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JP2608081B2 - 組換えタンパク質の精製方法及びその製品 - Google Patents

組換えタンパク質の精製方法及びその製品

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JP2608081B2
JP2608081B2 JP62501228A JP50122887A JP2608081B2 JP 2608081 B2 JP2608081 B2 JP 2608081B2 JP 62501228 A JP62501228 A JP 62501228A JP 50122887 A JP50122887 A JP 50122887A JP 2608081 B2 JP2608081 B2 JP 2608081B2
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Description

【発明の詳細な説明】 関連出願に対する相互参照 本出願は、1986年２月３日に出願された出願Serial N
o.825,597の部分継続出願であり、この出願は茲におい
て完全に準用される。
発明の背景 発明の分野 本発明は、微生物屈折封入体（microbial refractile
inclusion bodies）から従来公知の技術によっては可
溶化及び分離することが困難である、組換えタンパク質
及びポリペプチド類を単離する方法に向けられたもので
ある。この方法は微生物バイオマスの崩壊、屈折体の採
集、及び屈折体タンパク質の可溶化を含むものである。
可溶化は組換えタンパク質の遊離スルフヒドリル基を可
逆的或いは不可逆的保護剤（blocking ageuts）を用い
て保護して物理的、化学的、及び酵素的手段の組合わせ
により行なわれる。タンパク質の遊離アミノ基を次い
で、環状酸無水物とモレキュラーシーブ及びイオン交換
クロマトグラフィを用いて分離された個々のタンパク質
誘導体との反応により誘導化する。分離されたタンパク
質のスルフヒドリル基及びアミノ基を次いで脱保護す
る。
本発明には、分離された組換えタンパク質抗原で被覆
された固体支持体を含んでなる診断装置の製造、及びそ
の診断装置の体液内の抗体のアッセイのための使用が含
まれる。
背景情報についての簡単な説明 組換えDNA技術は微生物及びその他の宿主細胞におけ
る外来（異種）タンパク質の発現を可能にした。多くの
例において、組換えタンパク質の高度の発現はしばしば
「（細胞）封入体」或いは「屈折体（refractile bodie
s）」と称される高分子量集合体の形成に導く〔オール
ド・アンド・プリムロース（Old and Primrose）、「遺
伝子操作の原理（Princeples of Gene Manipulatio
n）」、第三版、ブラックウェル・サイエンティフィッ
ク・パブリッシャーズ（Blackwell Scientific Publish
ers）、オックスフォード、1985年、289〜290頁〕。こ
れらの封入体は次の二つの範疇に分けられる。即ち、第
一のものは必ずしも生来的なものではないが、タンパク
質がおそらく安定な立体配座にあるパラ結晶配列であ
り、及び第二のものは部分的及び完全に変性タンパク質
並びに不正確な翻訳の結果として合成された異常型タン
パク質を含有する無定形の集合体である。その様な異種
タンパク質の集合体は全細胞タンパク質の相当な部分を
構成する。
封入体はおそらく内在プロテアーゼに対するタンパク
質への保護を与えるものであるが、それらは実際水性緩
衝液に極めて難溶性であるので抽出及び精製の問題を提
起する。殆んどの場合において、変性剤及び洗剤（例、
グアニジン塩酸塩、尿素、ナトリウムドデシルサルフェ
ート（SDS）、Triton X−100）を用いてタンパク質を抽
出しなければならない。医薬的興味のある、特に非経口
投用のタンパク質に対しては洗剤及び変性剤の使用は、
特にタンパク質が広範な疎水性領域を有する場合にはそ
れらを完全に単離タンパク質から除去することが困難で
あるので、望ましくない。更に、強変性剤であるグアニ
ジン塩酸塩（グアニジン・HCl）を用いる場合には、単
離タンパク質の再変性は不可能でないにせよ、困難であ
り、従って、得られる異種タンパク質は不正確な折りた
たみ或いは立体配座により生物学的に不活性である。加
えて、比較的弱い変性剤である尿素が抽出剤として用い
られる場合には、幾つかのアミノ酸残基の修飾が生じ得
る。
屈折体の形態にある目的タンパク質の回収におけるも
う一つの問題は、屈折体タンパク質を他の宿主細胞物質
から分離することのみならず、又、引続いて屈折体タン
パク質汚染物質を目的屈折体異種タンパク質から除去す
る必要性があることである。この第二の問題は、おそら
く多分イオン的吸引性或いは疎水性結合による屈折体タ
ンパク質が相互に有する強い吸引性によるものと思われ
る。
一連の密接に関連した特許〔ビルダー等（Builder,et
al.）米国特許4,551,502号明細書、オルソン等（Olso
n,et al.）米国特許4,511,503号明細書、ジョーンズ等
（Jones et al.）米国特許4,512,922号明細書、及びオ
ルソン（Olson）米国特許4,518,526号明細書〕におい
て、発明者等は大腸菌（E.coli）屈折体組換えタンパク
質を天然の或いは誘導された不溶性状態から可溶性形態
に転換する方法を教示している。これらの技術は、タン
パク質の可溶化に関連する超音波処理或いは高圧下にお
ける均質化などの膜崩壊方法を、グアニジン・HCl及び
多SDSなどのイオン性洗剤中における強変性剤と組合わ
せて用いるものである。その様な処理後、組換えタンパ
ク質は２−メルカプトエタノールなどの還元剤の存在下
において尿素などの比較的弱い変性剤中へ緩衝剤交換に
より再生される（緩衝剤交換の前にタンパク質を亜硫酸
塩及び穏やかな酸化試薬に接触させることによる亜硫酸
分解を行なってよい）。組換えタンパク質を次いで、緩
衝化尿素の存在下において、イオン交換及びモレキュラ
ーシーブクロマトグラフィを用いて単離する。この様
に、これらの特許によれば、変性剤は全工程を通して及
び屈折体タンパク質の回収方法に引続いて存在しなけれ
ばならない。
キンセラ等（Kinsella et al.）からの二つの特許
（米国特許4,168,262号及び米国特許4,348,479号各明細
書）及び同一グループからの二つの技術レポート〔シェ
ッティ等（Shetty et al.）バイオケミカル・ジャーナ
ル（Biochemical Journal）、191:269〜272（1980）；
シェッティ等（Shetty et al.）、ジャーナル・オブ・
アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー
（Journal of Agricultural and Food Chemistry）、3
0:1166−1172（1982）〕は核タンパク質複合体から微生
物タンパク質をバルクで分離する方法を教示している。
この方法は、洗剤或いは変性試薬の不存在下における物
理的手段によるバイオマスの崩壊を含んでなるものであ
る。この後、遠心分離を行ない、細胞破片を除去し、水
溶性タンパク質物質−核酸混合物を無水シトラコン酸或
いは無水マレイン酸などの有機ジカルボン酸無水物を用
いて誘導化し、誘導化されたタンパク質（遠心分離によ
り不溶性細胞破片を除去）をpH4.0〜4.5における等電沈
澱に付する。次いで、保護Ｎ−アシル基を酸性pHにおい
て加水分解により除去し、タンパク質溶液を透析して塩
を除去し、及び核酸−減少したバルクタンパク質を凍結
乾燥或いは等電沈澱により単離する。これらの二つのキ
ンセラ等（Kinsella et al.）の特許及びシェッティ等
（Shetty et al.）の技術レポートの目標は、バルクの
微生物タンパク質をヒト消費用に適した形態で単離する
ことである。Ｎ−アシル化工程の目的は、目的バルクタ
ンパク質を微生物核酸汚染物質から分離することであ
る。
哺乳動物細胞からタンパク質を可溶化するためにシト
ラコニル化も又使用されている。エッシャー等（Eshhar
et al.）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノ
ロジー（European Journal of Immunology）、1:323−3
29（1971年）はラット胸腺細胞及びリンパ球からの60〜
70％の膜タンパク質がシトラコニル化により可溶化さ
れ、及びこれらのタンパク質誘導体がpH5において脱シ
トラコニル化されるまで抗原的に不活性であることを報
告した。元の抗原性に僅かに10〜20％が脱アシル化によ
り回収されたに過ぎなかった。ルンダール等（Lundahl
et al.）、バイオヒミカ・バイオフィジク・アクタ（Bi
ochim.Biophys.Acta）、379:304−316（1975年）は水−
不溶性ヒト赤血球膜タンパク質の部分を可溶化するため
にシトラコニル化の使用を開示した。シトラコニル化タ
ンパク質は更にSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（SDS−PAGE）或いはヒドロキシアパタイトカラム上で
更に分離された。
キンセラ等（Kinsella et al.）、インターナショナ
ル・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロティン
・リサーチ（International Journar of Peptide and P
rotein Research）、18:18〜25（1981年）は、タンパク
質のシトラコニル化はリジン残基の一級アミノ基のＮ−
アシル化に限定されないことを開示した。無水シトラコ
ン酸は又幾つかの遊離スルフヒドリル基をアルキル化し
て架橋に導き、依ってタンパク質の凝集に導く。
ライト（Light）、バイオテクニクス（Biotechnique
s）、3:298〜308（1985年）は、アミノ基が無水シトラ
コン酸を用いて誘導化された場所に折りたたまれていな
いタンパク質の溶解度が増大し、凝集が避けられること
を開示した。
スナイダー等（Snyder et al.）、カーボハイドレー
ト・リサーチ（Carbohydrate Research）、105:87〜93
（1982年）は、ヒト唾液タンパク質を可溶化するため
に、及びムチン糖タンパク質を外来タンパク質から解離
するために、シトラコニル化を用いている。個々のシト
ラコニル化タンパク質を分離する試みは何等なされてい
なかった。
それらの各種面において、タンパク質うの可溶化し、
汚染宿主細胞タンパク質を除去し、及び個々の組換えタ
ンパク質を生物学的及び免疫アッセイにおいて活性であ
り及び適当てあり、及び如何なる変性剤あるいは界面活
性剤の不存在下においても可溶且つ生物学的に活性であ
る形態で分離することに成功する方法を用いて、微生物
組換え異種タンパク質にい可溶化及び分離することにお
ける問題を解決する方法を提供することは有用であろ
う。
発明の概要 本発明は、微生物細胞内において産正され、それに対
して異種であり、及び細胞内部の屈折封入体、即ち不溶
性タンパク質の塊内に少なくとも部分的に堆積されてい
る組換えポリペプチド或いはタンパク質を活性な形態で
回収する方法に向けられたものである。本発明は又、本
発明の方法に回収された個々の組換えタンパク質により
被覆された固体支持体の製造にも向けられたものであ
り、該被覆固体支持体は固体状態タイプの診断アッセイ
に適したものである。
本発明は、バックグラウンド宿主細胞タンパク質か
ら、全細胞の溶解により、次いで任意の適当な方法、例
えば低速遠心分離などにより屈折体の回収により組換え
異種タンパク質を分離する方法に関する。この屈折体タ
ンパク質は界面活性剤／変性剤溶液に溶解され、スルフ
ヒドルリ基を可逆的或いは不可逆的に誘導化して引続く
タンパク質の操作に際してその様な基を保護し、誘導体
が次いで分画される。
組換えタンパク質の解凝集はこのタンパク質上に大き
な陰性電荷を課することにより、カチオン性アミノ基を
アニオン性カルボン酸基に転換することにより行なわれ
る。この二重の誘導化されたタンパク質を次いでクロマ
トグラフ操作により分別し、次いで精製組換えタンパク
質を未保護、再変性された生物学的に活性形態を回復す
る。
本発明の異なった実施態様は、脱保護後各種の診断ア
ッセイに適した組換えタンパク質で被覆された固体支持
体の製造に関する。
本発明のこれらの面は、それらの遺伝源或いは生物学
的性質の如何に拘らず、宿主細胞培養液中の不溶性異種
組換えタンパク質に適用可能な多段方法を提供するもの
であり、従って任意の目的生成斑い対する化学薬品及び
装置要件の均一性を提供する利点を有する。
これらの操作は一般的に適用可能であり、特別のタン
パク質に対して僅かに小さい修正或いは調整が必要とさ
れるに過ぎない。本発明の各種面はその適当な組合わせ
及び選択により屈折体タンパク質の回収の問題に解決を
与えるものである。
図面の簡単な説明 第１図は、活性目的組換えタンパク質をこのタンパク
質が産生された屈折体の形態で堆積されている宿主細胞
から単離するための一般的操作のフローシートである。
第２図は、組換えタンパク質を単離するための異なっ
た操作のフローシートである。
第３図は、第１図及び第２図の方法により回収された
組換えタンパク質を含む固体状態及び凝集アッセイに適
した装置の製造操作を示すフローシートである。
第４図は、Ultragel ACA 34カラムからのＳ−アルキ
ル化、Ｎ−シトラコニル化HTLV−III/LAV組換えタンパ
ク質の溶出プロフィールを示す。
第５図は、第４図において回収された組換えタンパク
質のSDS−PAGEによる分析を示す。
第６図は、アニオン交換Fractogel DEAE−TSKカラム
からのＳ−アルキル化、Ｎ−シトラコニル化HTLV−III/
LAV組換えタンパク質の溶出プロフィールを示す。第７
図は、第６図において回収された組換えタンパク質のSD
S−PAGEによる分折を示す。
第８図は、クエン酸ナトリウム緩衝液pH5.5中におけ
る37℃及び25℃における組換えHTLV−III/LAVタンパク
質の脱シトラコニル化の動力学を示す。
第９図は、シトラコニル化HTLV−III/LAVタンパク質
抗原の免疫反応性をタンパク質の脱シトラコニル化形態
と対比するものである。
好ましい実施態様の説明 屈折封入体が形成されている微生物及びその他の宿主
細胞からなる異種組換えタンパク質の回収のための有効
な方法を提供する本発明の手法と、本明細書の第１図及
び第２図のような各種利用可能な代替形態を含む図解形
態で示す。
簡単に説明すると、第１図の図式は幾つかの段階を有
する。第一の段階において、不溶性組換えタンパク質
は、強い外部細胞壁膜を、宿主細胞タンパク質が可溶化
されるか或いは少なくとも組換えタンパク質−含有封入
体を沈澱させるに十分な沈澱力において懸濁状態に留ど
まるようなpH及びイオン強度条件下で崩壊する酵素及び
／又は化学的手段を用いて、宿主細胞から放出される。
用いられる酵素及び化学薬品（洗剤及び弱い変性剤）は
宿主細胞壁及び膜及び核タンパク質体などの各種高分子
構造を攻撃して細胞溶解を促進することが知られている
ものである。沈澱ペレットは主として目的タンパク質を
含有するものであるが、それは又この段階においては除
去を必要とする少量の可溶性宿主細胞タンパク質で汚染
されている。
第二段階において、汚染宿主タンパク質を洗剤及び弱
い変性剤の両者を含む穏やかな溶液で洗浄することによ
る組換えタンパク質凝集物から除去する。
組換えタンパク質が細胞質条件下にin vivoで沈澱さ
れるにつれて、通常の水性可溶化技術が失敗するのは明
らかである。依って、第三段階において、封入体を溶液
にするためにより強烈な手段が用いられる。これを行な
うのに強い変性剤溶液が有効であることが判明した。
強い変性剤は又目的組換えタンパク質の三次元構造の
下りたたみを開いて遊離スルフヒドリル基を空気酸化そ
の他の望ましくない副作用に曝露する。この困難をなく
すために並びにスルフヒドリル基を以下に説明する本発
明の第四段階における環状酸無水物との反応から保護す
るために、本発明はこの第三段階において各種試薬によ
る遊離スルフヒドリル基の誘導化を提供する。本発明に
よるスルフヒドリル試薬は遊離スルフヒドリル基に可逆
的或いは不可逆的のいずれかにより結合するものであ
る。
目的タンパク質の部分的精製は、目的タンパク質が変
性剤の濃度が透析により低下されるにつれて溶液から沈
澱する条件下におちて透析或いは他の任意の方法により
スルフヒドリル誘導化反応混合液を脱塩することにより
達成される。
この段階において、宿主細胞の封入体をそれらの起源
として有した組換え及びその他の汚染タンパク質は高濃
度の強い変性剤の存在下においては尚凝集する傾向を有
する。しかしながら、変性条件下におけるタンパク質は
それらの正常な生物学的活性を示さない。この様に、強
い変性剤の不存在下において、組換えタンパク質を溶液
中に維持するための代替的手段が探索された。本発明の
第四段階によるこの代替法は、組換えタンパク質の遊離
アミノ基を選ばれた環状ジカルボン酸無水物化合物と反
応させることよりなるものである。この反応は、そのカ
チオン性アミノ基がアニオン性カルボン酸基に転換され
るにつれて、組換えタンパク質の総合電荷に変化をもた
らすものである。高度に陰性に荷電したタンパク質が互
いに反発し合って、封入体組換えタンパク質が水性媒体
内において凝集する傾向を減少させて、高度に望ましい
水溶性タンパク質単量体を生成するものと仮定される
が、しかし、本発明者等はこの仮説に拘束される意図を
有するものではない。弱い変性剤の存在下における単離
に引続き、及び透析或いはゲル過のいずれかにより脱
塩し、本発明のこの段階はこの様な誘導化された組換え
タンパク質のモレキュラーシーブ或いはイオン交換クロ
マトグラフィによる分別を提供するものである。
個々の回収されたタンパク質は少なくとも三つの様式
で利用することができる。第一の様式において、可逆的
に保護されたスルヒドリル基は適当に主段により脱保護
することができ、及び今だＮ−アシル化されている純粋
な組換えタンパク質を凍結乾燥により回収するか或いは
溶液中に凍結して保存することができる。この段階はま
だ完全に誘導化されているか、或いは部分的に誘導化さ
れているか、或いは非誘導化形態にある組換えタンパク
質を回収することを含む幾つかの代替様式を含むもので
ある。
本発明のもう一つの面は、純粋組換えタンパク質の回
収方法の幾つかの段階におけるその柔軟性である。第２
図に示す如く、第一段階において酵素消化及び機械的崩
壊の組合わせにより洗剤及び変性剤の不存在下において
細胞溶解を達成することができる。更に、第三段階にお
いて、スルフヒドリル基の保護に引続いて組換えタンパ
ク質の予備的精製を第１図に示したような強い変性剤の
濃度の減少に引続く凝集によらないでモレキュラーシー
ブ上におけるタンパク質分別により達成することができ
る。
本発明のもう一つの実施態様は、回収精製組換えタン
パク質の診断及びその他のアッセイへの利用に向けられ
たものである。本発明はこの様に又マイクロタイタープ
レート、ラテックスビーズなどの固体支持体をＮ−アシ
ル化組換えタンパク質で被覆し、アミノ基をその場で
（in situ）で脱保護してタンパク質に抗原性を回復さ
せ、及び脱保護された組換え抗原を、酵素−結合イムノ
アッセイ（ELISA）及びラテックスビーズ凝集アッセイ
（LBA）を含む固体状態アッセイに用いる方法も含んで
なるものである。これらの用途は本明細書中の第３図に
素描されている。
A.被精製タンパク質源の一般的説明 本発明において説明される発明は、微生物内における
発現に引続いて該細胞内に「屈折体」或いは「封入
体」、即ち光を屈折し且つ位相差顕微鏡を通して見た場
合に明るいスポットとして表われる小体、として現われ
る異種組換えタンパク質を単離、精製、再活性及び使用
するのに有用な操作に向けられたものである。本発明の
目的のためには、これらのタンパク質は「屈折タンパク
質」或いは「屈折体タンパク質」或いは「封入体タンパ
ク質」と称される。
組換えDNA技術を用いて宿主微生物に複製量の外来タ
ンパク質を産生することを誘発する場合には、その様な
タンパク質をしばしば「異種タンパク質」或いは「組換
えタンパク質」或いは「目的タンパク質」と称される。
本発明において、「タンパク質」という用語は、全ての
ポリペプチド類及びタンパク質を含んで意味する。本発
明において、「屈折」、「異種」、及び「組換え」は言
及び時点、例えばそれが本発明の方法により屈折形態か
ら可溶性形態に転換された後において、タンパク質の実
際の物理的状態に如何に拘らず、発現或いは精製のある
段階において位相差顕微鏡により沈澱として見ることの
できる宿主微生物内に発現されたタンパク質を示すもの
として互換可能に用いられる。
微生物宿主細胞内に発現される各種異種タンパク質、
例えばHTLV−III/LAVウィルス抗原、HTLV−IIウィルス
抗原、HTLV−Ｉウィルス抗原、及びネコ白血病ウィルス
抗原は通常見られる溶媒体条件下においては屈折体とし
て現われる。その他のその様な例としては、ヒト及びブ
タ成長ホルモン類、口蹄疫ウィルスキャプシドタンパク
質、繊維芽球インターフェロン、ヒトインシュリン、ソ
マトスタチン、アルファ、ベータ、及びガンマインター
フェロン、及びＢ型肝炎抗原などが挙げられる〔ビルダ
ー等（Builder et al.）上掲、及びオールド及びプリム
ロース（Old and Primrose）上掲、160−164頁〕。要す
るに、本発明の方法には該タンパク質が宿主細胞内に不
溶性屈折体として蓄積する宿主微生物内にDNA技術によ
り発現される任意のタンパク質が包含される。
本発明において、「宿主細胞」としては組換えDNA技
術において用いられる任意の微生物、例えばグラム陰性
細菌〔E.コリ（E.coli）、シュードモナス種（Pseudomo
nas spp.）、プロテウス種（Proteus spp.）、ナイセリ
ア種（Neisseriae spp.）の菌株から選ばれるが、好ま
しくはE.コリの菌株である〕、グラム陽性細菌〔バチル
ス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、コリネホルミ
ス種（Coryneformis spp.）、アクチノマイセート種（A
ctinomycetes spp.）、ストレプトミセス種（Streptomy
ces spp.）、メチロフィルス種（Methylophilus sp
p.）、シアノバクテリウム種（Cyanobacterium spp.）
の菌株から選ばれるが、好ましくはB.ズブチリスの菌株
である〕、サッカロミセス・セレビジアエ（Saccharomy
ces cerevisiae）などの酵母、真菌〔ノイロスポラ（Ne
urospora）、アスペギルス（Aspergillus）及びポドス
ペラ（Podospera）から選ばれる〕、及びクラミドモナ
ス（Chlamydomonas）などの藻類〔オールド及びプリム
ロース（Old and Primrose）、上掲、３章、４章、８章
及び10章〕などの任意のものが包含されるが、これらに
限定されるものではない。
本文脈内において、「宿主細胞」は、又は、異種タン
パク質の発現が上方温度シフトその他の手段により誘発
された任意の形態の微生物を指し、その生育培地内にお
ける全細胞培養液、収穫された細胞ペースト、ペースト
の凍結試料、或いはペーストの凍結及び解凍試料、典型
的には標準条件、例えば6000xgで60分まで、最も好まし
くは4000xgで30分間の標準的条件下に遠心分離により集
められた細胞を含むものとされる。
B.屈折体組換えタンパク質の回収 1.屈折体の回収 第１図は、活性目的タンパク質をこのタンパク質が発
現ベクターに応答して産生され、その後屈折体の形態で
堆積されている宿主細胞から単離する問題を解決するに
際して含まれる一般的操作を示すフローシートである。
第１図に示されるように、屈折体は宿主細胞内に封入
されているので屈折体を放出してそれらを例えば遠心分
離により回収し利用可能とするために先ず細胞を崩壊す
ることが好ましい。本発明の一面において、屈折体の部
分的精製は宿主細胞破片が低速遠心分離に際して上澄液
相内において残存するのに十分に崩壊することを確実に
することによって単純に得られる。本発明のこの面にお
いて、細胞は0.01M〜2M、好ましくは0.1〜0.2Mのイオン
強度を用いてpH5〜9.5、好ましくは８〜９の緩衝液内に
おいて洗浄及び再懸濁される。任意の適当な塩、好まし
くは塩化ナトリウムを用いて、適当なイオン強度レベル
を維持することができる。通常のイオン濃度の目安であ
るイオン強度は、存在する各イオン濃度Ｘその上の電荷
の２乗の積の合計の1/2と定義される。任意の適当な緩
衝液を用いてpHを正しい範囲に維持してよいが、Tris塩
酸塩（Tris・HCl）緩衝液がこの範囲におけるその緩衝
化能力及びその生化学的不活性によりpHを８〜９に維持
するのに好ましい緩衝液である。
細胞は前記緩衝液中に懸濁されながら、次いでこの目
的のために通常用いられる技術により溶解される。細胞
溶解は酵素的及び／又は化学的手段の組合わせにより達
成される。この目的のために通常用いられる酵素として
はRhiz.solaniからの「溶解酵素混合物」、Arth.luteus
からの「リチカーゼ」、Strep.globisporusからの「ム
タノリシン」、Staph.staphlolyticusからの「リゾスタ
フィン」、ウシ膵臓及び／又は脾臓からのデオキシリボ
ヌクレアーゼ（DNAse）及びリゾチーム（ムラミダー
ゼ）などが挙げらる。リゾチーム＋DNAseを用いるのが
好ましい。又、目的タンパク質を宿主細胞自身のプロテ
アーゼによる攻撃から保護することも望ましい。これ
は、溶解混合物を肺タンパク質アポプロチニン、大豆ト
リプシン阻害剤或いはフェニルメチルスルホニルフルオ
ライド（PMSF）などのプロテアーゼ阻害剤、好ましくは
アポプロチニン及びPMSFを接触させることにより達成す
ることができる。
又、細胞壁／膜内の疎水性構造を洗剤、例えば界面活
性剤を用いて崩壊することも好ましい。細胞溶解はポリ
オキシエチレンエーテルタイプ、例えばTriton X−15乃
至Triton X−405、Triton N−101、Triton WR−1339、L
ubrol−PX、好ましくはTriton X−100を細胞溶解段階に
おいて屈折体を崩壊しない程度に十分に低い濃度で含む
非イオン性洗剤により助けられる。洗剤濃度は0.005〜
１％、好ましくは0.1〜0.2％のオーダである。
細胞が十分に崩壊されて沈澱するように十分に大きい
径の細胞断片が全くないか或いは最少量であると判断さ
れた時点において溶解懸濁液を約500〜600xg、好ましく
は5000〜6000xgの低速で標準的遠心分離器内で容量に応
じて異なる適当な時間、通常20〜30分間遠心分離にかけ
る。得られたペレットは通常（位相差顕微鏡により決定
して）まだ吸着宿主細胞タンパク質及び膜断片により汚
染されている屈折体を含有する。
汚染物質は適当な緩衝液中において屈折体ペレットを
繰返し懸濁することにより除去することができ、好まし
くはTris・HSl緩衝液pH8〜９中で0.1〜0.2％ Triton X
−100で２回、Tris・HCl緩衝液pH8〜９中で0.15〜2M Na
Clで１回、１〜10mMエチレンジアミンテトラアセテート
（EDTA）などのキレート化剤及び市販の（Pierce Chemi
cal社）SDS、LDS、CHAPS、CHAPSO及びZwittergent、好
ましくはZwittergent3〜14（0.05〜0.3％、好ましくは
0.1〜0.2％）の中から選ばれたイオン性洗剤を含有する
Tris・HCl緩衝液（pH8〜９）で１回、及びTris・HCl緩
衝液pH8〜９中の例えば２〜10M、好ましくは５〜6M尿素
などの弱い変性剤溶液で１回行なわれる。
「変性溶液」とは「変性剤」を含有する溶液を指し、
「変性剤」とは茲に水溶液中においてタンパク質の立体
配座を水和状態、溶媒環境或いは溶媒−表面相互作用を
変更することにより変化することのできるカオトロピッ
ク化合物を指す。変性剤の具体例としては、尿素、グア
ニジン・HCl、及びナトリウムチオシアネートが挙げら
れるが、又洗剤、即ち上記界面活性剤なども含まれる。
掲げられた試薬のあるものは強い変性剤であるのに対
し、他のものはより弱いものである。これらの任意のも
のの濃度は勿論その強度及び有効性に直接影響を及ぼ
す。
「強い」及び「弱い」の間に正確な分割線は存在しな
いが、一般的に強い変性剤はタンパク質をそれらの生来
の立体配座からより完全に変性するものである。屈折タ
ンパク質を溶解するのに有用な最も普通に用いられる強
変性環境はイオン性変性剤、グアニジン・HClの十分に
高い（４〜9M）濃度である。尿素は十分に高い、例えば
7Mの濃度であっても幾らかのタンパク質二次構造の保持
を許容するので、比較的弱い変性剤の最も頻繁に用いら
れる例である。従って、第１図に示す如く、屈折体の弱
い変性剤、例えば尿素の溶液による洗浄は屈折体自身を
溶解することなく、汚染宿主タンパク質を除去する。
2.スルフヒドリル基の誘導化 屈折体タンパク質の遊離スルフヒドリル基をスルホン
酸への空気酸化及びタンパク質のジスルフィド架橋など
の望ましくない副反応に対して、並びに下記段階３にお
ける環状酸無水物との反応に対して保護することが望ま
しい。
従って、上記の如く調整された屈折体はスルフヒドリ
ル基をそれらの還元状態に維持するように計画された還
元剤の存在下において強い変性溶液、好ましくはグアニ
ジン・HCl（Tris・HCl緩衝液、pH8〜９中６〜7M）内に
溶解される。典型的な還元剤としては２−メルカプトエ
タノール、ジチオスレイトール（DTT）システィン、或
いはナトリウムホスホロチオレートなどが挙げられる
が、これらに限定されるものではない。又、ミーンズ・
アンド・フィーニィ（Means＆Feeney）、「タンパク質
の化学的修飾（Chemical Modification of Protein
s）」、Holden−Day社、サンフランシスコ、1971年、第
８章参照。２−メルカプトエタノール（0.1〜1.0M）が
好ましい。その後、遊離スルフヒドリル基は可逆的に或
いは不可逆的に誘導化されるが、その選択は個々の回収
される組換えタンパク質が生物学的或いは免疫学的活性
のために、そのスルフヒドリル基が遊離状態にあること
を必要とするか否かに基づくものである。その様な遊離
性が必要でなければ、保護基の化学的付加の容易性及び
完全性の理由により、又、不可逆性誘導体の化学的安定
性の理由により不可逆的誘導化が選ばれる。
組換えタンパク質スルヒドリル基の不可逆的アルキル
化は標準的操作により典型的には該タンパク質を過剰
（好ましくは５〜10倍モル過剰）のヨード酢酸、ヨード
酢酸アミド、Ｎ−エチルマレイミド、３−ブロモプロピ
オン酸、アクリロニトリル、好ましくはヨード酢酸から
選ばれたアルキル化剤と室温において0.5〜２時間、好
ましくは１時間、アルカリ性pH（pH8〜９）を反応に際
して強アルカリ好ましくはNaOHを添加することにより維
持して、接触させることにより達成される。ミーンズ及
びフィーニィ（Means＆Feeney）、上記第６章及び第８
章参照。
後に組換えタンパク質のスルフヒドリル基から保護部
分を除去することが望ましい場合には、組換えタンパク
質スルフヒドリル基の可逆的誘導化は、該スルフヒドリ
ル基をモル過剰の、それとスルフヒドリル基がジスルフ
ィド結合を形成するグルタチオン、システィン、5,5′
−ジチオビス（２−ニトロベンゾエート）、或いはｏ−
ヨードソベンゾエートの中から選ばれた試剤と接触させ
ることにより達成することができる。或いは又、遊離ス
ルフヒドリル基は亜流酸ナトリウムとの反応によりＳ−
スルホネート誘導体に或いはナトリウムテトラチオネー
トとの反応によりＳ−スルフェニルスルホネート誘導体
に転換することができる。ワーク等（Work et al.）
（編者）「生化学及び分子生物学における実験技術（La
boratory Techniques in Biochemistry and Molecular
Biology」中のグレーザー等（Glazer et al.）、「タン
パク質の化学的修飾（Chemical Modification of Prote
ins）」、Elsevier、アムステルダム、（1976年）、108
〜110頁。適当な時点において、ジスルフィド、Ｓ−ス
ルフェニルスルホネート及びＳ−スルホネート誘導体は
該誘導体を高還元ポテンシャルを有する還元剤、好まし
くは２−メルカプトエタノール及びDTTと接触させるこ
とにより遊離スルフヒドリル状態に回復することができ
る。スルフヒドリル基の可逆的保護は制御された組換え
タンパク質の再生及び分子内ジスルフィド結合の形成を
可能にしてそれにより正しい生来の立体配座を達成する
機会を増大する。
第１図に示した実施態様に従えばアルカリ性媒体中に
おける強い変性剤の濃度を減少することにより選択的沈
澱によるスルフヒドリル基の誘導化に続いて組換えタン
パク質の部分的精製を達成することが可能である。これ
は誘導化反応混合物をホウ酸ナトリウム緩衝液に対して
透析することにより行なうのが最も好ましい。緩衝液濃
度は0.01〜1M、好ましくは0.05〜0.10Mであり、pHな８
〜10、好ましくは8.5〜9.5である。沈澱タンパク質は上
記の如く低速遠心分離によりペレットとして回収され
る。
3.アミノ基の環状ジカルボン酸無水物による誘導化 一度達成された屈折体組換えタンパク質の溶解度は可
溶化タンパク質がより弱い変性溶液、例えば高濃度の緩
衝化尿素中に交換される場合にしばしば維持されるが、
この同一の弱い変性媒体中の初期の溶解度は非実用的で
ある。熱力学的或いは動力学的理由を問わず、屈折体タ
ンパク質はこれらの強烈でない変性条件下では合理的時
間内に溶解しない。従って、初期可溶化に対してグアニ
ジン・HClの強い変性溶液が必要とされ、弱い変性溶液
はその後溶解度を維持することができる（上記、オルソ
ン）。屈折体タンパク質の溶解度問題を克服するため
に、又必ずしも変性剤を使うことなくそうするために
は、組換えタンパク質に大きな陰性電荷が課され、陰性
電荷はタンパク質の水溶性、単量体状態への解凝集を促
進する。
本発明のこの面は、目的タンパク質の遊離アミノ基を
アルカリ性条件下に特別の環状ジカルボン酸無水物と接
触することに向けられており、この接触はカルボン酸基
末端を形成するＮ−アシル基の可逆的形成に導き、それ
らの全てはイオン化され、従って数値的に弱有機酸のイ
オン化定数よりも全てのpH値、即ち約４のpHを越えるpH
において陰性に荷電される。
アミノ基の環状酸無水物によるアシル化の可逆性は加
水分解反応の分子内触媒としての粒子に対して特別に配
向したプロトン化カルボキシル基の存在に依存する。こ
の配向は炭素・炭素二重結合の周りのカルボキシル基の
シス−立体配置或いはヒドロフタル環上の隣接カルボキ
シル基の配置の結果である。グレーザー等（Glazer et
al.）、上記、79−84頁。
上記望ましい特性を有する環状酸無水物の一般構造は
次の如く表わすことができる： （式中、左側の図におけるR1及びR2は水素原子及びアル
キル基の任意の組合わせから選ぶことかできる。右側に
示された構造においては、4,5−結合に単一或いは二重
結合のいずれでもよい）。
これらの条件の結果、適当な環状酸無水物の具体例と
してはシトラコン酸無水物（モノメチルマレイン酸）、
無水マレイン酸、無水ジメチルメレイン酸、エキソ−シ
ス−3,6−エンドキソ−Δ４−ヘキサヒドロフタル酸無
水物、及びエキソ−シス−3,6−エンドキソ−Δ４−テ
トラヒドロフタル酸無水物などが挙げられるが、これら
に限定されるものではない。特別の組換えタンパク質に
最も適した特別の酸無水は当業者の技術内の試験により
選ぶことができる。
組換えタンパク質は高濃度（６〜9M、好ましくは７〜
8M）の弱い変性溶液、好ましくはホウ酸ナトリウム緩衝
液（１〜100mM、好ましくは40〜60mM）中の尿素中にpH8
〜10、好ましくはpH8.5〜9.5において溶解される。溶解
完結後、組換えタンパク質を、過剰（５〜100倍モル過
剰、好ましくは40〜60倍モル過剰）の添加される全無水
物の1/40を表わすアリコートとして添加される環状ジカ
ルボン酸無水物とpHを強アルカリ、好ましくは5N NaOH
の添加により８〜10、好ましくは8.5〜9.0に維持しなが
ら接触させる。
4.誘導化に続くタンパク質分別 上記Ｎ−アシル化反応の完結後、反応混合物を脱塩し
て過剰の環状ジカルボン酸無水物及びその加水分解生成
物、即ちジカルボン酸自体を除去する。これは本発明に
従えば、アルカリ性緩衝液例えばホウ酸ナトリウム（0.
01〜0.20M、好ましくは0.05〜0.01M;pH8〜10、好ましく
はpH8.5〜9.0）に対して透析することにより達成するこ
とができる。
透析の代りに、或いは引続いて組換えタンパク質二重
−誘導体をモレキュラーシーブ或いはイオン交換タイプ
のいずれかのクロマトグラフィマトリックス上の分別に
より回収することができる。適当なモレキュラーシーブ
カラムとしてはUltragel（LKB Products）、Fractogel
（Pierce Chemical Company）およびSepharose、Sephad
ex及びSephacryl（Pharmacia Fine Chemicals）などが
挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ま
しい実施態様においては、組換えタンパク質誘導体はホ
ウ酸ナトリウム緩衝液（0.01〜1.00M、pH8.5〜9.5）で
平衡化されたUltragel ACA34ゲルカラム上の分別され、
溶出プロフィールはタンパク質の最大紫外線吸収領域で
ある280nmの波長において追跡される。溶出組換えタン
パク質の分子量は通常用いられる標準的タンパク質の溶
出容積を参照して推定される。
適当なイオン交換カラムとしてはFractogel TSK−DEA
E（Pierce Chemical Company）或いはDEAE−Sepharose
及びDEAE−Sephacel（Pharmacia Fine Chemicals）など
が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好
ましい実施態様において、組換えタンパク質はホウ酸ナ
トリウム緩衝液（0.01〜0.10M.pH8.5〜9.5）中で平衡化
されたFractogel TSK−DEAE−650のカラム上で分別さ
れ、タンパク質は上記ホウ酸ナトリウム緩衝液中の0.3
〜1M塩化ナトリウムの塩勾配により溶出される。Fracto
gel TSK−DEAEイオン交換体はそのより大きな剛性及び
より速い流速により好ましい。
クロマトグラフィカラムから溶出される組換えタンパ
ク質溶液は凍結乾燥してタンパク質を粉末形態で回収す
るか或いは典型的に−20℃〜−180℃において凍結貯蔵
することができる。
5.アミノ及びスルフヒドリル基の脱保護 本発明のもう一つの面において、上記純粋組換えタン
パク質をその生来の状態に脱保護、即ち保護基をスルフ
ヒドリル基から除去することにより（誘導化が可逆的で
ある場合）、及びアミノ基からアシルカルボン酸基を除
去することにより回復することができる。例えば、組換
えタンパク質のＮ−アシルカルボン酸基を該タンパク質
を酸性緩衝液と３〜６、好ましくは4.0〜5.5のpH値にお
いて、適当な温度において適当な時間の長さ接触させる
ことにより加水分解することができる。タンパク質のμ
ｇ対酸性緩衝液のμmolの比率は約1:15である場合に、
加水分解は約室温（25℃）において約24時間以内に、約
37℃において約16時間以内に完結し；加水分解は37℃に
おいて約１時間以内に及び約25℃において約２時間以内
に約50％を完結する。組換えタンパク質が完全に抗原的
であるためにアミノ基の脱保護が必要とされる。シトラ
コニル化HTLV−III/LAV抗原は、例えば以下に説明するE
LISAアッセイにより判定して脱保護タンパク質の僅かに
約半分の抗原性を有するに過ぎない。
幾らかの屈折体組換えタンパク質が反発性アシルカル
ボン酸基の除去後、特にタンパク質が濃溶液中にある場
合に凝集することは本発明の一面である。従って、その
様な単離タンパク質が、以下に示すように、それらが固
体担体上に吸着される準備が整うまで脱保護されないこ
とが本発明の重要な面である。その他の場合には、ワク
チン或いは治療目的のために用いられる組換えタンパク
質は生物学的に活性な立体配座への適当な再生を可能に
し、及びその溶解度特性を保つ条件下において脱保護さ
れるべきである。
ある組換えタンパク質、例えばHTLV抗原については、
完全な生物学的活性を達成するためにスルフヒドリル基
を脱保護する必要がない場合がある。しかし、組換えタ
ンパク質抗原の性質に従って、スルフヒドリル基を脱保
護する必要がある場合には、本発明は又はスルフヒドリ
ル基のそれらの生来の状態への回復に向けられたもので
ある。本発明に従えば、これは組換えタンパク質上のＮ
−アシルカルボン酸部分の存在或いは不存在に如何に拘
らず達成することができる。標準的方法（ミーンズ及び
フィーニー、上記、第８章）に従えば、Ｓ−スルホン化
及びＳ−スルフェニルスルホン化組換えタンパク質はそ
れらの遊離スルフヒドリル対応物に0.02〜1M Tris・HCl
或いはリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0〜7.6中の１モル
のタンパク質を２−メルカプトエタノール、ジチオスレ
イトール、ナトリウムホスホロチオレート、ホウ水素化
ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの還元剤、好ましく
は0.1〜0.7M 2−メルカプトエタノールと37℃において1
5分間或いは25℃において60分間接触することにより還
元することができる。その後、反応混合物は適当な緩衝
液に対して透析することにより脱塩される。同様の標準
的操作により、ジスルフィド結合をシスティン、グルタ
チオン及び5,5′−ジチオビス（２−ニトロベンゾエー
ト）などの部分に還元する。
6.組換えタンパク質の代替的回収方法 本発明のもう一つの面は、純粋屈折体組換えタンパク
質の誘導化形態における回収方法の幾つかの工程に関す
るその柔軟性である。第２図に示された代替的手法にお
いては宿主細胞溶解は第１図に用いられた酵素的−化学
的組合わせの代りに酵素的及び機械的手段の組合わせに
より行なわれる。
第２図において、第１図におけるような細胞のTris−
緩衝化塩水による洗浄後、細胞をPMSF（0.5〜2.0M）、D
TT（0.01〜1.0M）、Triton X−100（0.05〜0.3％）、ED
TA（Tris・HCl緩衝液（0.01〜0.10M、pH8〜９）中１〜2
0mM）中に懸濁し、次いで第１図と同様な溶解酵素との
接触と共に超音波振動、均質化、ミル内の磨砕或いは圧
力セルへの曝露などと共に溶解され、変性剤は用いられ
ない。
第２図の方法のもう一つの面において、組換えタンパ
ク質のスルフヒドリル基の誘導化に続いて、目的タンパ
ク質の部分的精製が第１図の方法の沈澱方法によらず、
弱い変性剤、好ましくは8M尿素の存在下において操作さ
れるSepharose 6B−CL（Pharmacia Fine Chemicals）の
存在下においてモレキュラーシーブ上の分別により達成
される。このマトリックスは通常の水性緩衝液系におい
て不溶性であり凝集されるタンパク質の回収に特に適し
たものである。
C.精製組換えタンパク質の診断装置における使用 純水な組換えタンパク質抗原が結合された固体支持体
を含んでなる診断装置を製造することができることは極
めて有用である。この装置はヒト及び動物の血清及びそ
の他の体液に存在する様な抗原に対する抗体のための固
体状態イムノアッセイ及び凝集アッセイを行なうのに適
当なものである。本発明によるその様な診断装置の製造
は第３図のフローシートに要約されている。
第３図に説明される本発明の一面において、精製組換
えタンパク質はマイクロタイタープレートのウエルに吸
着される。典型的には、その様なプレートとしてはポリ
スチレン及びポリプロピレンが挙げられるが、これらに
限定されるものではない。アルカリ性緩衝液、好ましく
はホウ酸ナトリウム（0.01〜0.10M、pH8.5〜9.5）中に
溶解されたＮ−アシル化組換えタンパク質、好ましくは
Ｎ−シトラコニル化組換えタンパク質のアリコートをマ
イクロタイタープレートの各ウエルに添加する。各ウエ
ルに投入される組換えタンパク質の量は、このタンパク
質の生物学的活性に従って及び引続き用いられるアッセ
イの感度に従って調整される。典型的には、HTLV抗体に
対するELISAアッセイに対しては、ウエル当り0.01〜0.1
0mlの溶液中の0.1〜1.0μｇのタンパク質で十分であ
る。
抗原の添加後、本発明に従えば組換えタンパク質から
のアミノ基からの酸アシル基を加水分解するために10〜
20倍モル過剰の弱酸緩衝液がウエルに添加される。加水
分解緩衝液のpHは酢酸ナトリウム緩衝液に対して3.5〜
6.0の範囲であり、好ましくはpH4であり、及びクエン酸
ナトリウム緩衝液に対してはpH5.5〜5.6である。プレー
トは遊離アミノ基に対して標準的トリニトロベンゼンス
ルホン酸（TNBS、ミーンズ及びフィーニー、上記、217
頁）試験により決定されるＮ−酸アシル基を完全に加水
分解するのに必要な時間インキュベートされる。これは
37℃で約16時間以内或いは25℃において24時間以内に生
ずるが、より短い時間が好ましい。脱アシル化組換えタ
ンパク質のウエルへの吸着が完了後、ウエル内の溶液を
吸引して廃棄する。
標準的操作に従えば、組換えタンパク質及びウエルの
プラスチック表面の両者の上の非特異的結合部位は、例
えば純粋ウシ血清アルブミンの希釈溶液（典型的には、
標準リン酸緩衝塩水、pH7.6中等容量の0.1〜２％溶液）
で保護される。アルブミン溶液を次いで吸引廃棄し、ウ
エルを風乾させる。
本発明のもう一つの面において、それに組換えタンパ
ク質が吸着されるラテックスビーズを含んでなる診断装
置が製造される。この装置はラテックスビーズ凝集アッ
セイに特に適したものである。本発明に従えば、Ｎ−ア
シル化組換えタンパク質抗原、好ましくはシトラコニル
化組換えタンパク質が30μg/mlの濃度でアルカリ性緩衝
液、典型的には炭酸ナトリウム緩衝液、pH8.5〜9.5中の
１〜４％懸濁液としてのラテックスビーズ（好ましくは
0.1〜1.0μ直径のポリスチレンビーズ）に物理的に吸着
される。ビーズへのタンパク質の吸着に引続き、即ち撹
拌しながら25℃で16時間の間、酢酸ナトリウム緩衝液
（0.05〜1.0M、pH3.5〜4.5）などの弱い酸緩衝液を添加
して組換えタンパク質のＮ−酸アシル基を加水分解す
る。抗原−被覆ラエックスビーズを低速遠心分離により
単離し、上澄流体を吸引廃棄し、及びビーズを次いでラ
テックスビーズ面の非−特異的結合部位に吸着するよう
にしたタンパクの溶液内に再懸濁する。本発明に従え
は、これはビーズを0.01〜0.10％の非イオン性ポリエト
キシエーテル洗剤、好ましくはTween20をも含有する標
準的リン酸緩衝塩水（PBS、pH7.6）内の0.5〜2.0％（w/
v）のウシ血清アルブミンの溶液内にビーズを懸濁する
ことにより達成される。ビーズの懸濁液の最終濃度は0.
1〜1.0重量％、好ましくは0.5〜0.6％である。ビーズは
40℃において、冷蔵庫内に貯蔵されるべきである。
D.診断装置を用いるアッセイ 本発明により製造される診断装置は各種アッセイにお
いて利用することができる。
本発明の一面において、そのウエルが本発明に従って
得られた組換えタンパク質抗原で被覆されているマイク
ロタイタープレートは、ヒト及び動物の体液及び組織内
の該抗原に対する抗体のためのELISAアッセイに特に有
用である。ELISA試験はE.エングバル（E.Engvall）、メ
ソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymol
ogy）170:419〜438（1980）に従って行なわれ、これは
本明細書において準用する。
本発明のこの面において、適当な希釈率の被分析流体
のアリコートを吸着組換えタンパク質抗原を含有するウ
エルに添加する。抗原−抗体反応が完結後、典型的には
25゜〜40℃で30〜120分インキュベーション後、ウエル
内の流体を吸引廃棄し、ウエルをPBS pH7.6で洗浄す
る。
その後、各ウエルに第二の抗体、例えばそれに共有的
にアッセイの要件に従って選ばれる、好ましくはワサビ
ダイコンペルオキシダーゼ或いはアルカリホスファター
ゼなどのレポーター分子を共有的に結合した抗−ヒトIg
Gの溶液を添加する。
第一抗体及び第二抗体の反応が完結（25℃〜40℃にお
いて0.5〜24時間インキュペーション）後、ウエルをPBS
で洗浄し、レポーター分子を典型的には適当なクロマゲ
ン溶液、好ましくはアルカリホスファターゼに対しては
ｐ−ニトロフェニルホスフェート、及びペルオキシダー
ゼレポーターに対しては過酸化水素＋ジアミノベンジジ
ン及び硝酸銅を用いてレポーター分子が検出される。次
いで、マイクロタイタープレート分光光度計内で吸光度
を読取る。本発明のこの面を実施するためには、公知の
任意のレポーター分子が使用される。
本発明のもう一つの面において、上記方法に従って得
られた組換えタンパク質抗原で被覆されたラテックスビ
ーズを用いてヒト及び動物の体液内に存在する該タンパ
ク質に対する抗体のアッセイを行なう。ラテックスビー
ズ凝集試験は、ウィリアムス及びチェア（Williams and
Chare）、メソッズ・イン・イムノロジー・アンド・イ
ムノケミストリー（Methods in Immunology and Immuno
chemistry）、（1977年）、115〜125頁に従って行なわ
れ、これは本明細書において準用する。本発明に従え
ば、血清或いはその他の体液の小アリコート（５〜50μ
ｌ）を抗原−被覆ラテックスビーズの懸濁液の小アリコ
ート（３〜30μｌ）とガラススライド上で混合する。本
発明に従えば、抗原と抗体の反応を完結するために必要
な時間典型的には５〜10分間、25℃においてゆっくりス
ライドを回転するのが好ましい。本発明に従う陽性の終
了点は、肉眼或いは顕微鏡的に見えるラテックスビーズ
のマクロ凝集である。
以上、一般的に本発明を説明したが、これは以下の実
施例を参照することにより、より明確に理解され、特に
断りのない限りこれらのいずれも本発明を限定する趣旨
のものではない。
例１及び２は屈折体組換えタンパク質の可溶化及び精
製誘導化形態のその様なタンパク質の回収よりなる本発
明の面に関する。
例３及び４は精製組換えタンパク質抗原の固体支持体
への被覆及びその様な被覆固体支持体の幾つかの各種ア
ッセイにおける利用によりなる本発明の側面に関する。
全てのこれらの例は、本発明の方法により精製された
特定の異種組換えタンパク質に関する。精製の詳細は勿
論用いられた特定のタンパク質により異なる。本発明の
操作は、全ての場合において同様であるが、ある種の詳
細例えば変性剤の選択及び目的タンパク質の可溶化、適
当なサイジングゲル或いはイオン交換樹脂の選択、並び
に各工程において適当なイオン強度及びpH条件はタンパ
ク質の性質に応じて異なる。しかしながら、組換えタン
パク質は十分に共通の性質を有するのでこれらの小さな
変更は問題となる特別のタンパク質に操作を適用させる
のに十分である。
これらの例において引用された全ての文献は本出願に
準用する。
例１ 誘導化された屈折体組換えタンパク質抗原の水溶性性形
態における単離のための操作−第１図の方法 E.コリ（E.coli）細胞を4000xgで30分間遠心分離によ
り集め、0.15M NaCl−50mM Tris・HCl緩衝液、pH8.5で
１回洗浄し、及び４容の50mM Tris・HCl緩衝液、pH8.5
中に懸濁した。
細胞を次いで2mg/gペレット化細菌のリゾチームで30
μg/gペレット化細菌のaprotinin（アプロチニン）の存
在下において溶解した。細胞を更に0.2％ Triton X−10
0及び70mg/gペレット化細菌のDNAseを添加して崩壊し
た。60分間撹拌して最大溶解をさせた後、不溶性凝集
物、砂ち屈折体の形態の組換えタンパク質を6000xgで30
分間遠心分離させることにより集めた。これらの凝集物
を50mM Tris・HCl緩衝液、pH8.9中の0.2％ Triton X−1
00で２回、50mM Tris・HCl緩衝液pH8.9中の1M NaClで１
回、50mM Tris・HCl緩衝液、pH8.9中の0.2％ Zwitterge
nt3〜14及び5mM EDTAで１回、及び50mM Tris・HCl緩衝
液pH8.9中6M尿素で１回洗浄した。
これらの封入体を50mM Tris・HCl緩衝液、pH9.0中の6
Mグアニジン・HCl及び0.5％２−メルカプトエタノール
に溶解した。遊離スルフヒドリル基は２−メルカプトエ
タノールに対して５倍モル過剰のヨード酢酸で25℃にお
いて１時間アルキル化した。反応に際して、5N NaOHを
添加することにより8.5のpHを維持した。アルキル化タ
ンパク質の部分精製は50mMホウ酸ナトリウム緩衝液、pH
9に対する透析に際してその様なタンパク質の選択的沈
澱により達成され、グアニジン・HClを除去した。この
タンパク質を低速遠心分離によりペレットとして回収し
た。
50mMホウ酸ナトリウム緩衝液pH9.0中の100mlの8M尿素
に溶解した100〜150mgの組換えタンパク質に25℃におい
て一定に撹拌しながら100μｌのアリコートの4mlの無水
シトラコン酸を添加し、pHをNaOHを添加することによ
り、9.0に保った。反応の完結を確実にするために更に3
0分の反応時間後、反応混合物を50mMホウ酸ナトリウム
緩衝液pH8.5〜9.0に対する透析により或いはTrisacryl
GF 05（LKB Products）上のゲル過のいずれかにより
脱塩した。
1mlの溶液中5mgのシトラコニル化タンパク質を50mMホ
ウ酸ナトリウム緩衝液pH9.0で平衡化したUltragel ACA
34のモレキュラーシーブカラム（0.75cmI.D.×90cm）を
通して過することにより精製した。溶出プロフィール
は280nmにおける吸光度に従うことにより追跡し、標準
タンパク質の溶出プロフィールと対比した。第４図に示
す如く、組換えHTLV−III/LAV抗原は約35.000のMr単量
体に対応する位置に溶出した。質量基準でタンパク質を
分離するSDS−PAGEによるピークゲル過画分の分析は
約35,000のMrの１個の主たるバンドプラス数個の汚染高
分子量種の存在を示した（第５図）。
シトラコニル化タンパク質は又はイオン交換カラム上
で分別した。一例において、100mlの50mMホウ酸ナトリ
ウム緩衝液、pH9.0中の100mgのシトラコニル化タンパク
質を、Fractogel DEAE−TSK 650の2.5×17cmカラムに2m
l/分の流速でかけ、50mMホウ酸ナトリウム緩衝液pH9.0
中の500mlの0.3〜M NaCl勾配により溶出した。HTLV−II
I/LAV抗原（30mg）は0.4〜0.5M NaClの間に溶出した
（第６図のピークII）。小量の汚染タンパク質（ピーク
Ｉ）も又存在した。第６図のピークIIにおける組換えタ
ンパク質をSDS−PAGEにより分析した（第７図）。その
結果、主たるバンドは脱シトラコニル化時に約35,000の
Mrのタンパク質に対応した。
第７図はトランスフェクションされたE.コリ及び精製
されたHTLV−III/LAV（Delta G71A）ポリペプチド類の
クーマシーブルー−染色10％ポリアクリルアミドゲルと
写真である。レーン１はLambda PL及びHTLV−III/LAVポ
リペプチドをコードする遺伝子によりトランスフェクシ
ョンされた80μｇのE.コリのSDS−PAGE分析結果であ
る。レーン２は誘発に引続き、Lambda PL及びHTLV−III
/LAVポリペプチドをコードする遺伝子によりトランスフ
ェクションされた80μｇのE.コリのSDS−PAGE分析結果
である。35,000Mrタンパク質の発現における増大に注
意。レーン３はシトラコニル化後の、しかし脱保護なし
のSDS−PAGE分析の結果を示す。レーン４においては、
レーン４のタンパク質を酸性条件下に脱シトラコニル化
された。
例２ 誘導化された屈折体タンパク質の水溶性形態での単離操
作−第２図の方法 32℃においてLBブロス内で0.5のA550まで生育された
E.コリの培養液を誘発してHTLV−III抗原を42℃までの
温度シフトにより1.5時間発現させた。細胞を4000xgで
の30分間の遠心分離により集め、Tris−緩衝化塩水で１
度洗浄し、次いで1mM PMSF、50mM DTT、10mM EDTA及び
0.2％ Triton X−100を含有する50mM Tris・HCl緩衝
液、pH8.5中に再懸濁させた。細胞を次いでリポチーム
（Lipozyme）による消化及び短時間繰返された超音波処
理により溶解した。不溶性凝集体として発現されたタン
パク質を5000xgにて30分間の遠心分離により集めた。Tr
is・HCl−緩衝化0.2％ Triton X−100及び6M尿素で数回
逐次洗浄後、タンパク質凝集体を8M尿素及び50mM Tris
・HCl緩衝液、pH8.5中の１％２−メルカプトエタノール
中で可溶化させた。
組換えタンパク質の遊離スルフヒドリル基を10倍モル
過剰のヨード酢酸を25℃において添加することによりア
ルキル化した。アルキル化タンパク質抗原の部分精製
は、Tris・HCl−緩衝化8M尿素の存在下におけるSepharo
se 6B−CLカラムを通したゲル過により達成された。
アルキル化組換えタンパク質を含有するカラム画分を
次いでホウ酸ナトリウム緩衝液、pH8.5中の8M尿素の溶
液中において50−倍モル過剰の無水シトラコン酸で25℃
において1.5時間処理した。この反応混合物を0.1Mホウ
酸ナトリウム緩衝液pH8.5に対して十分透析した後、抗
原を更に同一緩衝液中で平衡化したFractogelカラム上
のゲル過により精製した。シトラコニル化HTLV−III/
LAVタンパク質は30,000ダルトン分子量標準に対比した
際に約35,000のMrに対応する位置に溶出した。
例３ マイクロタイタープレートのシトラコニル化組換えタン
パク質による被覆及びELISAにおける使用 Ｓ−アルキル化或いは遊離スルフヒドリルシトラコニ
ル化組換えタンパク質抗原（25〜50mMホウ酸ナトリウム
緩衝液、pH9.0中10μｇのタンパク質/ml溶液の50μｌ）
をポリスチレンマイクロタイタープレートの各ウエルに
添加した後、等容量の0.15Mクエン酸ナトリウム緩衝
液、pH5.5−5.6を添加した。プレートはシトラコニル基
をアミノ基から完全に加水分解するのに十分長い時間イ
ンキュベートした（遊離アミノ基に対する標準TNBS試験
により求めたところ、37℃で16時間或いは25℃で24時
間、第８図参照）。反応混合物を吸引廃棄した後吸着組
換えタンパク質上及びポリスチレン表面自体の上の非−
特異的結合部位を各ウエルに、0.06％Tween 20洗剤を含
有するPBSpH7.6中の１％（w/v）純粋ウシ血清アルブミ
ンをインキュベートすることにより保護した。溶液を吸
引廃棄し、ウエルを風乾した。
適当にPBS緩衝液pH7.6で希釈された血液血清のアリコ
ートをウエルに添加し、37℃で１時間インキュベータし
た。過剰の流体を吸引廃棄し、細胞をPBS緩衝液pH7.6で
１度洗浄した。その後、ペルオキシダーゼ−結合坑−ヒ
トIgGを添加した（上記、E.エングバル）。プレートを
インキュベートし、洗浄し、及びペルオキシダーゼクロ
マゲンを添加した。550nmにおける吸光度をマイクロタ
イタープレート分光光度計（Dynatech MR600）内で求め
た。これらの結果（表Ｉ）は全てのHTLV−III/LAV陽性
試料〔L.W.キッチン等（L.W.Kitchen et al.）、ネイチ
ャー（Nature）312:166（1984年）によるイムノブロッ
ト及びラジオイムノ沈澱アッセイにより確認〕は0.41よ
り大きいELISA吸光度を有し、６個の試料以外の全ては
1.00より大であった。全てのHTLV−III/LAV−陽性試
料、即ちバックグランド吸光度は0.24未満の読みを有し
た。従って、分画ELISA読み取りを0.30に設定すると脱
シトラコニル化組換えHTLV III/LAV抗原についてのELIS
A試験は100％正確であった。
組換えタンパク質抗原の脱シトラコニル化がそれらの
イムノアッセイにおける使用前に先行しなければならな
いという要請が第91図にも示される。シトラコニル化組
換えHTLV−III/LAVタンパク質抗原の脱保護はその完全
な免疫反応性の発現のために必要であったが、シトラコ
ニル化タンパク質さえもELISA試験において幾らかの活
性を保持することが明らかである。
例４ HTLV−III/LAVエイズウィルスタンパク質に対する抗体
に対するラテックス凝集試験 シトラコニル化組換えHTLV−III/LAVタンパク質抗原
を一定速度で静かに25℃で撹拌しながら16時間のインキ
ュベーションに際して重炭酸ナトリウム緩衝液pH9.0中
においてラテックスビーズ（2.5％の0.6μ直径ビーズの
懸濁液）に物理的に吸着させた。シトラコニル基を次い
で吸着タンパク質を0.1M酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.0
で25℃において16時間処理することにより除去した。
抗原−被覆ラテックスビーズを低速における短時間の
遠心分離により集め、次いで非−特異的結合部位を保護
するためにPBS緩衝液pH7.6中の１％ウシ血清アルブミン
−0.06％Tween 20中に再懸濁させた。再懸濁ビーズの最
終濃度は0.6％であった。被覆ビーズを４℃において貯
蔵した。
抗体に対する試験を25μｌの患者の血清を15μｌの被
覆ラテックスビーズとガラススライド上で混合し、次い
でスライドを100RPMで25℃において８分間回転すること
によって行なった。
この抗原に対する抗体の陽性の結果は、被覆ラテック
スビーズの凝集により表わされ、該凝集は肉眼に可視で
あった。或いは又、低倍率の顕微鏡が用いられた。
50個のその様な試験の結果を表IIに示す。
ELISA試験により陽性であった24個の血清中22個は
又、ラテックスビーズ凝集（LBA）試験によっても陽性
であった。二つの食い違った試料の再試験は、血清を未
希釈形態で用いた陽性であった。
ELISA試験により陰性であった全ての24の血清は又、L
BA試験によっても陰性であった。これらの結果は、血清
の1:10希釈率においてLBA試験は92％感受性及び100％特
異性であるのに対し、未希釈血清を用いると感度及び特
異性はレーザー試験に対して共に100％であることを示
す。
以上、本発明を十分に説明したが、茲に示した本発明
の趣旨或いは範囲から離れることなく多くの変更及び修
正がなされることは当業者には明らかであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 リギン，チャ−ルズ アメリカ合衆国マサチュ−セッツ州、ホ プデイル、ロ−レルウッド ドライブ 54 (72)発明者 マルチア−ニ，ダンテ ジュアン アメリカ合衆国マサチュ−セッツ州、ホ プキントン、スク−ル ストリ−ト 48

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】微生物から屈折体組換えタンパク質を回収
    する方法であって、 （ａ） 該屈折体組換えタンパク質を含有する宿主細胞
    を崩壊させ、 （ｂ） 該屈折体組換えタンパク質を可溶化させ、 （ｃ） 該組換えタンパク質内に含まれている遊離アミ
    ノ基を酸アシル化し、 （ｄ） 該組換えタンパク質をＮ−酸アシル化形態で分
    離し、及び （ｅ） 該組換えタンパク質を回収する、 ことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】該組換えタンパク質のスルフヒドリル基が
    存在する場合、それをアミノ基の酸アシル化に先立ち可
    逆的或いは不可逆的に誘導化する、請求の範囲第１項記
    載の方法。
  3. 【請求項３】該遊離スルフヒドリル基がシステイン、グ
    ルタチオン、ｏ−ヨードソベンゾエート、ナトリウムテ
    トラチオネート、或いは5,5′−ジチオビス（２−ニト
    ロベンゾエート）から選ばれる試剤を利用してジスルフ
    ィド結合の可逆的形成により可逆的に誘導される、請求
    の範囲第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】遊離スルフヒドリル基が可逆的に誘導さ
    れ、その際ジスルフィド形成の逆反応がナトリウムホス
    ホロチオレート、システイン、ジチオスレイトール、２
    −メルカプトエタノール、或いはホウ水素化ナトリウム
    から選ばれる還元剤を利用する、請求の範囲第２項記載
    の方法。
  5. 【請求項５】該遊離スルフヒドリル基がヨード酢酸、ヨ
    ードアセタミド、Ｎ−エチルマレイミド、３−ブロモプ
    ロピオン酸、或いはアクリロニトリルから選ばれる不可
    逆的アルキル化剤により不可逆的にアルキル化される、
    請求の範囲第２項記載の方法。
  6. 【請求項６】該工程（ｃ）において、酸アシル化が組換
    えタンパク質の遊離アミノ基を酸アシル化試薬と約7.5
    を越えるpHにおいて接触させることからなり、その際該
    酸アシル化試薬が、無水マレイン酸、無水シトラコン
    酸、無水ジメチルマレイン酸、エキソ−3,6−エンドキ
    ソ−Δ４−テトロヒドロフタル酸無水物、及びエキソ−
    3,6−エンドキソ−Δ４−ヘキサヒドロフタル酸無水物
    から選ばれる有機環状酸無水物である、請求の範囲第１
    項記載の方法。
  7. 【請求項７】該工程（ｄ）において、Ｎ−酸アシル化形
    態の該組換えタンパク質が他のタンパク質誘導体から分
    離される、請求の範囲第１項記載の方法。
  8. 【請求項８】Ｓ−誘導化及びＮ−アシル化形態の該組換
    えタンパク質が他のタンパク質誘導体から分離される、
    請求の範囲第２項記載の方法。
  9. 【請求項９】該分離がクロマトグラフィ手段を含んでな
    る、請求の範囲第７項又は第８項記載の方法。
  10. 【請求項１０】工程（ｅ）において、組換えタンパク質
    は生来の形態にあり、 （１）スルフヒドリル基がナトリウムホスホロチオレー
    ト、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、
    ホウ水素化ナトリウム或いは亜硫酸ナトリウムから選ば
    れる還元剤との接触により還元状態に回復されるか、或
    いは （２）遊離アミノ基が組換えタンパク質に回復され、そ
    の際Ｎ−酸アシル基が、約pH6未満の酸性緩衝液と適当
    な温度において適当な時間接触されることにより除去さ
    れる、 請求の範囲第１項記載の方法。
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