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JP2024501810A - 減少した免疫原性を有する抗体可変ドメイン及び抗体 - Google Patents

減少した免疫原性を有する抗体可変ドメイン及び抗体 Download PDF

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JP2024501810A
JP2024501810A JP2023537607A JP2023537607A JP2024501810A JP 2024501810 A JP2024501810 A JP 2024501810A JP 2023537607 A JP2023537607 A JP 2023537607A JP 2023537607 A JP2023537607 A JP 2023537607A JP 2024501810 A JP2024501810 A JP 2024501810A
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ヨハンソン マリア
ティーツ ユリア
バルムート シュテファン
ブロック マティアス
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ヌマブ セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト
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Abstract

本発明は、既存抗薬物抗体（ＡＤＡ）に対する低減された結合を呈する抗体可変ドメイン、及び前記抗体可変ドメインのうちの１つ以上を含む抗体に関する。本発明は更に、前記抗体可変ドメイン又は前記抗体をコードする核酸配列、前記核酸配列を含むベクター、前記核酸又は前記ベクターを含む宿主細胞、及び前記抗体可変ドメイン又は前記多特異性抗体を製造する方法に関する。追加的に、本発明は、前記抗体を含む医薬組成物及びその使用方法に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、既存抗薬物抗体（ＡＤＡ）に対する低減された結合を呈する抗体可変ドメイン、及び前記抗体可変ドメインのうちの１つ以上を含む抗体に関する。本発明は更に、前記抗体可変ドメイン又は前記抗体をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記核酸又は前記ベクターを含む宿主細胞、及び前記抗体可変ドメイン又は前記多特異性抗体を製造する方法に関する。追加的に、本発明は、前記抗体を含む医薬組成物及びその使用方法に関する。
最初のモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」；Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， １９７５， Ｖｏｌ．２５６， ｐｐ． ４９５－４９７）の開発からの過去４０年において、抗体は、研究、診断及び治療目的のための生体分子のますます重要なクラスとなっている。当初、抗体は、もっぱら関心対象の対応する抗原で動物を免疫化することにより得られた。非ヒト起源の抗体は研究及び診断において使用され得るが、治療的なアプローチにおいてヒト身体は典型的には非ヒト抗体を異物として認識し、非ヒト抗体薬物物質に対して免疫応答を生じさせて、それをより低い有効性とするか、又は有効でなくする。投与された抗体治療が、例えば非ヒト起源のＣＤＲをヒト免疫グロブリンフレームワークにグラフトして非ヒト成分を最小化することにより、ヒト化されていたとしても、それらは免疫応答を依然として誘発することがあり、それがこれらの治療の有効性及び／又は安全性を損なわせる。
そのような免疫応答は、典型的には、治療剤への抗薬物抗体（ＡＤＡ）の結合を伴う。これらのＡＤＡは、ヒト血清中に既に存在する抗体（いわゆる既存ＡＤＡ）、及び／又は治療の経過の間に形成される抗体であることができる。
ＡＤＡ結合のリスクは、天然に存在するヒト抗体の部分、例えばＦａｂ若しくはＦｖ抗体断片を含むか、又は該部分から構成される治療用抗体について有意に増強され得る。このＡＤＡ結合の増加の主な理由の１つは、抗体断片において、典型的には、他の抗体部分又はドメインへの接触により以前はシールドされていた有意な数のアミノ酸が溶媒に露出されるようになり、潜在的なエピトープとして免疫系に提示されることであると考えられる。
文献によれば、患者における抗体応答は、Ｂ細胞エピトープ及びＴ細胞エピトープの両方の存在に依存する。Ｂ細胞受容体が抗原、例えば投与された治療用抗体を認識して結合した場合、抗原は受容体媒介性エンドサイトーシスによりＢ細胞中に内部移行され、タンパク質分解プロセシングを受ける。得られるペプチドは引き続いてＭＨＣクラスＩＩ分子により提示される。ヘルパーＴ細胞によるＴ細胞エピトープの認識で、ヘルパーＴ細胞は対応するＢ細胞を刺激して増殖させ、抗体産生形質細胞に分化させる。
投与された抗体に対する患者の免疫系の応答を更に低下させるためのいくつかの戦略が先行技術において提供されている。
例えば、Ｚｈａｏ， Ｌ． ａｎｄ Ｌｉ， Ｊ． （２０１０）， ＢＭＣ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， １０， Ｓ６は、抗体－抗原複合体の構造情報に基づく、タンパク質表面上の潜在的なＢ細胞エピトープの予測方法を開示している。著者らは、Ｂ細胞エピトープ中に多くの場合に存在する共通の構造エレメントを同定した。特に、著者らは、抗体により認識される抗原エピトープにおいて、柔軟な側鎖を有する極性アミノ酸、例えばアルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、及びヒスチジン（Ｈ）は有意に大きな比率を占めていることを見出した。これらの不可欠な構造エレメントの知識は、それらを回避するための戦略のための基礎を形成する。
Ｎａｔａｇａ， Ｓ． ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ， Ｉ． （２００９）， Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ， ｐ． ９７７－９８５、Ｏｎｄａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ （２００８）， ＰＮＡＳ Ｖｏｌ １０５（３２）： １ １３１１－１１３１６及びＭａｚｏｒ， Ｒ． ｅｔ ａｌ （２０１６）， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． Ｖｏｌ． ２７０（１）： １５２－６４は、タンパク質上のＢ細胞エピトープを同定すること及び突然変異誘発によりそれらを排除することにより外来タンパク質の免疫原性を低減させる方法を開示している。著者らは、溶媒に曝露される区画内のバルキーな親水性残基、例えばアルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）又はリシン（Ｋ）を、小さいアミノ酸（例えばアラニン、グリシン及びセリン）で置換した。
国際公開第２０１１／０７５８６１号パンフレットは、対応する全長抗体の可変鎖と定常鎖との間の境界面に位置する１つ以上のアミノ酸を突然変異させることにより、抗体可変ドメイン、特にｓｃＦｖの免疫原性を減少させる方法を開示している。（ｉ）二次構造のターン領域中に存在する残基、（ｉｉ）大きい、柔軟な側鎖若しくはバルキーな側鎖を有する残基、又は（ｉｉｉ）疎水性の残基は、Ｂ細胞エピトープとなり易く、そのため免疫原性反応を誘発し易いこと、及びそのようなアミノ酸の除去はＢ細胞エピトープを妨害することが更に開示されている。置換される１つ以上のアミノ酸残基は、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、アスパラギン酸（Ｄ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アルギニン（Ｒ）及び／又はグルタミン酸（Ｅ）であることが更に指定されている。国際公開第２０１１／０７５８６１号パンフレットは、重鎖点突然変異Ｌ１２Ｓ、Ｌ１０３Ｔ及びＬ１４４Ｔ（ＡＨｏ番号付け）を有するｓｃＦｖの１つの例は、非突然変異バージョンと比較して、ヒト血清中に存在する既存ＡＤＡに対する低減された結合を呈することを開示している。そのため、国際公開第２０１１／０７５８６１号パンフレットは、可変鎖の間の境界面に位置する小さい疎水性残基、例えばＬ及びＶを、小さい及び弱く親水性のアミノ酸（例えばＳ及びＴ）で置き換えること、並びに前記境界面に位置する大きい及びバルキーな親水性残基を回避することにより既存ＡＤＡに対する抗体可変ドメインの免疫原性を減少させる方法を教示している。
現行で利用可能な方法は、抗体可変ドメインの免疫原性をどのようにすれば減少させられるのかについて有用な指標を提供しているが、成功の可能性はケース依存的であり、これらの方法により得られる抗体可変ドメインは、多くの場合に、有意な残留免疫原性を呈する。そのため、低い免疫原性を呈し、及び抗体断片の構築において一般に応用可能な抗体可変ドメインに対する満たされていない大きい必要性が依然として存在する。より特に、特に既存ＡＤＡに対する低減された結合に関して、低い免疫原性を呈し、及び抗体断片の構築において一般に応用可能な抗体可変ドメインを得ることが望ましい。これらの抗体可変ドメインは、最終の抗体フォーマットに組み込まれた場合に、高い安定性を提供することが更に望ましく、これは治療剤開発のために好適な安定な抗体断片及び断片ベース多特異性抗体の構築におけるそれらの応用を可能とする。
低減された免疫原性を呈する抗体可変ドメインバリアント、より特に、非改変バリアントと比較された場合に既存ＡＤＡによる認識が有意により低い抗体可変ドメインバリアントを提供することは本発明の目的である。更には、これらの抗体可変ドメインバリアントは、医薬品開発のために好適な抗体断片及び多特異性抗体の構築における応用を可能とするために高度に安定であるべきである。
重鎖フレームワークの１２位及び／又は１４４において大きい柔軟な及びバルキーな側鎖を有する親水性アミノ酸により置換されており、即ち１２位におけるＲ及び／又は１４４位におけるＱ（ＡＨｏ番号付けによる）により置換されており、並びに任意選択的に重鎖フレームワークの１０３位においてＴにより置換されている抗体可変ドメインは、ｓｃＦｖフォーマットである場合に、それらの非置換バージョンと比較された場合に、ヒト血清中に存在する既存抗薬物抗体（ＡＤＡ）に対する低減された結合を呈することを本発明者らは驚くべきことにこのたび見出した。更には、これらの抗体可変ドメインは、低い免疫原性及び優れた安定性を呈する様々なｓｃＦｖ及び断片ベース多特異性抗体の構築において成功裏に応用され得る。
よって、第１の態様において、本発明は、標的抗原に特異的に結合する抗体可変ドメインであって、
（ｉ）Ｎ末端からＣ末端へ、領域ＨＦＷ１－ＨＣＤＲ１－ＨＦＷ２－ＨＣＤＲ２－ＨＦＷ３－ＨＣＤＲ３－ＨＦＷ４を含む可変重鎖（ＶＨ）であって、各々のＨＦＷが重鎖フレームワーク領域を指定し、並びに各々のＨＣＤＲが重鎖相補性決定領域を指定し、
前記可変重鎖フレームワーク領域ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４が、ヒトＶＨフレームワークサブタイプから選択され、並びに前記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４が、以下の置換（ＡＨｏ番号付け）：
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）；
－ １４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）；
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）及び１０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）；
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）及び１４４位のアミノ酸における（Ｑ）；
－ １０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）及び１４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）；又は
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）；１０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）及び１４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）
のうちの１つを有する、
前記ＶＨ；
（ｉｉ）可変軽鎖（ＶＬ）であって、前記可変軽鎖が、Ｎ末端からＣ末端へ、領域ＬＦＷ１－ＬＣＤＲ１－ＬＦＷ２－ＬＣＤＲ２－ＬＦＷ３－ＬＣＤＲ３－ＬＦＷ４を含み、各々のＬＦＷが軽鎖フレームワーク領域を指定し、並びに各々のＬＣＤＲが軽鎖相補性決定領域を指定し、並びに
ａ．前記可変軽鎖フレームワーク領域ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３及びＬＦＷ４がヒト抗体Ｖκフレームワークサブタイプから選択されるか；又は
ｂ．前記可変軽鎖フレームワーク領域ＬＦＷ１、ＬＦＷ２及びＬＦＷ３がヒト抗体Ｖκフレームワークサブタイプから選択され、並びに前記可変軽鎖フレームワーク領域ＬＦＷ４がＶλフレームワークサブタイプから選択される、
前記ＶＬ
を含む、抗体可変ドメインに関する。
第２の態様において、本発明は、本発明の１つ以上の抗体可変ドメインを含む抗体に関する。
第３の態様において、本発明は、ＣＤ１３７に特異的に結合し、並びに
ａ）配列番号３のＶＨ配列及び配列番号５のＶＬ配列；
ｂ）配列番号４のＶＨ配列及び配列番号５のＶＬ配列；
ｃ）配列番号８のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列；又は
ｄ）配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列
を含む、本発明の抗体可変ドメインに関する。
第４の態様において、本発明は、ＰＤＬ１に特異的に結合し、並びに
ａ）配列番号１３のＶＨ配列及び配列番号１５のＶＬ配列；
ｂ）配列番号１４のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列；
ｃ）配列番号１９のＶＨ配列及び配列番号２１のＶＬ配列；又は
ｄ）配列番号２０のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列
を含む、本発明の抗体可変ドメインに関する。
第５の態様において、本発明は、ヒト血清アルブミンに特異的に結合し、並びに
ａ）配列番号２５のＶＨ配列及び配列番号２７のＶＬ配列；
ｂ）配列番号２６のＶＨ配列及び配列番号２８のＶＬ配列；
ｃ）配列番号３１のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列；又は
ｄ）配列番号３２のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列
を含む、本発明の抗体可変ドメインに関する。
第６の態様において、本発明は、ヒト血清アルブミンに特異的に結合し、並びに
ａ）配列番号３５のＶＨ配列及び配列番号３８のＶＬ配列；
ｂ）配列番号３６のＶＨ配列及び配列番号３９のＶＬ配列；
ｃ）配列番号３６のＶＨ配列及び配列番号４１のＶＬ配列；
ｄ）配列番号３７のＶＨ配列及び配列番号４０のＶＬ配列；
ｅ）配列番号４２のＶＨ配列及び配列番号４５のＶＬ配列；
ｆ）配列番号４３のＶＨ配列及び配列番号４６のＶＬ配列；
ｇ）配列番号４３のＶＨ配列及び配列番号４８のＶＬ配列；又は
ｈ）配列番号４４のＶＨ配列及び配列番号４７のＶＬ配列
を含む、本発明の抗体可変ドメインに関する。
第７の態様において、本発明は、本発明の抗体可変ドメイン又は抗体をコードする１つの核酸又は２つの核酸に関する。
第８の態様において、本発明は、本発明の１つの核酸又は２つの核酸を含む１つのベクター又は２つのベクターに関する。
第９の態様において、本発明は、本発明の１つのベクター又は２つのベクターを含む１つの宿主細胞又は複数の宿主細胞に関する。
第１０の態様において、本発明は、本発明の抗体可変ドメイン又は本発明の抗体を製造する方法であって、（ｉ）本発明の１つの核酸若しくは２つの核酸、若しくは本発明の１つのベクター若しくは２つのベクターを用意すること、前記１つの核酸若しくは前記２つの核酸、若しくは前記１つのベクター若しくは複数のベクターを発現させること、及び発現システムから前記抗体可変ドメイン若しくは前記抗体を収集すること、又は（ｉｉ）本発明の１つの宿主細胞若しくは複数の宿主細胞を用意すること、前記１つの宿主細胞若しくは前記複数の宿主細胞を培養すること；及び細胞培養物から前記抗体可変ドメイン若しくは前記抗体を収集することを含む、方法に関する。
第１１の態様において、本発明は、本発明の抗体及び医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物に関する。
第１２の態様において、本発明は、医薬としての使用のための本発明の医薬組成物に関する。
以下の項目中に要約される本発明の態様、有利な特色及び好ましい実施形態は、それぞれ単独又は組合せで、本発明の目的の解決に更に寄与する：
１．標的抗原に特異的に結合する抗体可変ドメインであって、
（ｉ）Ｎ末端からＣ末端へ、領域ＨＦＷ１－ＨＣＤＲ１－ＨＦＷ２－ＨＣＤＲ２－ＨＦＷ３－ＨＣＤＲ３－ＨＦＷ４を含む可変重鎖（ＶＨ）であって、各々のＨＦＷが重鎖フレームワーク領域を指定し、並びに各々のＨＣＤＲが重鎖相補性決定領域を指定し、
前記可変重鎖フレームワーク領域ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４が、ヒトＶＨフレームワークサブタイプから選択され、並びに前記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４が、以下の置換（ＡＨｏ番号付け）：
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）；
－ １４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）；
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）及び１０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）；
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）及び１４４位のアミノ酸における（Ｑ）；
－ １０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）及び１４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）；又は
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）；１０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）及び１４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）
のうちの１つを有する、
前記ＶＨ；
（ｉｉ）可変軽鎖（ＶＬ）であって、前記可変軽鎖が、Ｎ末端からＣ末端へ、領域ＬＦＷ１－ＬＣＤＲ１－ＬＦＷ２－ＬＣＤＲ２－ＬＦＷ３－ＬＣＤＲ３－ＬＦＷ４を含み、各々のＬＦＷが軽鎖フレームワーク領域を指定し、並びに各々のＬＣＤＲが軽鎖相補性決定領域を指定し、並びに
ａ．前記可変軽鎖フレームワーク領域ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３及びＬＦＷ４がヒト抗体Ｖκフレームワークサブタイプから選択されるか；又は
ｂ．前記可変軽鎖フレームワーク領域ＬＦＷ１、ＬＦＷ２及びＬＦＷ３がヒト抗体Ｖκフレームワークサブタイプから選択され、並びに前記可変軽鎖フレームワーク領域ＬＦＷ４がＶλフレームワークサブタイプから選択される、
前記ＶＬ
を含む、前記抗体可変ドメイン。

２．前記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４が、以下の置換（ＡＨｏ番号付け）：
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）；
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）及び１０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）；
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）及び１４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）；
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）及び１４４位のアミノ酸における（Ｑ）；又は
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）、１０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）及び１４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）
のうちの１つを有し；
好ましくは前記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４が、以下の置換（ＡＨｏ番号付け）：
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）；
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）及び１４４位のアミノ酸における（Ｑ）；又は
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）、１０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）及び１４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）
のうちの１つを有し；
特には前記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４が、以下の置換（ＡＨｏ番号付け）：１２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）、１０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）、及び１４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）を有する、
項目１に記載の抗体可変ドメイン。

３．前記可変重鎖フレームワーク領域ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４が、ヒトＶＨフレームワークサブタイプＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ、ＶＨ３又はＶＨ４から、特にヒトＶＨフレームワークサブタイプＶＨ３から選択される、項目１又は２のいずれか一項に記載の抗体可変ドメイン。

４．前記可変重鎖フレームワーク領域ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４が、
ａ．配列番号３、４、８、９、１３、１４、１９、２０、２５、２６、３１、３２、３５、３６、３７、４２、４３、４４、６０、６３、７１、７２、７６、７７、８１、９５、９６、９９、１００、１１６及び１１７のうちのいずれか１つのフレームワーク領域ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４（即ち、表１、２及び４における斜体ではない残基）の組合せ；並びに
ｂ．１２、１０３及び１４４（ＡＨｏ番号付け）とは異なる位置においてフレームワーク領域内に１、２又は３つの突然変異を有する配列番号３、４、８、９、１３、１４、１９、２０、２５、２６、３１、３２、３５、３６、３７、４２、４３、４４、６０、６３、７１、７２、７６、７７、８１、９５、９６、９９、１００、１１６及び１１７のうちのいずれか１つの前記フレームワーク領域ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４（即ち、表１、２及び４における斜体ではない残基）の組合せ
から選択される、先行する項目のいずれか一項に記載の抗体可変ドメイン。

５．前記ヒト抗体ＶκフレームワークサブタイプがＶκ１フレームワークサブタイプから選択される、先行する項目のいずれか一項に記載の抗体可変ドメイン。

６．ＬＦＷ１、ＬＦＷ２及びＬＦＷ３、及び、ＬＦＷ４がヒト抗体Ｖκフレームワークサブタイプから選択される場合に、任意選択的にＬＦＷ４が、
ａ．配列番号５、１０、１５、１６、２１、２２、２７、２８、３３、３４、３８、３９、４０、４１、４５、４６、４７、４８、６１、６４、７３、７４、７８、７９、８２、９７、９８、１０１、１０２、１１８及び１１９のうちのいずれか１つのフレームワーク領域ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３及び任意選択的にＬＦＷ４（即ち、表１、２及び４における斜体ではない残基）の組合せ；並びに
ｂ．フレームワーク領域内に１、２又は３つの突然変異を有する配列番号５、１０、１５、１６、２１、２２、２７、２８、３３、３４、３８、３９、４０、４１、４５、４６、４７、４８、６１、６４、７３、７４、７８、７９、８２、９７、９８、１０１、１０２、１１８及び１１９のうちのいずれか１つの前記フレームワーク領域ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３及び任意選択的にＬＦＷ４（即ち、表１、２及び４における斜体ではない残基）の組合せ
から選択される、先行する項目のいずれか一項に記載の抗体可変ドメイン。

７．前記可変軽鎖フレームワーク領域ＬＦＷ４がＶλフレームワークサブタイプから選択され、特には配列番号１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０及び１３１からなる群から選択される配列を有する、先行する項目のいずれか一項に記載の抗体可変ドメイン。

８．前記抗体可変ドメインのフォーマットが、Ｆｖ、ｄｓＦｖ及びｓｃＦｖから、特にはＦｖ及びｓｃＦｖから選択される、先行する項目のいずれか一項に記載の抗体可変ドメイン。

９．前記抗体可変ドメインが、ｓｃＦｖフォーマットである場合に、既存ＡＤＡ結合アッセイにおける測定の際、項目１において定義される置換を含まない前記抗体可変ドメインのバージョンと比較された場合にヒト血清中に存在する既存抗薬物抗体（ＡＤＡ）に対する低減された結合を呈する、先行する項目のいずれか一項に記載の抗体可変ドメイン。

１０．前記抗体可変ドメインが、ｓｃＦｖフォーマットである場合に、以下の特色：
ａ．ｐＨ ６．４の１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸クエン酸緩衝液中に製剤化された場合に、少なくとも６５℃の、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）により決定された、融解温度（Ｔｍ）を有すること；
ｂ．ｐＨ ６．４の１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸クエン酸緩衝液中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化された場合に、５％未満の、４℃で２８日間の貯蔵後の、単量体含有量における損失を有すること；
ｃ．ｐＨ ６．４の１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸クエン酸緩衝液中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化された場合に、５％未満の、４℃で２８日間の貯蔵後の、タンパク質含有量における損失を有すること
のうちの１つ以上により更に特徴付けられる、先行する項目のいずれか一項に記載の抗体可変ドメイン。

１１．項目１～１０のいずれか一項において定義される１つ以上の抗体可変ドメインを含む抗体。

１２．
（ｉ）単一特異性であり、及びその標的抗原について一価、二価若しくは三価であるか；
（ｉｉ）二特異性であり、及び、互いから独立して、各々の標的抗原について一価若しくは二価であるか；
（ｉｉｉ）三特異性であり、及び各々の標的抗原について一価であるか；
（ｉｖ）三特異性であり、並びに前記標的抗原のうちの１つについて二価であり、及び他の標的抗原について一価であるか；
（ｖ）三特異性であり、並びに前記標的抗原のうちの２つについて二価であり、及び第３の標的抗原について一価であるか；
（ｖｉ）四特異性であり、及び各々の標的抗原について一価であるか；
（ｖｉｉ）四特異性であり、並びに前記標的抗原のうちの１つについて二価であり、及び他の標的抗原について一価であるか；又は
（ｖｉｉｉ）四特異性であり、並びに前記標的抗原のうちの２つについて二価であり、及び他の標的抗原について一価である、
項目１１に記載の抗体。

１３．
（ｉ）２つの異なる標的抗原に対する特異性を有する、項目１～１０のいずれかにおいて定義される第１及び第２の抗体可変ドメイン；並びに
（ｉｉ）互いから独立して、前記第１及び第２の可変ドメインの前記標的抗原のうちの１つに対する特異性、又は前記第１及び第２の可変ドメインの前記標的抗原とは異なる標的抗原に対する特異性のうちのいずれかを有する、項目１～１０のいずれかにおいて定義される１、２、３又は４つの更なる抗体可変ドメイン
を含む、項目１１に記載の抗体。

１４．前記抗体のフォーマットが、二価二特異性ＩｇＧフォーマット、三価二特異性ＩｇＧフォーマット及び四価二特異性ＩｇＧフォーマットから選択され；
より特には前記抗体のフォーマットが、ＫｉＨベースＩｇＧ；ＤＶＤ－Ｉｇ；ＣＯＤＶ－ＩｇＧ及びＭｏｒｒｉｓｏｎ（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合物（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ－Ｈ）又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合物（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ－Ｌ））から、よりいっそう特にはＤＶＤ－Ｉｇ及びＭｏｒｒｉｓｏｎ（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合物（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ－Ｈ）又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合物（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ－Ｌ））から選択される、
項目１１～１３のいずれか一項に記載の抗体。

１５．前記ＩｇＧが、ＩｇＧサブクラスＩｇＧ１及びＩｇＧ４、特にＩｇＧ４から選択される、項目１４に記載の抗体。

１６．免疫グロブリンＦｃ領域を含まない、項目１１～１３のいずれか一項に記載の抗体。

１７．タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、直鎖状二量体ｓｃＤｂ（ＬＤ－ｓｃＤｂ）、環状二量体ｓｃＤｂ（ＣＤ－ｓｃＤｂ）、タンデムトリ－ｓｃＦｖ、トリボディ（Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）２）、Ｆａｂ－Ｆｖ２、トリアボディ、ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ、テトラボディ、ジダイアボディ（ｄｉｄｉａｂｏｄｙ）、タンデム－ジ－ｓｃＦｖ及びＭＡＴＣＨからなる群から選択されるフォーマットである、項目１６に記載の抗体。

１８．ＣＨ１及び／又はＣＬ領域を含まない、項目１６に記載の抗体。

１９．ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ、トリアボディ、テトラボディ又はＭＡＴＣＨフォーマット、特にＭＡＴＣＨ又はｓｃＤｂ－ｓｃＦｖフォーマット、より特にはＭＡＴＣＨフォーマット、より特にはＭＡＴＣＨ３又はＭＡＴＣＨ４フォーマットである、項目１８に記載の抗体。

２０．前記抗体が、三特異性であり、及び各々の標的抗原について一価であり、並びに前記抗体が、
１）ａ）配列番号１のＶＨ配列及び配列番号５のＶＬ配列；
ｂ）配列番号２のＶＨ配列及び配列番号５のＶＬ配列；
ｃ）配列番号３のＶＨ配列及び配列番号５のＶＬ配列；若しくは
ｄ）配列番号４のＶＨ配列及び配列番号５のＶＬ配列
を含む、ＣＤ１３７に特異的に結合する１つの結合性ドメイン（ＣＤ１３７－ＢＤ）；
２）ａ）配列番号１１のＶＨ配列及び配列番号１５のＶＬ配列；
ｂ）配列番号１２のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列；
ｃ）配列番号１３のＶＨ配列及び配列番号１５のＶＬ配列；若しくは
ｄ）配列番号１４のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列
を含む、ＰＤＬ１に特異的に結合する１つの結合性ドメイン（ＰＤＬ１－ＢＤ）；
３）ａ）配列番号２３のＶＨ配列及び配列番号２７のＶＬ配列；
ｂ）配列番号２４のＶＨ配列及び配列番号２８のＶＬ配列；
ｃ）配列番号２５のＶＨ配列及び配列番号２７のＶＬ配列；若しくは
ｄ）配列番号２６のＶＨ配列及び配列番号２８のＶＬ配列
を含む、１つのヒト血清アルブミン結合性ドメイン（ｈＳＡ－ＢＤ）
を含み；
但し、前記３つの結合性ドメインのうちの少なくとも１つが、ｃ）若しくはｄ）から選択されるＶＨ／ＶＬ配列ペアを含むか；
又は前記抗体が、
１）ａ）配列番号６のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列；
ｂ）配列番号７のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列；
ｃ）配列番号８のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列；若しくは
ｄ）配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列
を含む、ＣＤ１３７に特異的に結合する１つの結合性ドメイン（ＣＤ１３７－ＢＤ）；
２）ａ）配列番号１７のＶＨ配列及び配列番号２１のＶＬ配列；
ｂ）配列番号１８のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列；
ｃ）配列番号１９のＶＨ配列及び配列番号２１のＶＬ配列；若しくは
ｄ）配列番号２０のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列
を含む、ＰＤＬ１に特異的に結合する１つの結合性ドメイン（ＰＤＬ１－ＢＤ）；並びに
３）ａ）配列番号２９のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列；
ｂ）配列番号３０のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列；
ｃ）配列番号３１のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列；若しくは
ｄ）配列番号３２のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列
を含む、１つのヒト血清アルブミン結合性ドメイン（ｈＳＡ－ＢＤ）
を含み；
但し、前記３つの結合性ドメインのうちの少なくとも１つが、ｃ）若しくはｄ）から選択されるＶＨ／ＶＬ配列ペアを含む、
項目１８に記載の抗体。

２１．ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ（ｓｃＭＡＴＣＨ３）フォーマットの一本鎖タンパク質である、項目２０に記載の抗体。

２２．前記抗体が一本鎖タンパク質であり、前記一本鎖タンパク質が、
（ｉ）配列番号１５及び１６から選択される配列を含む第１のＶＬ領域；
（ｉｉ）第１のポリペプチドリンカー；
（ｉｉｉ）配列番号１、２、３及び４から選択される配列を含む第１のＶＨ領域；
（ｉｖ）第２のポリペプチドリンカー；
（ｖ）配列番号５の配列を含む第２のＶＬ領域、
（ｖｉ）第３のポリペプチドリンカー；並びに
（ｖｉｉ）前記第１のＶＬ領域が配列番号１５の配列を有する場合の、配列番号１１及び１３から選択される配列、若しくは、前記第１のＶＬ領域が配列番号１６の配列を有する場合の、配列番号１２及び１４から選択される配列のいずれかを含む第２のＶＨ領域
からなるアミノ酸配列を含み；
前記（ｉ）～（ｖｉｉ）が、記載されている順序で順次並べられており；
前記第１のＶＬ領域が前記第２のＶＨ領域と会合して前記ＰＤＬ１－ＢＤを形成しており、及び前記第２のＶＬ領域が前記第１のＶＨ領域と会合して前記ＣＤ１３７－ＢＤを形成しており；
並びに前記一本鎖タンパク質が、
（ｖｉｉｉ）ｈＳＡ－ＢＤであって、配列番号２７及び２８から選択される配列を含む、第３のＶＬ領域；並びに、前記第３のＶＬ領域が配列番号２７の配列を有する場合の、配列番号２３及び２５から選択される配列、若しくは、前記第３のＶＬ領域が配列番号２８の配列を有する場合の、配列番号２４及び２６から選択される配列のいずれかを含む、第３のＶＨ領域により形成されており；前記第３のＶＬ領域及び前記第３のＶＨ領域が、第４のポリペプチドリンカーを介して接続されており；並びに前記ｈＳＡ－ＢＤが、Ｃ末端若しくはＮ末端で第５のポリペプチドリンカーを介して前記アミノ酸配列に融合している、前記ｈＳＡ－ＢＤ
を更に含むか；
又は前記一本鎖タンパク質が、
（ｉ）配列番号２１及び２２から選択される配列を含む第１のＶＬ領域；
（ｉｉ）第１のポリペプチドリンカー；
（ｉｉｉ）配列番号６、７、８及び９から選択される配列を含む第１のＶＨ領域；
（ｉｖ）第２のポリペプチドリンカー；
（ｖ）配列番号１０の配列を含む第２のＶＬ領域、
（ｖｉ）第３のポリペプチドリンカー；並びに
（ｖｉｉ）前記第１のＶＬ領域が配列番号２１の配列を有する場合の、配列番号１７及び１８から選択される配列、若しくは、前記第１のＶＬ領域が配列番号２２の配列を有する場合の、配列番号１８及び２０から選択される配列のいずれかを含む第２のＶＨ領域
からなるアミノ酸配列を含み；
前記（ｉ）～（ｖｉｉ）が、記載されている順序で順次並べられており；
前記第１のＶＬ領域が前記第２のＶＨ領域と会合して前記ＰＤＬ１－ＢＤを形成しており、及び前記第２のＶＬ領域が前記第１のＶＨ領域と会合して前記ＣＤ１３７－ＢＤを形成しており；
並びに前記一本鎖タンパク質が、
（ｖｉｉｉ）ｈＳＡ－ＢＤであって、配列番号３３及び３４から選択される配列を含む、第３のＶＬ領域；並びに、前記第３のＶＬ領域が配列番号３３の配列を有する場合の、配列番号２９及び３１から選択される配列、若しくは、前記第３のＶＬ領域が配列番号３４の配列を有する場合の、配列番号３０及び３２から選択される配列のいずれかを含む、第３のＶＨ領域により形成されており；前記第３のＶＬ領域及び前記第３のＶＨ領域が、第４のポリペプチドリンカーを介して接続されており；並びに前記ｈＳＡ－ＢＤが、Ｃ末端若しくはＮ末端で第５のポリペプチドリンカーを介して前記アミノ酸配列に融合している、前記ｈＳＡ－ＢＤ
を更に含む、
項目２１に記載の抗体。

２３．配列番号５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７及び５８のｓｃＭＡＴＣＨ３抗体から選択される、項目２０～２２のいずれか一項に記載の抗体。

２４．既存抗薬物抗体（ＡＤＡ）結合アッセイにおいて決定された場合に、ヒト血清中に存在する既存ＡＤＡに対する低減された結合、特に、参照抗体ＮＭ２１－１４８０と比較された場合に既存ＡＤＡに対する低減された結合を呈する、項目２０～２３のいずれか一項に記載の抗体。

２５．ＣＤ１３７に特異的に結合し、並びに
ａ）配列番号３のＶＨ配列及び配列番号５のＶＬ配列；
ｂ）配列番号４のＶＨ配列及び配列番号５のＶＬ配列；
ｃ）配列番号８のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列；又は
ｄ）配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列
を含む、項目１～１０のいずれか一項において定義される抗体可変ドメイン。

２６．ＰＤＬ１に特異的に結合し、並びに
ａ）配列番号１３のＶＨ配列及び配列番号１５のＶＬ配列；
ｂ）配列番号１４のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列；
ｃ）配列番号１９のＶＨ配列及び配列番号２１のＶＬ配列；又は
ｄ）配列番号２０のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列
を含む、項目１～１０のいずれか一項において定義される抗体可変ドメイン。

２７．ヒト血清アルブミンに特異的に結合し、並びに
ａ）配列番号２５のＶＨ配列及び配列番号２７のＶＬ配列；
ｂ）配列番号２６のＶＨ配列及び配列番号２８のＶＬ配列；
ｃ）配列番号３１のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列；又は
ｄ）配列番号３２のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列
を含む、項目１～１０のいずれか一項において定義される抗体可変ドメイン。

２８．ヒト血清アルブミンに特異的に結合し、並びに
ａ）配列番号３５のＶＨ配列及び配列番号３８のＶＬ配列；
ｂ）配列番号３６のＶＨ配列及び配列番号３９のＶＬ配列；
ｃ）配列番号３６のＶＨ配列及び配列番号４１のＶＬ配列；
ｄ）配列番号３７のＶＨ配列及び配列番号４０のＶＬ配列；
ｅ）配列番号４２のＶＨ配列及び配列番号４５のＶＬ配列；
ｆ）配列番号４３のＶＨ配列及び配列番号４６のＶＬ配列；
ｇ）配列番号４３のＶＨ配列及び配列番号４８のＶＬ配列；又は
ｈ）配列番号４４のＶＨ配列及び配列番号４７のＶＬ配列
を含む、項目１～１０のいずれか一項において定義される抗体可変ドメイン。

２９．前記抗体可変ドメインが、ｓｃＦｖフォーマットである場合に、
ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定された場合に、５．５のｐＨ値において、１０ｎＭ未満の一価解離定数（ＫＤ）、特には０．０５～１０ｎＭ、特には０．０５～５ｎＭのＫＤでヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）に結合し；
ｂ．ＳＰＲにより測定された場合に、５．５のｐＨ値において、１０ｎＭ未満の一価ＫＤ、特には０．０５～１０ｎＭ、特には０．０５～５ｎＭのＫＤでカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ；Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）血清アルブミン（ｃＳＡ）に結合し；並びに
ｃ．ＳＰＲにより測定された場合に、５．５のｐＨ値において、１０ｎＭ未満の一価ＫＤ、特には０．０５～１０ｎＭ、特には０．０５ｇ～５ｎＭのＫＤでマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ；Ｍｏｕｓｅ）血清アルブミン（ｍＳＡ）に結合する、
項目２８に記載の抗体可変ドメイン。

３０．前記抗体可変ドメインが、ｓｃＦｖフォーマットである場合に、以下の特色：
ｄ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定された場合に、７．４のｐＨ値において、１０ｎＭ未満の一価解離定数（ＫＤ）、特には０．０５～１０ｎＭ、特には０．０５～５ｎＭのＫＤでヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）に結合すること；
ｅ．ＳＰＲにより測定された場合に、７．４のｐＨ値において、１０ｎＭ未満の一価ＫＤ、特には０．０５～１０ｎＭ、特には０．０５～５ｎＭのＫＤでカニクイザル血清アルブミン（ｃＳＡ）に結合すること；並びに／又は
ｆ．ＳＰＲにより測定された場合に、７．４のｐＨ値において、２０ｎＭ未満の一価ＫＤ、特には０．１～２０ｎＭ、特には０．１～１５ｎＭのＫＤでマウス血清アルブミン（ｍＳＡ）に結合すること
のうちの１つ以上により更に特徴付けられる、項目２９に記載の抗体可変ドメイン。

３１．前記抗体可変ドメインが、ｓｃＦｖフォーマットである場合に、以下の特色：
ｇ．前記ｈＳＡ－ＢＤが、ｐＨ ６．４の１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸クエン酸緩衝液中に製剤化されている場合に、少なくとも７０℃、好ましくは少なくとも７５℃の、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）により決定された、融解温度（Ｔｍ）を有すること；
ｈ．前記抗原結合性断片が１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度であり、及び前記ｈＳＡ－ＢＤが、ｐＨ ６．４の１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸クエン酸緩衝液中に製剤化されている場合に、２％未満、好ましくは１％未満の、４℃で２８日間の貯蔵後の、単量体含有量における損失を有すること；
ｉ．前記抗原結合性断片が１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度であり、及び前記ｈＳＡ－ＢＤが、ｐＨ ６．４の１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸クエン酸緩衝液中に製剤化されている場合に、２％未満、好ましくは１％未満の、４℃で２８日間の貯蔵後の、タンパク質含有量における損失を有すること；
ｊ．前記抗原結合性断片が１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度であり、及び前記ｈＳＡ－ＢＤが、ｐＨ ６．４の１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸クエン酸緩衝液中に製剤化されている場合に、２％未満、好ましくは１％未満の、４０℃で２８日間の貯蔵後の、タンパク質含有量における損失を有すること；並びに／又は
ｋ．前記抗原結合性断片が５０ｍｇ／ｍｌの開始濃度であり、及び前記ｈＳＡ－ＢＤが、ｐＨ ６．４の１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸クエン酸緩衝液中に製剤化されている場合に、２％未満、好ましくは１％未満の、４℃で１４日間の貯蔵後の、単量体含有量における損失を有すること
のうちの１つ以上により更に特徴付けられる、項目２９又は３０に記載の抗体可変ドメイン。

３２．前記抗体可変ドメインに結合した前記ｈＳＡが、ＦｃＲｎに結合する能力を依然として有する、項目２８～３１のいずれか一項に記載の抗体可変ドメイン。

３３．項目１～１０若しくは２５～３２のいずれか一項に記載の抗体可変ドメイン、又は項目１１～２４のいずれか一項に記載の抗体をコードする１つの核酸又は２つの核酸。

３４．項目３３に記載の１つの核酸又は２つの核酸を含む１つのベクター又は２つのベクター。

３５．項目３４に記載の１つのベクター又は２つのベクターを含む１つの宿主細胞又は複数の宿主細胞。

３６．項目１～１０若しくは２５～３２のいずれか一項に記載の抗体可変ドメイン、又は項目１１～２４のいずれか一項に記載の抗体を製造する方法であって、（ｉ）項目３３に記載の１つの核酸若しくは２つの核酸、若しくは項目３４に記載の１つのベクター若しくは２つのベクターを用意すること、前記１つの核酸配列若しくは複数の核酸、若しくは前記１つのベクター若しくは複数のベクターを発現させること、及び発現システムから前記抗体可変ドメイン若しくは前記抗体を収集すること、又は（ｉｉ）項目３５に記載の１つの宿主細胞若しくは複数の宿主細胞を用意すること、前記１つの宿主細胞若しくは前記複数の宿主細胞を培養すること；及び細胞培養物から前記抗体可変ドメイン若しくは前記抗体を収集することを含む、前記方法。

３７．項目１１～２４のいずれか一項に記載の抗体及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。

３８．医薬としての使用のための、項目１１～２４のいずれか一項に記載の抗体又は項目３６に記載の医薬組成物。

３９．抗体を改変する方法であって、前記抗体が、断片ベースであるか、又は１つ以上のｓｃＦｖ断片を含む抗体であり、前記方法が、前記断片ベース抗体のＶＨ配列中又は前記抗体のｓｃＦｖ断片のＶＨ配列中に以下の置換（ＡＨｏ番号付け）：
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）；
－ １４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）；
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）及び１０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）；
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）及び１４４位のアミノ酸における（Ｑ）；
－ １０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）及び１４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）；又は
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）；１０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）及び１４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）
を導入して、改変された抗体を得るステップを含み；
前記改変された抗体が、その非改変バージョンと比較された場合に、健常ドナーからのヒト血清中に存在する既存抗薬物抗体（ＡＤＡ）に対する減少した結合を呈し、並びに結合における前記減少が、ＥＬＩＳＡベース既存抗薬物抗体結合アッセイにより決定される、
前記方法。

４０．前記改変された抗体が、項目１～３２のいずれか一項において定義される抗体可変ドメインを含む、項目３９に記載の方法。
図１Ａは、実施例３に記載されるＥＬＩＳＡベース既存ＡＤＡ結合アッセイにより決定された、ＰＲＯ１９２２（Ａ）、ＰＲＯ２２３０（Ｃ）、ＰＲＯ２９２２（Ｅ）及びＰＲＯ２９２５（Ｇ）についての２０のヒト血清試料中の既存ＡＤＡの吸収レベル（ａｂｓｏｂｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ）を示す。測定は、スパイクされた及びスパイクされていない血清試料（確認アッセイ一式）を用いて行った。更に示されるのは、ＰＲＯ１９２２（Ｂ）、ＰＲＯ２２３０（Ｄ）、ＰＲＯ２９２２（Ｆ）及びＰＲＯ２９２５（Ｈ）についてのスパイクされたヒト血清試料の吸光度レベルの対応する低減（阻害（％））である。ＮＣ：陰性対照。ＰＣ：陽性（ｐｏｓｉｔｉｃｅ）対照、即ち既存抗体への高い結合を呈するヒト／ウサギキメラ抗体。図１Ｂは、実施例３に記載されるＥＬＩＳＡベース既存ＡＤＡ結合アッセイにより決定された、ＰＲＯ１９２２（Ａ）、ＰＲＯ２２３０（Ｃ）、ＰＲＯ２９２２（Ｅ）及びＰＲＯ２９２５（Ｇ）についての２０のヒト血清試料中の既存ＡＤＡの吸収レベル（ａｂｓｏｂｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ）を示す。測定は、スパイクされた及びスパイクされていない血清試料（確認アッセイ一式）を用いて行った。更に示されるのは、ＰＲＯ１９２２（Ｂ）、ＰＲＯ２２３０（Ｄ）、ＰＲＯ２９２２（Ｆ）及びＰＲＯ２９２５（Ｈ）についてのスパイクされたヒト血清試料の吸光度レベルの対応する低減（阻害（％））である。ＮＣ：陰性対照。ＰＣ：陽性（ｐｏｓｉｔｉｃｅ）対照、即ち既存抗体への高い結合を呈するヒト／ウサギキメラ抗体。 図１Ｃは、実施例３に記載されるＥＬＩＳＡベース既存ＡＤＡ結合アッセイにより決定された、ＰＲＯ１９２２（Ａ）、ＰＲＯ２２３０（Ｃ）、ＰＲＯ２９２２（Ｅ）及びＰＲＯ２９２５（Ｇ）についての２０のヒト血清試料中の既存ＡＤＡの吸収レベル（ａｂｓｏｂｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ）を示す。測定は、スパイクされた及びスパイクされていない血清試料（確認アッセイ一式）を用いて行った。更に示されるのは、ＰＲＯ１９２２（Ｂ）、ＰＲＯ２２３０（Ｄ）、ＰＲＯ２９２２（Ｆ）及びＰＲＯ２９２５（Ｈ）についてのスパイクされたヒト血清試料の吸光度レベルの対応する低減（阻害（％））である。ＮＣ：陰性対照。ＰＣ：陽性（ｐｏｓｉｔｉｃｅ）対照、即ち既存抗体への高い結合を呈するヒト／ウサギキメラ抗体。図１Ｄは、実施例３に記載されるＥＬＩＳＡベース既存ＡＤＡ結合アッセイにより決定された、ＰＲＯ１９２２（Ａ）、ＰＲＯ２２３０（Ｃ）、ＰＲＯ２９２２（Ｅ）及びＰＲＯ２９２５（Ｇ）についての２０のヒト血清試料中の既存ＡＤＡの吸収レベル（ａｂｓｏｂｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ）を示す。測定は、スパイクされた及びスパイクされていない血清試料（確認アッセイ一式）を用いて行った。更に示されるのは、ＰＲＯ１９２２（Ｂ）、ＰＲＯ２２３０（Ｄ）、ＰＲＯ２９２２（Ｆ）及びＰＲＯ２９２５（Ｈ）についてのスパイクされたヒト血清試料の吸光度レベルの対応する低減（阻害（％））である。ＮＣ：陰性対照。ＰＣ：陽性（ｐｏｓｉｔｉｃｅ）対照、即ち既存抗体への高い結合を呈するヒト／ウサギキメラ抗体。 図１Ｅは、実施例３に記載されるＥＬＩＳＡベース既存ＡＤＡ結合アッセイにより決定された、ＰＲＯ１９２２（Ａ）、ＰＲＯ２２３０（Ｃ）、ＰＲＯ２９２２（Ｅ）及びＰＲＯ２９２５（Ｇ）についての２０のヒト血清試料中の既存ＡＤＡの吸収レベル（ａｂｓｏｂｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ）を示す。測定は、スパイクされた及びスパイクされていない血清試料（確認アッセイ一式）を用いて行った。更に示されるのは、ＰＲＯ１９２２（Ｂ）、ＰＲＯ２２３０（Ｄ）、ＰＲＯ２９２２（Ｆ）及びＰＲＯ２９２５（Ｈ）についてのスパイクされたヒト血清試料の吸光度レベルの対応する低減（阻害（％））である。ＮＣ：陰性対照。ＰＣ：陽性（ｐｏｓｉｔｉｃｅ）対照、即ち既存抗体への高い結合を呈するヒト／ウサギキメラ抗体。図１Ｆは、実施例３に記載されるＥＬＩＳＡベース既存ＡＤＡ結合アッセイにより決定された、ＰＲＯ１９２２（Ａ）、ＰＲＯ２２３０（Ｃ）、ＰＲＯ２９２２（Ｅ）及びＰＲＯ２９２５（Ｇ）についての２０のヒト血清試料中の既存ＡＤＡの吸収レベル（ａｂｓｏｂｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ）を示す。測定は、スパイクされた及びスパイクされていない血清試料（確認アッセイ一式）を用いて行った。更に示されるのは、ＰＲＯ１９２２（Ｂ）、ＰＲＯ２２３０（Ｄ）、ＰＲＯ２９２２（Ｆ）及びＰＲＯ２９２５（Ｈ）についてのスパイクされたヒト血清試料の吸光度レベルの対応する低減（阻害（％））である。ＮＣ：陰性対照。ＰＣ：陽性（ｐｏｓｉｔｉｃｅ）対照、即ち既存抗体への高い結合を呈するヒト／ウサギキメラ抗体。 図１Ｇは、実施例３に記載されるＥＬＩＳＡベース既存ＡＤＡ結合アッセイにより決定された、ＰＲＯ１９２２（Ａ）、ＰＲＯ２２３０（Ｃ）、ＰＲＯ２９２２（Ｅ）及びＰＲＯ２９２５（Ｇ）についての２０のヒト血清試料中の既存ＡＤＡの吸収レベル（ａｂｓｏｂｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ）を示す。測定は、スパイクされた及びスパイクされていない血清試料（確認アッセイ一式）を用いて行った。更に示されるのは、ＰＲＯ１９２２（Ｂ）、ＰＲＯ２２３０（Ｄ）、ＰＲＯ２９２２（Ｆ）及びＰＲＯ２９２５（Ｈ）についてのスパイクされたヒト血清試料の吸光度レベルの対応する低減（阻害（％））である。ＮＣ：陰性対照。ＰＣ：陽性（ｐｏｓｉｔｉｃｅ）対照、即ち既存抗体への高い結合を呈するヒト／ウサギキメラ抗体。図１Ｈは、実施例３に記載されるＥＬＩＳＡベース既存ＡＤＡ結合アッセイにより決定された、ＰＲＯ１９２２（Ａ）、ＰＲＯ２２３０（Ｃ）、ＰＲＯ２９２２（Ｅ）及びＰＲＯ２９２５（Ｇ）についての２０のヒト血清試料中の既存ＡＤＡの吸収レベル（ａｂｓｏｂｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ）を示す。測定は、スパイクされた及びスパイクされていない血清試料（確認アッセイ一式）を用いて行った。更に示されるのは、ＰＲＯ１９２２（Ｂ）、ＰＲＯ２２３０（Ｄ）、ＰＲＯ２９２２（Ｆ）及びＰＲＯ２９２５（Ｈ）についてのスパイクされたヒト血清試料の吸光度レベルの対応する低減（阻害（％））である。ＮＣ：陰性対照。ＰＣ：陽性（ｐｏｓｉｔｉｃｅ）対照、即ち既存抗体への高い結合を呈するヒト／ウサギキメラ抗体。 図２Ａは、実施例３に記載されるＥＬＩＳＡベース既存ＡＤＡ結合アッセイにより決定された、ＮＭ２１－１４８０（Ａ）及びＰＲＯ２７６４（Ｂ）についての４０のヒト血清試料中の既存ＡＤＡの吸収レベルを示す。測定は、スパイクされた及びスパイクされていない血清試料（確認アッセイ一式）を用いて行った。ＮＣ：陰性対照。 図２Ｂは、実施例３に記載されるＥＬＩＳＡベース既存ＡＤＡ結合アッセイにより決定された、ＮＭ２１－１４８０（Ａ）及びＰＲＯ２７６４（Ｂ）についての４０のヒト血清試料中の既存ＡＤＡの吸収レベルを示す。測定は、スパイクされた及びスパイクされていない血清試料（確認アッセイ一式）を用いて行った。ＮＣ：陰性対照。 図３Ａは、実施例３に記載されるＥＬＩＳＡベース既存ＡＤＡ結合アッセイにより決定された、ＰＲＯ２７４１（Ａ）及びＰＲＯ２６６０（Ｂ）についての２０のヒト血清試料中の既存ＡＤＡの吸収レベルを示す。測定は、スパイクされた及びスパイクされていない血清試料（確認アッセイ一式）を用いて行った。更に示されるのは、前記分子でのスパイクされたヒト血清試料の吸光度レベルの対応する低減（阻害（％））である（Ｃ）。図３Ｂは、実施例３に記載されるＥＬＩＳＡベース既存ＡＤＡ結合アッセイにより決定された、ＰＲＯ２７４１（Ａ）及びＰＲＯ２６６０（Ｂ）についての２０のヒト血清試料中の既存ＡＤＡの吸収レベルを示す。測定は、スパイクされた及びスパイクされていない血清試料（確認アッセイ一式）を用いて行った。更に示されるのは、前記分子でのスパイクされたヒト血清試料の吸光度レベルの対応する低減（阻害（％））である（Ｃ）。 図３Ｃは、実施例３に記載されるＥＬＩＳＡベース既存ＡＤＡ結合アッセイにより決定された、ＰＲＯ２７４１（Ａ）及びＰＲＯ２６６０（Ｂ）についての２０のヒト血清試料中の既存ＡＤＡの吸収レベルを示す。測定は、スパイクされた及びスパイクされていない血清試料（確認アッセイ一式）を用いて行った。更に示されるのは、前記分子でのスパイクされたヒト血清試料の吸光度レベルの対応する低減（阻害（％））である（Ｃ）。図３Ｄは、実施例３に記載されるＥＬＩＳＡベース既存ＡＤＡ結合アッセイにより決定された、ＰＲＯ２７４１（Ａ）及びＰＲＯ２６６０（Ｂ）についての２０のヒト血清試料中の既存ＡＤＡの吸収レベルを示す。測定は、スパイクされた及びスパイクされていない血清試料（確認アッセイ一式）を用いて行った。更に示されるのは、前記分子でのスパイクされたヒト血清試料の吸光度レベルの対応する低減（阻害（％））である（Ｃ）。 図３Ｅは、実施例３に記載されるＥＬＩＳＡベース既存ＡＤＡ結合アッセイにより決定された、ＰＲＯ２７４１（Ａ）及びＰＲＯ２６６０（Ｂ）についての２０のヒト血清試料中の既存ＡＤＡの吸収レベルを示す。測定は、スパイクされた及びスパイクされていない血清試料（確認アッセイ一式）を用いて行った。更に示されるのは、前記分子でのスパイクされたヒト血清試料の吸光度レベルの対応する低減（阻害（％））である（Ｃ）。 図４Ａは、実施例３に記載されるＥＬＩＳＡベース既存ＡＤＡ結合アッセイにより決定された、ＰＲＯ２２６８（Ａ）、ＰＲＯ２２６９（Ｂ）、ＰＲＯ２５１０（Ｃ）及びＰＲＯ２５８９（Ｄ）についての２０のヒト血清試料（ＰＲＯ２５８９の場合は１９個）中の既存ＡＤＡの吸収レベルを示す。測定は、スパイクされた及びスパイクされていない血清試料（確認アッセイ一式）を用いて行った。更に示されるのは、前記分子でのスパイクされたヒト血清試料の吸光度レベルの対応する低減（阻害（％））である（Ｅ）。図４Ｂは、実施例３に記載されるＥＬＩＳＡベース既存ＡＤＡ結合アッセイにより決定された、ＰＲＯ２２６８（Ａ）、ＰＲＯ２２６９（Ｂ）、ＰＲＯ２５１０（Ｃ）及びＰＲＯ２５８９（Ｄ）についての２０のヒト血清試料（ＰＲＯ２５８９の場合は１９個）中の既存ＡＤＡの吸収レベルを示す。測定は、スパイクされた及びスパイクされていない血清試料（確認アッセイ一式）を用いて行った。更に示されるのは、前記分子でのスパイクされたヒト血清試料の吸光度レベルの対応する低減（阻害（％））である（Ｅ）。 図４Ｃは、実施例３に記載されるＥＬＩＳＡベース既存ＡＤＡ結合アッセイにより決定された、ＰＲＯ２２６８（Ａ）、ＰＲＯ２２６９（Ｂ）、ＰＲＯ２５１０（Ｃ）及びＰＲＯ２５８９（Ｄ）についての２０のヒト血清試料（ＰＲＯ２５８９の場合は１９個）中の既存ＡＤＡの吸収レベルを示す。測定は、スパイクされた及びスパイクされていない血清試料（確認アッセイ一式）を用いて行った。更に示されるのは、前記分子でのスパイクされたヒト血清試料の吸光度レベルの対応する低減（阻害（％））である（Ｅ）。
重鎖フレームワークの１２位及び／又は１４４において大きい柔軟な及びバルキーな側鎖を有する親水性アミノ酸により置換されており、即ち１２位におけるＲ及び／又は１４４位におけるＱ（ＡＨｏ番号付けによる）により置換されており、並びに任意選択的に重鎖フレームワークの１０３位においてＴにより置換されている抗体可変ドメインは、ｓｃＦｖフォーマットである場合に、それらの非置換バージョンと比較された場合に、ヒト血清中に存在する既存抗薬物抗体（ＡＤＡ）に対する低減された結合を呈することを本発明者らは驚くべきことにこのたび見出した。更には、これらの抗体可変ドメインは、低い免疫原性及び優れた安定性を呈する様々なｓｃＦｖ及び断片ベース多特異性抗体の構築において成功裏に応用することができた。
抗体可変ドメインの免疫原性を低減させるために多くの方法及び戦略が開発されているという事実にもかかわらず、これらの方法を用いて達成可能な免疫原性の低減は、多くの場合に、医薬品開発の観点から望ましいであろうほどは大きくない。そのため、低い免疫原性を呈する抗体可変ドメインに対する満たされていない大きい必要性が依然として存在する。より特に、特に既存ＡＤＡに対する低減された結合に関して、低い免疫原性を呈し、及び抗体断片の構築において一般に応用可能な抗体可変ドメインを得ることが望ましい。これらの抗体可変ドメインは、最終の抗体フォーマットに組み込まれた場合に、高い安定性を提供することが更に望ましく、これは治療剤開発のために好適な安定な抗体断片及び断片ベース多特異性抗体の構築におけるそれらの応用を可能とする。
本発明は、重鎖１２位におけるＲ及び／又は重鎖１４４位におけるＱ（ＡＨｏ番号付けによる）で置換されており、並びに任意選択的に重鎖フレームワークの１０３位におけるＴで置換されている新規の抗体可変ドメインを提供する。これらの新規の抗体可変ドメインバリアントは、ｓｃＦｖフォーマットである場合に、それらの非置換バージョンと比較された場合に既存ＡＤＡへの有意に低減された結合を呈する。更には、これらの抗体可変ドメインは、低い免疫原性及び優れた安定性を呈する様々なｓｃＦｖ及び断片ベース多特異性抗体の構築において成功裏に応用することができた。
本発明者らが知る限りでは、そのような有利な特性を有する抗体可変ドメインは先行技術には存在しない。
本発明の抗体可変ドメインは、いくつかのｓｃＦｖ及び抗体断片ベース多特異性抗体フォーマットの構築のために成功裏に使用することができた。例えば、本発明の抗体可変ドメインは、ヒトメソテリン（ＭＳＬＮ）、ＣＤ３及びヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）を標的化する抗体断片ベース多特異性抗体（ＭＡＴＣＨ４フォーマット）の構築において成功裏に応用されている。これらの抗体断片ベース抗ＭＳＬＮｘＣＤ３ｘｈＳＡ抗体の設計、製造並びに機能的及び生物物理学的特性は、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０６４４２７に詳細に開示されている。特有の例は、ＰＲＯ２７４１、ＰＲＯ２７４５及びＰＲＯ２７４６である。
更には、本発明の抗体可変ドメインは、ＲＯＲ１、ＣＤ３及びｈＳＡを標的化する抗体断片ベース多特異性抗体（ｓｃＭＡＴＣＨ３及びＭＡＴＣＨ４フォーマット）に成功裏に組み込まれている。断片ベース抗ＲＯＲ１ｘＣＤ３ｘｈＳＡ抗体の設計、製造並びに機能的及び生物物理学的特性は、実験パート及び優先権文献ＥＰ２１１５４７８６．４に詳細に開示されている。特有の例は、ＰＲＯ２６６７、ＰＲＯ２６６８、ＰＲＯ２６６９及びＰＲＯ２６７０である。
更には、本発明の抗体可変ドメインは、ＩＬ－４Ｒ及びＩＬ－３１を標的化するＭｏｒｒｉｓｏｎベース多特異性抗体（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ－Ｈフォーマット）に成功裏に組み込まれている。Ｍｏｒｒｉｓｏｎベース抗ＩＬ４ＲｘＩＬ３１抗体の設計、製造並びに機能的及び生物物理学的特性は、優先権文献ＥＰ２０２１６９５７．９に詳細に開示されている。特有の例は、ＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９である。
更には、本発明の抗体可変ドメイン は、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１３７及びｈＳＡを標的化する抗体断片ベース多特異性抗体ＮＭ２１－１４８０（ｓｃＭＡＴＣＨ３フォーマット）に成功裏に組み込まれている。ＮＭ２１－１４８０のいくつかのバリアントが作製されている。親断片ベース抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘｈＳＡ抗体の設計、製造並びに機能的及び生物物理学的特性は、実験パート及び特許出願国際公開第２０１９／０７２８６８号パンフレットに詳細に開示されている。特有の例は、ＰＲＯ２７５８、ＰＲＯ２７５９、ＰＲＯ２７６０、ＰＲＯ２７６１、ＰＲＯ２７６２、ＰＲＯ２７６３、ＰＲＯ２７６４、ＰＲＯ２７６５及びＰＲＯ３３５１である。
他に定義されなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本発明が関連する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）及び「含む」（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）という用語は、他に注記されなければそれらのオープンエンド及び非限定的な意味において本明細書において使用される。そのような後者の実施形態に関して、「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）という用語はそのため、より狭い用語「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）を含む。
本発明を記載する文脈（特に以下の請求項の文脈）における「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語並びに類似した言及は、本明細書において他に指し示されるか、又は文脈に明確に矛盾する場合を除いて、単数及び複数の両方をカバーすると解釈されるべきである。例えば、「細胞」（ａ ｃｅｌｌ）という用語は、細胞の混合物を含む、複数の細胞を含む。複数形が化合物、塩、及び同種のもののために使用される場合、これは、単一の化合物、塩、又は同種のものも意味すると解される。
第１の態様において、本発明は、標的抗原に特異的に結合する抗体可変ドメインであって、
（ｉ）Ｎ末端からＣ末端へ、領域ＨＦＷ１－ＨＣＤＲ１－ＨＦＷ２－ＨＣＤＲ２－ＨＦＷ３－ＨＣＤＲ３－ＨＦＷ４を含む可変重鎖（ＶＨ）であって、各々のＨＦＷが重鎖フレームワーク領域を指定し、並びに各々のＨＣＤＲが重鎖相補性決定領域を指定し、
前記可変重鎖フレームワーク領域ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４が、ヒトＶＨフレームワークサブタイプから選択され、並びに前記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４が、以下の置換（ＡＨｏ番号付け）：
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）；
－ １４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）；
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）及び１０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）；
－ １０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）及び１４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）；又は
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）及び１４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）；
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）；１０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）及び１４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）
のうちの１つを有する、
前記ＶＨ；
（ｉｉ）可変軽鎖（ＶＬ）であって、前記可変軽鎖が、Ｎ末端からＣ末端へ、領域ＬＦＷ１－ＬＣＤＲ１－ＬＦＷ２－ＬＣＤＲ２－ＬＦＷ３－ＬＣＤＲ３－ＬＦＷ４を含み、各々のＬＦＷが軽鎖フレームワーク領域を指定し、並びに各々のＬＣＤＲが軽鎖相補性決定領域を指定し、並びに
ａ．前記可変軽鎖フレームワーク領域ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３及びＬＦＷ４がヒト抗体Ｖκフレームワークサブタイプから選択されるか；又は
ｂ．前記可変軽鎖フレームワーク領域ＬＦＷ１、ＬＦＷ２及びＬＦＷ３がヒト抗体Ｖκフレームワークサブタイプから選択され、並びに前記可変軽鎖フレームワーク領域ＬＦＷ４がＶλフレームワークサブタイプから選択される、
前記ＶＬ
を含む、前記抗体可変ドメインに関する。
「抗体」及び同種の用語は、本明細書において使用される場合、全体抗体又はその単一の鎖；及び任意の抗原結合性可変ドメイン（即ち、「抗原結合性部分」）又はその単一の鎖；及び抗体ＣＤＲ、ＶＨ領域又はＶＬ領域を含む分子（限定なしに多特異性抗体を含む）を含む。天然に存在する「全体抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各々の重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記される）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される複数の超可変性の領域、および、それらに隣接した、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された複数の領域に更に分けられ得る。各々のＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並んだ３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合性ドメインを有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体システムの第１成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
「抗体可変ドメイン」という用語は、本明細書において使用される場合、所与の抗原（例えば、ＰＤＬ１、ＣＤ１３７、ＲＯＲ１、ＭＳＬＮ、ＣＤ３、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－３１又はｈＳＡ）に特異的に結合する能力を有するインタクトな抗体の１つ以上の部分を指す。これは、インタクトな抗体又はその単一の鎖の任意の抗原結合性断片（即ち、「抗原結合性部分」）；及び抗体ＣＤＲ、ＶＨ領域又はＶＬ領域を含む分子であることができる。特に、本発明の多特異性抗体の場合において、「抗体可変ドメイン」という用語は、本明細書において使用される場合、Ｆａｂ断片、即ちＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片；抗体の単一のアームのＶＬ及びＶＨドメイン（Ｆｖ）からなるＦｖ断片；ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）；単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；並びにそれに融合した追加の軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有する単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＡＢ）を指す。好ましくは、本発明の抗体可変ドメインは、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）及びｓｃＦｖ断片から選択される。より好ましくは、本発明の抗体可変ドメインは、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）及びｓｃＦｖ断片から選択される。特定の実施形態において、本発明の抗体可変ドメインは、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片又はジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）である。他の特定の実施形態において、本発明の抗体可変ドメインは単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。他の特定の実施形態において、ｓｃＦｖ断片のＶＬ及びＶＨドメインは、ドメイン間ジスルフィド結合により安定化され、特に前記ＶＨドメインは５１位（ＡＨｏ番号付け）における単一のシステイン残基を含み、及び前記ＶＬドメインは１４１位（ＡＨｏ番号付け）における単一のシステイン残基を含む。
「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． （１９９１）， “Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤにより記載されるもの（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） ＪＭＢ ２７３， ９２７－９４８により記載されるもの（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）；ＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）番号付け（Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ．－Ｐ．， Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ， ７， １３２－１３６ （１９９９）； Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ．－Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２７， ５５－７７ （２００３））（「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）；及びＨｏｎｅｇｇｅｒ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３０９ （２００１） ６５７－６７０において記載される番号付けスキーム（「ＡＨｏ」番号付け）を含む、多数の周知のスキームのいずれかを使用して決定される境界を有するアミノ酸配列を指す。例えば、古典的なフォーマットのために、Ｋａｂａｔの下で、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）中のＣＤＲアミノ酸残基は、３１～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ；並びに軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）中のＣＤＲアミノ酸残基は、２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けされる。Ｃｈｏｔｈｉａの下でＶＨ中のＣＤＲアミノ酸は、２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５２～５６（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ；並びにＶＬ中のアミノ酸残基は、２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けされる。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲ定義を組み合わせることにより、ＣＤＲは、ヒトＶＨ中のアミノ酸残基２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）並びにヒトＶＬ中のアミノ酸残基２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）からなる。ＩＭＧＴの下でＶＨ中のＣＤＲアミノ酸残基は、約２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５１～５７（ＨＣＤＲ２）及び９３～１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ、並びにＶＬ中のＣＤＲアミノ酸残基は、約２７～３２（ＬＣＤＲ１）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けされる（「Ｋａｂａｔ」による番号付け）。ＩＭＧＴの下で、抗体のＣＤＲは、プログラムＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ Ａｌｉｇｎを使用して決定され得る。
本発明の文脈において、特に他に記載されなければ、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎにより示唆される番号付けシステム（「ＡＨｏ」）が使用される（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３０９ （２００１） ６５７－６７０）。特に、以下の残基は、ＡＨｏ番号付けスキームによるＣＤＲとして定義される：ＬＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｌ１としても参照される）：Ｌ２４～Ｌ４２；ＬＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｌ２としても参照される）：Ｌ５８～Ｌ７２；ＬＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｌ３としても参照される）：Ｌ１０７～Ｌ１３８；ＨＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｈ１としても参照される）：Ｈ２７～Ｈ４２；ＨＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｈ２としても参照される）：Ｈ５７～Ｈ７６；ＨＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｈ３としても参照される）：Ｈ１０８～Ｈ１３８。対応して、本発明の文脈において、以下の残基は、ＡＨｏ番号付けスキームにしたがってそれぞれ軽鎖フレームワーク１～４（ＬＦＷ１～ＬＦＷ４）及び重鎖フレームワーク１～４（ＨＦＷ１～ＨＦＷ４）として定義される：ＬＦＷ１：Ｌ１～Ｌ２３；ＬＦＷ２：Ｌ４３～Ｌ５７；ＬＦＷ３：Ｌ７３～Ｌ１０６；ＬＦＷ４：Ｌ１３９～Ｌ１４９；ＨＦＷ１：Ｈ１～Ｈ２６；ＨＦＷ２：Ｈ４３～Ｈ５６；ＨＦＷ３：Ｈ７７～Ｈ１０７；ＨＦＷ４：Ｈ１３９～Ｈ１４９。明確性のために、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎによる番号付けシステムは、天然に存在する抗体中で、異なるＶＨ及びＶＬサブファミリーの両方、特に、ＣＤＲにおいて見出される長さの多様性を考慮に入れ、配列中にギャップを提供する。そのため、所与の抗体可変ドメインにおいて通常は１～１４９位の全てがアミノ酸残基により占有されるわけではない。
「結合特異性」という用語は、本明細書において使用される場合、１つの抗原決定基と反応し、及び異なる抗原決定基とは反応しない個々の抗体の能力を指す。本明細書において使用される場合、「～に特異的に結合する」又は「～に特異的である」という用語は、生物学的分子を含む分子の不均質な集団の存在下で標的の存在を決定付ける、測定可能な及び再現性のある相互作用、例えば標的と抗体との間の結合を指す。例えば、標的（エピトープであることができる）に特異的に結合する抗体は、それが他の標的に結合するよりも高い親和性、アビディティで、より容易に、及び／又はより長い持続期間でこの標的に結合する抗体である。その最も一般的な形態において（及び定義される参照が記載されない場合）、「特異的結合」は、例えば、当技術分野において公知の特異性アッセイ方法にしたがって決定される、関心対象の標的と無関連の分子との間で識別する抗体の能力を指す。そのような方法は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）試験及びペプチドスキャンを含むが、これらに限定されない。例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイが実行され得る。スコア付けは、標準的な顕色（例えば、ホースラディッシュペルオキシドを用いた二次抗体及び過酸化水素とテトラメチルベンジジン）により実行されてもよい。ある特定のウェルにおける反応は、例えば、４５０ｎｍにおける、光学密度によりスコア付けされる。典型的なバックグラウンド（＝陰性反応）は約０．１ＯＤであってもよく；典型的な陽性反応は約１ＯＤであってもよい。陽性スコアと陰性スコアとの間の比は１０倍又はより高いものであり得ることをこれは意味する。更なる例において、ＳＰＲアッセイが実行可能であり、該アッセイにおいて、バックグラウンドとシグナルとの間の少なくとも１０倍、特には少なくとも１００倍の差異は特異的結合を指し示す。典型的には、結合特異性の決定は、単一の参照分子ではなく、約３～５個の無関連の分子、例えば粉乳、トランスフェリン、又は同種のもののセットを使用することにより行われる。
本発明の抗体可変ドメインは標的抗原に結合し、これは任意の標的抗原であり得る。標的抗原の例は、膜貫通分子、受容体、リガンド、増殖因子、成長ホルモン、凝固因子、抗凝固因子、プラスミノーゲン活性化因子、血清アルブミン、ホルモン若しくは増殖因子の受容体、神経栄養因子、神経増殖因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、ＣＤタンパク質、インターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞共刺激受容体、例えばＣＤ１３７、表面膜タンパク質、ウイルスタンパク質、腫瘍関連抗原、インテグリン若しくはインターロイキン、ＶＥＧＦ；レニン；ヒト成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ－１－アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子ＶＩＩＩＣ；凝固因子ＩＸ；組織因子（ＴＰ）；フォンウィルブランド因子；プロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；ウロキナーゼ；ヒト尿；組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血性増殖因子；腫瘍壊死因子－アルファ若しくは－ベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭｌＰ－ｌ）－アルファ；ヒト血清アルブミン；ミュラー管阻害物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロレラキシリ（ｐｒｏｒｅｌａｘｉｒｉ）；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、ベータ－ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；ＣＴＬＡ－４；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；プロテインＡ若しくはＤ；リウマトイド因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；ニューロトロフィン－３、－４、－５、若しくは－６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５、若しくはＮＴ－６）；ＮＧＦ－ベータ；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ；ｂＦＧＦ；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ－アルファ；ＴＧＦ－ベータｌ、ＴＧＦ－ベータ２、ＴＧＦ－ベータ３、ＴＧＦ－ベータｌ４、若しくはＴＧＦ－ベータ５を含む、ＴＧＦ－ベータ；インスリン様増殖因子－Ｉ若しくは－ＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ若しくはＩＧＦ－ＩＩ）；ｄｅｓ（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳ＩＧＦ－Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質、エリスロポエチン；骨誘導性因子；免疫毒素；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン－アルファ、－ベータ、若しくは－ガンマ；Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ若しくはＧ－ＣＳＦ；ＩＬ－１～ＩＬ－１０；スーパーオキシドディスムターゼ；分解促進因子；ＡＩＤＳエンベロープタンパク質；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤｌ ｌａ、ＣＤｌ ｌｂ、ＣＤｌ ｌｃ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ４０、若しくはＣＤ４６、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ－４若しくはＶＣＡＭ；又はＨＥＲ２、ＨＥＲ３若しくはＨＥＲ４受容体；ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー；ＥＧＦ受容体；ＨＥＲ２、ＨＥＲ３若しくはＨＥＲ４受容体；細胞接着分子；ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐｌ５０．９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、アルファ４／ベータ７インテグリン若しくはアルファｖ／ベータ３インテグリン；細胞接着分子のアルファ若しくはベータサブユニット；抗体）；増殖因子、ＶＥＧＦ；組織因子（ＴＦ）；ＴＧＦ－ベータ；アルファインターフェロン（アルファ－ＩＦＮ）；ＩＬ－８；ＩｇＥ；血液型抗原Ａｐｏ２；細胞死受容体、例えばＰＤ－１；細胞死受容体リガンド、例えばＰＤ－Ｌ１；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ４又はプロテインＣを含むが、これらに限定されない。
「腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）」という用語は、腫瘍細胞の表面上に発現される抗原を指す。特定の実施形態において、ＴＡＡは、非腫瘍細胞と比較された場合に腫瘍細胞上に優先的に発現される抗原であり、特には腫瘍細胞上のＴＡＡの発現は、同じ生物又は患者からの非腫瘍細胞上よりも少なくとも５倍高い、少なくとも１０倍高い、少なくとも２０倍高い、少なくとも５０倍高い、又は少なくとも１００倍高い。
腫瘍関連抗原標的の例は、ＡＤＲＢ３、ＡＦＰ、ＡＬＫ、ＢＣＭＡ、ベータヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＣＡ－１２５（ＭＵＣ１６）、ＣＡＩＸ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５、ＣＤ１３５（ＦＬＴ３）、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２７６、ＣＤ３３、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７、ＣＤＨ３（カドヘリン３）、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＬＤＮ６、ＣＬＥＣ１２Ａ（ＣＬＬ１）、ＣＳＰＧ４、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖｌｌｌ、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、エフリンＢ２、ＥＲＢＢｓ（例えば、ＥＲＢＢ２）、ＦＡＰ、ＦＧＦＲ１、葉酸受容体アルファ、葉酸受容体ベータ、Ｆｏｓ関連抗原、ＧＡ７３３、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＦＲアルファ４、ｇｌｏｂｏＨ、ＧＰＣ３、ＧＰＲ２０、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＨＡＶＣＲ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＨＥＲ２）、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＭＷＭＡＡ、ＨＰＶ Ｅ６又はＥ７、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＩＬ－１１Ｒａ、ＩＬ－１３Ｒａ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ＫＩＴ、レグマイン、ＬｅｗｉｓＹ、ＬＭＰ２、Ｌｙ６ｋ、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＭＬ－ＩＡＰ、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ｍｕｔ ｈｓｐ ７０－２、ＮＡ－１７、ＮＣＡＭ、好中球エラスターゼ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｏ－アセチル－ＧＤ２、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＡＮＸ３、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＰＬＡＣ１、ポリシアル酸、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ１、ＲＯＲ１、ｓＬｅ、精子タンパク質１７、ＳＳＥＡ－４、ＳＳＴＲ２、ｓＴｎ抗原、ｓＴｎ－Ｏグリコペプチド、ＴＡＧ７２、ＴＡＲＰ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、サイログロブリン、Ｔｎ抗原、Ｔｎ－Ｏ－グリコペプチド、ＴＰＢＧ（５Ｔ４）、ＴＲＰ－２、ＴＳＨＲ、ＵＰＫ２及びＶＥＧＦＲ２を含むが、これらに限定されない。好ましい例は、ＣＤ１３８、ＣＤ７９ｂ、ＴＰＢＧ（５Ｔ４）、ＨＥＲ２、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＣＡ－１２５（ＭＵＣ１６）、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＥｐＣＡＭ、ＣＬＥＣ１２Ａ（ＣＬＬ１）、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＥＡ、ＣＤ３３、ＥＧＦＲ、ＧＰＣ３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ２７６、ＣＤＨ３（カドヘリン３）、ＦＧＦＲ１、ＳＳＴＲ２、ＣＤ１３３、ＥＰＨＡ２、ＨＬＡ－Ａ２、ＩＬ１３ＲＡ２、ＲＯＲ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＤ１３５、ＧＤ－２、ＧＡ７３３、ＣＤ１３５（ＦＬＴ３）、ＣＳＰＧ４及びＴＡＧ－７２である。特定の例は、ＣＤ１３８、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＭＳＬＮ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＬＥＣ１２ａ、及びＲＯＲ１である。
好ましい実施形態において、本発明の抗体可変ドメインに含まれるＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４は、以下の置換（ＡＨｏ番号付け）：
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）；
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）及び１４４位のアミノ酸における（Ｑ）；又は
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）、１０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）及び１４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）
のうちの１つを有する。
特定の実施形態において、本発明の抗体可変ドメインに含まれるＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４は、以下の置換（ＡＨｏ番号付け）：１２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）、１０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）、及び１４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）を有する。
好適には、本発明の結合性ドメインのＶＨドメインはヒト抗体ＶＨファミリーに属する。好ましい実施形態において、本発明の結合性ドメインのＶＨドメインは、ＶＨフレームワークサブタイプＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ、ＶＨ３又はＶＨ４に属する。特定の実施形態において、本発明の結合性ドメインは、ＶＨフレームワークサブタイプＶＨ３に属するＶＨドメインを含む。
本発明の文脈において、「ＶＨｘフレームワークサブタイプ（若しくはＶκ／Ｖλフレームワークサブタイプ）に属するか、又はそれから選択される」という用語は、フレームワーク配列ＨＦＷ１～ＨＦＷ４（又はＬＦ１～ＬＦＷ４）が前記ヒト抗体ＶＨ又はＶＬフレームワークサブタイプに対して最も高い程度の相同性を示すことを意味する。ＶＨ３フレームワークサブタイプに属するＶＨドメインの特有の例は、配列番号１１４又は１１５により表され、ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ又はＶＨ４フレームワークサブタイプに属するＶＨドメインの特有の例は、配列番号１２０、１２１及び１２２により表される（表８、フレームワーク領域は太字でない文字で示されている）。ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ、ＶＨ３及びＶＨ４配列の代替的な例、並びに他のＶＨｘ配列の例は、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９６ （２０００） ５７－８６又は国際公開第２０１９／０５７７８７号パンフレットにおいて見出され得る。
特定の実施形態において、本発明の抗体可変ドメインの可変重鎖フレームワーク領域ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４は、配列番号３、４、８、９、１３、１４、１９、２０、２５、２６、３１、３２、３５、３６、３７、４２、４３、４４、６０、６３、７１、７２、７６、７７、８１、９５、９６、９９、１００、１１６及び１１７のうちのいずれか１つのフレームワーク領域（表１～７における斜体ではない残基、即ちＣＤＲ残基として示されていない全ての残基）の組合せ；並びに１２、１０３及び１４４（ＡＨｏ番号付け）とは異なる位置におけるフレームワーク領域内の５つ以下のアミノ酸、特には４つ以下のアミノ酸、特には３つ以下のアミノ酸、特には２つ以下のアミノ酸、特には１つ以下のアミノ酸が突然変異している配列番号３、４、８、９、１３、１４、１９、２０、２５、２６、３１、３２、３５、３６、３７、４２、４３、４４、６０、６３、７１、７２、７６、７７、８１、９５、９６、９９、１００、１１６及び１１７のバリアントのフレームワーク領域（表１～７における斜体ではない残基）の組合せから選択される。これと関連して、「突然変異」という用語は、様々な非限定的な例として、付加、置換又は欠失を意味する。ＶＨ領域は、配列番号３、４、８、９、１３、１４、１９、２０、２５、２６、３１、３２、３５、３６、３７、４２、４３、４４、６０、６３、７１、７２、７６、７７、８１、９５、９６、９９、１００、１１６及び１１７に示される配列のうちの１つの少なくとも５～１４０位（ＡＨｏ番号付け）、特には少なくとも３～１４５位、より特には少なくとも２～１４７位を含むＶＨドメインを更に含み、但し、そのようなＶＨドメインは、上記の項目９及び１０において定義される機能的な特色を呈する。
好ましい実施形態において、本発明の抗体可変ドメインの可変軽鎖フレームワークＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３及びＬＦＷ４は、ヒト抗体Ｖκフレームワークサブタイプ（例えばＶκ１、Ｖκ２、Ｖκ３又はＶκ４フレームワークサブタイプ）から選択され、特にはＶκ１フレームワークサブタイプのものである。Ｖκ１フレームワークサブタイプの特有の例は、配列番号１１８又は１１９により表される（表８、フレームワーク領域は太字でない文字で標識されている）。Ｖκ１配列の代替的な例、及びＶκ２、Ｖκ３又はＶκ４配列の例は、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９６ （２０００） ５７－８６において見出され得る。
他の好ましい実施形態において、可変軽鎖フレームワークＬＦＷ１、ＬＦＷ２及びＬＦＷ３は、ヒト抗体Ｖκフレームワークサブタイプ、好ましくはＶκ１フレームワークサブタイプから選択され、可変軽鎖フレームワークＬＦＷ４はＶλフレームワークサブタイプから選択される。特定の実施形態において、本発明の抗体可変ドメインの可変軽鎖フレームワークＬＦＷ４は、配列番号１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０及び１３１のＶλフレームワーク４配列からなる群から選択される。配列番号１２９のＶλフレームワーク４配列は、可変軽鎖（ＶＬ）１４４位（ＡＨｏ番号付け）における単一のシステイン残基を含み、特に、第２の単一のシステインが、ドメイン間ジスルフィド結合の形成のために、対応する可変重鎖（ＶＨ）中、特にはＶＨの５１位（ＡＨｏ番号付け）に存在する場合において適用される。
特定の実施形態において、本発明の抗体可変ドメインの可変軽鎖フレームワークＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３及びＬＦＷ４は、配列番号５、１０、１５、１６、２１、２２、２７、２８、３３、３４、３８、３９、４０、４１、４５、４６、４７、４８、６１、６４、７３、７４、７８、７９、８２、９７、９８、１０１、１０２、１１８及び１１９のうちのいずれか１つのフレームワーク領域（表１～７における斜体ではない残基、即ちＣＤＲ残基として示されていない全ての残基）の組合せ；並びにフレームワーク領域内の５つ以下のアミノ酸、特には４つ以下のアミノ酸、特には３つ以下のアミノ酸、特には２つ以下のアミノ酸、特には１つ以下のアミノ酸が突然変異している配列番号５、１０、１５、１６、２１、２２、２７、２８、３３、３４、３８、３９、４０、４１、４５、４６、４７、４８、６１、６４、７３、７４、７８、７９、８２、９７、９８、１０１、１０２、１１８及び１１９のバリアントのフレームワーク領域（表１～７における斜体ではない残基）の組合せから選択される。これと関連して、「突然変異」という用語は、様々な非限定的な例として、付加、置換又は欠失を意味する。ＶＬ領域は、配列番号５、１０、１５、１６、２１、２２、２７、２８、３３、３４、３８、３９、４０、４１、４５、４６、４７、４８、６１、６４、７３、７４、７８、７９、８２、９７、９８、１０１、１０２、１１８及び１１９に示される配列のうちの１つの少なくとも５～１４０位（ＡＨｏ番号付け）、特には少なくとも３～１４５位、より特には少なくとも２～１４７位を含むＶＬドメインを更に含み、但し、そのようなＶＬドメインは、上記の項目９及び１０において定義される機能的な特色を呈する。
好ましい実施形態において、本発明の抗体可変ドメインは、Ｆａｂ断片、即ちＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片；抗体の単一のアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）；並びに単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）から選択されるフォーマットである。好ましくは、本発明の抗体可変ドメインは、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）及び単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）から選択される。特定の実施形態において、本発明の抗体可変ドメインはＦｖ断片及び単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）から選択される。他の特定の実施形態において、ｓｃＦｖ断片のＶＬ及びＶＨドメインは、ドメイン間ジスルフィド結合により安定化され、特に前記ＶＨドメインは５１位（ＡＨｏ番号付け）における単一のシステイン残基を含み、及び前記ＶＬドメインは１４１位（ＡＨｏ番号付け）における単一のシステイン残基を含む。
本発明の抗体可変ドメインは、ｓｃＦｖフォーマットである場合に、ＶＨフレームワーク領域中に上記に定義される置換を含まない前記抗体可変ドメインのバージョンと比較された場合に、低減された免疫原性を呈する。より特に、本発明の抗体可変ドメインは、ｓｃＦｖフォーマットである場合に、既存ＡＤＡ結合アッセイにおける測定の際、特に実施例３において定義されている既存ＡＤＡ結合アッセイにおける測定の際、ヒト血清中に存在する既存抗薬物抗体（ＡＤＡ）に対する低減された結合を呈する。特に、ＶＨフレームワーク領域中に上記に定義される置換を含まない前記抗体可変ドメインのバージョンと比較された場合に、既存ＡＤＡに対する低減された結合を呈する。
免疫原性、即ち患者の身体内で治療用タンパク質が抗体応答を誘導する傾向は、例えば、本明細書において「既存ＡＤＡ」として参照される、健康な及び処置されていない個体のヒト血清中に既に存在する抗薬物抗体（ＡＤＡ）により認識されるその能力により予測され得る。
そのため、本発明の目的のために、「免疫原性」という用語は、本明細書において使用される場合、治療用タンパク質、例えば抗体、抗体断片又は抗体結合性ドメインがヒト血清試料中の既存ＡＤＡにより認識される能力を指す。理論に縛られないが、既存ＡＤＡの結合の他に、治療的処置の間のＡＤＡの形成の誘導は、治療用タンパク質上のＢ細胞及び／又はＴ細胞エピトープの存在と関連すると考えられる。そのような免疫原性の程度は、ＥＬＩＳＡアッセイにより決定可能であり、試験されたヒト血清の総数と比べた、測定可能な量の、問題とする治療用タンパク質を認識する、即ちそれに結合する、既存ＡＤＡ及び／又は治療的処置の間に形成されたＡＤＡを含有するヒト血清試料のパーセンテージ（陽性血清試料のパーセンテージ）により表され得る。治療用タンパク質と、その免疫原性を低減させる目標と共に改変されている対応する治療用タンパク質との間の免疫原性の低減は、改変された治療用タンパク質に対する陽性血清試料のパーセンテージを、元々の治療用タンパク質に対する陽性血清試料のパーセンテージと比較することにより測定され得る。改変された治療用タンパク質についての陽性血清試料のより低い数又はパーセンテージは、元々の治療用タンパク質と比べた免疫原性の低減を指し示す。
ＥＬＩＳＡシグナルがある特定の閾値を上回る場合に、血清試料は、測定可能な量の既存ＡＤＡを含有するとみなされる。この閾値は、本明細書においてスクリーニングカットポイント（ＳＣＰ）としても参照される。ＳＣＰは、以下において定義されるように算出され得るか、又は試験された血清について得られた最大ＥＬＩＳＡシグナルに対して任意の値（例えば試験された血清について得られた最大ＥＬＩＳＡシグナルの２０％、１５％、１０％若しくは５％）に設定され得る。好ましくは、ＳＣＰは、以下において定義されるように算出される。
本発明の抗体可変ドメインは、ｓｃＦｖフォーマットである場合に、有利な生物物理学的特性、特に、優れた安定性を更に有する。好適には、本発明の抗体可変ドメインは、ｓｃＦｖフォーマットである場合に、以下の特色：
ａ．ｐＨ ６．４の１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸クエン酸緩衝液中に製剤化された場合に、少なくとも６５℃の、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）により決定された、融解温度（Ｔｍ）を有すること；
ｂ．ｐＨ ６．４の１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸クエン酸緩衝液中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化された場合に、５％未満の、４℃で２８日間の貯蔵後の、単量体含有量における損失を有すること；
ｃ．ｐＨ ６．４の１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸クエン酸緩衝液中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化された場合に、５％未満の、４℃で２８日間の貯蔵後の、タンパク質含有量における損失を有すること
のうちの１つ以上により更に特徴付けられる。
ＤＳＦは以前に記載されている（Ｅｇａｎ， ｅｔ ａｌ．， ＭＡｂｓ， ９（１） （２０１７）， ６８－８４； Ｎｉｅｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ２（９） （２００７） ２２１２－２２２１）。ｓｃＦｖ構築物の熱的アンフォールディングのための転移の中間点は、蛍光色素ＳＹＰＲＯ（登録商標） Ｏｒａｎｇｅを使用して示差走査蛍光定量法により決定される（Ｗｏｎｇ ＆ Ｒａｌｅｉｇｈ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５ （２０１６） １８３４－１８４０を参照）。ｐＨ ６．４のリン酸－クエン酸緩衝液中の試料は、５０μｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度において１００μｌの総体積中に５ｘ ＳＹＰＲＯ（登録商標） Ｏｒａｎｇｅの最終濃度を含有するように調製される。２５マイクロリットルの調製された試料は、白色壁ＡＢ ｇｅｎｅ ＰＣＲプレートに３連で加えられる。アッセイは、サーマルサイクラーとして使用されるｑＰＣＲ装置において行われ、蛍光放出は、ソフトウェアのカスタム色素較正ルーチンを使用して検出される。試験試料を含有するＰＣＲプレートに対して２５℃から９６℃まで１℃ずつの増分で昇温を行い、各々の温度増分後に３０秒の休止を置く。全アッセイ時間は約２ｈである。Ｔｍは、曲線の変曲点を算出するために数学的な二次導関数の方法を使用してソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにより算出される。報告されるＴｍは３回の測定の平均である。
単量体含有量における損失は、ＳＥ－ＨＰＬＣクロマトグラムの曲線下面積の算出により決定される。ＳＥ－ＨＰＬＣは、米国薬局方（ＵＳＰ）、第６２１章に概説されるように、固体静止相及び液体移動相に基づく分離技術である。この方法は、疎水性静止相及び水性移動相を利用してサイズ及び形状に基づいて分子を分離する。分子の分離は、特有のカラムの排除体積（Ｖ０）と全透過体積（ＶＴ）との間で発生している。ＳＥ－ＨＰＬＣによる測定は、自動化された試料注入及び２８０ｎｍの検出波長に設定されたＵＶ検出器を備えたＣｈｒｏｍａｓｔｅｒ ＨＰＬＣシステム（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈｉｇｈ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上で行われる。機器は、ソフトウェアＥＺＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．３．２ ＳＰ２）により制御され、該ソフトウェアはまた、得られるクロマトグラムの分析をサポートする。タンパク質試料は、遠心分離により清澄化され、注入に先立ってオートサンプラー中で４～６℃の温度に保たれる。ｓｃＦｖ試料の分析のためにカラムＳｈｏｄｅｘ ＫＷ４０３－４Ｆ（Ｓｈｏｗａ Ｄｅｎｋｏ Ｉｎｃ．、＃Ｆ６９８９２０２）が、０．３５ｍｌ／分の推奨される流速の標準化された緩衝食塩水移動相（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ ６．５、３００ｍＭの塩化ナトリウム）と共に用いられる。注入当たりの標的試料ロードは５μｇであった。試料は２８０ｎｍの波長においてＵＶ検出器により検出され、データは好適なソフトウェアスイートにより記録される。得られたクロマトグラムは、Ｖ０～ＶＴの範囲において分析され、それにより、＞１０分の溶出時間を伴うマトリックス関連ピークは除外される。
第２の態様において、本発明は、本発明の１つ以上の抗体可変ドメインを含む抗体に関する。
ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、本発明の抗体可変ドメインとは異なる抗体可変ドメインを更に含む。より特に、本発明の抗体は、本明細書において定義されているフレームワーク領域中の置換を有しない抗体可変ドメインを更に含む。
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、本発明の抗体可変ドメインを排他的に含む。より特に、これらの好ましい実施形態において、本発明の抗体は、本明細書において定義されているフレームワーク領域中の置換を有する抗体可変ドメインを排他的に含む。
「一価抗体」又は「その標的抗原について一価の抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、単一の標的分子に、及びより特に標的分子上の単一のエピトープに結合する抗体を指す。また、「結合性ドメイン」又は「一価結合性ドメイン」という用語は、本明細書において使用される場合、標的分子上の単一のエピトープに結合する結合性ドメインを指す。
「二価抗体」又は「その標的抗原について二価の抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、２の価数を有する単一の抗体を指し、「価数」は、特有の標的分子上のエピトープに結合する抗原結合性部分の数として記載される。そのため、単一の抗体は、２コピーの対応する抗原結合性部分の存在に起因して標的分子上の２つの結合性部位及び／又は２つの標的分子に結合することができる。
同様に、「三価抗体」又は「その標的抗原について三価の抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、３の価数を有する単一の抗体を指す。そのため、単一の抗体は、３コピーの対応する抗原結合性部分の存在に起因して標的分子上の３つの結合性部位に結合することができ、及び／又は３つまでの標的分子に結合することができる。
本発明の抗体が２又は３つの結合性ドメインを含む場合、前記２又は３つの結合性ドメインは、標的分子上の同じエピトープ又は異なるエピトープのいずれかに結合する。好ましくは、２又は３つの結合性ドメインは、標的分子上の同じエピトープに結合する。
「同じエピトープ」という用語は、本明細書において使用される場合、１つより多くの抗体に特異的に結合する能力を有するタンパク質上の個々のタンパク質決定基であって、その個々のタンパク質決定基が同一である、即ち、前記抗体の各々にとって同一の３次元構造的特徴と同一の電荷的特徴とを有する分子、例えばアミノ酸又は糖側鎖の同一の化学活性表面グルーピング（ｓｕｒｆａｃｅ ｇｒｏｕｐｉｎｇｓ）からなるものを指す。
「異なるエピトープ」という用語は、特定のタンパク質標的との関連で本明細書において使用される場合、タンパク質上の個々のタンパク質決定基であって、各々が異なる抗体に特異的に結合する能力を有し、これらの個々のタンパク質決定基が、前記異なる抗体にとって同一でない、即ち、異なる３次元構造的特徴と異なる電荷的特徴とを有する分子、例えばアミノ酸又は糖側鎖の非同一の化学活性表面グルーピングからなるものを指す。これらの異なるエピトープは、オーバーラップしているか、又はオーバーラップしていないものであることができる。
１つの群の実施形態において、抗体のフォーマットは、二価二特異性ＩｇＧフォーマット、三価二特異性ＩｇＧフォーマット及び四価二特異性ＩｇＧフォーマットから選択される。特に、前記抗体のフォーマットは、ＫｉＨベースＩｇＧ、例えばＤｕｏＢｏｄｉｅｓ（Ｄｕｏｂｏｄｙ技術により作製される二特異性ＩｇＧ）（ＭＡｂｓ． ２０１７ Ｆｅｂ／Ｍａｒ；９（２）：１８２－２１２． ｄｏｉ： １０．１０８０／１９４２０８６２．２０１６．１２６８３０７）；ＤＶＤ－Ｉｇ；ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合物、例えばＣＯＤＶ－ＩｇＧ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合物（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ－Ｈ）又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合物（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ－Ｌ））、ｂｓＡｂ（軽鎖のＣ末端に連結されたｓｃＦｖ）、Ｂｓ１Ａｂ（軽鎖のＮ末端に連結されたｓｃＦｖ）、Ｂｓ２Ａｂ（重鎖のＮ末端に連結されたｓｃＦｖ）、Ｂｓ３Ａｂ（重鎖のＣ末端に連結されたｓｃＦｖ）、Ｔｓ１Ａｂ（重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に連結されたｓｃＦｖ）並びにＴｓ２Ａｂ（重鎖のＣ末端に連結されたｄｓｓｃＦｖ）から選択される。より特には、前記抗体のフォーマットは、ＫｉＨベースＩｇＧ、例えばＤｕｏＢｏｄｉｅｓ；ＤＶＤ－Ｉｇ；ＣＯＤＶ－ＩｇＧ及びＭｏｒｒｉｓｏｎ（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合物（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ－Ｈ）又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合物（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ－Ｌ））から、よりいっそう特にはＤＶＤ－Ｉｇ及びＭｏｒｒｉｓｏｎ（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合物（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ－Ｈ）又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合物（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ－Ｌ））から選択される。
この群の実施形態において、ＩｇＧは、好ましくは、ＩｇＧサブクラスＩｇＧ１及びＩｇＧ４、特にＩｇＧ４から選択される。
特定の実施形態において、前記抗体のフォーマットは、Ｍｏｒｒｉｓｏｎフォーマット、即ちＭｏｒｒｉｓｏｎ－Ｌ及びＭｏｒｒｉｓｏｎ－Ｈフォーマットから選択される。本発明において使用されるＭｏｒｒｉｓｏｎ－Ｌ及びＭｏｒｒｉｓｏｎ－Ｈフォーマットは、ＩｇＧ Ｆｃ領域、特にＩｇＧ４ Ｆｃ領域を有する四価及び二特異性分子フォーマットである。軽鎖が、Ｖλ ＦＲ４と組み合わせてＶκ ＦＲ１～ＦＲ３を含み、及び本発明の抗体可変ドメインに基づく、２つの高度に安定なｓｃＦｖ結合性ドメインは、リンカーＬ１を介して重鎖（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ－Ｈ）又は軽鎖（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ－Ｌ）Ｃ末端に融合される。
リンカーＬ１は、２～３０個のアミノ酸、より特には５～２５個のアミノ酸、最も特には１０～２０個のアミノ酸のペプチドである。特定の実施形態において、前記リンカーＬ１は、４つのグリシンアミノ酸残基及び１つのセリンアミノ酸残基の１つ以上の単位（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎ＝１、２、３、４又は５、特にはｎ＝２）を含む。
２つのｓｃＦｖドメインのＶＨ領域及びＶＬ領域はリンカーＬ２により接続される。リンカーＬ２は、１０～４０個のアミノ酸、より特には１５～３０個のアミノ酸、最も特には２０～２５個のアミノ酸のペプチドである。特には、前記リンカーＬ２は、４つのグリシンアミノ酸残基及び１つのセリンアミノ酸残基の１つ以上の単位（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎ＝１、２、３、４、５、６、７又は８、特にはｎ＝４）を含む。
別の群の実施形態において、本発明の抗体は免疫グロブリンＦｃ領域を含まない。
「免疫グロブリンＦｃ領域」又は「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において使用される場合、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域、即ち重鎖定常領域のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを定義するために使用される。「Ｆｃ領域」という用語は、ネイティブ配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域、即ちある特定の所望される特性、例えば変更されたＦｃ受容体結合機能及び／若しくは低減若しくは抑制されたＦａｂアーム交換等を呈するように操作されたＦｃ領域を含む。そのような操作されたＦｃ領域の例はノブ－イントゥー－ホール（ＫｉＨ）技術である（例えばＲｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ９：６１７－２１ （１９９６）及びＳｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８８（３７）：２６５８３－９３ （２０１３）を参照）。ネイティブ配列Ｆｃ領域は、ヒトｌｇＧ１、ｌｇＧ２（ｌｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ｌｇＧ３及びｌｇＧ４を含む。「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」とは、抗体のＦｃ領域に結合する受容体のことを指す。特には、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合し（ガンマ受容体）、ＦｃγＲＩ、ＦｃｙＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含む、ネイティブ配列ヒトＦｃＲであり、これは、これらの受容体のアレルバリアント及び選択的にスプライシングされた形態、主にその細胞質ドメインにおいて異なる類似したアミノ酸配列を有する、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩ ＩＢ（「阻害受容体」）を含むＦｃγＲＩＩ受容体を含む。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有する（Ｍ． Ｄａｅｒｏｎ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５：２０３－２３４ （１９９７）を参照）。ＦｃＲはＲａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９： ４５７－９２ （１９９１）； Ｃａｐｅｔ ｅｔ ａｌ， Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４： ２５－３４ （１９９４）；及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｌａｂ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ． １２６： ３３０－４１ （１９９５）において総説されている。将来的に同定されるものを含む、他のＦｃＲは、本明細書において「ＦｃＲ」という用語に包含される。「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」という用語はまた、母親のＩｇＧの胎児への移動の原因となる、新生児受容体、ＦｃＲｎを含む。Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１７： ５８７ （１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４： ２４９ （１９９４）。ＦｃＲｎへの結合を測定する方法は公知である（例えば、Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １８： （１２）： ５９２－８ （１９９７）； Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５ （７）： ６３７－４０ （１９９７）； Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ＴＪＩ （８）： ６２１３－６ （２００４）；国際公開第２００４／９２２１９号パンフレット（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ）を参照）。ヒトＦｃＲｎ高親和性結合性ポリペプチドのインビボでのＦｃＲｎへの結合及び血清半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス若しくはトランスフェクトされたヒト細胞株において、又はバリアントＦｃ領域を有するポリペプチドを投与された霊長動物においてアッセイされ得る。国際公開第２００４／４２０７２号パンフレット（Ｐｒｅｓｔａ）は、ＦｃＲへの結合を向上又は減少させた抗体バリアントを記載している。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ９（２）： ６５９１－６６０４ （２００１）も参照。
この群の実施形態において、抗体は、好ましくは、タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、直鎖状二量体ｓｃＤｂ（ＬＤ－ｓｃＤｂ）、環状二量体ｓｃＤｂ（ＣＤ－ｓｃＤｂ）、タンデムトリ－ｓｃＦｖ、トリボディ（Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）２）、Ｆａｂ－Ｆｖ２、トリアボディ、ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ、テトラボディ、ジダイアボディ、タンデム－ジ－ｓｃＦｖ及びＭＡＴＣＨ（国際公開第２０１６／０２０２４５７号パンフレット；Ｅｇａｎ Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， ＭＡＢＳ ９ （２０１７） ６８－８４において記載されている）からなる群から選択されるフォーマットである。
特定の実施形態において、本発明の抗体は、ＣＨ１及び／又はＣＬ領域を更に含まない。これらの特定の実施形態において、抗体は、ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ、トリアボディ、テトラボディ又はＭＡＴＣＨフォーマット、特にはＭＡＴＣＨ又はｓｃＤｂ－ｓｃＦｖフォーマットである。より特には、本発明の抗体はＭＡＴＣＨ３又はＭＡＴＣＨ４フォーマットである。
特有の実施形態において、本発明の抗体は三特異性及び四価である。
更なる特有の実施形態において、本発明の抗体は三特異性及び三価である。
本発明の二特異性、三特異性、四特異性又は五特異性の抗体に含まれる抗体可変ドメインは、それらのそれぞれの抗原又は受容体に同時に結合する能力を有する。「同時に」という用語は、この関連で使用される場合、例えばＲＯＲ１に特異的に結合する、抗体可変ドメインのうちの１つの、並びに、例えばＣＤ３及びｈＳＡに対して特異性を有する、１又は２つの更なる抗体可変ドメインの、同時の結合を指す。
好適には、本発明の二特異性、三特異性、四特異性又は五特異性の抗体に含まれる抗体可変ドメインは、作動可能に連結している。
「作動可能に連結した」という用語は、本明細書において使用される場合、２つの分子（例えば、ポリペプチド、ドメイン、結合性ドメイン）が、各々の分子が機能的活性を保持する仕方で取り付けられていることを指し示す。２つの分子は、それらが直接的に取り付けられているのか、それとも間接的に（例えば、リンカーを介して、部分を介して、部分へのリンカーを介して）取り付けられているのかにかかわらず、「作動可能に連結した」ものであり得る。「リンカー」という用語は、本発明において使用される結合性ドメイン又は抗体可変ドメインの間に任意選択的に位置するペプチド又は他の部分を指す。分子を共有結合的に連結させるために多数の戦略が使用され得る。これらは、タンパク質又はタンパク質ドメインのＮ末端とＣ末端との間のポリペプチド連結、ジスルフィド結合を介する連結、及び化学架橋試薬を介する連結を含むが、これらに限定されない。この実施形態の１つの態様において、リンカーは、組換え技術又はペプチド合成により生成された、ペプチド結合である。２つのポリペプチド鎖が接続される特有の場合のための好適なリンカーの選択は、２つのポリペプチド鎖の性質（例えば、それらが天然にオリゴマー化するかどうか）、既知である場合に接続されるべきＮ末端とＣ末端との間の距離、並びに／又はタンパク質加水分解及び酸化に対するリンカーの安定性を含むがこれらに限定されない、様々なパラメーターに依存する。更には、リンカーは、柔軟性を提供するアミノ酸残基を有してもよい。
本発明の文脈において、「ポリペプチドリンカー」という用語は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の鎖からなるリンカーであって、このリンカーが２つのドメインを接続し、各ドメインがリンカーの一方の末端に取り付けられる、リンカーのことを指す。ポリペプチドリンカーは、２つの分子が所望される活性を保持するように互いに対して正確なコンホメーションを取るような仕方で２つの分子を連結するために適切な長さを有するべきである。特定の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、２～３０個のアミノ酸残基（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のアミノ酸残基）の連続的な鎖を有する。追加的に、ポリペプチドリンカーに含めるために選択されるアミノ酸残基は、ポリペプチドの活性に重大に干渉しない特性を呈するべきである。そのため、リンカーペプチドは全体として、ポリペプチドの活性と合致しない電荷を呈するべきではないし、内部フォールディングに干渉するべきでもないし、受容体単量体ドメインの結合を深刻に妨害するであろう単量体のうちの１つ以上におけるアミノ酸残基との結合若しくは他の相互作用を形成するべきでもない。特定の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、構造化されていないポリペプチドである。有用なリンカーは、グリシン－セリン、又はＧＳリンカーを含む。「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ」又は「ＧＳ」リンカーにより、連続するグリシン及びセリンのポリマー（例えば、（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（ＧＧＧＧＳ）ｎ及び（ＧＧＧＳ）ｎ（ｎは少なくとも１の整数である）を含む）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、並びに他の柔軟性リンカー、例えばシェーカーカリウムチャネルのためのテザー、及び当業者により理解されるような様々な他の柔軟性リンカーが意味される。グリシン－セリンポリマーは好ましく、その理由は、これらのアミノ酸を含むオリゴペプチドは相対的に構造化されておらず、したがって成分の間の中立なテザーとして役立つことができる可能性があるからである。第２に、セリンは親水性であり、したがって球状グリシン鎖であり得るものを可溶化することができる。第３に、類似した鎖は、組換えタンパク質、例えば単鎖抗体のサブユニットの接合において有効であることが示されている。
好適には、本発明の抗体可変ドメインは、単離された可変ドメインである。同様に、本発明の抗体は、単離された抗体である。「単離された可変ドメイン」又は「単離された抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、異なる抗原特異性を有する他の可変ドメイン又は他の抗体を実質的に含まない可変ドメイン又は抗体を指す（例えば、メソテリンに特異的に結合する単離された抗体可変ドメインは、メソテリン以外の抗原に特異的に結合する抗体可変ドメインを実質的に含まない）。更に、単離された抗体可変ドメイン又は単離された抗体は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まないものであってもよい。
好適には、本発明の抗体可変ドメイン及び抗体はモノクローナル抗体可変ドメイン及び抗体である。「モノクローナル抗体可変ドメイン」又は「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、又は同じ遺伝学的供給源に由来する可変ドメイン又は抗体を指す。モノクローナル可変ドメイン又は抗体は、特定のエピトープに対する結合特異性及び親和性、又は特異的なエピトープに対する結合特異性及び親和性を示す。
本発明の抗体可変ドメイン及び抗体は、キメラ、ヒト及びヒト化抗体可変ドメイン及び抗体を含むが、これらに限定されない。
「キメラ抗体」又は「キメラ抗体可変ドメイン」という用語は、本明細書において使用される場合、（ａ）抗原結合性部位（可変領域）が、異なる若しくは変更されたクラス、エフェクター機能及び／若しくは種の定常領域に連結されるように、定常領域、若しくはその部分が、変更、置き換え若しくは交換されているか；又は（ｂ）可変領域、若しくはその部分が、異なる若しくは変更された抗原特異性を有する可変領域を用いて変更、置き換え若しくは交換されている、抗体分子又は抗体可変ドメインを指す。例えば、マウス抗体は、ヒト免疫グロブリンからの定常領域でその定常領域を置き換えることにより改変され得る。ヒト定常領域との置き換えに起因して、キメラ抗体は、元々のマウス抗体と比較して低減されたヒトにおける抗原性を有しながら抗原の認識におけるその特異性を保持することができる。
「ヒト抗体」又は「ヒト抗体可変ドメイン」という用語は、本明細書において使用される場合、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体又は抗体可変ドメインを含むことが意図される。更には、抗体又は抗体可変ドメインが定常領域を有する場合、定常領域もまた、そのようなヒト配列、例えば、ヒト生殖系列配列、又はヒト生殖系列配列の突然変異バージョンに由来する。本発明のヒト抗体及び抗体可変ドメインは、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発により又はインビボでの体細胞突然変異により導入された突然変異）を含んでもよい。ヒト抗体又は抗体可変ドメインのこの定義は、非ヒト抗原結合性残基を含むヒト化抗体又は抗体可変ドメインを特に除外する。ヒト抗体及び抗体可変ドメインは、ファージディスプレイライブラリーを含む、当技術分野において公知の様々な技術を使用して製造され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ， ２２７：３８１ （１９９２）； Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ， ２２２：５８１ （１９９１））。Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， ｐ． ７７ （１９８５）； Ｂｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， １４７（ｌ）：８６－９５ （１９９１）において記載される方法もまた、ヒトモノクローナル抗体及びヒトモノクローナル抗体可変ドメインの調製のために利用可能である。ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， ５： ３６８－７４ （２００１）も参照。ヒト抗体及びヒト抗体可変ドメインは、抗原チャレンジに応答してそのような抗体及び抗体可変ドメインを産生するように改変されているが、その内因性座位が不能にされているトランスジェニック動物、例えば、免疫化されたゼノマウスに抗原を投与することにより調製され得る（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関して米国特許第６，０７５，１８１号明細書及び同第６，１５０，５８４号明細書を参照）。例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体に関してＬｉ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １０３：３５５７－ ３５６２ （２００６）も参照。
「ヒト化」抗体又は「ヒト化」抗体可変ドメインという用語は、本明細書において使用される場合、ヒトにおいてより低い免疫原性でありながら非ヒト抗体又は抗体可変ドメインの反応性を保持する抗体又は抗体可変ドメインを指す。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、及び抗体又は抗体可変ドメインの残りの部分をそれらのヒト対応物（即ち、定常領域の他に、可変領域のフレームワーク部分）で置き換えることにより達成され得る。追加のフレームワーク領域改変が、ヒトフレームワーク配列内の他に、別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列内で為されてもよい。本発明のヒト化抗体及び抗体可変ドメインは、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発により若しくはインビボでの体細胞突然変異により導入された突然変異、又は安定性若しくは製造を促進するための保存的置換）を含んでもよい。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１：６８５１－６８５５， １９８４； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ， Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ４４：６５－９２， １９８８； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９： １５３４－１５３６， １９８８； Ｐａｄｌａｎ， Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎ．， ２８：４８９－４９８， １９９１；及びＰａｄｌａｎ， Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎ．， ３１： １６９－２１７， １９９４を参照。ヒト操作技術の他の例は、米国特許第５，７６６，８８６号明細書において開示されるＸｏｍａ技術を含むがこれに限定されない。
「組換えヒト化抗体」又は「組換えヒト化抗体可変ドメイン」という用語は、本明細書において使用される場合、組換え手段により調製、発現、作出又は単離されたすべてのヒト抗体及びヒト抗体可変ドメイン、例えばヒト化抗体又はヒト化抗体可変ドメインを発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体及び抗体可変ドメイン、並びにヒト免疫グロブリン遺伝子の配列の全体又は部分の、他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段により調製、発現、作出又は単離された抗体及び抗体可変ドメインを含む。
好ましくは、本発明の抗体可変ドメイン及び抗体はヒト化されている。より好ましくは、本発明の抗体可変ドメイン及び抗体はヒト化されており、及びウサギ由来ＣＤＲを含む。
「二特異性抗体」、「三特異性抗体」、「四特異性抗体」、「五特異性抗体」という用語又はより一般的な用語「多特異性抗体」は、本明細書において使用される場合、少なくとも２つ以上の異なる標的、例えば２つの異なる標的（二特異性）、３つの異なる標的（三特異性）、４つの異なる標的（四特異性）、又は５つの異なる標的（五特異性）上の２つ以上の異なるエピトープに結合する抗体を指す。好ましくは、本発明の抗体は、二特異性、三特異性又は四特異性、特には二特異性又は三特異性、より特には三特異性である。上記に指し示されるように、三特異性抗体という用語は、３つの異なる標的（例えば、メソテリン、ＣＤ３及びｈＳＡ又はＲＯＲ１、ＣＤ３及びｈＳＡ）上の少なくとも３つの異なるエピトープに結合する抗体を指す。
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合する能力を有するタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常、分子、例えばアミノ酸又は糖側鎖の化学活性表面グルーピングからなり、通常、特有の３次元構造的特徴の他に、特有の電荷的特徴を有する。「コンホメーショナル」及び「リニア」エピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合は喪失されるが、後者への結合は喪失されないという点において区別される。
「コンホメーショナルエピトープ」という用語は、本明細書において使用される場合、ポリペプチド鎖がフォールディングしてネイティブなタンパク質を形成する場合に表面上で集合する抗原のアミノ酸残基を指す。
「リニアエピトープ」という用語は、タンパク質と相互作用性分子（例えば抗体）との間の相互作用の全ての箇所がタンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線状（連続的）に存在するエピトープを指す。
「認識する」という用語は、本明細書において使用される場合、そのコンホメーショナルエピトープを発見し、及び相互作用（例えば、結合）する抗体又は抗体可変ドメインを指す。
本発明の抗体可変ドメインは、それらの非改変対応物と比較された場合に、有意に低減された免疫原性を呈し、及び優れた安定性を有する、多様な抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ断片、並びに多特異性抗体、例えば、二特異性及び三特異性抗体の構築において成功裏に応用され得ることを本発明者らは見出した。
１つの特有の群の実施形態は、本発明の１つ以上の抗体可変ドメインを含む抗体であって、抗体は、三特異性であり、及び各々の標的抗原について一価であり、並びに抗体は、
１）ＣＤ１３７に特異的に結合する１つの結合性ドメイン（ＣＤ１３７－ＢＤ）；
２）ＰＤＬ１に特異的に結合する１つの結合性ドメイン（ＰＤＬ１－ＢＤ）；及び
３）１つのヒト血清アルブミン結合性ドメイン（ｈＳＡ－ＢＤ）
を含む、抗体に関する。
好ましくは、この特有の群の実施形態において、
ＣＤ１３７に特異的に結合する１つの結合性ドメイン（ＣＤ１３７－ＢＤ）は、
ａ．配列番号１のＶＨ配列及び配列番号５のＶＬ配列；
ｂ．配列番号２のＶＨ配列及び配列番号５のＶＬ配列；
ｃ．配列番号３のＶＨ配列及び配列番号５のＶＬ配列；若しくは
ｄ．配列番号４のＶＨ配列及び配列番号５のＶＬ配列
を含み；
ＰＤＬ１に特異的に結合する１つの結合性ドメイン（ＰＤＬ１－ＢＤ）は、
ａ．配列番号１１のＶＨ配列及び配列番号１５のＶＬ配列；
ｂ．配列番号１２のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列；
ｃ．配列番号１３のＶＨ配列及び配列番号１５のＶＬ配列；若しくは
ｄ．配列番号１４のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列
を含み；
１つのヒト血清アルブミン結合性ドメイン（ｈＳＡ－ＢＤ）は、
ａ．配列番号２３のＶＨ配列及び配列番号２７のＶＬ配列；
ｂ．配列番号２４のＶＨ配列及び配列番号２８のＶＬ配列；
ｃ．配列番号２５のＶＨ配列及び配列番号２７のＶＬ配列；若しくは
ｄ．配列番号２６のＶＨ配列及び配列番号２８のＶＬ配列
を含み；
但し、３つの結合性ドメインのうちの少なくとも１つは、ｃ）若しくはｄ）から選択されるＶＨ／ＶＬ配列ペアを含むか；
又は
ＣＤ１３７に特異的に結合する１つの結合性ドメイン（ＣＤ１３７－ＢＤ）は、
ａ．配列番号６のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列；
ｂ．配列番号７のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列；
ｃ．配列番号８のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列；若しくは
ｄ．配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列
を含み；
ＰＤＬ１に特異的に結合する１つの結合性ドメイン（ＰＤＬ１－ＢＤ）は、
ａ．配列番号１７のＶＨ配列及び配列番号２１のＶＬ配列；
ｂ．配列番号１８のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列；
ｃ．配列番号１９のＶＨ配列及び配列番号２１のＶＬ配列；若しくは
ｄ．配列番号２０のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列
を含み；及び
１つのヒト血清アルブミン結合性ドメイン（ｈＳＡ－ＢＤ）は、
ａ．配列番号２９のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列；
ｂ．配列番号３０のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列；
ｃ．配列番号３１のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列；若しくは
ｄ．配列番号３２のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列
を含み；
但し、３つの結合性ドメインのうちの少なくとも１つは、ｃ）若しくはｄ）から選択されるＶＨ／ＶＬ配列ペアを含む。
上記の定義は、前記ＶＨ及びＶＬドメインのバリアント、即ち重鎖の１２、１０３及び１４４位（ＡＨｏ番号付け）とは異なる位置におけるフレームワーク領域（表１における斜体ではない残基）内の５つ以下のアミノ酸、特には４つ以下のアミノ酸、特には３つ以下のアミノ酸、特には２つ以下のアミノ酸、特には１つ以下のアミノ酸が突然変異している、配列番号３、４、５、１３，１４，１５，１６、２５、２６、２７及び２８のバリアント、又は、配列番号８、９、１０、１９、２０、２１、２２、３１、３２、３３及び３４のバリアントを更に含み、但し、これらのバリアント配列から選択されるＶＨ及びＶＬドメインは、ＣＤ３、ＰＤＬ１又はｈＳＡに対するそれぞれの結合特性の他に、上記の項目２４において定義されている機能的特性を依然として呈する。これと関連して、「突然変異」という用語は、様々な非限定的な例として、付加、置換又は欠失を意味する。
本明細書において使用される、抗体の「結合性ドメイン」という用語、又は「その抗原結合性断片」若しくは抗体の「抗原結合性部分」及び同種の用語は、所与の抗原に特異的に結合する能力を有する、インタクトな抗体の１つ以上の部分を指す。抗体の抗原結合機能は、インタクトな抗体の断片により行われ得る。特に、本発明の抗体の場合に、本明細書において使用される「結合性ドメイン」という用語、又は「その抗原結合性断片」若しくは「抗原結合性部分」及び同種の用語は、Ｆａｂ断片、即ちＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片；抗体の単一のアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）；並びに単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を指す。好ましくは、本発明の抗体の結合性ドメインは、互いから独立して、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）及び単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）から選択される。特定の実施形態において、本発明の抗体の結合性ドメインは、互いから独立して、Ｆｖ断片及び単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）から選択される。他の特定の実施形態において、ｓｃＦｖ断片のＶＬ及びＶＨドメインは、ドメイン間ジスルフィド結合により安定化され、特に前記ＶＨドメインは５１位（ＡＨｏ番号付け）における単一のシステイン残基を含み、及び前記ＶＬドメインは１４１位（ＡＨｏ番号付け）における単一のシステイン残基を含む。
好ましくは、前記特有の群の実施形態の抗体は免疫グロブリンＦｃ領域を含まない。特に、前記特有の群の実施形態の抗体は、免疫グロブリンＦｃ領域を含まず、並びにＣＨ１及び／又はＣＬ領域も含まない。
好ましくは、前記結合性ドメインの少なくとも２つ、特には３つ全ての結合性ドメインは、本発明の抗体可変ドメインから構築され、即ち、本発明の抗体可変ドメインについて本明細書において定義されている特有の置換を有する重鎖フレームワーク領域を含む。
好ましくは、この特有の群の実施形態の抗体は、表３において見出され得る、本明細書において定義されているＶＨ／ＶＬ配列を含む。
好ましくは、この特有の群の実施形態の抗体は、ＭＡＴＣＨ３フォーマットであり、特にはｓｃＭＡＴＣＨ３フォーマットを有する。
特には、この特有の群の実施形態の抗体は三特異性三価抗体ＮＭ２１－１４８０のバリアントである。特有の例は、ＰＲＯ２７５８、ＰＲＯ２７５９、ＰＲＯ２７６０、ＰＲＯ２７６１、ＰＲＯ２７６２、ＰＲＯ２７６３、ＰＲＯ２７６４、ＰＲＯ２７６５及びＰＲＯ３３５１であり、その配列は表３において見出され得る。
上述されるように、これらの親断片ベース抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘｈＳＡ抗体の製造及び生物物理学的特性に関する詳細は本明細書において開示されている。更なる詳細、特にそれらの設計及びそれらの機能的特性に関する更なる詳細は、特許出願国際公開第２０１９／０７２８６８号パンフレットにおいて開示されている。
本発明の抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘｈＳＡ抗体、特に本明細書において定義されるＮＭ２１－１４８０バリアントは、有意に低減された免疫原性を呈し、即ち、項目１において定義されている置換を含まないＮＭ２１－１４８０と比較された場合に、健康な処置されていない個体のヒト血清試料中に存在する既存ＡＤＡに対する有意に低減された結合を呈する。本発明の抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘｈＳＡ抗体、ＮＭ２１－１４８０バリアント及びＮＭ２１－１４８０に対する前記血清試料中のＡＤＡの結合を決定するために使用されるアッセイは、実施例３において詳細に記載されている。
他に、これらの断片ベース抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘｈＳＡ抗体は、有利な生物物理学的特性、特に優れた安定性を有する。
別の態様において、本発明は、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する、本明細書において定義されている抗体可変ドメインに関する。
「血清アルブミン」という用語は、特に、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ０２７６８を有するヒト血清アルブミン又はそのバリアントを指す。ヒト血清アルブミン（本明細書においてｈＳＡと略記される）は、５８５個のアミノ酸を含む、ヒト血清中に豊富に存在する（総タンパク質の５０％）６６．４ｋＤａのタンパク質である（Ｓｕｇｉｏ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ， Ｖｏｌ． １２， １９９９， ４３９－４４６）。多機能性ｈＳＡタンパク質の構造は、多数の代謝物、例えば脂肪酸、金属イオン、ビリルビン及び一部の薬物に結合してそれを輸送することを可能とする（Ｆａｎａｌｉ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｖｏｌ． ３３， ２０１２， ２０９－２９０）。血清中のＨＳＡ濃度は約３．５～５ｇ／ｄｌである。本発明の前記ｈＳＡ結合性抗体可変ドメインはそのため、例えば、それにコンジュゲートされた薬物又はタンパク質のインビボ血清半減期を延長させるために、使用され得る。
好ましい実施形態において、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する前記抗体可変ドメインは、
ａ）配列番号３５、３６及び３７のいずれか１つ、並びに、１２、１０３及び１４４（ＡＨｏ番号付け）とは異なる位置におけるフレームワーク領域（表２における斜体ではない残基）内の５つ以下のアミノ酸、特には４つ以下のアミノ酸、特には３つ以下のアミノ酸、特には２つ以下のアミノ酸、特には１つ以下のアミノ酸が突然変異している配列番号３５、３６及び３７のバリアントであって、但し、これらのバリアント配列から選択されるＶＨドメインが、上記の項目２９～３１のいずれか１つにおいて定義される機能的な特色を呈する、バリアントから選択される、ＶＨドメイン；並びに
ｂ）配列番号３８、３９及び４０のいずれか１つ、並びに、フレームワーク領域（表２における斜体ではない残基）内の５つ以下のアミノ酸、特には４つ以下のアミノ酸、特には３つ以下のアミノ酸、特には２つ以下のアミノ酸、特には１つ以下のアミノ酸が突然変異している配列番号３８、３９及び４０のバリアントであって、但し、これらのバリアント配列から選択されるＶＬドメインが、上記の項目２９～３１のいずれか１つにおいて定義される機能的な特色を呈する、バリアントから選択される、ＶＬドメイン
を含む。
他の好ましい実施形態において、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する前記抗体可変ドメインは、
ａ）配列番号３５、３６及び３７のいずれか１つ、並びに、１２、１０３及び１４４（ＡＨｏ番号付け）とは異なる位置におけるフレームワーク領域（表２における斜体ではない残基）内の５つ以下のアミノ酸、特には４つ以下のアミノ酸、特には３つ以下のアミノ酸、特には２つ以下のアミノ酸、特には１つ以下のアミノ酸が突然変異している配列番号３５、３６及び３７のバリアントであって、但し、これらのバリアント配列から選択されるＶＨドメインが、上記の項目２９～３１のいずれか１つにおいて定義される機能的な特色を呈する、バリアントから選択される、ＶＨドメイン；並びに
ｂ）配列番号３８、３９及び４０のいずれか１つ、並びに、フレームワーク領域（表２における斜体ではない残基）内の５つ以下のアミノ酸、特には４つ以下のアミノ酸、特には３つ以下のアミノ酸、特には２つ以下のアミノ酸、特には１つ以下のアミノ酸が突然変異している配列番号３８、３９及び４０のバリアントであって、但し、これらのバリアント配列から選択されるＶＬドメインが、上記の項目２９～３１のいずれか１つにおいて定義される機能的な特色を呈する、バリアントから選択される、ＶＬドメイン
を含む。
これと関連して、「突然変異」という用語は、様々な非限定的な例として、付加、置換又は欠失を意味する。ＶＨ及びＶＬ領域は、配列番号３５、３６及び３７に示される配列のうちの１つの少なくとも５～１４０位（ＡＨｏ番号付け）、特には少なくとも３～１４５位、より特には少なくとも２～１４７位を含むＶＨ及びＶＬドメインを更に含み、但し、そのようなＶＬドメインは、上記の項目９及び１０において定義される機能的な特色を呈する。
特定の実施形態において、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する前記抗体可変ドメインは、
ａ）配列番号３５のＶＨ配列及び配列番号３８のＶＬ配列；
ｂ）配列番号３６のＶＨ配列及び配列番号３９のＶＬ配列；
ｃ）配列番号３６のＶＨ配列及び配列番号４１のＶＬ配列；
ｄ）配列番号３７のＶＨ配列及び配列番号４０のＶＬ配列；
ｅ）配列番号４２のＶＨ配列及び配列番号４５のＶＬ配列；
ｆ）配列番号４３のＶＨ配列及び配列番号４６のＶＬ配列；
ｇ）配列番号４３のＶＨ配列及び配列番号４８のＶＬ配列；又は
ｈ）配列番号４４のＶＨ配列及び配列番号４７のＶＬ配列
を含む。
好適には、本発明のこのｈＳＡ結合性抗体可変ドメインは、他の種に対して交差反応性である。特には、本発明の抗体可変ドメインは、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）血清アルブミン（本明細書においてｃＳＡと略記される）及びマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）血清アルブミン（本明細書においてｍＳＡと略記される）に対して交差反応性である。
本発明のｈＳＡ結合性抗体可変ドメインは、ｓｃＦｖフォーマットである場合に、以下のパラメーター：
ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定された場合に、５．５のｐＨ値において、１０ｎＭ未満の一価解離定数（ＫＤ）、特には０．０５～１０ｎＭ、特には０．０５～５ｎＭのＫＤでヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）に結合すること；
ｂ．ＳＰＲにより測定された場合に、５．５のｐＨ値において、１０ｎＭ未満の一価ＫＤ、特には０．０５～１０ｎＭ、特には０．０５～５ｎＭのＫＤでカニクイザル血清アルブミン（ｃＳＡ）に結合すること；及び
ｃ．ＳＰＲにより測定された場合に、５．５のｐＨ値において、１０ｎＭ未満の一価ＫＤ、特には０．０５～１０ｎＭ、特には０．０５～５ｎＭのＫＤでマウス血清アルブミン（ｍＳＡ）に結合すること
により更に特徴付けられる。
特には、本発明のｈＳＡ結合性抗体可変ドメインは、ｓｃＦｖフォーマットである場合に、以下のパラメーター：
ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定された場合に、５．５のｐＨ値において、１０ｎＭ未満の一価解離定数（ＫＤ）、特には０．０５～１０ｎＭ、特には０．０５～５ｎＭのＫＤでヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）に結合すること；
ｂ．ＳＰＲにより測定された場合に、５．５のｐＨ値において、１０ｎＭ未満の一価ＫＤ、特には０．０５～１０ｎＭ、特には０．０５～５ｎＭのＫＤでカニクイザル血清アルブミン（ｃＳＡ）に結合すること；及び
ｃ．ＳＰＲにより測定された場合に、５．５のｐＨ値において、１０ｎＭ未満の一価ＫＤ、特には０．０５～１０ｎＭ、特には０．０５～５ｎＭのＫＤでマウス血清アルブミン（ｍＳＡ）に結合すること
により更に特徴付けられ；
並びに以下の特色：
ｄ．前記ｈＳＡ－ＢＤが、ｐＨ ６．４の１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸クエン酸緩衝液中に製剤化されている場合に、少なくとも７０℃、好ましくは少なくとも７５℃の、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）により決定された、融解温度（Ｔｍ）を有すること；
ｅ．前記抗原結合性断片が１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度であり、及び前記ｈＳＡ－ＢＤが、ｐＨ ６．４の１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸クエン酸緩衝液中に製剤化されている場合に、２％未満、好ましくは１％未満の、４℃で２８日間の貯蔵後の、単量体含有量における損失を有すること；
ｆ．前記抗原結合性断片が１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度であり、及び前記ｈＳＡ－ＢＤが、ｐＨ ６．４の１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸クエン酸緩衝液中に製剤化されている場合に、２％未満、好ましくは１％未満の、４℃で２８日間の貯蔵後の、タンパク質含有量における損失を有すること；
ｇ．前記抗原結合性断片が１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度であり、及び前記ｈＳＡ－ＢＤが、ｐＨ ６．４の１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸クエン酸緩衝液中に製剤化されている場合に、２％未満、好ましくは１％未満の、４０℃で２８日間の貯蔵後の、タンパク質含有量における損失を有すること；並びに／又は
ｈ．前記抗原結合性断片が５０ｍｇ／ｍｌの開始濃度であり、及び前記ｈＳＡ－ＢＤが、ｐＨ ６．４の１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸クエン酸緩衝液中に製剤化されている場合に、２％未満、好ましくは１％未満の、４℃で１４日間の貯蔵後の、単量体含有量における損失を有すること
のうちの１つ以上により追加的に特徴付けられる。
特には、本発明のｈＳＡ結合性抗体可変ドメインは、ｓｃＦｖフォーマットである場合に、以下のパラメーター：
ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定された場合に、５．５のｐＨ値において、１０ｎＭ未満の一価解離定数（ＫＤ）、特には０．０５～１０ｎＭ、特には０．０５～５ｎＭのＫＤでヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）に結合すること；
ｂ．ＳＰＲにより測定された場合に、５．５のｐＨ値において、１０ｎＭ未満の一価ＫＤ、特には０．０５～１０ｎＭ、特には０．０５～５ｎＭのＫＤでカニクイザル血清アルブミン（ｃＳＡ）に結合すること；及び
ｃ．ＳＰＲにより測定された場合に、５．５のｐＨ値において、１０ｎＭ未満の一価ＫＤ、特には０．０５～１０ｎＭ、特には０．０５～５ｎＭのＫＤでマウス血清アルブミン（ｍＳＡ）に結合すること
により更に特徴付けられ；
並びに以下のパラメーター：
ｄ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定された場合に、７．４のｐＨ値において、１０ｎＭ未満の一価解離定数（ＫＤ）、特には０．０５～１０ｎＭ、特には０．０５～５ｎＭのＫＤでヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）に結合すること；
ｅ．ＳＰＲにより測定された場合に、７．４のｐＨ値において、１０ｎＭ未満の一価ＫＤ、特には０．０５～１０ｎＭ、特には０．０５～５ｎＭのＫＤでカニクイザル血清アルブミン（ｃＳＡ）に結合すること；及び／又は
ｆ．ＳＰＲにより測定された場合に、７．４のｐＨ値において、２０ｎＭ未満の一価ＫＤ、特には０．１～２０ｎＭ、特には０．１～１５ｎＭのＫＤでマウス血清アルブミン（ｍＳＡ）に結合すること
のうちの１つ以上により追加的に特徴付けられる。
より特には、本発明のｈＳＡ結合性抗体可変ドメインは、以下のパラメーター：
ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定された場合に、５．５のｐＨ値において、１０ｎＭ未満の一価解離定数（ＫＤ）、特には０．０５～１０ｎＭ、特には０．０５～５ｎＭのＫＤでヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）に結合すること；
ｂ．ＳＰＲにより測定された場合に、５．５のｐＨ値において、１０ｎＭ未満の一価ＫＤ、特には０．０５～１０ｎＭ、特には０．０５～５ｎＭのＫＤでカニクイザル血清アルブミン（ｃＳＡ）に結合すること；
ｃ．ＳＰＲにより測定された場合に、５．５のｐＨ値において、１０ｎＭ未満の一価ＫＤ、特には０．０５～１０ｎＭ、特には０．０５～５ｎＭのＫＤでマウス血清アルブミン（ｍＳＡ）に結合すること；
ｄ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定された場合に、７．４のｐＨ値において、１０ｎＭ未満の一価解離定数（ＫＤ）、特には０．０５～１０ｎＭ、特には０．０５～５ｎＭのＫＤでヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）に結合すること；
ｅ．ＳＰＲにより測定された場合に、７．４のｐＨ値において、１０ｎＭ未満の一価ＫＤ、特には０．０５～１０ｎＭ、特には０．０５～５ｎＭのＫＤでカニクイザル血清アルブミン（ｃＳＡ）に結合すること；及び
ｆ．ＳＰＲにより測定された場合に、７．４のｐＨ値において、２０ｎＭ未満の一価ＫＤ、特には０．１～２０ｎＭ、特には０．１～１５ｎＭのＫＤでマウス血清アルブミン（ｍＳＡ）に結合すること
により更に特徴付けられ；
並びに以下の特色：
ｇ．前記ｈＳＡ－ＢＤが、ｐＨ ６．４の１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸クエン酸緩衝液中に製剤化されている場合に、少なくとも７０℃、好ましくは少なくとも７５℃の、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）により決定された、融解温度（Ｔｍ）を有すること；
ｈ．前記抗原結合性断片が１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度であり、及び前記ｈＳＡ－ＢＤが、ｐＨ ６．４の１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸クエン酸緩衝液中に製剤化されている場合に、２％未満、好ましくは１％未満の、４℃で２８日間の貯蔵後の、単量体含有量における損失を有すること；
ｉ．前記抗原結合性断片が１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度であり、及び前記ｈＳＡ－ＢＤが、ｐＨ ６．４の１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸クエン酸緩衝液中に製剤化されている場合に、２％未満、好ましくは１％未満の、４℃で２８日間の貯蔵後の、タンパク質含有量における損失を有すること；
ｊ．前記抗原結合性断片が１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度であり、及び前記ｈＳＡ－ＢＤが、ｐＨ ６．４の１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸クエン酸緩衝液中に製剤化されている場合に、２％未満、好ましくは１％未満の、４０℃で２８日間の貯蔵後の、タンパク質含有量における損失を有すること；並びに／又は
ｋ．前記抗原結合性断片が５０ｍｇ／ｍｌの開始濃度であり、及び前記ｈＳＡ－ＢＤが、ｐＨ ６．４の１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸クエン酸緩衝液中に製剤化されている場合に、２％未満、好ましくは１％未満の、４℃で１４日間の貯蔵後の、単量体含有量における損失を有すること
のうちの１つ以上により追加的に特徴付けられる。
本明細書において使用される場合、「親和性」という用語は、抗体又は抗体可変ドメインと単一の抗原部位における抗原との間の相互作用の強さを指す。各々の抗原部位内で、抗体可変ドメイン又は抗体「アーム」の可変領域は、弱い非共有結合性の力を通じて抗原と多数の部位において相互作用し；相互作用がより多くなればなるほど、親和性はより強くなる。
「結合親和性」は、分子（例えば、抗体又は抗体可変ドメイン）の単一の結合性部位とその結合パートナー（例えば、抗原又は、より特に、抗原上のエピトープ）との間の非共有結合性相互作用の総計の強さを一般に指す。他に指し示されなければ、本明細書において使用される場合、「結合親和性」、「～に結合する」（ｂｉｎｄ ｔｏ）、「～に結合する」（ｂｉｎｄｓ ｔｏ）又は「～に結合する」（ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ）は、結合ペアのメンバー（例えば、抗体可変ドメイン及び抗原）の間の１：１の相互作用を反映する内因性の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、解離定数（ＫＤ）により一般に表され得る。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当技術分野において公知の一般的な方法により測定され得る。低親和性抗体及び抗体可変ドメインは、一般に、抗原に緩徐に結合し、容易に解離する傾向がある一方、高親和性抗体は、一般に、抗原により急速に結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当技術分野において公知であり、そのいずれも本発明の目的のために使用され得る。結合親和性、即ち結合強度を測定するための特有の実例的な及び好ましい実施形態は、以下において記載されている。
「Ｋａｓｓｏｃ」、「Ｋａ」又は「Ｋｏｎ」という用語は、本明細書において使用される場合、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指すことが意図される一方、「Ｋｄｉｓ」、「Ｋｄ」又は「Ｋｏｆｆ」という用語は、本明細書において使用される場合、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指すことが意図される。１つの実施形態において、「ＫＤ」という用語は、本明細書において使用される場合、Ｋａに対するＫｄの比（即ちＫｄ／Ｋａ）から得られ、及びモル濃度（Ｍ）として表される、解離定数を指すことが意図される。本発明による「ＫＤ」若しくは「ＫＤ値」又は「ＫＤ」若しくは「ＫＤ値」は、１つの実施形態において、表面プラズモン共鳴アッセイを使用することにより測定される。
好適には、本発明のｈＳＡ結合性抗体可変ドメインは、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ及びｓｃＦｖからなる群から選択される。
本発明のｈＳＡ結合性抗体可変ドメインは、ｓｃＦｖフォーマットである場合に、有意に低減された免疫原性を呈し、即ち、上記の項目１において定義されているフレームワーク置換を含まない対応するｈＳＡ結合性ｓｃＦｖと比較された場合に、ヒト血清試料中に存在する既存ＡＤＡに対する有意に低減された結合を呈する。前記ｈＳＡ結合性ｓｃＦｖに対する前記血清試料中のＡＤＡの結合を決定するために使用されるアッセイは、実施例３において詳細に記載されている。
本発明の抗体可変ドメイン及び抗体は、当技術分野において公知の任意の好都合な抗体製造方法を使用して製造され得る（例えば、二特異性構築物の製造に関してＦｉｓｃｈｅｒ， Ｎ． ＆ Ｌｅｇｅｒ， Ｏ．， Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４ （２００７） ３－１４；二特異性ダイアボディ及びタンデムｓｃＦｖに関してＨｏｒｎｉｇ， Ｎ． ＆ Ｆａｒｂｅｒ－Ｓｃｈｗａｒｚ， Ａ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９０７ （２０１２）７１３－７２７、及び国際公開第９９／５７１５０号パンフレットを参照）。多特異性構築物の調製のための好適な方法の特有の例は、とりわけ、Ｇｅｎｍａｂ（Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １１０ （２０１３） ５１４５－５１５０を参照）及びＭｅｒｕｓ（ｄｅ Ｋｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． １０６ （２０１０） ７４１－７５０を参照）技術を更に含む。
これらの方法は、典型的には、例えば、ハイブリドーマ技術を使用して所望される抗原で免疫化されているマウスからの脾臓細胞と骨髄腫細胞を融合することによって（例えば、Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔｏｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｃｈａｐｔｅｒ ２， Ｕｎｉｔ ２．５， ２００６を参照）、又は組換え抗体操作（レパートリークローニング若しくはファージディスプレイ／酵母ディスプレイ）（例えば、Ｃｈａｍｅｓ ＆ Ｂａｔｙ， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔｅｒｓ １８９ （２０００） １－８を参照）によって為される、モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体可変ドメインの生成、及び公知の分子クローニング技術を使用して２つ以上の異なるモノクローナル抗体の抗原結合性ドメイン又はその断片若しくは部分を組み合わせて二特異性又は多特異性構築物を得ることによって為される。
多特異性、例えば二特異性、三特異性、四特異性若しくは五特異性、及び／又は多価の、本発明の抗体は、当技術分野において公知の方法を使用して、構成要素の結合特異性部分をコンジュゲートすることにより調製され得る。例えば、これらの抗体の各々の結合特異性部分は、別々に生成され、次に互いにコンジュゲートされ得る。結合特異性部分がタンパク質又はペプチドである場合、様々なカップリング又は架橋剤が共有結合性コンジュゲーションのために使用され得る。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジル－５－アセチル－チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ－フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル ４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９８４ Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６０： １６８６； Ｌｉｕ， Ｍ Ａ ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：８６４８を参照）。他の方法は、Ｐａｕｌｕｓ， １９８５ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓ． Ｍｉｔｔ． Ｎｏ． ７８， １１８－１３２； Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１－８３、及びＧｌｅｎｎｉｅ ｅｔ ａｌ．， １９８７ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３９： ２３６７－２３７５において記載されているものを含む。コンジュゲート剤はＳＡＴＡ及びスルホ－ＳＭＣＣであり、両方ともＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ）から入手可能である。
代替的に、２つ以上の結合特異性部分は、同じベクター中にコードされ、並びに同じ宿主細胞中で発現及びアセンブルされ得る。この方法は、二特異性分子が、ｍＡｂ×Ｆａｂ、ｍＡｂ×ｓｃＦｖ、ｍＡｂ×ｄｓＦｖ又はｍＡｂ×Ｆｖ融合タンパク質である場合に特に有用である。多特異性及び／又は多価抗体及び分子を調製する方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号明細書；米国特許第５，４５５，０３０号明細書；米国特許第４，８８１，１７５号明細書；米国特許第５，１３２，４０５号明細書；米国特許第５，０９１，５１３号明細書；米国特許第５，４７６，７８６号明細書；米国特許第５，０１３，６５３号明細書；米国特許第５，２５８，４９８号明細書；及び米国特許第５，４８２，８５８号明細書において記載されている。
抗体可変ドメイン及び多特異性抗体の、それらの特異的な標的への結合は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害）、又はウエスタンブロットアッセイにより確認され得る。これらのアッセイの各々は、一般に、関心対象の複合体に特異的な標識された試薬（例えば、抗体）を用いることにより特定の関心対象のタンパク質－抗体複合体の存在を検出する。
更なる態様において、本発明は、本発明の抗体可変ドメイン又は抗体をコードする１つの核酸又は２つの核酸を提供する。そのような核酸は、哺乳動物細胞中での発現のために最適化され得る。
「核酸」という用語は、本明細書において「ポリヌクレオチド」という用語と交換可能に使用され、１つ以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及び一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態のそのポリマーを指す。該用語は、合成、天然に存在する、及び天然に存在しない、参照核酸と類似した結合特性を有し、並びに参照ヌクレオチドと類似した方式で代謝される、公知のヌクレオチドアナログ又は修飾された骨格残基若しくは連結を含有する核酸を包含する。そのようなアナログの例は、限定なしに、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル－メチルホスホネート（ｃｈｉｒａｌ－ｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｔｅｓ）、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。他に指し示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に指し示される配列の他に、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）及び相補的配列を暗黙的に包含する。特に、以下において詳述されるように、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又はすべての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することにより達成されてもよい（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９：５０８１， １９９１； Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：２６０５－２６０８， １９８５；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８， １９９４）。
本発明は、上記される抗体可変ドメイン又は抗体のセグメント又はドメインを含むポリペプチドをコードする実質的に精製された核酸分子を提供する。適切な発現ベクターから発現される場合、これらの核酸分子によりコードされるポリペプチドは、本発明の抗体可変ドメイン又は抗体の抗原結合能力を呈する能力を有する。
ポリヌクレオチド配列は、デノボの固相ＤＮＡ合成により、又は本発明の抗体可変ドメイン若しくは抗体をコードする既存の配列（例えば、以下の実施例において記載されている配列）のＰＣＲ突然変異誘発により製造され得る。核酸の直接的な化学合成は、当技術分野において公知の方法、例えばＮａｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９７９， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：９０のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８： １０９， １９７９のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， ２２： １８５９， １９８１のジエチルホスホロアミダイト法；及び米国特許第４，４５８，０６６号明細書の固体支持体法により達成され得る。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への突然変異の導入は、例えば、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｈ． Ａ． Ｅｒｌｉｃｈ （Ｅｄ．）， Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， Ｎ．Ｙ．， １９９２； ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ． （Ｅｄ．）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ， １９９０； Ｍａｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：９６７， １９９１；及びＥｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １：１７， １９９１に記載されているように行われ得る。
本発明において提供されるのはまた、本発明の抗体可変ドメイン又は抗体を製造するための発現ベクター及び宿主細胞である。
「ベクター」という用語は、それが連結されている別のポリヌクレオチドを輸送する能力を有するポリヌクレオチド分子を指す。１つの種類のベクターは「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲートされ得るウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞中で自律複製する能力を有する（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入で宿主細胞のゲノムへの組込みが可能であり、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。
更に、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指令する能力を有する。そのようなベクターは本明細書において「組換え発現ベクター」（又は単純に、「発現ベクター」）として参照される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは多くの場合にプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は交換可能に使用されることがあり、これは、プラスミドは最も一般的に使用されるベクターの形態であるからである。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たす、そのような他の形態の発現ベクター、例えばウイルスベクター（例えば、複製欠陥性レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）を含むことが意図される。この特定の文脈において、「作動可能に連結した」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメントの間の機能的な関係性を指す。典型的には、それは、転写される配列に対する転写調節配列の機能的な関係性を指す。例えば、プロモーター又はエンハンサー配列は、適切な宿主細胞又は他の発現システムにおいてコーディング配列の転写を刺激又はモジュレートする場合に、コーディング配列に作動可能に連結している。一般に、転写される配列に作動可能に連結したプロモーター転写調節配列は、転写される配列に物理的に連続している、即ち、それらはシス作用性である。しかしながら、一部の転写調節配列、例えばエンハンサーは、それらが転写を増強するコーディング配列に物理的に連続しているか、又はそれに近接して位置する必要はない。
抗体可変ドメイン又は抗体鎖をコードするポリヌクレオチドを発現させるために様々な発現ベクターが用いられ得る。哺乳動物宿主細胞において抗体又は抗体可変ドメインを製造するためにウイルスベース及び非ウイルスの両方の発現ベクターが使用され得る。非ウイルスベクター及びシステムは、プラスミド、エピソームベクター、典型的にはタンパク質又はＲＮＡを発現するための発現カセットを有するもの、及びヒト人工染色体を含む（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５， １９９７を参照）。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞におけるｈＳＡ結合性ポリペプチド、又はそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために有用な非ウイルスベクターは、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、Ｂ及びＣ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ａ、Ｂ及びＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＭＰＳ Ｖベクター、並びに他のタンパク質を発現させるための当技術分野において公知の多数の他のベクターを含む。有用なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルスベクター及びセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）に基づくベクターを含む。Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， 上掲； Ｓｍｉｔｈ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４９：８０７， １９９５；及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６８： １４３， １９９２を参照。
発現ベクターの選択は、ベクターが発現される意図される宿主細胞に依存する。典型的には、発現ベクターは、多特異性抗体鎖又は可変ドメインをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーター及び他の調節配列（例えば、エンハンサー）を有する。１つの実施形態において、誘導性条件下を除いて挿入された配列の発現を予防するために誘導性プロモーターが用いられる。誘導性プロモーターは、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター又は熱ショックプロモーターを含む。形質転換された生物の培養物は、その発現産物が宿主細胞によってより良好に許容されるコーディング配列のために集団をバイアスすることなく非誘導性条件下で拡大増殖され得る。プロモーターに加えて、他の調節エレメントもまた、多特異性抗体鎖又は可変ドメインの効率的な発現のために要求又は所望されることがある。これらのエレメントは、典型的には、ＡＴＧ開始コドン及び隣接するリボソーム結合部位又は他の配列を含む。追加的に、発現の効率は、使用される細胞システムにとって適切なエンハンサーを含めることにより増強されてもよい（例えば、Ｓｃｈａｒｆ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０： １２５， １９９４；及びＢｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １５３：５１６， １９８７を参照）。例えば、哺乳動物宿主細胞中での発現を増加させるためにＳＶ４０エンハンサー又はＣＭＶエンハンサーが使用されてもよい。
使用されるベクターは、典型的には、存在する場合に定常領域又はその部分を含む抗体可変ドメイン又は抗体軽鎖及び重鎖をコードする。そのようなベクターは、定常領域との融合タンパク質としての可変領域の発現を可能とし、それにより、インタクトな抗体及びその抗体可変ドメインの製造に繋がる。典型的には、そのような定常領域はヒトのものである。
「組換え宿主細胞」（又は単純に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指す。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指すことが意図されると理解されるべきである。ある特定の改変が突然変異又は環境上の影響に起因して後続する世代において起こり得るので、そのような子孫は実際には親細胞と同一でないことがあるが、本明細書において使用されている用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。
本発明の抗体可変ドメイン又は抗体を宿し、及び発現させるための宿主細胞は、原核性又は真核性のいずれかであることができる。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）は、本発明のポリヌクレオチドのクローニング及び発現のために有用な１つの原核性宿主である。使用のために好適な他の微生物宿主は、桿菌（ｂａｃｉｌｌｉ）、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、並びに他の腸内細菌科細菌（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び様々なシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を含む。これらの原核性宿主において、宿主細胞と適合性の発現制御配列（例えば、複製起点）を典型的には有する発現ベクターも作製することができる。追加的に、いくつもの様々な周知のプロモーターが存在し、これは例えば、ラクトースプロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、ベータ－ラクタマーゼプロモーターシステム、又はファージラムダからのプロモーターシステムである。プロモーターは、典型的には、任意選択的にオペレーター配列と共に、発現を制御し、並びに転写及び翻訳の開始及び完了のために、リボソーム結合部位配列及び同種のものを有する。他の微生物、例えば酵母もまた、本発明の抗体可変ドメイン又は多特異性抗体を発現させるために用いられ得る。バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞もまた使用され得る。
１つの実施形態において、本発明の抗体可変ドメイン又は抗体の発現及び製造のために哺乳動物宿主細胞が使用される。例えば、それらは、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株又は外因性発現ベクターを宿す哺乳動物細胞株のいずれかであることができる。これらは、任意の正常な非不死の又は正常な若しくは異常な不死の動物又はヒト細胞を含む。例えば、インタクトな免疫グロブリンを分泌する能力を有する多数の好適な宿主細胞株が開発されており、これは、ＣＨＯ細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換されたＢ細胞及びハイブリドーマを含む。ポリペプチドを発現させるための哺乳動物組織細胞培養の使用は、例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ， ＦＲＯＭ ＧＥＮＥＳ ＴＯ ＣＬＯＮＥＳ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎ．Ｙ．， Ｎ．Ｙ．， １９８７において一般に議論されている。哺乳動物宿主細胞用の発現ベクターは、発現制御配列、例えば複製起点、プロモーター、及びエンハンサー（例えば、Ｑｕｅｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． ８９：４９－６８， １９８６を参照）、並びに必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列を含むことができる。これらの発現ベクターは、通常は、哺乳動物遺伝子又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを有する。好適なプロモーターは、構成的、細胞型特異的、ステージ特異的、及び／又はモジュレート可能若しくは調節可能なものであり得る。有用なプロモーターは、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス後期主要プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳ Ｖプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（例えばヒト最初期ＣＭＶプロモーター）、構成的ＣＭＶプロモーター、及び当技術分野において公知のプロモーターとエンハンサーとの組合せを含むが、これらに限定されない。
関心対象のポリヌクレオチド配列を有する発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主の種類によって異なる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが原核細胞のために一般的に利用される一方、リン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションが他の細胞宿主のために使用され得る。（一般に、Ｇｒｅｅｎ， Ｍ． Ｒ．， ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （２０１２）を参照）。他の方法は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介性形質転換、インジェクション及びマイクロインジェクション、バリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）法、ビロソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン－核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２への融合（Ｅｌｌｉｏｔ ａｎｄ Ｏ’Ｈａｒｅ， Ｃｅｌｌ ８８：２２３， １９９７）、ＤＮＡの薬剤増強性取込み、並びにエクスビボ形質導入を含む。組換えタンパク質の長期の高収率製造のために、安定発現が多くの場合に所望される。例えば、本発明の抗体可変ドメイン又は抗体を安定的に発現する細胞株は、ウイルス複製起点又は内因性発現エレメント及び選択マーカー遺伝子を有する本発明の発現ベクターを使用して調製され得る。ベクターの導入後に、細胞は、富化培地中で１～２日間生育された後に選択培地に切り替えられてもよい。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在は、選択培地中で、導入された配列を成功裏に発現する細胞の増殖を可能とする。耐性の、安定的にトランスフェクトされた細胞は、細胞型にとって適切な組織培養技術を使用して増殖させることができる。本発明は、そのため、本発明の抗体可変ドメイン又は抗体を製造する方法を提供し、前記方法は、本発明の抗体可変ドメイン又は抗体をコードする核酸又はベクターを含む宿主細胞を培養し、それにより、本開示の前記抗体可変ドメイン又は前記抗体を発現させるステップを含む。
１つの態様において、本発明は、本発明の抗体可変ドメイン又は抗体を製造する方法であって、本発明の抗体可変ドメイン又は抗体をコードする１つの核酸又は２つの核酸を発現する宿主細胞を培養するステップを含む、方法に関する。特に、本発明は、本発明の抗体可変ドメイン又は抗体を製造する方法であって、（ｉ）本発明の抗体可変ドメイン若しくは抗体をコードする１つの核酸若しくは２つの核酸若しくは本発明の抗体可変ドメイン若しくは抗体をコードする１若しくは２つのベクターを用意すること、前記１つの核酸若しくは複数の核酸、若しくは前記１つのベクター若しくは複数のベクターを発現させること、及び発現システムから前記抗体可変ドメイン若しくは前記抗体を収集すること、又は（ｉｉ）本発明の抗体可変ドメイン若しくは抗体をコードする１つの核酸若しくは２つの核酸を発現する１つの宿主細胞若しくは複数の宿主細胞を用意すること、前記１つの宿主細胞若しくは前記複数の宿主細胞を培養すること；及び細胞培養物から前記抗体可変ドメイン若しくは前記多特異性抗体を収集することを含む、方法に関する。
更なる態様において、本発明は、本発明の抗体、及び医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物に関する。「医薬的に許容される担体」は、抗体の構造に干渉しない媒体又は希釈剤を意味する。医薬的に許容される担体は、組成物を増強若しくは安定化させるか、又は組成物の調製を促す。医薬的に許容される担体は、生理学的に適合性の溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、並びに同種のものを含む。
そのような担体のうちのある特定のものは、医薬組成物が、例えば、対象による経口摂取のための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液及びロゼンジとして製剤化されることを可能にする。そのような担体のうちのある特定のものは、医薬組成物が、注射、点滴又は局所投与のために製剤化されることを可能にする。例えば、医薬的に許容される担体は無菌水性溶液であることができる。
本開示による医薬組成物は、医薬的に許容される濃度の塩、緩衝化剤、防腐剤、補充的な免疫増強剤、例えばアジュバント及びサイトカイン並びに任意選択的に他の治療剤をルーチン的に更に含有してもよい。組成物はまた、抗酸化剤及び／又は防腐剤を含んでもよい。抗酸化剤として、チオール誘導体（例えば、チオグリセロール、システイン、アセチルシステイン、シスチン、ジチオエリトリトール（ｄｉｔｈｉｏｅｒｙｔｈｒｅｉｔｏｌ）、ジチオトレイトール、グルタチオン）、トコフェロール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、亜硫酸塩（例えば、硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、アセトン亜硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム）及びノルジヒドログアイアレチン酸が言及され得る。好適な防腐剤は、例えば、フェノール、クロロブタノール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム及び塩化セチルピリジニウムであり得る。
本発明の医薬組成物は、当技術分野において公知の様々な方法により投与され得る。投与の経路及び／又は形態は、所望される結果によって異なる。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、若しくは皮下であるか、又は標的の部位の近位に投与されることができる。医薬的に許容される担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は上皮投与（例えば、注射又は点滴による）のために好適であるべきである。投与の経路に依存して、活性化合物、即ち、本発明の抗体は、酸、及び化合物を不活性化させ得る他の天然の条件の作用から化合物を保護するために材料中に被覆されてもよい。
本発明の医薬組成物は、当技術分野において周知の及びルーチン的に実施される方法にしたがって調製され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， ２０ｔｈ ｅｄ．， ２０００；及びＳｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｊ． Ｒ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， ｅｄ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７８を参照。医薬組成物は、好ましくは、ＧＭＰ条件下で製造される。典型的には、治療有効用量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）又は有効用量（ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ ｄｏｓｅ ）の本発明の抗体が本発明の医薬組成物中で用いられる。本発明の抗体は、当業者に公知の従来の方法により医薬的に許容される投薬形態に製剤化される。投薬量レジメンは、最適な所望される応答（例えば、治療奏功）を提供するために調整される。例えば、単一のボーラスが投与されてもよく、いくつかの分割された用量が経時的に投与されてもよく、又は用量は、治療的な状況の緊急性により指し示されるように比例的に低減若しくは増加されてもよい。投与の容易さ及び投薬量の均一性のために、投薬単位形態に非経口組成物を製剤化することが特に有利である。投薬単位形態は、本明細書において使用される場合、処置される対象のための単位投薬量として適する物理的に別々の単位を指し；各々の単位は、要求される薬学的担体とともに所望される治療効果を生成するために算出された予め決定された量の活性化合物を含有する。
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、患者に対して毒性となることなく、特定の患者、組成物、及び投与形態のための所望される治療奏功を達成するために有効な活性成分の量を得るように変更され得る。選択される投薬レベルは、用いられる本発明の特定の組成物、又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、投与の経路、投与の時間、用いられている特定の化合物の排出の速度、処置の継続期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、処置されている患者の年齢、性別、体重、条件、全般的健康状態及び過去の病歴、並びに同様の要因を含む様々な薬物動態的要因に依存する。
本発明の抗体は、通常は複数回投与される。単一の投薬の間の間隔は、週毎、月毎又は年毎であることができる。間隔はまた、患者における本発明の多特異性抗体の血中濃度の測定が示すところに従い、不規則であることができる。代替的に、本発明の抗体は持続放出製剤として投与可能であり、その場合、より少ない頻度の投与が要求される。投薬量及び頻度は、患者における抗体の半減期によって異なる。一般に、ヒト化抗体は、キメラ抗体及び非ヒト抗体よりも長い半減期を示す。投与の投薬量及び頻度は、処置が予防的であるのか、それとも治療的であるのかによって異なり得る。予防応用において、相対的に低い投薬量が、相対的に低い頻度で長期間投与される。一部の患者は、残りの生涯にわたり処置を受け続ける。治療応用において、疾患の進行が軽減されるか又は止まるまで、及び好ましくは患者が疾患の症状の部分的な又は完全な改善を示すまで、相対的に短い間隔での相対的に高い投薬量が要求される場合がある。その後は予防レジームに従い、患者への投与を行うことができる。
１つの態様において、本発明は、医薬としての使用のための本発明の抗体又は本発明の医薬組成物に関する。好適な実施形態において、本発明は、増殖性疾患、例えばがん、又はアレルギー性、炎症性及び自己免疫疾患から選択される疾患の処置における使用のための多特異性抗体又は医薬組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、増殖性疾患、例えばがん、又はアレルギー性、炎症性及び自己免疫疾患から選択される疾患の処置用の医薬の製造における使用のための本発明の医薬組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、増殖性疾患、例えばがん、又はアレルギー性、炎症性及び自己免疫疾患から選択される疾患を、その処置を必要とする対象において処置するための本発明の抗体又は医薬組成物の使用に関する。
別の態様において、本発明は、治療有効量の本発明の抗体を対象に投与することを含む、対象を処置する方法に関する。好適な実施形態において、本発明は、対象において増殖性疾患、例えばがん、又はアレルギー性、炎症性及び自己免疫疾患から選択される疾患を処置する方法であって、対象に治療有効量の本発明の抗体を投与することを含む、方法に関する。
「対象」という用語はヒト及び非ヒト動物を含む。
「動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト哺乳動物及び非哺乳動物、例えば非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類を含む。注記される場合を除いて、「患者」又は「対象」という用語は本明細書において交換可能に使用される。
「処置」、「処置する」（ｔｒｅａｔｉｎｇ）、「処置する」（ｔｒｅａｔ）、「処置される」、及び同種の用語は、本明細書において使用される場合、所望される薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患及び／若しくは疾患に帰せられる有害効果の部分的な若しくは完全な治癒又は疾患進行の遅延の観点において治療的であってもよい。「処置」は、本明細書において使用される場合、哺乳動物、例えば、ヒトにおける疾患の任意の処置をカバーし、（ａ）疾患の阻害、即ち、その発症の停止；及び（ｂ）疾患の緩和、即ち、疾患を軽減することを含む。
「治療有効量」又は「有効量」という用語は、疾患を処置するために哺乳動物又は他の対象に投与される場合に、疾患に対するそのような処置に効果をもたらすために充分である剤の量を指す。「治療有効量」は、薬剤、疾患及びその重症度並びに処置される対象の年齢、体重等によって異なる。
最終の態様において、本発明は、抗体を改変する方法であって、前記抗体が、断片ベースであるか、又は１つ以上のｓｃＦｖ断片を含む抗体であり、前記方法が、前記断片ベース抗体のＶＨ配列中又は前記抗体のｓｃＦｖ断片のＶＨ配列中に以下の置換（ＡＨｏ番号付け）：
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）；
－ １４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）；
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）及び１０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）；
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）及び１４４位のアミノ酸における（Ｑ）；
－ １０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）及び１４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）；又は
－ １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）；１０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）及び１４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）
を導入して、改変された抗体を得るステップを含み；
改変された抗体が、その非改変バージョンと比較された場合に、健常ドナーからのヒト血清中に存在する既存抗薬物抗体（ＡＤＡ）に対する減少した結合を呈し、並びに結合における減少が、ＥＬＩＳＡベース既存抗薬物抗体結合アッセイにより決定される、
方法に関する。
前記最終の態様の特定の実施形態において、前記改変された抗体は、本発明による、即ち請求項、項目１～３２又は発明の詳細な説明において定義されている、抗体可変ドメインを含む。
本出願のテキストの全体を通じて、本明細書（例えば、表１～８）のテキストと配列表との間に不一致がある場合、明細書のテキストが優先される。
明確性のために、別々の実施形態の文脈において記載されている本発明のある特定の特色はまた、単一の実施形態において組合せで提供されてもよいことが理解される。反対に、簡潔性のために、単一の実施形態の文脈において記載されている本発明の様々な特色はまた、別々に又は任意の好適な部分的組合せで提供されてもよい。本発明に関する実施形態の全ての組合せは本発明により具体的に包含され、一つ一つの組合せが個々に及び明示的に開示された場合と同様に本明細書において開示されている。追加的に、様々な実施形態及びその要素の全ての部分的組合せもまた本発明により具体的に包含され、一つ一つのそのような部分的組合せが個々に及び明示的に本明細書において開示された場合と同様に本明細書において開示されている。
本発明は、本明細書に記載される特有の実施形態により範囲を限定されない。実際に、本明細書に記載されるものに加えて本発明の様々な改変が以上の記載から当業者に明らかとなる。そのような改変は、添付の請求項の範囲内に入ることが意図される。
それぞれの特許法の下で可能な程度まで、本明細書において参照される全ての特許、出願、刊行物、試験方法、文献、及び他の資料は、参照により本明細書に援用される。
以下の実施例は、上記される本発明の実例を示すが、本発明の範囲を限定することは決して意図されない。関連技術分野の当業者に公知の他の試験モデルもまた請求項の発明の有益な効果を決定することができる。
実施例１：本発明によるｓｃＦｖバリアントの製造
１．１．ＰＲＯ１９２２（ＭＳＬＮ結合性ｓｃＦｖ）のバリアント及びＰＲＯ２２３０（ＰＤＬ１結合性ｓｃＦｖ）のバリアントの製造：
ＰＲＯ１９２２の製造の他に、機能的及び生物物理学的特徴付けは、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０６４４２７において詳細に開示されている。
ＰＲＯ２２３０は、多特異性抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘｈＳＡ抗体ＰＲＯ１４８０のＰＤ－Ｌ１結合性ドメインのｓｃＦｖである。ＰＲＯ１４８０及びその結合性ドメインの設計、特徴付け及び製造は、特許出願国際公開第２０１９／０７２８６８号パンフレットにおいて詳細に開示されている。
本発明のＰＲＯ１９２２及びＰＲＯ２２３０のバリアントは、前記特許出願に記載される方法にしたがって製造された。
簡潔に述べれば、本明細書において定義されている、ＰＲＯ１９２２及びＰＲＯ２２３０のバリアントの発現は、ＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＣＨＯ細胞中で行った。発現は、製造者の指示書にしたがって実行した。清澄化された採取物からアフィニティークロマトグラフィーによりタンパク質を精製した。必要な場合、バリアントｓｃＦｖは、ＳＥ－クロマトグラフィーにより９５％より高い最終単量体含有量まで最終精製した。製造される材料の品質制御のために、標準的な分析方法、例えばＳＥ－ＨＰＬＣ、ＵＶ２８０及びＳＤＳ－ＰＡＧＥを適用した。
製造されたＰＲＯ１９２２及びＰＲＯ２２３０のバリアントは表９に要約されている。ＰＲＯ１９２２及びＰＲＯ２２３０のバリアントｓｃＦｖの製造の詳細は表１０に要約されている。
１．２．ＰＲＯ２１５５及びＰＲＯ２３１７（ｈＳＡ結合性ｓｃＦｖ）のバリアントの製造：
ＰＲＯ２１５５及びＰＲＯ２３１７は、多特異性抗ＭＳＬＮｘＣＤ３ｘｈＳＡ抗体ＰＲＯ２５７６及びＰＲＯ２６６０、並びに多特異性抗ＲＯＲ１ｘＣＤ３ｘｈＳＡ抗体ＰＲＯ２５１０、ＰＲＯ２５８９、ＰＲＯ２６５８及びＰＲＯ２６５９中に存在するｈＳＡ結合性ドメインのｓｃＦｖである。同様に、本発明によるＰＲＯ２１５５及びＰＲＯ２３１７のバリアントは、抗ＭＳＬＮｘＣＤ３ｘｈＳＡ及び抗ＲＯＲ１ｘＣＤ３ｘｈＳＡ多特異性抗体バリアントＰＲＯ２７４１、ＰＲＯ２７４５、ＰＲＯ２７４６、ＰＲＯ２６６７、ＰＲＯ２６６８、ＰＲＯ２６６９及びＰＲＯ２６７０中に存在するｈＳＡ結合性ドメインのｓｃＦｖである。
ＰＲＯ２１５５及びＰＲＯ２３１７の製造の他に、機能的及び生物物理学的特徴付けは、特許出願国際公開第２０２１／０８９６０９号パンフレットにおいて詳細に開示されている。
本発明のＰＲＯ２１５５及びＰＲＯ２３１７のバリアントは、前記特許出願及び上記のセクション１．１に記載される方法にしたがって製造された。
実施例２：本発明による抗体バリアントの製造
２．１．ＮＭ２１－１４８０（ＰＲＯ１４８０）のバリアントの製造
上述されるように、ＮＭ２１－１４８０（ＰＲＯ１４８０）及びその結合性ドメインの設計、特徴付け及び製造は、特許出願国際公開第２０１９／０７２８６８号パンフレットにおいて詳細に開示されている。本発明のＮＭ２１－１４８０バリアントは、該文献において記載される方法にしたがって製造された。
簡潔に述べれば、表１１に列記されているＮＭ２１－１４８０バリアント（ｓｃＭＡＴＣＨ３構築物）の発現は、ＣＨＯｇｒｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ）及び哺乳動物ＣＨＯ－Ｓ細胞を使用して０．５Ｌスケールで行った。７日の発現後に、清澄化された培養上清からプロテインＡ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ、Ｃｙｔｉｖａ）アフィニティークロマトグラフィー、続いてｐＨ ６．５の３００ｍＭのスクロースを含む５０ｍＭのリン酸－クエン酸緩衝液中でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりタンパク質を精製したか、又は、適用可能な場合、９５％より高い純度を有する捕捉画分を直接的にプールし、ｐＨ ６．５の緩衝液の３００ｍＭのスクロースを含む５０ｍＭのリン酸－クエン酸緩衝液に緩衝液交換した。ＳＥＣ画分の単量体含有量をＳＥ－ＨＰＬＣ分析により評価し、９５％より高い単量体含有量を有する画分をプールした。製造される材料の品質制御のために、標準的な分析方法、例えばＳＥ－ＨＰＬＣ、ＵＶ２８０及びＳＤＳ－ＰＡＧＥを適用した。ｓｃＭＡＴＣＨ３分子の分子組成及び製造の要約を表２に示している。表１２にも要約されるように、選択された分子の熱安定性を、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８デバイス（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ）を使用してｎＤＳＦにより評価した。
２．２．ＮＭ３２バリアントの製造：
上述されるように、ＮＭ３２参照ＰＲＯ２５１０、ＰＲＯ２５８９、ＰＲＯ２６５８及びＰＲＯ２６５９並びにその結合性ドメインの設計、特徴付け及び製造は、優先権文献ＥＰ２１１５４７８６．４において詳細に開示されている。本発明のＮＭ３２バリアントは、該文献において記載される方法にしたがって製造された。
簡潔に述べれば、表１３に列記されているＮＭ３２バリアント（ｓｃＭＡＴＣＨ３及びＭＡＴＣＨ４構築物）の発現は、Ｅｖｉｔｒｉａ ＡＧ（Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において独自の哺乳動物発現システムを使用して１Ｌスケールで行った。清澄化された培養上清からプロテインＬ（ＣａｐｔｏＬ、Ｃｙｔｉｖａ）アフィニティークロマトグラフィー、続いてｐＨ ６．５の３００ｍＭのスクロースを含む５０ｍＭのリン酸－クエン酸緩衝液中でのＳＥＣによりタンパク質を精製した。ＳＥＣ画分の単量体含有量をＳＥ－ＨＰＬＣ分析により評価し、９５％より高い単量体含有量を有する画分をプールした。製造される材料の品質制御のために、標準的な分析方法、例えばＳＥ－ＨＰＬＣ、ＵＶ２８０及びＳＤＳ－ＰＡＧＥを適用した。ｓｃＭＡＴＣＨ３及びＭＡＴＣＨ４分子の製造の要約は表１３に示されている。表１３にも要約されるように、分子の熱安定性を、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８デバイス（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ）を使用してｎＤＳＦにより評価した。
２．３．ＮＭ２６バリアントの製造：
上述されるように、ＮＭ２６バリアントＰＲＯ２１９８及びＰＲＯ２１９９並びにその結合性ドメインの設計、特徴付け及び製造は、優先権文献ＥＰ２０２１６９５７．９において詳細に開示されている。
２．４．ＮＭ２８バリアントの製造：
上述されるように、ＮＭ２８参照ＰＲＯ２５６７及びＰＲＯ２６６０並びにＮＭ２８バリアントＰＲＯ２７４１、ＰＲＯ２７４５及びＰＲＯ２７４６並びにその結合性ドメインの設計、特徴付け及び製造は、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０６４４２７において詳細に開示されている。
実施例３：既存ＡＤＡ結合アッセイ
３．１．一般的なアッセイ手順：
直接的なアッセイフォーマットを使用してヒト血清中の既存抗薬物抗体を検出する方法はＮｕｍａｂにおいて開発された。
９６ウェル半区画プレートを１００ｎｇ／ｍｌの試験分子（ＭＡＴＣＨ３又はｓｃＦｖフォーマット）で２時間、室温で被覆した。プレートを１時間、０．２％のＴｗｅｅｎ（登録商標）及び１％のＢＳＡを含有するＰＢＳでブロッキングした。個々のヒト血清を次に、スパイクなし（スクリーニングアッセイ）で、又は対応するウェル中に被覆されたものと同じ分子でスパイク（確認アッセイ）して、１：２０（５％の血清）又は１：１００（１％の血清）の希釈で加えた。スパイク濃度は６０～１１５ｎＭの範囲とし、スパイクされた試料を１時間プレインキュベートした。プレート上に被覆された分子に結合した抗体を次に、１００ｎｇ／ｍｌのウサギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰを用いて１時間検出した。ＴＭＢ基質を基質として加え、短いインキュベーション後に、酵素反応を１ＭのＨＣｌで停止させた。各々のウェルの光学密度を４５０ｎｍで読み取った。
全てのステップは室温で行った。各々のステップの間に、プレートを４５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄した。ブロッキング及び洗浄ステップを除いて、全てのアッセイ成分は２５μｌ／ウェルの体積で加え、それらを二重で使用した。インキュベーションステップのために、ＥＬＩＳＡプレートを回転ミキサー（４０ｒｐｍ）に置いた。
一般に、第１ラウンドの測定は、スパイクなしのヒト血清を用いて行った（スクリーニングアッセイ）。次にスクリーニングカットポイント（ＳＣＰ）を各々のプレートについて算出した。ＳＣＰより低いシグナルを有するスパイクなしの試料を「スクリーニング陰性」と称し、確認アッセイにおいて考慮に入れなかった。ＳＣＰより高いシグナルを有するスパイクなしの試料を「スクリーニング陽性」と称した。
これらの「スクリーニング陽性」試料のほとんどを用いて、第２ラウンドの測定を、スパイクされたヒト血清を用いて行って（確認アッセイ）、それぞれの血清試料中の抗体の最初に検出された結合が試験分子に特異的であるかどうかを決定した。スパイクされたウェルにおける吸光度シグナルの減少は、初期スクリーニングアッセイのスパイクなしのウェルにおいて観察されたシグナルが、プレート上に被覆された分子に特異的であることを指し示す。特異性を裏付けるために要求される得られる阻害パーセント（阻害％）は２０～３０％に設定したか、又は確認用カットポイントを百分率で算出した（％ＣＣＰ）。後者の場合、阻害パーセントがＣＣＰより高い試料のみが陽性と確認された。阻害％は、以下：％ＣＣＰ＝初期シグナル（１－（スパイクされた血清のシグナル／スパイクなしの血清のシグナル））×１００
のようにスパイクなしの血清（スクリーニングアッセイ）について得られた初期シグナルの低減として算出した。
代替的な手順において、初期スクリーニングアッセイは行わなかった。代わりに、確認アッセイ手順を使用して試験試料を直接的に分析した。しかしながらデータ分析のために、少なくともＳＣＰ及び％ＣＣＰの算出を伴う同じ算出を行った。
３．２．スクリーニングカットポイント（ＳＣＰ）、正規化係数（ＮＦ）及びフローティングカットポイント（ＦＣＰ）の決定／算出
各々の試験化合物について、健康な未処置の対象の４０の個々のヒト血清試料を分析した。他の場合において、健康な未処置の対象の２０の個々のヒト血清試料を分析した。
スクリーニングカットポイント（ＳＣＰ）：
スクリーニングカットポイント（ＳＣＰ）は、シグナルが陽性（スクリーニング陽性）と考えられる閾値である。それは、５％の偽陽性血清が含まれるように算出される。
スクリーニングカットポイント（ＳＣＰ）は以下のように算出される：
ＳＣＰ＝平均Ｎ＋１．６４５×ＳＤＮ
式中：
－ 「平均Ｎ」は、特有の試験化合物について測定された全てのスパイクなしの個々の血清からの平均シグナルに対応し；
－ 「ＳＤＮ」は、特有の試験化合物について測定された全てのスパイクなしの個々の血清から算出された標準偏差に対応する。
正規化係数（ＮＦ）：
正規化係数（ＮＦ）は以下のように算出される：
ＮＦ＝ＳＣＰ－陰性対照の平均
式中：
－ 「ＳＣＰ」は上記に定義される通りであり；
－ 「陰性対照の平均」は、プレート当たり２重（即ち２つのウェル）で分析された陰性対照（プールされた個々のヒト血清；各々のプレート上で同じもの）からの平均シグナルに対応する。
少なくとも２つのＮＣ試料（即ち４つのウェル）が正規化係数の算出のために考慮されなければならない。
フローティングカットポイント（ＦＣＰ）の算出：
ＳＣＰ及びＮＦの決定後に、各々のプレートについてのフローティングカットポイント（ＦＣＰ）を参照カットポイントとして使用した。ＦＣＰは、プレートの陰性対照でＳＣＰを正規化することにより、各々の分析ランの分析的ばらつきを考慮に入れる。ＦＣＰは各々の分析ランについて以下のように算出される：
ＦＣＰ＝ＮＦ＋平均ＮＣ
式中：
－ 「平均ＮＣ」は陰性対照試料の平均シグナルを指し；
－ 「ＮＦ」は、上記に定義されている正規化係数を指す。
３．３．ＰＲＯ１９２２（ＭＳＬＮ結合性ｓｃＦｖ）及びＰＲＯ２２３０（ＰＤＬ１結合性ｓｃＦｖ）のバリアントについての既存ＡＤＡ結合アッセイの結果
本発明による７つのＰＲＯ１９２２バリアント及び７つのＰＲＯ２２３０バリアントを、上記される既存ＡＤＡ結合アッセイを使用してそれらの免疫原性特性について測定した。２つの参照、即ちＰＲＯ１９２２－Ｌ１２Ｓ－Ｖ１０３Ｔ－Ｌ１４４Ｔ（ＰＲＯ２９９０）及びＰＲＯ２２３０－Ｌ１２Ｓ－Ｖ１０３Ｔ－Ｌ１４４Ｔ（ＰＲＯ２９８４）もまた分析した。測定は、２０のヒト血清試料を使用して確認アッセイの構成で直接的に行った。
上記されるように、各々の個々のプレートについてＳＣＰを算出することによりデータを分析した。スクリーニング陽性の血清を次に、３０％の％ＣＣＰを考慮に入れることにより更に分析した。試験された分子についての陽性血清試料の数が表１４に要約されている。ＰＲＯ１９２２、ＰＲＯ２２３０、ＰＲＯ２９２２及びＰＲＯ２９２５についての、ヒト血清中の既存ＡＤＡの吸収レベル、及びスパイクされたヒト血清の吸光度レベルの低減の一部の例示的なグラフが図１に示される。
３．４．ＮＭ２１－１４８０（ＰＲＯ１４８０）バリアントについての既存ＡＤＡ結合アッセイの結果：
参照としてのＮＭ２１－１４８０（ＰＲＯ１４８０）を含む８つのＮＭ２１－１４８０バリアントを、上記される既存ＡＤＡ結合アッセイを使用してそれらの免疫原性特性について測定した。測定は、４０のヒト血清試料を使用して確認アッセイの構成で直接的に行った。
上記されるように、ＳＣＰを算出することによりデータを分析した。スクリーニング陽性の血清を次に、３１．５６％の％ＣＣＰを考慮に入れることにより更に分析した。％ＣＣＰは、全ての測定からのデータを使用して上記されるように算出した。各々の試験された分子についての陽性血清試料の数が表１５に要約されている。ＰＲＯ１４８０及びＰＲＯ２７６４についてのヒト血清中の既存ＡＤＡの吸収レベルの一部の例示的なグラフが図２に示される。
３．５．ＮＭ２８バリアントについての既存ＡＤＡ結合アッセイの結果：
ＮＭ２８バリアントＰＲＯ２７４１及び、比較として、対応する非改変参照ＰＲＯ２６６０を、上記される既存ＡＤＡ結合アッセイを使用してそれらの免疫原性特性について測定した。測定は、２０のヒト血清試料を使用して確認アッセイの構成で直接的に行った。
スクリーニング陽性の血清を次に、３０％の％ＣＣＰを考慮に入れることにより更に分析した。各々の試験された分子についての陽性血清試料の数が表１６に要約されている。ＰＲＯ２７４１及び参照ＰＲＯ２６６０についての、ヒト血清中の既存ＡＤＡの吸収レベル、及びスパイクされたヒト血清の吸光度レベルの低減（ＡＤＡ結合阻害）のグラフが図３に示される。
３．６．ＮＭ３２バリアントについての既存ＡＤＡ結合アッセイの結果：
ＮＭ３２バリアントＰＲＯ２６６８及びＰＲＯ２６６９並びに、比較として、対応する非改変参照ＰＲＯ２５１０及びＰＲＯ２５８９を、上記される既存ＡＤＡ結合アッセイを使用してそれらの免疫原性特性について測定した。測定は、２０（ＰＲＯ２５８９の場合に１９）のヒト血清試料を使用して確認アッセイの構成で直接的に行った。
スクリーニング陽性の血清を次に、３０％の％ＣＣＰを考慮に入れることにより更に分析した。各々の試験された分子についての陽性血清試料の数が表１７に要約されている。ＰＲＯ２７４１及び参照ＰＲＯ２６６０についての、ヒト血清中の既存ＡＤＡの吸収レベル、及びスパイクされたヒト血清の吸光度レベルの低減（ＡＤＡ結合阻害）のグラフが図４に示される。

Claims (16)

  1. 標的抗原に特異的に結合する抗体可変ドメインであって、
    （ｉ）Ｎ末端からＣ末端へ、領域ＨＦＷ１－ＨＣＤＲ１－ＨＦＷ２－ＨＣＤＲ２－ＨＦＷ３－ＨＣＤＲ３－ＨＦＷ４を含む可変重鎖（ＶＨ）であって、各々のＨＦＷが重鎖フレームワーク領域を指定し、並びに各々のＨＣＤＲが重鎖相補性決定領域を指定し、
    前記可変重鎖フレームワーク領域ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４がＶＨフレームワークサブタイプから選択され、並びに前記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４が、以下の置換（ＡＨｏ番号付け）：
    － １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）；
    － １４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）；
    － １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）及び１０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）；
    － １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）及び１４４位のアミノ酸における（Ｑ）；
    － １０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）及び１４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）；又は
    － １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）；１０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）及び１４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）
    のうちの１つを有する、
    前記ＶＨ；
    （ｉｉ）可変軽鎖（ＶＬ）であって、前記可変軽鎖が、Ｎ末端からＣ末端へ、領域ＬＦＷ１－ＬＣＤＲ１－ＬＦＷ２－ＬＣＤＲ２－ＬＦＷ３－ＬＣＤＲ３－ＬＦＷ４を含み、各々のＬＦＷが軽鎖フレームワーク領域を指定し、並びに各々のＬＣＤＲが軽鎖相補性決定領域を指定し、並びに
    ａ．前記可変軽鎖フレームワーク領域ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３及びＬＦＷ４がヒト抗体Ｖκフレームワークサブタイプから選択されるか；又は
    ｂ．前記可変軽鎖フレームワーク領域ＬＦＷ１、ＬＦＷ２及びＬＦＷ３がヒト抗体Ｖκフレームワークサブタイプから選択され、並びに前記可変軽鎖フレームワーク領域ＬＦＷ４がＶλフレームワークサブタイプから選択される、
    前記ＶＬ
    を含む、前記抗体可変ドメイン。
  2. 前記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４が、以下の置換（ＡＨｏ番号付け）：
    － １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）；
    － １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）及び１４４位のアミノ酸における（Ｑ）；又は
    － １２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）、１０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）及び１４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）
    のうちの１つを有し；
    特には前記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４が、以下の置換（ＡＨｏ番号付け）：１２位のアミノ酸におけるアルギニン（Ｒ）、１０３位のアミノ酸におけるスレオニン（Ｔ）、及び１４４位のアミノ酸におけるグルタミン（Ｑ）を有する、
    請求項１に記載の抗体可変ドメイン。
  3. 前記可変重鎖フレームワーク領域ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４が、ＶＨフレームワークサブタイプＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ、ＶＨ３又はＶＨ４から、特にＶＨフレームワークサブタイプＶＨ３から選択され；及び前記ヒト抗体ＶκフレームワークサブタイプがＶκ１フレームワークサブタイプから選択される、請求項１又は２に記載の抗体可変ドメイン。
  4. 前記可変重鎖フレームワーク領域ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４が、
    ａ．配列番号３、４、８、９、１３、１４、１９、２０、２５、２６、３１、３２、３５、３６、３７、４２、４３、４４、６０、６３、７１、７２、７６、７７、８１、９５、９６、９９、１００、１１６及び１１７のうちのいずれか１つのフレームワーク領域（即ち、表１、２及び４における斜体ではない残基）；並びに
    ｂ．１２、１０３及び１４４（ＡＨｏ番号付け）とは異なる位置においてフレームワーク領域内に１、２又は３つの突然変異を有する配列番号３、４、８、９、１３、１４、１９、２０、２５、２６、３１、３２、３５、３６、３７、４２、４３、４４、６０、６３、７１、７２、７６、７７、８１、９５、９６、９９、１００、１１６及び１１７のうちのいずれか１つの前記フレームワーク領域（即ち、表１、２及び４における斜体ではない残基）
    から選択され；
    並びに前記可変軽鎖フレームワーク領域ＬＦＷ１、ＬＦＷ２及びＬＦＷ３、及び、ＬＦＷ４がヒト抗体Ｖκフレームワークサブタイプから選択される場合に、ＬＦＷ４が、
    ａ．配列番号５、１０、１５、１６、２１、２２、２７、２８、３３、３４、３８、３９、４０、４１、４５、４６、４７、４８、６１、６４、７３、７４、７８、７９、８２、９７、９８、１０１、１０２、１１８及び１１９のうちのいずれか１つのフレームワーク領域（即ち、表１、２及び４における斜体ではない残基）；並びに
    ｂ．フレームワーク領域内に１、２又は３つの突然変異を有する配列番号５、１０、１５、１６、２１、２２、２７、２８、３３、３４、３８、３９、４０、４１、４５、４６、４７、４８、６１、６４、７３、７４、７８、７９、８２、９７、９８、１０１、１０２、１１８及び１１９のうちのいずれか１つの前記フレームワーク領域（即ち、表１、２及び４における斜体ではない残基）
    から選択される、
    請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体可変ドメイン。
  5. 前記可変軽鎖フレームワーク領域ＬＦＷ４がＶλフレームワークサブタイプから選択され、特には配列番号１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０及び１３１からなる群から選択される配列のうちの１つを有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体可変ドメイン。
  6. 請求項１～５のいずれか一項に定義される１つ以上の抗体可変ドメインを含む抗体。
  7. （ｉ）単一特異性であり、及びその標的抗原について一価、二価若しくは三価であるか；
    （ｉｉ）二特異性であり、及び、互いから独立して、各々の標的抗原について一価若しくは二価であるか；
    （ｉｉｉ）三特異性であり、及び各々の標的抗原について一価であるか；
    （ｉｖ）三特異性であり、並びに前記標的抗原のうちの１つについて二価であり、及び他の標的抗原について一価であるか；
    （ｖ）三特異性であり、並びに前記標的抗原のうちの２つについて二価であり、及び第３の標的抗原について一価であるか；
    （ｖｉ）四特異性であり、及び各々の標的抗原について一価であるか；
    （ｖｉｉ）四特異性であり、並びに前記標的抗原のうちの１つについて二価であり、及び他の標的抗原について一価であるか；又は
    （ｖｉｉｉ）四特異性であり、並びに前記標的抗原のうちの２つについて二価であり、及び他の標的抗原について一価である、
    請求項６に記載の抗体。
  8. 前記抗体のフォーマットが、二価二特異性ＩｇＧフォーマット、三価二特異性ＩｇＧフォーマット及び四価二特異性ＩｇＧフォーマットから選択され；
    より特には前記抗体のフォーマットが、ＫｉＨベースＩｇＧ；ＤＶＤ－Ｉｇ；ＣＯＤＶ－ＩｇＧ及びＭｏｒｒｉｓｏｎ（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合物（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ－Ｈ）又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合物（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ－Ｌ））から、よりいっそう特にはＤＶＤ－Ｉｇ及びＭｏｒｒｉｓｏｎ（ＩｇＧ ＣＨ３－ｓｃＦｖ融合物（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ－Ｈ）又はＩｇＧ ＣＬ－ｓｃＦｖ融合物（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ－Ｌ））から選択される、
    請求項６又は７に記載の抗体。
  9. 前記抗体が免疫グロブリンＦｃ領域を含まず、並びに前記抗体がＣＨ１及び／又はＣＬ領域をさらに含まず、特には前記抗体が、ｓｃＤｂ－ｓｃＦｖ、トリアボディ、テトラボディ又はＭＡＴＣＨフォーマットであり、より特には前記抗体がＭＡＴＣＨ又はｓｃＤｂ－ｓｃＦｖフォーマットであり、より特には前記抗体がＭＡＴＣＨフォーマット、より特にはＭＡＴＣＨ３又はＭＡＴＣＨ４フォーマットである、請求項６又は７に記載の抗体。
  10. 前記抗体が、三特異性であり、及び各々の標的抗原について一価であり、並びに前記抗体が、
    １）ａ）配列番号１のＶＨ配列及び配列番号５のＶＬ配列；
    ｂ）配列番号２のＶＨ配列及び配列番号５のＶＬ配列；
    ｃ）配列番号３のＶＨ配列及び配列番号５のＶＬ配列；若しくは
    ｄ）配列番号４のＶＨ配列及び配列番号５のＶＬ配列
    を含む、ＣＤ１３７に特異的に結合する１つの結合性ドメイン（ＣＤ１３７－ＢＤ）；
    ２）ａ）配列番号１１のＶＨ配列及び配列番号１５のＶＬ配列；
    ｂ）配列番号１２のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列；
    ｃ）配列番号１３のＶＨ配列及び配列番号１５のＶＬ配列；若しくは
    ｄ）配列番号１４のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列
    を含む、ＰＤＬ１に特異的に結合する１つの結合性ドメイン（ＰＤＬ１－ＢＤ）；
    ３）ａ）配列番号２３のＶＨ配列及び配列番号２７のＶＬ配列；
    ｂ）配列番号２４のＶＨ配列及び配列番号２８のＶＬ配列；
    ｃ）配列番号２５のＶＨ配列及び配列番号２７のＶＬ配列；若しくは
    ｄ）配列番号２６のＶＨ配列及び配列番号２８のＶＬ配列
    を含む、１つのヒト血清アルブミン結合性ドメイン（ｈＳＡ－ＢＤ）
    を含み；
    但し、前記３つの結合性ドメインのうちの少なくとも１つが、ｃ）若しくはｄ）から選択されるＶＨ／ＶＬ配列ペアを含むか；
    又は前記抗体が、
    １）ａ）配列番号６のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列；
    ｂ）配列番号７のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列；
    ｃ）配列番号８のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列；若しくは
    ｄ）配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列
    を含む、ＣＤ１３７に特異的に結合する１つの結合性ドメイン（ＣＤ１３７－ＢＤ）；
    ２）ａ）配列番号１７のＶＨ配列及び配列番号２１のＶＬ配列；
    ｂ）配列番号１８のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列；
    ｃ）配列番号１９のＶＨ配列及び配列番号２１のＶＬ配列；若しくは
    ｄ）配列番号２０のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列
    を含む、ＰＤＬ１に特異的に結合する１つの結合性ドメイン（ＰＤＬ１－ＢＤ）；並びに
    ３）ａ）配列番号２９のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列；
    ｂ）配列番号３０のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列；
    ｃ）配列番号３１のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列；若しくは
    ｄ）配列番号３２のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列
    を含む、１つのヒト血清アルブミン結合性ドメイン（ｈＳＡ－ＢＤ）
    を含み；
    但し、前記３つの結合性ドメインのうちの少なくとも１つが、ｃ）若しくはｄ）から選択されるＶＨ／ＶＬ配列ペアを含む、
    請求項９に記載の抗体。
  11. ＣＤ１３７に特異的に結合し、並びに
    ａ）配列番号３のＶＨ配列及び配列番号５のＶＬ配列；
    ｂ）配列番号４のＶＨ配列及び配列番号５のＶＬ配列；
    ｃ）配列番号８のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列；若しくは
    ｄ）配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列
    を含む、請求項１～５のいずれか一項に定義される抗体可変ドメイン；
    又は
    ＰＤＬ１に特異的に結合し、並びに
    ａ）配列番号１３のＶＨ配列及び配列番号１５のＶＬ配列；
    ｂ）配列番号１４のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列；
    ｃ）配列番号１９のＶＨ配列及び配列番号２１のＶＬ配列；若しくは
    ｄ）配列番号２０のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列
    を含む、請求項１～５のいずれか一項に定義される抗体可変ドメイン；
    又は
    ヒト血清アルブミンに特異的に結合し、並びに
    ａ）配列番号２５のＶＨ配列及び配列番号２７のＶＬ配列；
    ｂ）配列番号２６のＶＨ配列及び配列番号２８のＶＬ配列；
    ｃ）配列番号３１のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列；若しくは
    ｄ）配列番号３２のＶＨ配列及び配列番号３４のＶＬ配列
    を含む、請求項１～５のいずれか一項に定義される抗体可変ドメイン；
    又は
    ヒト血清アルブミンに特異的に結合し、並びに
    ａ）配列番号３５のＶＨ配列及び配列番号３８のＶＬ配列；
    ｂ）配列番号３６のＶＨ配列及び配列番号３９のＶＬ配列；
    ｃ）配列番号３６のＶＨ配列及び配列番号４１のＶＬ配列；
    ｄ）配列番号３７のＶＨ配列及び配列番号４０のＶＬ配列；
    ｅ）配列番号４２のＶＨ配列及び配列番号４５のＶＬ配列；
    ｆ）配列番号４３のＶＨ配列及び配列番号４６のＶＬ配列；
    ｇ）配列番号４３のＶＨ配列及び配列番号４８のＶＬ配列；若しくは
    ｈ）配列番号４４のＶＨ配列及び配列番号４７のＶＬ配列
    を含む、請求項１～５のいずれか一項に定義される抗体可変ドメイン。
  12. 請求項１～５若しくは１１のいずれか一項に記載の抗体可変ドメイン、又は請求項６～１０のいずれか一項に記載の抗体をコードする１つの核酸又は２つの核酸。
  13. 請求項１２に記載の１つの核酸又は２つの核酸を含む１つのベクター又は２つのベクター。
  14. 請求項１３に記載の１つのベクター又は２つのベクターを含む１つの宿主細胞又は複数の宿主細胞。
  15. 請求項１～５若しくは１１のいずれか一項に記載の抗体可変ドメイン、又は請求項６～１０のいずれか一項に記載の抗体を製造する方法であって、（ｉ）請求項１２に記載の１つの核酸若しくは２つの核酸、若しくは請求項１３に記載の１つのベクター若しくは２つのベクターを用意すること、前記１つの核酸配列若しくは複数の核酸、若しくは前記１つのベクター若しくは複数のベクターを発現させること、及び発現システムから前記抗体可変ドメイン若しくは前記抗体を収集すること、又は（ｉｉ）請求項１４に記載の１つの宿主細胞若しくは複数の宿主細胞を用意すること、前記１つの宿主細胞若しくは前記複数の宿主細胞を培養すること；及び細胞培養物から前記抗体可変ドメイン若しくは前記抗体を収集することを含む、前記方法。
  16. 請求項６～１０のいずれか一項に記載の抗体及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
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