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JP2023535332A - 好中球セリンプロテアーゼを抽出するおよびジペプチジルペプチダーゼ１媒介性病態を治療するための方法 - Google Patents

好中球セリンプロテアーゼを抽出するおよびジペプチジルペプチダーゼ１媒介性病態を治療するための方法 Download PDF

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Abstract

対象から獲得された白血球（WBC）を含むサンプルから、１種または複数の好中球セリンプロテアーゼ（NSP）、例えば好中球エラスターゼ（NE）、プロテイナーゼ３（PR3）、カテプシンＧ（CatG）、好中球セリンプロテアーゼ４（NSP4）、またはその組み合わせを抽出するための方法が提供される。抽出方法は、非イオン性界面活性剤の使用、ならびにＷＢＣおよびそれらの残留物の２回以上のサイクルの繰り返しの溶解を特色とする。ジペプチジルペプチダーゼ１（DPP1）活性を可逆的に阻害する、その薬学的に許容される塩を含めた式（Ｉ）のある特定のＮ－（１－シアノ－２－フェニルエチル）－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド化合物を含む組成物を用いて、患者におけるＤＰＰ１媒介性病態を治療するための方法も提供される。本明細書において提供される治療方法は、患者のＷＢＣサンプルから抽出された活性ＮＳＰの濃度をバイオマーカーとして使用して、式（Ｉ）の化合物の有効投薬量の選択またはその調整をガイドする。【化１】TIFF2023535332000054.tif65117

Description

[0001] 関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年７月２０日に出願された米国仮出願第６３／０５３，９３９号、および２０２１年６月２８日に出願された米国仮出願第６３／２１５，５９９号からの優先権を主張するものであり、そのそれぞれの開示は本明細書における参照によりその全体として組み入れられる。
[0002] 好中球セリンプロテアーゼ（NSP）は、好中球のアズール顆粒の内側に存在する。広範な基質特異性を有して、ＮＳＰは好中球の機能に重要であり、細菌感染からの免疫保護においておよび炎症性病態の調節において主要な役割を果たす。公知のＮＳＰは、好中球エラスターゼ（NE）、プロテイナーゼ３（PR3）、カテプシンＧ（CatG）、および好中球セリンプロテアーゼ４（NSP4）を含む。古典的ＮＳＰ、すなわちＮＥ、ＰＲ３、およびＣａｔＧは、好中球分化の前骨髄球段階の間に不活性チモーゲンとして合成され、それは、アミノ末端におけるタンパク質分解的プロセシングを介して、システインプロテアーゼのジペプチジルペプチダーゼ１（DPP1；カテプシンCとしても知られる）によって活性化される。最近発見されたが、ＮＳＰ４は、ＮＥおよびＰＲ３と３９％の同一性を有し、好中性顆粒球および骨髄前駆細胞において制限された発現を呈する。ＮＥ、ＰＲ３、およびＣａｔＧのように、ＮＳＰ４は、アミノ末端におけるタンパク質分解的プロセシングを介して、ＤＰＰ１によって活性プロテアーゼに変換される。Ｐｈａｍら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６：５４１－５５０（２００６）；Ｐｅｒｅｒａら、ＰＮＡＳ、１０９：６２２９－６２３４（２０１２）を参照されたく、そのそれぞれはすべての目的上参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。
[0003] ＮＳＰは、様々な疾患経路に関わるため、血液サンプル由来の活性ＮＳＰの濃度を有効に測定する能力は、疾患進行についての洞察を提供し得、バイオマーカーとして働き得る。本発明は、このおよび他の必要性に取り組む。
[0004] １つの態様において、本出願は、対象から獲得された白血球（WBC）を含むサンプルから１種または複数の好中球セリンプロテアーゼ（NSP）を抽出する方法に関する。方法は、
サンプルと、少なくとも０．０１％（v/v）の第１の非イオン性界面活性剤を含む第１の水性媒体とを接触させて、第１のＮＳＰ抽出物を含む第１の細胞溶解物および第１のＷＢＣ残留物を獲得する工程であって、第１のＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程、
第１のＷＢＣ残留物から第１の細胞溶解物を分離して、第１のＮＳＰ抽出物を含む第１の分離された細胞溶解物を提供する工程、
第１のＷＢＣ残留物と、少なくとも０．０１％（v/v）の第２の非イオン性界面活性剤を含む第２の水性媒体とを接触させて、第２のＮＳＰ抽出物を含む第２の細胞溶解物および第２のＷＢＣ残留物を獲得する工程であって、第２のＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程、ならびに
第２のＷＢＣ残留物から第２の細胞溶解物を分離して、第２のＮＳＰ抽出物を含む第２の分離された細胞溶解物を提供する工程
を含む。
[0005] 方法の一部の実施形態において、付加的な繰り返しの溶解工程が行われる。１つの実施形態において、方法は、第２のＷＢＣ残留物と、少なくとも０．０１％（v/v）の第３の非イオン性界面活性剤を含む第３の水性媒体とを接触させて、第３のＮＳＰ抽出物を含む第３の細胞溶解物および第３のＷＢＣ残留物を獲得する工程であって、第３のＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程、ならびに第３のＷＢＣ残留物から第３の細胞溶解物を分離して、第３のＮＳＰ抽出物を含む第３の分離された細胞溶解物を提供する工程、をさらに含む。さらなる実施形態において、方法は、第３のＷＢＣ残留物と、少なくとも０．０１％（v/v）の第４の非イオン性界面活性剤を含む第４の水性媒体とを接触させて、第４のＮＳＰ抽出物を含む第４の細胞溶解物および第４のＷＢＣ残留物を獲得する工程であって、第４のＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程、ならびに第４のＷＢＣ残留物から第４の細胞溶解物を分離して、第４のＮＳＰ抽出物を含む第４の分離された細胞溶解物を提供する工程、を含む。さらにさらなる実施形態において、方法は、第４のＷＢＣ残留物と、少なくとも０．０１％（v/v）の第５の非イオン性界面活性剤を含む第５の水性媒体とを接触させて、第５のＮＳＰ抽出物を含む第５の細胞溶解物および第５のＷＢＣ残留物を獲得する工程であって、第５のＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程、ならびに第５のＷＢＣ残留物から第５の細胞溶解物を分離して、第５のＮＳＰ抽出物を含む第５の分離された細胞溶解物を提供する工程、を含む。なおさらなる実施形態において、方法は、第５のＷＢＣ残留物と、少なくとも０．０１％（v/v）の第６の非イオン性界面活性剤を含む第６の水性媒体とを接触させて、第６のＮＳＰ抽出物を含む第６の細胞溶解物および第６のＷＢＣ残留物を獲得する工程であって、第６のＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程、ならびに第６のＷＢＣ残留物から第６の細胞溶解物を分離して、第６のＮＳＰ抽出物を含む第６の分離された細胞溶解物を提供する工程、を含む。
[0006] 方法の１つの実施形態において、水性媒体のいずれか１種に存在する非イオン界面活性剤は、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤、例えばオクチルフェノキシポリエトキシエタノール、２－［４－（２，４，４－トリメチルペンタン－２－イル）フェノキシ］エタノール、ポリオキシエチレン（９）ノニルフェニルエーテル（分岐）、またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートである。さらなる実施形態において、水性媒体のいずれか１種に存在する界面活性剤はオクチルフェノキシポリエトキシエタノールである。
[0007] ２回以上の繰り返しの溶解工程が行われる方法の１つの実施形態において、各溶解工程に使用される水性媒体に存在する非イオン性界面活性剤は同じである。別の実施形態において、使用される水性媒体の少なくとも２種に存在する非イオン性界面活性剤は異なる。水性媒体に存在する界面活性剤の同一性にかかわらず、１つの実施形態において、各溶解工程に使用される水性媒体に存在する非イオン性界面活性剤の濃度は同じである。別の実施形態において、使用される水性媒体の少なくとも２種における非イオン性界面活性剤の濃度は異なる。
[0008] 方法の１つの実施形態において、使用される水性媒体のすべて（例えば、実施される繰り返しの溶解工程の数に応じて、第１の水性媒体、第２の水性媒体、第３の水性媒体等のすべて）は、同じ水性媒体である。別の実施形態において、水性媒体の少なくとも２種は異なる。
[0009] 方法の１つの実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせは、少なくとも０．０２％（v/v）のそれぞれの第１、第２、第３、第４、第５、または第６の非イオン性界面活性剤を含む。別の実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせは、少なくとも０．０５％（v/v）のそれぞれの第１、第２、第３、第４、第５、または第６の非イオン性界面活性剤を含む。別の実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせは、約０．０２％（v/v）～約１．５％（v/v）のそれぞれの第１、第２、第３、第４、第５、または第６の非イオン性界面活性剤を含む。別の実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせは、約０．０３％（v/v）～約１％（v/v）のそれぞれの第１、第２、第３、第４、第５、または第６の非イオン性界面活性剤を含む。別の実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせは、約０．０４％（v/v）～約０．８％（v/v）のそれぞれの第１、第２、第３、第４、第５、または第６の非イオン性界面活性剤を含む。別の実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせは、約０．０５％（v/v）～約０．６％（v/v）のそれぞれの第１、第２、第３、第４、第５、または第６の非イオン性界面活性剤を含む。別の実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせは、約０．０５％（v/v）のそれぞれの第１、第２、第３、第４、第５、または第６の非イオン性界面活性剤を含む。さらなる実施形態において、それぞれの第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の非イオン性界面活性剤、またはその組み合わせは、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤である。さらなる実施形態において、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤はオクチルフェノキシポリエトキシエタノールである。さらなる実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせは、約０．０５％（v/v）のオクチルフェノキシポリエトキシエタノール、約０．７５Ｍ ＮａＣｌ、および約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む。
[0010] 方法の１つの実施形態において、ＷＢＣを含むサンプルを、約０℃～約１０℃の温度で第１の水性媒体と接触させる。別の実施形態において、ＷＢＣ残留物（例えば、第１、第２、第３、第４、または第５のWBC残留物）を、約０℃～約１０℃の温度で相当する水性媒体と接触させる。
[0011] 方法の１つの実施形態において、ＷＢＣを含むサンプルと第１の水性媒体とを接触させる工程は、サンプルと第１の水性媒体とを混合する工程を含む。さらなる実施形態において、サンプルと第１の水性媒体とを混合する工程は、サンプルと第１の水性媒体とを撹拌する工程を含む。別の実施形態において、ＷＢＣ残留物（例えば、第１、第２、第３、第４、または第５のWBC残留物）と相当する水性媒体とを接触させる工程は、ＷＢＣ残留物と相当する水性媒体とを混合する工程を含む。さらなる実施形態において、ＷＢＣ残留物と相当する水性媒体とを混合する工程は、ＷＢＣ残留物と相当する水性媒体とを撹拌する工程を含む。上で述べられる撹拌する工程は、ピペッティングする、ボルテックスする、振とうする、かき混ぜることによって、または米国薬局方（USP）装置２等のパドルを使用して行われ得る。
[0012] 方法の１つの実施形態において、サンプルと第１の水性媒体とを接触させる工程は、サンプルに水性洗浄溶液を添加して、水性洗浄溶液とサンプルとの混合物を形成する工程、水性洗浄溶液とサンプルとの混合物を遠心分離して、上清（すなわち、洗浄画分）とＷＢＣを含むペレットとを提供する工程、上清を収集する工程、およびペレットと第１の水性媒体とを接触させる工程を含む。１つの実施形態において、水性洗浄溶液はリン酸緩衝生理食塩溶液である。別の実施形態において、水性洗浄溶液は、約０．９％ＮａＣｌを含む生理食塩溶液である。別の実施形態において、水性洗浄溶液は、Ｔｒｉｓベースのアルカリ性緩衝液およびＮａＣｌを含む。さらなる実施形態において、水性洗浄溶液は、約１００ｍＭ Ｔｒｉｓおよび約１００ｍＭ ＮａＣｌを含み、約７．５のｐＨを有する。さらなる実施形態において、上清（すなわち、洗浄画分）は１種または複数のＮＳＰを含み、方法は、上清の１種または複数のＮＳＰの活性形態の濃度を測定する工程をさらに含む。
[0013] 方法の１つの実施形態において、方法は、個々の分離された細胞溶解物（例えば、第１、第２、第３、第４、第５、または第６の分離された細胞溶解物）の１種または複数のＮＳＰの活性形態の濃度を測定する工程をさらに含む。代替的にまたは付加的に、方法は、２種以上の分離された細胞溶解物を組み合わせて、１種または複数のＮＳＰを含有するプールされたＮＳＰ抽出物を含むプールされた細胞溶解物を提供する工程、任意選択によりそれに続く、プールされたＮＳＰ抽出物を含むプールされた細胞溶解物の１種または複数のＮＳＰの活性形態の濃度を測定する工程を含む。例示的な実施形態において、方法は、分離された細胞溶解物のすべてを組み合わせて、単一のプールされた細胞溶解物を提供する工程を含む。さらなる実施形態において、単一のプールされた細胞溶解物の１種または複数のＮＳＰの活性形態の濃度を測定する。
[0014] 方法の１つの実施形態において、１種または複数のＮＳＰは、好中球エラスターゼ（NE）、プロテイナーゼ３（PR3）、カテプシンＧ（CatG）、好中球セリンプロテアーゼ４（NSP4）、またはその組み合わせを含む。別の実施形態において、１種または複数のＮＳＰはＮＥを含む。別の実施形態において、１種または複数のＮＳＰはＰＲ３を含む。別の実施形態において、１種または複数のＮＳＰはＣａｔＧを含む。別の実施形態において、１種または複数のＮＳＰはＮＳＰ４を含む。
[0015] 方法の１つの実施形態において、対象はヒト対象である。
[0016] 別の態様において、本開示は、それを必要とする患者におけるＤＰＰ１媒介性病態を治療する方法に関する。方法は、
（a）患者から獲得された白血球を含む第１のサンプルから抽出された１種または複数のＮＳＰの活性形態のベースライン濃度を測定する工程、
（b）式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の約１０ｍｇ～約４０ｍｇの第１の１日投薬量を含む薬学的組成物を、約２週間～約１６週間の第１の投与期間毎日患者に経口投与する工程、
Figure 2023535332000002
 （式中、Ｒ１は、
Figure 2023535332000003
 であり；
Ｒ２は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＳＯ２Ｃ１～３アルキル、またはＣ１～３アルキルであり；
Ｒ３は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＳＯ２Ｃ１～３アルキル、ＣＯＮＨ２、またはＳＯ２ＮＲ４Ｒ５（式中、Ｒ４およびＲ５は、それらが付着される窒素原子とともにアゼチジン、ピロリジン、またはピペリジン環を形成する）であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＦ２であり；
Ｙは、ＯまたはＳであり；
Ｑは、ＣＨまたはＮであり；
Ｒ６はＣ１～３アルキルであり、Ｃ１～３アルキルは、任意選択により１、２、または３個のＦによって、任意選択によりＯＨ、ＯＣ１～３アルキル、Ｎ（Ｃ１～３アルキル）２、シクロプロピル、またはテトラヒドロピランから選択される１種の置換基によって置換されており；
Ｒ７は、水素、Ｆ、Ｃｌ、またはＣＨ３である）；
（c）白血球を含む第２のサンプルから抽出された１種または複数のＮＳＰの活性形態の濃度を測定する工程であって、第２のサンプルは、第１の投与期間の間または第１の投与期間の約１週間以下後に患者から獲得される、工程、
（d）第２のサンプルからの濃度と、第１のサンプルからのベースライン濃度とを比較し；
第２のサンプルからの濃度が、第１のサンプルからのベースライン濃度と比較して約１０％以上低下した場合には、式（Ｉ）の化合物もしくはその薬学的に許容される塩の第１の１日投薬量と同じ１日投薬量を、第２の投与期間毎日患者に経口投与する工程、または
第２のサンプルからの濃度が、第１のサンプルからのベースライン濃度と比較して約１０％以上低下しなかった場合には、式（Ｉ）の化合物もしくはその薬学的に許容される塩の第２の１日投薬量を、第２の投与期間毎日患者に経口投与する工程であって、第２の１日投薬量は、第１の１日投薬量の約１．５倍～約７倍である、工程
を含む。
[0017] 方法の一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の第１の１日投薬量は、約１０ｍｇ～約２５ｍｇ、約１０ｍｇ～約１５ｍｇ、約１０ｍｇ～約１２ｍｇ、約１６ｍｇ～約２５ｍｇ、または約２０ｍｇ～約２５ｍｇである。
[0018] 方法の一部の実施形態において、第２の１日投薬量は、第１の１日投薬量の約１．５倍～約６倍、約１．５倍～約５倍、約１．５倍～約４倍、約１．５倍～約３倍、または約１．５倍～約２倍である。
[0019] 方法の一部の実施形態において、第１の投与期間は、約２週間～約１２週間、約２週間～約８週間、約３週間～約６週間、約３週間～約５週間、例えば約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間である。
[0020] 方法の一部の実施形態において、第２のサンプルは、第１の投与期間の間に患者から獲得される。例えば、第２のサンプルは、第１の投与期間の終了時に、または第１の投与期間の終了の約１、２、３、４、５、６、もしくは７日前に患者から獲得され得る。１つの実施形態において、第１の投与期間は約４週間であり、第２のサンプルは、第１の投与期間の間の約４週間の時点で患者から獲得される。
[0021] 方法の一部の実施形態において、第２のサンプルは、第１の投与期間の約１週間後に患者から獲得される。他の実施形態において、第２のサンプルは、第１の投与期間の約１、２、３、４、５、６、または７日後に患者から獲得される。
[0022] 方法の１つの実施形態において、１種または複数のＮＳＰはＮＥを含む。さらなる実施形態において、第２のサンプル由来のＮＥの活性形態の濃度が、第１のサンプル由来のＮＥの活性形態のベースライン濃度と比較して約１９％以上低下した場合には、式（Ｉ）の化合物もしくはその薬学的に許容される塩の第１の１日投薬量と同じ１日投薬量を、第２の投与期間毎日経口投与する、または第２のサンプル由来のＮＥの活性形態の濃度が、第１のサンプル由来のＮＥの活性形態のベースライン濃度と比較して約１９％以上低下しなかった場合には、式（Ｉ）の化合物もしくはその薬学的に許容される塩の第２の１日投薬量を、第２の投与期間毎日経口投与する。
[0023] 方法の一部の実施形態において、第２の投与期間は、少なくとも１カ月間、例えば約１カ月間～約２４カ月間、約１カ月間～約１２カ月間、約５カ月間～約２４カ月間、約５カ月間～約１８カ月間、または約５カ月間～約１５カ月間、約３カ月間～約６カ月間、約６カ月間～約１２カ月間、約１２カ月間～約１８カ月間、または約１２カ月間～約２４カ月間である。
[0024] 方法の１つの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、本明細書においてその国際一般名（INN）のブレンソカチブ（以前はINS1007およびAZD7986として知られていた）によって称される（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド
Figure 2023535332000004
 またはその薬学的に許容される塩である。
[0025] 方法の１つの実施形態において、ＤＰＰ１媒介性病態は気道の閉塞性疾患である。１つの実施形態において、気道の閉塞性疾患は気管支拡張症である。さらなる実施形態において、気管支拡張症は非嚢胞性線維症気管支拡張症である。別の実施形態において、気道の閉塞性疾患は嚢胞性線維症である。別の実施形態において、気道の閉塞性疾患はアルファ－１アンチトリプシン欠乏症である。
[0026] 方法の１つの実施形態において、ＤＰＰ１媒介性病態は、癌、例えば乳癌、膀胱癌、肺癌、脳腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肝臓癌、肝細胞癌腫、腎臓癌、胃癌、皮膚癌、線維性癌（fibroid cancer）、リンパ腫、ウイルス誘導性癌、口腔咽頭癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、黒色腫、および骨癌である。さらなる実施形態において、癌は、転移性癌、例えば転移性乳癌である。さらなる実施形態において、癌は、肺、脳、骨、膵臓、リンパ節、および／または肝臓への乳癌の転移を含む転移性乳癌である。
[0027]０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００（IUPAC名：２－［４－（２，４，４－トリメチルペンタン－２－イル）フェノキシ］エタノール）溶解緩衝液（０．０２％Triton）、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液（１％Triton）、Ａｂｃａｍ溶解緩衝液（Abcam）、第１の溶解工程の間のＡｂｃａｍ溶解緩衝液の後、第２の溶解工程の間の１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液（Abcam後に１０％Triton）を用いたＷＢＣペレットの溶解後、ＮＥ反応速度論アッセイによって測定され、起源となる全血の容積に対して正規化された活性ＮＥの濃度として表現された、活性ＮＥの回収、または第１の溶解工程の間のＡｂｃａｍ溶解緩衝液および第２の溶解工程の間の１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を用いた活性ＮＥの組み合わせ回収（組み合わせ）を示したグラフである。上述の溶解緩衝液の処方は表１Ａに示されている。 [0028]０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液（０．０２％Triton）、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液（１％Triton）、Ａｂｃａｍ溶解緩衝液（Abcam）、第１の溶解工程の間のＡｂｃａｍ溶解緩衝液の後、第２の溶解工程の間の１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液（Abcam後に１０％Triton）を用いたＷＢＣペレットの溶解後、ＰＲ３反応速度論アッセイによって測定され、起源となる全血の容積に対して正規化された活性ＰＲ３の濃度として表現された、活性ＰＲ３の回収、または第１の溶解工程の間のＡｂｃａｍ溶解緩衝液および第２の溶解工程の間の１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を用いた活性ＰＲ３の組み合わせ回収（組み合わせ）を示したグラフである。上述の溶解緩衝液の処方は表１Ａに示されている。 [0029]サンプル群Ａ～ＣのＷＢＣペレットからのＮＥの多抽出、またはサンプル群ＤおよびＥのＷＢＣペレットからのＮＥの単一抽出の後、ＮＥ反応速度論アッセイによって測定され、起源となる全血の容積に対して正規化された、細胞溶解物において回収された活性ＮＥの濃度を示したグラフである。サンプル群Ａ～Ｃの各データセットにおいて、左から右への５本の棒は、それぞれ、１°、２°、３°、１°＋２°、および１°＋２°＋３°細胞溶解物における活性ＮＥ濃度を表す。サンプル群ＤおよびＥの単一の棒は、１°細胞溶解物における活性ＮＥ濃度を表す。 [0030]サンプル群Ａ～ＣのＷＢＣペレットからのＰＲ３の多抽出、またはサンプル群ＤおよびＥのＷＢＣペレットからのＰＲ３の単一抽出の後、ＰＲ３反応速度論アッセイによって測定され、起源となる全血の容積に対して正規化された、細胞溶解物において回収された活性ＰＲ３の濃度を示したグラフである。サンプル群Ａ～Ｃの各データセットにおいて、左から右への５本の棒は、それぞれ、１°、２°、３°、１°＋２°、および１°＋２°＋３°細胞溶解物における活性ＰＲ３濃度を表す。サンプル群ＤおよびＥの単一の棒は、１°細胞溶解物における活性ＰＲ３濃度を表す。 [0031]０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液（０．０２％Triton）、Ａｂｃａｍ溶解緩衝液（Abcam）、１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液（１０％Triton）を用いたＷＢＣペレットの単一溶解の後、またはＮＰ－４０溶解緩衝液を用いた溶解前洗浄ＷＢＣペレットの単一溶解の後（NP-40（洗浄））、ＮＥ反応速度論アッセイによって測定され、起源となる全血の容積に対して正規化された、１°細胞溶解物において回収された活性ＮＥの濃度を示したグラフである。上述の溶解緩衝液の処方は表１Ａに示されており、ＮＰ－４０溶解緩衝液は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％（v/v）Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ－４０（IUPAC名：オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）を含有する。 [0032]０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液（０．０２％Triton）、Ａｂｃａｍ溶解緩衝液（Abcam）、１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液（１０％Triton）を用いたＷＢＣペレットの単一溶解の後、またはＮＰ－４０溶解緩衝液を用いた溶解前洗浄ＷＢＣペレットの単一溶解の後（NP-40（洗浄））、ＰＲ３反応速度論アッセイによって測定され、起源となる全血の容積に対して正規化された、１°細胞溶解物において回収された活性ＰＲ３の濃度を示したグラフである。上述の溶解緩衝液の処方は表１Ａに示されており、ＮＰ－４０溶解緩衝液は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％（v/v）Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ－４０を含有する。 [0033]５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％（v/v）Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ－４０を含有するＮＰ－４０溶解緩衝液を使用した単一溶解の後、非洗浄ＷＢＣペレットおよび溶解前洗浄ＷＢＣペレットから回収された活性ＮＥの濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）を示したグラフである。 [0034]５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％（v/v）Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ－４０を含有するＮＰ－４０溶解緩衝液を使用した単一溶解の後、非洗浄ＷＢＣペレットおよび溶解前洗浄ＷＢＣペレットから回収された活性ＰＲ３の濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）を示したグラフである。 [0035]溶解前洗浄、ならびにＮＰ－４０溶解緩衝液（溶解工程１において）、それに続く１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液（溶解工程２において）、溶解工程１および２の両方においてＮＰ－４０溶解緩衝液、または溶解工程１および２の両方において１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を用いた洗浄ＷＢＣペレットの二重抽出の後、洗浄画分、１°細胞溶解物、および２°細胞溶解物において回収された活性ＮＥの総濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）を示したグラフである。上述の溶解緩衝液の処方は表１Ａに示されており、ＮＰ－４０溶解緩衝液は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％（v/v）Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ－４０を含有する。 [0036]溶解前洗浄、ならびにＮＰ－４０溶解緩衝液（溶解工程１において）、それに続く１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液（溶解工程２において）、溶解工程１および２の両方においてＮＰ－４０溶解緩衝液、または溶解工程１および２の両方において１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を用いた洗浄ＷＢＣペレットの二重抽出の後、洗浄画分、１°細胞溶解物、および２°細胞溶解物において回収された活性ＰＲ３の総濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）を示したグラフである。上述の溶解緩衝液の処方は表１Ａに示されており、ＮＰ－４０溶解緩衝液は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％（v/v）Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ－４０を含有する。 [0037]４人の異なるドナーＢ０１～Ｂ０４の対照半ＷＢＣペレットから回収された洗浄画分（洗浄）、ならびに１°、２°、および３°細胞溶解物における活性ＮＥの個々のおよび総計の濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）を示したグラフである。各ドナーデータセットにおいて、左から右への５本の棒は、それぞれ、洗浄、１°、２°、および３°細胞溶解物における個々の活性ＮＥ濃度、ならびに総活性ＮＥ濃度を表す。 [0038]４人の異なるドナーＢ０１～Ｂ０４の対照半ＷＢＣペレットから回収された洗浄画分（洗浄）、ならびに１°、２°、および３°細胞溶解物における活性ＰＲ３の個々のおよび総計の濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）を示したグラフである。各ドナーデータセットにおいて、左から右への５本の棒は、それぞれ、洗浄、１°、２°、および３°細胞溶解物における個々の活性ＰＲ３濃度、ならびに総活性ＰＲ３濃度を表す。 [0039]４人の異なるドナーＢ０１～Ｂ０４の増強した撹拌を有する半ＷＢＣペレットから回収された洗浄画分（洗浄）、ならびに１°および２°細胞溶解物における活性ＮＥの個々のおよび総計の濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）を示したグラフである。各ドナーデータセットにおいて、左から右への４本の棒は、それぞれ、洗浄、１°、２°細胞溶解物における個々の活性ＮＥ濃度、および総活性ＮＥ濃度を表す。 [0040]４人の異なるドナーＢ０１～Ｂ０４の増強した撹拌を有する半ＷＢＣペレットから回収された洗浄画分（洗浄）、ならびに１°および２°細胞溶解物における活性ＰＲ３の個々のおよび総計の濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）を示したグラフである。各ドナーデータセットにおいて、左から右への４本の棒は、それぞれ、洗浄、１°、２°細胞溶解物における個々の活性ＰＲ３濃度、および総活性ＰＲ３濃度を表す。 [0041]図４Ａにおいて以前に示される、４人の異なるドナーＢ０１～Ｂ０４の対照半ＷＢＣペレットから回収された活性ＮＥの総濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）と、図４Ｃにおいて以前に示される、同じドナーの増強した撹拌を有する半ＷＢＣペレットから回収された活性ＮＥの総濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）との対照比較を示したグラフである。各ドナーデータセットにおいて、左および右の棒は、それぞれ、対照半ペレット（対照）および増強した撹拌を有する半ペレット（増強した撹拌）から回収された総活性ＮＥ濃度を表す。 [0042]図４Ｂにおいて以前に示される、４人の異なるドナーＢ０１～Ｂ０４の対照半ＷＢＣペレットから回収された活性ＰＲ３の総濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）と、図４Ｄにおいて以前に示される、同じドナーの増強した撹拌を有する半ＷＢＣペレットから回収された活性ＰＲ３の総濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）との対照比較を示したグラフである。各ドナーデータセットにおいて、左および右の棒は、それぞれ、対照半ペレット（対照）および増強した撹拌を有する半ペレット（増強した撹拌）から回収された総活性ＰＲ３濃度を表す。 [0043]半分の量の撹拌を有する０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を使用した、同じドナー由来の非洗浄ＷＢＣペレットの単一工程溶解後に１°細胞溶解物において回収された活性ＮＥの濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）（各ドナーデータセットにおける右の棒）と比較した、増強した撹拌の下でＮＰ－４０溶解緩衝液を使用した、２人の異なるドナーＢ０５およびＢ０４由来の溶解前洗浄ＷＢＣペレットの溶解の第１の工程後に１°細胞溶解物において回収された活性ＮＥの濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）（各ドナーデータセットにおける左の棒）を示したグラフである。上述の溶解緩衝液の処方は表１Ａに示されており、ＮＰ－４０溶解緩衝液は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％（v/v）Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ－４０を含有する。 [0044]半分の量の撹拌を有する０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を使用した、同じドナー由来の非洗浄ＷＢＣペレットの単一工程溶解後に１°細胞溶解物において回収された活性ＰＲ３の濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）（各ドナーデータセットにおける右の棒）と比較した、増強した撹拌の下でＮＰ－４０溶解緩衝液を使用した、２人の異なるドナーＢ０５およびＢ０４由来の溶解前洗浄ＷＢＣペレットの溶解の第１の工程後に１°細胞溶解物において回収された活性ＰＲ３の濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）（各ドナーデータセットにおける左の棒）を示したグラフである。上述の溶解緩衝液の処方は表１Ａに示されており、ＮＰ－４０溶解緩衝液は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％（v/v）Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ－４０を含有する。 [0045]溶解前洗浄、および増強した撹拌の下でＮＰ－４０溶解緩衝液（５０ｍＭ HEPES緩衝液、０．７５Ｍ NaCl、および０．０５％（v/v）Nonidet（登録商標）P-40を含有する）を使用した５工程の繰り返しのペレット溶解過程により、複製ドナーＷＢＣペレットサンプル（Ｂ０５ａおよびＢ０５ｂ）から回収された、洗浄画分（洗浄）、１°、２°、３°、４°、および５°細胞溶解物における活性ＮＥの個々の濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）、ならびに洗浄＋１°、２°、３°、４°、５°細胞溶解物の総活性ＮＥ濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）、ならびに洗浄＋１°、２°、３°細胞溶解物の小計活性ＮＥ濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）を示したグラフである。各データセットにおいて、左の棒は、ドナーペレットサンプルＢ０５ａから回収された活性ＮＥ濃度、および右の棒は、ドナーペレットサンプルＢ０５ｂから回収された活性ＮＥ濃度を表す。 [0046]溶解前洗浄、および増強した撹拌の下でＮＰ－４０溶解緩衝液（５０ｍＭ HEPES緩衝液、０．７５Ｍ NaCl、および０．０５％（v/v）Nonidet（登録商標）P-40を含有する）を使用した５工程の繰り返しのペレット溶解過程により、複製ドナーＷＢＣペレットサンプル（Ｂ０５ａおよびＢ０５ｂ）から回収された、洗浄画分（洗浄）、１°、２°、３°、４°、および５°細胞溶解物における活性ＰＲ３の個々の濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）、ならびに洗浄＋１°、２°、３°、４°、５°細胞溶解物の総活性ＰＲ３濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）、ならびに洗浄＋１°、２°、３°細胞溶解物の小計活性ＰＲ３濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）を示したグラフである。各データセットにおいて、左の棒は、ドナーペレットサンプルＢ０５ａから回収された活性ＰＲ３濃度、および右の棒は、ドナーペレットサンプルＢ０５ｂから回収された活性ＰＲ３濃度を表す。 [0047]溶解前洗浄、および増強した（２倍の量の）撹拌の下でＮＰ－４０溶解緩衝液を使用した５工程の繰り返しのペレット溶解過程により、同じドナーのＷＢＣペレットから回収された、洗浄＋１°、２°、３°細胞溶解物の小計活性ＮＥ濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）（「NP40（３抽出物）」とラベルされた、各ドナーデータセットにおける中央の棒）、および洗浄＋１°、２°、３°、４°、５°細胞溶解物の総活性ＮＥ濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）（「NP40（５抽出物）とラベルされた、各ドナーデータセットにおける右の棒）と比較した、撹拌を有する０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を使用した単一工程溶解により、２人の異なるドナー（Ｂ０５およびＢ０４）の非洗浄ＷＢＣペレットから回収された活性ＮＥの総濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）（各ドナーデータセットにおける左の棒）を示したグラフである。上述の溶解緩衝液の処方は表１Ａに示されており、ＮＰ－４０溶解緩衝液は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％（v/v）Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ－４０を含有する。 [0048]溶解前洗浄、および増強した（２倍の量の）撹拌の下でＮＰ－４０溶解緩衝液を使用した５工程の繰り返しのペレット溶解過程により、同じドナーのＷＢＣペレットから回収された、洗浄＋１°、２°、３°細胞溶解物の小計活性ＰＲ３濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）（「NP40（３抽出物）」とラベルされた、各ドナーデータセットにおける中央の棒）、および洗浄＋１°、２°、３°、４°、５°細胞溶解物の総活性ＰＲ３濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）（「NP40（５抽出物）とラベルされた、各ドナーデータセットにおける右の棒）と比較した、撹拌を有する０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を使用した単一工程溶解により、２人の異なるドナー（Ｂ０５およびＢ０４）の非洗浄ＷＢＣペレットから回収された活性ＰＲ３の総濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）（各ドナーデータセットにおける左の棒）を示したグラフである。上述の溶解緩衝液の処方は表１Ａに示されており、ＮＰ－４０溶解緩衝液は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％（v/v）Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ－４０を含有する。 [0049]溶解前洗浄、および増強した撹拌の下でＮＰ－４０溶解緩衝液（５０ｍＭ HEPES緩衝液、０．７５Ｍ NaCl、および０．０５％（v/v）Nonidet（登録商標）P-40を含有する）を使用した５工程の繰り返しのペレット溶解過程により、ドナーＢ０４ ＷＢＣペレットから回収された、洗浄画分（洗浄）、１°、２°、３°、４°、および５°細胞溶解物における活性ＮＥの個々の濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）を示したグラフである。各データセットにおいて、左の棒および右の棒は、それぞれ、消泡剤なし（AFなし）および消泡剤あり（AF）でＮＥ反応速度論アッセイによって判定された活性ＮＥ濃度を表す。 [0050]溶解前洗浄、および増強した撹拌の下でＮＰ－４０溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％（v/v）Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ－４０を含有する）を使用した５工程の繰り返しのペレット溶解過程により、ドナーＢ０４ ＷＢＣペレットから回収された、洗浄画分（洗浄）、１°、２°、３°、４°、および５°細胞溶解物における活性ＰＲ３の個々の濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）を示したグラフである。各データセットにおいて、左の棒および右の棒は、それぞれ、消泡剤なし（AFなし）および消泡剤あり（AF）でＰＲ３反応速度論アッセイによって判定された活性ＰＲ３濃度を表す。 [0051]溶解前洗浄、および増強した撹拌の下でＮＰ－４０溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ－４０を含有する）を使用した５工程の繰り返しのペレット溶解過程により、ドナーＢ０５ ＷＢＣペレットから回収された、洗浄画分（洗浄）、１°、２°、３°、４°、および５°細胞溶解物における活性ＮＥの個々の濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）を示したグラフである。各データセットにおいて、左の棒および右の棒は、それぞれ、消泡剤なし（AFなし）および消泡剤あり（AF）でＮＥ反応速度論アッセイによって判定された活性ＮＥ濃度を表す。 [0052]溶解前洗浄、および増強した撹拌の下でＮＰ－４０溶解緩衝液（５０ｍＭ HEPES緩衝液、０．７５Ｍ NaCl、および０．０５％（v/v）Nonidet（登録商標）P-40を含有する）を使用した５工程の繰り返しのペレット溶解過程により、ドナーＢ０５ ＷＢＣペレットから回収された、洗浄画分（洗浄）、１°、２°、３°、４°、および５°細胞溶解物における活性ＰＲ３の個々の濃度（起源となる全血の容積に対して正規化された）を示したグラフである。各データセットにおいて、左の棒および右の棒は、それぞれ、消泡剤なし（AFなし）および消泡剤あり（AF）でＰＲ３反応速度論アッセイによって判定された活性ＰＲ３濃度を表す。 [0053]増強した撹拌を有するＮＰ－４０溶解緩衝液（５０ｍＭ HEPES緩衝液、０．７５Ｍ NaCl、および０．０５％（v/v）Nonidet（登録商標）P-40を含有する）を使用した３工程の繰り返しのペレット溶解過程に供された溶解前洗浄ＷＢＣペレットから調製された細胞溶解物における、ＮＥ反応速度論アッセイによって測定され、起源となる全血の容積に対して正規化された活性ＮＥの濃度として表現された、活性ＮＥの様々なサンプル時点における回収を示したグラフである。各サンプル時点において、左の棒（個々のサンプル）は、ＮＥ活性について個々の細胞溶解物サンプルをアッセイし、個々の活性を総和することによって判定された活性ＮＥの回収を表し、一方で右の棒（プールされたサンプル）は、等容積の個々の細胞溶解物をプールしてプールされたサンプルを獲得し、プールされたサンプルのＮＥ活性をアッセイすることによって判定された活性ＮＥの回収を表す。 [0054]増強した撹拌を有するＮＰ－４０溶解緩衝液（５０ｍＭ HEPES緩衝液、０．７５Ｍ NaCl、および０．０５％（v/v）Nonidet（登録商標）P-40を含有する）を使用した３工程の繰り返しのペレット溶解過程に供された溶解前洗浄ＷＢＣペレットから調製された細胞溶解物における、ＰＲ３反応速度論アッセイによって測定され、起源となる全血の容積に対して正規化された活性ＰＲ３の濃度として表現された、活性ＰＲ３の様々なサンプル時点における回収を示したグラフである。各サンプル時点において、左の棒（個々のサンプル）は、ＰＲ３活性について個々の細胞溶解物サンプルをアッセイし、個々の活性を総和することによって判定された活性ＰＲ３の回収を表し、一方で右の棒（プールされたサンプル）は、等容積の個々の細胞溶解物をプールしてプールされたサンプルを獲得し、プールされたサンプルのＰＲ３活性をアッセイすることによって判定された活性ＰＲ３の回収を表す。 [0055]５人の異なるドナー（ドナー１～５）から獲得され、様々な条件下で処理され、溶解された、群Ａ～Ｇ ＷＢＣペレットから回収された活性ＣａｔＧの総濃度（棒によって表される）を示したグラフであり、折れ線グラフは、各群における５人のドナーの間の活性ＣａｔＧの総濃度の平均を示している。活性ＣａｔＧの濃度を、Ｓｉｇｍａ製のＳｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡペプチドを基質として用いた反応速度論ＣａｔＧアッセイを使用して定量し、起源となる全血の容積に対して正規化した。 [0056]ＮＰ－４０溶解緩衝液（５０ｍＭ HEPES緩衝液、０．７５Ｍ NaCl、および０．０５％（v/v）Nonidet（登録商標）P-40を含有する）を使用して、５人の異なるドナー（ドナー１～５）から獲得された群Ｅ ＷＢＣペレットから回収された１°、２°、および３°細胞溶解物における活性ＣａｔＧの個々の濃度およびそれらの数学的総和（積み上げ棒によって表される）、ならびに各ドナーＷＢＣペレットに由来する等容積の１°、２°、および３°細胞溶解物を組み合わせることによって獲得された、プールされた溶解物の活性ＣａｔＧ濃度（折れ線グラフによって表される）を示したグラフである。「平均」は、５人のドナーの相当する平均値を有する仮説的ドナーを表す。活性ＣａｔＧの濃度を、Ｓｉｇｍａ製のＳｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡペプチドを基質として用いた反応速度論ＣａｔＧアッセイを使用して定量し、起源となる全血の容積に対して正規化した。 [0057]５人の異なるドナー（ドナー１～５）から獲得され、様々な条件下で処理され、溶解された、群Ａ～Ｇ ＷＢＣペレットから回収された活性ＣａｔＧの総濃度（棒によって表される）を示したグラフであり、折れ線グラフは、各群における５人のドナーの間の活性ＣａｔＧの総濃度の平均を示している。活性ＣａｔＧの濃度を、ＰｒｏＡｘｓｉｓ製のＥＬＩＳＡベースのＰｒｏｔｅａｓｅＴａｇ（登録商標）活性ＣａｔＧイムノアッセイを使用して定量し、起源となる全血の容積に対して正規化した。 [0058]ＮＰ－４０溶解緩衝液（５０ｍＭ HEPES緩衝液、０．７５Ｍ NaCl、および０．０５％（v/v）Nonidet（登録商標）P-40を含有する）を使用して、５人の異なるドナー（ドナー１～５）から獲得された群Ｅ ＷＢＣペレットから回収された１°、２°、および３°細胞溶解物における活性ＣａｔＧの個々の濃度およびそれらの数学的総和（積み上げ棒によって表される）、ならびに各ドナーＷＢＣペレットに由来する等容積の１°、２°、および３°細胞溶解物を組み合わせることによって獲得された、プールされた溶解物の活性ＣａｔＧ濃度（折れ線グラフによって表される）を示したグラフである。「平均」は、５人のドナーの相当する平均値を有する仮説的ドナーを表す。活性ＣａｔＧの濃度を、ＰｒｏＡｘｓｉｓ製のＥＬＩＳＡベースのＰｒｏｔｅａｓｅＴａｇ（登録商標）活性ＣａｔＧイムノアッセイを使用して定量し、起源となる全血の容積に対して正規化した。 [0059]全血サンプルからＮＳＰを抽出するための例示的な方法についての図式的概要である。 [0060]３種の治療アームの患者から獲得された痰サンプルにおける活性ＮＥの濃度のベースラインからの変化を示したグラフである。＊、プラセボに対してｐ＜０．０５。 [0061]３種の治療アームの患者から獲得された痰サンプルにおける活性ＰＲ３の濃度のベースラインからの変化を示したグラフである。＊、プラセボに対してｐ＜０．０５。 [0062]３種の治療アームの患者から獲得された痰サンプルにおける活性ＣａｔＧの濃度のベースラインからの変化を示したグラフである。＊、プラセボに対してｐ＜０．０５。 [0063]３種の治療アームの患者の全血サンプルに由来するＷＢＣにおける活性ＮＥの濃度のベースラインからの変化を示したグラフである。活性ＮＥの濃度を、反応速度論ＮＥアッセイによって判定し、起源となる全血の容積に対して正規化した。＊、プラセボに対してｐ＜０．０５。 [0064]３種の治療アームの患者の全血サンプルに由来するＷＢＣにおける活性ＰＲ３の濃度のベースラインからの変化を示したグラフである。活性ＰＲ３の濃度を、反応速度論ＰＲ３アッセイによって判定し、起源となる全血の容積に対して正規化した。＊、プラセボに対してｐ＜０．０５。
[0065] 発明の詳細な説明
本開示を通して、「約」という用語は、数値および／または数域と合わせて使用され得る。「約」という用語は、挙げられた値に近いそうした値を意味すると理解される。例えば、「約４０［単位］」は、４０の±２５％以内（例えば、３０～５０）、±２０％、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、±１％以内、±１％未満、またはその中のもしくはそれを下回る任意の他の値もしくは値の域を意味し得る。
[0066] 本開示を通して、数域は、ある特定の分量に対して提供される。これらの域は、その中のすべての部分域を含むと理解されるべきである。ゆえに、「５０～８０」という域は、その中のすべての考え得る域（例えば、５１～７９、５２～７８、５３～７７、５４～７６、５５～７５、６０～７０等）を含む。さらに、所与の域内のすべての値は、それによって包含される域に対する終点であり得る（例えば、５０～８０という域は、５５～８０、５０～７５等、終点を有する域を含む）。
[0067] ＮＳＰの成熟した活性形態の量または濃度に比例した１種または複数のＮＳＰの活性は、ある特定の疾患状態または治療の根底にあり得るまたはそれと相関し得る。そのため、患者血液サンプルからのＮＳＰの抽出、およびＮＳＰの活性形態の濃度の判定は、ＤＰＰ１／ＮＳＰカスケードが関わるある特定の疾患の診断および治療に重大であり得る。本出願は、対象から獲得された白血球を含むサンプルからＮＳＰを抽出するための効率的で、再現性のある方法を提供する。付加的に、本出願は、可逆的ＤＰＰ１阻害剤を用いて、患者におけるＤＰＰ１媒介性病態を治療する方法を提供する。本明細書において提供される治療方法は、患者の白血球サンプルから抽出された１種または複数のＮＳＰの活性形態の濃度をバイオマーカーとして利用して、本明細書において提供される可逆的ＤＰＰ１阻害剤の１種または複数についての有効投薬量の選択またはその調整をガイドする。
[0068] １つの態様において、本開示は、対象から獲得されたサンプルから１種または複数のＮＳＰを抽出するための効率的で、再現性のある方法であって、サンプルは白血球を含む、方法を提供する。方法は、
サンプルと、少なくとも０．０１％（v/v）の第１の界面活性剤を含む第１の水性媒体とを接触させて、第１のＮＳＰ抽出物を含む第１の細胞溶解物および第１のＷＢＣ残留物を獲得する工程であって、第１のＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程
第１のＷＢＣ残留物から第１の細胞溶解物を分離して、第１のＮＳＰ抽出物を含む第１の分離された細胞溶解物を提供する工程
第１のＷＢＣ残留物と、少なくとも０．０１％（v/v）の第２の界面活性剤を含む第２の水性媒体とを接触させて、第２のＮＳＰ抽出物を含む第２の細胞溶解物および第２のＷＢＣ残留物を獲得する工程であって、第２のＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程、ならびに
第２のＷＢＣ残留物から第２の細胞溶解物を分離して、第２のＮＳＰ抽出物を含む第２の分離された細胞溶解物を提供する工程
を含む。
[0069] １つの実施形態におけるサンプルは、対象から獲得される。さらなる実施形態において、対象はヒト対象である。別の実施形態において、対象は哺乳類である。さらなる実施形態において、哺乳類は、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、または齧歯類（例えば、マウス、ラット）から選択される。
[0070] ＮＳＰは、好中球のアズール顆粒の内側に存在し、炎症性病態の調節に関わる。非限定的な例示的なＮＳＰは、好中球エラスターゼ（NE）、プロテイナーゼ３（PR3）、カテプシンＧ（CatG）、およびＮＳＰ４を含む。１つの実施形態において、本明細書に開示される方法を実施して、ＮＥ、ＰＲ３、ＣａｔＧ、ＮＳＰ４、またはその組み合わせを抽出する。別の実施形態において、本明細書に開示される方法を実施してＮＥを抽出する。別の実施形態において、本明細書に開示される方法を実施してＰＲ３を抽出する。別の実施形態において、本明細書に開示される方法を実施して、ＮＥおよびＰＲ３を抽出する。別の実施形態において、本明細書に開示される方法を実施してＣａｔＧを抽出する。別の実施形態において、本明細書に開示される方法を実施して、ＮＥ、ＰＲ３、およびＣａｔＧを抽出する。別の実施形態において、本明細書に開示される方法を実施してＮＳＰ４を抽出する。開示される方法に従ってサンプルから抽出された１種または複数のＮＳＰは、活性ならびに非活性形態を含めた、サンプルに存在するＮＳＰのすべての形態を含む。
[0071] 本明細書において提供される抽出方法の１つの実施形態において、白血球（WBC）を含むサンプルは、ＷＢＣを含む細胞懸濁液を含む。別の実施形態において、ＷＢＣを含むサンプルはＷＢＣペレットを含む。１つの実施形態において、ＷＢＣを含むサンプルは、全血サンプルに由来し、例えば赤血球の選択的溶解により、赤血球を実質的に欠いている。
[0072] 本明細書において提供される抽出方法の１つの実施形態において、サンプルにおけるＷＢＣは、サンプルを第１の水性媒体と接触させてＷＢＣを溶解する前に、水性洗浄溶液で洗浄される。１つの実施形態において、水性洗浄溶液はリン酸緩衝生理食塩（PBS）溶液である。別の実施形態において、水性洗浄溶液は、約０．９％ＮａＣｌを含む生理食塩溶液である。別の実施形態において、水性洗浄溶液は、Ｔｒｉｓベースのアルカリ性緩衝液およびＮａＣｌを含み、例えば、約１００ｍＭ Ｔｒｉｓおよび約１００ｍＭ ＮａＣｌを含み、約７．５のｐＨを有する水性溶液である。ＷＢＣの溶解前洗浄は、サンプル、例えばＷＢＣ懸濁液またはペレットを含むサンプルに水性洗浄溶液を添加し、任意選択によりそれに続いて、穏やかに混合して洗浄を促すことによって成し遂げられ得る。洗浄のために穏やかに混合する工程は、水性洗浄溶液とサンプルとの混合物の低強度のピペッティング、ボルテックス、振とう、かき混ぜによって、例えばかき混ぜロッドを使用して、もしくはかき混ぜ棒を用いたかき混ぜプレート上で、または米国薬局方（USP）装置２（パドル）等のパドルを用いて行われ得る。次いで、水性洗浄溶液とサンプルとの混合物を遠心分離して、上清（「洗浄画分」とも称される）とＷＢＣを含むペレットとを提供し得る。一部の実施形態において、上清（洗浄画分）は、１種または複数のＮＳＰを含み、ゆえに、ＮＳＰ活性を指し示す１種または複数のＮＳＰの活性形態の濃度の判定のために収集される。上清を収集するとともに、ＷＢＣを含むペレットを第１の水性媒体と接触させる。
[0073] 本明細書に開示される任意の水性媒体、例えば上で記載されるそれぞれ第１および第２の界面活性剤を含む第１および第２の水性媒体、ならびに下で記載されるそれぞれの第３、第４、第５、および第６の界面活性剤を含む第３、第４、第５、および第６の水性媒体は、緩衝液および界面活性剤を含有し、界面活性剤は緩衝液に溶けている。適切な緩衝液は、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）、Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩（TBS）溶液、およびＨＥＰＥＳ緩衝液等のリン酸緩衝生理食塩水を含むが、それらに限定されるわけではない。１つの実施形態において、緩衝液はＨＥＰＥＳ緩衝液である。さらなる実施形態において、ＨＥＰＥＳ緩衝液は、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび約０．７５Ｍ ＮａＣｌを含有する。水性媒体は、例えばエタノール等のアルコールを不含であり得るまたは実質的に不含であり得る（例えば、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．１％未満、約０．０５％未満、または約０．０１％ｖ／ｖ未満等、約５％未満含有する）。
[0074] 本明細書に開示される水性媒体のいずれかに存在する界面活性剤は、イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤等、任意のタイプの界面活性剤であり得る。界面活性剤は、１つの実施形態において、非イオン性界面活性剤である。本明細書に開示される水性媒体における使用のための適切な非イオン性界面活性剤の非限定的な例は、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシ化エステル等の非イオン性エステル、脂肪族アルコールエトキシレート、プロポキシ化（propoxylated）アルコール、エトキシ化／プロポキシ化ブロックポリマー、およびポリオキシエチレン界面活性剤等の非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルを含む。さらなる実施形態において、本明細書に開示される水性媒体において使用される界面活性剤は、親水性ポリエチレンオキシド鎖を含む非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤である。さらにさらなる実施形態において、親水性ポリエチレンオキシド鎖を含む界面活性剤は、親油性または疎水性である芳香族炭化水素基をさらに含む。
[0075] １つの実施形態において、本明細書に開示される水性媒体のいずれかにおける非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤は、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Nonidet（登録商標）P-40、またはSt. Louis、MOのSigma Aldrichから入手可能なIGEPAL（登録商標）CA-630という商標名の下で販売される）を含む。さらなる実施形態において、本明細書に開示される水性媒体の１種または複数、例えば第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせは、約０．０５％（v/v）のオクチルフェノキシポリエトキシエタノール、約０．７５Ｍ ＮａＣｌ、および約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む。
[0076] 別の実施形態において、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤は、２－［４－（２，４，４－トリメチルペンタン－２－イル）フェノキシ］エタノール（オクチルフェノールエトキシレートとしても知られる、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯのＳｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈからＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００として入手可能）を含む。
[0077] 別の実施形態において、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤は、ポリオキシエチレン（９）ノニルフェニルエーテル（分岐）（ThermoFisher ScientificからNP-40として、またはSigmaからIGEPAL（登録商標）CO-630として入手可能）を含む。
[0078] 別の実施形態において、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Tween（登録商標）20という商標名の下で入手可能）を含む。
[0079] １つの実施形態において、界面活性剤は、約５ｍＭ未満、約２ｍＭ未満、または約１ｍＭ未満の臨界ミセル濃度（CMC）を有する。例えば、界面活性剤は、約０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、もしくは０．５ｍＭのＣＭＣ、または約０．１～約０．５ｍＭ等の約０．１～約１ｍＭに及ぶＣＭＣを有し得る。
[0080] 本明細書に開示されるＮＳＰ抽出方法によれば、第１の溶解工程で、ＷＢＣを含むサンプルを、第１の界面活性剤を含む第１の水性媒体と接触させ、その時点で、サンプルにおけるＷＢＣまたはその一部分は第１の界面活性剤によって溶解され、ＷＢＣからの１種または複数のＮＳＰの抽出、および抽出されたＮＳＰと第１の水性媒体に可溶性のＷＢＣの他の構成要素とを含有する第１の細胞溶解物（本明細書において、１種または複数のNSPを含む「第１のNSP抽出物」と称される）の形成をもたらす。第１のＷＢＣ残留物も、第１の溶解工程の後に形成する。第１のＷＢＣ残留物は、１つの実施形態において、第１の溶解工程において第１の界面活性剤によって可溶化され得ないＷＢＣの構成要素、例えば細胞骨格、ならびにまだ抽出されない残留ＮＳＰを含有する。第１のＷＢＣ残留物は、第１の溶解工程の後に、まだ溶解されないＷＢＣの一部分も含有し得る。ＮＳＰのより完全な抽出を達成するために、第１の細胞溶解物を、例えば沈降または遠心分離によって、第１のＷＢＣ残留物から分離して、第１のＮＳＰ抽出物を含む第１の分離された細胞溶解物を提供する。
[0081] 第１の分離された細胞溶解物は、１つの実施形態において、ＮＳＰ活性を指し示す１種または複数のＮＳＰの活性形態の濃度を測定し、かつ／または本明細書において提供される方法によって生成される後続の細胞溶解物とともにプールするために収集される。第１のＷＢＣ残留物を、１つの実施形態において、第１のＷＢＣ残留物と第２の水性媒体とを接触させることによってさらなる（第２の）溶解工程に供して、抽出された付加的なＮＳＰ（すなわち、１種または複数のNSPを含む第２のNSP抽出物）を含有する第２の細胞溶解物および第２のＷＢＣ残留物を獲得する。１つの実施形態において、第２のＷＢＣ残留物は、第１のＷＢＣ残留物と同様に、第２の界面活性剤によって可溶化され得ない、サンプルにおけるＷＢＣの構成要素、ならびにこれまでのところまだ溶解されないＷＢＣおよび／または依然として残存し得るＮＳＰを含有する。
[0082] ＮＳＰのさらなる抽出が、本明細書において提供される方法によって企図される。例えば、ＮＳＰのさらにさらなる抽出を達成するために、第２のＷＢＣ残留物から第２の細胞溶解物を分離して、第２のＮＳＰ抽出物を含む第２の分離された細胞溶解物を獲得し次第、第２のＷＢＣ残留物を、１つの実施形態において、少なくとも０．０１％（v/v）の第３の界面活性剤を含む第３の水性媒体と接触させることにより、付加的な溶解工程（すなわち、第３の溶解工程）に供して、さらに抽出されたＮＳＰ（すなわち、１種または複数のNSPを含む第３のNSP抽出物）を含有する第３の細胞溶解物および後継（第３の）ＷＢＣ残留物を獲得し、その後に、第３のＷＢＣ残留物からの第３の細胞溶解物の分離が続いて、第３のＮＳＰ抽出物を含む第３の分離された細胞溶解物を提供する。第３のＷＢＣ残留物は、まだ抽出されないＮＳＰおよび／またはまだ溶解されないＷＢＣを依然として含有し得ることから、１、２、３回、またはそれを上回る付加的な繰り返しの溶解工程（すなわち、少なくとも０．０１％（v/v）の第４の界面活性剤を含む第４の水性媒体を用いた第４の溶解工程、少なくとも０．０１％（v/v）の第５の界面活性剤を含む第５の水性媒体を用いた第５の溶解工程、少なくとも０．０１％（v/v）の第６の界面活性剤を含む第６の水性媒体を用いた第６の溶解工程、またはそれを超える）が実施され得、付加的な各溶解工程は、後継のＷＢＣ残留物（例えば、第４、第５、および第６の残留物）およびさらに抽出されたＮＳＰを含有する新しい細胞溶解物（例えば、第４、第５、および第６の細胞溶解物は、それぞれの第４、第５、および第６のNSP抽出物を含み、各NSP抽出物は１種または複数のNSPを含む）を生成する。次いで、新しい細胞溶解物を相当するＷＢＣ残留物から分離して、新しい分離された細胞溶解物（例えば、第４、第５、および第６の分離された細胞溶解物は、それぞれの第４、第５、および第６のNSP抽出物を含み、各NSP抽出物は１種または複数のNSPを含む）を提供する。１つの実施形態において、第３のＷＢＣ残留物を第４の水性媒体と接触させて、第４のＮＳＰ抽出物を含む第４の細胞溶解物および第４のＷＢＣ残留物を獲得し、その後に、第４のＷＢＣ残留物からの第４の細胞溶解物の分離が続いて、第４のＮＳＰ抽出物を含む第４の分離された細胞溶解物を提供する。さらなる実施形態において、第４のＷＢＣ残留物を第５の水性媒体と接触させて、第５のＮＳＰ抽出物を含む第５の細胞溶解物および第５のＷＢＣ残留物を獲得し、その後に、第５のＷＢＣ残留物からの第５の細胞溶解物の分離が続いて、第５のＮＳＰ抽出物を含む第５の分離された細胞溶解物を提供する。さらなる実施形態において、第５のＷＢＣ残留物を第６の水性媒体と接触させて、第６のＮＳＰ抽出物を含む第６の細胞溶解物および第６のＷＢＣ残留物を獲得し、その後に、第６のＷＢＣ残留物からの第６の細胞溶解物の分離が続いて、第６のＮＳＰ抽出物を含む第６の分離された細胞溶解物を提供する。
[0083] 多重の繰り返しの溶解工程が行われる場合、１つの実施形態において、各溶解工程に使用される水性媒体に存在する界面活性剤は、同じであり得るまたは異なり得る。付加的に、各溶解工程に使用される水性媒体に存在する界面活性剤の濃度は、界面活性剤の同一性にかかわらず、同じであり得るまたは異なり得る。例えば、ＷＢＣサンプルが６工程の繰り返しの溶解に供される場合、１つの実施形態において、それらそれぞれの水性媒体における第１、第２、第３、第４、第５、および第６の界面活性剤は、同じ界面活性剤であり、６種すべての水性媒体において同じ濃度で存在する、または６種の水性媒体のうちの少なくとも２種において異なる濃度で存在する。別の実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、および第６の界面活性剤のうちの少なくとも２種は、異なる界面活性剤である。各水性媒体における界面活性剤の同一性にかかわらず、６種の水性媒体の間の界面活性剤の濃度は同じであり得る。代替的に、６種の水性媒体のうちの少なくとも２種における界面活性剤の濃度は異なる。
[0084] 多重の繰り返しの溶解工程が行われる別の実施形態において、各溶解工程に使用される水性媒体は、同じであり得るまたは異なり得る。１つの実施形態において、使用される水性媒体のすべては、同じ水性媒体である。別の実施形態において、使用される水性媒体のうちの少なくとも２種は、異なる水性媒体である。例えば、ＷＢＣサンプルが６工程の繰り返しの溶解に供される場合、１つの実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、および第６の水性媒体は、同じ水性媒体である。別の実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、および第６の水性媒体のうちの少なくとも２種は、異なる水性媒体である。例えば、第１の水性媒体および第６の水性媒体は異なる水性媒体であり得、残りの水性媒体は、第１または第６の水性媒体と同じである。代替的に、第１、第３、および第６の水性媒体は互いに異なり得、残りの水性媒体は、第１、第３、および第６の水性媒体のいずれか１種と同じである。
[0085] ＷＢＣ、その一部分、および／またはＷＢＣ残留物（またはその一部分）を溶解して、１種または複数の抽出されたＮＳＰを含有する細胞溶解物を生成するために、水性媒体のそれぞれ、例えば本出願に記載される第１、第２、第３、第４、第５、および第６の水性媒体は、少なくとも０．０１％（v/v）のその相当する界面活性剤を含む。１つの実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせは、少なくとも０．０２％（v/v）のそれぞれの第１、第２、第３、第４、第５、または第６の界面活性剤を含む。別の実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせは、少なくとも０．０５％（v/v）のそれぞれの第１、第２、第３、第４、第５、または第６の界面活性剤を含む。別の実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせは、約０．０２％（v/v）～約１．５％（v/v）のそれぞれの第１、第２、第３、第４、第５、または第６の界面活性剤を含む。別の実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせは、約０．０３％（v/v）～約１％（v/v）のそれぞれの第１、第２、第３、第４、第５、または第６の界面活性剤を含む。別の実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせは、約０．０４％（v/v）～約０．８％（v/v）のそれぞれの第１、第２、第３、第４、第５、または第６の界面活性剤を含む。別の実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせは、約０．０５％（v/v）～約０．６％（v/v）のそれぞれの第１、第２、第３、第４、第５、または第６の界面活性剤を含む。別の実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせは、約０．０５％（v/v）のそれぞれの第１、第２、第３、第４、第５、または第６の界面活性剤を含む。別の実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせは、その臨界ミセル濃度（CMC）を上回る濃度でそれぞれの第１、第２、第３、第４、第５、または第６の界面活性剤を含む。第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせにおいて上述の濃度のそれぞれで存在する場合、１つの実施形態において、それぞれの第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の界面活性剤、またはその組み合わせは、非イオン性界面活性剤である。さらなる実施形態において、それぞれの第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の界面活性剤、またはその組み合わせは、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤である。なおさらなる実施形態において、それぞれの第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の界面活性剤、またはその組み合わせは、オクチルフェノキシポリエトキシエタノールである。
[0086] 一部の実施形態において、各溶解工程を比較的低い温度で行って、ＷＢＣまたはＷＢＣ残留物から抽出されるＮＳＰを安定化する。１つの実施形態において、ＷＢＣを含むサンプルを、約０℃～約１０℃、約２℃～約８℃、約３℃～約６℃、または約４℃の温度で第１の水性媒体と接触させる。別の実施形態において、ＷＢＣ残留物（例えば、第１、第２、第３、第４、または第５のWBC残留物）を、約０℃～約１０℃、約２℃～約８℃、約３℃～約６℃、または約４℃の温度で相当する水性媒体と接触させる。
[0087] １つの実施形態において、第１の溶解工程でサンプルと第１の水性媒体とを接触させる工程は、サンプルと第１の水性媒体とを混合する工程を含む。ＷＢＣペレットを含むサンプルを第１の水性媒体と接触させる前に、サンプルにおけるＷＢＣを水性洗浄溶液で洗浄する別の実施形態において、洗浄ＷＢＣを含むＷＢＣペレットと第１の水性媒体とを接触させる工程は、ＷＢＣペレットと第１の水性媒体とを混合する工程を含む。さらなる実施形態において、サンプルまたはＷＢＣペレットと第１の水性媒体とを混合する工程は、サンプルまたはＷＢＣペレットと第１の水性媒体とを撹拌する工程を含む。同じように、後続の付加的な溶解工程のそれぞれにおいて、ＷＢＣ残留物（例えば、第１、第２、第３、第４、または第５のWBC残留物）と相当する水性媒体とを接触させる工程は、ＷＢＣ残留物と相当する水性媒体とを混合する工程を含み得る。さらなる実施形態において、ＷＢＣ残留物と相当する水性媒体とを混合する工程は、ＷＢＣ残留物と相当する水性媒体とを撹拌する工程を含む。上で述べられる撹拌は、例えばピペッティング、ボルテックス、振とう、種々の手段によるかき混ぜ（例えば、かき混ぜロッド、またはかき混ぜ棒を用いたかき混ぜプレートを使用することによる）によって、またはＵＳＰ装置２（パドル）等のパドルを使用することによってもたらされ得る。１つの実施形態において、撹拌は、各溶解工程の間に、例えば約１０～約３０回、約１５～約２５回、または約２０回ピペッティングすることによってもたらされる。
[0088] 洗浄画分におよび個々の分離された細胞溶解物に存在するＮＳＰは、抗ＮＳＰ抗体を使用したウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡアッセイ、および酵素活性アッセイを含めた様々な方法によって検出および定量され得る。例示的なＥＬＩＳＡアッセイは、本明細書に明記される実施例に記載されるＰｒｏＡｘｓｉｓ（Belfast、Northern Ireland）製のＰｒｏｔｅａｓｅＴａｇ（登録商標）活性ＮＥイムノアッセイ、ＰｒｏｔｅａｓｅＴａｇ（登録商標）活性ＰＲ３イムノアッセイ、およびＰｒｏｔｅａｓｅＴａｇ（登録商標）活性ＣａｔＧイムノアッセイを含む。例示的な酵素活性アッセイは、また実施例に記載されるＮＥ、ＰＲ３、およびＣａｔＧ酵素反応速度論アッセイを含む。
[0089] １つの実施形態において、洗浄画分におよび／または個々の分離された細胞溶解物（例えば、第１、第２、第３、第４、第５、または第６の分離された細胞溶解物）に存在するＮＳＰの活性形態は、ＮＳＰの酵素活性またはＮＳＰの活性形態の濃度を測定することによって検出される。実施例に記載されるように、ＮＳＰの酵素活性は、標準曲線を使用してＮＳＰの活性形態の濃度に変換され得るため、ＮＳＰ活性への言及およびＮＳＰの活性形態の濃度への言及は、本出願において互換可能である。別の実施形態において、分離された各細胞溶解物（例えば、第１、第２、第３、第４、第５、または第６の分離された細胞溶解物）におけるＮＳＰの酵素活性またはＮＳＰの活性形態の濃度は、個々に測定される。すべての分離された細胞溶解物の総ＮＳＰ活性またはＮＳＰの活性形態の総濃度は、１つの実施形態において、個々の活性または濃度の数学的総和として算出され得る。別の実施形態において、２種以上の分離された細胞溶解物を組み合わせて、プールされたＮＳＰ抽出物を含むプールされた細胞溶解物を提供する。すべての分離された細胞溶解物の総ＮＳＰ活性またはＮＳＰの活性形態の総濃度は、（１）プールされた細胞溶解物を用いて測定される、ＮＳＰ活性またはＮＳＰの活性形態の濃度、および（２）残りのプールされない分離された細胞溶解物を用いて個々に測定される、ＮＳＰ活性またはＮＳＰの活性形態の濃度、に基づいて算出され得る。なお別の実施形態において、分離された細胞溶解物のすべてを組み合わせて、単一のプールされた細胞溶解物を提供し、すべての分離された細胞溶解物の総ＮＳＰ活性またはＮＳＰの活性形態の総濃度は、単一のプールされた細胞溶解物のＮＳＰ活性またはＮＳＰの活性形態の濃度の測定に基づいて獲得される。１つの実施形態において、等容積の２種以上の分離された細胞溶解物を組み合わせて、プールされた細胞溶解物を提供する。
[0090] 別の態様において、本開示は、それを必要とする患者におけるＤＰＰ１媒介性病態を治療する方法に関する。方法は、
（a）患者から獲得された白血球を含む第１のサンプルから抽出された１種または複数のＮＳＰの活性形態のベースライン濃度を測定する工程、
（b）式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の約１０ｍｇ～約４０ｍｇの第１の１日投薬量を含む薬学的組成物を、約２週間～約１６週間の第１の投与期間毎日患者に経口投与する工程、
Figure 2023535332000005
 （式中、Ｒ１は、
Figure 2023535332000006
 であり；
Ｒ２は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＳＯ２Ｃ１～３アルキル、またはＣ１～３アルキルであり；
Ｒ３は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＳＯ２Ｃ１～３アルキル、ＣＯＮＨ２、またはＳＯ２ＮＲ４Ｒ５（式中、Ｒ４およびＲ５は、それらが付着される窒素原子とともにアゼチジン、ピロリジン、またはピペリジン環を形成する）であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＦ２であり；
Ｙは、ＯまたはＳであり；
Ｑは、ＣＨまたはＮであり；
Ｒ６はＣ１～３アルキルであり、Ｃ１～３アルキルは、任意選択により１、２、または３個のＦによって、任意選択によりＯＨ、ＯＣ１～３アルキル、Ｎ（Ｃ１～３アルキル）２、シクロプロピル、またはテトラヒドロピランから選択される１種の置換基によって置換されており；
Ｒ７は、水素、Ｆ、Ｃｌ、またはＣＨ３である）；
（c）白血球を含む第２のサンプルから抽出された１種または複数のＮＳＰの活性形態の濃度を測定する工程であって、第２のサンプルは、第１の投与期間の間または第１の投与期間の約１週間以下後に患者から獲得される、工程、
（d）第２のサンプルからの濃度と、第１のサンプルからのベースライン濃度とを比較し；
第２のサンプルからの濃度が、第１のサンプルからのベースライン濃度と比較して約１０％以上低下した場合には、式（Ｉ）の化合物もしくはその薬学的に許容される塩の第１の１日投薬量と同じ１日投薬量を、第２の投与期間毎日患者に経口投与する工程、または
第２のサンプルからの濃度が、第１のサンプルからのベースライン濃度と比較して約１０％以上低下しなかった場合には、式（Ｉ）の化合物もしくはその薬学的に許容される塩の第２の１日投薬量を、第２の投与期間毎日患者に経口投与する工程であって、第２の１日投薬量は、第１の１日投薬量の約１．５倍～約７倍である、工程
を含む。
[0091] リソソームシステインジペプチジルペプチダーゼ１（DPP1）は、アズール顆粒会合の間のそれらの前駆体からのＮ末端ジペプチド配列の除去によって、ＮＥ、ＰＲ３、ＣａｔＧ、およびＮＳＰ４を含めたＮＳＰを活性化するプロテイナーゼである。Ｐｈａｍら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：７２７７－７２８１（２００４）；Ｐｈａｍら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６：５４１－５５０（２００６）；Ｐｅｒｅｒａら、ＰＮＡＳ、１０９：６２２９－６２３４（２０１２）を参照されたく、そのそれぞれはすべての目的上参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。式（Ｉ）の化合物およびそれらの薬学的に許容される塩は、ＤＰＰ１活性の可逆的阻害剤である。本明細書において別様に提供されない限り、本明細書において提供される式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の１日投薬量の量は、式（Ｉ）の化合物のそれぞれの遊離塩基形態に対するものである。
[0092] 本明細書において使用するとき、「Ｃ１～３」とは、１、２、または３個の炭素原子を有する炭素基を意味する。
[0093] 「アルキル」という用語は、別様に記されない限り、直鎖および分岐鎖アルキル基の両方を含み、置換されていても置換されていなくてもよい。「アルキル」基は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ブチル、ペンチルを含むが、それらに限定されるわけではない。
[0094] 「薬学的に許容される」という用語は、別様に記されない限り、正しい医学的判断に従った使用に適当であると部分（例えば、塩、剤形、または賦形剤）を特徴付けるために使用される。一般的に、薬学的に許容される部分は、部分が有し得る任意の有害な効果をしのぐ1つまたは複数の有益性を有する。有害な効果は、例えば過度の毒性、刺激、アレルギー応答、および他の問題、ならびに合併症を含み得る。
[0095] １つの実施形態における「治療すること」という用語は、（１）状態、障害、または病態に罹患するまたはかかりやすい可能性があるが、状態、障害、または病態の臨床的または亜臨床的な症状をまだ経験していないまたは呈示していない患者において発症する状態、障害、または病態の臨床的症状の出現を阻止することまたは遅延させること；（２）状態、障害、または病態を阻害すること（すなわち、疾患の発症を、またはその少なくとも１つの臨床的もしくは亜臨床的症状の維持治療の場合にはその再発を食い止めること、低下させること、または遅延させること）；（３）病態を緩和すること（すなわち、状態、障害、もしくは病態、またはその臨床的もしくは亜臨床的症状の少なくとも１つの退縮を引き起こすこと）；および（４）疾患状態、障害、または病態の予防、を含む。
[0096] 本明細書に開示される治療方法において、１種または複数のＮＳＰは、本出願に開示されるＮＳＰ抽出方法に従って第１のサンプルおよび／または第２のサンプルから抽出され得る。ＮＳＰは、他の公知の方法を使用しても抽出され得る。
[0097] 本明細書に開示される治療方法において、それを用いて１種または複数のＮＳＰの活性形態のベースライン濃度が測定される第１のサンプルは、患者が初めて薬学的組成物を投与される前に、すなわち第１の投与期間の前に、患者から獲得される。
[0098] 方法の１つの実施形態において、第１の投与期間は約２週間～約１２週間である。別の実施形態において、第１の投与期間は約２週間～約８週間である。別の実施形態において、第１の投与期間は約３週間～約６週間である。別の実施形態において、第１の投与期間は約３週間～約５週間である。別の実施形態において、第１の投与期間は約３週間である。別の実施形態において、第１の投与期間は約４週間である。別の実施形態において、第１の投与期間は約５週間である。別の実施形態において、第１の投与期間は約６週間である。別の実施形態において、第１の投与期間は約７週間である。別の実施形態において、第１の投与期間は約８週間である。別の実施形態において、第１の投与期間は約９週間である。別の実施形態において、第１の投与期間は約１０週間である。別の実施形態において、第１の投与期間は約１１週間である。別の実施形態において、第１の投与期間は約１２週間である。
[0099] 方法の１つの実施形態において、第２のサンプルは、第１の投与期間の間に患者から獲得される。例えば、第２のサンプルは、第１の投与期間の終了時に、または第１の投与期間の終了の約１、２、３、４、５、６、もしくは７日前に患者から獲得され得る。さらなる実施形態において、第１の投与期間は約４週間である。
[00100] 方法の１つの実施形態において、第２のサンプルは、第１の投与期間の約１週間後に患者から獲得される。他の実施形態において、第２のサンプルは、第１の投与期間の約１、２、３、４、５、６、または７日後に患者から獲得される。さらなる実施形態において、第１の投与期間は約４週間である。
[00101] 方法の１つの実施形態において、第１の投与期間は約４週間であり、第２のサンプルは、第１の投与期間の間の約４週間の時点で患者から獲得される。
[00102] 方法の１つの実施形態において、１種または複数のＮＳＰはＰＲ３を含み、第１および第２のサンプル由来のＰＲ３の活性形態の濃度を測定し、比較する。
[00103] １つの実施形態において、１種または複数のＮＳＰはＣａｔＧを含み、第１および第２のサンプル由来のＣａｔＧの活性形態の濃度を測定し、比較する。
[00104] １つの実施形態において、１種または複数のＮＳＰはＮＳＰ４を含み、第１および第２のサンプル由来のＮＳＰ４の活性形態の濃度を測定し、比較する。
[00105] 方法の１つの実施形態において、１種または複数のＮＳＰはＮＥを含み、第１および第２のサンプル由来のＮＥの活性形態の濃度を測定し、比較する。さらなる実施形態において、第２のサンプル由来のＮＥの活性形態の濃度が、第１のサンプル由来のＮＥの活性形態のベースライン濃度と比較して約１９％以上低下した場合には、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩は、第２の投与期間の間、第１の１日投薬量と同じ１日投薬量で毎日および経口で投与され、第２のサンプル由来のＮＥの活性形態の濃度が、第１のサンプル由来のＮＥの活性形態のベースライン濃度と比較して約１９％以上低下しなかった場合には、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩は、第２の投与期間の間、第２の１日投薬量で毎日および経口で投与される。
[00106] 本明細書に開示される治療方法は、第１の投与期間の間または後に獲得された患者の白血球（WBC）サンプルから抽出されたＮＳＰの活性形態の濃度の低下をバイオマーカーとして使用する。このバイオマーカーは、第２の投与期間に投与される式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の１日投薬量の判定をガイドする。バイオマーカー、すなわち、患者のＷＢＣサンプルから抽出された活性ＮＳＰの濃度の低下が、上で規定されるある特定の閾値に達したまたはそれを超えた場合、患者は、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩を、第１の投与期間の間のもの、すなわち第１の１日投薬量と同じ１日投薬量で、第２の投与期間に投与される。そうでなければ、患者は、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩を、上で規定される第１の１日投薬量よりも高い第２の１日投薬量で、第２の投与期間に投与される。
[00107] １つの実施形態において、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の第１の１日投薬量は約１０ｍｇ～約２５ｍｇである。別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の第１の１日投薬量は約１０ｍｇ～約１５ｍｇである。別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の第１の１日投薬量は約１０ｍｇ～約１２ｍｇである。別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の第１の１日投薬量は約１６ｍｇ～約２５ｍｇである。別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の第１の１日投薬量は約２０ｍｇ～約２５ｍｇである。別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の第１の１日投薬量は約２５ｍｇ～約４０ｍｇである。
[00108] １つの実施形態において、第２の１日投薬量は、第１の１日投薬量の約１．５倍～約６倍である。さらなる実施形態において、第１の１日投薬量は、約１０ｍｇ～約１５ｍｇまたは約１０ｍｇ～約１２ｍｇである。
[00109] 別の実施形態において、第２の１日投薬量は、第１の１日投薬量の約１．５倍～約５倍である。さらなる実施形態において、第１の１日投薬量は、約１０ｍｇ～約１５ｍｇまたは約１０ｍｇ～約１２ｍｇである。
[00110] 別の実施形態において、第２の１日投薬量は、第１の１日投薬量の約１．５倍～約４倍である。さらなる実施形態において、第１の１日投薬量は、約１０ｍｇ～約１５ｍｇ、約１０ｍｇ～約１２ｍｇ、または約１６ｍｇ～約２５ｍｇである。
[00111] 別の実施形態において、第２の１日投薬量は、第１の１日投薬量の約１．５倍～約３倍である。さらなる実施形態において、第１の１日投薬量は、約１６ｍｇ～約２５ｍｇ、約２０ｍｇ～約２５ｍｇ、または約２５ｍｇ～約４０ｍｇである。
[00112] 別の実施形態において、第２の１日投薬量は、第１の１日投薬量の約１．５倍～約２倍である。さらなる実施形態において、第１の１日投薬量は、約１６ｍｇ～約２５ｍｇ、約２０ｍｇ～約２５ｍｇ、または約２５ｍｇ～約４０ｍｇである。
[00113] １つの実施形態において、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の第１の１日投薬量は約１０ｍｇであり、第２の１日投薬量は、第１の１日投薬量の約２倍～約６．５倍である。別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の第１の１日投薬量は約２５ｍｇであり、第２の１日投薬量は、第１の１日投薬量の約１．６倍～約２．６倍である。
[00114] 治療方法の１つの実施形態において、第２の投与期間は、少なくとも１カ月間、例えば約１カ月間～約２４カ月間、約１カ月間～約１２カ月間、約５カ月間～約２４カ月間、約５カ月間～約１８カ月間、または約５カ月間～約１５カ月間である。別の実施形態において、第２の投与期間は約３カ月間～約６カ月間である。別の実施形態において、第２の投与期間は約６カ月間～約１２カ月間である。別の実施形態において、第２の投与期間は約１２カ月間～約１８カ月間である。さらに別の実施形態において、第２の投与期間は約１２カ月間～約２４カ月間である。
[00115] １つの実施形態において、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の第１および第２の１日投薬量にそれぞれ達するように、薬学的組成物は、第１および第２の投与期間の間に１日１回患者に経口投与される。別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の第１および第２の１日投薬量にそれぞれ達するように、薬学的組成物は、第１および第２の投与期間の間に１日２回患者に経口投与される。
[00116] 本明細書に開示されるＤＰＰ１媒介性病態を治療するための方法に従って使用され得る式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の実施形態が下で記載される。式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩以外の１種または複数のＤＰＰ１阻害剤も、開示される治療方法に従って、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の代わりにまたはそれとの組み合わせで使用され得る。使用に企図される式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩以外のＤＰＰ１阻害剤の非限定的な例は、Ｍｉｌｌｅｒら、「Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｄｅｓｑｕａｍａｔｉｏｎ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａｎ ｏｒａｌ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（GSK2793660）」、Ｂｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８３：２８１３－２８２０（２０１７）；Ｍｅｔｈｏｔ Ｎら、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｐｒｏｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８２：２０８３６－２０８４６（２００７）；Ｇｕａｙ Ｄら、「Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｎｉｔｒｉｌｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ，ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ，ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｃ」、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．１９：５３９２－５３９６（２００９）；Ｍｅｔｈｏｔ Ｎら、「Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｒｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｒｅｑｕｉｒｅｓ ａ Ｈｉｇｈ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｃ」、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．７３：１８５７－１８６５（２００８）；Ｇｕａｙ Ｄら、「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．１０：７０８－７１６（２０１０）；Ｂｏｎｄｅｂｊｅｒｇ Ｊら、「Ｎｏｖｅｌ ｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｉ（hDPPI）」、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．１３：４４０８－４４２４（２００５）；Ｂｏｎｄｅｊｂｅｒｇ Ｊら、「Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ Ｎｉｔｒｉｌｅｓ ａｓ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ １ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．１６：３６１４－３６１７（２００６）；Ｇｕａｒｉｎｏ Ｃら、「Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｃ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３１：５２－６７（２０１７）；米国特許第８，８７１，７８３号、第８，８７７，７７５号、第８，８８９，７０８号、第８，９８７，２４９号、第８，９９９，９７５号、第９，０７３，８６９号、第９，４４０，９６０号、第９，７１３，６０６号、第９，８７９，０２６号、ＲＥ４７，６３６Ｅ１、第１０，２３８，６３３号、第９，８５６，２２８号、および第１０，４７９，７８１号に開示されるものを含み、そのそれぞれはすべての目的上参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。
式（Ｉ）の化合物
[00117] 本明細書に開示される治療方法の１つの実施形態において、式（Ｉ）の化合物はＳ，Ｓジアステレオマーである。言い換えれば、式（Ｉ）の化合物は、以下の立体化学を有する：
Figure 2023535332000007
[00118] 他のジアステレオマー形態も企図される。例えば、１つの実施形態において、式（Ｉ）の化合物はＲ，Ｒジアステレオマーである：
Figure 2023535332000008
[00119] 別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物はＲ，Ｓジアステレオマーである：
Figure 2023535332000009
[00120] さらに別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物はＳ，Ｒジアステレオマーである：
Figure 2023535332000010
[00121] １つの実施形態において、組成物は、式（Ｉ）の化合物のＳ，Ｓジアステレオマーと式（Ｉ）の化合物のＳ，Ｒジアステレオマーとの混合物を含む。
[00122] １つの実施形態において、組成物は、式（Ｉ）の化合物のＳ，Ｓジアステレオマーと式（Ｉ）の化合物のＲ，Ｓジアステレオマーとの混合物を含む。
[00123] １つの実施形態において、組成物は、式（Ｉ）の化合物のＳ，Ｓジアステレオマーと式（Ｉ）の化合物のＲ，Ｒジアステレオマーとの混合物を含む。
[00124] １つの実施形態において、Ｒ１は、
Figure 2023535332000011
 であり；Ｒ２は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＳＯ２Ｃ１～３アルキル、またはＣ１～３アルキルであり；Ｒ３は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＳＯ２Ｃ１～３アルキル、ＣＯＮＨ２、またはＳＯ２ＮＲ４Ｒ５（式中、Ｒ４およびＲ５は、それらが付着される窒素原子とともにアゼチジン、ピロリジン、またはピペリジン環を形成する）である。さらなる実施形態において、Ｒ２は、水素、Ｆ、Ｃｌ、またはＣ１～３アルキルであり；Ｒ３は、水素、Ｆ、Ｃｌ、ＣＮ、またはＳＯ２Ｃ１～３アルキルである。さらなる実施形態において、Ｒ３は、水素、Ｆ、またはＣＮである。
[00125] 別の実施形態において、Ｒ１は、
Figure 2023535332000012
 であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＦ２であり；Ｙは、ＯまたはＳであり；Ｑは、ＣＨまたはＮであり；Ｒ６はＣ１～３アルキルであり、Ｃ１～３アルキルは、任意選択により１、２、または３個のＦによって置換されており、任意選択によりＯＨ、ＯＣ１～３アルキル、Ｎ（Ｃ１～３アルキル）２、シクロプロピル、またはテトラヒドロピランによって置換されており；Ｒ７は、水素、Ｆ、Ｃｌ、またはＣＨ３である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、
Figure 2023535332000013
 である。
[00126] 別の実施形態において、Ｒ１は、
Figure 2023535332000014
 であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＦ２であり；Ｙは、ＯまたはＳであり；Ｒ６は、任意選択により１、２、または３個のＦによって置換され、任意選択によりＯＨ、ＯＣ１～３アルキル、Ｎ（Ｃ１～３アルキル）２、シクロプロピル、またはテトラヒドロピランによって置換されたＣ１～３アルキルであり；Ｒ７は、水素、Ｆ、Ｃｌ、またはＣＨ３である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、
Figure 2023535332000015
 である。
[00127] 別の実施形態において、Ｒ１は、
Figure 2023535332000016
 であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＦ２であり；Ｒ６はＣ１～３アルキルであり、Ｃ１～３アルキルは、任意選択により１、２、または３個のＦによって置換されており；Ｒ７は、水素、Ｆ、Ｃｌ、またはＣＨ３である。
[00128] 別の実施形態において、Ｒ１は、
Figure 2023535332000017
 であり；ＸはＯであり；Ｒ６はＣ１～３アルキルであり、Ｃ１～３アルキルは、任意選択により１、２、または３個のＦによって置換されており；Ｒ７は水素である。さらなる実施形態において、Ｒ６は、Ｃ１～３アルキル、すなわちメチル、エチル、またはプロピルである。なおさらなる実施形態において、Ｒ６はメチルである。
[00129] １つの実施形態において、Ｒ２は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＳＯ２Ｃ１～３アルキル、またはＣ１～３アルキルである。
[00130] さらなる実施形態において、Ｒ２は、水素、Ｆ、Ｃｌ、またはＣ１～３アルキルである。
[00131] なおさらなる実施形態において、Ｒ２は、水素、Ｆ、またはＣ１～３アルキルである。
[00132] １つの実施形態において、Ｒ３は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＳＯ２Ｃ１～３アルキル、ＣＯＮＨ２、またはＳＯ２ＮＲ４Ｒ５（式中、Ｒ４およびＲ５は、それらが付着される窒素原子とともにアゼチジン、ピロリジン、またはピペリジン環を形成する）である。
[00133] さらなる実施形態において、Ｒ３は、水素、Ｆ、Ｃｌ、ＣＮ、またはＳＯ２Ｃ１～３アルキルである。
[00134] なおさらなる実施形態において、Ｒ３は、水素、Ｆ、またはＣＮである。
[00135] １つの実施形態において、Ｒ６はＣ１～３アルキルであり、Ｃ１～３アルキルは、任意選択により１、２、または３個のＦによって、任意選択によりＯＨ、ＯＣ１～３アルキル、Ｎ（Ｃ１～３アルキル）２、シクロプロピル、またはテトラヒドロピランから選択される１種の置換基によって置換されている。
[00136] さらなる実施形態において、Ｒ６はＣ１～３アルキルであり、Ｃ１～３アルキルは、任意選択により１、２、または３個のＦによって置換されている。なおさらなる実施形態において、Ｒ６は、メチルまたはエチルである。なおさらなる実施形態において、Ｒ６はメチルである。
[00137] １つの実施形態において、Ｒ７は、水素、Ｆ、Ｃｌ、またはＣＨ３である。さらなる実施形態において、Ｒ７は水素である。
[00138] １つの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド（ブレンソカチブ）：
Figure 2023535332000018
 ；またはその薬学的に許容される塩である。さらなる実施形態において、式（Ｉ）の化合物はブレンソカチブである。
[00139] １つの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、
[00140] （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－（４’－シアノビフェニル－４－イル）エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00141] （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00142] （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３，７－ジメチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00143] ４’－［（２Ｓ）－２－シアノ－２－｛［（２Ｓ）－１，４－オキサゼパン－２－イルカルボニル］アミノ｝エチル］ビフェニル－３－イルメタンスルホネート、
[00144] （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－１，２－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00145] （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４’－（トリフルオロメチル）ビフェニル－４－イル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00146] （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－（３’，４’－ジフルオロビフェニル－４－イル）エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00147] （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（６－シアノピリジン－３－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00148] （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（４－メチル－３－オキソ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－１，４－ベンゾチアジン－６－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00149] （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－エチル－７－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00150] （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00151] （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（２，２－ジフルオロエチル）－７－フルオロ－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00152] （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－（４－｛３－［２－（ジメチルアミノ）エチル］－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル｝フェニル）エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00153] （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３，３－ジフルオロ－１－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インドール－６－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00154] （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（７－フルオロ－３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00155] （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－エチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00156] （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（シクロプロピルメチル）－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00157] （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（２－メトキシエチル）－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾチアゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00158] （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［２－オキソ－３－（プロパン－２－イル）－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00159] （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（４－メチル－３－オキソ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－１，４－ベンゾオキサジン－６－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00160] （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（２－メトキシエチル）－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00161] （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（５－シアノチオフェン－２－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00162] （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－２－（４’－カルバモイル－３’－フルオロビフェニル－４－イル）－１－シアノエチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00163] （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（１－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－７－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00164] （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［２－オキソ－３－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イルメチル）－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00165] （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－２－［４－（７－クロロ－３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］－１－シアノエチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00166] （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（２，２－ジフルオロエチル）－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00167] （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［２－オキソ－３－（２，２，２－トリフルオロエチル）－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00168] （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾチアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00169] （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４’－（メチルスルホニル）ビフェニル－４－イル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00170] （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－２－［４’－（アゼチジン－１－イルスルホニル）ビフェニル－４－イル］－１－シアノエチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00171] （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－（４’－フルオロビフェニル－４－イル）エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00172] （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－２－［４－（１，３－ベンゾチアゾール－５－イル）フェニル］－１－シアノエチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、または
[00173] （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－（４’－シアノビフェニル－４－イル）エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
[00174] または前述の化合物のうちの１種の薬学的に許容される塩である。
[00175] １つの実施形態において、式（Ｉ）の化合物はブレンソカチブである。一部の実施形態において、ブレンソカチブは、米国特許第９，５２２，８９４号に開示される多形形態Ａにあり、その開示はすべての目的上参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。一部の実施形態において、ブレンソカチブは、ＣｕＫα放射を使用して測定される、約１２．２±０．２（°２－シータ）にピークを有するＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる。一部の実施形態において、ブレンソカチブは、ＣｕＫα放射を使用して測定される、約２０．６±０．２（°２－シータ）にピークを有するＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる。一部の実施形態において、ブレンソカチブは、ＣｕＫα放射を使用して測定される、約１２．２±０．２および約２０．６±０．２（°２－シータ）にピークを有するＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる。一部の実施形態において、ブレンソカチブは、ＣｕＫα放射を使用して測定される、約１２．２±０．２、約１４．３±０．２、約１６．２±０．２、約１９．１±０．２、および約２０．６±０．２（°２－シータ）にピークを有するＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる。
[00176] 全体を通して提供されるように、本明細書において提供される方法によれば、式（Ｉ）の化合物は、薬学的に許容される塩として投与され得る。式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩は、種々の温度および湿度における安定性、またはＨ２Ｏ、油、もしくは他の溶媒における望ましい溶解度等、その化学的または物理的特性の１つまたは複数に起因して有利であり得る。一部の場合には、塩を使用して、式（Ｉ）の化合物の単離または精製を支援し得る。
[00177] 式（Ｉ）の化合物が十分に酸性である場合、薬学的に許容される塩は、アルカリ金属塩、例えばＮａもしくはＫ、アルカリ土類金属塩、例えばＣａもしくはＭｇ、または有機アミン塩を含むが、それらに限定されるわけではない。式（Ｉ）の化合物が十分に塩基性である場合、薬学的に許容される塩は、無機または有機酸付加塩を含むが、それらに限定されるわけではない。
[00178] 帯電した官能基の数およびカチオンまたはアニオンの価数に応じて、１つを上回るカチオンまたはアニオンが存在し得る。
[00179] 本明細書における使用に適した適切な塩および薬学的に許容される塩に関する概説に関しては、すべての目的上本明細書における参照によりその全体として組み入れられる、Ｂｅｒｇｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９７７、６６、１－１９または「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｓｅ」、Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ、Ｐ．Ｇ．Ｖｅｒｍｕｔｈ、ＩＵＰＡＣ、Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ、２００２を参照されたい。
[00180] 式（Ｉ）の化合物は、その塩と共結晶形態との混合物を形成し得る。本明細書において提供される方法は、式（Ｉ）の化合物のそのような塩／共結晶混合物を採用し得ることも理解されるべきである。
[00181] 塩および共結晶は、周知の技法、例えばＸ線粉末回折、単結晶Ｘ線回折（例えば、プロトン位置、結合長、または結合角を評価する）、固体ＮＭＲ（例えばＣ、Ｎ、またはＰ化学シフトを評価する）、または分光学的技法（例えばＯ－Ｈ、Ｎ－Ｈ、またはＣＯＯＨシグナル、および水素結合により生じるＩＲピークシフトを測定する）を使用して特徴付けされ得る。
[00182] 式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩の溶媒和物を含めた、溶媒和形態、例えば水和物で存在し得ることも理解されるべきである。
[00183] １つの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、ラセミ体およびラセミ混合物、単一エナンチオマー、個々のジアステレオマー、ならびにジアステレオマー混合物として存在し得る。本開示は、すべてのそのような異性体形態、例えば本明細書に開示されるＳ，Ｓジアステレオマー、Ｓ，Ｒジアステレオマー、Ｒ，Ｓジアステレオマー、およびＲ，Ｒジアステレオマー、ならびに前述のジアステレオマーの任意の２種以上の混合物を包含することが理解されるべきである。したがって、１つの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、下で示される（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド（すなわち、ブレンソカチブ、Ｓ，Ｓ異性体）である。
Figure 2023535332000019
 またはその薬学的に許容される塩。
[00184] １つの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、下で示される（２Ｒ）－Ｎ－｛（１Ｒ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド（すなわち、Ｒ，Ｒ異性体）である。
Figure 2023535332000020
 またはその薬学的に許容される塩。
[00185] １つの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、下で示される（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｒ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド（すなわち、Ｓ，Ｒ異性体）である。
Figure 2023535332000021
 またはその薬学的に許容される塩。
[00186] １つの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、下で示される（２Ｒ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド（すなわち、Ｒ，Ｓ異性体）である。
Figure 2023535332000022
 またはその薬学的に許容される塩。
[00187] １つの実施形態において、組成物は、前述の立体異性体の２種以上の混合物を含む。１つの実施形態における混合物は、式（Ｉ）の化合物のＳ，Ｓ異性体（ブレンソカチブ）およびＳ，Ｒ異性体を含む。別の実施形態において、組成物は、Ｓ，Ｓ異性体（ブレンソカチブ）とＲ，Ｓ異性体との混合物を含む。さらに別の実施形態において、組成物は、Ｓ，Ｓ異性体（ブレンソカチブ）とＲ，Ｒ異性体との混合物を含む。
[00188] 式（Ｉ）のある特定の化合物は、連結（例えば、炭素－炭素結合、アミド結合等の炭素－窒素結合）も含有し得、結合回転は、その特定の連結について制限される、例えば制限は環結合または二重結合の存在により生じる。したがって、本開示は、すべてのそのような異性体を包含することが理解されるべきである。式（Ｉ）のある特定の化合物は、複数の互変異性形態も含有し得る。本開示は、すべてのそのような互変異性形態を包含することが理解されるべきである。立体異性体は、従来の技法、例えばクロマトグラフィーもしくは分別結晶を使用して分離され得る、または立体異性体は、立体選択的合成によって作製され得る。
[00189] さらなる実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ）の化合物の任意の同位体標識された（または「放射性標識された」）誘導体を包含する。そのような誘導体は、１つまたは複数の原子が、天然に典型的に見い出される原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子によって置き換えられている、式（Ｉ）の化合物の誘導体である。組み入れられ得る放射性核種の例は、２Ｈ（デューテリウムに対する「D」とも書かれる）を含む。そのため、１つの実施形態において、１つまたは複数の水素原子が、１つまたは複数のデューテリウム原子によって置き換えられている式（Ｉ）の化合物が提供され；重水素化化合物は、ＤＰＰ１媒介性病態を治療するための本明細書において提供される方法の１つにおいて使用される。
[00190] 当業者であれば、式（Ｉ）の化合物が、公知の様式で様々なやり方で調製され得ることを認識するであろう。例えば、１つの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、すべての目的上本明細書における参照によりその全体として組み入れられる、米国特許第９，５２２，８９４号に明記される方法に従って調製される。
薬学的組成物
[00191] 式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩は、単独で使用され得るが、一般的に、式（Ｉ）化合物／塩（活性薬学的成分（API））が、薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、および／または担体を含む組成物中にある、薬学的組成物の形態で投与されるであろう。適切な薬学的製剤の選択および調製のための従来の手順は、すべての目的上本明細書における参照によりその全体として組み入れられる、例えば「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ－Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍ Ｄｅｓｉｇｎｓ」、Ｍ．Ｅ．Ａｕｌｔｏｎ、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、第２編、２００２に記載される。
[00192] 投与の様態に応じて、薬学的組成物は、約０．０５～約９９ｗｔ％、例えば約０．０５～約８０ｗｔ％、または約０．１０～約７０ｗｔ％、または約０．１０～約５０ｗｔ％のＡＰＩを含み得、すべての重量パーセンテージは薬学的組成物の総重量に基づく。本明細書において別様に提供されない限り、本明細書において提供されるＡＰＩ重量パーセンテージは、式（Ｉ）の化合物のそれぞれの遊離塩基形態に対するものである。
[00193] １つの実施形態において、薬学的組成物は、フィルムコートされた経口錠剤の経口剤形にある。別の実施形態において、経口剤形は、インビトロの試験条件下で迅速に溶ける特徴を有する即時放出剤形である。１つの実施形態において、経口剤形は、本明細書に開示される第１および／または第２の１日投薬量に達するように１日１回投与される。さらなる実施形態において、経口剤形は、毎日のおよそ同じ時間に、例えば朝食前に、投与される。別の実施形態において、経口剤形は、本明細書に開示される第１および／または第２の１日投薬量に達するように１日２×投与される。
[00194] 経口剤形において、式（Ｉ）の化合物は、アジュバント、希釈剤、または担体、例えばラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール；デンプン、例えばジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、もしくはアミロペクチン；セルロース誘導体；結合剤、例えばゼラチンもしくはポリビニルピロリドン；崩壊剤、例えばセルロース誘導体；および／または潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ポリエチレングリコール、ワックス、パラフィン等と混和され得、次いで錠剤に圧縮され得る。コートされた錠剤が要される場合、上で記載されるように調製されたコアは、水または易揮発性有機溶媒に溶けるまたは分散する適切なポリマーでコートされ得る。代替的に、錠剤は、例えばアラビアガム、ゼラチン、タルカム、および二酸化チタンを含有し得る濃縮された糖溶液でコートされ得る。
[00195] 経口投与のための軟ゼラチンカプセルの調製に関して、式（Ｉ）の化合物は、例えば植物油またはポリエチレングリコールと混和され得る。硬ゼラチンカプセルは、錠剤に対する上述の賦形剤のような薬学的賦形剤を使用して、化合物の顆粒を含有し得る。また、式（Ｉ）の化合物の液体または半固体製剤は、硬ゼラチンカプセルに充填され得る。
[00196] １つの実施形態において、組成物は口腔内崩壊錠（ODT）である。ＯＤＴは、それらが、丸飲みされるよりはむしろ舌の上で溶けるように設計されるという点で伝統的な錠剤とは異なる。
[00197] １つの実施形態において、組成物は、口腔内薄フィルムまたは口腔内崩壊フィルム（ODF）である。そのような製剤は、舌の上に置かれた場合、唾液との相互作用により水和し、剤形から活性化合物を放出する。ＯＤＦは、１つの実施形態において、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、ヒドロキシプロピルセルロース（HPC）、プルラン、カルボキシメチルセルロース（CMC）、ペクチン、デンプン、ポリ酢酸ビニル（PVA）、またはアルギン酸ナトリウム等のフィルム形成ポリマーを含有する。
[00198] 経口投与のための液体調製物は、シロップ、溶液、または懸濁液の形態にあり得る。溶液は、例えば、式（Ｉ）の化合物を含有し得、残部は、糖類、ならびにエタノール、水、グリセロール、およびプロピレングリコールの混合物である。任意選択により、そのような液体調製物は、着色剤、香味剤、増粘剤としてのサッカリンおよび／またはカルボキシメチルセルロースを含有し得る。さらに、経口使用のための製剤を作製する場合、当業者に公知の他の賦形剤が使用され得る。
[00199] 方法の１つの実施形態において、薬学的組成物は、国際出願公開第ＷＯ２０１９／１６６６２６号に記載される組成物の１種であり、その開示はすべての目的上参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。
[00200] 方法の別の実施形態において、患者に投与される薬学的組成物は、
（a）約１～約３０ｗｔ％の式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩；
（b）約４５～約８５ｗｔ％の薬学的希釈剤；
（c）約６～約３０ｗｔ％の圧縮補助剤（compression aid）；
（d）約１～約１５ｗｔ％の薬学的崩壊剤；
（e）約０．００～約２ｗｔ％の薬学的滑剤；および
（f）約１～約１０ｗｔ％の薬学的潤滑剤；
を含む組成物（A）であり、構成要素は合計すると１００ｗｔ％になる。
[00201] さらなる実施形態において、式（Ｉ）の化合物はブレンソカチブである。１つの実施形態において、ブレンソカチブは多形形態Ａにある。別の実施形態において、ブレンソカチブは、上で記載されるＸ線粉末回折パターンの１つによって特徴付けられる。
[00202] 方法の一部の実施形態において、組成物（A）は、組成物の総重量の約１～約２５ｗｔ％；約１～約２０ｗｔ％；約１～約１５ｗｔ％；約１～約１０ｗｔ％；約１～約５ｗｔ％；または約１～約３ｗｔ％の量で、式（Ｉ）の化合物、例えばブレンソカチブを含む。
[00203] 方法の一部の実施形態において、組成物（A）は、組成物の総重量の約１．５～約３０ｗｔ％；約１．５～約２５ｗｔ％；約１．５～約２０ｗｔ％；約１．５～約１５ｗｔ％；約１．５～約１０ｗｔ％；または約１．５～約５ｗｔ％の量で、式（Ｉ）の化合物、例えばブレンソカチブを含む。
[00204] 方法の一部の実施形態において、組成物（A）は、組成物の総重量の約３～約３０ｗｔ％；約３～約２５ｗｔ％；約３～約２０ｗｔ％；約３～約１５ｗｔ％；約３～約１０ｗｔ％；または約３～約５ｗｔ％の量で、式（Ｉ）の化合物、例えばブレンソカチブを含む。さらなる実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、組成物の総重量の約３～約１０ｗｔ％で存在する。さらなる実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、ブレンソカチブまたはその薬学的に許容される塩である。
[00205] 方法の一部の実施形態において、組成物（A）は、組成物の総重量の約１ｗｔ％、約２ｗｔ％、約３ｗｔ％、約４ｗｔ％、約５ｗｔ％、約６ｗｔ％、約７ｗｔ％、約８ｗｔ％、約９ｗｔ％、約１０ｗｔ％、約１１ｗｔ％、約１２ｗｔ％、約１３ｗｔ％、約１４ｗｔ％、約１５ｗｔ％、約１６ｗｔ％、約１７ｗｔ％、約１８ｗｔ％、約１９ｗｔ％、約２０ｗｔ％、約２１ｗｔ％、約２２ｗｔ％、約２３ｗｔ％、約２４ｗｔ％、約２５ｗｔ％、約２６ｗｔ％、約２７ｗｔ％、約２８ｗｔ％、約２９ｗｔ％、または約３０ｗｔ％の量で、式（Ｉ）の化合物、例えばブレンソカチブを含む。
[00206] 方法の一部の実施形態において、組成物（A）は、微結晶セルロース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸セルロース、エリトリトール、エチルセルロース、フルクトース、イヌリン、イソマルト、ラクチトール、ラクトース、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、マルチトール、マルトデキストリン、マルトース、マンニトール、ポリデキストロース、ポリエチレングリコール、プルラン、シメチコン、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ソルビトール、デンプン、スクロース、トレハロース、キシリトール、および前述のものの組み合わせからなる群から選択される１種または複数の薬学的希釈剤を含む。１つの実施形態において、組成物（A）は、２種以上の薬学的希釈剤を含む。別の実施形態において、組成物（A）は、１種の薬学的希釈剤を含む。さらなる実施形態において、薬学的希釈剤は微結晶セルロースである。微結晶セルロースは、経口錠剤およびカプセル製剤における結合剤／希釈剤であり、乾式造粒、湿式造粒、および直接圧縮過程において使用され得る。
[00207] 方法の一部の実施形態において、組成物（A）は、組成物の総重量の約４５～約８０ｗｔ％、約４５～約７５ｗｔ％、約４５～約７０ｗｔ％、約４５～約６５ｗｔ％、約４５～約６０ｗｔ％、または約４５～約５５ｗｔ％の量で、１種または複数の薬学的希釈剤を含む。さらなる実施形態において、１種または複数の薬学的希釈剤は微結晶セルロースを含む。さらにさらなる実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、ブレンソカチブまたはその薬学的に許容される塩である。
[00208] 方法の一部の実施形態において、組成物（A）は、組成物の総重量の約５０～約８５ｗｔ％、約５０～約７５ｗｔ％、約５５～約８５ｗｔ％、約５５～約７０ｗｔ％、約６０～約８５ｗｔ％、約６５～約８５ｗｔ％、約７０～約８５ｗｔ％、または約７５～約８５ｗｔ％の量で、１種または複数の薬学的希釈剤を含む。さらなる実施形態において、１種または複数の薬学的希釈剤は、組成物の総重量の約５５～約７０ｗｔ％で存在する。さらなる実施形態において、１種または複数の薬学的希釈剤は微結晶セルロースを含む。さらにさらなる実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、ブレンソカチブまたはその薬学的に許容される塩である。
[00209] 方法の一部の実施形態において、組成物（A）は、組成物の総重量の約４５ｗｔ％、約５０ｗｔ％、約５５ｗｔ％、約６０ｗｔ％、約６５ｗｔ％、約７０ｗｔ％、約７５ｗｔ％、約８０ｗｔ％、または約８５ｗｔ％の量で、１種または複数の薬学的希釈剤を含む。
[00210] 方法の一部の実施形態において、組成物（A）における１種または複数の薬学的希釈剤は微結晶セルロースである。他の実施形態において、１種または複数の薬学的希釈剤は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸セルロース、エリトリトール、エチルセルロース、フルクトース、イヌリン、イソマルト、ラクチトール、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、マルチトール、マルトデキストリン、マルトース、マンニトール、ポリデキストロース、ポリエチレングリコール、プルラン、シメチコン、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ソルビトール、デンプン、スクロース、トレハロース、およびキシリトールを含む。
[00211] 本開示において、「崩壊剤（disintegrant）」および「崩壊剤（disintegrants）」という用語は、薬学的製剤科学の文脈において解釈されることを意図される。したがって、組成物（A）における崩壊剤は、例えばアルギン酸、アルギン酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、キトサン、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、グリシン、グアーガム、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、メチルセルロース、ポビドン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、デンプン、またはその組み合わせであり得る。
[00212] 方法の一部の実施形態において、組成物（A）における１種または複数の崩壊剤はデンプングリコール酸ナトリウムである。１つの実施形態において、組成物（A）に存在する崩壊剤の量は、組成物の総重量の２％～８％である。さらなる実施形態において、崩壊剤の量は、組成物の総重量の約２ｗｔ％、約２．５ｗｔ％、約３ｗｔ％、約３．５ｗｔ％、約４ｗｔ％、または約４．５ｗｔ％である。デンプングリコール酸ナトリウムの物理的特性、それゆえ崩壊剤としてのその有効性は、架橋の度合い、カルボキシメチル化の程度、および純度の影響を受ける。
[00213] 方法の一部の実施形態において、組成物（A）における１種または複数の薬学的崩壊剤はクロスカルメロースナトリウムを含む。
[00214] 方法の一部の実施形態において、組成物（A）は、組成物の総重量の約２～約１４ｗｔ％、約２～約１３ｗｔ％、約２～約１２ｗｔ％、約２～約１１ｗｔ％、約２～約１０ｗｔ％、約２～約９ｗｔ％、約２～約８ｗｔ％、約２～約７ｗｔ％、約２～約６ｗｔ％、約２～約５ｗｔ％、約３．５～約４．５ｗｔ％の量で、１種または複数の薬学的崩壊剤を含む。さらなる実施形態において、１種または複数の薬学的崩壊剤は、薬学的組成物の総重量の約３．５～約４．５ｗｔ％で存在する。さらなる実施形態において、１種または複数の薬学的崩壊剤はデンプングリコール酸ナトリウムである。さらなる実施形態において、１種または複数の薬学的希釈剤は微結晶セルロースを含む。さらにさらなる実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、ブレンソカチブまたはその薬学的に許容される塩である。
[00215] 本開示において、「滑剤」および「滑化剤」という用語は、薬学的製剤科学の文脈において解釈されることを意図される。したがって、組成物（A）における滑剤は、例えば二酸化ケイ素、コロイド状二酸化ケイ素、粉末セルロース、疎水性コロイド状シリカ、酸化マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、三ケイ酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、およびタルクであり得る。
[00216] したがって、方法の一部の実施形態において、組成物（A）における１種または複数の薬学的滑剤は、二酸化ケイ素、コロイド状二酸化ケイ素、粉末セルロース、疎水性コロイド状シリカ、酸化マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、三ケイ酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、タルク、または前述のものの組み合わせから選択される。１つの実施形態において、滑剤は二酸化ケイ素である。その小さな粒子サイズおよび大きな特異的表面積は、錠剤化およびカプセル充填等のいくつかの過程における乾燥粉末の流動特性を向上させるために活用される望ましい流動特徴をそれに与える。本明細書における使用のための典型的な二酸化ケイ素濃度は約０．０５～約１．０ｗｔ％に及ぶ。多孔質シリカゲル粒子も滑剤として使用され得、それは、０．２５～１％の典型的濃度を有して、一部の製剤にとって利点であり得る。
[00217] 方法の一部の実施形態において、組成物（A）は、組成物の総重量の約０．００～約１．７５ｗｔ％；約０．００～約１．５０ｗｔ％；約０．００～約１．２５ｗｔ％；約０．００～約１．００ｗｔ％；約０．００～約０．７５ｗｔ％；約０．００～約０．５０ｗｔ％；約０．００～約０．２５ｗｔ％；約０．００～約０．２０ｗｔ％の量で、１種または複数の薬学的滑剤を含む。さらなる実施形態において、１種または複数の薬学的滑剤は二酸化ケイ素を含む。さらなる実施形態において、１種または複数の薬学的崩壊剤はデンプングリコール酸ナトリウムである。さらなる実施形態において、１種または複数の薬学的希釈剤は微結晶セルロースを含む。さらにさらなる実施形態において、組成物（A）における式（Ｉ）の化合物は、ブレンソカチブまたはその薬学的に許容される塩である。
[00218] 方法の一部の実施形態において、組成物（A）は、組成物の総重量の約０．０５～約２ｗｔ％；約０．０５～約１．７５ｗｔ％；約０．０５～約１．５０ｗｔ％；約０．０５～約１．２５ｗｔ％；約０．０５～約１．００ｗｔ％；約０．０５～約０．７５ｗｔ％；約０．０５～約０．５０ｗｔ％；約０．０５～約０．２５ｗｔ％；または約０．０５～約０．２０ｗｔ％の量で、１種または複数の薬学的滑剤を含む。さらなる実施形態において、１種または複数の薬学的滑剤は、組成物の総重量の約０．０５～約０．２５ｗｔ％で存在する。さらなる実施形態において、１種または複数の薬学的滑剤は二酸化ケイ素を含む。さらなる実施形態において、１種または複数の薬学的崩壊剤はデンプングリコール酸ナトリウムである。さらなる実施形態において、１種または複数の薬学的希釈剤は微結晶セルロースを含む。さらにさらなる実施形態において、組成物（A）における式（Ｉ）の化合物は、ブレンソカチブまたはその薬学的に許容される塩である。
[00219] 方法の一部の実施形態において、組成物（A）は、組成物の総重量の約０．０５～約２ｗｔ％；約０．１０～約２ｗｔ％；約０．２～約２ｗｔ％；約０．３～約２ｗｔ％；または約０．４０～約２ｗｔ％の量で、１種または複数の薬学的滑剤を含む。さらなる実施形態において、１種または複数の薬学的滑剤は二酸化ケイ素を含む。さらなる実施形態において、１種または複数の薬学的崩壊剤はデンプングリコール酸ナトリウムである。さらなる実施形態において、１種または複数の薬学的希釈剤は微結晶セルロースを含む。さらにさらなる実施形態において、組成物（A）における式（Ｉ）の化合物は、ブレンソカチブまたはその薬学的に許容される塩である。
[00220] 本開示において、本明細書において使用される「潤滑剤（lubricant）」および「潤滑剤（lubricants）」という用語は、薬学的製剤科学の文脈において解釈されることを意図される。したがって、潤滑剤は、例えばステアリン酸カルシウム、ベヘン酸グリセリル、モノステアリン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセリル、グリセリンのベヘン酸エステルの混合物（例えば、ジベヘン酸グリセリル（glyceryl bihenehate）、トリベヘニン、およびベヘン酸グリセリルの混合物）、ロイシン、ステアリン酸マグネシウム、ミリスチン酸、パルミチン酸、ポロキサマー、ポリエチレングリコール、安息香酸カリウム、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、フマル酸ステアリルナトリウム、ステアリン酸、タルク、トリベヘニン、およびステアリン酸亜鉛であり得る。
[00221] したがって、方法の一部の実施形態において、組成物（A）における１種または複数の薬学的潤滑剤は、ステアリン酸カルシウム、ベヘン酸グリセリル、モノステアリン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセリル、グリセリンのベヘン酸エステルの混合物（例えば、ジベヘン酸グリセリル、トリベヘニン、およびベヘン酸グリセリルの混合物）、ロイシン、ステアリン酸マグネシウム、ミリスチン酸、パルミチン酸、ポロキサマー、ポリエチレングリコール、安息香酸カリウム、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、フマル酸ステアリルナトリウム、ステアリン酸、タルク、トリベヘニン、およびステアリン酸亜鉛からなる群から選択される。他の実施形態において、１種または複数の薬学的潤滑剤は、ステアリン酸カルシウム、ベヘン酸グリセリル、モノステアリン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセリル、グリセリンのベヘン酸エステルの混合物（例えば、ジベヘン酸グリセリル、トリベヘニン、およびベヘン酸グリセリルの混合物）、ロイシン、ステアリン酸マグネシウム、ミリスチン酸、パルミチン酸、ポロキサマー、ポリエチレングリコール、安息香酸カリウム、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸、タルク、トリベヘニン、およびステアリン酸亜鉛からなる群から選択される。
[00222] 方法の一部の実施形態において、組成物（A）は、１種または複数の薬学的潤滑剤を含み、潤滑剤はフマル酸ステアリルナトリウムではない。さらなる実施形態において、組成物（A）における式（Ｉ）の化合物は、ブレンソカチブまたはその薬学的に許容される塩である。
[00223] 方法の１つの実施形態において、組成物（A）は、潤滑剤としてベヘン酸グリセロールを含む。
[00224] 方法の一部の実施形態において、組成物（A）における１種または複数の薬学的潤滑剤は、ベヘン酸グリセリル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはその組み合わせを含む。
[00225] 方法の１つの実施形態において、組成物（A）における潤滑剤は、ベヘン酸グリセリル、ステアリン酸マグネシウム、またはその組み合わせである。
[00226] 方法の１つの実施形態において、組成物（A）における１種または複数の薬学的潤滑剤は、フマル酸ステアリルナトリウムおよび／またはグリセリンの１種もしくは複数のベヘン酸エステルを含む。
[00227] 方法の一部の実施形態において、組成物（A）は、組成物の総重量の約１ｗｔ％～約９ｗｔ％、約１ｗｔ％～約８ｗｔ％、約１ｗｔ％～約７ｗｔ％、約１ｗｔ％～約６ｗｔ％、約１ｗｔ％～約５ｗｔ％、約２ｗｔ％～約１０ｗｔ％、約２．５ｗｔ％～約１０ｗｔ％、約２ｗｔ％～約８ｗｔ％、約２ｗｔ％～約７ｗｔ％、約２ｗｔ％～約６ｗｔ％、約２ｗｔ％～約５ｗｔ％、約２ｗｔ％～約４．５ｗｔ％、または約２．５ｗｔ％～約４．５ｗｔ％の量で、１種または複数の薬学的潤滑剤を含む。さらなる実施形態において、１種または複数の薬学的潤滑剤は、組成物の総重量の約２．５～約４．５ｗｔ％で存在する。さらなる実施形態において、組成物（A）における１種または複数の薬学的潤滑剤はベヘン酸グリセロールである。さらなる実施形態において、組成物（A）における１種または複数の薬学的滑剤は二酸化ケイ素を含む。さらなる実施形態において、組成物（A）における１種または複数の薬学的崩壊剤はデンプングリコール酸ナトリウムである。さらなる実施形態において、組成物（A）における１種または複数の薬学的希釈剤は微結晶セルロースを含む。さらにさらなる実施形態において、組成物（A）における式（Ｉ）の化合物は、ブレンソカチブまたはその薬学的に許容される塩である。
[00228] 方法の１つの実施形態において、組成物（A）における１種または複数の薬学的潤滑剤は、フマル酸ステアリルナトリウムおよび／またはグリセリンの１種もしくは複数のベヘン酸エステル、あるいはその混合物からなる。
[00229] 方法の別の実施形態において、組成物（A）における１種または複数の薬学的潤滑剤は、フマル酸ステアリルナトリウム、ジベヘン酸グリセリル、ベヘン酸グリセリル、トリベヘニン、またはその任意の混合物からなる。
[00230] 方法の１つの実施形態において、組成物（A）における１種または複数の薬学的潤滑剤はフマル酸ステアリルナトリウムを含む。別の実施形態において、組成物（A）における１種または複数の薬学的潤滑剤はフマル酸ステアリルナトリウムからなる。
[00231] 方法の１つの実施形態において、組成物（A）における１種または複数の薬学的潤滑剤は、グリセリンの１種または複数のベヘン酸エステル（すなわち、ジベヘン酸グリセリル、トリベヘニン、およびベヘン酸グリセリルのうちの１種または複数）を含む。
[00232] 方法の１つの実施形態において、組成物（A）における圧縮補助剤はリン酸二カルシウム二水和物（第二リン酸カルシウム二水和物（dibasic calcium phosphate dihydrate）としても知られる）（DCPD）である。ＤＣＰＤは、賦形剤としても、栄養補給剤におけるカルシウムおよびリンの供給源としても、錠剤製剤において使用される。
[00233] 方法の１つの実施形態において、組成物（A）は、組成物の総重量の約１６ｗｔ％、約１７ｗｔ％、約１８ｗｔ％、約１９ｗｔ％、約２０ｗｔ％、約２１ｗｔ％、約２２ｗｔ％、約２３ｗｔ％、または約２４ｗｔ％を含めた約１０～約３０ｗｔ％の量で、圧縮補助剤、例えばＤＣＰＤを含む。さらなる実施形態において、圧縮補助剤は、組成物の総重量の約２０ｗｔ％で存在する。
[00234] 方法の１つの実施形態において、組成物（A）は、組成物の総重量の約１０～約２５ｗｔ％、約１０～約２０ｗｔ％、約１０～約１５ｗｔ％、約１５～約２５ｗｔ％、または約２０～約２５ｗｔ％、または約１８～約２２ｗｔ％の量で、圧縮補助剤、例えばＤＣＰＤを含む。さらなる実施形態において、圧縮補助剤は、組成物の総重量の約１８～約２２ｗｔ％で存在する。さらなる実施形態において、圧縮補助剤はＤＣＰＤである。さらなる実施形態において、組成物（A）における１種または複数の薬学的潤滑剤はベヘン酸グリセロールである。さらなる実施形態において、組成物（A）における１種または複数の薬学的滑剤は二酸化ケイ素を含む。さらなる実施形態において、組成物（A）における１種または複数の薬学的崩壊剤はデンプングリコール酸ナトリウムである。さらなる実施形態において、組成物（A）における１種または複数の薬学的希釈剤は微結晶セルロースを含む。さらにさらなる実施形態において、例示的な組成物における式（Ｉ）の化合物は、ブレンソカチブまたはその薬学的に許容される塩である。
[00235] 方法の１つの実施形態において、患者に投与される薬学的組成物は、
（a）約１～約３０ｗｔ％の式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩；
（b）約５５～約７５ｗｔ％の薬学的希釈剤；
（c）約１５～約２５ｗｔ％の圧縮補助剤；
（d）約３～約５ｗｔ％の薬学的崩壊剤；
（e）約０．００～約１ｗｔ％の薬学的滑剤；および
（f）約２～約６ｗｔ％の薬学的潤滑剤；
を含む組成物（B）であり、構成要素は合計すると１００ｗｔ％になる。
[00236] 組成物（B）が患者に投与される方法の一部の実施形態において、組成物における薬学的希釈剤、圧縮補助剤、薬学的崩壊剤、薬学的滑剤、および薬学的潤滑剤の正体は、組成物（A）に関して上で記載されるものの１種であり得る。他の実施形態において、組成物（B）における薬学的希釈剤、圧縮補助剤、薬学的崩壊剤、薬学的滑剤、および薬学的潤滑剤の量も、量が、組成物（B）に関して上で挙げられる相当するより広い域内にある限りにおいて、組成物（A）に関して上で記載されるものの１つであり得る。
[00237] 組成物（A）および（B）を含めた、本明細書に開示される薬学的組成物は、人間への経口投与に適切な固体剤形にあり得る。例えば、薬学的組成物は薬学的錠剤である。薬学的錠剤は、例えば国際出願公開第ＷＯ２０１９／１６６６２６号に記載される乾式混合／直接圧縮過程を含めた、当業者に公知の方法を使用して調製され得る。一部の実施形態において、薬学的錠剤は錠剤コアを含み、錠剤コアは本明細書に開示される薬学的組成物を含み、錠剤コアはコーティングを有する。一部の実施形態において、コーティングはフィルムコーティングである。フィルムコーティングは、当業者に公知の従来の方法を使用して適用され得る。機能的コーティングを使用して、例えば湿気侵入または光による分解からの保護を提供し得る。付加的に、機能的コーティングを使用して、組成物からの式（Ｉ）の化合物、例えばブレンソカチブの放出を改変し得るまたは制御し得る。コーティングは、例えば薬学的組成物の総重量の約０．２～約１０ｗｔ％、例えば薬学的組成物の総重量の約０．２～約４ｗｔ％、約０．２～約３ｗｔ％、約１～約６ｗｔ％、または約２～約５ｗｔ％を構成し得る。
ＤＰＰ１媒介性病態
[00238] 一部の実施形態において、本明細書において提供される治療方法に適したＤＰＰ１媒介性病態は気道の閉塞性疾患である。気道の閉塞性疾患の非限定的な例は、間欠性でも持続性でも、およびすべての重症度の、気管支性、アレルギー性、内因性、外因性、運動誘導性、薬物誘導性（アスピリンおよびNSAID誘導性を含む）、およびダスト誘導性喘息を含めた喘息、ならびに気道過敏症の他の原因；慢性閉塞性肺疾患（COPD）；感染性および好酸球性気管支炎を含めた気管支炎；肺気腫；気管支拡張症；嚢胞性線維症；サルコイドーシス；アルファ－１アンチトリプシン欠乏症；農夫肺および関連疾患；過敏性肺臓炎；原因不明の線維化性肺胞炎、特発性間質性肺炎、抗新生物療法を複雑にする線維症を含めた肺線維症、ならびに結核およびアスペルギルス症、ならびに他の真菌感染症を含めた慢性感染症；肺移植の合併症；肺血管系の血管炎性および血栓性障害、ならびに肺高血圧症；気道の炎症性および分泌性病態と関連した慢性の咳、ならびに医原性の咳の治療を含めた鎮咳作用；薬物性鼻炎および血管運動性鼻炎を含めた急性および慢性鼻炎；神経性鼻炎を含めた通年性および季節性アレルギー性鼻炎（花粉症）；鼻ポリープ；感冒を含めた急性ウイルス性感染症、ならびに呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザ、コロナウイルス（SARSを含む）、およびアデノウイルスに起因した感染症に起因した気道の閉塞性疾患、急性肺傷害、ならびに急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ならびに前述の呼吸器疾患状態のそれぞれの増悪を含む。
[00239] １つの実施形態において、方法によって治療されるＤＰＰ１媒介性病態は喘息（気管支性、アレルギー性、内因性、外因性、またはダスト喘息、特に慢性または常習性喘息（例えば、遅発型喘息または気道過敏症）等）である。
[00240] １つの実施形態において、方法によって治療されるＤＰＰ１媒介性病態は慢性閉塞性肺疾患（COPD）である。
[00241] １つの実施形態において、方法によって治療されるＤＰＰ１媒介性病態はアレルギー性鼻炎である。
[00242] １つの実施形態において、方法によって治療されるＤＰＰ１媒介性病態はアルファ－１アンチトリプシン欠乏症である。
[00243] １つの実施形態において、方法によって治療されるＤＰＰ１媒介性病態は急性呼吸窮迫症候群（ARDS）である。
[00244] １つの実施形態において、方法によって治療されるＤＰＰ１媒介性病態は気管支拡張症である。気管支拡張症は、嚢胞性線維症を有する患者における、または嚢胞性線維症を有しない患者における（「嚢胞性線維症と無関係の気管支拡張症」または「非嚢胞性線維症（CF）気管支拡張症」と称されることもある）ものであり得る。式（Ｉ）の化合物を使用して気管支拡張症を治療する方法は、すべての目的上本明細書における参照によりその全体として組み入れられる、米国出願公開第２０１８／００２８５４１号に記載される。
[00245] 気管支拡張症は、多くの疾患過程により生じる病理学的終点と見なされ、拡張した壁の厚い気管支によって特徴付けられる持続性または進行性病態である。症状は、喀出の間欠的発作、およびしばしば大量の膿性痰の持続的な毎日の喀出の影響を受ける肺の領域に限局された感染症から様々である。気管支拡張症は、他の非特異的な呼吸器症状と関連し得る。理論によって拘束されることを望むことなく、気管支拡張症の根底にある病理学的過程は、炎症が過程の中心となる事象または一連の事象により生じる気道への損傷として報告されている（すべての目的上本明細書における参照によりその全体として組み入れられる、Guideline for non-CF Bronchiectasis、Thorax、２０１０年７月、第６５巻（補足１））。非ＣＦ気管支拡張症は、遺伝病から気道異物の保持に及ぶ数々の病因によって引き起こされるまたはそれと関連すると報告されており、全身性疾患、慢性閉塞性肺疾患（COPD）等のよく見られる呼吸器疾患、ならびにサルコイドーシス等の稀少な疾患を有する患者に存在すると報告されている（すべての目的上本明細書における参照によりその全体として組み入れられる、ChangおよびBilton（２００８）、Thorax 63、２６９～２７６頁）。
[00246] １つの実施形態において、方法によって治療されるＤＰＰ１媒介性病態は、多発血管炎性肉芽腫症（GPA）または顕微鏡的多発血管炎（MPA）を含むがそれらに限定されない、抗好中球細胞質自己抗体（ANCA）関連血管炎である。式（Ｉ）の化合物を使用してＡＮＣＡ関連血管炎（例えば、GPAまたはMPA）を治療する方法は、すべての目的上本明細書における参照によりその全体として組み入れられる、米国出願公開第２０１９／０２４７４００号に記載される。
[00247] １つの実施形態において、方法によって治療されるＤＰＰ１媒介性病態は嚢胞性線維症である。嚢胞性線維症（CF）は、ＣＦ膜コンダクタンス調節タンパク質の異常によって引き起こされ、慢性肺感染症（特に、Pseudomonas aeruginosaによる）および過度の炎症を引き起こし、気管支拡張症、衰退する肺機能、呼吸不全、および生活の質につながる。炎症過程は、細胞外マトリックスタンパク質に直接作用し、炎症および感染症への宿主応答において役割を果たす、ＮＥ、ならびにＣａｔＧおよびＰＲ３を含めた他の破壊的ＮＳＰを産生する好中球によって支配される（Dittrichら、Eur Respir J．2018；51（3））。理論によって拘束されることを望むことなく、本明細書において提供される方法により投与される、ＤＰＰ１の可逆的阻害剤である式（Ｉ）の化合物は、ＮＳＰの活性化の有効な阻害および炎症を減少させることにより有益な効果を有し、それは今度は、ＣＦ患者における肺の増悪の減少、肺の増悪の速度の減少、および／または肺機能（例えば、１秒間における努力呼気肺活量（forced expiratory volume）［FEV1］）の向上につながると考えられる。
[00248] 一部の実施形態において、本明細書において提供される治療方法に適したＤＰＰ１媒介性病態は、原発性固形腫瘍、液性腫瘍、または転移性癌を含めた癌である。１つの実施形態において、ＤＰＰ１は、癌患者の癌性細胞、好中球、マクロファージ、単球、または肥満細胞によって発現される。
[00249] ＤＰＰ１によって活性化される好中球エラスターゼ（NE）、プロテイナーゼ３（PR3）、カテプシンＧ（CatG）、および好中球セリンプロテアーゼ４（NSP4）を含めたＮＳＰは、腫瘍開始、腫瘍進行、および/または腫瘍転移を媒介し得る。さらに、好中球は、血管内播種、溢出、および転移成長等、転移のステージにおいて重要な役割を果たす。好中球は、セレクチンおよびインテグリンのそれらの表面発現により、転移部位における内皮への癌細胞接着を支援し得る。好中球由来ＩＬ－１βは、腫瘍細胞溢出を促進し得る。さらに、好中球細胞外トラップ（NET）は、腫瘍細胞の侵襲性および遊走性挙動を誘導し得る。ＮＥＴは、トロンボスポンジン－１の分解ももたらし得、それは今度は、転移性癌成長を促す。理論によって拘束されることを望むことなく、式（Ｉ）の化合物によるＤＰＰ１機能の阻害は、ＮＳＰおよび／または好中球の癌促進性機能の阻害、それゆえ多様な癌の発症、成長、および進行、ならびに様々なステージにおける癌転移（血管内播種、溢出等）の阻害をもたらし得ると考えられる。
[00250] １つの実施形態において、方法によって治療されるＤＰＰ１媒介性病態は、原発性固形腫瘍を含む癌である。一部の実施形態において、癌は、乳癌、膀胱癌、肺癌、脳腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肝臓癌、肝細胞癌腫、腎臓癌、胃癌、皮膚癌、線維性癌、リンパ腫、ウイルス誘導性癌、口腔咽頭癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、黒色腫、および骨癌からなる群から選択される。
[00251] １つの実施形態において、癌は膀胱癌である。
[00252] １つの実施形態において、癌は肺癌である。
[00253] １つの実施形態において、癌は脳腫瘍である。一部の実施形態において、脳腫瘍は、星細胞腫、退形成性星細胞腫、多形性膠芽細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫、髄膜腫、神経鞘腫、または髄芽腫である。一部の実施形態において、脳腫瘍は星細胞腫である。一部の実施形態において、脳腫瘍は退形成性星細胞腫である。一部の実施形態において、脳腫瘍は多形性膠芽細胞腫である。一部の実施形態において、脳腫瘍は乏突起膠腫である。一部の実施形態において、脳腫瘍は上衣腫である。一部の実施形態において、脳腫瘍は髄膜腫である。一部の実施形態において、脳腫瘍は神経鞘腫である。一部の実施形態において、脳腫瘍は髄芽腫である。
[00254] １つの実施形態において、癌は卵巣癌である。
[00255] １つの実施形態において、癌は膵臓癌である。
[00256] １つの実施形態において、癌は結腸直腸癌である。
[00257] １つの実施形態において、癌は前立腺癌である。
[00258] １つの実施形態において、癌は肝臓癌である。
[00259] １つの実施形態において、癌は肝細胞癌腫である。
[00260] １つの実施形態において、癌は腎臓癌である。
[00261] １つの実施形態において、癌は胃癌である。
[00262] １つの実施形態において、癌は皮膚癌である。
[00263] １つの実施形態において、癌は線維性癌である。さらなる実施形態において、線維性癌は平滑筋肉腫である。
[00264] １つの実施形態において、癌はリンパ腫である。一部の実施形態において、リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞免疫芽球性リンパ腫、ナチュラルキラー細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、またはカポジ肉腫である。一部の実施形態において、リンパ腫はホジキンリンパ腫である。一部の実施形態において、リンパ腫は非ホジキンリンパ腫である。一部の実施形態において、リンパ腫はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。一部の実施形態において、リンパ腫はＢ細胞免疫芽球性リンパ腫である。一部の実施形態において、リンパ腫はナチュラルキラー細胞リンパ腫である。一部の実施形態において、リンパ腫はＴ細胞リンパ腫である。一部の実施形態において、リンパ腫はバーキットリンパ腫である。一部の実施形態において、リンパ腫はカポジ肉腫である。
[00265] １つの実施形態において、癌はウイルス誘導性癌である。
[00266] １つの実施形態において、癌は口腔咽頭癌である。
[00267] １つの実施形態において、癌は精巣癌である。
[00268] １つの実施形態において、癌は胸腺癌である。
[00269] １つの実施形態において、癌は甲状腺癌である。
[00270] １つの実施形態において、癌は黒色腫である。
[00271] １つの実施形態において、癌は骨癌である。
[00272] １つの実施形態において、癌は乳癌である。一部の実施形態において、乳癌は、腺管癌腫、小葉癌腫、髄様癌腫、膠様癌腫、管状癌腫、または炎症性乳癌を含む。一部の実施形態において、乳癌は腺管癌腫を含む。一部の実施形態において、乳癌は小葉癌腫を含む。一部の実施形態において、乳癌は髄様癌腫を含む。一部の実施形態において、乳癌は膠様癌腫を含む。一部の実施形態において、乳癌は管状癌腫を含む。一部の実施形態において、乳癌は炎症性乳癌を含む。
[00273] 一部の実施形態において、乳癌はトリプルネガティブ乳癌である。一部の実施形態において、乳癌は、ホルモン療法またはＨＥＲ２タンパク質受容体を標的にする治療法に応答しない。
[00274] １つの実施形態において、方法によって治療されるＤＰＰ１媒介性病態は、液性腫瘍を含む癌である。一部の実施形態において、液性腫瘍は、急性骨髄白血病（AML）、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性前骨髄球性白血病、慢性骨髄白血病、有毛細胞白血病、骨髄増殖性障害、ナチュラルキラー細胞白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、慢性骨髄性白血病（CML）、肥満細胞症、慢性リンパ球性白血病（CLL）、多発性骨髄腫（MM）、および骨髄異形成症候群（MDS）からなる群から選択される。一部の実施形態において、液性腫瘍は急性骨髄白血病（AML）である。一部の実施形態において、液性腫瘍は急性リンパ芽球性白血病である。一部の実施形態において、液性腫瘍は急性リンパ球性白血病である。一部の実施形態において、液性腫瘍は急性前骨髄球性白血病である。一部の実施形態において、液性腫瘍は慢性骨髄白血病である。一部の実施形態において、液性腫瘍は有毛細胞白血病である。一部の実施形態において、液性腫瘍は骨髄増殖性障害である。一部の実施形態において、液性腫瘍はナチュラルキラー細胞白血病である。一部の実施形態において、液性腫瘍は芽球性形質細胞様樹状細胞新生物である。一部の実施形態において、液性腫瘍は慢性骨髄性白血病（CML）である。一部の実施形態において、液性腫瘍は肥満細胞症である。一部の実施形態において、液性腫瘍は慢性リンパ球性白血病（CLL）である。一部の実施形態において、液性腫瘍は多発性骨髄腫（MM）である。一部の実施形態において、液性腫瘍は骨髄異形成症候群（MDS）である。
[00275] １つの実施形態において、方法によって治療されるＤＰＰ１媒介性病態は小児癌である。一部の実施形態において、小児癌は、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、骨肉腫、またはユーイング肉腫である。一部の実施形態において、小児癌は神経芽細胞腫である。一部の実施形態において、小児癌はウィルムス腫瘍である。一部の実施形態において、小児癌は横紋筋肉腫である。一部の実施形態において、小児癌は網膜芽細胞腫である。一部の実施形態において、小児癌は骨肉腫である。一部の実施形態において、小児癌はユーイング肉腫である。
[00276] 一部の実施形態において、方法によって治療されるＤＰＰ１媒介性病態は転移性癌である。一部の実施形態において、患者は、転移性癌を発症するリスクがある。一部の実施形態において、転移性癌は転移性乳癌を含む。さらなる実施形態において、転移性乳癌は、肺、脳、骨、膵臓、リンパ節、および／または肝臓への乳癌の転移を含む。なおさらなる実施形態において、転移性乳癌は、肺への乳癌の転移を含む。他の実施形態において、転移性癌は、肺への骨癌の転移を含む。他の実施形態において、転移性癌は、腹膜、膵臓、胃、肺、肝臓、腎臓、および／または脾臓への結腸直腸癌の転移を含む。他の実施形態において、転移性癌は、腸間膜、脾臓、膵臓、肺、肝臓、副腎、および／または卵巣への胃癌の転移を含む。他の実施形態において、転移性癌は、リンパ節、肺、肝臓、後肢、脳、腎臓、および／または脾臓への白血病の転移を含む。他の実施形態において、転移性癌は、腸、脾臓、膵臓、胃、肺、および／または腎臓への肝臓癌の転移を含む。他の実施形態において、転移性癌は、腎臓、卵巣、肝臓、膀胱、および／または脾臓へのリンパ腫の転移を含む。
[00277] 他の実施形態において、転移性癌は、腸、肺、肝臓、脾臓、腎臓、および／または胃への造血性癌の転移を含む。他の実施形態において、転移性癌は、リンパ節および／または肺への黒色腫の転移を含む。他の実施形態において、転移性癌は、腸間膜、卵巣、腎臓、脾臓、リンパ節、胃、および／または肝臓への膵臓癌の転移を含む。他の実施形態において、転移性癌は、肺、膵臓、腎臓、脾臓、腸、肝臓、骨、および／またはリンパ節への前立腺癌の転移を含む。他の実施形態において、転移性癌は、横隔膜、肝臓、腸、胃、肺、膵臓、脾臓、腎臓、リンパ節、および／または子宮への卵巣癌の転移を含む。他の実施形態において、転移性癌は、骨への骨髄腫の転移を含む。
[00278] 他の実施形態において、転移性癌は、骨、脳、リンパ節、肝臓、卵巣、および／または腸への肺癌の転移を含む。他の実施形態において、転移性癌は、肝臓、肺、膵臓、胃、脳、および／または脾臓への腎臓癌の転移を含む。他の実施形態において、転移性癌は、骨、肝臓、および／または肺への膀胱癌の転移を含む。他の実施形態において、転移性癌は、骨、肝臓、および／または肺への甲状腺癌の転移を含む。
[00279] 本発明は、以下の実施例を参照することによってさらに解説される。しかしながら、これらの実施例は、上で記載される実施形態のように、例示であり、決して本発明の範囲を制限するものとして捉えられるべきではないことに留意すべきである。
[00280] 下の実施例１～８は、白血球（WBC）を含む患者サンプルからのＮＥ、ＰＲ３、およびＣａｔＧの抽出および活性アッセイの向上のための条件および手順を検討する。
材料
[00281] 表１Ａは、ヒトＷＢＣサンプルからＮＥ、ＰＲ３、およびＣａｔＧを抽出するために試験された様々な溶解緩衝液の組成、ならびに洗浄画分においてならびに抽出されたＮＥ、ＰＲ３、およびＣａｔＧを含有する細胞溶解物において、それぞれ、ＮＥ、ＰＲ３、およびＣａｔＧの酵素活性を測定するための試薬および緩衝液の組成を示している。
Figure 2023535332000023
方法
１．サンプル処理
[00282] ＮＥ、ＰＲ３、およびＣａｔＧ抽出を実施する前に、全血サンプル２ｍＬを１×赤血球（RBC）溶解緩衝液（Abcam、カタログ番号Ａｂ２０４７３３）４０ｍＬで溶解し、５回反転させ、室温で２０分間インキュベートすることによって、全血サンプルを白血球（WBC）ペレットに処理した。次いで、サンプルを４００ｇで５分間および４℃でスピンダウンし、それに続いて、ＷＢＣペレットを乱すことなく液体を慎重にデカントした。ＮＥおよびＰＲ３抽出を意図されるＷＢＣペレットを凍結し、－８０℃で保管した。ＮＥおよびＰＲ３抽出のためのＷＢＣペレットを用意するために、ペレットを融解し、溶解緩衝液を用いたペレット溶解に供した。ＮＥおよびＰＲ３抽出にＮＰ－４０溶解緩衝液を使用したある特定の調査では、融解されたペレットを、ペレット溶解の前に洗浄した（すなわち、下で記載される溶解前洗浄）。ＣａｔＧ抽出を意図されるＷＢＣペレットに関しては、それらの一部を同じように凍結し、－８０℃で保管し、後に融解し、ＮＰ－４０溶解緩衝液を用いたペレット溶解の前に洗浄した。ＣａｔＧ抽出を意図されるＷＢＣペレットの一部を、凍結および－８０℃での保管の前にＲＢＣ溶解後洗浄に供した。つまり、ＲＢＣ溶解後に獲得されたＷＢＣペレットを、アッセイ緩衝液４０ｍＬまたは０．９％生理食塩水４０ｍＬのいずれかを用いて洗浄し、５回反転させて混合し、遠心分離し（４℃で５分間の４００×ｇ）、それに続いて、ＷＢＣペレットを乱すことなく液体を慎重にデカントした。次いで、洗浄されたペレットを凍結し、－８０℃で保管した。ＣａｔＧを抽出するために、凍結されたＲＢＣ溶解後洗浄ＷＢＣペレットを融解し、ＮＰ－４０溶解緩衝液を使用した場合でさえ溶解前洗浄を受けることなく、ＮＰ－４０溶解緩衝液または０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶解緩衝液を用いたペレット溶解に供した。ＷＢＣペレットからのＣａｔＧ抽出に関係した実施例８における細胞ペレット処理および溶解条件の概要に関しては表７を参照されたい。種々の溶解条件を比較した実験に関しては、複数のＷＢＣペレットを各ドナー全血サンプルから生成した。
２．ＷＢＣペレットの溶解前洗浄
[00283] ＮＰ－４０溶解緩衝液を使用して、ＷＢＣペレットからＮＥ、ＰＲ３、およびＣａｔＧを抽出した一部の実験では、ＮＰ－４０溶解緩衝液を用いたペレット溶解の前に、凍結されたＷＢＣペレットを室温で融解し、ペレットとアッセイ緩衝液との混合物を穏やかにピペッティングすることによって、氷冷アッセイ緩衝液１ｍＬで洗浄した。混合物を４℃で３分間１６，０００ｇで遠心分離して、洗浄されたペレットおよび上清（すなわち、洗浄画分）を獲得した。洗浄されたペレットを溶解に供して、ＮＥ、ＰＲ３、およびＣａｔＧを抽出した。洗浄画分を収集し、ＮＥ、ＰＲ３、およびＣａｔＧ活性アッセイのための空の微量遠心（microfuge）チューブに移した。洗浄前にＷＢＣペレットサンプルに存在し得る様々な容積の残留ＲＢＣ溶解緩衝液を説明するために、洗浄画分を移す前および後に微量遠心分離チューブを計量し、重量差を算出した。洗浄画分の容積を重量差に基づいて獲得し、それを、１ｇ／ｍＬの密度（水の密度）を使用して容積に変換した。上で記されるように、溶解前洗浄は、ＣａｔＧ抽出のためにＲＢＣ溶解後に前もって洗浄されているＷＢＣペレットに関しては実施されなかった。
３．ＷＢＣペレット溶解
[00284] 前もって凍結され、室温で融解されている非洗浄ＷＢＣペレット、または溶解前洗浄ＷＢＣペレット、またはＲＢＣ溶解後洗浄ＷＢＣペレットに溶解緩衝液１ｍＬを添加し、その後にピペッティングを用いた撹拌が続くことによって、ＷＢＣペレット溶解を実施した。残屑を４℃で３～１０分間１６，０００ｇでの遠心分離によりペレットにし、ＮＥ、ＰＲ３、およびＣａｔＧ活性アッセイのために上清（「１°細胞溶解物」と称される）を収集し、－８０℃で保管した。ＷＢＣペレットを多工程の繰り返しのペレット溶解過程に供した多抽出実験では、残屑を溶解の付加的な工程（ラウンドまたはサイクル）に供した。各付加的な溶解工程の間、前の溶解工程からの残屑を、撹拌しながら同じまたは異なる溶解緩衝液によって溶解した。その後、残りの残屑を遠心分離により同じようにペレットにし、次の溶解工程に供し、一方で上清を、同じように２°、３°、４°、５°細胞溶解物等と称される付加的な細胞溶解物として収集し、命名における番号は、起源となる溶解工程の番号と合致した。溶解工程の間に適用された機械的撹拌の量、および繰り返しのペレット溶解過程における溶解工程の数を変えて、ＮＥおよびＰＲ３回収に対するそれらの効果を査定した。ＣａｔＧ抽出および活性判定に関しては、各ＷＢＣペレットを、各溶解サイクルの間に２０回の機械的ピペッティングが適用される総計３回の溶解サイクルに供し、結果として生じた１°、２°、および３°細胞溶解物をプールした（細胞ペレット処理および溶解条件の概要に関しては実施例８における表７を参照されたい）。変動を最小限に抑えならびに総抽出回数を低下させるために、マルチチャネルピペットを使用することによって同時に、実質的に同じ条件、例えば同じ継続時間の溶解および同じ量の機械的撹拌の下で、各ドナー由来の複数のＷＢＣペレットを処理した。
４．ＮＥ、ＰＲ３、およびＣａｔＧアッセイ
[00285] ＮＥ、ＰＲ３、およびＣａｔＧの活性を、２種のやり方の一方で測定した：（１）ＥＬＩＳＡベースのアッセイ、すなわちＰｒｏＡｘｓｉｓ（Belfast、Northern Ireland）製のＰｒｏｔｅａｓｅＴａｇ（登録商標）活性ＮＥイムノアッセイ、ＰｒｏｔｅａｓｅＴａｇ（登録商標）活性ＰＲ３イムノアッセイ、およびＰｒｏｔｅａｓｅＴａｇ（登録商標）活性ＣａｔＧイムノアッセイ、または（２）そのそれぞれが、ＮＥ、ＰＲ３、もしくはＣａｔＧに特異的な外来性ペプチド基質を使用する、酵素反応速度論アッセイ。比較のために、生物学的サンプルにおけるＣａｔＧ活性を検出し、定量する蛍光分析酵素アッセイであるＳｅｎｓｏＬｙｔｅ（登録商標）Ｒｈ１１０カテプシンＧアッセイキット（AnaSpec、Fremont、CA）を使用することによって、ＣａｔＧ活性も測定した。
[00286] そのそれぞれが、潜在的なまたは阻害剤が結合している対応物ではなく、活性ＮＥ、ＰＲ３、またはＣａｔＧを検出し、定量するＥＬＩＳＡベースのアッセイを、メーカーの使用説明書に従って実施した。
[00287] ＮＥ反応速度論アッセイにおいて、ＮＥに対する高い特異性を有する外来性ペプチド基質（表１Ａに示される）は、サンプルに存在するＮＥによって切断され、フルオロフォア反応産物の７－アミノ４－メチルクマリン（AMC）を生成した。サンプルにおける活性ＮＥの量に比例するこの反応の初速度を、相対蛍光単位（RFU）で測定し、サンプルにおける活性ＮＥの濃度に変換した。具体的には、マルチウェルプレート上のサンプル希釈物の酵素緩衝液（サンプル希釈剤）に対する溶解緩衝液の比と合致する、標準物質希釈剤におけるヒトＮＥストックタンパク質（Sigma、カタログ番号Ｅ８１４０－１ＵＮ、表１Ａを参照されたい）の連続希釈により標準物質を創出した。酵素緩衝液を希釈剤として使用して、サンプル希釈物をプレート上に創出した。アッセイ緩衝液におけるＤＭＳＯまたはＮＥ阻害剤（Abcam、カタログ番号ａｂ１４２１５４、最終濃度８０μＭ）のいずれかの１：２５希釈物をすべてのウェルに添加し、３７℃で１５分間インキュベートさせた。ＤＭＳＯの添加を、将来的な試験が、非特異的活性により誘導される切断の差し引きのために阻害剤の添加を要する場合のプレースホルダーとして使用した。インキュベーションの後、ＮＥ基質希釈剤に希釈されたＮＥ基質（メトキシスクシニル－ala－ala－pro－val－AMC、Sigma、カタログ番号Ｍ９７７１、最終濃度１００μＭ）をサンプルおよび対照ウェルにその順序で添加し、２～３回ピペッティングすることにより簡単に混合した。プレートを、ＢｉｏＴｅｋ Ｇｅｎ５プレートリーダーで３７℃にて最高３時間（最小３０分間）５分ごとに反応速度論モードで、基質添加後に３５０／４５０ｎｍ（励起／発光）で直ちに読み取った。読み取りの生データを、下で記載されるデータ分析のためにエクセルファイルにエクスポートした。
[00288] ＮＥの代わりにＰＲ３に特異的な外来性ペプチド基質を使用することを除いて、ＰＲ３反応速度論アッセイは、上で記載されるＮＥ反応速度論アッセイと同じ原理に基づく。サンプルに存在するＰＲ３によるＰＲ３基質の切断は、フルオロフォア反応産物の２－アミノベンゾイルまたはアントラニロイル（Abz）を生成した。サンプルにおける活性ＰＲ３の量に比例するこの反応の初速度を、ＲＦＵで測定し、サンプルにおける活性ＰＲ３の濃度に変換した。具体的には、マルチウェルプレート上のサンプル希釈物の酵素緩衝液（サンプル希釈剤）に対する溶解緩衝液の比と合致する、標準物質希釈剤におけるヒトＰＲ３ストックタンパク質（Sigma、カタログ番号ＳＲＰ６３０９－２５ＵＧ、表１Ａを参照されたい）の連続希釈により標準物質を創出した。酵素緩衝液を希釈剤として使用して、サンプル希釈物をプレート上に創出した。アッセイ緩衝液におけるＤＭＳＯまたはＰＲ３阻害剤（Abcam、カタログ番号ａｂ１４６１８４、最終濃度５００μＭ）のいずれかの１：２０希釈物をすべてのウェルに添加し、３７℃で１５分間インキュベートさせた。ＤＭＳＯの添加を、将来的な試験が、非特異的活性により誘導される切断の差し引きのために阻害剤の添加を要する場合のプレースホルダーとして使用した。インキュベーションの後、アッセイ緩衝液に希釈されたＰＲ３基質（Abz－VADCADQ－Lys（DNP）、最終濃度１００μＭ）をサンプルおよび対照ウェルにその順序で添加し、２～３回ピペッティングすることにより簡単に混合した。プレートを、ＢｉｏＴｅｋ Ｇｅｎ５プレートリーダーで３７℃にて最高３時間（最小３０分間）５分ごとに反応速度論モードで、基質添加後に３４０／４３０ｎｍ（励起／発光）で直ちに読み取った。読み取りの生データを、下で記載されるデータ分析のためにエクセルファイルにエクスポートした。
[00289] ＣａｔＧ活性を、外来性ペプチド基質を使用して酵素アッセイにおいて測定した。基質の切断は、クロモフォアまたはフルオロフォア反応産物のｐ－ニトロアニリン（pNA）、６－カルボキシテトラメチルローダミン（6-TAMRA）、または７－メトキシクマリン－４－酢酸（MCA）を生成した。この反応の初速度は、サンプルにおける活性ＣａｔＧの量に比例し、基質に応じて吸光度（ABS）または蛍光（RFU）で測定し、サンプルにおける活性ＣａｔＧの濃度に変換した。具体的には、プレート上のサンプル希釈物の酵素緩衝液（サンプル希釈剤）に対する溶解緩衝液の比と合致する、標準物質希釈剤におけるストックヒトＣａｔＧタンパク質（Sigma、カタログ番号Ｃ４４２８－．２５ＵＮ）の連続希釈により標準物質を創出した。酵素緩衝液を希釈剤として使用して、サンプル希釈物をプレート上に創出し、かつ／または整然とランした。アッセイ緩衝液におけるＤＭＳＯまたはＣａｔＧ阻害剤（Cayman Chemical、カタログ番号１４９２８、最終濃度２００μＭ）のいずれかの１：１０希釈物をすべてのウェルに添加し、３７℃で１５分間インキュベートさせた。ＤＭＳＯの添加を、将来的な試験が、非特異的活性切断の差し引きのために阻害剤の添加を要する場合のプレースホルダーとして使用した。インキュベーションの後、アッセイ緩衝液に希釈されたＣａｔＧ基質をサンプルおよび対照ウェルにその順序で添加し、２～３回ピペッティングすることにより簡単に混合した（試験された基質のリストに関しては表１Ｂを参照されたい）。プレートを、Ｇｅｎ５ソフトウェアを用いたＢｉｏＴｅｋ’ｓ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＮｅｏまたはＢｉｏＴｅｋ’ｓ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１Ｍプレートリーダーで３７℃にて１．５時間５分ごとに反応速度論モードで、基質添加後に表１Ｂに従った適当な波長で直ちに読み取った。実験を保存し、生データを、データ分析のためにエクセルファイルにエクスポートした（下のデータ分析方法を参照されたい）。
Figure 2023535332000024
５．データ分析
[00290] ＥＬＩＳＡベースのアッセイからのデータを分析するために、標準物質吸光度値およびそれらそれぞれの既知の濃度を使用して、標準曲線を創出した。複数の標準物質希釈剤をアッセイにおいて使用した場合には、複数の標準曲線を創出した。次いで、適当な標準曲線（使用可能な場合）からの最良適合式の二次多項式直線を使用して、未知のサンプル濃度を算出した。サンプル濃度を希釈に対して補正し、複製物を平均化した。
[00291] ＮＥおよびＰＲ３反応速度論アッセイからのデータを分析するために、２種の方法を使用し、結果を比較して一貫性を確保した。具体的には、反応速度論的傾きの線形部分を、（１）視覚的に判定し、エクセルのｓｌｏｐｅ式を使用して算出した、または（２）自動的に判定し、社内で開発されたマクロエクセルプログラムを使用して算出した。標準物質傾き値およびそれらそれぞれの既知の濃度を使用して、標準曲線を創出した。複数の標準物質希釈剤をアッセイにおいて使用した場合には、複数の標準曲線を創出した。次いで、適当な標準曲線（使用可能な場合）からの最良適合式の二次多項式直線を使用して、未知のサンプル濃度を算出した。サンプル濃度を希釈に対して補正し、複製物を平均化した。
[00292] ＣａｔＧ反応速度論アッセイからのデータを分析するために、Ｇｅｎ５ソフトウェアおよびＩｍａｇｅｒソフトウェアを用いたＢｉｏＴｅｋ’ｓ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＮｅｏおよびＨ１プレートリーダーからの読み取りを、生データを含有するエクセルファイルに直接エクスポートした。次いで、各プレートからのこれら生データ読み取りを、データ分析のために第２のエクセルファイルにコピーした。反応速度論的傾きの線形部分を視覚的に判定し、エクセルのｓｌｏｐｅ式を使用して算出した。標準物質傾き値およびそれらそれぞれの既知の濃度を使用して、標準曲線を創出した。複数の標準物質希釈剤をアッセイにおいて使用した場合には、複数の標準曲線を創出した。次いで、適当な標準曲線（使用可能な場合）からの最良適合式の二次多項式直線を使用して、未知のサンプル濃度を算出した。サンプル濃度を希釈に対して補正し、複製物を平均化した。
[00293] 別様に記されない限り、実施例において提示される活性ＮＥ、ＰＲ３、およびＣａｔＧのＷＢＣサンプル濃度のすべては、ＷＢＣサンプルが由来する全血の容積に対して正規化され、全血のｍＬあたりの活性ＮＥ、ＰＲ３、またはＣａｔＧの質量として表現される（例えば、ngまたはμg単位で）。
６．統計分析
[00294] ＷＢＣペレット抽出結果についての統計分析を、ダネットの多重比較検定を使用して実施した。アルファ値を０．０５に設定した。
実施例１－ヒトＷＢＣサンプルからのＮＥおよびＰＲ３の抽出のための溶解緩衝液スクリーニング
[00295] ＮＥおよびＰＲ３等の好中球セリンプロテアーゼ（NSP）は、好中球のアズール顆粒の内側にカプセル化され、放出されて迅速な免疫応答を提供し得る。ＮＳＰの一部分は、一般的に好中球内にも存在し得る。定量化のためにこれらの酵素を抽出するために、細胞および顆粒の両方が溶解されなければならない。溶解の伝統的な方法は、細胞膜を破壊して開き、ＮＳＰを曝露する物理的分断（例えば、撹拌）および化学的手段（例えば、洗浄剤を使用することによる）を含む。洗浄剤およびその濃度の選定は、ＮＳＰの回収に影響を及ぼし得るだけでなく、下流のＮＳＰ定量または活性アッセイを妨害もし得ることから、ＮＳＰの抽出に対する種々の濃度の種々の洗浄剤の適性は予測不可能である。種々の洗浄剤条件下でのＮＥおよびＰＲ３回収を比較するために、複数の血液ドナーサンプル（n=5）を使用して、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液、および市販のＡｂｃａｍ溶解緩衝液を試験した。付加的に、２工程の繰り返しのペレット溶解過程において、ＷＢＣペレットを最初にＡｂｃａｍ溶解緩衝液で、次いで第２の溶解工程の間に１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液で溶解した。表１Ａは、スクリーニングにおいて使用された溶解緩衝液の処方を示している。ペレット溶解の後、細胞溶解物を獲得し、細胞溶解物におけるそれぞれ活性ＮＥおよびＰＲ３の濃度として表現されるＮＥおよびＰＲ３活性を、ＰｒｏＡｘｓｉｓ ＥＬＩＳＡベースのアッセイおよび反応速度論アッセイを使用して定量した。
[00296] ＥＬＩＳＡベースのアッセイと比較して、反応速度論アッセイは、ＮＥおよびＰＲ３活性に対するより大きな感度、ならびに洗浄剤、および溶解緩衝液から持ち込まれた他の作用物質によるより低い妨害を呈した。結果として、反応速度論アッセイを実施し、それらの結果を実施例を通して示した。図１Ａに示されるように、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液および１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液は、同様の量の活性ＮＥを回収し、一方でＡｂｃａｍ溶解緩衝液は、３倍を上回るほど多くの活性ＮＥを回収した。図１Ｂに示されるように、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液およびＡｂｃａｍ溶解緩衝液は、活性ＰＲ３の等価の回収、および０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液よりも５倍多い活性ＰＲ３回収を達成した。Ａｂｃａｍ溶解緩衝液の後に１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を用いた付加的な（第２の）溶解工程は、活性ＮＥまたは活性ＰＲ３の付加的な回収をもたらした（図１Ａおよび１Ｂ）。
実施例２－溶解緩衝液の組み合わせを用いた、ヒトＷＢＣサンプルからのＮＥおよびＰＲ３の多抽出
[00297] 溶解緩衝液スクリーニング調査において、一部の緩衝液は、ＮＥを抽出することにおいてよく働いたが、異なるＮＳＰを抽出することにおいては上手く働かなかった、またはその活性を定量するのを妨害した。例えば、Ａｂｃａｍ溶解緩衝液は、活性ＮＥの最良の回収を示したが、活性ＰＲ３に対しては最悪の回収を示した（図２Ｃおよび２Ｄ）。逆に、１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液は、最大量の活性ＰＲ３を回収したが、最少量の活性ＮＥを回収した（図２Ｃおよび２Ｄ）。妨害に起因したアッセイデータの品質を犠牲にせずに、ＮＳＰの回収を増加させるために、抽出のために溶解緩衝液の種々の組み合わせを使用する多抽出過程を検証した。溶解緩衝液の３種の異なる組み合わせを、サンプル群Ａ、Ｂ、およびＣにおいてそれぞれ試験した。各組み合わせのうち、３工程の繰り返しのＷＢＣペレット溶解過程において使用された溶解緩衝液の順序が表２に示されている。
Figure 2023535332000025
[00298] 付加的に、１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を用いた単一（工程）抽出を、対照として使用した（サンプル群D）。最後に、以前に評価されていないＮＰ－４０溶解緩衝液を、単一（工程）抽出条件下で試験した（サンプル群E）。異なるドナー由来の２種のペレットを、各サンプル群において溶解した。ＮＰ－４０溶解緩衝液を使用したサンプル群Ｅを除いて、ＷＢＣペレットは洗浄されなかった。ＮＰ－４０溶解緩衝液を使用したサンプル群Ｅに関しては、２種のペレットの一方を、サンプル処理の間のＲＢＣ溶解の直後にＰＢＳで洗浄した。サンプル群に応じて、１°、２°、および３°細胞溶解物または１°細胞溶解物のみを、ペレット溶解の後に獲得し、細胞溶解物におけるＮＥおよびＰＲ３活性を、ＮＥおよびＰＲ３反応速度論アッセイを使用して定量した。図２Ａおよび２Ｂ、ならびに表３Ａおよび３Ｂに、反応速度論アッセイ結果に基づくサンプル群Ａ～Ｅからの、それぞれ活性ＮＥおよび活性ＰＲ３の回収に関するデータが示されている。図２Ａおよび２Ｂは、異なるドナーＷＢＣペレットからの活性ＮＥおよび活性ＰＲ３の回収が、通常の変動を呈したことも示している。
Figure 2023535332000026
Figure 2023535332000027
[00299] 図２Ａおよび表３Ａからのデータは、Ａｂｃａｍ溶解緩衝液を第１のペレット溶解工程において使用した、緩衝液組み合わせを用いたサンプル群ＡおよびＢの多抽出が、活性ＮＥの匹敵する回収を達成し、最初の２つの溶解工程の後、回収可能な総活性ＮＥのおよそ９０～１００％を獲得したことを示している（１°＋２°細胞溶解物において回収された活性NEを参照されたい）。
[00300] 図２Ｂおよび表３Ｂからのデータは、緩衝液組み合わせを用いたサンプル群Ａ～Ｃの多抽出が、最初の２つの溶解工程の後、回収可能な総活性ＰＲ３のおよそ７５～９０％を回収したことを示している（１°＋２°細胞溶解物において回収された活性PR3を参照されたい）。活性ＰＲ３の総回収に関して、その溶解緩衝液組み合わせを用いたサンプル群Ｃの多抽出は、それらそれぞれの溶解緩衝液組み合わせを用いたサンプル群ＡまたはＢの多抽出よりもおよそ１．５倍良好であった。サンプル群Ａ～Ｅにおいて試験された抽出過程のすべての中で、１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を用いた群Ｄの単一抽出は、最大量の活性ＰＲ３を回収した。比較すると、群Ａ～Ｃの多抽出は、群Ｄの単一抽出から回収された活性ＰＲ３のおよそ４０～８０％を回収した。
[00301] ＮＰ－４０溶解緩衝液を使用した群Ｅの単一抽出を実施した場合、ゲル様物質が形成され、細胞残屑およびゲル様物質をペレットにすることに、ならびに非粘性の上清を完全に単離し、回収することに困難を引き起こした。非洗浄ＷＢＣペレットを用いると、困難はより深刻であった。したがって、図２Ｅおよび２Ｆに示されるように、ＮＰ－４０溶解緩衝液で溶解された洗浄ＷＢＣペレットは、非洗浄ペレット対応物よりも、活性ＮＥの４倍多い回収および活性ＰＲ３の８倍多い回収を生じさせた。理論によって拘束されることを望むことなく、ＷＢＣペレットの溶解前洗浄は、ＲＢＣ溶解からの妨害もしくはバックグラウンドを除去している可能性があり、かつ／またはゲル様物質の形成を低下させている可能性があり、ゆえにＮＥおよびＰＲ３の回収の増加に寄与する。図２Ｃおよび２Ｄに示されるように、ＮＰ－４０溶解緩衝液を使用した洗浄ＷＢＣペレットの単一抽出（単一の第１の溶解工程を用いた）は、Ａｂｃａｍ溶解緩衝液を用いた非洗浄ＷＢＣペレットの単一抽出と比較して、回収される匹敵する量の活性ＮＥおよびより多くのＰＲ３をもたらした。以前に図１Ａに示されるように、Ａｂｃａｍ溶解緩衝液を用いた単一抽出は、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液または１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を用いた単一抽出と比較して、活性ＮＥのより良好な回収を生じさせた。
実施例３－ＮＰ－４０溶解緩衝液を用いた、またはＮＰ－４０溶解緩衝液、それに続く１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を用いた、ヒトＷＢＣサンプルからのＮＥおよびＰＲ３の二重抽出
[00302] 以前に図１Ｂに示されるように、Ａｂｃａｍ溶解緩衝液、それに続く１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を用いた２工程のＷＢＣペレット溶解は、Ａｂｃａｍ溶解緩衝液を用いた単一工程溶解と比較して、活性ＰＲ３のはるかに向上した回収を生じさせた。２工程のペレット溶解過程において単独でまたは組み合わせで使用されるＮＰ－４０溶解緩衝液および１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を評価するために、本発明者らは、溶解工程１および２の両方においてＮＰ－４０溶解緩衝液を用いた、溶解工程１においてＮＰ－４０溶解緩衝液、それに続く溶解工程２において１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を用いた、または溶解工程１および２の両方において１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を用いた二重抽出に供されたＷＢＣペレットからの活性ＮＥおよび活性ＰＲ３の回収を判定した。溶解工程１および２の後、それぞれ１°および２°細胞溶解物を獲得し、細胞溶解物における活性ＮＥおよび活性ＰＲ３の濃度として表現されるＮＥおよびＰＲ３活性を、ＮＥおよびＰＲ３反応速度論アッセイを使用して定量した。以前の実験は、洗浄ペレットをＮＰ－４０溶解緩衝液で溶解した場合にＮＳＰの回収がより高いことを示したことから（図２Ｅおよび２Ｆ）、二重抽出の前にＷＢＣペレットをアッセイ緩衝液で洗浄した。ＷＢＣは、凍結融解過程の間に破裂し得、細胞質材料を放出し得ることから、洗浄画分もＮＥおよびＰＲ３反応速度論アッセイのために保存した。
[00303] 活性ＮＥの回収に関して、洗浄画分は、回収可能な総ＮＥ活性のおよそ１０～２５％を示した（表４Ａ）。ペレット溶解工程１の間にＮＰ－４０溶解緩衝液を用いて、次いでペレット溶解工程２の間に１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を用いて溶解されたサンプルに関して、溶解工程２由来の２°細胞溶解物は、５％未満の付加的なＮＥ活性をもたらした。１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を用いた２工程のペレット溶解を受けたサンプルに関して、溶解工程２由来の２°細胞溶解物は、１０％未満の付加的なＮＥ活性をもたらした。ＮＰ－４０溶解緩衝液を用いた２工程のペレット溶解を受けたサンプルに関して、溶解工程２由来の２°細胞溶解物は、およそ３０％の付加的なＮＥ活性をもたらした（表４Ａ）。全体として、ＮＰ－４０溶解緩衝液、それに続く１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を用いた二重抽出によるもの、および１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を用いた二重抽出によるものよりも、ＮＰ－４０溶解緩衝液を用いた二重抽出による活性ＮＥのそれぞれおよそ１．４倍および５．４倍多くの回収があった（図３Ａ、表４Ａ）。
Figure 2023535332000028
Figure 2023535332000029
[00304] 活性ＰＲ３の回収に関して、洗浄画分は、総ＰＲ３活性のおよそ１０～２５％を示した（表４Ｂ）。ペレット溶解工程１の間にＮＰ－４０溶解緩衝液を用いて、次いでペレット溶解工程２の間に１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を用いて溶解されたサンプルに関して、溶解工程２由来の２°細胞溶解物は、およそ３５％の付加的なＰＲ３活性をもたらした。１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を用いた二重抽出に供されたサンプルに関して、溶解工程２由来の２°細胞溶解物は、およそ２５％の付加的なＰＲ３活性をもたらした。ＮＰ－４０溶解緩衝液を用いて二重抽出されたサンプルに関して、溶解工程２由来の２°細胞溶解物は、２０％の付加的なＰＲ３活性をもたらした（表４Ｂ）。３種すべての二重抽出設計は、活性ＰＲ３の匹敵する回収を呈した（図３Ｂ、表４Ｂ）。まとめると、本発明者らのデータは、ＷＢＣペレットの溶解前洗浄、ＮＥおよびＰＲ３活性アッセイのための結果として生じた洗浄画分の収集、ならびにＮＰ－４０溶解緩衝液を用いた洗浄ＷＢＣペレットの二重抽出は、ヒトＷＢＣサンプルからの予想外の優れたＮＥおよびＰＲ３回収を生じさせることを示している。
実施例４－ヒトＷＢＣサンプルからのＮＥおよびＰＲ３回収に対する、増強した撹拌対ＮＰ－４０溶解緩衝液を用いた付加的な溶解工程の効果についての評価
[00305] ＷＢＣの物理的分断（例えば、撹拌）は、ＮＳＰ回収にも影響を及ぼし得ることから、本発明者らは、４人の異なるドナーＷＢＣペレットサンプル（Ｂ０１～Ｂ０４）からのＮＳＰ回収に対する、手動のピペッティングによる増強した撹拌の効果を判定した。以前の実施例では、各ペレット溶解工程の間に溶解緩衝液／ペレット混合物を１０回ピペッティングすることによって、ＷＢＣペレットを物理的に撹拌した。本実施例では、各ドナーサンプル由来のペレットの半分を、１０回の手動のピペット撹拌で溶解し（「対照半ペレット」と称される）、もう半分を、２０回の手動のピペット撹拌で溶解した（「増強した撹拌を有する半ペレット」と称される）。対照半ペレットを、ＮＰ－４０溶解緩衝液を使用した３工程の繰り返しのペレット溶解過程に供し、溶解工程１、２、および３の後にそれぞれ１°、２°、および３°細胞溶解物を収集した。増強した撹拌を有する半ペレットを、またＮＰ－４０溶解緩衝液を使用した２工程の繰り返しのペレット溶解過程に供し、溶解工程１および２の後にそれぞれ１°および２°細胞溶解物を収集した。ＮＰ－４０溶解緩衝液を用いた溶解工程１の前に、対照半ペレットおよび増強した撹拌を有する半ペレットの両方をアッセイ緩衝液で洗浄し、洗浄画分を収集した。細胞溶解物および洗浄画分をＮＥおよびＰＲ３活性についてアッセイして、活性ＮＥおよびＰＲ３の回収を判定した。
[00306] 対照半ペレットに関して、洗浄画分は、回収可能な総活性ＮＥのおよそ１０％を含有した（表５Ａ）。１°、２°、および３°細胞溶解物は、回収された総活性ＮＥのそれぞれおよそ６０％、１６％、および１７％を含有した（図４Ａ、表５Ａ）。増強した撹拌を有する半ペレットに関して、洗浄画分は、回収された総活性ＮＥの５％未満を含有した。１°および２°細胞溶解物は、回収された総活性ＮＥのそれぞれおよそ３０％および７０％を含有した（図４Ｃ、表５Ａ）。組み合わされた洗浄画分および１°細胞溶解物において回収された活性ＮＥの量に関して、第１の溶解工程の間に２倍の量のピペッティングを有する増強した撹拌は、４人のドナーのうちの３人（すなわち、Ｂ０２、Ｂ０３、およびＢ０４）に関して活性ＮＥの平均５５％多い回収、および残りのドナー（Ｂ０１、表５Ａ）に関して活性ＮＥのおよそ８％多い回収につながった。増強した撹拌を有する２工程のペレット溶解は、各溶解工程において半分の量の撹拌を有する３工程のペレット溶解よりも、活性ＮＥのおよそ３倍多い総回収をもたらした（図４Ｅ、表５Ａ）。
Figure 2023535332000030
[00307] 同様の結果が、活性ＰＲ３の回収に対して獲得された。具体的には、対照半ペレットに関して、洗浄画分は、回収された総活性ＰＲ３のおよそ２０％を含有した（表５Ｂ）。１°、２°、および３°細胞溶解物は、回収された総活性ＰＲ３のそれぞれおよそ６０％、１４％、および１０％を含有した（図４Ｂ、表５Ｂ）。増強した撹拌を有する半ペレットに関して、洗浄画分は、回収された総活性ＰＲ３のおよそ１０％を含有し、１°および２°細胞溶解物は、回収された総活性ＰＲ３のそれぞれおよそ５５％および３５％を含有した（図４Ｄ、表５Ｂ）。組み合わされた洗浄画分および１°細胞溶解物において回収された活性ＰＲ３の量に関して、第１の溶解工程の間に２倍の量のピペッティングを有する増強した撹拌は、４人のドナーのうちの３人（すなわち、Ｂ０２、Ｂ０３、およびＢ０４）に関して平均して活性ＰＲ３のおよそ４０％多い回収、および残りのドナー（Ｂ０１、表５Ｂ）に関して活性ＰＲ３のおよそ７％多い回収につながった。増強した撹拌を有する２工程のペレット溶解は、各溶解工程において半分の量の撹拌を有する３工程のペレット溶解よりも、回収される１．５倍多い総活性ＰＲ３をもたらした（図４Ｆ、表５Ｂ）。
Figure 2023535332000031
実施例５－増強した撹拌の下でＮＰ－４０溶解緩衝液を用いた５工程の繰り返しのＷＢＣペレット溶解による、ヒトＷＢＣサンプルからのＮＥおよびＰＲ３回収についての評価
[00308] 本実施例では、溶解前洗浄ＷＢＣペレットを、増強した撹拌（すなわち、各溶解工程の間に２０回のピペット撹拌）の下でＮＰ－４０溶解緩衝液を使用した５工程繰り返しのペレット溶解過程に供した。洗浄画分、ならびに１°、２°、３°、４°、および５°細胞溶解物を収集し、ＮＥおよびＰＲ３活性についてアッセイして、活性ＮＥおよび活性ＰＲ３の回収を判定した。付加的に、委託研究産業によって現在実践される参照抽出方法に従って、同じドナー由来の非洗浄ＷＢＣペレットを、半分の量の撹拌（すなわち、単一溶解工程の間に１０回のピペット撹拌）の下で０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を使用した単一（工程）溶解に供した。１°細胞溶解物を収集し、ＮＥおよびＰＲ３活性について同じようにアッセイして、活性ＮＥおよび活性ＰＲ３の回収を判定した。
[00309] 図５Ａおよび５Ｂに示されるように、増強した撹拌の下でＮＰ－４０溶解緩衝液を用いた繰り返しのペレット溶解過程の第１の溶解工程の後に獲得された１°細胞溶解物は、参照抽出方法に従った０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液および低下した撹拌を用いた単一ペレット溶解により獲得された１°細胞溶解物と比較して、４０倍超もの量の活性ＮＥおよび１５倍超の量の活性ＰＲ３を含有した。さらに、ＮＰ－４０溶解緩衝液を用いた繰り返しのペレット溶解過程の間、付加的な活性ＮＥが、各連続的溶解工程の後に回収され、洗浄画分、ならびに最初の３つの溶解工程からの１°、２°、および３°細胞溶解物は、回収可能な総活性ＮＥの７０～８０％を回収した（図５Ｃ）。回収可能な総活性ＮＥは、洗浄画分、ならびに１°、２°、３°、４°、および５°細胞溶解物に存在する個々の活性ＮＥ量の総和であった。
[00310] 増強した撹拌の下で溶解前洗浄ＷＢＣペレットおよびＮＰ－４０溶解緩衝液を使用した５工程の繰り返しのペレット溶解過程を用いたＰＲ３回収に関して、洗浄画分は、回収可能な総活性ＰＲ３のおよそ３０％を回収した（図５Ｄ）。付加的に、最初の３つの溶解工程から獲得された１°、２°、および３°細胞溶解物と組み合わされた洗浄画分は、回収可能な総活性ＰＲ３の９０％を上回る割合を回収した（図５Ｄ）。回収可能な総活性ＰＲ３は、洗浄画分、ならびに１°、２°、３°、４°、および５°細胞溶解物に存在する個々の活性ＰＲ３量の総和であった。
[00311] 本発明者らは、非洗浄ＷＢＣペレットを、５０％未満の撹拌の下で０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液を用いて１回のみ溶解する、参照抽出方法を用いた活性ＮＥおよび活性ＰＲ３の回収と比較して、洗浄ＷＢＣペレットを、増強した撹拌の下でＮＰ－４０溶解緩衝液を用いた３回または５回の繰り返しの溶解工程に供した場合に、それぞれ１００倍および２０倍もの活性ＮＥおよび活性ＰＲ３の回収の全体的増加を観察した（図５Ｅおよび５Ｆ）。付加的に、溶解前洗浄および多工程の繰り返しのペレット溶解過程は、複製ドナーペレットサンプル（Ｂ０５ａおよびＢ０５ｂ）に対して実行された場合、活性ＮＥおよび活性ＰＲ３の回収に関して非常に一貫した結果をもたらし、ＮＥおよびＰＲ３抽出方法が堅牢であり、再現性があることを示した（図５Ｃおよび５Ｄ）。まとめると、本発明者らのデータは、ＷＢＣペレットの溶解前洗浄、ならびにＮＰ－４０溶解緩衝液および増強した撹拌を用いた多工程の繰り返しのペレット溶解過程が、ヒトＷＢＣサンプルからのＮＥおよびＰＲ３の優れた回収に寄与することを示している。
実施例６－反応速度論ＮＥおよびＰＲ３アッセイに対する消泡剤の効果についての評価
[00312] 洗浄剤（例えば、NP-40）を使用してＷＢＣペレットを溶解することから、洗浄剤は細胞溶解物に存在し、それゆえ反応速度論ＮＥおよびＰＲ３アッセイに持ち込まれ、洗浄剤は、プレートリーダーによる蛍光読み取りを変更させ得る泡を形成し得る。そのリスクを軽減するために、本発明者らは、消泡剤の使用が、プレートのウェルにおける泡形成を減少させ得るかどうか、および消泡剤がアッセイを妨害するであろうかどうかを判定した。その目標に向けて、２人の異なるドナー（Ｂ０４およびＢ０５）由来のＷＢＣペレットを洗浄し、洗浄画分を収集し、実施例５に記載されるように、増強した撹拌の下でＮＰ－４０溶解緩衝液を使用した５工程の繰り返しのペレット溶解過程に従って、細胞溶解物を洗浄ペレットを用いて作製した。反応速度論ＮＥおよびＰＲ３アッセイのために、標準物質およびサンプルを、洗浄画分および細胞溶解物を用いて調製する際、サンプルおよび標準物質の半分に対するＤＭＳＯ希釈剤に消泡剤を添加した。消泡剤を有するサンプルおよび標準物質を、消泡剤を有しないそれらの対応物と比較した。１°細胞溶解物（第１の溶解工程から獲得された）を用いた反応速度論ＮＥアッセイを除いて、消泡剤の存在は、ＮＥおよびＰＲ３反応速度論アッセイの妨害を呈しなかった（図６Ａ～６Ｄ）。ゆえに、泡形成を阻止するための消泡剤の添加は、ＮＥおよびＰＲ３反応速度論アッセイの信頼性を向上させる。
実施例７－ＮＥおよびＰＲ３活性の判定のための細胞溶解物プールについての評価
[00313] ＮＥおよびＰＲ３を、多工程の繰り返しのペレット溶解過程を使用してＷＢＣペレットから抽出した後、各溶解工程からの各細胞溶解物を酵素活性について個々にアッセイし、総活性を算出することによって、細胞溶解物における総ＮＥおよびＰＲ３活性を判定し得る。代替的に、単一のＮＥまたはＰＲ３活性アッセイのために細胞溶解物をプールすることによって、総活性を判定し得る。個々の細胞溶解物をアッセイすることは、必要とされるアッセイの数を増加させ、ゆえにより多くの材料、試薬、および時間を要するであろうことから、本発明者らは、細胞溶解物プール手法が、匹敵する結果をもたらすであろうかどうかを判定した。ＷＢＣペレットを洗浄し、次いで、増強した撹拌を有するＮＰ－４０溶解緩衝液を使用した３工程の繰り返しのペレット溶解過程に供した。各溶解工程からの細胞溶解物を収集し、ＮＥおよびＰＲ３活性について個々にアッセイした。付加的に、等容積の個々の細胞溶解物を組み合わせて、単一のＮＥまたはＰＲ３活性アッセイのためのプールされた細胞溶解物を産出した。図７Ａおよび７Ｂに示されるように、個々の細胞溶解物のＮＥもしくはＰＲ３活性をアッセイし、活性を総和することによって、または個々の細胞溶解物をプールし、プールされた細胞溶解物のＮＥもしくはＰＲ３活性をアッセイすることによって、活性ＮＥおよび活性ＰＲ３の回収に関する同様のデータ、ならびにサンプル時点のすべてにわたる同様の回収傾向が獲得された。図７Ａおよび７Ｂにおいて、各サンプル時点（Ｔ１～Ｔ８）は、全血サンプルがヒト対象から収集された、臨床試験のコースにおける異なる日に相当する。
実施例８－反応速度論ＣａｔＧアッセイ開発
[00314] 本実施例は、表１Ｂに示される様々なＣａｔＧ基質、ならびに活性ＣａｔＧを含むマウス骨髄溶解物サンプルおよびヒトＷＢＣ溶解物サンプルの両方を使用した、反応速度論ＣａｔＧアッセイの開発を記載する。本実施例は、特異性、感度、および精度に関して、市販のＡｎａＳｐｅｃ’ｓ ＳｅｎｓｏＬｙｔｅ（登録商標）Ｒｈ１１０カテプシンＧアッセイおよびＰｒｏＡｘｓｉｓ製のＰｒｏｔｅａｓｅＴａｇ（登録商標）活性ＣａｔＧイムノアッセイを用いて、開発されている反応速度論ＣａｔＧアッセイを比較もする。純粋なＮＥタンパク質（Sigma、カタログ番号Ｅ８１４０－１ＵＮ）および純粋なＰＲ３タンパク質（Sigma、カタログ番号ＳＲＰ６３０９－２５ＵＧ）を含めた、他のＮＳＰ酵素によって切断される基質の能力を試験することによって、特異性を判定した。ＣａｔＧ以外の酵素によって切断される能力は、低い特異性を示唆する。感度を、標準物質の傾きの微分により査定し、次のより高い濃度標準物質の傾きのパーセンテージとして、１種の標準物質の傾きとして表現した。それゆえ、より大きな値は、標準物質濃度間の傾きの小さな変化を示し、低い感度を示し、一方でより小さな値は、傾き値の間のより大きな微分、および潜在的により高い感度を示す。付加的に、標準物質を、１μｇ／ｍＬから始まる２倍連続希釈により創出し；それゆえ、線形曲線は、標準物質傾きの５０％微分を示すと予想されるであろう。最後に、サンプルに純粋なＣａｔＧを混ぜることによって、アッセイ精度を査定した。
１．反応速度論ＣａｔＧアッセイの開発のための、Ｓｉｇｍａ反応速度論ＣａｔＧ基質（比色分析）、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ反応速度論ＣａｔＧ基質（蛍光分析）、およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ反応速度論ＣａｔＧ基質（蛍光分析）の間でのＣａｔＧ基質の試験
Ｓｉｇｍａ反応速度論ＣａｔＧ基質（比色分析）
[00315] 標準曲線は、標準物質傾きの間で一貫した微分を有して比較的線形であると観察された（４９．９±３％、表６）。このことは、アッセイが、０．０１５６２５～１μｇ／ｍＬの域にわたる種々のサンプル濃度を区別することに高感度であることを示唆する。Ｓｉｇｍａ製のＣａｔＧ基質は、また、算出された活性が陰性対照ブランクに近かったことから、ＮＥおよびＰＲ３による最小限の切断を示したまたは切断を示さなかった。付加的に、洗浄画分は活性を示さなかった。洗浄画分においてＣａｔＧ活性を検出し得なかったにもかかわらず、ヒト溶解物サンプルからの測定可能な活性があった。ＣａｔＧ阻害剤を用いて試験されたサンプルは、５％未満の残留ＣａｔＧ活性を示し、基質の最小限の非特異的切断をさらに示した。
Figure 2023535332000032
[00316] サンプルに２５０ｎｇ／ｍＬのＣａｔＧタンパク質を混ぜることによって、アッセイ精度を査定した。ＣａｔＧ活性を呈しない、混ぜられていない洗浄画分とは対照的に、混ぜられた洗浄画分は、混ぜられたＣａｔＧタンパク質の標的濃度と同様に、およそ２７０ｎｇ／ｍＬで測定可能な活性を示した。
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ反応速度論ＣａｔＧ基質（蛍光分析）
[00317] 標準曲線は、標準物質間であまり一貫しない微分を示し、それゆえあまり線形ではなかった（３８．４±１５．８％、表６）。Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ製のＣａｔＧ基質は、また、算出された活性が陰性対照ブランクに近かったことから、ＮＥおよびＰＲ３による最小限の切断を示したまたは切断を示さなかった。付加的に、洗浄画分、ならびに長期保管および複数回の凍結融解サイクルに供されている溶解物サンプルは、測定可能な活性を示した。ＣａｔＧ阻害剤を用いて試験されたサンプルは、１０％未満の残留ＣａｔＧ活性を示し、基質の最小限の非特異的切断を示した。
[00318] サンプルに２５０ｎｇ／ｍＬのＣａｔＧタンパク質を混ぜることによって、アッセイ精度を査定した。混ぜられたサンプルは、混ぜられたＣａｔＧタンパク質の標的濃度と同様に、およそ２６０ｎｇ／ｍＬで測定可能な活性を示した。
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ反応速度論ＣａｔＧ基質（蛍光分析）
[00319] 標準曲線は様々な傾きの傾向を示し、基質は、希釈された場合にわずかに溶液から沈殿し、それが要因であり得ることが留意された。付加的に、標準曲線Ｒ－２乗値は、一般的に予想される０．９９５を上回る代わりに、０．９８５未満であった。低いＲ－２乗値は、標準物質濃度の間の最小の微分に起因する可能性が最も高く、低いアッセイ感度をさらに示した（７０．８±１４．３％、表６）。ＰＲ３はこの基質を切断しないように見えた一方で、基質はＮＥによって切断可能であった。このことは、ＣａｔＧ阻害剤を含有するサンプルにおいてほんの８０％の阻害が観察されたように、基質がＣａｔＧに特異的でないことを示唆する。それゆえ、２０％の残留活性は、基質のＮＥ切断に起因し得る。基質が高い特異性または高い感度を示さなかったことから、サンプルにＣａｔＧタンパク質を混ぜることによる、精度を試験しなかった。
[00320] 上記の知見に基づいて、Ｓｉｇｍａ基質およびＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ基質は、特異的でもあり高感度でもあることが示された唯一の基質であった。加えて、両方とも、混ぜられたサンプルを測定することにおいて高い精度を示した。Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ基質と比較してＳｉｇｍａ基質に関して、より高い感度（すなわち、より一貫した傾き微分）および標準曲線のより大きな線形性が観察されたため、さらなる調査において使用されるＣａｔＧ反応速度論アッセイにＳｉｇｍａ基質を選定した。
２．ＳｅｎｓｏＬｙｔｅ（登録商標）Ｒｈ１１０カテプシンＧアッセイキット（蛍光分析）についての評価
[00321] 標準曲線準備のためにキットの使用説明書に従ったにもかかわらず、オーバーフローエラーが観察された。付加的に、ＮＥ含有サンプルは、高すぎる蛍光読み取りに起因してオーバーフローエラーを示し、キットのＣａｔＧ基質がＮＥによって切断され得、それゆえＣａｔＧに特異的でないことを示した。さらに、ＰＲ３は基質の最小限の切断を示し、キットの基質が低い特異性を有し、サンプルにおけるアッセイキットによって検出された活性が、ＣａｔＧだけに由来しない可能性があることをさらに示した。実際、ＣａｔＧ阻害剤含有サンプルは、活性の低下を示さず、検出された活性が、サンプルに存在する主にＮＥおよびＰＲ３のものであることを示した。キットが高い特異性を示さなかったことから、サンプルにＣａｔＧタンパク質を混ぜることによる、精度を試験しなかった。
３．反応速度論ＣａｔＧアッセイ対ＰｒｏＡｘｓｉｓ製のＥＬＩＳＡベースのＰｒｏｔｅａｓｅＴａｇ（登録商標）活性ＣａｔＧイムノアッセイについての評価
[00322] 表７に要約されるように、ＷＢＣペレットを、ＣａｔＧ抽出、ならびに反応速度論ＣａｔＧアッセイおよびＰｒｏＡｘｓｉｓ製のＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用した活性判定のために処理した。
Figure 2023535332000033
[00323] 以前の実施例に記載される、ＮＰ－４０溶解緩衝液を抽出に使用した場合のＮＥおよびＰＲ３活性を判定するためのものと同様に、群ＡおよびＢにおけるＷＢＣペレットを、洗浄画分活性アッセイおよび溶解物画分活性アッセイを含むデュアルアッセイ設計に供した。
[00324] ＮＳＰ抽出あたりのアッセイの数を減少させるために、単一アッセイ処理手順を、群Ｃ～Ｇにおけるペレットを用いて試験した。この過程は、ＲＢＣ溶解直後にＷＢＣペレットを洗浄して、妨害を引き起こし得る過度のＲＢＣ溶解物残留物を除去する工程を伴った。群Ｃにおけるペレットを、アッセイ緩衝液を用いてＲＢＣ溶解後に洗浄した。群Ｄにおけるペレットを、０．９％生理食塩水を用いてＲＢＣ溶解後に洗浄した。群Ｅにおけるペレットを、各溶解サイクル後の酵素回収についての付加的な評価を有して、群Ｄにおけるペレットと同様に処理した。これは、細胞溶解物をプールする前に、活性分析のために各溶解サイクルから細胞溶解物のごく一部を保存することによって成し遂げられた。臨床現場で生じ得る洗浄緩衝液の不完全なデカントの効果を、群Ｆにおけるペレットを用いて評価し、洗浄し、上清をデカントした後に、生理食塩水５００μＬを各ペレットに戻し添加した。群Ｇにおけるペレットに関しては、ＮＰ－４０溶解緩衝液の代わりに０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶解緩衝液をＣａｔＧ抽出に使用した。０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶解緩衝液は、様々なタイプの生物学的サンプルからＮＳＰを抽出するために、委託研究産業において広く使用されている。５人の異なるドナー（ドナー１～５）由来の５種のＷＢＣペレット一式を、組み合わされた群ＡおよびＢにおいて、ならびに群Ｃ～Ｇのそれぞれにおいて使用した。
[00325] 図８は、Ｓｉｇｍａ製のＳｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡペプチドを基質として使用した反応速度論ＣａｔＧアッセイによって判定され、活性ＣａｔＧ濃度として表現された、群Ａ～ＧにおけるＷＢＣペレットの総ＣａｔＧ活性を示している。群ＡおよびＢのペレットに関して、洗浄画分は、総ＣａｔＧ活性の１５％未満を占めた（データ示されず）。様々なペレット群に適用された種々のペレット処理手順は、一貫したドナー間ＣａｔＧ活性結果を生んだ。付加的に、群ＡおよびＢにおけるペレットに適用されたデュアルアッセイ手順と、群Ｃ、Ｄ、およびＥにおけるペレットに適用された単一アッセイ手順とを比較した場合、ＲＢＣ溶解直後に洗浄することは、「デュアルアッセイ」アーチファクト、すなわち異なるサンプル母材（洗浄溶液対細胞溶解物）を使用した２種のアッセイの遂行によって引き起こされる一方向性システムエラーにおそらく起因した、ＣａｔＧ活性のおよそ２５％の喪失をもたらした。活性のこの喪失は、群Ｃペレット（P=0.0066）および群Ｄペレット（P=0.0250）に関して有意であったが；しかしながら、群Ｅペレットの活性は、群Ａ／Ｂペレットのものよりも有意に低いことが見い出されなかった（P=0.0554）。
[00326] 処理手順が、臨床現場における潜在的なサンプル取り扱いミスである、洗浄緩衝液の不完全なデカントを模倣した群Ｆにおけるペレットは、群Ｄのその適正に取り扱われた対応物ペレットと比較して、２０％の有意に減退したＣａｔＧ活性を呈した（P=0.0423）。最後に、ＮＰ－４０溶解緩衝液で溶解された群Ｄペレットは、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶解緩衝液で溶解された群Ｇペレットと比較して、活性ＣａｔＧの３．５倍良好な回収を示した。
[00327] プールされた細胞溶解物画分を用いてＣａｔＧ活性を測定することに加えて、群Ｅペレットの一次、二次、および三次溶解からの個々の細胞溶解物画分におけるＣａｔＧ活性を、反応速度論ＣａｔＧアッセイを使用して測定した。目的は二元的であった：（１）個々の溶解物画分のＣａｔＧ活性の総和と、プールされた溶解物画分のＣａｔＧ活性とを比較して、プール手法の妥当性を判定すること；および（２）活性ＣａｔＧの大部分を抽出するために付加的な溶解工程が必要であるかどうかを判定すること。図９は、積み上げ棒が、総和された個々の溶解物画分における活性ＣａｔＧの濃度を表し、折れ線グラフが、ＷＢＣドナー１～５の間のプールされた溶解物画分における活性ＣａｔＧの濃度の傾向（プール希釈に対して補正された）、ならびに５人のドナーの相当する平均値を有する仮説的「平均」ドナーを描写する、結果を示している。
[00328] 総和されたおよびプールされた活性ＣａｔＧ濃度は互いに比較的近く、図８におけるものと同じドナー間傾向に従い、溶解物画分をプールすることが、反応速度論ＣａｔＧアッセイに対する妥当な手法であることを示唆する（図９）。一次細胞溶解物は、総活性ＣａｔＧのおよそ８１％を含有した。二次および三次細胞溶解物は、抽出された総活性ＣａｔＧのそれぞれおよそ１３％および６％を含有し、２回の溶解サイクルの後、完全に近い抽出が達成されることを示した。
[00329] 反応速度論ＣａｔＧアッセイと、ＰｒｏＡｘｓｉｓ製のＥＬＩＳＡベースのＰｒｏｔｅａｓｅＴａｇ（登録商標）活性ＣａｔＧイムノアッセイとを比較するために、群Ａ～Ｇの複製ＷＢＣペレットを、表７において指示される条件下で処理し、溶解し、活性ＣａｔＧ濃度としても表現されるそれらのＣａｔＧ活性をＰｒｏＡｘｓｉｓ製のＣａｔＧアッセイによって判定した。図１０は、総ＣａｔＧ活性データを示している。群ＡおよびＢにおけるペレットに関して、洗浄画分は、総ＣａｔＧ活性の２０％未満を占めた（データ示されず）。付加的に、群ＡおよびＢのペレットに適用されたデュアルアッセイ手順と、群Ｃ、Ｄ、およびＥのペレットに適用された単一アッセイ手順とを比較した場合、ＲＢＣ溶解直後に洗浄することは、上で論じられた「デュアルアッセイ」アーチファクトにおそらく起因した、ＣａｔＧ活性のおよそ３５％の喪失をもたらした。しかしながら、ドナー間ＣａｔＧ活性結果の一貫性の低下が、種々のペレット処理手順に供された様々なペレット群の間で観察された。群ＤおよびＥのペレットは、他の条件下で処理され、溶解された他の群のペレットとは異なるドナー間の傾向を示した。このことは、ＰｒｏＡｘｓｉｓ製のＣａｔＧアッセイが、反応速度論ＣａｔＧアッセイよりも、種々のペレット処理手順の下で信頼性が低いことを示す。
[00330] 群Ｆのペレットは、群Ｄのペレットと比較してＣａｔＧ活性の減退を示さず、洗浄緩衝液の不完全なデカントが、ＰｒｏＡｘｓｉｓ製のＣａｔＧアッセイを使用した活性ＣａｔＧの定量に影響を及ぼさないであろうことを示した。
[00331] 最後に、ＮＰ－４０溶解緩衝液で溶解された群Ｄペレットは、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶解緩衝液で溶解された群Ｇペレットと比較して、活性ＣａｔＧの３．５倍良好な回収を同じように示した。
[00332] プールされた細胞溶解物画分を用いてＣａｔＧ活性を測定することに加えて、ペレットＥの一次、二次、および三次溶解からの個々の細胞溶解物画分におけるＣａｔＧ活性を、ＰｒｏＡｘｓｉｓ製のＣａｔＧアッセイを使用して測定した。図１１は、積み上げ棒が、総和された個々の溶解物画分における活性ＣａｔＧの濃度を表し、折れ線グラフが、ＷＢＣドナー１～５の間のプールされた溶解物画分における活性ＣａｔＧの濃度の傾向（プール希釈に対して補正された）、ならびに５人のドナーの相当する平均値を有する「平均」ドナーを描写する、結果を示している。
[00333] 総和されたおよびプールされた活性ＣａｔＧ濃度は互いに比較的近く、溶解物画分をプールすることが、ＰｒｏＡｘｓｉｓ製のＣａｔＧアッセイに対する妥当な手法であることを示唆する（図１１）。一次細胞溶解物は、回収された総活性ＣａｔＧのおよそ６２％を含有した。二次および三次細胞溶解物は、抽出された総活性ＣａｔＧのそれぞれおよそ２７および１２％を含有した。一次細胞溶解物は、それらのサンプルはオーバーフローをもたらし、それゆえ最も高い標準物質濃度のものであると近似されたことから、総活性ＣａｔＧの６２％を上回る割合を実際には含有している可能性がある。
[00334] 要約すると、ＰｒｏＡｘｓｉｓ製のＣａｔＧアッセイおよび反応速度論ＣａｔＧアッセイは、同一のサンプルから同様の結果をもたらした。しかしながら、ＰｒｏＡｘｓｉｓ製のＣａｔＧアッセイは、使用された種々のペレット処理手順が、より一貫性の低いドナー間のＣａｔＧ活性結果につながったことから、より低いアッセイ感度を有するように見えた。付加的に、ＰｒｏＡｘｓｉｓ製のアッセイは、サンプルが標準物質域に入ることを確保するために複数の希釈を要し、ゆえに調製するためにより多くの時間を要する、Ｓ字状の標準曲線を生んだ。対照的に、反応速度論ＣａｔＧアッセイの標準曲線は、サンプル希釈および標準曲線域のより高い柔軟性を可能にする、ほぼ線形であった。ゆえに、反応速度論ＣａｔＧアッセイは、ＷＢＣサンプルにおける活性ＣａｔＧの定量に対して、ＰｒｏＡｘｓｉｓ製のＣａｔＧアッセイと比べて、感度、一貫性、および信頼性の向上を提供する。
[00335] まとめると、上の実施例は、図１２に図解されるように、ＷＢＣペレットからＮＳＰを抽出するための効率的で、再現性のある方法を実証する。合理化され、下流のＮＳＰ活性アッセイと適合して、方法は、ゲル化および活性アッセイの妨害を減少させるための、ＮＳＰ緩衝液（すなわち、アッセイ緩衝液）または０．９％生理食塩水を用いたペレットの溶解前またはＲＢＣ溶解（直）後の洗浄、ＮＳＰ活性アッセイのための洗浄画分の収集および内包、抽出されたＮＳＰを含有する細胞溶解物を生成するための、ＮＰ－４０溶解緩衝液を使用した洗浄ペレットの多工程（例えば、３、４、または５工程）の繰り返しの溶解、各溶解工程の間の増強した機械的撹拌、ならびにゲル化をさらに低下させ、スピンダウン後に細胞溶解物の収集を容易にするための、各細胞溶解物へのＮＳＰ緩衝液の添加、ならびにＮＳＰ活性アッセイのために細胞溶解物をプールすることを特色とする。
実施例９－ブレンソカチブ治療を受けた非嚢胞性線維症気管支拡張症を有する患者から獲得されたＷＢＣサンプルにおける活性ＮＳＰ濃度の低下は、気管支拡張症臨床転帰の向上と関連付けられた
[00336] 本発明者らは、非嚢胞性線維症気管支拡張症（NCFBE）を有する患者において２４週間１日１回投与される（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド（ブレンソカチブ）の効力、安全性および忍容性、ならびに薬物動態を査定するために、第２相、無作為化、二重盲検、プラセボ対照の治験を行っている。すべての目的上本参照によりその全体として本明細書に組み入れられる、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３８３（２２）：２１２７－２１３７（２０２０）における治験の詳細および結果を参照されたい。
[00337] 治験において、対象を、（ｉ）１日１回のブレンソカチブ１０ｍｇ；（ｉｉ）１日１回のブレンソカチブ２５ｍｇ；または（ｉｉｉ）１日１回の合致するプラセボ、のいずれかを受ける３種の治療アームに１：１：１比で無作為化した。スクリーニング来院（来院１）および最高６週間のスクリーニング期間の後、対象は、来院２（１日目、「ベースライン」）時に無作為化され、その後、２週目（来院３）、４週目（来院４）、８週目（来院５）、１２週目（来院６）、１６週目（来院７）、２０週目（来院８）、２４週目（来院９、治療の終了）、および２８週目（来院１０、調査の終了）の時点の調査来院のために訪れた。各来院の間、バイオマーカー査定のために、ベースライン、ならびに２、４、１２、２４、および２８週目の時点の血液および痰サンプルの収集を含めた、査定および手順を実施した。調査治療は、来院２～９に存在した。最初の肺の増悪までの時間（主要評価項目）、肺の増悪の速度（副次的評価項目）、痰における活性ＮＥの濃度の変化、および安全性を査定した。両投薬量でのブレンソカチブ治療は、プラセボと比較して最初の増悪までの時間を引き延ばした（ブレンソカチブ１０－ｍｇ対プラセボに関してp=0.03；ブレンソカチブ２５－ｍｇ対プラセボに関してp=0.04）。加えて、ブレンソカチブ治療は、プラセボと比較して、肺の増悪の頻度の低下をもたらした。具体的には、ブレンソカチブで治療された患者は、１０ｍｇアームにおいて３６％の低下（p=0.04）、および２５ｍｇアームにおいて２５％の低下（p=0.17）を経験した。ベースラインから治療期間の終了までの、プラセボに対する痰における活性ＮＥの濃度の変化も統計的に有意であり（１０ｍｇに関してp=0.034、２５ｍｇに関してp=0.021）、痰におけるＮＳＰ活性の低下と気管支拡張症臨床転帰の向上との間の関連性を示した。
[00338] 本実施例において、本発明者らは、以前の実施例に記載される反応速度論ＰＲ３およびＣａｔＧアッセイを使用して、３種の治療アームにおける患者から獲得された同じ痰サンプルにおける活性ＰＲ３およびＣａｔＧの濃度のベースラインからの変化をさらに判定し、活性ＮＥのものと変化を比較した。付加的に、本発明者らは、患者の血液サンプルに由来する白血球（WBC）からＮＥおよびＰＲ３を抽出し、実施例７に記載される方法を使用して、ＷＢＣサンプルにおける活性ＮＥおよびＰＲ３の濃度のベースラインからの変化を判定した。本発明者らは、同じサンプルタイプ由来または異なるサンプルタイプ由来の活性ＮＳＰレベルの変化の間の関係性をさらに調査した。
[00339] 図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃは、それぞれ活性ＮＥ、ＰＲ３、およびＣａｔＧの痰中濃度のベースライン（０週目）からの変化を示している。活性ＮＥ、ＰＲ３、およびＣａｔＧのベースライン痰中濃度のそれぞれは、スクリーニングおよび１日目の間に観察された平均値に由来した。３種の活性ＮＳＰは、痰中濃度の変化の同様のパターンを呈した。各活性ＮＳＰの痰中濃度は、ブレンソカチブ１０ｍｇアームにおいてよりもブレンソカチブ２５ｍｇアームにおいてより大きな低下を有して、用量依存的様式で４週目までにブレンソカチブ治療によって低下し、治療期間の終了後４週間を通じて回復した。３種の活性ＮＳＰの間で、活性ＰＲ３の濃度は、ブレンソカチブ治療による低下が最も小さかった。
[00340] 図１４Ａおよび１４Ｂは、患者のＷＢＣサンプルにおけるそれぞれ活性ＮＥおよびＰＲ３の濃度のベースライン（０週目）からの変化を示している。ＷＢＣサンプルにおける活性ＮＥ濃度は、用量依存的様式で４週目までにブレンソカチブ治療によって低下し、低下は２４週間の治療期間にわたって持続した。低下した活性ＮＥ濃度は、治療期間の終了の約４週間後にベースラインまで回復した（図１４Ａ）。活性ＰＲ３濃度に関して、それらが活性ＮＥ濃度よりも低い程度にブレンソカチブ治療によって低下したことを除いて、同様の傾向が観察された（図１４Ｂ）。
[00341] まとめると、ブレンソカチブ治療は、活性ＮＥ、ＰＲ３、およびＣａｔＧがＮＣＦＢＥにおける慢性炎症の主要な推進因子である、肺を起源とする痰サンプルにおける活性ＮＥ、ＰＲ３、およびＣａｔＧレベルを低下させた。ブレンソカチブ治療は、同様の時間経過および継続期間を有して、ＷＢＣにおける活性ＮＥおよびＰＲ３レベルも低下させたが、とはいえＷＢＣにおける低下は、痰サンプルにおける相当する低下よりも小さかった。
[00342] 表８は、ブレンソカチブ治療期間の４週目までの、ＷＢＣサンプルにおけるおよび痰における活性ＮＳＰ濃度のベースラインからの低下パーセンテージを示している。
Figure 2023535332000034
[00343] ４週目は、本発明者らが、ＮＳＰ活性に対するブレンソカチブの十分な影響が見えると予想する最初の時点であることから選定された。ＷＢＣおよび痰サンプルの両方において、より高用量（２５ｍｇ）のブレンソカチブは、活性ＮＳＰレベルのより大きな低下をもたらした。付加的に、痰における活性ＮＳＰ濃度は、ＷＢＣにおけるものよりも大きな程度に低下した。例えば、ブレンソカチブ１０ｍｇアームの患者において、活性ＮＥレベルは、痰における８６％の低下と比較して、ＷＢＣにおいて１９％低下した。ブレンソカチブ２５ｍｇアームにおいて、ＷＢＣにおいておよび痰において、それぞれ５４％および９１％のより大きな低下が観察された。
[00344] 表９は、同じサンプルタイプ由来（すなわち、WBCサンプル由来または痰サンプル由来）の活性ＮＳＰのレベルの間の、ならびに異なるサンプルタイプ由来の活性ＮＳＰのレベルの間の正の相関関係を示している。
Figure 2023535332000035
[00345] 表９では、５種のバイオマーカー（すなわち、痰中NE、PR3、およびCatG、ならびに血中NEおよびPR3）のそれぞれが、上部および左側の両方に列挙されており、対角線に沿って１の完全な相関関係を有する。痰サンプル由来の２種の異なるＮＳＰの間で、０．６１～０．８７に及ぶ強い正の相関関係が見られた。最も強い相関関係は、活性ＣａｔＧおよび活性ＮＥの痰中レベルの間であった。本発明者らは、血中ＮＥおよび血中ＰＲ３のレベルの間にも正の相関関係を観察した。付加的に、本発明者らは、０．１８～０．３６に及ぶ、血中および痰中ＮＳＰレベルの間のわずかにより低い正の相関関係を観察した。
[00346] 痰およびＷＢＣサンプル内および間の両方における活性ＮＳＰレベルの間の正の相関関係が理由で、気管支拡張症を有する患者におけるブレンソカチブ治療によるＷＢＣサンプルにおける活性ＮＳＰ濃度の低下は、痰における相当する低下のように、気管支拡張症臨床転帰の向上と関連付けられる。それゆえ、ＷＢＣにおける活性ＮＳＰ（例えば、NE、PR3、CatG、およびNSP4）の濃度の低下および低下の程度は、有効なブレンソカチブ投薬量を判定するための、ならびに／またはＮＣＦＢＥおよび本明細書に開示される他のＤＰＰ１媒介性疾患のブレンソカチブ治療の効力を評価するための有用なバイオマーカーとして働き得る。
[00347] 記載される発明は、その具体的な実施形態を参照して記載されているものの、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変化が加えられ得、等価物が置換され得ることは、当業者によって理解されるべきである。加えて、記載される発明の客観的な精神および範囲に、特定の状況、材料、物質の組成、過程、過程の１つまたは複数の工程を取り入れるために、多くの改変が加えられ得る。すべてのそのような改変は、本明細書に添付される特許請求の範囲の内にあることが意図される。
[00348] 本明細書において参照される特許、特許出願、特許出願公開、論文、およびプロトコールは、すべての目的上、参照によりそれらの全体として組み入れられる。

Claims (359)

  1. 対象から獲得されたＷＢＣを含むサンプルから１種または複数のＮＳＰを抽出する方法であって、
    サンプルと、少なくとも０．０１％（v/v）の第１の非イオン性界面活性剤を含む第１の水性媒体とを接触させて、第１の好中球セリンプロテアーゼ（NSP）抽出物を含む第１の細胞溶解物および第１の白血球（WBC）残留物を獲得する工程であって、第１のＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程、
    第１のＷＢＣ残留物から第１の細胞溶解物を分離して、第１のＮＳＰ抽出物を含む第１の分離された細胞溶解物を提供する工程、
    第１のＷＢＣ残留物と、少なくとも０．０１％（v/v）の第２の非イオン性界面活性剤を含む第２の水性媒体とを接触させて、第２のＮＳＰ抽出物を含む第２の細胞溶解物および第２のＷＢＣ残留物を獲得する工程であって、第２のＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程、ならびに
    第２のＷＢＣ残留物から第２の細胞溶解物を分離して、第２のＮＳＰ抽出物を含む第２の分離された細胞溶解物を提供する工程
    を含む、方法。
  2. サンプルと第１の水性媒体とを接触させる工程、および第１のＷＢＣ残留物と第２の水性媒体とを接触させる工程それぞれが、約０℃～約１０℃の温度で実施される、請求項１に記載の方法。
  3. サンプルと第１の水性媒体とを接触させる工程が、サンプルと第１の水性媒体とを混合する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. サンプルと第１の水性媒体とを混合する工程が、サンプルと第１の水性媒体とを撹拌する工程を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 撹拌する工程が、ピペッティングすることによって行われる、請求項４に記載の方法。
  6. 撹拌する工程が、ボルテックスするまたは振とうすることによって行われる、請求項４に記載の方法。
  7. 撹拌する工程が、かき混ぜることによって行われる、請求項４に記載の方法。
  8. 撹拌する工程が、パドルを用いて行われる、請求項４に記載の方法。
  9. パドルがＵＳＰ装置２である、請求項８に記載の方法。
  10. 第１のＷＢＣ残留物と第２の水性媒体とを接触させる工程が、第１のＷＢＣ残留物と第２の水性媒体とを混合する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
  11. 第１のＷＢＣ残留物と第２の水性媒体とを混合する工程が、第１のＷＢＣ残留物と第２の水性媒体とを撹拌する工程を含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 撹拌する工程が、ピペッティングすることによって行われる、請求項１１に記載の方法。
  13. 撹拌する工程が、ボルテックスするまたは振とうすることによって行われる、請求項１１に記載の方法。
  14. 撹拌する工程が、かき混ぜることによって行われる、請求項１１に記載の方法。
  15. 撹拌する工程が、パドルを用いて行われる、請求項１１に記載の方法。
  16. パドルがＵＳＰ装置２である、請求項１５に記載の方法。
  17. 第１の非イオン性界面活性剤および第２の非イオン性界面活性剤が同じである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 第１の非イオン性界面活性剤および第２の非イオン性界面活性剤が、異なる非イオン性界面活性剤である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  19. 第１の非イオン性界面活性剤および第２の非イオン性界面活性剤が、同じ濃度で存在する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 第１の非イオン性界面活性剤および第２の非イオン性界面活性剤が、異なる濃度で存在する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  21. 第１または第２の分離された細胞溶解物の１種または複数のＮＳＰの活性形態の濃度を測定する工程をさらに含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 第１および第２の分離された細胞溶解物を組み合わせて、第１のプールされたＮＳＰ抽出物を含む第１のプールされた細胞溶解物を提供する工程であって、第１のプールされたＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程をさらに含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  23. 第１のプールされたＮＳＰ抽出物を含む第１のプールされた細胞溶解物の１種または複数のＮＳＰの活性形態の濃度を測定する工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 第２のＷＢＣ残留物と、少なくとも０．０１％（v/v）の第３の非イオン性界面活性剤を含む第３の水性媒体とを接触させて、第３のＮＳＰ抽出物を含む第３の細胞溶解物および第３のＷＢＣ残留物を獲得する工程であって、第３のＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程、ならびに
    第３のＷＢＣ残留物から第３の細胞溶解物を分離して、第３のＮＳＰ抽出物を含む第３の分離された細胞溶解物を提供する工程
    をさらに含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  25. 第２のＷＢＣ残留物と第３の水性媒体とを接触させる工程が、約０℃～約１０℃の温度で実施される、請求項２４に記載の方法。
  26. 第２のＷＢＣ残留物と第３の水性媒体とを接触させる工程が、第２のＷＢＣ残留物と第３の水性媒体とを混合する工程を含む、請求項２４または２５に記載の方法。
  27. 第２のＷＢＣ残留物と第３の水性媒体とを混合する工程が、第２のＷＢＣ残留物と第３の水性媒体とを撹拌する工程を含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 撹拌する工程が、ピペッティングすることによって行われる、請求項２７に記載の方法。
  29. 撹拌する工程が、ボルテックスするまたは振とうすることによって行われる、請求項２７に記載の方法。
  30. 撹拌する工程が、かき混ぜることによって行われる、請求項２７に記載の方法。
  31. 撹拌する工程が、パドルを用いて行われる、請求項２７に記載の方法。
  32. パドルがＵＳＰ装置２である、請求項３１に記載の方法。
  33. 第１、第２、および第３の非イオン性界面活性剤が同じである、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 第１、第２、および第３の非イオン性界面活性剤のうちの少なくとも２種が、異なる非イオン性界面活性剤である、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の方法。
  35. 第１、第２、および第３の非イオン性界面活性剤が、同じ濃度で存在する、請求項２４～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 第１、第２、および第３の非イオン性界面活性剤のうちの少なくとも２種が、異なる濃度で存在する、請求項２４～３４のいずれか一項に記載の方法。
  37. 第１、第２、または第３の分離された細胞溶解物の１種または複数のＮＳＰの活性形態の濃度を測定する工程をさらに含む、請求項２４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 第３の分離された細胞溶解物と、第１の分離された細胞溶解物、第２の分離された細胞溶解物、または第１および第２の分離された細胞溶解物とを組み合わせて、第２のプールされたＮＳＰ抽出物を含む第２のプールされた細胞溶解物を提供する工程であって、第２のプールされたＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程をさらに含む、請求項２４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  39. 第３の分離された細胞溶解物と第１および第２の分離された細胞溶解物とを組み合わせて、第２のプールされたＮＳＰ抽出物を含む第２のプールされた細胞溶解物を提供する工程であって、第２のプールされたＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程をさらに含む、請求項２４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  40. 第２のプールされたＮＳＰ抽出物を含む第２のプールされた細胞溶解物の１種または複数のＮＳＰの活性形態の濃度を測定する工程をさらに含む、請求項３８または３９に記載の方法。
  41. 第３のＷＢＣ残留物と、少なくとも０．０１％（v/v）の第４の非イオン性界面活性剤を含む第４の水性媒体とを接触させて、第４のＮＳＰ抽出物を含む第４の細胞溶解物および第４のＷＢＣ残留物を獲得する工程であって、第４のＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程、ならびに
    第４のＷＢＣ残留物から第４の細胞溶解物を分離して、第４のＮＳＰ抽出物を含む第４の分離された細胞溶解物を提供する工程
    をさらに含む、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の方法。
  42. 第３のＷＢＣ残留物と第４の水性媒体とを接触させる工程が、約０℃～約１０℃の温度で実施される、請求項４１に記載の方法。
  43. 第３のＷＢＣ残留物と第４の水性媒体とを接触させる工程が、第３のＷＢＣ残留物と第４の水性媒体とを混合する工程を含む、請求項４１または４２に記載の方法。
  44. 第３のＷＢＣ残留物と第４の水性媒体とを混合する工程が、第３のＷＢＣ残留物と第４の水性媒体とを撹拌する工程を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 撹拌する工程が、ピペッティングすることによって行われる、請求項４４に記載の方法。
  46. 撹拌する工程が、ボルテックスするまたは振とうすることによって行われる、請求項４４に記載の方法。
  47. 撹拌する工程が、かき混ぜることによって行われる、請求項４４に記載の方法。
  48. 撹拌する工程が、パドルを用いて行われる、請求項４４に記載の方法。
  49. パドルがＵＳＰ装置２である、請求項４８に記載の方法。
  50. 第１、第２、第３、および第４の非イオン性界面活性剤が同じである、請求項４１～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 第１、第２、第３、および第４の非イオン性界面活性剤のうちの少なくとも２種が、異なる非イオン性界面活性剤である、請求項４１～４９のいずれか一項に記載の方法。
  52. 第１、第２、第３、および第４の非イオン性界面活性剤が、同じ濃度で存在する、請求項４１～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 第１、第２、第３、および第４の非イオン性界面活性剤のうちの少なくとも２種が、異なる濃度で存在する、請求項４１～５１のいずれか一項に記載の方法。
  54. 第１、第２、第３、または第４の分離された細胞溶解物の１種または複数のＮＳＰの活性形態の濃度を測定する工程をさらに含む、請求項４１～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 第４の分離された細胞溶解物と、第１の分離された細胞溶解物、第２の分離された細胞溶解物、第３の分離された細胞溶解物、またはその組み合わせとを組み合わせて、第３のプールされたＮＳＰ抽出物を含む第３のプールされた細胞溶解物を提供する工程であって、第３のプールされたＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程をさらに含む、請求項４１～５３のいずれか一項に記載の方法。
  56. 第４の分離された細胞溶解物と第１、第２、および第３の分離された細胞溶解物とを組み合わせて、第３のプールされたＮＳＰ抽出物を含む第３のプールされた細胞溶解物を提供する工程であって、第３のプールされたＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程をさらに含む、請求項４１～５３のいずれか一項に記載の方法。
  57. 第３のプールされたＮＳＰ抽出物を含む第３のプールされた細胞溶解物の１種または複数のＮＳＰの活性形態の濃度を測定する工程をさらに含む、請求項５５または５６に記載の方法。
  58. 第４のＷＢＣ残留物と、少なくとも０．０１％（v/v）の第５の非イオン性界面活性剤を含む第５の水性媒体とを接触させて、第５のＮＳＰ抽出物を含む第５の細胞溶解物および第５のＷＢＣ残留物を獲得する工程であって、第５のＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程、ならびに
    第５のＷＢＣ残留物から第５の細胞溶解物を分離して、第５のＮＳＰ抽出物を含む第５の分離された細胞溶解物を提供する工程
    をさらに含む、請求項４１～４９のいずれか一項に記載の方法。
  59. 第４のＷＢＣ残留物と第５の水性媒体とを接触させる工程が、約０℃～約１０℃の温度で実施される、請求項５８に記載の方法。
  60. 第４のＷＢＣ残留物と第５の水性媒体とを接触させる工程が、第４のＷＢＣ残留物と第５の水性媒体とを混合する工程を含む、請求項５８または５９に記載の方法。
  61. 第４のＷＢＣ残留物と第５の水性媒体とを混合する工程が、第４のＷＢＣ残留物と第５の水性媒体とを撹拌する工程を含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 撹拌する工程が、ピペッティングすることによって行われる、請求項６１に記載の方法。
  63. 撹拌する工程が、ボルテックスするまたは振とうすることによって行われる、請求項６１に記載の方法。
  64. 撹拌する工程が、かき混ぜることによって行われる、請求項６１に記載の方法。
  65. 撹拌する工程が、パドルを用いて行われる、請求項６１に記載の方法。
  66. パドルがＵＳＰ装置２である、請求項６５に記載の方法。
  67. 第１、第２、第３、第４、および第５の非イオン性界面活性剤が同じである、請求項５８～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 第１、第２、第３、第４、および第５の非イオン性界面活性剤のうちの少なくとも２種が、異なる非イオン性界面活性剤である、請求項５８～６６のいずれか一項に記載の方法。
  69. 第１、第２、第３、第４、および第５の非イオン性界面活性剤が、同じ濃度で存在する、請求項５８～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 第１、第２、第３、第４、および第５の非イオン性界面活性剤のうちの少なくとも２種が、異なる濃度で存在する、請求項５８～６８のいずれか一項に記載の方法。
  71. 第１、第２、第３、第４、または第５の分離された細胞溶解物の１種または複数のＮＳＰの活性形態の濃度を測定する工程をさらに含む、請求項５８～７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 第５の分離された細胞溶解物と、第１の分離された細胞溶解物、第２の分離された細胞溶解物、第３の分離された細胞溶解物、第４の分離された細胞溶解物、またはその組み合わせとを組み合わせて、第４のプールされたＮＳＰ抽出物を含む第４のプールされた細胞溶解物を提供する工程であって、第４のプールされたＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程をさらに含む、請求項５８～７０のいずれか一項に記載の方法。
  73. 第５の分離された細胞溶解物と第１、第２、第３、および第４の分離された細胞溶解物とを組み合わせて、第４のプールされたＮＳＰ抽出物を含む第４のプールされた細胞溶解物を提供する工程であって、第４のプールされたＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程をさらに含む、請求項５８～７０のいずれか一項に記載の方法。
  74. 第４のプールされたＮＳＰ抽出物を含む第４のプールされた細胞溶解物の１種または複数のＮＳＰの活性形態の濃度を測定する工程をさらに含む、請求項７２または７３に記載の方法。
  75. 第５のＷＢＣ残留物と、少なくとも０．０１％（v/v）の第６の非イオン性界面活性剤を含む第６の水性媒体とを接触させて、第６のＮＳＰ抽出物を含む第６の細胞溶解物および第６のＷＢＣ残留物を獲得する工程であって、第６のＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程、ならびに
    第６のＷＢＣ残留物から第６の細胞溶解物を分離して、第６のＮＳＰ抽出物を含む第６の分離された細胞溶解物を提供する工程
    をさらに含む、請求項５８～６６のいずれか一項に記載の方法。
  76. 第５のＷＢＣ残留物と第６の水性媒体とを接触させる工程が、約０℃～約１０℃の温度で実施される、請求項７５に記載の方法。
  77. 第５のＷＢＣ残留物と第６の水性媒体とを接触させる工程が、第５のＷＢＣ残留物と第６の水性媒体とを混合する工程を含む、請求項７５または７６に記載の方法。
  78. 第５のＷＢＣ残留物と第６の水性媒体とを混合する工程が、第５のＷＢＣ残留物と第６の水性媒体とを撹拌する工程を含む、請求項７７に記載の方法。
  79. 撹拌する工程が、ピペッティングすることによって行われる、請求項７７に記載の方法。
  80. 撹拌する工程が、ボルテックスするまたは振とうすることによって行われる、請求項７７に記載の方法。
  81. 撹拌する工程が、かき混ぜることによって行われる、請求項７７に記載の方法。
  82. 撹拌する工程が、パドルを用いて行われる、請求項７７に記載の方法。
  83. パドルがＵＳＰ装置２である、請求項８２に記載の方法。
  84. 第１、第２、第３、第４、第５、および第６の非イオン性界面活性剤が同じである、請求項７５～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 第１、第２、第３、第４、第５、および第６の非イオン性界面活性剤のうちの少なくとも２種が、異なる非イオン性界面活性剤である、請求項７５～８３のいずれか一項に記載の方法。
  86. 第１、第２、第３、第４、第５、および第６の非イオン性界面活性剤が、同じ濃度で存在する、請求項７５～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 第１、第２、第３、第４、第５、および第６の非イオン性界面活性剤のうちの少なくとも２種が、異なる濃度で存在する、請求項７５～８５のいずれか一項に記載の方法。
  88. 第１、第２、第３、第４、第５、または第６の分離された細胞溶解物の１種または複数のＮＳＰの活性形態の濃度を測定する工程をさらに含む、請求項７５～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 第６の分離された細胞溶解物と、第１の分離された細胞溶解物、第２の分離された細胞溶解物、第３の分離された細胞溶解物、第４の分離された細胞溶解物、第５の分離された細胞溶解物、またはその組み合わせとを組み合わせて、第５のプールされたＮＳＰ抽出物を含む第５のプールされた細胞溶解物を提供する工程であって、第５のプールされたＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程をさらに含む、請求項７５～８７のいずれか一項に記載の方法。
  90. 第６の分離された細胞溶解物と第１、第２、第３、第４、および第５の分離された細胞溶解物とを組み合わせて、第５のプールされたＮＳＰ抽出物を含む第５のプールされた細胞溶解物を提供する工程であって、第５のプールされたＮＳＰ抽出物は１種または複数のＮＳＰを含む、工程をさらに含む、請求項７５～８７のいずれか一項に記載の方法。
  91. 第５のプールされたＮＳＰ抽出物を含む第５のプールされた細胞溶解物の１種または複数のＮＳＰの活性形態の濃度を測定する工程をさらに含む、請求項８９または９０に記載の方法。
  92. サンプルと第１の水性媒体とを接触させる工程が、サンプルに水性洗浄溶液を添加して、水性洗浄溶液とサンプルとの混合物を形成する工程、水性洗浄溶液とサンプルとの混合物を遠心分離して、上清とＷＢＣを含むペレットとを提供する工程、上清を収集する工程、およびペレットと第１の水性媒体とを接触させる工程を含む、請求項１～９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. ペレットと第１の水性媒体とを接触させる工程が、ペレットと第１の水性媒体とを混合する工程を含む、請求項９２に記載の方法。
  94. ペレットと第１の水性媒体とを混合する工程が、ペレットと第１の水性媒体とを撹拌する工程を含む、請求項９３に記載の方法。
  95. 撹拌する工程が、ピペッティングすることによって行われる、請求項９４に記載の方法。
  96. 撹拌する工程が、ボルテックスするまたは振とうすることによって行われる、請求項９４に記載の方法。
  97. 撹拌する工程が、かき混ぜることによって行われる、請求項９４に記載の方法。
  98. 撹拌する工程が、パドルを用いて行われる、請求項９４に記載の方法。
  99. パドルがＵＳＰ装置２である、請求項９８に記載の方法。
  100. 水性洗浄溶液が、リン酸緩衝生理食塩溶液、または約０．９％ＮａＣｌを含む生理食塩溶液である、請求項９２～９９のいずれか一項に記載の方法。
  101. 水性洗浄溶液が、Ｔｒｉｓベースのアルカリ性緩衝液およびＮａＣｌを含む、請求項９２～９９のいずれか一項に記載の方法。
  102. 水性洗浄溶液が、約１００ｍＭ Ｔｒｉｓおよび約１００ｍＭ ＮａＣｌを含み、約７．５のｐＨを有する、請求項１０１に記載の方法。
  103. 上清が１種または複数のＮＳＰを含み、方法が、上清の１種または複数のＮＳＰの活性形態の濃度を測定する工程をさらに含む、請求項９２～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. 第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせが、少なくとも０．０２％（v/v）のそれぞれの第１、第２、第３、第４、第５、または第６の非イオン性界面活性剤を含む、請求項１～１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. 第１もしくは第２の水性媒体、またはその組み合わせが、少なくとも０．０２％（v/v）のそれぞれの第１または第２の非イオン性界面活性剤を含む、請求項１０４に記載の方法。
  106. 第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせが、少なくとも０．０５％（v/v）のそれぞれの第１、第２、第３、第４、第５、または第６の非イオン性界面活性剤を含む、請求項１～１０４のいずれか一項に記載の方法。
  107. 第１もしくは第２の水性媒体、またはその組み合わせが、少なくとも０．０５％（v/v）のそれぞれの第１または第２の非イオン性界面活性剤を含む、請求項１０６に記載の方法。
  108. 第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせが、約０．０２％（v/v）～約１．５％（v/v）のそれぞれの第１、第２、第３、第４、第５、または第６の非イオン性界面活性剤を含む、請求項１～１０４のいずれか一項に記載の方法。
  109. 第１もしくは第２の水性媒体、またはその組み合わせが、約０．０２％（v/v）～約１．５％（v/v）のそれぞれの第１または第２の非イオン性界面活性剤を含む、請求項１０８に記載の方法。
  110. 第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせが、約０．０３％（v/v）～約１％（v/v）のそれぞれの第１、第２、第３、第４、第５、または第６の非イオン性界面活性剤を含む、請求項１０８に記載の方法。
  111. 第１もしくは第２の水性媒体、またはその組み合わせが、約０．０３％（v/v）～約１％（v/v）のそれぞれの第１または第２の非イオン性界面活性剤を含む、請求項１１０に記載の方法。
  112. 第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせが、約０．０４％（v/v）～約０．８％（v/v）のそれぞれの第１、第２、第３、第４、第５、または第６の非イオン性界面活性剤を含む、請求項１１０に記載の方法。
  113. 第１もしくは第２の水性媒体、またはその組み合わせが、約０．０４％（v/v）～約０．８％（v/v）のそれぞれの第１または第２の非イオン性界面活性剤を含む、請求項１１２に記載の方法。
  114. 第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせが、約０．０５％（v/v）～約０．６％（v/v）のそれぞれの第１、第２、第３、第４、第５、または第６の非イオン性界面活性剤を含む、請求項１１２に記載の方法。
  115. 第１もしくは第２の水性媒体、またはその組み合わせが、約０．０５％（v/v）～約０．６％（v/v）のそれぞれの第１または第２の非イオン性界面活性剤を含む、請求項１１４に記載の方法。
  116. 第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせが、約０．０５％（v/v）のそれぞれの第１、第２、第３、第４、第５、または第６の非イオン性界面活性剤を含む、請求項１１４に記載の方法。
  117. 第１もしくは第２の水性媒体、またはその組み合わせが、約０．０５％（v/v）のそれぞれの第１または第２の非イオン性界面活性剤を含む、請求項１１６に記載の方法。
  118. 第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の非イオン性界面活性剤、またはその組み合わせが、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤である、請求項１～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  119. 第１の非イオン性界面活性剤が、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤である、請求項１～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  120. 第２の非イオン性界面活性剤が、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤である、請求項１～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  121. 第３の非イオン性界面活性剤が、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤である、請求項２４～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  122. 第４の非イオン性界面活性剤が、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤である、請求項４１～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  123. 第５の非イオン性界面活性剤が、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤である、請求項５８～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  124. 第６の非イオン性界面活性剤が、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤である、請求項７５～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  125. 第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の非イオン性界面活性剤、またはその組み合わせが、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、２－［４－（２，４，４－トリメチルペンタン－２－イル）フェノキシ］エタノール、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（分岐）、およびポリエチレングリコールソルビタンモノラウレートからなる群から選択される非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤である、請求項１１８～１２４のいずれか一項に記載の方法。
  126. 第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の非イオン性界面活性剤、またはその組み合わせが、オクチルフェノキシポリエトキシエタノールである、請求項１２５に記載の方法。
  127. 第１の非イオン性界面活性剤が、オクチルフェノキシポリエトキシエタノールである、請求項１２５または１２６に記載の方法。
  128. 第２の非イオン性界面活性剤が、オクチルフェノキシポリエトキシエタノールである、請求項１２５または１２６に記載の方法。
  129. 第３の非イオン性界面活性剤が、オクチルフェノキシポリエトキシエタノールである、請求項１２５または１２６に記載の方法。
  130. 第４の非イオン性界面活性剤が、オクチルフェノキシポリエトキシエタノールである、請求項１２５または１２６に記載の方法。
  131. 第５の非イオン性界面活性剤が、オクチルフェノキシポリエトキシエタノールである、請求項１２５または１２６に記載の方法。
  132. 第６の非イオン性界面活性剤が、オクチルフェノキシポリエトキシエタノールである、請求項１２５または１２６に記載の方法。
  133. 第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の水性媒体、またはその組み合わせが、約０．０５％（v/v）のオクチルフェノキシポリエトキシエタノール、約０．７５Ｍ ＮａＣｌ、および約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む、請求項１２６～１３２のいずれか一項に記載の方法。
  134. 第１もしくは第２の水性媒体、またはその組み合わせが、約０．０５％（v/v）のオクチルフェノキシポリエトキシエタノール、約０．７５Ｍ ＮａＣｌ、および約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む、請求項１３３に記載の方法。
  135. １種または複数のＮＳＰが、好中球エラスターゼ（NE）、プロテイナーゼ３（PR3）、カテプシンＧ（CatG）、好中球セリンプロテアーゼ４（NSP4）、またはその組み合わせを含む、請求項１～１３４のいずれか一項に記載の方法。
  136. １種または複数のＮＳＰが、ＮＥを含む、請求項１３５に記載の方法。
  137. １種または複数のＮＳＰが、ＰＲ３を含む、請求項１３５または１３６に記載の方法。
  138. １種または複数のＮＳＰが、ＣａｔＧを含む、請求項１３５～１３７のいずれか一項に記載の方法。
  139. １種または複数のＮＳＰが、ＮＳＰ４を含む、請求項１３５～１３８のいずれか一項に記載の方法。
  140. 対象が、ヒト対象である、請求項１～１３９のいずれか一項に記載の方法。
  141. それを必要とする患者におけるＤＰＰ１媒介性病態を治療する方法であって、
    （a）患者から獲得された白血球を含む第１のサンプルから抽出された１種または複数のＮＳＰの活性形態のベースライン濃度を測定する工程、
    （b）式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の約１０ｍｇ～約４０ｍｇの第１の１日投薬量を含む薬学的組成物を、約２週間～約１６週間の第１の投与期間毎日患者に経口投与する工程、
    Figure 2023535332000036
     （式中、Ｒ１は、
    Figure 2023535332000037
     であり；
    Ｒ２は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＳＯ２Ｃ１～３アルキル、またはＣ１～３アルキルであり；
    Ｒ３は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＳＯ２Ｃ１～３アルキル、ＣＯＮＨ２、またはＳＯ２ＮＲ４Ｒ５（式中、Ｒ４およびＲ５は、それらが付着される窒素原子とともにアゼチジン、ピロリジン、またはピペリジン環を形成する）であり；
    Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＦ２であり；
    Ｙは、ＯまたはＳであり；
    Ｑは、ＣＨまたはＮであり；
    Ｒ６はＣ１～３アルキルであり、Ｃ１～３アルキルは、任意選択により１、２、または３個のＦによって、任意選択によりＯＨ、ＯＣ１～３アルキル、Ｎ（Ｃ１～３アルキル）２、シクロプロピル、またはテトラヒドロピランから選択される１種の置換基によって置換されており；
    Ｒ７は、水素、Ｆ、Ｃｌ、またはＣＨ３である）；
    （c）白血球を含む第２のサンプルから抽出された１種または複数のＮＳＰの活性形態の濃度を測定する工程であって、第２のサンプルは、第１の投与期間の間または第１の投与期間の約１週間以下後に患者から獲得される、工程、
    （d）第２のサンプルからの濃度と、第１のサンプルからのベースライン濃度とを比較し；
    第２のサンプルからの濃度が、第１のサンプルからのベースライン濃度と比較して約１０％以上低下した場合には、式（Ｉ）の化合物もしくはその薬学的に許容される塩の第１の１日投薬量と同じ１日投薬量を、第２の投与期間毎日患者に経口投与する工程、または
    第２のサンプルからの濃度が、第１のサンプルからのベースライン濃度と比較して約１０％以上低下しなかった場合には、式（Ｉ）の化合物もしくはその薬学的に許容される塩の第２の１日投薬量を、第２の投与期間毎日患者に経口投与する工程であって、第２の１日投薬量は、第１の１日投薬量の約１．５倍～約７倍である、工程
    を含む、方法。
  142. 式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩が、Ｓ，Ｓジアステレオマー：
    Figure 2023535332000038
     である、請求項１４１に記載の方法。
  143. 式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩が、Ｓ，Ｒジアステレオマー：
    Figure 2023535332000039
     である、請求項１４１に記載の方法。
  144. 式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩が、Ｒ，Ｓジアステレオマー：
    Figure 2023535332000040
     である、請求項１４１に記載の方法。
  145. 式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩が、Ｒ，Ｒジアステレオマー：
    Figure 2023535332000041
     である、請求項１４１に記載の方法。
  146. 組成物が、式（Ｉ）の化合物のＳ，Ｓジアステレオマーと式（Ｉ）の化合物のＳ，Ｒジアステレオマーとの混合物を含む、請求項１４１に記載の方法。
  147. 組成物が、式（Ｉ）の化合物のＳ，Ｓジアステレオマーと式（Ｉ）の化合物のＲ，Ｓジアステレオマーとの混合物を含む、請求項１４１に記載の方法。
  148. 組成物が、式（Ｉ）の化合物のＳ，Ｓジアステレオマーと式（Ｉ）の化合物のＲ，Ｒジアステレオマーとの混合物を含む、請求項１４１に記載の方法。
  149. Ｒ１が、
    Figure 2023535332000042
     であり；
    Ｘが、Ｏ、Ｓ、またはＣＦ２であり；
    Ｙが、ＯまたはＳであり；
    Ｑが、ＣＨまたはＮであり；
    Ｒ６がＣ１～３アルキルであり、Ｃ１～３アルキルは、任意選択により１、２、または３個のＦによって、任意選択によりＯＨ、ＯＣ１～３アルキル、Ｎ（Ｃ１～３アルキル）２、シクロプロピル、またはテトラヒドロピランから選択される１種の置換基によって置換されており；
    Ｒ７が、水素、Ｆ、Ｃｌ、またはＣＨ３である、請求項１４１～１４８のいずれか一項に記載の方法。
  150. Ｒ１が、
    Figure 2023535332000043
     であり；
    Ｘが、Ｏ、Ｓ、またはＣＦ２であり；
    Ｙが、ＯまたはＳであり；
    Ｒ６がＣ１～３アルキルであり、Ｃ１～３アルキルは、任意選択により１、２、または３個のＦによって、任意選択によりＯＨ、ＯＣ１～３アルキル、Ｎ（Ｃ１～３アルキル）２、シクロプロピル、またはテトラヒドロピランから選択される１種の置換基によって置換されており；
    Ｒ７が、水素、Ｆ、Ｃｌ、またはＣＨ３である、請求項１４１～１４９のいずれか一項に記載の方法。
  151. Ｒ１が、
    Figure 2023535332000044
     である、請求項１４１～１５０のいずれか一項に記載の方法。
  152. Ｘが、Ｏ、Ｓ、またはＣＦ２であり；Ｒ６がＣ１～３アルキルであり、Ｃ１～３アルキルは、任意選択により１、２、または３個のＦによって置換されており；Ｒ７が、水素、Ｆ、Ｃｌ、またはＣＨ３である、請求項１４１～１５１のいずれか一項に記載の方法。
  153. ＸがＯであり；Ｒ６がＣ１～３アルキルであり、Ｃ１～３アルキルは、任意選択により１、２、または３個のＦによって置換されており；Ｒ７が水素である、請求項１４１～１５１のいずれか一項に記載の方法。
  154. ＸがＯであり；Ｒ６がＣ１～３アルキルであり；Ｒ７が水素である、請求項１４１～１５１のいずれか一項に記載の方法。
  155. 式（Ｉ）の化合物が、
    （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－（４’－シアノビフェニル－４－イル）エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３，７－ジメチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    ４’－［（２Ｓ）－２－シアノ－２－｛［（２Ｓ）－１，４－オキサゼパン－２－イルカルボニル］アミノ｝エチル］ビフェニル－３－イルメタンスルホネート；
    （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－１，２－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４’－（トリフルオロメチル）ビフェニル－４－イル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－（３’，４’－ジフルオロビフェニル－４－イル）エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（６－シアノピリジン－３－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（４－メチル－３－オキソ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－１，４－ベンゾチアジン－６－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－エチル－７－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（２，２－ジフルオロエチル）－７－フルオロ－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－（４－｛３－［２－（ジメチルアミノ）エチル］－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル｝フェニル）エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３，３－ジフルオロ－１－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インドール－６－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（７－フルオロ－３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－エチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（シクロプロピルメチル）－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（２－メトキシエチル）－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾチアゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［２－オキソ－３－（プロパン－２－イル）－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（４－メチル－３－オキソ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－１，４－ベンゾオキサジン－６－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（２－メトキシエチル）－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（５－シアノチオフェン－２－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－２－（４’－カルバモイル－３’－フルオロビフェニル－４－イル）－１－シアノエチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（１－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－７－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［２－オキソ－３－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イルメチル）－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－２－［４－（７－クロロ－３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］－１－シアノエチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（２，２－ジフルオロエチル）－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［２－オキソ－３－（２，２，２－トリフルオロエチル）－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾチアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４’－（メチルスルホニル）ビフェニル－４－イル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－２－［４’－（アゼチジン－１－イルスルホニル）ビフェニル－４－イル］－１－シアノエチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－（４’－フルオロビフェニル－４－イル）エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－２－［４－（１，３－ベンゾチアゾール－５－イル）フェニル］－１－シアノエチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－（４’－シアノビフェニル－４－イル）エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド；
    およびその薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項１４１または１４２に記載の方法。
  156. 式（Ｉ）の化合物が、ブレンソカチブまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１４１または１４２に記載の方法。
  157. 式（Ｉ）の化合物が、ブレンソカチブである、請求項１４１または１４２に記載の方法。
  158. 式（Ｉ）の化合物が、（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｒ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド：
    Figure 2023535332000045
     またはその薬学的に許容される塩である、請求項１４１または１４３に記載の方法。
  159. 式（Ｉ）の化合物が、（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｒ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド：
    Figure 2023535332000046
     である、請求項１５８に記載の方法。
  160. 式（Ｉ）の化合物が、（２Ｒ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド：
    Figure 2023535332000047
     またはその薬学的に許容される塩である、請求項１４１または１４４に記載の方法。
  161. 式（Ｉ）の化合物が、（２Ｒ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド：
    Figure 2023535332000048
     である、請求項１６０に記載の方法。
  162. 式（Ｉ）の化合物が、（２Ｒ）－Ｎ－｛（１Ｒ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド：
    Figure 2023535332000049
     またはその薬学的に許容される塩である、請求項１４１または１４５に記載の方法。
  163. 式（Ｉ）の化合物が、（２Ｒ）－Ｎ－｛（１Ｒ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド：
    Figure 2023535332000050
     である、請求項１６２に記載の方法。
  164. 組成物が、ブレンソカチブまたはその薬学的に許容される塩と、（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｒ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド：
    Figure 2023535332000051
     またはその薬学的に許容される塩との混合物を含む、請求項１４１に記載の方法。
  165. 組成物が、ブレンソカチブまたはその薬学的に許容される塩と、（２Ｒ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド：
    Figure 2023535332000052
     またはその薬学的に許容される塩との混合物を含む、請求項１４１に記載の方法。
  166. 組成物が、ブレンソカチブまたはその薬学的に許容される塩と、（２Ｒ）－Ｎ－｛（１Ｒ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド：
    Figure 2023535332000053
     またはその薬学的に許容される塩との混合物を含む、請求項１４１に記載の方法。
  167. 組成物が、薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、または担体を含む、請求項１４１～１６６のいずれか一項に記載の方法。
  168. 組成物が、
    （a）約１～約３０ｗｔ％の式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩、
    （b）約５５～約７５ｗｔ％の薬学的希釈剤、
    （c）約１５～約２５ｗｔ％の圧縮補助剤、
    （d）約３～約５ｗｔ％の薬学的崩壊剤、
    （e）約０．００～約１ｗｔ％の薬学的滑剤；および
    （f）約２～約６ｗｔ％の薬学的潤滑剤、
    を含み、構成要素重量は合計すると１００ｗｔ％になる、請求項１４１～１６７のいずれか一項に記載の方法。
  169. 薬学的潤滑剤が、ベヘン酸グリセロールである、請求項１６８に記載の方法。
  170. 薬学的希釈剤が、微結晶セルロースである、請求項１６８または１６９に記載の方法。
  171. 圧縮補助剤が、第二リン酸カルシウム二水和物である、請求項１６８～１７０のいずれか一項に記載の方法。
  172. 薬学的崩壊剤が、デンプングリコール酸ナトリウムである、請求項１６８～１７１のいずれか一項に記載の方法。
  173. 薬学的滑剤が、二酸化ケイ素である、請求項１６８～１７２のいずれか一項に記載の方法。
  174. 組成物が、錠剤形態にある、請求項１６８～１７３のいずれか一項に記載の方法。
  175. 組成物が、錠剤コーティングをさらに含む、請求項１７４に記載の方法。
  176. 式（Ｉ）の化合物が、薬学的組成物の総重量の約３～約１０ｗｔ％で存在する、請求項１６８～１７５のいずれか一項に記載の方法。
  177. 薬学的潤滑剤が、ベヘン酸グリセロールであり、ベヘン酸グリセロールは、組成物の総重量の約２．５～約４．５ｗｔ％で存在する、請求項１７６に記載の方法。
  178. 薬学的滑剤が、二酸化ケイ素であり、二酸化ケイ素は、組成物の総重量の約０．０５～約０．２５ｗｔ％で存在する、請求項１７６または１７７に記載の方法。
  179. 薬学的崩壊剤が、デンプングリコール酸ナトリウムであり、デンプングリコール酸ナトリウムは、組成物の総重量の約３．５～約４．５ｗｔ％で存在する、請求項１７６～１７８のいずれか一項に記載の方法。
  180. 圧縮補助剤が、第二リン酸カルシウム二水和物であり、第二リン酸カルシウム二水和物は、組成物の総重量の約１８～約２２ｗｔ％で存在する、請求項１７６～１７９のいずれか一項に記載の方法。
  181. 薬学的希釈剤が、微結晶セルロースであり、微結晶セルロースは、組成物の総重量の約５５～約７０ｗｔ％で存在する、請求項１７６～１８０のいずれか一項に記載の方法。
  182. 第２の１日投薬量が、第１の１日投薬量の約１．５倍～約６倍である、請求項１４１～１８１のいずれか一項に記載の方法。
  183. 第２の１日投薬量が、第１の１日投薬量の約１．５倍～約５倍である、請求項１８２に記載の方法。
  184. 第２の１日投薬量が、第１の１日投薬量の約１．５倍～約４倍である、請求項１８２に記載の方法。
  185. 第２の１日投薬量が、第１の１日投薬量の約１．５倍～約３倍である、請求項１８２に記載の方法。
  186. 第２の１日投薬量が、第１の１日投薬量の約１．５倍～約２倍である、請求項１８２に記載の方法。
  187. 式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の第１の１日投薬量が、約１０ｍｇ～約２５ｍｇである、請求項１４１～１８６のいずれか一項に記載の方法。
  188. 式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の第１の１日投薬量が、約１０ｍｇ～約１５ｍｇである、請求項１４１～１８７のいずれか一項に記載の方法。
  189. 式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の第１の１日投薬量が、約１０ｍｇ～約１２ｍｇである、請求項１４１～１８８のいずれか一項に記載の方法。
  190. 式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の第１の１日投薬量が、約１６ｍｇ～約２５ｍｇである、請求項１８４～１８６のいずれか一項に記載の方法。
  191. 式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の第１の１日投薬量が、約２０ｍｇ～約２５ｍｇである、請求項１８５または１８６に記載の方法。
  192. 式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の第１の１日投薬量が、約２５ｍｇ～約４０ｍｇである、請求項１８５または１８６に記載の方法。
  193. 式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の第１の１日投薬量が、約１０ｍｇであり、第２の１日投薬量は、第１の１日投薬量の約２倍～約６．５倍である、請求項１４１～１８１のいずれか一項に記載の方法。
  194. 式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の第１の１日投薬量が、約２５ｍｇであり、第２の１日投薬量が、第１の１日投薬量の約１．６倍～約２．６倍である、請求項１４１～１８１のいずれか一項に記載の方法。
  195. 第２のサンプルが、第１の投与期間の間に患者から獲得される、請求項１４１～１９４のいずれか一項に記載の方法。
  196. 第２のサンプルが、第１の投与期間の終了時に患者から獲得される、請求項１９５に記載の方法。
  197. 第２のサンプルが、第１の投与期間の終了の約７日前に患者から獲得される、請求項１９５に記載の方法。
  198. 第２のサンプルが、第１の投与期間の終了の約６日前に患者から獲得される、請求項１９５に記載の方法。
  199. 第２のサンプルが、第１の投与期間の終了の約５日前に患者から獲得される、請求項１９５に記載の方法。
  200. 第２のサンプルが、第１の投与期間の終了の約４日前に患者から獲得される、請求項１９５に記載の方法。
  201. 第２のサンプルが、第１の投与期間の終了の約３日前に患者から獲得される、請求項１９５に記載の方法。
  202. 第２のサンプルが、第１の投与期間の終了の約２日前に患者から獲得される、請求項１９５に記載の方法。
  203. 第２のサンプルが、第１の投与期間の終了の約１日前に患者から獲得される、請求項１９５に記載の方法。
  204. 第２のサンプルが、第１の投与期間の約１週間後に患者から獲得される、請求項１４１～１９４のいずれか一項に記載の方法。
  205. 第２のサンプルが、第１の投与期間の約１日後に患者から獲得される、請求項１４１～１９４のいずれか一項に記載の方法。
  206. 第２のサンプルが、第１の投与期間の約２日後に患者から獲得される、請求項１４１～１９４のいずれか一項に記載の方法。
  207. 第２のサンプルが、第１の投与期間の約３日後に患者から獲得される、請求項１４１～１９４のいずれか一項に記載の方法。
  208. 第２のサンプルが、第１の投与期間の約４日後に患者から獲得される、請求項１４１～１９４のいずれか一項に記載の方法。
  209. 第２のサンプルが、第１の投与期間の約５日後に患者から獲得される、請求項１４１～１９４のいずれか一項に記載の方法。
  210. 第２のサンプルが、第１の投与期間の約６日後に患者から獲得される、請求項１４１～１９４のいずれか一項に記載の方法。
  211. 第２のサンプルが、第１の投与期間の約７日後に患者から獲得される、請求項１４１～１９４のいずれか一項に記載の方法。
  212. 第１の投与期間が、約２週間～約１２週間である、請求項１４１～２１１のいずれか一項に記載の方法。
  213. 第１の投与期間が、約２週間～約８週間である、請求項１４１～２１２のいずれか一項に記載の方法。
  214. 第１の投与期間が、約３週間～約６週間である、請求項１４１～２１３のいずれか一項に記載の方法。
  215. 第１の投与期間が、約３週間～約５週間である、請求項１４１～２１４のいずれか一項に記載の方法。
  216. 第１の投与期間が、約３週間である、請求項２１２に記載の方法。
  217. 第１の投与期間が、約４週間である、請求項２１２に記載の方法。
  218. 第１の投与期間が、約５週間である、請求項２１２に記載の方法。
  219. 第１の投与期間が、約６週間である、請求項２１２に記載の方法。
  220. 第１の投与期間が、約７週間である、請求項２１２に記載の方法。
  221. 第１の投与期間が、約８週間である、請求項２１２に記載の方法。
  222. 第１の投与期間が、約９週間である、請求項２１２に記載の方法。
  223. 第１の投与期間が、約１０週間である、請求項２１２に記載の方法。
  224. 第１の投与期間が、約１１週間である、請求項２１２に記載の方法。
  225. 第１の投与期間が、約１２週間である、請求項２１２に記載の方法。
  226. 第１の投与期間が、約４週間であり、第２のサンプルが、第１の投与期間の間の約４週間の時点で患者から獲得される、請求項１４１～１９５のいずれか一項に記載の方法。
  227. １種または複数のＮＳＰが、ＮＥを含む、請求項１４１～２２６のいずれか一項に記載の方法。
  228. 第２のサンプル由来のＮＥの活性形態の濃度が、第１のサンプル由来のＮＥの活性形態のベースライン濃度と比較して約１９％以上低下した場合には、式（Ｉ）の化合物もしくはその薬学的に許容される塩の第１の１日投薬量と同じ１日投薬量を、第２の投与期間毎日経口投与する、または第２のサンプル由来のＮＥの活性形態の濃度が、第１のサンプル由来のＮＥの活性形態のベースライン濃度と比較して約１９％以上低下しなかった場合には、式（Ｉ）の化合物もしくはその薬学的に許容される塩の第２の１日投薬量を、第２の投与期間毎日経口投与する、請求項２２７に記載の方法。
  229. １種または複数のＮＳＰが、ＰＲ３を含む、請求項１４１～２２８のいずれか一項に記載の方法。
  230. １種または複数のＮＳＰが、ＣａｔＧを含む、請求項１４１～２２９のいずれか一項に記載の方法。
  231. １種または複数のＮＳＰが、ＮＳＰ４を含む、請求項１４１～２３０のいずれか一項に記載の方法。
  232. 第２の投与期間が、少なくとも１カ月間である、請求項１４１～２３１のいずれか一項に記載の方法。
  233. 第２の投与期間が、約１カ月間～約１２カ月間である、請求項１４１～２３２のいずれか一項に記載の方法。
  234. 第２の投与期間が、約５カ月間～約２４カ月間である、請求項１４１～２３２のいずれか一項に記載の方法。
  235. 第２の投与期間が、約５カ月間～約１８カ月間である、請求項１４１～２３２のいずれか一項に記載の方法。
  236. 第２の投与期間が、約５カ月間～約１５カ月間である、請求項１４１～２３２のいずれか一項に記載の方法。
  237. 第２の投与期間が、約３カ月間～約６カ月間である、請求項１４１～２３２のいずれか一項に記載の方法。
  238. 第２の投与期間が、約６カ月間～約１２カ月間である、請求項１４１～２３２のいずれか一項に記載の方法。
  239. 第２の投与期間が、約１２カ月間～約１８カ月間である、請求項１４１～２３２のいずれか一項に記載の方法。
  240. 第２の投与期間が、約１２カ月間～約２４カ月間である、請求項１４１～２３２のいずれか一項に記載の方法。
  241. 第１および第２の投与期間の間毎日患者に経口投与する工程が、１日１回行われる、請求項１４１～２４０のいずれか一項に記載の方法。
  242. 第１および第２の投与期間の間毎日患者に経口投与する工程が、１日２回行われる、請求項１４１～２４０のいずれか一項に記載の方法。
  243. １種または複数のＮＳＰが、請求項１～１４０のいずれか一項に記載の方法によって第１のサンプルから抽出される、請求項１４１～２４２のいずれか一項に記載の方法。
  244. １種または複数のＮＳＰが、請求項１～１４０のいずれか一項に記載の方法によって第２のサンプルから抽出される、請求項１４１～２４３のいずれか一項に記載の方法。
  245. ＤＰＰ１媒介性病態が、気道の閉塞性疾患である、請求項１４１～２４４のいずれか一項に記載の方法。
  246. 気道の閉塞性疾患が、喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、気管支炎、肺気腫、気管支拡張症、嚢胞性線維症、サルコイドーシス、アルファ－１アンチトリプシン欠乏症、農夫肺もしくは関連疾患、過敏性肺臓炎、肺線維症、急性もしくは慢性鼻炎、通年性および季節性アレルギー性鼻炎、鼻ポリープ、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、または呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザ、コロナウイルス、もしくはアデノウイルス感染症に起因した気道の閉塞性疾患である、請求項２４５に記載の方法。
  247. 気道の閉塞性疾患が、気管支拡張症である、請求項２４６に記載の方法。
  248. 気管支拡張症が、非嚢胞性線維症気管支拡張症である、請求項２４７に記載の方法。
  249. 気道の閉塞性疾患が、嚢胞性線維症である、請求項２４６に記載の方法。
  250. 気道の閉塞性疾患が、アルファ－１アンチトリプシン欠乏症である、請求項２４６に記載の方法。
  251. 気道の閉塞性疾患が、ＣＯＰＤである、請求項２４６に記載の方法。
  252. 気道の閉塞性疾患が、喘息である、請求項２４６に記載の方法。
  253. 喘息が、気管支性、アレルギー性、内因性、外因性、またはダスト喘息である、請求項２５２に記載の方法。
  254. 気道の閉塞性疾患が、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）である、請求項２４６に記載の方法。
  255. ＤＰＰ１媒介性病態が、抗好中球細胞質自己抗体（ANCA）関連血管炎である、請求項１４１～２４４のいずれか一項に記載の方法。
  256. ＡＮＣＡ関連血管炎が、多発血管炎性肉芽腫症（GPA）である、請求項２５５に記載の方法。
  257. ＡＮＣＡ関連血管炎が、顕微鏡的多発血管炎（MPA）である、請求項２５５に記載の方法。
  258. ＤＰＰ１媒介性病態が、癌である、請求項１４１～２４４のいずれか一項に記載の方法。
  259. 癌が、原発性固形腫瘍、液性腫瘍、または転移性癌である、請求項２５８に記載の方法。
  260. ＤＰＰ１が、癌性細胞、好中球、マクロファージ、単球、または肥満細胞によって発現される、請求項２５９に記載の方法。
  261. 癌が、転移性癌である、請求項２５９または２６０に記載の方法。
  262. 転移性癌が、転移性乳癌を含む、請求項２６１に記載の方法。
  263. 転移性乳癌が、肺、脳、骨、膵臓、リンパ節、および／または肝臓への乳癌の転移を含む、請求項２６２に記載の方法。
  264. 転移性乳癌が、肺への乳癌の転移を含む、請求項２６３に記載の方法。
  265. 転移性乳癌が、脳への乳癌の転移を含む、請求項２６３に記載の方法。
  266. 転移性乳癌が、骨への乳癌の転移を含む、請求項２６３に記載の方法。
  267. 転移性乳癌が、膵臓への乳癌の転移を含む、請求項２６３に記載の方法。
  268. 転移性乳癌が、リンパ節への乳癌の転移を含む、請求項２６３に記載の方法。
  269. 転移性乳癌が、肝臓への乳癌の転移を含む、請求項２６３に記載の方法。
  270. 転移性癌が、肺への骨癌の転移を含む、請求項２６１に記載の方法。
  271. 転移性癌が、腹膜、膵臓、胃、肺、肝臓、腎臓、および／または脾臓への結腸直腸癌の転移を含む、請求項２６１に記載の方法。
  272. 転移性癌が、腸間膜、脾臓、膵臓、肺、肝臓、副腎、および／または卵巣への胃癌の転移を含む、請求項２６１に記載の方法。
  273. 転移性癌が、リンパ節、肺、肝臓、後肢、脳、腎臓、および／または脾臓への白血病の転移を含む、請求項２６１に記載の方法。
  274. 転移性癌が、腸、脾臓、膵臓、胃、肺、および／または腎臓への肝臓癌の転移を含む、請求項２６１に記載の方法。
  275. 転移性癌が、腎臓、卵巣、肝臓、膀胱、および／または脾臓へのリンパ腫の転移を含む、請求項２６１に記載の方法。
  276. 転移性癌が、腸、肺、肝臓、脾臓、腎臓、および／または胃への造血性癌の転移を含む、請求項２６１に記載の方法。
  277. 転移性癌が、リンパ節および／または肺への黒色腫の転移を含む、請求項２６１に記載の方法。
  278. 転移性癌が、腸間膜、卵巣、腎臓、脾臓、リンパ節、胃、および／または肝臓への膵臓癌の転移を含む、請求項２６１に記載の方法。
  279. 転移性癌が、肺、膵臓、腎臓、脾臓、腸、肝臓、骨、および／またはリンパ節への前立腺癌の転移を含む、請求項２６１に記載の方法。
  280. 転移性癌が、横隔膜、肝臓、腸、胃、肺、膵臓、脾臓、腎臓、リンパ節、および／または子宮への卵巣癌の転移を含む、請求項２６１に記載の方法。
  281. 転移性癌が、骨への骨髄腫の転移を含む、請求項２６１に記載の方法。
  282. 転移性癌が、骨、脳、リンパ節、肝臓、卵巣、および／または腸への肺癌の転移を含む、請求項２６１に記載の方法。
  283. 転移性癌が、肝臓、肺、膵臓、胃、脳、および／または脾臓への腎臓癌の転移を含む、請求項２６１に記載の方法。
  284. 転移性癌が、骨、肝臓、および／または肺への膀胱癌の転移を含む、請求項２６１に記載の方法。
  285. 転移性癌が、骨、肝臓、および／または肺への甲状腺癌の転移を含む、請求項２６１に記載の方法。
  286. 癌が、原発性固形腫瘍である、請求項２５９または２６０に記載の方法。
  287. 癌が、乳癌、膀胱癌、肺癌、脳腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肝臓癌、肝細胞癌腫、腎臓癌、胃癌、皮膚癌、線維性癌、リンパ腫、ウイルス誘導性癌、口腔咽頭癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、黒色腫、および骨癌からなる群から選択される、請求項２８６に記載の方法。
  288. 癌が、膀胱癌である、請求項２８７に記載の方法。
  289. 癌が、肺癌である、請求項２８７に記載の方法。
  290. 癌が、脳腫瘍である、請求項２８７に記載の方法。
  291. 脳腫瘍が、星細胞腫、退形成性星細胞腫、多形性膠芽細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫、髄膜腫、神経鞘腫、または髄芽腫である、請求項２９０に記載の方法。
  292. 脳腫瘍が、星細胞腫である、請求項２９１に記載の方法。
  293. 脳腫瘍が、退形成性星細胞腫である、請求項２９１に記載の方法。
  294. 脳腫瘍が、多形性膠芽細胞腫である、請求項２９１に記載の方法。
  295. 脳腫瘍が、乏突起膠腫である、請求項２９１に記載の方法。
  296. 脳腫瘍が、上衣腫である、請求項２９１に記載の方法。
  297. 脳腫瘍が、髄膜腫である、請求項２９１に記載の方法。
  298. 脳腫瘍が、神経鞘腫である、請求項２９１に記載の方法。
  299. 脳腫瘍が、髄芽腫である、請求項２９１に記載の方法。
  300. 癌が、卵巣癌である、請求項２８７に記載の方法。
  301. 癌が、膵臓癌である、請求項２８７に記載の方法。
  302. 癌が、結腸直腸癌である、請求項２８７に記載の方法。
  303. 癌が、前立腺癌である、請求項２８７に記載の方法。
  304. 癌が、肝臓癌である、請求項２８７に記載の方法。
  305. 癌が、肝細胞癌腫である、請求項２８７に記載の方法。
  306. 癌が、腎臓癌である、請求項２８７に記載の方法。
  307. 癌が、胃癌である、請求項２８７に記載の方法。
  308. 癌が、皮膚癌である、請求項２８７に記載の方法。
  309. 癌が、線維性癌である、請求項２８７に記載の方法。
  310. 線維性癌が、平滑筋肉腫である、請求項３０９に記載の方法。
  311. 癌が、リンパ腫である、請求項２８７に記載の方法。
  312. リンパ腫が、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞免疫芽球性リンパ腫、ナチュラルキラー細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、またはカポジ肉腫である、請求項３１１に記載の方法。
  313. リンパ腫が、ホジキンリンパ腫である、請求項３１２に記載の方法。
  314. リンパ腫が、非ホジキンリンパ腫である、請求項３１２に記載の方法。
  315. リンパ腫が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、請求項３１２に記載の方法。
  316. リンパ腫が、Ｂ細胞免疫芽球性リンパ腫である、請求項３１２に記載の方法。
  317. リンパ腫が、ナチュラルキラー細胞リンパ腫である、請求項３１２に記載の方法。
  318. リンパ腫が、Ｔ細胞リンパ腫である、請求項３１２に記載の方法。
  319. リンパ腫が、バーキットリンパ腫である、請求項３１２に記載の方法。
  320. リンパ腫が、カポジ肉腫である、請求項３１２に記載の方法。
  321. 癌が、ウイルス誘導性癌である、請求項２８７に記載の方法。
  322. 癌が、口腔咽頭癌である、請求項２８７に記載の方法。
  323. 癌が、精巣癌である、請求項２８７に記載の方法。
  324. 癌が、胸腺癌である、請求項２８７に記載の方法。
  325. 癌が、甲状腺癌である、請求項２８７に記載の方法。
  326. 癌が、黒色腫である、請求項２８７に記載の方法。
  327. 癌が、骨癌である、請求項２８７に記載の方法。
  328. 癌が、乳癌である、請求項２８７に記載の方法。
  329. 乳癌が、腺管癌腫、小葉癌腫、髄様癌腫、膠様癌腫、管状癌腫、または炎症性乳癌を含む、請求項３２８に記載の方法。
  330. 乳癌が、腺管癌腫を含む、請求項３２９に記載の方法。
  331. 乳癌が、小葉癌腫を含む、請求項３２９に記載の方法。
  332. 乳癌が、髄様癌腫を含む、請求項３２９に記載の方法。
  333. 乳癌が、膠様癌腫を含む、請求項３２９に記載の方法。
  334. 乳癌が、管状癌腫を含む、請求項３２９に記載の方法。
  335. 乳癌が、炎症性乳癌を含む、請求項３２９に記載の方法。
  336. 癌が、液性腫瘍である、請求項２５９または２６０に記載の方法。
  337. 液性腫瘍が、急性骨髄白血病（AML）、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性前骨髄球性白血病、慢性骨髄白血病、有毛細胞白血病、骨髄増殖性障害、ナチュラルキラー細胞白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、慢性骨髄性白血病（CML）、肥満細胞症、慢性リンパ球性白血病（CLL）、多発性骨髄腫（MM）、および骨髄異形成症候群（MDS）からなる群から選択される、請求項３３６に記載の方法。
  338. 液性腫瘍が、急性骨髄白血病（AML）である、請求項３３７に記載の方法。
  339. 液性腫瘍が、急性リンパ芽球性白血病である、請求項３３７に記載の方法。
  340. 液性腫瘍が、急性リンパ球性白血病である、請求項３３７に記載の方法。
  341. 液性腫瘍が、急性前骨髄球性白血病である、請求項３３７に記載の方法。
  342. 液性腫瘍が、慢性骨髄白血病である、請求項３３７に記載の方法。
  343. 液性腫瘍が、有毛細胞白血病である、請求項３３７に記載の方法。
  344. 液性腫瘍が、骨髄増殖性障害である、請求項３３７に記載の方法。
  345. 液性腫瘍が、ナチュラルキラー細胞白血病である、請求項３３７に記載の方法。
  346. 液性腫瘍が、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物である、請求項３３７に記載の方法。
  347. 液性腫瘍が、慢性骨髄性白血病（CML）である、請求項３３７に記載の方法。
  348. 液性腫瘍が、肥満細胞症である、請求項３３７に記載の方法。
  349. 液性腫瘍が、慢性リンパ球性白血病（CLL）である、請求項３３７に記載の方法。
  350. 液性腫瘍が、多発性骨髄腫（MM）である、請求項３３７に記載の方法。
  351. 液性腫瘍が、骨髄異形成症候群（MDS）である、請求項３３７に記載の方法。
  352. 癌が、小児癌である、請求項２５８に記載の方法。
  353. 小児癌が、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、骨肉腫、またはユーイング肉腫である、請求項３５２に記載の方法。
  354. 小児癌が、神経芽細胞腫である、請求項３５３に記載の方法。
  355. 小児癌が、ウィルムス腫瘍である、請求項３５３に記載の方法。
  356. 小児癌が、横紋筋肉腫である、請求項３５３に記載の方法。
  357. 小児癌が、網膜芽細胞腫である、請求項３５３に記載の方法。
  358. 小児癌が、骨肉腫である、請求項３５３に記載の方法。
  359. 小児癌が、ユーイング肉腫である、請求項３５３に記載の方法。
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