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JP2024504981A - 新規の操作されたヌクレアーゼおよびキメラヌクレアーゼ - Google Patents

新規の操作されたヌクレアーゼおよびキメラヌクレアーゼ Download PDF

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エム． テモーチェ－ディアス，モライマ
コスト，グレッグ
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Abstract

【解決手段】キメラヌクレアーゼおよびキメラヌクレアーゼシステムを含む、操作されたヌクレアーゼおよびヌクレアーゼシステムが本明細書において開示される。本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼおよびキメラヌクレアーゼは、核酸ガイドヌクレアーゼを含む。さらに、操作されたヌクレアーゼを作製する方法およびそれを使用する方法が、本明細書において開示される。【選択図】図１Ａ

Description

相互参照
本出願は、２０２１年５月６日に出願された、名称「ＥＮＺＹＭＥＳ ＷＩＴＨ ＲＵＶＣ ＤＯＭＡＩＮＳ」の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０３１１３６号、２０２０年２月１４日に出願された、名称「ＥＮＺＹＭＥＳ ＷＩＴＨ ＲＵＶＣ ＤＯＭＡＩＮＳ」の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１８４３２号に関し、それぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年８月２６日に出願された、名称「ＮＯＶＥＬ ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ ＡＮＤ ＣＨＩＭＥＲＩＣ ＮＵＣＬＥＡＳＥＳ」の米国仮特許出願第６３／２３７，４８４号、および２０２１年１月２２日に出願された、名称「ＮＯＶＥＬ ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ ＡＮＤ ＣＨＩＭＥＲＩＣ ＮＵＣＬＥＡＳＥＳ」の米国仮特許出願第６３／１４０，６２０号の優先権を主張するものであり、それぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Ｃａｓ酵素は、それらの関連するクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ガイドリボ核酸（ＲＮＡ）と共に、原核生物の免疫システムの広範（細菌の約４５％、古細菌の約８４％）な成分であるようであり、ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡガイド核酸切断による感染性ウイルスおよびプラスミドなどの非自己核酸からこうした微生物を保護するのに役立つ。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡエレメントをコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エレメントは、構造および長さが比較的保存され得るが、それらのＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質は、高度に多様であり、非常に様々な核酸相互作用ドメインを含有する。ＣＲＩＳＰＲ ＤＮＡエレメントは、早くも１９８７年に観察されているが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体のプログラム可能なエンドヌクレアーゼ切断能力は、比較的最近でしか認識されておらず、多様なＤＮＡ操作および遺伝子編集用途における組換えＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用につながっている。
一部の態様では、本開示は、（ａ）配列番号６９６またはそのバリアントと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼのＲｕｖＣドメイン、ＲＥＣドメイン、またはＨＮＨドメインの少なくとも一部を含むＮ末端配列；および（ｂ）配列番号６９７～７２１のいずれか一つまたはそのバリアントと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼのＷＥＤ、ＴＯＰＯ、またはＣＴＤドメインを含むＣ末端配列を含む融合エンドヌクレアーゼを提供し、当該Ｎ末端配列および当該Ｃ末端配列は、天然では、同じリーディングフレームにおいて一緒に生じない。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、クラスＩＩ、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、クラスＩＩ、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、当該Ｎ末端配列および当該Ｃ末端配列は、異なる生物に由来する。一部の実施形態では、当該Ｎ末端配列は、ＲｕｖＣ－Ｉ、ＢＨ、またはＲｕｖＣ－ＩＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、当該Ｃ末端配列は、ＰＡＭ相互作用ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、当該融合エンドヌクレアーゼは、配列番号１～２７または１０８のいずれか一つと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該融合エンドヌクレアーゼは、ｎｎＲＧＧｎＴ（配列番号５３）ではないＰＡＭに結合するように構成される。一部の実施形態では、当該融合エンドヌクレアーゼは、配列番号４６～５２または５４～６６のいずれか一つを含むＰＡＭに結合するように構成される。
一部の態様では、本開示は、配列番号１～２７または１０８のいずれか一つ、またはそのバリアントと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する操作されたアミノ酸配列を含むエンドヌクレアーゼを提供する。
一部の態様では、本開示は、配列番号１０９～１１０のいずれか一つ、またはそのバリアントと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する操作されたアミノ酸配列を含むエンドヌクレアーゼを提供する。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼ、融合エンドヌクレアーゼ、またはＣａｓ酵素のいずれかをコードする配列を含む核酸を提供する。一部の態様では、配列は、宿主細胞における発現のためコドン最適化される。一部の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞、真核細胞、哺乳類、またはヒトである。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される核酸配列のいずれかを含むベクターを提供する。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるベクター、システム、または核酸のいずれかを含む宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞、真核細胞、哺乳類、またはヒトである。
一部の態様では、本開示は、（ａ）本明細書に記載されるヌクレアーゼ、Ｃａｓ酵素、または融合エンドヌクレアーゼのいずれか；および（ｂ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成されたガイドリボ核酸を含む当該エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成された操作されたガイドリボ核酸構造を含む、操作されたヌクレアーゼシステムを提供し、当該ガイドリボ核酸配列は、当該エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されている。一部の実施形態では、当該ガイドリボ核酸は、当該エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、当該エンドヌクレアーゼは、培養されていない微生物に由来する。一部の実施形態では、当該エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ １２ｃエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｄエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｃエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓ１３ｄエンドヌクレアーゼではない。一部の実施形態では、当該エンドヌクレアーゼは、ＳｐｙＣａｓ９エンドヌクレアーゼと８６％未満の同一性を有する。一部の実施形態では、当該システムは、Ｍｇ２＋の供給源をさらに含む。一部の実施形態では、当該エンドヌクレアーゼは、配列番号８～１２、２６～２７、若しくは１０８のいずれか一つ、またはそのバリアントと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該ガイドリボ核酸配列は、配列番号３３、３４、４４、４５、７８、８４、または８７のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
一部の態様では、本開示は、（ａ）配列番号１～２７、１０８、もしくは１０９～１１０のいずれか一つ、またはそのバリアントのＲｕｖＣまたはＨＮＨドメインと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するクラスＩＩ、タイプＩＩ Ｃａｓ 酵素ＲｕｖＣまたはＨＮＨドメイン；および（ｂ）配列番号１～２７、１０８、もしくは１０９～１１０のいずれか一つ、またはそのバリアントのＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するクラスＩＩ、タイプＩＩ Ｃａｓ酵素ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含む操作されたヌクレアーゼを提供する。一部の実施形態では、（ａ）および（ｂ）は、天然では一緒に生じない。一部の実施形態では、当該クラスＩＩ、タイプＩＩ Ｃａｓ酵素は、培養されていない微生物に由来する。一部の実施形態では、当該エンドヌクレアーゼは、ＳｐｙＣａｓ９エンドヌクレアーゼと８６％未満の同一性を有する。一部の実施形態では、当該操作されたヌクレアーゼは、配列番号１～２７のいずれか一つまたはそのバリアントと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
一部の態様では、本開示は、（ａ）本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼのいずれか；および（ｂ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成され、当該エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたガイドリボ核酸配列を含む当該エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成された操作されたガイドリボ核酸構造を含む、操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。一部の実施形態では、当該ガイドリボ核酸は、当該エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、当該ガイドリボ核酸配列は、配列番号２８～３２もしくは３３～４４のいずれか一つ、またはそのバリアントの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、システムは、当該標的核酸部位に隣接する当該ヌクレアーゼと適合性があるＰＡＭ配列をさらに含む。一部の実施形態では、当該ＰＡＭ配列は、当該標的デオキシリボ核酸配列の３’に位置する。一部の実施形態では、当該ＰＡＭ配列は、当該標的デオキシリボ核酸配列の５’に位置する。一部の実施形態では、当該ＰＡＭ配列は、配列番号４６～６６のいずれか一つを含む。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるシステムのいずれかを細胞に導入することを含む、アルブミン遺伝子を標的化する方法を提供し、当該ガイドリボ核酸配列は、配列番号６７～８６のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列にハイブリダイズするよう構成されている。一部の実施形態では、当該細胞に導入することは、当該細胞を、当該融合タンパク質もしくは当該ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸もしくはベクターと接触させることをさらに含むか、または当該細胞を、当該ベクターもしくは核酸を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む。一部の実施形態では、当該細胞に導入することは、当該細胞を、当該融合タンパク質もしくは当該ガイドポリヌクレオチドを含むリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）と接触させることをさらに含むか、または当該細胞を、当該ＲＮＰを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるシステムのいずれかを細胞に導入することを含む、ＨＡＯ１遺伝子または遺伝子座を標的化する方法を提供し、当該ガイドリボ核酸配列は、配列番号６１１～６３３のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列にハイブリダイズするよう構成されている。一部の実施形態では、当該ガイドリボ核酸配列は、配列番号６１５、６１８、６２０、６２４、または６２６のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列にハイブリダイズするよう構成されている。一部の実施形態では、当該ガイドリボ核酸は、配列番号６４５～６８４のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該ガイドリボ核酸は、配列番号６４５～６４９、６５２～６５６、６６０～６７１、６７４～６７５、もしくは６８１～６８４のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列、または配列番号６４５～６４９、６５２～６５６、６６０～６７１、６７４～６７５、もしくは６８１～６８４のいずれか一つの標的化配列と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該細胞に導入することは、当該細胞を、当該融合タンパク質もしくは当該ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸もしくはベクターと接触させることをさらに含むか、または当該細胞を、当該ベクターもしくは核酸を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む。一部の実施形態では、当該細胞に導入することは、当該細胞を、当該融合タンパク質もしくは当該ガイドポリヌクレオチドを含むリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）と接触させることをさらに含むか、または当該細胞を、当該ＲＮＰを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む。
一部の実施形態では、本開示は、当該細胞に、（ａ）本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼのいずれか；および（ｂ）操作されたガイドＲＮＡを導入することを含む、細胞におけるＨＡＯ－１遺伝子座を破壊する方法を提供し、当該操作されたガイドＲＮＡは、当該エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、当該操作されたガイドＲＮＡは、当該ＨＡＯ－１遺伝子座の領域にハイブリダイズするよう構成された標的化配列を含み、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号６１１～６２６または６２７～６３３と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する標的化配列にハイブリダイズするよう構成されているか、または含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される融合または操作されたエンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される融合または操作されたエンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号１０またはそのバリアントと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号７２２の非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号６１８、６２０、６２４、もしくは６２６のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列、または配列番号６１８、６２０、６２４、もしくは６２６のいずれか一つの標的化配列と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、表９または表１２のガイドＲＮＡのいずれか一つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、細胞は、哺乳類細胞である。一部の実施形態では、当該細胞に導入することは、当該細胞を、当該融合タンパク質もしくは当該ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸もしくはベクターと接触させることをさらに含むか、または当該細胞を、当該ベクターもしくは核酸を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む。一部の実施形態では、当該細胞に導入することは、当該細胞を、当該融合タンパク質もしくは当該ガイドポリヌクレオチドを含むリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）と接触させることをさらに含むか、または当該細胞を、当該ＲＮＰを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む。
一部の態様では、本開示は、当該細胞に、（ａ）本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼのいずれか；および（ｂ）操作されたガイドＲＮＡを導入することを含む、細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子座を破壊する方法を提供し、当該操作されたガイドＲＮＡは、当該エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、当該操作されたガイドＲＮＡは、当該ＴＲＡＣ遺伝子座の領域にハイブリダイズするよう構成された標的化配列を含み、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号１３９～１５８と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する標的化配列にハイブリダイズするよう構成さるか、もしくは含むか、または当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号１１９～１３８のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される融合または操作されたエンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される融合または操作されたエンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される融合エンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号１０またはそのバリアントと少なくとも５５％の同一性を有する融合エンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号７２２の非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号１２１、１３２、１３６、１３０、１３４、１３５、もしくは１３７のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列、または配列番号１２１、１３２、１３６、１３０、１３４、１３５、もしくは１３７のいずれか一つの標的化配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、表７ＡのガイドＲＮＡのいずれか一つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、当該細胞に導入することは、当該細胞を、当該融合タンパク質もしくは当該ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸もしくはベクターと接触させることをさらに含むか、または当該細胞を、当該ベクターもしくは核酸を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む。一部の実施形態では、当該細胞に導入することは、当該細胞を、当該融合タンパク質もしくは当該ガイドポリヌクレオチドを含むリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）と接触させることをさらに含むか、または当該細胞を、当該ＲＮＰを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む。
一部の実施形態では、本開示は、当該細胞に、（ａ）本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼのいずれか；および（ｂ）操作されたガイドＲＮＡを導入することを含む、細胞におけるＢ２Ｍ遺伝子座を破壊する方法を提供し、当該操作されたガイドＲＮＡは、当該エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、当該操作されたガイドＲＮＡは、当該Ｂ２Ｍ遺伝子座の領域にハイブリダイズするよう構成された標的化配列を含み、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号１８５～２１０と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する標的化配列にハイブリダイズするよう構成された、もしくは含むか、または当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号１５９～１８４のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される融合または操作されたエンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される融合または操作されたエンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される融合エンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号１０またはそのバリアントと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む融合エンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号７２２の非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号１５９、１６５、１６８、１７４、もしくは１８４のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列、または配列番号１５９、１６５、１６８、１７４、もしくは１８４のいずれか一つの標的化配列と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、表７ＢのガイドＲＮＡのいずれか一つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、当該細胞に導入することは、当該細胞を、当該融合タンパク質もしくは当該ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸もしくはベクターと接触させることをさらに含むか、または当該細胞を、当該ベクターもしくは核酸を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む。一部の実施形態では、当該細胞に導入することは、当該細胞を、当該融合タンパク質もしくは当該ガイドポリヌクレオチドを含むリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）と接触させることをさらに含むか、または当該細胞を、当該ＲＮＰを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む。
一部の態様では、本開示は、当該細胞に、（ａ）本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼのいずれか；および（ｂ）操作されたガイドＲＮＡを導入することを含む、細胞におけるＴＲＢＣ１遺伝子座を破壊する方法を提供し、当該操作されたガイドＲＮＡは、当該エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、当該操作されたガイドＲＮＡは、当該ＴＲＢＣ１遺伝子座の領域にハイブリダイズするよう構成された標的化配列を含み、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号２５２～２９２と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する標的化配列にハイブリダイズするよう構成された、もしくは含むか、または操作されたガイドＲＮＡは、配列番号２１１～２５１のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される融合または操作されたエンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される融合または操作されたエンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される融合エンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号１０またはそのバリアントと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む融合エンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号７２２の非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号２１１、２１２、２１５、２４１、もしくは２４２のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むか、または配列番号２１１、２１２、２１５、２４１、もしくは２４２のいずれか一つの標的化配列と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する標的化配列を含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、表７ＣのガイドＲＮＡのいずれか一つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、当該細胞に導入することは、当該細胞を、当該融合タンパク質もしくは当該ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸もしくはベクターと接触させることをさらに含むか、または当該細胞を、当該ベクターもしくは核酸を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む。一部の実施形態では、当該細胞に導入することは、当該細胞を、当該融合タンパク質もしくは当該ガイドポリヌクレオチドを含むリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）と接触させることをさらに含むか、または当該細胞を、当該ＲＮＰを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む。
一部の態様では、本開示は、当該細胞に、（ａ）本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼのいずれか；および（ｂ）操作されたガイドＲＮＡを導入することを含む、細胞におけるＴＲＢＣ２遺伝子座を破壊する方法を提供し、当該操作されたガイドＲＮＡは、当該エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、当該操作されたガイドＲＮＡは、当該ＴＲＢＣ２遺伝子座の領域にハイブリダイズするよう構成された標的化配列を含み、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号３３８～３８２と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する標的化配列にハイブリダイズするよう構成されるか、もしくは含むか、または当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号２９３～３３７のいずれか一つ少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される融合または操作されたエンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される融合または操作されたエンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される融合エンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号１０またはそのバリアントと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む融合エンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号７２２の非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号２９６、３０６、もしくは３３２のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むか、または配列番号２９６、３０６、もしくは３３２のいずれか一つの標的化配列と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する標的化配列を含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、表７ＣのガイドＲＮＡのいずれか一つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、当該細胞に導入することは、当該細胞を、当該融合タンパク質もしくは当該ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸もしくはベクターと接触させることをさらに含むか、または当該細胞を、当該ベクターもしくは核酸を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む。一部の実施形態では、当該細胞に導入することは、当該細胞を、当該融合タンパク質もしくは当該ガイドポリヌクレオチドを含むリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）と接触させることをさらに含むか、または当該細胞を、当該ＲＮＰを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む。
一部の態様では、本開示は、当該細胞に、（ａ）本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼのいずれか；および（ｂ）操作されたガイドＲＮＡに導入することを含む、細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子座を破壊する方法を提供し、当該操作されたガイドＲＮＡは、当該エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、当該操作されたガイドＲＮＡは、当該ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子座の領域にハイブリダイズするよう構成された標的化配列を含み、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号４７８～５７２と少なくとも８０％の同一性を有する標的化配列にハイブリダイズするよう構成されるか、もしくは含むか、または当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号３８３～４７７のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される融合または操作されたエンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される融合または操作されたエンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される融合エンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号１０またはそのバリアントと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する融合エンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号７２２の非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号４１９、４２５、４３１、４３９、４４７、４５３、４６１、４６７、４７１、もしくは４７３のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列、または配列番号４１９、４２５、４３１、４３９、４４７、４５３、４６１、４６７、４７１、もしくは４７３のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、表７ＤのガイドＲＮＡのいずれか一つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、当該細胞に導入することは、当該細胞を、当該融合タンパク質もしくは当該ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸もしくはベクターと接触させることをさらに含むか、または当該細胞を、当該ベクターもしくは核酸を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む。一部の実施形態では、当該細胞に導入することは、当該細胞を、当該融合タンパク質もしくは当該ガイドポリヌクレオチドを含むリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）と接触させることをさらに含むか、または当該細胞を、当該ＲＮＰを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む。
一部の態様では、本開示は、当該細胞に、（ａ）本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼのいずれか；および（ｂ）操作されたガイドＲＮＡを導入することを含む、細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子座を破壊する方法を提供し、当該操作されたガイドＲＮＡは、当該エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、当該操作されたガイドＲＮＡは、当該ＰＣＳＫ９遺伝子座の領域にハイブリダイズするよう構成された標的化配列を含み、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号５８８～６０２と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する標的化配列にハイブリダイズするよう構成されるか、もしくは含むか、または当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号５７３～５８７のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される融合または操作されたエンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される融合または操作されたエンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される融合エンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号１０またはそのバリアントと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む融合エンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号７２２の非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドは、配列番号５７４、５７８、５８１、または５８５のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、表７ＥのガイドＲＮＡのいずれか一つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、当該細胞に導入することは、当該細胞を、当該融合タンパク質もしくは当該ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸もしくはベクターと接触させることをさらに含むか、または当該細胞を、当該ベクターもしくは核酸を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む。一部の実施形態では、当該細胞に導入することは、当該細胞を、当該融合タンパク質もしくは当該ガイドポリヌクレオチドを含むリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）と接触させることをさらに含むか、または当該細胞を、当該ＲＮＰを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む。
一部の実施形態では、本開示は、当該細胞に、（ａ）本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼのいずれか；および（ｂ）操作されたガイドＲＮＡを導入することを含む、細胞におけるアルブミン遺伝子座を破壊する方法を提供し、当該操作されたガイドＲＮＡは、当該エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、当該操作されたガイドＲＮＡは、当該アルブミン遺伝子座の領域にハイブリダイズするよう構成された標的化配列を含み、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号６７～８６もしくは６４６～６９５のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むか、または当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号６７～８６もしくは６４６～６９５のいずれか一つの標的化配列と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する標的化配列を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される融合または操作されたエンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される融合または操作されたエンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、本明細書に記載されるタイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号１０またはそのバリアントと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する融合エンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号７２２の非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、配列番号６７、６８、７０、７１、７２、７６、７９、８０、６４７、６４８、６４９、６５３、６５４、６５５、６５６、６７３、６８０、６８１、または６８２のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列に相補的であるか、または含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドＲＮＡは、表６のガイドＲＮＡのいずれか一つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、当該細胞に導入することは、当該細胞を、当該融合タンパク質もしくは当該ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸もしくはベクターと接触させることをさらに含むか、または当該細胞を、当該ベクターもしくは核酸を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む。一部の実施形態では、当該細胞に導入することは、当該細胞を、当該融合タンパク質もしくは当該ガイドポリヌクレオチドを含むリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）と接触させることをさらに含むか、または当該細胞を、当該ＲＮＰを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む。
一部の態様では、本開示は、配列番号１～２７、１０８、または１０９～１１０のいずれか一つと少なくとも５５％の配列同一性を有する操作されたアミノ酸配列を含むエンドヌクレアーゼを提供する。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼ、ならびに標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成されたガイドリボ核酸配列；および当該エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含むエンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成された操作されたガイドリボ核酸構造を含む、操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、培養されていない微生物に由来する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ １２ｃエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｄエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｃエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓ１３ｄエンドヌクレアーゼではない。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＳｐｙＣａｓ９エンドヌクレアーゼと８６％未満の同一性を有する。一部の実施形態では、システムは、ＭＧ２＋の供給源をさらに含む。
一部の態様では、本開示は、（ａ）配列番号１～２７、１０８、または１０９～１１０のいずれか一つのＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインと少なくとも５５％の配列同一性を有するクラスＩＩ、タイプＩＩ Ｃａｓ酵素ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメイン；ならびに（ｂ）配列番号１～２７、１０８、または１０９～１１０のいずれか一つのＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインと少なくとも５５％の配列同一性を有するクラスＩＩ、タイプＩＩ Ｃａｓ酵素ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含む、操作されたヌクレアーゼを提供する。一部の実施形態では、（ａ）および（ｂ）は、天然では一緒に生じない。一部の実施形態では、クラスＩＩ、タイプＩＩ Ｃａｓ酵素は、培養されていない微生物に由来する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＳｐｙＣａｓ９エンドヌクレアーゼと８６％未満の同一性を有する。一部の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、配列番号１～２７のいずれか一つと少なくとも５５％の配列同一性を有する配列を含む。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかによるエンドヌクレアーゼ；ならびに標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成されたガイドリボ核酸配列；およびエンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含むエンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成された操作されたガイドリボ核酸構造を含む、操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。一部の実施形態では、ガイドリボ核酸配列は、配列番号２８～３２もしくは３３～４４のいずれか一つ、またはそのバリアントの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、システムは、標的核酸部位に隣接するヌクレアーゼと適合性があるＰＡＭ配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、標的デオキシリボ核酸配列の３’に位置する。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、配列番号４６～６６のいずれか一つを含む。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される態様または実施形態によるクラスＩＩ、タイプＩＩ酵素と適合性がある操作された一分子異種ガイドポリヌクレオチドを提供し、異種ガイドポリヌクレオチドは、配列番号６４５～６８４のいずれか一つに記載の化学修飾を含む。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される態様または実施形態のいずれか一つによるシステムを細胞に導入することを含む、アルブミン遺伝子を標的化する方法を提供し、ガイドリボ核酸配列は、配列番号６７～８６のいずれか一つを含む配列にハイブリダイズするよう構成されている。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される態様または実施形態のいずれか一つによるシステムを細胞に導入することを含む、ＨＡＯ１遺伝子を標的化する方法を提供し、ガイドリボ核酸配列は、配列番号６１１～６３３のいずれか一つにハイブリダイズするよう構成されている。一部の実施形態では、ガイドリボ核酸配列は、配列番号６１５、６１８、６２０、６２４、または６２６のいずれか一つにハイブリダイズするよう構成されている。一部の実施形態では、ガイドリボ核酸は、配列番号６４５～６８４のいずれか一つによる配列を含む。一部の実施形態では、ガイドリボ核酸は、配列番号６４５～６４９、６５２～６５６、６６０～６７１、６７４～６７５、または６８１～６８４のいずれか一つによる配列を含む。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼを含む細胞を提供する。一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるいずれかの核酸分子を含む細胞を提供する。一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるいずれかの操作されたヌクレアーゼシステムを含む細胞を提供する。
本開示のさらなる態様および利点は、以下の詳細な説明から、当業者に容易に明らかになり、ここで、本開示の例示的な実施形態のみが示され、記載される。理解されるように、本開示は、他の異なる実施形態をすることができ、そのいくつかの詳細は、すべて本開示から逸脱することなく、様々な明白な点において改変することができる。したがって、図面および説明は、本質的に例示とみなされるべきであり、制限としみなされるべきではない。
参照による組み込み
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれるべきことが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に特記して記載される。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および添付の図面（また、本明細書において「図」および「図」）を参照することによって得られるだろう。
図１Ａ～１Ｂは、本明細書に記載される様々なエフェクターの天然のＰＡＭ特異性を示す。図１Ａは、本明細書に記載される様々なエフェクターの系統樹を示す。 図１Ｂは、天然のＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼのＰＡＭ特異性の表である。
図２は、ＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ間のドメイン交換の概念を示す。
図３Ａおよび３Ｂは、最適なブレークポイントの決定をガイドするための複数の配列のアライメントを示す。図３Ａは、本明細書に記載されるいくつかのタンパク質にアラインしたＳａＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９を示し、これらの配列の末端の保存された残基（アラニン残基）を、交換したセクションの提案したＣ末端として識別する。 図３Ｂは、ＲｕｖＣ－ＩＩＩドメイン、ＷＥＤドメイン、ＴＯＰＯドメイン、およびＣＴＤドメインの交換したスパンのＳａＣａｓ９タンパク質のＣ末端ドメインを示す。ＰＡＭ相互作用ドメインは、ＴＯＰＯドメインおよびＣＴＤドメインから構成される。活性部位残基（ＲｕｖＣドメインのＤ１０、Ｅ４７７、およびＨ７０１、ならびにＮＨＮドメインのＤ５５６、Ｄ５５７、およびＮ５８０）は、交換したＣ末端ドメインに含まれない。
図４は、密接に関連するヌクレアーゼおよび遠く関連するヌクレアーゼ由来の様々なＣ末端ドメインとＭＧ３－６を組換える際の、インビトロＰＡＭ濃縮アッセイを用いたキメラのスクリーニングを示す。Ｎ末端親ドメイン由来のｓｇＲＮＡを、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ活性に使用した。
図５Ａ～５Ｂは、ＰＡＭ配列（図５Ａ）および本明細書に記載される機能的キメラのＰＡＭ配列の配列ロゴ表示（図５Ｂ）を示す。ＲｕｖＣ－ＩＩＩ、ＷＥＤ、ＴＯＰＯおよびＣＴＤの予測Ｃ末端ドメインのブレークポイント交換を考慮すると、密接に関連するヌクレアーゼと再度組換える場合、キメラは機能的であった。操作したキメラは、天然タンパク質が同じ実験で機能していない場合であっても、天然タンパク質のＰＡＭ相互作用ドメイン由来のＰＡＭ特異性を保存する傾向にあった。 図５Ａ～５Ｂは、ＰＡＭ配列（図５Ａ）および本明細書に記載される機能的キメラのＰＡＭ配列の配列ロゴ表示（図５Ｂ）を示す。ＲｕｖＣ－ＩＩＩ、ＷＥＤ、ＴＯＰＯおよびＣＴＤの予測Ｃ末端ドメインのブレークポイント交換を考慮すると、密接に関連するヌクレアーゼと再度組換える場合、キメラは機能的であった。操作したキメラは、天然タンパク質が同じ実験で機能していない場合であっても、天然タンパク質のＰＡＭ相互作用ドメイン由来のＰＡＭ特異性を保存する傾向にあった。
図６は、密接に関連するヌクレアーゼおよび遠く関連するヌクレアーゼ由来の様々なｃ末端ドメインとＭＧ３－６を組換えているキメラを用いたインビトロＰＡＭ濃縮アッセイを用いたキメラのスクリーニングを示す。Ｃ末端親ドメイン由来のｓｇＲＮＡを、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ活性に使用した。括弧内の数字は、ｓｇＲＮＡ種を示す。Ｃ末端親ドメインからのｓｇＲＮＡの使用は、活性を救出しなかった。
図７は、ＭＧ３－６およびＭＧ１５－１の予測した構造を示す。ＭＧ３－６のＷＥＤドメインおよびＰＩドメインを、ＭＧ１５－１対応物のドメインと交換して、キメラ１（Ｃ１）を生成した。あるいは、ＭＧ３－６のＰＩドメインをＭＧ１５－１の対応物と交換して、キメラ２（Ｃ２）を生成した。
図８Ａ～８Ｂは、ＰＡＭ特異性についてのインビトロＰＡＭ濃縮アッセイおよびサンガー配列決定の結果を示す。Ｃ１：ＭＧ３－６＋ＭＧ１５－１（ＷＰ）およびＣ２：ＭＧ３－６＋ＭＧ１５－１（Ｐ）。操作したキメラは、天然タンパク質のＰＡＭ相互作用ドメイン由来のＰＡＭ特異性を保存する傾向にある。ＰＡＭ濃縮アッセイを３回行った。（図８Ａ）は、配列を活性酵素の存在下で切断したことを示すアッセイのアガロースゲル表示を示し、（図８Ｂ）は、アッセイによって決定したＰＡＭ配列のＳｅｑＬｏｇｏ表示を示す。 図８Ａ～８Ｂは、ＰＡＭ特異性についてのインビトロＰＡＭ濃縮アッセイおよびサンガー配列決定の結果を示す。Ｃ１：ＭＧ３－６＋ＭＧ１５－１（ＷＰ）およびＣ２：ＭＧ３－６＋ＭＧ１５－１（Ｐ）。操作したキメラは、天然タンパク質のＰＡＭ相互作用ドメイン由来のＰＡＭ特異性を保存する傾向にある。ＰＡＭ濃縮アッセイを３回行った。（図８Ａ）は、配列を活性酵素の存在下で切断したことを示すアッセイのアガロースゲル表示を示し、（図８Ｂ）は、アッセイによって決定したＰＡＭ配列のＳｅｑＬｏｇｏ表示を示す。
図９Ａ～９Ｂは、哺乳類細胞における本明細書に記載されるキメラの活性を示す。キメラに対するｍＲＮＡの交配を、２０個の異なるｓｇＲＮＡ（例えば、配列番号６７～８６を参照）とＨｅｐａ １－６細胞に共トランスフェクトした。編集を、サンガー配列決定およびＣＲＩＳＰＲ編集（ＩＣＥ）の推論によって評価した。図９Ａは、試験したガイドの編集効率を示す。二つの生物学的複製物を示す。 図９Ｂは、代表的なガイドによって生じたインデルプロファイルを示す。
図１０は、Ｈｅｐａ１－６細胞におけるガイド画面の結果を示し、ガイドを、リポフェクタミンメッセンジャーマックスを使用してｍＲＮＡおよびｇＲＮＡとして送達した。
図１１Ａは、ＭＧ３－６／３－４ガイドの構造部分を示す。 図１１Ｂは、ＭＧ３－６ガイドの構造部分を示す。
図１２は、リポフェクタミンメッセンジャーマックスを使用してｍＲＮＡおよびｇＲＮＡとして送達したときの、Ｈｅｐａ１－６細胞における化学的に修飾したＭＧ３－６／３－４ガイドの活性を示す。
図１３は、３７℃で９時間にわたる化学修飾したＭＧ３－６／３－４ガイドの安定性を示す。
図１４は、３７℃で２１時間にわたる化学修飾したＭＧ３－６／３－４ガイドの安定性を示す。
図１５Ａ～１５Ｂは、タイプＶ－Ａキメラのインビトロスクリーニングを示す。図１５Ａは、各切断反応についての増幅した切断産物のアガロースゲルを示す。同じファミリーからのドメイン交換（括弧内の数字はｓｇＲＮＡ種を示す）であるＭＧ２９－１＋ＭＧ２９－５キメラで、陽性濃縮を観察する。 図１５Ｂは、親酵素およびそれから誘導したキメラについてのＰＡＭのＳｅｑｌｏｇｏ表示を示す。
図１６は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＴＲＡＣのＤＮＡレベルでの遺伝子編集結果を示す。
図１７は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＢ２ＭのＤＮＡレベルでの遺伝子編集結果を示す。
図１８は、Ｔ細胞におけるＴＲＡＣのＤＮＡおよび表現型レベルでの遺伝子編集結果を示す。
図１９は、Ｔ細胞におけるＢ２ＭのＤＮＡレベルでの遺伝子編集結果を示す。
図２０は、Ｔ細胞におけるＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２の表現型レベルでの遺伝子編集結果を示す。
図２１は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３のＤＮＡレベルでの遺伝子編集結果を示す。
図２２は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるＰＣＳＫ９のＤＮＡレベルでの遺伝子編集結果を示す。
図２３は、次世代配列決定により分析した野生型マウスにおける、ＭＧ３－６／３－４によるＨＡＯ－１遺伝子座でのゲノム編集を示す。
図２４は、ＭＧ３－６／３－４ ｍＲＮＡおよびＨＡＯ－１遺伝子を標的化するガイドＲＮＡで処置したマウスの肝臓におけるグリコール酸オキシダーゼタンパク質レベルを示す。
図２５は、ＭＧ３－６／３－４ ｍＲＮＡおよび四つの異なる化学修飾を有するＨＡＯ－１を標的化するガイドＲＮＡ７（Ｇ７）で処置した野生型マウスにおけるＨＡＯ－１遺伝子座でのゲノム編集を示す。
図２６は、ＭＧ３－６／３－４ ｍＲＮＡおよび四つの異なる化学修飾を有するｓｇＲＮＡ ７（Ｇ７）を封入しているＬＮＰを用いた処置の１１日後のマウスの肝臓におけるグリコール酸オキシダーゼ（ＧＯ）タンパク質レベルでのウェスタンブロット分析を示す。
配列表の簡単な説明
本明細書と共に提出された配列表は、本開示による方法、組成物、およびシステムで使用するためのポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の例を提供する。以下は、その中の配列の説明例である。
ＭＧ３－６キメラ
配列番号１～２７は、ＭＧ３－６キメラヌクレアーゼの全長ペプチド配列を示す。
配列番号１０８は、５’ＵＴＲ、ＮＬＳ、ＣＤＳ、ＮＬＳ、３’ＵＴＲ、およびｐｏｌｙＡテールを含むＭＧ３－６／３－４ヌクレアーゼのヌクレオチド配列を示す。
配列番号２８～４５および６０５～６１０は、ＭＧ３－６キメラヌクレアーゼで機能するよう操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号４６～５９は、様々なエフェクターの天然ＰＡＭ特異性を示す。
配列番号６０～６６は、本明細書に記載されるキメラヌクレアーゼのＰＡＭ特異性を示す。
配列番号６０３は、ＭＧ３－６／３－４のＤＮＡコード配列を示す。
配列番号６０４は、ＭＧ３－６／３－４カセットコード配列のタンパク質配列を示す。
ＭＧ２９－１キメラ
配列番号１０９～１１０は、ＭＧ２９－１キメラヌクレアーゼの全長ペプチド配列を示す。
配列番号１１１～１１３は、ＭＧ２９－１キメラヌクレアーゼで機能するよう操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１１４～１１６は、様々なエフェクターの天然ＰＡＭ特異性を示す。
配列番号１１７は、本明細書に記載されるキメラヌクレアーゼのＰＡＭ特異性を示す。
ＴＲＡＣ標的化
配列番号１１９～１３８は、ＴＲＡＣを標的化するために、ＭＧ３－６／３－４ヌクレアーゼで機能するよう操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１３９～１５８は、ＴＲＡＣ標的部位のＤＮＡ配列を示す。
Ｂ２Ｍ標的化
配列番号１５９～１８４は、Ｂ２Ｍを標的化するために、ＭＧ３－６／３－４ヌクレアーゼで機能するよう操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１８５～２１０は、Ｂ２Ｍ標的部位のＤＮＡ配列を示す。
ＴＲＢＣ１標的化
配列番号２１１～２５１は、ＴＲＢＣ１を標的化するために、ＭＧ３－６／３－４ヌクレアーゼで機能するよう操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号２５２～２９２は、ＴＲＢＣ１標的部位のＤＮＡ配列を示す。
ＴＲＢＣ２標的化
配列番号２９３～３３７は、ＴＲＢＣ２を標的化するために、ＭＧ３－６／３－４ヌクレアーゼで機能するよう操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号３３８～３８２は、ＴＲＢＣ２標的部位のＤＮＡ配列を示す。
ＡＮＧＰＴＬ３標的化
配列番号３８３～４７７は、ＡＮＧＰＴＬ３を標的化するために、ＭＧ３－６／３－４ヌクレアーゼで機能するよう操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号４７８～５７２は、ＡＮＧＰＴＬ３標的部位のＤＮＡ配列を示す。
ＰＣＳＫ９標的化
配列番号５７３～５８７は、ＰＣＳＫ９を標的化するために、ＭＧ３－６／３－４ヌクレアーゼで機能するよう操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号５８８～６０２は、ＰＣＳＫ９標的部位のＤＮＡ配列を示す。
本発明の様々な実施形態は本明細書に示され、記載されるが、このような実施形態が、例示の目的でのみ提供されることは、当業者には明らかであろう。多数の変形、変更、および置換は、本発明から逸脱することなく、当業者にとって生じ得る。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替が用いられ得ることは、理解されるべきである。
本明細書に開示されるいくつかの方法の実践は、別段の示唆がない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、および組換えＤＮＡの技術を用いる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（２０１０））（参照により本明細書に完全に組み込まれる）を参照のこと。
本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、用語「含むこと」、「含む」、「有すること」、「有する」、「有する」、またはそのバリアントが、詳細な説明または特許請求の範囲のいずれかで使用される限りにおいて、かかる用語は、用語「含むこと」と類似した様式で包含的であることが意図される。
用語「約」または「およそ」は、当業者によって決定される特定の値についての許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるか、例えば、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該技術分野の慣行によると、一つ以上の標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１５％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味し得る。
本明細書において使用される場合、「細胞」は概して生物学的細胞を指す。細胞は、生きている生物の基本的な構造、機能、または生物学的単位であり得る。細胞は、一つまたは複数の細胞を有する任意の生物を起源とし得る。いくつかの非限定的な例としては、原核細胞、真核生物の細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単一細胞の真核生物の細胞、原虫細胞、植物由来の細胞（例えば、植物作物、果実、野菜、穀物、大豆、トウモロコシ、トウモロコシ、小麦、種子、トマト、米、キャッサバ、サトウキビ、カボチャ、乾草、 ジャガイモ、綿、大麻、タバコ、開花している植物、針葉樹、ジムノスパーム、シダ、ヒカゲノカズラ、ツノゴケ、コケ植物、コケ由来の細胞）、藻類の細胞（例えば、ボトリオコッカス・ブラウニイ（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ）、クラミドモナス・ラインハートティ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ナンノクロロプシス・ガジタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）、クロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、サルガッスム・パテンスＣ．アガード（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ Ｃ．Ａｇａｒｄｈ）など）、海藻（例えば、ケルプ）、真菌細胞（例えば、酵母細胞、キノコ由来の細胞）、動物細胞、脊椎動物（例えば、フルーツフライ、クニダリアン、エキノデルム、線虫など）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）由来の細胞、哺乳類（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒトなど）由来の細胞などが挙げられる。場合によっては、細胞は、天然の生物に由来するものではない（例えば、細胞は、合成的に作製されてもよく、時には人工細胞と呼ばれることがある）。
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、概して、塩基－糖－リン酸の組み合わせを指す。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドアナログを含んでもよい。ヌクレオチドは、核酸配列（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ））の単量体単位であってもよい。ヌクレオチドという用語は、リボヌクレオシド三リン酸アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シトシン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはその誘導体を含み得る。かかる誘導体としては、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７－ジアザ－ｄＧＴＰおよび７－ジアザ－ｄＡＴＰ、ならびにそれらを含有する核酸分子にヌクレアーゼ耐性を付与するヌクレオチド誘導体を挙げることができる。本明細書で使用される場合、ヌクレオチドという用語は、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびその誘導体を指す場合がある。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の例としては、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰが挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、光学的に検出可能な部分（例えば、フルオロフォア）を含む部分を使用するなど、非標識または検出可能に標識されてもよい。標識はまた、量子ドットを用いて行われてもよい。検出可能な標識としては、例えば、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、および酵素標識を挙げることができる。ヌクレオチドの蛍光標識は、フルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２′７′－ジメトキシ－４′５－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６－カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、４－（４′ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、カスケードブルー、オレゴングリーン、テキサスレット、シアニンおよび５－（２′－アミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）を含むが、これらに限定されない。蛍光標識されたヌクレオチドの具体的な例としては、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆから入手可能な［Ｒ６Ｇ］ｄＵＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＵＴＰ、［Ｒ１１０］ｄＣＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＣＴＰ、［ＪＯＥ］ｄｄＡＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ＦＡＭ］ｄｄＣＴＰ、［Ｒ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、［ＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ、［ｄＲ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ｄＲ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ｄＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、および［ｄＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｉｌｌ．から入手可能なフルオロ結合デオキシヌクレオチド、フルオロ結合Ｃｙ３－ｄＣＴＰ、フルオロ結合Ｃｙ５－ｄＣＴＰ、フルオロ結合フルオロＸ－ｄＣＴＰ、フルオロ結合Ｃｙ３－ｄＵＴＰ、およびフルオロ結合Ｃｙ５－ｄＵＴＰ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．から入手可能なフルオレセイン－１５－ｄＡＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄＵＴＰ、テトラメチル－ローダミン－６－ｄＵＴＰ、ＩＲ７７０－９－ｄＡＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄｄＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ＵＴＰ、およびフルオレセイン－１５－２′－ｄＡＴＰ；ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇから入手可能な染色体標識ヌクレオチド、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ－４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ－１４－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－１４－ｄＵＴＰ、カスケードブルー－７－ＵＴＰ、カスケードブルー－７－ｄＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄＵＴＰ、オレゴングリーン４８８－５－ｄＵＴＰ、ローダミングリーン－５－ＵＴＰ、ローダミングリーン－５－ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン－６－ＵＴＰ、テトラメチルローダミン－６－ｄＵＴＰ、テキサスレッド－５－ＵＴＰ、テキサスレッド－５－ｄＵＴＰ、およびテキサスレッド－１２－ｄＵＴＰを挙げることができる。ヌクレオチドはまた、化学修飾によって標識または印付られてもよい。化学修飾された単一ヌクレオチドは、ビオチン－ｄＮＴＰであり得る。ビオチン化ｄＮＴＰのいくつかの非限定的な例としては、ビオチン－ｄＡＴＰ（例えば、ビオ－Ｎ６－ｄｄＡＴＰ、ビオチン－１４－ｄＡＴＰ）、ビオチン－ｄＣＴＰ（例えば、ビオチン－１１－ｄＣＴＰ、ビオチン－１４－ｄＣＴＰ）、およびビオチン－ｄＵＴＰ（例えば、ビオチン－１１－ｄＵＴＰ、ビオチン－１６－ｄＵＴＰ、ビオチン－２０－ｄＵＴＰ）が挙げられる。
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」は、概して、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそのアナログのいずれかを、一本鎖、二本鎖、または多本鎖の形態で、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すように互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、細胞にとって外因性または内因性であってもよい。ポリヌクレオチドは、無細胞環境に存在してもよい。ポリヌクレオチドは、遺伝子またはその断片であってもよい。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもよい。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであってもよい。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有してもよく、任意の機能を発揮してもよい。ポリヌクレオチドは、一つまたは複数のアナログ（例えば、改変された骨格、糖、または核酸塩基）を含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前または後に付与されてもよい。アナログのいくつかの非限定的な例としては、５－ブロモウラシル、ペプチド核酸、異種核酸、モルホリノ、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コーディセピン、７－ジアザ－ＧＴＰ、フルオロフォア（例えば、糖に結合したローダミンまたはフルオレセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン結合ヌクレオチド、蛍光塩基アナログ、ＣｐＧアイランド、メチル－７－グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、クエオシン、およびワイオシンが挙げられる。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、結合分析から定義した座位（遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロ－ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、細胞を含まないＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）および細胞を含まないＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）を含む細胞を含まないポリヌクレオチド、核酸プローブ、ならびにプライマーが挙げられる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。
用語「トランスフェクション」または「トランスフェクトされた」は、概して、非ウイルスまたはウイルスベースの方法による細胞内への核酸の導入を指す。核酸分子は、完全なタンパク質またはその機能的部分をコードする遺伝子配列であってもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１８．１－１８．８８を参照のこと。
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、概して、ペプチド結合（複数可）によって結合された少なくとも二つのアミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、ポリマーの特定の長さを意味しておらず、ペプチドが組換え技術、化学もしくは酵素合成を使用して産生されるか、または天然に存在するかを暗示または区別することを意図するものではない。この用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーならびに少なくとも一つの修飾アミノ酸を含むアミノ酸ポリマーに適用する。ある場合では、ポリマーは、非アミノ酸によって中断されてもよい。用語は、全長タンパク質、および２次または３次構造を有するかまたは有さないタンパク質（例えば、ドメイン）を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を含む。用語はまた、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質形成、アセチル化、リン酸化、酸化、および標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」および「複数のアミノ酸」という用語は、概して、修飾アミノ酸およびアミノ酸アナログを含むが、これに限定されない天然および非天然アミノ酸を指す。修飾アミノ酸は、天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含んでもよく、これは、アミノ酸上に天然に存在しない基または化学的部分を含むように化学的に修飾されている。アミノ酸アナログは、アミノ酸誘導体を指す場合がある。用語「アミノ酸」は、Ｄ－アミノ酸とＬ－アミノ酸の両方を含む。
本明細書において使用される場合、「非天然」は、概して、天然の核酸またはタンパク質に存在しない核酸またはポリペプチド配列を指すことができる。非天然は、親和性タグを指してもよい。非天然は、融合物を指してもよい。非天然は、変異、挿入、または欠失を含む、天然に存在する核酸またはポリペプチド配列を指してもよい。非天然配列は、非天然配列が融合される核酸配列またはポリペプチド配列によっても呈され得る活性（例えば、酵素活性、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性など）を示すか、またはコードしてもよい。非天然核酸またはポリペプチド配列を、遺伝子操作によって天然に生じる核酸またはポリペプチド配列（もしくはそのバリアント）に連結して、キメラ核酸またはポリペプチドをコードするキメラ核酸またはポリペプチド配列を生成してもよい。
本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」は、概して、遺伝子の転写または発現を制御し、ＲＮＡ転写が開始されるヌクレオチドのヌクレオチドまたはヌクレオチドの領域に隣接するか、または重複して位置し得る調節ＤＮＡ領域を指す。プロモーターは、しばしば転写因子と呼ばれるタンパク質因子に結合する特定のＤＮＡ配列を含有してもよく、これは、ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡへの結合を促進し、これにより、遺伝子転写をもたらす。「コアプロモーター」とも呼ばれる「基礎プロモーター」は、概して、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写発現を促進するための全ての塩基性要素を含有するプロモーターを指してもよい。真核生物の基礎プロモーターは、ある場合では、ＴＡＴＡ－ボックスまたはＣＡＡＴボックスを含む。
本明細書で使用される場合、用語「発現」は、概して、核酸配列もしくはポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡもしくは他のＲＮＡ転写物に）転写されるプロセス、または転写ｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされたポリペプチドは、「遺伝子産物」と総称され得る。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核生物の細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含む。
本明細書において使用される場合、「作動可能に連結された」、「作動可能な連結」、「作動可能に連結された」、またはその文法的な均等物は、概して、遺伝子エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列などの並列化を指し、ここで、エレメントは、それらが予期される様式で作動することを可能にする関係にある。例えば、プロモーター配列またはエンハンサー配列を含み得る、調節エレメントは、調節エレメントが、コード配列の転写を開始するのを助ける場合、コード領域に作動可能に連結される。この機能的関係が維持される限り、制御エレメントとコード領域との間に介在する残基があってもよい。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、概して、ポリヌクレオチドを含むか、またはポリヌクレオチドと会合し、ポリヌクレオチドの細胞への送達を媒介するために使用され得る高分子または高分子の会合を指す。ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、および他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。ベクターは、概して、標的中の遺伝子の発現を促進するために遺伝子に作動可能に連結された、遺伝子エレメント、例えば、制御エレメントを含む。
本明細書において使用される場合、「発現カセット」および「核酸カセット」は、または発現のために作動可能に連結される核酸配列またはエレメントの組み合わせを指すために概して互換的に使用される。ある場合では、発現カセットは、発現のために作動可能に連結されている制御エレメントと遺伝子または複数の遺伝子との組み合わせを指す。
ＤＮＡまたはタンパク質配列の「機能的断片」は、概して、全長ＤＮＡまたはタンパク質配列の生物学的活性と実質的に類似した生物学的活性（機能的または構造的のいずれか）を保持する断片を指す。ＤＮＡ配列の生物学的活性は、全長配列に起因する様式で発現に影響を与える能力であってもよい。
本明細書において使用される場合、「操作された」対象は、概して、対象がヒトの介入によって修飾されたことを示す。非限定的な実施例によれば、核酸は、その配列を、天然では生じない配列に改変することによって修飾されてもよく、核酸は、ライゲーションされた産物が、オリジナルの核酸に存在しない機能を有するように、天然では関連しない核酸にライゲーションすることによって修飾されてもよく、操作された核酸は、天然では存在しない配列を用いてインビトロで合成されてもよく、タンパク質は、天然では存在しない配列にそのアミノ酸配列を変更することによって修飾されてもよく、操作されたタンパク質は、新しい機能または特性を獲得してもよい。「操作された」システムは、少なくとも一つの操作された構成要素を含む。
本明細書において使用される場合、「合成」および「人工」は、天然に存在するヒトタンパク質と低い配列同一性（例えば、５０％未満の配列同一性、２５％未満の配列同一性、１０％未満の配列同一性、５％未満の配列同一性、１％未満の配列同一性）を有するタンパク質またはそのドメインを指すために互換的に使用される。例えば、ＶＰＲドメインおよびＶＰ６４ドメインは、合成トランス活性化ドメインである。
本明細書で使用される場合、用語「ｔｒａｃｒＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒ配列」は、概して、野生型となるｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス、黄色ブドウ球菌由来のｔｒａｃｒＲＮＡなど、または配列番号＊＿＊）と少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは１００％の配列同一性または配列類似性を有する核酸を指すことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、野生型となるｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス、黄色ブドウ球菌由来のｔｒａｃｒＲＮＡなど、または配列番号＊＿＊）に対し最大約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％の配列同一性または配列類似性を有する核酸を指すことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、欠失、挿入、もしくは置換、バリアント、変異、またはキメラなどのヌクレオチド変更を含み得るｔｒａｃｒＲＮＡの修飾形態を指す。ｔｒａｃｒＲＮＡは、少なくとも６つの連続ヌクレオチドの区間にわたって、野生型の例となるｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス、黄色ブドウ球菌由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）配列と少なくとも約６０％同一であり得る核酸を指してもよい。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６つの連続するヌクレオチドの区画にわたって野生型の例となるｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、トレプトコッカス・ピオゲネス、黄色ブドウ球菌由来のｔｒａｃｒＲＮＡなど）配列と少なくとも約６０％同一、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一であり得る。タイプＩＩ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、隣接するＣＲＩＳＰＲアレイ中のリピート配列の一部に対して相補性を有する領域を特定することによって、ゲノム配列上で予測することができる。
本明細書において使用される場合、「ガイド核酸」は、概して、別の核酸にハイブリダイズし得る核酸を指すことができる。ガイド核酸は、ＲＮＡであってもよい。ガイド核酸は、ＤＮＡであってもよい。ガイド核酸は、部位特異的に核酸の配列に結合するようにプログラムされてもよい。標的化されるべき核酸、または標的核酸は、ヌクレオチドを含んでもよい。ガイド核酸は、ヌクレオチドを含んでもよい。標的核酸の一部は、ガイド核酸の一部に対して相補的であってもよい。ガイド核酸に相補的であり、ガイド核酸とハイブリダイズする二本鎖標的ポリヌクレオチドの鎖を、相補鎖と呼ぶことができる。相補鎖に相補的であり、それゆえ、ガイド核酸に相補的ではない二本鎖標的ポリヌクレオチドの鎖は、非相補鎖と呼ばれてもよい。ガイド核酸は、ポリヌクレオチド鎖を含んでもよく、また「単一ガイド核酸」と呼ばれ得る。ガイド核酸は、二つのポリヌクレオチド鎖を含んでもよく、また「ダブルガイド核酸」と呼ばれ得る。そうでない場合、用語「ガイド核酸」は、単一ガイド核酸とダブルガイド核酸の両方を指す、包括的であってもよい。ガイド核酸は、「核酸標的化セグメント」または「核酸標的化配列」と称され得るセグメントを含み得る。核酸標的化セグメントは、「タンパク質結合セグメント」または「タンパク質結合配列」または「Ｃａｓタンパク質結合セグメント」と称され得るサブセグメントを含んでもよい。
二つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における用語「配列同一性」または「パーセント同一性」は、概して、配列比較アルゴリズムを使用して測定された場合、局所比較ウィンドウまたはグローバル比較ウィンドウにわたって最大対応のために比較および整列されたとき、同一であるか、または特定のパーセンテージの、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する、二つ（例えば、ペアワイズアラインメントで）またはそれ以上（例えば、複数の配列アラインメントにおける）の配列を指す。ポリペプチド配列に好適な配列比較アルゴリズムとしては、例えば、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、および１１の存在のパラメーター、１の延長でギャップコストを設定しているＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用し、かつ３０残基より長いポリペプチド配列についての条件付き組成スコアマトリックス調整を使用したＢＬＡＳＴＰ；２のワード長（Ｗ）、１００００００の期待値（Ｅ）のパラメーター、およびオープンギャップに対して９および３０残基より短い配列についての拡張ギャップに対して１でのＰＡＭ３０スコアリング設定ギャップコストを使用したＢＬＡＳＴＰ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで入手可能なＢＬＡＳＴにおいてＢＬＡＳＴＰについてのデフォルトのパラメーターが存在する）；２の一致、－１のミスマッチ、および－１のギャップのパラメーターを用いたＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを用いたＣＬＵＳＴＡＬＷ；デフォルトパラメーターを用いたＭＵＳＣＬＥ；２のパラメーターリツリーおよび１０００の最大反復を用いたＭＡＦＦＴ；デフォルトパラメーターを用いたＮｏｖａｆｏｌｄ；デフォルトパラメーターを用いたＨＭＭＥＲ ｈｍｍａｌｉｇｎが挙げられる。
本明細書において使用される場合、用語「ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメイン」は、概して、ＲｕｖＣエンドヌクレアーゼドメインの第３の不連続セグメントを指す（ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインは、三つの不連続セグメントであるＲｕｖＣ＿Ｉ、ＲｕｖＣ＿ＩＩ、およびＲｕｖＣ＿ＩＩＩから構成される）。ＲｕｖＣドメインまたはそのセグメントは、概して、文書化されたドメイン配列へのアライメント、注釈付きドメインを有するタンパク質への構造的アライメント、または文書化されたドメイン配列（例えば、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩのＰｆａｍ ＨＭＭ ＰＦ１８５４１）に基づいて構築されたＨｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌｓ（ＨＭＭ）との比較によって識別することができる。
本明細書において使用される場合、用語「ウェッジ」（ＷＥＤ）ドメインは、概して、主にｓｇＲＮＡおよびＰＡＭ二重の反復：抗反復二重と相互作用するドメイン（例えば、Ｃａｓタンパク質に存在する）を指す。ＷＥＤドメインは、概して、文書化されたドメイン配列へのアライメント、注釈付きドメインを有するタンパク質への構造的アライメント、または文書化されたドメイン配列に基づいて構築されたＨｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌｓ（ＨＭＭ）との比較によって識別することができる。
本明細書において使用される場合、用語「ＰＡＭ相互作用ドメイン」または「ＰＩドメイン」は、概して、Ｃａｓタンパク質によって標的化される領域内のシード配列の外部のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と相互作用するドメインを指す。ＰＡＭ相互作用ドメインの例としては、Ｃａｓタンパク質に存在するトポイソメラーゼ相同性（ＴＯＰＯ）ドメインおよびＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＡＭ相互作用ドメインまたはそのセグメントは、概して、文書化されたドメイン配列へのアライメント、注釈付きドメインを有するタンパク質への構造的アライメント、または文書化されたドメイン配列に基づいて構築されたＨｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌｓ（ＨＭＭ）との比較によって識別することができる。
本明細書において使用される場合、用語「ＲＥＣドメイン」は、概して、ガイドＲＮＡに接触すると考えられるアルファらせんドメインである二つのセグメント（ＲＥＣ１またはＲＥＣ２）のうちの少なくとも一つを含むドメイン（例えば、Ｃａｓタンパク質に存在する）を指す。ＲＥＣドメインまたはそのセグメントは、概して、文書化されたドメイン配列へのアライメント、注釈付きドメインを有するタンパク質への構造的アライメント、または文書化されたドメイン配列（例えば、ドメインＲＥＣ１のＰｆａｍ ＰＦ１９５０１）に基づいて構築されたＨｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌｓ（ＨＭＭ）との比較によって識別することができる。
本明細書において使用される場合、用語「ＢＨドメイン」は、概して、タイプＩＩ Ｃａｓ酵素のＮＵＣ葉とＲＥＣ葉との間の架橋ヘリックスであるドメイン（例えば、Ｃａｓタンパク質に存在する）を指す。ＢＨドメインまたはそのセグメントは、概して、文書化されたドメイン配列へのアライメント、注釈付きドメインを有するタンパク質への構造的アライメント、または文書化されたドメイン配列（例えば、ドメインＢＨのＰｆａｍ ＰＦ１６５９３）に基づいて構築されたＨｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌｓ（ＨＭＭ）との比較によって識別することができる。
本明細書において使用される場合、用語「ＨＮＨドメイン」は、概して、特徴的なヒスチジン残基およびアスパラギン残基を有するエンドヌクレアーゼドメインを指す。ＨＮＨドメインは、概して、文書化されたドメイン配列へのアライメント、注釈付きドメインを有するタンパク質への構造的アライメント、または文書化されたドメイン配列（例えば、ドメインＨＮＨのＰｆａｍ ＨＭＭ ＰＦ０１８４４）に基づいて構築されたＨｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌｓ（ＨＭＭ）との比較によって識別することができる。
一つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する本明細書に記載される酵素のいずれかのバリアントが、本開示に含まれる。こうした保存的置換は、ポリペプチドの三次元構造または機能を破壊することなく、ポリペプチドのアミノ酸配列においてなされ得る。保存的置換は、アミノ酸を、互いに同様の疎水性、極性、およびＲ鎖長で置換することによって達成することができる。加えて、または代わりに、異なる種由来の相同なタンパク質のアラインされた配列を比較することによって、保存的置換は、種間で変異したアミノ酸残基（例えば、コードされるタンパク質の基本的な機能を変化させることなく、非保存残基）を特定することによって特定することができる。このような保存的置換されたバリアントは、本明細書に記載されるシステムのいずれか一つと少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するバリアントを含んでもよい。一部の実施形態では、このような保存的に置換されたバリアントは、機能的バリアントである。こうした機能的バリアントは、エンドヌクレアーゼの重要な活性部位残基の活性が破壊されないように、置換を有する配列を包含することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるシステムのいずれかの機能的バリアントは、本明細書に記載される保存された残基または機能的残基のうちの少なくとも一つの置換を欠く。一部の実施形態では、本明細書に記載されるシステムのいずれかの機能的バリアントは、本明細書に記載される保存された残基または機能的残基の全ての置換を欠く。
機能的に類似したアミノ酸をもたらす保存的置換表は、様々な参考文献から入手可能である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．；２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９３）を参照のこと））。以下の８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：
ａ． アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
ｂ． アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
ｃ． アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
ｄ． アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
ｅ． イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、
ｆ． フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
ｇ． セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、および
ｈ． システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
概要
固有の機能性および構造を有する新しいＣａｓ酵素の発見は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）編集テクノロジーをさらに破壊し、速度、特異性、機能性、および使いやすさを改善する可能性を付与する可能性がある。微生物におけるクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムの予測される保有率および微生物種の純多様性と比較して、比較的少数の機能的に特徴付けられたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が、文献に存在する。これは、一部、実験室条件下では、膨大な数の微生物種が容易には培養されないためである。多数の微生物種を表す天然の環境ニッチからのメタゲノムシークエンシングは、文書化された新しいＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの数を劇的に増加させ、新しいオリゴヌクレオチド編集機能の発見を早める可能性を付与する可能性がある。このようなアプローチの実りのある最近の例は、天然微生物群集のメタゲノム解析からのＣａｓＸ／ＣａｓＹ ＣＲＩＳＰＲシステムの２０１６年の発見によって示される。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、微生物における適応免疫システムとして機能すると記載されているＲＮＡ指向ヌクレアーゼ複合体である。それらの自然な状況では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）オペロンまたは遺伝子座において生じ、これは概して、二つの部分：（ｉ）ＲＮＡベースの標的化エレメントをコードする、同等に短いスペーサー配列によって分けられた短い反復配列（３０～４０ｂｐ）のアレイ；および（ｉｉ）アクセサリータンパク質／酵素と並んだＲＮＡベースの標的化エレメントによって指示されるヌクレアーゼポリペプチドをコードするＣａｓをコードするＯＲＦを含む。特定の標的核酸配列の効率的なヌクレアーゼ標的化は、概して、（ｉ）標的（標的シード）の最初の６～８個の核酸とｃｒＲＮＡガイドとの間の相補的なハイブリダイゼーション；および（ｉｉ）標的シードの画定された近傍内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の存在の両方を必要とする（ＰＡＭは、通常、宿主ゲノム内に一般的に表されない配列である）。システムの正確な機能および構成に応じて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、共有された機能的特徴および進化的類似性に基づき、二つのクラス、５つのタイプ、および１６のサブタイプに一般的に構成されている。
クラスＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、大型の複数サブユニットエフェクター複合体を有し、タイプＩ、ＩＩＩ、およびＩＶを含む。
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、構成要素の面で中程度の複雑さとみなされる。タイプＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムでは、ＲＮＡ標的化エレメントのアレイは、リピートエレメントで処理される長い前駆ｃｒＲＮＡ（プレｃｒＲＮＡ）として転写されて、ヌクレアーゼ複合体を核酸標的に配向させる短い成熟ｃｒＲＮＡが、その後、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる適切な短いコンセンサス配列に引き続いて放出される。このプロセシングは、カスケードと呼ばれる大きなエンドヌクレアーゼ複合体のエンドリボヌクレアーゼサブユニット（Ｃａｓ６）を介して生じ、これは、ｃｒＲＮＡ指向性ヌクレアーゼ複合体のヌクレアーゼ（Ｃａｓ３）タンパク質成分も含む。Ｃａｓ Ｉヌクレアーゼは、主にＤＮＡヌクレアーゼとして機能する。
タイプＩＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣｓｍまたはＣｍｒタンパク質サブユニットを含む反復関連ミステリアスタンパク質（ＲＡＭＰ）と共に、Ｃａｓ１０として知られる中心ヌクレアーゼの存在によって特徴付けられ得る。タイプＩシステムと同様、成熟ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ６様酵素を使用してプレｃｒＲＮＡから処理される。タイプＩおよびＩＩシステムとは異なり、タイプＩＩＩシステムは、ＤＮＡ－ＲＮＡ二本鎖（ＲＮＡポリメラーゼの鋳型として使用されるＤＮＡ鎖など）を標的化し、開裂するようである。
タイプＩＶ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、高度に還元された大きなサブユニットヌクレアーゼ（ｃｓｆ１）、Ｃａｓ５（ｃｓｆ３）およびＣａｓ７（ｃｓｆ２）群のＲＡＭＰタンパク質の二つの遺伝子、ならびにある場合では、予測される小さいサブユニットの遺伝子からなるエフェクター複合体を有し、そのようなシステムは、内因性プラスミドに一般的に存在する。
クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、概して、単一ポリペプチド複数ドメインヌクレアーゼエフェクターを有し、タイプＩＩ、ＶおよびＶＩを含む。
タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、構成要素の点で最も単純なものとみなされる。タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムでは、ＣＲＩＳＰＲアレイを成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングすることは、特別なエンドヌクレアーゼサブユニットの存在を必要としないが、むしろ、アレイリピート配列に相補的な領域を有する小さなトランスコードｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）であり、ｔｒａｃｒＲＮＡは、その対応するエフェクターヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）およびリピート配列の両方と相互作用して、前駆ｄｓＲＮＡ構造を形成し、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの両方を負荷した成熟エフェクター酵素を生成するために、内因性ＲＮＡｓｅ ＩＩＩによって切断される。Ｃａｓ ＩＩヌクレアーゼは、ＤＮＡヌクレアーゼとして文書化される。タイプ２エフェクターは、概して、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインのフォールドに挿入された無関係なＨＮＨヌクレアーゼドメインを有するＲＮａｓｅ Ｈフォールドに適合するＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインからなる構造を呈する。ＲｕｖＣ様ドメインは、標的（例えば、ｃｒＲＮＡ相補的）ＤＮＡ鎖の切断に関与し、一方、ＨＮＨドメインは、置換ＤＮＡ鎖の切断に関与する。
タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＲｕｖＣ様ドメインを含む、タイプＩＩエフェクターの構造と類似したヌクレアーゼエフェクター（例えば、Ｃａｓ１２）構造によって特徴付けられる。タイプＩＩと同様に、ほとんどの（すべてではない）タイプＶ ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｔｒａｃｒＲＮＡを使用して、プレｃｒＲＮＡを成熟ｃｒＲＮＡに処理するが、プレｃｒＲＮＡを複数のｃｒＲＮＡに切断するためのＲＮＡｓｅ ＩＩＩを必要とするタイプＩＩ型システムとは異なり、タイプＶシステムは、エフェクターヌクレアーゼ自体を使用してプレｃｒＲＮＡを切断することができる。タイプＩＩ ＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと同様に、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＤＮＡヌクレアーゼとして文書化される。タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとは異なり、一部のタイプＶ酵素（例えば、Ｃａｓ１２ａ）は、二本鎖標的配列の第一のｃｒＲＮＡ指向切断によって活性化される、強固な一本鎖非特異的デオキシリボヌクレアーゼ活性を有するようである。
タイプＶＩ ＣＲＩＰＳＲ－Ｃａｓシステムは、ＲＮＡガイドＲＮＡエンドヌクレアーゼを有する。ＲｕｖＣ様ドメインの代わりに、タイプＶＩシステム（例えば、Ｃａｓ１３）の単一ポリペプチドエフェクターは、二つのＨＥＰＮリボヌクレアーゼドメインを含む。タイプＩＩとＶシステムの両方とは異なり、タイプＶＩシステムもまた、一部の実施形態では、プレｃｒＲＮＡをｃｒＲＮＡに処理するためｔｒａｃｒＲＮＡを必要としないと思われる。しかしながら、タイプＶシステムと同様に、一部のタイプＶＩシステム（例えば、Ｃ２Ｃ２）は、標的ＲＮＡの第一のｃｒＲＮＡ指向切断によって活性化される、頑強な一本鎖非特異的ヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼ）活性を有するようである。
クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、より単純な構築物であるため、設計ヌクレアーゼ／ゲノム編集適用としての操作および開発に最も広く適用されてきた。
インビトロ使用のためのこのようなシステムの早期適用のうちの一つは、Ｊｉｎｅｋら（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ａｕｇ １７；３３７（６０９６）：８１６－２１、参照により本明細書に完全に組み込まれる）において見ることができる。Ｊｉｎｅｋ試験では、最初に（ｉ）ストレプトコッカス・ピオゲネスＳＦ３７０から単離した、組換え発現した、精製された全長Ｃａｓ９（例えば、クラスＩＩ、タイプＩＩ Ｃａｓ酵素）、（ｉｉ）切断されるべき標的ＤＮＡ配列に相補的な約２０ｎｔの５’配列、続いて３’ｔｒａｃｒ結合配列を生じる、精製された成熟約４２ｎｔのｃｒＲＮＡ（Ｔ７プロモーター配列を担持する合成ＤＮＡ鋳型からインビトロで転写された全ｃｒＲＮＡ）、（ｉｉｉ）Ｔ７プロモーター配列を担持する合成ＤＮＡ鋳型からインビトロで転写された精製ｔｒａｃｒＲＮＡ、および（ｉｖ）Ｍｇ２＋を含むシステムを記載した。Ｊｉｎｅｋは、後に、（ｉｉ）のｃｒＲＮＡが、（ｉｉｉ）の５’末端にリンカー（例えば、ＧＡＡＡ）によって結合されて、それ自体で標的にＣａｓ９を誘導することができる単一の融合合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成する、改良された操作されたシステムを記載した。
参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｍａｌｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８２３－８２６．）は、後に、（ｉ）Ｃ末端核局在化配列（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ）および適当なポリアデニル化シグナル（例えば、ＴＫ ｐＡシグナル）を有する適当な哺乳類プロモーター下でコドン最適化Ｃａｓ９（例えば、クラスＩＩ、タイプＩＩ Ｃａｓ酵素）をコードするＯＲＦ；ならびに（ｉｉ）適当なポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター）下にｓｇＲＮＡ（Ｇで始まる５′配列、続いて３′ｔｒａｃｒ結合配列に結合した２０ｎｔの相補的標的化核酸配列、リンカー、およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を有する）をコードするＯＲＦをコードするＤＮＡベクターをもたらすことによって、哺乳類細胞での使用にこのシステムを適合した。
操作されたヌクレアーゼ
一部の態様では、本開示は、新規核酸ガイドヌクレアーゼおよびシステムの操作に関する。一部の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、インビトロ、インビボまたはエクスビボ用途のための原核生物または真核生物の細胞において機能的である。一部の実施形態では、本開示は、核酸ガイドヌクレアーゼシステムおよびその構成要素に関する、ゲノム動揺または遺伝子編集などの配列標的化を含むゲノム操作に使用されるシステム、方法および組成物の操作および最適化に関する。
一部の態様では、本開示は、核酸ガイドヌクレアーゼ、キメラヌクレアーゼ、およびヌクレアーゼ融合物を含み得る操作されたヌクレアーゼを提供する。
キメラまたは融合操作ヌクレアーゼ
本明細書に記載されるキメラ操作ヌクレアーゼは、一つまたは複数の断片またはドメインを含んでもよく、断片またはドメインは、核酸ガイドヌクレアーゼ、属、種、または本明細書に記載される他の系統発生群の生物のオルソログなどの、ヌクレアーゼの断片またはドメインであってもよい。断片は、異なる種のヌクレアーゼオルソログ由来であってもよい。キメラ操作ヌクレアーゼは、少なくとも二つの異なるヌクレアーゼ由来の断片またはドメインから構成されてもよい。キメラ操作ヌクレアーゼは、少なくとも二つの異なる種由来のヌクレアーゼ由来の断片またはドメインから構成されてもよい。キメラ操作ヌクレアーゼは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０つ以上の異なるヌクレアーゼまたは異なる種由来のヌクレアーゼ由来の断片またはドメインから構成されてもよい。一部の実施形態では、キメラ操作ヌクレアーゼは、一つのヌクレアーゼ由来の一つより多くの断片またはドメインを含み、一つより多くの断片またはドメインは、第２のヌクレアーゼ由来の断片またはドメインによって分けられる。一部の例では、キメラ操作ヌクレアーゼは、それぞれが異なるタンパク質またはヌクレアーゼ由来である２つの断片を含む。一部の例では、キメラ操作ヌクレアーゼは、それぞれが異なるタンパク質またはヌクレアーゼ由来である３つの断片を含む。一部の例では、キメラ操作ヌクレアーゼは、それぞれが異なるタンパク質またはヌクレアーゼ由来である４つの断片を含む。一部の例では、キメラ操作ヌクレアーゼは、それぞれが異なるタンパク質またはヌクレアーゼ由来である５つの断片を含む。一部の例では、キメラ操作ヌクレアーゼは、３つの断片を含み、少なくとも一つの断片は、異なるタンパク質またはヌクレアーゼ由来である。一部の例では、キメラ操作ヌクレアーゼは、４つの断片を含み、少なくとも一つの断片は、異なるタンパク質またはヌクレアーゼ由来である。一部の例では、キメラ操作ヌクレアーゼは、５つの断片を含み、少なくとも一つの断片は、異なるタンパク質またはヌクレアーゼ由来である。
異なるヌクレアーゼまたは種由来の断片またはドメイン間の結合は、非構造化領域の区間で生じ得る。非構造化領域は、タンパク質構造内に曝露されるか、または様々なヌクレアーゼオルソログ内に保存されない領域を含み得る。
ＭＧキメラ酵素
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲエフェクターは、天然ＰＡＭ特異性を有する（図１を参照）。一態様では、本開示は、タンパク質操作による新規ＰＡＭ特異性の実現を提供する。新規ＰＡＭ特異性のこの実現は、ＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼのドメイン交換によって達成され得る（図２を参照）。ドメイン交換および組換えの過程には、最適なブレークポイントが存在し得る。最適なブレークポイントは、本明細書に記載される複数の配列のアラインメントによってガイドされ得る（図３を参照）。
一部の態様では、本開示は、（ａ）配列番号６９６またはそのバリアントと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＣａｓエンドヌクレアーゼのＲｕｖＣ、ＲＥＣ、またはＨＮＨドメインを含むＮ末端配列；および（ｂ）配列番号６９７～７２１のいずれか一つまたはそのバリアントと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＣａｓエンドヌクレアーゼのＷＥＤ、ＴＯＰＯ、またはＣＴＤドメインを含むＣ末端配列を含む融合エンドヌクレアーゼを提供する。一部の実施形態では、融合エンドヌクレアーゼは、（ａ）におけるＲｕｖＣ、ＲＥＣ、およびＨＮＨドメインを含む。一部の実施形態では、融合エンドヌクレアーゼは、（ａ）におけるＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む。一部の実施形態では、融合エンドヌクレアーゼは、（ｂ）におけるＷＥＤ、ＴＯＰＯ、およびＣＴＤドメインを含む。一部の実施形態では、Ｎ末端配列およびＣ末端配列は、天然では、同じリーディングフレームにおいて一緒に生じない。一部の実施形態では、Ｎ末端配列およびＣ末端配列は、異なる生物に由来する。一部の実施形態では、Ｎ末端配列は、ＲｕｖＣ－Ｉ、ＢＨ、およびＲｕｖＣ－ＩＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、Ｃ末端配列は、ＰＡＭ相互作用ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、融合Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号１～２７または１０８のいずれか一つと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、融合エンドヌクレアーゼは、ｎｎＲＧＧｎＴ（配列番号５３）ではないＰＡＭに結合するように構成される。一部の実施形態では、融合エンドヌクレアーゼは、配列番号４６～５２または５４～６６のいずれか一つを含むＰＡＭに結合するように構成される。
一部の態様では、本開示は、配列番号１～２７、１０８、または１０９～１１０のいずれか一つと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する操作された核酸配列を含むエンドヌクレアーゼを提供する。一態様では、本開示は、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼ；および標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成され、エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたガイドリボ核酸配列を含むエンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成された操作されたガイドリボ核酸構造を含む、操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。一部の実施形態では、操作されたガイドリボ核酸配列は、ｔｒａｃｒリボ核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、培養されていない微生物に由来する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ １２ｃエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｄエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｃエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓ１３ｄエンドヌクレアーゼではない。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＳｐｙＣａｓ９エンドヌクレアーゼと８６％未満の同一性を有する。一部の実施形態では、システムは、Ｍｇ２＋の供給源をさらに含む。
一部の態様では、本開示は、（ａ）（ａ）配列番号６９６またはそのバリアントと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＣａｓエンドヌクレアーゼのＲｕｖＣ、ＲＥＣ、またはＨＮＨドメインを含むＮ末端配列；および（ｂ）配列番号６９７～７２１のいずれか一つまたはそのバリアントと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＣａｓエンドヌクレアーゼのＷＥＤ、ＴＯＰＯ、またはＣＴＤドメインを含むＣ末端配列を含む、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼ（例えば、融合エンドヌクレアーゼ）のいずれか；ならびに（ｂ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成されたガイドリボ核酸を含むエンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成された操作されたガイドリボ核酸構造、ガイドリボ核酸配列が、エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されている、を含む、操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。一部の実施形態では、ガイドリボ核酸は、ｔｒａｃｒリボ核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、培養されていない微生物に由来する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ １２ｃエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｄエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｃエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓ１３ｄエンドヌクレアーゼではない。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＳｐｙＣａｓ９エンドヌクレアーゼと８６％未満の同一性を有する。一部の実施形態では、システムは、Ｍｇ２＋の供給源をさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号８～１２、２６～２７、または１０８のいずれか一つと少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ガイドリボ核酸配列は、配列番号３３、３４、４４、４５、７８、８４、または８７のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
本開示のシステムは、例えば、核酸分子に結合する（例えば、配列特異的結合）、核酸編集（例えば、遺伝子編集）などの様々な用途に使用され得る。このようなシステムは、例えば、対象において疾患を引き起こす可能性のある遺伝的に受け継がれた突然変異に対処する（例えば、除去または置換する）ため、細胞におけるその機能を確認するために遺伝子を不活性化するため、疾患を引き起こす遺伝子エレメントを検出する診断ツールとして（例えば、逆転写されたウイルスＲＮＡもしくは疾患を引き起こす突然変異をコードする増幅されたＤＮＡ配列の切断を介して）、特定のヌクレオチド配列（例えば、細菌内の抗生物質耐性をコードする配列）を標的化するためのプローブと組み合わせた不活性化した酵素として、ウイルスゲノムを標的化することによってウイルスを不活性化するか、もしくは宿主細胞に感染できないようにするため、価値ある低分子、高分子、もしくは二次代謝産物を生じるように生物を操作するための遺伝子を加えるか、もしくは代謝経路を修正するため、進化的選択のための遺伝子駆動エレメントを確立するため、バイオセンサーとして外来低分子およびヌクレオチドによる細胞の摂動を検出するため使用され得る。

実施例１－プラスミド
キメラ配列は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）ウェブサイトを介した大腸菌発現に最適化したコドンであり、合成し、別段の指定がない限り、Ｔｗｉｓｔ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅでｐＥＴ２１ベクターにクローニングした。ｐＥＴ２１－ＭＧ３－６＋ＭＧ１５－１（ＷＰ）およびｐＥＴ２１－ＭＧ３－６＋ＭＧ１５－１（Ｐ）を構築するために、プライマーＰ４４１～Ｐ４４６を使用して、ｐＭＧＸ３－６およびｐＭＧＸ１５－１から遺伝子断片を増幅した。得られたＰＣＲ産物を、Ｚｙｍｏ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔにより精製し、ＮＥＢＵｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアセンブリを介してｐＡＬ３（ＣｌａＩおよびＸｈｏＩにより消化した）にアセンブリした。クローン化したキメラ遺伝子のＤＮＡ配列を、Ｅｌｉｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍが提供するサンガー配列決定サービスによって確認した。
実施例２－バイオインフォマティクス解析
本明細書で利用するＣＲＩＳＰＲタイプＩＩエンドヌクレアーゼは、推定上のＨＮＨおよびＲｕｖＣ触媒残基の存在に基づくヌクレアーゼ活性を有すると予測した。さらに、構造予測は、ＰＡＭとの相互作用のガイド、標的、および認識に関与する残基を示唆した。重要な残基の位置に基づき、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの予測ドメイン構築物は、とりわけ、三つのＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメイン、認識ドメインおよびＰＡＭ相互作用ドメインを含んでいた。ＣＲＩＳＰＲアレイの隣の全長タイプＩＩ エンドヌクレアーゼをコードするゲノム配列について、本発明者らは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ヌクレアーゼが単一ガイドＲＮＡとして使用するよう操作した、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を予測した。
選択したＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲタイプＩＩエンドヌクレアーゼ配列の複数の配列アライメントを、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（で入手可能）の組込みＭＵＳＣＬＥアライナを使用して行った（図３を参照）。ＭＧ３－６およびＭＧ１５－１のタンパク質構造を、ＤＮＡＳＴＡＲ ＮｏｖａＦｏｌｄを用いて予測し、Ｐｒｏｔｅａｎ ３Ｄを介して表示した。キメラ組成物の詳細を表１に示す。ガイドＲＮＡ最適化と共に予測した構造モデル情報をガイドして（図７を参照）、本発明者らは、ドメインを、密接に関連するタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ならびに遠く関連するタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼと接触させることによって、非正規ＰＡＭを認識するタンパク質バリアントを操作した。
実施例３－インビトロＰＡＭ濃縮アッセイ
本明細書で利用したヌクレアーゼのＰＡＭ配列を、大腸菌可溶化物ベースの発現系または再構成したインビトロ翻訳（ｍｙＴＸＴＬ、Ａｒｂｏｒ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓもしくはＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のいずれかでの発現を介して決定した。大腸菌コドン最適化タンパク質配列を転写し、Ｔ７プロモーターの制御下でＰＣＲ断片から翻訳した。この混合物を、タンパク質特異的ｓｇＲＮＡおよびＰＡＭプラスミドライブラリー（ＰＡＭライブラリーＵ６７／Ｕ４０）を用いて、反応緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）に希釈した。プラスミドのライブラリーは、単一ガイドでそれに続く８Ｎの混合塩基と合致するスペーサー配列を含有し、そのサブセットは、正しいＰＡＭを有すると推定した。１～３時間後、反応を停止し、ＤＮＡクリーンアップキット、例えば、Ｚｙｍｏ ＤＣＣ、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ、ＱｉａＱｕｉｃｋなどを介してＤＮＡを回収した。ＤＮＡを平滑末端ライゲーション反応に供し、インタクトな環状プラスミドを変えないで、アダプター配列を切断したライブラリープラスミドに加えた。ＰＣＲを、ライブラリーならびにアダプター配列に特異的なプライマー（ＬＡ０６５およびＬＡ１２５）を用いて行い、ゲル上で分解して、活性タンパク質複合体を識別した（図４および図６を参照）。得られたＰＣＲ産物を、ハイスループットシーケンシングプライマー（ＴｒｕｅＳｅｑ）および８のサイクルパラメータでＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔを使用して、ＰＣＲによりさらに増幅した。ＮＧＳ分析に供した試料を、４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により定量し、一緒にプールした。ＮＧＳライブラリーを、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを介して精製し、ＡｒｉａＭｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）で定量した。開始８Ｎライブラリーのサブセットであるこのライブラリーを配列決定することにより、正しいＰＡＭを含む配列を明らかにした（図５を参照）。
実施例４－インビボ標的化のための単一ガイド設計
本明細書で使用する単一ガイド（ｓｇＲＮＡ）構造は、５’－－２２ｎｔプロトスペーサー－リピート－ｔｒａｃｒ－－３’の構造を含む。マウスアルブミンイントロン１を標的化する２０個の単一ガイドを、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｐｒｉｍｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｏｕｓ．ｃｏｍ／ｐｒｉｍｅ／）を使用して設計した。場合により、ガイドを、ＩＤＴによって化学的に合成し、Ｃａｓ９ガイド（「Ａｌｔ－Ｒ」修飾）の性能を改善するたようＩＤＴによって最適化したガイドの化学修飾を含んでいた。
実施例５－ｍＲＮＡのインビトロ転写
キメラ（例えば、ＭＧ３－６＋ＭＧ３－４（配列番号１０））をコードするコード配列（ＣＤＳ）を、マウスに対してコドン最適化し、Ｔｗｉｓｔ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓで化学的に合成した。ＣＤＳをｍＲＮＡ産生ベクターｐＭＧ０１０にクローニングした。ｐＭＧ０１０の構築物は、以下のエレメントの配列を含んでいた：Ｔ７プロモーター－５’ＵＴＲ－開始コドン－核局在化シグナル１－ＣＤＳ－核局在化シグナル２－停止コドン－３’ＵＴＲ－１０７ヌクレオチドポリＡテール（配列番号１０８）。ＭＧ３－６＋ＭＧ ３－４ ＣＤＳを含有するプラスミドｐＭＧ０１０を、ＥｎｄｏＦｒｅｅプラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して２００ｍｌの細菌培養物から精製した。ベクターを、ポリＡテールの下流のプラスミドを直線化するために、ＳａｐＩで一晩消化した。直線化したベクターを、フェノール／クロロホルムＤＮＡ抽出を使用して精製した。インビトロ転写を、５０℃で１時間、ＨｉＴ７ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写したｍＲＮＡを、３７°Ｃで１０分間ＤＮａｓｅで処理し、ｍＲＮＡを、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ転写クリーンアップキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して精製した。ｍＲＮＡを２６０ｎｍでの吸光度により定量化し、そのサイズおよび純度を自動電気泳動（ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ、Ａｇｉｌｅｎｔ）により評価し、期待サイズであることを示した。
実施例６－Ｈｅｐａ１－６細胞のトランスフェクションおよびアルブミン標的化
３００ｎｇのｍＲＮＡおよび３５０ｎｇの配列番号６７～８６の各単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を、以下のようにＨｅｐａ１－６細胞に共トランスフェクトした。トランスフェクションの１日前に、Ｈｅｐａ１－６細胞を、２４時間後に７０％のコンフルエントを達成する密度で２４ウェルに播種した。翌日、２５μｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地および１．２５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ Ｍａｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を混合し、５秒間ボルテックスして溶液Ａを作製した。別個の管で、３００ｎｇのＭＧ３－６＋ＭＧ３－４キメラｍＲＮＡおよび３５０ｎｇの単一ガイドを、２５μｌのＯｐｔｉＭＥＭと共に混合して、溶液Ｂを作製した。溶液Ａと溶液Ｂを混合し、室温で１０分間インキュベートし、Ｈｅｐａ１－６細胞に直接加えた。トランスフェクションの２日後、培地を吸引し、Ｐｕｒｅｌｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｍｉｎｉキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の指示に従い精製した（図９を参照）。結果は、最も性能の高いｓｇＲＮＡが、ｇ８７（配列番号７２）およびｇ３４（配列番号７０）と指定したものであり、ｇＲＮＡｇ４５（配列番号６７）、ｇ４４（配列番号７１）、ｇ５９（配列番号７６）、ｇ７８（配列番号６８）、ｇ８４（配列番号７９）、およびｇ３３（配列番号８０）についても顕著な編集が起きたことを示す。
実施例７－ゲノム編集した試料のサンガー配列決定
単一ガイドＲＮＡ（例えば、アルブミン遺伝子）によって標的化したゲノムの領域に隣接するプライマーを設計した。プライマー５７Ｆ（配列番号９７）および１０７２Ｒ（配列番号９８）を使用したＰＣＲ増幅を、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｆｌａｓｈ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して行い、１０１６ｂｐのＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物を精製し、ＤＮＡ ｃｌｅａｎ＆ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ ５（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して濃縮し、１００ｎｇのＰＣＲ産物を、８ピコモルの個々の配列決定プライマー（１３２Ｆ、２８２Ｆ、４４６Ｒ、および４６０Ｆ、配列番号９９～１０２）を使用したサンガーシーケンシング（ＥＲＩＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にした。サンガーシーケンシング結果を、ＣＲＩＳＰＲ編集の推論と呼ばれるアルゴリズム（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｓｙｎｔｈｅｇｏ－ｏｐｅｎ／ｉｃｅで入手可能）を使用して解析し、データをＧｒａｄＰｒｉｓｍを使用してプロットした（図９Ｂを参照）。
実施例８－ｍＲＮＡトランスフェクションを使用したマウスＨＡＯ－１遺伝子のＭＧ３－６／３－４ヌクレアーゼガイドスクリーニング
マウスＨＡＯ－１遺伝子のエクソン１～４（グリコール酸オキシダーゼをコードする）を標的化するＭＧ３－６／３－４ヌクレアーゼのガイドＲＮＡを、ＰＡＭ配列３’ＮＮＡＡＡ（Ａ／Ｔ）Ｎ ５’を検索することによってインシリコで同定した。マウスゲノム内で最も少ない予測オフターゲット部位を有する合計２３個のガイドを、単一ガイドＲＮＡとして化学的に合成した。３００ｎｇのｍＲＮＡおよび１２０ｎｇの単一ガイドＲＮＡを、以下のようにＨｅｐａ１－６細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの１日前に、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含まないＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１×ＮＥＡＡ培地中で１０日未満培養したＨｅｐａ１－６細胞を、ＴＣ処理した２４ウェルプレートに播種した。細胞を計数し、６０，０００個の生細胞と同等の体積を各ウェルに加えた。さらに予め平衡化した培地を各ウェルに加えて、総体積を５００μＬにした。トランスフェクションの日、２５μＬのＯｐｔｉＭＥＭ培地と１．２５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ Ｍａｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）をマスターミックス溶液中で混合し、ボルテックスし、室温で少なくとも５分間置いた。別個の管において、３００ｎｇのＭＧ３－６－ＭＧ－３－４をコードするｇｍＲＮＡ（配列番号１０８）および１２０ｎｇのｓｇＲＮＡ（配列番号３４の足場配列）を、２５μＬのＯｐｔｉＭＥＭ培地と混合し、軽くボルテックスした。適切な量のＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ溶液を各ＲＮＡ溶液に添加し、チューブをフリックして混合し、低速で軽くスピンダウンした。完全な編集試薬溶液を、室温で１０分間インキュベートし、次いでＨｅｐａ１－６細胞に直接加えた。トランスフェクションの２日後、培地をＨｅｐａ１－６細胞の各ウェルから吸引し、ゲノムＤＮＡを、ＭａｇＭＡＸ（商標）ＤＮＡマルチサンプルウルトラ２．０キットを用いたＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘを介して、自動磁気ビーズ精製により精製した。ガイドの活性を、表２および３に要約し、使用したプライマーを表４に要約する。
実施例９－ＭＧ３－６／３－４およびＭＧ３－６タイプＩＩヌクレアーゼについてのガイド化学最適化
本発明者らは、４０種の異なる化学的に修飾したガイド（ｍＡｌｂ３６３４－３４－０～ｍＡｌｂ３６３４－３４－４４と命名）を設計し、これらのガイドのうち３９種の活性を試験した。一つのガイドであるｍＨ３６３４－３４－３２は、ＲＮＡ合成に失敗し、したがって、これを試験しなかった。本発明者らが、様々な化学修飾を挿入するためにモデルとして選択したガイドスペーサー配列は、マウス肝細胞株であるＨｅｐａ１－６細胞におけるガイドスクリーンにおいて最も活性なガイドであることが証明されたため、ｍＡｌｂ３６３４－３４（アルブミンイントロン１を標的化する）であった（表５および図１０を参照）。
ＭＧ３－６／３－４のｓｇＲＮＡは、５’末端に位置するスペーサー、続いてＣＲＩＳＰＲリピートおよびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒ）を含む。ＣＲＩＳＰＲリピートおよびｔｒａｃｒは、ＭＧ３－６ヌクレアーゼのものと同一である（図１１ａ、１１ｂ）。ＣＲＩＳＰＲリピートおよびｔｒａｃｒは、三つのステムループを含む構造化ＲＮＡを形成する（図１１ａ）。本発明者らは、リボースの２’ヒドロキシルをメチル基で置換するか、またはホスホジエステル骨格をホスホロチオエート（ＰＳ）で置換することによって、ステムループの異なる領域を修飾した。さらに、ガイドの５’のスペーサーを、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フッ素塩基とＰＳ結合の混合物で修飾した。設計した化学修飾の異なる組み合わせを、ｍＡｌｂ３６３４－３４－０～ｍＡｌｂ３６３４－３４－４４と呼び、配列を表６に示す。
全く同じ塩基配列を有するが、異なる化学修飾を有する３９の単一ガイドの編集活性を、ＭＧ３－６／３－４をコードするｍＲＮＡおよびガイドの共トランスフェクションによってＨｅｐａ１－６細胞で評価し、結果を表６および図１２に示す。
同じ塩基配列およびＡｌｔＲ１／ＡｌｔＲ２と呼ばれる市販の化学修飾を有するガイドを、対照として使用した。これらのガイドにおけるスペーサー配列は、マウスゲノムのアルブミンイントロン１の２２のヌクレオチド領域を標的化する。ガイドｍＡｌｂ３６３４－３４－０（化学修飾なし）は、ＡｌｔＲ１／ＡｌｔＲ２ガイドに対して７２％の活性を示した。ガイドｍＡｌｂ３６３４－３４－１は、ＡｌｔＲ１／ＡｌｔＲ２ガイドと比較して１２４％の活性を示し、これは、編集のためのガイドの安定性の重要性である、ｍＡｌｂ３６３４－３４－１が、ｍＡｌｂ３６３４－３４－０より安定であることを示している（図１３および図１４を参照）。重要なことに、ｍＡｌｂ３６３４－３４－１７は、ＡｌｔＲ１／ＡｌｔＲ２と比較して１４７％の活性を保持していた。スペーサーにおける２’－Ｏ－フッ素の取り込みは、ｍＡｌｂ３６３４－３４－３５の安定性を大幅に増大させ、ガイドは、６５％の活性を保持していた。ｍＡｌｂ３６３４－３４－３５は、ＭＧ３－６／３－４ガイドの三つのステムループのループに２’－Ｏ－メチルおよびＰＳ結合を含有する。重要なことに、ｍＡｌｂ３６３４－３４－４２は、活性の６６％を保持し、このガイドは、ｍＡｌｂ３６３４－３４－１７と同じ数のフッ素をスペーサー中に含有するが、ｇＲＮＡに存在するすべてのループにＰＳ結合も含有する。ｍＡｌｂ３６３４－３４－２７は、６７％の活性を保持し、ｍＡｌｂ３６３４－３４－２９は、１１４％の活性を保持した。修飾のうち、これらのガイドは、それぞれ、ｍＡｌｂ３６３４－３４－２７およびｍＡｌｂ３６３４－３４－２９について、第一のステムループのループにおけるＰＳ結合および第一のステムループの第一の鎖における２’－Ｏ－メチル基を含む。これら二つの修飾を組み合わせる（第１のステムループの第１の鎖における２’－Ｏ－メチルおよび第１のステムループのループにおけるＰＳ結合）とき、ガイドは、それらの活性を失い（ｍＡｌｂ３６３４－３４－３３、ｍＡｌｂ３６３４－３４－３６、ｍＡｌｂ３６３４－３４－３８）、これは、ｇＲＮＡ／タンパク質の相互作用の複雑さを示し、単純な外挿の結果は、予測することが困難であることを示している。
化学修飾を有さないガイド（天然ＲＮＡ）と比較して、これらの化学的に修飾したガイドの安定性を試験するために、粗細胞抽出物を使用した安定性アッセイを使用した。ガイドＲＮＡは、インビトロまたはインビボで哺乳類細胞に送達したとき曝露するヌクレアーゼの混合物を含有するため、哺乳類細胞由来の粗細胞抽出物を選択した。Ｈｅｐａ１－６細胞を、コンフルエント細胞の１５ｃｍのディッシュ当たり３ｍｌの冷ＰＢＳを加え、細胞スクレーパーを使用してディッシュの表面から細胞を放出することによって回収した。細胞を、１０分間、２００ｇでペレット化し、将来的な使用のため－８０℃で凍結した。安定性アッセイのため、細胞を４体積の冷ＰＢＳ中に再懸濁した（例えば、１００ｍｇのペレットについて、細胞を４００μｌの冷ＰＢＳ中に再懸濁した）。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を、０．２％（ｖ／ｖ）の濃度撫で加え、細胞を１０秒間ボルテックスし、１０分間氷上に置き、１０秒間再びボルテックスした。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、細胞膜を破壊するが、使用した濃度ではタンパク質を不活化または変性しない、マイルドな非イオン性界面活性剤である。安定性反応を氷上でセットアップし、２ピコモルの各ガイド（１μｌの２μＭストック）と共に２０μｌの細胞粗抽出物を含んだ。入力、０．５時間、１時間、４時間、９時間、および場合により２１時間（時間は、各試料をインキュベートする時間の長さを指している）を含むガイド当たり、６種の反応をセットアップした。試料を０．５時間～２１時間、３７℃でインキュベートし、一方、入力対照を氷上に５分間置いた。各インキュベーション期間の後、反応を、フェノールとグアニジンチオシアネート（Ｔｒｉ試薬、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の混合物３００μｌを加えることによって停止させ、すべてのタンパク質を直ちに変性させ、リボヌクレアーゼを効率的に阻害し、その後のＲＮＡの回収を促進した。Ｔｒｉ試薬を加えた後、試料を１５秒間ボルテックスし、－２０℃で保存した。ＲＮＡを、Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して試料から抽出し、１００μｌのヌクレアーゼを含まない水において溶出した。修飾したガイドの検出を、Ｔａｑｍａｎ ｍｉＲＮＡアッセイテクノロジー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用したＴａｑｍａｎ ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して行い、プライマーおよびプローブを、ｍＡｌｂ３６３４－３４ ｓｇＲＮＡ中の配列を特異的に検出するよう設計した、これは、ガイドのすべてについて同じである。データを、入力試料に対する残りのｓｇＲＮＡの割合の関数としてプロットした（表７および８；図１３および図１４を参照）。
安定性アッセイは、ガイドの５’末端および３’末端に三つの２’－Ｏ－メチルおよび三つのＰＳ結合を導入することで、安定性が有意に改善されたことを示した（図１３および図１４を参照）。ｍＡｌｂ３６３４－１７およびｍＡｌｂ３６３４－４２のように、５’および３’修飾に追加の２’－蛍光を加えても、図１３に示すように、早期時点（最長９時間）では明らかな利点を示されず、安定性アッセイを２１時間にわたって行ったとき、安定性のわずかな改善が明白であった（図１４を参照）。ステムループのすべてのループに２－Ｏ－メチルおよびＰＳ結合を含むこと（ｍＡｌｂ３６３４－３５）は、図１３に示す通り、５’および３’末端に化学修飾を有するガイド（ｍＡｌｂ３６３４－１）と比較して、安定性が明白により大きく増大した。しかしながら、これらの結果を繰り返し、より長い時点で、この増大は、より早い時点では明白ではなくなり、図１４に示す通り、最長２１時間までのより遅い時間点で明白になった。個別のステムループの第１の鎖に２’－Ｏ－メチルを含むことは、ｍＡｌｂ３６３４－０およびｍＡｌｂ３６３４－２９およびｍＡｌｂ３６３４－３０を比較することによって示すように、最長９時間の安定性の利点をもたらさなかった。ｍＡｌｂ３６３４－３６は、全てのステムループの第１の鎖における２’－Ｏ－メチルと全てのステムループのループにおけるＰＳ結合の組み合わせを有し、これは、末端を修飾したガイド（ｍＡｌｂ３６３４－０）と比較したとき、９時間の明白な増大した安定性を示した。しかしながら、このガイドは、Ｈｅｐａ１－６細胞においてｍＲＮＡトランスフェクションを介して試験したとき、活性ではなかった。一般に、追加の修飾（例えば、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－フルオロまたはＰＳ結合）を末端を修飾したガイドに加えることは、最長９時間の早期時点での安定性に大きな利点をもたらさず（図１３）、安定性のわずかな増加は、より長い時点で明らかになった（図１４）。このｇＲＮＡの大きなサイズ（１１０ｎｔ）および高度に構造化された性質は、より短いまたはあまり構造化されていないガイドＲＮＡよりも本質的に安定的になり得、これにより、安定性に対する化学修飾の利点が限定される。ガイドの５’および３’末端を修正すると、ヌクレアーゼに対する良好なレベルの保護を提供するように思われる。しかしながら、ガイドに追加の修飾を加えることは、これらのタイプの修飾が免疫原性を低減する可能性があるため、インビボでより多くの利点をもたらし得る。
実施例１０－タイプＶ－Ａヌクレアーゼのタンパク質組換え
タイプＩＩヌクレアーゼより迅速なＰＡＭ交換の能力を拡大するために、タンパク質組換えのため、三つのタイプのＶ－Ａヌクレアーゼを選択した。ブレークポイントを、予測した構造情報に基づき選択した（表１）。タイプＩＩ酵素組換えと同様に、タイプＶキメラを、タンパク質が密接に関連するファミリーから組換えたとき、活性を示した。インビトロＰＡＭ濃縮およびＮＧＳ解析により、キメラのＰＡＭがＣ末端親から遺伝するという一貫した結果が明らかになった。ブレークポイント最適化を利用することによって遠く関連するファミリーからのタンパク質組換えの可能性のある構造破壊を回避することが可能であり得る（図１５）。
実施例１１－ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＴＲＡＣのＤＮＡレベルでの遺伝子編集結果の解析
以下の表７Ａおよび配列番号１１９～１５８に記載するｓｇＲＮＡを含むＭＧ３－６／４ ＲＮＰ（１０４ｐｍｏｌのタンパク質／３００ｐｍｏｌのガイド）のヌクレオフェクションを、Ｌｏｎｚａ ４Ｄエレクトロポレーターを使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２００，０００）において行った。細胞を回収し、トランスフェクションの３日後にゲノムＤＮＡを調製した。ＮＧＳベースのＤＮＡシーケンシングでの使用に適したＰＣＲプライマーを作製し、最適化し、各ガイドＲＮＡの個々の標的配列を増幅するために使用した。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑマシン上で配列決定し、独自のＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いて解析して、遺伝子編集を測定した（図１６）。結果は、ｓｇＲＮＡであるＣ１、Ｆ２、およびＢ３が、インデルの誘導に最も効果的であることを示し、ｓｇＲＮＡであるＤ２、Ｈ２、Ａ３、およびＣ３についてもかなりの編集が生じている。
実施例１２－ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＢ２ＭのＤＮＡレベルでの遺伝子編集結果の解析
以下の表７Ｂおよび配列番号１５９～２１０に記載するｓｇＲＮＡを含むＭＧ３－６／４ ＲＮＰ（１０４ｐｍｏｌのタンパク質／３００ｐｍｏｌのガイド）のヌクレオフェクションを、Ｌｏｎｚａ ４Ｄエレクトロポレーターを使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２００，０００）において行った。細胞を回収し、トランスフェクションの３日後にゲノムＤＮＡを調製した。ＮＧＳベースのＤＮＡシーケンシングでの使用に適したＰＣＲプライマーを作製し、最適化し、各ガイドＲＮＡの個々の標的配列を増幅するために使用した。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑマシン上で配列決定し、独自のＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いて解析して、遺伝子編集を測定した（図１７）。結果は、ｓｇＲＮＡであるＡ１、Ｇ１、Ｂ２、Ｈ２、およびＢ４が、編集を誘導するのに最も効果的であることを示し、ｓｇＲＮＡであるＣ１、Ｄ１、Ａ２、Ｈ１、Ｅ２、Ｆ２、Ｇ２、Ａ３、Ｃ３、およびＤ３についてもかなりの編集を検出した。
実施例１３－Ｔ細胞におけるＴＲＡＣのＤＮＡおよび表現型レベルでの遺伝子編集結果の解析
初代Ｔ細胞を、製造元の推奨に従って、負の選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してＰＭＢＣから精製した。以下の表７Ａおよび配列番号１１９～１５８に記載するｓｇＲＮＡを含むＭＧ３－６／４ ＲＮＰ（１０４ｐｍｏｌのタンパク質／１２０ｐｍｏｌのガイド）のヌクレオフェクションを、Ｌｏｎｚａ ４Ｄエレクトロポレーターを使用してＴ細胞（２００，０００）において行った。細胞を回収し、トランスフェクションの３日後にゲノムＤＮＡを調製した。ＮＧＳベースのＤＮＡシーケンシングでの使用に適したＰＣＲプライマーを作製し、最適化し、各ガイドＲＮＡの個々の標的配列を増幅するために使用した。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑマシン上で配列決定し、独自のＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いて解析して、遺伝子編集を測定した。フローサイトメトリーによる解析のため、ヌクレオフェクションの３日後、１００，０００個のＴ細胞を抗ＣＤ３抗体で４℃で３０分間染色し、Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔフローサイトメーターで解析した（図１８）。結果は、ｓｇＲＮＡであるＣ１、Ｄ２、Ｆ２、Ｈ２、Ａ３、Ｂ３、Ｃ３、およびＤ３が、ｓｇＲＮＡであるＣ１およびＢ３によって行われたほとんどの編集で、かなりの編集を示したことを示した。
実施例１４－Ｔ細胞におけるＢ２ＭのＤＮＡレベルでの遺伝子編集結果の解析
初代Ｔ細胞を、製造元の推奨に従って、負の選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してＰＭＢＣから精製した。以下の表７Ｂおよび配列番号１５９～２１０に記載するｓｇＲＮＡを含むＭＧ３－６／４ ＲＮＰ（１０４ｐｍｏｌのタンパク質／１２０ｐｍｏｌのガイド）のヌクレオフェクションを、Ｌｏｎｚａ ４Ｄエレクトロポレーターを使用してＴ細胞（２００，０００）において行った。細胞を回収し、トランスフェクションの３日後にゲノムＤＮＡを調製した。ＮＧＳベースのＤＮＡシーケンシングでの使用に適したＰＣＲプライマーを作製し、最適化し、各ガイドＲＮＡの個々の標的配列を増幅するために使用した。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑマシン上で配列決定し、独自のＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いて解析して、遺伝子編集を測定した（図１９）。
実施例１５－Ｔ細胞におけるＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２の表現型レベルでの遺伝子編集結果の解析
初代Ｔ細胞を、製造元の推奨に従って、負の選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してＰＢＭＣから精製した。以下の表７Ｃおよび配列番号２１１～３８２に記載するｓｇＲＮＡを含むＭＧ３－６／４ ＲＮＰ（１０４ｐｍｏｌのタンパク質／１２０ｐｍｏｌのガイド）のヌクレオフェクションを、Ｌｏｎｚａ ４Ｄエレクトロポレーターを使用してＴ細胞（２００，０００）において行った。フローサイトメトリーによる解析のため、ヌクレオフェクションの３日後、１００，０００個のＴ細胞を抗ＣＤ３抗体で４℃で３０分間染色し、Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔフローサイトメーターで解析した（図２０）。図２０の結果から分かるように、ＴＲＢＣ１の最も性能の高いｓｇＲＮＡは、Ａ１、Ｂ１、Ｅ１、Ｇ４、Ｈ４、およびＢ５であった。同様に、ＴＲＢＣ２の最も高い性能のｓｇＲＮＡは、Ｄ１、Ｈ１、およびＡ５であった。
実施例１６－Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３のＤＮＡレベルでの遺伝子編集結果の解析
以下の表７Ｄおよび配列番号３８３～５７２に記載するｓｇＲＮＡを含むＭＧ３－６／４ ＲＮＰ（１０４ｐｍｏｌのタンパク質／１２０ｐｍｏｌのガイド）のヌクレオフェクションを、Ｌｏｎｚａ ４Ｄエレクトロポレーターを使用してＨｅｐ３Ｂ細胞（１００，０００）において行った。細胞を回収し、トランスフェクションの３日後にゲノムＤＮＡを調製した。ＮＧＳベースのＤＮＡシーケンシングでの使用に適したＰＣＲプライマーを作製し、最適化し、各ガイドＲＮＡの個々の標的配列を増幅するために使用した。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑマシン上で配列決定し、独自のＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いて解析して、遺伝子編集を測定した（図２１）。結果は、ｓｇＲＮＡであるＥ５、Ｃ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ｇ９、Ｇ１０、Ｅ１１、Ａ１２、およびＣ１２が、このアッセイにおける最高性能のｓｇＲＮＡであることを示す。
実施例１７－Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるＰＣＳＫ９のＤＮＡレベルでの遺伝子編集結果の解析
以下の表７Ｅおよび配列番号５７３～６０２に記載するｓｇＲＮＡを含むＭＧ３－６／４ ＲＮＰ（１０４ｐｍｏｌのタンパク質／１２０ｐｍｏｌのガイド）のヌクレオフェクションを、Ｌｏｎｚａ ４Ｄエレクトロポレーターを使用してＨｅｐ３Ｂ細胞（１００，０００）において行った。細胞を回収し、トランスフェクションの３日後にゲノムＤＮＡを調製した。ＮＧＳベースのＤＮＡシーケンシングでの使用に適したＰＣＲプライマーを作製し、最適化し、各ガイドＲＮＡの個々の標的配列を増幅するために使用した。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑマシン上で配列決定し、独自のＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いて解析して、遺伝子編集を測定した（図２２）。結果は、最も高い編集性能を、ｓｇＲＮＡであるＢ１、Ｆ１、Ａ２、およびＥ２で達成し、相当な編集をＤ２、Ｃ２、Ｂ２、Ｈ１、およびＦ２でも生じたことを示す。
実施例１８－脂質ナノ粒子の全身投与によって送達したキメラヌクレアーゼＭＧ３－６／３－４によるマウスの肝臓におけるインビボ遺伝子編集
生きている動物においてインビボでゲノムを編集するＭＧ３－６／３－４キメラタイプＩＩヌクレアーゼの能力を評価するために、脂質ナノ粒子を使用して、マウスＨＡＯ－１遺伝子のコード配列の異なる部分を標的化するＭＧ３－６／３－４ヌクレアーゼ（例えば、配列番号６０３のＲＮＡバージョン）をコードするｍＲＮＡおよび単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（例えば、以下の表に記載する）を送達した。ＨＡＯ－１遺伝子は、グリコール酸代謝に関与する酵素であり、主に肝臓の肝細胞で発現される、グリコール酸オキシダーゼをコードする。ＨＡＯ－１コード配列を標的化するｓｇＲＮＡのスクリーニングを、マウス肝細胞株Ｈｅｐａ１－６で行い、活性ガイドを特定した。ＭＧ３－６／３－４ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトしたとき、Ｈｅｐａ１－６細胞において４６％および２６％の編集を示したｓｇＲＮＡであるｍＨ３６４－７およびｍＨ３６４－２０を、マウスにおける試験のため選択した。ｍＨ３６４－７は、エクソン２を標的化し、ｍＨ３６４－２０は、エクソン４を標的化する。
天然ＲＮＡ構造の多数の化学修飾を、これらのｓｇＲＮＡに組み入れた。これらの化学修飾を、編集活性に悪影響を与えることなく、哺乳類細胞由来の抽出物においてインキュベートしたとき、インビトロでのｓｇＲＮＡの安定性を改善するそれらの能力に基づいて選択した。マウスにおける初期試験のため、化学１および化学３５を組み込んだｓｇＲＮＡ ｍＨ３６４－７およびｍＨ３６４－２０を試験のため選択し、ｍＨ３６４－７－１、ｍＨ３６４－２０－１、ｍＨ３６４－７－３５、ｍＨ３６４－２０－３５と指定した。化学修飾を含むこれらのガイドの配列を以下の表９に示す。
ＭＧ３－６／３－４ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓまたはＴｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した酵素を使用して、直線化プラスミド鋳型のインビトロ転写によって生成した。
ＲＮＡに転写したＤＮＡ配列（配列番号６０３）は、５’から３’の順序で以下のエレメント：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、核局在化シグナル、短いリンカー、ＭＧ３－６／３－４ヌクレアーゼのコード配列、短いリンカー、核局在化シグナル、ならびに３’非翻訳領域および約１００ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール（配列番号６０３は含まない）を含む。
このＭＧ３－６／３－４カセットにコードされる合成ｍＲＮＡ中にコードされるタンパク質配列は、５’から３’に以下のエレメント：ＳＶ４０由来の核局在化シグナル、五つのアミノ酸のリンカー（ＧＧＧＳ）、開始メチオニンコドンを除去したＭＧ３－６／３－４ヌクレアーゼのタンパク質コード配列、３つのアミノ酸のリンカー（ＳＧＧ）およびヌクレオプラスミン由来の核局在化シグナルを含む。このカセットのタンパク質コード領域のＤＮＡ配列を、市販のアルゴリズムを使用してヒトにおけるコドン使用を反映するように改変した。およそ１００個のヌクレオチドのｐｏｌｙＡテールを、インビトロ転写に使用するプラスミド中にコードさせ、ｍＲＮＡを、Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入したＣｌｅａｎＣＡＰ（商標）試薬を使用して共転写的にキャッピングした。ｍＲＮＡ中のウリジンを、Ｎ１－メチルシュードウリジンで置換した。
ＭＧ３－６／３－４ ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡを送達するために使用した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤は、Ｋａｕｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ（Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１５，１５，１１，７３００－７３０６（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．５ｂ０２４９７０）を含む文献に記載されるＬＮＰ製剤に基づく。四つの脂質成分をエタノールに溶解し、適切なモル比で混合して、脂質ワーキングミックスを作製した。ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡを、製剤化する前に１：１の質量比で混合するか、または別個のＬＮＰ中で製剤化し、その後、二つのＲＮＡの１：１の質量比でマウスに同時注射した。いずれの場合も、ＲＮＡを１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）において希釈して、ＲＮＡワーキングストックを作製した。脂質ワーキングストックおよびＲＮＡワーキングストックを、マイクロ流体デバイス（Ｉｇｎｉｔｅ ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で、それぞれ１：３の流速比および１２ｍＬ／分の流速で混合した。ＬＮＰを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して２～１６時間透析し、次いで、体積減少を達成するまで、Ａｍｉｃｏｎスピン濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。ＬＮＰ製剤中のＲＮＡの濃度を、リボグリーン試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して測定した。ＬＮＰの直径および多分散性（ＰＤＩ）を、動的光散乱によって決定した。代表的なＬＮＰは、６５ｎｍ～１２０ｎｍの範囲にある直径を有し、ＰＤＩは０．０５～０．２０であった。ＬＮＰを、８～１２週齢のＣ５７Ｂｌ６野生型マウスに、尾静脈（マウス当たり０．１ｍＬ）を介して、体重１ｋｇ当たり１ｍｇのＲＮＡ総ＲＮＡ用量で静脈内注射した。投与後１１日目に、各群中の５匹のマウスのうち３匹を屠殺し、肝臓を収集し、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で供給された消化緩衝液中のビードビーター（Ｏｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用してホモジナイズした。ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、得られたホモジネートからゲノムＤＮＡを精製し、２６０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量した。緩衝液のみを注射したマウスから精製したゲノムＤＮＡを対照として使用した。投与の２８日後に、各群中の残りの２匹のマウスを屠殺し、肝臓を収集し、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で供給された消化緩衝液中のビードビーター（Ｏｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用してホモジナイズした。ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、得られたホモジネートからゲノムＤＮＡを精製し、２６０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量した。緩衝液のみを注射したマウスから精製したゲノムＤＮＡを対照として使用した。
次いで、肝臓ゲノムＤＮＡを、二つのガイドによって標的化される領域に隣接するプライマーの第１のセットを使用してＰＣＲ増幅した。使用したＰＣＲプライマーを以下の表１０に示す。
これらのプライマーの５’末端は、配列多様性を与え、ＭｉＳｅｑ配列決定品質を改善するために、第２のＰＣＲで使用するＰＣＲプライマーに相補的な保存された領域、続いて５Ｎを含み、マウスゲノム中の標的領域に相補的な配列で終わる。ＰＣＲを、Ｑ５（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２×Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、１００ｎｇのゲノムＤＮＡおよび６０℃のアニーリング温度で、合計３０サイクルにわたって行った。続いて、ＭｉＳｅｑ装置上の次世代配列決定のための固有の二重イルミナバーコード（ＩＤＴ）を追加するように設計したプライマーを使用したＰＣＲの１０サイクルの第２ラウンドを行った。各試料を、１５０ｂｐの対形成した最終読み取り値を使用して、１０，０００リードを超える深さまで配列決定した。読み取り値を合わせて、単一の２５０ｂｐの配列を生成し、そこからインデルパーセンテージおよびインデルプロファイルを、独自のＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して計算した。
投与の１１日後のマウス由来のインデルのＮＧＳ解析の結果を、個々のマウスについて表１１に示し、図３２に要約する。
群２のマウスは、ガイドＲＮＡ ｍＨ３６４－７－１を封入しているＬＮＰを受けた。群３のマウスは、ガイドＲＮＡｍＨ３６４－７－３５を封入しているＬＮＰを受けた。群４のマウスは、ガイドＲＮＡ ｍＨ３６４－２０－１を封入しているＬＮＰを受けた。群５のマウスは、ガイドＲＮＡｍＨ３６４－２０－３５を封入しているＬＮＰを受けた。群２～５のすべてのマウスはまた、注射前に１：１のＲＮＡ質量比でＬＮＰを含有するガイドＲＮＡと混合したＭＧ３－６／３－４ ｍＲＮＡを封入しているＬＮＰを受けた。ＰＢＳ緩衝液を注射したマウスの肝臓では、インデルを検出しなかった（表１１を参照）。ガイド３６４ｍＨＡ－Ｇ７－１およびＭＧ３－６／３－４を封入しているＬＮＰを注射したマウスは、平均頻度５３．０％で、ＨＡＯ－１の標的部位でインデルを示した。ガイド３６４ｍＨＡ－Ｇ７－３５およびＭＧ３－６／３－４を封入しているＬＮＰを注射したマウスは、平均頻度２３．６％で、ＨＡＯ－１の標的部位でインデルを示した。ガイド３６４ｍＨＡ－Ｇ２０－１およびＭＧ３－６／３－４を封入しているＬＮＰを注射したマウスは、平均頻度８．９％で、ＨＡＯ－１の標的部位でインデルを示した。ガイド３６４ｍＨＡ－Ｇ２０－３５およびＭＧ３－６／３－４を封入しているＬＮＰを注射したマウスは、平均頻度２．５％で、ＨＡＯ－１の標的部位でインデルを示した。これらのデータは、同じ化学修飾を有するガイドを比較するとき、スペーサー７（３６４ｍＨＡ－Ｇ７－１および３６４ｍＨＡ－Ｇ７－３５）を有するガイドが、スペーサー２０を有するガイド（３６４ｍＨＡ－Ｇ２０－１および３６４ｍＨＡ－Ｇ２０－３５）よりもインビボで有意に強力であることを示す。これは、ｍＲＮＡベースのトランスフェクションによって、Ｈｅｐａ１－６細胞においてこれら二つのガイド配列で観察した高レベルの編集と一致する（ｍＨ３６４－７は、Ｈｅｐａ１－６細胞において４６％のインデルを示し、ｍＨ３６４－２０は、２６％のインデルを示した）。ガイド化学＃１は、ガイド７（化学＃１で２．２倍高い編集）およびガイド２０（化学＃１で３．５倍高い編集）の両方について化学＃３５よりも高いレベルの編集をもたらした。これらのデータは、ＭＧ３－６／３－４ヌクレアーゼが、マウスにおいて、ｓｇＲＮＡによって特定される標的部位でインビボで編集できることを示す。さらに、化学＃１と指定した化学修飾のセットを有するｓｇＲＮＡは、ＬＮＰを使用して送達されたとき、肝臓全体中のゲノムＤＮＡの５３％で編集を促進することができた。これらの研究で使用したＬＮＰを、低密度リポタンパク質受容体への結合のためのリガンドであるＬＮＰへのアポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）の結合を介して取り込む（例えば、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２００５ ３２８（１）：５７－６２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｒｃ．２００４．１２．１３７、Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１０（７）：１３５７－６４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１０．８５を参照）。
肝臓は、多数の異なる細胞タイプから構成される。マウスの肝臓では、肝細胞は、全細胞の約５２％を構成し（肝細胞の３５％は二つの核を含む）、クッパー細胞（１８％）、伊東細胞（８％）、および内皮細胞（２２％）が残りの細胞を構成する（Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３１，７１３－７２６ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００４１８－００９－０５７７－１）。理論によって結びつけられることを望まないが、外挿により、マウス肝臓の総核の約６０％［（（５２＋（０．３５×５２））／（４８＋（５２＋（０．３５×５２））］］が肝細胞に由来すると予測する。ＬＤＬ受容体は、主に肝臓の肝細胞上に発現するため（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ＥＮＳＧ０００００１３０１６４－ＬＤＬＲ／ｔｉｓｓｕｅ／ｌｉｖｅｒ＃ｉｍｉｄ＿２８１５８３１）、本明細書に記載するマウス研究で使用するＬＮＰは、主に肝細胞によって取り込まれると予想する。肝細胞核は、マウスの肝臓全体の全核の約６０％を占めるため、すべての肝細胞核が編集された場合、肝臓全体で測定したインデルのレベルは、約６０％であると予測すると予測することができる。ＭＧ３－６／３－４のＬＮＰ送達が５３％のインデル率を達成することができたという所見は、肝細胞核の大部分が編集されたことを示唆している。
ＨＡＯ１遺伝子は、グリコール酸代謝に関与する細胞内酵素であるタンパク質グリコール酸オキシダーゼ（ＧＯ）をコードする。ＨＡＯ１遺伝子で観察した遺伝子編集が肝臓におけるＧＯタンパク質の発現の減少をもたらしたかどうかを決定するために、本発明者らは、同じ研究のマウスの肝臓の別個の葉から総タンパク質を抽出した。ＧＯタンパク質を、マウスＧＯタンパク質に対する市販の抗体を用いたウェスタンブロットアッセイを使用して検出した。ビンクリンのレベルは、ＨＡＯ１遺伝子の遺伝子編集によって影響を受けないと予測するため、タンパク質ビンクリンをウェスタンブロットのローディング対照として使用した。図２４に示すように、ＧＯタンパク質のレベルは、ＭＧ３－６／３－４ ｍＲＮＡおよびＨＡＯ１を標的化するｓｇＲＮＡを封入しているＬＮＰで処置したマウスの肝臓で有意に減少した。画像解析ソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ）を使用したウェスタンブロットの定量およびビンキュリンレベルへのＧＯの正規化は、ＧＯレベルが、それぞれ、ｓｇＲＮＡ ｍＨ３６４－７－１、ｍＨ３６４－７－３５、ｍＨ３６４－２０－１、およびｍＨ３６４－２０－３５で処置したマウスにおいて平均７５％、５８％、４％、および２４％減少したことを示した。ＧＯタンパク質の減少の程度は、マウスのこれらの群におけるインデル頻度と相関する（表１１を参照）。これらのデータは、適切に設計したｓｇＲＮＡと組み合わせたＭＧ３－６／３－４ヌクレアーゼを使用して、生きいている哺乳動物においてインビボで対象の遺伝子においてインデルを作製し、その遺伝子によってコードされるタンパク質の産生を減少させる（ノックダウンする）ことができることを示す。特定の遺伝子の発現の減少は、特定の疾患において治療上有益であり得る。ＧＯタンパク質をコードするＨＡＯ１遺伝子の場合、肝臓におけるＧＯタンパク質のレベルの減少は、遺伝性疾患原発性高オキサル尿症Ｉ型を有する患者において有益であると予測する（Ｍａｒｔｉｎ－Ｈｉｇｅｒａｓ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２４，７１９－７２５）。したがって、ＭＧ３－６／３－４ヌクレアーゼは、ＨＡＯ１遺伝子を標的化する適切な化学修飾を含有する適切なｓｇＲＮＡとともに、一次高オキサル尿症Ｉ型の処置のための可能性のあるアプローチである。
実施例１９－四つの異なる化学修飾を有する同じガイドＲＮＡ配列を使用したマウスにおけるＭＧ３－６／３－４遺伝子編集効率の比較
インビボでの編集効率に対するｓｇＲＮＡへの化学修飾の影響を、同じガイドＲＮＡ配列に導入した四つの異なるガイド化学を試験することによってさらに調べた。マウスＨＡＯ１遺伝子を標的化するガイドＲＮＡ７を、化学修飾＃１、＃３５、＃４２、または＃４５で合成した。これらのガイドの配列を以下の表１２に示す。
ＭＧ３－６／３－４ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓまたはＴｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した酵素を使用して、直線化プラスミド鋳型のインビトロ転写によって生成した。ＲＮＡに転写したＤＮＡ配列は、５’から３’の順序で以下のエレメント：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、核局在化シグナル、短いリンカー、ＭＧ３－６／３－４ヌクレアーゼのコード配列、短いリンカー、核局在化シグナル、ならびに３’非翻訳領域（配列番号６０３）および約１００ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール（配列番号６０３は含まない）を含む。
このＭＧ３－６／３－４カセットにコードされる合成ｍＲＮＡ中にコードされるタンパク質配列は、５’から３’に以下のエレメント：ＳＶ４０由来の核局在化シグナル、五つのアミノ酸のリンカー（ＧＧＧＳ）、開始メチオニンコドンを除去したＭＧ３－６／３－４ヌクレアーゼのタンパク質コード配列、３つのアミノ酸のリンカー（ＳＧＧ）およびヌクレオプラスミン由来の核局在化シグナルを含む。このカセットのタンパク質コード領域のＤＮＡ配列を、市販のアルゴリズムを使用してヒトにおけるコドン使用を反映するように改変した。およそ１００個のヌクレオチドのｐｏｌｙＡテールを、インビトロ転写に使用するプラスミド中にコードさせ、ｍＲＮＡを、Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入したＣｌｅａｎＣＡＰ（商標）試薬を使用して共転写的にキャッピングした。ｍＲＮＡ中のウリジンを、Ｎ１－メチルシュードウリジンで置換した。ＭＧ３－６／３－４ ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡを送達するために使用した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤は、Ｋａｕｆｆｍａｎら（Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１５，１５，１１，７３００－７３０６，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．５ｂ０２４９７０）を含む文献に記載されるＬＮＰ製剤に基づく。四つの脂質成分をエタノールに溶解し、適切なモル比で混合して、脂質ワーキングミックスを作製した。ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡを、製剤化前に１：１の質量比で混合するか、または別個のＬＮＰで製剤化し、それらを後に二つのＲＮＡの１：１の質量比でマウスに同時注射した。いずれの場合でも、ＲＮＡを１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）に希釈して、ＲＮＡワーキングストックを作製した。脂質ワーキングストックおよびＲＮＡワーキングストックを、マイクロ流体装置（Ｉｇｎｉｔｅ ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で、それぞれ、１：３の流速比、および１２ｍＬ／分の流速で混合した。ＬＮＰを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して２～１６時間透析し、次いで、体積の減少を達成するまで、Ａｍｉｃｏｎスピン濃縮器（ミリポア）を使用して濃縮した。ＬＮＰ製剤中のＲＮＡの濃度を、リボグリーン試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して測定した。ＬＮＰの直径および多分散性（ＰＤＩ）を、動的光散乱によって決定した。代表的なＬＮＰは、６５ｎｍ～１２０ｎｍの範囲にある直径を有し、ＰＤＩは０．０５～０．２０であった。ＬＮＰを、８～１２週齢のＣ５７Ｂｌ６野生型マウスに、尾静脈（マウス当たり０．１ｍＬ）を介して、体重１ｋｇ当たり１ｍｇのＲＮＡ総ＲＮＡ用量で静脈内注射した。投与後１０日目に、各群中の５匹のマウスのうち３匹を屠殺し、肝臓を収集し、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で供給された消化緩衝液中のビードビーター（Ｏｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用してホモジナイズした。ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、得られたホモジネートからゲノムＤＮＡを精製し、２６０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量した。緩衝液のみを注射したマウスから精製したゲノムＤＮＡを対照として使用した。投与後２８日後に、各群中の残る２匹のマウスを屠殺し、肝臓を収集し、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で供給された消化緩衝液中のビードビーター（Ｏｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用してホモジナイズした。ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、得られたホモジネートからゲノムＤＮＡを精製し、２６０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量した。緩衝液のみを注射したマウスから精製したゲノムＤＮＡを対照として使用した。
次いで、肝臓ゲノムＤＮＡを、二つのガイドによって標的化される領域に隣接するプライマーの第１のセットを使用してＰＣＲ増幅した。使用したＰＣＲプライマーを表１０に示す。これらのプライマーの５’末端は、配列多様性を与え、ＭｉＳｅｑ配列決定品質を改善するために、第２のＰＣＲで使用するＰＣＲプライマーに相補的な保存された領域、続いて５Ｎを含み、マウスゲノム中の標的領域に相補的な配列で終わる。ＰＣＲを、Ｑ５（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２×Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、１００ｎｇのゲノムＤＮＡおよび６０℃のアニーリング温度で、合計３０サイクルにわたって行った。続いて、ＭｉＳｅｑ装置上の次世代配列決定のための固有の二重イルミナバーコード（ＩＤＴ）を追加するように設計したプライマーを使用したＰＣＲの１０サイクルの第２ラウンドを行った。各試料を、１５０ｂｐの対形成した最終読み取り値を使用して、１０，０００リードを超える深さまで配列決定した。読み取り値を合わせて、単一の２５０ｂｐの配列を生成し、そこからインデルパーセンテージおよびインデルプロファイルを、独自のＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して計算した。
編集結果を図２５に要約し、表１３に集計する。
ＰＢＳ緩衝液を注射した対照マウスは、ガイド７の標的部位に測定可能なインデルを含有しなかった。ガイドｍＨ３６４－７－１、ｍＨ３６４－７－３５、ｍＨ３６４－７－４２、およびｍＨ３６４－７－４５を含有するＬＮＰを受け取ったマウスにおける平均インデル頻度は、それぞれ、４６．１％、２６．６％、３２．４％、および３２．１％であり、ガイドＲＮＡ化学＃１が最も強力であり、続いて＃４２および＃４５であり、化学＃３５が最も強力ではないことを示している。これらのデータは、ガイドＲＮＡの５’末端および３’末端の塩基および骨格に対する化学修飾が、試験した化学の中で最も高いインビボ効力をもたらしたことを示唆している。内部塩基の追加の修飾は、インビボでの効力を改善しなかった。これらの所見は、ｓｇＲＮＡの両端および内部配列での塩基または骨格の修飾が、最適なインビボ編集に必要であった場合、ｓｐＣａｓ９ ｓｇＲＮＡの公表データ（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．４００５）と対照的であり、ｓｇＲＮＡの５’末端および３’末端のみの修飾が、同様のＬＮＰにおける送達を使用して肝臓における低レベルの編集（２０％のＩＮＤＥＬＳ）を可能にした。
全ＲＮＡを、表１３に記載した同じマウス由来の肝臓の別個の葉から精製し、これを使用して、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄ－ＰＣＲ）によりＨＡＯ－１ ｍＲＮＡのレベルを測定した。ＰＢＳを注射したマウスを対照として使用し、編集したマウスの肝臓におけるＨＡＯ－１ ｍＲＮＡレベルをこれらの対照と比較した。ｄｄ－ＰＣＲアッセイを、標準的な技術を使用して設計し、最適化した。ｄｄＰＣＲは、複合体混合物中の特定の核酸の絶対的なコピー数を決定するための非常に正確な方法である（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７，２４０９（２０１７）。ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１７－０２２１７－ｘ）。総肝臓ＲＮＡを、逆転写によりｃＤＮＡにまず変換し、次いでＧＡＰＤＨを内部対照として使用してｄｄ－ＰＣＲアッセイにおいて定量して、試料間で正規化した。表１４に示す通り、ＭＧ３－６／３－４ ｍＲＮＡおよびマウスＨＡＯ１遺伝子を標的化するｓｇＲＮＡを封入しているＬＮＰで処置した個々のマウスにおけるＨＡＯ１ ｍＲＮＡのレベルは減少し、減少の程度は、インデル頻度と相関した。
ＨＡＯ１ ｍＲＮＡの最大の減少は、ｓｇＲＮＡ ｍＨ３６４－７－１で処置したマウスの群に見られ、一方、ｓｇＲＮＡ ｍＨ３６４－７－３５で処置したマウスでは、ＨＡＯ－１ ｍＲＮＡの最小の減少を観察した。ＨＡＯ１ ｍＲＮＡの減少は、ナンセンス媒介性崩壊と呼ばれる機序を介して、フレームシフト変異を遺伝子のコード配列に導入するときに生じ得る（Ｂｒｏｇｎａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １６，１０７－１１３（２００９），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｓｍｂ．１５５０）。ＭＧ３－６／３－４を有するＨＡＯ－１遺伝子で編集したマウスの肝臓におけるＨＡＯ－１ ｍＲＮＡの減少の観察は、表１５に示すように、高いフレームシフト率をもたらすインデルの存在と一致する。
表１５では、ＨＡＯ１コード配列のフレームシフトをもたらすインデルの平均頻度を、ＮＧＳデータから決定した。この解析は、インデルの大部分が、試験したｓｇＲＮＡの四つすべてのフレームシフトをもたらしたことを示す。
ＨＡＯ１遺伝子は、グリコール酸代謝に関与する細胞内酵素であるタンパク質グリコール酸オキシダーゼ（ＧＯ）をコードする。ＨＡＯ１遺伝子で観察した遺伝子編集が肝臓におけるＧＯタンパク質の発現の減少をもたらしたかどうかを決定するために、本発明者らは、図２５および表１３～１５に記載した同じ研究のマウスの肝臓の別個の葉から総タンパク質を抽出した。ＧＯタンパク質を、マウスＧＯタンパク質に対する市販の抗体を用いたウェスタンブロットアッセイを使用して検出した。等量のタンパク質をウェスタンブロットにロードした。図２５に示すように、ＧＯタンパク質のレベルは、ＭＧ３－６／３－４ ｍＲＮＡおよびＨＡＯ１を標的化するｓｇＲＮＡを封入しているＬＮＰで処置したマウスの肝臓で減少した。ガイドｍＨ３６４－７－４２（マウス７、８）、ｍＨ３６４－７－４５（マウス１２、１３）、およびｍＨ３６４－７－１（マウス１７、１８）は、ＧＯタンパク質の明らかな低減をもたらした。試験した四つのガイドの中で最も低いレベルのインデルを有するガイドｍＨ３６４－７－３５（マウス２２、２３）は、ＧＯタンパク質レベルを顕著に低減しなかった。これらのデータは、適切に設計したｓｇＲＮＡと組み合わせたＭＧ３－６／３－４ヌクレアーゼを使用して、生きいている哺乳動物においてインビボで対象の遺伝子においてインデルを作製し、その遺伝子によってコードされるタンパク質の産生を減少させる（ノックダウンする）ことができることを示す。特定の遺伝子の発現の減少は、特定の疾患において治療上有益であり得る。ＧＯタンパク質をコードするＨＡＯ１遺伝子の場合、肝臓におけるＧＯタンパク質のレベルの減少は、遺伝性疾患原発性高オキサル尿症Ｉ型を有する患者において有益であると予測する（Ｍａｒｔｉｎ－Ｈｉｇｅｒａｓ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２４，７１９－７２５）。したがって、ＭＧ３－６／３－４ヌクレアーゼは、ＨＡＯ１遺伝子を標的化する適切な化学修飾を含有する適切なｓｇＲＮＡとともに、一次高オキサル尿症Ｉ型の治療のための可能性のあるアプローチである。
本発明の好ましい実施形態は本明細書に示され、記載されるが、このような実施形態が、例示の目的でのみ提供されることは、当業者には明らかであろう。本発明は、本明細書内で提供される特定の実施例によって限定されることは意図されていない。本発明は前述の説明を参照して記載されているが、本明細書の実施形態の記載および説明は、限定された意味で解釈されることを意図していない。多数の変形、変更、および置換は、ここで、本発明から逸脱することなく、当業者にとって生じるであろう。さらに、本発明のすべての態様は、様々な条件および変数に依存する、本明細書に記載される特定の描写、構成または相対的割合に限定されないことが理解されよう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替が、本発明の実施に用いられ得ることは、理解されるべきである。したがって、本発明は、こうした任意の代替、修正、変形、または均等物も包含することが企図される。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲、およびそれによって包含されるこれらの請求の範囲およびそれらの均等物内のその方法および構造を定義することが意図される。

Claims (81)

  1. 融合エンドヌクレアーゼであって、
    （ａ）配列番号６９６またはそのバリアントと少なくとも５５％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼのＲｕｖＣドメイン、ＲＥＣドメイン、またはＨＮＨドメインの少なくとも一部を含むＮ末端配列；および
    （ｂ）配列番号６９７～７２１のいずれか一つまたはそのバリアントと少なくとも５５％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼのＷＥＤ、ＴＯＰＯ、またはＣＴＤドメインを含むＣ末端配列を含む、融合エンドヌクレアーゼであって、前記Ｎ末端配列および前記Ｃ末端配列が、天然では、同じリーディングフレームにおいて一緒に生じない、融合エンドヌクレアーゼ。
  2. 前記Ｎ末端配列および前記Ｃ末端配列が、異なる生物に由来する、請求項１に記載の融合エンドヌクレアーゼ。
  3. 前記Ｎ末端配列が、ＲｕｖＣ－Ｉ、ＢＨ、またはＲｕｖＣ－ＩＩドメインをさらに含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の融合エンドヌクレアーゼ。
  4. 前記Ｃ末端配列が、ＰＡＭ相互作用ドメインをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合エンドヌクレアーゼ。
  5. 配列番号１～２７または１０８のいずれか一つと少なくとも５５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の融合エンドヌクレアーゼ。
  6. ｎｎＲＧＧｎＴ（配列番号５３）ではないＰＡＭに結合するよう構成されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合エンドヌクレアーゼ。
  7. 配列番号４６～５２または５４～６６のいずれか一つを含むＰＡＭに結合するよう構成されている、請求項６に記載の融合エンドヌクレアーゼ。
  8. 配列番号１～２７もしくは１０８のいずれか一つ、またはそのバリアントと少なくとも５５％の配列同一性を有する操作されたアミノ酸配列を含む、エンドヌクレアーゼ。
  9. 配列番号１０９～１１０のいずれか一つ、またはそのバリアントと少なくとも５５％の配列同一性を有する操作されたアミノ酸配列を含む、エンドヌクレアーゼ。
  10. 操作されたヌクレアーゼシステムであって、
    （ａ）請求項１～９のいずれか一項に記載の前記エンドヌクレアーゼ；および
    （ｂ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成されたガイドリボ核酸；
    前記ガイドリボ核酸配列が、前記エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されている、を含む前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成された操作されたガイドリボ核酸構造を含む、操作されたヌクレアーゼシステム。
  11. 前記ガイドリボ核酸が、前記エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列をさらに含む、請求項１０に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
  12. 前記エンドヌクレアーゼが、培養されていない微生物に由来する、請求項１０または１１に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
  13. 前記エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ １２ｃエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｄエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｃエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓ１３ｄエンドヌクレアーゼである、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
  14. 前記エンドヌクレアーゼが、ＳｐｙＣａｓ９エンドヌクレアーゼと８６％未満の同一性を有する、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
  15. 前記システムが、Ｍｇ２＋の供給源をさらに含む、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
  16. 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号８～１２、２６～２７、もしくは１０８のいずれか一つ、またはそのバリアントと少なくとも５５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
  17. 前記ガイドリボ核酸配列が、配列番号３３、３４、４４、４５、７８、８４、または８７のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１０～１６のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
  18. 操作されたヌクレアーゼであって、
    （ａ）配列番号１～２７、１０８、もしくは１０９～１１０のいずれか一つ、またはそのバリアントのＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインと少なくとも５５％の配列同一性を有するクラスＩＩ、タイプＩＩ Ｃａｓ酵素ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメイン；ならびに
    （ｂ）配列番号１～２７、１０８、もしくは１０９～１１０のいずれか一つ、またはそのバリアントのＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインと少なくとも５５％の配列同一性を有するクラスＩＩ、タイプＩＩ Ｃａｓ酵素ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含む、操作されたヌクレアーゼ。
  19. （ａ）および（ｂ）が、天然では、一緒に生じない、請求項１８に記載の操作されたヌクレアーゼ。
  20. 前記クラスＩＩ、タイプＩＩ Ｃａｓ酵素が、培養されていない微生物に由来する、請求項１８または１９に記載の操作されたヌクレアーゼ。
  21. 前記エンドヌクレアーゼが、ＳｐｙＣａｓ９エンドヌクレアーゼと８６％未満の同一性を有する、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼ。
  22. 配列番号１～２７のいずれか一つと少なくとも５５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼ。
  23. 操作されたヌクレアーゼシステムであって、
    （ａ）請求項１８～２２のいずれか一項に記載の操作されたエンドヌクレアーゼ；および
    （ｂ）ｉ．標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成され、前記エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたガイドリボ核酸配列を含む、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成された操作されたガイドリボ核酸構造を含む、操作されたヌクレアーゼシステム。
  24. 前記ガイドリボ核酸が、前記エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列をさらに含む、請求項２３に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
  25. 前記ガイドリボ核酸配列が、配列番号２８～３２もしくは３３～４４のいずれか一つ、またはそのバリアントの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２３または２４に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
  26. 前記標的核酸部位に隣接する前記ヌクレアーゼと適合性があるＰＡＭ配列をさらに含む、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
  27. 前記ＰＡＭ配列が、前記標的デオキシリボ核酸配列の３’に位置する、請求項２６に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
  28. 前記ＰＡＭ配列が、配列番号４６～６６のいずれか一つを含む、請求項２６～２７のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
  29. 請求項２３～２８のいずれか一項に記載のシステムを細胞に導入することを含む、アルブミン遺伝子を標的化する方法であって、前記ガイドリボ核酸配列が、配列番号６７～８６のいずれか一つを含む配列にハイブリダイズするよう構成されている、方法。
  30. 請求項２３～２８のいずれか一項に記載のシステムを細胞に導入することを含む、ＨＡＯ１遺伝子を標的化する方法であって、前記ガイドリボ核酸配列が、配列番号６１１～６３３のいずれか一つにハイブリダイズするよう構成されている、方法。
  31. 前記ガイドリボ核酸配列が、配列番号６１５、６１８、６２０、６２４、または６２６のいずれか一つにハイブリダイズするよう構成されている、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ガイドリボ核酸が、配列番号６４５～６８４のいずれか一つに記載の配列を含む、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記ガイドリボ核酸が、配列番号６４５～６４９、６５２～６５６、６６０～６７１、６７４～６７５、もしくは６８１～６８４のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列、または配列番号６４５～６４９、６５２～６５６、６６０～６７１、６７４～６７５、もしくは６８１～６８４のいずれか一つの標的化配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 細胞におけるＨＡＯ－１遺伝子座を破壊する方法であって、前記細胞に
    （ａ）クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ；および
    （ｂ）操作されたガイドＲＮＡ、前記操作されたガイドＲＮＡが、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、前記操作されたガイドＲＮＡが、前記ＨＡＯ－１遺伝子座の領域にハイブリダイズするよう構成された標的化配列を含む、を導入することを含み、
    前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号６１１～６２６または６２７～６３３と少なくとも８０％の同一性を有する標的化配列にハイブリダイズするよう構成されるか、または含む、方法。
  35. 前記クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、請求項１～９または１８～２２のいずれか一項に記載の融合エンドヌクレアーゼを含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、配列番号１０またはそのバリアントと少なくとも５５％の同一性を有する配列を含む、請求項３４または３５に記載の方法。
  37. 前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号７２２の非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号６１８、６２０、６２４、もしくは６２６のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列、または配列番号６１８、６２０、６２４、もしくは６２６のいずれか一つの標的化配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記操作されたガイドＲＮＡが、表９または表１２のガイドＲＮＡのいずれか一つのヌクレオチド配列を含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  40. 細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子座を破壊する方法であって、前記細胞に、
    （ａ）クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ；および
    （ｂ）操作されたガイドＲＮＡ、前記操作されたガイドＲＮＡが、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、前記操作されたガイドＲＮＡが、前記ＴＲＡＣ遺伝子座の領域にハイブリダイズするよう構成された標的化配列を含む、を導入することを含み、
    前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号１３９～１５８と少なくとも８０％の同一性を有する標的化配列にハイブリダイズするよう構成されるか、もしくは含むか；または
    前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号１１９～１３８のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、方法。
  41. 前記クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、請求項１～９または１８～２２のいずれか一つに記載の融合エンドヌクレアーゼを含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、配列番号１０またはそのバリアントと少なくとも５５％の同一性を有する融合エンドヌクレアーゼを含む、請求項４０または４１に記載の方法。
  43. 前記操作されたガイドＲＮＡ が、配列番号７２２の非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号１２１、１３２、１３６、１３０、１３４、１３５、もしくは１３７のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列、または配列番号１２１、１３２、１３６、１３０、１３４、１３５、もしくは１３７のいずれか一つの標的化配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記操作されたガイドＲＮＡが、表７ＡのガイドＲＮＡのいずれか一つのヌクレオチド配列を含む、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
  46. 細胞におけるＢ２Ｍ遺伝子座を破壊する方法であって、前記細胞に、
    （ａ）クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ；および
    （ｂ）操作されたガイドＲＮＡ、前記操作されたガイドＲＮＡが、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、前記操作されたガイドＲＮＡが、前記Ｂ２Ｍ遺伝子座の領域にハイブリダイズするよう構成された標的化配列を含む、を導入することを含み、
    前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号１８５～２１０と少なくとも８０％の同一性を有する標的化配列にハイブリダイズするよう構成されるか、もしくは含むか；または
    前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号１５９～１８４のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、方法。
  47. 前記クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、請求項１～９または１８～２２のいずれか一項に記載の融合エンドヌクレアーゼを含む、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、配列番号１０またはそのバリアントと少なくとも５５％の同一性を有する配列を含む融合エンドヌクレアーゼを含む、請求項４６または４７に記載の方法。
  49. 前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号７２２の非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号１５９、１６５、１６８、１７４、もしくは１８４のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列、または配列番号１５９、１６５、１６８、１７４、もしくは１８４のいずれか一つの標的化配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記操作されたガイドＲＮＡが、表７ＢのガイドＲＮＡのいずれか一つのヌクレオチド配列を含む、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の方法。
  52. 細胞におけるＴＲＢＣ１遺伝子座を破壊する方法であって、前記細胞に、
    （ａ）クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ；および
    （ｂ）操作されたガイドＲＮＡ、前記操作されたガイドＲＮＡが、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、前記操作されたガイドＲＮＡが、前記ＴＲＢＣ１遺伝子座の領域にハイブリダイズするよう構成された標的化配列を含む、を導入することを含み、
    前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号２５２～２９２と少なくとも８０％の同一性を有する標的化配列にハイブリダイズするよう構成されるか、もしくは含むか；または
    前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号２１１～２５１のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、方法。
  53. 前記クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、請求項１～９または１８～２２のいずれか一項に記載の融合エンドヌクレアーゼを含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、配列番号１０またはそのバリアントと少なくとも５５％の同一性を有する配列を含む融合エンドヌクレアーゼを含む、請求項５２または５３に記載の方法。
  55. 前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号７２２の非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号２１１、２１２、２１５、２４１、もしくは２４２のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列、または配列番号２１１、２１２、２１５、２４１、もしくは２４２のいずれか一つの標的化配列と少なくとも８０％の同一性を有する標的化配列を含む、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記操作されたガイドＲＮＡが、表７ＣのガイドＲＮＡのいずれか一つのヌクレオチド配列を含む、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の方法。
  58. 細胞におけるＴＲＢＣ２遺伝子座を破壊する方法であって、前記細胞に、
    （ａ）クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ；および
    （ｂ）操作されたガイドＲＮＡ、前記操作されたガイドＲＮＡが、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、前記操作されたガイドＲＮＡが、前記ＴＲＢＣ２遺伝子座の領域にハイブリダイズするよう構成された標的化配列を含む、を導入することを含み、
    前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号３３８～３８２と少なくとも８０％の同一性を有する標的化配列にハイブリダイズするよう構成されるか、もしくは含むか；または
    前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号２９３～３３７のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、方法。
  59. 前記クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、請求項１～９または１８～２２のいずれか一項に記載の融合エンドヌクレアーゼを含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、配列番号１０またはそのバリアントと少なくとも５５％の同一性を有する配列を含む融合エンドヌクレアーゼを含む、請求項５８または５９に記載の方法。
  61. 前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号７２２の非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項５８～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号２９６、３０６、もしくは３３２のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むか、または配列番号２９６、３０６、もしくは３３２のいずれか一つの標的化配列と少なくとも８０％の同一性を有する標的化配列を含む、請求項５８～６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記操作されたガイドＲＮＡが、表７ＣのガイドＲＮＡのいずれか一つのヌクレオチド配列を含む、請求項５８～６１のいずれか一項に記載の方法。
  64. 細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子座を破壊する方法であって、前記細胞に、
    （ａ）クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ；および
    （ｂ）操作されたガイドＲＮＡ、前記操作されたガイドＲＮＡが、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、前記操作されたガイドＲＮＡが、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子座の領域にハイブリダイズするよう構成された標的化配列を含む、を導入することを含み、
    前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号４７８～５７２と少なくとも８０％の同一性を有する標的化配列にハイブリダイズするよう構成されるか、もしくは含むか；または
    前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号３８３～４７７のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、方法。
  65. 前記クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、請求項１～９または１８～２２のいずれか一項に記載の融合エンドヌクレアーゼを含む、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、配列番号１０またはそのバリアントと少なくとも５５％の同一性を有する融合エンドヌクレアーゼを含む、請求項６４または６５に記載の方法。
  67. 前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号７２２の非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６４～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号４１９、４２５、４３１、４３９、４４７、４５３、４６１、４６７、４７１、もしくは４７３のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列、または配列番号４１９、４２５、４３１、４３９、４４７、４５３、４６１、４６７、４７１、もしくは４７３のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項６４～６６のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記操作されたガイドＲＮＡが、表７ＤのガイドＲＮＡのいずれか一つのヌクレオチド配列を含む、請求項６４～６６のいずれか一項に記載の方法。
  70. 細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子座を破壊する方法であって、前記細胞に、
    （ａ）クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ；および
    （ｂ）操作されたガイドＲＮＡ、前記操作されたガイドＲＮＡが、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、前記操作されたガイドＲＮＡが、前記ＰＣＳＫ９遺伝子座の領域にハイブリダイズするよう構成された標的化配列を含む、を導入することを含み、
    前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号５８８～６０２と少なくとも８０％の同一性を有する標的化配列にハイブリダイズするよう構成されるか、もしくは含むか；または
    前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号５７３～５８７のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、方法。
  71. 前記クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、請求項１～９または１８～２２のいずれか一項に記載の融合エンドヌクレアーゼを含む、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、配列番号１０またはそのバリアントと少なくとも５５％の同一性を有する配列を含む融合エンドヌクレアーゼを含む、請求項７０または７１に記載の方法。
  73. 前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号７２２の非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項７０～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記操作されたガイドが、配列番号５７４、５７８、５８１、もしくは５８５のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項７０～７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記操作されたガイドＲＮＡが、表７ＥのガイドＲＮＡのいずれか一つのヌクレオチド配列を含む、請求項７０～７３のいずれか一項に記載の方法。
  76. 細胞におけるアルブミン遺伝子座を破壊する方法であって、前記細胞に、
    （ａ）クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ；および
    （ｂ）操作されたガイドＲＮＡ、前記操作されたガイドＲＮＡが、前記エンドヌクレアーゼとの複合体を形成するよう構成され、前記操作されたガイドＲＮＡが、前記アルブミン遺伝子座の領域にハイブリダイズするよう構成された標的化配列を含む、を導入することを含み、
    前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号６７～８６もしくは６４６～６９５のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むか、または前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号６７～８６もしくは６４６～６９５のいずれか一つの標的化配列と少なくとも８０％の同一性を有する標的化配列を含む、方法。
  77. 前記クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、請求項１～９または１８～２２のいずれか一項に記載の融合エンドヌクレアーゼを含む、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、配列番号１０またはそのバリアントと少なくとも５５％の同一性を有する融合エンドヌクレアーゼを含む、請求項７６または７７に記載の方法。
  79. 前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号７２２の非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項７６～７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号６７、６８、７０、７１、７２、７６、７９、８０、６４７、６４８、６４９、６５３、６５４、６５５、６５６、６７３、６８０、６８１、または６８２のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列と相補的であるか、または含む、請求項７６～７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記操作されたガイドＲＮＡが、表６のガイドＲＮＡのいずれか一つのヌクレオチド配列を含む、請求項７６～７９のいずれか一項に記載の方法。
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