JP2024508764A - 抗ｖｉｓｔａ抗体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本開示は、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ含有サプレッサー（ＶＩＳＴＡ）に対する抗体、及びかかる抗体を含む組成物を提供する。同様に提供するのは、疾患を治療するために、例えば、がんを治療するために、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体を使用する方法である。１つの態様では、本明細書に開示するのは、ヒトＶＩＳＴＡ（配列番号３７７）への結合をめぐって本明細書に記載の抗体、またはその抗原結合断片のいずれか１つと競合する抗体、またはその抗原結合断片である。
Description
関連出願
本出願は、２０２１年２月１８日に出願された米国仮出願第６３／１５０，９９５号の優先権を主張する。当該出願の全内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
本出願は、２０２１年２月１８日に出願された米国仮出願第６３／１５０，９９５号の優先権を主張する。当該出願の全内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２２年２月１日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、１３６５８９－００１２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、７８４，９３５バイトのサイズである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２２年２月１日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、１３６５８９－００１２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、７８４，９３５バイトのサイズである。
本開示は、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ含有サプレッサー（ＶＩＳＴＡ）に対する抗体、及びかかる抗体を含む組成物を提供する。同様に提供するのは、疾患を治療するために、例えば、がん、自己免疫疾患、ならびに感染症、例えば、細菌及び真菌感染症を治療するために、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体を使用する方法である。
ＶＩＳＴＡは、Ｂ７ファミリーの免疫抑制性細胞表面タンパク質であり、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）と類似性を示す。ＶＩＳＴＡは、抗原提示細胞のリガンド及びＴ細胞の受容体の両方の機能を果たす（Ｂｏｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１７；６（４）：ｅ１２９３２１５（２０１７））。ＶＩＳＴＡは、主に造血組織（例えば、脾臓、胸腺及び骨髄）ならびに骨髄細胞、好中球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）で発現する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．２０８ Ｎｏ．３ ５７７－５９２）。
特に、ＶＩＳＴＡは、免疫抑制を媒介する腫瘍微小環境の骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）及びＴｒｅｇ上で高度に発現する。特に、ＶＩＳＴＡは、Ｔ細胞受容体の活性化を抑制することによってＴ細胞応答を阻害し、細胞周期停止を引き起こすが、アポトーシスは引き起こさない（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．２０８ Ｎｏ．３ ５７７－５９２）。ＶＩＳＴＡは、「冷たい腫瘍（ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒ）」（Ｔ細胞によって浸潤されない腫瘍）で高度に発現しており、ＶＩＳＴＡの高発現は、がん患者、例えば、膵臓癌における低生存率と関連している（Ｂｌａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１１６（５）：１６９２－９７）。ＶＩＳＴＡの発現は、チェックポイント阻害剤療法による治療後の前立腺癌及び黒色腫で増加することが分かっており、潜在的な耐性メカニズムを示唆している（Ｋａｋａｖａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｍｏｄｅｒｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３０：１６６６－１６７６、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎａｔ Ｍｅｄ．Ｍａｙ；２３（５）：５５１－５５５）。
抗体工学の場合、配列変異は新生児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、Ｆｃアルファ受容体、Ｆｃガンマ受容体、及び補体タンパク質Ｃ１ｑに対する親和性及び特異性を決定する部位で発生するため、抗体の最適化及び機能のためには、様々なアイソタイプ及びサブクラスが重要である（Ｗｏｏｆ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４（２００４）８９－９９）。ＩｇＧに結合後にエフェクター細胞を活性化する５つのＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）が存在する。該活性化受容体の中には、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩｂが存在する（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．ａｎｄ Ｒｅｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８（２００８）３４－４７）。１つの抑制性Ｆｃガンマ受容体、すなわち、ＦｃγＲＩＩｂが存在する。ＦｃγＲは多型であり、ある特定のアレルが他のアレルよりもＦｃに対して高い親和性を示す。これらの受容体に結合する抗体は、クリアランスのためのオプソニン化標的細胞またはオプソニン化病原体へのエフェクター細胞の動員を促進することができる（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．ａｎｄ Ｒｅｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８（２００８）３４－４７）。したがって、抗体のＦｃ及びヒンジ領域の配列の変更及び翻訳後修飾により、所与の抗体または抗体様タンパク質のエフェクター機能及び循環を操作することが可能となる（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０（２００８）４６０－４７０）。配列変異に加えて、Ｆｃ領域はまた、Ｆｃの構造及び機能にとって重要である残基２９７にＮ結合型グリコシル化部位も含む（Ｄｗｅｋ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｎａｔ．１８７（１９９５）２７９－２９２）。Ｆｃガンマ受容体への結合が減少し、Ｆｃガンマ受容体媒介活性が減少した変異型Ｆｃ領域が記載されている（米国特許第１０，０５３，５１３Ｂ２号）。
抗体の消失は主に、飲作用または受容体媒介エンドサイトーシスプロセスによる取り込み後のリソソームによるアミノ酸への分解による細胞内異化作用によって生じる（Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｗ．Ｐｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ １３（１９６９）１－１１０）。
抗体の受容体媒介エンドサイトーシスは、細胞表面受容体と、該抗体のＦｃドメインまたはＦａｂ結合ドメインの１つのいずれかとの相互作用によってもたらされる。この結合事象は、小胞への抗体のエンドサイトーシスによる内在化及びその後のリソソーム分解を引き起こす。抗体Ｆａｂとその抗原との間に結合がある場合、その結果生じるエンドサイトーシス及び消失は、標的介在性の薬物消失（ＴＭＤＤ）と呼ばれる（Ｍａｇｅｒ，Ｄ．Ｅ．ａｎｄ Ｊｕｓｋｏ，Ｗ．Ｊ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ．２８（２００１）５０７－５３２０）。
ＴＭＤＤによる抗体の消失速度は、抗原受容体標的の発現、抗原に対するｍＡｂの親和性、ｍＡｂの用量、受容体－抗体複合体の内在化及び再利用の速度、ならびに標的細胞内の異化作用速度に依存する。主にＴＭＤＤによって除去される抗体は、用量依存的に非線形性に消失する。ＶＩＳＴＡのような原形質膜発現標的を有する抗体の場合、ＴＭＤＤは、特に低用量及び濃度の治療用抗体の主要な消失経路である（Ｒｙｍａｎ，Ｊ．Ｔ．ａｎｄ Ｍｅｉｂｏｈｍ，Ｂ．ＣＰＴ Ｐｈａｒｍａｃｏｍｅｔｒｉｃｓ Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６（２０１７）５７６－５８８）。
原形質膜上の抗体－受容体複合体は、エンドソームコンパートメントと融合する小胞に取り込まれる。該複合体は、リソソームでの分解に送られる場合もあれば、そのままで細胞表面及び細胞外媒体にリサイクルされる場合もある。エビデンスにより、このソーティング決定の結果は、抗体－受容体結合親和性に関連し、結合したままの複合体は一般に分解され、解離したものはリサイクルされることが示唆される（Ｃｈｉｍａｌａｋｏｎｄａ，Ａ．Ｐ．，ｅｔ．Ａｌ．ＡＡＰＳ Ｊ．１５（２０１３）７１７－７２７）。一般に、エンドソーム内の複合体の解離は、抗体のリサイクルを促進する。エンドソーム及びリソソームにおける抗体－受容体複合体の解離は、ｐＨ感受性の相互作用によって調節され得る。
研究されたｐＨ感受性相互作用のほとんどでは、ｐＨ依存性の結合は、相互作用するタンパク質の結合またはフォールディングにおける構造転移を媒介するイオン性ヒスチジン（「ヒスチジンスイッチ」）の存在に依存している（Ｋｕｌｋａｒｎｉ，Ｍ．Ｖ．ａｔ．Ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２０１０）３８５２４－３８５３３、Ｍａｅｄａ，Ｋ．ｅｔ．Ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ ８２（２００２）７１－８２、Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ．Ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７（２００８）１１６４７－１１６５２）。より低いｐＨ値でのヒスチジンのプロトン化によって誘発される静電相互作用の変化により、結合親和性が低下する可能性があり、タンパク質にｐＨ感受性を組み込むタンパク質工学的アプローチでは、通常、ヒスチジン置換の戦略が使用される。
以下は、代謝を低下させ、半減期を改善するために治療用タンパク質のヒスチジンスイッチを操作することに成功した例である。
Ｉｇａｗａ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８（２０１０）１２０３－１２０７は、エンドソームの酸性環境（ｐＨ６．０）内でＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）から急速に解離する一方、血漿中（ｐＨ７．４）ではＩＬ－６Ｒに対する結合親和性を維持するＩＬ－６Ｒに対する操作された抗体を記載している。
ＷＯ２０１１／１１１００７は、好ましくはエンドソーム内で抗原から解離する、ｐＨ依存性の抗原結合を有する抗体を開示している。
Ｒｏｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５（２００７）１２５６－１２６４は、発作性夜間ヘモグロビン尿症の治療のためエンドソーム脱出を媒介するヒスチジンスイッチを有する補体阻害剤エクリズマブの発見及び開発を記載している。
ＷＯ２０１５／１３４８９４Ａ１は、エンドソームのｐＨで標的から急速に解離するように操作され、それによって半減期が長くなる、Ｃ５に結合する抗体を記載している。
ＵＳ９，５４０，４４９Ｂ２は、中性ｐＨでは細胞表面受容体に結合するが、酸性ｐＨでは標的から容易に解離する、血清半減期が改善されたＰＣＳＫ９に対する抗体を記載している。
Ｆａｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（１９９９）６７９０－６７９７は、リガンドのリサイクルの強化により、エンドサイトーシス分解の減少を示すインターロイキン２の変異体を記載している。変異型ＩＬ－２のその受容体に対する結合親和性は、酸性ｐＨよりも中性ｐＨで高く、エンドソームによるソーティング及びリガンド受容体複合体のリサイクルが可能になる。
Ｓａｒｋａｒ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ．Ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０（２００２）９０８－９１３は、顆粒球コロニー刺激因子の細胞輸送を改善する「ヒスチジンスイッチ」の使用を記載している。
抗ＶＩＳＴＡ抗体が記載されている（例えば、米国特許第８，２３１，８７２号、同第８，２３６，３０４号、同第８，５０１，９１５号、及び同第１０，７６６，９５９号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０４０７４４９Ａ１号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／２０７７１７Ａ８号、同第ＷＯ２０１４／１９７８４９Ａ９号、同第ＷＯ２０１８／１６９９９３Ａ１号、同第ＷＯ２０１８／２３７２８７Ａ１号、同第ＷＯ２０１９／１５２８１０Ａ１号、同第ＷＯ２０１９／１８５８７９Ａ１号、及び同第ＷＯ２０２０／０１６４５９Ａ１号参照）。しかしながら、上記のすべてにかかわらず、当技術分野では効果的な治療用抗体の必要性が存在する。
本開示における参照文献の引用は、かかる参照文献が先行技術であることを認めるものとして解釈されるべきではない。
抗ＶＩＳＴＡ抗体が記載されている（例えば、米国特許第８，２３１，８７２号、同第８，２３６，３０４号、同第８，５０１，９１５号、及び同第１０，７６６，９５９号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０４０７４４９Ａ１号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／２０７７１７Ａ８号、同第ＷＯ２０１４／１９７８４９Ａ９号、同第ＷＯ２０１８／１６９９９３Ａ１号、同第ＷＯ２０１８／２３７２８７Ａ１号、同第ＷＯ２０１９／１５２８１０Ａ１号、同第ＷＯ２０１９／１８５８７９Ａ１号、及び同第ＷＯ２０２０／０１６４５９Ａ１号参照）。しかしながら、上記のすべてにかかわらず、当技術分野では効果的な治療用抗体の必要性が存在する。
本開示における参照文献の引用は、かかる参照文献が先行技術であることを認めるものとして解釈されるべきではない。
Ｂｏｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１７；６（４）：ｅ１２９３２１５（２０１７）
Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．２０８ Ｎｏ．３ ５７７－５９２
Ｂｌａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１１６（５）：１６９２－９７
Ｋａｋａｖａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｍｏｄｅｒｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３０：１６６６－１６７６
Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎａｔ Ｍｅｄ．Ｍａｙ；２３（５）：５５１－５５５
Ｗｏｏｆ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４（２００４）８９－９９
Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．ａｎｄ Ｒｅｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８（２００８）３４－４７
Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０（２００８）４６０－４７０
Ｄｗｅｋ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｎａｔ．１８７（１９９５）２７９－２９２
Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｗ．Ｐｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ １３（１９６９）１－１１０
本開示より前に知られている抗ＶＩＳＴＡ抗体は、複数のリガンドがＶＩＳＴＡ受容体に結合するという事実、ＶＩＳＴＡを発現する免疫細胞及び毒性サイトカイン放出の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の可能性、抗薬物抗体または免疫原性、様々な有効性及び毒性を有するＶＩＳＴＡ上の複数の結合エピトープ、ならびに最適化されていないＦｃ結合に対処できないことを含めた多くの欠点を示している。本出願の発明者らは、これらの欠点に関する知識を利用して、これらの懸念を克服する新規な抗ＶＩＳＴＡ抗体及びその抗原結合断片を設計した。これら態様の各々を以下に詳述する。
第一に、既知の抗ＶＩＳＴＡ抗体のほとんどは、ＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン上の２つの主要なエピトープのうちの１つに結合する。第１のエピトープであるＲ５４／Ｆ６２／Ｑ６３は、抗腫瘍効果に関連しているが、重大なサイトカイン放出と炎症にも関連しており、治療上の安全性に関する重大な懸念を引き起こす。第２のエピトープであるＨ１２１／Ｈ１２２／Ｈ１２３は、ｐＨ感受性の結合及びＰＫの増加をもたらすが、ほとんどの抗腫瘍活性を消失させる。本出願の発明者らは、第３の独自のエピトープに結合し、かつ安全性の改善及び腫瘍モデルにおいて優れた単剤有効性を示す本明細書に開示する抗ＶＩＳＴＡ抗体、及びその抗原結合断片を同定した（本明細書の実施例参照）。
第二に、既知の抗ＶＩＳＴＡ抗体は、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４のいずれかで既知のＶＩＳＴＡリガンドのうちの１つ、２つ、または（多くても）３つのみをブロックすることが分かっている。対照的に、本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ抗体及び抗原結合断片は、ｐＨ６．０～７．４の範囲にわたって、５つすべての既知のＶＩＳＴＡに対するリガンドの結合をブロックすることが可能であり、有効性が増加する。
さらに、本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ抗体及びその抗原結合断片は、Ｆｃγ受容体結合を減少させ、ひいてはＡＤＣＣ、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）及び炎症性サイトカイン放出を減少させるようにＦｃが最適化されており、治療的投与の安全性が向上する。本明細書に記載のいくつかの抗ＶＩＳＴＡ抗体は、ＦｃＲｎ結合を増加させるためにさらにＦｃが最適化されており、ひいては抗体のリサイクル及び長期曝露が増加する。最後に、本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ抗体及び抗原結合断片は、遺伝子操作されたヒト化マウスモデルを使用して開発され、ヒトにおける免疫原性の低下に関連するさらなる利点をもたらす。したがって、本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ抗体及びその抗原結合断片は、本開示より前に知られていた抗ＶＩＳＴＡ抗体及びその使用よりも驚くべき改良された特性を示す。
したがって、１つの態様では、本明細書に開示するのは、ヒト抗ＶＩＳＴＡ抗体、またはその抗原結合断片であり、これは、（ｉ）５つすべての既知のＶＩＳＴＡに対するリガンド（ＶＳＩＧ－３（Ｖ－ｓｅｔ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ３）、ＶＳＩＧ－８（Ｖ－ｓｅｔ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ８）、ＰＳＧＬ－１（Ｐ－セレクチン糖タンパク質リガンド－１）、ＬＲＩＧ１（ロイシンリッチリピート及び免疫グロブリン様ドメイン１）ならびにＶＩＳＴＡ）の結合をｐＨ６．０及び／またはｐＨ７．４でブロックし、及び／または（ｉｉ）ＶＩＳＴＡ－ＥＣＤ（細胞外ドメイン）のアミノ酸チロシン３７、アルギニン５４、バリン１１７及びアルギニン１２７を含めた固有のエピトープに結合する。
１つの態様では、本明細書に開示するのは、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ含有サプレッサー（ＶＩＳＴＡ）に結合する抗体、またはその抗原結合断片であり、該抗体、またはその抗原結合断片は、５つすべてのＶＩＳＴＡに対するリガンドの結合をｐＨ６．０及びｐＨ７．４でブロックし、該５つの既知のＶＩＳＴＡに対するリガンドは、ＶＳＩＧ－３（Ｖ－ｓｅｔ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ３）、ＶＳＩＧ－８（Ｖ－ｓｅｔ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ８）、ＰＳＧＬ－１（Ｐ－セレクチン糖タンパク質リガンド－１）、ＬＲＩＧ１（ロイシンリッチリピート及び免疫グロブリン様ドメイン１）ならびにＶＩＳＴＡであり、該抗体、またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
別の態様では、本明細書に開示するのは、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ含有サプレッサー（ＶＩＳＴＡ）に結合する抗体、またはその抗原結合断片であり、該抗体、またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、該ＶＨは、配列番号５８４～５９７、２２７～２４６、及び３８３～３８６のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５８４～５９７、２２７～２４６、及び３８３～３８６のいずれか１つを含む、またはそれからなる配列を含み、該ＶＬは、配列番号８４～１１０のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８４～１１０のいずれか１つを含む、またはそれからなる配列を含む。１つの実施形態では、該抗体、またはその抗原結合断片は、５つすべてのＶＩＳＴＡに対するリガンドの結合をｐＨ６．０及びｐＨ７．４でブロックし、該５つの既知のＶＩＳＴＡに対するリガンドは、ＶＳＩＧ－３（Ｖ－ｓｅｔ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ３）、ＶＳＩＧ－８（Ｖ－ｓｅｔ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ８）、ＰＳＧＬ－１（Ｐ－セレクチン糖タンパク質リガンド－１）、ＬＲＩＧ１（ロイシンリッチリピート及び免疫グロブリン様ドメイン１）ならびにＶＩＳＴＡである。別の実施形態では、該抗体、またはその抗原結合断片は、Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号２４７～２５３のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号２８４～２９１のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号３１８～３２５のいずれか１つのＶＨ ＣＤＲ１、Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号２５４～２６５のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号２９２～２９８のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号３２６～３３９のいずれか１つのＶＨ ＣＤＲ２、Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号２６６～２８３のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号２９９～３１７のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号３４０～３５９のいずれか１つのＶＨ ＣＤＲ３、Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号１１１～１２２のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号１５２～１６２のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号１８８～１９６もしくは５７６～５７８のいずれか１つのＶＬ ＣＤＲ１、Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号１２３～１３１及び５７５のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号１６３～１６７のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号１９７～２０６のいずれか１つのＶＬ ＣＤＲ２、Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号１３２～１５１のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号１６８～１８６のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号２０７～２２６のいずれか１つのＶＬ ＣＤＲ３を含む。
１つの態様では、本明細書に開示するのは、ＶＩＳＴＡに結合する抗体、またはその抗原結合断片であり、該抗体またはその抗原結合断片は、ＶＨ及びＶＬを含み、該ＶＨは、Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号２４７～２５３のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号２８４～２９１のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号３１８～３２５のいずれか１つのＶＨ ＣＤＲ１、Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号２５４～２６５のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号２９２～２９８のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号３２６～３３９のいずれか１つのＶＨ ＣＤＲ２、Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号２６６～２８３のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号２９９～３１７のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号３４０～３５９のいずれか１つのＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号１１１～１２２のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号１５２～１６２のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号１８８～１９６もしくは５７６～５７８のいずれか１つのＶＬ ＣＤＲ１、Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号１２３～１３１及び５７５のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号１６３～１６７のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号１９７～２０６のいずれか１つのＶＬ ＣＤＲ２、ならびにＫａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号１３２～１５１のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号１６８～１８６のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号２０７～２２６のいずれか１つのＶＬ ＣＤＲ３を含む。１つの実施形態では、該抗体、またはその抗原結合断片は、５つすべてのＶＩＳＴＡに対するリガンドの結合をｐＨ６．０及びｐＨ７．４でブロックし、該５つの既知のＶＩＳＴＡに対するリガンドは、ＶＳＩＧ－３（Ｖ－ｓｅｔ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ３）、ＶＳＩＧ－８（Ｖ－ｓｅｔ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ８）、ＰＳＧＬ－１（Ｐ－セレクチン糖タンパク質リガンド－１）、ＬＲＩＧ１（ロイシンリッチリピート及び免疫グロブリン様ドメイン１）ならびにＶＩＳＴＡである。
１つの実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８４～５９７、２２７～２４６、及び３８３～３８６のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５８４～５９７、２２７～２４６、及び３８３～３８６のいずれか１つを含む、またはそれからなる配列を含み、該ＶＬは、配列番号８４～１１０のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８４～１１０のいずれか１つを含む、またはそれからなる配列を含む。
別の実施形態では、該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２４７を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５４を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２６６を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１１を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２３を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３２を含むか、該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２８４を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２９２を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２９９を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１５２を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１６３を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１６８を含むか、該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号３１８を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号３２６を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３４０を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１８８を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１９７を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号２０７を含むか、該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２４８を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５５を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２６７を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１２を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２４を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３３を含むか、該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２８５を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２９３を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３００を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１５３を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１６４を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１６９を含むか、該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号３１９を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号３２７を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３４１を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１８９を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１９８を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号２０８を含むか、該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２４９を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５６を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２６８を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１３を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２５を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３４を含むか、該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２８６を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２９４を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３０１を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１５４を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１６５を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１７０を含むか、該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号３２０を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号３２８を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３４２を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１９０を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１９９を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号２０９を含むか、該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２５０を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５７を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２６９を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１４を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２６を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３５を含むか、該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２８７を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２９５を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３０２を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１５５を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１６５を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１７１を含むか、該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号３２１を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号３２９を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３４３を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１９１を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号２００を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号２１０を含むか、該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２５１を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５８を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２７０を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１５を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２７を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３６を含むか、該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２８８を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２９５を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３０３を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１５６を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１６６を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１７２を含むか、該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号３２２を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号３３０を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３４４を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１９２を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号２０１を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号２１１を含むか、該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２４８を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５９を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２７１を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１６を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２６を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３７を含むか、該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２８５を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２９６を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３０４を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１５７を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１６５を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１７３を含むか、または該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号３１９を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号３３１を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３４５を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１９３を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号２００を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号２１２を含む。
別の実施形態では、該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２４７、配列番号２８４もしくは配列番号３１８を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５４、配列番号２９２もしくは配列番号３２６を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２６６、配列番号２９９もしくは配列番号３４０を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１１、配列番号１５２もしくは配列番号１８８を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２３、配列番号１６３もしくは配列番号１９７を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３２、配列番号１６８もしくは配列番号２０７を含むか、該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２４８、配列番号２８５もしくは配列番号３１９を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５５、配列番号２９３もしくは配列番号３２７を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２６７、配列番号３００もしくは配列番号３４１を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１２、配列番号１５３もしくは配列番号１８９を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２４、配列番号１６４もしくは配列番号１９８を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３３、配列番号１６９もしくは配列番号２０８を含むか、該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２４９、配列番号２８６もしくは配列番号３２０を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５６、配列番号２９４もしくは配列番号３２８を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２６８、配列番号３０１もしくは配列番号３４２を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１３、配列番号１５４もしくは配列番号１９０を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２５、配列番号１６５、もしくは配列番号１９９を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３４、配列番号１７０もしくは配列番号２０９を含むか、該ＶＨ１ ＣＤＲ１は、配列番号２５０、配列番号２８７、もしくは配列番号３２１を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５７、配列番号２９５もしくは配列番号３３２を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２６９、配列番号３０２もしくは配列番号３４６を含み、該１９５、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１４、配列番号１５５もしくは配列番号１９１を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２６、配列番号１６５もしくは配列番号２００を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３５、配列番号１７１もしくは配列番号２１０を含むか、該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２５１、配列番号２８８もしくは配列番号３２２を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５８、配列番号２９５もしくは配列番号３３３を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２７０、配列番号３０３もしくは配列番号３４４を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１５、配列番号１５６もしくは配列番号１９２を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２７、配列番号１６６もしくは配列番号２０１を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３６、配列番号１７２もしくは配列番号２１１を含むか、または該ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２４８、配列番号１８５もしくは配列番号３１９を含み、該ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５９、配列番号２９６もしくは配列番号３３１を含み、該ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２７１、配列番号３０４もしくは配列番号３４５を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１６、配列番号１５７もしくは配列番号１９３を含み、該ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２６、配列番号１６５もしくは配列番号２００を含み、該ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３７、配列番号１７３もしくは配列番号２１２を含む。
別の実施形態では、（ｉ）該ＶＨは、配列番号５９２に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５９２を含む、またはそれからなる配列を含み、該ＶＬは、配列番号８６に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８６を含む、またはそれからなる配列を含むか、（ｉｉ）該ＶＨは、配列番号５８４に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５８４を含む、またはそれからなる配列を含み、該ＶＬは、配列番号８４に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８４を含む、またはそれからなる配列を含むか、（ｉｉｉ）該ＶＨは、配列番号５８５に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５８５を含む、またはそれからなる配列を含み、該ＶＬは、配列番号８５に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８５を含む、またはそれからなる配列を含むか、（ｉｖ）該ＶＨは、配列番号５８６に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５８６を含む、またはそれからなる配列を含み、該ＶＬは、配列番号８６に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８６を含む、またはそれからなる配列を含むか、（ｖ）該ＶＨは、配列番号５８７に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５８７を含む、またはそれからなる配列を含み、該ＶＬは、配列番号８７に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８７を含む、またはそれからなる配列を含むか、（ｖｉ）該ＶＨは、配列番号５８８に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５８８を含む、またはそれからなる配列を含み、該ＶＬは、配列番号８８に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８８を含む、またはそれからなる配列を含むか、（ｖｉｉ）該ＶＨは、配列番号５８９に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５８９を含む、またはそれからなる配列を含み、該ＶＬは、配列番号８９に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８９を含む、またはそれからなる配列を含むか、（ｖｉｉｉ）該ＶＨは、配列番号２３８に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号２３８を含む、またはそれからなる配列を含み、該ＶＬは、配列番号８４に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８４を含む、またはそれからなる配列を含むか、（ｉｘ）該ＶＨは、配列番号５９０に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５９０を含む、またはそれからなる配列を含み、該ＶＬは、配列番号８４に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８４を含む、またはそれからなる配列を含むか、（ｘ）該ＶＨは、配列番号５９１２３８に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５９１２３８を含む、またはそれからなる配列を含み、該ＶＬは、配列番号８５に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８５を含む、またはそれからなる配列を含むか、（ｘｉ）該ＶＨは、配列番号５９３に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５９３を含む、またはそれからなる配列を含み、該ＶＬは、配列番号８６に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８６を含む、またはそれからなる配列を含むか、（ｘｉｉ）該ＶＨは、配列番号５９３２３８に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５９３２３８を含む、またはそれからなる配列を含み、該ＶＬは、配列番号８７に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８７を含む、またはそれからなる配列を含むか、（ｘｉｉｉ）該ＶＨは、配列番号５９４に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５９４を含む、またはそれからなる配列を含み、該ＶＬは、配列番号８８４に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８８４を含む、またはそれからなる配列を含むか、あるいは（ｘｉｖ）該ＶＨは、配列番号５９５に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５９５を含む、またはそれからなる配列を含み、該ＶＬは、配列番号８９に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８９を含む、またはそれからなる配列を含む。
１つの実施形態では、該抗体、またはその抗原結合断片は、配列番号４０７～４７７、５７２～５７４、及び６０４～６０９のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号４０７～４７７、５７２～５７４、及び６０４～６０９のいずれか１つを含む、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）配列、ならびに配列番号３８７～４０６、５６９～５７１、及び５９８～６０３のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号３８７～４０６、５６９～５７１、及び５９８～６０３のいずれか１つを含む、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）配列を含む。
１つの実施形態では、該抗体、またはその抗原結合断片は、ヒトＶＩＳＴＡ（配列番号３７７のアミノ酸３３～３１１）に結合する。１つの実施形態では、該抗体、またはその抗原結合断片は、ヒトＶＩＳＴＡ（配列番号３７７のアミノ酸３３～３１１）に特異的に結合する。１つの実施形態では、該抗体、またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＨＬＨＨＧ（配列番号３７７のアミノ酸９８～１０２）またはＶＶＥＩＲＨＨＨＳＥＨＲ（配列番号３７７のアミノ酸１４８～１５９）を含むヒトＶＩＳＴＡのエピトープに結合する。１つの実施形態では、該抗体、またはその抗原結合断片は、配列番号３７７のチロシン３７、アルギニン５４、バリン１１７及びアルギニン１２７を含むヒトＶＩＳＴＡのエピトープに結合する。
１つの実施形態では、該抗体、またはその抗原結合断片は、Ｆｃ領域を含む。１つの実施形態では、該Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域であるか、または該ヒトＦｃ領域のバリアントであり、これは、天然のヒトＦｃ領域と比較して、該Ｆｃ領域に１～７個に及ぶアミノ酸変異を有する。１つの実施形態では、該ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４のものである。別の実施形態では、該抗体は、ヒトＩｇＧ１もしくはヒトＩｇＧ４の定常領域を含むか、または該定常領域のバリアントを含み、これは、天然の定常領域と比較して、該定常領域に１～７個に及ぶアミノ酸変異を有する。
１つの実施形態では、（ａ）該Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１のものであり、該変異は、Ｃ２２０Ｄ、Ｄ２２１Ｃ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ｆ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３６Ｗ、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４１Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５６Ｎ、Ｖ２６４Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｈ２６８Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｅ２９４欠失、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｅ、Ｓ２９８Ａ、Ｔ３０７Ｐ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｍ、Ｌ３２８Ｒ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ａ、Ｐ３３１Ｓ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３７８Ｖ、Ｓ３８３Ｎ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、及びＮ４３４Ｙからなる群から選択され、ここで、該残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されるか、（ｂ）該Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ２のものであり、該変異は、Ｃ２２０Ｄ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４１Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５６Ｎ、Ｖ２６４Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｈ２６８Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｅ２９４欠失、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｅ、Ｓ２９８Ａ、Ｔ３０７Ｐ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｍ、Ｌ３２８Ｒ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ａ、Ｐ３３１Ｓ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ｓ３８３Ｎ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、及びＮ４３４Ｙからなる群から選択され、ここで、該残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されるか、または（ｃ）該Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ４のものであり、該変異は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ｆ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３６Ｗ、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４１Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５６Ｎ、Ｖ２６４Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｈ２６８Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｅ２９４欠失、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｅ、Ｓ２９８Ａ、Ｔ３０７Ｐ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｍ、Ｌ３２８Ｒ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３７８Ｖ、Ｓ３８３Ｎ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、及びＮ４３４Ｙからなる群から選択され、ここで、該残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番される。
１つの実施形態では、該抗体、またはその抗原結合断片は、二重特異性抗体または多重特異性抗体である。１つの実施形態では、該抗原結合断片は、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。
１つの態様では、本明細書に開示するのは、ヒトＶＩＳＴＡ（配列番号３７７）への結合をめぐって本明細書に記載の抗体、またはその抗原結合断片のいずれか１つと競合する抗体、またはその抗原結合断片である。１つの態様では、本明細書に開示するのは、本明細書に記載の抗体、またはその抗原結合断片のいずれか１つとヒトＶＩＳＴＡ（配列番号３７７）との結合を防ぐ抗体、またはその抗原結合断片である。１つの実施形態では、該結合は、ＥＬＩＳＡアッセイ、表面プラズモン共鳴、またはＢＬＩ、例えば、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｓｙｓｔｅｍ）でのＢＬＩによって測定される。
別の態様では、本明細書に開示するのは、本明細書に開示する抗体、またはその抗原結合断片、及び治療薬を含む抗体－薬物複合体である。別の態様では、本明細書に開示するのは、本明細書に開示するｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
別の態様では、本明細書に開示するのは、本明細書に開示する抗体、または抗原結合断片のＶＨをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。別の態様では、本明細書に開示するのは、本明細書に開示する抗体、または抗原結合断片のＶＬをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。別の態様では、本明細書に開示するのは、本明細書に開示する抗体、または抗原結合断片のＶＨ及びＶＬをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。
１つの態様では、本明細書に開示するのは、本明細書に開示する抗体、またはその抗原結合断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む細胞である。
１つの態様では、本明細書に開示するのは、本明細書に開示する抗体、もしくはその抗原結合断片、抗体－薬物複合体、またはＣＡＲ、及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物である。
１つの態様では、本明細書に開示するのは、本明細書に開示する抗体、またはその抗原結合断片を産生する方法であり、該方法は、上記１つ以上のポリヌクレオチドが、細胞によって発現されて、該ポリヌクレオチドによってコードされる抗体、またはその抗原結合断片が産生されるような条件下で該細胞を培養することを含む。
１つの態様では、本明細書に開示するのは、がん、自己免疫疾患、及び／または感染症の治療を必要とする対象におけるその治療方法であり、これは、本明細書に開示する医薬組成物を該対象に投与することを含む。１つの実施形態では、該方法は、がんを治療するためのものである。１つの実施形態では、該方法は、自己免疫疾患を治療するためのものである。１つの実施形態では、該方法は、感染症を治療するためのものである。１つの実施形態では、該がんは、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、卵巣癌、神経芽腫、口腔癌、甲状腺癌、乳癌、肉腫、膵臓癌、結腸癌、胃癌、絨毛癌、精巣癌、中皮腫、皮膚癌、腎細胞癌、膀胱癌、血液癌、または子宮頸癌である。１つの実施形態では、該がんは、転移性がんである。１つの実施形態では、該がんは、血液癌、急性骨髄性白血病、または骨髄異形成症候群である。１つの実施形態では、該方法はさらに、該対象に追加の療法を施すことを含み、任意選択で、該追加の療法は、放射線療法、化学療法剤、標的療法、チロシンキナーゼ阻害剤、ホルモン療法、及び／または免疫チェックポイント阻害剤である。１つの実施形態では、該免疫チェックポイント阻害剤は、プログラム死－１（ＰＤ－１）、もしくはプログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）、または細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）の阻害剤である。
１つの態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに結合する、例えば、特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体は、可変重鎖領域（ＶＨ）及び可変軽鎖領域（ＶＬ）を含む。１つの実施形態では、該ＶＨは、（ｉ）配列番号２４７のＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号２５４のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号２６６のＶＨ ＣＤＲ３、（ｉｉ）配列番号２８４のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２９２のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号２９９のＶＨ ＣＤＲ３、または（ｉｉｉ）配列番号３１８のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３２６のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３４０のＶＨ ＣＤＲ３を含む。
別の態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、該ＶＨは、（ｉ）配列番号２４８のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２５５のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号２６７のＶＨ ＣＤＲ３、（ｉｉ）配列番号２８５のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２９３のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３００のＶＨ ＣＤＲ３、または（ｉｉｉ）配列番号３１９のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３２７のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３４１のＶＨ ＣＤＲ３を含む。
別の態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、該ＶＨは、（ｉ）配列番号２４９のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２５６のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号２６８のＶＨ ＣＤＲ３、（ｉｉ）配列番号２８６のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２９４のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３０１のＶＨ ＣＤＲ３、または（ｉｉｉ）配列番号３２０のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３２８のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３４２のＶＨ ＣＤＲ３を含む。
別の態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、該ＶＨは、（ｉ）配列番号２５０のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２５７のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号２６９のＶＨ ＣＤＲ３、（ｉｉ）配列番号２８７のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２９５のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３０２のＶＨ ＣＤＲ３、または（ｉｉｉ）配列番号３２１のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３２９のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３４３のＶＨ ＣＤＲ３を含む。
別の態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、該ＶＨは、（ｉ）配列番号２５１のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２５８のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号２７０のＶＨ ＣＤＲ３、（ｉｉ）配列番号２８８のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２９５のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３０３のＶＨ ＣＤＲ３、または（ｉｉｉ）配列番号３２２のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３３０のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３４４のＶＨ ＣＤＲ３を含む。
別の態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、該ＶＨは、（ｉ）配列番号２４８のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２５９のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号２７１のＶＨ ＣＤＲ３、（ｉｉ）配列番号２８５のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２９６のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３０４のＶＨ ＣＤＲ３、または（ｉｉｉ）配列番号３１９のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３３１のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３４５のＶＨ ＣＤＲ３を含む。
別の態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、該ＶＨは、（ｉ）配列番号２４７のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２５４のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号２７７のＶＨ ＣＤＲ３、（ｉｉ）配列番号２８４のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２９２のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３１０のＶＨ ＣＤＲ３、または（ｉｉｉ）配列番号３１８のＣＤＲ１、配列番号３２６のＣＤＲ２、及び配列番号３５２のＣＤＲ３を含む。
別の態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ｉ）該ＶＨは、配列番号２４７のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２５４のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号２６６のＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、配列番号１１１のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１２３のＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号１３２のＶＬ ＣＤＲ３を含むか、（ｉｉ）該ＶＨは、配列番号２８４のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２９２のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号２９９のＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、配列番号１５２のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１６３のＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号１６８のＶＬ ＣＤＲ３を含むか、または（ｉｉｉ）該ＶＨは、配列番号３１８のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３２６のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３４０のＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、配列番号１８８のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１９７のＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号２０７のＶＬ ＣＤＲ３を含む。
別の態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ｉ）該ＶＨは、配列番号２４８のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２５５のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号２６７のＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、配列番号１１２のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１２４のＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号１３３のＶＬ ＣＤＲ３を含むか、（ｉｉ）該ＶＨは、配列番号２８５のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２９３のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３００のＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、配列番号１５３のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１６４のＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号１６９のＶＬ ＣＤＲ３を含むか、または（ｉｉｉ）該ＶＨは、配列番号３１９のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３２７のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３４１のＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、配列番号１８９のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１９８のＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号２０８のＶＬ ＣＤＲ３を含む。
別の態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ｉ）該ＶＨは、配列番号２４９のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２５６のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号２６８のＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、配列番号１１３のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１２５のＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号１３４のＶＬ ＣＤＲ３を含むか、（ｉｉ）該ＶＨは、配列番号２８６のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２９４のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３０１のＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、配列番号１５４のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１６５のＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号１７０のＶＬ ＣＤＲ３を含むか、または（ｉｉｉ）該ＶＨは、配列番号３２０のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３２８のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３４２のＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、配列番号１９０のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１９９のＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号２０９のＶＬ ＣＤＲ３を含む。
別の態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ｉ）該ＶＨは、配列番号２５０のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２５７のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号２６９のＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、配列番号１１４のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１２６のＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号１３５のＶＬ ＣＤＲ３を含むか、（ｉｉ）該ＶＨは、配列番号２８７のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２９５のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３０２のＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、配列番号１５５のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１６５のＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号１７１のＶＬ ＣＤＲ３を含むか、または（ｉｉｉ）該ＶＨは、配列番号３２１のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３２９のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３４３のＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、配列番号１９１のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２００のＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号２１０のＶＬ ＣＤＲ３を含む。
別の態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ｉ）該ＶＨは、配列番号２５１のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２５８のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号２７０のＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、配列番号１１５のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１２７のＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号１３６のＶＬ ＣＤＲ３を含むか、（ｉｉ）該ＶＨは、配列番号２８８のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２９５のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３０３のＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、配列番号１５６のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１６６のＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号１７２のＶＬ ＣＤＲ３を含むか、または（ｉｉｉ）該ＶＨは、配列番号３２２のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３３０のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３４４のＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、配列番号１９２のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２０１のＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号２１１のＶＬ ＣＤＲ３を含む。
別の態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ｉ）該ＶＨは、配列番号２４８のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２５９のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号２７１のＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、配列番号１１６のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１２６のＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号１３７のＶＬ ＣＤＲ３を含むか、（ｉｉ）該ＶＨは、配列番号２８５のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２９６のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３０４のＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、配列番号１５７のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１６５のＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号１７３のＶＬ ＣＤＲ３を含むか、または（ｉｉｉ）該ＶＨは、配列番号３１９のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３３１のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３４５のＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、配列番号１９３のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２００のＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号２１２のＶＬ ＣＤＲ３を含む。
別の態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ｉ）該ＶＨは、配列番号２４７のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２５４のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号２７７のＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、配列番号１１１のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１２３のＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号１３２のＶＬ ＣＤＲ３を含むか、（ｉｉ）該ＶＨは、配列番号２８４のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２９２のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３１０のＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、配列番号１５２のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１６３のＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号１６８のＶＬ ＣＤＲ３を含むか、または（ｉｉｉ）該ＶＨは、配列番号３１８のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３２６のＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号３５２のＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、配列番号１６８のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１９７のＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号２０７のＶＬ ＣＤＲ３を含む。
特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８４の配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＬは、配列番号８４の配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８４の配列を含み、該ＶＬは、配列番号８４の配列を含む。
特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８５の配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＬは、配列番号８５の配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８５の配列を含み、該ＶＬは、配列番号８５の配列を含む。
特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８６の配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＬは、配列番号８６の配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８６の配列を含み、該ＶＬは、配列番号８６の配列を含む。
特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８７の配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＬは、配列番号８７の配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８７の配列を含み、該ＶＬは、配列番号８７の配列を含む。
特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８８の配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８８の配列を含み、該ＶＬは、配列番号８８の配列を含む。
特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８９の配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＬは、配列番号８９の配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８９の配列を含み、該ＶＬは、配列番号８９の配列を含む。
特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５９２の配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＬは、配列番号８６の配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５９２の配列を含み、該ＶＬは、配列番号８６の配列を含む。
特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号２３８の配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＬは、配列番号８４の配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号２３８の配列を含み、該ＶＬは、配列番号８４の配列を含む。
特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８４の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＬは、配列番号８４の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８４の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、該ＶＬは、配列番号８４の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８５の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＬは、配列番号８５の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８５の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、該ＶＬは、配列番号８５の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８６の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＬは、配列番号８６の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８６の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、該ＶＬは、配列番号８６の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８７の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＬは、配列番号８７の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８７の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、該ＶＬは、配列番号８７の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８８の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＬは、配列番号８８の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８８の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、該ＶＬは、配列番号８８の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８９の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＬは、配列番号８９の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５８９の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、該ＶＬは、配列番号８９の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５９２の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＬは、配列番号８６の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号５９２の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、該ＶＬは、配列番号８６の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号２３８の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＬは、配列番号８４の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＨは、配列番号２３８の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、該ＶＬは、配列番号８４の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
別の態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、該ＶＨは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＨ ＣＤＲ１は、表１に列挙される抗体番号に対するＶＨ ＣＤＲ１として表１に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ２は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ２として表１に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ３は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ３として表１に記載される配列番号のものである。
別の態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、該ＶＨは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＨ ＣＤＲ１は、表２に列挙される抗体番号に対するＶＨ ＣＤＲ１として表２に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ２は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ２として表２に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ３は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ３として表２に記載される配列番号のものである。
別の態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、該ＶＨは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＨ ＣＤＲ１は、表３に列挙される抗体番号に対するＶＨ ＣＤＲ１として表３に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ２は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ２として表３に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ３は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ３として表３に記載される配列番号のものである。
別の態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ｉ）該ＶＨは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＨ ＣＤＲ１は、表１に列挙される抗体番号に対するＶＨ ＣＤＲ１として表１に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ２は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ２として表１に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ３は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ３として表１に記載される配列番号のものであり、（ｉｉ）該ＶＬは、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ１として表４に記載される配列番号のものであり、該ＶＬ ＣＤＲ２は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ２として表４に記載される配列番号のものであり、該ＶＬ ＣＤＲ３は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ３として表４に記載される配列番号のものである。
別の態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ｉ）該ＶＨは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＨ ＣＤＲ１は、表２に列挙される抗体番号に対するＶＨ ＣＤＲ１として表２に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ２は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ２として表２に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ３は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ３として表２に記載される配列番号のものであり、（ｉｉ）該ＶＬは、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ１として表５に記載される配列番号のものであり、該ＶＬ ＣＤＲ２は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ２として表５に記載される配列番号のものであり、該ＶＬ ＣＤＲ３は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ３として表５に記載される配列番号のものである。
別の態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ｉ）該ＶＨは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＨ ＣＤＲ１は、表３に列挙される抗体番号に対するＶＨ ＣＤＲ１として表３に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ２は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ２として表３に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ３は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ３として表３に記載される配列番号のものであり、（ｉｉ）該ＶＬは、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ１として表６に記載される配列番号のものであり、該ＶＬ ＣＤＲ２は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ２として表６に記載される配列番号のものであり、該ＶＬ ＣＤＲ３は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ３として表６に記載される配列番号のものである。
特定の実施形態では、該ＶＨは、抗体のＶＨとして表７に記載される配列番号を含む。特定の実施形態では、該ＶＨは、抗体のＶＨとして表７に記載される配列番号を含み、該ＶＬは、該抗体のＶＬとして表８に記載される配列番号を含む。
別の態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、該軽鎖は、表９に列挙される抗体番号に対する軽鎖として表９に記載される配列番号のものであり、該重鎖は、該抗体の重鎖として表９に記載される配列番号のものである。
特定の実施形態では、該抗体または抗原結合断片は、ヒトＶＩＳＴＡ（配列番号３７７のアミノ酸３３～３１１）に特異的に結合する。
別の態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体は、アミノ酸配列ＨＬＨＨＧ（配列番号３７７のアミノ酸９８～１０２、付番は、シグナル配列（シグナル配列は、下線が引かれ、太字である。表１１）より後の最初のアミノ酸から開始する）またはＶＶＥＩＲＨＨＨＳＥＨＲ（配列番号３７７のアミノ酸１４８～１５９、付番は、シグナル配列（下線、太字、表１１）より後の最初のアミノ酸から開始する）を含むヒトＶＩＳＴＡのエピトープを認識する。別の実施形態では、該抗体は、配列番号３７７のチロシン３７、アルギニン５４、バリン１１７及びアルギニン１２７を含むヒトＶＩＳＴＡのエピトープを認識する（付番は、シグナル配列（表１１中、下線、太字）より後の最初のアミノ酸から開始する）。
別の態様では、本明細書に提供するのは、以下からなる群から選択される、ＶＩＳＴＡへの結合をめぐって参照抗体と競合する抗体またはその抗原結合断片である：（ａ）（ｉ）配列番号５８４の配列を含むＶＨ及び（ｉｉ）配列番号８４の配列を含むＶＬを含む第１の免疫グロブリン、（ｂ）（ｉ）配列番号５８５の配列を含むＶＨ及び（ｉｉ）配列番号８５の配列を含むＶＬを含む第２の免疫グロブリン、（ｃ）（ｉ）配列番号５８６の配列を含むＶＨ及び（ｉｉ）配列番号８６の配列を含むＶＬを含む第３の免疫グロブリン、（ｄ）（ｉ）配列番号５８７の配列を含むＶＨ及び（ｉｉ）配列番号８７の配列を含むＶＬを含む第４の免疫グロブリン、（ｅ）（ｉ）配列番号５８８の配列を含むＶＨ及び（ｉｉ）配列番号８８の配列を含むＶＬを含む第５の免疫グロブリン、（ｆ）（ｉ）配列番号５８９の配列を含むＶＨ及び（ｉｉ）配列番号８９の配列を含むＶＬを含む第６の免疫グロブリン、（ｇ）（ｉ）配列番号２３８の配列を含むＶＨ及び（ｉｉ）配列番号８４の配列を含むＶＬを含む第７の免疫グロブリン、ならびに（ｈ）（ｉ）配列番号５９２の配列を含むＶＨ及び（ｉｉ）配列番号８６の配列を含むＶＬを含む第８の免疫グロブリン。
１つの実施形態では、該抗体は、モノクローナル抗体である。特定の実施形態では、該抗体は、ヒト抗体である。特定の実施形態では、該抗体は、免疫グロブリンである。
特定の実施形態では、該抗体は、Ｆｃ領域または該Ｆｃ領域のバリアントを含み、任意選択で、該Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域または天然のヒトＦｃ領域と比較して、該Ｆｃ領域に１～７個に及ぶアミノ酸変異を有する該ヒトＦｃ領域のバリアントであり、及び／または任意選択で、該ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４のものであり、さらに、任意選択で、該抗体は、ヒトＩｇＧ１もしくはヒトＩｇＧ４の定常領域または天然の定常領域と比較して、該定常領域に１～７個に及ぶアミノ酸変異を有する該定常領域のバリアントを含む。
特定の実施形態では、該抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。特定の実施形態では、該抗体は、補体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する。特定の実施形態では、該抗体は、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を媒介する。
特定の実施形態では、該抗体は、該ヒトＦｃ領域の該バリアントを含む。特定の実施形態では、（ａ）該Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１のものであり、該変異は、Ｃ２２０Ｄ、Ｄ２２１Ｃ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ｆ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３６Ｗ、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４１Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５６Ｎ、Ｖ２６４Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｈ２６８Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｅ２９４欠失、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｅ、Ｓ２９８Ａ、Ｔ３０７Ｐ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｍ、Ｌ３２８Ｒ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ａ、Ｐ３３１Ｓ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３７８Ｖ、Ｓ３８３Ｎ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、及びＮ４３４Ｙからなる群から選択され、ここで、該残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されるか、（ｂ）該Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ２のものであり、該変異は、Ｃ２２０Ｄ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４１Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５６Ｎ、Ｖ２６４Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｈ２６８Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｅ２９４欠失、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｅ、Ｓ２９８Ａ、Ｔ３０７Ｐ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｍ、Ｌ３２８Ｒ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ａ、Ｐ３３１Ｓ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ｓ３８３Ｎ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、及びＮ４３４Ｙからなる群から選択され、ここで、該残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されるか、または（ｃ）該Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ４のものであり、該変異は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ｆ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３６Ｗ、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４１Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５６Ｎ、Ｖ２６４Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｈ２６８Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｅ２９４欠失、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｅ、Ｓ２９８Ａ、Ｔ３０７Ｐ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｍ、Ｌ３２８Ｒ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３７８Ｖ、Ｓ３８３Ｎ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、及びＮ４３４Ｙからなる群から選択され、ここで、該残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番される。
特定の実施形態では、該Ｆｃ領域は、（ａ）ヒトＩｇＧ１のものであり、該変異は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、ならびに任意選択でＰ３２９Ｇを含み、該残基はＥＵ付番システムを使用して付番されるか、または（ｂ）ヒトＩｇＧ４のものであり、該変異は、Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、ならびに任意選択でＰ３２９Ｇを含み、該残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番される。
特定の実施形態では、該Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４のものであり、該変異は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅを含み、該残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番される。
特定の実施形態では、該Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のものであり、該変異は、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含み、該残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番される。
特定の実施形態では、該Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ４のものであり、該変異は、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを含み、該残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番される。
１つの実施形態では、該Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ４であり、該変異は、Ｓ２２８Ｐ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅを含み、該残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番される。
１つの実施形態では、該Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ４のものであり、該変異は、Ｓ２２８Ｐ、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含み、該残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番される。
特定の実施形態では、該抗体または抗原結合断片は、二重特異性抗体または三重特異性抗体である。別の実施形態では、該抗体または抗原結合断片は、ＢｉＴＥまたはＴｒｉＫＥである。
特定の実施形態では、該抗原結合断片は、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、またはＦ（ａｂ’）２断片である。
特定の実施形態では、該抗体またはその抗原結合断片は、精製される。別の実施形態では、該抗体、または抗原結合断片は、単離される。
別の態様では、本明細書に提供するのは、リンカー配列によって分離されたＶＨ及びＶＬを含む一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）であり、該ＶＨは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＨ ＣＤＲ１は、表１～３からなる群から選択される表に列挙される抗体番号に対するＶＨ ＣＤＲ１として該表に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ２は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ２として該表に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ３は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ３として該表に記載される配列番号のものである。特定の実施形態では、該ＶＬは、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ１として表４～６からなる群から選択される表に記載される配列番号のものであり、該ＶＬ ＣＤＲ２は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ２として該表に記載される配列番号のものであり、該ＶＬ ＣＤＲ３は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ３として該表に記載される配列番号のものであり、該ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ３、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３はすべて、同じＣＤＲ付番システムによって定義される。特定の実施形態では、該ＶＨは、該抗体のＶＨとして表７に記載される配列番号を含む。特定の実施形態では、該ＶＬは、該抗体のＶＬとして表８に記載される配列番号を含む。
別の態様では、本明細書に提供するのは、本明細書に提供するｓｃＦｖを含む融合タンパク質である。
別の態様では、本明細書に提供するのは、治療薬に結合した（任意選択で共有結合した）前述の実施形態のいずれかの抗体もしくは抗原結合断片、ｓｃＦｖ、または融合タンパク質を含む抗体－薬物複合体である。
別の態様では、本明細書に提供するのは、前述の実施形態のいずれかのｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。同様に本明細書に提供するのは、該ＣＡＲを発現する細胞である。
別の態様では、本明細書に提供するのは、前述の実施形態のいずれかの抗体もしくは抗原結合断片、ｓｃＦｖ、融合タンパク質、またはＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。
別の態様では、本明細書に提供するのは、前述の実施形態のいずれかの抗体もしくは抗原結合断片、ｓｃＦｖ、融合タンパク質、またはＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を各々が含む１つ以上のポリヌクレオチドを含むエキソビボ細胞である。同様に本明細書に提供するのは、抗体もしくは抗原結合断片またはｓｃＦｖまたは融合タンパク質またはＣＡＲを産生する方法であり、該方法は、上記１つ以上のポリヌクレオチドが、細胞によって発現されて、該ポリヌクレオチドによってコードされる抗体もしくは抗原結合断片またはｓｃＦｖまたは融合タンパク質またはＣＡＲが産生されるような条件下で該細胞を培養することを含む。
別の態様では、本明細書に提供するのは、（ａ）前述の実施形態のいずれかの抗体もしくは抗原結合断片、ｓｃＦｖ、融合タンパク質、ＣＡＲ、抗体－薬物複合体、または細胞の治療有効量、及び（ｂ）医薬的に許容される担体を含む医薬組成物である。同様に本明細書に提供するのは、がんの治療を必要とする対象におけるその治療方法であり、これは、該対象に対して、該医薬組成物を投与することを含む。特定の実施形態では、該がんは、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、頭頸部扁平上皮癌、血液癌（ｂｌｏｏｄ ｃａｎｃｅｒ）、肝細胞癌、卵巣癌、中皮腫、神経芽腫、口腔癌、甲状腺癌、乳癌、肉腫、膵臓癌、結腸癌、胃癌、絨毛癌、精巣癌、皮膚癌、腎細胞癌、膀胱癌、血液癌（ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）（例えば、急性骨髄性白血病）、または子宮頸癌である。１つの実施形態では、該がんは、骨髄異形成症候群である。特定の実施形態では、該がんは、転移性がんである。特定の実施形態では、該がんは、急性骨髄性白血病であり、該医薬組成物は、治療有効量の該抗体－薬物複合体を含み、該治療薬は、任意選択で細胞毒性薬である。
特定の実施形態では、該がんを治療する方法はさらに、該対象に対して追加の療法を施すことを含む。特定の実施形態では、該追加の療法は、該がんを治療するためのものである。特定の実施形態では、該がんを治療する方法はさらに、該対象に対して、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤、及び／または免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含む。特定の実施形態では、該がんを治療する方法はさらに、該対象に対して、該免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含み、該免疫チェックポイント阻害剤は、プログラム死－１（ＰＤ－１）、もしくはプログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）、または細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）の阻害剤である。特定の実施形態では、該対象は、ヒトである。１つの実施形態では、該追加の療法は、放射線療法である。
本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片であり、この抗体及び断片は、本明細書では、それぞれ、「抗ＶＩＳＴＡ抗体」及び「抗ＶＩＳＴＡ抗原結合断片」とも呼ばれる。本明細書で使用される場合、「免疫特異的に結合する」、「免疫特異的に認識する」、「特異的に結合する」、及び「特異的に認識する」という表現は、抗体及びその抗原結合断片の文脈では同義で使用され、当業者には理解されるように、抗体及び抗原結合断片による、該抗体の抗原結合部位を介した抗原への結合を指し、該抗体または抗原結合断片の他の抗原との交差反応性を排除するものではない。例えば、本明細書に提供する抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＶＩＳＴＡ及びカニクイザルＶＩＳＴＡの両方に免疫特異的に結合し得るが、マウスＶＩＳＴＡには結合しない可能性がある。当技術分野で既知の任意の方法を使用して、ＶＩＳＴＡへの免疫特異的結合が生じるかどうかを確認することができる。
本明細書に記載の抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、好ましくは、モノクローナル抗体である。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、免疫グロブリン、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含むテトラマー抗体、抗体軽鎖モノマー、抗体重鎖モノマー、抗体軽鎖ダイマー、抗体重鎖ダイマー、抗体軽鎖－抗体重鎖ペア、単一ドメイン抗体、一価抗体、一本鎖抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、またはジスルフィド結合Ｆｖである。本開示の目的上、ｓｃＦｖはＶＨドメイン及びＶＬドメイン（リンカーによって接続されている）を含むため、ｓｃＦｖは抗原結合断片と見なされるものとする。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、二価である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、多重特異性または二重特異性である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、二重特異性モノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、一価である。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、二価である。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、単一特異性である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、組み換え的に産生される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、精製される。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、合成抗体である。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ヒト抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、マウス抗体である。
本発明の抗体の特定の実施形態では、該抗体は、免疫グロブリンである。本明細書に記載の抗体は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＷもしくはＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２）、または任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ２ｂ）のものであり得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ＩｇＧ抗体、またはそのクラスもしくはサブクラスである。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体である。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ＩｇＧ抗体である。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ＩｇＧ１抗体である。別の特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ＩｇＧ２抗体である。別の特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ＩｇＧ３抗体である。別の特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ＩｇＧ４抗体である。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、重鎖と軽鎖の結合によって、または重鎖可変領域と軽鎖可変領域の結合によって形成される。
抗原結合断片は、抗原に結合し、抗体分子に該抗原に対する特異性を付与するフレームワーク領域に囲まれたアミノ酸残基を含む抗体分子の部分（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ））を含む。該ＣＤＲは、任意の動物種、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラットまたはハムスター）、ニワトリ、ウシ、ラクダ、及びヒト等に由来し得る。例として、抗原結合断片としては、本明細書に記載の抗体のいずれかのＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、及び他の抗原結合断片が挙げられる。
本明細書で使用される、「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、同義で使用され、当技術分野では一般的である。可変領域は通常、抗体の一部、通常は、軽鎖または重鎖の一部を指し、これは、抗体間で配列が大きく異なり、特定の抗原に対する特定の抗体の結合及び特異性に使用される。配列の可変性は、ＣＤＲに集中しているが、可変ドメイン内のより高度に保存された領域は、フレームワーク領域と呼ばれる。いかなる特定の機構にも理論にも拘束されることを望むものではないが、軽鎖及び重鎖のＣＤＲは、主に、当該抗体と抗原の相互作用及び特異性に関与すると考えられる。
ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、ｃｏｎｔａｃｔ、ＩＭＧＴ、及びＰａｒａｔｏｍｅ付番システムを含めた当技術分野における様々な方法で定義される。本明細書に開示する抗ＶＩＳＴＡ抗体のＣＤＲを定義するために、当技術分野で既知のＣＤＲ付番システムのいずれかが使用され得る。Ｋａｂａｔ付番システムは、配列可変性に基づくものであり、ＣＤＲ領域を予測するために最も一般的に使用されている定義である（Ｋａｂａｔ，Ｅｌｖｉｎ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，１９８３）。Ｃｈｏｔｈｉａ付番システムは、構造ループ領域の位置に基づいている（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－９１７）。ＡｂＭ付番システムは、Ｋａｂａｔ付番システムとＣｈｏｔｈｉａ付番システムとの間の折衷であり、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ（ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ）によって作製された抗体構造モデリングのための一連の統合プログラムである（Ｍａｒｔｉｎ ＡＣＲ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）ＰＮＡＳ ８６：９２６８－９２７２）。ｃｏｎｔａｃｔ付番システムは、入手可能な複雑な結晶構造（ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ）の分析に基づいている（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ＲＭ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５：７３２－７４５参照）。ＩＭＧＴ付番システムは、ＩＭＧＴ（“ＩＭＧＴ（登録商標）、ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）ｗｅｂｓｉｔｅ ｉｍｇｔ．ｏｒｇ，ｆｏｕｎｄｅｒ ａｎｄ ｄｉｒｅｃｔｏｒ：Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）によるものである。Ｐａｒａｔｏｍｅ付番システムは、すべての既知の抗体－抗原複合体の非重複セットの構造アラインメントから得られるコンセンサス領域のセットに基づいて、抗体の抗原結合領域を予測する。このアルゴリズムは、抗原結合残基の大部分が、抗体間の構造的コンセンサス領域に存在し、抗体配列内で６つのＣＤＲにほぼ対応する６つの配列ストレッチを形成するという前提に基づいている（Ｋｕｎｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，Ｖｏｌ．４０，Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ Ｗ５２１－Ｗ５２４参照）。
本開示は、本明細書に開示する配列を含む抗体及び抗原結合断片ならびに他の対象（例えば、ｓｃＦｖ、ＣＤＲ、可変領域等）だけでなく、本明細書に開示する配列からなるまたはそれらから本質的になる抗体及び抗原結合断片ならびに他の対象も提供する。
別の態様では、本明細書に提供するのは、多重特異性抗体及びヘテロコンジュゲート抗体である。特定の実施形態では、本明細書に提供するのは、２つの異なる抗原結合領域を含む二重特異性抗体であり、該結合領域のうちの一方はＶＩＳＴＡに結合し、本明細書に記載の抗体の可変重鎖領域、可変軽鎖領域またはその両方を含み、他方の結合領域は、目的の別の抗原に結合する。特定の態様では、本明細書に提供するのは、２つの異なる抗原結合領域を含む二重特異性抗体であり、該結合領域のうちの一方はＶＩＳＴＡに特異的に結合し、他方の結合領域は、目的の別の抗原に結合し、該ＶＩＳＴＡに特異的に結合する結合領域は、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。特定の態様では、本明細書に提供するのは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する２つの抗原結合部位を含む第１の可変領域（すなわち、二価である）、及び異なる抗原に特異的に結合する２つの結合部位を含む第２の可変領域（すなわち、二価である）を含む二重特異性抗体であり、該第１及び第２の可変領域は、Ｆｃ断片によって連結され、本態様の特定の実施形態では、該可変領域は、各々Ｆａｂ領域である。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、二重特異性抗体または三重特異性抗体である。特定の実施形態では、本明細書に提供するのは、２つの異なる抗原結合領域を含む二重特異性抗体であり、該結合領域のうちの一方はＶＩＳＴＡに特異的に結合し、他方の結合領域は、目的の別の抗原に結合し、該ＶＩＳＴＡに特異的に結合する結合領域は、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の可変重鎖領域を含む。特定の実施形態では、本明細書に提供するのは、２つの異なる抗原結合領域を含む二重特異性抗体であり、該結合領域のうちの一方はＶＩＳＴＡに特異的に結合し、他方の結合領域は、目的の別の抗原に結合し、該ＶＩＳＴＡに特異的に結合する結合領域は、表７に記載される抗体のＶＨ、及び任意選択でＶＬを含む。別の特定の実施形態では、本明細書に提供するのは、２つの異なる抗原結合領域を含む二重特異性抗体であり、該結合領域のうちの一方はＶＩＳＴＡに特異的に結合し、他方の結合領域は、目的の別の抗原に結合し、該ＶＩＳＴＡに特異的に結合する結合領域は、表７に記載される抗体のＶＨ、及び表８に記載される同じ抗体のＶＬを含む。１つの実施形態では、該ＶＩＳＴＡに特異的に結合する結合領域は、ｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の二重特異性抗体の他の結合領域が結合する目的の抗原は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞）に存在する抗原である。特定の実施形態では、本明細書に提供する抗体は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。多重特異性抗体のいくつかの異なる形式が記載されている。例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，ＭＡＢＳ ２０１７，９（２）：１８２－２１２を参照されたい。
同様に本明細書に提供するのは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体または抗原結合断片を含む融合タンパク質である。特定の実施形態では、融合タンパク質は、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体または抗原結合断片のＶＨ及びＶＬを含む。同様に本明細書に提供するのは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体または抗原結合断片を含むｓｃＦｖを含む融合タンパク質である。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、リンカー配列によって分離されたＶＨ及びＶＬを含み、該ＶＨは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＨ ＣＤＲ１は、表１～３からなる群から選択される表に列挙される抗体番号に対するＶＨ ＣＤＲ１として該表に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ２は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ２として該表に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ３は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ３として該表に記載される配列番号のものである。特定の実施形態では、該ｓｃＦｖは、リンカー配列によって分離されたＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ｉ）該ＶＨは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＨ ＣＤＲ１は、表１～３からなる群から選択される表に列挙される抗体番号に対するＶＨ ＣＤＲ１として該表に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ２は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ２として該表に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ３は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ３として該表に記載される配列番号のものであり、（ｉｉ）該ＶＬは、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ１として表４～６からなる群から選択される表に記載される配列番号のものであり、該ＶＬ ＣＤＲ２は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ２として該表に記載される配列番号のものであり、該ＶＬ ＣＤＲ３は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ３として該表に記載される配列番号のものであり、該ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ３、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３は、すべて同じＣＤＲ付番システムによって定義される。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＶＨ及びＶＬを含み、該ＶＨは、該抗体のＶＨとして表７に記載される配列番号を含む。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ｉ）該ＶＨは、該抗体のＶＨとして表７に記載される配列番号を含み、（ｉｉ）該ＶＬは、該抗体のＶＬとして表８に記載される配列番号を含む。
さらに本明細書に提供するのは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体または抗原結合断片を含むｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及び該ＣＡＲを発現する細胞を含めた該ＣＡＲをコードする核酸を含む細胞である。特定の実施形態では、該細胞は、該細胞がＣＡＲを発現するように、該ＣＡＲをコードする組み換え核酸を含む。特定の実施形態では、該細胞は、エキソビボである。
「第一世代」、「第二世代」及び「第三世代」のＣＡＲの構造は、当技術分野で記載されている（例えば、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２５７：１２７－１３３（２０１４）、Ｓｈａｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓ．Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ．８（４）：３３７－３５０（２０１５）、Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：５４２６－５４３５（２００７）、Ｇａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：９０８０－９０８８（２００５）、Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：７０－７５（２００２）、Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：２１４３－２１５０（２００４）、Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１（２）：２１５－２２３（２００９）、Ｈｏｌｌｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３２：１６９－１８０（２００９）参照）。
特定の実施形態では、該ＣＡＲは、Ｔ細胞受容体複合体鎖の細胞質／細胞内ドメインに融合された、膜貫通ドメインに融合された、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する細胞外抗原結合断片（例えば、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合するｓｃＦｖ）を含む「第一世代」のＣＡＲである。特定の実施形態では、該細胞質ドメインは、ＣＤ３ζ鎖の細胞内ドメインである。
特定の実施形態では、該ＣＡＲは、免疫細胞を活性化することができる細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ鎖の細胞内ドメイン）に融合された、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の効力及び持続性を高めるための共刺激ドメインに融合された、膜貫通ドメインに融合された、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗原結合断片（例えば、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合するｓｃＦｖ）を含む「第二世代」のＣＡＲである（Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．３：３８８－３９８（２０１３）参照）。該「第二世代」のＣＡＲの共刺激ドメインは、様々な共刺激分子のいずれかに由来する細胞内ドメイン、例えば、ＣＤ２８、４－ＩＢＢ、ＩＣＯＳ、またはＯＸ４０の共刺激ドメインであり得る。したがって、「第二世代」のＣＡＲは、共刺激（例えば、ＣＤ２８または４－ＩＢＢ細胞内ドメインによる）、及び活性化（例えば、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインによる）の両方をもたらす。
「第三世代」のＣＡＲは、複数（例えば、２つ）の共刺激ドメインを有することを除いて、第二世代のＣＡＲの構造を含む。したがって、第三世代のＣＡＲは、複数の共刺激を、例えば、ＣＤ２８と４－１ＢＢの両方の細胞内ドメインを含むことによってもたらし、活性化を、例えば、ＣＤ３ζ活性化ドメインを含むことによってもたらす。
特定の実施形態では、本発明のＣＡＲは、上記のように、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、該細胞外抗原結合ドメインは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体または抗原結合断片を含むｓｃＦｖである。特定の実施形態では、該細胞内ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインである。
特定の実施形態では、該ＣＡＲを含む細胞は、Ｔ細胞である。他の特定の実施形態では、該ＣＡＲを含む細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。他の特定の実施形態では、該ＣＡＲを含む細胞は、マクロファージである。ＣＡＲを発現し得る細胞の例は記載されている。例えば、Ｂａｓａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２０２０ ＡＳＨ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ ｐｐ．５７０－５７８、Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ ２０２０，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｖｏｌ．２０：３００、Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ ２０２０、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｏｌ．１７：５６１、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １７，２０２０）、Ｃｏｒｔｅｚ－Ｓｅｌｖａ ｅｔ ａｌ．，２０２１，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ４２（１）：４５－５９、Ｋｌｉｃｈｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３８：９４７－９５９、Ｖａｃｃａ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３０１３ ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１９．０３０１３、及びＸｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０２０，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ ５９：１０２９７５を参照されたい。
同様に本明細書に提供するのは、治療薬に結合した（例えば、共有結合した）本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくは抗原結合断片またはｓｃＦｖを含む抗体－薬物複合体である。特定の実施形態では、該治療薬は、細胞毒性薬である。特定の実施形態では、本明細書に提供するのは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体または抗原結合断片を含む融合タンパク質を含む抗体－薬物複合体である。
別の特定の実施形態では、提供するのは、標識または造影剤に結合した、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくは抗原結合断片またはｓｃＦｖを含む抗体－薬物複合体であり、インビボもしくはエキソビボでの（例えば、患者の生検腫瘍サンプルにおける）ＶＩＳＴＡのレベルの検出及び／または測定及び／または位置の特定において、エキソビボ細胞サンプル（例えば、生検腫瘍サンプル）を接触させること、または該抗体を該患者に投与することにより、該ラベルまたは造影剤を介して結合を検出することに使用される。特定の実施形態では、かかる方法は、患者のがんがＶＩＳＴＡ陽性であることまたはＶＩＳＴＡを所望のレベルで発現することを特定することによって、該患者が、本発明の抗ＶＩＳＴＡ抗体及び抗原結合断片ならびに抗体－薬物複合体（治療薬に結合した）によるがん治療の適応であるかどうかを判断するために使用される。
１．１抗体
本開示において特定の抗体を同定するために使用される抗体番号の各々（それぞれの「抗体［またはＡｂ］番号」）について、抗体番号のピリオドの後の数字は、当該抗体のＩｇＧクラスを示す。したがって、例えば、抗体番号１７３．１は、ＩｇＧ１抗体であるのに対し、抗体番号１７３．４は、ＩｇＧ４抗体である。
本開示において特定の抗体を同定するために使用される抗体番号の各々（それぞれの「抗体［またはＡｂ］番号」）について、抗体番号のピリオドの後の数字は、当該抗体のＩｇＧクラスを示す。したがって、例えば、抗体番号１７３．１は、ＩｇＧ１抗体であるのに対し、抗体番号１７３．４は、ＩｇＧ４抗体である。
配列及びバリアント
下記の表１～表６に提供するのは、異なる付番システム（Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ及びＰａｒａｔｏｍｅ）を使用して定義されるＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のＶＨ ＣＤＲ及びＶＬ ＣＤＲである。下記の表１～表３は、異なるシステムを使用して定義されたＶＨ ＣＤＲを提供し、これらは、表４～表６のＶＬ ＣＤＲと組み合わせてもよい。特定の実施形態では、表１の１つの抗体（例えば、抗体番号２６９．１）のＶＨ ＣＤＲは、表４の同じ抗体（例えば、２６９．１）のＶＬ ＣＤＲと組み合わされる。特定の実施形態では、表２の１つの抗体（例えば、抗体番号２６９．１）のＶＨ ＣＤＲは、表５の同じ抗体（例えば、抗体番号２６９．１）のＶＬ ＣＤＲと組み合わされる。特定の実施形態では、表３の１つの抗体（例えば、抗体番号２６９．１）のＶＨ ＣＤＲは、表６の同じ抗体（例えば、抗体番号２６９．１）のＶＬ ＣＤＲと組み合わされる。
下記の表１～表６に提供するのは、異なる付番システム（Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ及びＰａｒａｔｏｍｅ）を使用して定義されるＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のＶＨ ＣＤＲ及びＶＬ ＣＤＲである。下記の表１～表３は、異なるシステムを使用して定義されたＶＨ ＣＤＲを提供し、これらは、表４～表６のＶＬ ＣＤＲと組み合わせてもよい。特定の実施形態では、表１の１つの抗体（例えば、抗体番号２６９．１）のＶＨ ＣＤＲは、表４の同じ抗体（例えば、２６９．１）のＶＬ ＣＤＲと組み合わされる。特定の実施形態では、表２の１つの抗体（例えば、抗体番号２６９．１）のＶＨ ＣＤＲは、表５の同じ抗体（例えば、抗体番号２６９．１）のＶＬ ＣＤＲと組み合わされる。特定の実施形態では、表３の１つの抗体（例えば、抗体番号２６９．１）のＶＨ ＣＤＲは、表６の同じ抗体（例えば、抗体番号２６９．１）のＶＬ ＣＤＲと組み合わされる。
特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＶＨ及びＶＬを含み、該ＶＨは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＨ ＣＤＲ１は、表１に列挙される抗体番号に対するＶＨ ＣＤＲ１として表１に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ２は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ２として表１に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ３は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ３として表１に記載される配列番号のものである。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ｉ）該ＶＨは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＨ ＣＤＲ１は、表１に列挙される抗体番号に対するＶＨ ＣＤＲ１として表１に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ２は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ２として表１に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ３は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ３として表１に記載される配列番号のものであり、（ｉｉ）該ＶＬは、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ１として表４に記載される配列番号のものであり、該ＶＬ ＣＤＲ２は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ２として表４に記載される配列番号のものであり、該ＶＬ ＣＤＲ３は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ３として表４に記載される配列番号のものである。
特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＶＨ及びＶＬを含み、該ＶＨは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＨ ＣＤＲ１は、表２に列挙される抗体番号に対するＶＨ ＣＤＲ１として表２に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ２は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ２として表２に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ３は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ３として表２に記載される配列番号のものである。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ｉ）該ＶＨは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＨ ＣＤＲ１は、表２に列挙される抗体番号に対するＶＨ ＣＤＲ１として表２に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ２は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ２として表２に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ３は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ３として表２に記載される配列番号のものであり、（ｉｉ）該ＶＬは、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ１として表５に記載される配列番号のものであり、該ＶＬ ＣＤＲ２は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ２として表５に記載される配列番号のものであり、該ＶＬ ＣＤＲ３は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ３として表５に記載される配列番号のものである。
特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ｉ）該ＶＨは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＨ ＣＤＲ１は、表３に列挙される抗体番号に対するＶＨ ＣＤＲ１として表３に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ２は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ２として表３に記載される配列番号のものであり、該ＶＨ ＣＤＲ３は、該抗体のＶＨ ＣＤＲ３として表３に記載される配列番号のものであり、（ｉｉ）該ＶＬは、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬ ＣＤＲ１は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ１として表６に記載される配列番号のものであり、該ＶＬ ＣＤＲ２は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ２として表６に記載される配列番号のものであり、該ＶＬ ＣＤＲ３は、該抗体のＶＬ ＣＤＲ３として表６に記載される配列番号のものである。
同様に本明細書に提供するのは、ＶＨ及びＶＬを含む、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体または抗原結合断片であり、該ＶＨは、ある抗体のＶＨとして表７に記載される配列番号のいずれか１つのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、該ＶＨ ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される。特定の実施形態では、該ＶＨ ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ付番システムによって定義される。特定の実施形態では、該ＶＨ ＣＤＲは、ＡｂＭ付番システムによって定義される。特定の実施形態では、該ＶＨ ＣＤＲは、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される。特定の実施形態では、該ＶＨ ＣＤＲは、Ｐａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される。特定の実施形態では、該ＶＨ ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔ付番システムによって定義される。
特定の実施形態では、ＶＨ及びＶＬを含む、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体または抗原結合断片であり、該ＶＨは、ある抗体のＶＨとして表７に記載される配列番号のいずれか１つのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含み、該ＶＬは、該抗体のＶＬとして表８に記載される配列番号のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、該ＶＨ ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される。特定の実施形態では、該ＶＨ ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ付番システムによって定義される。特定の実施形態では、該ＶＨ ＣＤＲは、ＡｂＭ付番システムによって定義される。特定の実施形態では、該ＶＨ ＣＤＲは、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される。特定の実施形態では、該ＶＨ ＣＤＲは、Ｐａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される。特定の実施形態では、該ＶＨ ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔ付番システムによって定義される。
ＶＩＳＴＡに特異的に結合する、本明細書に提供する抗体または抗原結合断片のＣＤＲは、例えば、１つ以上の該ＣＤＲに１つ以上の変異を導入することによって修飾され得る。かかる変異は、例えば、ある特定のｐＨ値での該抗体またはその抗原結合断片の結合親和性を変化させ、ひいては該抗体の生物学的半減期に影響を与える可能性がある。したがって、内在化後にエンドソーム内でＶＩＳＴＡに対する結合親和性が低下する抗体を再設計することにより、抗体の枯渇が減少し、半減期が延長し得る。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、酸性ｐＨよりも中性ｐＨで高い親和性でＶＩＳＴＡに結合する（すなわち、酸性ｐＨでは結合親和性が低下する）。酸性ｐＨで結合親和性が低下する抗ＶＩＳＴＡ抗体は、酸性ｐＨで結合親和性の低下を示さない抗体と比較して、様々な改善／強化された生物学的特性を有し得る。例えば、特定の実施形態では、酸性ｐＨで結合親和性が低下する本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、酸性ｐＨで結合親和性の低下を示さない抗ＶＩＳＴＡ抗体と比較して、循環中でより長い半減期を有し得る。特定の実施形態では、酸性ｐＨで結合親和性が低下する本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ｐＨ依存性の結合を欠く抗ＶＩＳＴＡ抗体よりもゆっくりと循環から除去され得る。より遅い抗体クリアランス（すなわち、より長い循環中の半減期）は、生物学的活性の延長と相関するはずである。したがって、特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、酸性ｐＨでの結合親和性の低下を有さない抗体よりも低頻度で、及び／または低用量で対象に投与され得るとともに、それでもなおそれと同等の（またはより良好な）有効性を示す。
理論にも機構にも拘束されることを望むものではないが、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで結合親和性が低い抗ＶＩＳＴＡ抗体は、エンドソームの酸性環境で抗原から解離し、血漿にリサイクルされ、そこでさらなる治療用抗原結合を受ける。抗原結合領域におけるヒスチジンスイッチの導入と合わせて、抗体のＦｃ領域における新生児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合の修飾（例えば、修飾、例えば、下記のもの）により、細胞表面ではＶＩＳＴＡに高親和性で結合し、酸性エンドソーム環境への輸送後にＶＩＳＴＡから解離し、該ＦｃＲｎ受容体によって細胞外空間に捕捉及びリサイクルされる抗体が得られる。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖ＣＤＲまたは重鎖ＣＤＲに生じる任意のＹ、Ｄ、Ｅ、ＮまたはＱアミノ酸に１つ以上のヒスチジン置換を含む。特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖ＣＤＲまたは重鎖ＣＤＲに生じるＹ、Ｄ、Ｅ、ＮまたはＱアミノ酸に１つのヒスチジン置換を含む。特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、表１、表２、または表３に記載される抗体番号４７４．１のＶＨ ＣＤＲ、及びＶＬ ＣＤＲにおける１つ以上のヒスチジン置換を除いて表４、表５、または表６に記載される抗体番号４７４．１のＶＬ ＣＤＲを含み、該置換は、各々Ｋａｂａｔ付番システムに従って付番されるＹ３１Ｈ（例えば、抗体番号３７３．１に存在する）、Ｙ３２Ｈ（例えば、抗体番号４６７．１に存在する）、Ｄ５０Ｈ（例えば、抗体番号９０８．１に存在する）、Ｎ５３Ｈ（例えば、抗体番号３８６．１に存在する）、Ｑ８９Ｈ（例えば、抗体番号２６８．１に存在する）、Ｑ９０Ｈ（例えば、抗体番号３４２．１に存在する）、及びＮ９３Ｈ（例えば、抗体番号２５９．１に存在する）から選択され得る。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、表１、表２、または表３に記載される抗体番号４７４．１のＶＨ ＣＤＲ、及びＶＨ ＣＤＲにおける１つ以上のヒスチジン置換を除いて表４、表５、または表６に記載される抗体番号４７４．１のＶＬ ＣＤＲを含み、該置換は、各々Ｋａｂａｔ付番システムに従うＹ３２Ｈ（例えば、抗体番号３３８．１に存在する）、Ｙ３３Ｈ（例えば、抗体番号４１９．１に存在する）、Ｙ５０Ｈ（例えば、抗体番号２７７．１に存在する）、Ｙ５２Ｈ（例えば、抗体番号９４６．１に存在する）、Ｙ５３Ｈ（例えば、抗体番号３２２．１に存在する）、Ｎ５８Ｈ（例えば、抗体番号３４６．１に存在する）、Ｙ５９Ｈ（例えば、抗体番号３０４．１に存在する）、Ｎ６０Ｈ（例えば、抗体番号８１４．１に存在する）、Ｄ９５Ｈ（例えば、抗体番号２１０．１に存在する）及びＤ１０１Ｈ（例えば、抗体番号４６０．１に存在する）から選択され得る。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、表１、表２、または表３に記載される抗体番号１７３．１のＶＨ ＣＤＲ、及びＶＬ ＣＤＲにおける１つ以上のヒスチジン置換を除いて表４、表５、または表６に記載される抗体番号１７３．１のＶＬ ＣＤＲを含み、該置換は、各々Ｋａｂａｔ付番システムに従うＤ４７Ｈ（例えば、抗体番号３７４．１に存在する）、Ｄ６９Ｈ（例えば、抗体番号３９４．１に存在する）、Ｄ１１１Ｈ（例えば、抗体番号２１３．１に存在する）、及びＥ７４Ｈ（例えば、抗体番号２１９．１に存在する）から選択され得る。
ある特定の態様では、本明細書に記載の抗体は、そのＶＨドメイン単独、またはそのＶＬドメイン単独、またはＶＨもしくはＶＬの３つのＣＤＲのセットを特定することによって記載され得る。例えば、特定のＶＨドメイン（またはＶＬドメイン）を使用することによって特定の抗原に結合する抗体を産生する方法、及びその相補的可変ドメインのライブラリをスクリーニングする方法を記載している、参照により全体として本明細書に組み込まれるＣｌａｃｋｓｏｎ Ｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８を参照されたい。特定のＶＨドメインを使用することによって特定の抗原に結合する抗体を産生する方法、及び相補的ＶＬドメインのライブラリ（例えば、ヒトＶＬライブラリ）をスクリーニングする方法を記載している、参照により全体として本明細書に組み込まれるＫｉｍ ＳＪ ＆ Ｈｏｎｇ ＨＪ，（２００７）Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４５：５７２－５７７も参照のこと。選択されたＶＬドメインは、次にさらなる相補的（例えば、ヒト）ＶＨドメインの選択をガイドするために使用され得る。
特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＶＨを含み、該ＶＨは、該抗体のＶＨとして表７に記載される配列番号を含む。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＶＬを含み、該ＶＬは、該抗体のＶＬとして表８に記載される配列番号を含む。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＶＨを含み、該ＶＨは、該抗体のＶＨとして表７に記載される配列番号を含むＶＨ、及びＶＬを含む。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ｉ）該ＶＨは、該抗体のＶＨとして表７に記載される配列番号を含み、（ｉｉ）該ＶＬは、該抗体のＶＬとして表８に記載される配列番号を含む。
ある特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＶＨ及びＶＬを含み、該ＶＨは、表７に記載されるＶＨのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＶＨ及びＶＬを含み、該ＶＨは、表７に記載されるＶＨのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＶＨ及びＶＬを含み、該ＶＬは、表８に記載されるＶＬのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、表８に記載されるＶＬのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ｉ）該ＶＬは、表７に記載される抗体のＶＨのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し、（ｉｉ）該ＶＬは、表８に記載される該抗体のＶＬのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＶＨ及びＶＬを含み、該ＶＨは、表７に記載される抗体のＶＨのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、（ｉｉ）該ＶＬは、表８に記載される該抗体のＶＬに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、重鎖及び軽鎖を含み、該軽鎖は、表９に列挙される抗体番号の軽鎖として表９に記載される配列番号のものであり、該重鎖は、該抗体（例えば、抗体番号２６９．１、抗体番号３２１．１、抗体番号２４５．１、抗体番号４６５．１、抗体番号４５７．１、抗体番号１７３．１、抗体番号８３３．１、抗体番号２４５．４、抗体番号４６５．４、抗体番号１７３．４、抗体番号２４５．２、抗体番号２８９．１または抗体番号４２０．１）の重鎖として表９に記載される配列番号のものである。
特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、重鎖及び軽鎖を含み、該重鎖は、表９に列挙される抗体番号の重鎖として表９に記載される配列番号に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、重鎖及び軽鎖を含み、該軽鎖は、表９に列挙される抗体番号の軽鎖として表９に記載される配列番号に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し、該重鎖は、該抗体の重鎖として表９に記載される配列番号に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、重鎖及び軽鎖を含み、該重鎖は、表９に列挙される抗体番号の重鎖として表９に記載される配列番号に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、重鎖及び軽鎖を含み、該軽鎖は、表９に列挙される抗体番号の軽鎖として表９に記載される配列番号に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、該重鎖は、該抗体の重鎖として表９に記載される配列番号に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
２つの配列（例えば、アミノ酸配列または核酸配列）間の同一性パーセントの特定は、当技術分野で既知の数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの許容の有無にかかわらず特定され得る。同一性パーセントの計算では、通常、完全一致のみがカウントされる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定的な具体例は、Ｋａｒｌｉｎ Ｓ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ（１９９０）ＰＮＡＳ ８７：２２６４－２２６８の、Ｋａｒｌｉｎ Ｓ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ（１９９３）ＰＮＡＳ ９０：５８７３－５８７７で修正されたアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴのヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムで実行することができ、タンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラムで実行することができる。比較目的のためのギャップアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ及び／またはＰＳＩ ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：３３８９ ３４０２に記載の通りに利用することができる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを使用することができる（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のインターネット、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。
特定の態様では、本明細書に提供するのは、抗体重鎖及び／または軽鎖、例えば、重鎖単独、軽鎖単独、または重鎖と軽鎖の両方を含む、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。軽鎖に関しては、特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の軽鎖は、カッパ軽鎖である。別の特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の軽鎖は、ラムダ軽鎖である。さらに別の特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖またはヒトラムダ軽鎖である。
本明細書で使用される、「定常領域」または「定常ドメイン」という用語は同義であり、当技術分野において共通の意味を有する。該定常領域は、抗体部分、例えば、軽鎖及び／または重鎖のカルボキシル末端部分であり、抗原に対する抗体の結合には直接関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば、重鎖の場合のＦｃ受容体との相互作用等を示すことができる。免疫グロブリン分子の定常領域は、免疫グロブリン可変ドメインと比較して、より保存されたアミノ酸配列を有する。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖を含み、該軽鎖は、ＶＬ及びヒトカッパまたはヒトラムダ軽鎖定常領域を含み、該ＶＬは、表８に記載される配列を含む。ヒト定常領域配列の非限定的な例は、当技術分野で記載されており、例えば、Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）を参照されたい。
重鎖に関しては、特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖は、ヒトアルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）またはミュー（μ）重鎖であり得る。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、重鎖を含み、該重鎖は、本明細書に記載のまたは当技術分野で既知の定常領域またはその部分（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２もしくはＣＨ３またはそれらの組み合わせ）、及び可変重鎖領域（ＶＨ）を含み、該ＶＨは、表７に記載される配列を含む。特定の実施形態では、該定常領域は、ヒトガンマ重鎖のものである。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に記載の任意のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、該定常領域は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＷまたはＩｇＹ免疫グロブリン分子の定常領域のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体または抗原結合断片は、ＩｇＧ定常領域、例えば、表１０に記載のＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４定常領域を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、または任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ）のヒトＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ ＩｇＷ、またはＩｇＹ免疫グロブリン分子の定常領域を含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、重鎖及び／または軽鎖を含み、該重鎖は、（ａ）表７に記載される抗体のＶＨ及び（ｂ）ヒトＩｇＧの定常ドメインのアミノ酸配列を含む定常重鎖ドメインを含む。
別の特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、重鎖及び軽鎖を含み、ここで、（ｉ）該重鎖は、（ａ）表７に記載される抗体のＶＨ及び（ｂ）ヒトＩｇＧの定常ドメインのアミノ酸配列を含む定常重鎖ドメインを含み、（ｉｉ）該軽鎖は、表８に記載される同じ抗体のＶＬ、及び（ｂ）ヒトカッパ軽鎖の定常ドメインのアミノ酸配列を含む定常軽鎖ドメインを含む。
Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、Ｆｃ領域を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含む。特定の実施形態では、該Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域である。さらなる特定の実施形態では、該ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４のものである。さらに特定の実施形態では、該Ｆｃ領域は、天然のヒトＦｃ領域と比較して、Ｆｃ領域内に１つ以上の変異（例えば、１、２、３、４または５個のアミノ酸変異）を含むバリアントヒトＦｃ領域である。特定の実施形態では、該１つ以上の変異は、挿入、置換、及び／または欠失である。
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、Ｆｃ領域を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含む。特定の実施形態では、該Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域である。さらなる特定の実施形態では、該ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４のものである。さらに特定の実施形態では、該Ｆｃ領域は、天然のヒトＦｃ領域と比較して、Ｆｃ領域内に１つ以上の変異（例えば、１、２、３、４または５個のアミノ酸変異）を含むバリアントヒトＦｃ領域である。特定の実施形態では、該１つ以上の変異は、挿入、置換、及び／または欠失である。
特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、その定常領域に、野生型定常領域と比較して、本開示で特定される特定のアミノ酸変異のうちの１つのみまたは特定のアミノ酸変異の組み合わせを有し、野生型定常領域と比較して、他のアミノ酸変異を含まない。別の特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、その定常領域に、野生型定常領域と比較して、本開示で特定される特定のアミノ酸変異または特定のアミノ酸変異の組み合わせを含み、野生型定常領域と比較して、合計で７個以下（すなわち、１、２、３、４、５、６、または７個）のアミノ酸変異を有する。
したがって、該Ｆｃ領域が天然のヒトＦｃ領域と比較してＦｃ領域に１、２、３、４、または５個のアミノ酸変異を含む特定の実施形態では、該変異は、独立して、１つのアミノ酸の欠失、１つのアミノ酸の置換、または１つのアミノ酸の挿入からなる群から選択され、特定の実施形態では、本明細書に記載の変異のいずれかであり得る。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプ／クラスの重鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプ／クラスのヒトＦｃ領域を含む。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する本明細書に提供する抗体または抗原結合断片の定常領域は、天然の定常領域と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸変異を含む。本発明の抗ＶＩＳＴＡ抗体及び抗原結合断片の特定の実施形態では、該抗体は、Ｆｃ領域または該Ｆｃ領域のバリアントを含み、任意選択で、該Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域、または天然のヒトＦｃ領域と比較して、該Ｆｃ領域に１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸変異を有する該ヒトＦｃ領域のバリアントであり、及び／または任意選択で、該ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４のものであり、さらに、任意選択で、該抗体は、ヒトＩｇＧ１もしくはヒトＩｇＧ４の定常領域、または天然の定常領域と比較して、該定常領域に１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸変異を有する該定常領域のバリアントを含む。
ある特定の実施形態では、１、２またはそれを超える変異（例えば、アミノ酸置換）が、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のＦｃ領域に導入され、該抗体の１つ以上の機能特性が変更される。
特定の実施形態では、１、２またはそれを超える変異（例えば、アミノ酸置換）は、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のＦｃ領域及び／またはヒンジ領域に導入される。ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のＦｃ領域における変異は、Ｆｃ受容体及び／または補体受容体に対する該抗体の親和性を修正し得る。かかる変異を該Ｆｃ受容体またはその断片に導入する技術は当業者に既知である。Ｆｃ受容体に対する該抗体またはその抗原結合断片の親和性を変更するためになされ得るＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のＦｃ受容体における変異の例は、例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ １０９：６１８１－６１８６、米国特許第６，７３７，０５６号、及び国際公開第ＷＯ０２／０６０９１９号、同第ＷＯ９８／２３２８９号、及び同第ＷＯ９７／３４６３１号に記載されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供する抗体は、表１０に記載される定常領域を含む。理論に拘束されることを望むものではないが、該抗体の定常領域は、該重鎖の配列変異に寄与する。該重鎖の可変領域は、該重鎖の定常領域と再結合して全長重鎖を生成する（Ｄｒｅｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．，ａｎｄ Ｊ．Ｃ．Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ５４（１９６５）８６４－８６９）。該抗体は、アルファ、ミュー、ガンマ、イプシロン、またはデルタ定常領域の遺伝子セグメントが該可変領域と組み換えられるかどうかに応じてアイソタイプが異なり得る（Ｋａｔａｏｋａ，Ｔ．，ｅｔ．Ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７（１９８０）９１９－９２３）。ヒトガンマ遺伝子セグメントの中には、ガンマ１、２、３、及び４と呼ばれる４つの異なるサブクラスがあり、それらは互いに約９０％同一である。これらの異なるアイソタイプまたはサブクラスのいずれかを本明細書に記載の抗体の可変領域に結合させて全長重鎖を生成してもよく、これがその後相補的な軽鎖とペアにされ、本発明の抗体が生成され得る。
本明細書に提供する抗体の抗体工学の場合、該抗体のＦｃ及びヒンジ領域の配列の変更及び／または翻訳後修飾により、所与の抗体または抗体様タンパク質のエフェクター機能及び循環を操作することが可能となる（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０（２００８）４６０－４７０）。配列変異に加えて、該Ｆｃ領域はまた、Ｆｃの構造及び機能にとって重要である残基２９７（ＥＵ付番システム）にＮ結合型グリコシル化部位も含み（Ｄｗｅｋ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｎａｔ．１８７（１９９５）２７９－２９２）、これを、例えば、アラニンまたはグリシンまたはグルタミン酸に変異させ、該グリコシル化部位を破壊して該抗体の特性に影響を与えることができる。
Ｎ２９７に存在するグリカンは、通常、２つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、３つのマンノース、及び該マンノースに結合して二分岐複合グリカンを形成するさらに２つのＧｌｃＮＡｃからなる（Ｌｉｕ，Ｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１０４（２０１５）１８６６－８４）。これら２つのＧｌｃＮＡｃは、マンノースのα－３またはα－６へのβ１，２結合のいずれかを介してマンノースに結合する。したがって、グリカンの各アームは、マンノースとＧｌｃＮＡｃ２がどのように結合しているかに応じて、α１，３またはα１，６アームとして区別され得る（Ｌｉｕ，Ｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１０４（２０１５）１８６６－８４）。追加のフコース、ガラクトース、シアル酸、及びＧｌｃＮＡｃをコアグリカン構造に追加することができ、該グリカン組成は、ＦｃγＲ結合に直接影響する。
例えば、ＩｇＧ発現時にβ（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩを発現させると、Ｎ２９７でグリコシル化された抗体が得られ、これは、二分岐グリカンを有し、より高いＡＤＣＣ活性を有する（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ｅｔ．Ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７（１９９９）１７６－１８０）。フコース含量が減少した抗体は、Ｆｃ受容体、例えば、ＦｃγＲＩＩＩａ等に対する親和性が増加すると報告されている。フコースが欠損した抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合が５０倍高く、ＡＤＣＣ活性が増強されることが分かっている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ．Ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２００２）２６７３３－２６７４０）。Ｎ２９７のガラクトシル化により、Ｃ１ｑ結合及びＣＤＣ活性が高まる（Ｄｅｋｋｅｒｓ，Ｇ．，ｅｔ．Ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８（２０１７）８７７）。これらのＮ２９７グリコシル化の操作のいずれかが、本発明の抗体に対して行われ得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び／またはＣＤＣを媒介する。抗体のＦｃ領域における変異により、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）が高まり得る（Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｋ．Ｏ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（２０１９）１－２０）。
ある特定の変異の組み合わせは、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩａ及び／またはＦｃγＲＩａに対する親和性を増加させ、ＡＤＣＣ及び／またはＡＤＣＰを高め、本明細書に提供する抗ＶＩＳＴＡ抗体及び抗原結合断片に存在し得る。本明細書に提供する抗ＶＩＳＴＡ抗体及び抗原結合断片に存在し得るＦｃγＲＩＩＩａ及び／またはＦｃγＲＩＩａに対する親和性を増加させ、ＡＤＣＣ及び／またはＡＤＣＰを高める変異の組み合わせの例としては、（１）Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ及びＫ３３４Ａの組み合わせ、（２）Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅの組み合わせ、（３）Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅの組み合わせ、（４）Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅの組み合わせ、（５）Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、及びＧ２３６Ａの組み合わせ、ならびに（６）Ｌ２３４Ｙ、Ｇ２３６Ｗ及びＳ２９８Ａの組み合わせのいずれかが挙げられ、これらの残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されている。「ＥＵインデックス」（すなわち、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（Ｕ．Ｓ．）Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｉｒｅｃｔｏｒ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（５ｔｈ ｅｄ．，ＤＩＡＮＥ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ：Ｃｏｌｌｉｎｇｄａｌｅ，ＰＡ１９９１に報告されているＥＵインデックス）とも呼ばれる「ＥＵ付番システム」は、免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基を指す場合に一般に使用される。
ある特定の変異または変異の組み合わせは、Ｃ１ｑ結合及びＣＤＣを増加させ、本明細書に提供する抗ＶＩＳＴＡ抗体及び抗原結合断片に存在し得る。本明細書に提供する抗ＶＩＳＴＡ抗体及び抗原結合断片に存在し得るＣ１ｑ結合及びＣＤＣを増加させる変異または変異の組み合わせの例としては、（１）Ｋ３２６Ａ及びＥ３３３Ａの組み合わせ、（２）Ｋ３２６Ｍ及びＥ３３３Ｓの組み合わせ、（３）Ｃ２２１Ｄ及びＤ２２２Ｃの組み合わせ、（４）Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ及びＳ３２４Ｔの組み合わせ、（５）Ｈ２６８Ｆ及びＳ３２４Ｔの組み合わせ、ならびに（６）Ｅ３４５Ｒのいずれかが挙げられ、これらの残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されている。
インビボでのＩｇＧ異化は、ＩｇＧと新生児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用によって調節される（Ｓｏｃｋｏｌｏｓｋｙ Ｊ．Ｔ．，ｅｔ．Ａｌ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．９１（２０１５）１０９－１２４）。ＩｇＧは、細胞によって取り込まれ、そこでリソソームに運ばれる場合もあれば、細胞表面にリサイクルされる場合もある（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ，Ｄ．Ｃ．，ａｎｄ Ａｋｉｌｅｓｈ，Ｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（２００７）７１５－７２５）。エンドソーム内の低ｐＨ（ｐＨ＜６．５）でＩｇＧがＦｃＲｎに結合すると、該抗体がＦｃＲｎとともに輸送されて細胞表面に戻ることが可能になる。ｐＨ＜６．５では、ＦｃＲｎへの結合が不十分なため、該抗体がリソソームに輸送されて分解される。細胞外環境の生理学的ｐＨでは、ＩｇＧは、ＦｃＲｎに対して弱い親和性を有し、その結果該ＦｃＲｎから放出されて循環に戻る。したがって、本明細書に提供する抗ＶＩＳＴＡ抗体及び抗原結合断片に存在し得る変異は、ＦｃＲｎ結合をｐＨ＜６．５で高め、ひいては抗体のリサイクルを増加させ、ＰＫを改善し得る。
本明細書に提供する抗ＶＩＳＴＡ抗体及び抗原結合断片に存在し得るＦｃＲｎ結合を増加させ、ひいては抗体の半減期を延長する変異及び変異の組み合わせの例としては、（１）Ｒ４３５Ｈ、（２）Ｎ４３４Ａ、（３）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅの組み合わせ、（４）Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓの組み合わせ、（５）Ｅ２９４欠失、Ｔ３０７Ｐ及びＮ４３４Ｙの組み合わせ、（６）Ｔ２５６Ｎ、Ａ３７８Ｖ、Ｓ３８３Ｎ及びＮ４３４Ｙの組み合わせ、ならびに（７）Ｅ２９４欠失のいずれかが挙げられ、これらの残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されている。
Ｆｃ受容体結合、補体受容体結合、または抗体エフェクター機能を低下させる変異も望ましい場合があり、本明細書に提供する抗ＶＩＳＴＡ抗体及び抗原結合断片に存在する場合がある。かかる変異は、抗体または抗原結合断片によって媒介される炎症及び細胞死を減少させ得る。本明細書に提供する抗ＶＩＳＴＡ抗体及び抗原結合断片に存在し得るＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及び／またはＣ１ｑに対する結合を減少させ、それによってＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／またはＣＤＣを低下させる変異及び変異の組み合わせの例としては、（１）Ｌ２３５Ｅ、（２）Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの組み合わせ、（３）Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅの組み合わせ（この組み合わせは、ＳＰＬＥ変異と呼ばれ、Ｓ２２８Ｐの変異は、ＩｇＧ４へのクラススイッチを回避する。Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ（２０１６）２９：４５７－４６６参照）、（４）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇの組み合わせ、（５）Ｐ３３１Ｓ、Ｌ２３４Ｅ及びＬ２３５Ｆの組み合わせ、（６）Ｄ２６５Ａ、（７）Ｇ２３７Ａ、（８）Ｅ３１８Ａ、（９）Ｅ２３３Ｐ、（１０）Ｇ２３６Ｒ及びＬ３２８Ｒの組み合わせ、（１１）Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓの組み合わせ、（１２）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓの組み合わせ、（１３）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓのうちの任意の１、２、３、４、５、または６個、（１４）Ａ３３０Ｌ、（１５）Ｄ２７０Ａ、（１６）Ｋ３２２Ａ、（１７）Ｐ３２９Ａ、（１８）Ｐ３３１Ａ、（１９）Ｖ２６４Ａ、（２０）Ｆ２４１Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｅ、ならびに（２１）Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの組み合わせのうちのいずれかが挙げられ、これらの残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されている。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ヒトＦｃ領域のバリアントを含み、該ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１のものであり、該Ｆｃ領域は、天然のヒトＦｃ領域と比較して、１つ以上のアミノ酸変異、例えば、１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸変異を該Ｆｃ領域に有し、これは、Ｃ２２０Ｄ、Ｄ２２１Ｃ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ｆ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３６Ｗ、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４１Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５６Ｎ、Ｖ２６４Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｈ２６８Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｅ２９４欠失、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｅ、Ｓ２９８Ａ、Ｔ３０７Ｐ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｍ、Ｌ３２８Ｒ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ａ、Ｐ３３１Ｓ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３７８Ｖ、Ｓ３８３Ｎ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、及びＮ４３４Ｙからなる群から選択され、これらの残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されている。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ヒトＦｃ領域のバリアントを含み、該ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ２のものであり、該Ｆｃ領域は、天然のヒトＦｃ領域と比較して、１つ以上のアミノ酸変異、例えば、１、２、３、４、５、６または７個のアミノ酸変異を該Ｆｃ領域に有し、これは、Ｃ２２０Ｄ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４１Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５６Ｎ、Ｖ２６４Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｈ２６８Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｅ２９４欠失、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｅ、Ｓ２９８Ａ、Ｔ３０７Ｐ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｍ、Ｌ３２８Ｒ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ａ、Ｐ３３１Ｓ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ｓ３８３Ｎ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、及びＮ４３４Ｙからなる群から選択され、これらの残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されている。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ヒトＦｃ領域のバリアントを含み、該ヒトＦｃ領域はヒトＩｇＧ４のものであり、該Ｆｃ領域は、天然のヒトＦｃ領域と比較して、１つ以上のアミノ酸変異、例えば、１、２、３、４、５、６または７個のアミノ酸変異を該Ｆｃ領域に有し、これは、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ｆ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３６Ｗ、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４１Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５６Ｎ、Ｖ２６４Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｈ２６８Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｅ２９４欠失、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｅ、Ｓ２９８Ａ、Ｔ３０７Ｐ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｍ、Ｌ３２８Ｒ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３７８Ｖ、Ｓ３８３Ｎ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、及びＮ４３４Ｙからなる群から選択され、これらの残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されている。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ヒトＦｃ領域のバリアントを含み、該ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１のものであり、該Ｆｃ領域は、天然のヒトＦｃ領域と比較して１つ以上のアミノ酸変異を有し、該変異は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、ならびに任意選択でＰ３２９Ｇであり、これらの残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されている。特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ヒトＦｃ領域のバリアントを含み、該ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１のものであり、該Ｆｃ領域は、天然のヒトＦｃ領域と比較して１つ以上のアミノ酸変異を有し、該変異は、Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、ならびに任意選択でＰ３２９Ｇであり、これらの残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されている。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ヒトＦｃ領域のバリアントを含み、該ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４のものであり、該Ｆｃ領域は、天然のヒトＦｃ領域と比較して１つ以上のアミノ酸変異を有し、該変異は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅであり、これらの残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されている。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ヒトＦｃ領域のバリアントを含み、該ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４のものであり、該Ｆｃ領域は、天然のヒトＦｃ領域と比較して１つ以上のアミノ酸変異を有し、該変異は、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓであり、これらの残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されている。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ヒトＦｃ領域のバリアントを含み、該ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４のものであり、該Ｆｃ領域は、天然のヒトＦｃ領域と比較して１つ以上のアミノ酸変異を有し、該変異は、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅであり、これらの残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されている。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ヒトＦｃ領域のバリアントを含み、該ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４のものであり、該Ｆｃ領域は、天然のヒトＦｃ領域と比較して１つ以上のアミノ酸変異を有し、該変異は、Ｓ２２８Ｐ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅであり、これらの残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されている。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ヒトＦｃ領域のバリアントを含み、該ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４のものであり、該Ｆｃ領域は、天然のヒトＦｃ領域と比較して１つ以上のアミノ酸変異を有し、該変異は、Ｓ２２８Ｐ、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓであり、これらの残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されている。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ヒトＦｃ領域のバリアントを含み、該ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１のものであり、該Ｆｃ領域は、天然のヒトＦｃ領域と比較して１～１０個に及ぶアミノ酸変異を有し、該変異は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、ならびに任意選択でＰ３２９Ｇを含み、これらの残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されている。特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ヒトＦｃ領域のバリアントを含み、該ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１のものであり、該Ｆｃ領域は、天然のヒトＦｃ領域と比較して１～１０個に及ぶアミノ酸変異を有し、該変異は、Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、ならびに任意選択でＰ３２９Ｇを含み、これらの残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されている。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ヒトＦｃ領域のバリアントを含み、該ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４のものであり、該Ｆｃ領域は、天然のヒトＦｃ領域と比較して１～１０個に及ぶアミノ酸変異を有し、該変異は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅを含み、これらの残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されている。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ヒトＦｃ領域のバリアントを含み、該ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４のものであり、該Ｆｃ領域は、天然のヒトＦｃ領域と比較して１～１０個に及ぶアミノ酸変異を有し、該変異は、変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含み、これらの残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されている。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ヒトＦｃ領域のバリアントを含み、該ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４のものであり、該Ｆｃ領域は、天然のヒトＦｃ領域と比較して１～１０個に及ぶアミノ酸変異を有し、該変異は、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを含み、これらの残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されている。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ヒトＦｃ領域のバリアントを含み、該ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４のものであり、該Ｆｃ領域は、天然のヒトＦｃ領域と比較して１～１０個に及ぶアミノ酸変異を有し、該変異は、Ｓ２２８Ｐ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅを含み、これらの残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されている。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ヒトＦｃ領域のバリアントを含み、該ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４のものであり、該Ｆｃ領域は、天然のヒトＦｃ領域と比較して１～１０個に及ぶアミノ酸変異を有し、該変異は、Ｓ２２８Ｐ、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含み、これらの残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されている。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、グリコシル化定常領域を含む。特定の実施形態では、ある抗体は、非グリコシル化定常領域を含む。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、フコース含量が低下しているか、またはフコースを含まない。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、混合アイソタイプ抗体、すなわち、２つ以上の異なるアイソタイプに由来する重鎖定常領域を含む抗体である。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、該抗体のＩｇＧ－ＦｃのＡｓｎ２９７（ＥＵ付番システムによって特定される）に結合した二分岐グリカン（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を含む。特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、脱グリコシル化抗体、脱フコシル化抗体、またはガラクトシル化抗体である。
特定の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のアミノ酸変異を含む本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、該１つ以上のアミノ酸置換を含まない抗体と比較して、標的介在性の薬物消失、例えば、受容体媒介エンドサイトーシスとその後のリソソーム分解を減少させる。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体は、ＶＩＳＴＡに対するｐＨ依存性の結合を示す。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、先行する段落に記載のヒスチジン変異のいずれかを、Ｆｃ受容体またはＣ１ｑ受容体への結合を増加または減少させる変異を含めた本記載の定常領域への任意の変異と組み合わせて含む。特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、酸性ｐＨでの標的の解離を高めるヒスチジン置換及びＦｃＲｎ結合を高める変異を含む。
結合特性
特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＶＩＳＴＡ（例えば、配列番号３７７をコードする核酸から発現される）、特に、シグナル配列を欠く成熟型ヒトＶＩＳＴＡに結合する。成熟型ヒトＶＩＳＴＡは、配列番号３７７のアミノ酸３３～３１１であり、これは、配列番号３７７のアミノ酸１～３２であるシグナル配列を欠いている。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（例えば、配列番号３７８のアミノ酸３３～１９４）に結合する。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＶＩＳＴＡ及びカニクイザルＶＩＳＴＡ（例えば、配列番号３８０をコードする核酸から発現される成熟型サルＶＩＳＴＡまたはシグナル配列を欠くもの）の両方に結合する。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、マウスＶＩＳＴＡ（例えば、配列番号３６９をコードする核酸から発現される成熟型マウスＶＩＳＴＡまたはシグナル配列を欠くもの）に結合しない。例示的なＶＩＳＴＡの配列を以下の表１１に示し、シグナル配列は下線付きかつ太字である。
特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＶＩＳＴＡ（例えば、配列番号３７７をコードする核酸から発現される）、特に、シグナル配列を欠く成熟型ヒトＶＩＳＴＡに結合する。成熟型ヒトＶＩＳＴＡは、配列番号３７７のアミノ酸３３～３１１であり、これは、配列番号３７７のアミノ酸１～３２であるシグナル配列を欠いている。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（例えば、配列番号３７８のアミノ酸３３～１９４）に結合する。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＶＩＳＴＡ及びカニクイザルＶＩＳＴＡ（例えば、配列番号３８０をコードする核酸から発現される成熟型サルＶＩＳＴＡまたはシグナル配列を欠くもの）の両方に結合する。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、マウスＶＩＳＴＡ（例えば、配列番号３６９をコードする核酸から発現される成熟型マウスＶＩＳＴＡまたはシグナル配列を欠くもの）に結合しない。例示的なＶＩＳＴＡの配列を以下の表１１に示し、シグナル配列は下線付きかつ太字である。
ある特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＶＩＳＴＡのＥＣＤに、バイオレイヤー干渉法で測定して、ＫＤ約０．５ｎＭ～約１ｎＭ、約１ｎＭ～約１．５ｎＭ、約１．５ｎＭ～約２ｎＭ、約２ｎＭ～約２．５ｎＭ、約２．５ｎＭ～約３ｎＭ、約３ｎＭ～約５ｎＭ、約５ｎＭ～約１０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２０ｎＭ、または約２０ｎＭ～約１００ｎＭで結合する。
特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、カニクイザルＶＩＳＴＡのＥＣＤに、バイオレイヤー干渉法で測定して、ＫＤ約０．５ｎＭ～約１ｎＭ、約１ｎＭ～約１．５ｎＭ、約１．５ｎＭ～約２ｎＭ、約２ｎＭ～約２．５ｎＭ、約２．５ｎＭ～約３ｎＭ、約３ｎＭ～約５ｎＭ、約５ｎＭ～約１０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２０ｎＭ、または約２０ｎＭ～約１００ｎＭで結合する。
親和性は、平衡解離定数（ＫＤ）、及び平衡結合定数（ＫＡ）が挙げられるがこれらに限定されない当技術分野で既知のいくつかの方法で測定及び／または表現され得る。該ＫＤは、当業者に既知の技術、例えば、バイオレイヤー干渉法または表面プラズモン共鳴、例えば、下記の方法によって測定され得る。
特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＶＩＳＴＡに、ＥＬＩＳＡで測定して、半数効果濃度（ＥＣ５０）約０．５ｎＭ、約０．９ｎＭ、約１．６ｎＭ、約１．７ｎＭ、約２．１ｎＭ、約２．７ｎＭ、約３．２ｎＭ、約４．２ｎＭ、約５．５ｎＭ、または約１１．７ｎＭで結合する。
特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、細胞表面のヒトＶＩＳＴＡに、ＥＣ５０約０．０５ｎＭ、約０．０６ｎＭ、約０．０９ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．２ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．８ｎＭまたは約１．２ｎＭで結合する。
特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、Ｂ７－１（別名ＣＤ８０）、Ｂ７－２（別名ＣＤ８６）、Ｂ７－Ｈ２（別名ＩＣＯＳリガンド）、Ｂ７－Ｈ１（別名ＰＤ－Ｌ１もしくはＣＤ２７４）、Ｂ７－ＤＣ（別名ＰＤ－Ｌ２もしくはＣＤ２７３）、Ｂ７－Ｈ４（別名Ｂ７Ｓ１）、及び／またはＢ７－Ｈ３（別名ＣＤ２７６）には結合しない。
特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、Ｖセット及びＩｇドメイン含有タンパク質３（ＶＳＩＧ３）とＶＩＳＴＡとの間の相互作用をブロックする。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＶＩＳＴＡの二量化または別の同型の相互作用をブロックする。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、Ｐ－セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ１）とＶＩＳＴＡとの間の相互作用をブロックする。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＶセットＩｇドメイン含有タンパク質８（ＶＳＩＧ８）とＶＩＳＴＡとの間の相互作用をブロックする。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ロイシンリッチリピート及び免疫グロブリン様ドメインタンパク質１（ＬＲＩＧ１）とＶＩＳＴＡとの間の相互作用をブロックする。
特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、配列６６ＨＬＨＨＧ７０（配列番号３７７のアミノ酸９８～１０２）または１１６ＶＶＥＩＲＨＨＨＳＥＨＲ１２７（配列番号３７７のアミノ酸１４８～１５９）（該ＶＩＳＴＡ残基の付番は、シグナルペプチドより後の最初のアミノ酸から開始する）を含むＶＩＳＴＡのエピトープに結合する。ＶＩＳＴＡのシグナル配列は、表１１では太字かつ下線付きである。１つの実施形態では、該抗体、またはその抗原結合断片は、配列番号３７７のチロシン３７、アルギニン５４、バリン１１７及びアルギニン１２７を含むヒトＶＩＳＴＡのエピトープに結合する。
特定の実施形態では、本明細書に提供するのは、本明細書に記載の抗体と同じまたは重複するＶＩＳＴＡのエピトープに結合する抗体及びその抗原結合断片である。本明細書で使用される場合、「エピトープ」は、当技術分野で既知のその意味に従って使用される用語であり、抗体がその抗原結合ドメインを介して特異的に結合することができる抗原の局所的領域を指す。エピトープは、例えば、ポリペプチドの連続したアミノ酸（直鎖状または連続したエピトープ）の場合もあれば、あるエピトープは、例えば、ポリペプチド（複数可）の２つ以上の非連続領域（立体構造、非線形、不連続、または非連続エピトープ）から集合する場合もある。
本明細書に記載の抗体と同じまたは重複するＶＩＳＴＡのエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、または二重特異性抗体であり得る。ヒト化抗体は一般に、ヒト定常領域及びヒトフレームワーク領域を含む可変領域を含むが、そのＣＤＲは、非ヒト種のもの（例えば、マウスＣＤＲ）である。キメラ抗体は一般に、ヒト由来の定常領域及び非ヒト種の可変領域（例えば、マウス可変領域）を含む。
ある特定の実施形態では、抗体のエピトープは、例えば、ＮＭＲ分光法、Ｘ線回折結晶構造解析試験、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分析と組み合わせた水素／重水素交換（例えば、ＭＡＬＤＩ質量分析）、アレイベースのオリゴペプチドスキャニングアッセイ、及び／または突然変異誘発マッピング（例えば、部位特異的突然変異誘発マッピング）、または下記の方法によって測定され得る。Ｘ線結晶構造解析の場合、結晶化は当技術分野で既知の方法のいずれかを使用して達成され得る（例えば、Ｇｉｅｇｅ Ｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５０（Ｐｔ ４）：３３９－３５０、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ａ（１９９０）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １８９：１－２３、Ｃｈａｙｅｎ ＮＥ（１９９７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：１２６９－１２７４、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ａ（１９７６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５１：６３００－６３０３）。抗体：抗原結晶は、周知のＸ線回折技術を使用して調べてもよく、コンピュータソフトウェア、例えば、Ｘ－ＰＬＯＲ（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．が配信、例えば、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８５）ｖｏｌｕｍｅｓ １１４ ＆ １１５，ｅｄｓ Ｗｙｃｋｏｆｆ ＨＷ ｅｔ ａｌ．，、米国特許出願第２００４／００１４１９４号参照）及びＢＵＳＴＥＲ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ Ｇ（１９９３）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ４９（Ｐｔ １）：３７－６０、Ｂｒｉｃｏｇｎｅ Ｇ（１９９７）Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２７６Ａ：３６１－４２３，ｅｄ Ｃａｒｔｅｒ ＣＷ、Ｒｏｖｅｒｓｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５６（Ｐｔ １０）：１３１６－１３２３）を使用して改良してもよい。突然変異誘発マッピング試験は、当業者に既知の任意の方法を使用して達成され得る。アラニンスキャニング突然変異誘発技術を含めた突然変異誘発技術の説明については、例えば、Ｃｈａｍｐｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＢＣ ＆ Ｗｅｌｌｓ ＪＡ（１９８９）を参照されたい。
本明細書に記載の抗体と同じまたは重複するＶＩＳＴＡのエピトープを認識してこれに結合する抗体は、所定の技術、例えば、イムノアッセイ等を使用して、例えば、標的抗原に対する別の抗体の結合をブロックする１つの抗体の能力を示すこと、すなわち、競合結合アッセイによっても同定され得る。競合結合アッセイはまた、２つの抗体がエピトープに対して同様の結合特異性を有するかどうかを判断するために使用され得る。競合的結合は、被試験免疫グロブリンが、共通の抗原、例えば、ＶＩＳＴＡ等に対する参照抗体の特異的結合を阻害するアッセイにおいて判断され得る。多数のタイプの競合的結合アッセイ、例えば、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ Ｃ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ９：２４２－２５３参照）、固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ ＴＮ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３７：３６１４－９参照）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ Ｅ ＆ Ｌａｎｅ Ｄ，（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ参照）、Ｉ－１２５標識を使用した固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ ＧＡ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５（１）：７－１５参照）、固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇ ＲＣ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６－５２）、直接標識ＲＩＡ．（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ Ｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：７７－８２）、及びバイオレイヤー干渉法（「ＢＬＩ」）、例えば、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）システムのＢＬＩが知られている。通常、かかるアッセイは、固体表面に結合した精製抗原（例えば、ＶＩＳＴＡ）またはこれらのいずれかを担持する細胞、非標識試験免疫グロブリン及び標識参照免疫グロブリンの使用を含む。競合的阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量を特定することによって測定され得る。通常、該試験免疫グロブリンは過剰に存在する。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、それによって共通抗原に対する参照抗体の特異的結合が、少なくとも５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％またはそれ以上阻害される。競合結合アッセイは、標識抗原または標識抗体のいずれかを使用して、多数の異なる形式で構成され得る。このアッセイの一般的なバージョンでは、抗原は、９６ウェルプレートに固定化される。非標識抗体が標識抗体の抗原への結合をブロックする能力が、その後放射性標識または酵素標識を使用して測定される。さらなる詳細については、例えば、Ｗａｇｅｎｅｒ Ｃ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３０：２３０８－２３１５、Ｗａｇｅｎｅｒ Ｃ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６８：２６９－２７４、Ｋｕｒｏｋｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５０：４８７２－４８７９、Ｋｕｒｏｋｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｎｖｅｓｔ ２１：５２３－５３８、Ｋｕｒｏｋｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １１：３９１－４０７及びＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ Ｅ ＆ Ｌａｎｅ Ｄ ｅｄｉｔｏｒｓ、前出，ｐｐ．３８６－３８９を参照されたい。
ある特定の態様では、競合結合アッセイを使用して、ある抗体が、別の抗体によって、例えば、用量依存的に競合的にブロックされるかどうかを判断することができる。特定の実施形態では、該競合結合アッセイは、標識抗原または標識抗体のいずれかを使用して、いくつかの異なる形式で構成され得る競合的ＥＬＩＳＡである。特定の実施形態では、抗体は、本明細書に記載の抗体による競合結合アッセイで試験され得る。
特定の実施形態では、本明細書に提供するのは、当業者に既知の、または本明細書に記載のアッセイのいずれか、例えば、ＥＬＩＳＡ競合アッセイ、ＢＬＩ（例えば、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）システムでのＢＬＩ、または表面プラズモン共鳴）を使用して測定して、ＶＩＳＴＡへの結合をめぐって本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と（例えば、用量依存的に）競合する抗体である。特定の実施形態では、本明細書に提供するのは、当業者に既知の、または本明細書に記載のアッセイのいずれか、例えば、ＥＬＩＳＡ競合アッセイ、サスペンションアレイ、ＢＬＩ（例えば、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）システムでのＢＬＩ、または表面プラズモン共鳴）を使用して測定して、ＶＩＳＴＡへの結合から、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を（例えば、用量依存的に）競合的に阻害する抗体である。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供するのは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と、ＶＩＳＴＡに対する結合をめぐって、本明細書に記載の抗体がＶＩＳＴＡに対する結合に関して自己競合するのと同じ程度に競合する抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するのは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と、ＶＩＳＴＡに対する結合をめぐって競合する第１の抗体であり、該競合は、ＶＩＳＴＡに対する該第１の抗体の結合の８０％を超える（例えば、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％、または８０％～８５％、８０％～９０％、８５％～９０％もしくは８５％～９５％の）低下として示される。
本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と、ＶＩＳＴＡに対する結合をめぐって競合する抗体またはその抗原結合断片は、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
特定の態様では、本明細書に提供するのは、表７に記載される抗体のＶＨ、及び表８に記載される同じ抗体のＶＬを含む抗体と、ＶＩＳＴＡに対する特異的結合をめぐって（例えば、用量依存的に）競合する抗体である。特定の実施形態では、本明細書に提供するのは、表９に記載される抗体の軽鎖、及び表９に記載される同じ抗体の重鎖を含む免疫グロブリンと、ＶＩＳＴＡに対する特異的結合をめぐって（例えば、用量依存的に）競合する抗体である。
特定の実施形態では、表７に記載される抗体のＶＨ及び表８に記載される同じ抗体のＶＬを含む、抗体の同じまたは重複するエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。当業者に既知の、または本明細書に記載のアッセイ（例えば、Ｘ線結晶構造解析、ＥＬＩＳＡアッセイ等）を使用して、２つの抗体が同じエピトープに結合するかどうかを判断することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片と、ＶＩＳＴＡに対する結合をめぐって競合する抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片の同じもしくは重複するエピトープに結合する抗体もしくはその抗原結合断片は、ヒトＶＩＳＴＡのＥＣＤに、バイオレイヤー干渉法または当技術分野で既知の別の方法で測定して、ＫＤ約０．５ｎＭ～約１ｎＭ、約１ｎＭ～約１．５ｎＭ、約１．５ｎＭ～約２ｎＭ、約２ｎＭ～約２．５ｎＭ、約２．５ｎＭ～約３ｎＭ、約３ｎＭ～約５ｎＭ、約５ｎＭ～約１０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２０ｎＭ、または約２０ｎＭ～約１００ｎＭで結合する。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片と、ＶＩＳＴＡに対する結合をめぐって競合する抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片の同じもしくは重複するエピトープに結合する抗体もしくはその抗原結合断片は、カニクイザルＶＩＳＴＡのＥＣＤに、バイオレイヤー干渉法で測定して、ＫＤ約０．５ｎＭ～約１ｎＭ、約１ｎＭ～約１．５ｎＭ、約１．５ｎＭ～約２ｎＭ、約２ｎＭ～約２．５ｎＭ、約２．５ｎＭ～約３ｎＭ、約３ｎＭ～約５ｎＭ、約５ｎＭ～約１０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２０ｎＭ、または約２０ｎＭ～約１００ｎＭで結合する。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片と、ＶＩＳＴＡに対する結合をめぐって競合する抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片の同じもしくは重複するエピトープに結合する抗体もしくはその抗原結合断片は、ヒトＶＩＳＴＡに、ＥＬＩＳＡで測定して、半数効果濃度（ＥＣ５０）約０．５ｎＭ、約０．９ｎＭ、約１．６ｎＭ、約１．７ｎＭ、約２．１ｎＭ、約２．７ｎＭ、約３．２ｎＭ、約４．２ｎＭ、約５．５ｎＭ、または約１１．７ｎＭで結合する。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片と、ＶＩＳＴＡに対する結合をめぐって競合する抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片の同じもしくは重複するエピトープに結合する抗体もしくはその抗原結合断片は、細胞表面のヒトＶＩＳＴＡに、ＥＣ５０約０．０５ｎＭ、約０．０６ｎＭ、約０．０９ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．２ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．８ｎＭまたは約１．２ｎＭで結合する。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片と、ＶＩＳＴＡに対する結合をめぐって競合する本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片の同じもしくは重複するエピトープに結合する抗体もしくはその抗原結合断片は、Ｂ７－１（別名ＣＤ８０）、Ｂ７－２（別名ＣＤ８６）、Ｂ７－Ｈ２（別名ＩＣＯＳリガンド）、Ｂ７－Ｈ１（別名ＰＤ－Ｌ１もしくはＣＤ２７４）、Ｂ７－ＤＣ（別名ＰＤ－Ｌ２もしくはＣＤ２７３）、Ｂ７－Ｈ４（別名Ｂ７Ｓ１）、及び／またはＢ７－Ｈ３（別名ＣＤ２７６）には結合しない。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片と、ＶＩＳＴＡに対する結合をめぐって競合する本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片の同じもしくは重複するエピトープに結合する抗体もしくはその抗原結合断片は、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの間の相互作用をブロックする。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＶＩＳＴＡの二量化または他の同型の相互作用をブロックする。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＰＳＧＬ１とＶＩＳＴＡとの間の相互作用をブロックする。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＶＳＩＧ８とＶＩＳＴＡとの間の相互作用をブロックする。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＬＲＩＧ１とＶＩＳＴＡとの間の相互作用をブロックする。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、数値または数値範囲を修飾するために使用される場合、列挙された値または範囲の意図された意味の範囲内にとどまる値または範囲を５％～１０％上回る及び５％～１０％下回る偏差を示す。
機能特性
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＴ細胞活性化を高める。ヒトＴ細胞活性化は、当技術分野で既知の、または本明細書に記載の任意のアッセイ（例えば、下記ＳＥＢ誘発性ヒトＴ細胞活性化アッセイ）によって測定され得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＴ細胞活性化を、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４対照と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％または約２００％増加させる。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＴ細胞活性化を高める。ヒトＴ細胞活性化は、当技術分野で既知の、または本明細書に記載の任意のアッセイ（例えば、下記ＳＥＢ誘発性ヒトＴ細胞活性化アッセイ）によって測定され得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＴ細胞活性化を、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４対照と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％または約２００％増加させる。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＶＩＳＴＡ媒介Ｔ細胞抑制を減少させる。ＶＩＳＴＡ媒介Ｔ細胞抑制は、当技術分野で既知の、または本明細書に記載の任意のアッセイを使用して測定され得る（例えば、下記の通り、ＥＬＩＳＡを使用してＩＦＮγ産生を測定することによって、またはＴ細胞増殖を測定することによって）。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＶＩＳＴＡ媒介Ｔ細胞抑制を、Ｔ細胞増殖によって測定して、ＩｇＧ１対照と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、約２１０％、約２２０％、約２３０％、約２４０％、約２５０％、約２６０％、約２７０％、約２８０％、約２９０％、または約３００％減少させる。
他の特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＶＩＳＴＡ媒介Ｔ細胞抑制を、ＩＦＮγ産生によって測定して、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４対照と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、約２１０％、約２２０％、約２３０％、約２４０％、約２５０％、約２６０％、約２７０％、約２８０％、約２９０％、または約３００％減少させる。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、単球を活性化する。単球の活性化は、当技術分野で既知の、または本明細書に記載の任意のアッセイを使用して測定され得る（例えば、下記の通り、ＣＤ１４＋細胞の表面のＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８０及び／またはＣＤ８６のレベルを測定することによって、またはＣＸＣＬ１０ケモカイン分泌を測定することによって）。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ１４＋単球でのＨＬＡ－ＤＲ発現を、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４対照と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、約２１０％、約２２０％、約２３０％、約２４０％、約２５０％、約２６０％、約２７０％、約２８０％、約２９０％、または約３００％増加させる。特定の実施形態では、該ＨＬＡ－ＤＲ発現の増加は、ＮＫ細胞依存性である。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ１４＋単球でのＣＤ８０発現を、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４対照と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、約２１０％、約２２０％、約２３０％、約２４０％、約２５０％、約２６０％、約２７０％、約２８０％、約２９０％、または約３００％増加させる。特定の実施形態では、該ＣＤ８０発現は、ＮＫ細胞依存性である。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ１４＋単球でのＣＤ８６発現を、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４対照と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、約２１０％、約２２０％、約２３０％、約２４０％、約２５０％、約２６０％、約２７０％、約２８０％、約２９０％、または約３００％増加させる。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＣＸＣＬ１０の分泌を、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４対照と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、約２１０％、約２２０％、約２３０％、約２４０％、約２５０％、約２６０％、約２７０％、約２８０％、約２９０％、約３００％、約３１０％、約３２０％、約３３０％、約３４０％、約３５０％、約３６０％、約３７０％、約３８０％、約３９０％、約４００％、約４１０％、約４２０％、約４３０％、約４４０％、約４５０％、約４６０％、約４７０％、約４８０％、約４９０％、または約５００％増加させる。特定の実施形態では、該ＣＸＣＬ１０の分泌は、ＮＫ細胞依存性である。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）のサイトカイン誘導性の活性化に影響を与える。ＭＤＳＣの活性は、当技術分野で既知の、または本明細書に記載の任意のアッセイを使用して測定され得る（例えば、下記の通り、フローサイトメトリーによって抗ＣＤ３誘導性Ｔ細胞増殖を阻害するＭＤＳＣの能力を測定することによって及び／またはＥＬＩＳＡによってＩＦＮγ産生を測定することによって）。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＭＤＳＣ媒介Ｔ細胞抑制を、Ｔ細胞増殖によって測定して、ＩｇＧ１対照と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％または約２００％減少させる。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＭＤＳＣ媒介Ｔ細胞抑制を、ＩＦＮγ分泌によって測定して、ＩｇＧ１対照と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、約２１０％、約２２０％、約２３０％、約２４０％、約２５０％、約２６０％、約２７０％、約２８０％、約２９０％、約３００％、約３１０％、約３２０％、約３３０％、約３４０％、約３５０％、約３６０％、約３７０％、約３８０％、約３９０％、約４００％、約４１０％、約４２０％、約４３０％、約４４０％、約４５０％、約４６０％、約４７０％、約４８０％、約４９０％、または約５００％減少させる。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導する。ＡＤＣＣは、当技術分野で既知の、または本明細書に記載の任意のアッセイによって測定され得る（例えば、下記の通り、ヒトＶＩＳＴＡを発現するＲａｊｉ細胞に対するＡＤＣＣを測定することによって）。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＡＤＣＣを、半数効果濃度（ＥＣ５０）約１～５ｎｇ／ｍＬ、約５～１０ｎｇ／ｍＬ、約１０～１５ｎｇ／ｍＬ、約１５～２０ｎｇ／ｍＬもしくは約２０～２５ｎｇ／ｍＬ、またはＥＣ５０約１０．７８ｎｇ／ｍＬ、約５．２４ｎｇ／ｍＬ、約５．７５ｎｇ／ｍＬ、約１５．７ｎｇ／ｍＬ、約７．９４ｎｇ／ｍＬ、約８．５ｎｇ／ｍＬ、約１５．６ｎｇ／ｍＬ、もしくは約２２．１ｎｇ／ｍＬで誘導する。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、がんのインビボモデルにおける腫瘍形成または腫瘍成長を阻害する。特定の実施形態では、該がんのインビボモデルは、ヒトＶＩＳＴＡノックイン（「ｈＶＩＳＴＡ ＫＩ」）マウス、ＭＣ３８マウスモデル、ＭＢ４９マウスモデル、またはＥＧ７マウスモデルである。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、結腸直腸癌のＭＣ３８マウスモデルにおける腫瘍形成または腫瘍成長を阻害する。ＭＣ３８マウスモデルにおける腫瘍形成の阻害を測定するための例示的なプロトコルを以下に示す）。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＭＣ３８マウスモデルにおける腫瘍成長の阻害が、マウスのＩｇＧ２ａ対照よりも大きい。他の特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＭＣ３８マウスモデルにおける腫瘍成長の阻害が、抗ＰＤ－１抗体よりも大きい。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、膀胱癌のＭＢ４９マウスモデルにおける腫瘍成長を阻害する。ＭＢ４９マウスモデルにおける腫瘍形成の阻害を測定するための例示的なプロトコルを以下に示す）。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＭＢ４９マウスモデルにおける腫瘍成長の阻害が、マウスのＩｇＧ２ａ対照よりも大きい。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、胸腺腫のＥＧ７マウスモデルにおける腫瘍成長を阻害する。ＥＧ７マウスモデルにおける腫瘍形成の阻害を測定するための例示的なプロトコルを以下に示す）。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＥＧ７マウスモデルにおける腫瘍成長の阻害が、マウスのＩｇＧ２ａ対照よりも大きい。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ｈＶＩＳＴＡ ＫＩマウスにおける１０ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射後、約９時間の排出半減期を有する。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ｈＶＩＳＴＡ ＫＩマウスにおける３０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射後、約３３時間の排出半減期を有する。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、血中の骨髄細胞活性化マーカーを調節する。骨髄活性化マーカーとしては、例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＤＲが挙げられ、当技術分野で既知の、または本明細書に記載の任意のアッセイによって測定され得る（例えば、下記の通り、フローサイトメトリーによって骨髄樹状細胞（ｍＤＣ）または単球でのＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＤＲの発現を測定することによって）。
１．２ 抗体産生
抗体の産生及びスクリーニング
別の態様では、本明細書に提供するのは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を産生する方法である。
抗体の産生及びスクリーニング
別の態様では、本明細書に提供するのは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を産生する方法である。
本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、抗体の合成のための当技術分野で既知の任意の方法によって、例えば、化学合成によって、または組み換え発現技術によって産生され得る。本明細書に記載の方法は、特に断りのない限り、分子生物学、微生物学、遺伝子解析、組み換えＤＮＡ、有機化学、生化学、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチドの合成及び修飾、核酸ハイブリダイゼーション、ならびに当技術分野の範囲内の関連分野における従来の技術を使用する。これらの技術は、例えば、本明細書で引用される参照文献に記載されており、該文献で十分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７ ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７ ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ）Ｇａｉｔ（ｅｄ．）（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）（１９９１）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｉｒｒｅｎ Ｂ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．）（１９９９）Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、創出、例えば、合成、ＤＮＡ配列の遺伝子操作経由を含む任意の手段によって調製、発現、創出または単離された抗体（例えば、組み換え抗体）である。ある特定の実施形態では、かかる抗体は、インビボで動物または哺乳類（例えば、ヒト）の抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在しないＤＮＡ配列によってコードされる配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、成熟型ヒトＶＩＳＴＡ（配列番号３７７のアミノ酸３３～３１１）またはその細胞外ドメイン（配列番号３７８）を免疫原として使用することを含む方法によって作製される。
ある特定の態様では、本明細書に提供するのは、本明細書に記載の細胞または宿主細胞を培養することを含む、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を作製する方法である。ある特定の態様では、本明細書に提供するのは、本明細書に記載の細胞または宿主細胞（例えば、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む細胞または宿主細胞）を使用して抗体またはその抗原結合断片を発現させる（例えば、組み換え的に発現させる）ことを含む、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を作製する方法である。特定の実施形態では、該細胞は、単離された細胞またはエキソビボ細胞である。特定の実施形態では、該外因性ポリヌクレオチドは、該細胞に導入されている。特定の実施形態では、該方法はさらに、該細胞または宿主細胞から得られる抗体またはその抗原結合断片を精製するステップを含む。
ポリクローナル抗体を産生する方法は当技術分野で既知である（例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ １１ ｉｎ：Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２００２）５ｔｈ Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組み換え、及びファージ提示技術、またはそれらの組み合わせの使用を含め、当技術分野で既知の広範な技術を使用して調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、本明細書に記載の抗体またはその断片、例えば、かかる抗体の軽鎖及び／または重鎖を外因的に発現する宿主細胞から組み換え的に産生され得る。クローン細胞株及びそれによって発現されるモノクローナル抗体の調製方法は、当技術分野では周知である（例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ １１ ｉｎ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２００２）５ｔｈ Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．、前出参照）。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で既知の、例えば、Ｈａｒｌｏｗ Ｅ ＆ Ｌａｎｅ Ｄ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ＧＪ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３ ６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）、及びＫｏｈｌｅｒ Ｇ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５に教示されている技術を含めたハイブリドーマ技術を使用して産生され得る。ハイブリドーマ技術を使用して特異的抗体を産生及びスクリーニングする方法は所定のものであり、当技術分野では周知である。特定の実施形態では、マウス（または他の動物、例えば、ラット、サル、ロバ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、ウシ、ラクダ、ニワトリ、もしくはイヌ等）が抗原（例えば、ヒト）で免疫化される場合があり、免疫応答が検出された後、例えば、該マウスの血清中に該抗原に特異的な抗体が検出された後、該マウスの脾臓が採取され、脾細胞が単離される。次いで、該脾細胞を、周知の技術によって、任意の適切な骨髄腫細胞、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能な細胞株ＳＰ２／０からの細胞に融合させ、ハイブリドーマを形成する。ハイブリドーマは選択され、限界希釈によってクローニングされる。このように調製されたハイブリドーマ細胞は、播種され、好ましくは、融合されていない親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を含む適切な培地で成長する。ハイブリドーマ細胞が成長している培地は、ＶＩＳＴＡに対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。所望の特異性、親和性、及び／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後、当該クローンは、標準的な方法によってサブクローニングされ、成長し、培地から分離され得る（Ｇｏｄｉｎｇ ＪＷ（Ｅｄ），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、前出）。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、当技術分野で既知の方法、例えば、免疫沈降によって、またはインビトロ結合アッセイ、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等によって測定される。
特定の実施形態では、本明細書に提供するのは、単一の細胞（例えば、単一のＢ細胞、ハイブリドーマ、または組み換え抗体を産生する宿主細胞）によって産生されるモノクローナル抗体であり、該抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡまたは当技術分野で既知のもしくは本明細書に記載の他の抗原結合もしくは競合結合アッセイで測定して、免疫特異的にＶＩＳＴＡに結合する。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、一価抗体または多価（例えば、二価）抗体である。特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、単一特異性抗体または多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体または三重特異性抗体）である。特定の実施形態では、本明細書に提供する抗体は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する抗体は、三重特異性キラーエンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）である。
ＶＩＳＴＡを認識する抗体断片は、当業者に既知の任意の技術によって生成され得る。例えば、本明細書に記載のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、酵素、例えば、パパイン（Ｆａｂ断片を産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を産生するため）等を使用した免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって産生され得る。Ｆａｂ断片は、抗体分子の２つの同一のアームの１つに対応し、重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインとペアになった完全な軽鎖を含む。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された抗体分子の２つの抗原結合アームを含む。
さらに、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片はまた、当技術分野で既知の様々なファージ提示法を使用して生成され得る。ファージ提示法では、機能的抗体ドメインは、それをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面で提示される。特に、ＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列は、動物ｃＤＮＡライブラリ（例えば、罹患組織のヒトまたはマウスのｃＤＮＡライブラリ）から増幅される。ＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードするＤＮＡは、ＰＣＲによってｓｃＦｖリンカーとともに組み換えられ、ファージミドベクターにクローニングされる。該ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞にエレクトロポレーションされ、該Ｅ．ｃｏｌｉは、ヘルパーファージに感染する。これらの方法で使用されるファージは、通常、ｆｄ及びＭ１３を含む繊維状ファージであり、該ＶＨドメイン及びＶＬドメインは通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組み換え的に融合される。特定の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原によって、例えば、標識した抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を使用して選択または特定され得る。本明細書に記載の抗体を作製するために使用され得るファージ提示法の例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１－５０、Ａｍｅｓ ＲＳ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７－１８６、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ＣＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２４：９５２－９５８、Ｐｅｒｓｉｃ Ｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｇｅｎｅ １８７：９－１８、Ｂｕｒｔｏｎ ＤＲ ＆ Ｂａｒｂａｓ ＣＦ（１９９４）Ａｄｖａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５７：１９１－２８０、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／００１１３４号、国際公開第ＷＯ９０／０２８０９号、同第ＷＯ９１／１０７３７号、同第ＷＯ９２／０１０４７号、同第ＷＯ９２／１８６１９号、同第ＷＯ９３／１ １２３６号、同第ＷＯ９５／１５９８２号、同第ＷＯ９５／２０４０１号、及び同第ＷＯ９７／１３８４４号、ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，７３３，７４３号及び同第５，９６９，１０８号に開示されているものが挙げられる。
上記の参照文献に記載の通り、ファージ選択後、該ファージからの抗体コード領域が単離され、ヒト化抗体、キメラ抗体、または任意の他の所望の抗原結合断片を含む全抗体を生成するために使用され、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌を含めた任意の所望の宿主にて、例えば、下記の通りに発現され得る。抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２断片等を組み換え的に生成する技術はまた、当技術分野で既知の方法、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２２３２４号、Ｍｕｌｌｉｎａｘ ＲＬ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４－９、Ｓａｗａｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ａｍ Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３４：２６－３４、及びＢｅｔｔｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１－１０４３に開示されているもの等を用いて採用され得る。
１つの態様では、全抗体を生成するために、ＶＨまたはＶＬヌクレオチド配列、制限酵素認識部位、及び該制限酵素認識部位を保護するための隣接配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、鋳型、例えば、ｓｃＦｖクローンから該ＶＨまたはＶＬ配列を増幅することができる。当業者に既知のクローニング技術を利用して、ＰＣＲ増幅されたＶＨドメインを、重鎖定常領域を発現するベクターにクローニングすることができ、ＰＣＲ増幅されたＶＬドメインを、軽鎖定常領域を発現するベクター（例えば、ヒトカッパまたはラムダ定常領域）にクローニングすることができる。該ＶＨドメイン及びＶＬドメインを、必要な定常領域を発現する１つのベクターにクローニングすることもできる。次いで、当業者に既知の技術を使用して、重鎖変換ベクター及び軽鎖変換ベクターを細胞株に同時トランスフェクトして、全長抗体、例えば、ＩｇＧを発現する安定したまたは一過性の細胞株を生成する。
単一ドメイン抗体、例えば、軽鎖を欠く抗体は、当技術分野で周知の方法によって産生され得る。Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ ＆ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３１：２５－３８、Ｎｕｔｔａｌｌ ＳＤ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １（３）：２５３－２６３、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ，（２００１）Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７４（４）：２７７－３０２、米国特許第６，００５，０７９号、ならびに国際公開第ＷＯ９４／０４６７８号、同第ＷＯ９４／２５５９１号及び同第ＷＯ０１／４４３０１号を参照されたい。
さらに、当業者に周知の技術を使用して抗原を「模倣」する抗イディオタイプ抗体を生成するために、ＶＩＳＴＡ抗原に免疫特異的に結合する抗体を同様に利用することができる（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ ＮＳ ＆ Ｂｏｎａ ＣＡ（１９８９）ＦＡＳＥＢ Ｊ ７（５）：４３７－４４４、及びＮｉｓｓｉｎｏｆｆ Ａ（１９９１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７（８）：２４２９－２４３８参照）。
ヒト抗体は、当技術分野で既知の任意の方法を使用して産生され得る。例えば、機能的な内因性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスが使用され得る。特に、該ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、ランダムにまたは相同組み換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得る。代替的に、該ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、及び多様性領域をマウス胚性幹細胞に導入することもできる。マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組み換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別に、またはそれと同時に機能しない状態にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合体欠失により、内因性抗体産生が妨げられる。該修飾胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞に顕微注入してキメラマウスを産生する。次いで、該キメラマウスを繁殖させて、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を産生する。該トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えば、抗原の全部または一部（例えば、ＶＩＳＴＡ、またはＶＩＳＴＡのＥＣＤ、またはＶＩＳＴＡをコードするＤＮＡ）を用いて通常の方法で免疫化される。該抗原に対するモノクローナル抗体は、単一のＢ細胞またはハイブリドーマ技術を使用して、免疫化されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスが保有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞の分化中に再配列され、その後、クラススイッチ組み換え及び体細胞超突然変異が起こる。したがって、かかる技術を使用すると、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ ＆ Ｈｕｓｚａｒ Ｄ（１９９５）Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：６５－９３を参照されたい。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術の詳細な考察ならびにかかる抗体を産生するためのプロトコルについては、例えば、国際公開第ＷＯ９８／２４８９３号、同第ＷＯ９６／３４０９６号及び同第ＷＯ９６／３３７３５号、ならびに米国特許第５，４１３，９２３号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，５４５，８０６号、同第５，８１４，３１８号、及び同第５，９３９，５９８号を参照されたい。ヒト抗体を産生することができるマウスの例としては、Ｔｒｉａｎｎｉ（登録商標）マウス（例えば、米国特許第１０，８８１，０８４号及び同第１０，７９３，８２９号に記載されている）、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，１８４号）、ＨｕＡｂ－Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．／Ｇｅｎ Ｐｈａｒｍ、米国特許第５，５４５，８０６号及び同第５，５６９，８２５号）、Ｔｒａｎｓ Ｃｈｒｏｍｏ Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｋｉｒｉｎ）ならびにＫＭ Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｋｉｒｉｎ）が挙げられる。
ＶＩＳＴＡに特異的に結合するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリを使用する上記のファージ提示法を含めた当技術分野で既知の様々な方法によって作製され得る。米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、及び同第５，８８５，７９３号、ならびに国際公開第ＷＯ９８／４６６４５号、同第ＷＯ９８／５０４３３号、同第ＷＯ９８／２４８９３号、同第ＷＯ９８／１６６５４号、同第ＷＯ９６／３４０９６号、同第ＷＯ９６／３３７３５号、及び同第ＷＯ９１／１０７４１号も参照のこと。
特定の実施形態では、ヒト抗体は、マウス－ヒトハイブリドーマを使用して産生され得る。例えば、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換されたヒト末梢血リンパ球をマウス骨髄腫細胞と融合させて、ヒトモノクローナル抗体を分泌するマウス－ヒトハイブリドーマを産生することができ、これらのマウス－ヒトハイブリドーマをスクリーニングして、標的抗原（例えば、ヒトＶＩＳＴＡまたはヒトＶＩＳＴＡのＥＣＤ）に免疫特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを特定することができる。かかる方法は既知であり、当技術分野で記載されている。例えば、Ｓｈｉｎｍｏｔｏ Ｈ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４６：１９－２３、Ｎａｇａｎａｗａ Ｙ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ １４：２７－３１を参照されたい。
特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片をスクリーニング及び選択する方法は、本明細書に記載の通りである。
本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が産生された後、それを、免疫グロブリン分子の精製に関して当技術分野で既知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特に、プロテインＡ後の特定の抗原に対するアフィニティー、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって精製することができる。さらに、本明細書に記載の抗体は、精製を容易にするために、本明細書に記載の、または当技術分野で既知の異種ポリペプチド配列に融合され得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、単離または精製される。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、該単離された抗体とは異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体の調製物は、細胞物質及び／または化学的前駆体を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という語は、抗体が単離または組み換え的に産生される細胞の細胞成分から該抗体が分離される該抗体の調製物を含む。したがって、実質的に細胞物質を含まない抗体は、異種タンパク質（本明細書では「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）及び／または抗体のバリアント、例えば、異なる翻訳後修飾形態の抗体もしくは他の異なる型の抗体（例えば、抗体断片）を約３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満（乾燥重量）有する抗体の調製物を含む。抗体が組み換え的に産生される場合、それはまた、一般に培地を実質的に含まない。すなわち、培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％、１０％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満に相当する。該抗体が化学合成によって産生される場合、それは一般に、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。すなわち、それは、該タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から、ならびにミスフォールドしたタンパク質及び他の前駆体から分離される。したがって、かかる抗体の調製物は、目的の抗体以外の化学的前駆体または化合物を約３０％、２０％、１０％、または５％未満（乾燥重量）有する。
１．３ポリヌクレオチド
ある特定の態様では、本明細書に提供するのは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む１つ以上のポリヌクレオチド（または核酸分子）ならびにベクター、例えば、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ及び哺乳類細胞）、及びかかる抗体または抗原結合断片を含み、任意選択でこれを発現するエキソビボ宿主細胞におけるそれらの効率的な発現のためのポリヌクレオチドを含むベクターである。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、単離または精製される。
ある特定の態様では、本明細書に提供するのは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む１つ以上のポリヌクレオチド（または核酸分子）ならびにベクター、例えば、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ及び哺乳類細胞）、及びかかる抗体または抗原結合断片を含み、任意選択でこれを発現するエキソビボ宿主細胞におけるそれらの効率的な発現のためのポリヌクレオチドを含むベクターである。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、単離または精製される。
特定の実施形態では、該ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、該核酸分子の天然の供給源（例えば、マウスまたはヒト）に存在する他の核酸分子から分離されているものである。さらに、該核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ分子等は、組み換え技術によって産生された場合は他の細胞物質または培地を実質的に含まない可能性があるか、または化学合成された場合には、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない可能性がある。例えば、「実質的に含まない」という語は、他の物質、例えば、細胞物質、培地、他の核酸分子、化学的前駆体及び／または他の化学物質を約１５％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満有するポリヌクレオチドまたは核酸分子の調製物を含む。
特定の態様では、本明細書に提供するのは、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、ならびにＶＩＳＴＡポリペプチドに対する結合をめぐってかかる抗体と競合する（例えば、用量依存的に）か、またはかかる抗体のものと同じもしくは重複するエピトープに結合する抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。
ある特定の態様では、本明細書に提供するのは、本明細書に記載の抗体の軽鎖及び／または重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のＶＨ、例えば、表７に記載される抗体のＶＨをコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のＶＬ、例えば、表８に記載される抗体のＶＬをコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のＶＨ及びＶＬの両方、例えば、表７に記載される抗体のＶＨ及び表８に記載される同じ抗体のＶＬをコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、該ＶＨ及び該ＶＬは、別々のポリヌクレオチドによってコードされ得る。
特定の態様では、本明細書に提供するのは、軽鎖及び重鎖、例えば、別々の軽鎖及び重鎖を含む抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。特定の実施形態では、該軽鎖及び重鎖は、別々のポリヌクレオチドによってコードされ得る。該軽鎖に関して、特定の実施形態では、本明細書に提供するポリヌクレオチドは、ヒトカッパ軽鎖またはヒトラムダ軽鎖を含む本明細書に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、本明細書に提供するポリヌクレオチドは、抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列は、表１２に記載される配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に提供するポリヌクレオチドは、抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列は、表１３に記載される配列を含む。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のＶＨ、例えば、表７に記載される抗体のＶＨ、及びヒト重鎖定常領域（例えば、ヒトアルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）またはミュー（μ）重鎖定常領域）をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のＶＬ、例えば、表８に記載される抗体のＶＬ、及びヒト軽鎖定常領域（例えば、ヒトカッパ軽鎖またはヒトラムダ軽鎖定常領域）をコードするヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、（ｉ）本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のＶＨ（例えば、表７に記載される抗体のＶＨ）及びヒト重鎖定常領域（例えば、ヒトアルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）またはミュー（μ）重鎖定常領域）をコードするヌクレオチド配列、ならびに（ｉｉ）本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のＶＬ（例えば、表８に記載される抗体のＶＬ）及びヒト軽鎖定常領域（例えば、ヒトカッパ軽鎖またはヒトラムダ軽鎖定常領域）をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に提供する１つ以上のポリヌクレオチドは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列は、表１２に記載される配列及び表１３に記載される同じ抗体の配列を含む。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド（複数可）、核酸（複数可）またはヌクレオチド（複数可）は、デオキシリボ核酸、リボ核酸、リボヌクレオチド、及びそれらのポリマー形態を含む。特定の実施形態では、該ポリヌクレオチド（複数可）、核酸（複数可）またはヌクレオチド（複数可）は一本鎖または二本鎖である。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド、核酸、またはヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列である。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする本明細書に記載のポリヌクレオチド配列（例えば、核酸配列）は、当業者に既知の方法を使用してコドン最適化される。ある特定の実施形態では、最適化された本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＶＨドメイン及び／またはＶＬドメイン）をコードするポリヌクレオチド配列は、最適化されていない本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＶＨドメイン及び／またはＶＬドメイン）をコードするポリヌクレオチド配列のアンチセンス（例えば、相補的）ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る。特定の実施形態では、最適化された本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列は、最適化されていない本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列のアンチセンスポリヌクレオチドに対して、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。特定の実施形態では、最適化されたＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列は、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする最適化されていないヌクレオチド配列のアンチセンスポリヌクレオチドに対して、高ストリンジェンシー、中またはより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件に関する情報は記載されており、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００４８５４９号（例えば、段落７２～７３）を参照されたい。
当技術分野で既知の任意の方法によって、該ポリヌクレオチドを得ることができ、該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が特定される。本明細書に記載の抗体、及びこれら抗体の修飾型をコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で周知の方法を使用して特定され得る。すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが既知のヌクレオチドコドンが、該抗体をコードする核酸配列を生成するように組み立てられる。該抗体をコードするかかるポリヌクレオチドは、化学合成されたオリゴヌクレオチドから組み立てられ得る（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ Ｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２－６に記載の通りに）。これは、簡潔には、該抗体をコードする配列の一部を含む重複するオリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリング及び連結、次いで、連結されたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅を含む。
別の方法として、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で周知の方法（例えば、ＰＣＲ及び他の分子クローニング法）を使用して、適切な供給源（例えば、ハイブリドーマ、または免疫化トランスジェニックマウスのＢ細胞）からの核酸から生成され得る。例えば、既知の配列の３’及び５’末端にハイブリダイズすることが可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅は、目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞またはＢ細胞から得られたゲノムＤＮＡを使用して行うことができる。かかるＰＣＲ増幅法を使用して、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の軽鎖及び／または重鎖をコードする配列を含む核酸を得ることができる。かかるＰＣＲ増幅法を使用して、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の可変軽鎖領域及び／または可変重鎖領域をコードする配列を含む核酸を得ることができる。増幅された核酸は、宿主細胞での発現及びさらなるクローニングのためにベクターにクローニングされ得る。
特定の抗体をコードする核酸配列を含むクローンが入手できないが、抗体分子の配列が分かっている場合、該免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成される場合もあれば、適切な供給源（例えば、抗体のｃＤＮＡライブラリ、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞、例えば、本明細書に記載の抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞等から生成されたｃＤＮＡライブラリ、または単離された核酸、好ましくは、ポリＡ＋ＲＮＡ）から、ＰＣＲ増幅によって、該配列の３’及び５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用して、または、例えば、該抗体をコードするｃＤＮＡライブラリからｃＤＮＡクローンを同定するための特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用したクローニングによって得られる場合もある。次いで、ＰＣＲによって生成された増幅された核酸を、当技術分野で周知の任意の方法を使用して複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離及び配列決定され得る。ハイブリドーマ細胞または単離されたＢ細胞は、かかるＤＮＡの供給源として役割を果たすことができる。単離後、該ＤＮＡを発現ベクターに配すことができ、これがその後、宿主細胞、例えば、他の場合には免疫グロブリンタンパク質を産生しないＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ ＧＳ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｌｏｎｚａ）またはＣＨＯＺＮ（登録商標）システム（Ｓｉｇｍａ）からのＣＨＯ細胞）、２９３Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、または骨髄腫細胞にトランスフェクトされ、当該組み換え宿主細胞においてＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の合成が生じる。
全抗体を生成するために、ＶＨまたはＶＬヌクレオチド配列、制限酵素認識部位、及び該制限酵素認識部位を保護するための隣接配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、ｓｃＦｖクローンに含まれる該ＶＨまたはＶＬ配列を増幅することができる。当業者に既知のクローニング技術を利用して、ＰＣＲ増幅されたＶＨドメインを、重鎖定常領域、例えば、ヒトガンマ１定常領域またはヒトガンマ４定常領域を発現するベクターにクローニングすることができ、ＰＣＲ増幅されたＶＬドメインを、軽鎖定常領域を発現するベクター（例えば、ヒトカッパまたはラムダ定常領域）にクローニングすることができる。ある特定の実施形態では、該ＶＨまたはＶＬドメインを発現するためのベクターは、プロモーター、分泌シグナル、可変ドメインのクローニング部位、定常ドメイン、及び選択マーカーを含む。本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の産生に使用され得る例示的なシグナル配列は、ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ（配列番号３６０）である。該ＶＨドメイン及びＶＬドメインを、必要な定常領域を発現する１つのベクターにクローニングすることもできる。次いで、当業者に既知の技術を使用して、該ＶＨ及び／または該ＶＬをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを、細胞株に同時トランスフェクトして、全長抗体、例えば、ＩｇＧを発現する安定したまたは一過性の細胞株を生成する。
該ＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を、任意のマウス配列または他の非ヒト配列の代わりに置換することによるか、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部を抗体（例えば、免疫グロブリン）コード配列に共有結合することにより修飾され得る。
同様に提供するのは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドに対して、高ストリンジェンシー、中またはより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプライマーを含むポリヌクレオチドである。
ハイブリダイゼーション条件は、当技術分野において記載されており、当業者に既知である。例えば、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、約４５℃の６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーションと、それに続く約５０～６５℃の０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄を含み得る。高ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションは、６ｘＳＳＣ中、約４５℃でフィルター結合核酸へのハイブリダイゼーションと、その後の０．１ｘＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中、約６８℃での１回以上の洗浄を含み得る。他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションは、当業者に既知であり、記載されている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．及びＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｔ ｐａｇｅｓ ６．３．１－６．３．６ ａｎｄ ２．１０．３．を参照されたい。
１．４細胞及びベクター
ある特定の態様では、本明細書に提供するのは、宿主細胞、好ましくは、哺乳類細胞での組み換え発現のためのベクター（例えば、発現ベクター）であり、これは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。発現ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、ニューカッスル病ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニア等）であり得る。同様に本明細書に提供するのは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を組み換え的に発現するかかるベクターを含むエキソビボ宿主細胞である。
ある特定の態様では、本明細書に提供するのは、宿主細胞、好ましくは、哺乳類細胞での組み換え発現のためのベクター（例えば、発現ベクター）であり、これは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。発現ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、ニューカッスル病ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニア等）であり得る。同様に本明細書に提供するのは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を組み換え的に発現するかかるベクターを含むエキソビボ宿主細胞である。
本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば、全長抗体、抗体の重鎖及び／または軽鎖、または本明細書に記載の一本鎖抗体）の組み換え発現は、該抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を伴う。本明細書に記載の抗体分子、抗体またはその抗原結合断片の重鎖及び／または軽鎖（例えば、重鎖及び／または軽鎖可変領域）をコードするポリヌクレオチドが得られた後、該抗体分子の産生のためのベクターが、当技術分野で周知の技術を使用した組み換えＤＮＡ技術によって産生され得る。したがって、ヌクレオチド配列をコードするＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば、軽鎖もしくは重鎖、またはその両方）を含むポリヌクレオチドを発現させることによるタンパク質の調製方法は、本明細書に記載されている。当業者に周知の方法を使用して、抗体または抗体断片（例えば、軽鎖もしくは重鎖、またはその両方）のコード配列ならびに適切な転写及び翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組み換えが挙げられる。同様に提供するのは、プロモーターに作動可能に連結された、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖もしくは軽鎖、または本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターである。かかるベクターは、例えば、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列（例えば、国際公開第ＷＯ８６／０５８０７及び同第ＷＯ８９／０１０３６号、ならびに米国特許第５，１２２，４６４号参照）を含むことができ、該抗体の可変ドメインは、全重鎖、全軽鎖、または全重鎖及び軽鎖の両方を発現させるためのかかるベクターにクローニングされ得る。
発現ベクターは、従来の技術によって細胞（例えば、宿主細胞）に移入することができ、次いで得られた細胞を従来の技術によって培養して、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を産生することができる。したがって、本明細書に提供するのは、宿主細胞での配列の発現のためのプロモーターに作動可能に連結された、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、またはその重鎖もしくは軽鎖、またはその断片、あるいは本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する一本鎖抗体もしくはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含む該宿主細胞である。該宿主細胞は、発現に適した任意の細胞型、例えば、初代細胞、培養細胞、または細胞株からの細胞であり得る。
様々な宿主－発現ベクター系を利用して、本明細書に記載の抗体分子を発現させることができる。かかる宿主－発現系は、目的のコード配列を産生すること及びその後精製することができる媒体を表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質導入またはトランスフェクトされた場合に、本明細書に記載の抗体分子をインサイチュで発現することができる細胞も表す。これらとしては、微生物、例えば、抗体コード配列を含む組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、抗体コード配列を含む組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｐｉｃｈｉａ）、抗体コード配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、抗体コード配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、もしくは組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系（例えば、緑藻類、例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ等）、または哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳類ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組み換え発現構築物を有する哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１もしくはＣＯＳ）、ＣＨＯ、ＣＨＯ ＧＳ Ｓｙｓｔｅｍ、ＣＨＯＺＮ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ ２９３、ＮＳ０、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨｅＬａ、及びＮＩＨ ３Ｔ３、ＨＥＫ－２９３Ｔ、２９３Ｆ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０及びＢＭＴ１０細胞）が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を発現するための細胞は、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ ２９３細胞である。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を発現するための細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト細胞株である。特定の実施形態では、細菌細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、または真核細胞（例えば、哺乳類細胞）は、特に、全組み換え抗体分子の発現のため、組み換え抗体分子の発現に使用される。例えば、哺乳類細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞とベクター、例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーター要素等の組み合わせは、抗体の有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ＭＫ ＆ Ｈｏｆｓｔｅｔｔｅｒ Ｈ（１９８６）Ｇｅｎｅ ４５：１０１－５、及びＣｏｃｋｅｔｔ ＭＩ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８（７）：６６２－７）。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＮＳ０細胞によって産生される。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターによって調節される。
細菌系では、発現される抗体分子を対象とする用途に応じて、いくつかの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体分子の医薬組成物の生成のためにかかる抗体を大量に産生する場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましい場合がある。かかるベクターとしては、融合タンパク質が産生されるように抗体コード配列が個々にベクター内にｌａｃＺコード領域とインフレームで結合され得るＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｅｔｈｅｒ Ｕ ＆ Ｍｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｌｌ Ｂ（１９８３）ＥＭＢＯ Ｊ ２：１７９１－１７９４）、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ Ｓ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ Ｍ（１９８５）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １３：３１０１－３１０９、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ Ｇ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ ＳＭ（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２４：５５０３－５５０９）等が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、ｐＧＥＸベクターを使用して、外来ポリペプチドをグルタチオン５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させることもできる。一般に、かかる融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着及び結合、その後の遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解細胞から容易に精製され得る。ｐＧＥＸベクターは、クローン化された標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
昆虫系では、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するベクターとして使用され得る。該ウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの細胞内で増殖する。該抗体コード配列は、該ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個別にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドロンプロモーター）の制御下に配され得る。
哺乳類の宿主細胞では、いくつかのウイルスベースの発現系が使用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的の抗体コード配列は、アデノウイルスの転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーター及びトリパータイトリーダー配列に連結され得る。次に、このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組み換えによってアデノウイルスゲノムに挿入され得る。該ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域ＥｌまたはＥ３）への挿入は、感染した宿主において生存可能で抗体分子を発現することができる組み換えウイルスをもたらす（例えば、Ｌｏｇａｎ Ｊ ＆ Ｓｈｅｎｋ Ｔ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１（１２）：３６５５－９参照）。挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要となる場合がある。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接する配列を含む。さらに、挿入物全体の翻訳を確実にするために、開始コドンは所望のコード配列のリーディングフレームと位相が一致していなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成の両方の様々な起源のものであり得る。発現効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等を含めることによって高めることができる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ Ｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６－５４４参照）。
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾及びプロセシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物のかかる修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、切断）は、該タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾のための特徴的かつ特異的な機構を有する。発現された外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするために適切な細胞株または宿主系が選択され得る。この目的のために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、及びリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用してもよい。かかる哺乳類宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ ２９３、ＮＩＨ ３Ｔ３、Ｗ１３８、２９３Ｆ、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２Ｏ及びＴ４７Ｄ、ＮＳ０（内因的にはいかなる免疫グロブリン鎖も産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１またはＣＯＳ）、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、ＢＭＴ１０及びＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、フコース含量が低下しているか、またはフコースを含まない。かかる抗体は、当業者に知られている技術を使用して産生され得る。例えば、該抗体は、フコシル化能力が不足または欠如している細胞で発現され得る。特定の例では、α１，６－フコシルトランスフェラーゼの両方のアレルをノックアウトした細胞株を使用して、フコース含量が低下した抗体またはその抗原結合断片を産生することができる。Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）システム（Ｌｏｎｚａ）は、フコース含量が低下した抗体またはその抗原結合断片を産生するために使用され得る系の例である。
組み換えタンパク質の長期にわたる高収率の産生の場合、安定発現細胞が生成され得る。例えば、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を安定に発現する細胞株は、操作され得る。特定の実施形態では、本明細書に提供する細胞は、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を形成するために結合する軽鎖／軽鎖可変ドメイン及び重鎖／重鎖可変ドメインを安定に発現する。
ある特定の態様では、ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）によって制御されるＤＮＡ、及び選択マーカーで宿主細胞を形質転換してもよい。外来ＤＮＡ／ポリヌクレオチドの導入に続いて、操作された細胞は、強化培地中で１～２日間増殖させることができ、次いで選択培地に切り替えられる。組み換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞が該プラスミドをそれらの染色体に安定的に組み込むこと、及び増殖して病巣を形成することを可能にし、該病巣が次にクローニングされ、細胞株に増殖され得る。かかる操作された細胞株は、該抗体分子と直接または間接的に相互作用する組成物のスクリーニング及び評価に特に有用であり得る。
以下が挙げられるがこれらに限定されないいくつかの選択系を使用することができる。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｃｅｌｌ １１（１）：２２３－３２）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＥＨ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ Ｗ（１９６２）ＰＮＡＳ ４８（１２）：２０２６－２０３４）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ Ｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｃｅｌｌ ２２（３）：８１７－２３）遺伝子は、それぞれ、ｔｋ－、ｈｇｐｒｔ－またはａｐｒｔ－細胞に使用され得る。また、代謝拮抗剤耐性は、以下の遺伝子の選択の基礎として使用され得る：メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）ＰＮＡＳ ７７（６）：３５６７－７０、Ｏ’Ｈａｒｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）ＰＮＡＳ ７８：１５２７－３１）、ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＲＣ ＆ Ｂｅｒｇ Ｐ（１９８１）ＰＮＡＳ ７８（４）：２０７２－６）、アミノグリコシドＧ－４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ（Ｗｕ ＧＹ ＆ Ｗｕ ＣＨ（１９９１）Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７－９５、Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ Ｐ（１９９３）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ３２：５７３－５９６、Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＲＣ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６－９３２、及びＭｏｒｇａｎ ＲＡ ＆ Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＷＦ（１９９３）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６２：１９１－２１７、Ｎａｂｅｌ ＧＪ ＆ Ｆｅｌｇｎｅｒ ＰＬ（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１（５）：２１１－５）、ならびにハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ＲＦ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｇｅｎｅ ３０（１－３）：１４７－５６）。当技術分野で周知の組み換えＤＮＡ技術の方法が頻繁に使用され、所望の組み換えクローンを選択することができ、かかる方法は、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＡｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ Ｍ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）、及びＣｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ＮＣ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）、Ｃｏｌｂｅｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎ Ｆ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １５０：１－１４に記載されている。
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増加し得る（総説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ＣＲ ＆ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ ＣＣＧ，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）参照）。抗体を発現するベクター系内のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルが増加すると、マーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅された領域は抗体遺伝子と結合しているため、抗体の産生も増加する（Ｃｒｏｕｓｅ ＧＦ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３：２５７－６６）。
該宿主細胞は、本明細書に記載の２つ以上の発現ベクター、重鎖由来のポリペプチドをコードする第１のベクター、及び軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベクターで同時トランスフェクトされ得る。該２つのベクターは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能にする同一の選択マーカーを含み得る。
特定の態様では、本明細書に提供する宿主細胞は、ベクターを含み、該ベクターは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の可変軽鎖領域（ＶＬ）をコードするヌクレオチド配列、及び該抗体の可変重鎖領域（ＶＨ）をコードするヌクレオチド配列を含む。
別の特定の態様では、本明細書に提供するのは、各々が本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含むエキソビボ細胞である。特定の実施形態では、エキソビボ細胞は、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のＶＨ、例えば、表７に記載される抗体のＶＨをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、エキソビボ細胞は、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のＶＬ、例えば、表８に記載される抗体のＶＬをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、エキソビボ細胞は、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のＶＨ、例えば、表７に記載される抗体のＶＨをコードするヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチド及び表８に記載される同じ抗体またはその抗原結合断片のＶＬをコードするヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチドを含む。
代替的に、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖及び軽鎖の両ポリペプチドをコードし、これを発現することが可能な単一のベクターが使用され得る。かかる発現ベクターでは、両遺伝子の転写は、共通のプロモーターによって駆動され得るが、第１の遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳は、キャップ依存性のスキャニングメカニズムによるものである可能性があり、第２の遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳は、キャップ非依存性のメカニズム、例えば、ＩＲＥＳによるものである可能性がある。
別の特定の態様では、本明細書に提供するのは、各々が本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の軽鎖及び／または重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含むエキソビボ細胞である。特定の実施形態では、エキソビボ細胞は、表１２に記載されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、エキソビボ細胞は、表１３に記載されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、エキソビボ細胞は、抗体の重鎖をコードする表１２に記載されるヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチド、及び同じ抗体の軽鎖をコードする表１３に記載されるヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の宿主細胞（例えば、エキソビボ宿主細胞）は、当技術分野で既知の技術を使用して、該宿主細胞に含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされる抗体またはその抗原結合断片を産生する条件下で培養される。ある特定の実施形態では、該抗体またはその抗原結合断片は、当技術分野で既知の技術を使用して、該宿主細胞から単離または精製される。
１．５医薬組成物
本明細書に提供するのは、（ａ）本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片及び（ｂ）医薬的に許容される担体を含む医薬組成物である。特定の実施形態では、該抗体またはその抗原結合断片は、精製される。特定の実施形態では、該抗体またはその抗原結合断片は、治療有効量で該医薬組成物中に存在する。
本明細書に提供するのは、（ａ）本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片及び（ｂ）医薬的に許容される担体を含む医薬組成物である。特定の実施形態では、該抗体またはその抗原結合断片は、精製される。特定の実施形態では、該抗体またはその抗原結合断片は、治療有効量で該医薬組成物中に存在する。
特定の実施形態では、該抗体またはその抗原結合断片は、精製される。
同様に本明細書に提供するのは、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはベクター（複数可）及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物である。
同様に本明細書に提供するのは、（ａ）本明細書に記載の抗体－薬物複合体（例えば、治療薬に結合した、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む）及び（ｂ）医薬的に許容される担体を含む医薬組成物である。特定の実施形態では、該抗体－薬物複合体は、治療有効量で該医薬組成物中に存在する。
同様に本明細書に提供するのは、（ａ）ＶＩＳＴＡ及び目的の別の抗原に結合する二重特異性抗体または多重特異性抗体（例えば、本明細書に記載の）及び（ｂ）医薬的に許容される担体を含む医薬組成物である。特定の実施形態では、該二重特異性抗体は、精製される。特定の実施形態では、該二重特異性抗体は、治療有効量で該医薬組成物中に存在する。
同様に本明細書に提供するのは、（ａ）本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のＶＨ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含むＣＡＲを発現する細胞及び（ｂ）医薬的に許容される担体を含む医薬組成物である。
賦形剤の場合も安定剤の場合もある許容される担体は、レシピエントに対し、使用される用量及び濃度で非毒性であり、例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸等の緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含めた抗酸化剤、防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン等、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾール等）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等、親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン等、アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン等、単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた他の炭水化物、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ等、糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール等、塩形成対イオン、例えば、ナトリウム等、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）、及び／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等が挙げられるがこれらに限定されない。
特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、及び任意選択で、１つ以上の追加の予防薬または治療薬を、医薬的に許容される担体中に含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の有効量、及び任意選択で、１つ以上の追加の予防薬または治療薬を、医薬的に許容される担体中に含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物及び／または抗体もしくはその抗原結合断片は、治療有効量の追加の治療薬と組み合わせることができる。
特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の抗体－薬物複合体、及び任意選択で、１つ以上の追加の予防薬または治療薬を、医薬的に許容される担体中に含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の抗体－薬物複合体の有効量、及び任意選択で、１つ以上の追加の予防薬または治療薬を、医薬的に許容される担体中に含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物及び／または抗体－薬物複合体は、治療有効量の追加の治療薬と組み合わせることができる。
特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が、該医薬組成物に含まれる唯一の活性成分である。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド（複数可）またはベクター（複数可）が、該医薬組成物に含まれる唯一の活性成分である。
本明細書に記載の医薬組成物は、がん、自己免疫疾患、ならびに感染症、例えば、細菌感染症及び真菌感染症を治療するために使用され得る。
医薬組成物は、任意の投与経路（例えば、非経口、局所、腫瘍内等）用に製剤化され得る。
非経口調製物で使用される医薬的に許容される担体としては、水性媒体、非水性媒体、抗菌剤、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁剤及び分散剤、乳化剤、金属イオン封鎖剤またはキレート剤、ならびに他の医薬的に許容される物質が挙げられる。水性媒体の例としては、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、等張性デキストロース注射液、滅菌水注射液、デキストロース及び乳酸加リンガー注射液が挙げられる。非水性非経口媒体としては、植物由来の固定油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油及び落花生油が挙げられる。フェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチル及びプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム及び塩化ベンゼトニウムを含めた静細菌または静真菌濃度の抗菌剤は、複数回投与容器に包装される非経口調製物に添加され得る。等張剤としては、塩化ナトリウム及びデキストロースが挙げられる。緩衝剤としては、リン酸及びクエン酸が挙げられる。抗酸化剤としては、重硫酸ナトリウムが挙げられる。局所麻酔剤としては、塩酸プロカインが挙げられる。懸濁剤及び分散剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリビニルピロリドンが挙げられる。乳化剤としては、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）が挙げられる。金属イオンの封鎖剤またはキレート剤としては、ＥＤＴＡが挙げられる。医薬担体は、水混和性媒体のエチルアルコール、ポリエチレングリコール、及びプロピレングリコール、ならびにｐＨ調整用の水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸も含む。
医薬組成物は、対象への任意の投与経路用に処方され得る。投与経路の具体例としては、鼻腔内、経口、肺、経皮、皮内、膀胱内及び非経口が挙げられる。いくつかの実施形態では、該投与は、腫瘍内である。皮下、筋肉内または静脈内注射のいずれかを特徴とする非経口投与も本明細書で企図される。注射剤は、従来の形態、すなわち、溶液または懸濁液のいずれか、注射前の溶液もしくは懸濁液に適した固形、またはエマルションとして調製され得る。該注射剤、溶液及びエマルションは、１つ以上の賦形剤も含む。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールである。さらに、所望により、投与される医薬組成物はまた、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解度向上剤、及び他のかかる薬剤、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート及びシクロデキストリン等も含み得る。
非経口投与用の抗体の調製物としては、そのまま注射できる滅菌溶液、使用直前に溶媒と混合することができる滅菌乾燥可溶性製品、例えば、皮下錠剤を含めた凍結乾燥粉末等、そのまま注射できる滅菌懸濁液、使用直前に媒体と混合される滅菌乾燥不溶性製品及び滅菌エマルションが挙げられる。該溶液は、水性の場合もあれば非水性の場合もある。
静脈内投与される場合、適切な担体としては、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ならびに増粘剤及び可溶化剤、例えば、グルコース、ポリエチレングリコール、及びポリプロピレングリコール等、ならびにこれらの混合物を含む溶液が挙げられる。
抗体を含む局所混合物は、局所及び全身投与について記載の通りに調製される。得られる混合物は、溶液、懸濁液、エマルション等であることができ、クリーム、ゲル、軟膏、エマルション、溶液、エリキシル剤、ローション剤、懸濁液、チンキ剤、ペースト、フォーム、エアロゾル、灌注剤、スプレー、坐薬、包帯、皮膚パッチ、または局所投与に適した任意の他の製剤として製剤化され得る。
本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体は、局所適用、例えば、吸入等によるエアロゾルとして製剤化され得る（例えば、炎症性疾患、特に喘息の治療に有用なステロイドを送達するためのエアロゾルを記載している米国特許第４，０４４，１２６号、同第４，４１４，２０９号及び同第４，３６４，９２３号参照）。気道に投与するためのこれらの製剤は、単独で、または不活性担体、例えば、ラクトース等と組み合わせて、ネブライザー用にエアロゾルまたは溶液の形態であってもよく、吹送用超微粒粉末であってもよい。かかる場合、該製剤の粒子は、１つの実施形態では、直径５０ミクロン未満、１つの実施形態では、１０ミクロン未満を有する。
本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体は、局所（ｌｏｃａｌ）または局所（ｔｏｐｉｃａｌ）適用、例えば、皮膚及び粘膜への局所適用等のため、例えば、眼内に、ゲル、クリーム、及びローションの形態で、及び眼への適用のためまたは嚢内もしくは髄腔内適用等のために製剤化され得る。局所投与は、経皮送達用に、及び眼もしくは粘膜への投与、または吸入療法用にも企図される。該抗体単独または他の医薬的に許容される賦形剤との組み合わせの点鼻液もまた投与され得る。
イオントフォレシス及び電気泳動装置を含めた経皮パッチは当業者に周知であり、抗体を投与するために使用され得る。例えば、かかるパッチは、米国特許第６，２６７，９８３号、同第６，２６１，５９５号、同第６，２５６，５３３号、同第６，１６７，３０１号、同第６，０２４，９７５号、同第６，０１０７１５号、同第５，９８５，３１７号、同第５，９８３，１３４号、同第５，９４８，４３３号、及び同第５，８６０，９５７号に開示されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体を含む医薬組成物は、凍結乾燥粉末であり、これは、溶液、エマルション及び他の混合物として投与するために再構成され得る。それはまた、固体またはゲルとして再構成及び製剤化され得る。該凍結乾燥粉末は、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、もしくはその医薬的に許容される誘導体を適切な溶媒に溶解することによって調製される。特定の実施形態では、該凍結乾燥粉末は、無菌である。該溶媒は、安定性を改善する賦形剤もしくは粉末の他の薬理学的成分、または粉末から調製された再構成された溶液を含んでもよい。使用され得る賦形剤としては、デキストロース、ソルビトール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロース、または他の適切な薬剤が挙げられるがこれらに限定されない。該溶媒はまた、緩衝液、例えば、クエン酸緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、もしくはリン酸カリウム緩衝液、または当業者に既知の他のかかる緩衝液等、一実施形態では、ｐＨがほぼ中性の緩衝液を含み得る。その後、当業者に既知の標準的な条件下で溶液を滅菌濾過し、続いて凍結乾燥することにより、所望の製剤が提供される。一実施形態では、得られる溶液は、凍結乾燥用のバイアルに分配される。各バイアルは、単回用量または複数回用量の該化合物を含む。該凍結乾燥粉末は、適切な条件下、例えば、約４℃～室温等で保管され得る。
この凍結乾燥粉末の注射用水での再構成により、非経口投与に使用するための製剤が提供される。再構成するには、該凍結乾燥粉末を滅菌水または他の適切な担体に添加する。正確な量は、選択される化合物によって異なる。かかる量は、経験的に決定され得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体を含む医薬組成物は、液体形態で供給され、再構成する必要がない。
本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体及び本明細書に提供する他の組成物はまた、特定の組織、受容体、または治療を受ける対象の身体の他の領域を標的とするように製剤化され得る。多くのかかる標的法は、当業者に周知である。すべてのかかる標的法は、本組成物での使用に対して本明細書で企図される。標的法の非限定的な例については、例えば、米国特許第６，３１６，６５２号、同第６，２７４，５５２号、同第６，２７１，３５９号、同第６，２５３，８７２号、同第６，１３９，８６５号、同第６，１３１，５７０号、同第６，１２０，７５１号、同第６，０７１，４９５号、同第６，０６０，０８２号、同第６，０４８，７３６号、同第６，０３９，９７５号、同第６，００４，５３４号、同第５，９８５，３０７号、同第５，９７２，３６６号、同第５，９００，２５２号、同第５，８４０，６７４号、同第５，７５９，５４２号、及び同第５，７０９，８７４号を参照されたい。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体は、腫瘍に標的化される。
インビボ投与に使用される組成物は、無菌であり得る。これは、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
１．６治療方法
１つの態様では、本明細書に提示するのは、対象におけるがんの治療方法であり、これは、それを必要とする対象に対して、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片を含む医薬組成物を投与することを含む。別の態様では、本明細書に提示するのは、対象におけるがんの治療方法であり、これは、それを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体－薬物複合体（例えば、治療薬に結合した本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片を含む）、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体を含む医薬組成物を投与することを含む。別の態様では、本明細書に提示するのは、対象におけるがんの治療方法であり、これは、それを必要とする対象に対して、本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞または本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞を含む医薬組成物を投与することを含む。
１つの態様では、本明細書に提示するのは、対象におけるがんの治療方法であり、これは、それを必要とする対象に対して、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片を含む医薬組成物を投与することを含む。別の態様では、本明細書に提示するのは、対象におけるがんの治療方法であり、これは、それを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体－薬物複合体（例えば、治療薬に結合した本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片を含む）、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体を含む医薬組成物を投与することを含む。別の態様では、本明細書に提示するのは、対象におけるがんの治療方法であり、これは、それを必要とする対象に対して、本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞または本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞を含む医薬組成物を投与することを含む。
特定の実施形態では、本明細書に提示するのは、対象におけるがんの治療方法であり、これは、それを必要とする対象に対して、本明細書に記載の二重特異性抗体、または本明細書に記載の二重特異性もしくは多重特異性抗体を含む医薬組成物を投与することを含む。別の態様では、本明細書に提示するのは、対象におけるがんの治療方法であり、これは、それを必要とする対象に対して、本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞、または本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞を含む医薬組成物を投与することを含む。別の態様では、本明細書に提示するのは、対象におけるがんの治療方法であり、これは、それを必要とする対象に対して、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドもしくはベクター、または本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド（複数可）もしくはベクター（複数可）含む医薬組成物を投与することを含む。
特定の実施形態では、該対象は、哺乳類、例えば、霊長類（例えば、サルまたはヒト）等である。特定の実施形態では、該対象は、ヒトである。本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、同義で使用される。
特定の実施形態では、該治療されるがんは、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、卵巣癌、神経芽腫、口腔癌、甲状腺癌、乳癌、肉腫、膵臓癌、結腸癌、胃癌、絨毛癌、精巣癌、中皮腫、皮膚癌、腎細胞癌、膀胱癌、または子宮頸癌である。特定の実施形態では、該がんは、血液癌である。特定の実施形態では、該がんは、白血病（例えば、急性骨髄性白血病）である。特定の実施形態では、該がんは、リンパ腫である。該がんは、固形腫瘍または非固形腫瘍であり得る。特定の実施形態では、該がんは、転移性である。
特定の実施形態では、該治療されるがんは、「冷たい腫瘍（ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒ）」（すなわち、膵臓悪性腫瘍で一般に見られるレベルと同様の低レベルのＴ細胞による浸潤を有する腫瘍）、例えば、前立腺、乳房、卵巣、膀胱、もしくは膵臓腫瘍、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、小細胞肺癌、または膠芽細胞腫である。特定の実施形態では、該がんは、例えば、健康組織対照、例えば、該がんと同じ組織型または器官型の非がん性細胞サンプルと比較して、ＶＩＳＴＡの発現が高い冷たい腫瘍である。
特定の実施形態では、該治療されるがんは、ＶＩＳＴＡ陽性がんである。すなわち、それは、検出可能なレベルのＶＩＳＴＡを発現する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のがんの治療方法は、投与ステップの前に、該対象から腫瘍生検、腫瘍サンプル、またはがん細胞サンプルを取得し、本明細書に記載のアッセイまたは当業者に既知のアッセイを使用してＶＩＳＴＡの発現のレベルを評価するステップを含む。腫瘍生検またはがん細胞サンプルを得るために、当業者に既知の技術が使用され得る。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡの発現レベルを評価するために、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーが使用される。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って治療される対象は、検出可能な、例えば、高ＶＩＳＴＡ発現を示す腫瘍、例えば、高ＶＩＳＴＡ発現を、例えば、健康な組織対照、例えば、該がんと同じ組織型または器官型の非がん性細胞サンプルと比較して示す腫瘍を有する。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、または本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞、または本明細書に記載の医薬組成物を、がんを有する対象に投与することにより、以下の効果のうちの少なくとも１、２、３、４またはそれ以上が達成される：（ｉ）がんの１つ以上の症状の重症度の低減もしくは改善、（ｉｉ）がんに関連する１つ以上の症状の持続期間の短縮、（ｉｉｉ）がんに関連する症状の再発の予防、（ｉｖ）対象の入院の減少、（ｖ）入院期間の短縮、（ｖｉ）対象の生存期間の延長、（ｖｉｉ）別の治療法の治療効果の増強もしくは改善、（ｖｉｉｉ）がんに関連する１つ以上の症状の発展もしくは発症の阻害、（ｉｘ）がんに関連する症状の数の低減、（ｘ）当技術分野で周知の方法によって評価される生活の質の改善、（ｘ）腫瘍の再発の阻害、（ｘｉ）腫瘍及び／またはそれに関連する１つ以上の症状の退行、（ｘｉｉ）腫瘍及び／またはそれに関連する１つ以上の症状の進行の阻害、（ｘｉｉｉ）腫瘍の増殖の減少、（ｘｉｖ）腫瘍サイズ（例えば、体積または直径）の減少、（ｘｖ）新たに形成される腫瘍の形成の減少、（ｘｖｉ）原発腫瘍、局所腫瘍、及び／または転移性腫瘍の根絶、除去、もしくは制御、（ｘｖｉｉ）転移の数またはサイズの予防または減少、（ｘｖｉｉｉ）死亡率の減少、（ｘｉｘ）無再発生存率の増加、（ｘｘ）腫瘍のサイズが維持され、標準治療の投与後に増加しないか、もしくは当業者に利用可能な従来の方法、例えば、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、動的造影ＭＲＩ（ＤＣＥ－ＭＲＩ）、Ｘ線、及びコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、もしくは陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）スキャンで測定して、標準的な治療法の施用後の腫瘍の増加よりも増加が少ない、及び／または（ｘｘｉ）該対象における寛解期間の延長。
特定の実施形態では、本明細書に記載のがんの治療方法は、以下の効果のうちの１、２、３またはそれ以上をもたらす：完全奏効、部分奏効、客観的奏効、全生存期間の延長、無病生存期間の延長、客観的奏効率の増加、進行までの期間の延長、疾患の安定、無増悪生存期間の延長、治療成功期間の延長、及びがんの１つ以上の症状の改善または排除。特定の実施形態では、本明細書に記載のがんの治療方法は、全生存期間の延長をもたらす。別の特定の実施形態では、本明細書に記載のがんの治療方法は、無増悪生存期間の延長をもたらす。別の特定の実施形態では、本明細書に記載のがんの治療方法は、全生存期間の延長及び無増悪生存期間の延長をもたらす。
特定の実施形態では、完全奏効は、当業者によって理解される意味を有する。特定の実施形態では、完全奏効とは、治療に反応したがんの徴候のすべての消失を指す。完全奏効は、がんが治癒したことを意味しない場合があるが、患者が寛解期にあることを意味し得る。特定の実施形態では、がんは、疾患が既知の技術、例えば、放射線学的検査、骨髄、及び生検またはタンパク質測定によって検出されない場合に、完全寛解状態にある。
特定の実施形態では、部分奏効は、当業者によって理解される意味を有する。例えば、部分奏効は、治療に反応したヒト体内の腫瘍のサイズの減少を指す場合がある。特定の実施形態では、部分奏効は、新たな病変がない場合、すべての測定可能な腫瘍量（例えば、対象に存在する悪性細胞の数、または測定された腫瘍塊のかさ、または異常なモノクローナルタンパク質の量）における少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の減少を指す。
特定の実施形態では、全生存期間は、当業者によって理解される意味を有する。特定の実施形態では、全生存期間は、診断日または治療開始日のいずれかからの期間の長さを指す。統計的に有意な全生存期間の延長の実証は、毒性プロファイルが許容可能である場合に臨床的に有意であると見なすことができ、しばしば新薬の承認を支持してきた。
いくつかのエンドポイントは、通常、腫瘍評価に基づいている。これらのエンドポイントとしては、無病生存期間（ＤＦＳ）、客観的奏効率（ＯＲＲ）、進行までの期間（ＴＴＰ）、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、及び治療成功期間（ＴＴＦ）が挙げられる。これらの時間依存エンドポイントに関するデータの収集及び分析は、多くの場合、間接的な評価、計算、及び推定（例えば、腫瘍測定）に基づいている。
特定の実施形態では、無病生存期間（ＤＦＳ）は、当業者によって理解される意味を有する。特定の実施形態では、無病生存期間は、がんの一次治療が終了した後、ヒト対象が、がんの徴候または症状を全く示さずに生存する期間の長さを指す場合がある。ＤＦＳは、生存期間が延長され得る状況では、生存期間のエンドポイントを非現実的なものにする重要なエンドポイントであり得る。ＤＦＳは、臨床効果の代わりになる場合もあれば、臨床効果の直接的な証拠を提供する場合もある。この測定は通常、該効果の大きさ、そのリスクと効果の関係、及び該疾患の状況に基づく。ＤＦＳの定義は、特に腫瘍進行の事前の記録なしに死亡が確認された場合に複雑になる可能性がある。これらの事象は、疾患の再発または打ち切り事象のいずれかとしてスコア付けされる場合がある。死亡の統計分析のすべての方法にはいくつかの制限があるが、すべての死亡（あらゆる原因による死亡）を再発とみなすことでバイアスを最小限に抑えることができる。この定義を使用すると、特に長期間観察されずに死亡した患者では、ＤＦＳが過大評価される可能性がある。長期フォローアップ来院の頻度が試験群間で異なる場合、または毒性のために脱落者がランダムではない場合、バイアスが導入される可能性がある。
特定の実施形態では、客観的奏効率は、当業者によって理解される意味を有する。１つの実施形態では、客観的奏効率は、所定量の腫瘍サイズの縮小を最小期間において示した患者の割合として定義される。奏効期間は、初期反応の時点から腫瘍の進行が記録されるまで測定され得る。一般に、ＦＤＡは、ＯＲＲを、部分奏効と完全奏効の合計と定義している。このように定義すると、ＯＲＲは、薬剤の抗腫瘍活性の直接的な尺度となり、これは、単群試験で評価され得る。可能であれば、標準化された基準を使用して奏効を確認する必要がある。様々な奏効基準が適切であると考えられている（例えば、ＲＥＣＩＳＴ１．１基準）（例えば、Ｅｉｓｅｎｈｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，４５：２２８－２４７）参照）。ＯＲＲの有意性は、その大きさ及び持続期間、ならびに完全奏効（腫瘍の検出可能な証拠がない）の割合によって評価される。
特定の実施形態では、進行までの期間（ＴＴＰ）は、当業者によって理解される意味を有する。特定の実施形態では、進行までの時間は、がんの診断日または治療開始日からがんが悪化するか、またはヒト体内の他の部分に拡大するまでの期間の長さを指す。
特定の実施形態では、ＴＴＰは、ランダム化から客観的な腫瘍進行までの期間である。ＴＴＰは、死亡を含まない。
特定の実施形態では、無増悪生存期間（ＰＦＳ）は、当業者によって理解される意味を有する。特定の実施形態では、ＰＦＳは、がんの治療中及び治療後、ヒト患者ががんとともに生存するが、それが悪化しない期間の長さを指す。特定の実施形態では、ＰＦＳは、ランダム化から客観的な腫瘍進行または死亡までの期間として定義される。ＰＦＳは、死亡を含み得るため、全生存期間とさらに相関し得る。
特定の実施形態では、治療成功期間（ＴＴＦ）は、当業者によって理解される意味を有する。特定の実施形態では、ＴＴＦは、ランダム化から、疾患の進行、治療の毒性、及び死亡を含めた何らかの理由による治療の中止までの期間を測定する複合エンドポイントである。
特定の実施形態では、ヒト対象が本明細書に記載の治療方法にどの程度よく反応するかを測定するために、ＲＥＣＩＳＴ １．１基準が使用される。
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従う治療効果は、バイオマーカーを使用して評価され得る。効果の指標としては、例えば、骨髄樹状細胞（ｍＤＣ）の頻度の増加、及び／または単球及び／または樹状細胞の活性化の増加、及び／またはＣＤ８０、ＣＤ８６及び／またはＨＬＡ－ＤＲの増加が挙げられる。特定の実施形態では、効果の指標としては、患者の血液または腫瘍生検で測定して、１つ以上の特定の免疫細胞集団、ケモカインレベル、もしくはサイトカインレベル、またはＶＩＳＴＡ発現の増加または減少を挙げることもできる。特定の実施形態では、治療効果を測定するために、ＣＸＣＬ１０、ＭＩＰ１β（ＣＣＬ２）及び／またはＭＣＰ－１（ＣＣＬ４）の増加が使用される。
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って治療される対象は、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を受ける前に、化学療法及び／または放射線療法を受けている。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って治療される対象は、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を受ける前に、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、プログラム死－１（ＰＤ－１）もしくはプログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）の阻害剤または細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）の阻害剤等による治療を受けている。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って治療される対象は、該対象のがんの治療のための２つ以上の療法に失敗しており、例えば、該がんは２つ以上の療法に耐性を有する。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って治療される対象は、がんを有し、該がんは、該がんの治療のための１つ以上の他の療法に耐性を有し、かかる他のがん治療は、例えば、手術、放射線、化学療法、及び標的療法であり得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って治療される腫瘍は、手術、放射線療法及び／または化学療法が無効である。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って治療される腫瘍は、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤＬ１阻害剤、例えば、アテゾリズマブ等、ＰＤ－１阻害剤、例えば、ペムブロリズマブ等、または、ＣＴＬＡ－４阻害剤、例えば、イピリムマブ等）での治療が無効である。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って治療される腫瘍は、放射線療法及び／または化学療法が無効であり、かつ免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤＬ１阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、例えば、イピリムマブ等、または抗ＰＤ－１阻害剤、例えば、ペムブロリズマブ等）も無効である。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って治療される腫瘍は、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ソラフェニブ）による治療が無効である。
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って治療される腫瘍は、標的療法（例えば、ＨＥＲ－２阻害剤、例えば、トラスツズマブ等、ＨＥＲ３阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、例えばベバシズマブ等、ＢＲＡＦ阻害剤、例えば、ベムラフェニブ等、ＢＣＲ－ＡＢＬ融合タンパク質阻害剤、例えば、メシル酸イマチニブ等、シグナル伝達阻害剤、例えば、ＭＡＰキナーゼ阻害剤等、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、もしくはグルタチオンＳトランスフェラーゼ阻害剤、またはアポトーシス誘導剤）での治療が無効である。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って治療される腫瘍は、ホルモン療法（例えば、アビラテロン、アナストロゾール、エキセメスタン、フルベストラント、レトロゾール、ロイプロリドまたはタモキシフェン）による治療が無効である。
投与経路及び用量
本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物は、様々な経路によって対象に送達され得る。これらとしては、非経口、鼻腔内、気管内、経口、皮内、局所、筋肉内、腹腔内、膀胱内、経皮、静脈内、結膜、及び皮下経路が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、該投与は、腫瘍内である。経肺投与もまた、例えば、吸入具またはネブライザーを使用すること、及びスプレーとして使用するためのエアロゾル化剤を含む製剤を使用することによって採用され得る。一実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物は、対象に非経口投与される。特定の実施形態では、該非経口投与は、静脈内、筋肉内、または皮下である。特定の実施形態では、静脈内投与が使用される。
本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物は、様々な経路によって対象に送達され得る。これらとしては、非経口、鼻腔内、気管内、経口、皮内、局所、筋肉内、腹腔内、膀胱内、経皮、静脈内、結膜、及び皮下経路が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、該投与は、腫瘍内である。経肺投与もまた、例えば、吸入具またはネブライザーを使用すること、及びスプレーとして使用するためのエアロゾル化剤を含む製剤を使用することによって採用され得る。一実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物は、対象に非経口投与される。特定の実施形態では、該非経口投与は、静脈内、筋肉内、または皮下である。特定の実施形態では、静脈内投与が使用される。
状態の治療に有効である本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または抗体－薬物複合体、または本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞、または医薬組成物の量は、疾患の性質によって異なり、標準的な臨床技術によって決定され得る。
医薬組成物に使用される、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または抗体－薬物複合体、またはＣＡＲを発現する細胞の正確な用量は、投与経路、及びがんの型によっても異なり、医師の判断及び各対象の状況に応じて決定されるべきである。例えば、有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態（年齢、性別、体重及び健康状態等）、患者がヒトであるか動物であるか、投与された他の薬剤、または治療が予防的であるか治療的であるかによっても変化し得る。
ある特定の実施形態では、最適な用量範囲を特定するのに役立てるためにインビトロアッセイが使用される。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から誘導された用量反応曲線から外挿され得る。
抗体（もしくはその抗原結合断片）または抗体－薬物複合体の場合、通常、用量は、患者の体重の約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には、０．０１～１５ｍｇ／ｋｇに及ぶ。例えば、用量は、１ｍｇ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｋｇ体重、３０ｍｇ／ｋｇ体重または１～３０ｍｇ／ｋｇの範囲内、あるいは、言い換えれば、８０ｋｇの患者の場合、それぞれ、８０ｍｇもしくは２４００ｍｇまたは８０～２４００ｍｇの範囲内であり得る。特定の実施形態では、該患者に投与される用量は、該患者の体重の約１ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇである。特定の実施形態では、該患者に投与される用量は、該患者の体重の約１ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇである。代替的に、特定の実施形態では、本明細書に開示する治療方法に使用される用量は、１～５００ｍｇ、例えば、１０～４００ｍｇ、３０～３００ｍｇ、１００～３００ｍｇ、２００ｍｇ～１ｇ、または１ｇ～３ｇに及び、例えば、ヒト患者の場合、週１回、２週間に１回、または３週間に１回である。特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する免疫グロブリン抗体は、ヒト対象に対して、用量３ｍｇ、１０ｍｇ、３０ｍｇ、１００ｍｇ、もしくは３００ｍｇ、または１００～３００ｍｇ、１００ｍｇ～１ｇ、２００ｍｇ～１ｇ、もしくは１ｇ～３ｇの範囲で、週１回、２週間に１回または３週間に１回投与される。小児患者（例えば、１８歳未満の患者）では体重に基づいた用量が好ましい場合があるが、成人患者では固定用量が好まれ得る。
特定の実施形態では、上記のレジメンは、進行性固形腫瘍を有する患者を治療するために使用される。特定の実施形態では、上記のレジメンは、転移性または再発性の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者を治療するために使用される。特定の実施形態では、上記のレジメンは、転移性または再発性の頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を有する患者を治療するために使用される。特定の実施形態では、上記のレジメンは、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤療法を含めた化学療法が失敗した患者（例えば、ＮＳＣＬＣまたはＨＮＳＣＣを有する）を治療するために使用され、例えば、該がんは、化学療法に耐性を有する。特定の実施形態では、上記のレジメンは、放射線療法と、ＰＤ－１またはＰＤＬ１の阻害剤による療法の組み合わせに失敗した患者（例えば、ＮＳＣＬＣまたはＨＮＳＣＣを有する）を治療するために使用され、例えば、該がんは、放射線療法と、ＰＤ－１またはＰＬＤＬ１の阻害剤による療法の組み合わせに耐性を有する。特定の実施形態では、上記のレジメンは、化学療法と、放射線療法及びＰＤ－１またはＰＤＬ１の阻害剤による療法の組み合わせに失敗した患者（例えば、ＮＳＣＬＣまたはＨＮＳＣＣを有する）を治療するために使用され、例えば、該がんは、化学療法と、放射線療法及びＰＤ－１またはＰＤＬ１の阻害剤による療法の組み合わせに耐性を有する。
特定の実施形態では、上記のレジメンは、白金含有全身化学療法に失敗した再発性または進行性の卵巣癌または子宮頸癌を有する患者を治療するために使用され、例えば、該がんは、白金含有全身化学療法に耐性を有する。特定の実施形態では、上記のレジメンは、外科的切除、放射線療法、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン、ゲムシタビン、シスプラチン、オキサリプラチン、イリノテカン、ロイコボリン及びパクリタキセルのうちの１つ以上に失敗した再発性または進行性の膵臓癌を有する患者を治療するために使用され、例えば、該がんは、外科的切除、放射線療法、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン、ゲムシタビン、シスプラチン、オキサリプラチン、イリノテカン、ロイコボリン及びパクリタキセルのうちの１つ以上に耐性を有する。特定の実施形態では、上記のレジメンは、外科的切除、放射線療法、化学療法（ドセタキセル、パクリタキセル、シクロホスファミド、５－ＦＵ、カペシタビン、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、カルボプラチン、白金）、ホルモン療法（タモキシフェン、エキセメスタン、アナストロゾール、レトロゾール、フルベストラント）、標的療法（トラスツズマブ、ラパチニブ、ペルツズマブ、アベマシクリブ、パルボシクリブ、リボシクリブ、アルペリシブ、ネラチニブ、オラパリブ、タラゾパリブ）及び免疫療法（アテゾリズマブ）のうちの１つ以上に失敗した再発性または進行性の乳癌を有する患者を治療するために使用され、例えば、該がんは、外科的切除、放射線療法、化学療法（ドセタキセル、パクリタキセル、シクロホスファミド、５－ＦＵ、カペシタビン、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、カルボプラチン、白金）、ホルモン療法（タモキシフェン、エキセメスタン、アナストロゾール、レトロゾール、フルベストラント）、標的療法（トラスツズマブ、ラパチニブ、ペルツズマブ、アベマシクリブ、パルボシクリブ、リボシクリブ、アルペリシブ、ネラチニブ、オラパリブ、タラゾパリブ）及び免疫療法（アテゾリズマブ）のうちの１つ以上に耐性を有する。特定の実施形態では、上記のレジメンは、外科的切除、放射線療法、ホルモン療法（ブサレリン（ｂｕｓａｒｅｌｉｎ）、デガレリクス、ゴセレリン、ヒストレリン、ロイプロリド、レルゴリクス、トリプトレリン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、アビラテロン、アパルタミド、エンザルタミド）、化学療法（ドセタキセル）及び免疫療法（シプリューセル－Ｔ）のうちの１つ以上に失敗した再発性または進行性の前立腺癌を有する患者を治療するために使用され、例えば、該がんは、外科的切除、放射線療法、ホルモン療法（ブサレリン（ｂｕｓａｒｅｌｉｎ）、デガレリクス、ゴセレリン、ヒストレリン、ロイプロリド、レルゴリクス、トリプトレリン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、アビラテロン、アパルタミド、エンザルタミド）、化学療法（ドセタキセル）及び免疫療法（シプリューセル－Ｔ）のうちの１つ以上に耐性を有する。特定の実施形態では、上記のレジメンは、外科的切除、放射線療法、化学療法（５－ＦＵ、ロイコボリン、オキサリプラチン、カペシタビン、イリノテカン）、及び標的療法（ベバシズマブ、ｚｉｖ－アフリベルセプト、ラムシルマブ、セツキシマブまたはパニツムマブ）のうちの１つ以上に失敗した再発性または進行性の結腸直腸癌を有する患者を治療するために使用され、例えば、該がんは、外科的切除、放射線療法、化学療法（５－ＦＵ、ロイコボリン、オキサリプラチン、カペシタビン、イリノテカン）、及び標的療法（ベバシズマブ、ｚｉｖ－アフリベルセプト、ラムシルマブ、セツキシマブまたはパニツムマブ）のうちの１つ以上に耐性を有する。特定の実施形態では、上記のレジメンは、外科的切除、放射線療法、５－ＦＵ、エピルビシン、シスプラチン、オキサリプラチン、ドセタキセル、カペシタビン、エトポシド、メトトレキサート、ロイコボリン、トラスツズマブ、ニボルマブ及びペムブロリズマブのうちの１つ以上に失敗した再発性または進行性の胃癌または胃食道癌を有する患者を治療するために使用され、例えば、該がんは、外科的切除、放射線療法、５－ＦＵ、エピルビシン、シスプラチン、オキサリプラチン、ドセタキセル、カペシタビン、エトポシド、メトトレキサート、ロイコボリン、トラスツズマブ、ニボルマブ及びペムブロリズマブのうちの１つ以上に耐性を有する。特定の実施形態では、上記のレジメンは、腎細胞癌、頭頸部癌、または肺癌を有する患者を治療するために使用される。
例示的な治療レジームは、週１回、２週間に１回、もしくは３週間に１回または月１回もしくは３～６か月に１回、１年もしくは数年にわたって、または数年間隔での投与を必然的に伴う。いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２つ以上の抗体またはその抗原結合断片が対象に同時に投与される。ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または抗体－薬物複合体は、通常、複数回投与される。用量は、例えば、毎日、週２回、週３回、毎週、２週間ごと、３週間ごと、毎月、３か月ごと、６か月ごと、または毎年投与され得る。特定の実施形態では、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に提供する抗体－薬物複合体は、３週間に１回投与される。
併用療法
特定の態様では、本明細書に記載のがんの治療方法はさらに、例えば、がんを治療するための追加の療法を当該対象に投与することを含む。特定の実施形態では、該追加の療法は、１つの追加の療法である。代替的に、特定の実施形態では、該がんの治療方法は、複数の追加の療法を投与することを含む。該追加の療法（複数可）は、手術、放射線、化学療法、標的療法もしくは他の治療薬、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される抗がん治療であり得る。特定の実施形態では、該追加の療法は、該がんを治療するためのものである。特定の実施形態では、該追加の療法は、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または抗体－薬物複合体、またはＣＡＲを発現する細胞による治療の任意の副作用を治療するためのものである。特定の実施形態では、該追加の療法は、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の効果を高める。いくつかの実施形態では、該追加の療法は、免疫細胞療法、例えば、樹状細胞またはＴＩＬである。
特定の態様では、本明細書に記載のがんの治療方法はさらに、例えば、がんを治療するための追加の療法を当該対象に投与することを含む。特定の実施形態では、該追加の療法は、１つの追加の療法である。代替的に、特定の実施形態では、該がんの治療方法は、複数の追加の療法を投与することを含む。該追加の療法（複数可）は、手術、放射線、化学療法、標的療法もしくは他の治療薬、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される抗がん治療であり得る。特定の実施形態では、該追加の療法は、該がんを治療するためのものである。特定の実施形態では、該追加の療法は、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または抗体－薬物複合体、またはＣＡＲを発現する細胞による治療の任意の副作用を治療するためのものである。特定の実施形態では、該追加の療法は、本明細書に提供するＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の効果を高める。いくつかの実施形態では、該追加の療法は、免疫細胞療法、例えば、樹状細胞またはＴＩＬである。
特定の実施形態では、該追加の療法は、がんを治療するための療法であり、これは、化学療法剤または標的療法、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤である。特定の実施形態では、該追加の療法は、免疫チェックポイント阻害剤である。特定の実施形態では、該追加の療法は、Ｂ７Ｈ７、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１６０、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲ－Ｌ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ８０、またはＣＤ８６のアゴニストである。特定の実施形態では、該追加の療法は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ６、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ４７、ＳＩＲＰα、ＩＬＴ４、ＴＧＦβ、ＴＧＦβ－Ｒ、ＶＳＩＧ３、ＶＳＩＧ８、ＬＲＩＧ１、ＰＳＧＬ１、ＣＥＡＣＡＭ、ＨＶＥＭ、ガレクチン－９、またはＦＬＧ－１のアンタゴニストである。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を対象に投与することを含む、本明細書に記載のがんの治療方法は、さらに、該対象に対して、抗ＰＤ１抗体（例えば、ペムブロリズマブ、セミプリマブ、ピディリズマブ、もしくはニボルマブ）、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｎｉａｂ）、ＢＭＳ－９３６５５２、もしくはＣＫ－３０１）、または抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、イピリムマブ）を投与することを含み得る。
特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に記載の抗体－薬物複合体、または本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞は、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ペムブロリズマブ）と組み合わせて対象に投与される。特定の実施形態では、該療法の両方が同時に、例えば、同日に、任意選択で３週間に１回投与される。特定の実施形態では、該療法の両方が同日に、例えば、３週間に１回投与される。特定の実施形態では、該抗ＰＤ－１抗体は、ヒト対象に対して、用量２００ｍｇで投与される。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する免疫グロブリン抗体（またはその抗原結合断片もしくは複合体）は、ヒト対象に対して、用量３０ｍｇ、１００ｍｇ、３００ｍｇ、１ｇ、もしくは３ｇ、または１００～３００ｍｇ、２００ｍｇ～１ｇ、３００ｍｇ～１ｇ、もしくは１ｇ～３ｇの範囲で、毎週、隔週、または３週間ごとに投与され、同時に、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ペムブロリズマブ）がその処方情報に記載の通りの用量及び投与間隔で投与される。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する免疫グロブリン抗体（またはその抗原結合断片もしくは複合体）は、成人対象に対して、用量０．２～３ｇの範囲で、週２回～３週間に１回、任意選択で週１回、２または３週間ごと、さらに任意選択で３週間に１回投与され、任意選択で、該対象は、少なくとも５回投与される。特定の実施形態では、上記のレジメンは、進行性固形腫瘍を有する患者を治療するために使用される。特定の実施形態では、上記のレジメンは、転移性または再発性の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者を治療するために使用される。特定の実施形態では、上記のレジメンは、転移性または再発性の頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を有する患者を治療するために使用される。特定の実施形態では、上記のレジメンは、再発性または進行性の肝細胞癌（ＨＣＣ）、ＣＲＣ、または結腸癌を有し、任意選択で、ソラフェニブ単剤またはＰＤ－１もしくはＰＤＬ１の阻害剤との併用が失敗した患者を治療するために使用され、例えば、該がんは、ソラフェニブ単剤またはＰＤ－１もしくはＰＤＬ１の阻害剤との併用に耐性を有する。特定の実施形態では、上記のレジメンは、転移性または再発性の卵巣癌を有し、任意選択で少なくとも２つの以前の療法に失敗した患者を治療するために使用され、例えば、該がんは、少なくとも２つの以前の療法に耐性を有する。特定の実施形態では、上記のレジメンは、転移性または再発性の子宮頸癌を有し、任意選択で少なくとも２つの以前の療法に失敗した患者を治療するために使用され、例えば、該がんは、少なくとも２つの以前の療法に耐性を有する。特定の実施形態では、上記のレジメンは、以前の化学療法（例えば、カルボプラチン及びパクリタキセル）に失敗した患者を治療するために使用され、例えば、該がんは、化学療法（例えば、カルボプラチン及びパクリタキセル）に耐性を有する。特定の実施形態では、上記のレジメンは、放射線療法と、ＰＤ－１またはＰＤＬ１の阻害剤による療法の組み合わせに失敗した患者を治療するために使用され、例えば、該がんは、放射線療法と、ＰＤ－１またはＰＤＬ１の阻害剤による療法の組み合わせに耐性を有する。特定の実施形態では、上記のレジメンは、化学療法と、放射線療法及びＰＤ－１またはＰＤＬ１の阻害剤による療法の組み合わせに失敗した患者を治療するために使用され、例えば、該がんは、化学療法と、放射線療法及びＰＤ－１またはＰＤＬ１の阻害剤による療法の組み合わせに耐性を有する。
特定の実施形態では、上記のレジメンは、以前の化学療法（例えば、カルボプラチン／パクリタキセルまたはカルボプラチン／プレメトレキセド）及び／またはＰＤ－（Ｌ）－１阻害剤療法に失敗した、非扁平上皮組織構造を有しかつ進行性／再発性の疾患を有するＮＳＣＬＣ患者を治療するために使用され、例えば、該がんは、以前の化学療法（例えば、カルボプラチン／パクリタキセルまたはカルボプラチン／プレメトレキセド）及び／またはＰＤ－（Ｌ）－１阻害剤療法に耐性を有する。特定の実施形態では、以前のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤療法が失敗した、ＥＧＦＲが変異したがんを有する患者が治療され、例えば、該がんは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤療法に耐性を有する。特定の実施形態では、以前のＡＬＫ阻害剤療法が失敗した、ＡＬＫが転座したがんを有する患者が治療され、例えば、該がんは、ＡＬＫ阻害剤療法に耐性を有する。
特定の実施形態では、上記のレジメンは、組織学的に確認された、治療不能、局所進行性、再発性及び／または転移性のＨＮＳＣＣを治療するために使用される。患者は、以前の白金含有レジメンに失敗した（例えば、該がんは、白金含有レジメンに耐性を有する）、及び／または治癒を目的としたさらなる放射線療法または外科的療法の候補者ではない可能性がある。
特定の実施形態では、上記のレジメンは、進行性でありかつ以前のソラフェニブ療法が失敗した肝細胞癌を治療するために使用され、例えば、該がんは、ソラフェニブに耐性を有する。特定の実施形態では、上記のレジメンは、以前の白金ベースの療法に失敗した再発性または進行性の子宮頸癌を有する患者を治療するために使用され、例えば、該がんは、白金ベースの療法に耐性を有する。特定の実施形態では、上記のレジメンは、白金含有全身療法後に進行した卵巣癌を治療するために使用される。
特定の実施形態では、本明細書に提供する治療方法はさらに、化学療法剤及び免疫チェックポイント阻害剤で対象を治療することを含む。特定の実施形態では、該免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤＬ１、または細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）の阻害剤である。
本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または抗体－薬物複合体、またはＣＡＲを発現する細胞は、追加の療法と同時に及び／または連続的に（前及び／または後に）投与され得る。該抗体もしくはその抗原結合断片、または抗体－薬物複合体、または細胞、及び該追加の療法は、同じまたは異なる組成物中にて、同じまたは異なる投与経路によって投与され得る。第１の療法（例えば、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または該追加の療法）は、がんを有する対象に対して、第２の療法（例えば、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または該追加の療法）の投与の前、それと同時、またはその後に投与され得る。
特定の実施形態では、第１の療法（例えば、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または該追加の療法）は、がんを有する対象に対して、第２の療法（例えば、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または該追加の療法）と同じ日、同じ週、または同じ月に投与される。特定の実施形態では、第１の療法（例えば、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または該追加の療法）は、がんを有する対象に対して、第２の療法（例えば、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または該追加の療法）の投与から５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間以内に投与される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて対象に投与される追加の療法は、同じ組成物（医薬組成物）にて投与される。特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて投与される追加の療法は、対象に対して、該ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片とは異なる組成物にて投与される（例えば、２つ以上の医薬組成物が使用される）。
１．７キット
同様に本明細書に提供するのは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、本明細書に記載の抗体－薬物複合体（例えば、治療薬に結合した本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片を含む）、または本明細書に記載のｓｃＦｖを含むＣＡＲを発現する細胞を含むキットである。特定の実施形態では、本明細書に提供するのは、本明細書に記載の医薬組成物の成分のうちの１つ以上、例えば、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合断片等が充填された１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットである。特定の実施形態では、該キットは、本明細書に記載の医薬組成物及び予防薬または治療薬を含む。
同様に本明細書に提供するのは、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、本明細書に記載の抗体－薬物複合体（例えば、治療薬に結合した本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片を含む）、または本明細書に記載のｓｃＦｖを含むＣＡＲを発現する細胞を含むキットである。特定の実施形態では、本明細書に提供するのは、本明細書に記載の医薬組成物の成分のうちの１つ以上、例えば、本明細書に記載のＶＩＳＴＡに特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合断片等が充填された１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットである。特定の実施形態では、該キットは、本明細書に記載の医薬組成物及び予防薬または治療薬を含む。
任意選択でかかる容器（複数可）に加えられるのは、医薬品または生物学的製品の製造、使用、もしくは販売を規制する政府機関が定めた形式の通知、剤形、及び／またはその使用説明書であり得る。ある特定の実施形態では、該キットに含まれる説明書は、該医薬組成物（複数可）を投与するための投与量及び／または投与レジメンに関する指針を提供する。
医薬品包装材料の例としては、ブリスターパック、ボトル、パケット、サシェ、チューブ、吸入具、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジならびに選択された医薬組成物及び投与と治療の意図された様式に適した任意の包装材料が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書に提供するキットはさらに、活性成分を投与するために使用される装置を含み得る。かかる装置の例としては、シリンジ、無針注射器、点滴バッグ、パッチ、及び吸入具が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書に提供するキットはさらに、該成分を投与するために使用され得る医薬的に許容される媒体を含み得る。例えば、成分が非経口投与用に再構成する必要のある固体形態で提供される場合、該キットは、適切な媒体の密封容器を含むことができ、その中に該成分が溶解して、粒子を含まない非経口投与に適した無菌溶液を形成することが可能であるか、またはその中で該成分が経口投与用の懸濁液として再構成され得る。医薬的に許容される媒体の例としては、注射用水ＵＳＰ、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、デキストロース注射液、デキストロース及び塩化ナトリウム注射液、及び乳酸加リンガー注射液が挙げられるがこれらに限定されない水性媒体、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、及びポリプロピレングリコールが挙げられるがこれらに限定されない水混和性媒体、ならびにトウモロコシ油、綿実油、落花生油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、及び安息香酸ベンジルが挙げられるがこれらに限定されない非水性媒体が挙げられるがこれらに限定されない。
本セクションに記載する実施例は、例示のために提供される。
実施例１：ＶＩＳＴＡタンパク質に対して生成される抗体
免疫化：挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝子を担持する５匹のトランスジェニックマウス（Ｔｒｉａｎｎｉ（登録商標）マウス、ＷＯ２０１２／０１８６１０Ａ２参照）を、ヒトＶＩＳＴＡの可溶性細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（配列番号３７８）（ＶＩＳＴＡ－ＥＣＤタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のＨｉｓタグを除く）により、ＡＬＤ／ＭＤＰ（アルハイドロゲル／ムラミルジペプチド）をアジュバントとして使用して免疫化した。１０μｇの免疫原を各マウスの足蹠に週２回、４週間注射した。抗体力価は、１０００ｎｇ／ｍＬから開始する各動物の血清の１：３希釈系列を使用した酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって評価した。アジュバントを含まない１０μｇの可溶性ＶＩＳＴＡ－ＥＣＤの２回の最後の足蹠ブーストを各動物に与えた後、採取した。サクリファイス後、リンパ節（膝窩、鼠径部、腋窩、及び腸間膜）、脾臓、及び骨髄を採取した。動物組織ごとに手作業で破砕し、続いて７０μｍのメッシュフィルターを通すことによって、単細胞浮遊液を作製した。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）マウス汎Ｂ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）陰性選択キットを使用して、リンパ節及び脾臓からＢ細胞を単離し、マウスＣＤ１３８＋（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）陽性選択キットを使用して、骨髄からＢ細胞を単離した。Ｂ細胞集団を、Ｃ－Ｃｈｉｐ血球計算盤（Ｉｎｃｙｔｏ）で計数することによって定量し、トリパンブルーを使用して生存を評価した。次に細胞を、１２％ＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標）密度勾配培地（Ｓｉｇｍａ）を用いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で５，０００～６，０００細胞／ｍＬに希釈した。この細胞混合物を、マイクロ流体カプセル化に使用した。各免疫動物から約１００万個のＢ細胞をエマルション滴マイクロ流体プラットフォームを通過させた。
免疫化：挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝子を担持する５匹のトランスジェニックマウス（Ｔｒｉａｎｎｉ（登録商標）マウス、ＷＯ２０１２／０１８６１０Ａ２参照）を、ヒトＶＩＳＴＡの可溶性細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（配列番号３７８）（ＶＩＳＴＡ－ＥＣＤタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のＨｉｓタグを除く）により、ＡＬＤ／ＭＤＰ（アルハイドロゲル／ムラミルジペプチド）をアジュバントとして使用して免疫化した。１０μｇの免疫原を各マウスの足蹠に週２回、４週間注射した。抗体力価は、１０００ｎｇ／ｍＬから開始する各動物の血清の１：３希釈系列を使用した酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって評価した。アジュバントを含まない１０μｇの可溶性ＶＩＳＴＡ－ＥＣＤの２回の最後の足蹠ブーストを各動物に与えた後、採取した。サクリファイス後、リンパ節（膝窩、鼠径部、腋窩、及び腸間膜）、脾臓、及び骨髄を採取した。動物組織ごとに手作業で破砕し、続いて７０μｍのメッシュフィルターを通すことによって、単細胞浮遊液を作製した。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）マウス汎Ｂ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）陰性選択キットを使用して、リンパ節及び脾臓からＢ細胞を単離し、マウスＣＤ１３８＋（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）陽性選択キットを使用して、骨髄からＢ細胞を単離した。Ｂ細胞集団を、Ｃ－Ｃｈｉｐ血球計算盤（Ｉｎｃｙｔｏ）で計数することによって定量し、トリパンブルーを使用して生存を評価した。次に細胞を、１２％ＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標）密度勾配培地（Ｓｉｇｍａ）を用いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で５，０００～６，０００細胞／ｍＬに希釈した。この細胞混合物を、マイクロ流体カプセル化に使用した。各免疫動物から約１００万個のＢ細胞をエマルション滴マイクロ流体プラットフォームを通過させた。
重鎖と軽鎖のペアのライブラリの調製：天然の重－軽ＩｇペアがインタクトなｓｃＦｖをコードするＤＮＡライブラリを、単細胞のＲＮＡから、エマルション滴マイクロ流体プラットフォームまたはボルテックスエマルションを使用して生成した。ＤＮＡライブラリを生成する方法を、１）ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ捕捉、２）マルチプレックスオーバーラップ伸長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＯＥ－ＲＴ－ＰＣＲ）、及び３）ネステッドＰＣＲに分け、アーチファクトを除去し、ディープシーケンシングまたは酵母提示ライブラリのためのアダプターを追加した。これらのｓｃＦｖライブラリを、陽性ＥＬＩＳＡタイターを達成した５匹の各々の約４００，０００個のＢ細胞（リンパ節及び脾臓）または３０，０００個のＢ細胞（骨髄）から生成した。
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ捕捉には、カスタム設計のｃｏ－ｆｌｏｗ配置のエマルション滴マイクロ流体チップを、以前に記載された通りに使用した（Ａｓｅｎｓｉｏ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｍａｂｓ．２０１９ １１（５）：８７０－８８３参照）。このマイクロ流体チップは、オイル用の２つの流入流路、上記の細胞浮遊液混合物用の１つの流入流路、及び細胞溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、０．５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、及び２０ｍＭのジチオスレイトール）に１．２５ｍｇ／ｍｌで含まれるオリゴｄＴビーズ（ＮＥＢ）用の１つの流入流路を有する。Ｐｉｃｏ－Ｂｒｅａｋ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ）を使用して液滴からビーズを抽出した。
マルチプレックスオーバーラップ伸長リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＯＥ－ＲＴ－ＰＣＲ）には、ガラスＴｅｌｏｓ液滴エマルションマイクロ流体チップ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ）を使用した。ｍＲＮＡ結合ビーズを、鉱油ベースの界面活性剤混合物（ＧｉｇａＧｅｎ）を含むＯＥ－ＲＴ－ＰＣＲ混合物中に再懸濁した。このＯＥ－ＲＴ－ＰＣＲ混合物は、２ｘワンステップＲＴ－ＰＣＲ緩衝液、２．０ｍＭのＭｇＳＯ４、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素、及びＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に加えて、ＩｇＫ Ｃ領域、ＩｇＧ Ｃ領域、及び全Ｖ領域に対するプライマーの混合物を含む。オーバーラップ領域は、Ｇｌｙ－ＳｅｒリッチｓｃＦｖリンカー配列をコードするＤＮＡ配列であった。ＰＣＲ方法及びプライマーは、以前に記載されている通りである（Ａｄｌｅｒ ＡＳ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｒｅ，ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｔｉ－ｐａｔｈｏｇｅｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｍａｂｓ．２０１７ ９（８）：１２８２－１２９６参照）。ＤＮＡ断片を、液滴破壊溶液（ＧｉｇａＧｅｎ）を使用して液滴から回収し、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。
ネステッドＰＣＲの場合、精製したＯＥ－ＲＴ－ＰＣＲ産物を最初に１．７％アガロースゲルにて１５０Ｖで８０分間泳動させた。結合した産物に対応する１２００～１５００塩基対（ｂｐ）のバンドを切り出し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎゲル及びＰＣＲクリーンアップキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）を使用して精製した。次に、ＰＣＲを実行して、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングまたは酵母提示用のアダプターを追加した。シーケンシングでは、その後の次世代シーケンシングステップでのベースコールの精度を高めるために、７ヌクレオチドのランダマーを追加した。ネステッドＰＣＲを、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターを含むプライマーまたは酵母発現ベクターへのクローニング用のプライマーのいずれかを使用して、２ｘＮＥＢＮｅｘｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ増幅混合物（ＮＥＢ）を使用して実行した。そのネステッドＰＣＲ産物を、１．２％アガロースゲルにて１５０Ｖで５０分間泳動させた。８０～１１００ｂｐのバンドを切り出し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎゲル及びＰＣＲクリーンアップキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）を使用して精製した。
ＦＡＣＳ分析用の抗原調製：ヒトＩｇＧ１－Ｆｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＶＩＳＴＡ－ＥＣＤ－Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）タンパク質を、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｍｉｃｒｏ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してビオチン化した。このビオチン化試薬を９ｍＭに再懸濁し、５０倍モル過剰でそのタンパク質に添加した。この反応物を氷上で２時間インキュベートし、その後、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してそのビオチン化試薬を除去した。最終タンパク質濃度をブラッドフォードアッセイで計算した。
酵母ライブラリのスクリーニング：酵母提示ＤＮＡスクリーニングライブラリを以前に記載された通りに調製した（Ａｄｌｅｒ ＡＳ ｅｔ ａｌ．Ｒａｒｅ，ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｔｉ－ｐａｔｈｏｇｅｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｍａｂｓ．２０１７ ９（８）：１２８２－１２９６．参照）。ＧＡＬ１／１０プロモーター、Ａｇａ２細胞壁テザー、及びＣ末端ｃ－Ｍｙｃタグを含む酵母表面提示ベクター（ｐＹＤ）を構築した。このＧＡＬ１／１０プロモーターは、ガラクトースを含む培地中でｓｃＦｖタンパク質の発現を誘導する。このＡｇａ２細胞壁テザーは、ｓｃＦｖを酵母細胞表面に運び、そのｓｃＦｖを細胞外空間に繋ぐために必要とした。このｃ－Ｍｙｃタグは、インフレームｓｃＦｖタンパク質を発現する酵母細胞を染色するために流動選別の過程で使用した。インビボでの相同組み換えのために、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞（ＡＴＣＣ）をゲル精製ネステッドＰＣＲ産物及び線状化ｐＹＤベクターでエレクトロポレーションした（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ、０．５４ｋＶ、２５ｕＦ、抵抗を無限大に設定）。形質転換細胞を増殖させ、ガラクトースで誘導して、酵母ｓｃＦｖ提示ライブラリを生成した。
拡張したｓｃＦｖライブラリからの２００万個の酵母細胞を、抗ｃ－Ｍｙｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ２１２８１）及びＡＦ４８８結合二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ１１０３９）で染色した。ＶＩＳＴＡ－ＥＣＤに結合するｓｃＦｖ発現細胞を選択するために、一次抗体のインキュベーション中にビオチン化ＶＩＳＴＡ－ＥＣＤ抗原をその酵母培養物に添加し（最終２５０ｎＭ）、その後ＰＥ－ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。酵母細胞を、ＢＤ Ｉｎｆｌｕｘ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｓｈａｒｅｄ ＦＡＣＳ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で二重陽性細胞（ＡＦ４８８＋／ＰＥ＋）について流動選別し、回収したクローンを、カナマイシン、ストレプトマイシン、及びペニシリン（Ｔｅｋｎｏｖａ）とともにＳＤ－ＣＡＡプレートにプレーティングして増殖させた。次いで、増殖した第１回のＦＡＣＳクローンを、同じモル濃度（最終２５０ｎＭ）の同じ抗原で第２回のＦＡＣＳに供した。プラスミドミニプレップ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、最終ＦＡＣＳ選別から回収した酵母から調製した。テールドエンド（Ｔａｉｌｅｄ－ｅｎｄ）ＰＣＲを使用して、ディープシーケンシング用のＩｌｌｕｍｉｎａアダプターをプラスミドライブラリに追加した。
ディープレパートリーシーケンシング：定量的ＰＣＲ Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリ定量化キット（ＫＡＰＡ）を使用して抗体ディープシーケンシングライブラリを定量化し、１７．５ｐＭに希釈した。ライブラリを、製造業者の指示に従って、５００サイクルＭｉＳｅｑ試薬キットｖ２を使用してＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上でシーケンシングした。重鎖と軽鎖の結合が維持された高品質のシーケンスリードを得るために、シーケンシングを２回の別々のランで行った。第１のラン（「連結ラン」）では、ｓｃＦｖライブラリを直接シーケンシングして、軽鎖Ｖ遺伝子及びＣＤＲ３の３４０サイクルのフォワードリード、ならびに重鎖ＣＤＲ３及び重鎖Ｖ遺伝子の一部を網羅する１６２サイクルのリバースリードを得た。第２のラン（「非連結ラン」）では、ｓｃＦｖライブラリを最初にＰＣＲの鋳型として使用し、重鎖及び軽鎖のＶ遺伝子を別々に増幅した。次に、重鎖及び軽鎖Ｉｇの２５１サイクルの重複するフォワードリード及びリバースリードを別々に得た。
ベースコールエラーを除去するために、リードの予想エラー数（Ｅ）をそのＰｈｒｅｄスコアから計算した。デフォルトでは、Ｅ＞１のリードは破棄され、ベースコールエラーの最確数が０であるリードが残る。２回以上見つかった配列は高確率で正しいため、追加の品質フィルターとして、シングルトンヌクレオチドのリードを破棄した。最後に、連結ラン及び非連結ランからフィルタリングされた配列を統合することによって、高品質の連結された抗体配列を生成した。
リーディングフレーム及びＦＲ／ＣＤＲ接合部を特定するために、十分にキュレートされた免疫グロブリン配列のデータベース（Ｌｅ Ｆｒａｎｃ ＭＰ，ｅｔ ａｌ．ＩＭＧＴ，ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１９ ３７：Ｄ１００６－１００１２）を最初に処理して、ＦＲ／ＣＤＲ接合部ごとに位置特異的配列マトリックス（ＰＳＳＭ）を生成した。これらのＰＳＳＭを、上記のプロセスを使用して生成された統合されたヌクレオチド配列ごとにＦＲ／ＣＤＲ接合部を同定するために使用した。これにより、ヌクレオチド配列ごとにタンパク質リーディングフレームが同定された。リードには有効な予測ＣＤＲ３配列が必要であるため、例えば、ＶセグメントとＪセグメントの間にフレームシフトがあるリードは破棄された。次に、これらのｓｃＦｖヌクレオチド配列をクエリとして使用し、ＩＭＧＴデータベースからのＶ及びＪ遺伝子配列を参照配列として使用して、ＵＢＬＡＳＴを実行した。最低のＥ値のＵＢＬＡＳＴアラインメントを使用して、Ｖ及びＪ遺伝子ファミリーを割り当て、生殖系列に対する％ＩＤを計算した。
酵母ライブラリのＦＡＣＳ濃縮とその後の配列データ分析により、１０７個の固有のｓｃＦｖ配列が同定された。ペアワイズアラインメントを使用して、ＣＤＲ３配列の類似性に基づいてｓｃＦｖ配列をクレードにクラスター化した。全長ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体を、同定されたｓｃＦｖ配列から再フォーマットした。
実施例２：ＨＥＫ２９３細胞におけるモノクローナル抗体の産生及び特性評価
モノクローナル抗ＶＩＳＴＡ抗体を、ＨＥＫ２９３細胞で産生した。抗体ごとに配列をコドン最適化し、ｐｃＤＮＡ３．４のＥｃｏ ＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ部位にクローニングした。各重鎖及び軽鎖配列を別々にクローニングした。トランスフェクショングレードのプラスミドＤＮＡは、標準的な方法に従って調製した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）細胞を、無血清Ｅｘｐｉ２９３発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ）内で、８％ＣＯ２中３７℃にて、オービタルシェーカーに載せて増殖させた。トランスフェクションの１日前に、細胞を最適密度（３ｘ１０６細胞／ｍＬ）で播種し、翌日、製造業者が推奨する条件に従って市販のトランスフェクション試薬（Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を使用して抗体ＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの約１６～１８時間後、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ １及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２を各フラスコに添加し、トランスフェクトされた培養物を６日間インキュベートした後に採取した。細胞培養ブロスを、細胞ペレットの遠心分離後に培地を濾過することによって回収した。小規模生産の場合、抗体を４つのカラムのうちの１つ、すなわち、ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ Ｅｓｈｍｕｎｏ Ａ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＰｒｅＤｉｃｔｏｒ ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（Ｃｙｔｉｖａ／ＧＥ）、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（Ｃｙｔｉｖａ／ＧＥ）、またはＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸ（Ｃｙｔｉｖａ／ＧＥ）の培養上清から精製した。これらのカラムを使用して製造業者の推奨に従って抗体を精製し、得られた溶出液を、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４に緩衝液交換した。サンプルのタンパク質濃度については２８０ｎｍでの吸光度によって分析し、純度についてはＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ＬＡＬエンドトキシンアッセイキット（Ｂｉｏｅｎｄｏ）を使用してエンドトキシンレベルを評価した。
モノクローナル抗ＶＩＳＴＡ抗体を、ＨＥＫ２９３細胞で産生した。抗体ごとに配列をコドン最適化し、ｐｃＤＮＡ３．４のＥｃｏ ＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ部位にクローニングした。各重鎖及び軽鎖配列を別々にクローニングした。トランスフェクショングレードのプラスミドＤＮＡは、標準的な方法に従って調製した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）細胞を、無血清Ｅｘｐｉ２９３発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ）内で、８％ＣＯ２中３７℃にて、オービタルシェーカーに載せて増殖させた。トランスフェクションの１日前に、細胞を最適密度（３ｘ１０６細胞／ｍＬ）で播種し、翌日、製造業者が推奨する条件に従って市販のトランスフェクション試薬（Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を使用して抗体ＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの約１６～１８時間後、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ １及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２を各フラスコに添加し、トランスフェクトされた培養物を６日間インキュベートした後に採取した。細胞培養ブロスを、細胞ペレットの遠心分離後に培地を濾過することによって回収した。小規模生産の場合、抗体を４つのカラムのうちの１つ、すなわち、ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ Ｅｓｈｍｕｎｏ Ａ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＰｒｅＤｉｃｔｏｒ ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（Ｃｙｔｉｖａ／ＧＥ）、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（Ｃｙｔｉｖａ／ＧＥ）、またはＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸ（Ｃｙｔｉｖａ／ＧＥ）の培養上清から精製した。これらのカラムを使用して製造業者の推奨に従って抗体を精製し、得られた溶出液を、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４に緩衝液交換した。サンプルのタンパク質濃度については２８０ｎｍでの吸光度によって分析し、純度についてはＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ＬＡＬエンドトキシンアッセイキット（Ｂｉｏｅｎｄｏ）を使用してエンドトキシンレベルを評価した。
より大きなベンチスケール生成物（最大５００ｍＬの培地）は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸ及びＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラムを使用して精製し、上記の通りに純度及びタンパク質濃度を評価した。さらに、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）またはヤギ抗ヒトカッパ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を使用したウェスタンブロット、及び０．１ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＳＯ４を含む０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液ｐＨ６．７で分解するＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌ ７．８Ｘ３００ｍｍカラムでのＳＥＣ－ＨＰＬＣによってサンプル純度を測定した。
実施例３：ＣＨＯ細胞におけるモノクローナル抗体の産生及び特性評価
ＣＨＯ細胞で抗体を産生するためのＤＮＡプラスミドは、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｍａｘｉキット（カタログ番号１２３６２）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｈｉｇｈ（ＨＰ）Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｆｒｅｅ Ｍａｘｉプラスミド精製キット（カタログ番号ＮＡ０４１０）、またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｅｘｐｉ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ－Ｆｒｅｅ Ｍａｘｉプラスミド精製キット（カタログ番号Ａ３１２１７）を使用して、Ｅ ｃｏｌｉ ＤＨ５．アルファの終夜培養物から調製した。プラスミドＤＮＡは、キットごとに製造業者の推奨に従って調製した。プラスミドＤＮＡを１３ｍｍｘ０．２２μｍのフィルター（Ｆｏｘｘ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号３７１－２１１５）を使用して滅菌濾過した。ＤＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ発現細胞株は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号 Ａ２９１３３）から購入した。Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ細胞を、三角振盪フラスコで、ＥｘｐｉＣｈｏ発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ）中、３７℃、８％ＣＯ２にて１２５ＲＰＭで振盪しながら、最大細胞密度４～６ｘ１０６細胞／ｍＬまで増殖させた。所定の細胞集団の拡大の場合、細胞培養物を０．１～０．５ｘ１０６細胞／ｍＬに希釈した。細胞を、抗体重鎖及び軽鎖の各々からの０．５μｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡを用いて６ｘ１０６細胞／ｍＬの密度でトランスフェクトした。トランスフェクションの１日後、ＥｘｐｉＣＨＯエンハンサーを培養物に添加し、その後の増殖のために細胞を３２℃及び５％ＣＯ２に移した。ＥｘｐｉＣＨＯエンハンサーをトランスフェクションの５日後に再度添加し、生存率が≦７５％になるまで同じ条件で細胞を増殖させ、その時点で培養物を採取した。
ＣＨＯ細胞で抗体を産生するためのＤＮＡプラスミドは、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｍａｘｉキット（カタログ番号１２３６２）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｈｉｇｈ（ＨＰ）Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｆｒｅｅ Ｍａｘｉプラスミド精製キット（カタログ番号ＮＡ０４１０）、またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｅｘｐｉ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ－Ｆｒｅｅ Ｍａｘｉプラスミド精製キット（カタログ番号Ａ３１２１７）を使用して、Ｅ ｃｏｌｉ ＤＨ５．アルファの終夜培養物から調製した。プラスミドＤＮＡは、キットごとに製造業者の推奨に従って調製した。プラスミドＤＮＡを１３ｍｍｘ０．２２μｍのフィルター（Ｆｏｘｘ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号３７１－２１１５）を使用して滅菌濾過した。ＤＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ発現細胞株は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号 Ａ２９１３３）から購入した。Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ細胞を、三角振盪フラスコで、ＥｘｐｉＣｈｏ発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ）中、３７℃、８％ＣＯ２にて１２５ＲＰＭで振盪しながら、最大細胞密度４～６ｘ１０６細胞／ｍＬまで増殖させた。所定の細胞集団の拡大の場合、細胞培養物を０．１～０．５ｘ１０６細胞／ｍＬに希釈した。細胞を、抗体重鎖及び軽鎖の各々からの０．５μｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡを用いて６ｘ１０６細胞／ｍＬの密度でトランスフェクトした。トランスフェクションの１日後、ＥｘｐｉＣＨＯエンハンサーを培養物に添加し、その後の増殖のために細胞を３２℃及び５％ＣＯ２に移した。ＥｘｐｉＣＨＯエンハンサーをトランスフェクションの５日後に再度添加し、生存率が≦７５％になるまで同じ条件で細胞を増殖させ、その時点で培養物を採取した。
ＣＨＯ細胞を遠心分離により除去し、培養上清を０．２μｍフィルターで濾過した。モノクローナル抗体を、ＰＲＯｃｈｉｅｖＡ組み換えプロテインＡ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、カタログ番号ＪＴ７８９９）を使用したＧＥ ＡＫＴＡ ＦＰＬＣによって培地から精製した。このプロテインＡカラムは、２０ｍＭの一塩基性ＮａＰＯ４ ｐＨ７．４（ＥＭＤカタログ番号ＳＸ－０７１０－３）で平衡化した。細胞培養上清をこのカラムに載せ、プロテインＡ樹脂を２０ｍＭの一塩基性ＮａＰＯ４ ｐＨ７．４で洗浄し、結合した抗体を０．１０Ｍクエン酸ｐＨ３．０（ＥＭＤ、カタログ番号１．００２４２．０５００）で溶出した。抗体溶出画分を収集し、５分の１体積の１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ９．０（ＪＴ Ｂａｋｅｒ、カタログ番号４１０３－０１）で中和した。精製抗体を含む画分を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターユニット（カタログ番号ＵＦＣ９０５０２４）またはＰＢＳ ｐＨ７．４に対する透析のいずれかで緩衝液交換した。
精製抗体を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、還元及び非還元条件下、１ｍｍの４～１２％プレキャストＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて、ＭＥＳ泳動緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で電気泳動することによって評価した。ゲルをクーマシーブルーで染色し、画像化した。精製抗体はまた、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって２２０ｎｍにて、Ｔｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムで、移動相として０．２Ｍのリン酸ナトリウムｐＨ６．７を使用して評価した。エンドトキシン汚染は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｅｎｄｏｓａｆｅ ＰＴＳ１００を使用して測定した。
実施例４：Ｏｃｔｅｔを使用した抗体親和性の特定
Ｏｃｔｅｔスカウティング：抗体親和性を、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）システムのバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して測定した。抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）ｄｉｐ ａｎｄ ｒｅａｄセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のいずれかとしてフォーマットされ、ＰＢＳ ｐＨ７．４で２０μｇ／ｍＬに希釈された各抗ＶＩＳＴＡ抗体を捕捉した。ＡＨＣセンサーを抗体溶液に１８０秒間浸漬して、センサーに各ＩｇＧを捕捉した。初期ベースラインは、各センサーをＰＢＳ ｐＨ７．４にさらに１２０秒間浸すことによって確立した。初期の親和性スクリーニングは、Ｈｉｓタグ付き組み換えＶＩＳＴＡ－ＥＣＤ（Ｍｅｔ１からＡｌａ１９４）をＨＥＫ２９３細胞（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）で発現させ、ＰＢＳ ｐＨ７．４で５０ｎＭ～３００ｎＭに希釈して行った。ヒト、カニクイザル、及びマウスのＶＩＳＴＡ－ＥＣＤを評価した。試験は、ＶＩＳＴＡ－ＥＣＤとの２４０秒間の結合、及びＰＢＳ ｐＨ７．４中での３６０秒間の解離によって実施した。データ分析を、Ｏｃｔｅｔデータ分析ソフトウェアバージョン９．０．０．１４を使用して実行した。一般に、生データ処理には、減算を行わないベースラインアラインメントを使用した。Ｓａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙデジタルフィルターを使用して高周波ノイズを除去し、処理されたデータを１：１結合モデルにグローバルフィットさせた。結合が存在する場合、各抗体－抗原ペアの親和性定数（ＫＤ）を計算した。
Ｏｃｔｅｔスカウティング：抗体親和性を、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）システムのバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して測定した。抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）ｄｉｐ ａｎｄ ｒｅａｄセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のいずれかとしてフォーマットされ、ＰＢＳ ｐＨ７．４で２０μｇ／ｍＬに希釈された各抗ＶＩＳＴＡ抗体を捕捉した。ＡＨＣセンサーを抗体溶液に１８０秒間浸漬して、センサーに各ＩｇＧを捕捉した。初期ベースラインは、各センサーをＰＢＳ ｐＨ７．４にさらに１２０秒間浸すことによって確立した。初期の親和性スクリーニングは、Ｈｉｓタグ付き組み換えＶＩＳＴＡ－ＥＣＤ（Ｍｅｔ１からＡｌａ１９４）をＨＥＫ２９３細胞（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）で発現させ、ＰＢＳ ｐＨ７．４で５０ｎＭ～３００ｎＭに希釈して行った。ヒト、カニクイザル、及びマウスのＶＩＳＴＡ－ＥＣＤを評価した。試験は、ＶＩＳＴＡ－ＥＣＤとの２４０秒間の結合、及びＰＢＳ ｐＨ７．４中での３６０秒間の解離によって実施した。データ分析を、Ｏｃｔｅｔデータ分析ソフトウェアバージョン９．０．０．１４を使用して実行した。一般に、生データ処理には、減算を行わないベースラインアラインメントを使用した。Ｓａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙデジタルフィルターを使用して高周波ノイズを除去し、処理されたデータを１：１結合モデルにグローバルフィットさせた。結合が存在する場合、各抗体－抗原ペアの親和性定数（ＫＤ）を計算した。
場合によっては、抗ペンタ－Ｈｉｓ（ＨＩＳ１Ｋ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）センサーにＶＩＳＴＡ－ＥＣＤを捕捉し、固定化されたＶＩＳＴＡ－ＥＣＤに対する抗ＶＩＳＴＡ抗体の結合カイネティクスを測定することにより、親和性ではなくアビディティを測定した。
抗体ごとの代表的なデータを図１Ａ～１Ｎ、２Ａ～２Ｇ及び３Ａ～３Ｇならびに表１４及び表１５に示す。複数の独立した実験からのデータを、各表の個別の行として表す。各抗体は、ヒト及びカニクイザルの両ＶＩＳＴＡ－ＥＣＤに対して低ｎＭの親和性で強力に結合した。どの抗体もマウスＶＩＳＴＡ－ＥＣＤへの測定可能な結合を示さず、マウスのＫＤ値は計算されなかった。二価抗体で予想されたように、Ｏｃｔｅｔフォーマットを逆にすると、アビディティは親和性よりも大きくなった。
Ｏｃｔｅｔアッセイにおけるリガンドローディングレベルの影響は、結合ステップで０．２及び０．６ｎｍのシグナルシフトをもたらす条件下で評価した。一般に、センサーへのリガンドローディング濃度が減少すると、ＫＤ値は２～３分の１に低くなる。
ｐＨが抗体親和性に与える影響：細胞表面に発現したＶＩＳＴＡと一致して、ｐＨ７．４でＶＩＳＴＡに結合するが、エンドソームのｐＨで受容体から解離する抗体を同定するために、Ｏｃｔｅｔを、リガンド結合をｐＨ７．４で測定し、解離をｐＨ６で測定して行った。表１６は、ｐＨ７．４での７つの抗体の平均Ｋｏｎ（１／Ｍｓ）及びＫｄｉｓ（１／ｓ）を、一回の実験で同じ抗体のオンレート（ｐＨ７．４）及びオフレート（ｐＨ６）と比較して示している。結果を表に示す。いくつかの抗体の解離定数はｐＨ６で増加し、これらの抗体がｐＨ７．４では細胞表面に発現したＶＩＳＴＡにしっかりと結合するが、ｐＨ＜６ではエンドソームのＶＩＳＴＡから解離することが示唆される。
全動態分析：結合親和性の全動態分析を、分析物濃度０～５００ｎＭの２倍段階希釈にわたってＯｃｔｅｔシステムを使用してＢＬＩによって行った。平衡結合定数を、Ｏｃｔｅｔシステムデータ分析ソフトウェアの定常状態分析ツールを使用して計算した。分析は、０．０５＜Ｒｅｑ＜０．５ｎｍの結合トレースに対して行った。この方法で推定された抗体結合親和性を図４Ａ～４Ｇ及び表１７に示すが、これはＯｃｔｅｔスカウティング試験と一致している。
実施例５：ＥＬＩＳＡによる抗体親和性の特定
ニッケルコーティングされた９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＭａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、４℃にて、５０μＬの０．５～１μｇ／ｍＬのＨｉｓタグ付きＶＩＳＴＡタンパク質（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＨＥ２９３細胞で産生されるＭｅｔ１～Ａｌａ１９４）を含む０．１ＭのＮａＨＣＯ３ ｐＨ９．６溶液で終夜コーティングした。その後のすべてのインキュベーションは、室温で行った。ウェルをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０）で３回洗浄し、５％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ２００μＬで２時間ブロックした。抗ＶＩＳＴＡ抗体を０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで２～２３μｇ／ｍＬに希釈し、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで１０～０．００３μｇ／ｍＬの５倍段階希釈液を作成した。各抗体希釈液をＥＬＩＳＡプレートにて５０～１００μＬ／ウェルで１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１：２０，０００希釈のビオチンＳＰ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、５０～１００μＬ／ウェル）とともに１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、プレートを１：２００希釈のストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）５０～１００μＬとともに３０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μＬの１ステップＵｌｔｒａ Ｆａｓｔ ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２分間発色させた。反応を１００μＬの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止させ、プレートウェルの４５０ｎｍの吸光度を測定した（Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬｘ８０８）。
ニッケルコーティングされた９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＭａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、４℃にて、５０μＬの０．５～１μｇ／ｍＬのＨｉｓタグ付きＶＩＳＴＡタンパク質（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＨＥ２９３細胞で産生されるＭｅｔ１～Ａｌａ１９４）を含む０．１ＭのＮａＨＣＯ３ ｐＨ９．６溶液で終夜コーティングした。その後のすべてのインキュベーションは、室温で行った。ウェルをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０）で３回洗浄し、５％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ２００μＬで２時間ブロックした。抗ＶＩＳＴＡ抗体を０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで２～２３μｇ／ｍＬに希釈し、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで１０～０．００３μｇ／ｍＬの５倍段階希釈液を作成した。各抗体希釈液をＥＬＩＳＡプレートにて５０～１００μＬ／ウェルで１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１：２０，０００希釈のビオチンＳＰ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、５０～１００μＬ／ウェル）とともに１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、プレートを１：２００希釈のストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）５０～１００μＬとともに３０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μＬの１ステップＵｌｔｒａ Ｆａｓｔ ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２分間発色させた。反応を１００μＬの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止させ、プレートウェルの４５０ｎｍの吸光度を測定した（Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬｘ８０８）。
ヒトＶＩＳＴＡ結合データについては、対数変換された用量反応データの非線形回帰からＥＣ５０値を計算した。図５Ａ～５Ｄは、ヒトＶＩＳＴＡに対する抗ＶＩＳＴＡ抗体ごとの用量反応ＥＬＩＳＡデータを示し、表１８は、関連するＥＣ５０値を提供する。すべての抗体は、ＥＬＩＳＡによりヒトＶＩＳＴＡへの強力な結合を示し、ナノモルＥＣ５０が低かった。
サル及びマウスのＶＩＳＴＡ結合については、１、２、または２３μｇ／ｍＬで単一終点決定を行った。表１９は、ヒト、サル、及びマウスＶＩＳＴＡにおける抗体ごとの終点吸光度を示している。この方法では、すべての抗体がヒトおよびサルＶＩＳＴＡに同等に結合する。２３μｇ／ｍＬであっても、マウスＶＩＳＴＡに対して感知できるほどの結合を示す抗体はない。
実施例６：ＥＬＩＳＡによる抗体親和性の特定
ニッケルコーティングされた９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＭａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、４℃にて、５０μＬの０．５～１μｇ／ｍＬのＨｉｓタグ付きＶＩＳＴＡタンパク質（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＨＥ２９３細胞で産生されるＭｅｔ１～Ａｌａ１９４）を含む０．１ＭのＮａＨＣＯ３ ｐＨ９．６溶液で終夜コーティングした。その後のすべてのインキュベーションは、室温で行った。ウェルをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０）で３回洗浄し、５％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ２００μＬで２時間ブロックした。抗ＶＩＳＴＡ抗体を０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで２～２３μｇ／ｍＬに希釈し、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで１０μｇ／ｍＬ～０．０５ｎｇ／ｍＬの３．５～５倍段階希釈液を作成した。各抗体希釈液をＥＬＩＳＡプレートにて１時間インキュベート（５０～１００μＬ／ウェル）した後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１：２０，０００希釈のビオチンＳＰ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、５０～１００μＬ／ウェル）とともに１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、プレートを１：２００希釈のストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）５０～１００μＬとともに３０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μＬの１ステップＵｌｔｒａ Ｆａｓｔ ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１．５～２分間発色させた。反応を１００μＬの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止させ、プレートウェルの４５０ｎｍの吸光度を測定した（ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒマイクロプレートリーダー）。
ニッケルコーティングされた９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＭａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、４℃にて、５０μＬの０．５～１μｇ／ｍＬのＨｉｓタグ付きＶＩＳＴＡタンパク質（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＨＥ２９３細胞で産生されるＭｅｔ１～Ａｌａ１９４）を含む０．１ＭのＮａＨＣＯ３ ｐＨ９．６溶液で終夜コーティングした。その後のすべてのインキュベーションは、室温で行った。ウェルをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０）で３回洗浄し、５％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ２００μＬで２時間ブロックした。抗ＶＩＳＴＡ抗体を０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで２～２３μｇ／ｍＬに希釈し、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで１０μｇ／ｍＬ～０．０５ｎｇ／ｍＬの３．５～５倍段階希釈液を作成した。各抗体希釈液をＥＬＩＳＡプレートにて１時間インキュベート（５０～１００μＬ／ウェル）した後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１：２０，０００希釈のビオチンＳＰ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、５０～１００μＬ／ウェル）とともに１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、プレートを１：２００希釈のストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）５０～１００μＬとともに３０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μＬの１ステップＵｌｔｒａ Ｆａｓｔ ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１．５～２分間発色させた。反応を１００μＬの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止させ、プレートウェルの４５０ｎｍの吸光度を測定した（ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒマイクロプレートリーダー）。
ヒトＶＩＳＴＡ結合データについては、対数変換された用量反応データの非線形回帰からＥＣ５０値を計算した。図５Ｅ、５Ｆは、ヒトＶＩＳＴＡに対する抗ＶＩＳＴＡ抗体ごとの用量反応ＥＬＩＳＡデータを示し、表２０は、関連するＥＣ５０値を提供する。すべての抗体は、ＥＬＩＳＡによりヒトＶＩＳＴＡへの強力な結合を示し、ナノモルＥＣ５０が低かった。
実施例７：ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、またはｐＨ７．４でのＥＬＩＳＡによる抗体親和性の特定
Ｍａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、４℃にて、１００μＬの０．５μｇ／ｍＬのＨｉｓタグ付きＶＩＳＴＡタンパク質（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＨＥ２９３細胞で産生されるＭｅｔ１～Ａｌａ１９４）を含む０．１ＭのＮａＨＣＯ３ ｐＨ９．６溶液で終夜コーティングした。その後のすべてのインキュベーションは、室温で行った。ウェルをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０）で３回洗浄し、５％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ２００μＬで２時間ブロックした。抗ＶＩＳＴＡ抗体を０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで１０００ｎｇ／ｍＬに希釈し、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで１０００ｎｇ／ｍＬ～０．１６ｎｇ／ｍＬの２．４倍段階希釈液をｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、またはｐＨ７．４で作成した。各抗体希釈液をＥＬＩＳＡプレートにて１時間インキュベート（１００μＬ／ウェル）した後、プレートをｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、またはｐＨ７．４のＰＢＳＴで３回洗浄し、１：２０，０００希釈のビオチンＳＰ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１００μＬ／ウェル）とともにｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、またはｐＨ７．４で１時間インキュベートした。ウェルをｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、またはｐＨ７．４のＰＢＳＴで３回洗浄し、プレートを１：２００希釈のストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）１００μＬとともにｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、またはｐＨ７．４で３０分間インキュベートした。ウェルをｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、またはｐＨ７．４のＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μＬの１ステップＵｌｔｒａ Ｆａｓｔ ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１．５分間発色させた。反応を１００μＬの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止させ、プレートウェルの４５０ｎｍの吸光度を測定した（ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒマイクロプレートリーダー）。図５Ｇ～５Ｉは、異なるｐＨでのヒトＶＩＳＴＡに対する抗ＶＩＳＴＡ抗体ごとの用量反応ＥＬＩＳＡデータを示し、表２１は、関連するＥＣ５０値を提供する。すべての抗体は、ＥＬＩＳＡによりヒトＶＩＳＴＡへの強力な結合を示し、すべてのｐＨでナノモルＥＣ５０は低く、ｐＨ６．０で結合の低下が観察された。酸性ｐＨでの結合の低下は、抗体番号１５０．１でより顕著である。
Ｍａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、４℃にて、１００μＬの０．５μｇ／ｍＬのＨｉｓタグ付きＶＩＳＴＡタンパク質（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＨＥ２９３細胞で産生されるＭｅｔ１～Ａｌａ１９４）を含む０．１ＭのＮａＨＣＯ３ ｐＨ９．６溶液で終夜コーティングした。その後のすべてのインキュベーションは、室温で行った。ウェルをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０）で３回洗浄し、５％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ２００μＬで２時間ブロックした。抗ＶＩＳＴＡ抗体を０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで１０００ｎｇ／ｍＬに希釈し、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで１０００ｎｇ／ｍＬ～０．１６ｎｇ／ｍＬの２．４倍段階希釈液をｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、またはｐＨ７．４で作成した。各抗体希釈液をＥＬＩＳＡプレートにて１時間インキュベート（１００μＬ／ウェル）した後、プレートをｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、またはｐＨ７．４のＰＢＳＴで３回洗浄し、１：２０，０００希釈のビオチンＳＰ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１００μＬ／ウェル）とともにｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、またはｐＨ７．４で１時間インキュベートした。ウェルをｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、またはｐＨ７．４のＰＢＳＴで３回洗浄し、プレートを１：２００希釈のストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）１００μＬとともにｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、またはｐＨ７．４で３０分間インキュベートした。ウェルをｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、またはｐＨ７．４のＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μＬの１ステップＵｌｔｒａ Ｆａｓｔ ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１．５分間発色させた。反応を１００μＬの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止させ、プレートウェルの４５０ｎｍの吸光度を測定した（ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒマイクロプレートリーダー）。図５Ｇ～５Ｉは、異なるｐＨでのヒトＶＩＳＴＡに対する抗ＶＩＳＴＡ抗体ごとの用量反応ＥＬＩＳＡデータを示し、表２１は、関連するＥＣ５０値を提供する。すべての抗体は、ＥＬＩＳＡによりヒトＶＩＳＴＡへの強力な結合を示し、すべてのｐＨでナノモルＥＣ５０は低く、ｐＨ６．０で結合の低下が観察された。酸性ｐＨでの結合の低下は、抗体番号１５０．１でより顕著である。
実施例８：抗ＶＩＳＴＡ抗体の結合特異性
ＥＬＩＳＡを使用して、抗ＶＩＳＴＡ抗体のＢ７タンパク質ファミリーの関連メンバーへの結合能力を評価した。次のｈｉｓタグ付きＢ７タンパク質のオフターゲット結合について評価した：ＣＤ８０／Ｂ７－１、ＣＤ８６／Ｂ７－２、ＩＣＯＳ／Ｂ７－Ｈ２、ＰＤ－Ｌ１／Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－ＤＣ／ＰＤ－Ｌ２／ＣＤ２７３、Ｂ７－Ｈ４／Ｂ７Ｓ１／Ｂ７ｘ、及びＢ７－Ｈ３／ＣＤ２７６（すべてＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ製）。Ｍａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、０．１ＭのＮａＨＣＯ３ ｐＨ９．６の２μｇ／ｍＬ溶液５０μＬ／ウェルにて、各Ｂ７ファミリーメンバータンパク質で４℃にて終夜、または３７℃にて１時間コーティングした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、５％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ２００μＬで室温にて２時間ブロックした。さらに洗浄した後、一次抗体を室温で１時間、各プレートに結合させた。抗ＶＩＳＴＡ抗体は、１０μｇ／ｍＬで結合させた。以下の対照抗体を、１：２０００または１：１００００希釈で使用した：抗ＣＤ８０／Ｂ７－１抗体、マウスｍＡｂ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、カタログ番号１０６９８－ＭＭ０１）、抗ＣＤ８６／Ｂ７－２抗体、マウスｍＡｂ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、カタログ番号１０６９９－ＭＭ０２）、抗ＩＣＯＳ／Ｂ７－Ｈ２抗体、マウスｍＡｂ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、カタログ番号１１５５９－ＭＭ０７）、抗ＰＤ－Ｌ１／Ｂ７－Ｈ１抗体、マウスｍＡｂ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、カタログ番号１００８４－ＭＭ３７）、抗Ｂ７－ＤＣ／ＰＤ－Ｌ２／ＣＤ２７３抗体、ウサギｍＡｂ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓカタログ番号１０２９２－Ｒ０１８）、抗Ｂ７－Ｈ４／Ｂ７Ｓ１／Ｂ７ｘ抗体、ウサギｐＡｂ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、カタログ番号１０７３８－Ｔ２４）、抗Ｂ７－Ｈ３／ＣＤ２７６抗体、マウスｍＡｂ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、カタログ番号１１１８８－Ｍ００８）及びＵｌｔｒａ－ＬＥＡＦ（商標）精製ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。一次抗体をデカントし、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、１：１００００希釈（５０μＬ）ＨＲＰ結合抗マウス、抗ヒト、または抗ウサギＩｇＧとともに室温で１時間インキュベートした。さらに洗浄した後、プレートを１００μＬの１ステップＵｌｔｒａ ＴＭＢ基質で室温にて２分間発色させた。ＶＩＳＴＡ以外のＢ７タンパク質ファミリーのメンバーに結合した抗ＶＩＳＴＡ抗体はなかった（図６Ａ～６Ｈ）。
ＥＬＩＳＡを使用して、抗ＶＩＳＴＡ抗体のＢ７タンパク質ファミリーの関連メンバーへの結合能力を評価した。次のｈｉｓタグ付きＢ７タンパク質のオフターゲット結合について評価した：ＣＤ８０／Ｂ７－１、ＣＤ８６／Ｂ７－２、ＩＣＯＳ／Ｂ７－Ｈ２、ＰＤ－Ｌ１／Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－ＤＣ／ＰＤ－Ｌ２／ＣＤ２７３、Ｂ７－Ｈ４／Ｂ７Ｓ１／Ｂ７ｘ、及びＢ７－Ｈ３／ＣＤ２７６（すべてＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ製）。Ｍａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、０．１ＭのＮａＨＣＯ３ ｐＨ９．６の２μｇ／ｍＬ溶液５０μＬ／ウェルにて、各Ｂ７ファミリーメンバータンパク質で４℃にて終夜、または３７℃にて１時間コーティングした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、５％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ２００μＬで室温にて２時間ブロックした。さらに洗浄した後、一次抗体を室温で１時間、各プレートに結合させた。抗ＶＩＳＴＡ抗体は、１０μｇ／ｍＬで結合させた。以下の対照抗体を、１：２０００または１：１００００希釈で使用した：抗ＣＤ８０／Ｂ７－１抗体、マウスｍＡｂ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、カタログ番号１０６９８－ＭＭ０１）、抗ＣＤ８６／Ｂ７－２抗体、マウスｍＡｂ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、カタログ番号１０６９９－ＭＭ０２）、抗ＩＣＯＳ／Ｂ７－Ｈ２抗体、マウスｍＡｂ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、カタログ番号１１５５９－ＭＭ０７）、抗ＰＤ－Ｌ１／Ｂ７－Ｈ１抗体、マウスｍＡｂ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、カタログ番号１００８４－ＭＭ３７）、抗Ｂ７－ＤＣ／ＰＤ－Ｌ２／ＣＤ２７３抗体、ウサギｍＡｂ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓカタログ番号１０２９２－Ｒ０１８）、抗Ｂ７－Ｈ４／Ｂ７Ｓ１／Ｂ７ｘ抗体、ウサギｐＡｂ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、カタログ番号１０７３８－Ｔ２４）、抗Ｂ７－Ｈ３／ＣＤ２７６抗体、マウスｍＡｂ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、カタログ番号１１１８８－Ｍ００８）及びＵｌｔｒａ－ＬＥＡＦ（商標）精製ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。一次抗体をデカントし、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、１：１００００希釈（５０μＬ）ＨＲＰ結合抗マウス、抗ヒト、または抗ウサギＩｇＧとともに室温で１時間インキュベートした。さらに洗浄した後、プレートを１００μＬの１ステップＵｌｔｒａ ＴＭＢ基質で室温にて２分間発色させた。ＶＩＳＴＡ以外のＢ７タンパク質ファミリーのメンバーに結合した抗ＶＩＳＴＡ抗体はなかった（図６Ａ～６Ｈ）。
実施例９：細胞表面ＶＩＳＴＡに結合する抗体。
種間結合：抗体を、ＣＨＯ Ｋ１細胞で安定して発現されるヒト、マウス及びカニクイザルＶＩＳＴＡに結合する能力について評価した。ＶＩＳＴＡ発現ＣＨＯ細胞株を、選択下で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＦ－１２Ｋ培地（ＡＴＣＣ）中でコンフルエントになるまで増殖させた。細胞を組織培養フラスコから、室温でＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて剥離し、１０％ＦＢＳを含むＦ１２－Ｋ培地で希釈し、冷ＰＢＳで洗浄した。細胞浮遊液を最終濃度１．５ｘ１０６細胞／ｍＬまで希釈し、マイクロタイタープレートのウェルあたり１００μＬを分注した。細胞を遠心分離によりペレット化し、固定可能なｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｎＩＲ染色剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の１：１０００希釈液５０μＬに氷上で３０分間再懸濁した。細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液（４％ＦＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で希釈し、遠心分離によって回収し、ＦＡＣＳ染色緩衝液で０．０５、１、または１５０ｎＭに希釈した５０μＬの抗ＶＩＳＴＡ抗体中、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ染色緩衝液を含むＰＢＳの漸進的希釈液（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ）で洗浄し、ＦＡＣＳ染色緩衝液で１：２００に希釈した二次抗体（ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）５０μＬに再懸濁し、続いて氷上で３０分間インキュベートした。細胞を以前の通りに洗浄し、５０μＬの冷ＰＢＳに再懸濁し、１５０μＬのＣｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を添加して室温で５分間反応させた。細胞を遠心分離によって収集し、ＰＢＳに再懸濁した。サンプルデータをＡｔｔｕｎｅ ＮＸＴフローサイトメーターで収集した。
種間結合：抗体を、ＣＨＯ Ｋ１細胞で安定して発現されるヒト、マウス及びカニクイザルＶＩＳＴＡに結合する能力について評価した。ＶＩＳＴＡ発現ＣＨＯ細胞株を、選択下で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＦ－１２Ｋ培地（ＡＴＣＣ）中でコンフルエントになるまで増殖させた。細胞を組織培養フラスコから、室温でＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて剥離し、１０％ＦＢＳを含むＦ１２－Ｋ培地で希釈し、冷ＰＢＳで洗浄した。細胞浮遊液を最終濃度１．５ｘ１０６細胞／ｍＬまで希釈し、マイクロタイタープレートのウェルあたり１００μＬを分注した。細胞を遠心分離によりペレット化し、固定可能なｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｎＩＲ染色剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の１：１０００希釈液５０μＬに氷上で３０分間再懸濁した。細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液（４％ＦＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で希釈し、遠心分離によって回収し、ＦＡＣＳ染色緩衝液で０．０５、１、または１５０ｎＭに希釈した５０μＬの抗ＶＩＳＴＡ抗体中、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ染色緩衝液を含むＰＢＳの漸進的希釈液（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ）で洗浄し、ＦＡＣＳ染色緩衝液で１：２００に希釈した二次抗体（ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）５０μＬに再懸濁し、続いて氷上で３０分間インキュベートした。細胞を以前の通りに洗浄し、５０μＬの冷ＰＢＳに再懸濁し、１５０μＬのＣｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を添加して室温で５分間反応させた。細胞を遠心分離によって収集し、ＰＢＳに再懸濁した。サンプルデータをＡｔｔｕｎｅ ＮＸＴフローサイトメーターで収集した。
図７Ａ～７Ｃは、ヒト、サル及びマウスＶＩＳＴＡを１５０ｎＭ、１ｎＭ及び０．０５ｎＭで安定に発現するＣＨＯ細胞に結合する抗ＶＩＳＴＡ抗体からの平均蛍光強度を示す。抗体は、サル及びヒトＶＩＳＴＡに対して強力な結合を示した。これらの細胞株のＭＦＩレベルは、すべての抗体濃度において種間でほぼ同等である。マウスＶＩＳＴＡに対して有意な結合を示す抗体はない。
多点滴定：その表面にヒトＶＩＳＴＡを安定して発現するＣＨＯ Ｋ１細胞を増殖させ、採取し、一定範囲の濃度（０．００６、０．０２４、０．０９８、０．３９１、１．５６３、６．２５、２５、及び１００ｎＭ）にわたって抗ＶＩＳＴＡ抗体で上記の通りに標識した。データを収集し、Ｌｏｇ ＭＦＩ対Ｌｏｇ抗体濃度として表した。変換されたデータを非線形回帰によってフィットさせ（図８Ａ～８Ｒ）、下記表（表２２）に示す通り、ＥＣ５０値を計算した。
実施例１０：抗ＶＩＳＴＡ抗体のエピトープマッピング。
Ｏｃｔｅｔビニング試験：エピトープマッピングを、ＯｃｔｅｔシステムのＢＬＩによって実行した。ＡＨＣセンサーを使用して、１００秒にわたって抗ＶＩＳＴＡ抗体（２０μｇ／ｍＬ）を捕捉した。センサー上の未結合部位は、飽和量（５０μｇ／ｍＬ）のプールされた精製ヒトＩｇＧで１８０秒間ブロックした。抗原（１００ｎＭのｈｉｓタグ付きヒトＶＩＳＴＡ－ＥＣＤ）を固定化抗体に１８０秒間結合させ、その後、ペアの抗体がサンドイッチ形式で抗原に結合する能力についてセンサーを調べた。各抗体が少なくとも１回この形式で捕捉抗体として使用されるように、複数のペア配置を調査した。データは、二次抗体のレスポンス（ｎｍ）として表される。抗体ＶＳＴＢ－１７４（国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／２０７７１７Ａ８号に記載）を対照抗体として使用した。これらのデータは、ＢＬＩビニング技術を使用してこれらの抗体の各々が同じエピトープビンに結合することを明らかにする。データを以下の表２３に表す。
Ｏｃｔｅｔビニング試験：エピトープマッピングを、ＯｃｔｅｔシステムのＢＬＩによって実行した。ＡＨＣセンサーを使用して、１００秒にわたって抗ＶＩＳＴＡ抗体（２０μｇ／ｍＬ）を捕捉した。センサー上の未結合部位は、飽和量（５０μｇ／ｍＬ）のプールされた精製ヒトＩｇＧで１８０秒間ブロックした。抗原（１００ｎＭのｈｉｓタグ付きヒトＶＩＳＴＡ－ＥＣＤ）を固定化抗体に１８０秒間結合させ、その後、ペアの抗体がサンドイッチ形式で抗原に結合する能力についてセンサーを調べた。各抗体が少なくとも１回この形式で捕捉抗体として使用されるように、複数のペア配置を調査した。データは、二次抗体のレスポンス（ｎｍ）として表される。抗体ＶＳＴＢ－１７４（国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／２０７７１７Ａ８号に記載）を対照抗体として使用した。これらのデータは、ＢＬＩビニング技術を使用してこれらの抗体の各々が同じエピトープビンに結合することを明らかにする。データを以下の表２３に表す。
エピトープマッピング試験：ペプチドマッピング試験を使用して、抗体２４５．１、４６５．１、及びＶＳＴＢ－１７４へのヒトＶＩＳＴＡの結合を媒介する線状エピトープを同定した。ＥＬＩＳＡを使用して、マイクロタイタープレートに固定化された全長ＶＩＳＴＡ－ＥＣＤへの抗体の結合をブロックする、ヒトＶＩＳＴＡ由来の連続重複１５量体合成ペプチドの能力を測定した。ニッケルでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートをＢＳＡでブロックし、０．５μｇ／ｍＬのＶＩＳＴＡタンパク質（ヒト組み換え、ＨＥＫ２９３細胞で産生、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）と室温で１時間結合させた。抗ＶＩＳＴＡ抗体を、そのＥＣ５０濃度の２倍に希釈し、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳＴの２μｇ／ｍＬまたは２０μｇ／ｍＬのいずれかのペプチド溶液と１：１の比で室温にて３０分間プレインキュベートした。ペプチド結合抗体溶液（５０μＬ）を各マイクロタイターウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、標準ＥＬＩＳＡに関する上記の通りに処理した。データは、ペプチド溶液とのプレインキュベーションなしで得られたＥＬＩＳＡシグナルの減少パーセントとして表される。抗体結合を３３％以上減少させたペプチドは、潜在的なエピトープとして同定された（表２４）。
アミノ酸配列６６ＨＬＨＨＧ７０（配列番号３８０のアミノ酸９８～１０２）及び１１６ＶＶＥＩＲＨＨＨＳＥＨＲ１２７（配列番号３８０のアミノ酸１４８～１５９）を有する抗体２４５．１及び４６５．１について、この分析によって２つの同一の結合エピトープが同定された（付番は、成熟型ポリペプチドの最初のアミノ酸から始まるヒトＶＩＳＴＡ（配列番号３８０）の残基を示す）。これらの同じペプチド配列は、ＶＳＴＢ－１７４について同定された線状エピトープ内に含まれていると思われる。
抗体エピトープの突然変異解析：ヒトＶＩＳＴＡの３つのアミノ酸（Ｒ５４、Ｆ６２、及びＱ６３）が、ＶＳＴＢ－１７４の密接に関連した類似体であるＶＳＴＢ－１１２のＶＩＳＴＡタンパク質への結合に主に関与していることが以前に報告されている（Ｍｅｈｔａ，Ｎ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｆ Ｖ－ｄｏｍａｉｎ Ｉｇ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｔ．（２０１９）２８（１０）：Ｐ２５０９－２５１６参照）。本明細書に記載の抗体がＶＳＴＢ－１７４と同一のエピトープに結合するかどうかを判断するために、ＶＩＳＴＡ－ＥＣＤにおいてこれら３つのアミノ酸の各々をアラニンに置換し、Ｆｃ複合体（ｈＶＩＳＴＡ ＥＣＤ－Ｆｃ Ｒ５４Ａ、Ｆ６２Ａ、Ｑ６３Ａ、配列番号３８２）として発現されるこの三重変異体タンパク質への抗体の結合を測定した。ＥＬＩＳＡを使用して、本質的に上記の通り、野生型及び変異型ＶＩＳＴＡに対する抗体結合を測定した。ＶＩＳＴＡ－Ｆｃ（５μｇ／ｍＬ）をＭａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに固定化し、標準的なＥＬＩＳＡ形式で１０μｇ／ｍＬに希釈した各抗体と反応させた。結合データを、４５０ｎｍでの吸光度として報告した。
ＶＳＴＢ－１７４は、三重ＶＩＳＴＡ－Ｆｃ変異体に結合しなかった。抗体番号４６５．１は、変異型ＶＩＳＴＡへの結合の低下（野生型の約２５％）を示し、４６５．１とＶＳＴＢ－１７４の間で部分的に重複するエピトープが示唆された（下記表２５参照）。抗体番号２６９．１、３２１．１、２４５．１、４５７．１、１７３．１及び８３３．１の結合は変異による影響を受けず、これらの抗体がＶＳＴＢ－１７４とは異なるエピトープに結合することが示唆された。
抗体のビニング、ペプチドマッピング及び突然変異解析の組み合わせに基づいて、調べた抗体は空間的に近いが、ＶＳＴＢ－１７４及び関連する抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。
ＥＬＩＳＡによる抗体エピトープの突然変異解析
抗ＶＩＳＴＡ抗体のそのエピトープへの結合を、ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインの様々な変異を通じて評価した。様々な変異の付番は、シグナルペプチドを除いたＶＩＳＴＡ－ＥＣＤに対応する。ＶＩＳＴＡ－ＥＣＤでは、各変異アミノ酸をアラニンに置換し、Ｆｃ結合型として発現させた。以下の抗体番号：４７４．１（ＷＴ）、１５０．１（ＹＴＥ）、８５、８７、９１、９２、及びＶＳＴＢ１７４を評価し、変異型とＷＴのＶＩＳＴＡ ＥＣＤ間で比較した。ＥＬＩＳＡを使用して抗体結合を測定した。ＶＩＳＴＡ－Ｆｃ（３μｇ／ｍＬ）をＭａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに固定化し、１００ｕｇ／ｍＬ～０．００３ｕｇ／ｍＬで滴定された各抗体と反応させ、ビオチン化抗ヒトＩｇ軽鎖カッパに続いてストレプトアビジン－ＨＲＰ及びＴＭＢ基質を使用して検出した。結合は、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒプレートリーダーを使用して４５０ｎｍの光学密度を測定した。ＶＩＳＴＡ－ＥＣＤ変異体（Ｒ５４Ａ、Ｆ６２Ａ及びＱ６３Ａ）は、ＶＳＴＢ１７４に結合せず、抗体番号８７及び９１への結合の減少を示した（表２７、図８Ｓ～８Ｙ）。抗体番号１５０．１、４７４．１、８５及び９２の結合は、この三重変異による影響を受けなかった（表２６～２７、図８Ｓ～８Ｙ）。ＶＩＳＴＡ－ＥＣＤ変異体２．３（Ｙ３７Ａ、Ｖ１１７Ａ、Ｒ１２７Ａ）は、抗体番号１５０．１、４７４．１、８５、８７、９１、９２及びＶＳＴＢ１７４に対する結合の低下を示した（表２６～２７、図８Ｓ～８Ｙ）。ＶＳＴＢ１７４の結合は、この三重変異による影響が最も少なかった。二重ＶＩＳＴＡ－ＥＣＤ変異体１０．１（Ｒ５４Ａ、Ｒ１２７Ａ）は、抗体番号１５０．１、４７４．１、８５、８７、９１、９２及びＶＳＴＢ１７４に対する結合の低下を示した（表２６～２７、図８Ｓ～８Ｙ）。ＶＳＴＢ１７４の結合は、この二重変異による影響が最も少なかった。
抗ＶＩＳＴＡ抗体のそのエピトープへの結合を、ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインの様々な変異を通じて評価した。様々な変異の付番は、シグナルペプチドを除いたＶＩＳＴＡ－ＥＣＤに対応する。ＶＩＳＴＡ－ＥＣＤでは、各変異アミノ酸をアラニンに置換し、Ｆｃ結合型として発現させた。以下の抗体番号：４７４．１（ＷＴ）、１５０．１（ＹＴＥ）、８５、８７、９１、９２、及びＶＳＴＢ１７４を評価し、変異型とＷＴのＶＩＳＴＡ ＥＣＤ間で比較した。ＥＬＩＳＡを使用して抗体結合を測定した。ＶＩＳＴＡ－Ｆｃ（３μｇ／ｍＬ）をＭａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに固定化し、１００ｕｇ／ｍＬ～０．００３ｕｇ／ｍＬで滴定された各抗体と反応させ、ビオチン化抗ヒトＩｇ軽鎖カッパに続いてストレプトアビジン－ＨＲＰ及びＴＭＢ基質を使用して検出した。結合は、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒプレートリーダーを使用して４５０ｎｍの光学密度を測定した。ＶＩＳＴＡ－ＥＣＤ変異体（Ｒ５４Ａ、Ｆ６２Ａ及びＱ６３Ａ）は、ＶＳＴＢ１７４に結合せず、抗体番号８７及び９１への結合の減少を示した（表２７、図８Ｓ～８Ｙ）。抗体番号１５０．１、４７４．１、８５及び９２の結合は、この三重変異による影響を受けなかった（表２６～２７、図８Ｓ～８Ｙ）。ＶＩＳＴＡ－ＥＣＤ変異体２．３（Ｙ３７Ａ、Ｖ１１７Ａ、Ｒ１２７Ａ）は、抗体番号１５０．１、４７４．１、８５、８７、９１、９２及びＶＳＴＢ１７４に対する結合の低下を示した（表２６～２７、図８Ｓ～８Ｙ）。ＶＳＴＢ１７４の結合は、この三重変異による影響が最も少なかった。二重ＶＩＳＴＡ－ＥＣＤ変異体１０．１（Ｒ５４Ａ、Ｒ１２７Ａ）は、抗体番号１５０．１、４７４．１、８５、８７、９１、９２及びＶＳＴＢ１７４に対する結合の低下を示した（表２６～２７、図８Ｓ～８Ｙ）。ＶＳＴＢ１７４の結合は、この二重変異による影響が最も少なかった。
ヒトＶＩＳＴＡの３つのアミノ酸（Ｒ５４、Ｆ６２、及びＱ６３）が、ＶＳＴＢ－１７４の密接に関連した類似体であるＶＳＴＢ－１１２のＶＩＳＴＡタンパク質への結合に主に関与していることが以前に報告されている（Ｍｅｈｔａ，Ｎ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｆ Ｖ－ｄｏｍａｉｎ Ｉｇ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｔ．（２０１９）２８（１０）：Ｐ２５０９－２５１６参照）。抗体番号１５０．１、４７４．１、８５及び９２の結合は影響を受けず、これらの抗体が、ＶＳＴＢ－１７４について報告されている別のエピトープに結合することが示唆された。これらのデータを総合すると、抗体番号１５０．１及び抗体番号４７４．１は、ＶＳＴＢ１７４とは異なるエピトープに結合し、抗体番号１５０．１及び抗体番号４７４．１によって認識されるこのエピトープ内の主要なアミノ酸は、配列番号３７７のチロシン３７、アルギニン５４、バリン１１７及びアルギニン１２７であることが示される。
実施例１１：ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）のヒトＴ細胞活性化アッセイにおける抗ＶＩＳＴＡ Ｍａｂのインビトロ機能特性評価
抗ＶＩＳＴＡ ｍＡｂ（すべてのＩｇＧ１及び一部のＩｇＧ４）の有効性を、ＳＥＢヒトＴ細胞活性化アッセイで評価した。簡潔には、ＳＥＢアッセイでは、１人の健康なドナーに由来するヒトＰＢＭＣを細菌スーパー抗原（５ｎｇ／ｍｌのＳＥＢ）とインキュベートする。これが抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面のＭＨＣクラスＩＩタンパク質をＴ細胞上でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に直接連結させ、Ｔ細胞の活性化に続いてＩＦＮγサイトカインの分泌を引き起こし、これを４日後に定量的に測定する。ＩＦＮγは、ＮＫ細胞によっても分泌される可能性があるため、ＮＫ細胞枯渇ＰＢＭＣをアッセイに使用してバックグラウンドシグナルを低減し、レスポンスのダイナミックレンジを改善した。アイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ４ ｍＡｂを、それぞれのアッセイで陰性対照として使用した。ｍＡｂを、３μｇ／ｍｌの飽和濃度でスクリーニングした。
抗ＶＩＳＴＡ ｍＡｂ（すべてのＩｇＧ１及び一部のＩｇＧ４）の有効性を、ＳＥＢヒトＴ細胞活性化アッセイで評価した。簡潔には、ＳＥＢアッセイでは、１人の健康なドナーに由来するヒトＰＢＭＣを細菌スーパー抗原（５ｎｇ／ｍｌのＳＥＢ）とインキュベートする。これが抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面のＭＨＣクラスＩＩタンパク質をＴ細胞上でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に直接連結させ、Ｔ細胞の活性化に続いてＩＦＮγサイトカインの分泌を引き起こし、これを４日後に定量的に測定する。ＩＦＮγは、ＮＫ細胞によっても分泌される可能性があるため、ＮＫ細胞枯渇ＰＢＭＣをアッセイに使用してバックグラウンドシグナルを低減し、レスポンスのダイナミックレンジを改善した。アイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ４ ｍＡｂを、それぞれのアッセイで陰性対照として使用した。ｍＡｂを、３μｇ／ｍｌの飽和濃度でスクリーニングした。
健康なドナー由来のＰＢＭＣを、３７℃のウォーターバスで解凍した。細胞を室温にて、１５００ｒｐｍで５分間ペレット化し、細胞培地で洗浄した後、計数した。次いで、細胞をＥａｓｙＳｅｐ培地に１Ｅ８細胞／ｍｌで再懸濁し、５ｍｌのポリスチレン丸底チューブに移した。ＥａｓｙＳｅｐ ＮＫ選択キットを使用して、ＮＫ細胞の枯渇を次のように行った。選択カクテル（サンプル（細胞）の１００μｌ／ｍｌ）を添加し、混合し、室温で６分間インキュベートした後、ＲａｐｉｄＳｐｈｅｒｅｓ（サンプル（細胞）の１００μｌ／ｍｌ）を添加した。この混合物を室温で６分間インキュベートした後、ＥａｓｙＳｅｐ培地で最終体積を２．５ｍｌにした。次に、このチューブを蓋をせずにマグネットに配し、室温で６分間インキュベートした。マグネットに入ったチューブを倒し、上清を新たなチューブにあけた。この上清をマグネットに戻し、室温で６分間インキュベートした。次いでマグネットに入ったチューブを倒し、あけられた上清を新たな１５ｍｌのポリプロピレン製コニカルチューブに回収した。これは、細胞培地で最終体積１２ｍｌにしたＮＫ枯渇ＰＢＭＣサブセットに相当する。細胞を室温にて、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そのペレットを、５ｍｌの細胞培地に再懸濁した後、計数した。最後に、ＳＥＢ活性化アッセイに備えた細胞培地に細胞を２Ｅ６細胞／ｍｌで再懸濁した。このために、ウェルあたり１００μｌの細胞（２×１０５細胞／ウェル）を９６ウェルのＵ底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号３７９９）に添加し、条件を３連で行った。濃度１２μｇ／ｍＬ（４倍）の試験Ａｂを含む５０μｌの細胞培地を加えて、最終試験Ａｂ濃度を３μｇ／ｍＬとした。調べたＡｂの用量調整のために、次の最終濃度を調製し、室温で２０分間インキュベートした：３０、３、０．３、０．０３μｇ／ｍｌ。次に、最終ＳＥＢ濃度が５ｎｇ／ｍＬとなるように２０ｎｇ／ｍＬ（４倍）の濃度でＳＥＢ抗原を含む細胞培地５０μＬをウェルごとに添加し、その後３７℃、５％ＣＯ２で４日間インキュベートした。次に、室温で１５００ｒｐｍ、５分間の遠心分離後に上清を回収し、製造業者の指示に従って、ＰｒｏＱｕａｎｔｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒカタログ番号Ａ３５５７６５）またはＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号８８－７３１６－８８）を使用して、ＩＦＮγ産生について分析した。
結論として、抗体番号２６９．１、抗体番号３２１．１、抗体番号２４５．１、抗体番号４７４．１、抗体番号１５０．１、抗体番号４６５．１、抗体番号４５７．１、抗体番号１７３．１、及び抗体番号８３３．１は、ＳＥＢ誘発ヒトＴ細胞活性化アッセイで有効性を実証し、用量依存的にヒトＴ細胞活性化を増強する。ＩｇＧ１のＦｃ骨格は、ＳＥＢ誘発ヒトＴ細胞活性化アッセイにおいて、ＩｇＧ４のＦｃ骨格よりも有効である（図９～１７）。
実施例１２：Ｔ細胞活性化アッセイにおける抗ＶＩＳＴＡ Ｍａｂのインビトロ機能特性評価
このアッセイでは、ＶＩＳＴＡ処理細胞におけるＴ細胞増殖を回復する抗ＶＩＳＴＡ抗体の能力をフローサイトメトリーによって評価し、ＥＬＩＳＡを使用してＩＦＮγ分泌を測定することによってＴ細胞活性化を評価した。
このアッセイでは、ＶＩＳＴＡ処理細胞におけるＴ細胞増殖を回復する抗ＶＩＳＴＡ抗体の能力をフローサイトメトリーによって評価し、ＥＬＩＳＡを使用してＩＦＮγ分泌を測定することによってＴ細胞活性化を評価した。
９６ウェルの平底プレート（複数可）を、９６ウェル平底プレートの１００μｌ／ウェルで適切な抗ＣＤ３溶液、アイソタイプＡｂ、または抗ＶＩＳＴＡ抗体溶液でコーティングし、４℃で終夜インキュベートした。ＣＤ３＋汎Ｔ細胞を、ＣＴＬ Ａｎｔｉ－Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｗａｓｈを補充した温Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地中、３７℃で解凍し、計数した。細胞を４００ｇで５分間ペレット化し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ標識のためにＰＢＳに１ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅで細胞を標識するには、サンプル１ｍｌあたり５ｍＭのＶｉｏｌｅｔ １μｌ（最終濃度５μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ）を細胞に添加し、その細胞を３７℃、暗所で２０分間インキュベートした。染色をクエンチするため、５体積の１０％ＦＢＳ／培地を添加し、細胞を２０℃で５分間インキュベートした。次いで、細胞を４００ｇ、２０℃で５分間ペレット化し、Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地に２×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。
抗ＣＤ３ ＡｂでコーティングされたプレートをＰＢＳで２回洗浄し、Ａｂ（１００μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下でＶＩＳＴＡコーティングビーズを添加した後、さらに１００μｌ／ウェル（すなわち、２ｘ１０５細胞／ウェル）のＴ細胞を添加した。次いで、プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で４日間インキュベートした。次いで、ＩＦＮγ免疫アッセイ用の上清を回収し、遠心分離及び洗浄後に細胞をフローサイトメトリー分析用に回収した。
抗体番号１７３．１は、抗ＣＤ３抗体によって誘導されるヒト汎Ｔ細胞活性化のＶＩＳＴＡ媒介抑制の逆転を実証した。この抗体によるＴ細胞活性化のＶＩＳＴＡ媒介抑制の逆転は、ヒト汎Ｔ細胞がプレートに結合した抗ＣＤ３ Ａｂで刺激された場合に観察され、ＶＩＳＴＡ抑制は、ＶＩＳＴＡでコーティングされたビーズによって媒介された（ただし、ＶＩＳＴＡがプレートに結合した場合には観察されない）。抗体番号２６９．１、抗体番号３２１．１及び抗体番号４５７．１は、抗ＣＤ３ヒト汎Ｔ細胞活性化のＶＩＳＴＡ媒介抑制の逆転を実証した。抗体番号２４５．１は、抗ＣＤ３ヒト汎Ｔ細胞活性化のＶＩＳＴＡ媒介抑制の中程度の逆転を実証した（図１８Ａ～２２Ｂ）。
実施例１３：単球活性化アッセイにおける抗ＶＩＳＴＡ抗体のインビトロ機能特性評価
ヒト単球活性化の誘導における抗体の機能活性を、単球活性化機能アッセイを使用して測定した。簡潔には、１人のドナーに由来するＰＢＭＣを、同じドナー由来のＣＤ１４＋単球集団について濃縮し、その後抗ＶＩＳＴＡ ｍＡｂとともに２４時間インキュベートし、単球活性化、細胞表面活性化マーカーであるＣＤ１４＋単球上のＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８０及びＣＤ８６の上方制御、ならびにＣＸＣＬ１０ケモカイン分泌を引き起こす。本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ ｍＡｂのいくつかの機能スクリーニングを、単回投与で及び用量依存的に実施した。ＩｇＧ１対ＩｇＧ４のＦｃ骨格の役割、及びＮＫ細胞の役割もこのアッセイで評価した。
ヒト単球活性化の誘導における抗体の機能活性を、単球活性化機能アッセイを使用して測定した。簡潔には、１人のドナーに由来するＰＢＭＣを、同じドナー由来のＣＤ１４＋単球集団について濃縮し、その後抗ＶＩＳＴＡ ｍＡｂとともに２４時間インキュベートし、単球活性化、細胞表面活性化マーカーであるＣＤ１４＋単球上のＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８０及びＣＤ８６の上方制御、ならびにＣＸＣＬ１０ケモカイン分泌を引き起こす。本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ ｍＡｂのいくつかの機能スクリーニングを、単回投与で及び用量依存的に実施した。ＩｇＧ１対ＩｇＧ４のＦｃ骨格の役割、及びＮＫ細胞の役割もこのアッセイで評価した。
ＣＤ１４＋細胞の濃縮：健康なドナー由来のＰＢＭＣを解凍し、細胞を室温で、１５００ｒｐｍにて５分間の遠心分離によってペレット化した。１０ｍｌの細胞培地で洗浄した後、細胞を計数し、ＣＤ１４＋濃縮のために３００ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。１００μｌのＦｃＲブロッキング試薬を最初に添加し、その後１００ｍｌのビオチン－抗体カクテルを添加し、次いで穏やかに混合し、暗所にて氷上で１０分間インキュベートした。次に、２００μｌの抗ビオチンマイクロビーズを添加し、穏やかに混合し、室温で１５分間インキュベートした。細胞をＭＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、それらを室温にて１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、５００μｌのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁した後、適切なＭＡＣＳセパレーターの磁場にあるＬＳカラムに載せた。通過後に溶出した細胞を１５ｍｌのポリプロピレン製コニカルチューブに集めた。そのカラムをＭＡＣＳ緩衝液でさらに３回洗浄し、溶出液を集めた後、１５００ｒｐｍで５分間、室温にて遠心分離した。得られた細胞ペレットを５ｍｌの細胞培地に再懸濁して計数し、約２ｘ１０６細胞を濃縮後の染色用に保存し、１０ｘ１０６細胞を非標識共培養プレート用に保存した。これらの濃縮されたＣＤ１４＋細胞を、１ｘ１０６細胞／ｍｌでＰＢＳに再懸濁し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔで標識した。サンプル１ｍｌあたり５ｍＭのＶｉｏｌｅｔ １μｌ（最終濃度：５μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ）を添加し、細胞を３７℃、暗所で２０分間インキュベートした。染色をクエンチするために、１０％ＦＢＳを含む５体積の培地を添加し、５分間インキュベートした後、細胞を４００ｇで５分間、室温にて遠心分離した。次に、細胞を細胞培地に１ｘ１０＾６細胞／ｍｌで再懸濁した。
ＰＢＭＣの調製：同じドナー由来のＰＢＭＣを解凍し、細胞を、室温にて５分間、１５００ｒｐｍで遠心分離した後にペレット化した。１０ｍｌの細胞培地で洗浄した後、細胞を計数し、細胞培地に４ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。
５０μｌ／ウェルのＣＤ１４＋細胞（０．５ｘ１０５細胞／ウェル）を、５０μｌ／ウェルのヒトＰＢＭＣ（２ｘ１０５細胞／ウェル）に添加し、インキュベーター内の９６ウェルプレートに載せ、同時に抗体を調製した。試験抗体を最終濃度の２倍に希釈し、９６ウェルプレートに、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間に対して追加した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ標識ＣＤ１４＋濃縮細胞を含む１枚のプレートを取り分けてフローサイトメトリー分析に使用し、非標識細胞を含む第２のプレート（同じレイアウト）をＣＸＣＬ－１０分泌の測定に使用した。ＣＸＣＬ１０分泌の場合、細胞を室温にて１５００ｒｐｍで５分間ペレット化し、上清を９６ウェルプレートに移して、製造業者のプロトコルに従ってＣＸＣＬ１０ ＥＬＩＳＡを実施した。
フローサイトメトリー分析のために、５０μｌの抗ＦｃＲ抗体（ＦＡＣＳ緩衝液中最終１００μｇ／ｍｌのｈｕＩｇＧ）をウェルごとに添加し、氷上で１５分間インキュベートした。次に、細胞外染色のために、５０μｌのＡｂ混合物／ウェル（ＣＤ１４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色に対する抗体を含む）を添加し、暗所にて氷上で１５分間インキュベートした後、１０００ｇ、４℃で２分間遠心分離及び洗浄した。細胞をＡｔｔｕｎＮｅｘｔフローサイトメーターで分析した。
実験的な読み取りのために、ＣＤ１４＋細胞上の活性化マーカーＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＨＬＡ－ＤＲの上方制御を２４時間でフローサイトメトリーにより分析し、ＣＸＣＬ１０分泌を２４時間でＥＬＩＳＡにより分析した。
最初のスクリーニングでは、抗体番号２６９．１、抗体番号３２１．１、抗体番号２４５．１、抗体番号１５０．１、抗体番号４７４．１、抗体番号４６５．１、抗体番号４５７．１、抗体番号１７３．１、及び抗体番号８３３．１をそれらの有効性に基づいて選択し、さらに用量反応実験において、１００μｇ／ｍｌ～０．００３μｇ／ｍｌの範囲で試験抗ＶＩＳＴＡ抗体を特性評価した。
抗体番号２６９．１、抗体番号３２１．１、抗体番号２４５．１、抗体番号４６５．１、抗体番号４５７．１、抗体番号１７３．１、抗体番号１５０．１、抗体番号４７４．１及び抗体番号８３３．１は、ヒト単球活性化アッセイにおいて、用量依存的に有効性を示した（図２３Ａ～２３Ｄ、２４Ａ～２４Ｃ、２５Ａ～２５Ｄ、２６Ａ～２６Ｃ、２７Ａ～２７Ｃ、２８Ａ～２８Ｄ、２９Ａ～２９－Ｄ、３０Ａ～３０Ｃ、３１Ａ～３１Ｃ、３２Ａ～３２Ｃ、３３Ａ～３３Ｃ、３４Ａ～３４Ｃ、３５Ａ～３５Ｃ、３６Ａ～３６Ｉ）。
単球活性化アッセイでの媒介効果における選択されたｍＡｂのＦｃドメインの役割を評価するために、抗体番号２４５．１、抗体番号４６５．１、抗体番号４７４．１及び抗体番号１７３．１（ＩｇＧ１骨格）をそれらのＩｇＧ４骨格対応物（それぞれ、抗体番号２４５．４、抗体番号４６５．４、抗体番号２４６．４及び抗体番号１７３．４）と並行して、上記と同じプロトコルを使用した単球活性化アッセイで調べた。
単球活性化アッセイにおける抗ＶＩＳＴＡ抗体の有効性は、ＩｇＧ４ Ｆｃ骨格と比較して、ＩｇＧ１ Ｆｃ骨格で増加する（図３７ＡＤ～３７Ｆ、３８Ａ～３８Ｃ、３９Ａ～３９Ｃ）。
単球活性化アッセイでの抗ＶＩＳＴＡ抗体の媒介効果におけるＮＫ細胞の役割を評価するために、抗体番号２６９．１、抗体番号１７３．１、抗体番号１５０．１、及び抗体番号４７４．１、ならびに陰性対照の抗体番号１８．１を単球活性化アッセイで調べた。ＮＫ枯渇に備えるために、以前に記載された通りにＰＢＭＣを解凍し、遠心分離後、細胞をＥａｓｙＳｅｐ培地に１ｘ１０８細胞／ｍｌで再懸濁し、５ｍｌ（１２ｘ７５ｍｍ）のポリスチレン丸底チューブに移した。次に、５ｍｌ（１２ｘ７５ｍｍ）のポリスチレン丸底チューブに入った５０ｘ１０６細胞／５００μｌのＥａｓｙＳｅｐ培地を、選択カクテル（サンプル（細胞）の５０μｌ／ｍｌ）に加え、混合し、室温で６分間インキュベートした。次に、ＲａｐｉｄＳｐｈｅｒｅｓ（サンプル（細胞）の５０μｌ／ｍｌ））を添加し、混合し、室温で６分間インキュベートした。最終体積をＥａｓｙＳｅｐ培地で２．５ｍｌに調整した。このチューブをマグネットに配し、室温で６分間インキュベートした。マグネットに入ったチューブを倒し、上清を新たなチューブに移した。次に、この上清を含むチューブをマグネットに戻し、室温で６分間インキュベートした。マグネットに入ったチューブを倒し、上清を新たな１５ｍｌのチューブに移した。この上清は、ＮＫ枯渇ＰＢＭＣサブセットに相当する。細胞培地を最終体積１２ｍｌになるまで加え、細胞を室温にて、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その細胞ペレットを、５ｍｌの細胞培地に再懸濁した。細胞を計数し、細胞培地に４×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、９６ウェルのＵ底プレートに５０μｌ／ウェルでプレーティングし、アッセイセットアップ用の３７℃のインキュベーターに配した。
ＣＤ１４＋細胞上のＣＤ８０及びＨＬＡ－ＤＲ活性化マーカーの発現の誘導、ならびにＣＸＣＬ１０分泌の増加は、主にＮＫ細胞を含むＰＢＭＣの存在下で観察された。これらのデータは、抗ＶＩＳＴＡ抗体誘導性のヒト単球活性化にＮＫ細胞が必要であることを示唆している（図４０Ａ～４０Ｆ、４１Ａ～４１Ｉ）。
実施例１４：ＭＤＳＣ（サイトカイン誘導性）抑制アッセイにおける抗ＶＩＳＴＡ抗体のインビトロ機能特性評価
サイトカイン誘導性のＭＤＳＣの抑制機能は、抗ＣＤ３誘導性Ｔ細胞増殖（フローサイトメトリーによる）及びＩＦＮγ産生（ＥＬＩＳＡによる）を阻害するそれらの能力によって測定することができる。
サイトカイン誘導性のＭＤＳＣの抑制機能は、抗ＣＤ３誘導性Ｔ細胞増殖（フローサイトメトリーによる）及びＩＦＮγ産生（ＥＬＩＳＡによる）を阻害するそれらの能力によって測定することができる。
健康なドナー由来の全ＰＢＭＣから開始した細胞を、ＣＴＬ Ａｎｔｉ－Ａｇｇｒｅｇａｔｅを補充した温Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地中で解凍し、洗浄し、計数した。室温、４００ｇで５分間遠心分離した後、細胞を、ＧＭ－ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ６（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ１５培地に５ｘ１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。培地を２～３日ごとに、ＧＭ－ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ６（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ１５培地で更新した。ＭＤＳＣ単離に進むために、１ｍｌ／７５ｃｍ２のＤｅｔａｃｈｉｎ（非プロテアーゼ細胞剥離溶液）でこの細胞培養物から細胞を集め、３７℃で５～１０分間インキュベートした。細胞をセルスクレーパーで剥がした後、製造業者の指示に従い、ＣＤ１１ｂマイクロビーズ及びＬＳカラム分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してＣＤ１１ｂ＋細胞を単離した。最後に、ＭＤＳＣをＸ－ＶＩＶＯ１５培地１ｍｌあたり２×１０６細胞で再懸濁した。
同じドナーに由来するＰＢＭＣを解凍して計数した後、４００ｇで５分間ペレット化した。細胞を１ｘ１０６細胞／ｍｌでＰＢＳに再懸濁し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅで標識した。サンプルあたりＣｅｌｌＴｒａｃｅ １ｍｌあたり５ｍＭのＶｉｏｌｅｔ １μｌ（最終濃度：５μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ）を細胞に添加し、細胞を３７℃、暗所で２０分間インキュベートした。次いで、染色を１０％ＦＢＳを補充した５体積の培地でクエンチし、細胞を５分間インキュベートした。次いで、細胞懸濁液を２等分し、室温にて４００ｇで５分間ペレット化し、Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地中に２ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。
ＭＤＳＣプレートあたり、４μｇ／ｍｌ（プレート上の最終濃度：１μｇ／ｍＬ）の抗ＣＤ３ Ａｂ（ＨＩＴ３ａ）５０μｌを、９６ウェルのＵ底プレートの新たに解凍したＰＢＭＣに５０μｌ／ウェル（すなわち、１ｘ１０５細胞／ウェル、２ｘ１０６細胞／ｍＬ）で添加した。５０μｌ／ウェルのＭＤＳＣ（すなわち、１ｘ１０５細胞／ウェル、２ｘ１０６細胞／ｍＬ）を、同じ９６ウェルのＵ底プレートにプレーティングした。４０μｇ／ｍＬの抗体を５０μｌ／ウェルで添加した（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートした後、細胞増殖についてのフロー分析及びＩＦＮγ分泌についてのＥＬＩＳＡを実施した。
抗ＶＩＳＴＡ抗体は、抗ＣＤ３Ａｂ誘導性のＴ細胞増殖及びＩＦＮγ誘導性の分泌による活性化のＭＤＳＣ抑制の大部分を逆転させた（図４２Ａ～４６Ｂ）。
実施例１５：様々なＦｃ受容体結合アッセイにおけるＦｃ変異体の評価
この試験の目的は、Ｆｃ変異のインビボ効果の予測因子として、野生型及び様々なＩｇＧのＦｃ変異が、関連する一連のＦｃ受容体に結合する能力を評価することであった。本発明者らはまた、これらのＦｃ受容体に結合する能力について、ＩｇＧ１とＩｇＧ４の骨格を比較した。以下の抗体：抗体番号１７３．１及び抗体番号４７４．１（野生型、「ＷＴ」）、それぞれの抗体番号４２０．１及び抗体番号１５０．１（どちらもＥＵ付番に従ってＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ置換を有する）（「ＹＴＥ」）、抗体番号１７３．１と比較してＥＵ付番に従ってＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ置換を有する抗体番号２８９．１（「ＬＳ」）、抗体番号１７３．４及び抗体番号２４６．４（ＷＴ）、抗体番号４２０．４（ＹＴＥを含む）ならびに抗体番号２８９．４（ＬＳを含む）を評価し、ＶＳＴＢ１７４（ＷＴ）と、ＦｃＲｎ、ＦＣＧＲ１／ＣＤ６４、ＦＣＧＲ２ａ／ＣＤ３２ａ（１６７Ｈ）及びＦＣＧＲ２ａ／ＣＤ３２ａ（１６７Ｒ）、ならびにＦＣＧＲ３ａ／ＣＤ１６（１７６Ｐｈｅ／Ｆ１５８）及びＦＣＧＲ３ａ／ＣＤ１６ａ（１７６Ｖａｌ／Ｖ１５８）結合アッセイで比較した。以下のＡｌｐｈａＬｉｓａ結合キットを評価に使用した：
・ＦｃＲｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ＡＬ３０９５Ｃ）
・ＦｃｇＲ１／ＣＤ６４（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ＡＬ３０８１Ｃ）
・ＦｃｇＲ２Ａ／ＣＤ３２ａ（１６７Ｈ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ＡＬ３０８６Ｃ）
・ＦｃｇＲ２Ａ／ＣＤ３２ａ（１６７Ｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ＡＬ３０８７Ｃ）
・ＦｃｇＲ３Ａ／ＣＤ１６ａ（１７６Ｐｈｅ／Ｆ１５８）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ＡＬ３４７ＨＶ）
・ＦｃｇＲ３Ａ／ＣＤ１６ａ（１７６Ｖａｌ／Ｖ１５８）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ＡＬ３４８ＨＶ）
この試験の目的は、Ｆｃ変異のインビボ効果の予測因子として、野生型及び様々なＩｇＧのＦｃ変異が、関連する一連のＦｃ受容体に結合する能力を評価することであった。本発明者らはまた、これらのＦｃ受容体に結合する能力について、ＩｇＧ１とＩｇＧ４の骨格を比較した。以下の抗体：抗体番号１７３．１及び抗体番号４７４．１（野生型、「ＷＴ」）、それぞれの抗体番号４２０．１及び抗体番号１５０．１（どちらもＥＵ付番に従ってＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ置換を有する）（「ＹＴＥ」）、抗体番号１７３．１と比較してＥＵ付番に従ってＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ置換を有する抗体番号２８９．１（「ＬＳ」）、抗体番号１７３．４及び抗体番号２４６．４（ＷＴ）、抗体番号４２０．４（ＹＴＥを含む）ならびに抗体番号２８９．４（ＬＳを含む）を評価し、ＶＳＴＢ１７４（ＷＴ）と、ＦｃＲｎ、ＦＣＧＲ１／ＣＤ６４、ＦＣＧＲ２ａ／ＣＤ３２ａ（１６７Ｈ）及びＦＣＧＲ２ａ／ＣＤ３２ａ（１６７Ｒ）、ならびにＦＣＧＲ３ａ／ＣＤ１６（１７６Ｐｈｅ／Ｆ１５８）及びＦＣＧＲ３ａ／ＣＤ１６ａ（１７６Ｖａｌ／Ｖ１５８）結合アッセイで比較した。以下のＡｌｐｈａＬｉｓａ結合キットを評価に使用した：
・ＦｃＲｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ＡＬ３０９５Ｃ）
・ＦｃｇＲ１／ＣＤ６４（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ＡＬ３０８１Ｃ）
・ＦｃｇＲ２Ａ／ＣＤ３２ａ（１６７Ｈ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ＡＬ３０８６Ｃ）
・ＦｃｇＲ２Ａ／ＣＤ３２ａ（１６７Ｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ＡＬ３０８７Ｃ）
・ＦｃｇＲ３Ａ／ＣＤ１６ａ（１７６Ｐｈｅ／Ｆ１５８）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ＡＬ３４７ＨＶ）
・ＦｃｇＲ３Ａ／ＣＤ１６ａ（１７６Ｖａｌ／Ｖ１５８）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ＡＬ３４８ＨＶ）
この試験には、一般的なＦｃＲアッセイプロトコルを使用した。ＭＥＳ緩衝液を、このＦｃＲｎ結合アッセイのすべての試薬希釈に使用し、ＨｉＢｌｏｃｋ緩衝液を、ＦＣＧＲ１／ＣＤ６４、ＦＣＧＲ２ａ／ＣＤ３２ａ（１６７Ｈ）及びＦＣＧＲ２ａ／ＣＤ３２ａ（１６７Ｒ）、ならびにＦＣＧＲ３ａ／ＣＤ１６（１７６Ｐｈｅ／Ｆ１５８）及びＦＣＧＲ３ａ／ＣＤ１６ａ（１７６Ｖａｌ／Ｖ１５８）結合アッセイのすべての試薬希釈に使用した。抗ＶＩＳＴＡ抗体の段階希釈は、１ｍｇ／ｍＬで各ＩｇＧ １００μｌを含むＨｉＢｌｏｃｋまたはＭＥＳ緩衝液から開始して調製した。１２ポイントの半対数希釈を次のようにストックから調製した。
ビオチン化Ｆｃ受容体の４倍溶液を、各受容体に対する製造業者の推奨に従って調製した。ヒトＩｇＧのＦｃ結合アクセプタービーズ及びストレプトアビジンドナービーズの２倍溶液を、製造業者の推奨に従って受容体ごとに２０μｇ／ｍＬまたは４０μｇ／ｍＬのいずれかで調製し、抑えた光の下で使用まで保管した。９６ウェルの半分の領域の白色プレートに、ウェルごとに１０μｌの４倍試験抗体を添加し、次に１０μｌの４倍Ｆｃ受容体ならびに２０μｌの２倍ｈｕＩｇＧ Ｆｃ結合アクセプタービーズ及びストレプトアビジンドナービーズを添加して混合した。そのプレートを暗所にて、室温で９０分間インキュベートし、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ分光計で６８０ｎｍ／６１５ｎｍ（励起／発光）で読み取った。
これらの異なるＦｃＲ結合アッセイにおいて、本発明者らは、ＹＴＥ変異体が野生型ＩｇＧ１及び野生型ＩｇＧ４と比較してＦｃＲｎ結合において有意な改善（５～７倍）を示すことを示した。ＹＴＥ変異は、野生型ＩｇＧ１と比較して、ＦＣＧＲ１Ａへの結合の減少（４倍）、ＦＣＧＲ２Ａバリアントへの結合の減少（４～５倍）、及びＦＣＧＲ３Ａバリアントへの結合の減少（６～７倍）を示した。野生型ＩｇＧ４もまた、野生型ＩｇＧ１と比較して、ＦＣＧＲ１Ａへの結合の減少（６倍）、ＦＣＧＲ２Ａバリアントへの結合の減少（３～１４倍）、及びＦＣＧＲ３Ａバリアントへの結合の減少（＞３３倍）を示した。
ＬＳ変異体は、ＩｇＧ１とＩｇＧ４の両方について、野生型抗体と比較してＦｃＲｎ結合に有意な改善（３～４倍）を示している。ＬＳ変異体は、野生型ＩｇＧと比較してＦｃγＲ１バリアントへの結合の増加を示す。さらに、ＬＳ変異体は、野生型対照と比較してＦｃγＲ２バリアントへの結合の増加を示す。これらの変異の影響は、ＩｇＧ１型にのみ存在し、ＩｇＧ４の変異は、ＦｃγＲ２結合に影響を及ぼさない。ＬＳ変異体は、ＩｇＧ１構築物に組み込まれた場合、野生型と比較してＦｃγＲ３Ａバリアントの結合において野生型に対してほとんど変化を示さなかった。ＩｇＧ４のＬＳバリアントは、野生型と同等であった（図４７Ａ～４７Ｂ、４８Ａ～４８Ｂ、４９Ａ～４９Ｄ、５０Ａ～５０Ｄ）。
実施例１６：ＦＡＢ２Ｇバイオセンサーに結合したＶＩＳＴＡ ｍＡｂに結合するＦｃＲｎリガンドのカイネティクス
新生児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）によるリサイクリングは、リソソーム分解を防ぎ、抗体を細胞表面に戻すことにより、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の半減期を延長することができる。この試験の目的は、ＦｃＲｎ結合部位のＩｇＧ１のＦｃ特異的修飾とＦｃＲｎとの動態学的相互作用を評価することであり、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって、以前にＦｃＲｎ受容体に対してＥＬＩＳＡによって観察されたＷＴと比較してＹＴＥ変異型抗体の結合特異性が増加していることが確認された。以下のｍＡｂを比較した：ＶＳＴＢ１７４、抗体番号４７４．１（ＷＴ）及び１５０．１（ＹＴＥ）。３つの抗体と結合するＦｃＲｎのカイネティクスを、Ｏｃｔｅｔ Ｋ２（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）システムにて、ＢＬＩを使用して測定した。
新生児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）によるリサイクリングは、リソソーム分解を防ぎ、抗体を細胞表面に戻すことにより、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の半減期を延長することができる。この試験の目的は、ＦｃＲｎ結合部位のＩｇＧ１のＦｃ特異的修飾とＦｃＲｎとの動態学的相互作用を評価することであり、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって、以前にＦｃＲｎ受容体に対してＥＬＩＳＡによって観察されたＷＴと比較してＹＴＥ変異型抗体の結合特異性が増加していることが確認された。以下のｍＡｂを比較した：ＶＳＴＢ１７４、抗体番号４７４．１（ＷＴ）及び１５０．１（ＹＴＥ）。３つの抗体と結合するＦｃＲｎのカイネティクスを、Ｏｃｔｅｔ Ｋ２（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）システムにて、ＢＬＩを使用して測定した。
精製された抗体番号１５０．１、４７４．１及びＶＳＴＢ１７４を、１ｕｇ／ｍｌの濃度で抗ヒトＦａｂ－ＣＨ１（ＦＡＢ２Ｇ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）ｄｉｐ ａｎｄ ｒｅａｄバイオセンサーに１２０秒間ロードした（ローディングステップ）。ロードしたバイオセンサーを、８００、２００、５０及び０ナノモル濃度の段階希釈ＦｃＲｎ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に２４０秒間浸漬した（結合ステップ）。結合したバイオセンサーをリン酸アッセイ緩衝（ＰＡＢ、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０、ｐＨ６．０）溶液に３６０秒間浸漬した（解離ステップ）。ベースライン、結合及び解離を含めたすべてのステップをＰＡＢ（ｐＨ６．０）で実行して、ＦｃＲｎ－Ｆｃ活性の細胞内生物学を再現した。１：１グローバル曲線フィッティング分析を実行して、ＦｃＲｎ分析物のすべての濃度にわたってｋａ、ｋｄｉｓ、及びＫＤを決定した。解離の二相性曲線を、最初の１０秒間のみ分析した。データ分析を、Ｏｃｔｅｔデータ分析ソフトウェアバージョン１２．０．２．５９を使用して実行した。Ｓａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙデジタルフィルターを使用して高周波ノイズを除去した。
ｍＡｂごとに３つのセンサーグラムグラフを作成した。各ｍＡｂに対するＦｃＲｎリガンドの４つの濃度の二相性曲線は、図５０Ｅ～５０Ｇのグラフにおいて下から上に上昇する濃度が重なっていた。抗体番号１５０．１（ＹＴＥ）は、ＦｃＲｎリガンドに対して最も強い親和性を有し、４つの二相性曲線の全平均で平均ＫＤは８．４１Ｅ－０８であった。これは、野生型抗体番号４７４．１の１１倍である。結合したリガンドの量を示すことができる曲線のレスポンスもまた、抗体番号１５０．１のＦｃＲｎ修飾によって増加する。全体として、抗体番号１５０．１のＦｃＲｎ結合部位の修飾により、ＫＤ測定とレスポンス測定の両方で分析物と抗体間の相互作用の強度が向上した。この実験は、抗体番号１５０．１の半減期がインビボで延長される理由を示す。
実施例１７：ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害性）を誘導する抗ＶＩＳＴＡ Ｍａｂのインビトロ機能特性評価
抗ＶＩＳＴＡ抗体活性を、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害性）アッセイで評価した。抗体番号４６５．１、抗体番号１７３．１、抗体番号４２０．１、及び抗体番号１７３．４を調べるため、１００、３０、１０、３．０、１．０、及び０．３ｎｇ／ｍｌでの用量調整を、ＤＥＬＦＩＡ ＡＤＣＣアッセイにて、エフェクター細胞（健康なドナーのＰＢＭＣ）及び標的細胞（Ｒａｊｉ－ｈＶＩＳＴＡ細胞、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を用いて行った。
抗ＶＩＳＴＡ抗体活性を、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害性）アッセイで評価した。抗体番号４６５．１、抗体番号１７３．１、抗体番号４２０．１、及び抗体番号１７３．４を調べるため、１００、３０、１０、３．０、１．０、及び０．３ｎｇ／ｍｌでの用量調整を、ＤＥＬＦＩＡ ＡＤＣＣアッセイにて、エフェクター細胞（健康なドナーのＰＢＭＣ）及び標的細胞（Ｒａｊｉ－ｈＶＩＳＴＡ細胞、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を用いて行った。
エフェクター細胞（ヒトＰＢＭＣ）を［５０：１］比、すなわち、［エフェクター：標的］（［５ｘ１０５のＰＢＭＣ：ＢＡＴＤＡで標識された１ｘ１０４のＲａｊｉ－ｈＶＩＳＴＡ細胞］）で調製した。エフェクターヒトＰＢＭＣを、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を含むＰＢＭＣ培地中、１ｘ１０６細胞／ｍｌで終夜培養し、その後採取し、室温にて１５００ｒｐｍで５分間ペレット化した。細胞を計数し、アッセイ培地（５ｘ１０５ＰＢＭＣ／ＡＤＣＣアッセイウェル）中に５ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。Ｒａｊｉ－ｈＶＩＳＴＡ細胞を静置培養から採取し、室温にて、１５００ｒｐｍで５分間ペレット化し、計数し、４ｍｌのローディング緩衝液に４ｘ１０６個のＲａｊｉ－ｈＶＩＳＴＡ細胞で再懸濁した（１ｘ１０６／ｍｌ細胞浮遊液）。５μｌのＢＡＴＤＡを添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２０分間インキュベートした。ローディング緩衝液で洗浄した後、細胞を計数し、アッセイ培地に２ｘ１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。試験した抗体の段階希釈を５０μｌ／ウェルで調製した。バックグラウンド、自然放出、及び最大放出の条件を次のように設定した：
・バックグラウンド＝最終的な標的－ＢＡＴＤＡ浮遊液から１ｍｌの培地を取り出し、室温にて１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、（３Ｘ）５０μｌ／ウェルの「バックグラウンド上清」＋（３Ｘ）１５０μｌのアッセイ培地を適用した
・自然放出＝５０μｌ／ウェルの標的－ＢＡＴＤＡ＋１５０μｌのアッセイ培地
・最大放出量＝５０μｌ／ウェルの標的－ＢＡＴＤＡ＋１３０μｌのアッセイ培地＋２０μｌ（温）溶解緩衝液
・バックグラウンド＝最終的な標的－ＢＡＴＤＡ浮遊液から１ｍｌの培地を取り出し、室温にて１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、（３Ｘ）５０μｌ／ウェルの「バックグラウンド上清」＋（３Ｘ）１５０μｌのアッセイ培地を適用した
・自然放出＝５０μｌ／ウェルの標的－ＢＡＴＤＡ＋１５０μｌのアッセイ培地
・最大放出量＝５０μｌ／ウェルの標的－ＢＡＴＤＡ＋１３０μｌのアッセイ培地＋２０μｌ（温）溶解緩衝液
次に、標的細胞（Ｒａｊｉ－ｈＶＩＳＴＡ－ＢＡＴＤＡ）を、５０μｌ／ウェル［１ｘ１０４／ウェル］でエフェクター細胞（ＰＢＭＣ）１００μｌ／ウェル［５ｘ１０５／ウェル］とともに、最終［５０：１］比で培養した。この共培養物を、３７℃、５％ＣＯ２で２及び３時間インキュベートした。２００μｌ／ウェルのユウロピウム溶液をＤＥＬＦＩＡキット９６ウェル平底ストリップウェル読み取りプレートで調製し、ＡＤＣＣアッセイ培養プレートからの２０μｌ／ウェルの上清をそれに移し、２４０ｒｐｍのシェーカー上で室温にて１５分間インキュベートした。次に、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ ＰｌｕｓプレートリーダーでＥｕＴＤＡ蛍光を測定した。
このアッセイは、抗ＶＩＳＴＡ抗体番号４２１．１、抗体番号２４５．１、抗体番号４７５．１（ＬＳ）、抗体番号４６５．１、抗体番号４５７．１、及び抗体番号１７３．１が、Ｒａｊｉ－ｈＶＩＳＴＡ標的細胞に対するＡＤＣＣ活性を誘導することを実証した。抗体番号２４５．１及び抗体番号４７５．１（ＬＳ）は、ほぼ同一の誘導ＡＤＣＣ活性を示した。抗体番号１７３．１（ＷＴ）は、抗体番号４２０．１（ＹＴＥ）よりも誘導ＡＤＣＣ活性の割合が高く、ＥＣ５０値が低かった。抗体番号１７３．４は、抗体番号１７３．１と比較して、Ｒａｊｉ－ｈＶＩＳＴＡ標的細胞に対して低レベルの誘導ＡＤＣＣ活性を示した（図５１～５５Ａ）。
抗体番号４７４．１、１５０．１、及び２４６．４の活性を別のＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害性）アッセイで評価し、ＶＳＴＢ１７４と比較した。抗ＶＩＳＴＡ抗体（１００ｐｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ）を調べるため、用量調整を、ＡＤＣＣアッセイにて、エフェクター細胞（健康な６人のドナー由来のＰＢＭＣを２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２で３７℃にてＸ－ＶＩＶＯ－１５中、終夜処理したもの）及び標的細胞（Ｒａｊｉ－ｈＶＩＳＴＡ過剰発現細胞）を［１２：１］比で用いて行った。３７℃で４時間インキュベートした後、ＣｙｔｏＴｏｘＧｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞死を検出した。ＣｌａｒｉｏＳｔａｒ ＢＭＧプレートリーダーを使用して、相対発光単位（ＲＬＵ）を測定した。未処理の陰性対照に対する死細胞の増加倍率をプロットした。阻害曲線は、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ－Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムを使用してフィットさせた。半数効果濃度（ＥＣ５０）は、ベースラインと最大値との中間のレスポンスを誘導する抗体の濃度として定義した。（図５５Ｂ～５５Ｃ）。これらのデータは、ＶＳＴ１７４及び抗体番号４７４．１（ＷＴ）がＲａｊｉ－ｈＶＩＳＴＡ標的細胞に対して強力なＡＤＣＣ活性を誘導するのに対し、抗体番号１５０．１（ＹＴＥ）は、Ｒａｊｉ－ｈＶＩＳＴＡに対するＡＤＣＣ活性の低下を示すことを示している。
実施例１８：ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）を誘導する抗ＶＩＳＴＡ Ｍａｂのインビトロ機能特性評価
抗ＶＩＳＴＡ抗体活性を、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）アッセイで評価した。抗体番号４７４．１、抗体番号１５０．１、及び抗体番号２４６．４を調べるため、１００、１０、１．０、０．１、０．０１、及び０．００１ｎｇ／ｍｌでの用量調整を行い、ＶＳＴＢ１７４と比較した。ｈＶＩＳＴＡ－Ｒａｊｉ細胞を、白色９６ウェル平底組織培養アッセイプレートにて、１００μＬのＸ－ｖｉｖｏ培地に１００，０００細胞／ウェルの密度で播種した。抗体を、９６ウェルのＶ底ポリプロピレンプレートにてＸ－Ｖｉｖｏ－１５培地で段階希釈した。５０μＬの抗体をアッセイプレートのウェルに移した。５０μＬのヒトユニバーサルＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ）をこのアッセイプレートのウェルに添加した。各ウェルを１００ｕｌで３回混合した。次いで、アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で６時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｏｘ－Ｇｌｏ細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞をアッセイし、ＣｌａｒｉｏＳｔａｒ Ｐｌｕｓ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用してデータを読み取った。リツキシマブを陽性対照として使用した。ＶＳＴＢ１７４を除いて、調べた抗ＶＩＳＴＡ Ａｂはいずれも強いＣＤＣを誘導しなかった（図５５Ｄ）。
抗ＶＩＳＴＡ抗体活性を、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）アッセイで評価した。抗体番号４７４．１、抗体番号１５０．１、及び抗体番号２４６．４を調べるため、１００、１０、１．０、０．１、０．０１、及び０．００１ｎｇ／ｍｌでの用量調整を行い、ＶＳＴＢ１７４と比較した。ｈＶＩＳＴＡ－Ｒａｊｉ細胞を、白色９６ウェル平底組織培養アッセイプレートにて、１００μＬのＸ－ｖｉｖｏ培地に１００，０００細胞／ウェルの密度で播種した。抗体を、９６ウェルのＶ底ポリプロピレンプレートにてＸ－Ｖｉｖｏ－１５培地で段階希釈した。５０μＬの抗体をアッセイプレートのウェルに移した。５０μＬのヒトユニバーサルＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ）をこのアッセイプレートのウェルに添加した。各ウェルを１００ｕｌで３回混合した。次いで、アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で６時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｏｘ－Ｇｌｏ細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞をアッセイし、ＣｌａｒｉｏＳｔａｒ Ｐｌｕｓ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用してデータを読み取った。リツキシマブを陽性対照として使用した。ＶＳＴＢ１７４を除いて、調べた抗ＶＩＳＴＡ Ａｂはいずれも強いＣＤＣを誘導しなかった（図５５Ｄ）。
実施例１９：抗ＶＩＳＴＡ抗体のインシリコ特性評価
抗ＶＩＳＴＡ抗体のアミノ酸配列を、共分散違反、非標準的グリコシル化部位、非標準的システイン配置、塩架橋の破壊、等電点（ｐＩ）、脱アミド化のリスク、トリプトファン酸化のリスク、異性化のリスク、及び高い正、負、または疎水性の性質を有する表面積の計算の評価を含め、ＣＤＲ領域の潜在的な配列依存性の開発ライアビリティについて、インシリコで分析した。一般に、かかる潜在的ライアビリティは、分解部位（例えば、脱アミド化、酸化）、異性化（例えば、Ａｓｐ－ｉｓｏＡｓｐ）、生産タイターの制限、精製の課題、凝集及び製剤化の課題ならびに薬物動態への悪影響、インビボでの非特異的結合ならびに生体内分布の変化として現れる可能性がある。分析された配列のうち、抗体番号２６９．１、抗体番号３２１．１、抗体番号２４５．１、及び抗体番号４５７．１には大きな開発ライアビリティはなかった。抗体番号４６５．１及び抗体番号１７３．１の配列は、生理的ｐＨに近いｐＩ値を示し、これは、それらの有用な活性に影響を与えないはずであるが、これが潜在的な最適以下の製剤安定性を示す可能性がある。
抗ＶＩＳＴＡ抗体のアミノ酸配列を、共分散違反、非標準的グリコシル化部位、非標準的システイン配置、塩架橋の破壊、等電点（ｐＩ）、脱アミド化のリスク、トリプトファン酸化のリスク、異性化のリスク、及び高い正、負、または疎水性の性質を有する表面積の計算の評価を含め、ＣＤＲ領域の潜在的な配列依存性の開発ライアビリティについて、インシリコで分析した。一般に、かかる潜在的ライアビリティは、分解部位（例えば、脱アミド化、酸化）、異性化（例えば、Ａｓｐ－ｉｓｏＡｓｐ）、生産タイターの制限、精製の課題、凝集及び製剤化の課題ならびに薬物動態への悪影響、インビボでの非特異的結合ならびに生体内分布の変化として現れる可能性がある。分析された配列のうち、抗体番号２６９．１、抗体番号３２１．１、抗体番号２４５．１、及び抗体番号４５７．１には大きな開発ライアビリティはなかった。抗体番号４６５．１及び抗体番号１７３．１の配列は、生理的ｐＨに近いｐＩ値を示し、これは、それらの有用な活性に影響を与えないはずであるが、これが潜在的な最適以下の製剤安定性を示す可能性がある。
実施例２０：抗ＶＩＳＴＡ抗体のインビボ機能特性評価－ＶＩＳＴＡ－ＫＩマウスにおける単剤または併用療法でのＭＣ３８腫瘍増殖阻害
この試験の目的は、ＫＩ－ＶＩＳＴＡマウスのＭＣ３８マウスがんモデルにおける抗体番号２４５．２のインビボ治療効果を評価することであった。抗体番号２４５．２は、マウスＩｇＧ２ａ抗体である。
この試験の目的は、ＫＩ－ＶＩＳＴＡマウスのＭＣ３８マウスがんモデルにおける抗体番号２４５．２のインビボ治療効果を評価することであった。抗体番号２４５．２は、マウスＩｇＧ２ａ抗体である。
ＭＣ３８腫瘍細胞を、１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ中、３７℃、空気中５％ＣＯ２雰囲気下でインビトロにて培養した。細胞を指数増殖期に採取し、セルカウンターによって定量した後、腫瘍接種した。腫瘍の増殖のため、各マウスの右後部脇腹領域に、ＭＣ３８腫瘍細胞（１ｘ１０６）を含む０．１ｍｌのＰＢＳを皮下接種した。腫瘍細胞接種の日を０日目とした。平均腫瘍サイズが約７５ｍｍ３（７０～１００ｍｍ３）に達した時点でランダム化を行った。５６匹のマウスを試験に登録した。すべての動物をランダムに７つの試験群に割り当てた。腫瘍細胞接種後は、動物を病的状態及び死亡率について毎日確認した。腫瘍体積を、ノギスを使用して週２回２次元で測定し、その体積を、式：「Ｖ＝（ＬｘＷｘＷ）／２」を使用してｍｍ３で表した。式中、Ｖは、腫瘍体積であり、Ｌは、腫瘍長（最も長い腫瘍の寸法）であり、Ｗは、腫瘍幅（Ｌに直交する最も長い腫瘍の寸法）である。投与ならびに腫瘍及び体重の測定は層流キャビネット内で実施した。体重及び腫瘍体積は、ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ（商標）ソフトウェア（バージョン３．１．３９９．１９）を使用して測定した。媒体処置対照群の平均腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達した時点、または最終投与後１週間のいずれか早い方で試験を終了した。事前に指定された日の異なる群の腫瘍体積を比較するために、バートレットの検定を使用して、全群にわたる分散の均一性の仮定を確認した。バートレットの検定のｐ値が０．０５以上の場合、一元配置分散分析を実行して、全群にわたる平均の全体的な均一性を検定した。一元配置分散分析のｐ値が０．０５未満の場合、すべての対比較についてはチューキーのＨＳＤ（ｈｏｎｅｓｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）検定を実行することによって事後検定を行い、各処置群と媒体群の比較にはダネットの検定を実行した。バートレットの検定のｐ値が０．０５未満の場合、クラスカルワリス検定を実行して、全群間の中央値の全体的な均一性を検定した。クラスカルワリス検定のｐ値が０．０５未満の場合、すべての対比較について、または各処置群と媒体群を比較するためにコノバーのノンパラメトリック検定を実行してさらなる事後検定を行った。両方とも単一ステップのｐ値の調整を行う。
さらに、複数の検定補正を行わない対比較を行い、ウェルチのｔ検定またはマン・ホイットニーのＵ検定から直接得られた名目／未補正のｐ値を報告した。具体的には、最初にバートレット検定を使用して、一対の群の分散の均一性の仮定を確認した。バートレット検定のｐ値が０．０５以上の場合は、ウェルチのｔ検定を実行して名目ｐ値を取得し、そうでない場合は、マン・ホイットニーのＵ検定を実行した。すべての統計分析は、Ｒ（バージョン３．３．１）で行った。特に指定のない限り、すべての検定は両側検定であり、０．０５未満のｐ値を統計的に有意であると見なした。
抗体番号２４５．２は、ＶＩＳＴＡ ＫＩマウスモデルにおけるＭＣ３８腫瘍増殖を阻害し、その有効性は、抗ｍＰＤ１抗体と組み合わせて増大した（図５６Ａ）。
実施例２１：抗ＶＩＳＴＡ Ｍａｂのインビボ機能特性評価－ＶＩＳＴＡ ＥＣＤ ＫＩマウスにおける単剤または併用療法でのＭＢ４９腫瘍増殖阻害
これらの試験の目的は、ＶＩＳＴＡ ＥＣＤ ＫＩマウスの皮下ＭＢ４９マウス膀胱癌モデルの処置における抗体番号４７４．１（ＷＴ）または抗体番号１５０．１（ＹＴＥ）のインビボ治療効果を評価することであった。ＭＢ４９腫瘍細胞を、１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ培地とともに、３７℃、５％ＣＯ２中、インビトロにて培養した。指数増殖期の細胞を採取し、セルカウンターによって定量した後、腫瘍接種した。各マウスの右後部脇腹領域に、ＭＢ４９腫瘍細胞（１匹あたり５ｘ１０５細胞）を含む０．１ｍｌのＰＢＳを皮下接種した。腫瘍細胞接種の日を０日目とした。平均腫瘍サイズが約７５ｍｍ３（６０～１００ｍｍ３）に達した５日目にマウスを１群あたり８匹の群にランダム化した。マウスを、２０ｍｇ／ｋｇの抗体番号４７４．１または抗体番号１５０．１、２０ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧ１、５ｍｇ／ｋｇの抗ｍＰＤ１、または抗ＶＩＳＴＡ Ａｂと抗ｍＰＤ１の併用療法にて、５日目から３週間、週２回腹腔内（ＩＰ）投与によって処置した。
これらの試験の目的は、ＶＩＳＴＡ ＥＣＤ ＫＩマウスの皮下ＭＢ４９マウス膀胱癌モデルの処置における抗体番号４７４．１（ＷＴ）または抗体番号１５０．１（ＹＴＥ）のインビボ治療効果を評価することであった。ＭＢ４９腫瘍細胞を、１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ培地とともに、３７℃、５％ＣＯ２中、インビトロにて培養した。指数増殖期の細胞を採取し、セルカウンターによって定量した後、腫瘍接種した。各マウスの右後部脇腹領域に、ＭＢ４９腫瘍細胞（１匹あたり５ｘ１０５細胞）を含む０．１ｍｌのＰＢＳを皮下接種した。腫瘍細胞接種の日を０日目とした。平均腫瘍サイズが約７５ｍｍ３（６０～１００ｍｍ３）に達した５日目にマウスを１群あたり８匹の群にランダム化した。マウスを、２０ｍｇ／ｋｇの抗体番号４７４．１または抗体番号１５０．１、２０ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧ１、５ｍｇ／ｋｇの抗ｍＰＤ１、または抗ＶＩＳＴＡ Ａｂと抗ｍＰＤ１の併用療法にて、５日目から３週間、週２回腹腔内（ＩＰ）投与によって処置した。
腫瘍細胞接種後は、動物を病的状態及び死亡率について毎日確認した。定期的なモニタリング中に、動物を、腫瘍増殖及び処置が行動に及ぼす影響、例えば、行動能力、食物と水の消費、及び不快の徴候について確認した。これらの徴候としては、努力性呼吸、猫背、不十分なグルーミング、及び歩行異常が挙げられるがこれらに限定されない。死亡率及び観察された臨床徴候は、個々の動物について詳細に記録した。体重及び腫瘍体積は、少なくとも週３回測定した。腫瘍体積を、ノギスを使用して２次元で測定し、体積を、式Ｖ＝（ＬｘＷｘＷ）／２を使用してｍｍ３で表した。式中、Ｖは、腫瘍体積であり、Ｌは、腫瘍長（最も長い腫瘍の寸法）であり、Ｗは、腫瘍幅（Ｌに直交する最も長い腫瘍の寸法）である。腫瘍体積が２０００ｍｍ３以上、またはマウスの体重の１０％以上に達した時点のいずれか早い方、マウスが初期体重の２０％以上を失った場合、または身体状態スコアがスコア１に達した場合、個々のマウスを安楽死させた。潰瘍化した腫瘍を有するマウスは、毎日観察し、潰瘍が２４時間開放性であった場合に、または腫瘍が１０００ｍｍ３以上の開放性潰瘍を有した場合は直ちに安楽死させた。
抗体番号４７４．１または抗体番号１５０．１は両方とも、単剤としてＶＩＳＴＡ ＫＩマウスモデルにおけるＭＢ４９腫瘍増殖を強力に阻害する（図５６Ｂ）。抗体番号１５０．１の有効性は、併用療法、例えば、抗ｍＰＤ１との併用療法において、ＶＩＳＴＡ ＫＩマウスモデルで増強される（図５６Ｃ）。
実施例２２：単剤抗ＶＩＳＴＡ Ｍａｂで、または併用療法として処置したＶＩＳＴＡ－ＫＩマウスのＭＢ４９腫瘍微小環境における免疫細胞の表現型の特性評価。
腫瘍浸潤免疫細胞の表現型をマルチパラメータフローサイトメトリー実験によって分析した。１３日目（３回目の投与から２４時間後）に腫瘍サンプルを３マウス／群から採取し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈの腫瘍解離キット、マウス（カタログ番号１３０－０９６－７３０）を使用して単細胞浮遊液を調製した。単細胞浮遊液をフローサイトメーター染色緩衝液（２％ＦＢＳ／ＰＢＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で最終濃度５０００万細胞／ｍＬに調製した。表現型分析用に細胞を染色するため、各腫瘍サンプルから調製した単細胞浮遊液５０μＬを９６ウェルのＵ底プレートに添加した。残りのサンプルを組み合わせてＦＭＯ染色に使用した。細胞を４００ｇ／５分間で遠心し、上清を廃棄した。５０ｕＬのブロック緩衝液を各サンプルに加え（１：５０希釈のＢＤマウスＦｃブロックカタログ番号５５３１４１を含むＦＣＳ緩衝液）、氷上で１５分間インキュベートした。抗体カクテルをサンプル数に基づいて調製し、各ＦＭＯカクテルを、全染色カクテルから１つのフルオロフォア結合抗体を除いたすべての抗体を加えて調製した。ブロック緩衝液で染色した細胞に、各サンプル及びＦＭＯに５０ｕＬの抗体カクテルを加え、氷上で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、細胞を４００ｇで５分間遠沈させ、上清を廃棄する。表面染色後、ＲＢＣを溶解し、サンプルを１００ｕＬの１ｘ１ステップ溶解固定緩衝液（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号００－５３３３－５４）で固定し、氷上で２０分間インキュベートした。細胞をフローサイトメトリー染色緩衝液で２回洗浄する。細胞を１２５ｕＬのフローサイトメトリー染色緩衝液に再懸濁し、Ａｔｔｕｎｅ ＮＸＴフローサイトメーターに流す。
腫瘍浸潤免疫細胞の表現型をマルチパラメータフローサイトメトリー実験によって分析した。１３日目（３回目の投与から２４時間後）に腫瘍サンプルを３マウス／群から採取し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈの腫瘍解離キット、マウス（カタログ番号１３０－０９６－７３０）を使用して単細胞浮遊液を調製した。単細胞浮遊液をフローサイトメーター染色緩衝液（２％ＦＢＳ／ＰＢＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で最終濃度５０００万細胞／ｍＬに調製した。表現型分析用に細胞を染色するため、各腫瘍サンプルから調製した単細胞浮遊液５０μＬを９６ウェルのＵ底プレートに添加した。残りのサンプルを組み合わせてＦＭＯ染色に使用した。細胞を４００ｇ／５分間で遠心し、上清を廃棄した。５０ｕＬのブロック緩衝液を各サンプルに加え（１：５０希釈のＢＤマウスＦｃブロックカタログ番号５５３１４１を含むＦＣＳ緩衝液）、氷上で１５分間インキュベートした。抗体カクテルをサンプル数に基づいて調製し、各ＦＭＯカクテルを、全染色カクテルから１つのフルオロフォア結合抗体を除いたすべての抗体を加えて調製した。ブロック緩衝液で染色した細胞に、各サンプル及びＦＭＯに５０ｕＬの抗体カクテルを加え、氷上で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、細胞を４００ｇで５分間遠沈させ、上清を廃棄する。表面染色後、ＲＢＣを溶解し、サンプルを１００ｕＬの１ｘ１ステップ溶解固定緩衝液（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号００－５３３３－５４）で固定し、氷上で２０分間インキュベートした。細胞をフローサイトメトリー染色緩衝液で２回洗浄する。細胞を１２５ｕＬのフローサイトメトリー染色緩衝液に再懸濁し、Ａｔｔｕｎｅ ＮＸＴフローサイトメーターに流す。
抗体番号１５０．１によるＭＢ４９膀胱腫瘍の処置は、腫瘍内のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびにＮＫ細胞の増加を誘導する。これらのＴ細胞はほとんどがエフェクターメモリーＴ細胞である。さらに、抗体番号１５０．１での処置により、腫瘍内の抑制性ｇＭＤＳＣの数が減少し、Ｍ２マクロファージがＭ１に変換される。抗体番号１５０．１と抗ｍＰＤ１との組み合わせは、腫瘍内エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度をさらに増加させる（図５６Ｄ～５６Ｌ）。
実施例２３：ヒトＶＩＳＴＡ ＫＩマウスにおける抗ｈＶＩＳＴＡ抗体の曝露レベルを評価するためのインビボ薬物動態試験。
この薬物動態試験は、１０、３０、または１００ｍｇ／ｋｇの腹腔内（ＩＰ）投与後のヒトＶＩＳＴＡ ＫＩマウスにおける抗ｈＶＩＳＴＡ抗体の曝露レベルを評価するために行った。血液サンプリングは、投与後２、４、８、２４、４８または７２時間の時点で実施した。
この薬物動態試験は、１０、３０、または１００ｍｇ／ｋｇの腹腔内（ＩＰ）投与後のヒトＶＩＳＴＡ ＫＩマウスにおける抗ｈＶＩＳＴＡ抗体の曝露レベルを評価するために行った。血液サンプリングは、投与後２、４、８、２４、４８または７２時間の時点で実施した。
第一に、１０ポイントの標準曲線を、各抗ＶＩＳＴＡ抗体を含む０．５％ＢＳＡ－ＰＢＳ及び０．１～１０％マウス血清に対して生成した。抗体番号２４５．１及び抗体番号２４５．２をＰＢＳで５００ｎｇ／ｍＬに希釈し、０．１～１０％マウス血清で最終濃度範囲０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬになるように２．４倍希釈を行った。標準曲線を各プレートに対して生成し、シグモイド型用量反応（可変勾配）の非線形回帰を使用してサンプルに適用した。次に、サンプルを１：１０、１：１００、１：１，０００、１：１０，０００、または１：１００，０００に希釈し、サンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。濃度は、マウス血清の標準曲線から特定した。陽性ＯＤカットポイントを、ＥＬＩＳＡプレートごとに、下記式を使用して計算し、公開されているガイダンス（Ａ Ｆｒａｙ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ａ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｅｎｄｐｏｉｎｔ ｔｉｔｅｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２１，３５－４１）の通りに９５％信頼区間で陽性サンプルを検出した：カットポイント＝バックグラウンドの平均ＯＤ４５０＋（バックグラウンドのＯＤ４５０のＳＤｘＳＤ乗数）。ＳＤ：標準偏差、ＳＤ乗数：標準偏差乗数は反復数に依存する。３つの反復のサンプルの乗数として３．３７２を使用した。
カットポイントは、ブランク標準（０ｎｇ／ｍＬ）に対して決定された。ブランク標準に対して計算されたカットポイントを、標準曲線の陽性サンプルを決定するために使用し、投与前の血漿サンプルについて計算されたカットポイントを、各動物の陽性サンプルを決定するために使用した。標準曲線濃度ごとに、正確度（公称値の％）及び精度（変動係数、％ＣＶ）を計算した。定量範囲を以下の基準によって決定した：
・標準正確度は、公称値の±２０％（定量下限（ＬＬＯＱ）及び定量上限（ＵＬＯＱ）では±２５％）である。
・標準精度は、±２０％ＣＶ（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱでは±２５％）である。
・全誤差（正確度＋精度）は、３０％（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱでは４０％）を超えない。
・定量範囲内の非ゼロ標準の７５％が上記の基準（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱを含む）を満たす。
・ＬＬＯＱは、標準曲線に対して決定されたカットポイントを上回る。
・標準正確度は、公称値の±２０％（定量下限（ＬＬＯＱ）及び定量上限（ＵＬＯＱ）では±２５％）である。
・標準精度は、±２０％ＣＶ（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱでは±２５％）である。
・全誤差（正確度＋精度）は、３０％（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱでは４０％）を超えない。
・定量範囲内の非ゼロ標準の７５％が上記の基準（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱを含む）を満たす。
・ＬＬＯＱは、標準曲線に対して決定されたカットポイントを上回る。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、シグモイド型用量反応（可変勾配）による非線形回帰を使用してサンプルごとの濃度値を決定した。サンプルごとに、用量反応曲線のＥＣ５０のＯＤ４５０値に最も近いＯＤ４５０値をもたらす血漿希釈を、その時点の濃度を決定するために使用した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、各標準曲線のＥＣ５０を決定した。ＥＣ５０のＯＤ４５０値を、以下の式を使用して計算した：ＯＤ４５０＝曲線の底部＋（曲線の上部－曲線の底部）／［１＋１０（ＬｏｇＥＣ５０－Ｘ）＊ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ）］。
メスのヒトＶＩＳＴＡ ＫＩマウスに、抗体番号２４５．１を３０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ投与した後、抗体番号２４５．１の血清曝露のピークは投与後４時間で達成され、Ｃｍａｘは６４５μｇ／ｍＬとなり、曝露は投与後７２時間で６μｇ／ｍＬに減少した。ＡＵＣは１１，００８時間＊μｇ／ｍＬで、半減期は９．６時間であった。抗体番号２４５．１の１０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇ用量と比較して、用量が１０ｍｇ／ｋｇから３０ｍｇ／ｋｇに増加すると、ＡＵＣは７．６倍増加し、用量が３０ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇに増加すると、ＡＵＣは３．４倍増加した。３０ｍｇ／ｋｇ用量の半減期（９．６時間）は、１０ｍｇ／ｋｇ用量の半減期（９．４時間）と同様であった。
抗体番号２４５．１（ヒトＩｇＧ１）及び抗体番号２４５．２（マウスＩｇＧ２ａ）の薬物動態プロファイルは、ほぼ同一であった（図５７Ａ及び５７Ｂ）。
実施例２４：ヒトＶＩＳＴＡ ＫＩマウスにおける抗ｈＶＩＳＴＡ抗体の曝露レベルを評価するためのインビボ薬物動態試験。
薬物動態試験を、１０ｍｇ／ｋｇの腹腔内（ＩＰ）投与後のヒトＶＩＳＴＡ ＫＩマウスにおける新規抗ｈＶＩＳＴＡ抗体の曝露レベルを評価するために行った。血液サンプリングは、２、４、８、１２、２４、または４８時間の時点で実施した。
薬物動態試験を、１０ｍｇ／ｋｇの腹腔内（ＩＰ）投与後のヒトＶＩＳＴＡ ＫＩマウスにおける新規抗ｈＶＩＳＴＡ抗体の曝露レベルを評価するために行った。血液サンプリングは、２、４、８、１２、２４、または４８時間の時点で実施した。
別の薬物動態試験を、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇの反復腹腔内（ＩＰ）投与後のヒトＶＩＳＴＡ ＫＩマウスにおける新規抗ＶＩＳＴＡ抗体の曝露レベルを評価するために行った。１０ｍｇ／ｋｇ群のマウスには、４８時間ごとに合計３回投与し、３０ｍｇ／ｋｇ群のマウスには、３～４日ごとに合計４回投与した。血液サンプリングは、４、８、１２、２４、４８、７２または９６時間の時点で実施した。
第一に、１０ポイントの標準曲線を、各抗ＶＩＳＴＡ抗体を含む０．５％ＢＳＡ－ＰＢＳ及び０．１～１０％マウス血清に対して生成した。抗体番号４７４．１、１５０．１及びＶＳＴＢ１７４をＰＢＳで２５０ｎｇ／ｍＬに希釈し、０．１～１０％マウス血清で最終濃度範囲０．２ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬになるように２．４倍希釈を行った。標準曲線を各プレートに対して生成し、シグモイド型用量反応（可変勾配）の非線形回帰を使用してサンプルに適用した。次に、サンプルを１：１０、１：１００、１：１，０００、１：１０，０００、または１：１００，０００に希釈し、サンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。濃度は、上記の通りマウス血清の抗ＶＩＳＴＡ抗体標準曲線から特定した。陽性ＯＤカットポイントを、ＥＬＩＳＡプレートごとに、下記式を使用して計算し、公開されているガイダンス（Ａ Ｆｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．）の通りに９５％信頼区間で陽性サンプルを検出した：
カットポイント＝バックグラウンドの平均ＯＤ４５０＋（バックグラウンドのＯＤ４５０のＳＤｘＳＤ乗数）。
ＳＤ：標準偏差
ＳＤ乗数：標準偏差乗数は反復数に依存する。３つの反復のサンプルの乗数として３．３７２を使用した。
カットポイント＝バックグラウンドの平均ＯＤ４５０＋（バックグラウンドのＯＤ４５０のＳＤｘＳＤ乗数）。
ＳＤ：標準偏差
ＳＤ乗数：標準偏差乗数は反復数に依存する。３つの反復のサンプルの乗数として３．３７２を使用した。
カットポイントは、ブランク標準（０ｎｇ／ｍＬ）に対して決定された。ブランク標準に対して計算されたカットポイントを、標準曲線の陽性サンプルと未知のサンプルを特定するために使用した。標準曲線濃度ごとに、正確度（公称値の％）及び精度（変動係数、％ＣＶ）を計算した。定量範囲を以下の基準によって決定した：
１．標準正確度は、公称値の±２０％（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱでは±２５％）である。
２．標準精度は、±２０％ＣＶ（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱでは±２５％）である。
３．全誤差（正確度＋精度）は、３０％（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱでは４０％）を超えない。
４．定量範囲内の非ゼロ標準の７５％が上記の基準（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱを含む）を満たす。
５．ＬＬＯＱは、標準曲線に対して決定されたカットポイントを上回る。
１．標準正確度は、公称値の±２０％（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱでは±２５％）である。
２．標準精度は、±２０％ＣＶ（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱでは±２５％）である。
３．全誤差（正確度＋精度）は、３０％（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱでは４０％）を超えない。
４．定量範囲内の非ゼロ標準の７５％が上記の基準（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱを含む）を満たす。
５．ＬＬＯＱは、標準曲線に対して決定されたカットポイントを上回る。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、シグモイド型用量反応（可変勾配）による非線形回帰を使用してサンプルごとの濃度値を決定した。サンプルごとに、用量反応曲線のＥＣ５０のＯＤ４５０値に最も近いＯＤ４５０値をもたらす血漿希釈を、その時点の濃度を決定するために使用した（図５７Ｃ～５７Ｅ及び表３２及び３３）。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、各標準曲線のＥＣ５０を決定した。ＥＣ５０のＯＤ４５０値は、下記式を使用して計算した。
ＯＤ４５０＝曲線の底部＋（曲線の上部－曲線の底部）／［１＋１０（ＬｏｇＥＣ５０－Ｘ）＊ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ）］。
メスのヒトＶＩＳＴＡ ＫＩマウスに、抗体番号４７４．１を１０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ投与した後、抗体番号４７４．１の血清曝露のピークは投与後２時間であり、Ｃｍａｘは９６ｕｇ／ｍＬとなり、曝露は投与後２４時間（Ｔｌａｓｔ）で０．００８ｕｇ／ｍＬに減少した。血清曝露は、投与後４８時間でＢＬＱであった。ＡＵＣは９７５時間＊ｕｇ／ｍＬであり、半減期は１．４時間であった。
メスのヒトＶＩＳＴＡ ＫＩマウスに、抗体番号１５０．１を１０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ投与した後、抗体番号１５０．１の血清曝露のピークは投与後４時間であり、Ｃｍａｘは５６ｕｇ／ｍＬとなり、曝露は投与後２４時間で０．００７ｕｇ／ｍＬに減少した。血清曝露は、投与後４８時間でＢＬＱであった。ＡＵＣは６８０時間＊ｕｇ／ｍＬであり、半減期は１．２時間であった。
メスのヒトＶＩＳＴＡ ＫＩマウスに、ＶＳＴＢ１７４を１０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ投与した後、ＶＳＴＢ１７４の血清曝露のピークは投与後４時間であり、Ｃｍａｘは９２ｕｇ／ｍＬとなり、曝露は投与後２４時間で０．００３ｕｇ／ｍＬに減少した。血清曝露は、投与後４８時間でＢＬＱであった。ＡＵＣは１０４６時間＊ｕｇ／ｍＬであり、半減期は１．３時間であった。
メスのヒトＶＩＳＴＡ ＫＩマウスに、抗体番号１５０．１を単回１０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ投与した後、抗体番号１５０．１の血清曝露のピークは投与後４時間であり、Ｃｍａｘは６５ｕｇ／ｍＬとなり、曝露は投与後２４時間で０．０２ｕｇ／ｍＬに減少した。ＡＵＣは５９０時間＊ｕｇ／ｍＬであり、半減期は１．４時間であった。５日目、メスのヒトＶＩＳＴＡ ＫＩマウスに、抗体番号１５０．１の１０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ投与を４８時間ごとに３回繰り返した後、抗体番号１５０．１の血清曝露は、単回投与後に観察された曝露と同様であった。抗体番号１５０．１の血清曝露のピークは投与後４時間であり、Ｃｍａｘは６７ｕｇ／ｍＬとなり（１日目のＣｍａｘの１倍）、曝露は投与後２４時間で０．０２ｕｇ／ｍＬに減少した。ＡＵＣは６４５時間＊ｕｇ／ｍＬであり（１日目のＡＵＣの１．１倍）、半減期は１．４時間であった。
メスのヒトＶＩＳＴＡ ＫＩマウスに、抗体番号１５０．１を単回３０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ投与した後、抗体番号１５０．１の血清曝露のピークは投与後４時間であり、Ｃｍａｘは２９４ｕｇ／ｍＬとなり、曝露は投与後４８時間で０．０１ｕｇ／ｍＬに減少した。ＡＵＣは４３２７時間＊ｕｇ／ｍＬであり、半減期は２．８時間であった。１１日目、メスのヒトＶＩＳＴＡ ＫＩマウスに、抗体番号１５０．１の３０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ投与を３～４日ごとに４回繰り返した後、抗体番号１５０．１の血清曝露のピークは投与後４時間であり、Ｃｍａｘは１３５ｕｇ／ｍＬとなり（１日目のＣｍａｘの０．５倍）、曝露は投与後４８時間で０．０１ｕｇ／ｍＬに減少した。ＡＵＣは９０２時間＊ｕｇ／ｍＬであり（１日目のＡＵＣの０．２倍）、半減期は３．３時間であった。
実施例２５：カニクイザルにおける抗ｈＶＩＳＴＡ抗体である抗体番号１５０．１の曝露レベルを評価するためのインビボ薬物動態試験。
薬物動態試験を、３０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内（ＩＶ）投与後、３回の毎日の１０ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与後、及び２日ごとの５回の５ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与後のオス及びメスのカニクイザルにおける新規抗ｈＶＩＳＴＡ抗体の曝露レベルをカニクイザルで評価するために行った。血液サンプリングは、３０ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの投与後の０．０８３、２４、７２、１２０、１６８、２１６、２４０、または２６４時間の時点、及び５ｍｇ／ｋｇの投与後の０．０８３、２４、４８、７２、または１２０時間の時点で実施した。
薬物動態試験を、３０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内（ＩＶ）投与後、３回の毎日の１０ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与後、及び２日ごとの５回の５ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与後のオス及びメスのカニクイザルにおける新規抗ｈＶＩＳＴＡ抗体の曝露レベルをカニクイザルで評価するために行った。血液サンプリングは、３０ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの投与後の０．０８３、２４、７２、１２０、１６８、２１６、２４０、または２６４時間の時点、及び５ｍｇ／ｋｇの投与後の０．０８３、２４、４８、７２、または１２０時間の時点で実施した。
カニクイザルにおける１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇの反復静脈内（ＩＶ）投与後の新規抗ＶＩＳＴＡ抗体の曝露レベルを評価するためのトキシコキネティクス試験も行った。サルには７日ごとに合計４回の投与が行われた。血液サンプリングは、１回目及び４回目の投与後０．０８３、６、２４、４８、７２または１６８時間の時点で実施した。
第一に、１０ポイントの標準曲線を、各抗体を含む０．５％ＢＳＡ－ＰＢＳ及び０．０１～１０％カニクイザル血清に対して生成した。抗体番号１５０．１をＰＢＳで２５０ｎｇ／ｍＬに希釈し、０．０１～１０％サル血清で最終濃度範囲０．２ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬになるように２．４倍希釈を行った。標準曲線を各プレートに対して生成し、シグモイド型用量反応（可変勾配）の非線形回帰を使用してサンプルに適用した。次に、サンプルを１：１０、１：１００、１：１，０００、１：１０，０００、または１：１００，０００に希釈し、サンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。濃度は、上記の通りサル血清の抗体標準曲線から特定した。陽性ＯＤカットポイントを、ＥＬＩＳＡプレートごとに、下記式を使用して計算し、公開されているガイダンス（Ａ Ｆｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．）の通りに９５％信頼区間で陽性サンプルを検出した：
カットポイント＝バックグラウンドの平均ＯＤ４５０＋（バックグラウンドのＯＤ４５０のＳＤｘＳＤ乗数）
ＳＤ：標準偏差
ＳＤ乗数：標準偏差乗数は反復数に依存する。３つの反復のサンプルの乗数として３．３７２を使用した。
カットポイント＝バックグラウンドの平均ＯＤ４５０＋（バックグラウンドのＯＤ４５０のＳＤｘＳＤ乗数）
ＳＤ：標準偏差
ＳＤ乗数：標準偏差乗数は反復数に依存する。３つの反復のサンプルの乗数として３．３７２を使用した。
カットポイントは、ブランク標準（０ｎｇ／ｍＬ）及び動物の処置前血の血清サンプルに対して決定された。ブランク標準に対して計算されたカットポイントを、標準曲線の陽性サンプルを決定するために使用し、処置前血の血漿サンプルについて計算されたカットポイントを、その動物の陽性サンプルを決定するために使用した。標準曲線濃度ごとに、正確度（公称値の％）及び精度（変動係数、％ＣＶ）を計算した。定量範囲を以下の基準によって決定した：
１．標準正確度は、公称値の±２０％（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱでは±２５％）である。
２．標準精度は、±２０％ＣＶ（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱでは±２５％）である。
３．全誤差（正確度＋精度）は、３０％（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱでは４０％）を超えない。
４．定量範囲内の非ゼロ標準の７５％が上記の基準（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱを含む）を満たす。
５．ＬＬＯＱは、標準曲線に対して決定されたカットポイントを上回る。
１．標準正確度は、公称値の±２０％（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱでは±２５％）である。
２．標準精度は、±２０％ＣＶ（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱでは±２５％）である。
３．全誤差（正確度＋精度）は、３０％（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱでは４０％）を超えない。
４．定量範囲内の非ゼロ標準の７５％が上記の基準（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱを含む）を満たす。
５．ＬＬＯＱは、標準曲線に対して決定されたカットポイントを上回る。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、シグモイド型用量反応（可変勾配）による非線形回帰を使用してサンプルごとの濃度値を決定した。サンプルごとに、用量反応曲線のＥＣ５０のＯＤ４５０値に最も近いＯＤ４５０値をもたらす血漿希釈を、その時点の濃度を決定するために使用した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、各標準曲線のＥＣ５０を決定した。ＥＣ５０のＯＤ４５０値を、以下の式を使用して計算した：ＯＤ４５０＝曲線の底部＋（曲線の上部－曲線の底部）／［１＋１０（ＬｏｇＥＣ５０－Ｘ）＊ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ）］
オスのカニクイザルに、抗体番号１５０．１を単回３０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ投与した後、抗体番号１５０．１の血清曝露のピークは投与後０．０８３時間であり、Ｃｍａｘは１０３２ｕｇ／ｍＬとなり、曝露は投与後２６４時間で４０ｕｇ／ｍＬに減少した。ＡＵＣは７１８１１時間＊ｕｇ／ｍＬであり、半減期は６５時間であった。メスのカニクイザルに、抗体番号１５０．１を単回３０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ投与した後、抗体番号１５０．１の血清曝露のピークは投与後０．０８３時間であり、Ｃｍａｘは９８７ｕｇ／ｍＬとなり、曝露は投与後２６４時間で０．０４ｕｇ／ｍＬに減少した。ＡＵＣは４５７４２時間＊ｕｇ／ｍＬであり、半減期は１０時間であった。
オスのカニクイザルに、抗体番号１５０．１を３回毎日１０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ投与した後、抗体番号１５０．１の血清曝露のピークは投与後０．０８３時間であり、Ｃｍａｘは６２４ｕｇ／ｍＬとなり、曝露は投与後２６４時間で５ｕｇ／ｍＬに減少した。ＡＵＣは５１６１７時間＊ｕｇ／ｍＬであり、半減期は２２時間であった。メスのカニクイザルに、抗体番号１５０．１を３回毎日１０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ投与した後、抗体番号１５０．１の血清曝露のピークは投与後０．０８３時間であり、Ｃｍａｘは６４７ｕｇ／ｍＬとなり、曝露は投与後２６４時間で０．０１ｕｇ／ｍＬに減少した。ＡＵＣは３６７３５時間＊ｕｇ／ｍＬであり、半減期は９時間であった。
メスのカニクイザルに、抗体番号１５０．１を２日ごとに５回５ｍｇ／ｋｇ ＩＶ投与した後、抗体番号１５０．１の血清曝露のピークは投与後０．０８３時間であり、Ｃｍａｘは２２２ｕｇ／ｍＬとなり、曝露は投与後１２０時間で６ｕｇ／ｍＬに減少した。ＡＵＣは７４７０時間＊ｕｇ／ｍＬであり、半減期は２４時間であった。
カニクイザルに、抗体番号１５０．１を単回１０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ投与した後、抗体番号１５０．１の血清曝露のピークは投与後０．０８３時間であり、Ｃｍａｘは３２０ｕｇ／ｍＬとなり、曝露は投与後１６８時間で１８ｕｇ／ｍＬに減少した。ＡＵＣは１６９５５時間＊ｕｇ／ｍＬであり、半減期は４７時間であった。カニクイザルに、抗体番号１５０．１を４回毎週１０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ投与した後の２２日目、抗体番号１５０．１の血清曝露のピークは投与後０．０８３時間であり、Ｃｍａｘは２９１ｕｇ／ｍＬとなり（１日目のＣｍａｘの０．９倍）、曝露は投与後１６８時間で０．３ｕｇ／ｍＬに減少した。ＡＵＣは３４９３時間＊ｕｇ／ｍＬであり（１日目のＡＵＣの０．２倍）、半減期は１９時間であった。
カニクイザルに、抗体番号１５０．１を単回３０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ投与した後、抗体番号１５０．１の血清曝露のピークは投与後０．０８３時間であり、Ｃｍａｘは９００ｕｇ／ｍＬとなり、曝露は投与後１６８時間で６６ｕｇ／ｍＬに減少した。ＡＵＣは５４７０８時間＊ｕｇ／ｍＬであり、半減期は５０時間であった。カニクイザルに、抗体番号１５０．１を４回毎週３０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ投与した後の２２日目、抗体番号１５０．１の血清曝露のピークは投与後０．０８３時間であり、Ｃｍａｘは８８５ｕｇ／ｍＬとなり（１日目のＣｍａｘの１倍）、曝露は投与後１６８時間で６ｕｇ／ｍＬに減少した。ＡＵＣは１８９２４時間＊ｕｇ／ｍＬであり（１日目のＡＵＣの０．３倍）、半減期は４４時間であった。
カニクイザルに、抗体番号１５０．１を単回１００ｍｇ／ｋｇ ＩＶ投与した後、抗体番号１５０．１の血清曝露のピークは投与後０．０８３時間であり、Ｃｍａｘは２２６１ｕｇ／ｍＬとなり、曝露は投与後１６８時間で８２０ｕｇ／ｍＬに減少した。ＡＵＣは１８４１６７時間＊ｕｇ／ｍＬであり、半減期は１１８時間であった。カニクイザルに、抗体番号１５０．１を４回毎週１００ｍｇ／ｋｇ ＩＶ投与した後の２２日目、抗体番号１５０．１の血清曝露のピークは投与後０．０８３時間であり、Ｃｍａｘは３４９８ｕｇ／ｍＬとなり（１日目のＣｍａｘの１．５倍）、曝露は投与後１６８時間で１４２７ｕｇ／ｍＬに減少した。ＡＵＣは３１７４８９時間＊ｕｇ／ｍＬであり（１日目のＡＵＣの１．７倍）、半減期は１２１時間であった。
これらのインビボ薬物動態試験に加えて、臨床観察、血液学、臨床化学及び免疫原性を観察した。明らかな臨床徴候も体重減少も観察されず、臨床病理エンドポイントに関する非治療関連所見は検出されず、サイトカイン放出症候群に関与するサイトカインレベル、特にＩＬ６及びＴＮＦαの変化は観察されなかった。要約すると、高い反復用量（１００ｍｇ／ｋｇ）であっても、抗体番号１５０．１は、広範囲のＰＫに関連する優れた忍容性を示した。
実施例２６：カニクイザルにおける抗ｈＶＩＳＴＡ抗体である抗体番号１５０．１の血清曝露レベルと単球受容体占有率の関係を評価するためのインビボトキシコキネティック試験。
カニクイザルにおける１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇの反復静脈内（ＩＶ）投与後の新規抗ＶＩＳＴＡ抗体の血清曝露レベルと単球受容体占有率の関係を評価するためのトキシコキネティクス試験も行った。サルには７日ごとに合計４回の投与が行われた。血清曝露測定用の血液サンプリングは、１回目及び４回目の投与後０．０８３、６、２４、４８、７２または１６８時間の時点で実施した。これらのデータを表３６に報告する。受容体占有率測定用の血液サンプリングは、１回目及び４回目の投与後６、７２または１６８時間の時点で実施した。
カニクイザルにおける１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇの反復静脈内（ＩＶ）投与後の新規抗ＶＩＳＴＡ抗体の血清曝露レベルと単球受容体占有率の関係を評価するためのトキシコキネティクス試験も行った。サルには７日ごとに合計４回の投与が行われた。血清曝露測定用の血液サンプリングは、１回目及び４回目の投与後０．０８３、６、２４、４８、７２または１６８時間の時点で実施した。これらのデータを表３６に報告する。受容体占有率測定用の血液サンプリングは、１回目及び４回目の投与後６、７２または１６８時間の時点で実施した。
細胞サンプルは採血当日に凍結した。遊離、バックグラウンド、結合、及び全アッセイにおける生存、一重項、ＣＤ４５＋、ＣＤ１４＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋細胞の抗ＶＩＳＴＡ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７の蛍光強度中央値のフローサイトメトリー測定のため、すべての時点のサンプルを解凍し、染色し、同日に分析した。遊離及びバックグラウンドアッセイサンプルを、それぞれ、染色緩衝液または１０００ｕｇ／ｍＬの被験物質である抗体番号１５０．１とともに１／２時間インキュベートした後、抗ＣＤ４５－ＰＥ、抗ＣＤ１４－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１、抗ＨＬＡ－ＤＲ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、及び固定可能なＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｌｉｍｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅを含む染色カクテル、ならびに抗体番号１５０．１－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を添加した。サンプルを、固定／溶解溶液の添加によって固定した。結合及び全アッセイサンプルをそれぞれ、染色緩衝液または８０ｕｇ／ｍＬの被験物質抗体である抗体番号１５０．１とともに１時間インキュベートし、その後２回洗浄した。次に、サンプルを、抗ＣＤ４５－ＰＥ、抗ＣＤ１４－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１、抗ＨＬＡ－ＤＲ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、固定可能なＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｌｉｍｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ、及びヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＮＨＰ吸着）－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を含む染色カクテルとともにインキュベートした。サンプルを１回洗浄し、固定／溶解溶液の添加によって固定した。試験サンプル、ＱＣサンプル、ビーズ補正サンプル、及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ ＭＥＳＦビーズサンプルを、Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔアコースティックサイトメーターで得た。得られたサンプルの．ｆｃｓファイルを、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアで補正及び分析した。生存、一重項、ＣＤ４５＋、ＣＤ１４＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋細胞の抗ＶＩＳＴＡ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７の蛍光強度中央値を定量化し、Ｑｕａｎｔｕｍ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ ＭＥＳＦビーズ及びＱｕｉｃｋＣａｌ ｖ２．３定量ソフトウェアを適用することにより、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光強度の標準化された単位に変換した。これらの値を以下の計算に入力して、遊離受容体％（式１）、結合受容体％（式２）、及び加重受容体占有率％（式３）の値を生成した。１００％を超える式２の値は１００％に変換し、式３に入力した。データは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（３６５ ｆｏｒ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ）で分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖ８）でグラフ化した。加重受容体占有率％の値は、図及び表では「受容体占有率％」として報告した。
・式１：遊離ＶＩＳＴＡ％＝１００＊（遊離Ｔｉｍｅｐｏｉｎｔ－バックグラウンドＴｉｍｅｐｏｉｎｔ）／（遊離Ｐｒｅｄｏｓｅ－バックグラウンドＰｒｅｄｏｓｅ）
・式２：結合ＶＩＳＴＡ％＝１００＊（結合Ｔｉｍｅｐｏｉｎｔ－結合Ｐｒｅｄｏｓｅ）／（合計Ｔｉｍｅｐｏｉｎｔ－結合Ｐｒｅｄｏｓｅ）
・式３：加重ＲＯ％＝１００＊（１００－遊離％）／（（１００－遊離％）＋（１００－結合％））
・式１：遊離ＶＩＳＴＡ％＝１００＊（遊離Ｔｉｍｅｐｏｉｎｔ－バックグラウンドＴｉｍｅｐｏｉｎｔ）／（遊離Ｐｒｅｄｏｓｅ－バックグラウンドＰｒｅｄｏｓｅ）
・式２：結合ＶＩＳＴＡ％＝１００＊（結合Ｔｉｍｅｐｏｉｎｔ－結合Ｐｒｅｄｏｓｅ）／（合計Ｔｉｍｅｐｏｉｎｔ－結合Ｐｒｅｄｏｓｅ）
・式３：加重ＲＯ％＝１００＊（１００－遊離％）／（（１００－遊離％）＋（１００－結合％））
１０、３０、及び１００ｍｇ／ｋｇの抗体番号１５０．１投与群の平均ＶＩＳＴＡ受容体占有率レベルは、１０、３０、及び１００ｍｇ／ｋｇ群で、それぞれ、インビボ曝露レベル＞１８、６６、及び８２０ｕｇ／ｍｌにより、最初の投与後の１週間、＞９０％に維持された。１０及び３０ｍｇ／ｋｇの各投与群における１匹は、初回投与後１２０～１６８時間でベータ相クリアランスの加速を示し、血清曝露及び受容体占有率が中程度に減少した。対照的に、両動物は、初回投与後１６８時間にわたって持続的な高い曝露と受容体占有率を示した。４回目の投与後、１００ｍｇ／ｋｇを投与された動物における高い曝露レベルによって、高い受容体占有率レベルが維持され続けた。対照的に、４回目の投与後、３０及び１０ｍｇ／ｋｇ群の両方の動物において、受容体占有率は、曝露レベルと並行して急速に減少した。これはおそらくＡＤＡの発達によって説明され得る。図５７Ｆ～５７Ｎを参照されたい。
実施例２７：カニクイザルにおける抗ＶＩＳＴＡ Ｍａｂ免疫活性化のインビボ機能特性評価
抗体番号１７３．１、抗体番号１７３．４、抗体番号２８９．１及び抗体番号４２０．１抗体が、１０ｍｇ／ｋｇで単回及び反復静脈内投与後のカニクイザルの末梢血中の骨髄細胞活性化マーカーを調節する能力を以下の方法に従って評価した：
抗体番号１７３．１、抗体番号１７３．４、抗体番号２８９．１及び抗体番号４２０．１抗体が、１０ｍｇ／ｋｇで単回及び反復静脈内投与後のカニクイザルの末梢血中の骨髄細胞活性化マーカーを調節する能力を以下の方法に従って評価した：
並行（投与前）臨床病理サンプル収集のために、動物を投与前に絶食させた。各動物には、適切な試験抗体を単回静脈内（ＩＶ）投与した。１日目と８日目の処置の概要を表３７に示す。静脈内投与は、橈側皮／伏在（または他の適切な）静脈を介して施した。これらの投与は、少なくとも２分間にわたるゆっくりとした注射として施し、すべての採血時間は、投与の終了から計算した。
骨髄細胞集団及び活性化マーカーの発現は、エキソビボフローサイトメトリー分析によって評価した。細胞サンプルは採血当日に凍結し、分析まで保存した。すべての時点の投与前及び投与後のサンプルを、骨髄集団サイズ及び活性化マーカーの測定のために、同日に解凍、染色、及び分析した。サンプルを、一重項、生細胞、及びＣＤ４５＋細胞についてゲートした。骨髄細胞は、ＣＤ４５＋集団からＣＤ６６－ＣＤ３－ＣＤ８－ＣＤ２０－、側方散乱中間細胞として同定した。単球は、骨髄集団からＣＤ１４＋細胞として同定した。ＣＤ１４－ＨＬＡ－ＤＲ＋集団は、骨髄細胞の分析から同定した。骨髄ＤＣ（ｍＤＣ）は、ＣＤ１４－ＨＬＡ－ＤＲ＋集団からのＣＤ１ｃ＋及び／またはＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１２３－細胞として同定した。
抗ＶＩＳＴＡ抗体へのインビボ曝露後のｍＤＣ及びＣＤ１４＋集団における活性化マーカーの変化を測定した。図５８Ａ～５８Ｘは、エキソビボフローサイトメトリー分析によって同定された、投与前と比較したＭＦＩの変化％を示す。骨髄ＤＣ（ｍＤＣ）は、ＣＤ４５＋細胞のゲーティング分析によって同定した。ｍＤＣのＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＨＬＡ－ＤＲの平均蛍光強度を技術的に重複して取得し、ＦＭＯサンプルからのＭＦＩを差し引いた。投与前レベルに対するＭＦＩの変化パーセンテージを以下のように計算した：変化％＝１００＊（ＭＦＩＤｘ－ＭＦＩＤ０）／ＭＦＩＤ０。
骨髄活性化マーカーは、抗ＶＩＳＴＡ抗体によってｍＤＣと単球（ＣＤ１４＋細胞）の両方で上方制御された。抗体番号１７３．１は、両用量の投与の７２時間後にｍＤＣ上の活性化マーカーＣＤ８０及びＣＤ８６を強く上方制御し、ＨＬＡ－ＤＲを中程度上方制御した。抗体番号１７３．４は、初回投与後にｍＤＣ上のＣＤ８６及びＨＬＡ－ＤＲを中程度上方制御した。抗体番号１７３．１は、両用量の投与の７２時間にＣＤ１４＋細胞上の活性化マーカーＣＤ８０及びＣＤ８６を強く上方制御した。抗体番号１７３．４は、ＣＤ１４＋細胞上のＣＤ８０及びＣＤ８６を中程度に上方制御した。抗体番号１７３．１（ＷＴ）と比較して、抗体番号２８９．１（ＬＳ変異）は、ｍＤＣと単球（ＣＤ１４＋細胞）の両方でＣＤ８０の発現を高め、同時にＣＤ８６の誘導を低減（ｍＤＣで）または排除（単球で）した。ＣＤ８０及びＣＤ８６の誘導の振動リズムは、本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ抗体の薬物動態プロファイルと一致しており、このリズムは、ＷＴ抗体よりも変異型抗体でより顕著であった。これらのパターンは、ｍＤＣ集団とＣＤ１４＋集団の間で非常に類似していた。抗体番号４２０．１（ＹＴＥ変異）によるＣＤ８０及びＣＤ８６の結果は、抗体番号１７３．４（ＷＴ）によるものと最も類似していたが、多少より顕著であった（ＣＤ８０がより誘導され、ＣＤ８６はベースラインからより減少した）。ｍＤＣ及びＨＬＡ－ＤＲに対するＷＴによる中程度のＨＬＡ－ＤＲ誘導は、ＬＳ及びＹＴＥによってわずかに減少した（図５８Ａ～５８Ｘ）。
実施例２８：ＭＢ４９膀胱癌モデルにおける抗ＶＩＳＴＡ抗体の抗腫瘍活性
ＶＩＳＴＡヒトノックインマウス（１６～１９週齢）の右脇腹に、５ｘ１０５個のＭＢ４９細胞を含むＰＢＳ５０μＬを０日目に接種した。マウスの腫瘍増殖を観察し、平均腫瘍体積が約７０ｍｍ３に達した時点で処置群にランダム化した（１群あたりｎ＝１０～１１匹）。動物には、５日目から開始して３０ｍｇ／ｋｇのマウスＩｇＧ２ａ対照抗体（Ｂｉｏ ＸＣｅｌｌ、クローンＣ１．１８．４）、抗体番号２４５．２または抗体番号２４５．２ Ｌ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）を週に２回、合計６回注射した。腫瘍体積を２～３日ごとにノギスで測定した。試験の最終投与から２日後の２４日目に動物を安楽死させ、腫瘍、血液、及び流入領域リンパ節を採取した。２４日目の各群の平均腫瘍体積：ＩｇＧ２ａ（１５２２ｍｍ３）、２４５．２（５１１ｍｍ３）、及び２４５．２ＬＡＬＡ（１１１２ｍｍ３）（図５９Ａ～５９Ｄ）。抗ＶＩＳＴＡ抗体による処置は、２４５．２及び２４５．２ＬＡＬＡで、それぞれ、６６％及び２７％の腫瘍増殖阻害をもたらした。ＭＢ４９モデルでは、変異型Ｆｃ抗ＶＩＳＴＡ抗体の効力は、野生型抗ＶＩＳＴＡ ＩｇＧ２ａ抗体と比較して低下した。
ＶＩＳＴＡヒトノックインマウス（１６～１９週齢）の右脇腹に、５ｘ１０５個のＭＢ４９細胞を含むＰＢＳ５０μＬを０日目に接種した。マウスの腫瘍増殖を観察し、平均腫瘍体積が約７０ｍｍ３に達した時点で処置群にランダム化した（１群あたりｎ＝１０～１１匹）。動物には、５日目から開始して３０ｍｇ／ｋｇのマウスＩｇＧ２ａ対照抗体（Ｂｉｏ ＸＣｅｌｌ、クローンＣ１．１８．４）、抗体番号２４５．２または抗体番号２４５．２ Ｌ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）を週に２回、合計６回注射した。腫瘍体積を２～３日ごとにノギスで測定した。試験の最終投与から２日後の２４日目に動物を安楽死させ、腫瘍、血液、及び流入領域リンパ節を採取した。２４日目の各群の平均腫瘍体積：ＩｇＧ２ａ（１５２２ｍｍ３）、２４５．２（５１１ｍｍ３）、及び２４５．２ＬＡＬＡ（１１１２ｍｍ３）（図５９Ａ～５９Ｄ）。抗ＶＩＳＴＡ抗体による処置は、２４５．２及び２４５．２ＬＡＬＡで、それぞれ、６６％及び２７％の腫瘍増殖阻害をもたらした。ＭＢ４９モデルでは、変異型Ｆｃ抗ＶＩＳＴＡ抗体の効力は、野生型抗ＶＩＳＴＡ ＩｇＧ２ａ抗体と比較して低下した。
実施例２９：単剤抗ＶＩＳＴＡ Ｍａｂで、または併用療法として処置したＶＩＳＴＡ－ＫＩマウスのＭＢ４９腫瘍微小環境における免疫細胞の表現型の特性評価。
腫瘍浸潤免疫細胞の表現型をマルチパラメータフローサイトメトリー実験によって分析した。２４日目（６回投与から３日後）に腫瘍サンプルを３マウス／群から採取し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈの腫瘍解離キット、マウス（カタログ番号１３０－０９６－７３０）を使用して単細胞浮遊液を調製した。単細胞浮遊液をフローサイトメーター染色緩衝液（２％ＦＢＳ／ＰＢＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で最終濃度５０００万細胞／ｍＬに調製した。表現型分析用に細胞を染色するため、各腫瘍サンプルから調製した単細胞浮遊液５０ｕＬを９６ウェルのＵ底プレートに添加した。残りのサンプルを組み合わせてＦＭＯ染色に使用した。細胞を４００ｇ／５分間で遠心し、上清を廃棄した。５０ｕＬのブロック緩衝液を各サンプルに加え（１：５０希釈のＢＤマウスＦｃブロックカタログ番号５５３１４１を含むＦＣＳ緩衝液）、氷上で１５分間インキュベートした。抗体カクテルをサンプル数に基づいて調製し、各ＦＭＯカクテルを、全染色カクテルから１つのフルオロフォア結合抗体を除いたすべての抗体を加えて調製した。ブロック緩衝液で染色した細胞に、各サンプル及びＦＭＯに５０ｕＬの抗体カクテルを加え、氷上で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、細胞を４００ｇで５分間遠沈させ、上清を廃棄する。表面染色後、ＲＢＣを２００ｕＬの１×ＲＢＣ溶解緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号４２０３０１）で溶解し、室温で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を４００ｇで５分間遠沈させ、上清を廃棄する。表面染色後、ＲＢＣを溶解し、サンプルを１００ｕＬの１×１ステップＬｙｓｅ Ｆｉｘ緩衝液（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号００－５３３３－５４）で固定し、氷上で２０分間インキュベートした。細胞をフローサイトメトリー染色緩衝液で２回洗浄する。細胞を１２５ｕＬのフローサイトメトリー染色緩衝液に再懸濁し、Ａｔｔｕｎｅ ＮＸＴフローサイトメーターに流す。
腫瘍浸潤免疫細胞の表現型をマルチパラメータフローサイトメトリー実験によって分析した。２４日目（６回投与から３日後）に腫瘍サンプルを３マウス／群から採取し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈの腫瘍解離キット、マウス（カタログ番号１３０－０９６－７３０）を使用して単細胞浮遊液を調製した。単細胞浮遊液をフローサイトメーター染色緩衝液（２％ＦＢＳ／ＰＢＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で最終濃度５０００万細胞／ｍＬに調製した。表現型分析用に細胞を染色するため、各腫瘍サンプルから調製した単細胞浮遊液５０ｕＬを９６ウェルのＵ底プレートに添加した。残りのサンプルを組み合わせてＦＭＯ染色に使用した。細胞を４００ｇ／５分間で遠心し、上清を廃棄した。５０ｕＬのブロック緩衝液を各サンプルに加え（１：５０希釈のＢＤマウスＦｃブロックカタログ番号５５３１４１を含むＦＣＳ緩衝液）、氷上で１５分間インキュベートした。抗体カクテルをサンプル数に基づいて調製し、各ＦＭＯカクテルを、全染色カクテルから１つのフルオロフォア結合抗体を除いたすべての抗体を加えて調製した。ブロック緩衝液で染色した細胞に、各サンプル及びＦＭＯに５０ｕＬの抗体カクテルを加え、氷上で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、細胞を４００ｇで５分間遠沈させ、上清を廃棄する。表面染色後、ＲＢＣを２００ｕＬの１×ＲＢＣ溶解緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号４２０３０１）で溶解し、室温で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を４００ｇで５分間遠沈させ、上清を廃棄する。表面染色後、ＲＢＣを溶解し、サンプルを１００ｕＬの１×１ステップＬｙｓｅ Ｆｉｘ緩衝液（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号００－５３３３－５４）で固定し、氷上で２０分間インキュベートした。細胞をフローサイトメトリー染色緩衝液で２回洗浄する。細胞を１２５ｕＬのフローサイトメトリー染色緩衝液に再懸濁し、Ａｔｔｕｎｅ ＮＸＴフローサイトメーターに流す。
抗体番号２４５．２（Ｍｓｅ ＩｇＧ２ａ骨格）によるＭＢ４９膀胱腫瘍の処置により、ＮＫ細胞と同様にほとんどがＣＤ４＋である腫瘍内ＣＤ３＋Ｔ細胞の増加が誘導されるが、ＬＡＬＡ変異を有する抗体番号２４５．２は、腫瘍に浸潤するＴ細胞の頻度を増加させない。さらに、抗体番号２４５．２による処置により、腫瘍内の抑制性ｇＭＤＳＣの頻度が減少する。図５９Ｅ～５９Ｈを参照されたい。
実施例３０：Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ胸腺腫モデルにおける抗ＶＩＳＴＡ抗体の抗腫瘍活性
ＶＩＳＴＡヒトノックインマウス（１６～１８週齢）の右脇腹に、１ｘ１０６個のＥ．Ｇ７－ＯＶＡ細胞を含むＰＢＳ１００μＬを０日目に接種した。マウスの腫瘍増殖を観察し、平均腫瘍体積が約７０ｍｍ３に達した時点で処置群にランダム化した（１群あたりｎ＝１１～１２匹）。動物には、７日目から開始して３０ｍｇ／ｋｇのマウスＩｇＧ２ａ対照抗体（Ｂｉｏ ＸＣｅｌｌ、クローンＣ１．１８．４）、抗体番号２４５．２または抗体番号２４５．２ Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）を週に２回、合計６回注射した。腫瘍体積を２～３日ごとにノギスで測定した。試験の最終投与から２日後の２７日目に動物を安楽死させ、腫瘍、血液、及び流入領域リンパ節を採取した。２７日目の各群の平均腫瘍体積：ＩｇＧ２ａ（１６９２ｍｍ３）、２４５．２（５９４ｍｍ３）、及び２４５．２ＬＡＬＡ（７１６ｍｍ３）（図６０Ａ～６０Ｄ）。抗ＶＩＳＴＡ抗体による処置は、２４５．２及び２４５．２ＬＡＬＡで、それぞれ、６５％及び５８％の腫瘍増殖阻害をもたらした。Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡモデルでは、変異型Ｆｃ抗ＶＩＳＴＡ抗体の効力は、野生型抗ＶＩＳＴＡ ＩｇＧ２ａ抗体と比較してほぼ同等であった。抗体番号２４５．２及び抗体２４５．２ ＬＡＬＡによる処置により、それぞれ、３匹及び３匹で完全な腫瘍退縮が生じた。
ＶＩＳＴＡヒトノックインマウス（１６～１８週齢）の右脇腹に、１ｘ１０６個のＥ．Ｇ７－ＯＶＡ細胞を含むＰＢＳ１００μＬを０日目に接種した。マウスの腫瘍増殖を観察し、平均腫瘍体積が約７０ｍｍ３に達した時点で処置群にランダム化した（１群あたりｎ＝１１～１２匹）。動物には、７日目から開始して３０ｍｇ／ｋｇのマウスＩｇＧ２ａ対照抗体（Ｂｉｏ ＸＣｅｌｌ、クローンＣ１．１８．４）、抗体番号２４５．２または抗体番号２４５．２ Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）を週に２回、合計６回注射した。腫瘍体積を２～３日ごとにノギスで測定した。試験の最終投与から２日後の２７日目に動物を安楽死させ、腫瘍、血液、及び流入領域リンパ節を採取した。２７日目の各群の平均腫瘍体積：ＩｇＧ２ａ（１６９２ｍｍ３）、２４５．２（５９４ｍｍ３）、及び２４５．２ＬＡＬＡ（７１６ｍｍ３）（図６０Ａ～６０Ｄ）。抗ＶＩＳＴＡ抗体による処置は、２４５．２及び２４５．２ＬＡＬＡで、それぞれ、６５％及び５８％の腫瘍増殖阻害をもたらした。Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡモデルでは、変異型Ｆｃ抗ＶＩＳＴＡ抗体の効力は、野生型抗ＶＩＳＴＡ ＩｇＧ２ａ抗体と比較してほぼ同等であった。抗体番号２４５．２及び抗体２４５．２ ＬＡＬＡによる処置により、それぞれ、３匹及び３匹で完全な腫瘍退縮が生じた。
実施例３１：ｐＨ６．０とｐＨ７．４を対比して、ＶＩＳＴＡ－ＥＣＤからのオフレートを増加させる、抗体番号２４５．１及び４７４．１の重鎖及び軽鎖におけるヒスチジン置換。
ヒスチジンスイッチは、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びアスパラギン残基を標的とすることによって、抗体番号２４５．１及び抗体番号４７４．１の重鎖及び軽鎖の両方のＣＤＲ１～３に設計した。ＥＵ付番システムに従って、軽鎖のＹ３１Ｈ及び軽鎖のＹ３２Ｈの単一アミノ酸置換を、抗体番号２４５．１のバックグラウンドで行った。他のすべての単一及び複数の置換を、抗体番号４７４．１のバックグラウンドで行った。
ヒスチジンスイッチは、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びアスパラギン残基を標的とすることによって、抗体番号２４５．１及び抗体番号４７４．１の重鎖及び軽鎖の両方のＣＤＲ１～３に設計した。ＥＵ付番システムに従って、軽鎖のＹ３１Ｈ及び軽鎖のＹ３２Ｈの単一アミノ酸置換を、抗体番号２４５．１のバックグラウンドで行った。他のすべての単一及び複数の置換を、抗体番号４７４．１のバックグラウンドで行った。
ヒスチジン置換を含む抗体をＥｘｐｉ２９３細胞で発現させ、ｍＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅプロテインＡ樹脂で精製した。抗体－標的結合のカイネティクスは、抗ヒトＦｃ（ＡＨＣ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ １８－５０６０）及びＯｃｔｅｔ Ｋ２を使用し、２つのセンサーを並行して実行して評価した。抗体変異体を１ｘＰＢＳ ｐＨ７．４（ＧＥ ＳＨ３００２８．０２）で２０ｕｇ／ｍＬに希釈し、ＡＨＣバイオセンサーに１２０秒間ロードした。１ｘＰＢＳで１６０秒洗浄した後、ロードされたバイオセンサーを、２４０秒間の結合ステップのため、５０ｎＭのＶＩＳＴＡ－Ｈｉｓ ＥＣＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ １３４８２－Ｈ０８Ｈ）分析物に浸した。次に、並列バイオセンサーを、３６０秒間の解離ステップのため、１ｘＰＢＳに浸漬した。ここで、１つのＰＢＳサンプルはｐＨ７．４であり、他はｐＨ６．０である（１ＭのＨＣｌで調整）。データ分析を、Ｏｃｔｅｔデータ分析ソフトウェアバージョン９．０．０．１４を使用して行った。減算を行わないベースラインアラインメントを生データ処理に使用し、Ｓａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙデジタルフィルターを使用して高周波ノイズを除去した。処理されたデータを１：１結合モデルにグローバルフィットさせ、Ｋａ（１／ｍｓ）及びＫｄｉｓ（１／ｓ）を特定した。単一ヒスチジン置換がｐＨ６．０での抗体親和性に与える影響を表３８に示す（「ローディングサンプルＩＤ」は抗体番号である）。以下の抗体は、ｐＨ７．４では野生型と同様のＫａ及びＫｄｓを示したが、解離速度は、ｐＨ７．４と比較して、ｐＨ６．０では４～６倍増加した。抗体番号３７３．１、４６７．１、３３８．１、２７７．１及び４１９．１。変異は、ＥＵ付番システムに従って付番される。「ＶＨ」は、可変重鎖配列における変異を表す。「ＶＬ」は、可変軽鎖配列における変異を表す。抗体番号２４５．１をこの分析において未修飾の対照抗体として使用し、そのＣＤＲにヒスチジン置換を含まない。抗体番号４７４．１に対して１つ以上のヒスチジンスイッチの組み合わせを作成し、ｐＨ６．０とｐＨ７．４を対比したＶＩＳＴＡ－ＥＣＤのＫｄｓについて上記のように評価した。結果を表３９に示す。変異は、ＥＵ付番システムに従って付番される。「ＶＨ」は、可変重鎖配列における変異を表す。「ＶＬ」は、可変軽鎖配列における変異を表す。抗体番号２４５．１をこの分析において未修飾の対照抗体として使用した。これらの抗体置換は、単独または組み合わせて、ＶＩＳＴＡ受容体からの抗体のエンドソーム解離を増加させることが予測される。表３９の結果は、２つ以上のヒスチジン置換の組み合わせが、ｐＨ６．０でＶＩＳＴＡからの抗体の解離を増加させることができることを示している。
実施例３２：進行性固形腫瘍患者における抗ＶＩＳＴＡ抗体の第１／２相非盲検試験
抗ＶＩＳＴＡ抗体単剤及びペムブロリズマブとの併用の安全性及び有効性を、進行性固形腫瘍患者を対象とした第１／２相臨床試験で評価する。
抗ＶＩＳＴＡ抗体単剤及びペムブロリズマブとの併用の安全性及び有効性を、進行性固形腫瘍患者を対象とした第１／２相臨床試験で評価する。
この試験は、４つのパートで行われる。パートＡは、進行性腫瘍を有する対象に単剤として投与される抗ＶＩＳＴＡモノクローナル免疫グロブリン抗体の用量漸増で構成される。パートＢは、固定用量（３週間に１回（Ｑ３Ｗ）２００ｍｇ）のペムブロリズマブと組み合わせた抗ＶＩＳＴＡモノクローナル免疫グロブリン抗体による用量漸増で構成される。パートＡ及びＢの用量漸増は並行して進行する。パートＡ及びＢの試験集団は、用量レベルあたり最大６人の被験者で構成され、最大用量１ｇまで用量レベル間で抗ＶＩＳＴＡ抗体の用量が０．３～０．５対数増加する。投与は、０．１～１ｍｇの範囲の抗ＶＩＳＴＡ抗体の開始用量から始まり、その後２００ｍｇ～１ｇの範囲の最大用量まで増量される。用量が増加するまでの期間は、所定の用量に対する患者の反応によって異なる。抗ＶＩＳＴＡ抗体は、Ｑ３ＷでゆっくりとしたＩＶ注入によって投与される。抗ＶＩＳＴＡ抗体とペムブロリズマブは同日に投与され、最初にペムブロリズマブが３０分かけて静脈内注入によって投与される。各用量漸増コホートでは、最大６０人の被験者に処置される。
パートＣ及びＤは、それぞれの用量漸増群で最大耐量（ＭＴＤ）が定義された後に開始される（パートＡはパートＣに先立つ用量漸増群であり、パートＢはパートＤに先立つ用量漸増群である）。
コホートの拡大は、抗ＶＩＳＴＡ抗体の単独療法（パートＣ）及びペムブロリズマブとの併用（パートＤ）で実施され、抗ＶＩＳＴＡ抗体は、それぞれの用量漸増群で定義されたＭＴＤで投与される。パートＣでは、抗ＶＩＳＴＡ単独療法は、以前の化学療法（または化学放射線療法）、及び抗ＰＤ－１（または抗ＰＤ－Ｌ１療法）に失敗した、再発性もしくは進行性疾患を有する非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）または頭頸部扁平上皮がん（ＳＣＣＨＮ）の患者に投与され、例えば、該がんは、化学療法または化学放射線療法及び抗ＰＤ－１療法または抗ＰＤ－Ｌ１療法に耐性を有する。各腫瘍群で約２５人の被験者に処置され、パートＣでは合計５０人の被験者に処置される。
パートＤでは、ペムブロリズマブと組み合わせた抗ＶＩＳＴＡ抗体は、以下の疾患に限定された患者集団に投与される：（ｉ）ＮＳＣＬＣ、（ｉｉ）ＳＣＣＨＮ、（ｉｉｉ）肝細胞癌（ＨＣＣ）、（ｉｖ）卵巣がん及び（ｖ）子宮頸がんをそれぞれ有する患者。各腫瘍群で約２５人の被験者に処置され、パートＤでは合計１２５人の被験者に処置される。
各群の登録被験者は、それぞれの用量漸増群で定義されたＭＴＤで、治験薬（抗ＶＩＳＴＡ抗体）を１２週サイクルで最大４回（合計１６回）受ける資格がある。
パートＡ及びパートＢの被験者に関する追加の試験対象患者基準：（１）被験者は、組織学的または細胞学的に確認された進行性（転移性または切除不能）で既存の療法では治癒できない固形悪性腫瘍（中枢神経系の原発腫瘍を除く）を有し、（２）被験者は、進行性または転移性の状況において、少なくとも１つの標準治療レジメン後に進行したか、またはそれに耐性がない。
パートＣ及びパートＤの被験者の追加の試験対象患者基準は次の通りである。被験者は、以下の腫瘍特異的基準のうちの１つを満たす：ＮＳＣＬＣの場合、被験者は進行性または再発性疾患を伴う非扁平上皮組織型を有し、以前の化学療法（カルボプラチン／パクリタキセルまたはカルボプラチン／プレメトレキセド）及び抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１療法に失敗している必要があり、例えば、該がんは、化学療法（カルボプラチン／パクリタキセルまたはカルボプラチン／プレメトレキセド）及び抗ＰＤ－１療法または抗ＰＤ－Ｌ１療法に耐性を有する。ＥＧＦＲが変異したＮＳＣＬＣ被験者は、以前のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤療法に失敗していることが必要であり、例えば、該がんは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤療法に耐性を有する。ＡＬＫの転座を有する被験者は、以前のＡＬＫ阻害剤療法に失敗していることが必要であり、例えば、該がんは、ＡＬＫ阻害剤療法に耐性を有する。
ＳＣＣＨＮの場合、被験者は、組織学的に治癒不能、局所進行性、再発性または転移性ＳＣＣＨＮであることが確認されている必要がある。ＳＣＣＨＮの被験者は、以前の白金含有レジメンに失敗していること（例えば、該がんは、白金含有レジメンに耐性を有する）、及び治癒を目的とした放射線療法または外科的療法の候補者ではないことが必要である。
ＨＣＣの場合、被験者は進行性疾患を有すること、脳症及び臨床的に重大な食道静脈瘤がなく、チャイルド・ピュースコアが６未満で以前のソラフェニブ療法に失敗している（例えば、該がんは、ソラフェニブに耐性を有する）必要がある。子宮頸癌の場合、被験者は、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、または腺癌の組織型の再発性または転移性疾患を有すること、及び以前の白金ベースの療法に失敗している（例えば、該がんは、白金ベースの療法に耐性を有する）ことが必要である。卵巣癌患者は、以前のカルボプラチン／パクリタキセルまたは他の標準的な白金含有全身療法に失敗した疾患進行が記録された、組織学的に確認された上皮性卵巣癌を有する必要があり、例えば、該がんは、カルボプラチン／パクリタキセルまたは他の標準的な白金含有全身療法に耐性を有する。
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際に、記載されるものだけでなく、本発明の様々な修正が、上記の説明及び添付の図面から当業者に明らかとなるであろう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
本明細書に引用されるすべての参考文献（例えば、公開または特許または特許出願）は、各個別の参照文献（例えば、公開または特許または特許出願）が、参照によりすべての目的のために組み込まれることが特異的かつ個別に示されたものと同じ程度に、それらの全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (29)
- Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ含有サプレッサー（ＶＩＳＴＡ）に結合する抗体、またはその抗原結合断片であって、
５つすべてのＶＩＳＴＡに対するリガンドの結合をｐＨ６．０及びｐＨ７．４でブロックする前記抗体、またはその抗原結合断片であり、前記５つの既知のＶＩＳＴＡに対するリガンドは、ＶＳＩＧ－３（Ｖ－ｓｅｔ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ３）、ＶＳＩＧ－８（Ｖ－ｓｅｔ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ８）、ＰＳＧＬ－１（Ｐ－セレクチン糖タンパク質リガンド－１）、ＬＲＩＧ１（ロイシンリッチリピート及び免疫グロブリン様ドメイン１）ならびにＶＩＳＴＡであり、
重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、前記抗体、またはその抗原結合断片。 - Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）に結合する抗体、またはその抗原結合断片であって、
重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、前記抗体、またはその抗原結合断片であり、
前記ＶＨは、配列番号５８４～５９７、２２７～２４６、及び３８３～３８６のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５８４～５９７、２２７～２４６、及び３８３～３８６のいずれか１つを含む、またはそれからなる配列を含み、
前記ＶＬは、配列番号８４～１１０のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８４～１１０のいずれか１つを含む、またはそれからなる配列を含む、前記抗体、またはその抗原結合断片。 - 請求項１または請求項２に記載の抗体、またはその抗原結合断片であって、
Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号２４７～２５３のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号２８４～２９１のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号３１８～３２５のいずれか１つのＶＨ ＣＤＲ１、
Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号２５４～２６５のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号２９２～２９８のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号３２６～３３９のいずれか１つのＶＨ ＣＤＲ２、
Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号２６６～２８３のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号２９９～３１７のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号３４０～３５９のいずれか１つのＶＨ ＣＤＲ３、
Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号１１１～１２２のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号１５２～１６２のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号１８８～１９６もしくは５７６～５７８のいずれか１つのＶＬ ＣＤＲ１、
Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号１２３～１３１及び５７５のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号１６３～１６７のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号１９７～２０６のいずれか１つのＶＬ ＣＤＲ２、ならびに
Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号１３２～１５１のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号１６８～１８６のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号２０７～２２６のいずれか１つのＶＬ ＣＤＲ３を含む、前記抗体、またはその抗原結合断片。 - ＶＩＳＴＡに結合する抗体、またはその抗原結合断片であって、ＶＨ及びＶＬを含む前記抗体またはその抗原結合断片であり、
前記ＶＨは、
Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号２４７～２５３のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号２８４～２９１のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号３１８～３２５のいずれか１つのＶＨ ＣＤＲ１、
Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号２５４～２６５のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号２９２～２９８のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号３２６～３３９のいずれか１つのＶＨ ＣＤＲ２、
Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号２６６～２８３のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号２９９～３１７のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号３４０～３５９のいずれか１つのＶＨ ＣＤＲ３を含み、
前記ＶＬは、
Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号１１１～１２２のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号１５２～１６２のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号１８８～１９６もしくは５７６～５７８のいずれか１つのＶＬ ＣＤＲ１、
Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号１２３～１３１及び５７５のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号１６３～１６７のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号１９７～２０６のいずれか１つのＶＬ ＣＤＲ２、ならびに
Ｋａｂａｔ付番システムによって定義される配列番号１３２～１５１のいずれか１つ、ＩＭＧＴ付番システムによって定義される配列番号１６８～１８６のいずれか１つ、またはＰａｒａｔｏｍｅ付番システムによって定義される配列番号２０７～２２６のいずれか１つのＶＬ ＣＤＲ３を含む、前記抗体、またはその抗原結合断片。 - 請求項１または請求項４に記載の抗体、またはその抗原結合断片であって、
前記ＶＨは、配列番号５８４～５９７、２２７～２４６、及び３８３～３８６のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５８４～５９７、２２７～２４６、及び３８３～３８６のいずれか１つを含む、またはそれからなる配列を含み、
前記ＶＬは、配列番号８４～１１０のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８４～１１０のいずれか１つを含む、またはそれからなる配列を含む、前記抗体、またはその抗原結合断片。 - 請求項３または請求項４に記載の抗体、またはその抗原結合断片であって、
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２４７を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５４を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２６６を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１１を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２３を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３２を含むか、
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２８４を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２９２を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２９９を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１５２を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１６３を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１６８を含むか、
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号３１８を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号３２６を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３４０を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１８８を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１９７を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号２０７を含むか、
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２４８を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５５を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２６７を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１２を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２４を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３３を含むか、
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２８５を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２９３を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３００を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１５３を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１６４を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１６９を含むか、
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号３１９を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号３２７を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３４１を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１８９を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１９８を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号２０８を含むか、
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２４９を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５６を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２６８を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１３を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２５を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３４を含むか、
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２８６を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２９４を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３０１を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１５４を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１６５を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１７０を含むか、
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号３２０を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号３２８を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３４２を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１９０を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１９９を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号２０９を含むか、
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２５０を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５７を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２６９を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１４を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２６を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３５を含むか、
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２８７を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２９５を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３０２を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１５５を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１６５を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１７１を含むか、
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号３２１を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号３２９を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３４３を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１９１を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号２００を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号２１０を含むか、
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２５１を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５８を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２７０を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１５を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２７を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３６を含むか、
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２８８を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２９５を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３０３を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１５６を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１６６を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１７２を含むか、
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号３２２を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号３３０を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３４４を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１９２を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号２０１を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号２１１を含むか、
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２４８を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５９を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２７１を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１６を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２６を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３７を含むか、
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２８５を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２９６を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３０４を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１５７を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１６５を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１７３を含むか、または
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号３１９を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号３３１を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３４５を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１９３を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号２００を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号２１２を含む、前記抗体、またはその抗原結合断片。 - 請求項３または請求項４に記載の抗体、またはその抗原結合断片であって、
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２４７、配列番号２８４もしくは配列番号３１８を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５４、配列番号２９２もしくは配列番号３２６を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２６６、配列番号２９９もしくは配列番号３４０を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１１、配列番号１５２もしくは配列番号１８８を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２３、配列番号１６３もしくは配列番号１９７を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３２、配列番号１６８もしくは配列番号２０７を含むか、
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２４８、配列番号２８５もしくは配列番号３１９を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５５、配列番号２９３もしくは配列番号３２７を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２６７、配列番号３００もしくは配列番号３４１を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１２、配列番号１５３もしくは配列番号１８９を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２４、配列番号１６４もしくは配列番号１９８を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３３、配列番号１６９もしくは配列番号２０８を含むか、
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２４９、配列番号２８６もしくは配列番号３２０を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５６、配列番号２９４もしくは配列番号３２８を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２６８、配列番号３０１もしくは配列番号３４２を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１３、配列番号１５４もしくは配列番号１９０を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２５、配列番号１６５、もしくは配列番号１９９を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３４、配列番号１７０もしくは配列番号２０９を含むか、
前記ＶＨ１ ＣＤＲ１は、配列番号２５０、配列番号２８７、もしくは配列番号３２１を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５７、配列番号２９５もしくは配列番号３３２を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２６９、配列番号３０２もしくは配列番号３４６を含み、前記１９５、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１４、配列番号１５５もしくは配列番号１９１を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２６、配列番号１６５もしくは配列番号２００を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３５、配列番号１７１もしくは配列番号２１０を含むか、
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２５１、配列番号２８８もしくは配列番号３２２を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５８、配列番号２９５もしくは配列番号３３３を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２７０、配列番号３０３もしくは配列番号３４４を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１５、配列番号１５６もしくは配列番号１９２を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２７、配列番号１６６もしくは配列番号２０１を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３６、配列番号１７２もしくは配列番号２１１を含むか、または
前記ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号２４８、配列番号１８５もしくは配列番号３１９を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２５９、配列番号２９６もしくは配列番号３３１を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２７１、配列番号３０４もしくは配列番号３４５を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１１６、配列番号１５７もしくは配列番号１９３を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１２６、配列番号１６５もしくは配列番号２００を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３７、配列番号１７３もしくは配列番号２１２を含む、前記抗体、またはその抗原結合断片。 - 先行請求項のいずれか１項に記載の抗体、またはその抗原結合断片であって、
（ｉ）前記ＶＨは、配列番号５９２に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５９２を含む、またはそれからなる配列を含み、
前記ＶＬは、配列番号８６に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８６を含む、またはそれからなる配列を含むか、
（ｉｉ）前記ＶＨは、配列番号５８４に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５８４を含む、またはそれからなる配列を含み、
前記ＶＬは、配列番号８４に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８４を含む、またはそれからなる配列を含むか、
（ｉｉｉ）前記ＶＨは、配列番号５８５に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５８５を含む、またはそれからなる配列を含み、
前記ＶＬは、配列番号８５に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８５を含む、またはそれからなる配列を含むか、
（ｉｖ）前記ＶＨは、配列番号５８６に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５８６を含む、またはそれからなる配列を含み、
前記ＶＬは、配列番号８６に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８６を含む、またはそれからなる配列を含むか、
（ｖ）前記ＶＨは、配列番号５８７に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５８７を含む、またはそれからなる配列を含み、
前記ＶＬは、配列番号８７に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８７を含む、またはそれからなる配列を含むか、
（ｖｉ）前記ＶＨは、配列番号５８８に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５８８を含む、またはそれからなる配列を含み、
前記ＶＬは、配列番号８８に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８８を含む、またはそれからなる配列を含むか、
（ｖｉｉ）前記ＶＨは、配列番号５８９に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５８９を含む、またはそれからなる配列を含み、
前記ＶＬは、配列番号８９に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８９を含む、またはそれからなる配列を含むか、
（ｖｉｉｉ）前記ＶＨは、配列番号２３８に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号２３８を含む、またはそれからなる配列を含み、
前記ＶＬは、配列番号８４に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８４を含む、またはそれからなる配列を含むか、
（ｉｘ）前記ＶＨは、配列番号５９０に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５９０を含む、またはそれからなる配列を含み、
前記ＶＬは、配列番号８４に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８４を含む、またはそれからなる配列を含むか、
（ｘ）前記ＶＨは、配列番号５９１２３８に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５９１２３８を含む、またはそれからなる配列を含み、
前記ＶＬは、配列番号８５に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８５を含む、またはそれからなる配列を含むか、
（ｘｉ）前記ＶＨは、配列番号５９３に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５９３を含む、またはそれからなる配列を含み、
前記ＶＬは、配列番号８６に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８６を含む、またはそれからなる配列を含むか、
（ｘｉｉ）前記ＶＨは、配列番号５９３２３８に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５９３２３８を含む、またはそれからなる配列を含み、
前記ＶＬは、配列番号８７に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８７を含む、またはそれからなる配列を含むか、
（ｘｉｉｉ）前記ＶＨは、配列番号５９４に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５９４を含む、またはそれからなる配列を含み、
前記ＶＬは、配列番号８８４に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８８４を含む、またはそれからなる配列を含むか、あるいは
（ｘｉｖ）前記ＶＨは、配列番号５９５に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号５９５を含む、またはそれからなる配列を含み、
前記ＶＬは、配列番号８９に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号８９を含む、またはそれからなる配列を含む、前記抗体、またはその抗原結合断片。 - 先行請求項のいずれか１項に記載の抗体、またはその抗原結合断片であって、
配列番号４０７～４７７、５７２～５７４、及び６０４～６０９のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号４０７～４７７、５７２～５７４、及び６０４～６０９のいずれか１つを含む、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）配列を含み、
配列番号３８７～４０６、５６９～５７１、及び５９８～６０３のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、配列番号３８７～４０６、５６９～５７１、及び５９８～６０３のいずれか１つを含む、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）配列を含む、前記抗体、またはその抗原結合断片。 - ヒトＶＩＳＴＡ（配列番号３７７のアミノ酸３３～３１１）に結合する、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
- アミノ酸配列ＨＬＨＨＧ（配列番号３７７のアミノ酸９８～１０２）またはＶＶＥＩＲＨＨＨＳＥＨＲ（配列番号３７７のアミノ酸１４８～１５９）を含むヒトＶＩＳＴＡのエピトープに結合する、請求項１０に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
- 配列番号３７７のチロシン３７、アルギニン５４、バリン１１７及びアルギニン１２７を含むヒトＶＩＳＴＡのエピトープに結合する、請求項１０に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
- Ｆｃ領域を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体、またはその抗原結合断片であって、
任意選択で、前記Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域であるか、もしくは天然のヒトＦｃ領域と比較して、前記Ｆｃ領域に１～７個に及ぶアミノ酸変異を有する、前記ヒトＦｃ領域のバリアントである、及び／または
任意選択で、前記ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２もしくはヒトＩｇＧ４のものであり、さらに任意選択で、前記抗体は、ヒトＩｇＧ１もしくはヒトＩｇＧ４の定常領域、または天然の定常領域と比較して、前記定常領域に１～７個に及ぶアミノ酸変異を有する、前記定常領域のバリアントを含む、前記抗体、またはその抗原結合断片。 - 請求項１３に記載の抗体、またはその抗原結合断片であって、
（ａ）前記Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１のものであり、前記変異は、Ｃ２２０Ｄ、Ｄ２２１Ｃ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ｆ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３６Ｗ、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４１Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５６Ｎ、Ｖ２６４Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｈ２６８Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｅ２９４欠失、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｅ、Ｓ２９８Ａ、Ｔ３０７Ｐ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｍ、Ｌ３２８Ｒ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ａ、Ｐ３３１Ｓ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３７８Ｖ、Ｓ３８３Ｎ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、及びＮ４３４Ｙからなる群から選択され、ここで、残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されているか、
（ｂ）前記Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ２のものであり、前記変異は、Ｃ２２０Ｄ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４１Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５６Ｎ、Ｖ２６４Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｈ２６８Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｅ２９４欠失、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｅ、Ｓ２９８Ａ、Ｔ３０７Ｐ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｍ、Ｌ３２８Ｒ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ａ、Ｐ３３１Ｓ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ｓ３８３Ｎ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、及びＮ４３４Ｙからなる群から選択され、ここで、残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されているか、または
（ｃ）前記Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ４のものであり、前記変異は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ｆ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３６Ｗ、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４１Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５６Ｎ、Ｖ２６４Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｈ２６８Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｅ２９４欠失、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｅ、Ｓ２９８Ａ、Ｔ３０７Ｐ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｍ、Ｌ３２８Ｒ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３７８Ｖ、Ｓ３８３Ｎ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、及びＮ４３４Ｙからなる群から選択され、ここで、残基は、ＥＵ付番システムを使用して付番されている、前記抗体、またはその抗原結合断片。 - 二重特異性抗体または多重特異性抗体である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合断片が、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、または一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
- ヒトＶＩＳＴＡ（配列番号３７７）への結合をめぐって先行請求項に記載の抗体、またはその抗原結合断片のいずれか１つと競合する抗体、またはその抗原結合断片。
- 先行請求項のいずれか１項に記載の抗体、またはその抗原結合断片、及び治療薬を含む抗体－薬物複合体。
- 請求項１６に記載のｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
- 請求項１～１７のいずれか１項に記載の抗体、またはその抗原結合断片の前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨ及び前記ＶＬをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
- 請求項１～１７のいずれか１項に記載の抗体、またはその抗原結合断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む細胞。
- 請求項１～１７のいずれか１項に記載の抗体、もしくはその抗原結合断片、請求項１８に記載の抗体－薬物複合体、または請求項１９に記載のＣＡＲ、及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 請求項１～１７のいずれか１項に記載の抗体、またはその抗原結合断片を産生する方法であって、請求項２１に記載の細胞を、前記１つ以上のポリヌクレオチドが前記細胞によって発現されて、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記抗体、またはその抗原結合断片が産生されるような条件下で培養することを含む、前記方法。
- がん、自己免疫疾患、及び／または感染症の治療を必要とする対象におけるその治療方法であって、請求項２２に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
- 前記がんが、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、卵巣癌、神経芽腫、口腔癌、甲状腺癌、乳癌、肉腫、膵臓癌、結腸癌、胃癌、絨毛癌、精巣癌、中皮腫、皮膚癌、腎細胞癌、膀胱癌、血液癌、または子宮頸癌である、請求項２４に記載の方法。
- 前記がんが、転移性がんである、請求項２４または２５に記載の方法。
- 前記がんが、血液癌、急性骨髄性白血病、または骨髄異形成症候群である、請求項２４に記載の方法。
- 前記対象に追加の療法を施すことをさらに含み、任意選択で、前記追加の療法が、放射線療法、化学療法剤、標的療法、チロシンキナーゼ阻害剤、ホルモン療法、及び／または免疫チェックポイント阻害剤である、請求項２３～２７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記免疫チェックポイント阻害剤が、プログラム死－１（ＰＤ－１）、もしくはプログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）、または細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）の阻害剤である、請求項２８に記載の方法。
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