JP2548527B2 - 腫瘍壊死因子の産生を増加する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の技術的分野】本発明は、腫瘍壊死因子（ＴＮ
Ｆ）をコードする組換えＤＮＡ分子並びに形質転換細胞
に対する向上した細胞毒性もしくは細胞静止活性を有す
る化合物に関するものである。さらに詳細には本発明
は、腫瘍壊死因子様ポリペプチドを高収率で原核宿主内
で産生する方法に関するものである。特に、本発明はＴ
ＮＦ様ポリペプチドの産生に関し、発現制御配列Ｔ４も
しくはｐＬ−Ｔ４のいずれかに結合したこれらポリペプ
チドをコードするＤＮＡ配列からなる組換えＤＮＡ分子
によって形質転換された原核宿主により産生される。

【０００２】

【技術的背景】ＴＮＦは大食細胞および単核食細胞によ
って産生される。これはインビトロにおける広範囲の動
物およびヒト癌細胞に対し細胞毒性もしくは細胞静止活
性を示し、かつインビボにおけるある種の動物腫瘍およ
び異種移植ヒト腫瘍にて溶血壊死を誘発する〔Ｋ．ハラ
ナカおよびＮ．サトミ、「インビトロにおけるヒト癌細
胞に対する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の細胞毒性活性」、
ジャパン・ジャーナル・エキスペリメンタル・メソッ
ド、第５１巻、第１９１〜１９４頁（１９８１）；Ｌ．
オールド、「カンサー・イミュノロジー：特異性の検討
−Ｇ．Ｈ．Ａ．クロウス・メモリアル・レクチャー」、
カンサー・リサーチ、第４１巻、第３６１〜３７５頁
（１９８１）〕。

【０００３】ＴＮＦ活性を示す化合物は、バチルス−カ
ルメッテ−ゲラン（ＢＣＧ）もしくはコリネバクテリウ
ムが感染しかつ大腸菌のリポ多頭類（ＬＰＳ）で処理さ
れたネズミおよびウサギの血清から得られている〔Ｅ．
Ａ．カルスウエル等、「腫瘍の壊死を生ずるエンドトキ
シン誘発される血清因子」、プロシーディング・ナショ
ナル・アカデミー・サイエンス・ＵＳＡ、第７２巻、第
３６６６〜３６７０頁（１９７５）〕。さらに、これら
はＢＣＧを接種したネズミの大食細胞リッチな腹腔滲産
出細胞の培養培地からも得られており、さらにインビト
ロにて大食細胞増殖因子を発生させかつＬＰＳで刺戟し
た予備処理ネズミの大食細胞様の腫瘍細胞（ＰＵ５−
１．８）および腹腔大食細胞からも得られている〔Ｄ．
マネル、Ｒ．ムーアおよびＳ．メルゲンハーゲン、「殺
腫瘍活性（腫瘍壊死因子）の源泉としての大食細胞」、
インフェクション・イミュノロジー、第３０巻、第５２
３〜５３０頁（１９８０）〕。

【０００４】さらに、大食細胞の先駆体であるヒト単核
細胞を例えば健康なヒト供与体の血液から分離してリン
ホキンおよび／またはＬＰＳで刺戟すると、これら大食
細胞はネズミの標的細胞およびヒト形質転換細胞に対し
細胞毒性もしくは細胞静止作用を有する化学物質を産生
する〔Ｎ．マチュース、「ヒト単核細胞による抗腫瘍細
胞毒素の産生：エンドトキシンとインタフェロンと誘発
剤としての他の薬剤との比較」、ブリティッシュ・ジャ
ーナル・カンサー、第４５巻、第６１５〜６１７頁（１
９８２）；Ｊ．ハンマストローム、「ヒト単核細胞から
遊離される可溶性の細胞静止因子：Ｉ、産生並びに正常
および形質転換されたヒト標的細胞に対する作用」、ス
カンジナビア・ジャーナル・イミュノロジー、第１５
巻、第３１１〜３１８頁（１９８２）〕。したがって、
ＴＮＦは単核細胞由来の細胞によって産生されるので
（適当な処理の後）、この物質はしばしば「単核細胞サ
イトトキシン」と呼ばれる〔Ｄ．Ｓ．ストン−ウルフ
等、「ヒトγ−インタフェロンとリンホトキシンおよび
ヒトサイトトキシンとの相互関係」、ジャーナル・エキ
スペリメンタル・メソッズ、第１５９巻、第８２０〜８
４３頁（１９８４）〕。正常なヒトの血清から得られる
α１−α２グロブリンのフラクションも、ネズミにおけ
る腫瘍に対し毒性でありかつインビトロにおけるヒト結
腸癌、黒色腫および神経芽細胞腫の細胞ラインの増殖を
阻止することが示されている〔米国特許第４，３０９，
４１８号；Ｓ．グリーン等、「カンサー・レタース」、
第６巻、第２３５〜２４０頁（１９７９）；ジャーナル
・セル・バイオロジー、第７９巻、第６７頁（１９７
８）〕。

【０００５】しかしながら、現在、動物およびヒトのＴ
ＮＦは極めて少量しか生産されていない。動物ＴＮＦの
生産方法は、予備処理した多数のネズミもしくはウサギ
を殺してその血清を精製することによりＴＮＦを回収す
るか、或いはその大食細胞を集め、インビトロで細胞を
刺戟し、産生したＴＮＦを上澄液から回収しかつ精製す
ることからなっている。ヒト供与体から細胞を回収して
インビトロで培養して、ＴＮＦを産生させ、かつヒト供
与体からの血清のα−グロブリンフラクションを精製し
て抗腫瘍剤を回収することも大規模には役立たない。さ
らに、これらの方法はすべて時間がかかり、高価につき
かつ極めて低収量のＴＮＦしか生成しない。

【０００６】

【発明の開示】本発明は、抗癌剤および抗腫瘍組成物、
方法および治療に使用するのに充分な純度のＴＮＦ様化
合物およびＴＮＦを工業的に著量で製造する方法を提供
することにより、上記問題を解決する。したがって、本
発明は、抗癌剤および抗腫瘍剤並びにその方法に使用す
るため従来得られなかったような量および方法でＴＮＦ
またはＴＮＦ様ポリペプチドの製造を可能にする。

【０００７】本発明の他の目的は、ＴＮＦ様ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列の位置決定および同定、Ｔ４
およびｐＬ−Ｔ４よりなる群から選択される発現制御配
列に結合したこれらＤＮＡ配列による各種の宿主の形質
転換、並びにこれら形質転換宿主におけるＴＮＦもしく
はＴＮＦ様ポリペプチドの産生を包含する。本発明によ
り産生されるＴＮＦ様ポリペプチドおよびＴＮＦとして
は、例えばウサギ、ネズミおよびヒトＴＮＦのような哺
乳動物のＴＮＦが挙げられる。

【０００８】本発明はまた天然源からのＴＮＦの生成を
開示する。原ＴＮＦが生成された後、そのアミノ酸配列
を決定して、ＤＮＡ試料をそのアミノ酸に基づき合成す
ることができる。次いで、これらのＤＮＡ試料を各種の
天然および合成源からのＤＮＡ配列の回収物をスクリー
ニングして、ＴＮＦ関連ＤＮＡ配列を選択し、次いで本
発明の方法によりＴＮＦおよびＴＮＦ様化合物を発現さ
せることができる。

【０００９】この生成したＴＮＦも本発明の他の面、す
なわち天然もしくは組換ＴＮＦたとえばアクチノマイシ
ンＤのような抗生物質との組合せを使用することによる
腫瘍細胞の増殖阻止もしくは死滅の向上にも有用であ
る。本発明の方法によれば、腫瘍を有する哺乳動物を医
薬上有効量のＴＮＦとアクチノマイシンＤとで処理して
腫瘍細胞に対するＴＮＦの作用を高める。

【００１０】以下の開示から明らかとなるように、Ｔ４
またはｐＬ−Ｔ４のいずれかの発現制御配列に結合した
ＤＮＡ配列からなる本発明の組換ＤＮＡ分子は適当な宿
主においてＴＮＦもしくはＴＮＦ様ポリペプチドの産生
を指示することができる。適当な宿主におけるこれら組
換ＤＮＡ分子の複製も、これらポリペプチドをコードす
る遺伝子を多量に生産することを可能にする。これらポ
リペプチドおよび遺伝子の分子構造および性質をかくし
て容易に決定することができる。これらポリペプチドお
よび遺伝子は、適当な宿主で産生されたままで或いは適
当に誘導化もしくは改変した後、これら生産物自身の産
生を検出しかつ向上させる組成物および方法に使用する
ことができ、さらに抗癌、抗腫瘍および抗マラリア組成
物および治療方法に使用することができる。

【００１１】以下の記載から明らかとなるように、本発
明の基本的局面は、ＴＮＦもしくはＴＮＦ様ポリペプチ
ドをコードし或いは少なくともこの種のＤＮＡ配列を発
現制御配列に結合されたＤＮＡ配列の回収物から選択す
ることを可能にする、ＤＮＡ配列からなる組換ＤＮＡ分
子を提供することである。これらＤＮＡ配列は、 （ａ）ｐ−ｍＴＮＦ−３のＤＮＡ挿入物； （ｂ）ｐ−ｈＴＮＦ−１のＤＮＡ挿入物； （ｃ）これらＤＮＡ挿入物（ａ）および（ｂ）のいずれ
か一方または両方にハイブリッド化しかつ発現に際しＴ
ＮＦの生物学的活性を示すポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列；並びに （ｄ）前記ＤＮＡ挿入物および配列のいずれかに縮合す
るＤＮＡ配列よりなる群から選択される。

【００１２】本発明によればＤＮＡ配列はＴ４もしくは
ｐＬ−Ｔ４発現制御系に作用結合される。

【００１３】本発明の組換ＤＮＡ分子はさらに、これら
で形質転換された適当な宿主においてＴＮＦもしくはＴ
ＮＦ様ポリペプチドを高収量で産生し得ることを特徴と
する。

【００１４】本発明を充分理解しうるよう以下詳細に説
明する。

【００１５】説明において次の用語を使用する：ヌクレオチド ：糖部分（ペントース）と燐酸と窒素含有
複素環式塩基とよりなるＤＮＡもしくはＲＮＡのモノマ
単位。この塩基はグリコシド炭素（ペントースの１′炭
素）を介して糖部分に結合される。塩基と糖との組合せ
をヌクレオシドと呼ぶ。各ヌクレオチドはその塩基を特
徴とする。４種のＤＮＡ塩基はアデニン（「Ａ」），グ
アニン（「Ｇ」），シトシン（「Ｃ」）およびチミン
（「Ｔ」）である。４種のＲＮＡはＡ，Ｇ，Ｃおよびウ
ラシル（「Ｕ」）である。

【００１６】ＤＮＡ配列：隣接するペントースの３′炭
素と５′炭素との間のホスホジエステル結合により互い
に連結されたヌクレオチドの線状配列である。

【００１７】コドン：ｍＲＮＡを介しアミノ酸、翻訳開
始信号または翻訳停止信号をコードする３種のヌクレオ
チド（トリプレット）のＤＮＡ配列である。

【００１８】遺伝子：メッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮ
Ａ」）の雛型を介し特定ポリペプチドに特徴的なアミノ
酸の配列をコードするＤＮＡ配列である。

【００１９】転写：遺伝子からｍＲＮＡを産生する過程
である。

【００２０】翻訳：ｍＲＮＡからポリペプチドを産生す
る過程である。

【００２１】発現：ＤＮＡ配列もしくは遺伝子の作用を
受けてポリペプチドを産生する過程であり、これは転写
と翻訳との組合せである。

【００２２】プラスミド：完全「レプリコン」からなる
非染色体二重鎖ＤＮＡ配列であって、このプラスミドは
宿主細胞において複製される。プラスミドが単細胞生物
内に存在すると、この生物の特徴はプラスミドのＤＮＡ
の結果として変化し或いは形質転換される。たとえば、
テトラサイクリン耐性（Ｔｅｔ^Ｒ）に対する遺伝子を有
するプラスミドは、予めテトラサイクリンに対し感受性
であった細胞をこれに耐性の細胞に形質転換させる。プ
ラスミドにより形質転換された細胞を「形質転換体」と
呼ぶ。

【００２３】ファージもしくはバクテリオファージ：細
菌性ウイルスであって、その多くは蛋白エンベロプもし
くはコート中にカプセル化されたＤＮＡ配列よりなって
いる（「カプシド」）。

【００２４】クローン化ベヒクル：宿主細胞内で複製す
ることができ、たとえば複製コート蛋白の産生のような
ＤＮＡの本質的な生物学的機能の喪失或いはプロモータ
もしくは結合部位の喪失を伴うことなくＤＮＡ配列を決
定可能に切断しうる１個または少数のエンドヌクレアー
ゼ識別部位を特徴とし、かつたとえばテトラサイクリン
耐性もしくはアンピシリン耐性などの形質転換細胞の同
定に使用するのに適した標識を有するプラスミド、ファ
ージＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列であり、クローン
化ビークルはしばしばベクターと呼ばれる。

【００２５】クローン化：無性増殖によって１種の生物
もしくは配列から誘導される生物もしくはＤＮＡ配列の
集団を得る過程である。

【００２６】組換ＤＮＡ分子すなわちハイブリッドＤＮ
Ａ：互いに末端結合してある種の宿主細胞に感染しかつ
そこに維持される能力を有する種々異なるゲノムからの
ＤＮＡ断片よりなる分子である。

【００２７】発現制御配列：遺伝子に作用結合された際
これら遺伝子の発現を制御するヌクレオチドの配列であ
る。これらはｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ
系、ファージλの主オペレータおよびプロモータ領域、
ｆｄコート蛋白の制御領域ＳＶ４０の初期および後期お
よびプロモータ、ポリオーマから誘導されたプロモー
タ、アデノウイルスおよび猿ウイルス、３−ホスホグリ
セレートキナーゼもしくはその他の糖分解酵素のプロモ
ータ、酵母酸ホスファターゼのプロモータ、たとえばＰ
ｈｏ５、酵母α−結合ファクタのプロモータ、並びに原
核もしくは真核細胞およびそのウイルスの遺伝子の発現
を制御することが知られたその他の配列、或いはその組
合せを包含する。

【００２８】リンホキン：刺戟したリンパ球を特定抗原
と接触させた際、これらリンパ球により放出される可溶
性の液素性媒体である。リンホキンは、たとえばインタ
フェロンおよび大食細胞活性化因子を包含する。

【００２９】ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）：ＴＮＦは増殖阻
止もしくは細胞毒性リンホキンである。本明細書に使用
する場合、「ＴＮＦ」は天然もしくは組換ＴＮＦまたは
その誘導体である全ての蛋白、ポリペプチドおよびペプ
チドを包含し、これらは殺腫瘍活性或いはこれらＴＮＦ
による腫瘍生長の阻止を特徴とする。これらは各種の源
泉から得られるＴＮＦ様化合物、たとえば天然ＴＮＦ、
組換ＴＮＦおよび合成もしくは半合成ＴＮＦを包含す
る。

【００３０】ＴＮＦ様ポリペプチド：ＴＮＦの生物学的
活性を示すポリペプチドである。これはたとえばウサ
ギ、ネズミおよびヒトＴＮＦのような哺乳動物ＴＮＦ並
びにＴＮＦ様ポリペプチドを包含する。

【００３１】腫瘍：本明細書に使用する「腫瘍」という
用語は全ゆる望ましくない細胞の増殖を包含する。この
種の増殖は悪性および非悪性の固型もしくは液状腫瘍、
カルシノーマ、黒色腫、肉腫、白血腫、リンパ腫並びに
その他の発癌性、ネオプラスト性もしくは腫瘍発生性の
病気を包含する。

【００３２】アクチノマイシン：アクチノマイシンは１
種の抗生物質であって、ＲＮＡポリメラーゼの機能を阻
止することによりＤＮＡ転写を疎外すると思われる。本
明細書に使用する「アクチノマイシン」という用語は、
一般にアクチノマイシンとして知られた種類の関連する
抗生物質並びにその誘導体を全て含有する。この用語
は、たとえばアクチノマイシンＤを包含する。

【００３３】ＬＰＳ：イー・コリの細胞壁から得られる
リポ多糖類よりなる内生毒素である（０．５５：Ｂ５）
（ミシガン州、デトロイト所在のディフコ社）。

【００３４】ＢＣＧ：バチルス−カルメッテ−ゲラン
（パッスール・インスチチュート、ブラッセル）。

【００３５】本発明は、原核宿主におけるＴＮＦ様ポリ
ペプチドの高収量の発現に関するものである。然し本発
明は、ＴＮＦ様ポリペプチドを含有する組成物を陰イオ
ン交換体と接触させ、交換体に結合しない状態で残存す
る組成物の成分を除去し、かつＴＮＦ様ポリペプチドを
交換体から溶出させることを特徴とする精製方法を開示
する。

【００３６】概要において、ＴＮＦ様ポリペプチドは、
ＴＮＦの産生を誘発するよう特異的に処理した動物（好
ましくはウサギ）の血清を集め、この血清中の活性成分
を塩基（好ましくは硫酸アンモニウム）によってたとえ
ば約６０％飽和まで沈澱させ、中性乃至弱塩基性緩衝液
（好ましくはトリス−ＨＣｌ）中にペレットを再懸濁
し、イオン交換カラムクロマトグラフィー（好ましくは
ＤＥＡＥ−セファセル）を用いかつ塩濃度勾配を用いて
蛋白を分画し、ＴＮＦ活性を有する集めたフラクション
を好ましくはアミコンＴＣＦ−２装置で濃縮し、この濃
縮物をゲル濾過クロマトグラフカラム（好ましくはＡｃ
Ａ３４）にて分子量により分画し、ＴＮＦ活性を有する
フラクションを集めてこれらを好ましくはモノＱカラム
（ファルマシア社）にまず弱塩基性ｐＨでかつ次いで弱
酸性ｐＨでイオン交換クロマトグラフィーにかけること
により精製することができる。勿論、この精製法（特に
陰イオン交換体の使用）を用いてＴＮＦ様ポリペプチド
を広範な種類の天然源並びにこれらポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列で形質転換された各種の原核宿主から
精製し得ることを了解すべきである。

【００３７】上記工程で得られた精製ＴＮＦのアミノ酸
配列を次いで決定することができる。これらの得られた
アミノ酸配列を本発明の各種の方法で使用することがで
きる。これらを使用して、本発明のＴＮＦ様ポリペプチ
ドおよびＴＮＦをコードするＤＮＡ配列の存在下に天然
および合成哺乳動物ＤＮＡの各種の保存物をスクリーニ
ングするのに有用な一連のＤＮＡ試料を作成することが
できる。たとえば、ウサギＴＮＦのアミノ酸配列から得
られたＤＮＡ配列を使用して、ウサギもしくはその他の
哺乳動物のＴＮＦ様ポリペプチドをコードする他のＤＮ
Ａ配列につきＤＮＡ保存物をスクリーニングすることが
できる。さらに、このように選択されたＤＮＡ配列、よ
り好ましくはウサギもしくはネズミＤＮＡ配列を使用し
て、ヒトＴＮＦ様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
につきスクリーニングすることもできる。何故なら、ウ
サギとネズミとヒトのＴＮＦ間には同族性が予想される
からである。

【００３８】本発明の組換ＤＮＡ分子を使用して、これ
らにより形質転換された各種の原核宿主にてＴＮＦ様ポ
リペプチドを発現させる。これらのＴＮＦ様ポリペプチ
ドは、抗癌および抗腫瘍用途および治療に使用すること
ができる。概要において、本発明のこの具体例は、所望
のＴＮＦ様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を持っ
た組換ＤＮＡ分子により形質転換された適当な宿主を培
養することからなり、前記配列は組換ＤＮＡ分子におけ
る発現制御配列Ｔ４または発現制御配列ｐＬ−Ｔ４のい
ずれかに作用結合している。ここでもウサギＴＮＦまた
はその他の哺乳動物ＴＮＦとヒトＴＮＦとの間には類似
性が予想されるので、これらの全てはヒトの癌、腫瘍お
よびマラリア感染の治療に対して有用である。

【００３９】さらに、天然もしくは組換原料から得られ
た精製ＴＮＦを、たとえばＴＮＦとアクチノマイシンＤ
との組合せよりなる本発明の組合せ物に使用することが
できる。より詳細には、これらは腫瘍の処置に医薬上有
効量のアクチノマイシンＤと組合せて医薬上有効量にて
使用することができる。

【００４０】慣用の腫瘍処置はたとえば化学療法および
照射線のような非外科的治療並びに外科治療を包含す
る。典型的には、これらの治療は各種の望ましくない副
作用を伴う。免疫抑制作用を伴う非外科的治療は、二次
的感染に対する患者の感受性を増大させ得る。形質転換
した細胞を剔出する外科治療は侵食過程を伴う危険を有
し、かつ全形質転換細胞を効果的に除去しまたは排除す
ることができない。癌および非悪性腫瘍に対する他の処
置方法は、腫瘍特異性抗原に対するモノクローナル抗体
を形質転換細胞の表面に使用することを含む。典型的に
はネズミのモノクローナル抗体を含むこの種の治療の効
果は、しばしばさらにネズミ抗体を投与して得られる効
果を疎外するような反抗体反応を含む各種のファクタに
より制限される〔Ｇ．Ｅ．グッドマン等、「進行黒色腫
を有する患者におけるネズミモノクローナル抗体のパイ
ロット試験」、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコ
ロジー、第３巻、第３４０〜３５１頁（１９８５）〕。
モノクローナル抗体の治療に関する他の報告された副作
用は過敏症、発熱および悪寒を伴う。

【００４１】この種の治療の欠点に鑑み、腫瘍発生細胞
に対する人体の免疫反応を人体の種々のリンホキンレベ
ルを増大させて開始させるため、各種の治療法が開発さ
れている。たとえば、ＴＮＦのみが腫瘍細胞の増殖を阻
止し或いは死滅させることが知られている。さらに、ヒ
トリンホトキシンおよびヒトγ−インタフェロンの組合
せは腫瘍増殖を阻止することが報告されている。〔ヨー
ロッパ特許出願第１２８，００９号〕。ＴＮＦとヒトイ
ンタフェロンとの組合せは、さらにそれらの個々の効果
の合計よりも大きいヒト腫瘍に対する増殖抑制もしくは
細胞毒性作用を示すことが報告されている〔Ｌ．フラン
セン等「組換腫瘍壊死因子：各種の正常および形質転換
ヒトおよびネズミ細胞ラインに対するその作用並びにイ
ンタフェロンγとの相乗作用」、ヨーロピアン・ジャー
ナル・オブ・カンサー・アンド・クリニカル・オンコロ
ジー（印刷中）；ヨーロッパ特許出願第１３１，７８９
号〕。さらに、アクチノマイシンＤとＴＮＦとの組合せ
は、インビトロにおける腫瘍細胞増殖の抑制を示すこと
が報告されている〔Ｊ．Ｍ．オストロンおよびＧ．Ｅ．
ギフォード、「ウサギ腫瘍壊死因子（４０４４９）によ
るＬ−９２９細胞のＤＮＡ合成の刺戟」、Proc.Soc.Ex
p.Biol.Med 、第１６０巻、第３５４〜３５８頁（１９
７８）；Ｍ．Ｒ．ルフおよびＧ．Ｅ．ギフォード、「ウ
サギ腫瘍壊死因子：作用メカニズム」、インフェクショ
ン・アンド・イミュニティ」、第３１巻、第３８０〜３
８５頁（１９８５）〕。

【００４２】以下、本発明の組換ＤＮＡ分子により産生
されるＴＮＦ様ポリペプチドの製造につき説明する。先
ず、最初に本発明の方法により精製されたウサギＴＮＦ
の部分アミノ酸断片に基づいて作成された一連の合成Ｄ
ＮＡ断片からなるＤＮＡ試料を用いて、ＴＮＦ関連ＤＮ
Ａ配列を選別した。ＴＮＦおよびＴＮＦ様ポリペプチド
をコードする本発明のＤＮＡ配列を位置決定しかつ同定
するには、各種のクローン化および選択技術を理論的に
使用し得ることを了解すべきである。次いで、選別した
ＤＮＡ配列自身を試料として使用することにより、ＴＮ
Ｆ様ポリペプチドをコードする他のウサギおよび哺乳動
物ＤＮＡ配列を選択すると共に、これらによりコードさ
れるＴＮＦ様ポリペプチドを産生させるべく適当な原核
宿主を形質転換させた。さらに、ウサギＤＮＡ試料によ
り選別されたＤＮＡ配列自身を使用して、哺乳動物ＴＮ
ＦおよびＴＮＦ様ポリペプチドをコードするＤＮＡを選
択し、かつこれらＤＮＡ配列を使用して適当な原核宿主
においてポリペプチドを産生させた。

【００４３】本発明のＤＮＡ配列は、各種の宿主／ベク
ター組合せで使用して発現させることができる。例え
ば、有用なベクターは染色体、非染色体および合成のＤ
ＮＡ配列、たとえば各種の公知細菌性プラスミド、たと
えばｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９お
よびその誘導体を含むイー・コリからのプラスミドの各
種の公知誘導体、広範囲の宿主プラスミド、たとえばＲ
Ｐ４、ファージＤＮＡ、たとえばファージλの多数の誘
導体、たとえばＮＭ９８９およびその他のＤＮＡファー
ジ、たとえばＭ１３並びにフィラメント状一本鎖ＤＮＡ
ファージ、並びにプラスミドとファージＤＮＡとの組合
せから得られるたとえばファージＤＮＡもしくはその他
の誘導体を使用すべく改変させたプラスミドで構成する
ことができる。

【００４４】本発明のＤＮＡ分子は、ｐＬ−Ｔ４および
Ｔ４よりなる群から選択される特定の発現制御配列を含
有する。Ｔ４発現制御配列のみが本発明の組換ＤＮＡ分
子において特に有用であることが判明した。たとえばＴ
ＮＦ様ポリペプチドの特に有効な発現は、発現系の一部
としてプロモータとリボソーム結合部位との両者を含む
バクテリオファージＴ４から得られたＤＮＡ配列からな
るプラスミドを使用して得ることができる。この配列
は、ファージＴ４蛋白３２（ｇｐ３２）遺伝子の欠失誘
導体である〔Ｈ．Ｍ．クリシおよびＢ．アレット、「バ
クテリオファージＴ４遺伝子３２に含まれるヌクレオチ
ド配列：翻訳自己制御」、プロシーディング・ナショナ
ル・アカデミー・サイエンス、第７９巻、第４９３７〜
４９４１頁（１９８２）〕。

【００４５】本発明に使用するＴ４ ＤＮＡ配列の断片
が有効である少なくとも１つの理由は、この断片内に３
個もしくは４個の連続断片が存在し、そのそれぞれが順
次にプロモータとして機能することができ（すなわちｍ
ＲＮＡの転写を開始させ）、かつこれらのプロモータが
数種のＲＮＡポリメラーゼ分子を封鎖して単一のプロモ
ータよりも多いｍＲＮＡを開始させるからであると思わ
れる。さらに、Ｔ４ＤＮＡ配列で開始するｍＲＮＡはイ
ー・コリにおいて異常に安定であることが判明した
〔Ｋ．ゴルスキー等、セル（１９８５）（印刷中）〕。

【００４６】本発明は次の発現制御配列からなる組換Ｄ
ＮＡ分子に関する：

【化４】

【００４７】〔ここでＸは存在しない（この場合最後の
５個の塩基はＡＴＡＴＧによって示すことができ）か、
またはＸは１〜１５個の塩基の群である〕。好ましくは
ＸはＣＧＡＴＡＣＴ、ＣＧＣＧＡＴＡＣＴ、ＡＴＡＣＴ
ＡＡＡ、ＡＴＡＣＴ、ＣＧＣＧＡＴＡＣＴＡＡＡおよび
ＣＧＡＴＡＣＴＡＡＡよりなる群から選択される。

【００４８】Ｘが存在しない発現制御配列は次のように
示すこともできる：

【化５】

【００４９】好適発現制御配列はさらに次のように示す
こともできる：

【化６】

【００５０】この発現制御配列に対する適当な改変を行
って、配列を発現系の１部として使用する際にずっと高
レベルの蛋白発現を得ることができる。この配列は、た
とえば（１）部位特異性の突然変異〔Ｂ．Ａ．オースト
ラ等、ネイチャー、第３０４巻、第４５６〜４５９頁
（１９８３）〕；（２）ＣｌａＩ部位における部位操作
〔たとえばヌクレオチドを充填するためのクレノー断片
の使用、またはヌクレオチドを欠失させるためのＳ１／
Ｂａｌ切断〕；および（３）合成オリゴヌクレオシド断
片の挿入などの方法によって改変することができる。特
に、ＣｌａＩ部位或いは断片ＡＴＸＡＴＧを改変し得る
ことが判明した。この種の改変配列並びに同様に改変し
た配列を組換ＤＮＡ分子におけるこの配列、宿主および
本発明の方法の代りに使用することができ、かつこれら
全ては本発明の範囲内に入ると思われる。同様に、この
配列を改変させるため上記技術は、この配列の特定配列
を異なる配列に変換するために使用することもできる。
また、当業者は、Ｘの規定内における塩基の異なる組合
せを選択して特定位置における発現レベルを最適化さ
せ、或いは本発明の組換ＤＮＡ分子に対し他の所望の性
質を付与することもできる。

【００５１】ｐＬ−Ｔ４の使用は、ＴＮＦ様ポリペプチ
ドの高度の発現をもたらす。Ｐ_Ｌプロモータからなる組
換ＤＮＡ分子を使用して、有利にλリプレッサを有する
宿主を形質転換させることができる。本発明の１具体例
において、上記発現制御配列はＰ_Ｌプロモータの下流に
挿入される〔Ｈ．ベルナート等、ジーン、第５巻、第５
９〜７６頁（１９７９）並びにヨーロッパ特許出願第８
１，３０１４１３．１号、公告公報第００４１７６７
号〕。

【００５２】本発明の組換ＤＮＡ分子はｐＬ−Ｔ４およ
びＴ４よりなる群から選択される発現制御配列を含有
し、これらの配列と組合せて他の発現制御配列をも使用
することができるが、これらはＴＮＦ様ポリペプチドの
高度の発現とはなり得ない。この種の発現制御配列の例
はｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージ
λの主オペレータおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋
白の制御領域、酵母の糖分解プロモータ、たとえば３−
ホスホグリセレートキナーゼのプロモータ、酵母酸ホス
ファターゼのプロモータ（たとえばＰｈｏ５）並びに酵
母α−関連ファクタ並びに原核細胞およびそのウイルス
の遺伝子の発現を制御することが知られた他の配列のプ
ロモータ或いはその組合せである。

【００５３】有用な発現宿主は、Ｔ４およびｐＬ−Ｔ４
が作用する周知の原核宿主、たとえばイー・コリの菌
株、たとえばイー・コリＨＢ１０１、イー・コリＸ１７
７６、イー・コリＸ２２８２、イー・コリＤＨＩ（λ）
およびイー・コリＭＲＣ１並びにシュードモナス、バチ
ルスたとえばバチルス・ズブチリスおよびストレプトミ
セスの菌株を包含する。本発明によるＴＮＦの発現に
は、イー・コリ菌株Ｗ３１１０が特に有用であることが
判明した。

【００５４】勿論、全ての宿主／発現ベクター組合せが
本発明のＤＮＡ配列の発現或いは本発明のＴＮＦ様ポリ
ペプチドの産生に際し同等な効率をもって機能するとは
限らない。しかしながら、宿主／発現ベクター組合せの
特定の選択は、本発明の範囲を逸脱することなく本明細
書中に示した原理を考慮した後に当業者が容易になし得
ることができる。たとえば、選択は多数のファクタのバ
ランスに基づくべきである。たとえば、これらは宿主と
ベクターとの適合性、ＤＮＡ配列によりコードされた蛋
白の宿主に対す毒性、所望蛋白の回収の容易性、ＤＮＡ
配列およびこれに作用結合された発現制御配列の発現特
性、生物安全性、コストおよび重なり、形態或いは所望
蛋白の必要な他の発現後の改変などを包含する。

【００５５】さらに、それぞれ特定の発現ベクター内に
おいて、本発明のＴＮＦ関連ＤＮＡ配列を挿入するため
の部位を選択することができる。これらの部位は、一般
にこれら部位を切断する制限エンドヌクレアーゼによっ
て命名される。これらは当業者により充分認識されてい
る。勿論、本発明に有用な発現ベクターは、選択ＤＮＡ
断片を挿入するための制限エンドヌクレアーゼを必要と
しないことを了解すべきである。むしろ、このベクター
は他の手段によって断片に結合することができる。発現
ベクター、および特に選択ＤＮＡ断片を挿入するよう選
択した部位および発現制御配列に対するその作用結合
は、たとえば特定制限酵素に感受性の部位の個数、発現
すべき蛋白の大きさ、宿主細胞酵素による蛋白分解に対
する所望蛋白の感受性、精製の際に除去するのが困難な
宿主細胞蛋白による発現蛋白の汚染または結合、たとえ
ばベクター配列に対する開始および停止コドンの位置の
ような発現特性、並びに当業者に認識された他の多くの
ファクタによって決定される。ベクターおよびＤＮＡ配
列用の挿入部位の選択はこれらファクタのバランスによ
って決定され、必ずしも全ての選択がそれぞれの場合に
同等に有効であるとは限らない。

【００５６】本発明のＤＮＡ配列により形質転換された
原核宿主を発酵させて産生させるＴＮＦおよびＴＮＦ様
ポリペプチド、並びに本発明の方法により産生されかつ
精製されたＴＮＦ様ポリペプチドは、抗癌および抗腫瘍
処理および治療のための各種の組成物および方法に有用
である。これらはさらに抗マラリア治療および方法にも
有用である。

【００５７】これらのポリペプチド或いは恐らくこれら
からまたはそのアミノ酸配列を用いて誘導されまたは合
成されるペプチド或いはそれらの塩類またはその医薬上
許容しうる誘導体の投与は抗癌、抗腫瘍もしくは抗マラ
リア活性を示す薬剤の投与につき従来認められている任
意の方式によって行うことができる。これらは経口、非
経口、皮下、静脈内、病巣内もしくは局部投与を包含す
る。局部、病巣内もしくは静脈内注射が好適である。

【００５８】これらの治療に使用する組成物も各種の形
態とすることができる。これらはたとえば固体、半固体
および液体の投与形態、たとえばタブレット、ピル、粉
末、溶液もしくは懸濁液、座薬、注射溶液および潅流溶
液を含有する。好適形態は、目的とする投与方式および
治療用途に依存する。さらに、これら組成物は好ましく
は慣用の医薬上許容しうるキャリヤを包含し、他の医薬
品、キャリヤ、アジュバント、賦形薬など、たとえばヒ
ト血清アルブミンまたは血漿製剤を包含する。好ましく
は、本発明の組成物は単位投与の形態であって、一般に
１日１回もしくはそれ以上の回数で投与する。１回で或
いは処置の期間に亘って投与する活性化合物の量は処置
する患者、病状および腫瘍もしくは癌またはマラリア感
染の経過、投与方式および形態、並びに医者の判断に依
存する。しかしながら、有効投与量は約０．００５〜５
ｍｇ／Ｋｇ／日、好ましくは約０．０５〜０．５ｍｇ／
Ｋｇ／日の範囲とすることができ、それにより少量およ
び多量の投与も有用であることが認められる。

【００５９】したがって、本発明の方法により産生した
ＴＮＦ様ポリペプチドは、ヒトを含む哺乳動物における
癌もしくは腫瘍の処置方法に用いることができ、この方
法は腫瘍学上有効量の本発明の方法により生成した化合
物或いはその医薬上許容しうる塩もしくは誘導体を投与
することからなっている。勿論、本発明の方法によって
作成した組成物は他の癌もしくは腫瘍治療と組合せて、
たとえばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γのよ
うなインタフェロンと一緒に或いは哺乳動物における癌
および腫瘍を治療するための化学療法と一緒に使用する
ことができる。

【００６０】また、哺乳動物を本発明の方法により産生
した医薬上有効量のＴＮＦ様ポリペプチドと抗生物質と
を組合せて、腫瘍増殖を抑制もしくは阻止し、好ましく
は腫瘍細胞を死滅させるのに充分な期間にわたって処置
する。哺乳動物は、好ましくはＴＮＦとアクチノマイシ
ンＤとの組合せからなる組成物で処置する。代案とし
て、これら２種の成分で順次に処置することもできる。
しかしながら、選択する処置の特定順序は重要でないと
思われる。より詳細には、哺乳動物を皮下、静脈内、筋
肉内もしくは病巣内注射により患者一人当り毎日約１０
μｇ〜１００ｍｇのＴＮＦで処置することができる。し
かしながら、この投与量は認められた医薬基準にしたが
って医者により患者の身体状態および許容レベルに応じ
て調節すべきである。さらにＴＮＦで処置する前または
同時に或いはその後に医薬上有効量の抗生物質で処置す
ることもできる〔Ａ．グッドマン等、「治療の薬理基
準」、第１２９０〜１２９１頁（１９８０）〕。アクチ
ノマイシンＤは、腫瘍中へ病巣内注射として投与すべき
である。

【００６１】さらに本発明の方法により産生したＴＮＦ
様化合物は抗マラリア剤としても有用である。たとえ
ば、ヒトマラリア寄生虫、すなわちプラスモジウム・フ
ァルシパルム（Plasmodium falciparum)は、ＴＮＦに感
受性であることが知られている〔プレイフェア等、イミ
ュノロジー・ツデイ、第５巻、第１６５〜１６６頁（１
９８４）〕。

【００６２】本発明をよりよく理解しうるよう以下実施
例を示す。これらの実施例は例示の目的であって、特定
具体例のみに本発明を限定するものと解釈すべきでな
い。

【００６３】実施例１：ＴＮＦ様化合物のインビボ誘発
および分析 動物においてＴＮＦ産生を誘発することが知られた多く
の方法がある。たとえばＢＣＧ、コリネバクテリアおよ
びチモサン（酵母サッカロミセス・セレビシーの細胞壁
から）のような物質を動物に感染させると、インビボに
て細胞内皮系（ＲＥＳ）の多量増殖を誘発する。次い
で、細菌の細胞壁から生じた内生毒素（たとえばイー・
コリからのＬＰＳ）を使用して、活性化大食細胞により
ＴＮＦの放出を開始させることができる。

【００６４】本発明の方法におけるその後の使用のため
ＴＮＦ様ポリペプチドの産生を誘発させるべく、ウサギ
を使用するよう選択した。しかしながら、たとえばネズ
ミ、ラッテ、イヌ、サル、ウシなどの他の各種の動物を
選択することができるであろう。代案として、確定した
細胞ライン（ヒト、ネズミなど）を使用することもでき
る（上記）。ウサギを使用する好適具体例において、こ
れらウサギに４×１０^７の生存ＢＣＧ生物の接種物を静
脈内に注入した。ＲＥＳ系の最大刺戟と内生毒素の最大
感作とを与えることが知られているためＢＣＧを使用し
た〔Ｅ．Ａ．カルスウエル等、「腫瘍の壊死を生ぜしめ
る内生毒素誘発の血清ファクタ」、プロシーディング・
ナショナル・アカデミー・サイエンス・ＵＳＡ、第７２
巻、第３６６６頁（１９７５）〕。ＲＥＳが充分に刺戟
された約１４日後、各ウサギに１００μｇのＬＰＳを静
脈内注入して、ＴＮＦの産生を開始させた。２時間後に
動物を出血させて、処理動物の血清を集めた。

【００６５】ＴＮＦ分析用に適当な標的細胞を選択する
ため、インビトロで誘発したヒトＴＮＦおよびインビボ
で誘発したウサギＴＮＦの細胞毒性作用につき各種のヒ
ト細胞ラインの感受性を検査した。表１に要約したよう
に、試験した全てのヒト形質転換細胞ラインは、試験し
た形質転換してないヒト細胞ラインよりもＴＮＦ活性に
対しより感受性であった。さらに、３７℃にて全ての試
験した形質転換してない細胞ライン（１８２ＰＥ、Ｅ１
５Ｍ、ＷＩＳＨ、ＨＥＫ）のヒトＴＮＦに対する感受性
は、３７℃にてＬ−９２９細胞の感受性より１０％低か
った。さらに、正常な繊維芽細胞ラインと融合したヘラ
細胞から生ずるハイブリッドの１つの対応対（Ａ）（ｔ
ｕ⁻およびｔｕ^＋）は、壊死因子に対する感受性に相関
した腫瘍発生性を示したことは興味がある。しかしなが
ら、この種のハイブリッドの第２の対（Ｂ）には差が見
られなかった。さらに、試験したヒト細胞はウサギＴＮ
Ｆに対するよりもヒトＴＮＦに対し感受性が大であるた
め、ＴＮＦの作用において種類特異性の程度が存在する
と思われる。

【００６６】

【表１】

【００６７】ａ：Ｌ−９２９：ネズミ繊維芽腫瘍；Ｋ
Ｂ：ヒト表皮腫瘍；ＳＶ８０：ＳＶ４０形質転換したヒ
ト繊維芽細胞；Ｈｅｌａ：ヒト表皮腫瘍、頸部癌；ＶＡ
−４：ＳＶ−４０−形質転換した人肺；ＶＡ−１３：Ｓ
Ｖ４０−形質転換した人肺；ＨＯＳ：ヒト骨肉腫；ＭＮ
ＮＧ−ＨＯＳ：化学形質転換した骨肉腫；Ｈｅｐ：ヒト
表皮腫瘍、喉頭癌；ｔｕ⁻：腫瘍抑圧ハイブリッド（Ｈ
ｅｌａ×ヒト繊維芽細胞（ＧＭ００７７）；ｔｕ^＋：ｔ
ｕ⁻のインビボの対応物（Ｅ．Ｊ．スタンブリッジ等、
サイエンス、第２１５巻、第２５２〜２５９頁（１９８
２）；１８２ＰＦ：結腸および直腸のヒト皮膚遺伝性線
腫（正常なヒトのバイオプシ）；ＦＳ４：ヒト２倍体繊
維芽細胞；Ｅ１ＳＭ：ヒト２倍体繊維芽細胞；ＷＩＳ
Ｈ：ヒト羊膜；ＨＥＫ：ヒト未成熟腎臓。

【００６８】ｂ．ＢＣＧ−およびＬＰＳ−注射したウサ
ギの血清。

【００６９】ｃ．インビトロにてγ−ＩＦＮ（２４時
間）およびＬＰＳ（３時間）で刺戟したヒト胎盤Ｍφの
成長培地。

【００７０】ｄ．３７℃にてＬ−９２９細胞の感受性の
％として表わす。

【００７１】Ｌ−９２９細胞はＴＮＦ活性の証明となる
壊死因子に対し最高の特異的腫瘍関連感受性の１種を示
した。これらの細胞を本発明の分析用として選択した。
分析のため、実質的にラック等により記載された方法を
用いた〔リンホキン・レポート、第ＩＩ巻、（１９８
０）〕。

【００７２】先ず最初に、ＴＮＦを含有すると推定され
たフラクションの一連の希釈物を作成し、これらにＬ−
９２９細胞（細胞５０，０００個／穴部）とアクチノマ
イシンＤとを最終濃度１μｇ／ｍｌまで加えた。この混
合物を３７℃または３９．５℃にて１８時間培養した
（高い方の温度にてＬ−９２９標的細胞は、低い方の温
度におけるよりも２．５〜３．０倍感受性が大であっ
た）。培養期間の後、細胞を染色しかつ計数した。代案
として、染色細胞を３３％ＨＯＡｃに溶解し、かつ遊離
した染料をコントロン型分光光度計（５７７ｎｍ）を用
いて測定した。

【００７３】この分析において、１ｍｌ当りのＴＮＦ単
位（Ｕ）は、アクチノマイシンＤの存在下で行った死滅
分析において１８時間以内に細胞生存率５０％低下させ
るのに必要とするＴＮＦの希釈率の逆数を示す。

【００７４】実施例２：確率した細胞ラインにおけるＴ
ＮＦまたはＴＮＦ様活性の誘発 ＴＮＦもしくはＴＮＦ様活性は、インビトロにおいて確
立細胞ラインで誘発させることもできる。たとえばヒト
ＴＮＦ様を誘発させるため、ヒト単核Ｕ−９３７細胞ラ
インを選択した〔ヒト組織球のリンパ種、Ｃ．サンドソ
トロームおよびＫ．ニルソン、インターナショナル・ジ
ャーナル・カンサー、第１７巻、第５６５〜５７７頁
（１９７６）〕。しかしながら、たとえば胎盤からの他
のヒト前単核細胞ライン（たとえば、ＨＬ−６０、Ｍ１
−１）、ヒト単核細胞ライン（ＴＰＨ−１、Ｊ−１１
１）またはヒト大食細胞をも使用して、ヒトＴＮＦ様ポ
リペプチドを誘発させることができた。勿論、ヒトＴＮ
Ｆのこれらの各インビトロ原料は、ＴＮＦまたはＴＮＦ
様化合物の最適産生には多かれ少なかれ特異的誘発手段
を必要とすることを了解すべきである。

【００７５】ヒトＴＮＦを誘発させるために、５％の失
活してない予備選択した胎児牛血清のバッチ（ＦＣＳ、
ギブコ社、スコットランド、ペイスリー在）および５％
の馬血清（ギブコ社）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培
地にて転動瓶中でＵ−９３７細胞ラインを増殖させた。
細胞が１．５×１０^６個／ｍｌの密度に達した際、これ
らを３２ｎｍのＴＰＡ（シグマ社、セントルイス、ＵＳ
Ａ）にてＲＰＭＩ−１６４０、０．１Ｕ／ｍｌの牛結晶
インシュリン（ＢＤＨ社、プール、英国）、５０ｎＭレ
チノール酸（カルビオケム社、フランクフルト、西ドイ
ツ国）、１％の巨大腫瘍細胞（ＧＴＣ）−状態調節培地
（ギブコ社）、０．５ｍｇ／ｍｌのサイトデックス３
（ファルマシア社、ウプサラ、スウェーデン国）で１×
１０^６個／ｍｌの細胞の密度にて回転フラスコ中で２４
時間誘発させた。

【００７６】ネズミＴＮＦを誘発させるために、ネズミ
腫瘍大食細胞ラインＰＵ．５．１．８を選択した〔カン
サー・リサーチ、第３７巻、第５４６〜５５０頁（１９
７７）〕。しかしながら、たとえばＪ−７７４、ＲＡＷ
３０９およびＷＲ１９Ｍのような他のネズミ大食細胞ラ
インも選択しうるであろう。Ｐ．Ｕ．５．１．８細胞ラ
インを誘発させて、メネル等により実質的に記載された
ようにＴＮＦを産生させた〔インフェクション・アンド
・イミュノロジー、第３０巻、第５２３〜５３０頁（１
９８０）〕。概要において、これら細胞を１０％ＦＣＳ
（３０９ギブコ０１１−６３０９）を加えたＲＰＭＩ−
１６４０培地中で転動瓶にて増殖させた。次いで、これ
らの細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０における５μｇのＬＰ
Ｓ〜ｍｌにより転動瓶中で３．５×１０^６の濃度にて４
時間誘発させた。

【００７７】インビトロで誘発した細胞（ネズミもしく
はヒト）を遠心分離によって集め、これらをＴＮＦもし
くはＴＮＦ様ポリペプチドをコードする遺伝情報を有す
るｍＲＮＡ源として使用した。さらに、これらをネズミ
もしくはヒトＴＮＦ自身の原料として使用した。

【００７８】実施例３：ＴＮＦ活性コードする遺伝情報
を有するｍＲＮＡの作成 上記で作成したインビトロ誘発のＵ−９３７（ヒト）ま
たはＰＵ５．１．８（ネズミ）をＴＮＦ特異性ｍＲＮＡ
の原料として使用した。細胞をノニデットＰ−４０中で
溶解させ、次いで溶解物をフェノール化することによ
り、前記細胞から全細胞質ＲＮＡを抽出した。次いで、
オリゴｄＴ−セルロースクロマトグラフィーによって溶
解物からポリアデニル化ＲＮＡ（ポリＡ^＋ＲＮＡ）を単
離した（３型、共同研究）、さらに、ベックマンＳＷ４
１型ロータを用い４℃、４０Ｋかつ１９時間で１５％凍
結−解答蔗糖濃度勾配（５％〜２０％の蔗糖勾配に相当
する）にてポリＡ^＋ＲＮＡを分画した。

【００７９】アフリカ産カエルの卵母細胞中へ所定量を
微小注入することにより各フラクションの生物学的活性
を分析した（卵母細胞１個当り５０ｐｇのｍＲＮＡ；１
試料当り１５個の卵母細胞）。次いで、これら注入した
卵母細胞を卵母細胞の浸漬培地（０．１％のポリエチレ
ングリコール６０００と０．４％のアプロチニン（シグ
マ社）と１ｍＭのＣｕＳＯ_４とを含有する）中で２４時
間培養し、前記のインビトロ分析計を用い３９．５℃に
てＬ−９２９細胞につき培地中でＴＮＦ活性を分析し
た。これらの分析において、ヒトおよびネズミＴＮＦ関
連ＲＮＡにつきそれぞれ約１６Ｓおよび１７Ｓで沈降し
たｍＲＮＡに対応するフラクションにおいて再現性のあ
るＴＮＦ生物学的活性を観察した。図１は、それぞれヒ
トおよびネズミｍＲＮＡ調整物の２種の代表的蔗糖勾配
のＯＤ−経過を示している。

【００８０】実施例４：ネズミおよびヒトｃＤＮＡ保存
物の作成 ウイケンス等により「リゾチーム、オボムコイドおよび
オバルブミンｍＲＮＡに相補的な二重鎖ＤＮＡの合成」
ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２５３
巻、第２４８３〜２４９５頁（１９７８）〕に実質的に
記載されたように、卵母細胞中への注入後に最大ＴＮＦ
生物学活性を示したポリ^＋ＲＮＡのフラクション±８μ
ｇを使用して、ヒトおよびネズミのｃＤＮＡ保存物を作
成した。勿論、これらのクローン化したｃＤＮＡ保存物
は、他のヒトもしくは動物源から或いは全細胞ＲＮＡか
ら上記の事前の濃縮または寸法選択なしにポリＡ^＋ＲＮ
Ａから作成しうることも了解されよう。

【００８１】たとえば、ランド等、「真核ｍＲＮＡの５
−末端配列は高効率にてクローン化することができ
る」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第９巻、第
２２５１〜２２６６頁（１９８１）；オカヤマおよびベ
ルグ、「全長ｃＤＮＡの高効率のクローン化」、モレキ
ュラー・アンド・セル・バイオロジー、第２巻、第１６
１〜１７０頁（１９８２）；またはマニアチス等、「モ
レキュラー・クローニング」、（コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー出版、ニューヨーク）、第２
２９〜２４６頁（１９８２）に記載されたような他の慣
用の方法も使用しうるであろうが、ここではｃＤＮＡク
ローン化につき次の方法を選択した。

【００８２】（ａ）第１ストランドの合成 第１ｃＤＮＡストランドを合成するため、±８０μｇの
ポリＡ^＋ＲＮＡ／ｍｌと５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．３）と５０ｍＭのＫＣｌと１０ｍＭのＭｇＣｌ_２
と１０ｍＭのＤＴＴと０．５ｍＭの各ｄＮＴＰとを使用
し、１／１０００ｄＣＴＰの代りにα^３２Ｐ−ｄＣＴＰ
を±６００Ｃｉ／ミリモル（アメルシャム社、バッキン
ガムシャー、英国）を使用し、さらにｐ（ｄＴ）_１０を
６０μｇ／ｍｌ（ファルマシア−ＰＬバイオケミカルス
社、ウプサラ、スウェーデン国）にて使用し、また７５
０単位／ｍｌのヒト胎盤ＲＮＡアーゼ阻止剤（アメルシ
ャム社）と１０００単位／ｍｌのＡＭＶ逆転写酵素（ア
ングリア・バイオテクノロジー社、コルチェスター、英
国）を使用した。

【００８３】反応のため、１００μｌの全量と４１℃と
１時間とを用いた。次いで、反応混合物をフェノール／
クロロホルム／イソアミルアルコール（２５／２４／
１）の混合物で２回かつジエチルエーテルで２回抽出
し、１容量の４Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃと４容量のエタノール
とを添加してＤＮＡを沈澱させた。この沈澱を２回反復
した。必要に応じ、さらに反応混合物へ酵母ｔＲＮＡを
キャリヤとしてエタノールの添加前に加えた。

【００８４】（ｂ）ＲＮＡ雛型の除去および第２ストラ
ンドの合成 沈澱したＤＮＡを６０μｌの１５ｍＭ燐酸カリウム（ｐ
Ｈ６．９）および０．２５ｍＭのＥＰＴＡに再溶解さ
せ、２μｇＲＮＡアーゼＡ（ベーリンガー・マンハイム
社、西ドイツ国）と２５０単位のＲＮＡアーゼＴ１（Ｂ
ＲＬ社、ノイ−アイゼンブルグ、西ドイツ国）とを加
え、この混合物を３７℃にて３０分間静置した。

【００８５】次いで、この混合物を沸とう水浴中で２分
間加熱し、次いで直ちに氷上で急冷した。次いで、燐酸
カリウム緩衝剤（ｐＨ６．９）（最終濃度１００ｍＭま
で）とＭｇＣＬ_２（最終濃度１０ｍＭまで）とＤＴＴ
（最終濃度１０ｍＭまで）とｄＮＴＰ（最終濃度１ｍＭ
まで）と３３０Ｕ／ｍｌのイー・コリＤＮＡポリメラー
ゼＩ（エンドヌクレアーゼを含有しない）（ベーリンガ
ー・マンハイム社、西ドイツ国）とを加えた。この第２
ストランドの合成は１５℃にて全容積３００μｌにて６
時間行った。次いで、最終濃度２５ｍＭまでＥＤＴＡを
添加して（ｐＨ８）反応を停止させ、上記と同様に混合
物を抽出しかつ沈澱させた。

【００８６】ペレットを５０ｍＭのトリス−Ｈｃｌ（ｐ
Ｈ８．３）と５０ｍＭのＫｃｌと１０ｍＭのＭｇＣｌ_２
と１０ｍＭのＤＴＴと１ｍＭの各ｄＮＴＰと６５０Ｕ／
ｍｌのＡＭＶ逆転写酵素（アングリアン・バイオテクノ
ロジー社、コルチェスタ、英国）との混合物８０μｌ中
に再溶解させ、かつ混合物を４１℃にて９０分間培養す
ることにより、第２ストランドのｃＤＮＡ合成の効率を
高めた。次いで、再び上記と同様な抽出および沈澱によ
りＤＮＡを単離した。

【００８７】（ｃ）Ｓ１ヌクレアーゼ処理１２５ｍＭの
ＮａＣｌと２５ｍＭのＮａＯＡｃと１ｍＭの酢酸亜鉛
（ｐＨ４．５）とを含有する緩衝液８０μｌ中にＤＮＡ
ペレットを溶解させ、２０単位のＳ１−ヌクレアーゼ
（ＢＲＬ社、ノイ−アイゼンブルグ、西ドイツ国）を加
え、かつ混合物を３７℃にて２０分間静置した。最終濃
度２０ｍＭまでＥＤＴＡ（ｐＨ８）を添加して反応を停
止させ、かつ反応混合物を最終濃度２００ｍＭまでのト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ８）の添加によって中和した。次い
で、再びＤＮＡを上記と同様に抽出しかつ沈澱させ、こ
れを３０ｍＭのＮａＣｌと１０ｍＭのトリス−ＨＣｌと
１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）とを含有する緩衝液中に再
溶解させ、そして同じ緩衝液に対し平衡化させたセファ
ロースＣＬ４Ｂカラム（０．８×１２ｃｍ）（ファルマ
シア・ファイン・ケミカルス社、ウプサラ、スウェーデ
ン国）にて寸法分画した。それぞれ２滴のフラクション
を集め、少なくとも５００塩基対もしくはそれより大の
ＤＮＡを含有するフラクションを集め、そして集めたフ
ラクションを上記と同様に沈澱させた。

【００８８】（ｄ）二重鎖ｃＤＮＡおよびＰｓｔＩ−制
限ｐＡＴ１５３の処理 オリゴ−ｄＣ末端を有する前記二重鎖ｃＤＮＡを、次の
反応混合物を用いて処理した：±２．５μｇの二重鎖ｃ
ＤＮＡ／ｍｌと１００ｍＭのカコジル酸カリウム（ｐＨ
７．２）と２ｍＭのＣｏＣｌ_２と２００μＭのＤＴＴと
４０μＭのデオキシ−（５−Ｈ^３）−シチジン三燐酸
（１７Ｃｉ／ミリモル、アメルシャム社、バッキンガム
シャー、英国）と４００単位／ｍｌの末端デオキシヌク
レオチジルトランスフェラーゼ（ファルマシマ−ＰＬバ
イオケミカルス社、ウプサラ、スウェーデン国）。１２
−１８ｄｃ残基が３′ＯＨに対し組込まれるまで３７℃
にて反応を続け、次いで最終濃度２０ｍＭまでＥＤＴＡ
（ｐＨ８）の添加によって反応を停止させた。次いで、
直ちにこの物質をフェノールによって抽出し、次いでジ
エチルエーテルで２回抽出し、かつ処理したｃＤＮＡを
上記のように沈澱させた。

【００８９】さらに、同様な条件下でＰｓｔＩ制限プラ
スミドｐＡＴ１５３^＊にオリゴｄＧ−末端を付加した
が、ただし（１）デオキシ−（５−Ｈ^３）−シチジン−
５′−三燐酸の代りにデオキシ−（８−Ｈ^３）−グアノ
シン−５′−三燐酸（２５Ｃｉ／ミリモル、アメルシャ
ム社、バッキンガムシャー、英国）を４μＭの濃度で使
用し、かつ（２）±１６ｐモル／ｍｌの線状プラスミド
ＤＮＡの濃度を使用した。

【００９０】＊ｐＡＴ１５３（周知の入手しうるクロー
ン化ベクター）供給業者（ベーリンガー・マンハイム
社、西ドイツ国）の指示にしたがってＰｓｔＩで制限
し、ただし３倍多量の酵素単位を使用した。

【００９１】（ｅ）オリゴｄＣ−処理二重鎖ｃＤＮＡと
オリゴｄＧ−処理ベクターＤＮＡとの融合 ｄＣ−処理した二重鎖ｃＤＮＡとｄＧ処理した線状化プ
ラスミドとをマニアチス等の方法〔「モレキュラー・ク
ローニング」、（コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリーズ出版、ニューヨーク）、第２４２頁（１９
８２）〕に実質的にしたがって融合させたが、ただし混
合物を６５℃まで加熱した後にこれを２〜３時間かけて
室温まで冷却した。

【００９２】（ｆ）イー・コリ菌株ＤＨＩ（λ）の形質
転換 次いで、イー・コリＤＨＩ（λ）〔ハナハン、「プラス
ミドによる大腸菌の形質転換に関する研究」、ジャーナ
ル・モレキュラー・バイオロジー〕を前記の融合した組
換ＤＮＡにより、競合細胞１００μｌ当り１０ｎｇのベ
クターＤＮＡを用いて形質転換させた。次いで、形質転
換した混合物をミリポアＨＡＴＦ（０．４２μＭの孔
径）フィルタ（ミリポアコーポレーション社、レッドフ
ォード、マサチューセッツ州）に移植し、これらを１０
μｇのテトラサイクリンを含有するルリアブロス寒天板
の表面に載置した。コロニーを発生させた後、２０％の
グリセリンを含有する新たなプレートにフィルタを載置
し、かつこれを−２０℃で保存した。

【００９３】この手順を用いて、約６０，０００種のク
ローンよりなるヒトｃＤＮＡ保存物と約３０，０００種
のクローンよりなるネズミｃＤＮＡ保存物を得た。

【００９４】実施例５：ウサギ血清からのＴＮＦの精製 図２を参照して、ここには誘発したウサギ血清からのＴ
ＮＦ様ポリペプチドを精製するための１具体例を概略で
示している。図２に示した本発明の具体例で示したよう
に、実施例１に記載したと同様処理した５０羽のウサギ
の血清を集めた。典型的実験において、ＬＰＳを静脈内
注射した後に、ＢＣＧ処理したウサギの血清（１８００
ｍｌ）は約５．２×１０^４Ｕ ＴＮＦ／ｍｌを含有し、
その比活性は約５．３×１０^２Ｕ ＴＮＦ／蛋白ｍｇで
あった。

【００９５】（ａ）ウサギ血清からの蛋白の沈澱 先ず最初に分離したウサギ血清を固体の硫酸アンモニウ
ムで飽和させ、その際この硫酸塩を常に攪拌しながら４
℃にてゆっくり（約６ｇ／ｍｉｎ）添加し、３５．９％
硫酸アンモニウム飽和に達せしめた。次いで、アンモニ
ウムによりｐＨを７．０に維持し、かつ溶液を絶えず攪
拌しながら４℃にて約１８時間保った。次いで遠心分離
（３０ｍｉｎ、７５００ｒｐｍ、４℃、ベックマンＪＡ
７．５型ロータを用いる）によって沈澱物を溶液から
除去した。次いで、同じ条件下で６１．６％の飽和に達
するまで硫酸アンモニウムを上澄液に加えた。上記の飽
和血清を絶えず攪拌しながら５時間おいた後、再び上記
と同様に沈澱物を集め、かつこの第２沈澱からのペレッ
トを４℃の５０ｍＭトリス−Ｈｃｌ（ｐＨ７．５）６０
０ｍｌ中に再懸濁させた。次いで、この溶液を４×３０
００ｍｌの５０ｍＭトリス−Ｈｃｌ（ｐＨ７．５）に対
し４０時間透析して硫酸アンモニウムを除去した。この
工程により５０ｍＭトリス−Ｈｃｌ（ｐＨ７．５）にお
ける７６０ｍｌの蛋白溶液を得た。この３５．９〜６
１．６％の硫酸アンモニウムフラクションをフラクショ
ンＡと呼ぶ。

【００９６】０〜３５．９％の硫酸アンモニウムフラク
ションからのペレットも著量のＴＮＦ活性を有するの
で、これを約２００ｍｌの５０ｍＭトリス−Ｈｃｌ（ｐ
Ｈ７．５）に再懸濁させ、かつこの溶液を２０００ｍｌ
の３０．８％硫酸アンモニウム溶液に対し４℃にて絶え
ず攪拌しながら１８時間透析した。前記と同様に遠心分
離により沈澱物を除去した後、上澄液を３×２０００ｍ
ｌの５０ｍＭトリス−Ｈｃｌ（ｐＨ７．５）に対し４℃
にて絶えず攪拌しながら３×２．５時間にわたり透析し
た。この透析により、５０ｍＭトリス−Ｈｃｌ（ｐＨ
７．５）における２７０ｍｌの蛋白溶液が得られた。こ
の３０．８〜３５．９％の硫酸アンモニウムフラクショ
ンをフラクションＢと呼ぶ。

【００９７】フラクションＡとＢとを合し、かつ遠心分
離（３０ｍｉｎ、７５００ｒｐｍ、４℃、ベックマンＪ
Ａ ７．５型ロータを用いる）の後、溶液を０．４５μ
ｍのニトロセルロースフィルタ（ミリポア社、ベッドフ
ォード、マサチューセッツ州）に通過させて、１０２５
ｍｌの３０．８〜６１．５％の硫酸アンモニウムフラク
ションを得た。この混合したフラクションは約８．０×
１０^４Ｕ ＴＮＦ／ｍｌ（ウサギ血清のＴＮＦ活性のほ
ぼ全部）と、その全蛋白の５５％のみを含有した。この
フラクションの比活性は８．８×１０^２Ｕ ＴＮＦ／蛋
白ｍｇであった。

【００９８】（ｂ）イオン交換クロマトグラフィー（緩
和なアルカリ性ｐＨ） 組合せたフラクションにおけるＴＮＦ活性をそこに含ま
される他の多くの蛋白から分離し、その際陰イオン交換
樹脂に対するＴＮＦの強力な結合親和性を利用した。多
くの陰イオン交換クロマトグラフ系が当業者に周知され
ているが、直径２．６ｃｍ×４８ｃｍのＤＥＡＥ、セフ
ァセルカラム（ファルマシア社、ウプサラ、スウェーデ
ン国）を使用するよう選択した。勿論、他の陰イオン交
換カラムも選択し得ることが了解されよう。

【００９９】予め、５０ｍＭトリス−Ｈｃｌ（ｐＨ７．
５）で平衡化させた選択カラムにＴＮＦ含有溶液を充分
過剰に負荷させ、溶液を０．８ｍｌ／ｍｉｎの流速で通
した。ＴＮＦはカラム上において他の予め結合した蛋白
と競合するので、この手順は溶液中のほぼ全部のＴＮＦ
が結合したカラムを与えた。このカラムを同容積の５０
ｍＭトリス−Ｈｃｌ（ｐＨ７．５）と５０ｍＭトリス−
Ｈｃｌ（ｐＨ７．５）における同容積の０．１ＭのＮａ
Ｃｌとで０．８ｍｌ／ｍｉｎの流速にて洗浄した後、こ
れを５０ｍＭトリス−Ｈｃｌ（ｐＨ７．５）における
０．１Ｍから０．４ＭのＮａＣｌの直線的塩濃度勾配で
同流速にて溶出させた。この溶出は、０．１ＭのＮａＣ
ｌ洗浄工程の終りにＴＮＦ活性を有するフラクションの
溶出物を与えた。図２に示したように、得られた溶液は
２．８×１０^５Ｕ ＴＮＦ／ｍｌを含有し、比活性は
１．６×１０^５Ｕ／蛋白ｍｇであった。したがって、こ
の陰イン交換工程は、９９％以上の比ＴＮＦ蛋白を除去
することができると共に、ＴＮＦ活性のほぼ全部を保持
することができた。

【０１００】（ｃ）イオン交換物の濃縮 再び図２を参照して、ＤＥＡＥセファセルカラムから溶
出させたＴＮＦ含有フラクションを集めかつ濃縮した。
集めたフラクションを遠心分離し（３０ｍｉｎ、７５０
０ｒｐｍ、４℃、ベックマンＪＡ １４型ロータを用い
る）、次いでアミコンＴＣＦ−２型装置を用いて上澄液
を１７倍に濃縮した（セルを１．５気圧に加圧しかつジ
アフロＵＭ１０膜（アミコン、ダンバー、マサチューセ
ッツ集、ＵＳＡ）を使用した）。得られた濃縮物は２．
６×１０^６Ｕ ＴＮＦ／ｍｌを含有しかつ１．２×１０
^５Ｕ／ｍｇの比活性を有した（図２）。

【０１０１】（ｄ）ゲル濾過 上記のように作成した濃縮物をゲル濾過により分子量に
したがって分画した。多数の適当なゲル濾過系が当業者
に周知されているが、２０，０００〜３５０，０００ダ
ルトンの分画範囲を有するＡｃＡ３４ゲル（ＬＫＢ社、
ブロマ、スウェーデン国）を選択した。ここでも、他の
濾過系を使用し得ることが了解されよう。

【０１０２】選択したゲルを１ＭのＮａＣｌと５０ｍＭ
トリス−Ｈｃｌ（ｐＨ７．５）に懸濁させ、このゲルを
カラム（直径２．５ｃｍ×８９ｃｍ）中へ注ぎ込み、か
つこのカラムを同じ緩衝液で０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速
にて平衡化させた。ＴＮＦ濃縮物を調整されたＡｃＡ３
４カラムに充填する前に、アミコン濃縮物の塩濃度を、
５０ｍＭトリス−Ｈｃｌ（ｐＨ７．５）における５Ｍの
ＮａＣｌ溶液によりカラム緩衝液の塩濃度で平衡化させ
た。ＴＮＦ活性を有するこの工程のゲル濾過フラクショ
ンは、約３５０，０００ダルトンの分子量に相当した。

【０１０３】図２に示したように、ゲル濾過後に残留す
る３０ｍｌの溶液は４．０×１０^６Ｕ ＴＮＦ／ｍｌを
含有し、かつ９．３×１０^６Ｕ ＴＮＦ／蛋白ｍｇの比
活性を有した。これは、血清から約２０，０００倍ＴＮ
Ｆが精製されたことを示している。

【０１０４】（ｅ）イオン交換クロマトグラフィー（弱
酸性ｐＨ） ＴＮＦ活性を有する集めたゲル濾過フラクションを、２
０ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ５．８）にお
ける２×７５０ｍｌの０．１Ｍ ＮａＣｌに対し４℃に
て１晩透析した。次いで、調製用のモノ−Ｑカラム（直
径１ｃｍ×１１ｃｍ、ファルマシア社、ウプサラ、スウ
ェーデン国）を同じ緩衝液で平衡化させた後、透析した
ＴＮＦ含有の溶液をこのカラムにて２０ｍＭヒスチジン
−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ５．８）における０．１Ｍ〜０．
４ＭのＮａＣｌの直線的勾配により分画した。ＴＮＦ活
性を有するフラクションは約０．２６ＭのＮａＣｌの濃
度勾配で溶出した（フラクション１５および１６）。再
び図２を参照して、これらのクロマトグラフ工程は、
２．５×１０^７Ｕ ＴＮＦ／ｍｌを含有し、かつ４．５
×１０^７Ｕ ＴＮＦ／蛋白ｍｇの比活性を有する溶液４
ｍｌを与えた。このフラクションは、血清からの約１０
０，０００倍のＴＮＦ精製を示した。図２に示した全Ｔ
ＮＦ活性における変動は、ＴＮＦ活性分析における不正
確さ（ファクター２まで）によるものである。

【０１０５】酸性モノＱカラムからの溶出フラクション
をＳＤＳ−ＰＡＳＥ（１２％）で分析した。次いで図３
を参照して、約１８，０００ダルトンの分子量に相当す
る位置に単一の蛋白帯が活性カラムフラクション内に保
持されることを観察した。この蛋白帯におけるクーマシ
ー・ブリリアント・ブルー（セルバＲ２５０）の染色強
度は、対応するカラムフラクションのＴＮＦ活性と正確
に相関する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは蛋白を変性させるが、
非変性ゲルのゲルスライス物から溶出したＴＮＦ活性は
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動に際
し同じ蛋白帯を示し、したがって１８，０００ダルトン
のバンドはＴＮＦ様ポリペプチドを示すことが確認され
た。

【０１０６】実施例６：精製したウサギＴＮＦの部分の
アミノ酸配列の決定および各種ＤＮＡ試料の作成 誘発したウサギ血清からのこのＴＮＦ様ポリペプチドを
精製した後、これを使用してそのアミノ酸配列の部分を
決定した。しかしながら、精製ＴＮＦを臨床的に用い
て、癌および腫瘍ならびにマラリア感染に対するＴＮＦ
の作用ならびにこれらに対する治療効果を研究し得るこ
とも了解されよう。さらに、ＴＮＦを使用し、精製蛋白
を適当な動物中へ注射してＴＮＦ抗体（ポリクローナル
またはモノクローナル）を生成させることもできる〔た
とえばＢ．ベナセラフおよびＥ．ウナヌエ、「テキスト
ブック・オブ・イミュノロジー」、ウイリアムス・アン
ド・ウイルキンス（バルチモア、メリーランド州）、第
１２〜２２頁（１９７９）〕。これらの抗体は、たとえ
ば分析或いはＴＮＦ自身の精製工程に有用である。

【０１０７】これから誘導される蛋白およびペプチドの
アミノ酸配列を決定する技術は当業界で周知されてい
る。これらの利用しうる自動化技術の１つを選択して、
実施例５で精製されたウサギＴＮＦ様化合物の選択部分
に関するアミノ酸配列を決定した。先ず最初に、精製し
たウサギＴＮＦのＣＮＢγ断片を標準条件下で作成し
た。次いで、これらの断片をゲル上で分離し、個々のバ
ンドを電気溶出させ、これらを透析しかつアプライド・
バイオシステムス気相配列決定装置（モデル４７０型）
に直接施した。

【０１０８】図４および図５を参照して、ここには精製
したウサギＴＮＦポリペプチドの２種の部分のアミノ酸
配列が示されている。（ＴＮＦ ＣＮＢγ−断片３およ
び４）。さらにこれらの図面には２種の断片における各
アミノ酸をコードする各種のＤＮＡコドンも示されてい
る。各コドンは、決定されたアミノ酸配列をコードする
縮重群を示している。遺伝子コードの縮重により、多く
の存在しうるヌクレオチド変異を含む多くのＤＮＡ試料
を所定のアミノ酸配列につき合成することができる。勿
論、ＤＮＡ試料の合成には、少なくとも縮重コドンを有
するアミノ酸を含有したアミノ酸配列を選択するのが好
適である。しかしながら、充分長い試料を選択すれば、
生じうる不整合は完全整合の領域によって補われ、高縮
重群の試料においてさえ検出可能なハイブリッド化が生
ずるであろう。

【０１０９】精製したウサギＴＮＦから誘導したアミノ
酸配列は、各種のＤＮＡ保存物をスクリーニングしてハ
イブリッド化により関連ＤＮＡ配列を選択する際使用す
るためのヌクレオチド（ＤＮＡ）試料の合成に有用であ
る。次いで、これらの選択した配列を処理して、これら
により形質転換された原核宿主でＴＮＦ発現させること
ができる。さらに、これらは、哺乳動物ＴＮＦ、たとえ
ばネズミおよびヒトＴＮＦをコードするその他の関連Ｄ
ＮＡ配列を選択するためのスクリーニング試料としても
有用である。

【０１１０】さらに、精製ＴＮＦを用いかつそのアミノ
酸配列に基づく合成ペプチドを用いて、適当な動物にお
いてＴＮＦに対するポリクローナルもしくはモノクロー
ナル抗体を作成することもできる。これらの抗体はＴＮ
Ｆの精製およびＴＮＦの放射線免疫分析に有用であり、
たとえば本発明の方法により作成されたＴＮＦ発現性ク
ローンの直接的選択に使用することができる。さらに、
精製蛋白および合成ペプチドは腫瘍、癌およびマラリア
治療ならびにその関連方法においてＴＮＦ活性を臨床的
に評価するにも有用である。

【０１１１】再び図４および図５を参照して、ここには
ＴＮＦ断片３および４につき決定したアミノ酸配列に基
づき慣用のホスホアミドＤＮＡ合成技術を用いて作成し
た各群の縮重ＴＮＦＤＮＡ試料が示されている〔たとえ
ばテトラヘドロン・レタース、第２２巻、第１８５９〜
１８６２頁（１９８１）〕。たとえばＬｙｓ（ＡＡＮ
ｏ．２）からＡｌａ（ＡＡＮｏ．１２）に到る範囲のＴ
ＮＦ断片３におけるアミノ酸配列に基づき、位置４−６
−１９−２１にヌクレオチド組換へを有する４種の３２
量体（ＲＡＢ ＴＮＦ３−Ｉ〜ＲＡＢ ＴＮＦ３−Ｉ
Ｖ）を合成した。図４において組換部分には下線を施し
た。さらに、６０オリゴヌクレオチド長い重複試料を作
成した（図４参照）。

【０１１２】Ｔｒｐ（ＡＡＮｏ．３）からＬｅｕ（ＡＡ
Ｎｏ．９）に到る範囲のＴＮＦ断片４におけるアミノ酸
配列に基づき、４種の縮重群の２０量体（ＲＡＢ ＴＮ
Ｆ４−Ａ１〜ＲＡＢ ＴＮＦ４−Ａ４）を合成した（図
５参照）。これらの２０量体の位置１２にヌクレオチド
組換を有した（図５において下線を施す）。異なる群の
試料によるゲノムウサギＤＮＡのサウザンブロット法に
おける後のハイブリッド化パターンに基づき、ＲＡＢ
ＴＮＦ４−Ａ２試料を位置１５におけるヌクレオチド組
換に基づいて３群に分けた（図５において組換えに下線
を施す）。断片４のＰｈｅ（ＡＡＮｏ．１３）からＰｓ
ｐ（ＡＡＮｏ．１９）に到る範囲のアミノ酸配列に基づ
き、第２群の６種の２０量体（ＲＡＢ ＴＮＦ４−Ｂ１
〜ＲＡＢＴＮＦ４−Ｂ６）を作成した。最後に、ＴＮＦ
蛋白のこの部分におけるほぼ全部の公知アミノ酸配列に
わたる長い重複試料を作成した（図５参照）。

【０１１３】これらＤＮＡ試料を使用してスクリーニン
グする前に、各一本鎖ＤＮＡ試料をＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼによって５′末端標識した。４種のα^３２Ｐ
−デオキシヌクレオシド三燐酸全部の存在下でクレノー
・ポリメラーゼを用いる充填により、長い重複試料を長
い高比活性（＞１０^８／μｇ試料ＤＮＡ）まで標識し
た。

【０１１４】実施例７：ウサギゲノム保存物のスクリー
ニング １種もしくはそれ以上のＤＮＡ試料を用いて全てのＤＮ
Ａ収集物を有効にスクリーニングしうるが、一般に合成
ＤＮＡ試料の基礎となるポリペプチドの分離に使用した
と同じ動物から得られたＤＮＡ保存物を先ず最初にスク
リーニングするのが好ましい。同じ動物からのＤＮＡ保
存物の使用は、ハイブリッド化条件を一層厳格にするこ
とを可能にする。何故なら、この試料とゲノムＤＮＡに
おける対応、領域との間の類似性が高いからである。Ｄ
ＮＡ試料とＤＮＡ保存物との両者につき同じ動物源を使
用することは、短いＤＮＡ試料を使用する場合特に重要
である。より長いＤＮＡ試料を使用する場合には、それ
程重要でない。この種の短い試料につきスクリーニング
してＤＮＡを選択した後、これを単独でまたは組換ファ
ージもしくはプラスミドとして使用することにより、同
じ動物から得られた或いはヒトを含む他の動物から得ら
れたＤＮＡ保存物においてハイブリッド化により関連Ｄ
ＮＡを選択することができる。選択したＤＮＡはその分
離に使用した初期の合成試料よりも長く、したがって完
全整合の領域を含む可能性が大きいので、短い合成試料
を使用して同じ動物からのＤＮＡ配列を使用すると共
に、これらの試料につき選択されたＤＮＡを使用して種
属間のＤＮＡを選択するのが好ましい。

【０１１５】上記原理にしたがって、実質的にマニアチ
ス等の方法により作成されたウサギゲノムＤＮＡのクロ
ーン化保存物をスクリーニングした〔「真核ＤＮＡの保
存物からの構造遺伝子の分離」、セル、第１５巻、第６
８７〜７０１頁（１９７８）〕。

【０１１６】上記保存物につき、全部で６×１０^５個の
ファージをプレート培養し、次いでこれらを２個のナイ
ロンフィルタ（ＰＡＬ）に釣上げた（それぞれ５分およ
び８分の吸着時間を用いる）。フィルタ上でのファージ
ＤＮＡの変性、中和および固定の後、高比活性標識した
（０．５−１．０×１０^７ｃｐｍ／ｐモルＤＮＡ）合成
ヌクレオチド試料ＲＡＢ ＴＮＦ３−ＩＩＩを用いて保
存物をスクリーニングした（図４）（この試料はサウザ
ン切断およびハイブリッド化による予備分析に基づいて
選択した）。これらのフィルタを４×ＳＳＣ、１５ｍＭ
の燐酸ナトリウム（ｐＨ７）、１０×デンハルト溶液、
２５０μｇ／ｍｌのｔ−ＲＮＡおよび７％のＳＤＳにお
いて５０℃で２時間予備ハイブリッド化した。洗浄した
後、これらを１０％デキストラン硫酸塩、５×ＳＳＣ、
１０×デンハルト溶液、２０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ
７）、５００μｇ／ｍｌのｔ−ＲＮＡおよび７％のＳＤ
Ｓにて標識試料と５０℃にて１晩ハイブリッド化させ
た。２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中で５０℃にてこれらフィ
ルタを洗浄した後、光学分析にかけた。

【０１１７】このスクリーニングの結果、１６種の二重
陽性ハイブリッド化クローンを得た。これらの１６種の
陽性クローンから対応のプラークを分離し、かつＴＮＦ
断片３および４の両者から得られたＤＮＡ試料を用いて
サウザンブロットによりそれらのＤＮＡを分析した。そ
れらの分析の１つにおいて、オリゴヌクレオチド試料Ｒ
ＡＢ ＴＮＦ３−ＩＩＩおよびＲＡＢ ＴＮＦ４−Ａ２
−３による１６種のファージＤＮＡのＥｃｏＲＩ制限切
断に関するサウザンブロットは、両試料に対しハイブリ
ッド化するＥｃｏＲＩバンドを持った１種のファージを
与えることを観察した。この特定クローンはＤＮＡ断片
を含有してＴＮＦ関連ポリペプチドの両断片３および４
に対応する試料にハイブリッド化するので、これはウサ
ギＴＮＦ遺伝子のほぼ全部を含有する可能性が極めて高
いと結論された。

【０１１８】実施例８：ｃＤＮＡネズミおよびヒト保存
物のプラス−マイナススクリーニング このスクリーニング法は、２種のヒトおよびネズミＤＮ
Ａ試料を並行して使用することに基づいており、一方は
卵母細胞注射の後に最大ＴＮＦ生物学活性を示したポリ
^＋ＲＮＡの蔗糖濃度勾配フラクションから合成されたｃ
ＤＮＡ（実施例３）であり、他方は非誘発培養物から得
られた同等なフラクションで合成されたｃＤＮＡであ
る。前者をプラス試料と呼び、後者をマイナス試料と呼
ぶ。

【０１１９】実施例４の（ａ）部に実質的に記載したと
同様にプラス試料およびマイナス試料につきｃＤＮＡを
合成し、ただし０．２ｍＭのデオキシヌクレオシド三燐
酸だけを使用し、かつα^３２Ｐ−ｄＡＴＰ（７０００Ｃ
ｉ／ミリモル、アメルシャム社、バッキンガムシャー、
英国）を２μＭの濃度まで添加した。

【０１２０】プラスおよびマイナスのネズミおよびヒト
試料を併用して、２群のランダム選択したネズミおよび
ヒト原料から得られたｃＤＮＡ保存物の複製物をそれぞ
れスクリーニングした（実施例４）。ハナハンおよびメ
セルソンの方法〔「高コロニー密度におけるプラスミド
スクリーニング」、ジーン、第１０巻、第６３〜６７頁
（１９８０）〕にしたがってｃＤＮＡ保存物の複製を作
成した。マニアチス等により「モレキュラー・クローニ
ング」、（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー出版、ニューヨーク）、第３２６〜３２８頁（１９
８２）に実質的に記載されたように、フィルタ（ミリポ
ア、ＨＡＴＦ、０．４５μｍ）にて細菌コロニーを溶菌
させた。

【０１２１】これら保存物のハイブリッド化スクリーニ
ングを行うため、同属試料を使用し、すなわちネズミの
プラスおよびマイナス試料を使用して、ネズミのｃＤＮ
Ａ保存物をスクリーニングし、かつヒトのプラスおよび
マイナス試料を使用してヒトの保存物をスクリーニング
した。さらに、これらのクローンをプラス試料につき陽
性であるがマイナス試料については陽性でない各保存物
において検査した。

【０１２２】３０，０００種のクローン保存物からラン
ダム選択された５，０００種のクローンよりなるネズミ
保存物を上記のようにプラス／マイナススクリーニング
した結果、さらに分析するための５５種の陽性クローン
を選択した。ヒト保存物のプラス／マイナススクリーニ
ングの結果は不明瞭であった、したがって、ヒトｃＤＮ
Ａ保存物のこのプラス／マイナススクリーニングについ
てはもはや行なわなかった。その代りに、下記するヒト
ｃＤＮＡ保存物をスクリーニングした。

【０１２３】実施例９：ネズミおよびヒトのＴＮＦ特異
性ｃＤＮＡクローンの分離 （ａ）ネズミＴＮＦ特異性ｃＤＮＡの分離 プラス／マイナススクリーニングにおいて、上記した選
択５５ｃＤＮＡクローンを釣上げ、かつこれらを個々に
増殖させた。次いで、１晩培養した培養物（５ｍｌのル
リヤブロス、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンにおい
て増殖）からプラスミドＤＮＡを実質的にＨ．Ｃ．バー
ンボイムおよびＪ．ドリー、ヌクレイック・アシド・リ
サーチ、第７巻、第１５１３〜１５２３頁（１９７９）
に実質的に記載されたように分離し、かつ１１群の５種
のクローンをそれぞれその後の研究に使用した。これら
の群のプラスミドから挿入ＤＮＡを、ＰｓｔＩ制限およ
び次いでアガロースゲル電気泳動によって分離した。次
いで、これら１１群のクローンからの挿入物ＤＮＡをニ
トロセルロース膜フィルタ（０．４５μｍ、ミリポア
社）に移して固定した〔これは実質的にＥ．Ｍ．サウザ
ーンにより、ジャーナル・モレキュラー・バイオロジ
ー、第９８巻、第５０３〜５１７頁（１９７５）に記載
されている〕。

【０１２４】次いで、前記したウサギＴＮＦ断片３およ
び４から得られた長い重複試料を使用して、フィルタ結
合したＤＮＡをスクリーニングした（図４および図５参
照）。このハイブリッド化スクリーニングのため、先ず
最初にこれらフィルタを２０％ホルムアミド（混合床樹
脂を用いて脱イオン化したもの）、５×ＳＳＣ、５×デ
ンハルト溶液、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭの燐酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６．５）および２０μｇ／ｍｌのイ
ー・コリＤＮＡ（７分間煮沸して変性させかつＭＳＥソ
ニプレプ１５０型音波処理器により３×１ｍｉｎ、２５
〜３０μにて音波処理したもの）で４２℃にて１晩予備
ハイブリッド化した。次いで、これらフィルタを、４２
℃にて標識試料ＤＮＡ（実施例６参照）（７分間煮沸し
て変性したもの）と２０％のホルムアミド（混合床樹脂
にて脱イオン化したもの）と５×ＳＳＣと５×デンハル
ト溶液と５ｍＭのＥＤＴＡと２５ｍＭの燐酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ６．５）と２０μｇ／ｍｌのイー・コリＤ
ＮＡ（前記と同様に作成）との存在下に４０時間培養し
た。フィルタを２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの存在
下に３５℃にてそれぞれ１時間２回洗浄した後、これら
を光学分析した。

【０１２５】１つの群（群６）は、断片３から得られた
試料を用いて１種のプラスクローンを与えた。したがっ
て、この群の５種の個々の膜を実質的に上記したように
スクリーニングし、かつ両者とも同一の２種のプラスク
ローンを分離した。このクローンをｐ−ｍＴＮＦ−１と
呼ぶ。

【０１２６】次いで、予めニック翻訳によって放射能標
識したｐ−ｍＴＮＦ−１のＲｓａＩ断片によって５５種
のプラス／マイナスクローンの収集物をスクリーニング
し、他の２種の陽性クローン、すなわちｐ−ｍＴＮＦ−
２およびｐ−ｍＴＮＦ−３を選択した。

【０１２７】次いで、これら３種のクローンの全てがポ
リＡ^＋ＲＮＡからＴＮＦ−活性ｍＲＮＡを選別しうるこ
とを確認した。これを行うため、選定したクローンを釣
上げかつこれらを個々に増殖させた。次いで、プラスミ
ドＤＮＡを１晩培養した培養物（４００μｌのルリアブ
ロス、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン）から分離し
た〔これについてはプレイブランク等、「均質溶解およ
びポリエチレン−グリコール沈澱によるイー・コリプラ
スミドＤＮＡ精製方法」、モレキュラー・バイオロジカ
ル・レポート、第９巻、第１９１〜１９５頁（１９８
３）に実質的に記載されている〕。

【０１２８】次いで、約３０μｇの各調製物をＮＡＣＳ
３２プレパックカラム（ＢＲＬ社、ノイ−アイゼンベル
グ、西ドイツ国）にて業者により推奨された条件を用い
て精製し、エタノールでＤＮＡを沈澱させ、これを再溶
解させると共に、ＥｃｏＲＩ（ベーリンガー・マンハイ
ム社、西ドイツ国）で切断し、これをフェノール抽出し
て再沈澱させた。

【０１２９】次いで、この切断されたプラスミドＤＮＡ
を実質的にカファトス等「ドット・ハイブリッド化法に
よる各酸配列同属性および相対的濃度の決定」、ヌクレ
イック・アッシド・リサーチ、第１５４１〜１５５２頁
（１９７９）に実質的に記載されているように膜に結合
させ、ただしこの場合（１）ニトロセルロースフィルタ
の代りに遺伝子スクリーン（ニュー・イングランド・ヌ
クレア社、ボストン、マサチューセッツ州）を使用し；
（２）酢酸アンモニウム濃度を１Ｍから２Ｍまで増大さ
せ、かつ（３）これらフィルタを減圧下で処理せずに、
チャーチおよびギルバードによりプロシーディング・ナ
ショナル・アカデミー・サイエンス・ＵＳＡ、第８１
巻、第１９９１〜１９９５頁（１９８４）に実質的に記
載されているようにＵＶで処理した。

【０１３０】次いで、フィルタ結合したＥｃｏＲＩ切断
プラスミドＤＮＡを、ポリＡ^＋ＲＮＡ（卵母細胞の注射
の後に予め最大ＴＮＦ活性を示した蔗糖濃度勾配フラク
ションからのもの、実施例３参照）とのハイブリッド化
によってスクリーニングした。この結合したＲＮＡをパ
ルネス等、「ネズミβＺマイクロブリンｃＤＮＡクロー
ン：レアｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡクローンのスクリ
ーニング方法」、プロシーディング・ナショナル・アカ
デミー・サイエンス・ＵＳＡ、第７８巻、第２２５３〜
２２５７頁（１９８１）に実質的に記載されているよう
に溶出させ、ただしこの場合（１）ＲＮＡを５μｇのポ
リＡ⁻ＲＮＡ（オリゴｄＴセルロース）の存在下に溶出
させ、かつ（２）フェノール化する代りにＲＮＡを２回
沈澱させた。

【０１３１】回収したＲＮＡを実施例３に記載したと同
様にアフリカ産カエルの卵母細胞中へ注入し、かつ適当
な培養期間の後（同じく実施例３参照）、ＴＮＦ活性に
つき培地を分析した（実施例３参照）。上記ハイブリッ
ド選択を用いて、ｐ−ｍＴＮＦ−１、ｐ−ｍＴＮＦ−２
およびｐ−ｍＴＮＦ−３の挿入物のそれぞれがポリＡ^＋
ＲＮＡからＴＮＦ活性ＲＮＡを選択することを確認し
た。

【０１３２】次いで、制限分析によって３種のネズミＴ
ＮＦクローンを分析した（図６参照）。これらの分析
は、３種のクローンが同じＲＮＡから生じ、したがって
同じ遺伝子から由来することを示した。これらクローン
の詳細な制限マップを図６に示す。これら３種のクロー
ンは、それぞれ約±１５５０、±３５０および±１００
０塩基対のＴＮＦ関連挿入物を有した。

【０１３３】さらに、ｐ−ｍＴＮＦ−１およびｐ−ｍＴ
ＮＦ−３からの複合挿入物における完全ｃＤＮＡ配列を
マキサム−ギルバートの技術〔Ａ．Ｍ．マキサムおよび
Ｗ．ギルバートプロシーディング・ナショナル・アカデ
ミー・サイエンス・ＵＳＡ、第７４巻、第５６０〜５６
４頁（１９７７）〕を用いて決定した。これから得られ
た配列およびアミノ酸配列を図７に示す。

【０１３４】図７を参照して、ここにはクローンｐ−ｍ
ＴＮＦ−１およびｐ−ｍＴＮＦ−３の配列決定から得ら
れた複合ＴＮＦ関連ＤＮＡ配列における１６４４ヌクレ
オチドのヌクレオチド配列が示されている（クローンｐ
−ｍＴＮＦ−１のｃＤＮＡ挿入物は３′非コード化領域
を有しかつＡＴＧ開始コドンまで延在している（図７参
照）。ｐ−ｍＴＮＦ−３のｃＤＮＡ挿入物はネズミプレ
ＴＮＦに対する全コード配列と５′非コード化領域の１
部とを有する（図６参照）。この配列についてはヌクレ
オチド１から１６４４まで番号付けされている。全枠内
（ＡＴＧおよびＴＧＡ）は、推定ネズミプレ−ＴＮＦの
開始および停止コドンを意味する。破線で示した枠（ヌ
クレオチド１６１４−１６１９および１６３０−１６３
５）は、推定のＡＡＵＡＡＡポリアデニル化信号を示し
ている。連続する読み枠が、開始コドン（ＡＴＧ）と停
止コドン（ＴＧＡ）との間に存在する。この読み枠にお
けるコドンによってコードされるアミノ酸は、慣用の１
文字記号を用いてこれらのコドンの下に示されている。
ネズミＴＮＦの推定信号配列（下記するヒトＴＮＦの部
分Ｎ−末端アミノ酸配列と比較して決定）を、これらア
ミノ酸の下に破線で示す。しかしながら、ネズミＴＮＦ
はヒトＴＮＦに比較して成熟蛋白のＮ−末端にまたはそ
の近くに２個のアミノ酸失部を有するので、成熟ネズミ
ＴＮＦの第１Ｎ−末端アミノ酸としてのロイシンの確認
はヒトＴＮＦについてと同様に精製された原ネズミＴＮ
Ｆの蛋白配列決定にしたがうことを了解すべきである。
図７における推定の成熟ＴＮＦ配列は実線で示されてい
る。このアミノ酸配列における実線枠は、グリコシル化
信号（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）と２個のシスティン（Ｃ）残基
とを示し、これらはジスルフィルド結合に関与すると思
われる。

【０１３５】（ｂ）ヒトＴＮＦ−特異性ｃＤＮＡクロー
ンの分離 ヒトＴＮＦ−特異性ｃＤＮＡクローン化を選択するた
め、先ず最初に１群のヒトＴＮＦｃＤＮＡクローン（上
記６０，０００種のｃＤＮＡクローンの保存物からのラ
ンダムに選択したもの）をニトロセルロースフィルタ
（直径０．４５μｍ、ミリポア社）で増殖させかつこれ
らを溶解させると共に、Ｄ．ハナハンおよびＭ．メセル
ソン、ジーン、第１０巻、第６３〜６７頁（１９８０）
に実質的に記載されているようにフィルタへ固定した。
この保存物をネズミＴＮＦｃＤＮＡ（ｐ−ｍＴＮＦ−
１）（この断片は成熟ネズミＴＮＦに対するコード領域
の１部と重複する、図６および図７参照）からのＰｖｕ
ＩＩ−ＰｖｕＩＩ制限断片によってスクリーニングし
た。このＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって
精製し、かつこれをＰ．Ｗ．Ｊ．リグビー等、ジャーナ
ル・モレキュラー・バイオロジー、第１３巻、第２３７
〜２５１頁（１９７７）に実質的に記載されているよう
なニック翻訳によって放射能標識した。このハイブリッ
ド化のため、ネズミＴＮＦ−特異性ｃＤＮＡクローン
（ｐ−ｍＴＮＦ−１）を分離するために使用したと実質
的に同じ条件を使用した。

【０１３６】コロニーに対する比較的大きいバックグラ
ウンドを認めたが、１つのクローンは極めて大きい信号
を発生した。この結果を前記と同様にサウザンハイブリ
ッド化によって確認し、このクローンをｐ−ｈＴＮＦ−
１と名付けた。ゲノムヒトＤＮＡ保存物（上記ウサギゲ
ノム保存物につき実質的に上記したと同様に作成）か
ら、同じＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ試料につき多数の陽性
クローンを選択した。

【０１３７】図８を参照して、ここにはｐ−ｈＴＮＦ−
１の部分制限マップが示されている。ｐ−ｈＴＮＦ−１
におけるＴＮＦ−関連挿入物は長さ約１６５０塩基対で
あり、１６ＳヒトＴＮＦ ｍＲＮＡフラクションから得
られた全ｃＤＮＡ寸法に対応するのに必要な寸法を有す
る。

【０１３８】次に図９を参照して、ここにはｐ−ｈＴＮ
Ｆ−１のｃＤＮＡ挿入物における１６０６個のヌクレオ
チドのヌクレオチド配列が示されている。この配列には
ヌクレオチド１〜１６０６まで番号付けした。実線枠
（ＡＴＧおよびＴＧＡ）は、推定のヒトプレ−ＴＮＦの
開始および停止コドンを示している。連続読み枠が、開
始コドン（ＡＴＧ）と停止コドン（ＴＧＡ）との間に存
在する。この読み枠におけるコドンによってコードされ
るアミノ酸は、慣用の３文字記号によってコドンの下に
示す。ヒトＴＮＦの推定信号配列（誘発Ｕ９３７細胞
（後記）から精製された原ヒトＴＮＦの部分Ｎ−末端ア
ミノ酸配列と比較して決定）を、これらアミノ酸の下に
破線で示す。成熟ヒトＴＮＦについては実線で示す。成
熟ヒトＴＮＦはグリコシル化されていないと思われる。
これは、ヒトＴＮＦコード配列にグリコシル化信号が存
在しないことにより裏付けられる。しかしながら、成熟
ヒトＴＮＦアミノ酸配列には２個のシスティン（Ｃ）が
存在する、これらのシスティンはジスルフィド結合の形
成に関与すると思われる。

【０１３９】実施例１０：ヒト細胞からのＴＮＦの精製 図１０は、ＴＮＦ産生につき誘発されたＵ−９３７細胞
の培地からＴＮＦ様ポリペプチドを精製するための方法
を略図で示している（実施例２参照）。図１０に示した
ように、数種のＵ−９３７誘発培地を６５，０００ｍｌ
が得られるまで−８０℃にて集め、この量はアミノ酸配
列決定および抗体作成につき充分量のヒトＴＮＦを与え
る量であると思われる。この収集した溶液は約３．０×
１０^３ＵＴＮＦ／ｍｌを含有しかつ約２．７×１０^４Ｕ
／ＴＮＦ蛋白ｍｇの比活性を有し、ＴＮＦ活性は前記と
同様に測定した（実施例１参照）。

【０１４０】（ａ）ＴＮＦ含有培地の濃縮 ３７℃の温室で培地を解凍させ、かつ解凍した後直ちに
これを冷室（４℃）に移した。この６５，０００ｍｌの
収集物をペリコンカセット系（ミリポア社、レッドフォ
ード、マサチューセッツ州）により約８０倍濃縮した。
この培地を１００，０００ダルトンの公称分子量範囲
（ｎｍｗｌ）を有するペリコン膜カセットおよび３０，
０００ダルトンのｎｍｗｌを有するペリコン膜カセット
に順次に通過させた。ほとんどのＴＮＦ活性は１００，
０００ダルトンのカセットを通過したが、３０，０００
ダルトンのカセットにより保持された。次いで、透析濾
過によって３０，０００ダルトンの保持培地を２０ｍＭ
のエタノールアミン−ＨＣｌ（ＥＡ−Ｃｌ）（ｐＨ９．
０）緩衝液で置換した。濃縮および透析濾過の後、８１
０ｍｌの溶液は６．０×１０^４Ｕ ＴＮＦ／ｍｌを含有
しかつ約６．８×１０^４Ｕ ＴＮＦ／蛋白ｍｇの比活性
を有した。

【０１４１】（ｂ）イオン交換クロマトグラフィー 濃縮培地のヒトＴＮＦ活性をその他多くの蛋白から分離
し、その際陰イオン交換カラムに対するＴＮＦの結合親
和性を利用した。多くの陰イオン交換クロマトグラフ装
置が当業者に周知されているが、調製用モノ−Ｑカラム
（直径１ｃｍ×１１ｃｍ、ファルマシア社、ウプサラ、
スウェーデン国）を選択した。この寸法のカラムは約２
００ｍｇの蛋白の負荷容量を有する。このカラムを２０
ｍＭのＥＡ−Ｃｌ（ｐＨ９．０）で平衡化させた後、２
００ｍｌの濃縮物を２ｍｌ／ｍｉｎの流速で加えた。次
いで、１０ｍＭ ＥＡ−Ｃｌ（ｐＨ９．０）において０
〜０．４ＭのＮａＣｌの範囲の直線濃度勾配を用いて結
合蛋白を分画した。溶出したＴＮＦ活性はフラクション
２４近傍にピークを有し、これを約０．１６ＭのＮａＣ
ｌの塩濃度で溶出させた。この装填と濃度勾配とを３回
反復して、ＴＮＦ活性を有するフラクションを集めた。
これらの集めたフラクションは３．６×１０^６Ｕ ＴＮ
Ｆ／ｍｌを含有しかつ１．１×１０^６Ｕ ＴＮＦ／蛋白
ｍｇの比活性を有した（図１０参照）。

【０１４２】各試験に使用した蛋白の量はモノ−Ｑカラ
ムの装填範囲に丁度一致したので、分離は最適ではな
い。したがって、最初のモノ−ＱカラムからのＴＮＦ含
有収集物の他のモノ−Ｑカラムに通過させることに決定
した。先ず最初に収集物を２×１０００ｍｌのＥＡ−Ｃ
ｌ（ｐＨ９．０）に対し４℃にて１晩透析した。次い
で、このカラムを同じ緩衝液で平衡化させた後、カラム
上の収集物を２０ｍＭ ＥＡ−Ｃｌ（ｐＨ９．０）にお
ける０〜０．２ＭのＮａＣｌの直線的塩濃度勾配で溶出
させることにより分画した。得られた溶液は１．１×１
０^７Ｕ ＴＮＦ／ｍｌを含有しかつ２．３×１０^６Ｕ
ＴＮＦ／蛋白ｍｇの比活性を有した（図１０参照）。

【０１４３】（ｃ）ゲル濾過 次いで、分子量の差を利用して前記溶液を分画した。多
数の適当なゲル濾過系が当業者に周知されているが、５
００〜６０，０００ダルトンの蛋白の分画範囲を有する
ＴＳＫ−Ｇ２０００ＳＷＧカラム（ＬＫＢ社、ブロマ、
スウェーデン国）を選択した。モノ−Ｑ収集物を５０ｍ
Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）における２×１００
０ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌに対し４℃にて１晩透析し、か
つ透析物の容積をスピード・バック濃縮装置（サバント
社、ヒックスビル、ニューヨーク）を用いて急速蒸発に
より０．８５ｍｌまで濃縮した。ゲル濾過カラムを５０
ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）における１Ｍ Ｎ
ａＣｌで平衡化させた後、収集物をこのカラムに１ｍｌ
／ｍｉｎの流速で通過させた。約４０，０００ダルトン
の蛋白が溶出した領域にＴＮＦ活性を検出した。この分
画の後、ＴＮＦ含有溶液は３．４×１０Ｕ ＴＮＦ／ｍ
ｌを含有しかつ約１．１×１０^７Ｕ ＴＮＦ／蛋白ｍｇ
の比活性を有した（図１０参照）。この精製は、Ｕ−９
３７細胞培地からほぼ４００倍にＴＮＦ精製したことに
相当する。

【０１４４】この分画した収集物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（１２％）で分析した。約１７，０００ダルトンの分子
量に相当する位置に主たるバンドが観察された。さら
に、約１８，０００ダルトンの分子量には、ゆっくり移
動する弱いバンドが観察された。これらのことは、原ヒ
トＴＮＦが２種の蛋白単位で構成されていることを強く
示唆している。

【０１４５】この精製されたヒトＴＮＦを用いて、部分
Ｎ−末端アミノ酸配列を決定した。この配列を図１１に
示す。上記の付加或いはアミノ酸の欠失として示した配
列の変化を、ＤＮＡ配列から得た。この配列を用いて、
ヒトＴＮＦクローン（上記）が有する推定信号配列およ
び成熟コード配列を決定した。

【０１４６】実施例１１：イー・コリにおけるヒトＴＮ
Ｆ様ポリペプチドの発現 図１２を参照して、λＰ_Ｌに基づく発現制御配列を用い
ることにより、本発明のＴＮＦ様ポリペプチドを産生さ
せるための組換ＤＮＡ分子を作成した（図１２参照）。
この作成のため、先ずヒトＴＮＦをコードするＤＮＡ配
列５７８塩基対ＡｖａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を作成し
かつ精製した。この断片は、成熟配列（図１２）のアミ
ノ酸８から出発してヒトＴＮＦをコードする（アミノ酸
８（Ｐｒｏ）に対するコドンはＡｖａ−Ｉ−制限部位の
５′末端に位置する）。このＴＮＦ ＤＮＡ断片はλｇ
ｔ１０ｃＤＮＡ保存物（上記）におけるｃＤＮＡクロー
ンから分離したが、同じ断片をｐ−ｈＴＮＦ−１からＡ
ｖａＩおよびＥｃｏＲＩを用いて分離することもできる
であろう（実施例９（ｂ）参照）。

【０１４７】次いで、欠失ＴＮＦアミノ酸をコードする
ＣｌａＩ−ＡｖａＩ合成リンカを作成した（図１２参
照）。この断片は５７８塩基対のＡｖａＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩＴＮＦ断片に相補的な重複ＡｖａＩの５′末端を有
した。さらに、ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ−ＩＦＮ−γと称
するプラスミドの大きい方のＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
断片を作成しかつ精製した（図１２参照）。

【０１４８】これら３種のＤＮＡ断片を結合させた後、
得られたｐＢＲ３２２−ｔｒｐ−ｈＴＮＦ組換発現ベク
ターによってイー・コリＣ６００菌株を形質転換させた
（図１２）。次いで、形質転換宿主を燐酸塩緩衝された
栄養培地（グリセリン、酵母抽出物、カザミノ酸）にお
いて振とうフラスコ中で３７℃にて１晩発酵させた。発
酵後、菌体をＳＤＳ−尿素緩衝液中で溶菌させ、かつ菌
体産生された蛋白をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法によって分析した。このゲルにはｈＴＮＦ活性
に対応するバンドが観察された。この活性は全イー・コ
リ産生蛋白の約１０％に相当した。

【０１４９】次いで、ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ−ｈＴＮＦ
におけるｔｒｐ配列の代りにｐＬ−Ｔ４発現制御配列を
使用し、ｐＢＲ３２２−ｐＬ−Ｔ４−ＨＩＬ−２と名付
けたプラスミドの小さい方のＰｓｔＩ−ＣｌａＩ制限断
片（１２００塩基対）を分離しかつ精製した（図１２参
照）。図１２に示したように、この断片はアンピシリン
耐性をコードする遺伝子の１部と完全ｐＬ−Ｔ４制御配
列とを有する。同時に、ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ−ｈＴＮ
ＦをＰｓｔＩおよびＣｌａＩで制限すると共に、ｈＴＮ
Ｆコード配列を有する大きい方の断片を分離しかつ精製
した。次いでこれら２種の断片を合してｐＢＲ３２２−
ｐＬ−Ｔ４−ｈＴＮＦを作成した（図１２）。

【０１５０】発現につき分析するため、イー・コリＣ６
００菌株をλ ｃｔｓ Ｋａｎ^Ｒの低コピー数プラスミ
ドを有するｐＢＲ３２２−ｐＬ−Ｔ４−ｈＴＮＦで形質
転換させた。発酵（１．５ｌ、２８℃、２４時間、次い
で４２℃、５時間）の後、これは全イー・コリ蛋白の約
３０％のＴＮＦ活性を生じた。

【０１５１】ｐＬ−Ｔ４系において、ＴＮＦ様ポリペプ
チドの高発現が観察されたが、この生成物は原アルギニ
ンの代りにヒスチジンを第２アミノ酸として有する変異
ＴＮＦであった。変異ＴＮＦを生ずる単一の塩基対突然
変異がどうして生じたかは明らかでない。しかしなが
ら、原ＴＮＦ（ｓｒｇ）配列に対する部位特異性変異
（単一塩基の変異）の後、この手順ではもはやＴＮＦ発
現が観察されなかった、恐らく、ＲＮＡの二次構造にお
ける何らかの形態がこの現象に関与するものと思われ
る。

【０１５２】したがって、幾つかの新たな作成を行なっ
た。図１３を参照して、ｐＡＴ−１５３欠失（ｒｏ
ｐ⁻）を有するプラスミド１５３−ｐＬ−Ｔ４−ｈＴＮ
Ｆ−ＣＡ３（１３）を作成した。このプラスミドは、発
現に際し正確なアミノ酸配列（すなわち、Ｈｉｓでなく
Ａｒｇ）をコードするＣｌａＩ−ＡｖａＩ（「ＣＡ」）
合成リンカーを有する（図１３参照）。これは、上記の
ようにλｃｔｓリプレッサ遺伝子と共に、またはそれな
しに存在する。

【０１５３】図１３に示したように、ｐＢＲ３２２のヌ
クレオチド０位置にはＥＣＣＲ１部位が欠失している。
このプラスミドは、形質転換宿主イー・コリＷ３１１０
においてＴＮＦの高収量を示した（表２参照）。しかし
ながら、発酵の結果は、この作成物が貯蔵条件下にて不
安定であることを示した。

【０１５４】

【表２】

【０１５５】さらに、プラスミド１５３−ｐＬ−Ｔ４−
ｈＴＮＦ−ＣＡ３−ｃｔｓ−Ｔ４−ｔｅｒ〔ＤＳＭ３４
６０〕を作成し、これはλｃｔｓレプレッサ遺伝子を有
した。このプラスミドを作成するため、３′非コード領
域を欠失させ、かつＨｉｎｄＩＩＩ位置に合成Ｔ４末端
を加えた。このプラスミドは高発現を示したが、Ｔ４末
端の結果として１５３−ｐＬ−Ｔ４−ｈＴＮＦ−ＣＡ３
（１３）よりも安定性が大きかった（図１７参照）。こ
のプラスミドは２８℃で増殖させねばならず、培地の添
加後に４２℃にて熱誘発させねばならない。

【０１５６】好適具体例おいて、１５３−Ｔ４−ｈＴＮ
Ｆ−ＣＡ５−Ｔ４ｔｅｒ〔ＤＳＭ３４６１〕を作成し、
これは欠失したｐＬ部分を有し、発現ベクターのＴ４部
分のみを残す（図１４、図１５および図１６参照）。欠
失の結果、アンピシリンに対する抗生物質耐性を示す配
列の部分が喪失した。したがって、遺伝子の末端にテト
ラサイクリン耐性を示す抗生物質耐性の標識を加えた
後、ｐＬ配列を除去した。より好適なプラスミドはＣ５
合成リンカーを有する。このリンカーは、原ＴＮＦの最
初の７個のアミノ酸（ＡｖａＩ部位まで）をコードとす
ると共に、次の配列を有する：

【化７】

【０１５７】さらに、Ｔ４末端は発現レベルに対する作
用をも有する。この結果、宿主菌株ＷＡ８０２において
２５％以上のＴＮＦを産生する高発現ベクターが得られ
た（表３参照）。

【０１５８】

【表３】

【０１５９】上記した方式を用いて他のＴＮＦを作成す
ることができる。たとえば、成熟ＴＮＦの最初の２個の
アミノ酸−ｖａｌ−ａｒｇ−を欠失し、かつイー・コリ
で発現させた場合には−ｍｅｔ−ｓｅｒ−から出発する
ｈＴＮＦ誘導体を作成した。この誘導体をｐＢＲ３２２
−ｐＬ−Ｔ４ Δ２ ｈＴＮＦと呼ぶ。その構造は、そ
の他の点については上記ｐＢＲ３２２−ｐＬ−Ｔ４−ｈ
ＴＮＦと同じである（図１２）。

【０１６０】ｐＢＲ３２２−ｐＬ−Ｔ４ Δ２ ｈＴＮ
Ｆを作成するため、合成リンカー断片：

【化８】

【０１６１】を作成した。この断片をｐＢＲ３２２−ｐ
Ｌ−Ｔ４ ｈＴＮＦから得られた大きい方のＣｌａＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩ断片（図１２）上記したように５７８ｂ
ｐのＡｖａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の存在下で結合させ
た。

【０１６２】上記の作成物ｐＢＲ３２２−ｐＬ−Ｔ４−
ｈＴＮＦ、１５３−ｐＬ−Ｔ４−ｈＴＮＦ−ＣＡ３（１
３）、１５３−ｐＬ−Ｔ４−ｈＴＮＦ−ＣＡ３−ＣＴＳ
−Ｔ４ｔｅｒおよび１５３−Ｔ４−ｈＴＮＦ ＣＡ５−
Ｔ４ｔｅｒは全て、成熟ヒトＴＮＦを開始させる最初の
バリンコドンに直接融合したＡＴＧ開始コドンを有する
（図１２、図１６および図１７参照）。ｐＢＲ３２２−
ｐＬ−Ｔ４−Δ２−ｈＴＮＦは、Δ２−ＴＮＦの最初の
セリンコドンに融合したＡＴＧコドンを有する。したが
って、これらの作成物により産生される精製物は恐らく
Ｍｅｔ−成熟ｈＴＮＦ（或いはｐＢＲ３２２−ｐＬ−Ｔ
４−Δ２−ｈＴＮＦの場合にはＭｅｔ−Δ２−ｈＴＮ
Ｆ）あると思われる。しかしながらＮ末端−メチオニン
はイー・コリによってその増殖または産生に際し切断さ
れ、或いは所望ならば必要に応じ入手可能な酵素および
切断技術を用いて産生蛋白からその後に切断することも
できる。

【０１６３】勿論、他のＴＮＦ産生宿主も本発明の方法
に使用しうることが了解されよう。たとえば、前記した
発現ベクターおよび原核宿主のいずれも本発明の範囲内
で使用することができる。さらに、本発明のＴＮＦ様ポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列を改変して、その発
現もしくは生産物の精製特性を向上させることもでき
る。たとえば、化学的もしくは酵素的に作成したオリゴ
ヌクレオチドをＴＮＦ様ポリペプチドの開始コドンの前
に挿入したり、或いはこれを使用して、このポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列のＮ末端にてコドンを置換す
ることもできる。この手順により、一層好適な一次およ
び高次の構造のｍＲＮＡを得ることもできる。より詳細
には、開始ＡＵＧコドンがヘアピンの頂部或いは他の一
本鎖領域のいずれかに容易にアクセスしうる位置（すな
わち二次構造によって遮蔽されていない）に生ずるよう
に配列を設計することもできる。さらに、シャイン−ダ
ルガルノ断片の位置および配列も同様に最適化させるこ
とができる。この種の構造改変の重要性は、たとえば
Ｄ．イセレンタントおよびＷ．ファイエルス、「ｍＲＮ
Ａの二次構造および翻訳開始の効率」、ジーン、第９
巻、第１〜１２頁（１９７９）に記載されている。

【０１６４】本発明によるＴＮＦ様ポリペプチドの細胞
生産における向上は、さらに細胞内で使用しうる遺伝子
の個数を増大させて、たとえば高コピープラスミドを用
いて達成することができる〔たとえば、Ｂ．ウーリン
等、「クローン化遺伝子の増殖に対する温度依存性コピ
ー数を有するプラスミドおよびその生産物」、ジーン、
第６巻、第９１〜１０６頁（１９７９）〕。

【０１６５】したがって、本発明の各種のＴＮＦ関連Ｄ
ＮＡ配列を上記ベクターから除去して他のベクターおよ
び宿主に挿入し、これらによりコードされる生産物の最
終的産生を向上させうることが了解されよう。

【０１６６】さらに、本発明によるＴＮＦ様ポリペプチ
ドは融合蛋白（たとえば原核もしくは組合せＮ末端断片
に結合して分泌を指示すると共に、安定性を向上させか
つ精製を改善し、或いはＮ末端メチオニンもしくは他の
Ｎ末端断片の切断をも向上させる）の形態、或いはプレ
−ＴＮＦ（たとえば哺乳類ＴＮＦのプレ配列またはその
他の原核信号配列の１部または全部から出発する）の形
態、或いは成熟ＴＮＦ様ポリペプチドの形態、或いはｆ
−ｍｅｔ−ＴＮＦ−様ポリペプチドの形態の産生物を全
て包含しうることを了解すべきである。

【０１６７】本発明の方法により産生したＴＮＦ様ポリ
ペプチドの特に有用な１形態、或いは少なくともその先
駆体は、容易に切断されるアミノ酸或いはそのＮ末端に
結合した一連のアミノ酸を有する成熟ＴＮＦである。こ
の構造は適当な原核宿主における蛋白の合成を可能に
し、この場合成熟ＴＮＦに存在しない開始信号が必要と
され、次いで、過剰のアミノ酸をインビボもしくはイン
ビトロで切断して成熟ＴＮＦを産生させる。この種の方
法はたとえば米国特許第４，３３２，８９２号、第４，
３３８，３９７号、第４，３６６，３４６号および第
４，４２５，４３７号に見られる。さらに、本発明の方
法により産生したＴＮＦポリペプチドは、上記ＤＮＡ配
列のコドンの幾つかまたは全部につき異なるコドンを特
徴とするＤＮＡ配列によって発現に際しコードされるＴ
ＮＦ様ポリペプチドをも包含する。これらの置換コドン
は、これら置換コドンによりコードされるものと同一の
アミノ酸をコードすることができる。或いは、１種もし
くはそれ以上のアミノ酸変化をもたらす、或いはより長
いまたは短いＴＮＦ様ポリペプチドをもたらして産生化
合物の性質を有益に変化させうる（たとえば、安定性の
向上、溶解性の向上、治療活性の向上または半減期の増
大）をもたらすようなコドン１種もしくは組合せを置換
し、或いは欠失させることも本発明の方法により成し得
る。

【０１６８】実施例１２：インビボにおけるＴＮＦとア
クチノマイシンＤとの組合物の活性 γ−ｈＴＮＦと臨床上許容しうる投与量のアクチノマイ
シンＤとの組合せがインビボにおける腫瘍の増殖速度に
対する作用を示した。１群当り８種からなる３群の裸ネ
ズミに５×１０^６ＪＡＭＡ（卵巣癌）細胞／ネズミ１匹
を皮下注射し、かつ腫瘍を７日間増殖させた。第１群に
は１×１０^５Ｕのγ−ｈＴＮＦのみを毎日病巣内
（「ｉ．１」）接種し、第２群には同じ１日当り投与量
のγ−ｈＴＮＦを０．３μｇのアクチノマイシンＤと組
合せて接種し（「ｉ．１」にて）、第３群には同じ１日
投与量のγ−ｈＴＮＦ（ｉ．１）を０．３μｇのアクチ
ノマイシンＤと組合せて腹腔内（「ｉ．ｐ」）注射し
た。８匹のネズミよりなる比較群には処理を施さなかっ
た（群ＩＶ）。最後に、６匹のネズミよりなる群には
（群Ｖ）には０．３μｇの１日投与量のアクチノマイシ
ンＤをネズミ１匹当りに接種し、３匹のネズミには病巣
内注射し、残り３匹のネズミには腹腔内注射した。

【０１６９】毎日の注射を３週間続けた。各腫瘍を処理
前に毎日測定した。図１８および図１９に示すように、
第ＩＩ群には顕著な腫瘍増殖抑制および腫瘍の減退さえ
観察され、この群はＴＮＦとアクチノマイシンＤとによ
り病巣内注射で処理したものである。他の全ての群は、
比較群により示されると同様な腫瘍増殖を示した。

【０１７０】本発明に使用した微生物および組換ＤＮＡ
分子はドイツチェ・ザンムルング・ホン・ミクロオルガ
ニスメン・ゲッチンゲン、西ドイツ国に１９８４年１２
月１７日付けで（ＡおよびＢ）ならびに１９８４年１２
月２７日付け（Ｃ）で寄託した培養物で例示され、かつ
下記ＴＮＦ−Ａ〜Ｃとして同定された： Ａ．イー・コリＤＨＩ（λ）（ｐ−ｍＴＮＦ−３） Ｂ．イー・コリＤＨＩ（λ）（ｐ−ｈＴＮＦ−１） Ｃ．イー・コリＣ６００（ｐＢＲ３２２−ｐＬ−Ｔ４−
ｈＴＮＦ）。

【０１７１】これらの培養物にはそれぞれ受託番号ＤＳ
Ｍ３１５９、３１６０および３１７５が付与された。

【０１７２】さらに、下記の微生物および組換ＤＮＡ分
子をドイツチェ・ザンムルング・ホン・ミクロオルガニ
スメンに１９８５年８月２９日付けで寄託した。

【０１７３】Ｄ．イー・コリＷ３１１０（１５３−ｐＬ
−Ｔ４−ｈＴＮＦ−ＣＡ３−ｃｔｓ−Ｔ４−ｔｅｒ） Ｅ．イー・コリＷ３１１０（１５３−Ｔ４−ｈＴＮＦ−
ＣＡ５−Ｔ４−ｔｅｒ）。

【０１７４】これらの寄託物には次の受託番号がそれぞ
れ付与された：ＤＳＭ３４６０および３４６１。

【０１７５】以上、本発明を好適具体例を特に参照して
説明したが、本発明の思想および範囲を逸脱することな
く多くの改変をなしうることが当業者には明らかであろ
う。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト（Ａ）およびネズミ（ｂ）ｍＲＮＡ調整物
の２種の代表的な蔗糖濃度勾配のＯＤ−経過を示す特性
曲線図である（第１の濃度勾配においては７５０μｇの
ヒトポリＡ^＋ｍＲＮＡを充填しかつ第２の濃度勾配にお
いては２００μｇのネズミポリＡ^＋ＲＮＡを充填しアフ
リカ産カエル（Xenopus laevis) 卵母細胞におけるフラ
クションの生物学的活性を分析）。

【図２】誘発したウサギ血清からのＴＮＦ様ポリペプチ
ドを精製するための工程略図である。

【図３】本発明の生成方法の１例による誘発ウサギ血清
から生成されたウサギＴＮＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２
％）分析を示す説明図である。

【図４】本発明の方法により生成されたウサギＴＮＦの
２つの部分、すなわち精製したうさぎＴＮＦのＴＮＦ断
片３および４のアミノ酸配列を示すと共に、これらアミ
ノ酸配列部分をコードする各種のヌクレオチド配列並び
にこれらＤＮＡ配列から合成された各種のＤＮＡプロー
ブのヌクレオチド配列を示す説明図である。

【図５】本発明の方法により生成されたウサギＴＮＦの
２つの部分、すなわち精製したうさぎＴＮＦのＴＮＦ断
片３および４のアミノ酸配列を示すと共に、これらアミ
ノ酸配列部分をコードする各種のヌクレオチド配列並び
にこれらＤＮＡ配列から合成された各種のＤＮＡプロー
ブのヌクレオチド配列を示す説明図である。

【図６】ネズミＴＮＦ ＲＮＡの一般式構造並びにクロ
ーンｐ−ｍＴＮＦ−１、ｐ−ｍＴＮＦ−２およびｐ−ｍ
ＴＮＦ−３のｃＤＮＡの位置を示し、さらに図６はこれ
ら３種のクローンの部分制限マップを示し、また図６は
各種のＤＮＡ保存物を後にハイブリッド化スクリーニン
グするために使用したｐ−ｍＴＮＦ−１の２種の内部Ｒ
ｓａＩおよびＰｖｕＩＩ制限断片を示す説明図である。

【図７】ネズミＴＮＦ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列お
よびこれから誘導されたアミノ酸配列を示す説明図であ
る。

【図８】ヒトＴＮＦ ＲＮＡの一般的構造およびクロー
ンｐ−ｈＴＮＦ−１のｃＤＮＡの位置を示し、さらに本
図はこのクローンの部分制限マップを示す説明図であ
る。

【図９】ｐ−ｈＴＮＦ−１のｃＤＮＡ挿入物のヌクレオ
チド配列およびこれから誘導されたアミノ酸を示す説明
図である。

【図１０】誘発Ｕ−９３７ヒト細胞の培地から得られた
ＴＮＦ様ポリペプチドを精製するための略図である。

【図１１】精製したヒトＴＮＦ試料のアミノ酸配列決定
で決定されたＮ−末端アミノ酸配列を示す説明図であ
る。

【図１２】発現に際しヒトＴＮＦをコードするＤＮＡ配
列を特徴とする他の組換発現ベクターの作成方法の他の
例を示す略図である。

【図１３】ヒトＴＮＦを発現に際しコードするＤＮＡ配
列を特徴とする組換発現ベクター１５３−ＰＬ−Ｔ４−
ｈＴＮＦ−ＣＡ３（１３）を示す説明図である。

【図１４】ヒトＴＮＦを発現に際しコードするＤＮＡ配
列を特徴とする組換発現ベクター１５３−Ｔ４−ｈＴＮ
Ｆ−ＣＡ５−Ｔ４ｔｅｒを示す説明図である。

【図１５】（Ａ）プラスミドｐ２３６およびｐＴＡＫ２
１Δ〔Ｋ．ゴルスキー等、セル（１９８５）（印刷
中）〕からのプラスミドｐＬ−ｐＴＡＫ−２１Δ−ＣＬ
Ａ^＋の作成；（Ｂ）ｈＴＮＦ（Ｇ）ｎ誘導体の作成、並
びに（Ｃ）Ｔ４−ｔｅｒおよびΔＰＬ誘導体の作成を示
す説明図である。

【図１６】ＤＲＡＩ ＡＡＴＴＣ ＥｃｏＲＩ部位から
Ｔ４−ｔｅｒ ｈＴＮＦ遺伝子の末端に位置するＥｃｏ
ＲＩ部位に至るプラスミド１５３−Ｔ４−ｈＴＮＦ−Ｃ
Ａ５−Ｔ４−ｔｅｒのＤＮＡ配列および誘導アミノ酸配
列を示す説明図である。

【図１７】ＰｓｔＩ部位からＥｃｏＲＩ部位に至るプラ
スミド１５３−ｐＬ−Ｔ４−ＣＡ３−ｃｔｓ−Ｔ４−ｔ
ｅｒのＤＮＡ配列および誘導アミノ酸配列を示す説明図
である。

【図１８】アクチノマイシンＤとＴＮＦとの組合せの腫
瘍増殖に対する作用を示すグラフである。

【図１９】アクチノマイシンＤとＴＮＦとの組合せの腫
瘍増殖に対する作用を示すグラフである。

フロントページの続き (72)発明者 タベルニア，ジャン ホノール レオ ベルギー国、ビー−9000 ゲント、コニ ンジン アストリド ラーン 201 (72)発明者 マルメナウト，アニー ルイス マリー ベルギー国、8370 ブランケンベルク、 グローテ マルクト 22 バス ６ (72)発明者 バン デル ヘイデン，ジョゼ ベルギー国、9124 ミュンテ、ジンク 197 (72)発明者 アレット，ベルナール スイス国、1213 オネックス、リュー ド ボゾン 20 (72)発明者 カワシマ，エリック エイチ. スイス国、1207 ジュネーブ、リュー エルンスト ブロッチ 31

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １５３−ｐＬ−Ｔ４−ｈＴＮＦ−ＣＡ３
   −ｃｔｓ−Ｔ４−ｔｅｒ（ＤＳＭ ３４６０） 【化１】 【化２】 および１５３−Ｔ４−ｈＴＮＦ−ＣＡ５−Ｔ４−ｔｅｒ
   （ＤＳＭ ３４６１） 【化３】 よりなる群から選択され、リンカー断片 【化４】 を５７８ｂｐ断片 【化５】 の存在下でｐＢＲ３２２−ｐＬ−Ｔ４−ｈＴＮＦ（ＤＳ
   Ｍ ３１７５）から得られた主要ＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩ
   ＩＩ断片と連結することにより構成可能である組換ＤＮ
   Ａ分子により形質転換された原核宿主を培養し、ＴＮＦ
   を収集する工程からなる腫瘍壊死因子の産生を増加する
   方法。
2. 【請求項２】 宿主が、イー・コリ、バチルスおよびス
   トレプトミセスの菌株から選択される請求項１記載の方
   法。
3. 【請求項３】 形質転換された宿主が、イー・コリ Ｗ
   ３１１０（１５３−ｐＬ−Ｔ４−ｈＴＮＦ−ＣＡ３−ｃ
   ｔｓ−Ｔ４−ｔｅｒ）（ＤＳＭ３４６０）、イー・コリ
   Ｗ３１１０（１５３−Ｔ４−ｈＴＮＦ−ＣＡ５−Ｔ４
   −ｔｅｒ）（ＤＳＭ３４６１）、およびイー・コリ Ｗ
   Ａ８０２（１５３−Ｔ４−ｈＴＮＦ−ＣＡ５−Ｔ４−ｔ
   ｅｒ）よりなる群から選択される請求項１または２記載
   の方法。