JP2025503707A - ガレクチン－１０抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、タンパク質のガレクチン-10、特に、ヒトガレクチン-10に結合する抗体及びその抗原結合断片に関する。本発明のガレクチン-10抗体及び抗原結合断片は、ガレクチン-10の結晶化を中断させ、それゆえ、その病理がシャルコー・ライデン結晶(CLC)の形成/存在に関連している疾患及び疾病を予防及び治療する方法において有用である。
【選択図】図１
【選択図】図１
Description
(発明の分野)
本発明は、タンパク質のガレクチン-10、特に、ヒトガレクチン-10に結合する抗体及びその抗原結合断片に関する。本発明のガレクチン-10抗体及び抗原結合断片は、ガレクチン-10の結晶化を中断させ、それゆえ、その病理がシャルコー・ライデン結晶(CLC)の形成/存在に関連している疾患及び疾病を予防及び治療する方法において有用である。
本発明は、タンパク質のガレクチン-10、特に、ヒトガレクチン-10に結合する抗体及びその抗原結合断片に関する。本発明のガレクチン-10抗体及び抗原結合断片は、ガレクチン-10の結晶化を中断させ、それゆえ、その病理がシャルコー・ライデン結晶(CLC)の形成/存在に関連している疾患及び疾病を予防及び治療する方法において有用である。
(発明の背景)
シャルコー・ライデン結晶(CLC)は、1853年に最初に記載されたものであり、アレルギー性喘息及び寄生虫感染症を含む特定の疾病を有する患者に見られる微細な無色の結晶である。CLCは、多くの場合、好酸球性炎症応答と関連するヒト組織及び分泌物で観察される。喘息及び寄生虫感染症に加えて、これらの結晶は、癌、例えば、骨髄性白血病を有する患者に見られる。構造上、CLCは、20～40μmの長さ及び2～4μmの幅を有する細胞外六角両錐型結晶として蓄積する。これらの結晶を形成するタンパク質は、ガレクチン-10として同定されている。
シャルコー・ライデン結晶(CLC)は、1853年に最初に記載されたものであり、アレルギー性喘息及び寄生虫感染症を含む特定の疾病を有する患者に見られる微細な無色の結晶である。CLCは、多くの場合、好酸球性炎症応答と関連するヒト組織及び分泌物で観察される。喘息及び寄生虫感染症に加えて、これらの結晶は、癌、例えば、骨髄性白血病を有する患者に見られる。構造上、CLCは、20～40μmの長さ及び2～4μmの幅を有する細胞外六角両錐型結晶として蓄積する。これらの結晶を形成するタンパク質は、ガレクチン-10として同定されている。
ガレクチン-10(別名、シャルコー・ライデン結晶タンパク質)は、骨髄で、主に、好酸球によって大量に発現される小型(16.5kDa)の自己結晶化する疎水性グリカン-結合タンパク質である(Chuaらの文献(2012) PLoS One. 7(8): e42549)。ガレクチン-10は、比較的程度は低いが、好塩基球及びFoxp3陽性Tregによっても産生される(Kubachらの文献(2007) Blood 110(5): 1550-8)。このタンパク質は、最も豊富にある好酸球成分のうちの1つであり、全細胞タンパク質の7％～10％に相当する。ガレクチン-10は、ヒト及び非ヒト霊長類にしか見られず、これは、分泌ペプチドシグナル及び膜貫通ドメインを欠き、かつ特定の条件下で、非古典的かつ新規のアポクリン機構によって分泌される。
好酸球性障害を有する患者由来の組織におけるCLCの出現を示す多くの報告にもかかわらず、一般的な見方は、これらの結晶が好酸球消滅のマーカーにすぎないというものであった。この見方は、結局のところ、CLCがハウスダストマイト(HDM)誘発性喘息のマウスモデルで2型免疫を強化することを示した研究によって異議を唱えられた(Perssonらの文献、Science(2019))。さらに、CLCは、アスペルギルス症及びCRSwNPを有する患者の粘着性粘液に多く存在することが観察されており、これにより、CLCが粘液の粘弾性に寄与することが示唆されている(Su J.らの文献、Molecules(2018))。
(発明の概要)
ガレクチン-10及びCLC形成が疾患に関与しているという最近の知見は、それが治療薬の標的であることを示している。本明細書では、ガレクチン-10結晶をガレクチン-10抗体の投与によって溶解させることができることが報告されている。重要なことは、本明細書で報告されるガレクチン-10抗体は、37℃などの高温で4週間保存しても活性を保持し、かつ安定であり続けることである。まとめると、これは、本明細書で報告されるガレクチン-10抗体を用いて、その病理がCLCの存在に関連している疾病及び障害を治療することができることを示している。
ガレクチン-10及びCLC形成が疾患に関与しているという最近の知見は、それが治療薬の標的であることを示している。本明細書では、ガレクチン-10結晶をガレクチン-10抗体の投与によって溶解させることができることが報告されている。重要なことは、本明細書で報告されるガレクチン-10抗体は、37℃などの高温で4週間保存しても活性を保持し、かつ安定であり続けることである。まとめると、これは、本明細書で報告されるガレクチン-10抗体を用いて、その病理がCLCの存在に関連している疾病及び障害を治療することができることを示している。
第一の態様において、本発明は、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片であって、該抗体又は抗原結合断片が可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインが配列番号2を含む又は配列番号2からなるHCDR3;配列番号3を含む又は配列番号3からなるHCDR2;配列番号1を含む又は配列番号1からなるHCDR1のCDR配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインが配列番号8を含む又は配列番号8からなるLCDR3;配列番号9を含む又は配列番号9からなるLCDR2;配列番号7を含む又は配列番号7からなるLCDR1のCDR配列を含む、
抗体又は抗原結合断片を提供する。
(i)該VHドメインが配列番号2を含む又は配列番号2からなるHCDR3;配列番号3を含む又は配列番号3からなるHCDR2;配列番号1を含む又は配列番号1からなるHCDR1のCDR配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインが配列番号8を含む又は配列番号8からなるLCDR3;配列番号9を含む又は配列番号9からなるLCDR2;配列番号7を含む又は配列番号7からなるLCDR1のCDR配列を含む、
抗体又は抗原結合断片を提供する。
ある実施態様において、VHドメインは、配列番号4のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつVLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、VHドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含み;かつVLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗原結合断片は、単鎖抗体(scFv); F(ab')2断片; Fab断片; Fd断片; Fv断片;単腕(一価)抗体;ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、又はそのような抗原結合断片の組合せ、会合、もしくはコンジュゲーションによって形成される任意の抗原結合分子:からなる群から選択される。好ましい実施態様において、抗原結合断片は、Fab断片である。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載される抗体及び抗原結合断片のVH及び/又はVLドメインをコードするポリヌクレオチドを含む、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチド(単数)又はポリヌクレオチド(複数)を提供する。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、該抗体、抗原結合断片、可変重鎖ドメイン、又は可変軽鎖ドメインの宿主細胞又は無細胞発現系における発現を可能にする調節配列に機能的に連結された本明細書に記載されるポリヌクレオチド(単数)又はポリヌクレオチド(複数)を含む発現ベクターである。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載される発現ベクターを含有する宿主細胞又は無細胞発現系を提供する。
また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される組換え抗体又は抗原結合断片を産生する方法であって、本明細書に記載される宿主細胞又は無細胞発現系を該抗体又は抗原結合断片の発現を可能にする条件下で培養すること及び発現された抗体又は抗原結合断片を回収することを含む、方法である。
本発明の別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片、及び少なくとも1つの医薬として許容し得る担体又は賦形剤を含む医薬組成物である。
本明細書に記載される抗体もしくは抗原結合断片、又は本明細書に記載される医薬組成物は、さらなる態様において、医薬として使用するためのものである。さらなる態様において、それを必要としている対象を治療する方法であって、該対象に、本明細書に記載される抗体もしくは抗原結合断片又は本明細書に記載される医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法が提供される。
抗体、抗原結合断片、又は医薬組成物は、ガレクチン-10結晶の存在又は形成と関連する疾患又は疾病を予防又は治療するために投与することができる。好適には、該疾患又は疾病は、喘息;慢性鼻副鼻腔炎;セリアック病;蠕虫感染症;消化管好酸球性炎症;嚢胞性線維症(CF);アレルギー性気管支肺アスペルギルス症(ABPA);チャーグ・ストラウス血管炎;慢性好酸球性肺炎;及び急性骨髄性白血病(AML):からなる群から選択することができる。好ましい実施態様において、該疾患又は疾病は、喘息である。別の好ましい実施態様において、該疾患又は疾病は、嚢胞性線維症である。
本発明はまた、患者から得られた試料中のガレクチン-10の検出のための本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片の使用を提供する。好適には、患者試料は、粘液試料又は喀痰試料であることができる。
本発明はまた、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片を含むキットを提供する。キットは、使用説明書をさらに含むことができる。
(図面の簡単な説明)
図1は、2回の2連の実験の結果を示している。これらは、ヒト化Fabクローンg18C06、g18E04、g18G07、g18G12、g20H09、及びg23H09とともにインキュベートしたとき、平均シャルコー・ライデン結晶(CLC)面積が時間の関数としてどのように変化するかを示している。時間の関数としてのCLCの溶解を記録した。クローンを2回の独立した実験において250μg/mLの濃度で試験し(n=4)、画像は、抗体添加から2、5、7、及び16時間後の試料中のCLCを取り込んだ。画像を、個々の結晶を検出するアルゴリズムを用いて分割し、ウェル当たりの総結晶面積を決定した。このアッセイでは、1μLの抗体試料を1.5mg/mLで希釈し、その後、1μgのGal10で形成された組換えCLCとともにインキュベートした。使用されたy-軸は、各々の抗体試料とのインキュベーション後のウェル当たりの溶解した平均結晶面積パーセンテージである。「T0」と表記された試料は、各々のクローンの参照試料(解析前に-80℃で保存された試料)に対応する。「T2W」と表記された試料は、解析前に37℃の温度で2週間保存されたものである。
図2は、スピニングディスク共焦点顕微鏡法によって決定されたg7B07及びg24F02_N53A(hFab)による組換えシャルコー・ライデン結晶(CLC)の溶解速度を示すグラフを示している。PBSのみを含有する試料を陰性対照として使用した。図2Aは、組換えCLC溶解アッセイの略図を示している;図2Bは、アッセイの結果を示している。実験開始時にCLCによって覆われている初期面積を1と定義し、CLCによって占有されている表面をソフトウェアを用いて決定した。「T0」と表記された試料は、各々のクローンの参照試料(解析前に-80℃で保存された試料)に対応する。「T2W」と表記された試料は、解析前に37℃の温度で2週間保存されたものである。
図3は、Nanodropを用いて280nmの波長で吸光度(A)を測定することにより決定されたクローンg18C06、g20H09、g23H09、g24F02_N53A、及びg7B07のタンパク質濃度を示している。誤解を避けるために、図中の試料名には接頭辞「g」が含まれていないが、試験されたクローンは全て、生殖系列化クローンである。「T0」と表記された試料は、各々のクローンの参照試料(解析前に-80℃で保存された試料)に対応する。「TxW+y℃」と表記された試料は、解析前にy℃の温度でx週間保存されたものであり、例えば、「T1W+5℃」と表記された試料は、解析前に+5℃で1週間保存されたものであり、「T1W+25℃」と表記された試料は、解析前に+25℃で1週間保存されたものである、など。「1F/FT」と表記された試料は、解析前に1回の凍結解凍サイクルに供されたものであり;「10F/FT」と表記された試料は、解析前に10回の凍結解凍サイクルに供されたものであり;かつ「低pH」と表記された試料は、解析前に2時間、pH 3.7に供されたものである。
図4は、表面プラズモン参照(SPR)によって決定された、クローンg18C06、g20H09、g23H09、g24F02_N53A、及びg7B07の相対活性パーセンテージを示している。誤解を避けるために、図中の試料名には接頭辞「g」が含まれていないが、試験されたクローンは全て、生殖系列化クローンである。「T0」と表記された試料は、各々のクローンの参照試料(SPR解析前に-80℃で保存された試料)に対応する。「TxW+y℃」と表記された試料は、SPR解析前にy℃の温度でx週間保存されたものであり、例えば、「T1W+5℃」と表記された試料は、SPR解析前に+5℃で1週間保存されたものであり、「T1W+25℃」と表記された試料は、SPR解析前に+25℃で1週間保存されたものである、など。「1F/FT」と表記された試料は、SPR解析前に1回の凍結解凍サイクルに供されたものであり;「10F/FT」と表記された試料は、SPR解析前に10回の凍結解凍サイクルに供されたものであり;かつ「低pH」と表記された試料は、解析前に2時間、pH 3.7に供されたものである。
図5は、SE-HPLCによって決定されたクローンg18C06、g20H09、g23H09、g24F02_N53A、及びg7B07の純度パーセンテージを示している。誤解を避けるために、図中の試料名には接頭辞「g」が含まれていないが、試験されたクローンは全て、生殖系列化クローンである。上のグラフは、各々の試料中のモノマーのパーセンテージを示し、真ん中のグラフは、各々の試料中の全凝集体のパーセンテージを示し、下のグラフは、各々の試料中の全断片のパーセンテージを示している。「T0」と表記された試料は、各々のクローンの参照試料(SE-HPLCの前に-80℃で保存された試料)に対応する。「TxW+y℃」と表記された試料は、SE-HPLC解析前にy℃の温度でx週間保存されたものであり、例えば、「T1W+5℃」と表記された試料は、SE-HPLC解析前に+5℃で1週間保存されたものであり、「T1W+25℃」と表記された試料は、SE-HPLC解析前に+25℃で1週間保存されたものである、など。「1F/FT」と表記された試料は、SE-HPLCの前に1回の凍結解凍サイクルに供されたものであり;「10F/FT」と表記された試料は、SE-HPLCの前に10回の凍結解凍サイクルに供されたものであり;かつ「低pH」と表記された試料は、解析前に2時間、pH 3.7に供されたものである。
図6は、キャピラリーゲル電気泳動(cGE)によって評価されたクローンの純度パーセンテージを示している。試料の純度に対するストレスの影響を評価するために、クローン試料を純度の決定の前に様々なストレスにも供した。上のグラフは、非還元条件下でのインタクトFabの純度パーセンテージを示し、下のグラフは、還元条件下での全Fabのパーセンテージを示している。「T0」と表記された試料は、各々のクローンの参照試料(cGEの前に-80℃で保存された試料)に対応し;「T4W+5℃」と表記された試料は、cGEの前に+5℃で4週間保存されたものであり;「T4W+25℃」と表記された試料は、cGEの前に+25℃で4週間保存されたものであり;「T4W+37℃」と表記された試料は、cGEの前に+37℃で4週間保存されたものであり;「1F/FT」と表記された試料は、cGEの前に1回の凍結解凍サイクルに供されたものであり;かつ「10F/FT」と表記された試料は、cGE解析前に10回の凍結解凍サイクルに供されたものである。誤解を避けるために、図中の試料名には接頭辞「g」が含まれていないが、試験されたクローンは全て、生殖系列化クローンである。
図7は、クローンg18C06、g20H09、g23H09、及びg24F02_N53Aがクローンg7B07_N53Aと同程度の速度でGAL10結晶を溶解させることを示している。誤解を避けるために、図中の試料名には接頭辞「g」が含まれていないが、試験されたクローンは全て、生殖系列化クローンである。
図8は、クローンg18C06、g20H09、及びg23H09がGAL10結晶を溶解させることができることを示している。これらのクローンは、異なる条件下で4週間保存した後、及び噴霧後に、GAL10結晶を溶解させることができた。実施されたアッセイのさらなる詳細は、「実施例1～4で使用された材料及びプロトコル」と題する実施例の節に見出すことができる(そこに記載されているアッセイ1を参照)。誤解を避けるために、図中の試料名には接頭辞「g」が含まれていないが、試験されたクローンは全て、生殖系列化クローンである。
図9は、クローンg23H09及びg24F02_N53Aが異なるサイズのGAL10結晶を溶解させることを示している。これらのクローンは、5℃で4週間保存した後、及び噴霧後に、GAL10結晶を溶解させることができた(「solo 0125」という注釈が付けられた試料)。実施されたアッセイのさらなる詳細は、「実施例1～4で使用された材料及びプロトコル」と題する実施例の節に見出すことができる(そこに記載されているアッセイ2を参照)。
図10は、44種の上市されている治療用抗体の全体的なDRベータ1(DRB1)リスクスコア、並びにクローンg20H09、g23H09、g18C06、及びg24F02_N53Aのリスクスコアを示している。ヒト抗体は、中間グレーのバーによって、ヒト化抗体は、グレーのバーによって、キメラ抗体は、濃いグレーのバーによって示されている。
図11は、クローンg20H09、g23H09、g18C06、及びg24F02_N53Aに対するIFNγ応答(左グラフ)及びIL-5応答(右グラフ)を有するドナーのパーセンテージを示している。分布によらないリサンプリング(DFR2x)アルゴリズム及びDFReqを統計解析に使用した(Moodieらの文献、Cancer Immunol Immunother 59, 1489-1501(2010))。KLH試料は、陽性対照として使用した。
図12は、クローンg20H09、g23H09、g18C06、及びg24F02_N53Aのドナー試験集団(n=31)におけるIFNγ応答(左枠)及びIL-5応答(右枠)を示している(DFR2xアルゴリズムを統計解析に使用した(Moodieらの文献、Cancer Immunol Immunother 59, 1489-1501(2010))。
(詳細な説明)
(A.定義)
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術的及び科学的用語は全て、本発明の技術分野の専門家によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
(A.定義)
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術的及び科学的用語は全て、本発明の技術分野の専門家によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
「抗体」又は「免疫グロブリン」－本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン」という用語は、それが何らかの関連性のある特異的な免疫反応性を保有するか否かにかかわらず、2つの重鎖と2つの軽鎖の組合せを有するポリペプチドを含む。「抗体」は、対象となる抗原(本明細書では、ガレクチン-10)に対する顕著な既知の特異的免疫反応活性を有するそのような会合体を指す。「ガレクチン-10抗体」という用語は、ヒトガレクチン-10を含むガレクチン-10タンパク質に対する免疫学的特異性を示す抗体、及び場合によっては、その種ホモログを指すために本明細書で使用される。抗体及び免疫グロブリンは、それらの間の鎖間共有結合を有する又は有さない、軽鎖及び重鎖を含む。脊椎動物システムにおける基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。
「免疫グロブリン」という一般用語は、生化学的に区別することができる5つの異なるクラスの抗体を含む。5つのクラスの抗体は全て、本発明の範囲内にある。以下の議論は、概して、IgGクラスの免疫グロブリン分子に対するものである。IgGに関して、免疫グロブリンは、分子量約23,000ダルトンの2つの同一の軽ポリペプチド鎖及び分子量53,000～70,000の2つの同一の重鎖を含む。これら4つの鎖は、「Y」形状でジスルフィド結合により接続されており、ここで、軽鎖は、「Y」の口から始まり、可変領域を通して続いている重鎖を下支えする。
抗体の軽鎖は、カッパ又はラムダ(κ、λ)のいずれかに分類される。各々の重鎖クラスは、カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖のいずれかと結合することができる。一般に、軽鎖及び重鎖は、互いに共有結合しており、2つの重鎖の「テール」部分は、免疫グロブリンが、ハイブリドーマ、B細胞、又は遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって生成されるとき、共有結合的ジスルフィド連結又は非共有結合的連結によって互いに結合する。重鎖において、アミノ酸配列は、Y形状のフォーク型端部のN-末端から各々の鎖の下端のC-末端まで続いている。当業者は、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロン(γ、μ、α、δ、ε)に分類され、その中にいくつかのサブクラス(例えば、γ1～γ4)があることを理解しているであろう。抗体の「クラス」を、それぞれ、IgG、IgM、IgA、IgD、又はIgEとして決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1などは、十分に特徴付けられており、機能特化を付与することが知られている。これらのクラス及びアイソタイプの各々の修飾バージョンは、本開示に照らして、当業者に直ちに識別可能であり、したがって、本発明の範囲内にある。
上に示されているように、抗体の可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、それに特異的に結合することを可能にする。すなわち、抗体のVLドメインとVHドメインが組み合わさって、3次元抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この4つの要素からなる抗体構造は、Y字の各々のアームの端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、VH鎖及びVL鎖の各々の上にある3つの相補性決定領域(CDR)によって規定される。
「ガレクチン-10」－本明細書で使用される場合、「ガレクチン-10」(又はGal10又はGal-10、これらは、本明細書において互換的に使用される)という用語は、自己結晶化して、シャルコー・ライデン結晶を形成する小型の疎水性グリカン結合タンパク質を指す。ガレクチン-10は、シャルコー・ライデン結晶タンパク質(CLCP)、好酸球リゾホスホリパーゼ、及びリゾレシチンアシルヒドロラーゼとも呼ばれる。「ガレクチン-10」という用語は、ヒトタンパク質及び任意の種ホモログを網羅するのに十分な幅がある。全長ヒトガレクチン-10のアミノ酸配列は、配列番号25によって表される(下記参照)。この配列は、UniProtデータベースにヒトガレクチン-10、アクセッション番号Q05315として寄託された配列に対応する。ヒト配列の天然の変異体、例えば、位置28におけるAla→Val変異体も「ガレクチン-10」という用語に包含される。
配列番号25
配列番号25
「ガレクチン-10結晶」又は「シャルコー・ライデン結晶」－「ガレクチン-10結晶」、「シャルコー・ライデン結晶」、及び「CLC」という用語は、ガレクチン-10から形成された結晶を指すために、本明細書で互換的に使用される。ガレクチン-10によって形成された結晶は、通常、六角両錐型結晶であり、長さが約20～40μm、幅が約2～4μmである。これらの結晶は、好酸球性炎症性障害と関連付けられている。
「エピトープ」－本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、アンタゴニストが結合するガレクチン-10タンパク質の領域を意味する。アンタゴニストは、通常、アンタゴニスト上の相補的結合部位を介して、そのそれぞれのガレクチン-10エピトープに結合する。アンタゴニストが結合するエピトープは、通常、全長ガレクチン-10タンパク質由来の1以上のアミノ酸を含む。エピトープは、ガレクチン-10タンパク質中で連続しているアミノ酸、すなわち、線状エピトープを含んでいてもよく、又はガレクチン-10タンパク質中で連続していないアミノ酸、すなわち、立体構造エピトープを含んでいてもよい。
「結合部位」－本明細書で使用される場合、「結合部位」という用語は、対象となる標的抗原(例えば、ガレクチン-10)への選択的結合に関与するポリペプチドの領域を含む。結合ドメインは、少なくとも1つの結合部位を含む。例示的な結合ドメインとしては、抗体可変ドメインが挙げられる。本発明の抗体分子は、単一の結合部位又は複数(例えば、2つ、3つ、もしくは4つ)の結合部位を含むことができる。
「に由来する」－本明細書で使用される場合、指定されたタンパク質(例えば、ラクダ科動物抗体又はその抗原結合断片)「に由来する」という用語は、ポリペプチド又はアミノ酸配列の源を指す。一実施態様において、特定の出発ポリペプチドに由来するポリペプチド又はアミノ酸配列は、CDR配列又はそれに関連する配列である。一実施態様において、特定の出発ポリペプチドに由来するアミノ酸配列は、連続していない。例えば、一実施態様において、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、又は6つのCDRは、出発抗体に由来する。一実施態様において、特定の出発ポリペプチド又はアミノ酸配列に由来するポリペプチド又はアミノ酸配列は、出発配列又はその一部(ここで、該一部は、少なくとも3～5個のアミノ酸、少なくとも5～10個のアミノ酸、少なくとも10～20個のアミノ酸、少なくとも20～30個のアミノ酸、もしくは少なくとも30～50個のアミノ酸からなる)のアミノ酸配列と本質的に同一であるか、又はそうでなければ、出発配列中にその源を有することが当業者に同定可能である、アミノ酸配列を有する。一実施態様において、出発抗体に由来する1以上のCDR配列は、変異体CDR配列、例えば、親和性変異体を産生するように改変され、ここで、該変異体CDR配列は、標的抗原結合活性を維持している。
「ラクダ科動物由来」－ある好ましい実施態様において、本発明の抗体は、ラクダ科動物の従来の抗体又はラクダ科動物の能動免疫によって惹起されたVHH抗体に由来するフレームワークアミノ酸配列及び/又はCDRアミノ酸配列を含む。しかしながら、ラクダ科動物由来アミノ酸配列を含む本発明の抗体は、ヒトアミノ酸配列(すなわち、ヒト抗体)又は他の非ラクダ科動物哺乳動物種に由来するフレームワーク及び/又は定常領域配列を含むように人為的に作出することができる。例えば、ヒト又は非ヒト霊長類のフレームワーク領域、重鎖部分、及び/又はヒンジ部分をガレクチン-10抗体に含めることができる。一実施態様において、1以上の非ラクダ科動物アミノ酸が「ラクダ科動物由来」抗体のフレームワーク領域中に存在していてもよく、例えば、ラクダ科動物フレームワークアミノ酸配列は、対応するヒト又は非ヒト霊長類アミノ酸残基が存在する1以上のアミノ酸突然変異を含むことができる。さらに、ラクダ科動物由来VH及びVLドメイン、又はそのヒト化変異体を、本明細書中の別所に記載されているように、ヒト抗体の定常ドメインに連結させて、キメラ分子を産生することができる。
「VHH抗体」－本明細書で使用される場合、「VHH抗体」又は「重鎖のみの抗体」という用語は、ラクダ、ラマ、アルパカを含む、ラクダ科(Camelidae)ファミリーの種によってのみ産生される抗体のタイプを指す。重鎖のみの抗体又はVHH抗体は、2つの重鎖から構成され、軽鎖を欠いている。各々の重鎖は、N-末端に可変ドメインを有し、これらの可変ドメインは、それらを上記の従来のヘテロ四量体抗体の重鎖の可変ドメイン、すなわち、VHドメインと区別するために、「VHH」ドメインと呼ばれる。
「保存的アミノ酸置換」－「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されており、これには、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β-分岐側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。したがって、免疫グロブリンポリペプチド中の非必須アミノ酸残基を同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基と置き換えることができる。別の実施態様において、アミノ酸のストリングを、側鎖ファミリーメンバーの順序及び/又は組成が異なる構造的に類似したストリングと置き換えることができる。
「重鎖部分」－本明細書で使用される場合、「重鎖部分」という用語は、免疫グロブリン重鎖の定常ドメインに由来するアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは、CH1ドメイン、ヒンジ(例えば、上部、中央、及び/もしくは下部ヒンジ領域)ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、又はこれらの変異体もしくは断片:のうちの少なくとも1つを含む。一実施態様において、本発明の抗体又は抗原結合断片は、免疫グロブリン重鎖のFc部分(例えば、ヒンジ部分、CH2ドメイン、及びCH3ドメイン)を含み得る。別の実施態様において、本発明の抗体又は抗原結合断片は、定常ドメインの少なくとも一部(例えば、CH2ドメインの全て又は一部)を欠如し得る。ある実施態様において、定常ドメインの少なくとも1つ、好ましくは、全てがヒト免疫グロブリン重鎖に由来する。例えば、好ましい一実施態様において、重鎖部分は、完全ヒトヒンジドメインを含む。他の好ましい実施態様において、重鎖部分は、完全ヒトFc部分(例えば、ヒト免疫グロブリン由来のヒンジ、CH2、及びCH3ドメイン配列)を含む。
ある実施態様において、重鎖部分の構成的定常ドメインは、異なる免疫グロブリン分子に由来するものである。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、IgG1分子に由来するCH2ドメイン及びIgG3又はIgG4分子に由来するヒンジ領域を含むことができる。他の実施態様において、定常ドメインは、異なる免疫グロブリン分子の部分を含むキメラドメインである。例えば、ヒンジは、IgG1分子由来の第一の部分及びIgG3又はIgG4分子由来の第二の部分を含むことができる。上に示されているように、重鎖部分の定常ドメインは、天然(野生型)の免疫グロブリン分子由来のアミノ酸配列が異なるように修飾され得ることが当業者によって理解されるであろう。すなわち、本明細書に開示される本発明のポリペプチドは、重鎖定常ドメイン(CH1、ヒンジ、CH2、もしくはCH3)のうちの1つもしくは複数に対する及び/又は軽鎖定常領域ドメイン(CL)に対する改変又は修飾を含むことができる。例示的な修飾としては、1以上のドメインにおける1以上のアミノ酸の付加、欠失、又は置換が挙げられる。
「キメラ」－「キメラ」タンパク質は、それが本来は天然に連結していない第二のアミノ酸配列に連結された第一のアミノ酸配列を含む。該アミノ酸配列は、通常、融合ポリペプチド中で1つになる別々のタンパク質中に存在することができるか、又は該アミノ酸配列は、通常、同じタンパク質中に存在することができるが、融合ポリペプチド中、新しい配置で配置される。キメラタンパク質は、例えば、化学合成によるか、又はペプチド領域が所望の関係性でコードされるポリヌクレオチドを作製及び翻訳することにより作製することができる。本発明の例示的なキメラ抗体には、ヒト抗体、例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4の定常ドメインに融合された、ラクダ科動物由来VH及びVLドメイン、又はそのヒト化変異体を含む融合タンパク質が含まれる。
「可変領域」又は「可変ドメイン」－「可変領域」及び「可変ドメイン」という用語は、本明細書で互換的に使用されており、かつ等価な意味を有することが意図される。「可変」という用語は、可変ドメインVH及びVLのある部分が配列に関して抗体間で広範囲に異なり、かつその標的抗原に対する各々の特定の抗体の結合及び特異性に関して使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインの全体を通して一様には分布していない。それは、抗原結合部位の部分を形成するVLドメイン及びVHドメインの各々の中の「超可変ループ」と呼ばれる3つのセグメントに集中している。Vラムダ軽鎖ドメインの第一、第二、及び第三の超可変ループは、本明細書において、L1(λ)、L2(λ)、及びL3(λ)と称され、VLドメイン中の残基24～33(9、10、又は11個のアミノ酸残基からなるL1(λ))、49～53(3個の残基からなるL2(λ))、及び90～96(5個の残基からなるL3(λ))を含むものとして定義することができる(Moreaらの文献、Methods 20:267-279(2000))。Vカッパ軽鎖ドメインの第一、第二、及び第三の超可変ループは、本明細書において、L1(κ)、L2(κ)、及びL3(κ)と称され、VLドメイン中の残基25～33(6、7、8、11、12、又は13個の残基からなるL1(κ))、49～53(3個の残基からなるL2(κ))、及び90～97(6個の残基からなるL3(κ))を含むものとして定義することができる(Moreaらの文献、Methods 20:267-279(2000))。VHドメインの第一、第二、及び第三の超可変ループは、本明細書において、H1、H2、及びH3と称され、VHドメイン中の残基25～33(7、8、又は9個の残基からなるH1)、52～56(3又は4個の残基からなるH2)、及び91～105(長さに大きなばらつきがあるH3)を含むものとして定義することができる(Moreaらの文献、Methods 20:267-279(2000))。
別途示されない限り、L1、L2、及びL3という用語は、それぞれ、VLドメインの第一、第二、及び第三の超可変ループを指し、VカッパアイソタイプとVラムダアイソタイプの両方から得られる超可変ループを包含する。H1、H2、及びH3という用語は、それぞれ、VHドメインの第一、第二、及び第三の超可変ループを指し、γ、ε、δ、α、又はμを含む、既知の重鎖アイソタイプのいずれかから得られる超可変ループを包含する。
超可変ループL1、L2、L3、H1、H2、及びH3は、各々、以下で定義される「相補性決定領域」又は「CDR」の部分を含むことができる。「超可変ループ」及び「相補性決定領域」という用語は、厳密には同義ではないが、それは、超可変ループ(HV)が構造に基づいて定義されるのに対し、相補性決定領域(CDR)は配列可変性に基づいて定義されており(Kabatらの文献、免疫学的に興味深いタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)、第5版. Public Health Service、National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1983)、かつHV及びCDRの境界がいくつかのVH及びVLドメインで異なり得るからである。
VL及びVHドメインのCDRは、通常、以下のアミノ酸:軽鎖可変ドメイン中の残基24～34(LCDR1)、50～56(LCDR2)、及び89～97(LCDR3)、並びに重鎖可変ドメイン中の残基31～35又は31～35b(HCDR1)、50～65(HCDR2)、及び95～102(HCDR3)を含むものとして定義することができる;(Kabatらの文献、免疫学的に興味深いタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)、第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))。したがって、HVは、対応するCDR内に含まれることができ、別途示されない限り、VH及びVLドメインの「超可変ループ」に対する本明細書中の言及は、対応するCDRも包含するものとして解釈されるべきであり、逆もまた同様である。
可変ドメインのより高度に保存された部分は、以下で定義されるように、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々、3つの超可変ループによって接続された、主としてβ-シート形状を取っている4つのFR(それぞれ、FR1、FR2、FR3、及びFR4)を含む。各々の鎖の超可変ループは、FRによりごく接近して結び付けられ、他の鎖由来の超可変ループとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。抗体の構造解析により、相補性決定領域によって形成される結合部位の配列と形状の関係性が明らかになった(Chothiaらの文献、J. Mol. Biol. 227: 799-817(1992)); Tramontanoらの文献、J. Mol. Biol, 215:175-182(1990))。
「CDR」－本明細書で使用される場合、「CDR」又は「相補性決定領域」という用語は、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる非連続的な抗原結合部位を意味する。これらの特定の領域は、Kabatらの文献、J. Biol. Chem. 252, 6609-6616(1977)及びKabatらの文献、免疫学的に興味深いタンパク質の配列(Sequences of Protein of Immunological Interest)(1991)、並びにChothiaらの文献、J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)、並びにMacCallumらの文献、J. Mol. Biol. 262:732-745(1996)によって記載されており、ここで、これらの定義は、互いに比較したとき、アミノ酸残基の重複又は部分集合を含む。上で引用された参考文献の各々によって定義されるCDRを包含するアミノ酸残基が比較のために示されている。好ましくは、「CDR」という用語は、配列比較に基づいてKabatにより定義されたCDRである。
表1: CDR定義
1残基の付番はKabatらの文献(上記)の命名体系に従う
2残基の付番はChothiaらの文献(上記)の命名体系に従う
3残基の付番はMacCallumらの文献(上記)の命名体系に従う
表1: CDR定義
2残基の付番はChothiaらの文献(上記)の命名体系に従う
3残基の付番はMacCallumらの文献(上記)の命名体系に従う
「フレームワーク領域」－本明細書で使用される「フレームワーク領域」又は「FR領域」という用語は、(例えば、CDRのKabat定義を用いて)可変領域の部分であるが、CDRの部分ではないアミノ酸残基を含む。それゆえ、可変領域フレームワークは、約100～120アミノ酸の長さであるが、CDRの外側のアミノ酸しか含まない。重鎖可変ドメインの具体的な例について、及びKabatらによって定義されるCDRについて、フレームワーク領域1は、アミノ酸1～30を包含する可変領域のドメインに対応し;フレームワーク領域2は、アミノ酸36～49を包含する可変領域のドメインに対応し;フレームワーク領域3は、アミノ酸66～94を包含する可変領域のドメインに対応し、フレームワーク領域4は、アミノ酸103から可変領域の末端までの可変領域のドメインに対応する。軽鎖のフレームワーク領域は、軽鎖可変領域CDRの各々によって同様に隔てられる。同様に、Chothiaら又はMcCallumらによるCDRの定義を用いて、フレームワーク領域境界は、上記のようなそれぞれのCDR末端によって隔てられる。好ましい実施態様において、CDRは、Kabatによって定義されている通りである。
天然の抗体において、各々の単量体抗体上に存在する6つのCDRは、抗体が水性環境中でその3次元形状を取るときに、抗原結合部位を形成するように特異的に配置されている、アミノ酸の短い非連続的な配列である。重及び軽可変ドメインの残りの部分は、アミノ酸配列に関してより小さい分子間可変性を示し、フレームワーク領域と呼ばれる。フレームワーク領域は、主としてβ-シート立体配置を取っており、CDRは、β-シート構造に接続し、場合によっては、その部分を形成するループを形成する。したがって、これらのフレームワーク領域は、6つのCDRを鎖間の非共有結合的相互作用によって正しい方向に配置する足場を形成するように作用する。配置されたCDRによって形成される抗原結合部位は、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を規定する。この相補的な表面は、抗体と免疫反応性抗原エピトープとの非共有結合を促進する。CDRの位置は、当業者により容易に同定されることができる。
「ヒンジ領域」－本明細書で使用される場合、「ヒンジ領域」という用語は、CH1ドメインをCH2ドメインに接続する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は、約25残基を含み、可撓性であり、したがって、2つのN-末端抗原結合領域が独立に動くことを可能にする。ヒンジ領域は、3つの異なるドメイン:上部、中央、及び下部ヒンジドメインに細分することができる(Roux K.H.らの文献、J. Immunol. 161:4083-90 1998)。「完全ヒト」ヒンジ領域を含む本発明の抗体は、下の表2に示されるヒンジ領域配列のうちの1つを含有することができる。
表2:ヒトヒンジ配列
「CH2ドメイン」－本明細書で使用される場合、「CH2ドメイン」という用語は、従来の付番スキームを用いて、例えば、抗体の約残基244から残基360(残基244～360、Kabat付番体系;及び残基231～340、EU付番体系、Kabat EAらの文献、免疫学的に興味深いタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)、Bethesda, US Department of Health and Human Services, NIH. 1991)にまで及ぶ重鎖分子の部分を含む。CH2ドメインは、それが別のドメインと密接に対を形成しないという点で独特である。それどころか、2つのN-結合型分岐炭水化物鎖がインタクトの天然IgG分子の2つのCH2ドメイン間に挿入されている。CH3ドメインがIgG分子のCH2ドメインからC-末端にまで及び、約108個の残基を含むことも十分に立証されている。
表2:ヒトヒンジ配列
「断片」－本発明の抗体との関連で使用される「断片」という用語は、インタクトの又は完全な抗体又は抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体又は抗体鎖の部分(part)又は部分(portion)を指す。「抗原結合断片」という用語は、抗原に結合するか又はインタクト抗体と(すなわち、それが由来したインタクト抗体と)抗原結合(すなわち、ガレクチン-10との特異的結合)を競合する免疫グロブリン又は抗体のポリペプチド断片を指す。本明細書で使用される場合、抗体分子の「断片」という用語は、抗体の抗原結合断片、例えば、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、単鎖抗体(scFv)、F(ab')2断片、Fab断片、Fd断片、Fv断片、単腕(一価)抗体、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、又はそのような抗原結合断片の組合せ、会合、もしくはコンジュゲーションによって形成される任意の抗原結合分子を含む。本明細書で使用される「抗原結合断片」という用語は、ユニボディ、ドメイン抗体、及びナノボディからなる群から選択される抗体断片を包含することがさらに意図される。断片は、例えば、インタクトのもしくは完全な抗体もしくは抗体鎖の化学的もしくは酵素的処理によるか、又は組換え手段によって得ることができる。
「Fab」－「Fab」又は「Fab断片」は、重鎖及び軽鎖から構成される分子を指し、ここで、該軽鎖は、VLドメインと1つの定常ドメイン(CL、Cκ、又はCλ)とからなり、該重鎖は、VHドメインとCH1ドメインのみとからなる。Fab断片は、通常、Y形の免疫グロブリン分子の1つの腕である。Fab断片は、酵素パパインの作用により、免疫グロブリン分子から生成させることができる。パパインは、2つのFab断片と別々のFc領域とを生じるように、ヒンジの領域中で免疫グロブリン分子を切断する。
「scFv」又は「scFv断片」－scFv又はscFv断片は、単鎖可変断片を意味する。scFvは、リンカーを介して接続された抗体のVHドメインとVLドメインの融合タンパク質である。
「価数」－本明細書で使用される場合、「価数」という用語は、ポリペプチド中の潜在的な標的結合部位の数を指す。各々の標的結合部位は、1つの標的分子又は標的分子上の特異的部位に特異的に結合する。ポリペプチドが複数の標的結合部位を含む場合、各々の標的結合部位は、同じ又は異なる分子に特異的に結合することができる(例えば、異なるリガンドもしくは異なる抗原、又は同じ抗原上の異なるエピトープに結合することができる)。
「特異性」－「特異性」という用語は、所与の標的、例えば、ガレクチン-10と結合する(例えば、免疫反応する)能力を指す。ポリペプチドは、単一特異的であり、かつ標的に特異的に結合する1以上の結合部位を含有していてもよく、又はポリペプチドは、多重特異的であり、かつ同じもしくは異なる標的に特異的に結合する2以上の結合部位を含有していてもよい。
「合成的」－本明細書で使用される場合、ポリペプチドに関する「合成的」という用語は、天然ではないアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。例えば、天然のポリペプチドの修飾形態(例えば、付加、置換、もしくは欠失などの突然変異を含む)であるか又はアミノ酸の直線状配列中で、それが本来は天然に連結していない第二のアミノ酸配列(これは、天然であっても天然でなくてもよい)に連結している第一のアミノ酸配列(これは、天然であっても天然でなくてもよい)を含む、非天然のポリペプチド。
「人為的に作出された」－本明細書で使用される場合、「人為的に作出された」という用語は、合成手段による(例えば、組換え技法、インビトロペプチド合成による、ペプチドの酵素的もしくは化学的カップリングによる、又はこれらの技法のいくつかの組合せによる)核酸又はポリペプチド分子の操作を含む。好ましくは、本発明の抗体は、人為的に作出されたものであり、例えば、ヒト化及び/又はキメラ抗体、並びに抗原結合、安定性/半減期、免疫原性、又はエフェクター機能などの1以上の特性を改善するように人為的に作出されている抗体を含む。
「修飾抗体」－本明細書で使用される場合、「修飾抗体」という用語は、天然ではないように改変されている合成形態の抗体、例えば、少なくとも2つの重鎖部分を含むが、2つの完全な重鎖を含まない抗体(例えば、ドメイン欠失抗体又はミニボディ); 2以上の異なる抗原に又は単一の抗原上の異なるエピトープに結合するように改変された多重特異性形態の抗体(例えば、二重特異性、三重特異性など); scFv分子に接続された重鎖分子などを含む。scFv分子は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第5,892,019号に記載されている。さらに、「修飾抗体」という用語は、多価形態の抗体(例えば、3コピー以上の同じ抗原に結合する三価、四価などの抗体)を含む。別の実施態様において、本発明の修飾抗体は、CH2ドメインを欠く少なくとも1つの重鎖部分を含み、かつ受容体リガンド対の1つのメンバーの結合部分を含むポリペプチドの結合ドメインを含む融合タンパク質である。
「修飾抗体」という用語は、本明細書で構造的に定義された本発明の抗体のアミノ酸配列変異体を指すために、本明細書で使用することもできる。抗体は、それが由来した抗体と比較してアミノ酸配列が異なる変異体抗体を産生するように修飾され得ることが当業者によって理解されるであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基における保存的置換又は変化をもたらすヌクレオチド又はアミノ酸置換を(例えば、CDR及び/又はフレームワーク残基中で)行うことができる。アミノ酸置換は、1以上のアミノ酸と天然又は非天然アミノ酸との置換を含むことができる。
「ヒト化置換」－本明細書で使用される場合、「ヒト化置換」という用語は、抗体(例えば、ラクダ科動物由来ガレクチン-10抗体)のVH又はVLドメイン中の特定の位置に存在するアミノ酸残基が参照ヒトVH又はVLドメイン中の等価な位置に生じるアミノ酸残基と置き換えられるアミノ酸置換を指す。参照ヒトVH又はVLドメインは、ヒト生殖系列によってコードされるVH又はVLドメインであってもよい。ヒト化置換は、本明細書で定義される抗体のフレームワーク領域及び/又はCDR中で行われてもよい。
「ヒト化変異体」－本明細書で使用される場合、「ヒト化変異体」という用語は、参照抗体と比較して1以上の「ヒト化置換」を含有する変異体抗体を指し、ここで、該参照抗体の部分(例えば、少なくとも1つのCDRを含有するVHドメイン及び/もしくはVLドメイン又はその部分)は、非ヒト種に由来するアミノ酸を有し、かつ該「ヒト化置換」は、非ヒト種に由来するアミノ酸配列内で生じる。
「生殖系列化変異体」－「生殖系列化変異体」という用語は、「ヒト化置換」が抗体(例えば、ラクダ科動物由来ガレクチン-10抗体)のVH又はVLドメイン中の特定の位置に存在する1以上のアミノ酸残基とヒト生殖系列によってコードされる参照ヒトVH又はVLドメイン中の等価な位置に生じるアミノ酸残基との置換をもたらす「ヒト化変異体」を具体的に指すために本明細書で使用される。任意の所与の「生殖系列化変異体」について、生殖系列化変異体へと置換される置換アミノ酸残基は、ヒト生殖系列によってコードされる単一のVH又はVLドメインから独占的に又は優先的に取得されることが一般的である。「ヒト化変異体」及び「生殖系列化変異体」という用語は、多くの場合、本明細書で互換的に使用される。ラクダ科動物由来(例えば、ラマ由来)VH又はVLドメインへの1以上の「ヒト化置換」の導入は、ラクダ科動物(ラマ)由来VH又はVLドメインの「ヒト化変異体」の産生をもたらす。置換されるアミノ酸残基が優先的に又は独占的にヒト生殖系列によってコードされる単一のVH又はVLドメイン配列に由来する場合、ラクダ科動物(ラマ)由来VH又はVLドメインの「ヒト生殖系列化変異体」という結果になり得る。
「％同一性」－本明細書で使用される場合、本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列などの、2つの配列間の配列類似性を記載するためのものである。これは、最適な方法でアラインされた2つの配列を比較することにより決定することができ、比較されることになるアミノ酸配列は、これら2つの配列間の最適なアライメントのための参照配列に関して付加又は欠失を含むことができる。同一性のパーセンテージは、これら2つの配列間の同一性のパーセンテージを得るために、残基が2つの配列間で同一である同一位置の数を決定し、この同一位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除し、かつ得られた結果に100を乗じることにより計算される。例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/bl2.htmlというサイトで入手可能なBLASTプログラム「BLAST 2配列」(Tatusovaらの文献、「Blast 2配列－タンパク質及びヌクレオチド配列を比較するための新たなツール(Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences)」、FEMS Microbiol Lett. 174:247-250)を使用することが可能であり、使用されるパラメータは、デフォルトで与えられているものであり(特に、パラメータについては、「オープンギャップペナルティ」: 5及び「伸長ギャップペナルティ」: 2であり;選ばれるマトリックスは、例えば、本プログラムによって提案されるマトリックス「BLOSUM 62」である)、比較されることになる2つの配列間の同一性のパーセンテージは、本プログラムによって直接計算される。
「親和性変異体」－本明細書で使用される場合、「親和性変異体」という用語は、参照抗体と比較してアミノ酸配列の1以上の変化を示す変異体抗体を指し、ここで、該親和性変異体は、参照抗体と比較して標的抗原に対する改変された親和性を示す。例えば、親和性変異体は、参照ガレクチン-10抗体と比較したとき、ガレクチン-10に対する変化した親和性を示す。好ましくは、親和性変異体は、参照抗体と比較したとき、標的抗原、例えば、ガレクチン-10に対する改善された親和性を示す。親和性変異体は、通常、参照抗体と比較したとき、CDR中のアミノ酸配列の1以上の変化を示す。そのような置換は、CDR中の所与の位置に存在するもとのアミノ酸と、天然のアミノ酸残基又は非天然のアミノ酸残基であり得る異なるアミノ酸残基との置換をもたらすことができる。アミノ酸置換は、保存的であっても非保存的であってもよい。
「高いヒト相同性」－重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)を含む抗体は、VHドメイン及びVLドメインが1つにまとまって、最も近く一致するヒト生殖系列VH及びVL配列との少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示す場合、高いヒト相同性を有するとみなすことができる。高いヒト相同性を有する抗体としては、例えば、ラクダ科動物の従来の抗体のVH及びVLドメインを含む抗体を含む、ヒト生殖系列配列との十分に高い％配列同一性を示す天然の非ヒト抗体のVH及びVLドメインを含む抗体、並びにそのような抗体の人為的に作出された、特に、ヒト化又は生殖系列化された変異体、及び同じく「完全ヒト」抗体を挙げることができる。
一実施態様において、高いヒト相同性を有する抗体のVHドメインは、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3、及びFR4にわたって、1以上のヒトVHドメインとの80％以上のアミノ酸配列同一性又は配列相同性を示し得る。他の実施態様において、本発明のポリペプチドのVHドメインと最も近く一致するヒト生殖系列VHドメイン配列との間のアミノ酸配列同一性又は配列相同性は、85％以上、90％以上、95％以上、97％以上、もしくは最大99％、又は100％ですらあってもよい。
一実施態様において、高いヒト相同性を有する抗体のVHドメインは、最も近く一致するヒトVH配列と比較して、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3、及びFR4にわたって、1以上(例えば、1～10個)のアミノ酸配列ミスマッチを含有し得る。
別の実施態様において、高いヒト相同性を有する抗体のVLドメインは、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3、及びFR4にわたって、1以上のヒトVLドメインとの80％以上の配列同一性又は配列相同性を示し得る。他の実施態様において、本発明のポリペプチドのVLドメインと最も近く一致するヒト生殖系列VLドメイン配列との間のアミノ酸配列同一性又は配列相同性は、85％以上、90％以上、95％以上、97％以上、もしくは最大99％、又は100％ですらあってもよい。
一実施態様において、高いヒト相同性を有する抗体のVLドメインは、最も近く一致するヒトVL配列と比較して、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3、及びFR4にわたって、1以上(例えば、1～10個)のアミノ酸配列ミスマッチを含有し得る。
(B.ガレクチン-10に結合する抗体及び抗原結合断片)
上記の通り、本発明は、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片を対象とする。「抗体」という用語は、最も広範な意味で使用されており、かつそれが、ガレクチン-10タンパク質に対する適切な免疫学的特異性を示す限り、モノクローナル抗体(全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(すなわち、二重特異性抗体)を包含するが、これらに限定されない。本明細書に記載されるガレクチン-10に結合する抗体及び抗原結合断片は、任意のガレクチン-10エピトープに対する免疫学的特異性を示し得る。
上記の通り、本発明は、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片を対象とする。「抗体」という用語は、最も広範な意味で使用されており、かつそれが、ガレクチン-10タンパク質に対する適切な免疫学的特異性を示す限り、モノクローナル抗体(全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(すなわち、二重特異性抗体)を包含するが、これらに限定されない。本明細書に記載されるガレクチン-10に結合する抗体及び抗原結合断片は、任意のガレクチン-10エピトープに対する免疫学的特異性を示し得る。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、微量に存在し得る起こり得る天然の突然変異を除いて同一である集団を含む個々の抗体を指す。モノクローナル抗体は、極めて特異的であり、単一の抗原性部位に対するものである。さらに、通常は抗原上の異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含む、従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは対照的に、各々のモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基又はエピトープに対するものである。「抗体断片」又は「抗原結合断片」は、全長抗体の一部、通常、その抗原結合又は可変ドメインを含む。抗体断片は、本明細書中の別所に記載されており、抗体断片の例としては、Fab、Fab'、F(ab')2、二重特異性Fab'、及びFv断片、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子、単鎖可変断片(scFv)、並びに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる(その内容が引用により本明細書中に組み込まれる、Holliger及びHudsonの文献、Nature Biotechnol. 23:1126-36(2005)を参照)。
本明細書に記載されるガレクチン-10に結合する抗体及び抗原結合断片は、ヒトでの治療的使用が意図されており、それゆえ、典型的には、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM型、多くの場合、IgG型の免疫グロブリンであり、その場合、それは、4つのサブクラスIgG1、IgG2a及びb、IgG3、又はIgG4のいずれかに属することができる。好ましい実施態様において、抗体は、IgG抗体である。極めて特異的であり、単一の抗原性部位に対するものであるので、モノクローナル抗体が好ましい。ある好ましい実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗原結合断片は、Fab断片又は「Fab」である。
ガレクチン-10に結合する抗体及び抗原結合断片は、本明細書中の別所で定義されている高いヒト相同性を示すことができる。高いヒト相同性を有するそのような抗体分子としては、ヒト生殖系列配列に対する十分に高いパーセンテージ配列同一性を示す天然の非ヒト抗体のVH及びVLドメインを含む抗体を挙げることができる。ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、非ヒト抗体のヒト化又は生殖系列化変異体である。
ある実施態様において、本明細書に記載されるガルクチン-10に結合する抗体及び抗原結合断片は、ラクダ科動物由来であってもよい。ラクダ科動物由来抗体は、重鎖のみの抗体、すなわち、VHH抗体であってもよく、又は従来のヘテロ四量体抗体であってもよい。好ましい実施態様において、ガレクチン-10抗体及び抗原結合断片は、ラクダ科動物ヘテロ四量体抗体に由来する。さらなる好ましい実施態様において、ガレクチン-10抗体は、VHH抗体に由来する。
例えば、本明細書に記載される抗体及び抗原結合断片は、ラクダ科動物を、対象となる標的、すなわち、ガレクチン-10で免疫する工程を含む方法によって得られる免疫ライブラリーから選択することができる。ラクダ科動物を、標的タンパク質又はそのポリペプチド断片で、又は該タンパク質もしくはそのポリペプチド断片を発現するmRNA分子もしくはcDNA分子で免疫することができる。抗体をラクダ科動物種で産生し、好ましい標的に対する抗体をラクダ科動物免疫ライブラリーから選択する方法は、例えば、引用により本明細書中に組み込まれる、国際特許出願WO2010/001251号に記載されている。
ある実施態様において、抗体及び抗原結合断片は、ラクダ科ファミリーの種のVHドメイン又はVLドメインから得られる少なくとも1つの超可変(HV)ループ又は相補性決定領域(CDR)を含むという点で、ラクダ科動物由来であり得る。特に、抗体及び抗原結合断片は、ガレクチン-10による非近交系のラクダ科動物、すなわち、ラマの能動免疫によって得られるVH及び/もしくはVLドメイン、又はそのCDRを含むことができる。
これに関連した「から得られる」という用語は、抗体のHV又はCDRがもとはラクダ科免疫グロブリン遺伝子によってコードされていたアミノ酸配列(又はそのマイナー変異体)を具体化するという意味で構造的関係性を意味する。しかしながら、これは、抗体又はその抗原結合断片を調製するために使用される産生プロセスに関して、必ずしも特定の関係性を意味するものではない。
ラクダ科動物由来抗体又はその抗原結合断片は、とりわけ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、ビクーニャ、グアナコ、又はラクダを含む、任意のラクダ科動物種に由来することができる。
ラクダ科動物由来VH及びVLドメイン、又はそのCDRを含む抗体分子は、通常、組換え発現されたポリペプチドであり、キメラポリペプチドであってもよい。「キメラポリペプチド」という用語は、それ以外の場合には隣接して生じることがない2以上のペプチド断片の並置によって作り出される人工的な(非天然の)ポリペプチドを指す。この定義に含まれるのは、2以上の種、すなわち、ラクダ科動物及びヒトによってコードされるペプチド断片の並置によって作り出される「種」キメラポリペプチドである。
ある実施態様において、VHドメイン全体及び/又はVLドメイン全体は、ラクダ科ファミリーの種から得ることができる。ラクダ科動物由来VHドメイン及び/又はラクダ科動物由来VLドメインは、その後、1以上のアミノ酸置換、挿入、又は欠失がラクダ科動物アミノ酸配列に導入されるタンパク質エンジニアリングに供することができる。
これらの人為的に作出された変化は、好ましくは、ラクダ科動物配列に対するアミノ酸置換を含む。そのような変化には、ラクダ科動物によってコードされるVH又はVLドメイン中の1以上のアミノ酸残基がヒトによってコードされる相同なVH又はVLドメイン由来の等価な残基と置き換えられる、「ヒト化」又は「生殖系列化」が含まれる。
ガレクチン-10によるラクダ科動物(すなわち、ラマ)の能動免疫によって得られる単離されたラクダ科動物VH及びVLドメインは、本発明に従って、ガルクチン-10に結合する抗体及び抗原結合断片を人為的に作出するための土台として使用することができる。インタクトのラクダ科動物VH及びVLドメインから出発して、出発ラクダ科動物配列から逸脱する1以上のアミノ酸置換、挿入、又は欠失を人為的に作出することが可能である。ある実施態様において、そのような置換、挿入、又は欠失は、VHドメイン及び/又はVLドメインのフレームワーク領域中に存在していてもよい。
他の実施態様において、ラクダ科動物由来VH及びVLドメイン(又はその人工変異体)並びに非ラクダ科動物抗体由来の1以上の定常ドメイン、例えば、ヒトによってコードされる定常ドメイン(又はその人工変異体)を含む「キメラ」抗体分子が提供される。そのような実施態様において、VHドメインとVLドメインは両方ともラクダ科動物の同じ種から得られることが好ましく、例えば、(人為的に作出されたアミノ酸配列変異の導入の前に)、VHとVLは両方ともラマ(Lama glama)に由来するものであってもよく、又はVHとVLは両方ともアルパカ(Lama pacos)に由来するものであってもよい。そのような実施態様において、VHドメインとVLドメインは両方とも、単一の動物、特に、対象となる抗原で能動免疫された単一の動物に由来してもよい。
ラクダ科VH及び/又はVLドメインの一次アミノ酸配列の変化を人為的に作出する代わりとして、個々のラクダ科動物由来超可変ループもしくはCDR、又はその組合せをラクダ科動物VH/VLドメインから単離し、CDR移植により、代わりの(すなわち、非ラクダ科)フレームワーク、例えば、ヒトVH/VLフレームワークに移すことができる。
非限定的な実施態様において、本明細書に記載される抗体は、CH1ドメイン及び/又はCLドメイン(それぞれ、重鎖及び軽鎖由来)を含むことができ、そのアミノ酸配列は、完全に又は実質的にヒトのものである。ヒトでの治療的使用が意図される抗体分子について、抗体の定常領域全体、又は少なくともその一部が完全に又は実質的にヒトのアミノ酸配列を有することが典型的である。それゆえ、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン、及びCLドメイン(及び存在する場合、CH4ドメイン)の1以上の又は任意の組合せは、そのアミノ酸配列に関して完全に又は実質的にヒトのものであってもよい。CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン、及び/又はCLドメイン(及び/又は存在する場合、CH4ドメイン)は、ヒト抗体、好ましくは、ヒトIgG抗体、より好ましくは、亜型IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4のヒトIgG1抗体に由来してもよい。
有利には、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン、及びCLドメイン(及び存在する場合、CH4ドメイン)は全て、完全に又は実質的にヒトのアミノ酸配列を有することができる。ヒト化もしくはキメラ抗体、又は抗体断片の定常領域との関連において、「実質的にヒトの」という用語は、ヒト定常領域との少なくとも90％、又は少なくとも92％、又は少なくとも95％、又は少なくとも97％、又は少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を指す。これに関連した「ヒトアミノ酸配列」という用語は、再配列され、かつ体細胞突然変異した生殖系列の遺伝子を含む、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を指す。本発明は、「完全ヒト」ヒンジ領域の存在が明示的に要求される実施態様を除いて、ヒト配列に関する1以上のアミノ酸付加、欠失、又は置換により改変されている「ヒト」配列の定常ドメインを含むポリペプチドも企図する。
ガレクチン-10に結合する抗体は、重鎖及び/又は軽鎖の定常領域内に、特に、Fc領域内に1以上のアミノ酸置換、挿入、又は欠失を有することができる。アミノ酸置換は、置換されるアミノ酸と、異なる天然のアミノ酸との又は非天然もしくは修飾アミノ酸との交換を生じさせることができる。他の構造的修飾、例えば、グリコシル化パターンの変化(例えば、N-結合型又はO-結合型グリコシル化部位の付加又は欠失によるもの)なども許容される。
抗体をFc領域内で修飾して、新生児受容体FcRnに対する結合親和性を増大させることができる。増大した結合親和性は、酸性pH(例えば、大体約pH 5.5～約pH 6.0)で測定可能であり得る。増大した結合親和性は、中性pH(例えば、約pH 6.9～約pH 7.4)でも測定可能であり得る。「増大した結合親和性」とは、未修飾のFc領域と比べたFcRnに対する増大した結合親和性を意味する。通常、未修飾のFc領域は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4の野生型アミノ酸配列を保有する。そのような実施態様において、修飾されたFc領域を有する抗体分子の増大したFcRn結合親和性は、FcRnに対する野生型IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4の結合親和性と比べて測定される。
ある実施態様において、Fc領域内の1以上のアミノ酸残基は、FcRnに対する結合を増大させるように異なるアミノ酸と置換することができる。FcRn結合を増大させ、それにより、抗体薬物動態を改善するいくつかのFc置換が報告されている。そのような置換は、例えば、その内容が本明細書中に完全に組み込まれる、Zalevskyらの文献(2010) Nat. Biotechnol. 28(2):157-9; Hintonらの文献(2006) J Immunol. 176:346-356; Yeungらの文献(2009) J Immunol. 182:7663-7671; Presta LGの文献(2008) Curr. Op. Immunol. 20:460-470;及びVaccaroらの文献(2005) Nat. Biotechnol. 23(10):1283-88に報告されている。
ある実施態様において、抗体は、アミノ酸置換H433K及びN434Fを含むか又は該アミノ酸置換からなる修飾されたヒトIgG Fcドメインを含み、ここで、Fcドメイン付番は、EU付番によるものである(Edelman, G.M.らの文献、Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85(1969)及びKabat, E.A.の文献; National Institutes of Health(U.S.) Office of the Director. 免疫学的に興味深いタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)、第5版; DIANE Publishing: Collingdale, PA, USA,(1991))。さらなる実施態様において、本明細書に記載される抗体は、アミノ酸置換M252Y、S254T、T256E、H433K、及びN434Fを含むか又は該アミノ酸置換からなる修飾されたヒトIgG Fcドメインを含み、ここで、Fcドメイン付番は、EU付番によるものである。好ましい実施態様において、本発明は、ガレクチン-10に結合する抗体(すなわち、抗ガレクチン-10抗体)を提供し、ここで、該抗体は、ABDEG(商標)技術を取り入れた少なくとも1つの変異体Fcドメインを含む。ABDEG(商標)技術を取り入れたABDEG(商標)抗体及びFcRnアンタゴニストは、自己免疫疾患などの抗体媒介性疾患の治療について記載されている(引用により本明細書中に組み込まれるWO2006/130834号及びWO2015/100299号を参照)。
変異体Fcドメイン又はFcRn結合断片に組み込まれ得るさらなるFcドメイン改変には、限定されるものではないが、その内容が引用により本明細書中に完全に組み込まれる、Ghetieらの文献、1997, Nat. Biotech. 15:637-40; Duncanらの文献、1988, Nature 332:563-564; Lundらの文献、1991, J. Immunol., 147:2657-2662; Lundらの文献、1992, Mol. Immunol., 29:53-59; Alegreらの文献、1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchinsらの文献、1995, Proc Natl. Acad Sci USA, 92:11980-11984; Jefferisらの文献、1995, Immunol Lett., 44:111-117; Lundらの文献、1995, Faseb J., 9:115-119; Jefferisらの文献、1996, Immunol Lett., 54:101-104; Lundらの文献、1996, J. Immunol., 157:4963-4969; Armourらの文献、1999, Eur J Immunol. 29:2613-2624; Idusogieらの文献、2000, J. Immunol., 164:4178-4184; Reddyらの文献、2000, J. Immunol., 164:1925-1933; Xuらの文献、2000, Cell Immunol., 200:16-26; Idusogieらの文献、2001, J. Immunol., 166:2571-2575; Shieldsらの文献、2001, J Biol. Chem., 276:6591-6604; Jefferisらの文献、2002, Immunol Lett., 82:57-65; Prestaらの文献、2002, Biochem Soc Trans., 30:487-490);米国特許第5,624,821号;第5,885,573号;第5,677,425号;第6,165,745号;第6,277,375号;第5,869,046号;第6,121,022号;第5,624,821号;第5,648,260号;第6,528,624号;第6,194,551号;第6,737,056号;第6,821,505号;第6,277,375号;米国特許公開2004/0002587号及びPCT公開WO 94/29351号; WO 99/58572号; WO 00/42072号; WO 02/060919号; WO 04/029207号; WO 04/099249号; WO 04/063351号に開示されているものも含まれる。
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、対応する野生型IgG配列と比べて、最大2個、最大3個、最大4個、最大5個、最大6個、最大7個、最大8個、最大9個、最大10個、最大12個、最大15個、最大20個の置換からなる修飾されたヒトIgG Fcドメインを含む。
本明細書に記載されるガレクチン-10抗体はいずれも、pH依存的抗原結合、すなわち、ガレクチン-10に対するpH依存的結合を示すことができる。
抗原に結合している抗体は、細胞内に取り込まれ、エンドソーム-リソソーム分解経路に輸送される。初期エンドソーム中でその抗原から解離することができる抗体は、再循環されて、細胞表面に戻ることができる。エンドソーム区画中でその抗原に高い親和性で結合する抗体は、通常、分解のためにリソソームに輸送される。抗体が、血漿pHと比較して、初期エンドソームpHでその抗原に対するより低い結合親和性を有するようなpH依存的抗原結合活性を有する場合、抗体は、より効率的に細胞表面に再循環されることが以前に示されている。これは、抗体血漿半減期を延長し、同じ抗体が複数の抗原に結合するのを可能にすることができる。こうした理由から、本明細書に記載される抗ガレクチン-10抗体がpH依存的抗原結合を示すことが有利である。本発明によるpH依存性抗ガレクチン-10抗体は、このタンパク質に結合することにより、ガレクチン-10を排除する能力を有する。その後、ガレクチン-10は、酸性のエンドソーム区画中で放出され、分解のためにリソソームに輸送されることができる。その後、本発明の遊離の抗ガレクチン-10抗体は、さらなるガレクチン-10に結合して、それを内在化させることができるように、細胞表面に再循環されることができる。
本発明の抗ガレクチン-10抗体は、内因性のpH依存的抗原結合活性を保有し得る、すなわち、それは、この性質について選択されたものであり得る。その代わりに又はそれに加えて、本明細書に記載される抗ガレクチン-10抗体は、pH依存的標的結合を示すように人為的に作出することができる。抗体分子中のpH依存的抗原結合活性を人為的に作出する方法は、例えば、引用により本明細書中に組み込まれるEP2275443号に記載されている。抗体分子中のpH依存的抗原結合を人為的に作出する方法は、引用により本明細書中に組み込まれるWO2018/206748号にも記載されている。本明細書に記載される抗体は、pH依存的結合を達成するように、任意の技法によって修飾することができる。例えば、該抗体は、pH依存的抗原結合を示すように、EP2275443号又はWO2018/206748号に記載されている方法に従って修飾することができる。
本明細書に記載される抗ガレクチン-10抗体のpH依存的実施態様について、抗原結合活性は、血漿pHでの抗原結合活性と比較して、エンドソームpHでより低い。エンドソームpHが、通常、酸性pHであるのに対し、血漿pHは、通常、中性pHである。したがって、本明細書に記載される抗体は、その抗原結合活性が、中性pHでの抗原結合活性と比較して、酸性pHでより低いようなpH依存的抗原結合を示し得る。エンドソームpH又は「酸性pH」は、約pH 4.0～約pH 6.5、好ましくは、約pH 5.5～約pH 6.5、好ましくは、約pH 5.5～約pH 6.0、好ましくは、pH 5.5、pH 5.6、pH 5.7、又はpH 5.8というpHであり得る。血漿pH又は「中性pH」は、約pH 6.9～約pH 8.0、好ましくは、約pH 7.0～約pH 8.0、好ましくは、約pH 7.0～約pH 7.4、好ましくは、pH 7.0又はpH 7.4のpHであり得る。
ある実施態様において、抗ガレクチン-10抗体は、pH 5.8での抗原結合活性がpH 7.4での抗原結合活性と比較してより低いようなpH依存的結合を示す。pH依存性抗ガレクチン-10抗体は、酸性pH又はpH 5.8での抗体-抗原相互作用の解離定数(KD)が中性pH又はpH 7.4での抗体-抗原相互作用の解離定数(KD)よりも高いことを特徴とし得る。ある実施態様において、抗ガレクチン-10抗体は、pH 5.8での抗原に対するKDとpH 7.4での抗原に対するKDの比(KD(pH5.8)/KD(pH7.4))が、2以上、4以上、6以上、8以上、10以上、12以上となるようなpH依存的結合を示す。
抗体分子のpH依存的抗原結合活性は、酸性pHでの抗原結合能を損ない、かつ/又は中性pHでの抗原結合能を増大させるように抗体分子を修飾することにより、人為的に作出することができる。例えば、抗体分子は、抗体分子の少なくとも1つのアミノ酸をヒスチジンと置換することによるか、又は少なくとも1つのヒスチジンを抗体分子に挿入することにより修飾することができる。そのようなヒスチジン突然変異(置換又は挿入)部位は、特には限定されず、突然変異又は挿入前と比較して、エンドソームpH(例えば、pH 5.8)での抗原結合活性が血漿pH(例えば、pH 7.4)での抗原結合活性よりも低い限り、任意の部位が許容される。
ある実施態様において、抗ガレクチン-10抗体は、可変ドメインへの1以上の置換の導入によって、pH依存的抗原結合を示すように人為的に作出することができる。好ましい実施態様において、抗ガレクチン-10抗体は、抗体の1以上のCDRへの1以上の置換の導入によって、pH依存的抗原結合を示すように人為的に作出される。置換は、pH依存的抗原結合を付与するために、1以上のHis残基を、可変ドメイン、好ましくは、重鎖及び/又は軽鎖CDRの1以上の部位に導入することができる。
抗体が3つの重鎖CDR配列と3つの軽鎖CDR配列を含む本発明の実施態様について、組み合わされる6つのCDRは、合計1～10個のHis置換、任意に、1～5個のHis置換、任意に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のHis置換からなることができる。抗ガレクチン-10抗体は、引用により本明細書中に組み込まれるWO2018/206748号に記載されている方法に従って人為的に作出することができる。非ヒスチジン置換を、本明細書に記載されるpH依存性抗体の可変ドメイン、特に、CDRに組み込むこともできる。
好ましい実施態様において、本明細書に列挙されている特定のCDR、VH、及び/又はVLドメイン配列を有する例示的な抗ガレクチン-10抗体は、それがpH依存的抗原結合を示すように人為的に作出される。例えば、本明細書に記載される例示的な抗ガレクチン-10抗体のCDR配列は、pH依存的抗原結合を示す抗体を産生するための1以上のヒスチジン置換の導入によって修飾することができる。
本明細書に記載される抗体は、細胞毒性剤、例えば、化学療法剤、毒素(すなわち、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性のある毒素、又はこれらの断片)、或いは放射性同位体(すなわち、放射性コンジュゲート)にコンジュゲートされた抗体を含む免疫コンジュゲートを形成するように修飾することもできる。Fc領域は、引用により本明細書中に組み込まれるChan及びCarterの文献(2010) Nature Reviews: Immunology 10:301-316により記載されているように、半減期延長のために人為的に作出することもできる。
また別の実施態様において、Fc領域は、抗体依存的細胞傷害性(ADCC)を媒介する抗体の能力を増大させるために及び/又は1以上のアミノ酸を修飾することによりFcγ受容体に対する抗体の親和性を増大させるために修飾される。
特定の実施態様において、Fc領域は、エフェクター機能がないように人為的に作出することができる。ある実施態様において、本発明の抗体分子は、低下したエフェクター機能を有する天然のIgGアイソタイプ、例えば、IgG4に由来するFc領域を有することができる。IgG4に由来するFc領域は、例えば、インビボでのIgG4分子間の腕の交換を最小限に抑える修飾の導入により、治療的有用性を増大させるようにさらに修飾することができる。IgG4に由来するFc領域は、S228P置換を含むように修飾することができる。
ある実施態様において、抗体分子は、グリコシル化に関して修飾される。例えば、アグリコシル化抗体を作製することができる(すなわち、抗体はグリコシル化を欠く)。グリコシル化は、例えば、標的抗原に対する抗体の親和性を増大させるように改変することができる。そのような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の1以上のグリコシル化部位を改変すること;により達成することができる。例えば、1以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の消失をもたらし、それにより、その部位でのグリコシル化を消失させる1以上のアミノ酸置換を行うことができる。そのようなアグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増大させることができる。
フコシル残基の量が低下している低フコシル化抗体又は完全にもしくは部分的に脱フコシル化されている抗体(Natsumeらの文献、Drug Design Development and Therapy, Vol.3, pp7-16, 2009に記載されているもの)或いはバイセクティングGlcNac構造が増加している抗体などの改変されたタイプのグリコシル化を有するガレクチン-10に結合する変異体抗体も想定される。そのような改変されたグリコシル化パターンは、抗体のADCC活性を増大させ、通常、「天然の」ヒトFcドメインを含む等価な抗体と比べて10倍のADCC増強を生じさせることが示されている。そのような炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化酵素装置(Yamane-Ohnuki及びSatohの文献mAbs 1:3, 230-236, 2009により記載されているもの)を有する宿主細胞で抗体を発現させることにより達成することができる。増強されたADCC機能を有する非フコシル化抗体の例は、BioWa社のPotelligent(商標)技術を用いて産生されるものである。
(ガレクチン-10に結合する例示的な抗体)
本発明は、ガレクチン-10に結合する例示的な抗体及び抗原結合断片を提供する。本発明の抗体及び抗原結合断片は、下記のように、もっぱらその構造的特徴に関して定義することができる。
本発明は、ガレクチン-10に結合する例示的な抗体及び抗原結合断片を提供する。本発明の抗体及び抗原結合断片は、下記のように、もっぱらその構造的特徴に関して定義することができる。
[クローンg24F02_N53A]
本明細書に提供されるのは、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片であり、ここで、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号2を含む又は配列番号2からなるHCDR3;配列番号3を含む又は配列番号3からなるHCDR2;配列番号1を含む又は配列番号1からなるHCDR1のCDR配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号8を含む又は配列番号8からなるLCDR3;配列番号9を含む又は配列番号9からなるLCDR2;配列番号7を含む又は配列番号7からなるLCDR1のCDR配列を含む。
本明細書に提供されるのは、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片であり、ここで、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号2を含む又は配列番号2からなるHCDR3;配列番号3を含む又は配列番号3からなるHCDR2;配列番号1を含む又は配列番号1からなるHCDR1のCDR配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号8を含む又は配列番号8からなるLCDR3;配列番号9を含む又は配列番号9からなるLCDR2;配列番号7を含む又は配列番号7からなるLCDR1のCDR配列を含む。
また本明細書に提供されるのは、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片であり、ここで、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号4のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号4のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号4との少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号4との少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号4との少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号4との少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号4との少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号4との少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号4との少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号4との少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号4との少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号4との少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号4のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号4のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号4のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号4のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号4のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号4のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号4のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号4のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号4のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号4のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで;
(i)該VHドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで;
(i)該VHドメインは、配列番号4のアミノ酸配列からなり;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列からなる。
(i)該VHドメインは、配列番号4のアミノ酸配列からなり;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列からなる。
[クローンg24F02]
さらに本明細書に提供されるのは、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片であり、ここで、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号2を含む又は配列番号2からなるHCDR3;配列番号5を含む又は配列番号5からなるHCDR2;配列番号1を含む又は配列番号1からなるHCDR1のCDR配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号8を含む又は配列番号8からなるLCDR3;配列番号9を含む又は配列番号9からなるLCDR2;配列番号7を含む又は配列番号7からなるLCDR1のCDR配列を含む。
さらに本明細書に提供されるのは、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片であり、ここで、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号2を含む又は配列番号2からなるHCDR3;配列番号5を含む又は配列番号5からなるHCDR2;配列番号1を含む又は配列番号1からなるHCDR1のCDR配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号8を含む又は配列番号8からなるLCDR3;配列番号9を含む又は配列番号9からなるLCDR2;配列番号7を含む又は配列番号7からなるLCDR1のCDR配列を含む。
また本明細書に提供されるのは、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片であり、ここで、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号6のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号6のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号6との少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号6との少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号6との少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号6との少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号6との少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号6との少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号6との少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号6との少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号6との少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号6との少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号6のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号6のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号6のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号6のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号6のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号6のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号6のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号6のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号6のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号6のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで;
(i)該VHドメインは、配列番号6のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号6のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで;
(i)該VHドメインは、配列番号6のアミノ酸配列からなり;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列からなる。
(i)該VHドメインは、配列番号6のアミノ酸配列からなり;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列からなる。
[クローンg23H09]
さらに本明細書に提供されるのは、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片であり、ここで、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号12を含む又は配列番号12からなるHCDR3;配列番号13を含む又は配列番号13からなるHCDR2;配列番号11を含む又は配列番号11からなるHCDR1のCDR配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号8を含む又は配列番号8からなるLCDR3;配列番号9を含む又は配列番号9からなるLCDR2;配列番号7を含む又は配列番号7からなるLCDR1のCDR配列を含む。
さらに本明細書に提供されるのは、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片であり、ここで、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号12を含む又は配列番号12からなるHCDR3;配列番号13を含む又は配列番号13からなるHCDR2;配列番号11を含む又は配列番号11からなるHCDR1のCDR配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号8を含む又は配列番号8からなるLCDR3;配列番号9を含む又は配列番号9からなるLCDR2;配列番号7を含む又は配列番号7からなるLCDR1のCDR配列を含む。
また本明細書に提供されるのは、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片であり、ここで、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号14のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号14のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号14との少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号14との少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号14との少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号14との少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号14との少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号14との少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号14との少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号14との少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号14との少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号14との少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号14のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号14のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号14のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号14のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号14のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号14のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号14のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号14のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号14のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号14のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで;
(i)該VHドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで;
(i)該VHドメインは、配列番号14のアミノ酸配列からなり;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列からなる。
(i)該VHドメインは、配列番号14のアミノ酸配列からなり;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列からなる。
[クローンg18C06]
さらに本明細書に提供されるのは、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片であり、ここで、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号16を含む又は配列番号16からなるHCDR3;配列番号17を含む又は配列番号17からなるHCDR2;配列番号15を含む又は配列番号15からなるHCDR1のCDR配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号20を含む又は配列番号20からなるLCDR3;配列番号21を含む又は配列番号21からなるLCDR2;配列番号19を含む又は配列番号19からなるLCDR1のCDR配列を含む。
さらに本明細書に提供されるのは、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片であり、ここで、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号16を含む又は配列番号16からなるHCDR3;配列番号17を含む又は配列番号17からなるHCDR2;配列番号15を含む又は配列番号15からなるHCDR1のCDR配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号20を含む又は配列番号20からなるLCDR3;配列番号21を含む又は配列番号21からなるLCDR2;配列番号19を含む又は配列番号19からなるLCDR1のCDR配列を含む。
また本明細書に提供されるのは、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片であり、ここで、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号18のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号18のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号18との少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号18との少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号18との少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号18との少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号18との少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号18との少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号18との少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号18との少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号18との少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号18との少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号18のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22との少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号18のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22との少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号18のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22との少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号18のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22との少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号18のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22との少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号18のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22との少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号18のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22との少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号18のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22との少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号18のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22との少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号18のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22との少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで;
(i)該VHドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで;
(i)該VHドメインは、配列番号18のアミノ酸配列からなり;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22のアミノ酸配列からなる。
(i)該VHドメインは、配列番号18のアミノ酸配列からなり;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号22のアミノ酸配列からなる。
[クローンg20H09]
さらに本明細書に提供されるのは、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片であり、ここで、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号12を含む又は配列番号12からなるHCDR3;配列番号23を含む又は配列番号23からなるHCDR2;配列番号11を含む又は配列番号11からなるHCDR1のCDR配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号8を含む又は配列番号8からなるLCDR3;配列番号9を含む又は配列番号9からなるLCDR2;配列番号7を含む又は配列番号7からなるLCDR1のCDR配列を含む。
さらに本明細書に提供されるのは、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片であり、ここで、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号12を含む又は配列番号12からなるHCDR3;配列番号23を含む又は配列番号23からなるHCDR2;配列番号11を含む又は配列番号11からなるHCDR1のCDR配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号8を含む又は配列番号8からなるLCDR3;配列番号9を含む又は配列番号9からなるLCDR2;配列番号7を含む又は配列番号7からなるLCDR1のCDR配列を含む。
また本明細書に提供されるのは、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片であり、ここで、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号24のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号24のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号24との少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号24との少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号24との少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号24との少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号24との少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号24との少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号24との少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号24との少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号24との少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号24との少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号24のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号24のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号24のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号24のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号24のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号24のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号24のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号24のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインは、配列番号24のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号24のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10との少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで;
(i)該VHドメインは、配列番号24のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。
(i)該VHドメインは、配列番号24のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、該抗体又は抗原結合断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで;
(i)該VHドメインは、配列番号24のアミノ酸配列からなり;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列からなる。
(i)該VHドメインは、配列番号24のアミノ酸配列からなり;かつ
(ii)該VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列からなる。
抗体又は抗原結合断片のドメインが参照配列に対する特定のパーセンテージ配列同一性によって定義される実施態様について、VH及び/又はVLドメインは、変異がフレームワーク領域内にのみ存在するように、参照配列中に存在するものと同一のCDR配列を保持することができる。代わりの実施態様において、CDR配列は、参照配列に対するアミノ酸置換(例えば、保存的置換、ヒト化置換、又は親和性変異体)を含むこともできる。
本発明は、本明細書で例示されるガレクチン-10抗体と同じエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片も提供する。
ある実施態様において、上で列挙されたCDR配列を有すると定義されているか又は上で列挙された特定のVH/VLドメインアミノ酸配列との特定のパーセンテージ同一性を有すると定義されている例示的な抗体及び抗原結合断片は、該CDR、VH、及び/又はVL配列が由来する抗体又はその抗原結合断片のヒト化、生殖系列化、又は親和性変異体である。
好ましい実施態様において、例えば、高いヒト相同性を示す上で列挙されたCDR配列を有する例示的な抗体分子は、該CDR配列が由来する抗体又はその抗原結合断片のヒト化又は生殖系列化変異体である。
ヒトでの治療的使用が意図される抗体分子について、抗体の定常領域全体又はその少なくとも一部が完全に又は実質的にヒトのアミノ酸配列を有することが典型的である。それゆえ、一実施態様において、Fc領域は、そのアミノ酸配列に関して完全に又は実質的にヒトのものであってもよい。ヒト化もしくはキメラ抗体、又は抗体断片の定常領域との関連において、「実質的にヒトの」という用語は、ヒト定常領域との少なくとも90％、又は少なくとも92％、又は少なくとも95％、又は少なくとも97％、又は少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を指す。これに関連した「ヒトアミノ酸配列」という用語は、再配列され、かつ体細胞突然変異した生殖系列の遺伝子を含む、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を指す。本発明は、「完全ヒト」ヒンジ領域の存在が明示的に要求される実施態様を除いて、ヒト配列に関する1以上のアミノ酸付加、欠失、又は置換により改変されている「ヒト」配列の定常ドメインを含むポリペプチドも企図する。本明細書に記載される例示的なFc領域修飾はいずれも、上で列挙されたCDR及び/又はVH/VLドメイン配列を有する抗体に組み込むことができる。ある実施態様において、上で列挙されたCDR及び/又はVH/VLドメイン配列を有する抗体は、アミノ酸置換H433K及びN434Fを含むか又は該アミノ酸置換からなる修飾されたヒトIgG Fcドメインを含み、ここで、Fcドメイン付番は、EU付番によるものである。ある実施態様において、上で列挙されたCDR及び/又はVH/VLドメイン配列を有する抗体は、アミノ酸置換M252Y、S254T、T256E、H433K、及びN434Fを含むか又は該アミノ酸置換からなる修飾されたヒトIgG Fcドメインを含む。
(D.ガレクチン-10に結合する抗体をコードするポリヌクレオチド)
本発明はまた、本発明のガレクチン-10抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。全長ガレクチン-10抗体をコードするポリヌクレオチド分子が、本明細書に記載されるガレクチン-10抗体の断片、例えば、VH及び/又はVLドメインをコードするポリヌクレオチド分子とともに提供される。また提供されるのは、宿主細胞又は無細胞発現系における該抗体又はその断片の発現を可能にする調節配列に機能的に連結された本発明の該ヌクレオチド配列を含有する発現ベクター、及びこの発現ベクターを含有する宿主細胞又は無細胞発現系である。
本発明はまた、本発明のガレクチン-10抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。全長ガレクチン-10抗体をコードするポリヌクレオチド分子が、本明細書に記載されるガレクチン-10抗体の断片、例えば、VH及び/又はVLドメインをコードするポリヌクレオチド分子とともに提供される。また提供されるのは、宿主細胞又は無細胞発現系における該抗体又はその断片の発現を可能にする調節配列に機能的に連結された本発明の該ヌクレオチド配列を含有する発現ベクター、及びこの発現ベクターを含有する宿主細胞又は無細胞発現系である。
本発明のガレクチン-10抗体をコードするポリヌクレオチド分子には、例えば、組換えDNA分子が含まれる。「核酸」、「ポリヌクレオチド」、又は「ポリヌクレオチド分子」という用語は、本明細書で互換的に使用されており、かつ一本鎖又は二本鎖のいずれかの任意のDNA又はRNA分子、及び一本鎖の場合、その相補的配列の分子を指す。核酸分子を議論する際、特定の核酸分子の配列又は構造は、5'から3'の方向に配列を提供する通常の慣例に従って、本明細書に記載され得る。本発明のいくつかの実施態様において、核酸又はポリヌクレオチドは「単離された」ものである。この用語は、核酸分子に適用される場合、それが由来した生物の天然のゲノム中で直接隣接している配列から分離されている核酸分子を指す。例えば、「単離された核酸」は、プラスミド又はウイルスベクターなどのベクターに挿入されているか、或いは原核もしくは真核細胞又は非ヒト宿主生物のゲノムDNAに組み込まれているDNA分子を含むことができる。RNAに適用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」は、主に、上で定義されている単離されたDNA分子によってコードされるRNA分子を指す。或いは、この用語は、その天然状態で(すなわち、細胞又は組織内で)関連しているであろう他の核酸から精製/分離されているRNA分子を指すことができる。単離されたポリヌクレオチド(DNA又はRNAのいずれか)は、生物学的又は合成的手段により直接産生され、かつその産生時に存在する他の構成要素から分離された分子をさらに表すことができる。
本発明によるガレクチン-10抗体の組換え産生のために、それをコードする組換えポリヌクレオチド又は異なる鎖もしくはドメインをコードする組換えポリヌクレオチドを(標準的な分子生物学技法を用いて)調製し、選ばれた宿主細胞又は無細胞発現系における発現用の複製可能なベクターに挿入することができる。好適な宿主細胞は、原核生物、酵母、高等真核生物細胞、具体的には、哺乳動物であることができる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7、ATCC CRL 1651);ヒト胎児腎臓株(懸濁培養での増殖用にサブクローニングされた293又は293細胞、Grahamらの文献、J. Gen. Virol. 36:59(1977));ベイビーハムスター腎臓細胞(BHK、ATCC CCL 10);チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO、Urlaubらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980));マウスセルトリ細胞(TM4、Matherの文献、Biol. Reprod. 23:243-251(1980));マウス骨髄腫細胞SP2/0-AG14(ATCC CRL 1581; ATCC CRL 8287)又はNS0(HPAカルチャーコレクション第85110503号);サル腎臓細胞(CV1 ATCC CCL 70);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76、ATCC CRL-1587);ヒト子宮頸癌細胞(HELA、ATCC CCL 2);イヌ腎臓細胞(MDCK、ATCC CCL 34);バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442);ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75);ヒト肝臓細胞(Hep G2、HB 8065);マウス乳腺腫瘍(MMT 060562、ATCC CCL51); TRI細胞(Matherらの文献、Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982)); MRC 5細胞; FS4細胞;及びヒト肝癌株(Hep G2)、並びにDSMのPERC-6 細胞株である。これらの宿主細胞の各々で使用するのに好適な発現ベクターも当技術分野で一般に公知である。
「宿主細胞」という用語は、一般に、培養細胞株を指すことに留意すべきである。本発明による抗原結合ポリペプチドをコードする発現ベクターが導入されているヒト全体は、「宿主細胞」の定義から明白に除外される。
(E.抗体産生)
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体を産生する方法であって、該抗体の発現を可能にする条件下で該抗体をコードするポリヌクレオチド(例えば、発現ベクター)を含有する宿主細胞(又は無細胞発現系)を培養すること、及び発現された抗体を回収することを含む、方法も提供する。この組換え発現プロセスは、ヒトでの治療的使用が意図されるモノクローナル抗体を含む、本発明によるガレクチン-10抗体を含む抗体の大規模産生に使用することができる。インビボでの治療的使用に好適な組換え抗体の大規模産生のための好適なベクター、細胞株、及び産生プロセスは、通常、当技術分野で利用可能であり、かつ当業者に周知である。
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体を産生する方法であって、該抗体の発現を可能にする条件下で該抗体をコードするポリヌクレオチド(例えば、発現ベクター)を含有する宿主細胞(又は無細胞発現系)を培養すること、及び発現された抗体を回収することを含む、方法も提供する。この組換え発現プロセスは、ヒトでの治療的使用が意図されるモノクローナル抗体を含む、本発明によるガレクチン-10抗体を含む抗体の大規模産生に使用することができる。インビボでの治療的使用に好適な組換え抗体の大規模産生のための好適なベクター、細胞株、及び産生プロセスは、通常、当技術分野で利用可能であり、かつ当業者に周知である。
(F.医薬組成物)
本発明は、1以上の医薬として許容し得る担体又は賦形剤とともに製剤化された、ガレクチン-10抗体又はその抗原結合断片のうちの1つ又は組合せを含有する医薬組成物を含む。そのような組成物は、1つ又は組合せの(すなわち、2以上の異なる)ガレクチン-10抗体を含むことができる。ヒトでの治療的使用のためのモノクローナル抗体を製剤化するための技法は、当技術分野で周知であり、例えば、その内容が本明細書中に完全に組み込まれる、Wangらの文献、Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol.96, pp1-26, 2007で概説されている。
本発明は、1以上の医薬として許容し得る担体又は賦形剤とともに製剤化された、ガレクチン-10抗体又はその抗原結合断片のうちの1つ又は組合せを含有する医薬組成物を含む。そのような組成物は、1つ又は組合せの(すなわち、2以上の異なる)ガレクチン-10抗体を含むことができる。ヒトでの治療的使用のためのモノクローナル抗体を製剤化するための技法は、当技術分野で周知であり、例えば、その内容が本明細書中に完全に組み込まれる、Wangらの文献、Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol.96, pp1-26, 2007で概説されている。
本発明による医薬組成物は、単独で、又は同時もしくは順次のいずれかで他の治療と組み合わせて、投与することができる。
組成物を製剤化するために使用し得る医薬として許容し得る賦形剤としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば、プロタミン硫酸塩、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質(例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム)、ポリエチレングリコール、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン-ポリオキシプロピレン-ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂:が挙げられるが、これらに限定されない。
ある実施態様において、組成物は、限定されないが、筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内注射、皮下、硬膜外、経鼻、口腔、直腸、局所、吸入、口腔内(例えば、舌下)、及び経皮投与を含む、任意の好適な投与経路を介する対象への投与のために製剤化される。
好ましい実施態様において、投与経路は、吸入によるものである。好適には、本発明の組成物は、吸入用の粉末として又は吸入用のエアロゾル化された液体として製剤化することができる。好適には、本発明による組成物は、乾燥粉末として製剤化されてもよい。或いは、本発明による組成物は、噴霧される液体エアロゾル又は液体スプレーとして製剤化されてもよい。
組成物の吸入投与のための手段及び装置は、当技術分野で周知である。組成物の吸入投与は、例えば、ネブライザーを介して達成することができる。ネブライザーは、薬剤を肺に吸入されるミストとして投与するために使用される薬物送達装置である。代替法において、吸入器を用いて、本発明の組成物を投与することができる。吸入器は、薬剤を吸入を介して肺に送達する薬物送達装置である。いくつかのタイプの吸入器が当技術分野で周知であり、これには、例えば、定量吸入器(MDI)、乾燥粉末吸入器(DPI)、及びソフトミスト吸入器(SMI)が含まれる。
(G.治療方法)
本明細書に記載されるガレクチン-10に結合する抗体及び抗原結合断片は、治療方法において使用することができる。したがって、本発明は、薬剤として使用するためのガレクチン-10に結合する抗体及び抗原結合断片を提供する。或いは、本明細書に提供されるのは、治療方法において使用するためのガレクチン-10に結合する抗体及び抗原結合断片である。薬剤として使用するためのものである本発明の抗体及び抗原結合断片は、通常、医薬組成物として製剤化される。
本明細書に記載されるガレクチン-10に結合する抗体及び抗原結合断片は、治療方法において使用することができる。したがって、本発明は、薬剤として使用するためのガレクチン-10に結合する抗体及び抗原結合断片を提供する。或いは、本明細書に提供されるのは、治療方法において使用するためのガレクチン-10に結合する抗体及び抗原結合断片である。薬剤として使用するためのものである本発明の抗体及び抗原結合断片は、通常、医薬組成物として製剤化される。
重要なことに、抗体及び抗原結合断片に関する上記の全ての実施態様は、本明細書に記載される方法に等しく適用可能である。
本発明はまた、それを必要としている対象を治療する方法であって、該対象に、本明細書中の別所に記載される抗体又は抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。そのような治療方法において、該抗体及び抗原結合断片は、通常、医薬組成物として製剤化される。本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、治療効果を生じるのに十分であるガレクチン-10抗体の分量又は用量、例えば、疾患又は疾病と関連する症状を根絶するか又は少なくとも緩和するために必要とされるアンタゴニストの分量又は用量を意味することが意図される。適当な量又は用量は、必要に応じて、医師により決定されることができる。例えば、該用量は、治療されることになる対象のサイズ又は重量、治療されることになる対象の年齢、治療されることになる対象の全身の健康状態、治療されることになる疾病、及び投与経路などの因子に基づいて調整することができる。
臨床的使用のために、ある実施態様において、本明細書中の別所に記載されるガレクチン-10抗体又は抗原結合断片は、約0.1mg/kg体重～約20mg/kg体重の1以上の用量として対象に投与される。ある実施態様において、本明細書中の別所に記載される該抗体又は抗原結合断片は、約0.1mg/kg体重～約10mg/kg体重の用量で対象に投与される。ある実施態様において、本明細書中の別所に記載される該抗体又は抗原結合断片は、約0.5mg/kg体重～約10mg/kg体重の用量で対象に投与される。ある実施態様において、本明細書中の別所に記載される該抗体又は抗原結合断片は、約1mg/kg体重～約10mg/kg体重の用量で対象に投与される。
ガレクチン-10に結合する抗体及び抗原結合断片は、ガレクチン-10結晶化を中断させることができるという理由で、治療方法において有用である。本明細書中の別所で説明されているように、本発明の抗体は、ガレクチン-10のエピトープに結合し、それにより、ガレクチン-10の結晶化を中断させる。ある実施態様において、該抗体及び抗原結合断片は、ガレクチン-10の結晶化を阻害する。ある実施態様において、該抗体及び抗原結合断片は、結晶性ガレクチン-10の溶解を促進する。
ガレクチン-10抗体及びその抗原結合断片は、ガレクチン-10結晶又はCLCの存在又は形成と関連する疾患又は疾病を予防又は治療する際に使用するためのものであることができる。本明細書に提供されるのは、ガレクチン-10抗体又はその抗原結合断片の有効量を投与することにより、それを必要としている患者又は対象におけるガレクチン-10結晶又はCLCの存在又は形成と関連する疾患又は疾病を予防又は治療する方法である。
本明細書で使用される場合、疾患又は疾病を「予防する」方法は、疾患の発症を予防すること、症状の悪化を予防すること、疾患もしくは疾病の進行を予防すること、又は疾患もしくは疾病を発症する対象のリスクを軽減することを意味する。本明細書で使用される場合、疾患又は疾病を「治療する」方法は、疾患もしくは疾病を治癒させること、及び/又は患者の苦しみが軽減されるように、疾患もしくは疾病と関連する症状を緩和もしくは根絶することを意味する。
ガレクチン-10結晶の存在を特徴とする疾患又は疾病を有する患者について、治療方法は、通常、患者の組織中にあるガレクチン-10結晶を溶解させることができる、ガレクチン-10抗体又はその抗原結合断片の投与を含む。ガレクチン-10結晶の形成を特徴とする疾患又は疾病を発症する「リスクがある」と特定された患者について、予防方法は、ガレクチン-10の結晶化を阻害することができる、ガレクチン-10抗体又はその抗原結合断片の投与を含むことができる。
ガレクチン-10結晶又はCLCは、様々な疾患及び疾病を有する患者で観察されている。したがって、本明細書に記載されるガレクチン-10アンタゴニストは、喘息;慢性副鼻腔炎;セリアック病;蠕虫感染症;消化管好酸球性炎症;嚢胞性線維症(CF);アレルギー性気管支肺アスペルギルス症(ABPA);チャーグ・ストラウス血管炎;慢性好酸球性肺炎;及び急性骨髄性白血病(AML):からなる群から選択される疾患又は疾病を予防又は治療するために使用することができるということになる。好ましい実施態様において、ガレクチン-10抗体又はその抗原結合断片は、喘息;慢性副鼻腔炎;セリアック病;蠕虫感染症;消化管好酸球性炎症;嚢胞性線維症(CF);アレルギー性気管支肺アスペルギルス症(ABPA);チャーグ・ストラウス血管炎;慢性好酸球性肺炎;及び急性骨髄性白血病(AML):からなる群から選択される疾患又は疾病を予防又は治療するために使用される。
上述のように、ガレクチン-10結晶又はCLCは、特に、好酸球性炎症を特徴とする疾患又は疾病と関連している。それゆえ、好ましい実施態様において、本明細書に記載されるガレクチン-10抗体又はその抗原結合断片は、好酸球性炎症と関連する障害又は疾病を治療するために使用される。
特定の好ましい実施態様において、本明細書に記載されるガレクチン-10抗体又はその抗原結合断片は、喘息を予防又は治療するために使用される。喘息患者の気道及び肺の解析により、CLCの存在が示された(Persson EK、Verstraete K、Heyndrickx Iらの文献、タンパク質結晶化は2型免疫を促進し、かつ抗体処理によって可逆的となる(Protein crystallization promotes type 2 immunity and is reversible by antibody treatment)。Science. 2019;364(6442))。それゆえ、本発明の抗体は、ガレクチン-10のエピトープに結合し、それにより、ガレクチン-10の結晶化を中断させる。これは、次に、喘息患者の気道及び肺におけるCLC形成を予防する。
臨床的には、喘息は、息切れ及び喘鳴をもたらす可逆的な気道閉塞及び気道過敏性を特徴とする。多くの場合、吸入ステロイド及び気管支拡張薬で治療可能であるが、患者のサブグループは、致命的な発作をもたらす可能性がある、頻繁な入院を必要とする重度の治療抵抗性疾患を有する(Braido Fの文献、喘息制御の失敗:理由及び結果(Failure in asthma control: reasons and consequences). Scientifica(Cairo) 2013;2013:549252)。病理学的には、この疾患は、気道好酸球増多と小気道の不可逆的閉塞をもたらし得る濃厚粘液の過剰産生とを特徴とする(Zhang L、He L、Gong J、Liu Cの文献、喘息における不可逆的気道閉塞に関連する危険因子:システマティックレビュー及びメタアナリシス(Risk Factors Associated with Irreversible Airway Obstruction in Asthma: A Systematic Review and Meta-Analysis). Biomed Res Int. 2016;2016:9868704)。ほとんどの場合、この疾患は、2型免疫細胞(CD4 Th2リンパ球及び2型自然リンパ系細胞(ILC2))の免疫応答によって引き起こされ、IL-4(杯細胞化生及びIgE合成を刺激する)、IL-5(組織好酸球増多を促進する)、並びにIL-13(気管支過敏症及び杯細胞化生を引き起こす)の産生をもたらす(Lambrecht BN、Hammad Hの文献、喘息の免疫学(The immunology of asthma). Nat Immunol. 2015;16(1):45-56)。
いくつかの実施態様において、喘息は、アレルギー性喘息として特徴付けられる。アレルギー性喘息は、誘導気道の慢性炎症性疾患であり、ヨーロッパでは8～12％の人々が罹患している(Selroos O、Kupczyk M、Kuna Pらの文献、ヨーロッパにおける国及び地域の喘息プログラム(National and regional asthma programmes in Europe). Eur Respir Rev. 2015;24(137):474-483).
他の特定の好適な実施態様において、本明細書に記載されるガレクチン-10抗体又はその抗原結合断片は、嚢胞性線維症(CF)を予防又は治療するために使用される。
本発明はまた、患者から得られた試料中のガレクチン-10の検出のためのガレクチン-10抗体又はその抗原結合断片の使用を提供する。該抗体又はその抗原結合断片は、通常、結晶性ガレクチン-10を検出するために使用される。上述のように、ガレクチン-10結晶又はCLC結晶は、いくつかの異なる疾患及び疾病を有する患者で観察されている。したがって、患者試料は、以下の疾患又は疾病:喘息、慢性副鼻腔炎、セリアック病、蠕虫感染症、消化管好酸球性炎症、嚢胞性線維症(CF)、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症(ABPA)、チャーグ・ストラウス血管炎、慢性好酸球性肺炎、又は急性骨髄性白血病(AML)のうちのいずれか1つを有するか又はそれを有することが疑われる対象から得ることができるということになる。患者試料中の結晶性ガレクチン-10の検出は、試料が得られた対象の疾患又は疾病を診断するために使用することができる。該試料は、任意の好適な患者試料、例えば、CLCが疾患状態で観察される任意の流体又は組織であることができる。ある実施態様において、該試料は、ポリープ、例えば、鼻ポリープから得られる組織試料である。ある実施態様において、該試料は、粘液試料である。そのような実施態様において、本発明の抗体又はその抗原結合断片を用いる粘液試料中の結晶性ガレクチン-10の検出は、慢性副鼻腔炎を検出又は診断するために使用することができる。好ましい実施態様において、患者試料は、喀痰試料である。そのような実施態様において、本発明の抗体又はその抗原結合断片を用いる喀痰試料中の結晶性ガレクチン-10の検出は、喘息を検出又は診断するために使用することができる。
(H.キット)
本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片はいずれも、キットとしてパッケージングすることができ、かつ任意に使用説明書を含む。
本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片はいずれも、キットとしてパッケージングすることができ、かつ任意に使用説明書を含む。
(実施例)
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照して、さらに理解されるであろう。
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照して、さらに理解されるであろう。
(背景及び目的)
クローン7B07は、WO 2019/197675号で記載された。このクローンは、組換えシャルコー・ライデン結晶((CLC)、ガレクチン-10(GAL10)結晶とも呼ばれる)に結合し、それを溶解させることが観察された。相補性決定領域(CDR)移植による生殖系列化プロセスは、このクローンの結合と効力に影響を及ぼさなかった。しかしながら、安定性試験により、重鎖のCDR2中の脱アミド化部位(N53G54)が同定され、これは、25℃と37℃のインキュベーション温度で結合と効力の低下を引き起こした。この問題を克服するために、重鎖のCDR2中のN53及びG54に点突然変異を有する生殖系列化7B07(g7B07)クローンの変異体を作製した。これらのg7B07突然変異体が組換えCLCを溶解させる効力は維持されたが、全ての突然変異は、結合特性の低下をもたらした。
クローン7B07は、WO 2019/197675号で記載された。このクローンは、組換えシャルコー・ライデン結晶((CLC)、ガレクチン-10(GAL10)結晶とも呼ばれる)に結合し、それを溶解させることが観察された。相補性決定領域(CDR)移植による生殖系列化プロセスは、このクローンの結合と効力に影響を及ぼさなかった。しかしながら、安定性試験により、重鎖のCDR2中の脱アミド化部位(N53G54)が同定され、これは、25℃と37℃のインキュベーション温度で結合と効力の低下を引き起こした。この問題を克服するために、重鎖のCDR2中のN53及びG54に点突然変異を有する生殖系列化7B07(g7B07)クローンの変異体を作製した。これらのg7B07突然変異体が組換えCLCを溶解させる効力は維持されたが、全ての突然変異は、結合特性の低下をもたらした。
結果として、クローン7B07と比較してより好ましい特性を有する抗ガレクチン-10(抗Gal10)化合物をさらに同定するために、3つの発見キャンペーンを開始した。
(実施例1. Gal10に結合する組換え抗体の選択)
(1.1 7B07エピトープキャンペーン)
(ファージディスプレイによるGal10上の7B07エピトープに結合するクローンの選択)
ヒトGal10に対する適当な結合能を有するscFvクローンを選択するために、ファージパニングアプローチを使用した。クローン7B07と類似したGal10上の領域に結合するクローンを選択するために、競合設定を使用した。
(1.1 7B07エピトープキャンペーン)
(ファージディスプレイによるGal10上の7B07エピトープに結合するクローンの選択)
ヒトGal10に対する適当な結合能を有するscFvクローンを選択するために、ファージパニングアプローチを使用した。クローン7B07と類似したGal10上の領域に結合するクローンを選択するために、競合設定を使用した。
この設定では、チロシン69残基を標的とする抗ヒト特異的クローン1D11をMaxisorpプレートにコーティングして、Gal10-Hisを捕捉した。Gal10を1D11で捕捉することには、7B07エピトープに結合するクローンを選択する上で2つの利点があった。第一の利点は、1D11が7B07とは反対のGal10上の部位に結合するので、7B07エピトープがGal10に対するscFvを発現するファージにとって利用可能であることであった。第二の利点は、チロシン69に結合するクローン(クローン1D11)でGal10-Hisを捕捉することにより、このエピトープがマスクされることであった。これは、選択キャンペーン中に、ほとんどのクローンが1D11エピトープの近くに結合しているように見えたという理由で関連している。結合したファージの溶出は、トリプシン(非特異的溶出)によるか、又は高濃度の7B07 IgGとの競合溶出(クローン7B07と同様の結合領域に結合するscFvを発現するファージの特異的溶出)によって行った。
2つのラマ由来scFvライブラリー(ラムダ及びカッパ)を用いて、Gal10に対する結合活性を有するscFvクローンについて選択した。2ラウンドの選択により、ヒトGal10に特異的なscFvを発現するファージが明らかに濃縮された。PBS対照と同様の濃縮(最大100倍)が観察された。
(Gal10特異的バインダーのスクリーニング)
2つのマスタープレートをトリプシンと7B07による競合溶出の両方が使用されたGal10の7B07エピトープに対する第二ラウンドの選択の後に作製した。マスタープレート18(MP18)をラムダライブラリーの第二ラウンドの選択から作製し、その場合、競合溶出を第一ラウンドから実施した。マスタープレート19(MP19)を他の全ての条件から作製し、その場合、溶出をトリプシン又は7B07を用いて実施した(表3)。これらのマスタープレートから、ペリプラズム抽出物(scFv)を作製し、Gal10に対するその結合能をELISA及びBiacoreによって解析した。
表3: Gal10上の7B07エピトープに対する選択キャンペーン後に作製されたマスタープレート(MP)の概要
2つのマスタープレートをトリプシンと7B07による競合溶出の両方が使用されたGal10の7B07エピトープに対する第二ラウンドの選択の後に作製した。マスタープレート18(MP18)をラムダライブラリーの第二ラウンドの選択から作製し、その場合、競合溶出を第一ラウンドから実施した。マスタープレート19(MP19)を他の全ての条件から作製し、その場合、溶出をトリプシン又は7B07を用いて実施した(表3)。これらのマスタープレートから、ペリプラズム抽出物(scFv)を作製し、Gal10に対するその結合能をELISA及びBiacoreによって解析した。
(scFvペリプラズム抽出物のスクリーニング)
ペリプラズム抽出物の結合能をELISA(7B07との結合及び競合)並びに表面プラズモン共鳴(SPR)によって解析した。
ペリプラズム抽出物の結合能をELISA(7B07との結合及び競合)並びに表面プラズモン共鳴(SPR)によって解析した。
(ELISAによる結合スクリーニング)
ヒトGal10に対するscFv(ペリプラズム抽出物)の結合能をELISAによって解析した。この実験では、0.3以上のODを有するクローンをGal10バインダーとして分類した。合計で、48個のGal10特異的クローンが同定された。
ヒトGal10に対するscFv(ペリプラズム抽出物)の結合能をELISAによって解析した。この実験では、0.3以上のODを有するクローンをGal10バインダーとして分類した。合計で、48個のGal10特異的クローンが同定された。
(ELISAによる競合スクリーニング)
次に、Gal10上のscFvの標的結合領域を、クローン7B07に対するクローンの競合を調べる追加のELISAによって解析した。この設定では、Gal10を7B07でコーティングされたMaxisorpプレート上に捕捉した。それゆえ、Gal10上のクローン7B07と類似した結合位置を有するクローンは結合することができず、低いOD値を示すが、他の領域に結合するクローンは高いOD値を示すことが予想された。
次に、Gal10上のscFvの標的結合領域を、クローン7B07に対するクローンの競合を調べる追加のELISAによって解析した。この設定では、Gal10を7B07でコーティングされたMaxisorpプレート上に捕捉した。それゆえ、Gal10上のクローン7B07と類似した結合位置を有するクローンは結合することができず、低いOD値を示すが、他の領域に結合するクローンは高いOD値を示すことが予想された。
結合及び競合ELISA実験の解析から、25個のクローンは、Gal10結合について、クローン7B07と競合することが明らかになった。これらのクローンは、結合ELISAではOD値＞0.3、競合ELISAではOD値＜0.1を示した。
(SPR(Biacore 3000)でのオフレートスクリーニング)
ELISA実験の残りの25個のクローンのオフレートをBiacore 3000装置でのSPRによって決定した。ペリプラズム抽出物を2500RUのGal10-HisでコーティングされたCM5センサーチップ上に注入した。11個のクローンは、クローン7B07(2.18E-03 1/s)と比較して、少なくとも2倍のオフレートの改善を示し、これらのクローンをさらなる特性解析のために選択した(表4)。
表4: scFvペリプラズム抽出物のオフレート。この表は、各々のクローンの結合の振幅(Rmax)、解離(オフレート)、及び対照(g7B07)と比較したオフレートの倍数変化を示している。
ELISA実験の残りの25個のクローンのオフレートをBiacore 3000装置でのSPRによって決定した。ペリプラズム抽出物を2500RUのGal10-HisでコーティングされたCM5センサーチップ上に注入した。11個のクローンは、クローン7B07(2.18E-03 1/s)と比較して、少なくとも2倍のオフレートの改善を示し、これらのクローンをさらなる特性解析のために選択した(表4)。
(1.2 重鎖シャッフリングキャンペーン)
7B07軽鎖と対になり、かつGal10に対する良好な親和性及び安定性の向上を可能にするクローンを見出すために、重鎖シャッフリングアプローチを実行した。
7B07軽鎖と対になり、かつGal10に対する良好な親和性及び安定性の向上を可能にするクローンを見出すために、重鎖シャッフリングアプローチを実行した。
(ライブラリー構築(FabのVHシャッフリング))
シャッフルされた重鎖ライブラリーの構築のために、2段階PCRを使用した。まず、非タグ化プライマーを(前回の選択キャンペーンで得られた)2頭の免疫ラマのcDNAに対して直接用いて、VH-CH1を増幅させた。その後、得られたPCR産物を精製し、タグ化プライマーを用いる2回目のPCRで用いて、VHを増幅させた。クローン7B07は、ラマ・モントーヨ(llama Montoyo)から単離されたので、クローン7B07のVLをラマ・モントーヨ由来のPCR増幅VHレパートリーとシャッフルした。最終的なFabライブラリーのサイズは、1.5E+07のVH/VL組合せであり、VL及びVHの適切な挿入率は、コロニーPCRによって決定したとき、94％であった。
シャッフルされた重鎖ライブラリーの構築のために、2段階PCRを使用した。まず、非タグ化プライマーを(前回の選択キャンペーンで得られた)2頭の免疫ラマのcDNAに対して直接用いて、VH-CH1を増幅させた。その後、得られたPCR産物を精製し、タグ化プライマーを用いる2回目のPCRで用いて、VHを増幅させた。クローン7B07は、ラマ・モントーヨ(llama Montoyo)から単離されたので、クローン7B07のVLをラマ・モントーヨ由来のPCR増幅VHレパートリーとシャッフルした。最終的なFabライブラリーのサイズは、1.5E+07のVH/VL組合せであり、VL及びVHの適切な挿入率は、コロニーPCRによって決定したとき、94％であった。
親g7B07 Fabと同等又はそれ以上のヒトGal10に対する結合能を有する新しいFabを選択するために、ファージパンニングアプローチを使用した。この目的のために、第一ラウンド及び第二ラウンドの選択は、ヒトGal10-His及び無関係なHisタグ化タンパク質(対照として)に対して行った。第三ラウンド及び第四ラウンドの選択は、可溶性の非Hisタグ化ヒトGal10に対して行った。
最初の2ラウンドの選択は、1及び10μg/mLのコーティングされたヒトGal10-His並びに10μg/mLの無関係なHisタグ化タンパク質に対して実施した。第一ラウンドの選択と第二ラウンドの選択の両方について、10μg/mLのGal10-Hisという条件からの溶出ファージを、後続の第三ラウンド及び第四ラウンドの選択に使用した。
(Gal10特異的バインダーのスクリーニング)
(ペリプラズム抽出物としてのFabの産生)
ラウンド3及びラウンド4のトリプシン溶出ファージから、単一クローンを作製し、2つのマスタープレートを作製した(表5)。マスタープレート24(MP24)は、異なる条件(Gal10、非オフレート洗浄、及びオフレート洗浄)から選択されたコロニーを用いて、第三ラウンドの選択から作製された。マスタープレート26(MP26)は、非オフレート洗浄とオフレート洗浄の両方から選択されたコロニーを用いて、第四ラウンドの選択から作製された。
表5:ヒトGal10に対する選択キャンペーン後に作製されたマスタープレートの概要。
(ペリプラズム抽出物としてのFabの産生)
ラウンド3及びラウンド4のトリプシン溶出ファージから、単一クローンを作製し、2つのマスタープレートを作製した(表5)。マスタープレート24(MP24)は、異なる条件(Gal10、非オフレート洗浄、及びオフレート洗浄)から選択されたコロニーを用いて、第三ラウンドの選択から作製された。マスタープレート26(MP26)は、非オフレート洗浄とオフレート洗浄の両方から選択されたコロニーを用いて、第四ラウンドの選択から作製された。
(配列解析)
マスタープレート24(MP24)のシークエンシングの結果から、CDR3配列に基づき、7B07_VHとは異なるVHファミリーが4グループしか存在しないことが明らかになった。さらなる解析から、これら4つのVHファミリーのうち2つは、ラクダ科動物の単一ドメイン抗体であることが示された。残りの2つのVHファミリーから、代表的なクローン－クローン24A04及びクローン24F02をさらなる解析のために選択した。
マスタープレート24(MP24)のシークエンシングの結果から、CDR3配列に基づき、7B07_VHとは異なるVHファミリーが4グループしか存在しないことが明らかになった。さらなる解析から、これら4つのVHファミリーのうち2つは、ラクダ科動物の単一ドメイン抗体であることが示された。残りの2つのVHファミリーから、代表的なクローン－クローン24A04及びクローン24F02をさらなる解析のために選択した。
(BLI技術を用いた2つの選択クローンのGal10結合)
選択された2つのクローンのペリプラズム抽出物を、Octet RED96装置(Bio-Layer干渉法(BLI)技術)を用いて、捕捉されたGal10-Hisとの結合について試験した。
選択された2つのクローンのペリプラズム抽出物を、Octet RED96装置(Bio-Layer干渉法(BLI)技術)を用いて、捕捉されたGal10-Hisとの結合について試験した。
この解析では、クローン7B07の生殖系列化クローン(g7B07)を参照として含めた。参照クローンと比較して、Gal10-Hisに対する低い応答が測定された。クローン24F02のみがクローンg7B07と比較して良好な(128倍の)オフレートを示した(表6)。
表6:計算されたオフレートkd(1/s)
(7B07エピトープに対する競合ELISA)
選択されたクローンがクローンg7B07と同じGal10上の領域を標的としていることを確認するために、競合ELISAを実施した。簡単に説明すると、96-ウェルMaxisorpプレートを7B07_hIgG1でコーティングし、Gal10-Hisを捕捉した。その後、Fab-Mycを含有するペリプラズム抽出物をインキュベートし、結合したFabを抗Myc-HRP抗体で検出した。OD値＜0.1を有するクローンを7B07エピトープを共有するものと定義した。陽性対照試料(クローン18C06)を参照試料として使用した。
選択されたクローンがクローンg7B07と同じGal10上の領域を標的としていることを確認するために、競合ELISAを実施した。簡単に説明すると、96-ウェルMaxisorpプレートを7B07_hIgG1でコーティングし、Gal10-Hisを捕捉した。その後、Fab-Mycを含有するペリプラズム抽出物をインキュベートし、結合したFabを抗Myc-HRP抗体で検出した。OD値＜0.1を有するクローンを7B07エピトープを共有するものと定義した。陽性対照試料(クローン18C06)を参照試料として使用した。
クローン24F02は結合を示さず、24F02はクローン7B07と同じエピトープに結合することが示唆された。同様のデータが7B07と競合することが知られている対照抗体18C06について得られた。対照的に、クローン24A04は、OD値＞0.1を示し、7B07とは別のエピトープに結合することを示した。
表7:平均OD 450nm値。
(1.3 g7B07_CDR2_VHランダム化キャンペーン)
(ライブラリー構築(Fab))
g7B07のCDR2－N53G54－内の脱アミド化部位のランダム化によって、脱アミド化部位及びGal10に対する良好な結合親和性を有さないg7B07変異体を提供することはできなかった。CDR2残基をランダム化して、脱アミド化部位及び良好な結合親和性を有さない配列を見出した。Gal10と複合体を形成した7B07 Fabの部分の構造的モデリングにより、さらなる研究のためのランダム化CDR2ライブラリーの作製が導かれた。CDR2ループの柔軟な先端
のみをランダム化し、逆平行ベータ-シートはそのまま残して; 4つのライブラリーを構築した。X6と表示されたライブラリーでは、CDR2ループの柔軟な先端の6残基全てをランダム化した(IXXXXXXT、ここで、Xは、ランダム化された1つのアミノ酸を表す)。これは、もとの7B07 VH-CDR2配列を見直す危険を伴うため、1アミノ酸短い3つのさらなるライブラリーを構築した:
;ここで、「X」は、ランダム化された位置を表す。
(ライブラリー構築(Fab))
g7B07のCDR2－N53G54－内の脱アミド化部位のランダム化によって、脱アミド化部位及びGal10に対する良好な結合親和性を有さないg7B07変異体を提供することはできなかった。CDR2残基をランダム化して、脱アミド化部位及び良好な結合親和性を有さない配列を見出した。Gal10と複合体を形成した7B07 Fabの部分の構造的モデリングにより、さらなる研究のためのランダム化CDR2ライブラリーの作製が導かれた。CDR2ループの柔軟な先端
この結晶構造において、残基54～56(GGG)は、Gal10分子と衝突し、G55を後方に反らせる。それゆえ、この配列を1アミノ酸短くすると、より良好にフィットして、Gal10に結合すると考えられた。
クローンg7B07の重鎖の可変ドメインのCDR2中の6つの残基をランダム化するために、特異的なプライマーセットを各々のライブラリーについて作製した。生殖系列クローン7B07の重鎖のDNAを鋳型として用いる2段階の入れ子PCRの後、アンプリコンを制限酵素で消化し、その後、g7B07の軽鎖の可変ドメインを含有するPCB13ファージミドベクターにライゲーションした。
ライブラリー構築の結果として、理論的なライブラリーサイズよりも5～1224倍大きいライブラリーサイズを示す4つのライブラリーが得られた(表8)。
表8:作製された4つの異なるライブラリーのサイズ。
(ファージディスプレイによる選択)
Gal10に対する良好な結合親和性を有する安定なg7B07変異体を同定するために、4つの異なるライブラリーのファージ(入力)を、10倍過剰のGal10-Hisによるオフレート洗浄の存在下又は非存在下、24時間かけて、MaxisorpプレートにコーティングされたGal10-Hisに結合させた。His-タグではなく、Gal10に対する特異的濃縮を評価するために、無関係なHis-タグ化タンパク質を陰性対照としてコーティングした。このプロセスは、第一ラウンドの選択の後に明らかな濃縮をもたらした。無関係なHis-タグ化タンパク質パニングの出力力価は、PBS対照よりも明らかに高かった。さらに、10倍過剰のGal10を用いて実施された24時間のオフレート洗浄は、0日目に実施された溶出と比較して、より低い濃縮(10～100倍)をもたらしたが、24時間後に実施された溶出対照と同様であり(データは示さない)、Fabを発現するファージがヒトGal10に対するより高い親和性を有する可能性が高かった。
Gal10に対する良好な結合親和性を有する安定なg7B07変異体を同定するために、4つの異なるライブラリーのファージ(入力)を、10倍過剰のGal10-Hisによるオフレート洗浄の存在下又は非存在下、24時間かけて、MaxisorpプレートにコーティングされたGal10-Hisに結合させた。His-タグではなく、Gal10に対する特異的濃縮を評価するために、無関係なHis-タグ化タンパク質を陰性対照としてコーティングした。このプロセスは、第一ラウンドの選択の後に明らかな濃縮をもたらした。無関係なHis-タグ化タンパク質パニングの出力力価は、PBS対照よりも明らかに高かった。さらに、10倍過剰のGal10を用いて実施された24時間のオフレート洗浄は、0日目に実施された溶出と比較して、より低い濃縮(10～100倍)をもたらしたが、24時間後に実施された溶出対照と同様であり(データは示さない)、Fabを発現するファージがヒトGal10に対するより高い親和性を有する可能性が高かった。
10μg/mLのラウンド1の直接トリプシン溶出という条件からの溶出ファージを、2つの濃度のコーティングされたGal10-His(10及び1μg/mL)に対してさらに選択した。同じプロセスで、オフレート洗浄を第二ラウンドの選択時に適用した。
第二ラウンドの選択の結果は、第一ラウンドの選択と比較して、同様の又は最大で10倍低い濃縮を示した。24時間のオフレート洗浄は、X3ライブラリーの場合を除いて、オフレート洗浄なしの条件と比較して、10倍低い出力力価をもたらした。オフレート選択あり及びなしの第一及び第二ラウンドの選択からのクローンを含む1つのマスタープレートを各々のライブラリーについて調製した。
(CDR2ランダム化クローンの結合のスクリーニング)
(Fabペリプラズム抽出物の産生)
第一及び第二ラウンドの選択(オフレート洗浄あり及びなし)の溶出ファージから、単一クローンを作製し、合計4つのマスタープレート(表9に示されているような異なる条件から選択されたコロニーを含む、ライブラリー当たり1つのマスタープレート)を作製した。
表9:ヒトGal10-Hisに対する選択キャンペーン(CDR2ランダム化キャンペーン)後に作製されたマスタープレート(MP)の概要表。
(Fabペリプラズム抽出物の産生)
第一及び第二ラウンドの選択(オフレート洗浄あり及びなし)の溶出ファージから、単一クローンを作製し、合計4つのマスタープレート(表9に示されているような異なる条件から選択されたコロニーを含む、ライブラリー当たり1つのマスタープレート)を作製した。
合計4つのマスタープレートを、10μg/mLのヒトGal10に対する第一及び第二ラウンドの選択の後、10倍過剰の抗原を用いて実施されるオフレート洗浄あり又はなしで、トリプシンによる溶出法を用いて作製した。
これらのマスタープレートから、ペリプラズム抽出物を作製し(Fab)、ヒトGal10に対するその結合能をSPRによって解析した。
(CDR2ランダム化キャンペーンから作製されたFabペリプラズム抽出物のスクリーニング)
ヒトGal10-Hisに対するFab(ペリプラズム抽出物)の結合特性をBiacore 3000装置を用いるSPRによって解析した。この目的のために、希釈されたペリプラズム抽出物をヒトGal10-HisでコーティングされたCM5チップ上に塗布した。陽性対照として、ヒトFab骨格中の精製g7B07クローンの20nMの注入をランの最初と最後に含めた。Fabの有効濃度が未知であり、クローン毎に大きく異なり得るため、スクリーニング中、Fabの解離(オフレート)のみを決定することができた。
ヒトGal10-Hisに対するFab(ペリプラズム抽出物)の結合特性をBiacore 3000装置を用いるSPRによって解析した。この目的のために、希釈されたペリプラズム抽出物をヒトGal10-HisでコーティングされたCM5チップ上に塗布した。陽性対照として、ヒトFab骨格中の精製g7B07クローンの20nMの注入をランの最初と最後に含めた。Fabの有効濃度が未知であり、クローン毎に大きく異なり得るため、スクリーニング中、Fabの解離(オフレート)のみを決定することができた。
SPRでスクリーニングされた376個のクローンのうち、スクリーニングされたペリプラズム抽出物のほとんどは、クローンg7B07(オフレート=6.9E-03 1/s)よりも高い解離速度を示した。
表10: SPR技術を用いたCDR2ランダム化キャンペーンから作製されたFabペリプラズム抽出物のスクリーニング。対照g7B07と比較して同様又はそれよりも良好なオフレートを有するクローンを太字で強調した(「オフレート倍数」の列)。CDR2配列のランダム化部分には、下線が引かれている。
Fabペリプラズム抽出物の結合能は、Biacore 3000を用いるSPR技術によって解析した。簡単に説明すると、希釈されたペリプラズム抽出物を2500RUのGal10-HisでコーティングされたCM5チップ上に注入した。各々のクローンの結合の振幅(Rmax)、解離(オフレート)、並びに対照(g7B07及びg7B07_N53A)と比較したオフレート倍数変化が示されている。クローンg20H09及びg23H09は、対照g7B07と比較して同様又はそれよりも良好なオフレートを有していた(表10)。CDR2配列のランダム化部分には、下線が引かれている(表10)。
4つの異なるCDR2ランダム化ライブラリーから単離された限られた数のクローンが適切な結合特性を示した(表10)。このパネルの中で、X6ライブラリーから単離されたクローンg23H09は、親クローン7B07よりも良好なオフレート(2.5倍良好なオフレート)を示すユニークなクローンであった。8.8E-03 1/sに等しいオフレートを伴って、X3ライブラリーから単離されたクローン20H09は、クローンg7B07と比較して同様のオフレートを示した。しかしながら、クローンg20H09のCDR2のランダム化部分(WHR)及びg23H09のCDR2のランダム化部分(AQFQHW)は、光の影響下で潜在的に酸化し得る、1つのトリプトファンの存在によって表される、1つのあり得るマイナス点を示した。
最後に、g7B07と比較して1.8～2.3倍高いオフレートを伴って、クローン23E05(X6ライブラリー)及び20F04(X3ライブラリー)は、親クローンに近い結合特性を示した。X4及びX5ライブラリーから単離されたクローンはいずれも、適切な結合特性を示さなかった。
(実施例1の結果のまとめ)
実施例1からの7つのクローンをさらなる特性解析のために選択した(表11)。これらのクローンは、結合能(BLI又はSPR結合)、エピトープ特性解析(競合ELISA)、並びにVH及びVL配列に基づいて選択した(表11)。
表11:ヒトFabにおける生殖系列化及び再フォーマット化のために選択されたscFv/Fabクローンの特性
実施例1からの7つのクローンをさらなる特性解析のために選択した(表11)。これらのクローンは、結合能(BLI又はSPR結合)、エピトープ特性解析(競合ELISA)、並びにVH及びVL配列に基づいて選択した(表11)。
(実施例2:ヒトFab骨格中の選択されたクローンの生殖系列化、再フォーマット化、及び産生)
7つの選択されたクローンをさらに特性解析する前に、これらのクローンをヒト化し、ヒトFab骨格中に再クローニングした。
7つの選択されたクローンをさらに特性解析する前に、これらのクローンをヒト化し、ヒトFab骨格中に再クローニングした。
(CDR移植アプローチによる選択されたクローンの生殖系列化)
選択された抗Gal10クローンの免疫原性を低下させるために、最も近いヒト生殖系列フレームワーク(FW)に相補性決定領域(CDR)を移植することにより、可変領域(VH及びVL)の生殖系列化を開始した。選択されたクローンのV-領域との最も高い同一性を有するヒト生殖系列配列を同定した。
選択された抗Gal10クローンの免疫原性を低下させるために、最も近いヒト生殖系列フレームワーク(FW)に相補性決定領域(CDR)を移植することにより、可変領域(VH及びVL)の生殖系列化を開始した。選択されたクローンのV-領域との最も高い同一性を有するヒト生殖系列配列を同定した。
変異体24F02をさらに人為操作して、g7B07と全く同じ位置にある潜在的な脱アミド化部位(pos53_CDR2_VH)を除去した。このため、N位置53は、Aに突然変異した。
CDR2ランダム化ライブラリーは、7B07の生殖系列化変異体の重鎖の可変ドメインのDNAを用いて構築されたので、作製されたクローン(g20H09及びg23H09)は全て、既にヒト化されていた。
(実施例3:ヒトFab骨格中の生殖系列化クローンの結合の特性解析)
(3つの発見キャンペーンから選択されたFabクローンの結合特性のSPRでの特性解析)
ヒトGal10に対する選択されたFabクローンの結合特性をBiacore 3000装置で確立された捕捉法によって解析した。2つの濃度の選択されたFabクローンを、モノクローナル抗HisでコーティングされたCM5チップ上に固定されたヒトGal10-Hisに対して試験した。対照として、クローンg7B07及びg7B07_N53Aをランの最初と最後に注入した。簡単に説明すると、CM5チップをモノクローナル抗His抗体(4000RU)でコーティングし、その後、一定濃度のヒトGal10-His(25μg/mL)を抗Hisチップ上に捕捉させた後、ヒトFab骨格中の2つの濃度のクローンを受容した。
(3つの発見キャンペーンから選択されたFabクローンの結合特性のSPRでの特性解析)
ヒトGal10に対する選択されたFabクローンの結合特性をBiacore 3000装置で確立された捕捉法によって解析した。2つの濃度の選択されたFabクローンを、モノクローナル抗HisでコーティングされたCM5チップ上に固定されたヒトGal10-Hisに対して試験した。対照として、クローンg7B07及びg7B07_N53Aをランの最初と最後に注入した。簡単に説明すると、CM5チップをモノクローナル抗His抗体(4000RU)でコーティングし、その後、一定濃度のヒトGal10-His(25μg/mL)を抗Hisチップ上に捕捉させた後、ヒトFab骨格中の2つの濃度のクローンを受容した。
表11で同定されたクローンの生殖系列化変異体は、クローンg7B07と同様又はそれよりも良好なオフレート及び親和性を示した(表12参照)。このパネルの中で、7B07エピトープキャンペーンから単離されたクローンは、最も良好なオフレートを示し、クローンg7B07よりも6.2～9.8倍良好なオフレートを有していた。
初期クローン24F02の生殖系列化(g24F02)及び人為的に作出されたバージョン(g24F02_N53A)は、BLIでの以前のスクリーニングキャンペーン中に観察された初期のオフレート(5.86E-05 1/s)と比較して、より高いオフレートを示した。これら2つのFabは、極めて類似した結合能を示し、位置53に見られる脱アミド化部位の除去が、人工変異体g7B07_N53Aにおいて結合能の顕著な低下を示したg7B07とは異なり、g24F02の結合特性に影響を及ぼさないことを示した。
7.1～8.3 E+05のオンレート、及び1.6E-03 1/sに等しいオフレート、及び2.0～2.3nMの親和性を伴って、これらのクローンは、クローンg7B07よりも1.6～1.9倍良好なオンレート、2.8倍良好なオフレート、及び4.7倍良好な親和性を示した。
最後に、CDR2ランダム化キャンペーンから単離された2つのクローンは、スクリーニングデータと一致して、異なる結合特性を示した。クローンg23H09は、クローンg7B07と比較して、同様のオンレート、2.8倍良好な親和性(3.9nM)、及び1.8倍良好なオフレートを示した。クローンg20H09は、3倍高い解離速度を示したが、親和性は同様であった。
全てのクローンは、人工変異体g7B07_N53A(kd 7.8E-02 1/s、KD 143.5nM)と比較して、より良好な親和性及びオフレートを示した。
表12:表11から選択された生殖系列クローンの結合特性。
(実施例4:選択されたクローンの安定性試験)
ストレス試験の後、重鎖の可変ドメインのCDR2における脱アミド化部位が結合及び効力の明らかな低下を誘発したクローンg7B07の問題と同様の問題を調べるために、選択されたクローンの安定性を解析した。
ストレス試験の後、重鎖の可変ドメインのCDR2における脱アミド化部位が結合及び効力の明らかな低下を誘発したクローンg7B07の問題と同様の問題を調べるために、選択されたクローンの安定性を解析した。
この目的のために、温度ストレス試験を実施した。この設定では、ストレス試料を37℃で2週間インキュベートした後、非ストレス試料(T0)と並べて、結合、効力(CLC溶解)、及び翻訳後修飾(CDR2配列に着目)について解析した。試験されたクローンは、異なる出発濃度(3.2～7.3mg/mL)を示した。
(温度ストレス試料の結合能のSPRでの解析)
2週間の温度ストレスの後の7つの選択されたクローンの結合特性をBiacore 3000装置で最適化された捕捉法を用いて解析した。ストレス試料の結合特性を決定し、キャリブレーションポイントと比較し、相対活性のパーセンテージ(％RA)として表した。
2週間の温度ストレスの後の7つの選択されたクローンの結合特性をBiacore 3000装置で最適化された捕捉法を用いて解析した。ストレス試料の結合特性を決定し、キャリブレーションポイントと比較し、相対活性のパーセンテージ(％RA)として表した。
簡単に説明すると、捕捉法をBiacore3000装置で設定した。この目的のために、CM5チップをモノクローナル抗His抗体(4000RU)でコーティングし、その後、一定濃度のヒトGal10-His(25μg/mL)を抗Hisチップ上に捕捉させた後、各々のクローンのキャリブレーター、QC試料、及び温度ストレス試料の重複注入を受容した。その後、各々の注入された試料の傾きを、BIA評価ソフトウェアを用いて計算した。QC試料と温度ストレス試料の濃度は、これらの試料の得られた傾きをキャリブレーター曲線に内挿することにより逆算した。得られた値は、試験された試料の公称濃度の±20％以内であった。これは、平均相対精度(平均％RA)として表されている(表13)。
表13: 3つの発見キャンペーンから単離された選択されたクローンの温度ストレス試料の結合特性の解析。
クローンg18G12、g18C06、及びg24F02_N53Aは、37℃で2週間後、最良の安定性を示し、非温度ストレス試料と同様の結合能(それぞれ、95％、106％、及び99％RA)を有していた(表13)。さらに、g24F02の非人工変異体は、37℃で2週間のインキュベーションの後、結合の損失を示さず、位置53における脱アミド化がその結合特性に影響を及ぼさないことを示した。
クローンg23H09及びg20H09は、37℃でのインキュベーション後に結合能の低下を示し、これは、2週間後に、それぞれ、78％及び86％RAをもたらした。しかしながら、この結合の14％及び22％の低下は、アッセイのばらつきに起因する可能性があった。
g18G07及びg18E04を含有する試料の温度ストレスは、結合の明らかな低下(33％及び74％RA)を示し、37℃で2週間後のその不安定性を強調した。
(翻訳後修飾の解析(CDR2_VHに着目))
2週間の温度ストレスの後、作製された試料を、これらのクローンの重鎖のCDR2に着目した翻訳後修飾について解析した。
2週間の温度ストレスの後、作製された試料を、これらのクローンの重鎖のCDR2に着目した翻訳後修飾について解析した。
試験されたクローンのほとんどは、37℃で2週間のインキュベーションの後、比較的低いパーセンテージの修飾を示した。クローンg18C06、g20H09、及びg23H09は、最小量の修飾を示し、解析された配列において、それぞれ、3.1％、2.4％、及び8.4％の修飾を有していた(表14)。
37℃でのインキュベーション後の結合活性の低下と一致して、クローンg18G07、及びより少ない程度ではあるが、クローンg18E04は、翻訳後修飾を示した(表14)。クローンg18E04は、37℃で2週間のインキュベーションの後、11.7％の修飾を示したが、主として位置52のAsnの脱アミド化が原因であり、これにより、その結合能の低下を説明することができる(表13及び14)。非ストレス試料のクローンg18G07は、20.2％の修飾を示し、これは、37℃で2週間のインキュベーションの後、63％まで修飾を増加させたが、主として位置53のAsnの脱アミド化(58.8％)が原因であり、これにより、温度ストレス試料の結合能の低下が説明される。
非ストレス試料のクローンg18G12は、30％の脱アミド化(位置54のAsn)を示したが、これは、37℃で2週間のインキュベーションによる影響を受けなかった。このクローンの脱アミド化は、産生過程(37℃で6日間)で起こった可能性が最も高い。
表14:選択された抗Gal10クローンの温度ストレス試料の翻訳後修飾(PMはCDR2_VHに焦点を当てている)。選択されたクローンのVHのFW2及びCDR2配列の一部のみが表に示されているが、それは、翻訳後修飾が、FW2中で、ほとんどの場合、位置47のWを伴って認められたからである。下線の残基は、CDR2を表す(Kabat付番による)。
(組換えCLCを溶解させる温度ストレス試料の有効性の解析)
組換えCLCを溶解させるヒトFab骨格中の選択されたクローンの温度ストレス試料の能力を試験した。
組換えCLCを溶解させるヒトFab骨格中の選択されたクローンの温度ストレス試料の能力を試験した。
クローン1D11(抗ヒト特異的)をアッセイ間のばらつきを補正するための参照として含めた。CLCの溶解を、2、5、7、及び16時間のインキュベーションの後、InCell 2200アナライザーを用いて経時的にモニタリングした(図1)。簡単に説明すると、抗体を2回の独立した実験で250μg/mLで試験し(n=4)、抗体添加から2、5、7、及び16時間後に、画像を撮影した。この画像を、個々の結晶及びウェル当たりの総結晶面積を検出するために開発されたアルゴリズムを用いて分割した。この設定では、1.5mg/mLで希釈された1μLの試料(T0及びT2W)を1μgのGal10で形成された組換えCLCに適用した。
表15:各々のクローンとのインキュベーション後の平均％溶解結晶面積/ウェル。
アッセイは、5～10μm(ラン2)から最大10～20μm(ラン1)まで幅がある、様々なサイズのCLCを用いて実施した。結晶サイズは、Fabの有効性に影響を及ぼすことが観察された。特に、10～20μmのサイズを有するCLCは、クローン間の最も良好な識別を可能にした。
クローンg20H09及びg23H09は、パネルの中で最も効力の高いクローンであった(図1及び表15)。これらのクローンは、組換えCLCの59.6％及び68.6％を2時間以内に溶解させることができた(ラン1)。対照的に、他のクローンは、2時間後に30.6％～37.9％の溶解を示した(ラン1)。全体として、5時間のインキュベーションの後、ほとんどのクローン(g18G07と1D11を除く)は、CLCの～90％を可溶化することができた。
陽性対照であるクローン1D11は、結晶を溶解させる最低の効力を示し、2時間及び5時間のインキュベーション後のCLC溶解は、それぞれ、20％及び36％であった。
他の安定性の結果(結合及び翻訳後修飾)と一致して、クローンg18C06、g20H09、g23H09及びg18G12の温度ストレス試料は、非ストレス試料と同様の効力を示した。クローンg18G07及びg18E04の温度ストレス試料の結合能の低下と一致して、これらの試料は、組換えCLCを溶解させる有効性の低下を示した。
組換えCLCを溶解させるg24F02_N53Aの効力をスピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて解析した。簡単に説明すると、ヒト化Fab断片を予め形成されたCLCとともにインキュベートし、結晶の溶解を経時的にモニタリングした。
結合データと一致して、温度ストレス試料(37℃で2週間)は、非ストレス試料と比較したとき、同様の有効性を示した(図2及び表16)。これは、このクローンが37℃で2週間安定であることを強調している。実際、このクローンの試験された試料は、43～46分以内に50％のCLC溶解を示した(表16)。クローンg24F02は、非ストレス試料と温度試料の両方において、g7B07と比較して類似しているが、わずかに低い効力を示した。
表16:温度ストレス試料(T0及びT2W、37℃)のEC50値及びEC90値。非線形回帰(log(アゴニスト)対応答の可変勾配(4パラメータ))を用いて計算を行い、表中に報告した。結果は、各々のウェルを6つのレプリケートでモニタリングした1回の実験の組合せである。
(ELISAを用いたエピトープビニングによる選択されたクローンの結合部位の特性解析)
ヒト化Fabクローンのエピトープビニング解析をg7B07のヒト化Fabと比較して実施した。
ヒト化Fabクローンのエピトープビニング解析をg7B07のヒト化Fabと比較して実施した。
この実験のために、準最適濃度のビオチン化クローンg7B07ヒト化FabをGal10コーティングプレートに添加し、選択されたクローンとともにプレインキュベートした。その後、g7B07との競合のパーセンテージを決定した(表17)。ヒトFab骨格中のモタビズマブ(Mota)を陰性対照(0％競合)として使用した。クローンg7B07を競合の陽性対照として使用し、それゆえ、100％競合値として設定した。クローン1D11は、Gal10の反対側(チロシン69を含む)に結合することが知られているので、抗ヒト特異的クローン1D11(チロシン69残基に結合する)をGal10結合について7B07と競合する陰性対照として試験パネルに含めた。
表17: g7B07-ビオチン化ヒトFabに対する選択された抗Gal10クローンのELISAでのエピトープビニング。g7B07-hFab-Biotに対する競合のパーセンテージは、陰性対照であるモタビズマブのOD値を0％競合として、非ビオチン化クローンであるg7B07のOD値を100％競合として使用することにより測定した。
これらの結果から、選択されたクローンは、Gal10結合についてg7B07と競合することが確認された(表17)。
(3つの発見キャンペーンから選択されたFabクローンの結合特性のSPRでの特性解析)
ヒト及びカニクイザルGal10に対する選択されたクローンの結合特性をBiacore 3000装置で確立された捕捉法によって解析した。
ヒト及びカニクイザルGal10に対する選択されたクローンの結合特性をBiacore 3000装置で確立された捕捉法によって解析した。
この目的のために、2つのアプローチを使用した。第一に、2つの濃度の選択されたクローンを、モノクローナル抗His抗体でコーティングされたCM5チップ上のカニクイザル(WGSアイソフォーム) Gal10-His捕捉物に対して適用した。第二のアプローチは、ヒト又はカニクイザル(WGSアイソフォーム) Gal10-Hisに対して同じ設定で適用される連続希釈物を必要とした。
第一段階で、パネルのカニクイザル交差反応性を捕捉されたカニクイザルGal10(WGSアイソフォーム)に対する2つの濃度の注入によって試験した。
クローンg7B07及びその人工変異体g7B07_N53Aは、カニクイザルGal10のWGSアイソフォームに対する弱い結合を示した(KDは、g7B07-hFabの69nMに対して、g7B07-mIgG1の1.5nM)(表18)。
クローンg20H09がカニクイザル抗原に対する不良な結合能を示したのに対し、クローンg18C06は全く結合を示さなかった(表18)。しかしながら、クローンg23H09、g24F02及びその人工変異体g24F02_N53Aは、良好なカニクイザル交差反応性を示した(表18)。
これらのクローンのカニクイザル交差反応性のさらなる特性解析によって、g24F02_N53A及びg23H09が強調された。実際、これら2つのクローンは、それぞれ、ヒトGal10に対する1.4nM及び5.34nMの親和性、並びにカニクイザルGal10に対する8.0nM及び9.9nMの親和性を示した。さらに、これら2つのクローン(g23H09及びg24F02_N53A)は、クローンg7B07よりも1.7倍及び6.3倍良好な親和性、並びに1.9倍から最大3.5倍良好なオフレートを示した。g24F02_VHのCDR2中の位置53のAsnの突然変異は、ヒト又はカニクイザルGal10に対する結合の低下にはつながらず、同様の親和性及びオフレートが観察された。
スクリーニングデータと一致して、クローンg18C06は、ヒトGal10に対して試験されたパネルの中で最も良好な親和性(1.27nM)及びオフレート(4.9E-04 1/s)を示したが、そのカニクイザル対応物には結合しなかった。
g7B07_VHのCDR2の6つのアミノ酸をランダム化して、g23H09を作製すると、親クローンと比較して、カニクイザル交差反応性の増加が示された。しかしながら、CDR2の3つのアミノ酸がランダム化された同様の発見キャンペーンから単離されたクローンg20H09は、このカニクイザル交差反応性の増加を示さず、重要なアミノ酸がクローンg23H09のCDR2に導入され、カニクイザルGal10への結合が増加がもたらされることが示された。
表18: SPRによって決定された親和性の決定
(実施例4の結果のまとめ)
解析される全てのパラメーターを考慮して、4つのクローンをさらなる特性解析のために選択した:
解析される全てのパラメーターを考慮して、4つのクローンをさらなる特性解析のために選択した:
g18C06:「7B07エピトープキャンペーン」で同定され、ヒトGal10上での最も良好なオフレート(4.9E-04 1/s)、組換えCLCを溶解させる良好な効力(5時間後に76.8％)、並びに適切な安定性(37℃で2週間後、3.1％の翻訳後修飾、結合及び効力に変化なし)を示した。Gal10上の結合領域がg7B07と類似しているにもかかわらず、このクローンは、カニクイザルGal10に対する結合を示さなかった。
g23H09:重鎖のCDR2中の6つの残基がランダム化されているこのg7B07の変異体は、親クローンと同様の結合特性を示した。好適な安定性(37℃で2週間のインキュベーション後、結合及び効力が影響を受けない)に加えて、このクローンは、組換えCLCを溶解させる2番目に良好な有効性を示した(5時間後に84.1％)。これは、明らかなカニクイザル交差反応性も示し、WGSアイソフォームに対する親和性は9.9nMであり、これは、g7B07よりも7倍良好であり、カニクイザルにおける毒性試験へのg23H09の使用を可能にする。
g24F02_N53A: g7B07の「重鎖」シャッフリングから同定されたユニークなクローンは、全ての受け入れ基準を満たした。g7B07に見られるものと同様の可能な脱アミド化部位がアラニンに突然変異していた。効力及び結合能は、37℃で2週間後でも変化しなかった。カニクイザルGal10に対する8nMの親和性を伴って、このクローンは、カニクイザルにおける毒性試験を可能にする良好なカニクイザルの交差反応性を示した。
g20H09:重鎖のCDR2中の3つの残基がランダム化されているこのg7B07の変異体は、親クローンよりも低い結合能を明らかに示した。好適な安定性及びGal10結晶を溶解させる最も良好な有効性(5時間後に91.4％)にもかかわらず、このクローンは、カニクイザルGal10に対して弱い交差反応性を示した。
表19:クローン: g23H09、g24F02_N53A、g18C06、及びg20H09の特性のまとめ。
(実施例1～4で使用された材料及びプロトコル)
(シャルコー・ライデン結晶(CLC)溶解アッセイ)
(アッセイ1:)
・精製モノクローナルFabをPBS中に供給し、4℃で保存した。タンパク質濃度は、理論上の減衰係数を用いて、280nmでの吸収を測定することにより決定した。
・ヒトCLC結晶をPerssonらの文献5に記載されているように産生した。簡単に説明すると、4mg/mLの濃度のPBS中の5mLの精製されたN-末端Hisタグ化ヒトGal10をTEVプロテアーゼとともに1％(g/g)のプロテアーゼ:標的比で室温で一晩インキュベートした。翌日、溶液をボルテックス処理することにより、結晶化を誘導した(15秒)。CLC結晶が30分～1時間以内に現れ、結果として、濁った溶液が得られる。その後、この結晶溶液をさらに使用するまで4℃で保存する。
(シャルコー・ライデン結晶(CLC)溶解アッセイ)
(アッセイ1:)
・精製モノクローナルFabをPBS中に供給し、4℃で保存した。タンパク質濃度は、理論上の減衰係数を用いて、280nmでの吸収を測定することにより決定した。
・ヒトCLC結晶をPerssonらの文献5に記載されているように産生した。簡単に説明すると、4mg/mLの濃度のPBS中の5mLの精製されたN-末端Hisタグ化ヒトGal10をTEVプロテアーゼとともに1％(g/g)のプロテアーゼ:標的比で室温で一晩インキュベートした。翌日、溶液をボルテックス処理することにより、結晶化を誘導した(15秒)。CLC結晶が30分～1時間以内に現れ、結果として、濁った溶液が得られる。その後、この結晶溶液をさらに使用するまで4℃で保存する。
(アッセイ2:)
・精製モノクローナルFabをPBS中に供給し、4℃で保存した。タンパク質濃度は、理論上の減衰係数を用いて、280nmでの吸収を測定することにより決定した。
・抗体を2回の独立した実験で250μg/mLで試験し(n=4)、抗体添加から2、5、7、及び16時間後に、画像を撮影した。1D11濃度応答曲線(CRC)をさらなる陽性対照として含めた(n=3)。
・個々の結晶を検出し、ウェル当たりの総結晶面積を計算するための独自のアルゴリズムを用いて、画像を分割した。
・精製モノクローナルFabをPBS中に供給し、4℃で保存した。タンパク質濃度は、理論上の減衰係数を用いて、280nmでの吸収を測定することにより決定した。
・抗体を2回の独立した実験で250μg/mLで試験し(n=4)、抗体添加から2、5、7、及び16時間後に、画像を撮影した。1D11濃度応答曲線(CRC)をさらなる陽性対照として含めた(n=3)。
・個々の結晶を検出し、ウェル当たりの総結晶面積を計算するための独自のアルゴリズムを用いて、画像を分割した。
(プロトコル)
(1.1 CDR2ランダム化キャンペーンのためのライブラリー構築)
(入れ子PCR)
CDR2ランダム化キャンペーンのライブラリーを作製するために、2段階の入れ子PCRを実施して、クローンg7B07のVHを増幅させ、3-4-5残基(-1残基)及び対照6残基のランダム化を導入した。NcoI及びNheIで消化した後、PCR産物を、g7B07の軽鎖を含有するPCB13(NheI/NcoI及びBsteIII(自己ライゲーションを避けるため))ベクターにライゲーションし、その後、TG1 ECCにエレクトロポレーションした。
(1.1 CDR2ランダム化キャンペーンのためのライブラリー構築)
(入れ子PCR)
CDR2ランダム化キャンペーンのライブラリーを作製するために、2段階の入れ子PCRを実施して、クローンg7B07のVHを増幅させ、3-4-5残基(-1残基)及び対照6残基のランダム化を導入した。NcoI及びNheIで消化した後、PCR産物を、g7B07の軽鎖を含有するPCB13(NheI/NcoI及びBsteIII(自己ライゲーションを避けるため))ベクターにライゲーションし、その後、TG1 ECCにエレクトロポレーションした。
(2段階入れ子PCR:)
(1回目のPCR:)
g7B07_VH_PCB13を鋳型として使用し、50ng/μLの溶液を2×MQ水中に調製した。
表20:プライマー
(1回目のPCR:)
g7B07_VH_PCB13を鋳型として使用し、50ng/μLの溶液を2×MQ水中に調製した。
(第一の試料反応物の調製(下表を参照):)
表21: PCR試料の成分
次に、プレートを密閉し、PCR装置にローディングした。
表22: PCRサイクル条件
最後に、1回目のPCRからのDNA産物をアガロースゲル電気泳動で単離した。
(アガロースゲル電気泳動によるDNAの単離:)
1. 0.8％アガロースゲルを調製した(10ウェルコーム(1ウェル当たり120μL))。
2.同一のPCR産物をプールし(総量400μLで8つの複製物)、80μLの6×Orangeローディング色素(カタログR0631)を混合物に添加した。
3.重合後、ゲルを電気泳動システムに移し、タンクに新鮮な1×TEAを満たした。
4.ローダー(Gene Ruler Mix、20μL)を1つのウェルにローディングした。
5.その後、120μLのcDNAを各々のウェル中に移した(合計3ウェル)。
6.分離を200ボルトで少なくとも70分間実行した。
7.予想されるDNA産物の抽出を続ける前に、産物の適切な分離を評価した(15mLチューブ)。
1. 0.8％アガロースゲルを調製した(10ウェルコーム(1ウェル当たり120μL))。
2.同一のPCR産物をプールし(総量400μLで8つの複製物)、80μLの6×Orangeローディング色素(カタログR0631)を混合物に添加した。
3.重合後、ゲルを電気泳動システムに移し、タンクに新鮮な1×TEAを満たした。
4.ローダー(Gene Ruler Mix、20μL)を1つのウェルにローディングした。
5.その後、120μLのcDNAを各々のウェル中に移した(合計3ウェル)。
6.分離を200ボルトで少なくとも70分間実行した。
7.予想されるDNA産物の抽出を続ける前に、産物の適切な分離を評価した(15mLチューブ)。
(PCRクリーンアップ:)
アガロースゲルから単離されたPCR産物のクリーンアップをNucleoSpin Gel and PCR Clean-upキットとともに提供されているプロトコルに従って実施した:
1. PCR産物を計量した後、NTIバッファーを添加した(100mgのゲルの2倍、65℃で20～30分)。この溶液をベンチで15分間放置(冷却)した後、PCR Clean-upカラムにローディングし、11,000gで1分間遠心分離した。
2.フロースルーを捨て、700μLのNT3を添加して、メンブレンを洗浄し、カラムを11,000gで1分間遠心分離した。この工程を2回実施した。
3.フロースルーを捨て、カラムを11,000gで3分間遠心分離した。
4.最後に、PCR Clean-upカラムを1.5mLチューブに移し、20μLの温MQ水(70℃)を添加することにより、溶出を行った。
5.室温でのインキュベーション工程(1分間)の後、カラムを11,000gで1分間遠心分離し、溶出液DNAをNanodrop(260nm)で測定した。
アガロースゲルから単離されたPCR産物のクリーンアップをNucleoSpin Gel and PCR Clean-upキットとともに提供されているプロトコルに従って実施した:
1. PCR産物を計量した後、NTIバッファーを添加した(100mgのゲルの2倍、65℃で20～30分)。この溶液をベンチで15分間放置(冷却)した後、PCR Clean-upカラムにローディングし、11,000gで1分間遠心分離した。
2.フロースルーを捨て、700μLのNT3を添加して、メンブレンを洗浄し、カラムを11,000gで1分間遠心分離した。この工程を2回実施した。
3.フロースルーを捨て、カラムを11,000gで3分間遠心分離した。
4.最後に、PCR Clean-upカラムを1.5mLチューブに移し、20μLの温MQ水(70℃)を添加することにより、溶出を行った。
5.室温でのインキュベーション工程(1分間)の後、カラムを11,000gで1分間遠心分離し、溶出液DNAをNanodrop(260nm)で測定した。
(2回目のPCR:)
2回目の入れ子PCRについては、DNA産物を1回目の入れ子PCRから10ng/μLになるように調製した。
表23:プライマー
2回目の入れ子PCRについては、DNA産物を1回目の入れ子PCRから10ng/μLになるように調製した。
1. 2回目のPCRの準備:
表24: PCR試料の成分
2.その後、プレートを密閉し、PCR装置にローディングした。
表25: PCRサイクル条件
3. PCRプログラムを実行している間に、0.8％アガロースゲルを調製した。
4.プログラムの最後に、DNA産物の精製を電気泳動(0.8％アガロースゲル)によって行い、PCRクリーンアップを上記のように行った。最後に、DNA濃度をNanodropで測定した。
2.その後、プレートを密閉し、PCR装置にローディングした。
3. PCRプログラムを実行している間に、0.8％アガロースゲルを調製した。
4.プログラムの最後に、DNA産物の精製を電気泳動(0.8％アガロースゲル)によって行い、PCRクリーンアップを上記のように行った。最後に、DNA濃度をNanodropで測定した。
(PCR産物及びg7B07_VLLを含有するベクターの消化)
1. 2回目の入れ子PCRからのPCR産物を10ng/μLで希釈した。
表26: PCR産物の消化
2.この溶液をPCRチューブに50μLで分配した(合計6本のチューブ(300μL))。
3.消化をPCR装置(Thermocycler)で37℃で4時間実施した。
4.インキュベーション時間の最後に、各々のライブラリーのPCR反応物を1.5mLチューブにプールした。
5.精製をNucleospinカラムで行った(上のプロトコルを参照、各々のライブラリー当たり1カラム)。
6.溶出をカラム当たり75μLの2×温MQ水で実施した(10μgで合計150μL)。
7.その後、DNA濃度をNanodropで測定した。
1. 2回目の入れ子PCRからのPCR産物を10ng/μLで希釈した。
2.この溶液をPCRチューブに50μLで分配した(合計6本のチューブ(300μL))。
3.消化をPCR装置(Thermocycler)で37℃で4時間実施した。
4.インキュベーション時間の最後に、各々のライブラリーのPCR反応物を1.5mLチューブにプールした。
5.精製をNucleospinカラムで行った(上のプロトコルを参照、各々のライブラリー当たり1カラム)。
6.溶出をカラム当たり75μLの2×温MQ水で実施した(10μgで合計150μL)。
7.その後、DNA濃度をNanodropで測定した。
(消化されたVHのVLを含有する消化されたPCB13へのライゲーション)
NcoI/NheIで消化されたVH(N3-4-5又は6)のNcol/Nhel/Bstellで消化されたg7B07_VL PCB13へのライゲーションを行った。
NcoI/NheIで消化されたVH(N3-4-5又は6)のNcol/Nhel/Bstellで消化されたg7B07_VL PCB13へのライゲーションを行った。
混合物の調製を1.5mLチューブ中で行った(ライブラリー当たり1チューブ)。
表27:ライゲーション反応の条件
1.ライゲーション産物を室温で2時間又は16℃で一晩インキュベートした。
2.このインキュベーション時間の後、追加のDNAリガーゼ(50μL MQ水中の2.5μL T4 DNAリガーゼ、5μLバッファーT4 DNAリガーゼ)を250μLの総量となるように添加した。
3.最後に、ライゲーションを37℃(水浴)で2時間続けた。
4.その後、DNAをNucleospinカラムで精製した。この目的のために、500μLのNTIバッファーをライゲーション溶液に添加し、その後、先に説明した洗浄工程に進めた。終了させるために、溶出をカラム当たり30μLの温MiliQ水で実施した。
1.ライゲーション産物を室温で2時間又は16℃で一晩インキュベートした。
2.このインキュベーション時間の後、追加のDNAリガーゼ(50μL MQ水中の2.5μL T4 DNAリガーゼ、5μLバッファーT4 DNAリガーゼ)を250μLの総量となるように添加した。
3.最後に、ライゲーションを37℃(水浴)で2時間続けた。
4.その後、DNAをNucleospinカラムで精製した。この目的のために、500μLのNTIバッファーをライゲーション溶液に添加し、その後、先に説明した洗浄工程に進めた。終了させるために、溶出をカラム当たり30μLの温MiliQ水で実施した。
(最終的なライブラリーのためのエレクトロポレーション)
-1日目:
回収培地を-80℃から4℃に移した。
0日目:
実験開始4時間前に、回収培地を37℃で加温し(インキュベーター)、Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettesを氷上に置いた。
1.エレクトロコンピテント細胞(ECC、TG1)を15分間氷上に移した。
2.その後、50μLのECCを30μLの精製ライゲーション産物(ライブラリー)に添加した。
3.追加の50μLのECCを前回量の上に添加して、127μLの総量に到達させた。
4.その後、この容量を3つの画分に分け、42μLを予め冷やしておいた3つのBioRadキュベットに移した。
5.陰性対照のために、1/10希釈物を調製した。この予備希釈物から、10μLを新しい1.5mLチューブに移した。その後、20μLのECCを前回量の上に添加して、30μLの総量に到達させた。
6.エレクトロポレーションを、EC1プログラムを用いて実施した(値は、4.6を超えているべきである、BioRad Micropulser)。
7.予め温めておいた4mLの回収バッファー(キュベット当たり1mL＋3つのキュベットをすすぐために使用される1mL)を添加することにより、ECCを回収した。その後、この溶液を15mLチューブに移した(ライブラリー当たり合計4mL)。
8.培養物を180rpmで37℃で30分間インキュベートした。
9.インキュベーション後、1/1000希釈を各々のライブラリーについて2TY培地/アンピシリン/グルコース(新しい15mLチューブ)中で実施した。その後、1/10連続希釈を96ウェルプレート(F底)で行って、10-07希釈に到達させた。
10.最後に、5μLの各々の希釈物を専用ペトリ皿にスポットした。その後、プレートを37℃で一晩インキュベートした。
11.回収された培養物の残り(15mLチューブに4mL)を用いて、2％グルコース及びアンピシリンを含む300mLの2TY培地(予め温めておいたもの)に植菌した。その後培養物を、振盪させながら(110rpm)、37℃で9時間インキュベートした。
-1日目:
回収培地を-80℃から4℃に移した。
0日目:
実験開始4時間前に、回収培地を37℃で加温し(インキュベーター)、Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettesを氷上に置いた。
1.エレクトロコンピテント細胞(ECC、TG1)を15分間氷上に移した。
2.その後、50μLのECCを30μLの精製ライゲーション産物(ライブラリー)に添加した。
3.追加の50μLのECCを前回量の上に添加して、127μLの総量に到達させた。
4.その後、この容量を3つの画分に分け、42μLを予め冷やしておいた3つのBioRadキュベットに移した。
5.陰性対照のために、1/10希釈物を調製した。この予備希釈物から、10μLを新しい1.5mLチューブに移した。その後、20μLのECCを前回量の上に添加して、30μLの総量に到達させた。
6.エレクトロポレーションを、EC1プログラムを用いて実施した(値は、4.6を超えているべきである、BioRad Micropulser)。
7.予め温めておいた4mLの回収バッファー(キュベット当たり1mL＋3つのキュベットをすすぐために使用される1mL)を添加することにより、ECCを回収した。その後、この溶液を15mLチューブに移した(ライブラリー当たり合計4mL)。
8.培養物を180rpmで37℃で30分間インキュベートした。
9.インキュベーション後、1/1000希釈を各々のライブラリーについて2TY培地/アンピシリン/グルコース(新しい15mLチューブ)中で実施した。その後、1/10連続希釈を96ウェルプレート(F底)で行って、10-07希釈に到達させた。
10.最後に、5μLの各々の希釈物を専用ペトリ皿にスポットした。その後、プレートを37℃で一晩インキュベートした。
11.回収された培養物の残り(15mLチューブに4mL)を用いて、2％グルコース及びアンピシリンを含む300mLの2TY培地(予め温めておいたもの)に植菌した。その後培養物を、振盪させながら(110rpm)、37℃で9時間インキュベートした。
(ファージ調製)
(ファージ感染:)
飽和ライブラリーの一晩培養物から:
1. 4mLを400mLの2TY/アンピシリン/グルコース(OD値は0.1未満であるべきである)に添加し、0.5のOD値に達するまで(約2時間)、37℃、120rpmでインキュベートした。
2. 100mLのこの培養物(ライブラリー当たり100mL)を新しい500mLエルレンマイヤーに移した。
3. 20μLのヘルパーファージVCSM(ストック1×1013ファージ/mL)を添加し、培養物を、振盪させずに、37℃で30分間、その後、振盪させながら(110rpm)、30分間インキュベートした。
4. 100mLのこの培養物を2本の50mLファルコンチューブ(ライブラリー当たり2本)に移した後、3500g、室温で10分間遠心分離した。
5.各々の細菌ペレット(各々のライブラリー当たり2ペレット)を200mLの2TY/アンピシリン/カナマイシンに再懸濁させた(希釈度1/1000)。
6.その後、培養物を、振盪させながら(110rpm)、28℃で一晩インキュベートした。
(ファージ感染:)
飽和ライブラリーの一晩培養物から:
1. 4mLを400mLの2TY/アンピシリン/グルコース(OD値は0.1未満であるべきである)に添加し、0.5のOD値に達するまで(約2時間)、37℃、120rpmでインキュベートした。
2. 100mLのこの培養物(ライブラリー当たり100mL)を新しい500mLエルレンマイヤーに移した。
3. 20μLのヘルパーファージVCSM(ストック1×1013ファージ/mL)を添加し、培養物を、振盪させずに、37℃で30分間、その後、振盪させながら(110rpm)、30分間インキュベートした。
4. 100mLのこの培養物を2本の50mLファルコンチューブ(ライブラリー当たり2本)に移した後、3500g、室温で10分間遠心分離した。
5.各々の細菌ペレット(各々のライブラリー当たり2ペレット)を200mLの2TY/アンピシリン/カナマイシンに再懸濁させた(希釈度1/1000)。
6.その後、培養物を、振盪させながら(110rpm)、28℃で一晩インキュベートした。
(g7B07エピトープに対するscFvライブラリー(モントーヨ(Montoyo)＋イニゴ(Ynigo)、カッパ＋ラムダ)のファージディスプレイ選択)
1日目:
(コーティング:)
1. Maxisorpプレートを1ウェル当たり100μLの25μg/mLのクローン1D11(g7B07エピトープの反対側のGal10領域に結合)でコーティングした。PBS対照を陰性対照として含めた。
2.プレートをシールテープで覆い、4℃で一晩インキュベートした。
1日目:
(コーティング:)
1. Maxisorpプレートを1ウェル当たり100μLの25μg/mLのクローン1D11(g7B07エピトープの反対側のGal10領域に結合)でコーティングした。PBS対照を陰性対照として含めた。
2.プレートをシールテープで覆い、4℃で一晩インキュベートした。
(ファージ調製:)
1.ラウンド1: 50 OD(1 OD＝2×108細胞/mL)のグリセロールストック(最終的なライブラリーをエレクトロポレーションしたTG1細胞)を含有する溶液を650mLの2TY/2％グルコース/アンピシリンに添加した。
ラウンド2:一晩感染させたもの(前ラウンドの選択からのレスキュー)を15mLのLB/アンピシリン/グルコース1/100に希釈した後、約0.5のA600(±2時間)に達するまで、振盪させながら(110rpm)、37℃でインキュベートした。
2. OD値が0.5～0.6になったとき、ヘルパーファージ工程を開始した(この段階で、細菌の表面における線毛の最大発現によって、ファージによる良好な感染が可能になる)。
3. 10μLのヘルパーファージ(フリーザーに保存されたVCSM13(1013))を各々のファルコンチューブ(10mL R1-TG1)に添加した。混合する必要はない(ファージ:細菌の比は10:1であるべきであり、ストックは1×1013/mLである)。
4.チューブを振盪させずに37℃で30分間インキュベートした(感染)後、4800gで、室温で15分間遠心分離した(上清を除去)。
5.ペレットを250mLエルレンマイヤー中の50mL 2TY/アンピシリン/カナマイシン(希釈1/1000)(グルコースなし)に再懸濁させた(50mLチューブ)後、28℃(110rpm)で一晩インキュベートした。
1.ラウンド1: 50 OD(1 OD＝2×108細胞/mL)のグリセロールストック(最終的なライブラリーをエレクトロポレーションしたTG1細胞)を含有する溶液を650mLの2TY/2％グルコース/アンピシリンに添加した。
ラウンド2:一晩感染させたもの(前ラウンドの選択からのレスキュー)を15mLのLB/アンピシリン/グルコース1/100に希釈した後、約0.5のA600(±2時間)に達するまで、振盪させながら(110rpm)、37℃でインキュベートした。
2. OD値が0.5～0.6になったとき、ヘルパーファージ工程を開始した(この段階で、細菌の表面における線毛の最大発現によって、ファージによる良好な感染が可能になる)。
3. 10μLのヘルパーファージ(フリーザーに保存されたVCSM13(1013))を各々のファルコンチューブ(10mL R1-TG1)に添加した。混合する必要はない(ファージ:細菌の比は10:1であるべきであり、ストックは1×1013/mLである)。
4.チューブを振盪させずに37℃で30分間インキュベートした(感染)後、4800gで、室温で15分間遠心分離した(上清を除去)。
5.ペレットを250mLエルレンマイヤー中の50mL 2TY/アンピシリン/カナマイシン(希釈1/1000)(グルコースなし)に再懸濁させた(50mLチューブ)後、28℃(110rpm)で一晩インキュベートした。
(TG1植菌:)
1. 10mLのLB培地に、50mLエルレンマイヤー中の最小塩類寒天プレート上で増殖させたTG1の単一コロニーを植菌した。
2.培養物を37℃(100rpm)で一晩インキュベートした。
1. 10mLのLB培地に、50mLエルレンマイヤー中の最小塩類寒天プレート上で増殖させたTG1の単一コロニーを植菌した。
2.培養物を37℃(100rpm)で一晩インキュベートした。
2日目:
(ブロッキング)
1.一晩インキュベートした後、コーティングプレートをマルチステッパーピペットで1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで3回洗浄した。
2.ブロッキング工程を、使い捨てリザーバーから、マルチチャンネルピペットを用いて、1ウェル当たり200μLの1×PBS 2％MARVELを添加することにより実施した。
3.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で2時間インキュベートした。
(ブロッキング)
1.一晩インキュベートした後、コーティングプレートをマルチステッパーピペットで1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで3回洗浄した。
2.ブロッキング工程を、使い捨てリザーバーから、マルチチャンネルピペットを用いて、1ウェル当たり200μLの1×PBS 2％MARVELを添加することにより実施した。
3.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で2時間インキュベートした。
(ファージ沈殿:)
1.一晩増殖させたもの(ヘルパーファージを感染させたTG1)から、50mLを新しい50mLチューブに移し、4℃で15分間遠心分離(4800g)した(ラウンド1: 2×50mL)。
2.上清を回収し、40mLを10mLの冷たい20％PEG6000/2.5M NaClを含有する新しい50mLチューブに移した(ファージの沈殿)。
3.その後、チューブを氷上で30分間インキュベートした。
4.ファージの沈殿を4800gで15分間の遠心分離工程により行った。
5.上清を除去し、ペレットを1mLの滅菌PBSに再懸濁させ、新しい滅菌1.5mLチューブに移した。
6.その後、チューブを最高速度で3分間遠心分離した(卓上遠心分離機)。
7.上清を回収し、250μLの20％PEG/2.5M NaClを含有する新しいエッペンドルフチューブに添加した後、氷上で15分間インキュベートした。
8.チューブを最高速度で3分間遠心分離し、上清を除去した。
9.ペレットをPBSに再懸濁させた(ラウンド1:チューブ当たり500μLを最終的にプールした;ラウンド2: 1mL)。
10.追加の工程として、溶液を最高速度で3分間遠心分離して、残存する細胞残屑をペレット化した。上清を新しい1.5mLチューブに回収し(ファージ)、インプットを作製した。
11.このストック溶液から、グリセロールストックを作製した(400μLの60％グリセロール中の800μLのファージ)。
1.一晩増殖させたもの(ヘルパーファージを感染させたTG1)から、50mLを新しい50mLチューブに移し、4℃で15分間遠心分離(4800g)した(ラウンド1: 2×50mL)。
2.上清を回収し、40mLを10mLの冷たい20％PEG6000/2.5M NaClを含有する新しい50mLチューブに移した(ファージの沈殿)。
3.その後、チューブを氷上で30分間インキュベートした。
4.ファージの沈殿を4800gで15分間の遠心分離工程により行った。
5.上清を除去し、ペレットを1mLの滅菌PBSに再懸濁させ、新しい滅菌1.5mLチューブに移した。
6.その後、チューブを最高速度で3分間遠心分離した(卓上遠心分離機)。
7.上清を回収し、250μLの20％PEG/2.5M NaClを含有する新しいエッペンドルフチューブに添加した後、氷上で15分間インキュベートした。
8.チューブを最高速度で3分間遠心分離し、上清を除去した。
9.ペレットをPBSに再懸濁させた(ラウンド1:チューブ当たり500μLを最終的にプールした;ラウンド2: 1mL)。
10.追加の工程として、溶液を最高速度で3分間遠心分離して、残存する細胞残屑をペレット化した。上清を新しい1.5mLチューブに回収し(ファージ)、インプットを作製した。
11.このストック溶液から、グリセロールストックを作製した(400μLの60％グリセロール中の800μLのファージ)。
(クローン1D11でコーティングされたMaxisorpコーティングプレート上でのGal10捕捉:)
1.コーティングプレートを倒立させ、紙片の上で叩くことにより、該プレートのブロッキングバッファーを除去した。
2. 1ウェル当たり100μLの0.2％MARVEL中の5μg/mL Gal10-Hisを添加した。
3.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で2時間インキュベートした。
1.コーティングプレートを倒立させ、紙片の上で叩くことにより、該プレートのブロッキングバッファーを除去した。
2. 1ウェル当たり100μLの0.2％MARVEL中の5μg/mL Gal10-Hisを添加した。
3.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で2時間インキュベートした。
(ファージ選択:)
1.ラウンド1: 10μLのファージ/選択(90μLのPBS 0.2％MARVEL＋10μLのファージ)。
2.ラウンド2: 1μLのファージ/選択(99μLのPBS 0.2％MARVEL＋1μLのファージ)。
3. 96ウェルプレートを倒立させ、紙片の上で叩くことにより、ブロッキングバッファーを該プレートから除去し、100μLの希釈ファージを添加した。
4.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で2時間インキュベートした。
5. 2時間のインキュベーションの後、上清をプレートから除去した(ピペッティングする)。
6.ウェルを徹底洗浄した(200μL/ウェル)(合計25回)。
a. 200μLのPBS/Tween 0.05％で5回。
その後、密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で5分間インキュベートする。
この工程を4回行った。
b.その後、ウェルを200μLのPBSで3回洗浄した後、溶出工程を進める。
1.ラウンド1: 10μLのファージ/選択(90μLのPBS 0.2％MARVEL＋10μLのファージ)。
2.ラウンド2: 1μLのファージ/選択(99μLのPBS 0.2％MARVEL＋1μLのファージ)。
3. 96ウェルプレートを倒立させ、紙片の上で叩くことにより、ブロッキングバッファーを該プレートから除去し、100μLの希釈ファージを添加した。
4.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で2時間インキュベートした。
5. 2時間のインキュベーションの後、上清をプレートから除去した(ピペッティングする)。
6.ウェルを徹底洗浄した(200μL/ウェル)(合計25回)。
a. 200μLのPBS/Tween 0.05％で5回。
その後、密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で5分間インキュベートする。
この工程を4回行った。
b.その後、ウェルを200μLのPBSで3回洗浄した後、溶出工程を進める。
(溶出:トリプシン:)
1. PBSを除去し、溶出を1ウェル当たり150μLのトリプシン(10mg/mL)で実施した。
2.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で15分間インキュベートした。
3.このインキュベーション時間の後、150μLの溶出溶液を、各々のウェルに7.5μLのAEBSF(トリプシンの阻害剤)を含有する96ウェルV底プレートの対応するウェルに移した。その後、溶液を5回混合し、トリプシンを適切に中和させた(上下にピペッティングする)。
1. PBSを除去し、溶出を1ウェル当たり150μLのトリプシン(10mg/mL)で実施した。
2.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で15分間インキュベートした。
3.このインキュベーション時間の後、150μLの溶出溶液を、各々のウェルに7.5μLのAEBSF(トリプシンの阻害剤)を含有する96ウェルV底プレートの対応するウェルに移した。その後、溶液を5回混合し、トリプシンを適切に中和させた(上下にピペッティングする)。
(溶出:競合溶出:)
1.競合溶出を、1ウェル当たり100μLの0.2％MARVEL中の2.5mg/mL 7B07又はモタビズマブ(アイソタイプ対照)を添加することにより実施した。
2.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で一晩インキュベートした。
3.このインキュベーション時間の後、溶出溶液を新しい96ウェルプレートに移した。
1.競合溶出を、1ウェル当たり100μLの0.2％MARVEL中の2.5mg/mL 7B07又はモタビズマブ(アイソタイプ対照)を添加することにより実施した。
2.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で一晩インキュベートした。
3.このインキュベーション時間の後、溶出溶液を新しい96ウェルプレートに移した。
(感染/レスキュー:)
レスキュー(50mLチューブ):
1. 300μLのTG1細胞(約0.5のOD値)を、625μLの2TY及び75μLの溶出ファージ(トリプシン溶出又は競合溶出)を含有する50mLチューブに添加した。
2.チューブを、振盪させずに、37℃で30分間インキュベートした。
3.このインキュベーション時間の最後に、10mLのLB/アンピシリン/2％グルコースを、TG1/ファージを含有する各々の50mLチューブに添加した。
4.その後、チューブを、振盪させながら(110rpm)、37℃で一晩インキュベートした。
レスキュー(50mLチューブ):
1. 300μLのTG1細胞(約0.5のOD値)を、625μLの2TY及び75μLの溶出ファージ(トリプシン溶出又は競合溶出)を含有する50mLチューブに添加した。
2.チューブを、振盪させずに、37℃で30分間インキュベートした。
3.このインキュベーション時間の最後に、10mLのLB/アンピシリン/2％グルコースを、TG1/ファージを含有する各々の50mLチューブに添加した。
4.その後、チューブを、振盪させながら(110rpm)、37℃で一晩インキュベートした。
(スポッティング:)
1.スポッティング用の希釈物:
a.インプット:ファージの希釈系列(インプット)をスポッティング用の2TY中に調製した(LB寒天プレート)。
12点希釈系列(1/10)を2TY中に調製した(45μLの2TYに5μLのファージ)(10-1から10-12まで)。
b.アウトプット:ファージの希釈系列(アウトプット)をスポッティング用の2TY中に調製した(LB寒天プレート)。
6点希釈系列(1/10)を2TY中に調製した(45μLの2TYに5μLのファージ)(10-1から10-6まで)。
2.その後、50μLのTG1細胞(約0.5のOD値)を希釈プレート(インプット及びアウトプット)中の50μLのファージに添加した。
3.プレートを密閉し、振盪させずに、37℃で30分間インキュベートした。
4. 5μLの各々の希釈物(インプット: 10-6から10-12まで;アウトプット: 10-1から10-6まで)を乾燥ペトリ皿(LB/アンピシリン/グルコース)にスポッティングした。
1.スポッティング用の希釈物:
a.インプット:ファージの希釈系列(インプット)をスポッティング用の2TY中に調製した(LB寒天プレート)。
12点希釈系列(1/10)を2TY中に調製した(45μLの2TYに5μLのファージ)(10-1から10-12まで)。
b.アウトプット:ファージの希釈系列(アウトプット)をスポッティング用の2TY中に調製した(LB寒天プレート)。
6点希釈系列(1/10)を2TY中に調製した(45μLの2TYに5μLのファージ)(10-1から10-6まで)。
2.その後、50μLのTG1細胞(約0.5のOD値)を希釈プレート(インプット及びアウトプット)中の50μLのファージに添加した。
3.プレートを密閉し、振盪させずに、37℃で30分間インキュベートした。
4. 5μLの各々の希釈物(インプット: 10-6から10-12まで;アウトプット: 10-1から10-6まで)を乾燥ペトリ皿(LB/アンピシリン/グルコース)にスポッティングした。
3日目:
1.スポッティングプレート上の単一コロニーの存在を制御した。
2.一晩レスキューしたもののグリセロールストックを行った(1mLの培養物＋500μLの60％グリセロールをクライオバイアルに入れ、-80℃で保存した)。
1.スポッティングプレート上の単一コロニーの存在を制御した。
2.一晩レスキューしたもののグリセロールストックを行った(1mLの培養物＋500μLの60％グリセロールをクライオバイアルに入れ、-80℃で保存した)。
(マスタープレートの作製:)
1.適当なレスキューから、2TY中の希釈系列を調製した。
6点希釈系列(1/10)を2TY中に調製した(45μLの2TYに5μLのファージ)(10-1から10-6まで)。
2. 50μLの選択された希釈物(10-3/10-4)を、2％グルコース及びアンピシリンを含む固形LB寒天培地を含有するペトリ皿に移した。
3.ガラスビーズとともに振盪させることにより、TG1細胞を均一に分布させた。
4.ビーズを除去し、ペトリ皿を37℃で一晩インキュベートした。
1.適当なレスキューから、2TY中の希釈系列を調製した。
6点希釈系列(1/10)を2TY中に調製した(45μLの2TYに5μLのファージ)(10-1から10-6まで)。
2. 50μLの選択された希釈物(10-3/10-4)を、2％グルコース及びアンピシリンを含む固形LB寒天培地を含有するペトリ皿に移した。
3.ガラスビーズとともに振盪させることにより、TG1細胞を均一に分布させた。
4.ビーズを除去し、ペトリ皿を37℃で一晩インキュベートした。
4日目:
1.一晩インキュベートした後、単一のコロニーをp10チップで採取し、2％グルコース及びアンピシリンが補充された100μLのLB培地を含有する平底96ウェルプレートに移した。
2.プレートを通気性シールテープで密閉し、37℃及び120rpmで5時間インキュベートした。
1.一晩インキュベートした後、単一のコロニーをp10チップで採取し、2％グルコース及びアンピシリンが補充された100μLのLB培地を含有する平底96ウェルプレートに移した。
2.プレートを通気性シールテープで密閉し、37℃及び120rpmで5時間インキュベートした。
(重鎖シャッフリング及びCDR2ランダム化キャンペーンのファージディスプレイ)
1日目:
(コーティング(重鎖シャッフリング):)
1. Maxisorpプレートを1×PBSに希釈した100μLのヒトGal10-His又は非タグ化ヒトGal10でコーティングした:
ラウンド1及びラウンド2: 10μg/mL及び1μg/mLのヒトGal10-His。
ラウンド3及びラウンド4: 5μg/mL及び0.5μg/mLのヒトGal10-His及びGal10。
対照として、非コーティング条件(PBS)及び無関係のHisタグ化タンパク質(mCD11c-His R&Dカタログ番号7987 AX)を含めた。
2.プレートをシールテープで覆い、4℃で一晩インキュベートした。
1日目:
(コーティング(重鎖シャッフリング):)
1. Maxisorpプレートを1×PBSに希釈した100μLのヒトGal10-His又は非タグ化ヒトGal10でコーティングした:
ラウンド1及びラウンド2: 10μg/mL及び1μg/mLのヒトGal10-His。
ラウンド3及びラウンド4: 5μg/mL及び0.5μg/mLのヒトGal10-His及びGal10。
対照として、非コーティング条件(PBS)及び無関係のHisタグ化タンパク質(mCD11c-His R&Dカタログ番号7987 AX)を含めた。
2.プレートをシールテープで覆い、4℃で一晩インキュベートした。
(コーティング(CDR2ランダム化):)
1. Maxisorpプレートを1×PBSに希釈した100μLのヒトGal10-Hisでコーティングした:
ラウンド1及びラウンド2: 1×PBSに希釈した、10μg/mL及び1μg/mLのヒトGal10-His)、
対照として、非コーティング条件(PBS)及び無関係のHisタグ化タンパク質(mCD11c-His R&Dカタログ番号7987 AX)を含めた。
2.プレートをシールテープで覆い、4℃で一晩インキュベートした。
1. Maxisorpプレートを1×PBSに希釈した100μLのヒトGal10-Hisでコーティングした:
ラウンド1及びラウンド2: 1×PBSに希釈した、10μg/mL及び1μg/mLのヒトGal10-His)、
対照として、非コーティング条件(PBS)及び無関係のHisタグ化タンパク質(mCD11c-His R&Dカタログ番号7987 AX)を含めた。
2.プレートをシールテープで覆い、4℃で一晩インキュベートした。
(ファージ調製:)
1.一晩感染させたもの(前ラウンドの選択からのレスキュー)を15mLのLB/アンピシリン/グルコースに1/100に希釈した後、約0.5(+/-2時間)のOD値(A600)に達するまで、37℃で振盪させながらインキュベートした(110rpm)。
2. OD値が0.5～0.6になったとき、ヘルパーファージ工程を開始した(この段階で、細菌の表面における線毛の最大発現によって、ファージによる良好な感染が可能になる)。
3. 10μLのヘルパーファージ(フリーザーに保存されたVCSM13(1013))を各々のファルコンチューブ(10mL R1-TG1)に添加した。混合する必要はない(ファージ:細菌の比は10:1であるべきであり、ストックは1×1013/mLである)。
4.チューブを振盪させずに37℃で30分間インキュベートした(感染)後、4800gで、室温で15分間遠心分離した(上清を除去)。
5.ペレットを250mLエルレンマイヤー中の50mL 2TY/アンピシリン/カナマイシン(希釈1/1000)(グルコースなし)に再懸濁させた(50mLチューブ)後、28℃(110rpm)で一晩インキュベートした。
1.一晩感染させたもの(前ラウンドの選択からのレスキュー)を15mLのLB/アンピシリン/グルコースに1/100に希釈した後、約0.5(+/-2時間)のOD値(A600)に達するまで、37℃で振盪させながらインキュベートした(110rpm)。
2. OD値が0.5～0.6になったとき、ヘルパーファージ工程を開始した(この段階で、細菌の表面における線毛の最大発現によって、ファージによる良好な感染が可能になる)。
3. 10μLのヘルパーファージ(フリーザーに保存されたVCSM13(1013))を各々のファルコンチューブ(10mL R1-TG1)に添加した。混合する必要はない(ファージ:細菌の比は10:1であるべきであり、ストックは1×1013/mLである)。
4.チューブを振盪させずに37℃で30分間インキュベートした(感染)後、4800gで、室温で15分間遠心分離した(上清を除去)。
5.ペレットを250mLエルレンマイヤー中の50mL 2TY/アンピシリン/カナマイシン(希釈1/1000)(グルコースなし)に再懸濁させた(50mLチューブ)後、28℃(110rpm)で一晩インキュベートした。
(TG1植菌:)
1. 10mLのLB培地に、50mLエルレンマイヤー中の最小塩類寒天プレート上で増殖させたTG1の単一コロニーを植菌した。
2.培養物を37℃(100rpm)で一晩インキュベートした。
1. 10mLのLB培地に、50mLエルレンマイヤー中の最小塩類寒天プレート上で増殖させたTG1の単一コロニーを植菌した。
2.培養物を37℃(100rpm)で一晩インキュベートした。
2日目:
(ブロッキング)
1.一晩インキュベートした後、コーティングプレートをマルチステッパーピペットで1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで3回洗浄した。
2.ブロッキング工程を、使い捨てリザーバーから、マルチチャンネルピペットを用いて、1ウェル当たり200μLの1×PBS 2％MARVELを添加することにより実施した。
3.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で2時間インキュベートした。
(ブロッキング)
1.一晩インキュベートした後、コーティングプレートをマルチステッパーピペットで1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで3回洗浄した。
2.ブロッキング工程を、使い捨てリザーバーから、マルチチャンネルピペットを用いて、1ウェル当たり200μLの1×PBS 2％MARVELを添加することにより実施した。
3.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で2時間インキュベートした。
(ファージ沈殿:)
1.一晩増殖させたもの(ヘルパーファージを感染させたTG1)から、50mLを新しい50mLチューブに移し、4℃で15分間遠心分離(4800g)した(ラウンド1: 2×50mL)。
2.上清を回収し、40mLを10mLの冷たい20％PEG6000/2.5M NaClを含有する新しい50mLチューブに移した(ファージの沈殿)。
3.その後、チューブを氷上で30分間インキュベートした。
4.ファージの沈殿を4800gで15分間の遠心分離工程により行った。
5.上清を除去し、ペレットを1mLの滅菌PBSに再懸濁させ、新しい滅菌1.5mLチューブに移した。
6.その後、チューブを最高速度で3分間遠心分離した(卓上遠心分離機)。
7.上清を回収し、250μLの20％PEG/2.5M NaClを含有する新しいエッペンドルフチューブに添加した後、氷上で15分間インキュベートした。
8.チューブを最高速度で3分間遠心分離し、上清を除去した。
9.ペレットをPBSに再懸濁させた(ラウンド1:チューブ当たり500μLを最終的にプールした、ラウンド2: 1mL)。
10.追加の工程として、溶液を最高速度で3分間遠心分離して、残存する細胞残屑をペレット化した。上清を新しい1.5mLチューブに回収し(ファージ)、インプットを作製した。
11.このストック溶液から、グリセロールストックを作製した(400μLの60％グリセロール中の800μLのファージ)。
1.一晩増殖させたもの(ヘルパーファージを感染させたTG1)から、50mLを新しい50mLチューブに移し、4℃で15分間遠心分離(4800g)した(ラウンド1: 2×50mL)。
2.上清を回収し、40mLを10mLの冷たい20％PEG6000/2.5M NaClを含有する新しい50mLチューブに移した(ファージの沈殿)。
3.その後、チューブを氷上で30分間インキュベートした。
4.ファージの沈殿を4800gで15分間の遠心分離工程により行った。
5.上清を除去し、ペレットを1mLの滅菌PBSに再懸濁させ、新しい滅菌1.5mLチューブに移した。
6.その後、チューブを最高速度で3分間遠心分離した(卓上遠心分離機)。
7.上清を回収し、250μLの20％PEG/2.5M NaClを含有する新しいエッペンドルフチューブに添加した後、氷上で15分間インキュベートした。
8.チューブを最高速度で3分間遠心分離し、上清を除去した。
9.ペレットをPBSに再懸濁させた(ラウンド1:チューブ当たり500μLを最終的にプールした、ラウンド2: 1mL)。
10.追加の工程として、溶液を最高速度で3分間遠心分離して、残存する細胞残屑をペレット化した。上清を新しい1.5mLチューブに回収し(ファージ)、インプットを作製した。
11.このストック溶液から、グリセロールストックを作製した(400μLの60％グリセロール中の800μLのファージ)。
(ファージ選択:)
1.第二、第三、及び第四ラウンドの選択のインプットからのMARVELに希釈した1μLのファージ(495μLのPBS 2％MARVEL＋5μLのファージ)を使用した。
2. 96ウェルプレートを倒立させ、紙片の上で叩くことにより、ブロッキングバッファーを該プレートから除去し、100μLの希釈ファージを添加した。
3.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で2時間インキュベートした。
4. 2時間のインキュベーションの後、上清をプレートから除去した(ピペッティングする)。
5.ウェルを徹底洗浄した(200μL/ウェル)(合計25回)。
a. 200μLのPBS/Tween 0.05％で5回。
その後、密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で5分間インキュベートする。
この工程を4回行った。
b.その後、ウェルを200μLのPBSで3回洗浄した後、溶出工程を進める。
1.第二、第三、及び第四ラウンドの選択のインプットからのMARVELに希釈した1μLのファージ(495μLのPBS 2％MARVEL＋5μLのファージ)を使用した。
2. 96ウェルプレートを倒立させ、紙片の上で叩くことにより、ブロッキングバッファーを該プレートから除去し、100μLの希釈ファージを添加した。
3.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で2時間インキュベートした。
4. 2時間のインキュベーションの後、上清をプレートから除去した(ピペッティングする)。
5.ウェルを徹底洗浄した(200μL/ウェル)(合計25回)。
a. 200μLのPBS/Tween 0.05％で5回。
その後、密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で5分間インキュベートする。
この工程を4回行った。
b.その後、ウェルを200μLのPBSで3回洗浄した後、溶出工程を進める。
(オフレート洗浄条件用:)
1. 150μLの50～100μg/mLのGal10-His又は可溶性Gal10を各々の選択されたウェルに添加した。
2.プレートを、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、37℃で一晩又は最長2日間インキュベートした。
3.インキュベーション時間の後、ウェルを200μLのPBSで5回洗浄した。
1. 150μLの50～100μg/mLのGal10-His又は可溶性Gal10を各々の選択されたウェルに添加した。
2.プレートを、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、37℃で一晩又は最長2日間インキュベートした。
3.インキュベーション時間の後、ウェルを200μLのPBSで5回洗浄した。
(溶出:)
1. PBSを除去し、溶出を1ウェル当たり150μLのトリプシン(10mg/mL)で実施した。
2.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で15分間インキュベートした。
3.このインキュベーション時間の後、150μLの溶出溶液を、7.5μLのAEBSF(トリプシンの阻害剤)を各々のウェルに含有する96ウェルV底プレートの対応するウェルに移した。その後、溶液を5回混合し、トリプシンを適切に中和させた(上下にピペッティングする)。
1. PBSを除去し、溶出を1ウェル当たり150μLのトリプシン(10mg/mL)で実施した。
2.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で15分間インキュベートした。
3.このインキュベーション時間の後、150μLの溶出溶液を、7.5μLのAEBSF(トリプシンの阻害剤)を各々のウェルに含有する96ウェルV底プレートの対応するウェルに移した。その後、溶液を5回混合し、トリプシンを適切に中和させた(上下にピペッティングする)。
(感染/レスキュー:)
レスキュー(50mLチューブ):
1. 300μLのTG1細胞(約0.5のOD値)を、625μLの2TY及び75μLの溶出ファージ(トリプシン溶出又は競合溶出)を含有する50mLチューブに添加した。
2.チューブを、振盪させずに、37℃で30分間インキュベートした。
3.このインキュベーション時間の最後に、10mLのLB/アンピシリン/2％グルコースを、TG1/ファージを含有する各々の50mLチューブに添加した。
4.その後、チューブを、振盪させながら(110rpm)、37℃で一晩インキュベートした。
レスキュー(50mLチューブ):
1. 300μLのTG1細胞(約0.5のOD値)を、625μLの2TY及び75μLの溶出ファージ(トリプシン溶出又は競合溶出)を含有する50mLチューブに添加した。
2.チューブを、振盪させずに、37℃で30分間インキュベートした。
3.このインキュベーション時間の最後に、10mLのLB/アンピシリン/2％グルコースを、TG1/ファージを含有する各々の50mLチューブに添加した。
4.その後、チューブを、振盪させながら(110rpm)、37℃で一晩インキュベートした。
(スポッティング:)
1.スポッティング用の希釈物:
a.インプット:ファージの希釈系列(インプット)をスポッティング用の2TY中に調製した(LB寒天プレート)。
12点希釈系列(1/10)を2TY中に調製した(45μLの2TYに5μLのファージ)(10-1から10-12まで)。
b.アウトプット:ファージの希釈系列(アウトプット)をスポッティング用の2TY中に調製した(LB寒天プレート)。
6点希釈系列(1/10)を2TY中に調製した(45μLの2TYに5μLのファージ)(10-1から10-6まで)。
2.その後、50μLのTG1細胞(約0.5のOD値)を希釈プレート(インプット及びアウトプット)中の50μLのファージに添加した。
3.プレートを密閉し、振盪させずに、37℃で30分間インキュベートした。
4. 5μLの各々の希釈物(インプット: 10-6から10-12まで;アウトプット: 10-1から10-6まで)を乾燥ペトリ皿(LB/アンピシリン/グルコース)にスポッティングした。
1.スポッティング用の希釈物:
a.インプット:ファージの希釈系列(インプット)をスポッティング用の2TY中に調製した(LB寒天プレート)。
12点希釈系列(1/10)を2TY中に調製した(45μLの2TYに5μLのファージ)(10-1から10-12まで)。
b.アウトプット:ファージの希釈系列(アウトプット)をスポッティング用の2TY中に調製した(LB寒天プレート)。
6点希釈系列(1/10)を2TY中に調製した(45μLの2TYに5μLのファージ)(10-1から10-6まで)。
2.その後、50μLのTG1細胞(約0.5のOD値)を希釈プレート(インプット及びアウトプット)中の50μLのファージに添加した。
3.プレートを密閉し、振盪させずに、37℃で30分間インキュベートした。
4. 5μLの各々の希釈物(インプット: 10-6から10-12まで;アウトプット: 10-1から10-6まで)を乾燥ペトリ皿(LB/アンピシリン/グルコース)にスポッティングした。
3日目:
1.スポッティングプレート上の単一コロニーの存在を制御した。
2.一晩レスキューしたもののグリセロールストックを行った(1mLの培養物＋500μLの60％グリセロールをクライオバイアルに入れ、-80℃で保存した)。
1.スポッティングプレート上の単一コロニーの存在を制御した。
2.一晩レスキューしたもののグリセロールストックを行った(1mLの培養物＋500μLの60％グリセロールをクライオバイアルに入れ、-80℃で保存した)。
(マスタープレートの作製:)
1.適当なレスキューから、2TY中の希釈系列を調製した。
6点希釈系列(1/10)を2TY中に調製した(45μLの2TYに5μLのファージ)(10-1から10-6まで)。
2. 50μLの選択された希釈物(10-3/10-4)を、2％グルコース及びアンピシリンを含む固形LB培地を含有するペトリ皿に移した。
3.ガラスビーズとともに振盪させることにより、TG1細胞を均一に分布させた。
4.ビーズを除去し、ペトリ皿を37℃で一晩インキュベートした。
1.適当なレスキューから、2TY中の希釈系列を調製した。
6点希釈系列(1/10)を2TY中に調製した(45μLの2TYに5μLのファージ)(10-1から10-6まで)。
2. 50μLの選択された希釈物(10-3/10-4)を、2％グルコース及びアンピシリンを含む固形LB培地を含有するペトリ皿に移した。
3.ガラスビーズとともに振盪させることにより、TG1細胞を均一に分布させた。
4.ビーズを除去し、ペトリ皿を37℃で一晩インキュベートした。
(抗Gal10リード(Fab)の産生及び精製)
(ペリプラズム抽出物の産生)
1日目:
(植菌:)
1.マスタープレートを振盪させながら37℃でインキュベートした(110rpm)。
2. 1mLの2TY/アンピシリン/0.1％グルコースをV型底96ディープウェルプレートの各々のウェルに添加した後、振盪させながら15分間37℃でインキュベートした(110rpm)。
3.その後、マスタープレートからの10μLの細菌をディープウェルプレートの1mLの培地に添加した。
4.その後、プレートを、約0.8～1.0のOD600値に達するまで(6～7時間)、振盪させながら(110rpm)、37℃でインキュベートした。
(ペリプラズム抽出物の産生)
1日目:
(植菌:)
1.マスタープレートを振盪させながら37℃でインキュベートした(110rpm)。
2. 1mLの2TY/アンピシリン/0.1％グルコースをV型底96ディープウェルプレートの各々のウェルに添加した後、振盪させながら15分間37℃でインキュベートした(110rpm)。
3.その後、マスタープレートからの10μLの細菌をディープウェルプレートの1mLの培地に添加した。
4.その後、プレートを、約0.8～1.0のOD600値に達するまで(6～7時間)、振盪させながら(110rpm)、37℃でインキュベートした。
(産生の誘導)
1. scFv又はFabの産生を誘導するために、1ウェル当たり100μLのIPTG(2TY＋アンピシリン中、10mM IPTG;ウェル中の最終濃度＝+/-1mM IPTG)を添加した。
2.プレートを、振盪させながら(110rpm)、26℃で一晩インキュベートした。
1. scFv又はFabの産生を誘導するために、1ウェル当たり100μLのIPTG(2TY＋アンピシリン中、10mM IPTG;ウェル中の最終濃度＝+/-1mM IPTG)を添加した。
2.プレートを、振盪させながら(110rpm)、26℃で一晩インキュベートした。
2日目:
1.翌日、96-ディープウェルプレートを4℃に冷却した遠心分離機で4800gで15分間遠心分離して、細菌をペレット化した。
2.培地を除去した(注ぎ落とし、紙の上で乾燥させる)。
3.プレートを密閉し、-20℃で一晩保存した。
1.翌日、96-ディープウェルプレートを4℃に冷却した遠心分離機で4800gで15分間遠心分離して、細菌をペレット化した。
2.培地を除去した(注ぎ落とし、紙の上で乾燥させる)。
3.プレートを密閉し、-20℃で一晩保存した。
3日目:
1.プレートを-20℃から-80℃に少なくとも1時間移した。
2.細菌ペレットを室温で30分間解凍した。
3.ペレットを1ウェル当たり110μLのPBSで再懸濁させた後、1分間ボルテックス処理した。
4.プレートをシェーカー(900rpm)上で室温で90分間インキュベートした。
5.このインキュベーション時間の後、次に、細菌を遠心分離した(4800g、15分、4℃)。
6.上清(scFv又はFabペリ)を新しいV底96ウェルプレートに移した。
7. scFv又はFabクローンを含有するペリプラズム画分の保存を-20℃で行った。
1.プレートを-20℃から-80℃に少なくとも1時間移した。
2.細菌ペレットを室温で30分間解凍した。
3.ペレットを1ウェル当たり110μLのPBSで再懸濁させた後、1分間ボルテックス処理した。
4.プレートをシェーカー(900rpm)上で室温で90分間インキュベートした。
5.このインキュベーション時間の後、次に、細菌を遠心分離した(4800g、15分、4℃)。
6.上清(scFv又はFabペリ)を新しいV底96ウェルプレートに移した。
7. scFv又はFabクローンを含有するペリプラズム画分の保存を-20℃で行った。
(ヒトFab断片骨格中へのVH及びVL配列の再クローニング)
(DNAストリング設計)
1. AbAlignerソフトウェア(バージョン番号なし)を用いて、VH及びVLを整列させ、最も近いヒト生殖系列変異体と比較した。
2. CDR領域(CDR1及び3の+1残基前)を生殖系列変異体のFW領域に移植した。
3.ヒトでの産生のためのヌクレオチド配列の最適化を、GeneArt(登録商標)ツール(Life Technologies(商標))を用いて行った。
4.その後、BsmBI制限部位をpUPEXベクターへの再クローニング用の最適化されたアミノ酸配列の5'及び3'に付加した。
5.最後に、DNAストリングをLife Technologies(商標)(Thermo Fisher Scientific(商標))に注文した。
(DNAストリング設計)
1. AbAlignerソフトウェア(バージョン番号なし)を用いて、VH及びVLを整列させ、最も近いヒト生殖系列変異体と比較した。
2. CDR領域(CDR1及び3の+1残基前)を生殖系列変異体のFW領域に移植した。
3.ヒトでの産生のためのヌクレオチド配列の最適化を、GeneArt(登録商標)ツール(Life Technologies(商標))を用いて行った。
4.その後、BsmBI制限部位をpUPEXベクターへの再クローニング用の最適化されたアミノ酸配列の5'及び3'に付加した。
5.最後に、DNAストリングをLife Technologies(商標)(Thermo Fisher Scientific(商標))に注文した。
(BsmBIによるDNAストリングの消化)
1.各々のクローンについて、200ngのVH及びVLを20μLの最終容量の10×Tangoバッファー中のBsmBIで消化した。
2.混合物を下の表に従って調製し、10μLを、PCRプレートのプレートレイアウトに従って、各々のウェルに分注した。
3.その後、PCRプレートを37℃で2時間インキュベートした(Thermocycler中)。
表28: PCRサイクル条件
1.各々のクローンについて、200ngのVH及びVLを20μLの最終容量の10×Tangoバッファー中のBsmBIで消化した。
2.混合物を下の表に従って調製し、10μLを、PCRプレートのプレートレイアウトに従って、各々のウェルに分注した。
3.その後、PCRプレートを37℃で2時間インキュベートした(Thermocycler中)。
(消化されたDNAのPCRクリーンアップ)
消化されたストリングのクリーンアップをNucleoSpin Gel and PCR Clean upキットとともに提供されているプロトコルに従って実施した:
1. 37℃で2時間のインキュベーションの後、80μLのMQ水を各々の消化されたDNAストリングに添加し、その後、200μLのNTIバッファーを添加した後、PCR Clean upカラムに移し、11,000gで1分間遠心分離した。
2.フロースルーを捨て、700μLのNT3を添加して、メンブレンを洗浄し、カラムを11,000gで1分間遠心分離した。この工程を2回実施した。
3.フロースルーを捨て、カラムを11,000gで3分間遠心分離した。
4.最後に、PCR Clean-upカラムを1.5mLチューブに移し、25μLの温MQ水(70℃)を添加することにより、溶出を行った。
5.室温でのインキュベーション工程(1分間)の後、カラムを11,000gで1分間遠心分離し、溶出液のDNAをNanodrop(260nm)で測定した。
消化されたストリングのクリーンアップをNucleoSpin Gel and PCR Clean upキットとともに提供されているプロトコルに従って実施した:
1. 37℃で2時間のインキュベーションの後、80μLのMQ水を各々の消化されたDNAストリングに添加し、その後、200μLのNTIバッファーを添加した後、PCR Clean upカラムに移し、11,000gで1分間遠心分離した。
2.フロースルーを捨て、700μLのNT3を添加して、メンブレンを洗浄し、カラムを11,000gで1分間遠心分離した。この工程を2回実施した。
3.フロースルーを捨て、カラムを11,000gで3分間遠心分離した。
4.最後に、PCR Clean-upカラムを1.5mLチューブに移し、25μLの温MQ水(70℃)を添加することにより、溶出を行った。
5.室温でのインキュベーション工程(1分間)の後、カラムを11,000gで1分間遠心分離し、溶出液のDNAをNanodrop(260nm)で測定した。
(消化されたDNAと重鎖及び軽鎖ベクターとのライゲーション)
1.消化されたVH/VL(BsmBI)を
a. VH用のヒトCH1ドメインBsmBI消化ベクター(pUPEX86)
b. VL用のヒトラムダBsmBI消化ベクター(pUPEX116.9)
:に挿入した。
2.ライゲーション混合物を、下の表に従って、1:5(ベクター:挿入物)の比で1.5mLチューブに調製した。
表29:ライゲーション条件
3.ライゲーション混合物を室温で1時間インキュベートした。
1.消化されたVH/VL(BsmBI)を
a. VH用のヒトCH1ドメインBsmBI消化ベクター(pUPEX86)
b. VL用のヒトラムダBsmBI消化ベクター(pUPEX116.9)
:に挿入した。
2.ライゲーション混合物を、下の表に従って、1:5(ベクター:挿入物)の比で1.5mLチューブに調製した。
3.ライゲーション混合物を室温で1時間インキュベートした。
(Top10コンピテント細胞での形質転換)
各々のライゲーション産物のTop10コンピテント細胞への形質転換を熱ショックによって行った。
1. 1時間のインキュベーションの後、ライゲーション混合物を5分間氷に移した。
2. Top10コンピテント細胞を氷上で解凍し、40μLのTop10細胞を15μLの各々のライゲーション産物に添加した。
3.チューブを氷上に5分間移した。
4.コンピテントTop10細胞の形質転換を、温水浴中、42℃で90秒の熱ショックによって行った。
5.その後、チューブを氷上で1～2分間インキュベートした。
6.最後に、形質転換されたTop10細胞を、2％グルコース及びアンピシリン(ベクターの耐性遺伝子)を含む固形LB培地を含有するペトリ皿に移した。
7.ガラスビーズとともに振盪させることにより、細胞の均一分布を行った。
8.ビーズを除去し、ペトリ皿を37℃で一晩インキュベートした。
各々のライゲーション産物のTop10コンピテント細胞への形質転換を熱ショックによって行った。
1. 1時間のインキュベーションの後、ライゲーション混合物を5分間氷に移した。
2. Top10コンピテント細胞を氷上で解凍し、40μLのTop10細胞を15μLの各々のライゲーション産物に添加した。
3.チューブを氷上に5分間移した。
4.コンピテントTop10細胞の形質転換を、温水浴中、42℃で90秒の熱ショックによって行った。
5.その後、チューブを氷上で1～2分間インキュベートした。
6.最後に、形質転換されたTop10細胞を、2％グルコース及びアンピシリン(ベクターの耐性遺伝子)を含む固形LB培地を含有するペトリ皿に移した。
7.ガラスビーズとともに振盪させることにより、細胞の均一分布を行った。
8.ビーズを除去し、ペトリ皿を37℃で一晩インキュベートした。
(コロニー採取及びシークエンシング)
1.一晩のインキュベーションの後、ライゲーション産物が多数の単一細菌コロニーを示したのに対し、陰性対照(空ベクター)については、全く/ほとんどコロニーが観察されなかった。
2. VH又はVL当たり、8つの単一コロニーをp10の先端で採取し、2％グルコース及び1/1000アンピシリンが補充された100μLのLB培地を含有する平底96ウェルプレートに移した。
3.プレートを通気性シールテープで密閉し、120rpmで37℃で5時間インキュベートした。
4.最後に、10μLの各々のクローンをシークエンシングプレート(固形LB培地＋2％グルコース及び1/1000アンピシリンを含有する96ウェル平底プレート)に移した。
5.シークエンシングプレートをLGC genomic(プライマーp90)に送付した。
6. LGC genomicから得られたDNA配列をソフトウェアClone Managerバージョンn°9で解析した。各々のクローンの配列を整列させ、順番に配置された配列と比較した。
7.親配列と類似したDNA配列(DNAストリング)を示すクローンを選択した。
1.一晩のインキュベーションの後、ライゲーション産物が多数の単一細菌コロニーを示したのに対し、陰性対照(空ベクター)については、全く/ほとんどコロニーが観察されなかった。
2. VH又はVL当たり、8つの単一コロニーをp10の先端で採取し、2％グルコース及び1/1000アンピシリンが補充された100μLのLB培地を含有する平底96ウェルプレートに移した。
3.プレートを通気性シールテープで密閉し、120rpmで37℃で5時間インキュベートした。
4.最後に、10μLの各々のクローンをシークエンシングプレート(固形LB培地＋2％グルコース及び1/1000アンピシリンを含有する96ウェル平底プレート)に移した。
5.シークエンシングプレートをLGC genomic(プライマーp90)に送付した。
6. LGC genomicから得られたDNA配列をソフトウェアClone Managerバージョンn°9で解析した。各々のクローンの配列を整列させ、順番に配置された配列と比較した。
7.親配列と類似したDNA配列(DNAストリング)を示すクローンを選択した。
(増幅及びMidiPrep:)
1.コンストラクト毎に、2％グルコース及び1/1000アンピシリンを含有する10mLのLB培地への20μLの培養物の播種を午前中に実施した。
2.培養物を37℃、120rpmでインキュベートした。
3.夕方、培養物を100mL＋1/1000アンピシリンに移した(グルコースは、Midiprep DNAのシークエンシングに干渉し得るので含めず、pUPEXベクターは、グルコースを必要としない)。
4.培養物を37℃、120rpmで一晩インキュベートした。
1.コンストラクト毎に、2％グルコース及び1/1000アンピシリンを含有する10mLのLB培地への20μLの培養物の播種を午前中に実施した。
2.培養物を37℃、120rpmでインキュベートした。
3.夕方、培養物を100mL＋1/1000アンピシリンに移した(グルコースは、Midiprep DNAのシークエンシングに干渉し得るので含めず、pUPEXベクターは、グルコースを必要としない)。
4.培養物を37℃、120rpmで一晩インキュベートした。
MidiPrepをキットとともに提供されているプロトコルに従って実施した:
1. 110mLの培養物を遠心分離(4800g、4℃で15分間)によりペレット化した。
2.上清を除去し、ペレットをRNAseを含む8mLのRESバッファーに再懸濁させた(ボルテックス処理又はピペットにより)。
3. 8mLのLYSバッファーを添加し、溶液が完全に青くなるまで、各々のチューブを5回転倒させ(ボルテックス処理はしない)、室温で5分間インキュベートした。
4. 8mLのNEUバッファーを添加し、溶液が白くなるまで混合した。
5. NucleonBond Xtra Midi Column及びフィルターを12mLのEQUバッファーで平衡化した。
6.細菌溶液を平衡化されたカラムの境界上に静かにかつゆっくりと移した。
7. 1回目の洗浄を5mLのEQUバッファーで実施し、完全に溶出した後、NucleonBond Xtraカラムフィルターを除去し、2回目の洗浄を8mLのWASHバッファーで実施した。
8.その後、カラムを50mLチューブに移し、溶出を5mLのELUバッファーで実施した。
9. DNAの沈殿を、3.5mLのイソプロパノールを添加することにより行った。チューブをボルテックス処理し、4800g、4℃で30分間遠心分離した。
10.上清を除去し、2mLの70％エタノールを添加した。
11.チューブを4800g、4℃で30分間遠心分離した。
12.上清を除去し、ペレットを室温で1時間乾燥させた。
13.最後に、100μLの2×MQ水を添加して、ペレットを再懸濁させ、室温で振盪させながら(900rpm)、30分間インキュベートした後、DNA濃度をNanodropで測定した。
1. 110mLの培養物を遠心分離(4800g、4℃で15分間)によりペレット化した。
2.上清を除去し、ペレットをRNAseを含む8mLのRESバッファーに再懸濁させた(ボルテックス処理又はピペットにより)。
3. 8mLのLYSバッファーを添加し、溶液が完全に青くなるまで、各々のチューブを5回転倒させ(ボルテックス処理はしない)、室温で5分間インキュベートした。
4. 8mLのNEUバッファーを添加し、溶液が白くなるまで混合した。
5. NucleonBond Xtra Midi Column及びフィルターを12mLのEQUバッファーで平衡化した。
6.細菌溶液を平衡化されたカラムの境界上に静かにかつゆっくりと移した。
7. 1回目の洗浄を5mLのEQUバッファーで実施し、完全に溶出した後、NucleonBond Xtraカラムフィルターを除去し、2回目の洗浄を8mLのWASHバッファーで実施した。
8.その後、カラムを50mLチューブに移し、溶出を5mLのELUバッファーで実施した。
9. DNAの沈殿を、3.5mLのイソプロパノールを添加することにより行った。チューブをボルテックス処理し、4800g、4℃で30分間遠心分離した。
10.上清を除去し、2mLの70％エタノールを添加した。
11.チューブを4800g、4℃で30分間遠心分離した。
12.上清を除去し、ペレットを室温で1時間乾燥させた。
13.最後に、100μLの2×MQ水を添加して、ペレットを再懸濁させ、室温で振盪させながら(900rpm)、30分間インキュベートした後、DNA濃度をNanodropで測定した。
(抗ガレクチン-10クローンの産生)
(HEK293E細胞のトランスフェクション)
1日目:
1. HEK293E細胞を0.3E+06細胞/mLで播種した。
(HEK293E細胞のトランスフェクション)
1日目:
1. HEK293E細胞を0.3E+06細胞/mLで播種した。
2日目:
抗Gal10クローン毎に、+/-7.6mLの予め温めておいた(37℃) Optimem培地を含有する15mLチューブを用意した。
表30:形質転換成分
抗Gal10クローン毎に、+/-7.6mLの予め温めておいた(37℃) Optimem培地を含有する15mLチューブを用意した。
1. VH及びVLのMidiPrep DNAを100μgの最終量(VH 25μg＋VL 75μg)となるように1:3の比で添加した。
2.最後に、300μgのPEIをチューブに滴加し、短時間ボルテックス処理した。
3.培地/DNA/PEIの混合物を室温で10分間インキュベートした後、200mLのHEK293E培養物に添加した。
4.最後に、細胞をインキュベーター(37℃、5％CO2、120rpm)に戻した。
5.トランスフェクションから4時間後、予め温めておいた(37℃) 1/20 Hypep 1510を各々の培養物に添加した。
6. 6日間産生した後、各々の抗Gal10クローンの培地の全てを、50mLチューブに回収した。
7.チューブを1000g及び4℃で10分間遠心分離し、上清を新しい50mLチューブに移した。
2.最後に、300μgのPEIをチューブに滴加し、短時間ボルテックス処理した。
3.培地/DNA/PEIの混合物を室温で10分間インキュベートした後、200mLのHEK293E培養物に添加した。
4.最後に、細胞をインキュベーター(37℃、5％CO2、120rpm)に戻した。
5.トランスフェクションから4時間後、予め温めておいた(37℃) 1/20 Hypep 1510を各々の培養物に添加した。
6. 6日間産生した後、各々の抗Gal10クローンの培地の全てを、50mLチューブに回収した。
7.チューブを1000g及び4℃で10分間遠心分離し、上清を新しい50mLチューブに移した。
(Capture Select IgG CH1ビーズを用いる産生された抗Gal10 Fabの精製)
産生されたファブの精製をCapture Select IgG CH1ビーズを用いて行った。
産生されたファブの精製をCapture Select IgG CH1ビーズを用いて行った。
1日目:
1. CaptureSelect IgG CH1ビーズを、50mLチューブ中、PBSで3回洗浄することにより平衡化し、PBS中の50％スラリーを作製した。
2. HEK培養物の上清を含有する50mLチューブ当たり500μLの平衡化された50％スラリービーズを添加した。
3.チューブをローター(19rpm)上で4℃で一晩インキュベートした。
1. CaptureSelect IgG CH1ビーズを、50mLチューブ中、PBSで3回洗浄することにより平衡化し、PBS中の50％スラリーを作製した。
2. HEK培養物の上清を含有する50mLチューブ当たり500μLの平衡化された50％スラリービーズを添加した。
3.チューブをローター(19rpm)上で4℃で一晩インキュベートした。
2日目:
1.ビーズをスピンダウンした(630g、2分、4℃、加速＝9、減速＝7)。
2.上清を新しい50mLチューブに回収した。
3. 1mLの1×PBSを(ファルコンの側面に沿って)ビーズに添加し;再懸濁させ;カラムに移した(100mLのHEK培養物当たりカラム1本)。
4. 4mLの1×PBSを用いてチューブを洗浄した後、カラムに移した。
5.洗浄工程を2回繰り返した。
6.カラムを5mLの1×PBSで5回洗浄した。
7.洗浄工程の間、1クローンにつき3本の2mLチューブを用意し、100μLの中和溶液(1M Tris pH8)を各々のチューブに添加した。
8.溶出のために、カラムを2mLチューブ(中和溶液を含有)に移し、1mLの溶出溶液(0.1Mグリシン、pH 3)を添加した。完全に溶出させた後、カラムを別の2mLチューブに移し、溶出を2回繰り返した。チューブを適切に混合して、溶出溶液を良好に中和させた。
9.その後、各々の溶出画分のタンパク質濃度をNanodrop(280nm)を用いて決定した。
10. Amicon Ultra-4遠心分離フィルターに4mLをローディングすることにより、バッファー交換を実施した。その後、カラムを4000gで4℃で15分間遠心分離し、フロースルーを捨て、5mLの1×PBSを上部チャンバーに添加した。カラムを再度遠心分離し、5mLの1×PBSで合計5回洗浄した。
11.その後、タンパク質濃度をNanodropで測定し、各々のクローンの減衰係数で補正した。
1.ビーズをスピンダウンした(630g、2分、4℃、加速＝9、減速＝7)。
2.上清を新しい50mLチューブに回収した。
3. 1mLの1×PBSを(ファルコンの側面に沿って)ビーズに添加し;再懸濁させ;カラムに移した(100mLのHEK培養物当たりカラム1本)。
4. 4mLの1×PBSを用いてチューブを洗浄した後、カラムに移した。
5.洗浄工程を2回繰り返した。
6.カラムを5mLの1×PBSで5回洗浄した。
7.洗浄工程の間、1クローンにつき3本の2mLチューブを用意し、100μLの中和溶液(1M Tris pH8)を各々のチューブに添加した。
8.溶出のために、カラムを2mLチューブ(中和溶液を含有)に移し、1mLの溶出溶液(0.1Mグリシン、pH 3)を添加した。完全に溶出させた後、カラムを別の2mLチューブに移し、溶出を2回繰り返した。チューブを適切に混合して、溶出溶液を良好に中和させた。
9.その後、各々の溶出画分のタンパク質濃度をNanodrop(280nm)を用いて決定した。
10. Amicon Ultra-4遠心分離フィルターに4mLをローディングすることにより、バッファー交換を実施した。その後、カラムを4000gで4℃で15分間遠心分離し、フロースルーを捨て、5mLの1×PBSを上部チャンバーに添加した。カラムを再度遠心分離し、5mLの1×PBSで合計5回洗浄した。
11.その後、タンパク質濃度をNanodropで測定し、各々のクローンの減衰係数で補正した。
(ELISAによる抗Gal10分子の結合及びエピトープビニングのスクリーニング及び特性解析)
(scFv又はFabペリプラズム抽出物の結合特性のスクリーニング)
(結合ELISA)
1日目:
1. Maxisorpプレートを1ウェル当たり100μLのヒトGal10-His(0.5μg/mL、1×PBSに希釈)でコーティングした。
2.プレートをシールテープで密閉し、4℃で一晩インキュベートした。
(scFv又はFabペリプラズム抽出物の結合特性のスクリーニング)
(結合ELISA)
1日目:
1. Maxisorpプレートを1ウェル当たり100μLのヒトGal10-His(0.5μg/mL、1×PBSに希釈)でコーティングした。
2.プレートをシールテープで密閉し、4℃で一晩インキュベートした。
2日目:
1.翌日、プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで5回洗浄した。
2.その後、1ウェル当たり300μLのブロッキング溶液(1×PBS 1％カゼイン)を添加した。
3.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で2時間インキュベートした。
4.インキュベーション時間中、Periplasmic Master Plate(PMP)プレートからのペリプラズム抽出物をMicroplate 96ウェルU底プレート中の1×PBS-0.1％カゼインに5分の1希釈した。
5.ブロッキング溶液で2時間インキュベートした後、プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで5回洗浄した。
6. 200μLマルチチャンネルピペットを用いて、1ウェル当たり100μLの各々の希釈されたscFv-ペリプラズム抽出物を希釈プレートからコーティングプレートに移した。
7.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で1時間インキュベートした。
8.このインキュベーション時間中に、検出抗体(ウサギ抗Myc HRPコンジュゲート、1/2000)を十分量の1×PBS-0.1％カゼイン中に調製した。
9. 1時間のインキュベーションの後、プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで5回洗浄した。
10. 200μLマルチチャンネルピペットを用いて、1ウェル当たり100μLの検出抗体をコーティングプレートに移した。
11.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で1時間インキュベートした。
12.インキュベーション時間の終了の15分前に、TMB溶液を室温に移した。
13.インキュベーション後、プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで5回洗浄した。
14. 200μLマルチチャンネルピペットを用いて、1ウェル当たり100μLのTMBを添加し、450rpmで振盪させながら5分間インキュベートした後、1ウェル当たり100μLの0.5M H2SO4を添加することにより、反応を停止させた。
15.その後、吸光度を、Tecan装置及びMagellanソフトウェアバージョンn°7.2を用いて、450nmで測定した(基準は620nm)。
1.翌日、プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで5回洗浄した。
2.その後、1ウェル当たり300μLのブロッキング溶液(1×PBS 1％カゼイン)を添加した。
3.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で2時間インキュベートした。
4.インキュベーション時間中、Periplasmic Master Plate(PMP)プレートからのペリプラズム抽出物をMicroplate 96ウェルU底プレート中の1×PBS-0.1％カゼインに5分の1希釈した。
5.ブロッキング溶液で2時間インキュベートした後、プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで5回洗浄した。
6. 200μLマルチチャンネルピペットを用いて、1ウェル当たり100μLの各々の希釈されたscFv-ペリプラズム抽出物を希釈プレートからコーティングプレートに移した。
7.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で1時間インキュベートした。
8.このインキュベーション時間中に、検出抗体(ウサギ抗Myc HRPコンジュゲート、1/2000)を十分量の1×PBS-0.1％カゼイン中に調製した。
9. 1時間のインキュベーションの後、プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで5回洗浄した。
10. 200μLマルチチャンネルピペットを用いて、1ウェル当たり100μLの検出抗体をコーティングプレートに移した。
11.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で1時間インキュベートした。
12.インキュベーション時間の終了の15分前に、TMB溶液を室温に移した。
13.インキュベーション後、プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで5回洗浄した。
14. 200μLマルチチャンネルピペットを用いて、1ウェル当たり100μLのTMBを添加し、450rpmで振盪させながら5分間インキュベートした後、1ウェル当たり100μLの0.5M H2SO4を添加することにより、反応を停止させた。
15.その後、吸光度を、Tecan装置及びMagellanソフトウェアバージョンn°7.2を用いて、450nmで測定した(基準は620nm)。
(競合ELISA(7B07エピトープへの結合))
まず、Maxisorpプレートを7B07 hIG1でコーティングした(ここで、hGal10-Hisが捕捉される)。その後、1/5希釈で希釈されたペリプラズム抽出物を添加した。検出をウサギ抗Myc-HRP抗体で行った。
まず、Maxisorpプレートを7B07 hIG1でコーティングした(ここで、hGal10-Hisが捕捉される)。その後、1/5希釈で希釈されたペリプラズム抽出物を添加した。検出をウサギ抗Myc-HRP抗体で行った。
1日目:
1. Maxisorpプレートを1ウェル当たり100μLの7B07_hIgG1(3μg/mL、1×PBSに希釈)でコーティングした。
2.プレートを密閉し、4℃で一晩インキュベートした。
1. Maxisorpプレートを1ウェル当たり100μLの7B07_hIgG1(3μg/mL、1×PBSに希釈)でコーティングした。
2.プレートを密閉し、4℃で一晩インキュベートした。
2日目:
1.プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで5回洗浄した。
2. 1ウェル当たり300μLの1×PBS-1％カゼインを添加することにより、ブロッキング工程を行った。
3.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で2時間インキュベートした。
4.このインキュベーション時間の後、プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで5回洗浄した。
5.次に、1μg/mLのヒトGal10-Hisを添加した(1ウェル当たり100μL、1×PBS-0.1％カゼインに希釈)。
6.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で1時間インキュベートした。
7.インキュベーション時間中、scFv/Fabの選択されたペリプラズム抽出物の5分の1希釈物を別のMicroplate 96ウェルU底プレート中の1×PBS-0.1％カゼイン中に調製した。
8. Gal10-Hisとともに1時間インキュベートした後、プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで5回洗浄した。
9.その後、200μLのマルチチャンネルピペットを用いて、100μLの各々のペリプラズム抽出物をコーティングプレートに添加した。
10.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で1時間インキュベートした。
11.このインキュベーション時間の後、プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで5回洗浄した。
12. 1×PBS-0.1％カゼインに希釈された1ウェル当たり100μLのHRPコンジュゲートされたウサギ抗Mycを添加することにより、検出を実施した。
13.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら室温で1時間インキュベートした。
14.インキュベーション時間の終了の15分前に、TMBを室温に移した。
15.その後、プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで5回洗浄した。
16.最後に、200μLのマルチチャンネルピペットを用いて、1ウェル当たり100μLのTMBをプレートに添加した。450rpmで振盪させながら5分間反応させ、1ウェル当たり100μLの0.5M H2SO4を添加することにより、反応を停止させた。
17.吸光度を、Tecan装置を用いて、450nm(基準は620nm)で測定した。
1.プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで5回洗浄した。
2. 1ウェル当たり300μLの1×PBS-1％カゼインを添加することにより、ブロッキング工程を行った。
3.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で2時間インキュベートした。
4.このインキュベーション時間の後、プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで5回洗浄した。
5.次に、1μg/mLのヒトGal10-Hisを添加した(1ウェル当たり100μL、1×PBS-0.1％カゼインに希釈)。
6.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で1時間インキュベートした。
7.インキュベーション時間中、scFv/Fabの選択されたペリプラズム抽出物の5分の1希釈物を別のMicroplate 96ウェルU底プレート中の1×PBS-0.1％カゼイン中に調製した。
8. Gal10-Hisとともに1時間インキュベートした後、プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで5回洗浄した。
9.その後、200μLのマルチチャンネルピペットを用いて、100μLの各々のペリプラズム抽出物をコーティングプレートに添加した。
10.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で1時間インキュベートした。
11.このインキュベーション時間の後、プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで5回洗浄した。
12. 1×PBS-0.1％カゼインに希釈された1ウェル当たり100μLのHRPコンジュゲートされたウサギ抗Mycを添加することにより、検出を実施した。
13.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら室温で1時間インキュベートした。
14.インキュベーション時間の終了の15分前に、TMBを室温に移した。
15.その後、プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで5回洗浄した。
16.最後に、200μLのマルチチャンネルピペットを用いて、1ウェル当たり100μLのTMBをプレートに添加した。450rpmで振盪させながら5分間反応させ、1ウェル当たり100μLの0.5M H2SO4を添加することにより、反応を停止させた。
17.吸光度を、Tecan装置を用いて、450nm(基準は620nm)で測定した。
(Fabの結合特性のスクリーニング)
(エピトープビニング)
1日目:
1. Maxisorpプレートを100μLのヒトGal10-His(1.25μg/mL、1×PBSに希釈)でコーティングした。
2.プレートを密閉し、4℃で一晩インキュベートした。
(エピトープビニング)
1日目:
1. Maxisorpプレートを100μLのヒトGal10-His(1.25μg/mL、1×PBSに希釈)でコーティングした。
2.プレートを密閉し、4℃で一晩インキュベートした。
2日目:
1.プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで3回洗浄した。
2. 1ウェル当たり300μLの1×PBS-1％カゼインを添加することにより、ブロッキング工程を行った。
3.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で2時間インキュベートした。
4.このインキュベーション時間中、選択されたFabの希釈物をMicroplate 96ウェルU底プレート中の50μLの1×PBS-0.1％カゼイン中に40μg/mLで調製した。希釈されたFabの最終濃度は、20μg/mLとなる。
5.ブロッキング溶液で2時間インキュベートした後、プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで3回洗浄した。
6. 200μLマルチチャンネルピペットを用いて、50μLの各々のFab希釈物を希釈プレートからコーティングプレートに移した。
7.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で30分間インキュベートした。
8. 30分後、50μLの400ng/mLのビオチン化クローン7B07(hFab)を各々のウェルに添加して、200ng/mLの最終濃度に到達させた。
9.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で1時間インキュベートした。
10.このインキュベーションの後、プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで5回洗浄した。
11.その後、100μLのペルオキシダーゼストレプトアビジン(1×PBS-0.1％カゼインに1/5000で希釈)を用いて、検出を実施した。
12.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で1時間インキュベートした。
13.インキュベーション時間の終了の15分前に、TMBを室温に移した。
14.このインキュベーション時間の後、プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで5回洗浄した。
15.最後に、1ウェル当たり100μLのTMBを添加した。反応を450rpmで振盪させながら10分間実施した後、1ウェル当たり100μLの0.5M H2SO4を添加することにより、反応を停止させた。
16.吸光度を、Tecan装置及びMagellanソフトウェアバージョンn°7.2を用いて、450nmで測定した(基準は620nm)。
1.プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで3回洗浄した。
2. 1ウェル当たり300μLの1×PBS-1％カゼインを添加することにより、ブロッキング工程を行った。
3.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で2時間インキュベートした。
4.このインキュベーション時間中、選択されたFabの希釈物をMicroplate 96ウェルU底プレート中の50μLの1×PBS-0.1％カゼイン中に40μg/mLで調製した。希釈されたFabの最終濃度は、20μg/mLとなる。
5.ブロッキング溶液で2時間インキュベートした後、プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで3回洗浄した。
6. 200μLマルチチャンネルピペットを用いて、50μLの各々のFab希釈物を希釈プレートからコーティングプレートに移した。
7.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で30分間インキュベートした。
8. 30分後、50μLの400ng/mLのビオチン化クローン7B07(hFab)を各々のウェルに添加して、200ng/mLの最終濃度に到達させた。
9.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で1時間インキュベートした。
10.このインキュベーションの後、プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで5回洗浄した。
11.その後、100μLのペルオキシダーゼストレプトアビジン(1×PBS-0.1％カゼインに1/5000で希釈)を用いて、検出を実施した。
12.プレートを密閉し、プラットフォームシェーカーで450rpmで振盪させながら、室温で1時間インキュベートした。
13.インキュベーション時間の終了の15分前に、TMBを室温に移した。
14.このインキュベーション時間の後、プレートを1ウェル当たり300μLの1×PBS-0.05％Tweenで5回洗浄した。
15.最後に、1ウェル当たり100μLのTMBを添加した。反応を450rpmで振盪させながら10分間実施した後、1ウェル当たり100μLの0.5M H2SO4を添加することにより、反応を停止させた。
16.吸光度を、Tecan装置及びMagellanソフトウェアバージョンn°7.2を用いて、450nmで測定した(基準は620nm)。
(OctetRed96によるFabペリプラズム抽出物の結合スクリーニング)
BLIは、生体分子間相互作用を測定するための無標識技術である。これは、2つの表面:バイオセンサーの先端部の固定化されたタンパク質の層及び内部参照層から反射される白色光の干渉パターンを分析する光学分析技法である。バイオセンサーの先端部に結合している分子の数の何らかの変化によって、リアルタイムで測定することができる干渉パターンの変化が生じる。
BLIは、生体分子間相互作用を測定するための無標識技術である。これは、2つの表面:バイオセンサーの先端部の固定化されたタンパク質の層及び内部参照層から反射される白色光の干渉パターンを分析する光学分析技法である。バイオセンサーの先端部に結合している分子の数の何らかの変化によって、リアルタイムで測定することができる干渉パターンの変化が生じる。
BLI Octetスクリーニングアッセイを用いて、選択工程の後にペリプラズム抽出物として産生されたFabの結合能を試験した。
1. Hisタグ化ヒトGal10をキネティックバッファー(200μg/mL)に希釈し、1nmの捕捉レベルに達するまで、抗Penta His 1Kの先端部に捕捉させた(ローディング工程、30秒)。
2.ペリプラズム抽出物をキネティックバッファーに1:5希釈し、120秒間適用し(会合)、その後、120秒間解離させた。
3.先端部の再生をグリシンpH 1.5中で10秒間の2回の洗浄工程によって行った。
4.ペリプラズム抽出物のセンサー先端部への非特異的結合を評価するために、参照抗Penta His-1Kチップを使用した。これらの先端部を無関係なHisタグ化タンパク質(a-CD70 107B8-ソルターゼ-His D3対照)で1nmのレベルまでコーティングし、ペリプラズム抽出物とともにインキュベートした。
5. Gal10-HisのBLI結合解析を、OctetRed 96(ForteBio)を用いて25℃で実施した。
6.二重参照解析を実施し、参照先端部及びバッファー(Gal10-Hisコーティングされた先端部上)での結合をコーティングされた先端部で検出されたシグナルから除外した。
7.捕捉されたGal10-His上でのFabの結合を、ForteBio Data解析9.0ソフトウェアを用いて、1:1結合モデルでフィッティングすること(ベースラインへのY軸の整列、解離に対する工程間補正、Savitzky-Golayフィルタリング、局所的/部分的曲線フィッティング)により、動力学的パラメータを決定した。PMP当たり1カラムの抗Penta His-1Kを使用し、10回の再生サイクルの後に廃棄したことに留意されたい。
1. Hisタグ化ヒトGal10をキネティックバッファー(200μg/mL)に希釈し、1nmの捕捉レベルに達するまで、抗Penta His 1Kの先端部に捕捉させた(ローディング工程、30秒)。
2.ペリプラズム抽出物をキネティックバッファーに1:5希釈し、120秒間適用し(会合)、その後、120秒間解離させた。
3.先端部の再生をグリシンpH 1.5中で10秒間の2回の洗浄工程によって行った。
4.ペリプラズム抽出物のセンサー先端部への非特異的結合を評価するために、参照抗Penta His-1Kチップを使用した。これらの先端部を無関係なHisタグ化タンパク質(a-CD70 107B8-ソルターゼ-His D3対照)で1nmのレベルまでコーティングし、ペリプラズム抽出物とともにインキュベートした。
5. Gal10-HisのBLI結合解析を、OctetRed 96(ForteBio)を用いて25℃で実施した。
6.二重参照解析を実施し、参照先端部及びバッファー(Gal10-Hisコーティングされた先端部上)での結合をコーティングされた先端部で検出されたシグナルから除外した。
7.捕捉されたGal10-His上でのFabの結合を、ForteBio Data解析9.0ソフトウェアを用いて、1:1結合モデルでフィッティングすること(ベースラインへのY軸の整列、解離に対する工程間補正、Savitzky-Golayフィルタリング、局所的/部分的曲線フィッティング)により、動力学的パラメータを決定した。PMP当たり1カラムの抗Penta His-1Kを使用し、10回の再生サイクルの後に廃棄したことに留意されたい。
(Biacore 3000上での抗Gal10分子の結合特性解析)
(Gal10-HisによるCM5チップのコーティング)
ペリプラズム抽出物の結合特性を決定するために、CM5センサーチップを2500～3000RUのGal10-Hisでコーティングした。
1.コーティング材料を、酢酸pH 5.5中、20μg/mLの濃度で緩衝化した。
2.その後、Gal10-HisをEDC及びNHSとの反応によりCM5チップの表面で活性化されたNHSエステルに固定化した。
3.標的の固定化の後、遊離のNHSエステルの洗浄及び失活をエタノールアミンを用いて実施した。
(Gal10-HisによるCM5チップのコーティング)
ペリプラズム抽出物の結合特性を決定するために、CM5センサーチップを2500～3000RUのGal10-Hisでコーティングした。
1.コーティング材料を、酢酸pH 5.5中、20μg/mLの濃度で緩衝化した。
2.その後、Gal10-HisをEDC及びNHSとの反応によりCM5チップの表面で活性化されたNHSエステルに固定化した。
3.標的の固定化の後、遊離のNHSエステルの洗浄及び失活をエタノールアミンを用いて実施した。
(抗Hisタグ抗体によるCM5チップのコーティング)
Biacore 3000上での抗Gal10コンストラクトの結合能を決定するために、捕捉アプローチを使用した。この目的のために、BioRadモノクローナルマウス抗ヒスチジンタグ、クローンAD1.1.10を、アミンカップリングにより、4000RUの最終応答でCM5チップの4つのチャンネルにコーティングした。
1.コーティング材料を、酢酸pH 4.5中、20μg/mLの濃度で緩衝化した。
2.その後、モノクローナルmAbをEDC及びNHSとの反応によりCM5チップの表面で活性化されたNHSエステルに固定化した。
3.標的の固定化の後、遊離のNHSエステルの洗浄及び失活をエタノールアミンを用いて実施した。
Biacore 3000上での抗Gal10コンストラクトの結合能を決定するために、捕捉アプローチを使用した。この目的のために、BioRadモノクローナルマウス抗ヒスチジンタグ、クローンAD1.1.10を、アミンカップリングにより、4000RUの最終応答でCM5チップの4つのチャンネルにコーティングした。
1.コーティング材料を、酢酸pH 4.5中、20μg/mLの濃度で緩衝化した。
2.その後、モノクローナルmAbをEDC及びNHSとの反応によりCM5チップの表面で活性化されたNHSエステルに固定化した。
3.標的の固定化の後、遊離のNHSエステルの洗浄及び失活をエタノールアミンを用いて実施した。
(scFvペリプラズム抽出物の結合特性のスクリーニング(オフレートスクリーニング))
ペリプラズム抽出物の結合特性のスクリーニングのために、2600RUのGal10-Hisでコーティングされたチップを使用した。
1. 96ウェルプレートに-20℃で保存されたペリを解凍し、新しい丸底96ウェルBiacoreプレート中の40μLのHBS-EPランニングバッファーに10μLのペリを添加することにより、1:5希釈した。プレートを密閉した。
2.プライミング、標準化、及びプライミングのサイクルの後、コーティングされたCM5チップを、4サイクルの10μL HBS-EPバッファーpH 7.4を用いて、ランニングバッファーに対して平衡化した。
3. 5μL/分の流量を用いて、25μLの希釈ペリプラズム抽出物を注入した。
4. 15分後、6μLの8mM NaOH(流量100μL/分のQuickinject)を注入することにより、チップの再生を実施し、その後、新しい試料を注入した。
5.データ解析を、「BIAevaluation」ソフトウェアバージョンn°4.1.1を用いて、2-1及び4-3減算を用いて行った。センサーグラムバッファーのみを参照として使用し、そのシグナルを除外した(Y変換)。最後に、フィッティングモデルを用いて、Gal10-Hisに対するクローンの親和性及びオフレートを決定した(Fit Kineticsの個別のka/kd/解離/Langmuir解離)。
ペリプラズム抽出物の結合特性のスクリーニングのために、2600RUのGal10-Hisでコーティングされたチップを使用した。
1. 96ウェルプレートに-20℃で保存されたペリを解凍し、新しい丸底96ウェルBiacoreプレート中の40μLのHBS-EPランニングバッファーに10μLのペリを添加することにより、1:5希釈した。プレートを密閉した。
2.プライミング、標準化、及びプライミングのサイクルの後、コーティングされたCM5チップを、4サイクルの10μL HBS-EPバッファーpH 7.4を用いて、ランニングバッファーに対して平衡化した。
3. 5μL/分の流量を用いて、25μLの希釈ペリプラズム抽出物を注入した。
4. 15分後、6μLの8mM NaOH(流量100μL/分のQuickinject)を注入することにより、チップの再生を実施し、その後、新しい試料を注入した。
5.データ解析を、「BIAevaluation」ソフトウェアバージョンn°4.1.1を用いて、2-1及び4-3減算を用いて行った。センサーグラムバッファーのみを参照として使用し、そのシグナルを除外した(Y変換)。最後に、フィッティングモデルを用いて、Gal10-Hisに対するクローンの親和性及びオフレートを決定した(Fit Kineticsの個別のka/kd/解離/Langmuir解離)。
(Fabの結合特性のスクリーニング(オフレートスクリーニング))
ペリプラズム抽出物及び精製抗Gal10分子の結合特性のスクリーニングのために、4000RUの抗Hisタグ抗体でコーティングされたチップを使用した。
1.精製Fabを複数の濃度に希釈した。キャリブレーター及びQC試料(試験濃度の70％、100％、及び130％)を含めた。
2.プライミング、標準化、及びプライミングのサイクルの後、コーティングされたCM5チップを、2サイクルの60μL HBS EPバッファーpH 7.4を用いて、ランニングバッファーに対して平衡化した。
3.第一の工程として、20μLの希釈されたGal10-Hisを約500RUの最終的な捕捉レベルに達するまで注入すること(「Quickinject」、流量は30μL/分に設定した)により、コーティングされたCM5チップの1つのチャンネル上にGal10-Hisを捕捉させた。
4.第二の工程として、ヒトFab骨格中のクローンの1つの希釈物を捕捉されたGal10-His上に注入した(2チャンネル、60μL、「Kinject」)。
5. 100秒の解離時間の後、8μLの10mMグリシンHCl pH 2.4を1回注入すること(「Quickinject」)により、チップの再生を行った。
6.データ解析を、「BIAevaluation」ソフトウェアバージョンn°4.1.1を用いて、Fc4-Fc3又はFc2-Fc1減算を用いて行った。センサーグラムの標準化をGal10-Hisの捕捉レベル(約200秒)の後に行った。センサーグラムバッファーのみを参照として使用し、そのシグナルを除外した(Y変換/Curve-Curve 2(ブランクラン減算))。最後に、質量移動効果を用いるフィッティングモデルを用いて、Gal10-Hisに対するクローンの親和性及びオフレートを決定した(Fit Kineticsの同時ka/kd/質量移動を伴う結合/局所Rmax)。
ペリプラズム抽出物及び精製抗Gal10分子の結合特性のスクリーニングのために、4000RUの抗Hisタグ抗体でコーティングされたチップを使用した。
1.精製Fabを複数の濃度に希釈した。キャリブレーター及びQC試料(試験濃度の70％、100％、及び130％)を含めた。
2.プライミング、標準化、及びプライミングのサイクルの後、コーティングされたCM5チップを、2サイクルの60μL HBS EPバッファーpH 7.4を用いて、ランニングバッファーに対して平衡化した。
3.第一の工程として、20μLの希釈されたGal10-Hisを約500RUの最終的な捕捉レベルに達するまで注入すること(「Quickinject」、流量は30μL/分に設定した)により、コーティングされたCM5チップの1つのチャンネル上にGal10-Hisを捕捉させた。
4.第二の工程として、ヒトFab骨格中のクローンの1つの希釈物を捕捉されたGal10-His上に注入した(2チャンネル、60μL、「Kinject」)。
5. 100秒の解離時間の後、8μLの10mMグリシンHCl pH 2.4を1回注入すること(「Quickinject」)により、チップの再生を行った。
6.データ解析を、「BIAevaluation」ソフトウェアバージョンn°4.1.1を用いて、Fc4-Fc3又はFc2-Fc1減算を用いて行った。センサーグラムの標準化をGal10-Hisの捕捉レベル(約200秒)の後に行った。センサーグラムバッファーのみを参照として使用し、そのシグナルを除外した(Y変換/Curve-Curve 2(ブランクラン減算))。最後に、質量移動効果を用いるフィッティングモデルを用いて、Gal10-Hisに対するクローンの親和性及びオフレートを決定した(Fit Kineticsの同時ka/kd/質量移動を伴う結合/局所Rmax)。
(ヒトCLC溶解(タイムラプス))
1. 96ウェルプレートの外側のウェルに300μLのPBSバッファーを満たした。
2.蒸発を防ぐために、十分な真空グリースをプレートの端に塗布した。
3. 2μLの希釈されたCLC溶液滴(PBS中0.7mg/mL)を96ウェルプレート中にスポッティングした。
4.次に、透明なプラスチックの覆蓋をプレートの上に置いた。
5.その後、プレートをスピニングディスク共焦点顕微鏡の96ウェルプレートホルダーに入れ、1ウェル当たり2つの位置を決定した。
6.全ての位置を選んだ後、プレートをホルダーから外し、蓋を除去し、2μLの抗体溶液をウェル中の2μLのCLC滴に添加した。対照条件として、2μLのPBSバッファーを添加した。
7.再現性を確保するために、各々のFab条件を複数回撮像した。
8.その後、プレートを密閉し、顕微鏡のホルダーに戻し入れた。さらに、プレートを粘着テープで固定して、ステージのドリフトがないことをさらに保証した。その後、全ての位置を再チェックし、改良した。位置をソフトウェアによりメタデータ出力中に保存した。
9.その後、試料を、CSU-X1 Yokogawaスピニングディスクヘッド(Yokogawa Corporation)及びZeiss AxioCam Mrm(Zeiss)が装備されたAxio Observer.Z1(Zeiss)で、Plan ApoChromat 10×乾燥対物レンズ(NA 0.30、DIC)を用いて、3～5分毎に撮像した。画像を最長3時間連続取得した(サイクル全体では、約72秒かかる)。
10.画像再構成及びデータ解析をImageJ(NIH)を用いて実施する。簡単に説明すると、合計投影を各々のスタックについて作成し、その後、エッジフィルターを画像に適用した。この時点で閾値を適用することができる。結晶が占める全体的な面積を計算するために、各々の画像上で測定を行い、その後、データをExcelファイルにエクスポートし、そこで、それを時点ゼロに対して正規化し、時間の関数としてプロットした。複製試料のデータを統計解析のために統合した。CLCの全体的なサイズを経時的に測定し、GraphPad Prism 7.01にプロットした。非線形回帰(log(アゴニスト)対応答の可変勾配(4パラメータ))を用いて計算された、各々の抗体のEC50(50％溶解)値及びEC10(90％溶解)値。
1. 96ウェルプレートの外側のウェルに300μLのPBSバッファーを満たした。
2.蒸発を防ぐために、十分な真空グリースをプレートの端に塗布した。
3. 2μLの希釈されたCLC溶液滴(PBS中0.7mg/mL)を96ウェルプレート中にスポッティングした。
4.次に、透明なプラスチックの覆蓋をプレートの上に置いた。
5.その後、プレートをスピニングディスク共焦点顕微鏡の96ウェルプレートホルダーに入れ、1ウェル当たり2つの位置を決定した。
6.全ての位置を選んだ後、プレートをホルダーから外し、蓋を除去し、2μLの抗体溶液をウェル中の2μLのCLC滴に添加した。対照条件として、2μLのPBSバッファーを添加した。
7.再現性を確保するために、各々のFab条件を複数回撮像した。
8.その後、プレートを密閉し、顕微鏡のホルダーに戻し入れた。さらに、プレートを粘着テープで固定して、ステージのドリフトがないことをさらに保証した。その後、全ての位置を再チェックし、改良した。位置をソフトウェアによりメタデータ出力中に保存した。
9.その後、試料を、CSU-X1 Yokogawaスピニングディスクヘッド(Yokogawa Corporation)及びZeiss AxioCam Mrm(Zeiss)が装備されたAxio Observer.Z1(Zeiss)で、Plan ApoChromat 10×乾燥対物レンズ(NA 0.30、DIC)を用いて、3～5分毎に撮像した。画像を最長3時間連続取得した(サイクル全体では、約72秒かかる)。
10.画像再構成及びデータ解析をImageJ(NIH)を用いて実施する。簡単に説明すると、合計投影を各々のスタックについて作成し、その後、エッジフィルターを画像に適用した。この時点で閾値を適用することができる。結晶が占める全体的な面積を計算するために、各々の画像上で測定を行い、その後、データをExcelファイルにエクスポートし、そこで、それを時点ゼロに対して正規化し、時間の関数としてプロットした。複製試料のデータを統計解析のために統合した。CLCの全体的なサイズを経時的に測定し、GraphPad Prism 7.01にプロットした。非線形回帰(log(アゴニスト)対応答の可変勾配(4パラメータ))を用いて計算された、各々の抗体のEC50(50％溶解)値及びEC10(90％溶解)値。
(ヒトCLC溶解(タイムラプス))
1.この目的は、1ウェル当たり1μgのGal10の存在下、1536ウェルのHigh Contentアッセイで14種の抗体断片の活性を決定することであった。
2. 3.8mg/mLのGal10を、38μg/mLのTEVプロテアーゼを含む1.5mLチューブ中、20℃で一晩(16時間)インキュベートした。
3. 4mg/mLのGal10を30秒間ボルテックス処理し、ボルテックス処理から30分後、PBS中0.2mg/mLに希釈した。
4. アッセイ対照を1536ウェルプレートに添加した: 1D11の10点連続希釈物を調製し、1μLを1536ウェルプレートに手作業で添加した(n=3)。1μLのPBS及び1D11(3mg/mL)を添加した(n=64)。
5.抗体を1.5mg/mLに希釈し、1μLを1536ウェルプレートに移した(n=4)。
6. 5μLのGal10(合計1μg)を、バルクディスペンサー(BioTek MultiFlo)を用いて、プレート中の抗体に分配した。
7.抗体添加から2、5、7、及び16時間後に、プレートを撮像した(InCell 2200)。
1.この目的は、1ウェル当たり1μgのGal10の存在下、1536ウェルのHigh Contentアッセイで14種の抗体断片の活性を決定することであった。
2. 3.8mg/mLのGal10を、38μg/mLのTEVプロテアーゼを含む1.5mLチューブ中、20℃で一晩(16時間)インキュベートした。
3. 4mg/mLのGal10を30秒間ボルテックス処理し、ボルテックス処理から30分後、PBS中0.2mg/mLに希釈した。
4. アッセイ対照を1536ウェルプレートに添加した: 1D11の10点連続希釈物を調製し、1μLを1536ウェルプレートに手作業で添加した(n=3)。1μLのPBS及び1D11(3mg/mL)を添加した(n=64)。
5.抗体を1.5mg/mLに希釈し、1μLを1536ウェルプレートに移した(n=4)。
6. 5μLのGal10(合計1μg)を、バルクディスペンサー(BioTek MultiFlo)を用いて、プレート中の抗体に分配した。
7.抗体添加から2、5、7、及び16時間後に、プレートを撮像した(InCell 2200)。
画像を、所内で開発されたアルゴリズムを用いて分割して、個々の結晶を検出し、ウェル当たりの総結晶面積を計算した。
(実施例5:さらなる温度ストレス安定性試験の結果)
全てのクローンを最長48時間2～8℃で保存し、試料のタンパク質濃度を、無菌条件下、もとの製剤バッファー中10mg/mLに調整した。その後、クローンを異なる温度条件(+5℃、+25℃、及び+37℃)の下で4週間保存し、安定性について週間隔で試験した。安定性を、数回の凍結解凍サイクル(1回、5回、及び10回のサイクル)の後に、並びに55℃～80℃の範囲にまたがる様々な変性温度内での熱ストレス(熱耐性)の後に試験した。
全てのクローンを最長48時間2～8℃で保存し、試料のタンパク質濃度を、無菌条件下、もとの製剤バッファー中10mg/mLに調整した。その後、クローンを異なる温度条件(+5℃、+25℃、及び+37℃)の下で4週間保存し、安定性について週間隔で試験した。安定性を、数回の凍結解凍サイクル(1回、5回、及び10回のサイクル)の後に、並びに55℃～80℃の範囲にまたがる様々な変性温度内での熱ストレス(熱耐性)の後に試験した。
(2.1 温度ストレス安定性試験の結果)
(外観及び目視検査)
全ての時点及び全ての温度ストレス条件(0.5mLを透明ガラスバイアル中に1.5mLで充填)での試料の安定性の目視検査を2人で行った。全体的に、試料は、同じ視覚的外観を有していた(表31)。
A:可視粒子なし; B:可視粒子はわずか(＜5); F:繊維
表31:温度ストレス試験時のクローンの目視検査の結果の概要
(外観及び目視検査)
全ての時点及び全ての温度ストレス条件(0.5mLを透明ガラスバイアル中に1.5mLで充填)での試料の安定性の目視検査を2人で行った。全体的に、試料は、同じ視覚的外観を有していた(表31)。
表31:温度ストレス試験時のクローンの目視検査の結果の概要
(濁度)
散乱及び凝集の定性的検出のために、粒子を2つの波長における分光光度計での吸収スペクトル取得により評価した。結果を、全ての試料の340nm及び500nmにおける凝集指数(A.I.)として表した。A.I.は、以下の式: A.I.340nm=A340nm/(A280nm-A340nm)及びA.I.500nm=A500nm/(A280nm-A500nm)に従って決定した。
散乱及び凝集の定性的検出のために、粒子を2つの波長における分光光度計での吸収スペクトル取得により評価した。結果を、全ての試料の340nm及び500nmにおける凝集指数(A.I.)として表した。A.I.は、以下の式: A.I.340nm=A340nm/(A280nm-A340nm)及びA.I.500nm=A500nm/(A280nm-A500nm)に従って決定した。
各々の試料について、対応するバッファー、陰性対照(滅菌濾過されたmQ水)、及び陽性対照(増加した凝集体を含有することが分かっているタンパク質試料)も同じ分光光度分析に供した。製剤バッファーと比較したときの凝集指数に関してクローン間で、又は適用された温度ストレス条件のいずれかについてクローン間で、明確な違いは観察されなかった(表32)。
ND=未決定。
表32.異なる温度ストレス条件についての試験を通してクローンについて得られた濁度並びに凝集指数A.I.340及びA.I.500nm。
表32.異なる温度ストレス条件についての試験を通してクローンについて得られた濁度並びに凝集指数A.I.340及びA.I.500nm。
(動的光散乱(DLS)によるサブミクロン粒子の検出)
DLS分析を、全ての保存条件について、試験の4週間の時点(T4W)で、全てのクローン及び製剤試料について実施した。測定は、DynaPro Nanostart装置を用いて、3連の調製物で行った。ストレスのかかっていない対照試料、異なるストレス条件下(T0時及びT4W時)で4W維持された試料を並列分析した。質量パーセント、分子の流体力学的半径、多分散性パーセント(％PD)、及び多分散性指数(PDI)を用いて、溶液中のサブミクロン粒子の分布プロファイルをモニタリングした。
DLS分析を、全ての保存条件について、試験の4週間の時点(T4W)で、全てのクローン及び製剤試料について実施した。測定は、DynaPro Nanostart装置を用いて、3連の調製物で行った。ストレスのかかっていない対照試料、異なるストレス条件下(T0時及びT4W時)で4W維持された試料を並列分析した。質量パーセント、分子の流体力学的半径、多分散性パーセント(％PD)、及び多分散性指数(PDI)を用いて、溶液中のサブミクロン粒子の分布プロファイルをモニタリングした。
製剤バッファーは、濾過(0.2μm)前後の適用されたどの保存条件にも適さなかった。+25℃及び+37℃で4W(T4W)保存されたアリコートは、どの候補にも適さなかった。さらに、クローン20H09及び23H09の溶液は、試験開始時(T0)の非ストレス試料に適さなかった。したがって、4つ全ての候補についての全ての試料を濾過し、再分析した(3連測定)。試料のT4WにおけるDLSプロファイルは、比較的類似しており、強度にいくつかのピークを有したが、パーセント質量数が示すように、非モノマー種は、一般に無視できるものであった(表33)。全ての候補のメインピークの半径は、予想されるタンパク質のサイズと一致していた。試料の多分散性は、均質性の指標である。多分散性は、各々のクローンの複製物間でばらつきがあったが、全体として、多分散性スコアは、全ての試料で粒子のサイズ分布が狭いことを示していた。試験された異なる保存条件における濾過後試料の大部分は、多峰性であることが分かり、これにより、試料中に様々なサイズを有する粒子が存在することが示された。クローン24F02-N53Aからの試料は、多峰性散乱となる傾向が最も少なく、これらの試料がより狭い粒径分布を有することを示した。
(タンパク質濃度)
タンパク質濃度を温度ストレス試料及び凍結解凍ストレス試料についてA280nm(Nanodrop)で評価した(図3)。大まかに、タンパク質損失は、どの保存温度で試験されたどのクローンについても、最初から最後まで観察されなかった。
タンパク質濃度を温度ストレス試料及び凍結解凍ストレス試料についてA280nm(Nanodrop)で評価した(図3)。大まかに、タンパク質損失は、どの保存温度で試験されたどのクローンについても、最初から最後まで観察されなかった。
+37℃で4週間保存されたクローン18C06については、結果が非定型であった。しかしながら、予備試料として(同じ実験条件下で)保持された独立したアリコートの分析は、それにもかかわらず、予想された範囲内で測定された。
(SPRによる結合活性)
次に、候補の機能活性濃度をBiacore 3000装置でのSPRにより評価した(図4)。全ての試料を標準的な資格基準を満たす方法で評価した。アリコートを、参照試料(T0、-80℃保存)からの滴定曲線に対して予め規定された試験濃度で、かつ参照物質に対して70～130％相対活性(％RA)の範囲をカバーする品質管理(QC)試料の存在下で試験した。
次に、候補の機能活性濃度をBiacore 3000装置でのSPRにより評価した(図4)。全ての試料を標準的な資格基準を満たす方法で評価した。アリコートを、参照試料(T0、-80℃保存)からの滴定曲線に対して予め規定された試験濃度で、かつ参照物質に対して70～130％相対活性(％RA)の範囲をカバーする品質管理(QC)試料の存在下で試験した。
4つの候補クローンからの温度ストレス試料のほぼ全ては、それらが保存される条件にかかわらず、90％を上回る相対活性を保持していた(図4)。同様の観察を凍結解凍サイクル及び低pHに供された試料でも行った(図4)。記録された唯一の非定型の結果は、+37℃で4W保存されたクローン18C06についてのものであったが、同じ条件下で処理された同じ試料の独立したアリコートを試験すると、90％を上回るRAを保持していることが観察された(図4)。
(SE-HPLCによるサイズ純度)
SE-HPLCによる純度を、クォータナリーポンプ、自動インジェクター、オンライン脱気装置及びDAD検出器、カラム恒温コンパートメント(21℃)、並びに6℃に設定されたオートサンプラーが装備された、Agilent 1260 Infinity IIクロマトグラフィーシステムで評価した。検出器を280nm及び214nmの波長に同時に設定して、サイズ変異をモニタリングした。試料を全ての保存条件からかつ全ての時点で解析した。
SE-HPLCによる純度を、クォータナリーポンプ、自動インジェクター、オンライン脱気装置及びDAD検出器、カラム恒温コンパートメント(21℃)、並びに6℃に設定されたオートサンプラーが装備された、Agilent 1260 Infinity IIクロマトグラフィーシステムで評価した。検出器を280nm及び214nmの波長に同時に設定して、サイズ変異をモニタリングした。試料を全ての保存条件からかつ全ての時点で解析した。
4つのクローンの温度ストレス、凍結解凍、及び低pHの試料は全て、95％を超える純度を有することが観察された(図5)。凝集及び断片化のパーセンテージは、温度ストレス試料の大部分で1％未満にとどまった(図5)。唯一の例外は、クローン23H09試料であり、これは、温度誘発性の凝集体形成の増加を示した(図5)。
最大10回の凍結解凍サイクルに供された試料は、全てのクローンについて、参照物質と同程度の純度を示した(図5)。低pHストレス要因を受けた試料については、軽微な凝集がクローン23H09試料について検出された(図5)。試験された他の全てのクローンは、低pHストレスの適用後、いくらかの断片化を示した(図5)。しかしながら、いずれの場合も、不純物のパーセンテージは、5％未満にとどまった(図5)。
(キャピラリーゲル電気泳動(cGE)による純度)
cGEによる純度を、Expert2100 Bioanalyzer装置(Agilent)を用いるラボ・オン・チップ分析を用いて評価した。試料を、各々の試験の最終時点において、還元条件下及び非還元条件下で分析した。
cGEによる純度を、Expert2100 Bioanalyzer装置(Agilent)を用いるラボ・オン・チップ分析を用いて評価した。試料を、各々の試験の最終時点において、還元条件下及び非還元条件下で分析した。
異なる保存条件は、クローン18C06(図6)を除き、クローンの純度に影響を与えなかった。このクローンを含有する試料は、非還元条件下で90％を上回るメインピークの純度を示さなかった(図6)。これは、クローン18C06を含有する非ストレス参照試料の場合も同様であった(図6)。他の3つのクローンを含有する残りの試料については、保存温度、分析の時点、又はそれらが供される凍結解凍サイクルの回数(最大10回)にかかわらず、純度が非還元条件下で90％を超えていた(図6)。還元条件下では、試験された全ての試料が95％を超える純度を示した(図6)。
(耐熱性)
候補の熱安定性を評価するために、クローンは、55～85℃の温度範囲にまたがる勾配温度分解試験を受けた。いくつかの変性温度を適用するようにプログラムされたBiometra Thermocyclerで、このストレスを適用した後、ストレス試料の結合活性をBiacore 3000で評価して、Gal10に対する50％結合活性が消失する温度を特定した。100％結合活性は、後にSPRにより並列分析される各々のクローンの非ストレス試料によって生じた。全てのクローンについての試料が高温で50％活性損失を示した(表34)。この分析アプローチに従って同定された最も安定なクローンは、候補24F02_N53Aであり、これは、参照クローン7B07_N53Aとともに、70℃を上回る融解温度を示した。
表34:リード候補の熱安定性の概要
候補の熱安定性を評価するために、クローンは、55～85℃の温度範囲にまたがる勾配温度分解試験を受けた。いくつかの変性温度を適用するようにプログラムされたBiometra Thermocyclerで、このストレスを適用した後、ストレス試料の結合活性をBiacore 3000で評価して、Gal10に対する50％結合活性が消失する温度を特定した。100％結合活性は、後にSPRにより並列分析される各々のクローンの非ストレス試料によって生じた。全てのクローンについての試料が高温で50％活性損失を示した(表34)。この分析アプローチに従って同定された最も安定なクローンは、候補24F02_N53Aであり、これは、参照クローン7B07_N53Aとともに、70℃を上回る融解温度を示した。
(まとめの表)
選択されたFabのいくつかのコア特性(任意のタイプのストレスをかける前)を示す表形式でのまとめが表35に提供されている。7B07_N53A Fabは、比較及び参照目的で含まれている。
選択されたFabのいくつかのコア特性(任意のタイプのストレスをかける前)を示す表形式でのまとめが表35に提供されている。7B07_N53A Fabは、比較及び参照目的で含まれている。
異なる条件下での選択されたFabの属性の表形式でのまとめが表36に提供されている。凍結解凍、低pH、及び熱ストレス後の個々の候補のいくつかの物理化学的特性を示す表形式でのまとめが表37～40に提供されている。
NT:未試験; L:低免疫原性スコア
表35:リードFab候補の属性の概要
表36:いくつかのストレスの後の4つのFabクローンの属性の概要:結合活性、CLCに対する生物学的活性、CE-SDS(還元及び非還元)並びにSE-HPLCによる純度、翻訳後修飾、並びにDLS及びFCMによる粒子評価。
比較/参照のため
1試料は、+37℃で4週間維持されたアリコートに対応する
2試料は、噴霧前に+5℃で4週間維持されたアリコートに対応する。簡単に説明すると、試料を、薬液を吸入可能なエアロゾルに変換するアクティブ振動メッシュネブライザーのAerogen Soloで噴霧した。各々の時点について3つの異なる装置をクローン毎に使用した。結果は、装置(ネブライザー)のシリアル番号別に報告されている。所与のサイズのアリコートについて通常よりも長い噴霧時間によって示される装置汚損の場合、3連の装置による噴霧を完了するために、同じタイプの予備装置が利用可能であった。
3 +37℃で4週間保存した後のこの試料の％RAは、2つの独立した試料について、82％(Eppendorf)及び93％(ガラスバイアル)で測定された。
4 20H09及び23H09の試料は、非ストレスアリコートであっても、濾過なしでは適さなかった;この行の情報は、全てのクローン、全てのタイプの試料についての濾過後の結果を示している。
(1)低pHストレス試験を0.1MグリシンpH3.0でpH3.7に到達させることにより達成し、周囲条件で2時間の保持工程の後、アリコートを1M Tris pH8.0による中和に戻した。(2)1つのアリコートは、5回の凍結解凍サイクルを経たが、10回の凍結解凍アリコートについては不定型の結果が得られなかったため、プロトコル通り、それを解析しなかった。
NT:未試験; NA:未適用; ND:未検出
表37: Fabクローン18C06のいくつかの物理化学的特性の概要。
(1)低pHストレス試験を0.1MグリシンpH3.0でpH3.7に到達させることにより達成し、周囲条件で2時間の保持工程の後、アリコートを1M Tris pH8.0による中和に戻した。(2)1つのアリコートは、5回の凍結解凍サイクルを経たが、10回の凍結解凍アリコートについては不定型の結果が得られなかったため、プロトコル通り、それを解析しなかった。
NT:未試験; NA:未適用; ND:未検出
表38: Fab クローン20H09のいくつかの物理化学的特性の概要。
(1)低pHストレス試験を0.1MグリシンpH3.0でpH3.7に到達させることにより達成し、周囲条件で2時間の保持工程の後、アリコートを1M Tris pH8.0による中和に戻した。
(2)1つのアリコートは、5回の凍結解凍サイクルを経たが、10回の凍結解凍アリコートについては不定型の結果が得られなかったため、プロトコル通り、それを解析しなかった。
NT:未試験; NA:未適用; ND:未検出
表39: Fabクローン23H09のいくつかの物理化学的特性の概要。
(1)低pHストレス試験を0.1MグリシンpH3.0でpH3.7に到達させることにより達成し、周囲条件で2時間の保持工程の後、アリコートを1M Tris pH8.0による中和に戻した。
(2)1つのアリコートは、5回の凍結解凍サイクルを経たが、10回の凍結解凍アリコートについては不定型の結果が得られなかったため、プロトコル通り、それを解析しなかった。
NT:未試験; NA:未適用; ND:未検出
表40: Fabクローン24F02_N53Aのいくつかの物理化学的特性の概要。
表35:リードFab候補の属性の概要
表36:いくつかのストレスの後の4つのFabクローンの属性の概要:結合活性、CLCに対する生物学的活性、CE-SDS(還元及び非還元)並びにSE-HPLCによる純度、翻訳後修飾、並びにDLS及びFCMによる粒子評価。
1試料は、+37℃で4週間維持されたアリコートに対応する
2試料は、噴霧前に+5℃で4週間維持されたアリコートに対応する。簡単に説明すると、試料を、薬液を吸入可能なエアロゾルに変換するアクティブ振動メッシュネブライザーのAerogen Soloで噴霧した。各々の時点について3つの異なる装置をクローン毎に使用した。結果は、装置(ネブライザー)のシリアル番号別に報告されている。所与のサイズのアリコートについて通常よりも長い噴霧時間によって示される装置汚損の場合、3連の装置による噴霧を完了するために、同じタイプの予備装置が利用可能であった。
3 +37℃で4週間保存した後のこの試料の％RAは、2つの独立した試料について、82％(Eppendorf)及び93％(ガラスバイアル)で測定された。
4 20H09及び23H09の試料は、非ストレスアリコートであっても、濾過なしでは適さなかった;この行の情報は、全てのクローン、全てのタイプの試料についての濾過後の結果を示している。
NT:未試験; NA:未適用; ND:未検出
表37: Fabクローン18C06のいくつかの物理化学的特性の概要。
NT:未試験; NA:未適用; ND:未検出
表38: Fab クローン20H09のいくつかの物理化学的特性の概要。
(2)1つのアリコートは、5回の凍結解凍サイクルを経たが、10回の凍結解凍アリコートについては不定型の結果が得られなかったため、プロトコル通り、それを解析しなかった。
NT:未試験; NA:未適用; ND:未検出
表39: Fabクローン23H09のいくつかの物理化学的特性の概要。
(2)1つのアリコートは、5回の凍結解凍サイクルを経たが、10回の凍結解凍アリコートについては不定型の結果が得られなかったため、プロトコル通り、それを解析しなかった。
NT:未試験; NA:未適用; ND:未検出
表40: Fabクローン24F02_N53Aのいくつかの物理化学的特性の概要。
(実施例6:翻訳後修飾(PTM)解析)
クローンの構造的特性解析を、いくつかの分析技法(icIEF、オンライン脱塩MS、還元タンパク質に対するRPLC-UV-MS、トリプシン消化後のRPLC-MSを用いたペプチドマップ)を用いて、タンパク質及びペプチドレベルで実施した。クローンを、異なる温度(+5℃、+25℃、+37℃)で4W保存、+5℃で4W保存する前(T0)及び保存した後の噴霧、並びに低pH保持工程(2h/pH3.7)の後を含む、いくつかのストレス条件に供した後、PTMについて分析した。いずれの場合も、分析を各々のクローンについての対照非ストレス参照材料と並列で行った。
クローンの構造的特性解析を、いくつかの分析技法(icIEF、オンライン脱塩MS、還元タンパク質に対するRPLC-UV-MS、トリプシン消化後のRPLC-MSを用いたペプチドマップ)を用いて、タンパク質及びペプチドレベルで実施した。クローンを、異なる温度(+5℃、+25℃、+37℃)で4W保存、+5℃で4W保存する前(T0)及び保存した後の噴霧、並びに低pH保持工程(2h/pH3.7)の後を含む、いくつかのストレス条件に供した後、PTMについて分析した。いずれの場合も、分析を各々のクローンについての対照非ストレス参照材料と並列で行った。
分かったことを、以下のように要約することができる:
・4つのクローンのアミノ酸配列が、各々のインタクトFab(LC及びVH＋CH1)の分子量に基づいて、タンパク質レベルで確認された一方、ペプチド配列のカバレッジは100％であった。
・Fabのストレス前後の構造的完全性は不変のままであり、(鎖間及び鎖内の)予想されるジスルフィド架橋の存在を立証及び確認するインタクトタンパク質及びペプチドのマッピング解析で確認された。18C06(参照を含む全ての試料)のみが、VH＋CH1部分との予想される架橋ではなく、LC中の遊離システインを有して検出され、その代わりに、LC中の2つの近接した位置にあるシステイン間の別のジスルフィド架橋形成が検出された。
・N-末端の環化は、ストレスクローンの共通のVH＋CH1部分について検出され、これは、明らかに温度誘導性で、+37℃保存後にピログルタミン酸の純増(8.5～10.5％)を伴い、+25℃保存後に存在したが、あまり顕著ではなく(2.0～3.5％); VH＋CH1におけるこの修飾は、低pH又は噴霧試料については確認されなかった。さらに、g18C06については、LCは、噴霧後に完全に環状であることがわかった。
・全ての異なるストレス条件下での酸化は、全てのクローンについて、＜1％にとどまった。
・異性化及び脱アミド化などの部位特異的事象は、全てのクローンについて、低pHストレス工程又は噴霧後に概ね影響を受けないままであった。
・温度ストレス試料については、クローン18C06がLC鎖の1つの可変領域において温度感受性の脱アミド化スポットを示した(+37℃で4週間後に14.7％。2つの中程度の脱アミド化スポットが、全てのプレリード候補間で共有されているVH＋CH1ペプチド上に、高温で(各々最大5％)検出された。異性化については、LC鎖の1つのスポットが検出され、g20H09、g23H09については、異性化の増加がやや限定的であり、g24F02については、少なかった。コンストラクト間で共有されているLC中の2番目のペプチドも、異性化のわずかな増加(最大1.3％)を伴った。
1太字はCDR領域を示す。
2クローン18C06は、共通のLCを共有するクローン20H09、23H09、及び24F2_N53Aとは異なるLCをもたらす。
表41: +37℃で4週間保存した後のクローンで観察された主な翻訳後修飾。
・4つのクローンのアミノ酸配列が、各々のインタクトFab(LC及びVH＋CH1)の分子量に基づいて、タンパク質レベルで確認された一方、ペプチド配列のカバレッジは100％であった。
・Fabのストレス前後の構造的完全性は不変のままであり、(鎖間及び鎖内の)予想されるジスルフィド架橋の存在を立証及び確認するインタクトタンパク質及びペプチドのマッピング解析で確認された。18C06(参照を含む全ての試料)のみが、VH＋CH1部分との予想される架橋ではなく、LC中の遊離システインを有して検出され、その代わりに、LC中の2つの近接した位置にあるシステイン間の別のジスルフィド架橋形成が検出された。
・N-末端の環化は、ストレスクローンの共通のVH＋CH1部分について検出され、これは、明らかに温度誘導性で、+37℃保存後にピログルタミン酸の純増(8.5～10.5％)を伴い、+25℃保存後に存在したが、あまり顕著ではなく(2.0～3.5％); VH＋CH1におけるこの修飾は、低pH又は噴霧試料については確認されなかった。さらに、g18C06については、LCは、噴霧後に完全に環状であることがわかった。
・全ての異なるストレス条件下での酸化は、全てのクローンについて、＜1％にとどまった。
・異性化及び脱アミド化などの部位特異的事象は、全てのクローンについて、低pHストレス工程又は噴霧後に概ね影響を受けないままであった。
・温度ストレス試料については、クローン18C06がLC鎖の1つの可変領域において温度感受性の脱アミド化スポットを示した(+37℃で4週間後に14.7％。2つの中程度の脱アミド化スポットが、全てのプレリード候補間で共有されているVH＋CH1ペプチド上に、高温で(各々最大5％)検出された。異性化については、LC鎖の1つのスポットが検出され、g20H09、g23H09については、異性化の増加がやや限定的であり、g24F02については、少なかった。コンストラクト間で共有されているLC中の2番目のペプチドも、異性化のわずかな増加(最大1.3％)を伴った。
2クローン18C06は、共通のLCを共有するクローン20H09、23H09、及び24F2_N53Aとは異なるLCをもたらす。
表41: +37℃で4週間保存した後のクローンで観察された主な翻訳後修飾。
(実施例7:結晶溶解アッセイの結果)
全てのクローンを、インビトロでGAL10結晶を溶解させるその能力について評価した。簡単に説明すると、結晶溶解アッセイ(CDA)を開発し、噴霧を含むいくつかのストレス条件の適用前後のクローンの生物学的活性を評価するために標準化した。本試験の目的は、保存前/保存後の噴霧がクローンの(生物)活性に影響を及ぼし、GAL10結晶を溶解させるその能力の損失をもたらし得るかどうかを評価することであった。
全てのクローンを、インビトロでGAL10結晶を溶解させるその能力について評価した。簡単に説明すると、結晶溶解アッセイ(CDA)を開発し、噴霧を含むいくつかのストレス条件の適用前後のクローンの生物学的活性を評価するために標準化した。本試験の目的は、保存前/保存後の噴霧がクローンの(生物)活性に影響を及ぼし、GAL10結晶を溶解させるその能力の損失をもたらし得るかどうかを評価することであった。
全てのクローンについて、分析を適切なアッセイ対照が存在する2回の独立した実験で実施した。簡単に説明すると、試料を、薬液を吸入可能なエアロゾルに変換するアクティブ振動メッシュネブライザーのAerogen Soloで噴霧した。各々の時点について3つの異なる装置をクローン毎に使用した。結果は、装置(ネブライザー)のシリアル番号別に報告されている。所与のサイズのアリコートについて通常よりも長い噴霧時間によって示される装置汚損の場合、3連の装置による噴霧を完了するために、同じタイプの予備装置が利用可能であった。3連の装置を用いて噴霧された候補について、1つの共通の装置からエアロゾル化されたタンパク質を8濃度点曲線(Solo #0125)として解析し、残りの2つを予め選択された固定濃度で、常に2回の独立したアッセイで解析した。+5℃、+25℃、及び+37℃で4週間保存した後の試料を全てのクローンについて8濃度点曲線として解析した。ここに示されている結果は、GAL10結晶のサイズ分布が10μmを上回るもの(10～15μm)であったアッセイから得られたものである。
図7は、4つのクローンのうちの1つを含有する非ストレス試料のGAL10結晶を溶解させる効力を示している。次に、全てのクローンを上記のストレス条件を経た後の効力について試験し、この効力を保存後に並びに/又は保存前及び保存後の噴霧後に維持することができるかどうかを評価した(図8)。クローン18C06、20H09、及び23H09は、第一セットのアッセイで並行して試験し(図8)、クローン24F02_N53Aは、第二セットのアッセイでクローン23H09と並列して試験した(図9)。クローン7B07_N53Aは、第一セットのアッセイでコンパレーターとして試験した。
全てのクローンは、試料に適用されたストレス要因に関係なく、分析ラン全体を通して、GAL10結晶を完全に溶解させることができた(図7～9)。したがって、クローンのさらなる分析は、クローン間の効力の差が観察できる5時間までの最も早い時点に主に焦点を当てた。
アッセイによれば、クローン23H09及び24F02_N53Aは、4つのクローンの中で最も効力の高い分子であった(図9)。全ての独立したランについて、かつ試験されたGAL10結晶のサイズ分布に関係なく、クローン24F02_N53Aは、インビトロのGAL10結晶を溶解させるその能力に関して、より効力が高かった。温度又は噴霧ストレスは、非ストレス材料と比較したとき、その溶解能力に影響を与えなかった(図9)。上記のアッセイに基づき、候補を効力が最も高いものから最も低いものへとランク付けした:
・g24F02_N53 ～g23H09＞g20C06＞g18C06
・g24F02_N53 ～g23H09＞g20C06＞g18C06
(実施例8:候補クローンの免疫原性)
全てのクローンについてのエンドトキシン非含有材料を、インシリコ評価と細胞ベースのインビトロ評価を含むLonza Epibase(登録商標)を用いて、免疫原性リスクについて評価した。簡単に説明すると、インシリコ評価は、HLA-DRB1スコアを測定することにより、影響を受ける可能性のあるアロタイプと主要組織適合性複合体とを含む、潜在的な免疫原性エピトープについてクローンのアミノ酸配列をスクリーニングするアルゴリズムを利用した。このアッセイは、これらのアロタイプをその全体的な集団頻度と比べてスクリーニングした(図10)。免疫原性スコアに基づいて、クローンを免疫原性が最も低いものから最も高いものへとランク付けした:
・g24F02_N53＜[g23H09、g18C06]＜g20H09
全てのクローンについてのエンドトキシン非含有材料を、インシリコ評価と細胞ベースのインビトロ評価を含むLonza Epibase(登録商標)を用いて、免疫原性リスクについて評価した。簡単に説明すると、インシリコ評価は、HLA-DRB1スコアを測定することにより、影響を受ける可能性のあるアロタイプと主要組織適合性複合体とを含む、潜在的な免疫原性エピトープについてクローンのアミノ酸配列をスクリーニングするアルゴリズムを利用した。このアッセイは、これらのアロタイプをその全体的な集団頻度と比べてスクリーニングした(図10)。免疫原性スコアに基づいて、クローンを免疫原性が最も低いものから最も高いものへとランク付けした:
・g24F02_N53＜[g23H09、g18C06]＜g20H09
これらの結果は、Lonza Epibase(登録商標)インビトロアッセイを用いて確認された。簡単に説明すると、候補を31人の健常ドナー由来のPBMCで誘導されたT細胞応答について評価した。スクリーニングを刺激されたIFNγ及びIL-5細胞の検出及び計数時に評価して、望ましくない免疫応答リスクとしてのT細胞応答を誘発するドナーの数(図11)、及び試験集団にわたる大きさ(図12)を決定した。この試験に使用された陽性対照は、クローンKLHであった(図11)。
試験された全てのクローンが免疫応答を誘導する低い能力を示した。4つのクローンの中で、IFNγ応答に関しては、クローン23H09及び18C06が最も高い頻度を示し、一方、IL-5応答に関しては、クローン18C06及び20H09が最も高い頻度を示した。全ての場合において、及び全ての統計的アプローチに関して、クローンg24F02_N53Aは、望ましくないT細胞応答を誘発する可能性が最も低いと考えられ、したがって、このクローンは、免疫原性のリスクが最も低いと考えられる。
(実施例からの結論)
詳細に試験されたクローンのうち、生殖系列化Fabクローン24F02_N53Aが最も有望なクローンであると考えられたが、それは、以下の理由による:
・試料が保存温度の上昇、複数の凍結解凍サイクルに供され、かつ低いpH条件に供された後でも安定であり続けた;
・ガレクチン-10に対する強い結合を示した;
・組換えGal10結晶をインビトロで素速く溶解させることができた;
・カニクイザルGal10と交差反応した;
・ヒトにおいて低い免疫原性リスクを有することが前提となっている;及び
・このクローンの安定性及び結合特性は、噴霧による影響を受けなかった。
(参考文献)
詳細に試験されたクローンのうち、生殖系列化Fabクローン24F02_N53Aが最も有望なクローンであると考えられたが、それは、以下の理由による:
・試料が保存温度の上昇、複数の凍結解凍サイクルに供され、かつ低いpH条件に供された後でも安定であり続けた;
・ガレクチン-10に対する強い結合を示した;
・組換えGal10結晶をインビトロで素速く溶解させることができた;
・カニクイザルGal10と交差反応した;
・ヒトにおいて低い免疫原性リスクを有することが前提となっている;及び
・このクローンの安定性及び結合特性は、噴霧による影響を受けなかった。
Claims (23)
- ガレクチン-10に結合する抗体又は抗原結合断片であって、該抗体又は抗原結合断片が可変重鎖(VH)ドメイン及び可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで:
(i)該VHドメインが配列番号2を含む又は配列番号2からなるHCDR3;配列番号3を含む又は配列番号3からなるHCDR2;配列番号1を含む又は配列番号1からなるHCDR1のCDR配列を含み;かつ
(ii)該VLドメインが配列番号8を含む又は配列番号8からなるLCDR3;配列番号9を含む又は配列番号9からなるLCDR2;配列番号7を含む又は配列番号7からなるLCDR1のCDR配列を含む、
前記抗体又は抗原結合断片。 - (i)前記VHドメインが配列番号4のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)前記VLドメインが配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％、95％、97％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む:
請求項1記載の抗体又は抗原結合断片。 - (i)前記VHドメインが配列番号4のアミノ酸配列を含み;かつ
(ii)前記VLドメインが配列番号10のアミノ酸配列を含む、
請求項1又は請求項2記載の抗体又は抗原結合断片。 - 前記抗原結合断片が、単鎖抗体(scFv); F(ab')2断片; Fab断片; Fd断片; Fv断片;単腕(一価)抗体;ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、又はそのような抗原結合断片の組合せ、会合、もしくはコンジュゲーションによって形成される任意の抗原結合分子:からなる群から選択される、請求項1～3のいずれか一項記載の抗体又は抗原結合断片。
- 前記抗原結合断片がFab断片である、請求項4記載の抗原結合断片。
- 請求項1～5のいずれか一項記載の抗体もしくは抗原結合断片、又はそのVHもしくはVLドメインをコードする単離されたポリヌクレオチド(単数)又はポリヌクレオチド(複数)。
- 前記抗体、抗原結合断片、可変重鎖ドメイン、又は可変軽鎖ドメインの宿主細胞又は無細胞発現系における発現を可能にする調節配列に機能的に連結された、請求項6記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項7記載の発現ベクターを含有する宿主細胞又は無細胞発現系。
- 請求項1～5記載の組換え抗体又は抗原結合断片を産生する方法であって、請求項8記載の宿主細胞又は無細胞発現系を該抗体又は抗原結合断片の発現を可能にする条件下で培養すること及び発現された抗体又は抗原結合断片を回収することを含む、前記方法。
- 請求項1～5のいずれか一項記載の抗体又は抗原結合断片及び少なくとも1つの医薬として許容し得る担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
- 医薬として使用するための、請求項1～5のいずれか一項記載の抗体もしくは抗原結合断片、又は請求項10記載の医薬組成物。
- 前記抗体、抗原結合断片、又は医薬組成物が、ガレクチン-10結晶の存在又は形成と関連する疾患又は疾病を予防又は治療するために投与される、請求項11記載の使用のための抗体又は抗原結合断片。
- 前記抗体、抗原結合断片、又は医薬組成物が、喘息;慢性鼻副鼻腔炎;セリアック病;蠕虫感染症;消化管好酸球性炎症;嚢胞性線維症(CF);アレルギー性気管支肺アスペルギルス症(ABPA);チャーグ・ストラウス血管炎;慢性好酸球性肺炎;及び急性骨髄性白血病(AML):からなる群から選択される疾患又は疾病を予防又は治療するために投与される、請求項11又は請求項12記載の使用のための抗体又は抗原結合断片。
- 前記疾患又は疾病が喘息である、請求項13記載の使用のための抗体又は抗原結合断片。
- 前記疾患又は疾病が嚢胞性線維症である、請求項13記載の使用のための抗体又は抗原結合断片。
- それを必要としている対象を治療する方法であって、該対象に、請求項1～5のいずれか一項記載の抗体もしくは抗原結合断片、又は請求項10記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、前記方法。
- 前記抗体、抗原結合断片、又は医薬組成物がガレクチン-10結晶の存在又は形成と関連する疾患又は疾病を予防又は治療するために投与される、請求項16記載の方法。
- 前記抗体、抗原結合断片、又は医薬組成物が、喘息;慢性鼻副鼻腔炎;セリアック病;蠕虫感染症;消化管好酸球性炎症;嚢胞性線維症(CF);アレルギー性気管支肺アスペルギルス症(ABPA);チャーグ・ストラウス血管炎;慢性好酸球性肺炎;及び急性骨髄性白血病(AML):からなる群から選択される疾患又は疾病を予防又は治療するために投与される、請求項16又は請求項17記載の方法。
- 前記疾患又は疾病が喘息である、請求項18記載の方法。
- 前記疾患又は疾病が嚢胞性線維症である、請求項18記載の方法。
- 患者から得られた試料中のガレクチン-10の検出のための、請求項1～5のいずれか一項記載の抗体又は抗原結合断片の使用。
- 前記患者試料が粘液試料又は喀痰試料である、請求項21記載の使用。
- 請求項1～5のいずれか一項記載の抗体又は抗原結合断片を含むキット。
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