JP2022530653A - Ｔｅｔ２改変ｔ細胞療法を使用するがんの治療のための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

ＴＥＴ２遺伝子の発現のノックアウトを伴うｎｅｏＴＣＲベースの細胞療法を使用するがんの治療のための組成物及び方法。【選択図】図１

Description

［関連出願との相互参照］
この出願は、その内容がその全体について援用され、且つ優先権が主張される、２０１９年５月１日に出願された米国仮出願第６２／８４１７４８号と２０１９年５月１日に出願された米国仮出願第６２／８４１７５３号に基づく優先権を主張する。

［配列表］
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、出典明示によりその全体がここに援用される配列表を含む。２０２０年４月３０日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーは、０８７５２０＿０１４６＿ＳＬ．ｔｘｔという名称で、１３８６７バイトのサイズである。

Ｔｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ２（ＴＥＴ２）は、メチルシトシンから５－ヒドロキシメチルシトシンへの転換を触媒するタンパク質メチルシトシンジオキシゲナーゼをコードする遺伝子である。コードされたタンパク質は骨髄造血に関与しているようであり、この遺伝子における欠陥は幾つかの骨髄増殖性疾患に関連している。しかし、そのタンパク質の正確な機能は不明である。

ＴＥＴ２遺伝子は、細胞遺伝学的位置４ｑ２４（４番染色体の長（ｑ）腕の２４位）にある。ＴＥＴ２遺伝子の他の名前には、ＦＬＪ２００３２、ＫＩＡＡ１５４６、ＭＧＣ１２５７１５、プロバブリー（probably）メチルシトシンジオキシゲナーゼＴＥＴ２、プロバブリーメチルシトシンジオキシゲナーゼＴＥＴ２アイソフォームａ、プロバブリーメチルシトシンジオキシゲナーゼＴＥＴ２アイソフォームｂ、ｔｅｔがん遺伝子ファミリーメンバー２、及びＴＥＴ２＿ＨＵＭＡＮが含まれる。

類似のタンパク質の機能に基づいて、研究者は、ＴＥＴ２タンパク質が、タンパク質生産の最初のステップである転写プロセスの調節に関与していると考えている。このタンパク質は全身に見出されるが、造血幹細胞からの血球細胞の生成において特に重要な役割を果たしている可能性がある。これらの幹細胞は骨髄内にあり、赤血球、白血球、血小板に成長する可能性がある。ＴＥＴ２タンパク質は腫瘍抑制因子として作用し、細胞が制御不能な形で成長し分裂するのを防ぐようである。例えば、体細胞ＴＥＴ２変異は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び二次性ＡＭＬ（ｓＡＭＬ）を含むＭＤＳ／ＭＰＮ重複症候群において頻繁に観察される。

ＴＥＴ２変異は、細胞遺伝学的に正常な急性骨髄性白血病（ＣＮ－ＡＭＬ）において予後値を有することもまた示唆されている。この遺伝子における「ナンセンス」及び「フレームシフト」変異は、この他の点では好ましいリスク患者サブセットにおける標準治療での予後不良と関連している。機能欠失ＴＥＴ２変異は、アテローム発生において可能な因果的役割をまた有している可能性がある。

ＴＥＴ２は、シトシン塩基の５番目の炭素に付加されたメチル基の触媒的除去である活性ＤＮＡ脱メチル化の候補でもありうる。

ある遺伝子変異は、人間の一生の間に獲得され、所定の細胞にのみ存在する。体細胞変異と呼ばれるこれらの変化は遺伝しない。ＴＥＴ２遺伝子における体細胞変異は、血中の血小板の数が多いことを特徴とする状態である、本態性血小板血症の少数の人々において確認されている。血小板は、血液凝固に関与する血球細胞である。ＴＥＴ２遺伝子変異は、ＴＥＴ２タンパク質を様々な形で変化させる；しかし、それらは全て非機能性タンパク質をもたらすようである。本態性血小板血症の発症においてこれらの変異が果たす役割は不明である。

ＴＥＴ２遺伝子における体細胞変異は、制御されない血球細胞生産を特徴とする障害である真性多血症に関連している。これらの変異は、非機能性タンパク質をもたらすと考えられている。この遺伝子の変異は、真性多血症の患者のおよそ１６パーセントに見出されている。これらの変異が真性多血症の発症においてどのような役割を果たしているのかは不明である。

ＴＥＴ２遺伝子における体細胞変異は、原発性骨髄線維症に関連している。この状態は、血球細胞を産生する組織である骨髄の瘢痕組織（線維症）を特徴としている。ＴＥＴ２遺伝子変異が原発性骨髄線維症の発症においてどのような役割を果たしているのかは不明である。

体細胞ＴＥＴ２遺伝子変異は、ある種の造血細胞のがん（白血病）及び骨髄異形成症候群と呼ばれる血液と骨髄の疾患にまた関連している。これらの変異は、非機能性ＴＥＴ２タンパク質をもたらすと考えられている。造血幹細胞におけるＴＥＴ２タンパク質の減少は、これらの細胞の制御されない増殖及び分裂に至る可能性がある。研究者は、骨髄疾患の発症においてＴＥＴ２遺伝子変異がどのような役割を果たしているかを正確に特定しようと取り組んでいる。
ＴＥＴ２変異は、骨髄性腫瘍と関連していることもまた示されている。

ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＴＥＴ２破壊は、対象におけるがん寛解並びに注入後の長期のＣＡＲ Ｔ細胞生存と関連していることもまた示されている（Ｆｒａｉｅｔｔａ等，２０１８，Ｎａｔｕｒｅ，５５８（７７０９），３０７－３１２）。具体的には、ウイルス編集法によって改変されたＴＥＴ２破壊ＣＡＲ Ｔ細胞が、寛解した患者において同定され、２か月後に多量のほぼ全ての編集細胞を占めた。

ＴＥＴ２遺伝子のノックアウト又はノックダウンを同時に伴ってＮｅｏＴＣＲを発現するようにデザインされた細胞療法は、これまで探求されていなかった。更に、細胞療法を単回又は稀に投与される治療法にするために、長い持続時間及び／又はメモリー幹細胞としての理想的には完全な生着を示す細胞療法を開発するという未だ対処されていない必要性が存在する。

しかしながら、ＴＥＴ２の内因性抑制とその固有の抗腫瘍活性を考慮すると、Ｔ細胞上のＴＥＴ２の発現を調節する治療法は、そのような治療法のがん表現型を防ぐために正確に設計する必要がある。

従って、ＮｅｏＴＣＲの関与を通じて腫瘍を特異的に標的とすることができ、注入後に患者内で長期間持続する細胞療法の未だ対処されていない必要性が存在する。そのような治療法は、Ｔ細胞に特異的であるノックアウト又はノックダウンＴＥＴ２を含むものであり、ここに記載される。

ここに記載の本発明は、ＴＥＴ２遺伝子の内因性発現を調節するよう改変された細胞を提供する。
所定の実施態様では、本開示の主題は、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、及びＴＥＴ２遺伝子座の遺伝子破壊を含む、細胞を提供する。所定の実施態様では、遺伝子破壊は、置換、欠失、挿入、又はそれらの任意の組み合わせを含む。所定の実施態様では、遺伝子破壊は、ミスセンス変異、ナンセンス変異、非フレームシフト欠失、フレームシフト欠失、非フレームシフト挿入、フレームシフト挿入、又はそれらの任意の組み合わせを含む。所定の実施態様では、ＴＥＴ２遺伝子座の遺伝子破壊は、非機能性ＴＥＴ２タンパク質をもたらす。所定の実施態様では、ＴＥＴ２遺伝子座の遺伝子破壊は、ＴＥＴ２遺伝子発現のノックアウトをもたらす。

所定の実施態様では、細胞は、ｇＲＮＡとＣａｓ９ヌクレアーゼを含む。所定の実施態様では、ｇＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含む。
所定の実施態様では、ＴＥＴ２遺伝子座の遺伝子破壊は、細胞持続性を増強する。所定の実施態様では、ＴＥＴ２遺伝子座の遺伝子破壊は、メモリー細胞分化を増強する。

所定の実施態様では、細胞は初代細胞である。所定の実施態様では、細胞は患者由来の細胞である。所定の実施態様では、細胞はリンパ球である。所定の実施態様では、細胞はＴ細胞である。所定の実施態様では、細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５－、ＣＣＲ７＋、及びＣＤ２７＋である。所定の実施態様では、細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＤ２７＋、ＣＣＲ７＋である。所定の実施態様では、細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋である。
所定の実施態様では、外因性ＴＣＲは患者由来のＴＣＲである。所定の実施態様では、外因性ＴＣＲは、シグナル配列、第一の２Ａ配列及び第二の２Ａ配列、並びにＴＣＲポリペプチド配列を含む。所定の実施態様では、外因性ＴＣＲはがん抗原を認識する。所定の実施態様では、がん抗原はネオ抗原である。所定の実施態様では、がん抗原は患者特異的抗原である。

所定の実施態様では、本開示の主題は、相同組換え（ＨＲ）鋳型核酸配列を細胞に導入すること、ＨＲ鋳型核酸を細胞の内因性遺伝子座に組換えること、及び細胞のＴＥＴ２遺伝子座を破壊することを含む方法によって改変された細胞を提供する。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム、並びに第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列を含む。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、ＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第一の２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第二の２Ａコード配列とを含み、第一の２Ａコード配列及び第二の２Ａコード配列は、互いにコドンが異なる同じアミノ酸配列をコードする。所定の実施態様では、２Ａコード配列はＰ２Ａコード配列である。所定の実施態様では、アミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列は、２Ａコード配列の直ぐ上流に位置する。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、第二の２Ａコード配列の上流に位置するフューリン切断部位をコードする配列を含む。

所定の実施態様では、第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約３００塩基長から約２０００塩基長である。所定の実施態様では、第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約６００塩基長から約２０００塩基長である。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、第一の２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列との間に位置するシグナル配列を更に含む。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、第二の２Ａコード配列と第二の相同性アームとの間に位置する第二のＴＣＲ配列を含む。
所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、第一の２Ａコード配列と第一のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第一のシグナル配列、及び第二の２Ａコード配列と第二のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第二のシグナル配列を含み、ここで、第一のシグナル配列及び第二のシグナル配列は、同じアミノ酸配列をコードし、互いにコドンが異なる。所定の実施態様では、シグナル配列はヒト成長ホルモンシグナル配列である。

所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は非ウイルス性である。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は環状ＤＮＡである。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は直鎖ＤＮＡである。所定の実施態様では、導入は、エレクトロポレーションを介して生じる。
所定の実施態様では、組換えは、ヌクレアーゼによる内因性遺伝子座の切断、及び相同性指向修復によるＨＲ鋳型核酸配列の内因性遺伝子座への組換えを含む。所定の実施態様では、ヌクレアーゼは、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ、又はその誘導体である。所定の実施態様では、ヌクレアーゼはｇＲＮＡを含む。

所定の実施態様では、破壊は、置換、欠失、挿入、又はそれらの任意の組み合わせを導入することを含む。所定の実施態様では、破壊は、ミスセンス変異、ナンセンス変異、非フレームシフト欠失、フレームシフト欠失、非フレームシフト挿入、フレームシフト挿入、又はそれらの任意の組み合わせを導入することを含む。所定の実施態様では、破壊は、非機能性ＴＥＴ２タンパク質をもたらす。所定の実施態様では、破壊は、ＴＥＴ２遺伝子発現のノックアウトをもたらす。

所定の実施態様では、破壊は、ヌクレアーゼによるＴＥＴ２遺伝子座の切断を含む。所定の実施態様では、ヌクレアーゼは、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ、又はその誘導体である。所定の実施態様では、ヌクレアーゼはｇＲＮＡを含む。所定の実施態様では、ｇＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５に記載の配列を含む。所定の実施態様では、ヌクレアーゼはベクターによって発現される。所定の実施態様では、ｇＲＮＡはベクターによって発現される。所定の実施態様では、ベクターはウイルスベクターである。所定の実施態様では、ベクターは非ウイルスベクターである。
所定の実施態様では、ＴＥＴ２遺伝子座の破壊は細胞持続性を増強する。所定の実施態様では、ＴＥＴ２遺伝子座の破壊はメモリー細胞分化を増強する。

所定の実施態様では、細胞は初代細胞である。所定の実施態様では、細胞は患者由来の細胞である。所定の実施態様では、細胞はリンパ球である。所定の実施態様では、細胞はＴ細胞である。所定の実施態様では、Ｔ細胞は患者由来の細胞である。所定の実施態様では、細胞は幼若Ｔ細胞である。所定の実施態様では、細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５－、ＣＣＲ７＋、及びＣＤ２７＋である。所定の実施態様では、細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＤ２７＋、ＣＣＲ７＋である。所定の実施態様では、細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋である。

所定の実施態様では、内因性遺伝子座は、内因性ＴＣＲ遺伝子内にある。所定の実施態様では、ＴＣＲ遺伝子配列は、腫瘍抗原を認識するＴＣＲをコードする。所定の実施態様では、腫瘍抗原はネオ抗原である。所定の実施態様では、腫瘍抗原は患者特異的ネオ抗原である。所定の実施態様では、ＴＣＲ遺伝子配列は患者特異的ＴＣＲ遺伝子配列である。
所定の実施態様では、方法は、細胞を培養することを更に含む。所定の実施態様では、培養は、少なくとも一種のサイトカインの存在下で行われる。所定の実施態様では、培養は、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、又はそれらの任意の組み合わせの存在下で行われる。所定の実施態様では、培養はＩＬ７及びＩＬ１５の存在下で行われる。

所定の実施態様では、本開示の主題は、細胞を改変する方法であって、相同組換え（ＨＲ）鋳型核酸配列を細胞に導入すること、ＨＲ鋳型核酸を細胞の内因性遺伝子座に組換えること、及び細胞のＴＥＴ２遺伝子座を破壊することを含む、方法を提供する。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム、並びに第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列を含む。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、ＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第一の２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第二の２Ａコード配列とを含み、第一の２Ａコード配列及び第二の２Ａコード配列は、互いにコドンが異なる同じアミノ酸配列をコードする。所定の実施態様では、２Ａコード配列はＰ２Ａコード配列である。所定の実施態様では、アミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列は、２Ａコード配列の直ぐ上流に位置する。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、第二の２Ａコード配列の上流に位置するフューリン切断部位をコードする配列を含む。

所定の実施態様では、第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約３００塩基長から約２０００塩基長である。所定の実施態様では、第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約６００塩基長から約２０００塩基長である。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、第一の２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列との間に位置するシグナル配列を更に含む。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、第二の２Ａコード配列と第二の相同性アームとの間に位置する第二のＴＣＲ配列を含む。
所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、第一の２Ａコード配列と第一のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第一のシグナル配列、及び第二の２Ａコード配列と第二のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第二のシグナル配列を含み、ここで、第一のシグナル配列及び第二のシグナル配列が、同じアミノ酸配列をコードし、互いにコドンが異なる。所定の実施態様では、シグナル配列はヒト成長ホルモンシグナル配列である。

所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は非ウイルス性である。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は環状ＤＮＡである。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は直鎖ＤＮＡである。所定の実施態様では、導入は、エレクトロポレーションを介して生じる。
所定の実施態様では、組換えは、ヌクレアーゼによる内因性遺伝子座の切断、及び相同性指向修復によるＨＲ鋳型核酸配列の内因性遺伝子座への組換えを含む。所定の実施態様では、ヌクレアーゼは、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ、又はその誘導体である。所定の実施態様では、ヌクレアーゼはｇＲＮＡを含む。

所定の実施態様では、破壊は、置換、欠失、挿入、又はそれらの任意の組み合わせを導入することを含む。所定の実施態様では、破壊は、ミスセンス変異、ナンセンス変異、非フレームシフト欠失、フレームシフト欠失、非フレームシフト挿入、フレームシフト挿入、又はそれらの任意の組み合わせを含む。所定の実施態様では、破壊は、非機能性ＴＥＴ２タンパク質をもたらす。所定の実施態様では、破壊は、ＴＥＴ２遺伝子発現のノックアウトをもたらす。
所定の実施態様では、破壊は、ヌクレアーゼによるＴＥＴ２遺伝子座の切断を含む。所定の実施態様では、ヌクレアーゼは、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ、又はその誘導体である。所定の実施態様では、ヌクレアーゼはｇＲＮＡを含む。所定の実施態様では、ｇＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５に記載の配列を含む。所定の実施態様では、ヌクレアーゼはベクターによって発現される。所定の実施態様では、ｇＲＮＡはベクターによって発現される。所定の実施態様では、ベクターはウイルスベクターである。所定の実施態様では、ベクターは非ウイルスベクターである。

所定の実施態様では、ＴＥＴ２遺伝子座の破壊は細胞持続性を増強する。所定の実施態様では、ＴＥＴ２遺伝子座の破壊はメモリー細胞分化を増強する。
所定の実施態様では、細胞は初代細胞である。所定の実施態様では、細胞は患者由来の細胞である。所定の実施態様では、細胞はリンパ球である。所定の実施態様では、細胞はＴ細胞である。所定の実施態様では、Ｔ細胞は患者由来の細胞である。所定の実施態様では、細胞は幼若Ｔ細胞である。所定の実施態様では、細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５－、ＣＣＲ７＋、及びＣＤ２７＋である。所定の実施態様では、細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＤ２７＋、ＣＣＲ７＋である。所定の実施態様では、細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋である。

所定の実施態様では、内因性遺伝子座は、内因性ＴＣＲ遺伝子内にある。所定の実施態様では、ＴＣＲ遺伝子配列は、腫瘍抗原を認識するＴＣＲをコードする。所定の実施態様では、腫瘍抗原はネオ抗原である。所定の実施態様では、腫瘍抗原は患者特異的ネオ抗原である。所定の実施態様では、ＴＣＲ遺伝子配列は患者特異的ＴＣＲ遺伝子配列である。
所定の実施態様では、方法は、細胞を培養することを更に含む。所定の実施態様では、培養は、少なくとも一種のサイトカインの存在下で行われる。所定の実施態様では、培養は、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、又はそれらの任意の組み合わせの存在下で行われる。所定の実施態様では、培養はＩＬ７及びＩＬ１５の存在下で行われる。

所定の実施態様では、本開示の主題は、治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、ここに開示された細胞の治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。所定の実施態様では、治療有効量の細胞を投与する前に、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に施される。所定の実施態様では、がんは固形腫瘍である。所定の実施態様では、がんは液体腫瘍である。所定の実施態様では、固形腫瘍は、メラノーマ、胸部がん、肺がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、頭頸部がん、前立腺がん、婦人科がん、中枢神経系がん、皮膚がん、ＨＰＶ＋がん、食道がん、甲状腺がん、胃がん、肝細胞がん、胆管がん、腎細胞がん、精巣がん、肉腫、及び結腸直腸がんからなる群から選択される。所定の実施態様では、液体腫瘍は、濾胞性リンパ腫、白血病、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。

所定の実施態様では、本開示の主題は、ここに開示された細胞の有効量を含む組成物を提供する。所定の実施態様では、組成物は、薬学的に許容される添加物を更に含む薬学的組成物である。所定の実施態様では、組成物は、がんの治療のために治療を必要とする患者に投与される。所定の実施態様では、組成物は凍結保存剤を含む。所定の実施態様では、組成物は血清アルブミンを含む。所定の実施態様では、組成物は、Ｐｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ、ＨＳＡ、及びＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０を含む。

所定の実施態様では、本開示の主題は、ここに開示された細胞、方法を実施するための試薬、又は組成物を含むキットを提供する。所定の実施態様では、キットは、がんを治療するための書面による説明書を更に含む。

図１は、内因性ＴＣＲ遺伝子座でのノックアウトとノックイン、及びここに記載の遺伝子編集技術によって達成されたＴＥＴ２遺伝子のノックアウトの高レベル図を提供する。 図２Ａ－２Ｃは、ＮｅｏＴＣＲ生成物を作製するために使用できるＮｅｏＥ ＴＣＲカセットと遺伝子編集方法の例を示している。図２Ａは、ネオ抗原特異的ＴＣＲコンストラクト（ｎｅｏＴＣＲ）をＴＣＲα遺伝子座に組み込むために使用される一般的なターゲティング戦略を表す概略図を示す。 図２Ｂ及び２Ｃは、ＮｅｏＴＣＲをＴＣＲα遺伝子座に組み込むために使用されるネオ抗原特異的ＴＣＲコンストラクトのデザインを示し、カセットはシグナル配列（「ＳＳ」）、プロテアーゼ切断部位（「Ｐ」）、及び２Ａペプチド（「２Ａ」）と共に示されている。図２Ｂは、標的ＴＣＲα遺伝子座（内因性ＴＲＡＣ、上部パネル）とそのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９標的部位（水平縞、切断部位は矢印で示される）、及び組込み前は左右の相同性アーム（それぞれ「ＬＨＡ」及び「ＲＨＡ」）の間に位置する、ｎｅｏＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む環状プラスミドＨＲ鋳型（下部パネル）を示している。 図２Ｃは、ＴＣＲα遺伝子座に組み込まれたｎｅｏＴＣＲ（上部パネル）、転写され且つスプライシングされたｎｅｏＴＣＲ ｍＲＮＡ（中央パネル）、及び発現されたｎｅｏＴＣＲの翻訳且つプロセシング（下部パネル）を示している。 図３は、ＮｅｏＥ ＴＣＲカセットの正確な標的組込みを確認するＩｎ－Ｏｕｔ ＰＣＲの結果を示している。アガロースゲルは、ＮｅｏＥ ＴＣＲカセットに特異的なプライマーを使用したＰＣＲの結果を示し、相対部位は、ヌクレアーゼ及びＤＮＡ鋳型（ノックアウト－ノックイン（ＫＯＫＩ）及びノックアウト－ノックイン－ノックアウト（ＫＯＫＩＫＯ））の両方で処理された細胞に対してのみ予想されたサイズの生成物を生成し、部位特異的で正確な組込みを示している。 図４Ａは、内因性ＴＣＲのシグナルが減少し、ＮｅｏＥ ＴＣＲカセットで電気穿孔された細胞に強いＮｅｏＥ ＴＣＲシグナルがあることを示すＦＡＣＳ実験の結果を示している。 図４Ｂは、ＮｅｏＥ ＴＣＲカセットを用いた一連の複数のトランスフェクション実験の結果を示しており、実験間の再現性が高いことを示している。 図５Ａ－５Ｅは、ＴＥＴ２遺伝子をノックアウトするための５つの例示的なＲＮＰノックアウト戦略を示している。図５Ａ及び５Ｅは、マイナス鎖を標的とするｓｇＲＮＡを示している。図５Ｂ、５Ｃ、及び５Ｄは、プラス鎖を標的とするｓｇＲＮＡを示している。 上記 上記 上記 上記 図６Ａ及び６Ｂは、溶解したＴＥＴ２ ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９ＲＮＰ編集ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞から抽出した増幅ＤＮＡのアガロースゲルを示している。増幅に使用したプライマーを表３に提供する。図６Ａは、切断されていないＰＣＲアンプリコンを示している。図６Ｂは、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（ＮＥＢ）とのインキュベーションによって切断されたＰＣＲアンプリコンを示している。図６Ａと図６Ｂの両方のレーンは次の通りである：１．マーカー、２．ＷＴ（ＴＥＴ２＿Ｆｗｄ１，ＴＥＴ２＿Ｒｅｖ１）、３．ＷＴ（ＴＥＴ２＿Ｆｗｄ２，ＴＥＴ２＿Ｒｅｖ２）、４．ｇＲＮＡ１（ＴＥＴ２＿Ｆｗｄ１，ＴＥＴ２＿Ｒｅｖ１）、５．ｇＲＮＡ２（ＴＥＴ２＿Ｆｗｄ２，ＴＥＴ２＿Ｒｅｖ２）、６．ｇＲＮＡ３（ＴＥＴ２＿Ｆｗｄ２，ＴＥＴ２＿Ｒｅｖ２）、７．ｇＲＮＡ４（ＴＥＴ２＿Ｆｗｄ１，ＴＥＴ２＿Ｒｅｖ１）、８．ｇＲＮＡ５（ＴＥＴ２＿Ｆｗｄ１，ＴＥＴ２＿Ｒｅｖ１）。 上記 図７Ａ－７Ｅは、ＰＣＲアンプリコンのカバレッジがガイド部位を取り巻く全てのアンプリコンに対して堅牢であったことを示している。図７ＡはｇＲＮＡ１（配列番号：１）の結果を示す。図７Ｂは、ｇＲＮＡ４（配列番号：４）の結果を示す。図７Ｃは、ｇＲＮＡ５（配列番号：５）の結果を示す。図７Ｄは、ｇＲＮＡ３（配列番号：３）の結果を示す。図７Ｅは、ｇＲＮＡ２（配列番号：２）の結果を示す。 上記 上記 上記 上記 図８Ａ及び８Ｂは、ｓｇＲＮＡ３（配列番号：３）がＴＥＴ２の最良の破壊をもたらし、ｎｅｏＴＣＲ遺伝子編集及びｎｅｏＴＣＲの挿入を妨害しないことを示している。図８Ａはインデルの特徴付けを示し、図８Ｂは遺伝子編集（ｎｅｏＴＣＲの挿入）率を示している。図８Ｂに提供されたｎｅｏＴＣＲの遺伝子編集挿入は、遺伝子編集細胞に結合するデキストラマーによって測定される。デキストラマーはｎｅｏＴＣＲに特異的に結合するため、結合はｎｅｏＴＣＲの発現と直接的な相関関係がある。 図９は、同族ｃｏｍＰＡＣＴプレート被覆による１．５時間の刺激の有無にかかわらず、ＴＥＴ２の非存在下で（つまり、ＴＥＴ２生成物において）５－ｈｍＣの認識できるほどの低下がないことを示している。同族ｃｏｍＰＡＣＴ（ＥＸＰ１９００１２２２）で１．５時間休止又は刺激したサンプルの抗５－ｈｍＣ抗体染色を、フローサイトメトリーを使用して検出した。 図１０は、ＴＥＴ２生成物がＮｅｏＴＣＲ生成物（つまり、ＴＥＴ２欠失を有していなかった細胞）と同等のＴＣＦ７及びＴＢＥＴ転写因子の発現を示したことを示している。このフローサイトメトリー実験で使用した細胞は、休止編集細胞であった。 上記 図１１Ａ及び１１Ｂは、ｇＲＮＡ３によるＴＥＴ２破壊により、パーセントＩＦＮγ＋細胞（図１１Ａ）及びパーセントＣＤ１０７ａ＋細胞（図１１Ｂ）から明らかなように、ターミナルエフェクターの分化が低下することを示している。 図１２Ａ及び１２Ｂに示されるように、１４－１５日間培養を維持したＴＥＴ２生成物とＮｅｏＴＣＲ生成物の腫瘍細胞殺傷能力間に差異はない。ＩｎｃｕＣｙｔｅアッセイで、ＴＥＴ２ ｇＲＮＡ３を用いた場合と用いなかった場合のＰＡＣＴ０３５－ＴＣＲ０８９ｎｅｏＴＣＲ編集Ｔ細胞を、ＳＷ６２０ ＣＯＸ６Ｃ－Ｒ２０Ｑ腫瘍細胞（図１２Ａ）又はＣＯＸ６Ｃ－Ｒ２０Ｑ変異を欠くＳＷ６２０腫瘍細胞（図１２Ｂ）と共培養した。Ｒ２０Ｑ変異はＴＣＲ０８９と直接的に相関し、ＴＣＲ０８９がＲ２０Ｑ変異を発現する細胞を死滅させるようにデザインされている。 図１３Ａ及び１３Ｂは、ＴＥＴ２生成物がＮｅｏＴＣＲ生成物（ＴＥＴ２遺伝子のノックアウトのない細胞）よりも長く殺傷活性を維持することを示している。ＮｅｏＴＣＲ生成物（図に示されているＰＡＣＴ０３５－ＴＣＲ０８９）及びＴＥＴ２生成物（図に示されているＰＡＣＴ０３５－ＴＣＲ０８９ ＴＥＴ２ ｇＲＮＡ３）は、試験前に３０日間培養を続けた。ＩｎｃｕＣｙｔｅアッセイで、ＮｅｏＴＣＲ生成物（ＰＡＣＴ０３５－ＴＣＲ０８９）及びＴＥＴ２生成物（ＰＡＣＴ０３５－ＴＣＲ０８９ ＴＥＴ２ ｇＲＮＡ３）を、ＳＷ６２０ ＣＯＸ６Ｃ－Ｒ２０Ｑ腫瘍細胞（図１３Ａ）又はＣＯＸ６Ｃ－Ｒ２０Ｑ変異を欠くＳＷ６２０腫瘍細胞（図１３Ｂ）と共培養した。 図１４Ａ及び１４Ｂは、ＴＥＴ２の破壊がＣＤ８メモリー細胞分化を促進することを示している。同族ｃｏｍＰＡＣＴで７日間刺激されたＴＥＴ２ｇＲＮＡ３を用いた場合と用いなかった場合のＣＤ８＋デキストラマー＋ｎｅｏＴＣＲ編集Ｔ細胞の記憶及び消耗に関連する表面マーカーの幾何平均蛍光強度を、ＮｅｏＴＣＲ生成物（図に示されているＰＡＣＴ０３５－ＴＣＲ０８９）及びＴＥＴ２生成物（図に示されているＰＡＣＴ０３５－ＴＣＲ０８９ ＴＥＴ２ ｇＲＮＡ３）について示す。図１４Ａ及び１４Ｂに示されているＣＣＲ７及びＣＤ２７プロットは、ＴＥＴ２の破壊がＣＤ８メモリー細胞分化を促進することを示している。具体的には、ＣＣＲ７とＣＤ２７はセントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞で高度に発現される。ＴＥＴ２細胞がＮｅｏＴＣＲ細胞と比較して発現を増加させる（より高いＭＦＩ）という事実は、この効果を表している。 図１５Ａ－１５Ｄは、ＴＯＸ（図１５Ｂ及び１５Ｄ）及びＴＣＦ７（図１５Ａ及び１５Ｃ）の発現が、ＮｅｏＴＣＲ生成物（図に示されるＰＡＣＴ０３５－ＴＣＲ０８９）とＴＥＴ２生成物（図に示されるＰＡＣＴ０３５－ＴＣＲ０８９ ＴＥＴ２ ｇＲＮＡ３）の間で変化しなかったことを示している。７日間のｃｏｍＰＡＣＴ刺激（図１５Ａ及び１５Ｂ）又は７日間の刺激とそれに続く新鮮なｃｏｍＰＡＣＴ被覆プレートでの更に２日間の再刺激に応答したＴＣＦ７＋（図１５Ａ及び１５Ｃ）及びＴＯＸ＋（図１５Ｂ及び１５Ｄ）ＣＤ８＋デキストラマー＋Ｔ細胞の頻度。 上記

［定義］
別段の定義がない限り、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。次の参考文献は、本開示の主題で使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ等，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２版 １９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編，１９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５版，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ等（編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；並びにＨａｌｅ及びＭａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。ここで使用される場合、次の用語は、特に明記しない限り、以下の定義に帰する意味を有している。

ここに記載の本発明の態様及び実施態様は、「含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」態様及び実施態様を含むことが理解される。「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」という用語は、米国特許法においてそれらに帰する広い意味を有することを意図しており、「含む（includes）」、「含む（including）」などを意味しうる。

ここで使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味し、値がどのように測定され又は決定されるかに、すなわち、測定系の制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該技術分野の慣行に従って、３又は３を超える標準偏差内を意味しうる。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、例えば、最大１０％、最大５％、又は最大１％の範囲を意味しうる。あるいは、特に生物システム又はプロセスに関して、この用語は、値の一桁分以内、例えば、値の５倍以内又は２倍以内を意味しうる。

「がん」及び「腫瘍」という用語は、ここでは交換可能に使用される。ここで使用される場合、「がん」又は「腫瘍」という用語は、悪性か良性かを問わず、全ての新生物細胞の成長及び増殖、並びに全ての前がん性及びがん性細胞及び組織を指す。該用語は、更に、典型的には未制御の細胞成長／増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を参照し又は記述するために使用される。がんは、限定されないが、膀胱、骨、脳、乳房、軟骨、グリア、食道、ファロピウス管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、泌尿生殖器、尿管、尿道、子宮、及び膣、又はその組織若しくは細胞型からなる群から選択される器官を含む、様々な細胞型、組織、又は器官を罹患させうる。がんには、肉腫、癌腫、又は形質細胞腫（形質細胞の悪性腫瘍）などのがんが含まれる。がんの例には、限定されないが、ここに記載されているものが含まれる。「がん」又は「腫瘍」及び「増殖性疾患」という用語は、ここで使用される場合、相互に排他的ではない。

ここで使用される「デキストラマー」は、その同族ＮｅｏＴＣＲに特異的に結合する多量体化されたネオエピトープ－ＨＬＡ複合体を意味する。
ここで使用される場合、「ネオ抗原」、「ネオエピトープ」又は「ｎｅｏＥ」という用語は、例えば、体細胞変異から生じ、「非自己」として認識される、新しく形成された抗原決定基を指す。「ネオ抗原」、「ネオエピトープ」又は「ｎｅｏＥ」を生じさせる変異には、フレームシフト又は非フレームシフトインデル、ミスセンス又はナンセンス置換、スプライス部位変化（例えば、選択的スプライシングされた転写物）、ゲノム再編成又は遺伝子融合、何らかのゲノム又は発現変化、又は何らかの翻訳後修飾が含まれうる。

ここで使用される「ＮｅｏＴＣＲ」及び「ＮｅｏＥ ＴＣＲ」は、例えば遺伝子編集法によって、Ｔ細胞に導入されるネオエピトープ特異的Ｔ細胞受容体を意味する。
ここで使用される「ＮｅｏＴＣＲ細胞」は、一又は複数のＮｅｏＴＣＲを発現するように精密に改変された一又は複数の細胞を意味する。所定の実施態様では、細胞はＴ細胞である。所定の実施態様では、Ｔ細胞はＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞である。所定の実施態様では、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＮｅｏＴＣＲ生成物が投与される患者の自己細胞である。「ＮｅｏＴＣＲ細胞」及び「ＮｅｏＴＣＲ－Ｐ１ Ｔ細胞」及び「ＮｅｏＴＣＲ－Ｐ１細胞」という用語は、ここでは交換可能に使用される。ここで使用される場合、ＮｅｏＴＣＲ細胞は、ＴＥＴ２遺伝子の発現をノックアウトするように改変されていない。

ここで使用される「ＮｅｏＴＣＲ生成物」は、一又は複数のＮｅｏＴＣＲ細胞を含む薬学的製剤を意味する。ＮｅｏＴＣＲ生成物は、自己の精密ゲノム改変されたＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞からなる。標的ＤＮＡを介した非ウイルス精密ゲノム工学アプローチを使用して、内因性ＴＣＲの発現が排除され、腫瘍排他的ネオエピトープを標的とする末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞から単離された患者特異的ＮｅｏＴＣＲによって置換される。所定の実施態様では、得られた改変ＣＤ８＋又はＣＤ４＋Ｔ細胞は、天然発現レベル、天然ＴＣＲ機能で、天然配列のその表面上にＮｅｏＴＣＲを発現する。ＮｅｏＴＣＲ外部結合ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインの配列は、天然ＣＤ８＋Ｔ細胞から単離されたＴＣＲから未修飾である。ＮｅｏＴＣＲ遺伝子発現の調節は、ＮｅｏＴＣＲ遺伝子カセットがゲノムに組み込まれている場所の上流に位置する天然の内因性ＴＣＲプロモーターによって駆動される。このアプローチにより、ＮｅｏＴＣＲ発現の天然のレベルは、未刺激の抗原活性化Ｔ細胞状態で観察される。

各患者向けに製造されたＮｅｏＴＣＲ生成物は、その同じ患者の末梢血から個別に単離されたｎｅｏＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞からクローン化された単一のｎｅｏＥ特異的ＴＣＲを発現するように精密ゲノム改変された自己ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞の定まった用量を表す。
ここで使用される場合、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、ＴＥＴ２遺伝子の発現をノックアウトするようには改変されていない。
ここで使用される場合、「ＮｅｏＴＣＲウイルス生成物」は、ゲノム改変がウイルス媒介法を使用して実施されることを除いて、ＮｅｏＴＣＲ生成物と同じ定義を有する。

「薬学的製剤」は、そこに含まれる活性成分の生物学的活性を有効であるようにする形態であって、製剤が投与されうる対象に対して許容できないほど毒性である追加の成分を含まない製剤を指す。明確にするために、ＮｅｏＴＣＲ生成物において使用される量のＤＭＳＯは許容できないほど毒性であるとはみなされない。
治療の目的での「対象」、「患者」、又は「個体」は、ヒト、家畜動物、飼育動物、及び動物園動物、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

ここで使用される「ＴＣＲ」は、Ｔ細胞受容体を意味する。
「ＴＥＴ２」は、メチルシトシンから５－ヒドロキシメチルシトシンへの転換を触媒するタンパク質メチルシトシンジオキシゲナーゼをコードする遺伝子である。ＴＥＴ２は、Ｔｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ２、ＦＬＪ２００３２、ＫＩＡＡ１５４６、ＭＧＣ１２５７１５、プロバブリーメチルシトシンジオキシゲナーゼＴＥＴ２、プロバブリーメチルシトシンジオキシゲナーゼＴＥＴ２アイソフォームａ、プロバブリーメチルシトシンジオキシゲナーゼＴＥＴ２アイソフォームｂ、ｔｅｔがん遺伝子ファミリーメンバー２、及びＴＥＴ２＿ＨＵＭＡＮとも呼ばれる。

ここで使用される「ＴＥＴ２細胞」は、一又は複数のＮｅｏＴＣＲを発現しＴＥＴ２遺伝子をノックアウトするように精密改変された一又は複数の細胞を意味する。所定の実施態様では、細胞はＴ細胞である。所定の実施態様では、Ｔ細胞はＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞である。所定の実施態様では、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＴＥＴ２生成物が投与される患者の自己細胞である。
ここで使用される「ＴＥＴ２ ＮｅｏＴＣＲ生成物」は、ＴＥＴ２細胞を含む生成物を意味する。

「治療する（Treat）」、「治療（Treatment）」、及び「治療すること（treating）」は互換的に使用され、ここで使用される場合、臨床結果を含む有益な又は望ましい結果を得ることを意味する。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的病理的帰結の減少、転移の防止、疾患進行速度の低下、病状の回復又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。幾つかの実施態様では、この開示のＴＥＴ２生成物は、増殖性疾患（例えば、がん）の発症を遅らせるために、又はそのような疾患の進行を遅らせるために使用される。
「治療する（Treat）」、「治療（Treatment）」、及び「治療すること（treating）」は互換的に使用され、ここで使用される場合、臨床結果を含む有益な又は望ましい結果を得ることを意味する。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的病理的帰結の減少、転移の防止、疾患進行速度の低下、病状の回復又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。幾つかの実施態様では、本開示のＴＥＴ２生成物は、増殖性疾患（例えば、がん）の発症を遅らせるために、又はそのような疾患の進行を遅らせるために使用される。

ここで使用される「腫瘍抗原」という用語は、正常又は非腫瘍性細胞と比較して腫瘍細胞上に独特に又は差次的に発現される抗原（例えば、ポリペプチド）を指す。所定の実施態様では、腫瘍抗原には、抗原認識受容体を介して免疫応答を活性化又は誘導することができ、あるいは受容体－リガンド結合を介して免疫応答を抑制することができる、腫瘍によって発現される任意のポリペプチドが含まれる。
「２Ａ」及び「２Ａペプチド」は、ここでは交換可能に使用され、真核細胞での翻訳中にペプチドの切断を媒介することができる１８－２２アミノ酸長のウイルスの自己切断型ペプチドのクラスを意味する。

２Ａペプチドクラスの四種のよく知られたメンバーは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａである。Ｔ２Ａペプチドは、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａにおいて最初に同定された。Ｐ２Ａペプチドは、ブタのテッショウウイルス－１２Ａで最初に同定された。Ｅ２Ａペプチドは、ウマ鼻炎Ａウイルスで最初に同定された。Ｆ２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルスで最初に同定された。
２Ａペプチドの自己切断メカニズムは、リボソームが２ＡのＣ末端でのグリシル－プロリルペプチド結合の形成をスキップした結果である。具体的には、２Ａペプチドは、立体障害の作成とリボソームスキッピングに必要なＣ末端保存配列を有している。リボソームスキッピングは、次の三つの選択肢の一つをもたらしうる：１）スキッピングが成功し、翻訳が再開し、二つの切断タンパク質（Ｃ末端プロリンを除く完全な２Ａペプチドに結合する２Ａタンパク質の上流とＮ末端で一つのプロリンに結合する２Ａタンパク質の下流）が生じ；２）スキッピングは成功するが、リボソームの脱落により翻訳が中断され、２Ａの上流のタンパク質のみが生じ；あるいは３）スキッピングが失敗し、翻訳が継続する（すなわち、融合タンパク質）。

ここで使用される「内因性」という用語は、通常は、細胞又は組織において発現される核酸分子又はポリペプチドを指す。
ここで使用される「外因性」という用語は、細胞内に内因的には存在しない核酸分子又はポリペプチドを指す。従って、「外因性」という用語は、外来、異種、及び過剰発現された核酸分子及びポリペプチドなど、細胞内で発現される任意の組換え核酸分子又はポリペプチドを包含するであろう。「外因性」核酸とは、天然の野生型細胞に存在しない核酸を意味する；例えば、外因性核酸は、配列、位置（position）／位置（location）、又はその両方によって内因性の対応物とは異なりうる。明確にするために、外因性核酸は、その天然の内因性対応物と比較して同じ又は異なる配列を有しうる；それは、遺伝子工学によって細胞自体又はその前駆細胞に導入され得、任意選択的に、非天然プロモーター又は分泌配列などの代替制御配列に連結されうる。

Ｔ細胞に関連する場合、「幼若」又は「より幼若の」又は「幼若Ｔ細胞」は、メモリー幹細胞（Ｔ_ＭＳＣ）及びセントラルメモリー細胞（Ｔ_ＣＭ）を意味する。これらの細胞は、特異的活性化時にＴ細胞増殖を示し、複数の細胞分裂に対してコンピテントである。それらはまた、再注入後に生着し、それらの同族抗原への曝露時にエフェクターＴ細胞に迅速に分化し、腫瘍細胞を標的にして殺すだけでなく、進行中のがんの監視及び制御のために持続する能力を有する。

［ＮｅｏＴＣＲ生成物］
幾つかの実施態様では、その全体が出典明示によりここに援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１７８８７及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５４１５に記載されている遺伝子編集技術及びｎｅｏＴＣＲ単離技術を使用して、ＮｅｏＴＣＲは、ｎｅｏＴＣＲを発現するように（図２Ａ－２Ｃに記載されているＤＮＡ媒介（非ウイルス）法を使用して）精密ゲノム改変された同じがん患者からの自己ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞にクローン化される。言い換えれば、ＮｅｏＴＣＲは腫瘍特異的であり、がん患者において同定される。次に、これらのＮｅｏＴＣＲはクローン化され、クローン化されたＮｅｏＴＣＲはがん患者のＴ細胞に挿入される。次に、ＮｅｏＴＣＲを発現するＴ細胞が、「幼若」Ｔ細胞表現型を維持する形で増殖され、Ｔ細胞の大部分がＴメモリー幹細胞とＴセントラルメモリー表現型を示すＮｅｏＴＣＲ－Ｐ１生成物（すなわち、ＮｅｏＴＣＲ生成物）を生じる。

これらの「幼若」又は「より幼若の」又は低分化のＴ細胞表現型は、改善された生着能及び注入後の長期持続性を与えると記述される。従って、「幼若」Ｔ細胞表現型から有意に構成されるＮｅｏＴＣＲ生成物の投与は、生着可能性の改善、注入後の持続性の延長、及びエフェクターＴ細胞への迅速な分化を通して、身体全体の腫瘍細胞を根絶する利益をがん患者にもたらす可能性がある。
エクスビボでの作用機序研究は、がん患者のＴ細胞で製造されたＮｅｏＴＣＲ生成物でも実施された。Ｔ細胞殺傷活性、増殖、及びサイトカイン産生の抗原特異性によって測定される、同等の遺伝子編集効率及び機能的活性が観察され、ここに記載の製造方法が、出発物質としてがん患者からのＴ細胞を用いて生成物を作製することに成功したことを実証している。

所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物の製造方法は、ガイドＲＮＡ配列に結合したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼの二重リボヌクレオタンパク質種のエレクトロポレーションを含み、各種がゲノムＴＣＲα及びゲノムＴＣＲβ遺伝子座を標的とする。Ｃａｓ９ヌクレアーゼを各ゲノム遺伝子座にターゲティングする特異性は、以前に文献において高度に特異的であると記載されている。ＮｅｏＴＣＲ生成物の包括的な試験は、それぞれＣＯＳＭＩＤ及びＧＵＩＤＥ－ｓｅｑを使用して、可能性のあるオフターゲットゲノム切断部位を調査するインビトロ及びインシリコ分析で実施された。健康なドナーからの複数のＮｅｏＴＣＲ生成物又は同等の細胞生成物を、ディープシーケンシングによって候補オフターゲット部位の切断について評価し、選択されたヌクレアーゼが高度に特異的であるという公表された証拠を裏付けた。

精密ゲノム工学法の更なる態様は、安全性について評価されている。精密ゲノム改変後のゲノム不安定性の証拠は、標的遺伝子座増幅（ＴＬＡ）又は標準的ＦＩＳＨ細胞遺伝学による複数のＮｅｏＴＣＲ生成物の評価では見出されなかった。ＮｅｏＴＣＲ配列のゲノムへのオフターゲット組込みは検出されなかった。細胞生成物にＣａｓ９が残っている証拠は見出されなかった。
ＮｅｏＴＣＲ生成物と精密ゲノム工学法の包括的な評価は、ＮｅｏＴＣＲ生成物が患者への注入後に十分に許容されることを示している。

ここに記載のゲノム改変アプローチは、固形及び液体腫瘍を有する患者のための個別化された養子細胞治療法のための特注のＮｅｏＴＣＲ Ｔ細胞（すなわち、ＮｅｏＴＣＲ生成物）の非常に効率的な作製を可能にする。更に、改変手法はＴ細胞での使用に限定されず、ナチュラルキラー細胞及び造血幹細胞を含む他の初代細胞型にも成功裡に適用された。

［ＴＥＴ２生成物］
幾つかの実施態様では、上記のＮｅｏＴＣＲ生成物は、生成物の細胞からＴＥＴ２発現をノックアウトするように更に改変される（すなわち、ＴＥＴ２生成物）。具体的には、その全体が出典明示によりここに援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１７８８７及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５４１５に記載されている遺伝子編集技術及びｎｅｏＴＣＲ単離技術を使用して、ＮｅｏＴＣＲは、ｎｅｏＴＣＲを発現するように（図２Ａ－２Ｃに記載されているＤＮＡ媒介（非ウイルス）法を使用して）精密ゲノム改変された同じがん患者からの自己ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞にクローン化される。

所定の実施態様では、ＴＥＴ２遺伝子は、ｇＲＮＡを使用して破壊され、ＴＣＲβをノックアウトするために使用され、ｎｅｏＴＣＲαとｎｅｏＴＣＲβを挿入する反応と同じ反応でＴＥＴ２の発現をノックアウトする（図１を参照）。所定の実施態様では、ＴＣＲβのノックアウト、ｎｅｏＴＣＲαとｎｅｏＴＣＲβの挿入、ＴＥＴ２のノックアウトは、同じ反応で同時に実施される。

所定の実施態様では、ＴＥＴ２遺伝子は、ｇＲＮＡを使用して破壊され、ＴＣＲβのノックアウトするために使用され、ｎｅｏＴＣＲαとｎｅｏＴＣＲβを挿入する反応とは異なる反応でＴＥＴ２の発現をノックアウトする（図１を参照）。所定の実施態様では、ＴＣＲβのノックアウトとｎｅｏＴＣＲα及びｎｅｏＴＣＲβの挿入は、ＴＥＴ２のノックアウトとは別の逐次反応で実施される。所定の実施態様では、ＴＣＲβのノックアウトとｎｅｏＴＣＲα及びｎｅｏＴＣＲβの挿入が第一の反応で実施され、ＴＥＴ２のノックアウトが第二の反応で実施される。所定の実施態様では、ＴＥＴ２のノックアウトが第一の反応で実施され、ＴＣＲβのノックアウトとｎｅｏＴＣＲα及びｎｅｏＴＣＲβの挿入が第二の反応で実施される。

幾つかの実施態様では、ＴＥＴ２生成物は、ウイルス法を使用して一又は複数のＮｅｏＴＣＲを発現するように改変された細胞（すなわち、ＮｅｏＴＣＲウイルス生成物）及びＴＥＴ２遺伝子のノックアウトを含む。所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲウイルス生成物の細胞は、非ウイルス法を使用してＴＥＴ２遺伝子をノックアウトするように更に改変される。ＮｅｏＴＣＲウイルス生成物の細胞は、ウイルス法を使用してＴＥＴ２遺伝子をノックアウトするように更に改変される。

ＴＥＴ２生成物の製造方法は、１）ガイドＲＮＡ配列に結合したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼの二重リボヌクレオタンパク質種であって、各種がゲノムＴＣＲα及びゲノムＴＣＲβ遺伝子座を標的とするもの、及び２）ＴＥＴ２遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ配列に結合したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼのリボヌクレオタンパク質種のエレクトロポレーションを含む。各ゲノム遺伝子座にＣａｓ９ヌクレアーゼを標的化する特異性は、以前に文献において高度に特異的であると記載されている。ＴＥＴ２生成物の包括的な試験は、それぞれＣＯＳＭＩＤ及びＧＵＩＤＥ－ｓｅｑを使用して、可能性のあるオフターゲットゲノム切断部位を調べるインビトロ及びインシリコ分析で実施されうる。所定の実施態様では、試験は、オフターゲットのＣＯＳＭＩＤベースのインシリコ予測と、オフターゲットのＧＵＩＤＥ－ｓｅｑベースのインビトロ予測を使用して実施することができ、その後、標的ディープシーケンシングによるその推定オフターゲットの試験が続く。

所定の実施態様では、ＴＥＴ２細胞は、「幼若」Ｔ細胞表現型を維持するように増殖され、Ｔ細胞の大部分がＴメモリー幹細胞とＴセントラルメモリー表現型を示すＴＥＴ２生成物が生じる。

これらの「幼若」又は「より幼若の」又は低分化のＴ細胞表現型は、改善された生着能及び注入後の長期持続性を与えると記述される。従って、「幼若」Ｔ細胞表現型から有意に構成されるＴＥＴ２生成物の投与は、生着可能性の改善、注入後の持続性の延長、及びエフェクターＴ細胞への迅速な分化を通して、体全体の腫瘍細胞を根絶する利益をがん患者にもたらす可能性がある。

所定の実施態様では、ＴＥＴ２生成物のＴＥＴ２細胞は、主にメモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＴＥＴ２生成物のＴＥＴ２細胞の少なくとも２５％が、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＴＥＴ２生成物のＴＥＴ２細胞の少なくとも３０％が、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＴＥＴ２生成物のＴＥＴ２細胞の少なくとも３５％が、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＴＥＴ２生成物のＴＥＴ２細胞の少なくとも４０％が、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＴＥＴ２生成物のＴＥＴ２細胞の少なくとも４５％が、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＴＥＴ２生成物のＴＥＴ２細胞の少なくとも５０％が、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＴＥＴ２生成物のＴＥＴ２細胞の少なくとも５５％が、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＴＥＴ２生成物のＴＥＴ２細胞の少なくとも６０％が、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＴＥＴ２生成物のＴＥＴ２細胞の少なくとも６５％が、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＴＥＴ２生成物のＴＥＴ２細胞の少なくとも７０％が、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＴＥＴ２生成物のＴＥＴ２細胞の少なくとも７５％が、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＴＥＴ２生成物のＴＥＴ２細胞の７５％より多くが、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。Ｔｍｓｃは、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋ＣＤ９５＋、及びＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋である細胞として特徴付けられる。Ｔｃｍは、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋ＣＤ９５＋、及びＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋ＣＤ１２７＋である細胞として特徴付けられる。ＴｍｓｃとＴｃｍは両方とも、エフェクターＴ細胞の機能が弱く、増殖性が強く、生着性が強く、テロメアが長いと特徴付けられる。

［幼若表現型を持つＴＥＴ２生成物を産生する方法］
所定の実施態様では、本開示は、部分的には、改変された「幼若」Ｔ細胞の産生に関する。所定の実施態様では、本開示は、元々対象から得られた、又はそのようなサンプルから単離された抗原特異的細胞を活性化し、操作し、及び増殖することを含む、エクスビボでの抗原特異的細胞、例えばＴ細胞を産生するための方法を含む。
所定の実施態様では、細胞を活性化するための方法は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を活性化する工程を含む。例えば、限定されないが、Ｔ細胞は、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、又はそれらの組み合わせと共にインキュベートされ、及び／又は培養されうる。

所定の実施態様では、改変された活性化抗原特異的細胞、例えば、改変された活性化Ｔ細胞は、サイトカイン、ケモカイン、可溶性ペプチド、又はそれらの組み合わせと共に、改変された活性化抗原特異的細胞、例えば、Ｔ細胞を培養することによって増殖させることができる。所定の実施態様では、改変された活性化抗原特異的細胞、例えば改変された活性化Ｔ細胞は、一又は複数のサイトカインと共に培養されうる。所定の実施態様では、サイトカインは、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、又はそれらの組み合わせでありうる。例えば、改変された活性化抗原特異的細胞、例えば改変された活性化Ｔ細胞は、ＩＬ７及びＩＬ１５と共に培養されうる。所定の実施態様では、改変された活性化抗原特異的細胞、例えば改変された活性化Ｔ細胞の培養に関連して使用されるサイトカインは、約１ｐｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌ、又は約１ｍｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌ、及びその間の任意の値の濃度で存在しうる。

［薬学的製剤］
ＴＥＴ２生成物の薬学的製剤は、凍結保存された状態で細胞の「幼若」表現型を保存できる溶液中でＴＥＴ２細胞を組み合わせることによって調製される。表１は、そのような一薬学的製剤の例を提供する。あるいは、ＴＥＴ２生成物の薬学的製剤は、生成物を凍結し又は凍結保存する必要なしに、細胞の「幼若」表現型を保存できる溶液中でＴＥＴ２細胞を組み合わせることによって調製されうる（つまり、ＴＥＴ２生成物は水溶液中に又は非凍結／凍結保存細胞ペレットとして維持される）。
追加の薬学的に許容される担体、緩衝液、安定剤、及び／又は保存料もまた、凍結保存溶液又は水性貯蔵溶液（ＴＥＴ２生成物が凍結保存されていない場合）に加えることができる。限定されないが、ＣｒｙｏＳｔｏｒ、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ、及び場合によってはＤＭＳＯを含む特注の凍結保存培地を含む、任意の凍結保存剤及び／又は培地を使用して、ＴＥＴ２生成物を凍結保存することができる。

［遺伝子編集方法］
所定の実施態様では、本開示は、部分的に、ヒト細胞を改変する方法、例えば、改変されたＴ細胞又は改変されたヒト幹細胞を含む。所定の実施態様では、そのような改変はゲノム編集を含む。例えば、限定ではないが、そのようなゲノム編集は、ＴＥＴ２遺伝子座と共に、一又は複数の内因性遺伝子座、例えば、ＴＣＲアルファ（ＴＣＲα）遺伝子座及びＴＣＲベータ（ＴＣＲβ）遺伝子座を標的とするヌクレアーゼを用いて達成することができる。所定の実施態様では、ヌクレアーゼは、内因性標的配列に一本鎖ＤＮＡニック又は二本鎖ＤＮＡ切断を生成しうる。所定の実施態様では、ヌクレアーゼは、ゲノムのコーディング部分又は非コーディング部分、例えば、エクソン、イントロンを標的としうる。所定の実施態様では、ここで考えられるヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、メガＴＡＬヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、及びＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓヌクレアーゼを含む。所定の実施態様では、ヌクレアーゼは、切断活性の効率を高めるために、例えば、アミノ酸置換及び／又は欠失の導入により、それ自体が改変されうる。

所定の実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系が、ヒト細胞を改変するために使用される。所定の実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、Ｃａｓヌクレアーゼと、Ｃａｓヌクレアーゼを内因性標的配列に動員する一又は複数のＲＮＡ、例えば、単一のガイドＲＮＡとを含む。所定の実施態様では、ＣａｓヌクレアーゼとＲＮＡは、異なるベクター又は組成物を使用して別々に、又は例えば、ポリシストロニックコンストラクト又は単一タンパク質－ＲＮＡ複合体で一緒に、細胞に導入される。所定の実施態様では、ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ９又はＣａｓ１２ａである。所定の実施態様では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、限定されないが、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）又は髄膜炎菌（Neisseria menengitidis）を含む細菌種から得られる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の追加の例は当該技術分野で知られている。それが教示する全てについて出典明示によりここに援用される、Ａｄｌｉ，Ｍａｚｈａｒ．“Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｔｏｏｌ ｋｉｔ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ．”Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｖｏｌ．９，１ １９１１（２０１８）を参照のこと。

所定の実施態様では、ゲノム編集は、免疫応答を調節する一又は複数のゲノム遺伝子座で行われる。所定の実施態様では、遺伝子座には、限定されないが、ＴＣＲアルファ（ＴＣＲα）遺伝子座、ＴＣＲベータ（ＴＣＲβ）遺伝子座、ＴＣＲガンマ（ＴＣＲγ）、ＴＣＲデルタ（ＴＣＲδ）、及びＴＥＴ２が含まれる。所定の実施態様では、遺伝子座の一つはＴＥＴ２遺伝子座である。

所定の実施態様では、ゲノム編集は、非ウイルス送達系を使用して実施される。例えば、リポフェクションの存在下での核酸の投与（Ｆｅｉｇｎｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３，１９８７；Ｏｎｏ等，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ １７：２５９，１９９０；Ｂｒｉｇｈａｍ等，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８，１９８９；Ｓｔａｕｂｉｎｇｅｒ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：５１２，１９８３）、アシアロオロソムコイド－ポリリジンコンジュゲーション（Ｗｕ等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６３：１４６２１，１９８８；Ｗｕ等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６４：１６９８５，１９８９）、又は手術条件下でのマイクロインジェクション（Ｗｏｌｆｆ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５，１９９０）により、核酸分子を細胞に導入することができる。遺伝子導入のための他の非ウイルス手段には、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、及びプロトプラスト融合を使用したインビトロでのトランスフェクションが含まれる。リポソームはまた、細胞へのＤＮＡの送達に潜在的に有益でありうる。対象の罹患組織への正常遺伝子の移植はまた、正常核酸をエクスビボで培養可能な細胞型（例えば、自己又は異種の初代細胞又はその子孫）に導入することによって達成することができ、その後、細胞（又はその子孫）は標的組織に注入されるか、又は全身的に注入される。

所定の実施態様では、ゲノム編集は、ウイルス送達系を使用して実施される。所定の実施態様では、ウイルス法には、標的組込み（限定されないが、ＡＡＶを含む）とランダム組込み（限定されないが、レンチウイルスアプローチを含む）が含まれる。所定の実施態様では、ウイルス送達は、ヌクレアーゼの組込みなしに達成されるであろう。そのような実施態様では、ウイルス送達系は、Ｌｅｎｔｉｆｌａｓｈ又は別の同様の送達系でありうる。

［相同組換え鋳型］
所定の実施態様では、本開示は、相同組換え（ＨＲ）鋳型核酸配列を細胞の内因性遺伝子座に導入して組換えることにより、細胞のゲノム編集を提供する。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型核酸配列は直鎖状である。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型核酸配列は環状である。所定の実施態様では、環状ＨＲ鋳型は、プラスミド、ミニサークル、又はナノプラスミドでありうる。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型核酸配列は、第一の相同性アーム及び第二の相同性アームを含む。所定の実施態様では、相同性アームは、約３００塩基から約２０００塩基でありうる。例えば、各相同性アームは１０００塩基でありうる。所定の実施態様では、相同性アームは、細胞の第一の内因性配列及び第二の内因性配列に相同でありうる。所定の実施態様では、内因性遺伝子座はＴＣＲ遺伝子座である。例えば、第一の内因性配列及び第二の内因性配列は、ＴＣＲアルファ遺伝子座又はＴＣＲベータ遺伝子座内にある。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型はＴＣＲ遺伝子配列を含む。非限定的な実施態様では、ＴＣＲ遺伝子配列は、患者特異的なＴＣＲ遺伝子配列である。非限定的な実施態様では、ＴＣＲ遺伝子配列は腫瘍特異的である。非限定的な実施態様では、ＴＣＲ遺伝子配列は、その内容が出典明示によりここに援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１７８８７に記載された方法を使用して同定され取得されうる。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、ＴＣＲアルファ遺伝子配列とＴＣＲベータ遺伝子配列を含む。

所定の実施態様では、ＨＲ鋳型はポリシストロニックポリヌクレオチドである。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、可動性ポリペプチド配列をコードする配列（例えば、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ配列）を含む。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をコードする配列を含む。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は２Ａペプチド（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａ）を含む。ＨＲ鋳型核酸及びその細胞を改変する方法に関する追加の情報は、その内容が出典明示によりここに援用される国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５８２３０に見出すことができる。

［治療方法］
本開示の主題は、それを必要とする対象において免疫応答を誘導し及び／又は増加させるための方法を提供する。ＴＥＴ２生成物は、対象のがんを治療し及び／又は予防するために使用できる。ＴＥＴ２生成物は、がんに罹患した対象の生存を延長するために使用できる。ＴＥＴ２生成物はまた、対象のがんを治療し及び／又は予防するために使用できる。ＴＥＴ２生成物はまた、対象の腫瘍負荷を軽減するために使用できる。そのような方法は、有効量のＴＥＴ２生成物、又はそれを含む組成物（例えば、薬学的組成物）を投与して、既存の状態の緩和であろうと再発防止であろうと、所望の効果を達成することを含む。治療では、投与される量は、所望の効果を生み出すのに有効な量である。有効量は、一回又は一連の投与で提供されうる。有効量は、ボーラス又は連続灌流によって提供されうる。

所定の実施態様では、有効量のＴＥＴ２生成物は、静脈内（ＩＶ）投与により送達される。所定の実施態様では、ＴＥＴ２生成物は、単回投与でＩＶ投与により送達される。所定の実施態様では、ＴＥＴ２生成物は、複数回投与でＩＶ投与により送達される。所定の実施態様では、ＴＥＴ２生成物は、二回以上の投与でＩＶ投与により送達される。所定の実施態様では、ＴＥＴ２生成物は、二回の投与でＩＶ投与により送達される。所定の実施態様では、ＴＥＴ２生成物は、三回投与でＩＶ投与により送達される。
本開示の主題は、対象のがんを治療し及び／又は予防するための方法を提供する。所定の実施態様では、本方法は、がんを患っている対象に有効量のＴＥＴ２生成物を投与することを含む。

がんの非限定的な例には、血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫）、卵巣がん、乳がん、膀胱がん、脳がん、結腸がん、腸がん、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、神経膠芽腫、咽頭がん、メラノーマ、神経芽腫、腺癌、神経膠腫、軟部組織肉腫、及び様々な癌腫（前立腺がん及び小細胞肺がんを含む）が含まれる。適切な癌腫には更に、限定されないが、星状細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、乏突起膠腫、上衣腫、髄芽腫、原始神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、軟骨肉腫、骨肉腫、膵管腺癌、小細胞及び大細胞肺腺癌、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、扁平上皮がん、気管支肺胞がん、上皮腺癌、及びそれらの肝転移、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、肝細胞腫、胆管細胞がん、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、横紋筋肉腫、結腸がん、基底細胞がん、汗腺がん、乳頭がん、皮脂腺がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性肺がん、腎細胞がん、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、及び重鎖病、乳房腫瘍、例えば乳管及び小葉腺癌、子宮頸部の扁平上皮及び腺癌、子宮及び卵巣上皮がん、前立腺腺癌、膀胱の移行扁平上皮がん、Ｂ及びＴ細胞リンパ腫（結節性及びびまん性）形質細胞腫、急性及び慢性白血病、悪性メラノーマ、軟部組織肉腫及び平滑筋肉腫を含む腫瘍学の分野で知られている任意のものが含まれる。所定の実施態様では、がんは、血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫）、卵巣がん、前立腺がん、乳がん、膀胱がん、脳がん、結腸がん、腸がん、肝がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、神経膠芽腫、及び咽頭がんからなる群から選択される。所定の実施態様では、本開示の幼若Ｔ細胞及びそれを含む組成物は、一般的な治療的介入が受け入れられない血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫）又は卵巣がんを治療し及び／又は予防するために使用することができる。

所定の実施態様では、がんは固形がん又は固形腫瘍である。所定の実施態様では、固形腫瘍又は固形がんは、神経膠芽腫、前立腺腺癌、腎臓乳頭細胞がん、肉腫、卵巣がん、膵臓腺癌、直腸腺癌、結腸腺癌、食道がん、子宮体部類内膜がん、乳がん、皮膚メラノーマ、肺腺癌、胃腺癌、頸部及び子宮頸部がん、腎臓明細胞がん、精巣胚細胞腫瘍、及び侵攻性Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される。

対象は、進行形態の疾患を有する可能性があり、その場合、治療目的は、疾患進行の緩和又は逆転、及び／又は副作用の改善を含みうる。対象は、既に治療された状態の病歴を有する可能性があり、その場合、治療目的は、典型的には、再発のリスクの減少又は遅延を含むであろう。

治療に適したヒト対象は、典型的には、臨床基準によって区別することができる二種の治療群を含む。「進行した疾患」又は「高腫瘍負荷」の対象は、臨床的に測定可能な腫瘍を有する対象である。臨床的に測定可能な腫瘍は、腫瘍量に基づいて検出できる腫瘍である（例えば、触診、ＣＡＴスキャン、超音波検査、マンモグラム、又はＸ線による；陽性の生化学的又は病理組織マーカーだけでは、この集団を特定するには不十分である）。薬学的組成物は、これらの対象に、その状態を緩和する目的で、抗腫瘍応答を誘発するために投与される。理想的には、結果として腫瘍量の減少が起こるが、何らかの臨床的改善が利点を構成する。臨床的改善には、進行のリスク又は速度の低下あるいは腫瘍の病理的帰結の低下が含まれる。

［製造品］
ＴＥＴ２生成物は、製造品と組み合わせて使用されうる。そのような製造品は、増殖性疾患（例えば、がん）の予防又は治療に有用でありうる。製造品の例には、限定されないが、容器（例えば、注入バッグ、ボトル、貯蔵容器、フラスコ、バイアル、注射器、チューブ、及びＩＶ溶液バッグ）、及び容器上の又は容器に付随したラベル又は添付文書が含まれる。容器は、ＴＥＴ２生成物内のＴＥＴ２細胞の貯蔵及び保存に受け入れられる任意の材料で作製されうる。所定の実施態様では、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で貫通可能なストッパーを備えたバイアルでありうる。例えば、容器は、ＣｒｙｏＭＡＣＳ凍結バッグでありうる。ラベル又は添付文書は、ＴＥＴ２生成物が、選択された状態及び端緒の患者を治療するために使用されることを示している。ＴＥＴ２生成物は自己細胞から作製され、患者特異的な個別化された治療剤として設計されているため、患者はＴＥＴ２生成物の容器上で特定される。

製造品は、１）ＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第一の容器を含みうる。
製造品は、１）ＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第一の容器；及び２）第一の容器と同じＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第二の容器を含みうる。場合によっては、第一の容器及び第二の容器と同じＴＥＴ２生成物を含む追加の容器が準備され作製されうる。場合によっては、異なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む組成物を含む追加の容器がまた、上述の容器と組み合わせられうる。
製造品は、１）ＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第一の容器；及び２）組成物がその中に含まれる第二の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第二の容器を含みうる。

製造品は、１）二種のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第一の容器；及び２）組成物がその中に含まれる第二の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第二の容器を含みうる。
製造品は、１）ＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第一の容器；２）第二のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第二の容器；及び３）場合によっては、組成物がその中に含まれる第三の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第三の容器を含みうる。所定の実施態様では、第一のＴＥＴ２生成物及び第二のＴＥＴ２生成物は異なるＴＥＴ２生成物である。所定の実施態様では、第一のＴＥＴ２生成物及び第二のＴＥＴ２生成物は同じＴＥＴ２生成物である。

製造品は、１）三種のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第一の容器；及び２）場合によっては、組成物がその中に含まれる第二の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第二の容器を含みうる。
製造品は、１）ＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第一の容器；２）第二のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第二の容器；３）第三のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第三の容器；及び４）場合によっては、組成物がその中に含まれる第四の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第四の容器を含みうる。所定の実施態様では、第一、第二、第三のＴＥＴ２生成物は、異なるＴＥＴ２生成物である。所定の実施態様では、第一、第二、第三のＴＥＴ２生成物は、同じＴＥＴ２生成物である。所定の実施態様では、第一、第二、第三のＴＥＴ２生成物のうち二種は同じＴＥＴ２生成物である。

製造品は、１）四種のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第一の容器；及び２）場合によっては、組成物がその中に含まれる第二の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第二の容器を含みうる。
製造品は、１）ＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第一の容器；２）第二のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第二の容器；３）第三のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第三の容器；４）第四のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第四の容器；及び５）場合によっては、組成物がその中に含まれる第五の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第五の容器を含みうる。所定の実施態様では、第一、第二、第三、第四のＴＥＴ２生成物は、異なるＴＥＴ２生成物である。所定の実施態様では、第一、第二、第三、第四のＴＥＴ２生成物は、同じＴＥＴ２生成物である。所定の実施態様では、第一、第二、第三、第四のＴＥＴ２生成物のうち二種は同じＴＥＴ２生成物である。所定の実施態様では、第一、第二、第三、第四のＴＥＴ２生成物のうち三種は同じＴＥＴ２生成物である。

製造品は、１）五種以上のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第一の容器；及び２）場合によっては、組成物がその中に含まれる第二の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第二の容器を含みうる。
製造品は、１）ＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第一の容器；２）第二のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第二の容器；３）第三のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第三の容器；４）第四のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第四の容器；５）第五のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第五の容器；６）場合によっては、第六以上のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第六以上の追加の容器；及び７）場合によっては、組成物がその中に含まれる追加の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、追加の容器を含みうる。所定の実施態様では、ＴＥＴ２生成物の容器の全てが、異なるＴＥＴ２生成物である。所定の実施態様では、ＴＥＴ２生成物の容器の全てが、同じＴＥＴ２生成物である。所定の実施態様では、患者の腫瘍サンプル中の検出可能なＴＥＴ２の利用可能性、患者のための複数のＴＥＴ２生成物の必要性及び／又は要望、及び一又は複数の容器を必要とするかそれから利益をうる場合がある何れか一種のＴＥＴ２生成物の利用可能性に基づいて、五以上の容器内に同じ又は異なるＴＥＴ２生成物の任意の組み合わせが存在しうる。

製造品は、１）ＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第一の容器；２）第二のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第二の容器；及び３）第三のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第三の容器を含みうる。
製造品は、１）ＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第一の容器；２）第二のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第二の容器；３）第三のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第三の容器；及び４）場合によっては、第四のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第四の容器を含みうる。
製造品は、１）ＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第一の容器；２）第二のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第二の容器；３）第三のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第三の容器；４）第四のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第四の容器；及び５）場合によっては、第四のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第五の容器を含みうる。

製造品は、一種のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる容器を含みうる。製造品は、二種のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる容器を含みうる。製造品は、三種のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる容器を含みうる。製造品は、四種のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる容器を含みうる。製造品は、五種のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる容器を含みうる。
製造品は、１）一種のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第一の容器、及び２）二種のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第二の容器を含みうる。製造品は、１）二種のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第一の容器、及び２）一種のＴＥＴ２生成物がその中に含まれる第二の容器を含みうる。上記の例では、一又は複数の追加のＴＥＴ２生成物を含む第三及び／又は第四の容器が、製造品に含まれうる。加えて、一又は複数の追加のＴＥＴ２生成物を含む第五の容器が、製造品に含まれうる。

更に、ここに記載のＴＥＴ２生成物の任意の容器は、複数の投与時点のために、及び／又は患者のための適切な用量に基づいて、二、三、又は四の別個の容器に分割できる。
所定の実施態様では、ＴＥＴ２生成物はキットで提供される。キットには、非限定的な例として、添付文書、ラベル、ＴＥＴ２生成物の使用説明書、注射器、廃棄説明書、投与説明書、チューブ、針、及びＴＥＴ２生成物を適切に管理するために臨床医が必要とするその他のものを含めることができる。

［治療用組成物及び製造方法］
ここに記載されるように、ＴＥＴ２生成物の優良製造規範（ＧＭＰ）製造のためのプラスミドＤＮＡ媒介精密ゲノム工学法を開発した。患者特異的ｎｅｏＴＣＲの標的組込みを、プラスミドＤＮＡによってコードされた、個別化されたｎｅｏＴＣＲ遺伝子カセットと共にＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を電気穿孔することによって、達成した。ｎｅｏＴＣＲに加えて、ＴＥＴ２ノックアウトを、ＴＥＴ２遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を電気穿孔することによって、達成した。

ＴＥＴ２生成物は、臨床製造方法を使用して医薬品に製剤化されうる。この方法では、ＴＥＴ２生成物はＣｒｙｏＭＡＣＳ凍結バッグで凍結保存される。患者の必要性に応じて、一又は複数のバッグが各患者のために現場に出荷されうる。この生成物は、その患者の腫瘍細胞の表面に排他的に提示される内因性ＨＬＡ受容体の一つと複合体を形成したネオエピトープを標的とする一又は複数の自己ｎｅｏＴＣＲを発現するように精密ゲノム改変されている、アフェレーシス由来の患者自己ＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞で構成されている。

最終生成物は、５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヒト血清アルブミン、及びＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅを含むであろう。最終細胞生成物は、表１に提供されるリストの成分を含むであろう。

［組成物及びベクター］
本開示の主題は、ここに開示される細胞（例えば、免疫応答性細胞）を含む組成物を提供する。
所定の実施態様では、本開示の主題は、ここに開示されるＮｅｏＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む核酸組成物を提供する。所定の実施態様では、ここに開示される核酸組成物は、ＴＥＴ２遺伝子座の遺伝子破壊のためのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。所定の実施態様では、ここに開示される核酸組成物は、Ｃａｓヌクレアーゼ及びＴＥＴ２遺伝子座の遺伝子破壊のためのｇＲＮＡを含む。所定の実施態様では、ｇＲＮＡは、配列番号：１－５に記載のヌクレオチド配列を含む配列を有する。また提供されるのは、そのような核酸組成物を含む細胞である。

所定の実施態様では、核酸組成物は、ＴＥＴ２遺伝子座の遺伝子破壊のためのヌクレアーゼに作用可能に連結されているプロモーターを更に含む。
所定の実施態様では、プロモーターは内因性又は外因性である。所定の実施態様では、外因性プロモーターは、伸長因子（ＥＦ）－１プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫプロモーター、末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター及びメタロチオネインプロモーターからなる群から選択される。所定の実施態様では、プロモーターは誘導性プロモーターである。所定の実施態様では、誘導性プロモーターは、ＮＦＡＴ転写応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーター、ＣＤ６９プロモーター、ＣＤ２５プロモーター、ＩＬ－２プロモーター、ＩＬ－１２プロモーター、ｐ４０プロモーター、及びＢｃｌ－ｘＬプロモーターからなる群から選択される。

組成物及び核酸組成物は、当該技術分野で知られている方法によって又はここに記載されるように、対象に投与され、及び／又は細胞に送達されうる。細胞（例えば、Ｔ細胞）の遺伝子改変は、組換えＤＮＡコンストラクトで実質的に均質な細胞組成物を形質導入することによって達成することができる。所定の実施態様では、ＤＮＡコンストラクトを細胞に導入するために、レトロウイルスベクター（ガンマレトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターの何れか）が用いられる。例えば、ＴＥＴ２遺伝子座の遺伝子破壊のためのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを、ウイルスベクターにクローン化することができ、発現を、その内因性プロモーターから、又は目的の標的細胞型に特異的なプロモーターから駆動することができる。非ウイルスベクターもまた使用されうる。

可能な形質導入方法には、例えば、Ｂｒｅｇｎｉ等（１９９２）Ｂｌｏｏｄ ８０：１４１８－１４２２の方法による、プロデューサー細胞との細胞の直接共培養、あるいは例えば、Ｘｕ等（１９９４）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．２２：２２３－２３０；及びＨｕｇｈｅｓ等（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１８１７の方法による、ウイルス上清のみ、又は適切な成長因子及びポリカチオンを含むか又は含まない濃縮ベクターストックを用いた培養が含まれる。

他の形質導入ウイルスベクターを使用して細胞を改変することができる。所定の実施態様では、選択ベクターは、高い感染効率と安定した組込み及び発現を示す（例えば、Ｃａｙｏｕｅｔｔｅ等，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：４２３－４３０，１９９７；Ｋｉｄｏ等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：８３３－８４４，１９９６；Ｂｌｏｏｍｅｒ等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６６４１－６６４９，１９９７；Ｎａｌｄｉｎｉ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３－２６７，１９９６；及びＭｉｙｏｓｈｉ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１０３１９，１９９７を参照のこと）。使用できる他のウイルスベクターには、例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、又はヘルペスウイルス、例えばエプスタイン・バーウイルスが含まれる（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １５－１４，１９９０；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２７５－１２８１，１９８９；Ｅｇｌｉｔｉｓ等，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８－６１４，１９８８；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：５５－６１，１９９０；Ｓｈａｒｐ，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３３７：１２７７－１２７８，１９９１；Ｃｏｒｎｅｔｔａ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３６：３１１－３２２，１９８７；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：４０１－４０９，１９８４；Ｍｏｅｎ，Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ １７：４０７－４１６，１９９１；Ｍｉｌｌｅｒ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９８０－９９０，１９８９；ＬｅＧａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８－９９０，１９９３；及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｃｈｅｓｔ １０７：７７Ｓ－８３Ｓ，１９９５のベクターを参照）。レトロウイルスベクターは特によく開発されており、臨床現場で使用されてている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ３２３：３７０，１９９０；Ａｎｄｅｒｓｏｎ等，米国特許第５３９９３４６号）。

非ウイルスアプローチをまた細胞の遺伝子改変に用いることができる。例えば、リポフェクションの存在下で（Ｆｅｉｇｎｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３，１９８７；Ｏｎｏ等，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ １７：２５９，１９９０；Ｂｒｉｇｈａｍ等，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８，１９８９；Ｓｔａｕｂｉｎｇｅｒ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：５１２，１９８３）、アシアロロソムコイド－ポリリジンコンジュゲーション（Ｗｕ等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６３：１４６２１，１９８８；Ｗｕ等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６４：１６９８５，１９８９）の存在下で、又は手術条件下でのマイクロインジェクション（Ｗｏｌｆｆ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５，１９９０）により、核酸分子を投与することにより、核酸分子を細胞に導入することができる。遺伝子導入のための他の非ウイルス手段には、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、及びプロトプラスト融合を使用したインビトロでのトランスフェクションが含まれる。リポソームはまた、細胞へのＤＮＡの送達に潜在的に有益でありうる。対象の罹患組織への正常遺伝子の移植はまた、正常核酸をエクスビボで培養可能な細胞型（例えば、自己又は異種の初代細胞又はその子孫）に導入することによって達成することができ、その後、細胞（又はその子孫）は標的組織に注入されるか、又は全身的に注入される。

ポリヌクレオチド治療法は、任意の適切なプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、又はメタロチオネインプロモーター）から方向づけられ、任意の適切な哺乳動物調節エレメント又はイントロン（例えば、伸長因子１ａエンハンサー／プロモーター／イントロン構造）によって調節されうる。例えば、所望されるならば、特定の細胞型において遺伝子発現を優先的に方向づけることが知られているエンハンサーを使用して、核酸の発現を方向づけることができる。使用されるエンハンサーには、限定されないが、組織特異的又は細胞特異的エンハンサーとして特徴付けられるものが含まれうる。あるいは、ゲノムクローンが治療コンストラクトとして使用される場合、調節は、同族調節配列によって、又は所望されるならば、上記のプロモーター又は調節エレメントの何れかを含む異種源由来の調節配列によって媒介されうる。

得られた細胞は、未改変細胞と同様の条件下で増殖させることができ、それにより、改変細胞を増殖させ、様々な目的に使用することができる。

［キット］
本開示の主題は、対象における免疫応答を誘導し、及び／又は増強し、及び／又はがん若しくは病原体感染を治療し、及び／又は予防するためのキットを提供する。所定の実施態様では、キットは、有効量の本開示の細胞又はそれを含む薬学的組成物を含む。所定の実施態様では、キットは滅菌容器を含み；そのような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスターパック、又は当該技術分野で知られている他の適切な容器形態でありうる。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、又は医薬を保持するのに適した他の材料で作製されうる。

所望されるならば、細胞及び／又は核酸分子は、がん又は病原体又は免疫不全を有するか又は発症するリスクのある対象に細胞又は核酸分子を投与するための説明書（インストラクション）と共に提供される。説明書は一般に新生物又は病原体感染の治療及び／又は予防のための組成物の使用に関する情報を含む。所定の実施態様では、説明書は、次のうちの少なくとも一を含む：治療薬の説明；がん、病原体感染、又は免疫不全あるいはそれらの症状の治療又は予防のための投与スケジュール及び投与；注意；警告；適応症；禁忌；過量投与情報；有害反応；動物薬理；臨床試験；及び／又は参考文献。説明書は、容器（存在する場合）に直接に印刷され、又は容器に貼付されるラベルとして、又は容器内に若しくは容器と共に提供される別のシート、パンフレット、カード、又はフォルダーとして印刷されうる。得られた細胞は、未改変細胞と同様の条件下で増殖させることができ、それにより、改変細胞を増殖させ、様々な目的に使用することができる。

［例示的実施態様］
Ａ． 所定の非限定的実施態様では、本開示の主題は、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、及びＴＥＴ２遺伝子座の遺伝子破壊を含む、細胞を提供する。
Ａ１． 遺伝子破壊が、置換、欠失、挿入、又はそれらの任意の組み合わせを含む、Ａの前述の細胞。
Ａ２． 遺伝子破壊が、ミスセンス変異、ナンセンス変異、非フレームシフト欠失、フレームシフト欠失、非フレームシフト挿入、フレームシフト挿入、又はそれらの任意の組み合わせを含む、Ａ又はＡ１の前述の細胞。
Ａ３． ＴＥＴ２遺伝子座の遺伝子破壊が、非機能性ＴＥＴ２タンパク質をもたらす、Ａ－Ａ２の前述の細胞。
Ａ４． ＴＥＴ２遺伝子座の遺伝子破壊が、ＴＥＴ２遺伝子発現のノックアウトをもたらす、Ａ－Ａ３の前述の細胞。
Ａ５． ｇＲＮＡとＣａｓ９ヌクレアーゼを含む、Ａ－Ａ４の前述の細胞。
Ａ６． ｇＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含む、Ａ５の前述の細胞。
Ａ７． ＴＥＴ２遺伝子座の遺伝子破壊が、細胞持続性を増強する、Ａ－Ａ６の前述の細胞。
Ａ８． ＴＥＴ２遺伝子座の遺伝子破壊が、メモリー細胞分化を増強する、Ａ－Ａ７の前述の細胞。
Ａ９． 細胞が初代細胞である、Ａ－Ａ８の前述の細胞。
Ａ１０． 細胞が患者由来の細胞である、Ａ－Ａ９の前述の細胞。
Ａ１１． 細胞がリンパ球である、Ａ－Ａ１０の前述の細胞。
Ａ１２． 細胞がＴ細胞である、Ａ－Ａ１１の前述の細胞。
Ａ１３． 細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５－、ＣＣＲ７＋、及びＣＤ２７＋である、Ａ１２の前述の細胞。
Ａ１４． 細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＤ２７＋、ＣＣＲ７＋である、Ａ１２の前述の細胞。
Ａ１５． 細胞が、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋である、Ａ１２の前述の細胞。
Ａ１６． 外因性ＴＣＲが患者由来のＴＣＲである、Ａ－Ａ１５の前述の細胞。
Ａ１７． 外因性ＴＣＲが、シグナル配列、第一の２Ａ配列及び第二の２Ａ配列、並びにＴＣＲポリペプチド配列を含む、Ａ－Ａ１６の前述の細胞。
Ａ１８． 外因性ＴＣＲががん抗原を認識する、Ａ－Ａ１７の前述の細胞。
Ａ１９． がん抗原がネオ抗原である、Ａ１８の前述の細胞。
Ａ２０． がん抗原が患者特異的抗原である、Ａ１８の前述の細胞。

Ｂ． 所定の非限定的実施態様では、本開示の主題は、相同組換え（ＨＲ）鋳型核酸配列を細胞に導入すること；ＨＲ鋳型核酸を細胞の内因性遺伝子座に組換えること；及び細胞のＴＥＴ２遺伝子座を破壊することを含む方法によって改変された細胞を提供する。
Ｂ１． ＨＲ鋳型が、第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム；並びに第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列を含む、Ｂの前述の細胞。
Ｂ２． ＨＲ鋳型が、ＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第一の２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第二の２Ａコード配列とを含み、第一の２Ａコード配列及び第二の２Ａコード配列は、互いにコドンが異なる同じアミノ酸配列をコードする、Ｂ又はＢ１の前述の細胞。
Ｂ３． ２Ａコード配列がＰ２Ａコード配列である、Ｂ２の前述の細胞。
Ｂ４． アミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列が、２Ａコード配列の直ぐ上流に位置する、Ｂ２又はＢ３の前述の細胞。
Ｂ５． ＨＲ鋳型が、第二の２Ａコード配列の上流に位置するフューリン切断部位をコードする配列を含む、Ｂ－Ｂ４の前述の細胞。
Ｂ６． 第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約３００塩基長から約２０００塩基長である、Ｂ１－Ｂ５の前述の細胞。
Ｂ７． 第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約６００塩基長から約２０００塩基長である、Ｂ１－Ｂ５の前述の細胞。
Ｂ８． ＨＲ鋳型が、第一の２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列との間に位置するシグナル配列を更に含む、Ｂ２－Ｂ７の前述の細胞。
Ｂ９． ＨＲ鋳型が、第二の２Ａコード配列と第二の相同性アームとの間に位置する第二のＴＣＲ配列を含む、Ｂ２－Ｂ８の前述の細胞。
Ｂ１０． ＨＲ鋳型が、第一の２Ａコード配列と第一のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第一のシグナル配列；及び第二の２Ａコード配列と第二のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第二のシグナル配列を含み；ここで、第一のシグナル配列及び第二のシグナル配列が、同じアミノ酸配列をコードし、互いにコドンが異なる、Ｂ９の前述の細胞。
Ｂ１１． シグナル配列がヒト成長ホルモンシグナル配列である、Ｂ８又はＢ１０の前述の細胞。
Ｂ１２． ＨＲ鋳型が非ウイルス性である、Ｂ－Ｂ１１の前述の細胞。
Ｂ１３． ＨＲ鋳型が環状ＤＮＡであるＢ－Ｂ１２の前述の細胞。
Ｂ１４． ＨＲ鋳型が直鎖ＤＮＡである、Ｂ－Ｂ１２の前述の細胞。
Ｂ１５． 導入が、エレクトロポレーションを介して生じる、Ｂ－Ｂ１４の前述の細胞。
Ｂ１６． 組換えが、ヌクレアーゼによる内因性遺伝子座の切断；及び相同性指向修復によるＨＲ鋳型核酸配列の内因性遺伝子座への組換えを含む、Ｂ－Ｂ１５の前述の細胞。
Ｂ１７． ヌクレアーゼが、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ、又はその誘導体である、Ｂ１６の前述の細胞。
Ｂ１８． ｇＲＮＡを更に含む、Ｂ１７の前述の細胞。
Ｂ１９． 破壊が、置換、欠失、挿入、又はそれらの任意の組み合わせを導入することを含む、Ｂ－Ｂ１８の前述の細胞。
Ｂ２０． 破壊が、ミスセンス変異、ナンセンス変異、非フレームシフト欠失、フレームシフト欠失、非フレームシフト挿入、フレームシフト挿入、又はそれらの任意の組み合わせを導入することを含む、Ｂ－Ｂ１９の前述の細胞。
Ｂ２１． 破壊が、非機能性ＴＥＴ２タンパク質をもたらす、Ｂ－Ｂ２０の前述の細胞。
Ｂ２２． 破壊が、ＴＥＴ２遺伝子発現のノックアウトをもたらす、Ｂ－Ｂ２１の前述の細胞。
Ｂ２３． 破壊が、ヌクレアーゼによるＴＥＴ２遺伝子座の切断を含む、Ｂ－Ｂ２２の前述の細胞。
Ｂ２４． ヌクレアーゼが、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ、又はその誘導体である、Ｂ２３の前述の細胞。
Ｂ２５． ｇＲＮＡを更に含む、Ｂ２４の前述の細胞。
Ｂ２６． ｇＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５に記載の配列を含む、Ｂ２５の前述の細胞。
Ｂ２７． ヌクレアーゼがベクターによって発現される、Ｂ２３－Ｂ２６の前述の細胞。
Ｂ２８． ｇＲＮＡがベクターによって発現される、Ｂ２５－Ｂ２７の前述の細胞。
Ｂ２９． ベクターがウイルスベクターである、Ｂ２７又はＢ２８の前述の細胞。
Ｂ３０． ベクターが非ウイルスベクターである、Ｂ２７又はＢ２８の前述の細胞。
Ｂ３１． ＴＥＴ２遺伝子座の破壊が細胞持続性を増強する、Ｂ－Ｂ３０の前述の細胞。
Ｂ３２． ＴＥＴ２遺伝子座の破壊がメモリー細胞分化を増強する、Ｂ－Ｂ３１の前述の細胞。
Ｂ３３． 細胞が初代細胞である、Ｂ－Ｂ３２の前述の細胞。
Ｂ３４． 細胞が患者由来の細胞である、Ｂ－Ｂ３３の前述の細胞。
Ｂ３５． 細胞がリンパ球である、Ｂ－Ｂ３４の前述の細胞。
Ｂ３６． 細胞がＴ細胞である、Ｂ－Ｂ３５の前述の細胞。
Ｂ３７． Ｔ細胞が患者由来の細胞である、Ｂ３６の前述の細胞。
Ｂ３８． 細胞が幼若Ｔ細胞である、Ｂ－Ｂ３７の前述の細胞。
Ｂ３９． 細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５－、ＣＣＲ７＋、及びＣＤ２７＋である、Ｂ３８の前述の細胞。
Ｂ４０． 細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＤ２７＋、ＣＣＲ７＋である、Ｂ３８の前述の細胞。
Ｂ４１． 細胞が、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋である、Ｂ３８の前述の細胞。
Ｂ４２． 内因性遺伝子座が、内因性ＴＣＲ遺伝子内にある、Ｂ－Ｂ４１の前述の細胞。
Ｂ４３． ＴＣＲ遺伝子配列が、腫瘍抗原を認識するＴＣＲをコードする、Ｂ１－Ｂ４２の前述の細胞。
Ｂ４４． 腫瘍抗原がネオ抗原である、Ｂ４３の前述の細胞。
Ｂ４５． 腫瘍抗原が患者特異的ネオ抗原である、Ｂ４３の前述の細胞。
Ｂ４６． ＴＣＲ遺伝子配列が患者特異的ＴＣＲ遺伝子配列である、Ｂ１－Ｂ４５の前述の細胞。
Ｂ４７． 方法が、細胞を培養することを更に含む、Ｂ－Ｂ４６の前述の細胞。
Ｂ４８． 培養が、少なくとも一種のサイトカインの存在下で行われる、Ｂ４７の前述の細胞。
Ｂ４９． 培養が、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、又はそれらの任意の組み合わせの存在下で行われる、Ｂ４７又はＢ４８の前述の細胞。
Ｂ５０． 培養がＩＬ７及びＩＬ１５の存在下で行われる、Ｂ４７又はＢ４８の前述の細胞。

Ｃ． 所定の非限定的実施態様では、本開示の主題は、細胞を改変する方法であって、相同組換え（ＨＲ）鋳型核酸配列を細胞に導入すること；ＨＲ鋳型核酸を細胞の内因性遺伝子座に組換えること；及び細胞のＴＥＴ２遺伝子座を破壊することを含む、方法を提供する。
Ｃ１． ＨＲ鋳型が、第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム；並びに第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列を含む、Ｃの前述の方法。
Ｃ２． ＨＲ鋳型が、ＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第一の２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第二の２Ａコード配列とを含み、第一の２Ａコード配列及び第二の２Ａコード配列は、互いにコドンが異なる同じアミノ酸配列をコードする、Ｃ又はＣ１の前述の方法。
Ｃ３． ２Ａコード配列がＰ２Ａコード配列である、Ｃ１又はＣ２の前述の方法。
Ｃ４． アミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列が、２Ａコード配列の直ぐ上流に位置する、Ｃ２又はＣ３の前述の方法。
Ｃ５． ＨＲ鋳型が、第二の２Ａコード配列の上流に位置するフューリン切断部位をコードする配列を含む、Ｃ２－Ｃ４の前述の方法。
Ｃ６． 第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約３００塩基長から約２０００塩基長である、Ｃ１－Ｃ５の前述の方法。
Ｃ７． 第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約６００塩基長から約２０００塩基長である、Ｃ１－Ｃ６の前述の方法。
Ｃ８． ＨＲ鋳型が、第一の２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列との間に位置するシグナル配列を更に含む、Ｃ２－Ｃ７の前述の方法。
Ｃ９． ＨＲ鋳型が、第二の２Ａコード配列と第二の相同性アームとの間に位置する第二のＴＣＲ配列を含む、Ｃ２－Ｃ８の前述の方法。
Ｃ１０． ＨＲ鋳型が、第一の２Ａコード配列と第一のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第一のシグナル配列；及び第二の２Ａコード配列と第二のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第二のシグナル配列を含み；ここで、第一のシグナル配列及び第二のシグナル配列が、同じアミノ酸配列をコードし、互いにコドンが異なる、Ｃ９の前述の方法。
Ｃ１１． シグナル配列がヒト成長ホルモンシグナル配列である、Ｃ８又はＣ１０の前述の方法。
Ｃ１２． ＨＲ鋳型が非ウイルス性である、Ｃ１－Ｃ１１の前述の方法。
Ｃ１３． ＨＲ鋳型が環状ＤＮＡである、Ｃ－Ｃ１２の前述の方法。
Ｃ１４． ＨＲ鋳型が直鎖ＤＮＡである、Ｃ－Ｃ１３の前述の方法。
Ｃ１５． 導入が、エレクトロポレーションを介して生じる、Ｃ－Ｃ１４の前述の方法。
Ｃ１６． 組換えが、ヌクレアーゼによる内因性遺伝子座の切断；及び相同性指向修復によるＨＲ鋳型核酸配列の内因性遺伝子座への組換えを含む、Ｃ－Ｃ１５の前述の方法。
Ｃ１７． ヌクレアーゼが、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ、又はその誘導体である、Ｃ１６の前述の方法。
Ｃ１８． ｇＲＮＡを更に含む、Ｃ１７の前述の方法。
Ｃ１９． 破壊が、置換、欠失、挿入、又はそれらの任意の組み合わせを導入することを含む、Ｃ－Ｃ１８の前述の方法。
Ｃ２０． 破壊が、ミスセンス変異、ナンセンス変異、非フレームシフト欠失、フレームシフト欠失、非フレームシフト挿入、フレームシフト挿入、又はそれらの任意の組み合わせを含む、Ｃ－Ｃ１９の前述の方法。
Ｃ２１． 破壊が、非機能性ＴＥＴ２タンパク質をもたらす、Ｃ－Ｃ２０の前述の方法。
Ｃ２２． 破壊が、ＴＥＴ２遺伝子発現のノックアウトをもたらす、Ｃ－Ｃ２１の前述の方法。
Ｃ２３． 破壊が、ヌクレアーゼによるＴＥＴ２遺伝子座の切断を含む、Ｃ－Ｃ２２の前述の方法。
Ｃ２４． ヌクレアーゼが、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ、又はその誘導体である、Ｃ２３の前述の方法。
Ｃ２５． ｇＲＮＡを更に含む、Ｃ２４の前述の方法。
Ｃ２６． ｇＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５に記載の配列を含む、Ｃ２５の前述の方法。
Ｃ２７． ヌクレアーゼがベクターによって発現される、Ｃ２３－Ｃ２６の前述の方法。
Ｃ２８． ｇＲＮＡがベクターによって発現される、Ｃ２５－Ｃ２７の前述の方法。
Ｃ２９． ベクターがウイルスベクターである、Ｃ２７又はＣ２８の前述の方法。
Ｃ３０． ベクターが非ウイルスベクターである、Ｃ２７－Ｃ２９の前述の方法。
Ｃ３１． ＴＥＴ２遺伝子座の破壊が細胞持続性を増強する、Ｃ－Ｃ３０の前述の方法。
Ｃ３２． ＴＥＴ２遺伝子座の破壊がメモリー細胞分化を増強する、Ｃ－Ｃ３１の前述の方法。
Ｃ３３． 細胞が初代細胞である、Ｃ－Ｃ３２の前述の方法。
Ｃ３４． 細胞が患者由来の細胞である、Ｃ－Ｃ３２の前述の方法。
Ｃ３５． 細胞がリンパ球である、Ｃ－Ｃ３２の前述の方法。
Ｃ３６． 細胞がＴ細胞である、Ｃ－Ｃ３２の前述の方法。
Ｃ３７． Ｔ細胞が患者由来の細胞である、Ｃ３６の前述の方法。
Ｃ３８． 細胞が幼若Ｔ細胞である、Ｃ－Ｃ３２の前述の方法。
Ｃ３９． 細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５－、ＣＣＲ７＋、及びＣＤ２７＋である、Ｃ３８の前述の方法。
Ｃ４０． 細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＤ２７＋、ＣＣＲ７＋である、Ｃ３８の前述の方法。
Ｃ４１． 細胞が、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋である、Ｃ３８の前述の方法。
Ｃ４２． 内因性遺伝子座が、内因性ＴＣＲ遺伝子内にある、Ｃ－Ｃ４１の前述の方法。
Ｃ４３． ＴＣＲ遺伝子配列が、腫瘍抗原を認識するＴＣＲをコードする、Ｃ１－Ｃ４２の前述の方法。
Ｃ４４． 腫瘍抗原がネオ抗原である、Ｃ４３の前述の方法。
Ｃ４５． 腫瘍抗原が患者特異的ネオ抗原である、Ｃ４３の前述の方法。
Ｃ４６． ＴＣＲ遺伝子配列が患者特異的ＴＣＲ遺伝子配列である、Ｃ１－Ｃ４５の前述の方法。
Ｃ４７． 方法が、細胞を培養することを更に含む、Ｃ－Ｃ４６の前述の方法。
Ｃ４８． 培養が、少なくとも一種のサイトカインの存在下で行われる、Ｃ４７の前述の方法。
Ｃ４９． 培養が、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、又はそれらの任意の組み合わせの存在下で行われる、Ｃ４７又はＣ４８の前述の方法。
Ｃ５０． 培養がＩＬ７及びＩＬ１５の存在下で行われる、Ｃ４７又はＣ４８の前述の方法。

Ｄ． 所定の非限定的実施態様では、本開示の主題は、治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、Ａ－Ａ２０又はＢ－Ｂ５０の何れか一の細胞の治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。
Ｄ１． 治療有効量の細胞を投与する前に、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に施される、Ｄの前述の方法。
Ｄ２． がんが固形腫瘍である、Ｄ又はＤ１の前述の方法。
Ｄ３． がんが液体腫瘍である、Ｄ又はＤ１の前述の方法。
Ｄ４． 固形腫瘍が、メラノーマ、胸部がん、肺がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、頭頸部がん、前立腺がん、婦人科がん、中枢神経系がん、皮膚がん、ＨＰＶ＋がん、食道がん、甲状腺がん、胃がん、肝細胞がん、胆管がん、腎細胞がん、精巣がん、肉腫、及び結腸直腸がんからなる群から選択される、Ｄ２の前述の方法。
Ｄ５． 液体腫瘍が、濾胞性リンパ腫、白血病、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される、Ｄ３の前述の方法。

Ｅ． 所定の非限定的実施態様では、本開示の主題は、Ａ－Ａ２０又はＢ－Ｂ５０の何れか一の細胞の有効量を含む組成物を提供する。
Ｅ１． 組成物が、薬学的に許容される添加物を更に含む薬学的組成物である、Ｅの前述の組成物。
Ｅ２． 組成物が、がんの治療のために治療を必要とする患者に投与される、Ｅ又はＥ１の前述の組成物。
Ｅ３． 組成物が凍結保存剤を含む、Ｅ－Ｅ２の前述の組成物。
Ｅ４． 組成物が血清アルブミンを含む、Ｅ－Ｅ３の前述の組成物。
Ｅ５． 組成物が、Ｐｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ、ＨＳＡ、及びＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０を含む、Ｅ－Ｅ４の前述の組成物。

Ｆ． 所定の非限定的実施態様では、本開示の主題は、Ａ－Ａ２０又はＢ－Ｂ５０の何れか一の細胞、Ｃ－Ｃ５０の何れか一の方法を実施するための試薬、又はＥ－Ｅ５の何れか一の組成物を含むキットを提供する。
Ｆ１． キットが、がんを治療するための書面による説明書を更に含む、Ｆの前述のキット。

以下は、本発明を実施するための特定の実施態様の実施例である。該実施例は、例証のみを目的として提供されており、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関して正確さを確保するための努力がなされているが、勿論、ある程度の実験誤差と偏差は許容されるべきである。

本発明の実施には、他に示されない限り、当該技術分野における技量の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の一般的方法が用いられる。そのような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２版，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ及びＮ．Ｋａｐｌａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３版（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ） Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照のこと。

ここに提供されるのは、Ｔ細胞を改変してＮｅｏＴＣＲを発現させ、ＴＥＴ２の発現をノックアウトし、患者の腫瘍細胞の表面に専ら提示されるネオエピトープ（ｎｅｏＴＣＲ）を標的とする自己Ｔ細胞受容体を発現するように精密ゲノム改変された、アフェレーシス由来の患者自己ＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞で構成される個別化された養子Ｔ細胞療法剤（すなわち、ＴＥＴ２生成物）を作製する実施例であり、ここでＴＥＴ２生成物は幼若表現型を持つＴ細胞を含む。

実施例１．ＮｅｏＴＣＲの標的組込み
ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／１７８８７（出典明示によりその全体がここに援用される）に記載されているｉｍＰＡＣＴ単離技術によって同定されたネオエピトープ特異的ＴＣＲを使用して、相同組換え（ＨＲ）ＤＮＡ鋳型を作製した。これらのＨＲ鋳型を、部位特異的ヌクレアーゼとタンデムで初代ヒトＴ細胞にトランスフェクトした（図２Ａ－２Ｃ及び図３を参照）。一段階の非ウイルス精密ゲノム改変により、内因性ＴＣＲを、内因性プロモーターによって発現される患者のネオエピトープ特異的ＴＣＲでシームレスに置換した。表面に発現されるＴＣＲは配列が完全に天然である。
ｎｅｏＴＣＲ－Ｔ細胞ゲノム改変の精度を、オフターゲット組込みホットスポット又は転座について標的遺伝子座増幅（ＴＬＡ）によって、また次世代シーケンシングベースのオフターゲット切断アッセイによって評価し、意図しない結果の証拠がないことを見出した。

図２Ａ－２Ｃに示されるように、目的の遺伝子を含むコンストラクトを内因性遺伝子座に挿入した。これは、左右のＨＲアームに隣接する目的の遺伝子のコード配列を含む相同修復鋳型を使用して達成した。ＨＲアームに加えて、目的の遺伝子を、２Ａペプチド、目的の上流の翻訳遺伝子から２Ａペプチドを除去するための２Ａペプチドの上流にあるプロテアーゼ切断部位、及びシグナル配列の間に挟んだ（図２Ｂ）。ゲノムに組込まれると、目的の発現遺伝子カセットの遺伝子は、単一メッセンジャーＲＮＡとして転写された。メッセンジャーＲＮＡにおけるこの目的の遺伝子の翻訳中に、隣接領域は、自己切断２Ａペプチドによって目的の遺伝子から切り離され、プロテアーゼ切断部位は、翻訳された目的の遺伝子の上流の２Ａペプチドの除去のために切断された（図２Ｃ）。２Ａペプチド及びプロテアーゼ切断部位に加えて、ｇｌｙ－ｓｅｒ－ｇｌｙ（ＧＳＧ）リンカーを各２Ａペプチドの前に挿入して、発現カセット内の他のエレメントからの目的の遺伝子の分離を更に高めた。

Ｐ２Ａペプチドは、その効率的な切断のために、ＮｅｏＴＣＲ及びＴＥＴ２生成物の他の２Ａペプチドよりも優れていると判断された。従って、二つ（２）のＰ２Ａペプチド及びコドン分岐を使用して、Ｐ２Ａペプチドからの目的の遺伝子の何れかの末端にある残りのアミノ酸からの如何なる外因性エピトープも導入することなく、目的の遺伝子を発現させた。外因性エピトープを持たない（すなわち、目的の遺伝子の両側に隣接するＰ２Ａペプチドアミノ酸がない）遺伝子編集細胞の利点は、免疫原性が強烈に低下し、遺伝子編集細胞に対して免疫反応を起こす遺伝子編集細胞を含むＮｅｏＴＣＲ及びＴＥＴ２生成物が患者に注入される可能性が低くなることである。

ＰＣＴ／ＵＳ／２０１８／０５８２３０に記載されているように、ＮｅｏＴＣＲをＴ細胞のＴＣＲα遺伝子座に組み込んだ。具体的には、左右のＨＲアームに隣接するＮｅｏＴＣＲコード配列を含む相同修復鋳型を使用した。加えて、内因性ＴＣＲβ遺伝子座を破壊し、ＮｅｏＴＣＲコンストラクトによってコードされるＴＣＲ配列のみを発現させた。一般的な戦略を、環状ＨＲ鋳型並びに直鎖鋳型を使用して適用した。

ネオ抗原特異的ＴＣＲコンストラクトのデザインを図３Ａ及び３Ｂに図示した。標的ＴＣＲα遺伝子座（Ｃα）がプラスミドＨＲ鋳型と共に示され、得られた編集配列と下流のｍＲＮＡ／タンパク質生成物が示される。標的ＴＣＲα遺伝子座（内因性ＴＲＡＣ）とそのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９標的部位（水平縞、矢印で示された切断部位）が示される（図３Ａ）。左右の相同性アーム（それぞれ「ＬＨＡ」と「ＲＨＡ」）の間に位置する、ＮｅｏＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む環状プラスミドＨＲ鋳型が示される（図３Ａ）。コドン最適化されたＨＲ鋳型によって導入されたＴＲＡＣの領域が示される（縦縞）。ＴＣＲβ定常ドメインは、ＴＲＢＣ１と機能的に同等であることが示されているＴＲＢＣ２から誘導した。ＮｅｏＴＣＲカセットにおける他のエレメントには次のものが含まれる：２Ａ＝２Ａリボソームスキッピングエレメント（非限定的な例では、カセットで使用される２Ａペプチドは両方ともＰ２Ａ配列であり、コドン分岐と組み合わせて使用され、翻訳産物における他の形で生じる非内因性エピトープを排除する）；Ｐ＝上流のＴＣＲβタンパク質から２Ａタグを除去する２Ａの上流のプロテアーゼ切断部位（非限定的な例では、プロテアーゼ切断部位は、フューリンプロテアーゼ切断部位でありうる）；ＳＳ＝シグナル配列（非限定的な例では、プロテアーゼ切断部位は、ヒト成長ホルモンシグナル配列でありうる）。ＮｅｏＴＣＲ発現遺伝子カセットのＨＲ鋳型には、ＴＣＲαガイドＲＮＡを用いてＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ヌクレアーゼＲＮＰの標的となるＴＣＲαゲノム遺伝子座への挿入を方向づける二つの隣接する相同性アームが含まれる。これらの相同性アーム（ＬＨＡ及びＲＨＡ）は、ＮｅｏＴＣＲ発現遺伝子カセットのｎｅｏＥ特異的ＴＣＲ配列に隣接している。この実施例において使用されたプロテアーゼ切断部位はフューリンプロテアーゼ切断部位であったが、当業者に知られている任意の適切なプロテアーゼ切断部位を使用することができる。同様に、ＨＧＨがこの実施例のために選択されたシグナル配列であったが、当業者に知られている任意のシグナル配列を、所望の輸送に基づいて選択し、使用することができる。

ゲノムに組み込まれると（図２Ｃ）、ＮｅｏＴＣＲ発現遺伝子カセットは、その個々のＴ細胞からの内因性ＴＣＲαポリペプチドの一部をなおも含む（図２Ｃ）、内因性ＴＣＲαプロモーターから単一のメッセンジャーＲＮＡとして転写される。この単一ＮｅｏＴＣＲメッセンジャーＲＮＡのリボソームポリペプチド翻訳中に、ＮｅｏＴＣＲ配列は、Ｐ２Ａペプチドでの自己切断によって内因性のＣＲＩＳＰＲ破壊されたＴＣＲαポリペプチドから分離される（図２Ｃ）。コードされたＮｅｏＴＣＲα及びＮｅｏＴＣＲβポリペプチドはまた内因性細胞性ヒトフューリンプロテアーゼによる切断及びＮｅｏＴＣＲ発現遺伝子カセットに含まれる第二の自己切断Ｐ２Ａ配列モチーフを通して互いに分離している（図２Ｃ）。ＮｅｏＴＣＲα及びＮｅｏＴＣＲβポリペプチドは、多量体構築及びＴ細胞表面へのＮｅｏＴＣＲタンパク質複合体の輸送のために、シグナルリーダー配列（ヒト成長ホルモン、ＨＧＨに由来）によって別々に小胞体に標的化される。フューリンプロテアーゼ切断部位を含めることにより、上流のＴＣＲβ鎖からの２Ａ配列の除去が容易になり、ＴＣＲβ機能との潜在的な干渉が減少する。各２Ａの前にｇｌｙ－ｓｅｒ－ｇｌｙリンカーを含めると（図示せず）、三つのポリペプチドの分離が更に増強される。

加えて、三つの反復タンパク質配列は、ゲノム安定性を促進するためにＨＲ鋳型内でコドン分岐される。二つのＰ２Ａは、エクスビボ改変Ｔ細胞のゲノム内に導入されたＮｅｏＴＣＲカセット配列の安定性を促進するためにＴＣＲ遺伝子カセット内で、二つのＨＧＨシグナル配列も互いに同様に、互いにコドン分岐される。同様に、ＴＲＡＣエクソン１の再導入された５’末端（縦縞）は、二つの直接反復の介在配列を除去することにより、カセット全体が経時的に失われる可能性を低減させる。
ＮｅｏＴＣＲ生成物に加えて、この方法は任意のＴＥＴ２生成物に使用できる。

図３は、ＮｅｏＥ ＴＣＲカセットの正確な標的組込みを確認するＩｎ－Ｏｕｔ ＰＣＲの結果を示している。アガロースゲルは、組込みカセットに特異的なプライマーを使用し、部位がヌクレアーゼとＤＮＡ鋳型（ＫＯＫＩとＫＯＫＩＫＯ）の両方で処理された細胞に対してのみ予想されたサイズの生成物を生成するＰＣＲの結果を示しており、部位特異的で正確な組込みを証明している。

更に、標的遺伝子座増幅（ＴＬＡ）を使用して、標的組込みの特異性を確認した。架橋、ライゲーション、及びＮｅｏＴＣＲ挿入断片に特異的なプライマーの使用によって、組み込み部位周辺の配列を取得した。ゲノムにマッピングされたリードを、１０ｋｂ間隔でビニングする。有意なリードデプスは、１４番染色体上の組込み部位の目的部位周囲でのみ得られ、一般的なオフターゲット挿入部位の証拠がないことが示される。

内因性ＴＣＲの抗体染色及びｎｅｏＴＣＲのペプチド－ＨＬＡ染色は、改変がＮｅｏＴＣＲの高頻度のノックインをもたらし、一部のＴＣＲ細胞と少しのＷＴ Ｔ細胞が残っていることを示している（図４Ａ）。ノックインは、外因性プロモーターの非存在下でのｎｅｏＴＣＲ発現によって証明される。同じｎｅｏＴＣＲを使用して改変を複数回実施したところ、同様の結果が得られた（図４Ｂ）。従って、ＮｅｏＴＣＲの効率的且つ一貫した発現と改変されたＴ細胞における内因性ＴＣＲのノックアウトが達成された。

実施例２．ＴＥＴ２ノックアウトＮｅｏＴＣＲ－Ｐ１ Ｔ細胞の作製
［材料及び方法］ Ｔ細胞を、実施例１及びＰＣＴ／ＵＳ２０２０／１７８８７（出典明示によりその全体がここに援用される）に記載されるように、ＴＲＡ及びＴＲＢ ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９ ＲＮＰと共に、Ｃａｓ９ ＲＮＰとしてＴＥＴ２の第一エキソンを標的とするｇＲＮＡでトランスフェクトし、内因性ＴＥＴ２コード配列を破壊し、ＴＥＴ２タンパク質発現を低下させた（すなわち、ＴＥＴ２生成物）。

［Ｔ細胞の単離と編集］ ＴＥＴ２生成物を、最初にドナーのｌｅｕｋｏｐａｋからＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞を単離し、次にＴＥＴ２ｇＲＮＡと共に（実施例１に開示されたＮｅｏＴＣＲ組込み法を使用して）ＴＣＲα及びＴＣＲβｇＲＮＡで細胞をトランスフェクトしてＴＥＴ２遺伝子をノックアウトすることによって、作製した。ＴＥＴ２に特異的に結合し、ＴＥＴ２遺伝子を破壊し、且つＴＥＴ２遺伝子発現をノックアウトする任意のｇＲＮＡを使用することができるが、表２に提供される例示的なｇＲＮＡをここでは使用した。ｓｇＲＮＡ１及び５はマイナス鎖ｓｇＲＮＡであり、ｓｇＲＮＡ２－４はプラス鎖ｓｇＲＮＡである。

［ｇＲＮＡの選択と反応］ 上述のＴＥＴ２ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９ＲＮＰ編集ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞（すなわち、ＴＥＴ２生成物）を溶解し、ＤＮＡを抽出した。ｇＲＮＡ標的部位に隣接する領域を、表３に提供した例示的プライマーを使用するＰＣＲによって増幅させた。あるいは、より特異性のある再デザインされたプライマー又は増幅を達成するようにデザインされた代替プライマーをまた使用できる。次に、ＰＣＲアンプリコンをＴ７エンドヌクレアーゼＩ（ＮＥＢ）と共にインキュベートし、得られた生成物をアガロースゲルで流した（図６Ａ及び６Ｂ）。

ＴＥＴ２＿１ Ｆｗｄプライマー（配列番号：６）を使用して、ｓｇＲＮＡ１（配列番号：１）、４（配列番号：４）、及び５（配列番号：５）のｓｇＲＮＡインデルを分析した。この反応で予想される生成物サイズは８４９ｂｐである。
ＴＥＴ２＿１ Ｒｅｖプライマー（配列番号：７）を使用して、ｓｇＲＮＡ１（配列番号：１）、４（配列番号：４）、及び５（配列番号：５）のｓｇＲＮＡインデルを分析した。この反応で予想される生成物サイズは８４９ｂｐである。
ＴＥＴ２＿２ Ｆｗｄプライマー（配列番号：８）を使用して、ｓｇＲＮＡ２（配列番号：２）及び３（配列番号：３）のｓｇＲＮＡインデルを分析した。この反応で予想される生成物サイズは１０３２ｂｐである。
ＴＥＴ２＿２ Ｒｅｖプライマー（配列番号：９）を使用して、ｓｇＲＮＡ（配列番号：２）及び３（配列番号：３）のｓｇＲＮＡインデルを分析した。この反応で予想される生成物サイズは１０３２ｂｐである。

最適なｇＲＮＡを、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）アッセイによってＴＥＴ２ノックアウト（ＫＯ）を評価し、完全にはアニーリングされていないＰＣＲ生成物を検出することによって、決定した。遺伝子発現の喪失の更なる特徴づけは、ＴＥＴ２ｍＲＮＡのｑＰＣＲ定量化及びＴＥＴ２ ｇＲＮＡでヌクレオフェクトされたｎｅｏＴＣＲ Ｔ細胞におけるＴＥＴ２タンパク質のウエスタンブロットによって決定した。ＴＥＴ２ ｇＲＮＡで処理されていないＴ細胞を、ＴＥＴ２遺伝子及びタンパク質発現の陰性対照として使用した。Ｔ７ＥＩアッセイでは、Ｔ７ＥＩ酵素によって切断されたＰＣＲ産物の割合を測定することにより、ｇＲＮＡ標的化効率を定量した。ＴＥＴ２ ｍＲＮＡ転写生成物の存在量をｑＰＣＲによって定量した。ＴＥＴ２タンパク質の存在量は、抗ＴＥＴ２抗体を使用したウエスタンブロットによって定量した。ＴＥＴ２遺伝子のノックアウトに成功すると、ＮｅｏＴＣＲ生成物と比較してＴＥＴ２生成物においてｍＲＮＡ及びタンパク質レベルが低下した。

ｃｒｉｓｐｒ－ｄａｖ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｐｉｎｅｔｒｅｅ１／ｃｒｉｓｐｒ－ｄａｖ／ｂｌｏｂ／ｍａｓｔｅｒ／Ｉｎｓｔａｌｌ－ａｎｄ－Ｒｕｎ．ｍｄ＃ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｏｆ－ｆｉｌｅｓ－ｃｒｅａｔｅｄ－ｂｙ－ｐｒｅｐａｒｅ＿ｒｕｎｐｌ－ｓｃｒｉｐｔ）解析を、アウトフレームインデルを作製するための最も効率的なｇＲＮＡを同定するために実施した。ＰＣＲアンプリコンのカバレッジは、ガイド部位を取り巻く全てのアンプリコンに対して堅牢であった。図７Ａ－７Ｅを参照のこと。

五つの異なるガイドＲＮＡを、ＴＥＴ２の第一のコーディングエクソンを標的化し、堅牢に編集し、Ｔ７Ｅ１切断効率アッセイ並びにＰＣＲアンプリコンＤＮＡトランスポゾンベースのシーケンシングによって評価されて、＞７０％のフレーム外インデルをもたらすようにデザインした（図８Ａ及び８Ｂ）。

ＴＥＴ２活性の減少を確認するために、ポリクローナル抗５ｈｍＣ抗体（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ；１ｕｇ／ｍＬ；カタログ番号３９７９１）を使用した５－ｈｍＣの細胞内染色を実施した。具体的には、５－ｈｍＣフローサイトメトリー実験を次の通りに実施した：１）ＷＴ及び各ｇＲＮＡヌクレオフェクトサンプルからの２００Ｋ Ｔ細胞を、プレート被覆されたＰＡＣＴ０３５ｃｏｍＰＡＣＴで１．５時間刺激し、２）ついで、サンプルを収集し、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄのために染色した後、ＢＤ ＩＣＳ Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍで固定し、続いて２回洗浄し、染色バッファーに再懸濁させ、３）細胞をＰｅｒｍバッファーで１５分間透過処理し、４）細胞をＰｅｒｍバッファー中のＤＮａｓｅＩ（３００ｕｇ／ｍＬ）で３７℃において３時間処理し（１時間の処理が望まれた）、５）細胞をＰｅｒｍバッファーで２回洗浄し、６）細胞をＰｅｒｍバッファー中の抗５－ｈｍＣ（１ｕｇ／ｍＬ）で４℃において３０分間染色し、７）細胞をＰｅｒｍバッファーで２回洗浄し、８）細胞を抗ウサギＩｇＧ－ＡＦ６４７（５ｕＬ／５０ｕＬ）で４℃において３０分間染色し、９）細胞をＰｅｒｍバッファーで２回洗浄し、１０）フローサイトメーターでの処理のために細胞を２００ｕＬに再懸濁させた。

５－ｈｍＣ染色は、休止ＴＥＴ２生成物と刺激ＴＥＴ２生成物の５－ｈｍＣ状態に認識できるほどの違いがないことを示した。同族ｃｏｍＰＡＣＴプレート被覆による１．５時間の刺激の有無にかかわらず、ＴＥＴ２の非存在下では、５－ｈｍＣの認識できるほどの低下は観察されなかった。図９を参照のこと。
ＴＥＴ２破壊の影響を更に特徴づけるために、ＡＴＡＣ－ｓｅｑ（Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ等，２０１３，Ｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０（１２）１２１３－１２１８に記載）をＴＥＴ２生成物で実施し、細胞のゲノム全体のクロマチン状態を決定した。

休止中のＴＥＴ２生成物のＴＣＦ７及びＴＢＥＴ染色をまた実施した（図１０）。ＴＥＴ２をノックアウトしても、ＴＣＦ７及びＴＢＥＴ転写因子の発現に影響がないことが示された。
ＴＥＴ２生成物がＩＦＮγを産生する能力を試験した（図１１Ａ）。ＴＥＴ２をノックアウトすると、ＮｅｏＴＣＲ生成物と比較してＩＦＮγ産生Ｔ細胞の頻度が低下したことが確認された。
ＴＥＴ２生成物を試験して、ＣＤ１０７ａ＋細胞の数がノックアウトの影響を受けるかどうかを判定した（図１１Ｂ）。ＴＥＴ２をノックアウトすると、ＮｅｏＴＣＲ生成物と比較してＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度が低下したことが確認された。

複数のラウンドのＩｎｃｕＣｙｔｅ実験を、ＴＥＴ２生成物（「ＰＡＣＴ－０３５－ＴＣＲ０８９」細胞）及びＮｅｏＴＣＲ生成物（「ＰＡＣＴ０３５－ＴＣＲ０８９ＴＥＴ２ｇＲＮＡ３」細胞）を使用して実施した（図１２Ａ及び１２Ｂ）。これらの実験では、ＴＥＴ２生成物及びＮｅｏＴＣＲ生成物からの遺伝子編集１４日後の細胞と遺伝子編集＞３０日後の細胞を使用した。＞３０日のＴＥＴ２生成物細胞は＞３０日のＮｅｏＴＣＲ生成物細胞よりも効果的なキラーであったことが観察された（データは示さず）が、両生成物の１４日細胞間には差がなかった（図１２Ａ及び１２Ｂ）。どちらの場合も、対照を実施し、ＴＥＴ２生成物細胞とＮｅｏＴＣＲ生成物細胞は、ＣＯＸ６Ｃ Ｒ２０Ｑ変異を欠くＳＷ６２０細胞を殺さなかった。これらのＩｎｃｕＣｙｔｅ実験は、ＴＥＴ２欠損を操作する細胞の遺伝子編集後の日数が細胞の表現型に影響を与えることを示している。

ＴＥＴ２破壊は、ＣＤ８メモリー細胞の分化を促進する（Ｃａｒｔｙ等，２０１８；Ｆｒａｉｅｔｔａ等，２０１８，Ｎａｔｕｒｅ，５５８（７７０９），３０７－３１２）。編集細胞の表現型の状態を、ＣＣＲ７及びＣＤ２７に対する抗体で染色した後、フローサイトメトリーによって評価した。これらの実験に基づいて、ＴＥＴ２生成物は、対照Ｔ細胞及びＮｅｏＴＣＲ生成物と比較してＣＣＲ７及びＣＤ２７の発現に富むことが示され、ＴＥＴ２生成物がＴｃｍ Ｔ細胞を含むことが示されている。

ＣＤ２７はＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーである。それは、また、セントラルメモリーＴ（Ｔｃｍ）及びナイーブＴ細胞（Ｔｎ）でも構成的に発現される。ＴＥＴ２生成物細胞がメモリー様表現型を有していたかどうかを判定するために、ＴＥＴ２生成物細胞を同族ｃｏｍＰＡＣＴ被覆によって７日間刺激した。この刺激により、ＴＥＴ２生成物細胞の中でＣＤ２７（図１４Ｂ）及びＣＣＲ７（図１４Ａ）を発現する細胞の頻度が増加していることが明らかになった。言い換えれば、ＴＥＴ２生成物細胞はメモリー様表現型を有していることが示された。

サイトカイン及びグランザイムアッセイを、ＴＥＴ２生成物で実施した。具体的には、フローサイトメトリー及びネオ抗原特異的殺傷アッセイによる細胞内染色及び検出を実施した。これらの実験の結果は、ＴＥＴ２生成物が、ＴＥＴ２を発現する細胞（例えば、ＮｅｏＴＣＲ生成物）よりも高レベルのエフェクターサイトカインを産生し、より多くの細胞傷害性顆粒を放出することを示した。
最後に、ＴＯＸとＴＣＦ７の発現を、ＮｅｏＴＣＲ生成物細胞とＴＥＴ２生成物細胞において特徴づけた。ＴＯＸとＴＣＦ７の両方の発現は、１）休止状態、２）刺激後７日、及び３）刺激後９日で、ＮｅｏＴＣＲ生成物細胞とＴＥＴ２生成物細胞の間で変化しなかったことが示された。図１５Ａ－１５Ｄを参照のこと。

実施例３．ＴＥＴ２生成物の作製に使用される方法と材料
［材料及び方法］ Ｔ細胞を、実施例１及びＰＣＴ／ＵＳ２０２０／１７８８７（出典明示によりその全体がここに援用される）に記載されるように、ＴＲＡ及びＴＲＢ ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９ ＲＮＰと共に、Ｃａｓ９ ＲＮＰとしてＴＥＴ２の第一エキソンを標的とするｇＲＮＡでトランスフェクトして、内因性ＴＥＴ２コード配列の破壊とＴＥＴ２タンパク質発現の低下を生じさせた。

［Ｔ細胞単離及び編集］ ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞を健康なドナーＰＢＭＣから単離した。例として、このような細胞の単離は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｐｒｏｄｉｇｙ又はＭｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳ分離カラムを製造元の説明書に従って使用して達成することができる。陽性として選択されたＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ抗体と分離カラムを使用）を、１％ヒト血清アルブミン、４９％ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ（Ｂａｘｔｅｒ）、及び５０％ＣＳ１０（Ｓｉｇｍａ）で新鮮又は凍結保存して使用した。凍結保存した細胞を解凍し、ＴｅｘＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）＋１０％ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）で洗浄し、ＴｅｘＭＡＣＳ＋３％ヒトＡＢ血清（培地）に１ｍＬ当たり２×１０６細胞の密度で播種した。解凍の１日後、又は新鮮な状態で使用する場合は直ぐに、細胞を洗浄し、培地＋１２．５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ７＋１２．５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ１５＋容量で１：１７．５の比率のＴｒａｎｓＡＣＴ Ｔ細胞活性化試薬（全ての試薬がＭｉｌｔｅｎｙｉ）において１ｍＬ当たり１．４６×１０６細胞の密度で再播種した。活性化の二日後、目的のＮｅｏＴＣＲを含むプラスミドでＴ細胞を電気穿孔した。

［ｃｏｍＰＡＣＴ及びｃｏｍＰＡＣＴ－デキストラマーの調製］ ネオ抗原特異的ペプチド－ＨＬＡ複合体ポリペプチド（すなわち、それぞれ「ｃｏｍＰＡＣＴ」）を、出典明示によりその全体がここに援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５４１５に記載されている方法に従って、調製した。ｃｏｍＰＡＣＴ－デキストラマー複合体を、ｎｅｏＴＣＲ発現Ｔ細胞の標識化のために作製した。ビオチン化ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質をストレプトアビジン結合フルオロフォアと共に室温（ＲＴ）において１０分間インキュベートした。ビオチン－４０－デキストラン（ＮＡＮＯＣＳ）を混合物に加え、ＲＴにおいて更に１０分間インキュベートした。ｃｏｍＰＡＣＴ－デキストラマーを４℃で保存した。

［ｎｅｏＴＣＲ編集Ｔ細胞へのｃｏｍＰＡＣＴの結合の確認］ 示された日に、Ｔ細胞をフローサイトメトリーのために染色した。細胞を最初に生死判別色素で４℃において２０分間染色した後、洗浄し、ｃｏｍＰＡＣＴ－デキストラマーで４℃において１０分間染色した。細胞及びｃｏｍＰＡＣＴ－デキストラマーの懸濁液に表面抗体（抗ＣＤ８α、抗ＣＤ８β、抗ＣＤ４）を加え、細胞を４℃において更に２０分間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、細胞内固定バッファー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定した。全ての細胞をＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で取得し、データをＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ又はＦｌｏｗＪｏの何れかで解析した。

［サイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）］ ストレプトアビジン被覆プレート（Ｅａｇｌｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を洗浄バッファー（１％ＢＳＡ及び０．０５％トゥイーン２０を補充したＰＢＳ）で三回洗浄した後、１００－０．０１ｎｇ／ウェルの範囲の様々な濃度でｃｏｍＰＡＣＴで被覆した。ｃｏｍＰＡＣＴのないウェルとミスマッチｃｏｍＰＡＣＴで被覆したウェルを対照として使用した。プレートを室温において２時間インキュベートし、洗浄バッファーで三回洗浄した後、３％ヒトＡＢ血清を補充したＴｅｘＭＡＣＳで三回洗浄して、トゥイーン２０を除去した。Ｔ細胞を、３％ヒトＡＢ血清を補充したＴｅｘＭＡＣＳで二回洗浄し、３％ヒトＡＢ血清と１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン溶液を補充したＴｅｘＭＡＣＳに１００万細胞／ｍＬで再懸濁させた。Ｔ細胞をｃｏｍＰＡＣＴ被覆プレートに１００μＬ／ウェルで蒔き、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。２４時間後、上清を収集し、ＢＤ サイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩ（カタログ番号５５１８０９）を製造元のプロトコルに従って使用して、サイトカイン濃度を分析した。キャプチャービーズを培養上清と混合し、検出試薬と共に光から保護してＲＴにおいて３時間インキュベートし、洗浄し、洗浄バッファーに再懸濁させた。サンプルをＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターでアッセイし、データをＦｌｏｗＪｏで解析した。ＥＣ５０は、最大応答の５０％を誘発する同族ｃｏｍＰＡＣＴの濃度を表し、ある範囲のｃｏｍＰＡＣＴ濃度にわたるＩＦＮγ分泌の最小二乗適合を利用して計算した。

［細胞内染色］ 示された日にＴ細胞をフローサイトメトリーのために染色した。Ｔ細胞を最初に生死判別色素で４℃において２０分間染色し、次に洗浄し、表面抗体（抗ＣＤ８α、抗ＣＤ８β、抗ＣＤ４）と共に４℃において更に２０分間インキュベートした。次に、Ｔ細胞を洗浄し、細胞内染色のために透過処理した。Ｔ細胞を４℃において２０分間、透過バッファー中、抗２Ａペプチド、又は抗ＩＦＮγ、抗ＴＮＦ、又は抗ＩＬ２で染色した。Ｔ細胞を細胞内固定バッファー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定した。サンプルを、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でアッセイし、データをＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ又はＦｌｏｗＪｏで解析した。

［Ｔ細胞増殖アッセイ］ 編集ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞を、製造元の説明書に従ってｅ４５０増殖色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で標識した。標識細胞を、上記の濃度範囲でｃｏｍＰＡＣＴ被覆プレート上で刺激した。Ｔ細胞を４８－９６時間かけて収集し、ｅ４５０色素の希釈によって測定して増殖を分析した。

［Ｔ細胞殺傷アッセイ］ ＨＬＡ適合細胞株に、同族ネオ抗原ペプチド又は不適合ペプチドを３７℃において５％ＣＯ２で１時間パルスした。細胞を培地で３回洗浄して未結合ペプチドを除去した後、上記のｅ４５０増殖色素で標識されている編集ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞と共培養した。共培養物を、収集前に５％ＣＯ２で３７℃において４８時間インキュベートした。細胞を洗浄し、固定可能な生死判別色素で染色して、殺傷効率を決定した。ｅ４５０増殖色素は、編集Ｔ細胞と標的細胞を区別するために使用される。

本発明は、ある程度の長さで、幾つかの記載された実施態様に関してある程度の特殊性をもって記載されたが、何らかのそのような詳細又は実施態様又は何らかの特定の実施態様に限定されるべきとは意図されておらず、先行技術に照らしてそのような特許請求の範囲の可能な限り広い解釈を提供し、従って、本発明の意図された範囲を効果的に包含するように、添付の特許請求の範囲を参照して、解釈されるべきである。

ここで言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それらの全体が出典明示により援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。加えて、セクションの見出し、材料、方法、及び実施例は、例示に過ぎず、限定を意図するものではない。

Claims (137)

1. ａ．外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；及び
   ｂ．ＴＥＴ２遺伝子座の遺伝子破壊
   を含む、細胞。
2. 遺伝子破壊が、置換、欠失、挿入、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１に記載の細胞。
3. 遺伝子破壊が、ミスセンス変異、ナンセンス変異、非フレームシフト欠失、フレームシフト欠失、非フレームシフト挿入、フレームシフト挿入、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１又は２に記載の細胞。
4. ＴＥＴ２遺伝子座の遺伝子破壊が、非機能性ＴＥＴ２タンパク質をもたらす、請求項１から３の何れか一項に記載の細胞。
5. ＴＥＴ２遺伝子座の遺伝子破壊が、ＴＥＴ２遺伝子発現のノックアウトをもたらす、請求項１から３の何れか一項に記載の細胞。
6. ｇＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼを含む、請求項１から５の何れか一項に記載の細胞。
7. ｇＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の細胞。
8. ＴＥＴ２遺伝子座の遺伝子破壊が、細胞持続性を増強する、請求項１から７の何れか一項に記載の細胞。
9. ＴＥＴ２遺伝子座の遺伝子破壊が、メモリー細胞分化を増強する、請求項１から８の何れか一項に記載の細胞。
10. 細胞が初代細胞である、請求項１から９の何れか一項に記載の細胞。
11. 細胞が患者由来の細胞である、請求項１から１０の何れか一項に記載の細胞。
12. 細胞がリンパ球である、請求項１から１１の何れか一項に記載の細胞。
13. 細胞がＴ細胞である、請求項１から１２の何れか一項に記載の細胞。
14. 細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５－、ＣＣＲ７＋、及びＣＤ２７＋である、請求項１３に記載の細胞。
15. 細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＤ２７＋、ＣＣＲ７＋である、請求項１３に記載の細胞。
16. 細胞が、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋である、請求項１３に記載の細胞。
17. 外因性ＴＣＲが患者由来のＴＣＲである、請求項１から１６の何れか一項に記載の細胞。
18. 外因性ＴＣＲが、シグナル配列、第一の２Ａ配列及び第二の２Ａ配列、並びにＴＣＲポリペプチド配列を含む、請求項１から１７の何れか一項に記載の細胞。
19. 外因性ＴＣＲががん抗原を認識する、請求項１から１８の何れか一項に記載の細胞。
20. がん抗原がネオ抗原である、請求項１９に記載の細胞。
21. がん抗原が患者特異的抗原である、請求項１９に記載の細胞。
22. ａ．相同組換え（ＨＲ）鋳型核酸配列を細胞に導入すること；
    ｂ．ＨＲ鋳型核酸を細胞の内因性遺伝子座に組換えること；及び
    ｃ．細胞のＴＥＴ２遺伝子座を破壊すること
    を含む方法によって改変された細胞。
23. ＨＲ鋳型が、
    ａ．第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム；並びに
    ｂ．第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列
    を含む、請求項２２に記載の細胞。
24. ＨＲ鋳型が、ＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第一の２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第二の２Ａコード配列とを含み、第一の２Ａコード配列及び第二の２Ａコード配列は、互いにコドンが異なる同じアミノ酸配列をコードする、請求項２２又は２３に記載の細胞。
25. ２Ａコード配列がＰ２Ａコード配列である、請求項２４に記載の細胞。
26. アミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列が、２Ａコード配列の直ぐ上流に位置する、請求項２４又は２５に記載の細胞。
27. ＨＲ鋳型が、第二の２Ａコード配列の上流に位置するフューリン切断部位をコードする配列を含む、請求項２２から２６の何れか一項に記載の細胞。
28. 第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約３００塩基長から約２０００塩基長である、請求項２３から２７の何れか一項に記載の細胞。
29. 第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約６００塩基長から約２０００塩基長である、請求項２３から２８の何れか一項に記載の細胞。
30. ＨＲ鋳型が、第一の２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列との間に位置するシグナル配列を更に含む、請求項２４から２９の何れか一項に記載の細胞。
31. ＨＲ鋳型が、第二の２Ａコード配列と第二の相同性アームとの間に位置する第二のＴＣＲ配列を含む、請求項２４から３０の何れか一項に記載の細胞。
32. ＨＲ鋳型が、
    ａ．第一の２Ａコード配列と第一のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第一のシグナル配列；及び
    ｂ．第二の２Ａコード配列と第二のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第二のシグナル配列
    を含み、
    ｃ．ここで、第一のシグナル配列及び第二のシグナル配列が、同じアミノ酸配列をコードし、互いにコドンが異なる、請求項３１に記載の細胞。
33. シグナル配列がヒト成長ホルモンシグナル配列である、請求項３０又は３２に記載の細胞。
34. ＨＲ鋳型が非ウイルス性である、請求項２２から３３の何れか一項に記載の細胞。
35. ＨＲ鋳型が環状ＤＮＡである、請求項２２から３４の何れか一項に記載の細胞。
36. ＨＲ鋳型が直鎖ＤＮＡである、請求項２２から３４の何れか一項に記載の細胞。
37. 導入が、エレクトロポレーションを介して生じる、請求項２２から３６の何れか一項に記載の細胞。
38. 組換えが、
    ａ．ヌクレアーゼによる内因性遺伝子座の切断；及び
    ｂ．相同性指向修復によるＨＲ鋳型核酸配列の内因性遺伝子座への組換え
    を含む、請求項２２から３７の何れか一項に記載の細胞。
39. ヌクレアーゼが、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ、又はその誘導体である、請求項３８に記載の細胞。
40. ｇＲＮＡを更に含む、請求項３９に記載の細胞。
41. 破壊が、置換、欠失、挿入、又はそれらの任意の組み合わせを導入することを含む、請求項２２から４０の何れか一項に記載の細胞。
42. 破壊が、ミスセンス変異、ナンセンス変異、非フレームシフト欠失、フレームシフト欠失、非フレームシフト挿入、フレームシフト挿入、又はそれらの任意の組み合わせを導入することを含む、請求項２２から４１の何れか一項に記載の細胞。
43. 破壊が、非機能性ＴＥＴ２タンパク質をもたらす、請求項２２から４３の何れか一項に記載の細胞。
44. 破壊が、ＴＥＴ２遺伝子発現のノックアウトをもたらす、請求項２２から４４の何れか一項に記載の細胞。
45. 破壊が、ヌクレアーゼによるＴＥＴ２遺伝子座の切断を含む、請求項２２から４４の何れか一項に記載の細胞。
46. ヌクレアーゼが、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ、又はその誘導体である、請求項４５に記載の細胞。
47. ｇＲＮＡを更に含む、請求項４６に記載の細胞。
48. ｇＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５に記載の配列を含む、請求項４７に記載の細胞。
49. ヌクレアーゼがベクターによって発現される、請求項４５又は４６に記載の細胞。
50. ｇＲＮＡがベクターによって発現される、請求項４７又は４８に記載の細胞。
51. ベクターがウイルスベクターである、請求項４９又は５０に記載の細胞。
52. ベクターが非ウイルスベクターである、請求項４９又は５０に記載の細胞。
53. ＴＥＴ２遺伝子座の破壊が細胞持続性を増強する、請求項２２から５２の何れか一項に記載の細胞。
54. ＴＥＴ２遺伝子座の破壊がメモリー細胞分化を増強する、請求項２２から５３の何れか一項に記載の細胞。
55. 細胞が初代細胞である、請求項２２から５４の何れか一項に記載の細胞。
56. 細胞が患者由来の細胞である、請求項２２から５５の何れか一項に記載の細胞。
57. 細胞がリンパ球である、請求項２２から５６の何れか一項に記載の細胞。
58. 細胞がＴ細胞である、請求項２２から５７の何れか一項に記載の細胞。
59. Ｔ細胞が患者由来の細胞である、請求項５８に記載の細胞。
60. 細胞が幼若Ｔ細胞である、請求項２２から５９の何れか一項に記載の細胞。
61. 細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５－、ＣＣＲ７＋、及びＣＤ２７＋である、請求項６０に記載の細胞。
62. 細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＤ２７＋、ＣＣＲ７＋である、請求項６０に記載の細胞。
63. 細胞が、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋である、請求項６０に記載の細胞。
64. 内因性遺伝子座が、内因性ＴＣＲ遺伝子内にある、請求項２２から６３の何れか一項に記載の細胞。
65. ＴＣＲ遺伝子配列が、腫瘍抗原を認識するＴＣＲをコードする、請求項２３から６４の何れか一項に記載の細胞。
66. 腫瘍抗原がネオ抗原である、請求項６５に記載の細胞。
67. 腫瘍抗原が患者特異的ネオ抗原である、請求項６５に記載の細胞。
68. ＴＣＲ遺伝子配列が患者特異的ＴＣＲ遺伝子配列である、請求項２３から６７の何れか一項に記載の細胞。
69. 方法が、細胞を培養することを更に含む、請求項２２から６８の何れか一項に記載の細胞。
70. 培養が、少なくとも一種のサイトカインの存在下で行われる、請求項６９に記載の細胞。
71. 培養が、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、又はそれらの任意の組み合わせの存在下で行われる、請求項６９又は７０に記載の細胞。
72. 培養がＩＬ７及びＩＬ１５の存在下で行われる、請求項６９又は７０に記載の細胞。
73. 細胞を改変する方法であって、
    ａ．相同組換え（ＨＲ）鋳型核酸配列を細胞に導入すること；
    ｂ．ＨＲ鋳型核酸を細胞の内因性遺伝子座に組換えること；及び
    ｃ．細胞のＴＥＴ２遺伝子座を破壊すること
    を含む、方法。
74. ＨＲ鋳型が、
    ａ．第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム；並びに
    ｂ．第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列
    を含む、請求項７３に記載の方法。
75. ＨＲ鋳型が、ＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第一の２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第二の２Ａコード配列とを含み、第一の２Ａコード配列及び第二の２Ａコード配列は、互いにコドンが異なる同じアミノ酸配列をコードする、請求項７３又は７４に記載の方法。
76. ２Ａコード配列がＰ２Ａコード配列である、請求項７４又は７５に記載の方法。
77. アミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列が、２Ａコード配列の直ぐ上流に位置する、請求項７４から７６の何れか一項に記載の方法。
78. ＨＲ鋳型が、第二の２Ａコード配列の上流に位置するフューリン切断部位をコードする配列を含む、請求項７５から７７の何れか一項に記載の方法。
79. 第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約３００塩基長から約２０００塩基長である、請求項７４から７８の何れか一項に記載の方法。
80. 第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約６００塩基長から約２０００塩基長である、請求項７４から７９の何れか一項に記載の方法。
81. ＨＲ鋳型が、第一の２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列との間に位置するシグナル配列を更に含む、請求項７５から８０の何れか一項に記載の方法。
82. ＨＲ鋳型が、第二の２Ａコード配列と第二の相同性アームとの間に位置する第二のＴＣＲ配列を含む、請求項７５から８１の何れか一項に記載の方法。
83. ＨＲ鋳型が、
    ａ．第一の２Ａコード配列と第一のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第一のシグナル配列；及び
    ｂ．第二の２Ａコード配列と第二のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第二のシグナル配列
    を含み、
    ここで、第一のシグナル配列及び第二のシグナル配列が、同じアミノ酸配列をコードし、互いにコドンが異なる、請求項８２に記載の方法。
84. シグナル配列がヒト成長ホルモンシグナル配列である、請求項８１又は８３に記載の方法。
85. ＨＲ鋳型が非ウイルス性である、請求項７３から８４の何れか一項に記載の方法。
86. ＨＲ鋳型が環状ＤＮＡである、請求項７３から８５の何れか一項に記載の方法。
87. ＨＲ鋳型が直鎖ＤＮＡである、請求項７３から８５の何れか一項に記載の方法。
88. 導入が、エレクトロポレーションを介して生じる、請求項７３から８７の何れか一項に記載の方法。
89. 組換えが、
    ａ．ヌクレアーゼによる内因性遺伝子座の切断；及び
    ｂ．相同性指向修復によるＨＲ鋳型核酸配列の内因性遺伝子座への組換え
    を含む、請求項７３から８８の何れか一項に記載の方法。
90. ヌクレアーゼが、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ、又はその誘導体である、請求項８９に記載の方法。
91. ｇＲＮＡを更に含む、請求項９０に記載の方法。
92. 破壊が、置換、欠失、挿入、又はそれらの任意の組み合わせを導入することを含む、請求項７３から９１の何れか一項に記載の方法。
93. 破壊が、ミスセンス変異、ナンセンス変異、非フレームシフト欠失、フレームシフト欠失、非フレームシフト挿入、フレームシフト挿入、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項７３から９２の何れか一項に記載の方法。
94. 破壊が、非機能性ＴＥＴ２タンパク質をもたらす、請求項７３から９３の何れか一項に記載の方法。
95. 破壊が、ＴＥＴ２遺伝子発現のノックアウトをもたらす、請求項７３から９４の何れか一項に記載の方法。
96. 破壊が、ヌクレアーゼによるＴＥＴ２遺伝子座の切断を含む、請求項７３から９５の何れか一項に記載の方法。
97. ヌクレアーゼが、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ、又はその誘導体である、請求項９６に記載の方法。
98. ｇＲＮＡを更に含む、請求項９７に記載の方法。
99. ｇＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５に記載の配列を含む、請求項９８に記載の方法。
100. ヌクレアーゼがベクターによって発現される、請求項９６又は９７に記載の方法。
101. ｇＲＮＡがベクターによって発現される、請求項９８又は９９に記載の方法。
102. ベクターがウイルスベクターである、請求項９６又は９７に記載の方法。
103. ベクターが非ウイルスベクターである、請求項９６又は９７に記載の方法。
104. ＴＥＴ２遺伝子座の破壊が細胞持続性を増強する、請求項７３から１０３の何れか一項に記載の方法。
105. ＴＥＴ２遺伝子座の破壊がメモリー細胞分化を増強する、請求項７３から１０４の何れか一項に記載の方法。
106. 細胞が初代細胞である、請求項７３から１０５の何れか一項に記載の方法。
107. 細胞が患者由来の細胞である、請求項７３から１０６の何れか一項に記載の方法。
108. 細胞がリンパ球である、請求項７３から１０７の何れか一項に記載の方法。
109. 細胞がＴ細胞である、請求項７３から１０８の何れか一項に記載の方法。
110. Ｔ細胞が患者由来の細胞である、請求項１０９に記載の方法。
111. 細胞が幼若Ｔ細胞である、請求項７３から１０３の何れか一項に記載の方法。
112. 細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５－、ＣＣＲ７＋、及びＣＤ２７＋である、請求項１１１に記載の方法。
113. 細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＤ２７＋、ＣＣＲ７＋である、請求項１１１に記載の方法。
114. 細胞が、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋である、請求項１１１に記載の方法。
115. 内因性遺伝子座が、内因性ＴＣＲ遺伝子内にある、請求項７３から１１４の何れか一項に記載の方法。
116. ＴＣＲ遺伝子配列が、腫瘍抗原を認識するＴＣＲをコードする、請求項７３から１１５の何れか一項に記載の方法。
117. 腫瘍抗原がネオ抗原である、請求項１１６に記載の方法。
118. 腫瘍抗原が患者特異的ネオ抗原である、請求項１１６に記載の方法。
119. ＴＣＲ遺伝子配列が患者特異的ＴＣＲ遺伝子配列である、請求項７３から１１８の何れか一項に記載の方法。
120. 方法が、細胞を培養することを更に含む、請求項７３から１１９の何れか一項に記載の方法。
121. 培養が、少なくとも一種のサイトカインの存在下で行われる、請求項１２０に記載の方法。
122. 培養が、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、又はそれらの任意の組み合わせの存在下で行われる、請求項１２０又は１２１に記載の方法。
123. 培養がＩＬ７及びＩＬ１５の存在下で行われる、請求項１２０又は１２１に記載の方法。
124. 治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、請求項１から７２の何れか一項に記載の細胞の治療有効量を投与することを含む、方法。
125. 治療有効量の細胞を投与する前に、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に施される、請求項１２４に記載の方法。
126. がんが固形腫瘍である、請求項１２４又は１２５に記載の方法。
127. がんが液体腫瘍である、請求項１２４又は１２５に記載の方法。
128. 固形腫瘍が、メラノーマ、胸部がん、肺がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、頭頸部がん、前立腺がん、婦人科がん、中枢神経系がん、皮膚がん、ＨＰＶ＋がん、食道がん、甲状腺がん、胃がん、肝細胞がん、胆管がん、腎細胞がん、精巣がん、肉腫、及び結腸直腸がんからなる群から選択される、請求項１２６に記載の方法。
129. 液体腫瘍が、濾胞性リンパ腫、白血病、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される、請求項１２７に記載の方法。
130. 請求項１から７２の何れか一項に記載の細胞の有効量を含む組成物。
131. 組成物が、薬学的に許容される添加物を更に含む薬学的組成物である、請求項１３０に記載の組成物。
132. 組成物が、がんの治療のために治療を必要とする患者に投与される、請求項１３０又は１３１に記載の薬学的組成物。
133. 組成物が凍結保存剤を含む、請求項１３０から１３２の何れか一項に記載の組成物。
134. 組成物が血清アルブミンを含む、請求項１３０から１３３の何れか一項に記載の組成物。
135. 組成物が、Ｐｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ、ＨＳＡ、及びＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０を含む、請求項１３０から１３４の何れか一項に記載の組成物。
136. 請求項１から７２の何れか一項に記載の細胞、請求項７３から１２４の何れか一項に記載の方法を実施するための試薬、又は請求項１３０から１３５の何れか一項に記載の組成物を含むキット。
137. キットが、がんを治療するための書面による説明書を更に含む、請求項１３６に記載のキット。

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