JP2022528938A

JP2022528938A - Ｆｇｆｒの決定に基づいて試料を分類する方法

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Publication number: JP2022528938A
Application number: JP2021559984A
Authority: JP
Inventors: ラルフマルクスヴィルツ; フィリップエルベン; ロベルトシュテール; マルクスエックシュタイン
Original assignee: Stratifyer Molecular Pathology GmbH
Current assignee: Stratifyer Molecular Pathology GmbH
Priority date: 2019-04-12
Filing date: 2020-04-14
Publication date: 2022-06-16
Also published as: US20220145403A1; CN114450591A; EP3953713A1; WO2020208260A1

Abstract

本発明は、尿路上皮がんまたは膀胱がんを発症しているか、または発症する危険性がある患者の試料を分類する方法に関するものであり、前記方法は、ａ）前記患者からの試料において、ＦＧＦＲ遺伝子の変化の有無、および／またはＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ４からなる群から選択される受容体をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定する工程、およびｂ）工程の結果から前記患者の試料を少なくとも２つの分類の１つに分類する工程を含む方法に関する。（図６）

Description

本出願は、分子診断の分野に関する。

尿路上皮がん（ＵＣ）は、世界中で最も一般的な１０種類の悪性腫瘍の１つであり、新規症例数はほぼ３８６０００例、死亡数はほぼ１５０２００例であり、高い再発率と進行率を特徴とする。数十年間、転移性ＵＣに対する唯一の治療レジメンはプラチナ製剤ベースの化学療法であり、標準化学療法レジメンに失敗した患者の５年全生存率が１５％以下と不良であり、予後もきわめて不良である。

免疫療法は、抗がん治療の新たな概念を表している。特に、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１を標的とする抗体は、例えば、免疫原性が高い腫瘍と考えられる転移性黒色腫患者において、驚くべき治療成功をもたらした。さらに、ニボルマブのような抗体は、全身進行性非小細胞肺がんおよび腎細胞がんの治療に使用され、成功を収めている。非小細胞肺がんや黒色腫のように、変異負荷の高い腫瘍型では、これらの治療法の奏功はとくに説得力がある。

ＵＣは体変異率が最も高いがん腫であり、そのためネオアンチゲンが増加していることから免疫原性の高い腫瘍と考えられている。この２年間に、治療応答性に関する有望な結果を示したいくつかの研究が発表された。一方、いくつかの研究では、免疫組織化学的染色によって判定したＰＤ－Ｌ１発現とは無関係であるという有益性が示された。その後の研究で、ＰＤ－Ｌ１発現状態依存性応答（アテゾリズマブ、ペムブロリズマブ）が示された。

現在、腫瘍浸潤性免疫細胞（ＩＣ）のＰＤ‐Ｌ１染色は、潜在的な治療応答者のサブセットのみを検出するようであるが、そのすべてではない。遺伝子発現研究から、管腔Ｉ腫瘍を有する患者ではアテゾリズマブの方が有益性が低いことが示唆されており、ＦＧＦＲ３変異が濃縮されている可能性がある。異常なＦＧＦＲシグナル伝達は、血管新生をサポートすることだけでなく、がん細胞の増殖と生存を直接的に促すことによって腫瘍の発生を促進することができる。

進行期の筋層浸潤性膀胱がん（病期≧Ｔ２）では、患者の５％～２０％がＦＧＦＲ３がん遺伝子に点変異を有し、４０％がＦＧＦＲ３タンパク質の発現をアップレギュレートしている。ＦＧＦＲ３は上部尿路ＵＣでも一般的に変化し、膀胱のＵＣよりも高悪性度上部尿路ＵＣでより一般的に変化する（３５．６％対２１．６％，Ｐ＝０．０６５）。ＦＧＦＲ変異状態、免疫浸潤、ＰＤＬ１などの免疫療法標的の発現と免疫療法アプローチに対する応答性との相互作用はほとんど知られていないが、エルダフィチニブなどのＦＧＦＲ阻害剤に関して相乗的または補完的治療選択肢の可能性を秘めている。

研究範囲
進行性尿路上皮がん患者における抗ＰＤ－１および抗ＰＤ－Ｌ１治療結果に対するＦＧＦＲ３変異およびＦＧＦＲ２・ＦＧＦＲ３遺伝子融合の予測値を評価するための調査を実施した。予後の関連性は、ＦＧＦＲ発現、分子サブタイプおよびＰＤ１／ＰＤＬ１状態との関連でさらに評価した。

したがって、化学療法および／または免疫腫瘍学的治療において予後不良であるＵＣ患者を同定することは、本発明の１つの目的である。

ＦＧＦＲ阻害剤から恩恵を受ける可能性のあるそれらのＵＣ患者を同定することは、本発明のさらなる目的の１つである。

これらおよび他の目的は、独立した請求項に記載の方法および手段によって達成される。従属請求項は、具体的な実施形態に関連する。

本発明は、尿路上皮がんまたは膀胱がんに罹患しているか、または発症するリスクがある患者の試料を分類する方法を提供する。ａ）前記患者からの試料において、ＦＧＦＲ遺伝子における変化の有無を決定する工程、および／またはＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ４からなる群より選択される受容体をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定する工程、およびｂ）工程の結果から前記患者の試料を少なくとも２つの分類の１つに分類する工程を含む方法。

男女の患者（Ａ）とＰＤ１阻害剤（ニボルマブ／ペムブロリズマブ）を投与した患者とＰＤＬ１阻害剤（アテゾリズマブ）を投与した患者を比較した（Ｂ）全生存期間のカプランマイヤー分析。抗ＰＤ１治療群と抗ＰＤＬ１免疫治療群を比較した結果、これらの患者群で有意な生存期間の差異は認められなかった。

原発性腫瘍組織コホートにおけるＦＧＦＲ２ｍＲＮＡ高発現および低発現の患者を比較したＩＯ治療後の疾患特異的生存率（ＤＳＳ）のカプランマイヤー分析。

全コホート（転移を含む）におけるＦＧＦＲ２ｍＲＮＡ高発現および低発現の患者を比較したＩＯ治療後の疾患特異的生存率（ＤＳＳ）のカプランマイヤー分析。

ＩＯ治療後の原発腫瘍組織コホートにおける疾患特異的生存率（ＤＳＳ）のカプランマイヤー分析であって、ＦＧＦＲ変化状態で層別化した（１）ＦＧＦＲ２ｍＲＮＡ発現が高値であった患者と、（２）ＦＧＦＲ２ｍＲＮＡ発現が低値であった患者を比較したもの。（２ａ：ＦＧＦＲ変化を伴わない低ＦＧＦＲ２ｍＲＮＡ発現、２ｂ：ＦＧＦＲ変化を伴う低ＦＧＦＲ２ｍＲＮＡ発現）。

ＩＯ治療後の全コホート（転移を含む）における疾患特異的生存率（ＤＳＳ）のカプランマイヤー分析であって、ＦＧＦＲ変化状態で層別化した（１）ＦＧＦＲ２ｍＲＮＡ発現が高値の患者と（２）ＦＧＦＲ２ｍＲＮＡ発現が低値の患者（２ａ：ＦＧＦＲ変化を伴わない低ＦＧＦＲ２ｍＲＮＡ発現、２ｂ：ＦＧＦＲ変化を伴う低ＦＧＦＲ２ｍＲＮＡ発現）を比較したもの。

ＩＯ治療後の原発腫瘍組織コホートにおける疾患特異的生存率（ＤＳＳ）のカプランマイヤー分析であって、ＦＧＦＲ３ｍＲＮＡレベルで層別化した、ＦＧＦＲ２ｍＲＮＡ発現が高値の患者と、ＦＧＦＲ２ｍＲＮＡが低値の患者を比較したもの。

カプランマイヤー法による疾患特異的生存率（ＤＳＳ）の分析であって、ＩＯ治療後の全コホート（転移を含む）を、ＦＧＦＲ３ｍＲＮＡレベルで層別化した、ＦＧＦＲ２ｍＲＮＡ発現が高値（２９患者）の患者とＦＧＦＲ２ｍＲＮＡの発現が低値の患者を比較したもの。ＦＧＦＲ２ｍＲＮＡ低発現およびＦＧＦＲ３ｍＲＮＡ低発現（患者１０人）。ＦＧＦＲ２ｍＲＮＡ低発現およびＦＧＦＲ３ｍＲＮＡ高発現（患者２６人）

［図８］ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３再構成の構造。ＦＧＦＲ３およびＴＡＣＣ３遺伝子座のゲノム構成（上）報告されたＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３バリアントでは、ゲノム再編成により、ＦＧＦＲ３遺伝子のエクソン１７およびイントロン１７のごく一部とＴＡＣＣ３遺伝子のイントロン１０の近接が引き起こされ、接合ｍＲＮＡのサンガー配列が示すように、ＦＧＦＲ３のエクソン１７とＴＡＣＣ３のエクソン１１のインフレーム融合が引き起こされる。この融合構造は、同定された最も頻度の高いｍＲＮＡ融合バリアントの１つである。箱は、ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３のＲＴ－ＰＣＲスクリーニングアッセイに用いられる診断用プライマーの位置を示す。ＦＧＦＲ３‐ＴＡＣＣ３の構造は必ずＦＧＦＲ３のＴＫドメインとＴＡＣＣ３のコイルドコイルドメインを含む。ＦＧＦＲ３のキナーゼドメインはエクソン１２～１８にある。図８は、以下で議論するプライマー組合せをさらに示している。検出に用いるプローブは図８には示していない。列Ａは、ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合構築物の存在を検出し、定量することができるプライマー組合せを示す。列Ｂは、ＦＧＦＲ３のＣ末端の存在または不在（破線）、およびＦＧＦＲ３のＮ末端の存在を検出することによって、野生型ＦＧＦＲ３対ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合構築物を検出および定量するために用いることができるプライマー組合せを示す。ＦＧＦＲ３のＣ末端はＦＧＦＲ３野生型にのみ存在し、融合構築物には欠けている。列Ｃは、ＴＡＣＣ３のＣ末端の存在およびＴＡＣＣ３のＮ末端の有無（破線）を検出することにより、野生型ＴＡＣＣ３対ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合構築物を検出および定量するために使用できるプライマー組合せを示す。ＴＡＣＣ３のＮ末端はＴＡＣＣ３野生型にのみ存在し、融合構築物では欠損している。列Ｄは、ＦＧＦＲ３のエクソン１６（ＦＧＦＲ３野生型並びに融合構築物中に存在する）の存在、及びＦＧＦＲ３のエクソン１８（ＦＧＦＲ３野生型に存在するが融合構築物中には欠損している）の有無（破線）を検出することにより、野生型ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合構築物の検出及び定量に使用可能なプライマー組合せを示す。
次の表は、再度プライマー組合せを示している。

［図９］図８の列Ｃに記載のプライマーを用いた発現試験の結果。使用したプライマー組合せは、既知の融合遺伝子に保持または欠失され、したがって過剰発現され得るＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３の３’－配列を標的とするＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを検出することにより、野生型ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合構築物を検出および定量することが可能である。ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３の定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（登録商標）ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲシステム（米国アプライドバイオシステムズ（登録商標））のＴａｑＭａｎ（登録商標）ｆａｓｔａｄｖａｎｃｅｄｍａｓｔｅｒｍｉｘ（米国アプライドバイオシステムズ（登録商標））を用いて実施された。ＦＦＰＥ組織試料からのＲＮＡのｃＤＮＡ合成は、調査した各遺伝子に特異的なリバースプライマーを有するＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（登録商標）ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）を用いて実施した。確認されたＦＧＦＲ融合を有する細胞株および試料（例えば、ＲＴ４．ＲＴ１１２およびＰｔ１～Ｐｔ４）は、区切点から標的配列５’のｍＲＮＡ発現が上昇すること、融合区切点の標的配列３’のｍＲＮＡ発現が減少することは、区切点前後の個々のＦＧＦＲｍＲＮＡ発現の相対的な不均衡である。ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合の特異的ＰＣＲを用いて差異（１ＣＴ以上）および高いＦＧＦＲ３および－２発現を示す試料を分析し、次世代シークエンシングおよび増幅プライマーを用いた双方向サンガーシークエンシングによりさらに検証した。
ａ）ＦＧＦＲ３のエクソン１６の存在（ＦＧＦＲ３野生型および融合産物に存在する）
ｂ）ＦＧＦＲ３のエクソン１８の有無（ＦＧＦＲ３野生型に存在するが融合産物には存在しない）。
両エクソンの発現が類似している試料は、ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣＣ３の遺伝子再編成、または融合を示さず、一方、エクソン１６とエクソン１８の発現の不均衡（例えば、エクソン１６の発現が１８よりも高い）を有する試料は、ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣＣ３のそのような遺伝子再編成、または融合を示す。

［図１０］図８の列Ｃに従ったプライマーを用いて行った発現試験結果のさらなる分析。
Ａ）全コホートのＦＧＦＲ３エクソン１６およびエクソン１８レベルの相対ｍＲＮＡ発現レベル赤い四角で示された患者は、ＦＧＦＲ３の遺伝子融合を有する尿路上皮がん患者に由来し、一方、ＦＧＦ受容体遺伝子融合を有さない患者は、三角形の黒い丸で囲まれたもの（ｆｉｌｌｅｄｂｌａｃｋｃｉｒｃｌｅｓｏｆｔｒｉａｎｇｌｅｓ）で示されている。ＦＧＦＲ遺伝子融合を有する患者は比較的高いエクソン１６を示すが、エクソン１８のｍＲＮＡ発現は中間であった。
Ｂ）エクソン１６発現からエクソン１８の相対的ｍＲＮＡ発現を差し引いて（すなわち、（（４０－ＤＣＴＦＧＦＲ３エクソン１６）－（４０－ＤＣＴＦＧＦＲ３エクソン１８））、遺伝子比を構築すると、特にＦＧＦＲ３遺伝子融合を含む腫瘍で有意に高い遺伝子比（＞ＤＤＣＴ２）が明らかになった。対照的に、ＦＧＦＲ３遺伝子融合のない患者は、ＦＧＦＲ３エクソン１６とＦＧＦＲ３エクソン１８の両方のバランスのとれた発現を示す、より低い遺伝子比率（～ＤＤＣＴ０）を示した。

［図１１］研究における患者コホートと試料の選択を記述したフローチャート。

［図１２］本願が言及するエクソンを有するＴＡＣＣ３の遺伝子構造を示す。

［図１３］本願が言及するエクソンを有するＦＧＦＲ３の遺伝子構造を示す。

［図１４］（Ａ）ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合タンパク質の様々なバリアント、ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合特異的ＲＴ－ＰＣＲアンプリコンのアガロースゲル分離を示す。（Ｂ）ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合特異的ＲＴ－ＰＣＲ産物のサンガー配列決定クロマトグラム。矢印は２つの遺伝子の分解点を示す。Ｋｕｒｏｂｅら（２０１６）より引用、その内容は参照により本明細書に援用される。

発明の詳細な説明

本発明を詳細に説明する前に、本発明は説明されたデバイスの特定の構成要素部分に限定されず、あるいはそのようなデバイスおよび方法は変化する可能性があるので、説明された方法のプロセス工程に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、限定することを意図したものではないことも理解されたい。明細書および添付の請求項において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は文脈が明確に別途指示しない限り、単数形および／または複数形の参照を含むことに留意されたい。さらに、数値によって区切られるパラメータ範囲が与えられる場合、その範囲は、これらの限界値を含むものとみなされることを理解されたい。

さらに、本明細書に開示される実施形態は、互いに関連しない個々の実施形態として理解されることを意味しないことを理解されたい。一実施形態で議論される特徴は、本明細書に示される他の実施形態に関連しても開示されることを意味する。１つの場合において、特定の特徴が１つの実施形態で開示されず、別の実施形態で開示される場合、当業者は、前記特徴が前記他の実施形態で開示されることを意味しないことを必ずしも意味しないことを理解するのであろう。当業者であれば、他の実施形態についても前記特徴を開示することが本出願の主旨であるが、単に明瞭にするため、及び本明細書を管理可能な量に維持するために、これが行われていないことを理解されよう。

さらに、本明細書で参照される先行技術文献の内容は、参照により援用される。これは、特に、標準的または通常方法を開示する先行技術文献を指す。その場合、参照による援用は、十分に実施可能な開示を可能にし、長い反復を避ける目的がある。

本発明の第１の態様によれば、尿路上皮がんまたは膀胱がんに罹患しているか、または発症するリスクがある患者の試料を分類する方法が提供され、その方法は以下の工程を含む：
ａ）前記患者由来の前記試料において、以下を決定する工程
・ＦＧＦＲ遺伝子の変化の有無、および／または
・ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ４からなる群より選択される受容体をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現レベル、および
ｂ）工程ａ）の結果から前記患者の試料を少なくとも２つの分類の１つに分類する工程。

線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）は、その名称が示すように、タンパク質の線維芽細胞増殖因子ファミリーの一員に結合する受容体である。線維芽細胞の増殖因子受容体は、３つの免疫グロブリン様ドメイン、１つの膜貫通へリックスドメイン、チロシンキナーゼ活性をもつ細胞内ドメインからなる細胞外リガンドドメインからなる。これらの受容体は、２２の構成員からなる最大の増殖因子リガンドファミリーの一員である線維芽細胞増殖因子と結合する。

ＦＧＦＲは、３つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン（Ｄ１‐Ｄ３）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、および２つの細胞内チロシンキナーゼドメイン（ＴＫ１およびＴＫ２）を含むいくつかのドメインを有する～８００アミノ酸の受容体チロシンキナーゼである。

４つの線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）遺伝子の天然交互スプライシングにより、ＦＧＦＲの４８以上の異なったアイソフォームが産生される。これらのアイソフォームはリガンド結合特性やキナーゼドメインが異なる。

３種類の免疫グロビン（Ｉｇ）様ドメインは、Ｄ１とＤ２の間にある一連の酸性アミノ酸（「アシッドボックス」）を提示する。この「アシッドボックス」は、ＦＧＦＲへのＦＧＦ結合の調節に関与することができる。ＦＧＦ結合には免疫グロブリン様ドメインＤ２とＤ３で充分である。それぞれの受容体はいくつかのＦＧＦによって活性化される。多くの場合、ＦＧＦ自身も複数の受容体（すなわち、７つの主要なＦＧＦＲすべてに結合するＦＧＦ１）を活性化することができる。しかしながら、ＦＧＦ７は、ＦＧＦＲ２のみを活性化することができ、ＦＧＦ１８はＦＧＦＲ３を活性化することが最近示された。

これまでのところ、脊椎動物では、それぞれのｍＲＮＡ配列とともに表１に示した以下のＦＧＦＲが同定されており、そのすべてがチロシンキナーゼスーパーファミリー（ＦＧＦＲ１からＦＧＦＲ４）に属している。当業者は、従来の知見と併せて、本明細書に記載された開示に基づいて、これらの遺伝子のいずれかの発現を同定し、定量するのに適したプライマー組合せ（任意にプローブを用いる）を選択することができることに注意すべきである。

一般的に、「尿路上皮がん」と「膀胱がん」という用語は、範囲が重複しており、互換的に使われることもある。一般的には、「尿路上皮がん」という用語が一般的な定義として用いられ、「膀胱がん」は一定の種類の尿路上皮がんを決定するために用いられることがある。「尿路上皮がん」という用語を尿管内のがんを指すために用い、「膀胱がん」を膀胱内のがんをために用いる場合がある。

一実施形態では、その発現レベルが決定される２つの遺伝子はＦＧＦＲ２とＦＧＦＲ３である。

本明細書中で使用される用語「ＦＧＦＲ遺伝子における変化」は、特に、ＦＧＦＲ３遺伝子が、例えば変異または融合によって変化した試料に関する。一実施形態において、その変化が決定される遺伝子はＦＧＦＲ３である。

ＦＧＦＲ３遺伝子の典型的な変化は、ＴＡＣＣ３との融合である。

本発明の１以上の実施形態によれば、工程ａ）の結果から患者の試料を少なくとも２つの分類の１つに分類する工程ｂ）が、以下のいずれかに分類することを含む：
（ｉ）抗がん剤による治療について良好な予後、または
（ｉｉ）抗がん剤による治療について不良な予後。

本発明の１つ以上の実施形態によれば、工程ｂ）の分類に基づいて治療の方法が選択され、治療の方法が以下のいずれかから選択される：
（ｉ）抗がん剤による治療について良好な予後の場合には、抗がん剤の投与、または
（ｉｉ）抗がん剤による治療について不良な予後の場合には、ＦＧＦＲ阻害剤の投与。

本発明の１以上の実施形態によると、前記発現レベルは、以下の少なくとも１つにより決定される：
（ｉ）標識された一本鎖プローブを用いるハイブリダイゼーションに基づく方法、
（ｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むＰＣＲに基づく方法、
（ｉｉｉ）検出可能なシグナルを生成するために分子が結合する電極システムを包含する、特定の分子の電気化学的検出に基づく方法。
（ｉｖ）マイクロアレイおよび／またはバイオチップの使用を含むアレイに基づく方法
（ｖ）１つ以上の標的特異的タンパク質バインダーを用いる免疫学的方法。

本明細書中で使用される用語「ＰＣＲに基づく方法」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む方法を指す。これは、生きている生物を用いずに、酵素的複製を経て、ＤＮＡやＲＮＡのように核酸分子を指数関数的に増幅するためのアプローチである。ＰＣＲはｉｎｖｉｔｒｏな技術であるため、ＤＮＡの形成に制約を加えずに行うことができ、広範囲に遺伝子操作を行うように広範囲に改変することができる。発現レベルの決定に際しては、例えば、（１）逆転写酵素の助けを借りて完全なｍＲＮＡプール（いわゆるトランスクリプトーム）をｃＤＮＡに逆転写し、（２）それぞれのプライマーの助けを借りて所定のｃＤＮＡの存在を検出することによって、所定のｍＲＮＡの存在を検出するために、ＰＣＲに基づく方法を用いることができる。このアプローチは一般に逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）として知られている。さらに、ＰＣＲに基づく方法は、例えばリアルタイムＰＣＲを含み、特に発現レベル、動力学的または定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の分析に適している。

用語「定量的リアルタイムＰＣＲ」（ｑＰＣＲ）は、試料中の鋳型の定量を可能にするあらゆる種類のＰＣＲ法をいう。定量的リアルタイムＰＣＲは、例えばＴａｑＭａｎ技術またはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ技術のような性能または生成物検出の異なる技術を含む。例えば、ＴａｑＭａｎ技術は、二重標識蛍光発生プローブを使用する。ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲは、従来のＰＣＲエンドポイントではなく、ＰＣＲの指数関数的段階の間のフルオロフォアを介した生成物の蓄積を測定する。生成物の指数関数的増加は、閾値サイクルＣＴ、すなわち、蛍光の有意な指数関数的増加が検出され、かつ反応中に存在するＤＮＡ鋳型のコピー数と直接相関するＰＣＲサイクルの数を決定するために使用される。反応の設定は従来のＰＣＲと非常に似ているが、ＰＣＲチューブ内の蛍光分子の測定が可能なリアルタイム熱サイクル装置で行われる。通常のＰＣＲとは異なり、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲでは、プローブを反応に加える。すなわち、ＤＮＡ鋳型内の２０～６０ヌクレオチドの断片に相補的で、２つのプライマーの間に位置する一本鎖オリゴヌクレオチドである。蛍光レポーターまたはフルオロフォア（例えば、６－カルボキシフルオレセイン、頭文字：ＦＡＭ、またはテトラクロロフルオレシン、頭文字：ＴＥＴ）およびクエンチャー（例えば、テトラメチルローダミン、頭文字：ＴＡＭＲＡ、ジヒドロシクロピロロインドールトリペプチド「副溝バインダー」、頭文字：ＭＧＢ）は、それぞれプローブの５’末端および３’末端に共有結合している［２］。プローブに付着したフルオロフォアとクエンチャーが近接すると、フルオロフォアからの蛍光が阻害される。ＰＣＲの過程で、ＤＮＡ合成が始まると、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性が、鋳型にアニールしたプローブの割合（したがって、その名前はＴａｑポリメラーゼ＋ＰａｃＭａｎ）を分解する。プローブが分解されるとフルオロフォアがそこから離れ、クエンチャーに近接して壊れるので、消光作用が解消されてフルオロフォアの蛍光が出る。したがって、リアルタイムＰＣＲサーマルサイクラーで検出される蛍光は、放出されるフルオロフォアおよびＰＣＲに存在するＤＮＡ鋳型の量に正比例する。

本明細書の「マイクロアレイ」はまた、「バイオチップ」または「生物学的チップ」を意味する。少なくとも約１００／ｃｍ²の、好ましくは少なくとも約１０００／ｃｍ²の不連続な領域の密度を有する領域のアレイ。マイクロアレイ中の領域は、約１０～２５０μｍの範囲で直径などの典型的な寸法を有し、アレイ中の他の領域とほぼ同じ距離だけ隔てられている。

本明細書中で使用される用語「ハイブリダイゼーションに基づく方法」とは、相補的な一本鎖核酸またはヌクレオチドアナログを一本の二本鎖分子に結合させるプロセスを付与する方法を指す。ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、正常条件下ではその相補体に結合することになるので、２本の完全に相補的な鎖が互いに容易に結合することになる。バイオアナリシスでは、非常に多くの場合、相補的な標的配列を見つけるために、標識された一本鎖プローブが用いられる。このような配列が試料中に存在する場合、プローブは前記配列とハイブリダイズし、その配列はその標識のために検出することができる。他のハイブリダイゼーションに基づく方法は、マイクロアレイおよび／またはバイオチップ法を含む。そこで、プローブを固相上に固定化し、それを次に試料に曝露する。試料中に相補的な核酸が存在する場合、これらはプローブにハイブリダイズし、したがって検出され得る。これらのアプローチは「アレイに基づく方法」としても知られている。さらにもう一つのハイブリダイゼーションに基づく方法は、ＰＣＲであり、これは上で説明した。発現レベルの決定に関しては、ハイブリダイゼーションに基づく方法を用いて、所定の遺伝子のｍＲＮＡの量を決定することができる。

「分子の電気化学的検出に基づく方法」という用語は、検出可能なシグナルの生成のもとに、分子、特にタンパク質、核酸、抗原、抗体などの生体分子が結合する電極系を利用する方法に関する。このような方法は、例えば、本発明の出願人によって提出されたＷＯ０２４２７５９、ＷＯ０２４１９９２およびＷＯ０２０９７４１３に開示されており、その内容は参照により本明細書に援用される。これらのディテクターは、例えばシリコンチップの結晶学的表面によって形成される平坦な表面を有する基板、及び例えばデジタル間電極又は２次元電極アレイの形をとることができる電気ディテクターを含む。これらの電極は、標的分子、例えば標的核酸分子に特異的に結合することができるプローブ分子、例えば核酸プローブを有する。プローブ分子はたとえばチオール－金結合によって固定化されている。この目的のために、プローブを、金表面を含む電極に結合するチオール基でその５’－または３’－末端で修飾する。これらの標的核酸分子は、例えば、西洋ワサビペルオキシディーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼのような酵素標識を有することができる。標的分子がプローブに結合した後、基質が付加される（例えば、α－ナフチルリン酸または３，３’５，５’－テトラメチルベンジジン、これは、特に酸化還元反応において、前記酵素によって変換される）。次に、前記反応の生成物、または電子の交換により前記反応で生成される電流を、部位特異的様式で電気ディテクターの助けを借りて検出することができる。

用語「免疫学的方法」とは、１つ以上の標的特異的タンパク質バインダーが使用される方法を意味する。このような方法には、ウエスタンブロット法（ＷＢ）、免疫組織化学法（ＩＨＣ）、免疫蛍光法（ＩＦ）、免疫細胞化学法（ＩＣＣ）およびＥＬＩＳＡがあり、いずれもルーチンの方法である。とりわけ上記の方法で使用されるのに適しているこのようなタンパク質バインダーは、例えば、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ４のいずれか、またはそれらの変化したバリアントに結合するポリ－またはモノクローナル抗体である。このような抗体は、通常の方法（免疫化／ハイブリドーマ）を用いた当業者によって生成することができ、通常の供給者からも得ることができる。次の表は、非限定的な例の一覧のみを示している：

本発明の１以上の実施形態によれば、ＦＧＦＲ遺伝子中の前記変化は、以下によって決定される
（ｉ）変化したＦＧＦＲバリアントの発現レベルの決定
（ｉｉ）少なくともその発現レベルの決定
・変化したＦＧＦＲバリアントに組み込まれるＦＧＦＲエクソン、および
・変化したＦＧＦＲバリアントに組み込まれないＦＧＦＲエクソン、
両者を比較し、
（ｉｉｉ）各々の変化を同定するための各々のＦＧＦＲ遺伝子の配列決定、および／または
（ｉｖ）ＳＮａＰｓｈｏｔ突然変異解析。

それぞれの方法は、当業者によく知られており、本明細書の他の箇所で議論する。

このような変化したＦＧＦＲバリアントは、ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合であることが好ましく、とりわけ、その内容が参照により本明細書に援用されるコスタら（２０１６）、またはその内容が参照により本明細書に援用されるＬａｓｏｒｅｌｌａら（２０１７）、またはその内容が参照により本明細書に援用されるＫｕｒｏｂｅら（２０１６）において開示される。

本発明の１以上の実施形態によれば、前記発現レベルは、以下の少なくとも１つのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲまたはｑＰＣＲ）によって決定される：
・ＦＧＦＲ野生型ｍＲＮＡ、および／または、
・変化したＦＧＦＲバリアントのｍＲＮＡ。

この目的のためには、適当なプライマー、および任意にプローブが必要であり、本明細書の他の箇所に開示する。このような手法では、ｍＲＮＡ転写産物をｃＤＮＡに逆転写し、次にそのｃＤＮＡをｑＰＣＲ反応における鋳型として用いて、遺伝子発現産物を検出し、定量する。

ＲＴ－ＰＣＲまたはｑＰＣＲでは、標的ＤＮＡ分子の増幅は、ＰＣＲの間、すなわち、リアルタイムでモニターされ、通常のＰＣＲのように、その最終段階ではモニターされない。リアルタイムＰＣＲは、定量的（定量的リアルタイムＰＣＲ）、および半定量的、すなわち、ＤＮＡ分子の一定量の上／下（半定量的リアルタイムＰＣＲ）に用いることができる。

リアルタイムＰＣＲにおけるＰＣＲ産物の検出のための２つの一般的な方法は：（１）任意の二本鎖ＤＮＡとインターカレートする非特異的蛍光色素、および（２）プローブとその相補的配列とのハイブリダイゼーション後にのみ検出を可能にする蛍光レポーターで標識されたオリゴヌクレオチドからなる配列特異的ＤＮＡプローブである。

ある遺伝子の発現レベルの１つの測定はＣｔ（「サイクル閾値」）である。Ｃｔは、蛍光シグナルが閾値を越える（すなわち、バックグラウンドレベルを越える）のに必要なサイクル数と定義される。Ｃｔレベルは試料中の標的ｍＲＮＡの量に逆比例する。すなわち、Ｃｔレベルが低いほど、試料中の標的ｍＲＮＡの量が多くなる。すなわち、それぞれの遺伝子発現レベルが高くなる。

本発明の１つ以上の実施形態によれば、この方法は、１つ以上の正規化発現レベルを得るために、工程ａ）で決定された１つ以上の発現レベルが、工程ｂ）以前に１つ以上の基準遺伝子の１つ以上の発現レベルで正規化されることを特徴とするという特徴を有する。
ＰＣＲにおける基準遺伝子は、ＫｏｚｅｒａおよびＲａｐａｃｚ（２０１３）で考察されており、その内容は参照により本明細書に援用される。

所定の遺伝子の発現レベルを正常化するためには、基準遺伝子との比較を行うことが望ましい。１つの実施形態では、ＦＧＦＲ（以下では標的遺伝子と呼ぶ）、好ましくはＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３の正規化遺伝子発現を以下の公式により算出する：
４０－（（Ｃｔ標的遺伝子）－（Ｃｔハウスキーパー））
本明細書中では「ΔＣＴ」とも呼ばれる。

本発明の１以上の実施形態によれば、本方法は、前記１以上の基準遺伝子が少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子であることを特徴とする。

本明細書で使用する「ハウスキーピング遺伝子」という用語は、基準遺伝子のより特殊な形態を指す。細胞機能の維持に必須な活性をもつタンパク質をコードする一群の遺伝子を指す。これらの遺伝子は、典型的にはすべての細胞種で同様に発現している。ハウスキーピング遺伝子には、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、Ｃｙｐｌ、アルブミン、アクチン、例えばβ－アクチン、チューブリン、シクロフィリン、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＲＰＴ）、Ｌ３２、２８Ｓ、および１８Ｓが含まれるが、これらに限定されない。

本発明の１以上の実施形態によれば、少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子は、次の表２に示すＣＡＬＭ２、Ｂ２Ｍおよび／またはＲＰＬ３７Ａからなる群より選択される。当業者は、従来の知見と併せて、本明細書に記載された開示に基づいて、これらの遺伝子のいずれかの発現を同定し、定量するのに適したプライマー組合せ（任意にプローブを用いる）を選択することができることに注意すべきである。

本発明の１以上の実施形態によると、ＫＲＴ５、ＥＲＢＢ２、ＫＲＴ２０、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、および／またはＴＡＣＣ３からなる群から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子の発現レベルが決定され、任意に正規化される。これらの遺伝子を次の表３に示す。

当業者は、従来の知見と併せて、本明細書に記載された開示に基づいて、これらの遺伝子のいずれかの発現を同定し、定量するのに適したプライマー組合せ（任意にプローブを用いる）を選択することができることに注意すべきである。

表に記載されているＮＣＢＩ参照は単なるサンプルであることに注意する。それぞれのｍＲＮＡの他のアイソフォームやバリアントが存在することもあり、それぞれのデータベースの当業者で簡単に見つけることができる。

本発明の１つ以上の実施形態によれば、本方法は、尿路上皮がんまたは膀胱がんがＴ２、Ｔ３またはＴ４期がんであることを特徴とする。
尿路上皮がんまたは膀胱がんは以下のように４つの病期に分類される：

Ｔ１：腫瘍は、膀胱の内壁とその下の筋肉を隔てている結合組織（粘膜固有層と呼ばれる）に拡がっているが、膀胱壁の筋層は侵されていない。
Ｔ２：腫瘍が膀胱壁の筋層まで拡がっている。
Ｔ３：腫瘍は膀胱周囲組織（膀胱を取り囲む脂肪組織）内に増殖している。
Ｔ４：腫瘍が以下のいずれかに拡がっている：腹壁、骨盤壁、男性の前立腺または精のう（精液を運ぶ管）、女性の子宮または腟。

本発明の１以上の実施形態によると、工程ｂ）における分類は、ＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ３の発現レベルに依存する。

好ましくは、工程ｂ）における分類は、それぞれＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３の発現レベル間の比率、またはそれらの正規化された発現レベルに依存する。したがって、このようなアプローチは遺伝子間不均衡の存在を明らかにするために用いられる。

１４．工程ｂ）の分類が、ＦＧＦＲ遺伝子、好ましくはＦＧＦＲ３遺伝子における変化の有無に依存する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

ＦＧＦＲ遺伝子、好ましくはＦＧＦＲ３遺伝子におけるそのような変化は、本明細書中で議論されるように、例えば、ＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との間の融合である。このような変化は遺伝子内不均衡をもたらす。このような変異は、ＦＧＦＲ３のキナーゼドメインの過剰活性につながる可能性があり、したがって、ＦＧＦＲ３の相対的過剰発現と同様の作用を有する可能性がある。

本明細書中で使用される場合、用語「アップレギュレートされた」は、所与の試料中の遺伝子の発現、すなわち、転写されたｍＲＮＡまたは翻訳されたタンパク質の量が多い状態に関する。１つの実施形態では、健康な患者または正常患者についての比較試料におけるその発現の少なくとも１．３倍である。

本明細書中で使用される場合、用語「過剰発現」は、所与の試料中の遺伝子の発現、すなわち、転写されたｍＲＮＡまたは翻訳されたタンパク質の量が多い状態に関する。１つの実施形態では、健康な患者または正常患者についての比較試料におけるその発現の少なくとも１．３倍である。

一実施形態では、ＦＧＦＲ２のΔＣＴが３５以上であれば、ＦＧＦＲ２はアップレギュレートまたは過剰発現しているとみなされる。

一実施形態では、ＦＧＦＲ３のΔＣＴが３３，９７以上であれば、ＦＧＦＲ３はアップレギュレートまたは過剰発現していると考えられる。

本明細書中で使用される場合、用語「ダウンレギュレートされた」は、所与の試料中の遺伝子の発現、すなわち、転写されたｍＲＮＡまたは翻訳されたタンパク質の量が低くなる条件に関する。１つの実施形態において、健康な患者または正常患者についての比較試料におけるそれの発現より少なくとも１．３倍低い。

本明細書中で使用される場合、用語「過少発現」は、所与の試料中の遺伝子の発現、すなわち、転写されたｍＲＮＡまたは翻訳されたタンパク質の量が低くなる条件に関する。１つの実施形態において、健康な患者または正常患者についての比較試料におけるそれの発現より少なくとも１．３倍低い。

一実施形態では、ΔＣＴが３５未満であれば、ＦＧＦＲ２はダウンレギュレートされているか、過少発現しているとみなされる。一実施形態では、ΔＣＴが３３，９７未満であれば、ＦＧＦＲ３はダウンレギュレートされているか、過少発現しているとみなされる。

本明細書中で使用される用語「ＦＧＦＲ遺伝子における変化」は、特に、ＦＧＦＲ３遺伝子が、例えば変異または融合によって変化した試料に関する。このような変異体は、例えば、ＦＧＦＲ３遺伝子のエクソン７、１０および１５に存在し得る。最も頻繁に観測される変異体の１つはエクソン７におけるＳ２４９Ｃである（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎｅｔａｌ．，２００７）。他の頻繁に観察されるＦＧＦＲ３の変化は、ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合であり、例えば、その内容が参照により本明細書に援用されるＣｏｓｔａら（２０１６）またはその内容が参照により本明細書に援用されるＬａｓｏｒｅｌｌａら（２０１７）に記載されている通りである。

一般的に、図に示されるように、以下のＦＧＦＲ状態は、（ｉ）免疫腫瘍薬のような抗がん剤、または（ｉｉ）ＦＧＦＲ阻害剤による治療に関して適切な予後予測能を提供するものとして決定されている。表４にいくつかの例を示す。

したがって、もしＦＧＦＲ２がアップレギュレートされるか、または過剰発現されるならば、それぞれの患者は、抗がん剤による治療について良好な予後を有する。したがって、選択されるべき治療様式は、免疫腫瘍薬のような抗がん剤である。

ＦＧＦＲ３がアップレギュレートまたは過剰発現している場合、選択すべき治療様式はＦＧＦＲ阻害剤である。同様に、ＦＧＦＲ２がダウンレギュレートまたは低発現であり、ＦＧＦＲ３が変化している場合、選択すべき治療様式はＦＧＦＲ阻害剤である。

もしＦＧＦＲ２とＦＧＦＲ３がダウンレギュレートされているか、低発現であるならば、それぞれの患者は抗がん剤による治療の予後が良好である。したがって、選択されるべき治療様式は、免疫腫瘍薬のような抗がん剤である。

特に、もしＦＧＦＲ３がダウンレギュレートされているか、あるいは低発現であるならば、これは免疫浸潤の増加につながる可能性があり、その結果、免疫チェックポイント阻害剤（後述参照）のような免疫腫瘍薬による治療が成功する可能性があることが示唆される。

本発明の１つ以上の実施形態によれば、試料は、工程ａ）における決定前の試料に含まれる核酸の精製のために、シリカコーティングされた磁気粒子およびカオトロピック塩で処理される。

本発明の１以上の実施形態によると、抗がん剤は少なくとも１つの化学療法剤を含む。

本発明の１以上の実施形態によると、抗がん剤は免疫チェックポイント阻害剤を含む。

チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイント、すなわちその作用を刺激または阻害する免疫系の重要な調節因子を標的とするがん免疫療法薬の一種である。腫瘍はこれらのチェックポイントを使って、免疫系による攻撃から身を守ることができる。チェックポイント治療は阻害チェックポイントを遮断し、免疫系の機能を回復させることができる。

本発明の１以上の実施形態によると、免疫チェックポイント阻害剤は、少なくとも以下からなる群より選択される１つである
・ＰＤ－１阻害剤、
・ＰＤ－Ｌ１阻害剤、
・ＣＴＬＡ－４阻害剤、
・ＬＡＧ３阻害剤、
・ＴＩＭ３阻害剤、および／または
・ＯＸ４０阻害剤。

本発明の１つ以上の実施形態によると、免疫チェックポイント阻害剤は、以下からなる群より選択される少なくとも１つである
・抗体、
・修飾された抗体フォーマット、
・標的結合特性を保持する抗体誘導体または断片、
・抗体ベースの結合タンパク質、
・オリゴペプチドバインダー、および／または
・抗体ミメティック。

「抗体」は、「免疫グロブリン」（Ｉｇ）とも呼ばれ、一般的に２本の重鎖（Ｈ）と２本の軽鎖（Ｌ）の４本のポリペプチド鎖から構成されており、そのため多量体であるタンパク質またはその同等のＩｇホモログ（例えば、重鎖のみで構成されているラクダ科のナノボディ、重鎖または軽鎖のいずれかに由来し得る単一ドメインの抗体（ｄＡｂ））；その全長機能性変異体、バリアント、または誘導体とアロタイプを含む（マウス、キメラ、ヒト化および完全ヒト抗体を含み、Ｉｇ分子の本質的なエピトープ結合特徴を保持し、二重特異性（dual specific）、二重特異性、多特異性、および二重可変ドメイン免疫グロブリンを含むが、これらに限定されない；免疫グロブリン分子は、任意のクラス（例：ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、またはサブクラス（例：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）のいずれかである。）

本明細書で使用される「抗体ベースの結合タンパク質」は、他の非免疫グロブリン、または非抗体由来の成分の状況において、少なくとも１つの抗体由来のＶＨ、ＶＬ、またはＣＨ免疫グロブリンドメインを含む任意のタンパク質を表すことができる。そのような抗体ベースのタンパク質には、（ｉ）免疫グロブリンＣＨドメインの全部または一部を持つ受容体または受容体成分を含む結合タンパク質のＦｃ融合タンパク質、（ｉｉ）ＶＨおよびまたはＶＬドメインが代替の分子足場に結合した結合タンパク質、または（ｉｉｉ）免疫グロブリンＶＨ、および／またはＶＬ、および／またはＣＨドメインが、天然に存在する抗体または抗体断片には通常見られない方法で結合および／または組み立てられた分子が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用する「抗体誘導体または断片」は、全長ではない抗体由来の少なくとも１つのポリペプチド鎖を含む分子に関するもので、以下のものが含まれるが、これらに限定されない。
（ｉ）可変軽鎖（Ｖ_L）、可変重鎖（Ｖ_H）、定常軽鎖（Ｃ_L）、定常重鎖１（Ｃ_H１）ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片；
（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦ_ab断片を含む２価の断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；
（ｉｉｉ）Ｖ_HおよびＣ_H１ドメインからなるＦ_ab（Ｆ_d）断片の重鎖の一部；
（ｉｖ）抗体のシングルアームのＶ_LおよびＶ_Hドメインからなる可変断片（Ｆ_v）断片、
（ｖ）単一の可変ドメインを含むドメイン抗体（ｄＡｂ）断片；
（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；
（ｖｉｉ）単鎖Ｆ_v断片（ｓｃＦ_v）；
（ｖｉｉｉ）Ｖ_HとＶ_Lのドメインが単一のポリペプチドの鎖で発現されるが、短すぎてその２つのドメインを同一鎖上でペアリングできないリンカーを使用し、それにより、ドメインは別の鎖の相補性ドメインとペアになり、２つの抗原結合部位が作成される、二価の二重特異性抗体であるダイアボディ；および
（ｉｘ）相補性軽鎖ポリペプチドと一緒になって１対の抗原結合領域を形成する１対のタンデムＦｖセグメント（Ｖ_H－Ｃ_H１－Ｖ_H－Ｃ_H１）を含む線状抗体；および
（ｘ）免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の他の非全長部分、またはそれらの変異体、バリアント、もしくは誘導体の単独または任意の組み合わせ。
いずれの場合でも、前記誘導体または断片は、標的結合特性を保持している。

本明細書で使用される用語「修飾された抗体フォーマット」は、抗体－薬物－コンジュゲート、ポリアルキレンオキシド修飾ｓｃＦｖ、モノボディ、ディアボディ、ラクダ抗体、ドメイン抗体、二重または三重特異性抗体、ＩｇＡ、またはｊ鎖で結合された２つのＩｇＧ構造と分泌成分、サメ抗体、新世界霊長類フレームワーク＋非新世界霊長類ＣＤＲ、ヒンジ領域を除去したＩｇＧ４抗体、ＣＨ３ドメインに２つの追加結合部位をエンジニアリングしたＩｇＧ、Ｆｃガンマ受容体への親和性を高めるためにＦｃ領域を変更した抗体、ＣＨ３＋ＶＬ＋ＶＨを含む二量体化コンストラクトなどを包含する。

本明細書中で使用される用語「抗体ミメティック」は、免疫グロブリンファミリーに属さないタンパク質を指し、およびアプタマー、または合成ポリマーのような非タンパク質でさえも指す。いくつかの種類は、抗体様ベータシート構造を有する。抗体に対する「抗体ミメティック」または「代替スカフォールド」の潜在的な利点は、より良好な溶解性、より高い組織移行、加熱および酵素に対するより高い安定性、および比較的低い生産コストである。

いくつかの抗体ミメティックは大きなライブラリーで提供することができ、考えられるすべての標的に対して特異的な結合候補を提供する。抗体と同様に、標的特異的抗体ミメティックは、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）技術のほか、ファージディスプレイ、バクテリアディスプレイ、イーストまたは哺乳動物ディスプレイのように、確立されたディスプレイ技術を用いることによって開発することができる。現在開発されている抗体ミメティックには、例えば、アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎと呼ばれる）、Ｃ型レクチン、黄色ブドウ球菌のＡ型ドメインタンパク質、トランスフェリン、リポカリン、フィブロネクチンの第１０のIII型ドメイン、クニツドメインプロテアーゼ阻害剤、ユビキチン由来バインダー（アフィリンと呼ばれる）、ガンマクリスタリン由来バインダー、システインノットまたはノッチン、チオレドキシンＡスカフォールドベースのバインダー、ＳＨ－３ドメイン、ストラドボディ、ジスルフィド結合およびＣａ２＋によって安定化された膜受容体の「Ａドメイン」、ＣＴＬＡ４ベースの化合物、ＦｙｎＳＨ３、およびアプタマー（特定標的分子に結合するペプチド分子）が包含される。

本発明の１以上の実施形態によれば、免疫チェックポイント阻害剤は、表５に記載の群から選択される少なくとも１つである。

ＦＧＦＲ阻害剤はＦＧＦＲシグナル伝達を阻害するため、腫瘍の生存に影響を及ぼす様式が異なっている。これらは、ヒトがん細胞におけるパクリタキセル、およびエトポシドのような通常の抗がん剤に対する腫瘍感受性の増大を可能にし、それにより抗アポトーシス能力を増加する。さらに、ＦＧＦシグナル伝達抑制は、血管再生を劇的に減少させ、がん、血管新生の特徴的所見の１つに打撃を与え、乳がんに対する一般的なＶＥＧＦＲ－２治療後のＦＧＦ２アップレギュレーションに基づく自己分泌ＦＧＦシグナル伝達に依存するヒト腫瘍の腫瘍負荷を減少させる。このような方法で、ＦＧＦＲ阻害剤は治療法と相乗的に作用し、将来の再発の潜在的経路を排除することにより、がんクローン再燃を遮断することができる。

さらに、ＥＧＦＲまたはＶＥＧＦＲを標的とした治療後にＦＧＦＲ活性化マイナーサブポピュレーションがクローン性に進化するため、ＦＧＦＲ阻害剤は再発腫瘍に効果的である可能性がある。ＦＧＦＲ阻害剤にはヒトがんの薬剤耐性を克服する作用機序が多岐にわたるため、ＦＧＦＲを標的とした治療は難治がん治療の有望なストラテジーである。

本発明の１以上の実施形態によると、ＦＧＦＲ阻害剤はＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤である。チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、チロシンキナーゼを阻害する薬剤である。チロシンキナーゼは、シグナル伝達カスケードによる多くのタンパク質の活性化を担う酵素である。通常、これらは膜貫通型受容体の細胞内部分を形成し、細胞外リガンドが結合すると活性化される。チロシンキナーゼは、ＴＫＩが阻害する工程であるタンパク質にリン酸基を付加する（リン酸化）ことによってタンパク質を活性化する。ＴＫＩは抗がん剤として用いられるのが一般的である。例えば、これらは慢性骨髄性白血病の治療結果を大幅に改善している。

本発明の１以上の実施形態によれば、ＦＧＦＲ阻害剤は、表６に記載の群から少なくとも１つ選択される。

本発明の別の態様によると、以下にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが提供される：
ａ）ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ４のいずれか１つ、または変化したＦＧＦＲ遺伝子をコードする核酸分子、または、
ｂ）ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ４のいずれか１つ、またはそのアイソフォーム、または変化したＦＧＦＲをコードするｍＲＮＡ。
前記オリゴヌクレオチドが、以下からなる群より選択される：
－増幅プライマー（フォワードおよび／またはリバース）、
－標識されたプローブ、および／または
－基質結合プローブ。

本発明の一以上の実施形態によれば、前記オリゴヌクレオチドは、上記記載の方法を実施するためのキットの製造用に提供される。

好ましくは、（ｉ）フォワード増幅プライマー、（ｉｉ）リバース増幅プライマーおよび（ｉｉｉ）プローブ（標識および／または基質結合）のセットを提供する。
任意に、上記に加えて、以下にハイブリダイズし得る少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが提供される：
ａ）基準遺伝子、またはハウスキーピング遺伝子をコードする核酸分子、または
ｂ）基準タンパク質、またはハウスキーピングタンパク質をコードするｍＲＮＡ。
上記オリゴヌクレオチドは、以下からなる群より選択される：
－増幅プライマー（フォワードおよび／またはリバース）、、
－標識されたプローブ、および／または
－基質結合プローブ。

好ましくは、（ｉ）フォワード増幅プライマー、（ｉｉ）リバース増幅プライマー、および（ｉｉｉ）プローブ（標識および／または基質結合）のセットをその目的のために提供する。好ましくは、基準遺伝子またはハウスキーピング遺伝子は、ＣＡＬＭ２、Ｂ２Ｍおよび／またはＲＰＬ３７Ａからなる群から選択される。

いくつかの適当なプライマー（フォワードおよび／またはリバース）およびプローブが本明細書の配列表に示されていることに注意すること。
本発明の１つ以上の実施形態によると、上記記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むキット。

本発明の１つ以上の実施形態によれば、キットは、上記のように、リバースプライマー、フォワードプライマーの少なくとも１つのセット、および任意にプローブを含む。

本発明の１以上の実施形態によれば、本キットは、以下を含む：
ａ）ＦＧＦＲ２をコードする核酸分子にハイブリダイズすることができるフォワード／リバースプライマーのセット、および任意に適当なプローブ、およびｂ）ＦＧＦＲ３をコードする核酸分子にハイブリダイズすることができるフォワード／リバースプライマーのセット、および任意に適当なプローブ。

このようなプライマーおよび任意にプローブの例を、配列表、配列番号２５～５７（ＦＧＦＲ２）および配列番号５８～７５（ＦＧＦＲ３）に示す。

本発明の教示、およびここに開示された配列情報、ならびにＦＧＦＲ２および３のゲノムおよびｍＲＮＡ配列を示す公開データベースに基づいて、当業者は、いかなる発明の活動なしに、同様に適切な改変プライマー及びプローブを見出すことができる。したがって、このような代替品は、本出願の範囲にも含まれるものとする。

本発明の１つ以上の実施形態によれば、このキットはさらに、ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合タンパク質の存在を検出することができるプライマーのセットを含む。
本発明の１以上の実施形態によれば、本キットは、以下を含む：
ａ）ＦＧＦＲ２をコードする核酸分子にハイブリダイズすることができるフォワードプライマー／リバースプライマーのセット、およびｂ）ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合タンパク質の存在を検出することができるプライマーのセット。

本発明の１以上の実施形態によれば、ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合タンパク質セットの存在を検出することができるプライマーのセットは、以下を含む：
ａ）ＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合部位からＮ末端に位置するＦＧＦＲ３エクソンの核酸分子にハイブリダイズできるフォワードプライマー、及びＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合部位からＣ末端に位置するＴＡＣＣ３エクソンの核酸分子にハイブリダイズできるリバースプライマー、
ｂ）ＦＧＦＲ３のＮ末端領域をコードする核酸分子にハイブリダイズできるフォワードプライマーと、ＦＧＦＲ３のＮ末端領域をコードする核酸分子にハイブリダイズできるリバースプライマーに加えて、ＦＧＦＲ３のＣ末端領域をコードする核酸分子にハイブリダイズできるフォワードプライマーと、ＦＧＦＲ３のＣ末端領域をコードする核酸分子にハイブリダイズすることができるリバースプライマー、
ｃ）ＴＡＣＣ３のＣ末端領域をコードする核酸分子とハイブリダイズすることができるフォワードプライマー、およびＴＡＣＣ３のＮ末端領域をコードする核酸分子とハイブリダイズすることができるリバースプライマー、ならびにＴＡＣＣ３のＮ末端領域をコードする核酸分子とハイブリダイズすることができるフォワードプライマー、および／またはＴＡＣＣ３のＮ末端領域をコードする核酸分子とハイブリダイズすることができるリバースプライマー、
ｄ）ＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合部位からＮ末端に位置するＦＧＦＲ３エクソンの核酸分子にハイブリダイズできるフォワードプライマー、及びＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合部位からＣ末端に位置するＦＧＦＲ３エクソンの核酸分子にハイブリダイズできるリバースプライマー。

選択肢ａ）は、定義されたＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合タンパク質の発現を測定するのに役立つ。

選択肢ｂ）は、ＦＧＦＲ３Ｎ末端とＣ末端の発現間のデルタを測定するのに役立つ。ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合体が存在する場合、ＦＧＦＲ３のＣ末端の発現はＦＧＦＲ３のＮ末端の発現よりも小さいはずである。この実施形態により、様々なＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合タンパク質バリアントを測定することができる。

選択肢ｃ）は、ＴＡＣＣ３のＮ末端とＣ末端の発現間のデルタを測定するのに役立つ。ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合体が存在する場合、ＴＡＣＣ３Ｃ末端の発現はＴＡＣＣ３Ｎ末端の発現よりも高く、この実施形態を用いて、異なったＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合タンパク質バリアントを測定することができる。

選択肢ｄ）は、ＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３の融合部位からＮ末端に位置するＦＧＦＲ３エクソンと、ＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３の融合部位からＣ末端に位置するＦＧＦＲ３エクソンとの間の発現のデルタを測定するのに役立つ。ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合体が存在する場合、Ｎ末端に位置するＦＧＦＲ３エクソンの発現は、Ｃ末端に位置するＦＧＦＲ３の発現よりも高くなければならない。

選択肢ａ）～ｄ）は、図８Ａ～Ｄの実施形態に相当する。

ＴＡＣＣ３およびＦＧＦＲ３のエクソン構造を図１２および１３に開示する。ＴＡＣＣ３遺伝子は、２３．６ｋｂに及ぶ１６個の確認されたエクソンから構成されている。ＦＧＦＲ３遺伝子は１６．５Ｋｂに及ぶ１９個のエクソンから構成されており、そのうちヒトではエクソン１が知られていない。この情報に基づいて、当業者は、本発明の教示を読む場合に、プライマーおよび任意にプローブを設計することができる。

選択肢ａ）の１つの実施形態において、フォワードプライマーは、ＦＧＦＲ３のエクソン１－１８中の核酸分子にハイブリダイズすることが可能であり、リバースプライマーは、ＴＡＣＣ３のエクソン１１－１６中の核酸分子にハイブリダイズすることが可能である。

選択肢ａ）のこのようなプライマーおよび任意にのプローブの例を配列表、配列番号１４９および１５０に示す。

選択肢ｂ）のこのようなプライマーおよび任意にプローブの例を、配列表、配列番号１５３、１５４、１５７および１５８に示す。

選択肢ｃ）のこのようなプライマーおよび任意にプローブの例を、配列表、配列番号１５５、１５６、１５９および１６０に示す。

選択肢ｄ）の１つの実施形態において、ＦＧＦＲ３のエクソン１～１７の核酸分子にハイブリダイズすることができるフォワードプライマー、およびＦＧＦＲ３のエクソン１８またはそれ以上の核酸分子にハイブリダイズすることができるリバースプライマー。

選択肢ｄ）のこのようなプライマーおよび任意にプローブの例を配列表、配列番号１６１－１６６に示す。

他で考察されているように、ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合タンパク質は文献に記載されている。図８に示した１つの例では、融合はＮ－＞Ｃ配向で、ＦＧＦＲ３のエクソン１～１７とＴＡＣＣ３のエクソン１１～１６からなる。選択肢ａ）およびｄ）の好ましい実施形態として上記に示すプライマーキットは、このような融合構造の基礎の一つとして設計されている。しかしながら、融合構造が異なっている場合には、プライマーおよび任意にプローブを改変することができるか、または改変しなければならない。

本発明の教示、ならびにＦＧＦＲ３およびＴＡＣＣ３のゲノムおよびｍＲＮＡ配列を示す本明細書および公開データベース、ならびに代替ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合タンパク質の構造の公的利用可能性（図８および１４、ならびにクローベら（２０１６）を参照のこと。これらの内容は、参考により本明細書に援用される）に基づいて、当業者は、いずれの発明の活動無しに、同様に適切な情報プライマーおよびプローブを見出すことができる。したがって、このような代替品は、本出願の範囲にも含まれるものとする。

本発明の１以上の実施形態によると、本発明のキットは、以下を含むプライマー／プローブセットを含む：
ａ）表１に記載のフォワードプライマーとリバースプライマー、および任意にプローブ、ならびに表２に記載のフォワードプライマーとリバースプライマー、および任意にプローブ、
ｂ）ａ）のプライマーおよび任意にプローブ、および少なくとも表３に記載のフォワードプライマーおよびリバースプライマー、ならびに任意にプローブ、
ｃ）表１に記載のフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および任意にプローブ、ならびに表３に記載のフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および任意にプローブ。

任意に、前記キットは、基準遺伝子、またはハウスキーピング遺伝子を検出するためのリバースプライマー、フォワードプライマーのセット、および任意にプローブを含む。好ましくは、該遺伝子は、ＣＡＬＭ２、Ｂ２Ｍおよび／またはＲＰＬ３７Ａからなる群より選択される。

本明細書中で使用される用語「変化したＦＧＦＲ遺伝子」は、例えば、変異または融合によって変化したＦＧＦＲ３遺伝子に関する。このような変異体は、例えば、ＦＧＦＲ３遺伝子のエクソン７、１０および１５に存在し得る。最も頻繁に観測される変異体の１つはエクソン７におけるＳ２４９Ｃである（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎｅｔａｌ．，２００７）。他の頻繁に観察されるＦＧＦＲ３の変化は、例えばＣｏｓｔａＲｅｔａｌ．（２０１６）に記載されているように、ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合であり、その内容は、本明細書に参照により援用される。

本明細書中で使用される場合、用語「変化したＦＧＦＲ」は、そのような変化したＦＧＦＲ遺伝子に依存する遺伝子産物、すなわちタンパク質またはｍＲＮＡに関する。

本発明の１以上の実施形態によれば、該キットは、１以上の蛍光分子、発光分子、放射性分子、酵素分子および／または消光分子で標識される標識プローブを含む。

本発明の文脈で使用できるプローブの典型的なタイプの１つは、いわゆるＴａｑＭａｎプローブである。ＴａｑＭａｎプローブは、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に共有結合された蛍光体と、３’末端のクエンチャーから構成されている。いくつかの異なるフルオロフォア（例えば、６－カルボキシフルオレセイン、略語：ＦＡＭ、またはテトラクロロフルオレセイン、略語：ＴＥＴ）およびクエンチャー（例えば、テトラメチルローダミン、略語：ＴＡＭＲＡ）が利用可能である。クエンチャー分子は、Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を介してサイクラーの光源によって励起されたときにフルオロフォアによって放出される蛍光を消光する。フルオロフォアとクエンチャーが近接している限り、蛍光信号は消光により抑制される。ＴａｑＭａｎプローブは、特定のプライマーのセットによって増幅されたＤＮＡの領域内にアニールするように設計されている。（図とは異なり、プローブは一本鎖のＤＮＡに結合する）ＴａｑＭａｎプローブは、標的配列との結合親和性を高めるために、マイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）部位であるジヒドロシクロピロロインドールトリペプチド（ＤＰＩ３）とコンジュゲートさせることができる。ＭＧＢコンジュゲートプローブは、ファンダルワールス力の安定化が進むため、より高い融解温度（Ｔｍ）を持つ。Ｔａｑポリメラーゼがプライマーを伸長して新生鎖を合成すると（ここでも一本鎖の鋳型上であるが、図に示した方向とは逆の方向、すなわち相補鎖の３’から５’への方向である）、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にアニーリングしたプローブが分解される。プローブが分解されると、フルオロフォアがプローブから離れ、クエンチャーとの密着状態が解除されるため、クエンチング効果が解除され、フルオロフォアの蛍光が得られる。したがって、定量的ＰＣＲサーマルサイクラーで検出される蛍光は、ＰＣＲで放出されたフルオロフォアと存在するＤＮＡテンプレートの量に正比例する。

本発明の１以上の実施形態によれば、上記記載によるオリゴヌクレオチドまたはキットの使用は、尿路上皮がんまたは膀胱がんに罹患しているか、または発症するリスクがある患者の試料を少なくとも２つの分類の１つに分類する方法において提供される。

本発明は図面および前記の説明において詳細に図示および説明されてきたが、そのような図示および説明は例示または例示的であり、限定的ではないと考えられるべきであり、本発明は開示された実施形態に限定されない。開示される実施形態に対する他の変形形態は、図面、開示、及び添付の特許請求の範囲の研究から、請求される発明を実施する際に当業者によって理解され、実施され得る。特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、他の要素又はステップを排除するものではなく、不定冠詞「ａ（１つの）」又は「ａｎ（１つの）」は複数形を除外するものではない。特定の手段が相互に異なる従属請求項に列挙されているという単なる事実は、これらの手段の組み合わせを使用して利益を得ることができないことを示すものではない。特許請求の範囲のどの引用符号も、範囲を限定すると解釈するべきではない。

本明細書に開示される全てのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端まで示される；本明細書に開示される全ての核酸配列は、５’－＞３’で示される。

材料及び方法
解析した患者の病態と生存データ
本研究のために、７２のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）進行性尿路上皮がん試料を５つの病理学研究所から得た（２０１６年～２０１８年に収集）。すべての検体は、２０１０年のＴＮＭ分類に従って病理学的病期について再評価し、共通の悪性度分類システム（ＷＨＯ１９７４、ＡＨ、ＭＥ）に従って悪性度分類した。患者７２名（男５２名［７２％］、女２０名［２８％］）に免疫療法を施行し、患者４９名（６９％）にＰＤ１阻害剤（ニボルマブ、ペムブロリズマブ）、２２名（３１％）にＰＤＬ１阻害剤（アテゾリズマブ）を投与した。免疫療法開始後の追跡期間中央値は７．１か月（範囲：１～２５か月）であった。患者５０名（６９％）は膀胱に由来する腫瘍を有し、患者２２名（３１％）は上部尿路（尿管および／または腎盂）に腫瘍を有していた。組織病理学におけるＴＮＭ病期分類（膀胱摘除術、腎尿管摘除術、初診時）では、５２人の患者（７３％）がＴ３またはＴ４腫瘍を有していた。全身化学療法に関しては、患者４名（６％）が術前化学療法を受け、６７名（９４％）は術前化学療法を受けていない。補助療法の設定では、２０名（２８％）が補助化学療法を受け、５２名（７２％）の患者が補助化学療法を受けていない。病理組織学的データおよび外科手術を以下の表６に要約する。

［表６］

カプランマイヤー分析では、男女患者の全生存期間は同等であった（図２Ａ）。ＰＤ１阻害剤（ニボルマブ／ペムブロリズマブ）で治療した患者とＰＤＬ１阻害剤（アテゾリズマブ）で治療した患者を比較した場合も同じであった。再度、ＩＯ治療を受けた生存患者群で有意差は認められなかった。進行膀胱腫瘍および進行上部尿管腫瘍の患者を対象としたカプランマイヤー法による解析では、全生存率は同等であった（データーは示していない）。遠隔転移のある患者（ｎ＝１９）は、遠隔転移のない患者（ｎ＝４０；１２カ月後の生存確率５９．２％、ｐ＝０．００４８、（データは示していない））と比べて、全生存期間が有意に短かった（１２カ月後の生存確率２５．３％）。

ＳＮａＰＳｈｏｔ配列決定のためのＤＮＡ分離
自動化手順（ＰｒｏｍｅｇａＭａｘｗｅｌｌ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を用いてホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥ）からＤＮＡを単離した。通常、腫瘍含有量が５０％以上の１０μｍＦＦＰＥ切片５枚を１患者腫瘍当たり使用した。簡単に述べると、切片をキシロールで脱パラフィンし、ＲＮＡｓｅを含まないエタノール（１００％、９６％、７０％）を用いて再水和した。分画した腫瘍組織を３００μｌインキュベーション緩衝液（ＰＲＯＭＥＧＡ社）に懸濁し、８０℃でサーモシェーカー（３５０ｒｐｍ）上で１０分間プレインキュベートし、一晩５６℃（５５０ｒｐｍ）でプロテイナーゼＫ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）で処理した。次に、ＰｒｏｍｅｇａＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州、米国）を用いて溶解物からＤＮＡを単離した。

ＦＧＦＲ３－ＳＮａＰｓｈｏｔ突然変異解析
ＦＧＦＲ３変異解析は、前述のようにＳＮａＰｓｈｏｔＰＣＲにより実施した（ｖａｎＯｅｒｓ２００７を参照のこと、その内容は参照により本明細書に援用される）。要するに、膀胱がんに見出されるすべてのＦＧＦＲ３変異を含むＦＧＦＲ３遺伝子の３領域（その内容が参照により本明細書に援用されるｖａｎＲｈｉｊｎ２００２を参照のこと）を、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において同時に増幅した。過剰なプライマーおよびｄＮＴＰを除去した後、９つのＦＧＦＲ３変異を検出する８つのＳＮａＰｓｈｏｔプライマーをＰＣＲ産物にアニーリングし、標識ジデオキシヌクレオチドで伸長した。これらの伸長プライマーを自動シークエンサー上で分析し、取り込まれたヌクレオチド上に標識を付け、変異の有無を示した。すべての変異は、２回目の独立したＳＮａＰｓｈｏｔ分析によって検証した。

ＦＧＦＲ融合遺伝子スクリーニングと検証
一般的なＲＱ－ＰＣＲアッセイは、既知の融合遺伝子において保持または欠失され、したがって過剰発現され得るＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３の３’－配列を標的とし、前記のようにして確立された。（Ｅｒｂｅｎ２０１０）ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（登録商標）ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍ（米国アプライドバイオシステムズ（登録商標））のＴａｑＭａｎ（登録商標）ｆａｓｔａｄｖａｎｃｅｄｍａｓｔｅｒｍｉｘ（米国アプライドバイオシステムズ（登録商標））を用いて、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３の定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施した。ＦＦＰＥ組織試料からのＲＮＡのｃＤＮＡ合成は、調査した各遺伝子に特異的なリバースプライマーを有するＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（登録商標）ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）を用いて実施した。ｑＰＣＲには以下のプロトコルを用いた：９５℃で２０秒、その後９５℃で３秒あたり４０サイクル、６０℃で３０秒。Ａｌ測定は複製で行った。差異（１ＣＴより大）およびまたは高いＦＧＦＲ３および－２発現を示す試料を、ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合のための特異的ＰＣＲで分析し、次世代シークエンシングでさらに検証した。単一またはネステッドＰＣＲにおけるＦＧＦＲ３‐ＴＡＣＣ３融合遺伝子陽性試料のＰＣＲ産物を、増幅プライマーを用いた双方向サンガーシークエンシングにより確認した。

次世代シークエンシング
ＧＡＴＣＢｉｏｔｅｃｈ社のＦＦＰＥ試料から、ＡｇｉｌｅｎｔＳｕｒｅ選択技術を用いたハイブリダイゼーションに基づく標的捕獲次世代シークエンシングアプローチであるＩＮＶＩＥＷＯｎｃｏｐａｎｅｌＡｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ（Ｋｏｎｓｔａｎｚ、ドイツ）を用いて、関連する可能性のある遺伝的変化を分析した。パネルは、次世代イルミナプラットフォーム上の５９７のがん関連遺伝子（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｏｆｉｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｅｕ／ｅｎ／ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ／ｎｇｓ－ｂｕｉｌｔ－ｆｏｒ－ｙｏｕ／ｉｎｖｉｅｗ－ｐａｎｅｌ／ｉｎｖｉｅｗ－ｏｎｃｏｐａｎｅｌ－ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ／）のエクソンとプロモーター領域を網羅している。肉眼的に健康な尿路上皮組織をマクロ解剖し、コピー数分析の対照とした。核酸分子は、製造元の規格に従い、ビーズに基づくシステム（ＸＴＲＡＣＴキット、ＳＴＲＡＴＩＦＹＥＲＭｏｌｅｃｕｌａｒＰａｔｈｏｌｏｇｙＧｍｂＨ社、ドイツ）を用いて抽出し、塩基配列決定および遺伝子発現解析に用いた。

ｍＲＮＡ評価およびＲＴ－ｑＰＣＲによる定量のためのＦＦＰＥ組織からのＲＮＡ単離
ＲＮＡは１０μｍ切片を用いてＦＦＰＥ組織から抽出し、市販のビーズ抽出法（ＸＴＲＡＣＴキット；ＳＴＲＡＴＩＦＹＥＲＭｏｌｅｃｕｌａｒＰａｔｈｏｌｏｇｙＧｍｂＨ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により全自動処理した。ＲＮＡを１００μｌの溶出緩衝液で溶出し、ＲＮＡ溶出物を分析した。ＲＴ－ｑＰＣＲを、以前に記載したように遺伝子特異的ＴａｑＭａｎ（登録商標）に基づくアッセイを用いることにより（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ２０１８、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ２０１８、Ｗｏｒｓｔ２０１８）、ＦＧＦＲ１～４ｍＲＮＡの相対的定量化およびハウスキーピング遺伝子発現に適用した。それぞれの患者試料または対照を３回分析した。実験は、以下のプロトコールに従ってＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＬＣ４８０（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った：５０℃で５分間、９５℃で２０秒間、続いて９５℃で１５秒間、および６０℃で６０秒間の４０サイクル。４０回の増幅サイクルを適用し、３つのマーカーのサイクル定量化閾値（Ｃｔ）値および各試料についての１つの参照遺伝子を、３回の測定の平均として推定した。ハウスキーピング遺伝子のＣＴ値（ΔＣｔ）から標的遺伝子のＣＴ値を差し引いてΔＣＴ値を正規化し、これを行っているサイクル（例：４０サイクル）の内容に設定した。

統計解析
すべてのｐ値を両側で算出し、＜０．０５の値を有意であるとみなした。生存分析は単変量カプランマイヤー回帰により行い、Ｌｏｇ－Ｒａｎｋで有意性を検定した。試験の結果、有意レベルが０．０５未満であることが明らかになった場合、結果は有意であるとした。数値連続変数の統計解析はノンパラメトリック検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定）を行った。連続変数の相関解析はスピアマン順位相関を用いて行った。統計解析はすべてＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７．２（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ．、米国カリフォルニア州ラ・ジョラ）およびＪＭＰＳＡＳ１３．２（ＳＡＳ、米国ノースカロライナ州カロライナ州）により実施した。

患者コホート
多施設（ｎ＝５）で日常的に抗ＰＤ‐１／抗ＰＤ‐Ｌ１免疫腫瘍薬で治療された患者を１次、２次および３次治療の一部として同定し、原発性および転移性腫瘍組織選択のそれぞれの試料選択をもたらした。

プライマー・プローブセット
以下に、本発明を実施するための任意のプローブを有するＰＣＲプライマーセットを示す。当業者は、規定されていない場合、適当なプローブを選択することができることに留意すべきである。

配列
下記の配列は、本出願の開示の一部を形成する。ＷＩＰＯＳＴ２５互換性のある電子化配列表もまた、この出願と共に提供される。疑義を避けるため、以下の表中の配列と電子化配列表中の配列との間に齟齬が存在する場合、この表中の配列は正しいものとみなされるものとする。

Claims

尿路上皮がんまたは膀胱がんに罹患しているか、または発症するリスクがある患者の試料を分類する方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）前記患者由来の前記試料において、以下を決定する工程、
・ＦＧＦＲ遺伝子の変化の有無、および／または
・ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ４からなる群より選択される受容体をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現レベル、および
ｂ）工程ａ）の結果から前記患者の試料を少なくとも２つの分類の１つに分類する工程。
工程ａ）の結果から患者の試料を少なくとも２つの分類の１つに分類する工程ｂ）が、以下のいずれかに分類することを含む、請求項１に記載の方法。
（ｉ）抗がん剤による治療について良好な予後、または
（ｉｉ）抗がん剤による治療について不良な予後。
工程ｂ）の分類に基づいて治療の方法が選択され、治療の方法が以下のいずれかから選択される、請求項１または２に記載の方法。
（ｉ）抗がん剤による治療について良好な予後の場合には、抗がん剤の投与、または
（ｉｉ）抗がん剤による治療について不良な予後の場合には、ＦＧＦＲ阻害剤の投与。
前記発現レベルが、以下の少なくとも１つにより決定される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
（ｉ）標識された一本鎖プローブを用いるハイブリダイゼーションに基づく方法、
（ｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むＰＣＲに基づく方法、
（ｉｉｉ）検出可能なシグナルを生成するために分子が結合する電極システムを包含する、特定の分子の電気化学的検出に基づく方法、
（ｉｖ）マイクロアレイおよび／またはバイオチップの使用を含むアレイに基づく方法、
（ｖ）１つ以上の標的特異的タンパク質バインダーを用いる免疫学的方法。
ＦＧＦＲ遺伝子における前記変化が以下により決定される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
（ｉ）変化したＦＧＦＲバリアントの発現レベルの決定、
（ｉｉ）少なくとも
・変化したＦＧＦＲバリアントに組み込まれるＦＧＦＲエクソン、および
・変化したＦＧＦＲバリアントに組み込まれないＦＧＦＲエクソン
発現レベルの決定および両者の比較、および／または
（ｖ）それぞれの変化を同定するために、それぞれのＦＧＦＲ遺伝子の配列を決定する。
前記発現レベルが、以下の少なくとも１つのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲまたはｑＰＣＲ）によって決定される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
・ＦＧＦＲ野生型ｍＲＮＡ、および／または、
・変化したＦＧＦＲバリアントのｍＲＮＡ。
１つ以上の正規化発現レベルを得るために、工程ａ）で決定された１つ以上の発現レベルが、工程ｂ）以前に１つ以上の基準遺伝子の１つ以上の発現レベルで正規化されることを特徴とする、前記請求項のいずれか１つに記載の手法。
前記１以上の基準遺伝子が少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子が、ＣＡＬＭ２、Ｂ２Ｍおよび／またはＲＰＬ３７Ａからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
ＫＲＴ５、ＫＲＴ２０、ＰＤ１及び／又はＰＤ－Ｌ１からなる群より選択される少なくとも１つ以上の遺伝子の発現レベルが決定され、任意に正規化されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
尿路上皮がんまたは膀胱がんがＴ２、Ｔ３またはＴ４期がんであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
工程ｂ）の分類がＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ３の発現レベルに依存する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
工程ｂ）の分類が、それぞれＦＧＦＲ２とＦＧＦＲ３の発現レベル間の比率、またはそれらの正規化発現レベルに依存する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
工程ｂ）の分類が、ＦＧＦＲ遺伝子、好ましくはＦＧＦＲ３遺伝子における変化の有無に依存する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
工程ａ）の決定前に試料中に含まれる核酸分子を精製するために、試料をシリカ被覆磁気粒子およびカオトロピック塩で処理する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
抗がん剤が少なくとも１つの化学療法剤を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
抗がん剤が免疫チェックポイント阻害剤を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
免疫チェックポイント阻害剤が、以下からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１７記載の方法。
・ＰＤ－１阻害剤、
・ＰＤ－Ｌ１阻害剤、
・ＣＴＬＡ－４阻害剤、
・ＬＡＧ３阻害剤、
・ＴＩＭ３阻害剤、および／または
・ＯＸ４０阻害剤。
免疫チェックポイント阻害剤が、以下からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１７または１８記載の方法
・抗体、
・修飾された抗体フォーマット、
・標的結合特性を保持する抗体誘導体または断片、
・抗体ベースの結合タンパク質、
・オリゴペプチドバインダーおよび／または
・抗体ミメティック。
免疫チェックポイント阻害剤が、表５に記載の群から選択される少なくとも１つである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
ＦＧＦＲ阻害剤がＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
ＦＧＦＲ阻害剤が、表６に記載の群から選択される少なくとも１つである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
ａ）ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ４のいずれか１つ、または変化したＦＧＦＲ遺伝子をコードする核酸分子、または、
ｂ）ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ４のいずれか１つ、またはそのアイソフォーム、または変化したＦＧＦＲをコードするｍＲＮＡ
にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであって、
オリゴヌクレオチドが、
－増幅プライマー（フォワードおよび／またはリバース）、
－標識されたプローブ、および／または、
－基質結合プローブ
からなる群より選択され、
前記請求項のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットの製造用である、オリゴヌクレオチド。
請求項２１に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むキット。
以下を含む、請求項２４に記載のキット：
ａ）ＦＧＦＲ２をコードする核酸分子にハイブリダイズすることができるフォワード／リバースプライマーのセット、および任意に適当なプローブ、および
ｂ）ＦＧＦＲ３をコードする核酸分子にハイブリダイズすることができるフォワード／リバースプライマーのセット、および任意に適当なプローブ。
さらに、ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合タンパク質の存在を検出することができるプライマーのセットを含む、請求項２５に記載のキット。
以下を含む、請求項２４に記載のキット：
ａ）ＦＧＦＲ２をコードする核酸分子にハイブリダイズすることができるフォワードプライマー／リバースプライマーのセット、および
ｂ）ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合タンパク質の存在を検出することができるプライマーのセット。
ＦＧＦＲ３－ＴＡＣＣ３融合タンパク質の存在を検出することができるプライマーのセットが以下を含む、請求項２６～２７のいずれか一項に記載のキット：
ａ）ＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合部位からＮ末端に位置するＦＧＦＲ３エクソンの核酸分子にハイブリダイズできるフォワードプライマー、及びＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合部位からＣ末端に位置するＴＡＣＣ３エクソンの核酸分子にハイブリダイズできるリバースプライマー、
ｂ）ＦＧＦＲ３のＮ末端領域をコードする核酸分子にハイブリダイズできるフォワードプライマーと、ＦＧＦＲ３のＮ末端領域をコードする核酸分子にハイブリダイズできるリバースプライマーに加えて、ＦＧＦＲ３のＣ末端領域をコードする核酸分子にハイブリダイズできるフォワードプライマーと、ＦＧＦＲ３のＣ末端領域をコードする核酸分子にハイブリダイズすることができるリバースプライマー、
ｃ）ＴＡＣＣ３のＣ末端領域をコードする核酸分子とハイブリダイズすることができるフォワードプライマー、およびＴＡＣＣ３のＮ末端領域をコードする核酸分子とハイブリダイズすることができるリバースプライマー、ならびにＴＡＣＣ３のＮ末端領域をコードする核酸分子とハイブリダイズすることができるフォワードプライマー、および／またはＴＡＣＣ３のＮ末端領域をコードする核酸分子とハイブリダイズすることができるリバースプライマー、
ｄ）ＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合部位からＮ末端に位置するＦＧＦＲ３エクソンの核酸分子にハイブリダイズできるフォワードプライマー、及びＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合部位からＣ末端に位置するＦＧＦＲ３エクソンの核酸分子にハイブリダイズできるリバースプライマー。
以下を含むプライマー／プローブセットを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のキット。
ａ）表１に記載のフォワードプライマーとリバースプライマー、および任意にプローブ、ならびに表２に記載のフォワードプライマーとリバースプライマー、ならびに任意にプローブ、
ｂ）ａ）のプライマーおよび任意にプローブ、および少なくとも表３に記載のフォワードプライマーおよびリバースプライマー、ならびに任意にプローブ、
ｃ）表１に記載のフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および任意にプローブ、ならびに表３に記載のフォワードプライマーおよびリバースプライマー、ならびに任意にプローブ。
１つ以上の蛍光分子、発光分子、放射性分子、酵素分子および／または消光分子で標識される標識プローブを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のキット。
尿路上皮がんまたは膀胱がんに罹患しているか、または発症するリスクがある患者の試料を少なくとも２つの分類の１つに分類する方法における、前記請求項のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはキットの使用。