菌血症
および／または敗血症にかかりやすいヒト以外の動物の
治療方法。
【請求項９】請求項１記載のモノクローナル抗体を生産
する細胞系列であって、ATCC寄託番号HB9736またはHB97
37である細胞系列。
【請求項１０】ATCC寄託番号HB9736である請求項９記載
の細胞系列。
【請求項１１】ATCC寄託番号HB9737である請求項９記載
の細胞系列。
【請求項１２】内毒素保有細菌感染症に特異的であり、
それを治療または予防することができるモノクローナル
抗体を生産する方法であって：請求項10または11記載の細胞系列の少なくとも１種を培
養し、前記抗体を回収することから成る方法。
【請求項１３】菌血症および／または敗血症にかかりや
すいヒト以外の動物を治療する方法であって：前記動物に、予防または治療量の、請求項１記載のモノ
クローナル抗体を投与することから成る方法。