JP2022515124A - 免疫療法および組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、改善された機能を有する免疫制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を、対象に投与することを含む、免疫療法に関する。本発明はまた、改善された機能を有する改変Ｔｒｅｇｓと、それを含む医薬組成物とにも関する。本発明の改良されたＴｒｅｇは、改善された機能の中でも特に、増加された腸管ホーミング能力を有する。本発明の方法および組成物は、免疫介在性の腸管障害の治療に特に有用である。【選択図】なし

Description

技術分野
本発明は、改善された機能を有する免疫制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を、それを必要とする対象に投与することを含む、免疫療法に関する。本発明はまた、エクスビボ（生体外）で増殖され改変されたＴｒｅｇｓであって改善された機能を有するＴｒｅｇｓと、それを含む医薬組成物とにも関する。本発明の改良されたＴｒｅｇは、改善された機能の中でも特に、増加された腸管ホーミング能力を有する。本発明の方法および組成物は、免疫介在性の腸管障害の治療に特に有用である。

背景
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、免疫系の他の細胞を抑制または制御する役割を担うＴ細胞である。Ｔｒｅｇは、自己および異種の粒子（抗原）に対する免疫応答をコントロールするうえで重要であり、自己免疫疾患の予防を助ける。
クローン病（ＣＤ）は、治療法が無く、重篤な病状になる、慢性的な免疫介在性の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。治療がめざすものには、症状の改善や、粘膜の治療などがある。しかしながら、現在行うことのできる治療に対する患者の多くの応答は、最適状態に及ばない。このことは、医療のニーズが全く満たされていないことを表している。炎症性の腸疾患の発病にＴｒｅｇの機能の欠陥を関連付ける、明らかな証拠が、遺伝子の研究と、機能の研究との両方から出されている^１－４。

腸の恒常性を維持するか、または喪失するかは、自己免疫と移植拒絶反応に関与するとされてきた、炎症性エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）と、Ｔｒｅｇの集団との間のバランスにかかっている^５－７。
Ｔｒｅｇは、強力な免疫抑制作用を有するＣＤ４^＋Ｔ細胞の、一意的なサブセットである。それらは、マスター転写制御因子ＦＯＸＰ３と、鍵となる表面マーカーの一群との発現により定義される^８－１０。Ｔｒｅｇは、免疫介在性の病理の制限に寄与しており、機能的Ｔｒｅｇを持たないマウスやヒトは、慢性的な炎症性腸炎（ＩＰＥＸ症候群）など、深刻な多系統炎症障害を発症する^１１。

ＩＢＤの治療における近年の進歩は、Ｔ細胞のトラフィッキングに焦点が当てられ、腸管特異的なトラフィッキング分子インテグリンα４β７を遮断することによって、炎症を起こしている腸管からエフェクターＴ細胞をそらすことに、特に焦点が当てられている^１７。この治療の効能は、リンパ球を炎症を起こしている腸管へトラフィッキングすることが、ＣＤの発病における重要なステップであることを示唆している。最近の報告では、ＣＤ患者におけるＴｒｅｇトラフィッキングに欠陥がないこと^１８、健康なコントロール（ＨＣ）と比較してかなり多数のＣＤ４^＋ＦＯＸＰ３^＋細胞がＣＤ患者の粘膜固有層にある^１９ことが示唆されている。ただし、粘膜固有層にあるＴｒｅｇが局所的に誘発されて、炎症促進性条件のもとでＩＬ１７分泌能力を発揮することができ、これがその抑制能力を減少させうる、という仮説を支持する、無視できない証拠が存在する^{２０、２１}。
ＣＤ患者の末梢血（ＰＢ）から精製されたＴｒｅｇは、自己反応性のＴ細胞の表現型および増殖の両方を制御することにおいて、重要な役割を果たす^２２。レチノイン酸（ＲＡ）が主要な腸管ホーミングインテグリンα４β７の発現を調整し、以前から、ＲＡがＴ細胞分化系列決定の安定性を制御するメカニズムが定義されてきた^２３。また、インビトロ（試験管内）培養後に、正常な（ＨＣ）Ｔｒｅｇ上で、ＲＡがα４β７の発現を誘導できることが示されてきた^１３。

ＲＡは、インテグリンα４β７の発現の誘発に効果的であり、Ｔｒｅｇ抑制能力の改善に効果があると示唆されてきた^２４。しかしながら、Ｔｒｅｇに対する全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）の安定化効果は、一過的であり血清依存的であるとわかっており、レチノイン酸の、Ｔｒｅｇを炎症促進性表現型へも偏らせる能力についての懸念がある^２５。さらに、ＡＴＲＡは同様の親和性を有するレチノイン酸受容体（ＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγ）に結合し、このリガンドの存在下でのそれらの活性化は、比較的に非選択的である^２６。したがって、ＲＡＲやＲＸＲはすべて、細胞内で活性化され、そのなかには、利に反するオフターゲット効果に関連しうるものがある。
ＩＢＤや他の免疫介在性の腸管障害のために現在利用可能な治療に対して、応答が最適状態に及ばないことを考えると、医療のニーズには、まだ満たされていないものがあるということだ。

発明の概要
本発明は、改善された機能を有する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）を作製する方法を提供し、前記方法は、免疫介在性の腸管障害を有する対象由来のＴｒｅｇを、少なくとも一つのＲＡＲαアゴニスト、その機能的類似体または誘導体に接触させることを含む。

また、エクスビボ増殖させたＴｒｅｇであって、それを必要とする対象に投与する前に少なくとも一つのＲＡＲαアゴニスト、その機能的類似体または誘導体に前もって接触させ、コントロールと比較して腸管ホーミングの能力が増加し、および／またはコントロールと比較して腸管ホーミング分子の発現が変更されているＴｒｅｇを提供する。前記Ｔｒｅｇは、場合によっては、本発明の方法によって得られたか、または得られることが可能であってもよい。

改善されたＴｒｅｇ機能は、増加した腸管ホーミング能力、および／または向上したＴｒｅｇ保持力、および／または増加した力価（potency）、および／またはＴｒｅｇを炎症促進性表現型へ偏らせない（Tregs are not skewed towards a pro-inflammatory phenotype）こと、という形態であってもよい。

本発明はまた、コントロールと比較して腸管ホーミング分子の発現が変更されている、改変Ｔｒｅｇを提供する。
また、エクスビボ増殖されたＴｒｅｇ、および／または改変Ｔｒｅｇを含む医薬組成物が提供される。

本発明はまた、免疫介在性の腸管障害の症状や進行を治療、改善、または予防する方法を提供し、前記方法は、免疫介在性の腸管障害がある対象から事前に取得したＴｒｅｇを、治療の必要な同じまたは別の対象へ導入する前に、少なくとも一つのＲＡＲαアゴニスト、その機能的類似体または誘導体に接触させることを含む。前記治療方法は、また、免疫介在性の腸管障害を有する対象に、エクスビボ増殖させた、および／または改変されたＴｒｅｇ、またはそれを含む医薬組成物を投与することを含んでもよい。

本発明はまた、免疫介在性の腸管障害の治療に使用するための、改善された機能を有する、エクスビボ増殖させたＴｒｅｇおよび／または改変Ｔｒｅｇ、および／またはＲＡＲαアゴニスト、その機能的類似体および誘導体を提供する。

本発明はまた、エクスビボ増殖させたＴｒｅｇの産生に使用するための、培養および／または増殖の培地であって、少なくとも一つのＲＡＲαアゴニスト、その機能的類似体または誘導体を含む培地を提供する。

詳細な説明
本発明の第一の態様によると、改善された機能を有する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を作製する方法であって、免疫介在性の腸管障害がある対象由来のＴｒｅｇを、少なくとも一つのＲＡＲαアゴニスト、その機能的類似体または誘導体に接触させることを含む、方法を提供する。

本発明の前記方法は、培養および／または増殖の培地が、少なくとも一つのＲＡＲαアゴニスト、その機能的類似体または誘導体を含むこと以外の、Ｔｒｅｇの単離、培養、増殖、および患者への輸液のための公知の方法を含む。

前記方法の第一の工程は、免疫介在性の腸管障害を有する対象から、生体試料を取得することを含む。Ｔｒｅｇは、適切な生体試料から得られてもよい。生体試料は特に限定されず、末梢血、胸腺、リンパ節、脾臓、骨髄などがあり、天然のＴｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）細胞や末梢で生成、誘導されたＴｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）細胞であってもよく、これらは抗原刺激やＴＧＦ－βのようなサイトカインで誘導されてもよい。

前記免疫介在性の腸管障害は、クローン病（ＣＤ）および／または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）などの、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）から選択されてもよいが、これらに限定されるわけではない。前記免疫介在性の腸管障害は、セリアック病；自己免疫性胃炎；チェックポイント関連の大腸炎（チェックポイント阻害剤（抗ＣＴＬＡ４、および／または抗ＰＤ１／ＰＤＬ１／Ｌなど）で治療した固形癌のための治療に関連する大腸炎などの大腸炎；治療抵抗性の大腸炎（たとえば、クロストリジウム・ディフィシルなどの細菌による））；腸管が関係する移植片体宿主病（ＧｖＨＤ）などから選択されてもよいが、これらに限定されるわけではない。

好適には、Ｔｒｅｇは、対象から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離される。好適には、対象は哺乳動物である。好ましくは、免疫介在性の腸管障害を有するヒトである。好適には、前記細胞は、対象に適合しているか、または対象自身のものである。好適な実施形態において、Ｔｒｅｇは、対象から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離され、治療される対象に適合しているか、または、対象自身のものである。

本明細書において、Ｔｒｅｇという用語は、免疫抑制機能を有するＴ細胞のことである。好適には、生体試料から単離されるＴｒｅｇは、マーカーＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦＯＸＰ３（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋）を発現するＴ細胞である。「ＦＯＸＰ３」は、フォークヘッドボックスＰ３タンパク質の略称である。ＦＯＸＰ３は、転写因子のＦＯＸタンパク質ファミリーのメンバーであり、制御性Ｔ細胞の発生と機能において調節経路のマスターレギュレーターとして機能する。

好適には、Ｔｒｅｇは、表面タンパク質ＣＤ１２７の非存在下でまたは低レベルで発現した表面タンパク質ＣＤ１２７と組み合わせて、細胞表面マーカーＣＤ４およびＣＤ２５を使用して同定してもよい（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ）。
Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ Ｔ細胞であってもよい。
Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－／ｌｏｗ Ｔ細胞であってもよい。
Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ１２７－／ｌｏｗ Ｔ細胞であってもよい。
Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－ＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔ細胞であってもよい。
Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔ細胞であってもよい。
Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ Ｔ細胞であってもよい。
Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ＋ Ｔ細胞であってもよい。

好適には、Ｔｒｅｇは、天然Ｔｒｅｇであってもよい。本明細書において、「天然Ｔｒｅｇ」という用語は、胸腺由来Ｔｒｅｇという意味である。

天然Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ヘリオス＋ニューロピリン１＋である。ｉＴｒｅｇと比較して、ｎＴｒｅｇは、ＰＤ－１（プログラム細胞死－１、ｐｄｃｄ１）、ニューロピリン１（Ｎｒｐ１）、ヘリオス（Ｉｋｚｆ２）、およびＣＤ７３を高発現する。ｎＴｒｅｇは、ヘリオスタンパク質またはニューロピリン１（Ｎｒｐ１）の発現にそれぞれ基づいて、ｉＴｒｅｇｓから区別してもよい。

さらに、好適なＴｒｅｇの例としては、Ｔｒ１細胞（Ｆｏｘｐ３を発現せず、高いＩＬ－１０生産性を有する）；ＣＤ８＋ＦＯＸＰ３＋ Ｔ細胞；および、γδＦＯＸＰ３＋ Ｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
これに対して、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）は、たとえば次のように識別される。
ＣＤ４＋ＣＤ２５－ＦＯＸＰ３－ＣＤ１２７＋

簡便な分離技術によるフローサイトメトリーなど、Ｔｒｅｇ特異的な細胞マーカーに基づく、なんらかの従来技術やセルソーティング技術を使用して、Ｔｒｅｇを単離／精製してもよく、その例のひとつは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）である。市販のキットが、かかる単離および精製のために使用でき、たとえばMiltenyi Treg kit with Auotmacs、ClinMACSなどがあるが、これらに限定されるわけではない。

このように取得されたＴｒｅｇは、少なくとも一つのＲＡＲαアゴニストの存在下でエクスビボ培養され増殖される。Ｔｒｅｇ増殖プロトコルで使用されてもよい別の成分としては、ラパマイシン、ＴＧＦβ、インターロイキン（ＩＬ－２、またはＩＬ－１５など）、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８などのアクチベーターなどがあるが、これらに限定されるわけではない。本明細書において、「アクチベーター」は、細胞を刺激し、細胞を増殖させる。好ましくは、前記インターロイキンは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）であり、高用量で存在し、ＩＬ－２はＴｒｅｇの恒常性（産生、増殖、生存）、およびその抑制機能と表現型の安定性に重要である。好ましくは、Ｔｒｅｇは、少なくとも一つのＲＡＲαアゴニスト、ラパマイシン、およびＩＬ－２（高用量）の存在下でエクスビボ培養され増殖される。

「ＲＡＲαアゴニスト」という用語は、本明細書における定義としては、ＲＡＲを活性化させる、または、ＲＡＲでの活性が増加するようにレチノイン酸を持続させる、薬剤を意味するとされる。これは、受容体と組み合わせられた時に生理反応を起こす物質と、レチノイド（たとえば、レチノイン酸）の異化（または、分解）を防ぎ、レチノイン酸そのものからのシグナルを増加させる物質との両方を含む。非制限的に例を挙げれば、ＲＡＲαアゴニストは、ＡＴＲＡ、ＲＡＲ５６８、ＡＭ５８０、ＡＭ８０（タミバロテン）、ＲＸ－１９５１８３、ＢＭＳ７５３、ＢＤ４、ＡＣ－９３２５３、およびＡＲ７があるが、これらに限定されるわけではない。

他にも、ＲＡＲαアゴニストには、ＵＳ２０１２／０１４９７３７に記載または定義されているものがあり、他のＲＡＲαアゴニストの化学構造の教示および定義について、この参照により本明細書にＵＳ２０１２／０１４９７３７を包含するものとする。
たとえば、ＲＡＲαアゴニストは、下記式の化合物、またはそれらの製薬上許容される塩を含んでもよい。

－Ｒ^１は、独立して、－Ｘ、－Ｒ^Ｘ、－Ｏ－Ｒ^Ｘ、－Ｏ－Ｒ^Ａ、－Ｏ－Ｒ^Ｃ、－Ｏ－Ｌ－Ｒ^Ｃ、－Ｏ－Ｒ^ＡＲ、または－Ｏ－Ｌ－Ｒ^ＡＲであり、
－Ｒ^２は、独立して、－Ｘ、－Ｒ^Ｘ、－Ｏ－Ｒ^Ｘ、－Ｏ－Ｒ^Ａ、－Ｏ－Ｒ^Ｃ、－Ｏ－Ｌ－Ｒ^Ｃ、－Ｏ－Ｒ^ＡＲ、または－Ｏ－Ｌ－Ｒ^ＡＲであり、
－Ｒ^３は、独立して、－Ｘ、－Ｒ^Ｘ、－Ｏ－Ｒ^Ｘ、－Ｏ－Ｒ^Ａ、－Ｏ－Ｒ^Ｃ、－Ｏ－Ｌ－Ｒ^Ｃ、－Ｏ－Ｒ^ＡＲ、または－Ｏ－Ｌ－Ｒ^ＡＲであり、
ただし－Ｒ^１、－Ｒ^２、および－Ｒ^３は、すべてが－Ｏ－Ｒ^Ａというわけではなく、
および／または、－Ｒ^１および－Ｒ^２（または－Ｒ^２および－Ｒ^３）は、合わせて、場合によっては置換された５または６員環Ｒ^Ｄを形成してもよく、
ここで、
各－Ｘは、独立して－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、または－Ｉであり、
各－Ｒ^Ａは、飽和脂肪族Ｃ_１－６アルキルであり、
各－Ｒ^Ｘは、飽和脂肪族Ｃ_１－６ハロアルキルであり、
各－Ｒ^Ｃは、飽和Ｃ_３－７シクロアルキルであり、
各－Ｒ^ＡＲは、フェニルまたはＣ_５－６ヘテロアリールであり、
各－Ｌ－は、飽和脂肪族Ｃ_１－３アルキレンであり、
ここで、
－Ｊ－は、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲ^Ｎ－または－ＮＲ^Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－であり、
－Ｒ^Ｎは、独立して－Ｈまたは－Ｈまたは－Ｒ^ＮＮであり、
－Ｒ^ＮＮは、飽和脂肪族Ｃ_１－４アルキルであり、
＝Ｙ－は、＝ＣＲ^Ｙ－であり、－Ｚ＝は、－ＣＲ^Ｚ＝であり、
－Ｒ^Ｙは、－Ｈであり、
－Ｒ^Ｎは、独立して－Ｈまたは－Ｒ^ＺＺであり、
－Ｒ^ＺＺは、独立して－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－ＯＨ、飽和脂肪族Ｃ_１－４アルコキシ、飽和脂肪族Ｃ_１－４アルキル、または飽和脂肪族Ｃ_１－４ハロアルキルであり、
＝Ｗ－は、＝ＣＲ^Ｗ－であり、
－Ｒ^Ｗは、－Ｈであり、
－Ｒ^Ｏは、独立して－ＯＨ、－ＯＲ^Ｅ、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ^Ｔ１、－ＮＲ^Ｔ１Ｒ^Ｔ１、または－ＮＲ^Ｔ２Ｒ^Ｔ３であり、
－Ｒ^Ｅは、飽和脂肪族Ｃ_１－６アルキルであり、
各－Ｒ^Ｔ１は、飽和脂肪族Ｃ_１－６アルキルであり、
－ＮＲ^Ｔ２Ｒ^Ｔ３は、独立してアゼチジノ、ピロリジノ、ピペリジノ（piperidino）、ピペリジノ（piperizino）、Ｎ－（Ｃ_１－３アルキル）ピペリジノ、またはモルフォリノであり、
ただし、場合によっては、前記化合物は、下記化合物、その塩、水和物、および溶媒和物から選択される化合物ではない：
４－（３，５－ジクロロ－４－エトキシ－ベンゾイルアミノ）－安息香酸（ＰＰ－０２）、および／または
４－（３，５－ジクロロ－４－メトキシ－ベンゾイルアミノ）－安息香酸（ＰＰ－０３）。

様々な実施形態において、－Ｒ^１は、－Ｘまたは－Ｏ－Ｒ^Ａであってもよい。
様々な実施形態において、－Ｒ^２は、－Ｘまたは－Ｏ－Ｒ^Ａであってもよい。
様々な実施形態において、－Ｒ^３は、－Ｘまたは－Ｏ－Ｒ^Ａであってもよい。
様々な実施形態において、－Ｒ^１、－Ｒ^２、および－Ｒ^３のうちの二つは、それぞれ独立して、－Ｏ－Ｒ^Ａであり、残りの－Ｒ^１、－Ｒ^２、または－Ｒ^３は、－Ｘであってもよい。
様々な実施形態において、－Ｘは、－Ｃｌであってもよい。
様々な実施形態において、－Ｒ^Ａは、メチル、エチル、プロピル（ｎ－プロピルまたはｉｓｏ－プロピル）、ブチル（ｎ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチルまたはｔｅｒｔ－ブチル）、ペンチル（ｎ－ペンチル、ｉｓｏ－ペンチルまたはｎｅｏ－ペンチル）、またはヘキシルであってもよく、たとえばメチル、エチルまたはプロピル（ｎ－プロピルまたはｉｓｏ－プロピル）であってもよい。
様々な実施形態において、－Ｒ^Ｎは、－Ｈであってもよい。
様々な実施形態において、－Ｒ^Ｚは、－Ｈであってもよい。また、他の実施形態においては、－Ｒ^Ｚは、メチル、エチル、プロピル（ｎ－プロピルまたはｉｓｏ－プロピル）、またはブチル（ｎ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチルまたはｔｅｒｔ－ブチル）であってもよく、たとえばメチルまたはエチルであってもよい。
様々な実施形態において、－Ｒ^Ｏは、－ＯＨまたは－ＯＲ^Ｅであってもよい。
様々な実施形態において、－Ｒ^Ｅは、メチル、エチル、プロピル（ｎ－プロピルまたはｉｓｏ－プロピル）、ブチル（ｎ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチルまたはｔｅｒｔ－ブチル）、ペンチル（ｎ－ペンチル、ｉｓｏ－ペンチルまたはｎｅｏ－ペンチル）、またはヘキシルであってもよく、たとえばメチル、エチルまたはプロピル（ｎ－プロピルまたはｉｓｏ－プロピル）であってもよい。
好適には、－Ｒ^１および－Ｒ^２（または－Ｒ^２および－Ｒ^３）は、合わせて、５または６員環Ｒ^Ｄを形成してもよく、場合によっては、１つ以上のヒドロキシルまたは＝Ｏ基、および／またはＣ_１－６アルキル基、特に、メチル基で置換された５または６員環Ｒ^Ｄを形成してもよく、場合によっては－Ｒ^Ｏが、－ＯＨであり、および／または、－Ｚ＝が、－ＣＨ＝であってもよい。
様々な実施形態において、環Ｒ^Ｄは、６員環であってもよく、場合によっては１つ以上のＣ_１－６アルキル基、たとえばメチル基で置換された６員環であってもよい。

ある実施形態において、前記化合物は下記構造を有していてもよい。

または、ある実施形態において、前記化合物は下記構造を有していてもよい。

様々な実施形態において、－Ｒ^１、－Ｒ^２、および－Ｒ^３のうちの二つ（好ましくは－Ｒ^２、および－Ｒ^３）は、それぞれ独立して、－Ｏ－Ｒ^Ａであり、残りの－Ｒ^１、－Ｒ^２、または－Ｒ^３は－Ｘであり、場合によっては、－Ｒ^Ｏは、－ＯＨであり、および／または、－Ｚ＝は、－ＣＲ^ＺＺであり、－Ｒ^ＺＺは、飽和脂肪族Ｃ_１－４アルキル、特にメチルである。

ある実施形態において、前記化合物は下記構造を有していてもよい。

いくつかの実施形態において、前記ＲＡＲαアゴニストは、ＲＡＲβまたはＲＡＲγよりもＲＡＲαに対して選択的であり、ＲＡＲβまたはＲＡＲγに対して有意の作用効果が無い。いくつかの実施形態において、前記ＲＡＲαアゴニストは、ＲＡＲβまたはＲＡＲγよりもＲＡＲαに対して選択的であり、ＲＡＲβまたはＲＡＲγよりもＲＡＲαに対する選択性が、１０倍よりも大きく、２０倍よりも大きく、３０倍よりも大きく、４０倍よりも大きく、５０倍よりも大きく、７５倍よりも大きく、１００倍よりも大きく、１５０倍よりも大きく、２００倍よりも大きく、２５０倍よりも大きく、３００倍よりも大きく、４００倍よりも大きく、５００倍よりも大きく、６００倍よりも大きく、７００倍よりも大きく、８００倍よりも大きく、９００倍よりも大きく、１０００倍よりも大きく、１１００倍よりも大きく、１２００倍よりも大きく、１３００倍よりも大きく、１４００倍よりも大きく、１５００倍よりも大きく、１６００倍よりも大きく、１７００倍よりも大きく、１８００倍よりも大きく、１９００倍よりも大きく、２０００倍よりも大きく、またはそれよりも大きい。いくつかの例では、ＲＡＲβまたはＲＡＲγに対する影響を合わせたものと比較して、アゴニストの効果の約１００％、または少なくとも約９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、または６０％が、ＲＡＲαに影響する。

ＲＡＲαアゴニストの機能的類似体は、レチノイド（たとえば、レチノイン酸）の異化（または、分解）を防ぎ、レチノイン酸そのものからのシグナルを増加させる薬剤を含む。このような薬剤は、レチノイン酸の代謝を遮断する薬剤（ＲＡＭＢＡ）を含んでもよく、これはレチノイドの異化を阻害する薬物である。

ＲＡＭＢＡは、全トランス型レチノイン酸（All Trans Retinoic Acid（ATRA））の生体内における内在性レベルを一時的に上げる。そうすることで、局所的なレチノイド効果を誘発し、過剰な全身性レチノイド曝露を避け、それによってレチノイン酸アゴニストに関連する毒性の問題のいくつかを回避する。ＲＡＭＢＡは、ＲＡＲαアゴニストとして作用する。いくつかの実施形態において、ＲＡＭＢＡの例としては、ケトコナゾール、リアロゾール、および／またはタラロゾールなどである。

特に適したＲＡＲαアゴニスト、その類似体または誘導体は、Ｔｒｅｇにおける腸管ホーミング分子の発現を誘導できるものである。前記腸管ホーミング分子は、好ましくは、インテグリンα４β７および／またはＣＣＲ９および／または、ＲＡＲαによって誘導されるその他の腸管ホーミング分子である。前記ＲＡＲαアゴニストは、好適には、Ｔｒｅｇ細胞において腸管ホーミング分子の発現を誘導し、Ｔｒｅｇの腸管、腸管組織または腸管細胞へのトラフィッキングを増加させてもよい。ＲＡＲβまたはＲＡＲγよりもＲＡＲαに対して選択的なＲＡＲアゴニストの使用による腸管ホーミング分子の発現および／またはトラフィッキングの増加は、ＲＡＲβまたはＲＡＲγに対して選択的なＲＡＲアゴニストやＡＴＲＡを使用する場合と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれより大きくてもよい。適切なＲＡＲαアゴニストが呈するその他の特性としては、オフターゲットレチノイド効果の減少、細胞毒性の減少、遺伝毒性の減少、ＲＡＲβおよびＲＡＲγに比べてＲＡＲαに対する選択性の増加などがある。

ＲＡＲ５６８は、ＥＣ５０値が０．５９ｎＭ／Ｌ、ＲＡＲβと比べてＲＡＲαに対して２９０倍の選択性、ＲＡＲγと比べてＲＡＲαに対して１３，０００倍よりも大きい選択性、という、ヒトＲＡＲに対する選択性のプロファイルを示す。

少なくとも一つのＲＡＲαアゴニスト、たとえばＲＡＲ５６８は、培養および／または増殖の培地に、好ましくは０．５ｎＭ～２ｎＭ、好適には１ｎＭの濃度で添加され、好ましくは培養工程の期間中は前記濃度範囲に維持される。前記Ｔｒｅｇを、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、３３日間、３４日間、３５日間、３６日間、３７日間までのあいだ、好適には５日間、少なくとも一つのＲＡＲαアゴニストを添加した培養／増殖培地で培養してもよい。

前記増殖は、少なくとも１００倍に増殖するまで行われ、好ましくは１，０００倍を超えるまで行われる。前記増殖は、刺激の度合いおよび培養期間に依存する。
本明細書において、「増殖される」とは、細胞または細胞の集団の増殖が誘導されることを意味する。
細胞の集団の増殖は、たとえば、集団に存在する細胞の数をカウントすることにより測定してもよい。
細胞の表現型は、フローサイトメトリーなど当該技術分野で公知の方法によって判定してもよい。

本発明の第一の態様は、したがって、エクスビボ増殖させたＴｒｅｇを作製する方法であって、前記方法は、
（ｉ）免疫介在性の腸管障害を有する対象から、Ｔｒｅｇを含む生体試料を取得すること、
（ｉｉ）生体試料からＴｒｅｇを単離すること、たとえばセルソーティングを使用して単離すること、
（iii）工程（ｉｉ）のＴｒｅｇを増殖することを含み、前記増殖は、少なくとも一つのＲＡＲαアゴニストの有効量に前記Ｔｒｅｇを接触させ、エクスビボ増殖させたＴｒｅｇを取得することを含む。

本発明の第一の態様による方法によって得られた、前記エクスビボ増殖させたＴｒｅｇは、免疫介在性の腸管障害を患う同一の、または異なる対象に導入されてもよく、場合によっては、前記対象の障害における結果的な改善（resulting improvement）をモニターする、または検出する工程をその後に行ってもよい。

前記ＲＡＲαアゴニスト、その機能的類似体または誘導体は、前記対象への（再）注入または（再）導入の前に、実質的に除去される。これは、通常の細胞処理で一般的に起こることである。

本発明の第二の態様によると、腸管ホーミング能力が増加し、少なくともひとつのＲＡＲαアゴニスト、その機能的類似体または誘導体と事前に接触させられた、エクスビボ増殖させたＴｒｅｇが提供される。増加した腸管ホーミング能力は、発現の変化、たとえば、α４β７インテグリンおよび／またはＣＣＲ９などの腸管ホーミング分子の発現の増加によるものであってもよい。さらに、本発明の方法によって得られたか、または得られることが可能であるエクスビボ増殖させたＴｒｅｇ細胞は、インビトロでもインビボでも優れた腸管ホーミングを示す。このことは、動的インビトロシステムを用い、かつ、ヒトの腸の異種移植片のヒト化異種移植マウスモデルにおいて、本発明者により示された。前記Ｔｒｅｇは、場合によっては、本発明の方法によって得られたか、または得られることが可能であってもよい。Ｔｒｅｇは、増加した腸管ホーミング能力、α４β７インテグリンおよび／またはＣＣＲ９の発現の変化、たとえば増加、および／または向上したＴｒｅｇ保持力、および／または増加した力価を呈してもよい。

本発明は、ＲＡＲαアゴニストを添加したＴｒｅｇの培養／増殖が、腸管ホーミング分子、特にα４β７インテグリンおよび／またはＣＣＲ９の発現を増加させることを示す。腸管ホーミング分子、特にα４β７インテグリンおよび／またはＣＣＲ９の発現を増加させる方法としては他に、Ｔｒｅｇを改変してα４β７インテグリンおよび／またはＣＣＲ９および／またはその他の腸管ホーミング分子を過剰発現させる方法がある。本発明の効果を再現するためのインビボのアプローチとしては、Ｔｒｅｇを直接標的にすることが挙げられ、たとえば、選択的にＴｒｅｇ（Ｔｅｆｆではなく）を標的とし、かつ、ＲＡＲαアゴニスト、その機能的類似体または誘導体に接合してもよい、ナノ粒子や二重特異性抗体を使用して、Ｔｒｅｇを直接標的にすることがある。たとえば、Ｔｒｅｇ特異的な標的（ＬＡＧ３、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ－４など）に対する抗体は、ＲＡＲαアゴニスト、その機能的類似体または誘導体に接合でき、患者に直接投与できる。

本発明の第三の態様によると、腸管ホーミング分子、特にα４β７インテグリンおよび／またはＣＣＲ９を（過剰）発現するように改変された、改変Ｔｒｅｇが提供される。これらおよびその他の腸管ホーミング分子の配列は、当該技術分野において公知であり、容易に利用できる。たとえば、配列番号１は、インテグリンアルファ４の塩基配列を提供し、配列番号２は、インテグリンアルファ４、アイソフォーム１のアミノ酸配列を提供し、配列番号３は、インテグリンアルファ４、アイソフォーム２のアミノ酸配列を提供し、配列番号４は、インテグリンベータ７の塩基配列を提供し、配列番号５は、インテグリンベータ７、アイソフォーム１のアミノ酸配列を提供し、配列番号６は、インテグリンベータ７、アイソフォーム２のアミノ酸配列を提供し、配列番号７は、ＣＣＲ９の塩基配列を提供し、配列番号８は、ＣＣＲ９のアミノ酸配列を提供する。

インテグリンアルファ４およびインテグリンベータ７は、対を成し、ヘテロダイマーα４β７インテグリンを形成する。前記改変Ｔｒｅｇｓは、α４β７インテグリンおよび／またはＣＣＲ９を（過剰）発現するよう改変されており、前述のアミノ酸配列（またはその組み合わせ、たとえばα４β７インテグリンの場合の組み合わせ）のいずれか、または、前述のアミノ酸配列番号について少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の配列同一性を有する配列（または、たとえば、α４β７インテグリンの発現のために関連する配列の組み合わせ）を（過剰）発現してもよい。

前記改変Ｔｒｅｇは、配列番号１、４、および７（またはその組み合わせ、たとえば塩基配列がα４β７インテグリンをコードしている場合の組み合わせ）のいずれか、または、前述の塩基配列番号について少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の配列同一性を有する配列（または、たとえば、塩基配列がα４β７インテグリンをコードしている場合、その組み合わせ）によってコードされているα４β７インテグリンおよび／またはＣＣＲ９を、（過剰）発現してもよい。

本明細書において使用される「改変」Ｔｒｅｇとは、少なくとも一つの腸管ホーミング分子を含み、過剰発現するよう改変されているＴｒｅｇを意味し、前記分子が、前記Ｔｒｅｇに導入され、未改変Ｔｒｅｇにおいては自然にはコードされておらず、および／または、内在性腸管ホーミング遺伝子以外の付加的な分子であるようなＴｒｅｇである。

細胞を遺伝子的に操作または改変する方法は、当該技術分野で公知であり、たとえば、細胞の遺伝子組み換え（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）があり、それはたとえば、レトロウイルス形質導入またはレンチウイルス形質導入などの形質導入、リポフェクション法、ポリエチレングリコール法、リン酸カルシウム法、およびエレクトロポレーション法などの遺伝子導入（ＤＮＡまたはＲＮＡの一過性形質転換など）によるものであるが、これらに限定されるわけではない。腸管ホーミング核酸配列をＴｒｅｇに導入するために、いずれかの好適な方法が使用されればよい。前記腸管ホーミング核酸は、配列番号１、４、および７（またはその組み合わせ、たとえば塩基配列がα４β７インテグリンをコードしている場合の組み合わせ）に示されてもよく、または、前述の塩基配列番号について少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の配列同一性を有する配列（または、たとえば、塩基配列がα４β７インテグリンをコードしている場合、その組み合わせ）によって示されてもよい。

したがって、腸管ホーミング分子を含み、かつ腸管ホーミング分子を過剰発現または発現するように改変された、改変Ｔｒｅｇであって、前述の（過剰）発現が、対応する未改変Ｔｒｅｇに比例する、改変Ｔｒｅｇが提供される。ウイルスベクターを用いた形質導入や、ＤＮＡまたはＲＮＡを用いた遺伝子導入などの多数の手段のうちのひとつによって、腸管ホーミング分子、好ましくはα４β７インテグリンをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することにより、本発明の改変Ｔｒｅｇが生成されてもよい。本発明の改変Ｔｒｅｇは、本明細書において定義されたポリヌクレオチドまたはベクターを未改変Ｔｒｅｇに（たとえば、形質導入または遺伝子導入によって）導入することにより、作製される。好適には、前記改変される予定のＴｒｅｇは、免疫介在性の腸管障害を有する対象から単離されたサンプル由来であってもよい。

好適には、改変Ｔｒｅｇは、改変されたゲノムを有するＴｒｅｇであり、たとえば形質導入または遺伝子導入により改変されたゲノムを有するＴｒｅｇである。好適には、改変Ｔｒｅｇは、レトロウイルス形質導入によって、ゲノム修飾されたＴｒｅｇである。適切には、改変Ｔｒｅｇは、レンチウイルス形質導入によって、ゲノム修飾されたＴｒｅｇである。

本明細書において、「導入された」という用語は、外来ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に挿入するための方法のことである。本明細書において、「導入された」という用語は、形質導入法および遺伝子導入法の両方を含む。遺伝子導入は、非ウイルス法により核酸を細胞内に導入するプロセスである。形質導入は、ウイルスベクターを介して細胞に外来のＤＮＡまたはＲＮＡを導入するプロセスである。ウイルスベクターを用いた形質導入や、ＤＮＡまたはＲＮＡを用いた遺伝子導入などの多数の手段のうちのひとつによって、ＤＮＡまたはＲＮＡを導入することにより、本発明に係る改変Ｔｒｅｇが生成されてもよい。

腸管ホーミング分子をコードするポリヌクレオチドを導入する前に、または後に、Ｔｒｅｇを活性化および／または増殖させてもよい。活性化／増殖が腸管ホーミング分子をＴｒｅｇに導入した後になされる場合、前記増殖／培養培地には、ＲＡＲαアゴニストを追加しなくてもよく、または、少なくとも同じレベルでなくてもよい。
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよい。それらは、一本鎖または二本鎖であってもよい。多数の様々なポリヌクレオチドが、遺伝子コードの縮重の結果、同じポリペプチドをコードできるポリヌクレオチドが数多く様々あることを、当業者は理解しているであろう。さらに、当業者が常用手技を使用して、本発明のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド配列に影響を与えないヌクレオチド置換基を作り、本発明のポリペプチドが発現される特定の宿主個体のコドン使用を反映させてもよいことが、理解されるであろう。

前記ポリヌクレオチドは、当該技術分野で利用可能な任意の方法で改変してもよい。本発明のポリヌクレオチドのインビボ活性を向上し、または寿命を伸ばすために、かかる改変を行ってもよい。

ＤＮＡポリヌクレオチドのようなポリヌクレオチドは、遺伝子組換え、合成、または当業者が利用可能な任意の手段によって作成してもよい。標準的な技術でクローニングしてもよい。より長いポリヌクレオチドは、一般的に、組換え手段を使用して、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニング技術を使用して作製されるだろう。これは、クローニングしたい標的配列に隣接する一対のプライマー（たとえば、ヌクレオチドが約１５～３０個のもの）を作り、前記プライマーを動物またはヒトの細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させ、所望の領域の増幅をもたらすような条件でポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅された断片を単離し（たとえば、アガロースゲルで反応混合物を精製することにより）、増幅されたＤＮＡを回収することを含むだろう。前記プライマーは、増幅されたＤＮＡが好適なベクターにクローニングされるように、適切な制限酵素認識部位を含むように設計されてもよい。

当該ポリヌクレオチドは、選択可能なマーカーをコードする核酸配列を、さらに含んでもよい。好適に選択可能なマーカーは、当該技術分野において周知であり、ＧＦＰなどの蛍光蛋白質を含むが、これらに限定されるわけではない。選択可能マーカーをコードする核酸配列は、核酸コンストラクトの形態で腸管ホーミング分子をコードする核酸配列との組み合わせで提供される。かかる核酸コンストラクトは、ベクターに提供されてもよい。
選択可能マーカーを使用することにより、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターが（コードされている腸管ホーミング分子が発現するように）正常に導入されているＴｒｅｇを、たとえばフローサイトメトリーなどの一般的な方法を使用して開始細胞集団から選択し単離できるので、選択可能マーカーの使用が有利である。

本発明で使用されるポリヌクレオチドは、コドン最適化されてもよい。コドン最適化は、以前より、ＷＯ１９９９／４１３９７およびＷＯ２００１／７９５１８に記載されている。細胞が異なっていれば、特定のコドンの使用も異なる。このコドンバイアスは、細胞タイプにおける特定のｔＲＮＡの相対的存在量の偏りに対応している。配列中のコドンを変えて、対応するｔＲＮＡの相対的存在量に合うようにコドンを適合させることにより、発現を増加させることが可能である。同様に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞タイプにおいて少ないとわかっているコドンを故意に選択することによって、発現を減少させることが可能である。このように、翻訳調節の度合いをさらに増やすこともできる。

ベクターは、一つの環境から別の環境へのある実体の移入を可能にする、または容易にするツールである。本発明によれば、例として、組換え核酸技術に使用されるいくつかのベクターは、核酸のセグメント（たとえば、異種ｃＤＮＡセグメントなどの異種ＤＮＡセグメント）などの実体を、標的細胞に移入させることができる。ベクターは、非ウイルス性であってもよいし、ウイルス性であってもよい。組換え核酸技術に使用されるベクターの例としては、プラスミド、ｍＲＮＡ分子（たとえば、インビトロ転写ｍＲＮＡ）、染色体、人工染色体およびウイルスが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ベクターはまた、たとえば、ネイキッド核酸（たとえば、ＤＮＡ）であってもよい。最も単純な形態では、ベクターそれ自体が、目的のヌクレオチドであってもよい。

本発明で使用されるベクターは、たとえば、プラスミド、ｍＲＮＡ、またはウイルスベクターであってもよく、ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター、場合によってはそのプロモーターのレギュレーターを含んでもよい。

本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを、形質転換や形質導入など、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して細胞に導入してもよい。いくつかの技術が、当該技術分野で公知である。たとえば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターなどの組換えウイルスベクターを使用した感染、核酸の直接注入や、遺伝子銃形質転換である。

非ウイルス送達システムには、ＤＮＡ導入法などがあるが、これらに限定されるわけではない。なお、遺伝子導入は、遺伝子を標的細胞へ送達するための非ウイルスベクターを使用したプロセスを含む。

典型的な遺伝子導入法としては、エレクトロポレーション、ＤＮＡ遺伝子銃、脂質媒介トランスフェクション、圧縮ＤＮＡ媒介トランスフェクション、リポソーム法、イムノリポソーム法、リポフェクション法、カチオン性薬剤媒介トランスフェクション、カチオン性表面両親媒性物質法（ＣＦＡｓ）（Nat. Biotechnol.(1996) 14: 556）、および、これらの組み合わせがある。

腸管ホーミング分子を過剰発現させるためにＴｒｅｇを改変する他の方法には、遺伝子編集のアプローチ（ＣＲＩＳＰＲなど）がある。当該技術分野では、核酸を編集するための様々な方法が知られており、たとえば遺伝子ノックアウトや、遺伝子発現を下方制御させることなどがある。たとえば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせなど、様々なヌクレアーゼシステムを核酸の編集に使用することが当該技術分野で知られており、それを本発明で使用してもよい。近年、ゲノム編集には、Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats（ＣＲＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（CRISPR/Cas）ヌクレアーゼシステムがさらに一般的に使用されるようになっている。前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、たとえばＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０９３６３５、およびＷＯ２０１４／０８９２９０に詳述されている。Ｔ細胞にそれを使用することは、ＷＯ２０１４／１９１５１８に提案されている。

変異体の（ノックアウト、ノックイン、または遺伝子置換された）細胞株の生成の時間制限要因は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラットフォームの開発の前のクローンスクリーニングと選択であった。本明細書における「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラットフォーム」という用語は、Ｃａｓ９への結合部位を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列と、改変すべき領域に特異的な標的配列とを含む、遺伝子工学ツールを言う。Ｃａｓ９はｇＲＮＡに結合して、標的領域に結合して切断するリボ核タンパク質を形成する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の前に、哺乳類ゲノム編集を多重化できるが、特定の変異、導入遺伝子挿入、または遺伝子欠失の選択には、抗生物質耐性マーカーまたは手の係るＰＣＲに基づくスクリーニング方法が必要であった。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラットフォーム（タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのもの）に加えて、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、タイプＩＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなど、代替のシステムがある。様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが開示されているが、そのうちのいくつかを挙げるとすると、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、ストレプトコッカス・サーモフィラスＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９）、カンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）、およびナイセリア・シネレアＣａｓ９（ＮｃＣａｓ９）がある。Ｃａｓシステムのかわりに使用できるものとしては、フランシセラ・ノビサイダＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）、アシダミノコッカス属Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）、およびラクノスピラ属ＮＤ２００６Ｃｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）システムがある。上記のＣＲＩＳＰＲシステムのいずれも、改変Ｔｒｅｇを生成するために本発明の方法に使用してもよい。

標的遺伝子は、たとえば上記の方法を使用して、前記標的遺伝子内で一つ以上のヌクレオチドを欠失させる、挿入する、または置換することにより、前記遺伝子のノックアウトまたは前記遺伝子の発現の下方制御をもたらす編集がなされてもよい。

本発明の前記改変Ｔｒｅｇは、有利には、改善された機能を有し、改善された機能はＴｒｅｇの哺乳動物の腸管へのトラフィッキングの改善、および／または向上したＴｒｅｇ保持力、および／または増加した力価により明示されてもよい。ａ４ｂ７もまた、腸管のＴ細胞についての保持シグナルであり、有利には、トラフィッキングの増加のみならず、保持力の増加ももたらす。増加した力価は、たとえば炎症を起こしている粘膜内に、Ｔｒｅｇを適切に位置づけた結果であってもよい。

本発明の第四の態様によると、免疫介在性の腸管障害の治療、改善または予防のための、改変された、および／またはエクスビボ増殖させたＴｒｅｇを含む医薬組成物が提供され、前記障害は本明細書において定義されている。

医薬組成物は、治療上有効量の医薬的に活性な薬剤を含む、またはそれから成る、組成物であり、医薬的に活性な薬剤とは、本明細書において、改変された、および／またはエクスビボ増殖させたＴｒｅｇである。好ましくは、医薬組成物は薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤（それらの組み合わせを含む）を含む。

治療目的の使用のために許容される担体または希釈剤は周知であり、たとえばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.（A. R. Gennaro編 1985）に記載されている。薬学的担体、賦形剤、または希釈剤の選択は、意図する投与経路と標準的な薬務とを考慮して選択できる。前記医薬組成物は、担体、賦形剤、または希釈剤として、またはそれらに加えて、適した結合剤、滑剤、懸濁化剤、コーティング剤、または可溶化剤を含んでもよい。

薬学的に許容される担体の例としては、たとえば、水、塩類溶液、アルコール、シリコーン、蝋、ワセリン、植物油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、リポソーム、糖、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、界面活性剤、珪酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリド、ペトロエスラル脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどがある。

本発明の第五の態様によると、免疫介在性の腸管障害を治療する方法であって、免疫介在性の腸管障害がある対象から事前に取得したＴｒｅｇを、治療の必要な同じまたは別の対象へ導入する前に、少なくとも一つのＲＡＲαアゴニスト、その機能的類似体または誘導体に接触させることを含む方法が提供される。

前記治療方法は、免疫介在性の腸管障害を治療してもよく、その症状を改善してもよく、または、場合によっては免疫介在性の腸管障害を予防してもよい。前記免疫介在性の腸管障害は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、特にクローン病（ＣＤ）および／または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）であってもよい。前記免疫介在性の腸管障害は、大腸炎（チェックポイント関連の大腸炎（チェックポイント阻害剤（抗ＣＴＬＡ４、および／または抗ＰＤ１／ＰＤＬ１／Ｌなど）で治療した固形癌のための治療に関連する大腸炎）や、治療抵抗性のクロストリジウム・ディフィシル関連の大腸炎）、ＧｖＨＤなど、腸管が関係するものでもよい。

エクスビボ処理以前のＴｒｅｇ細胞は、α４β７^＋Ｔｅｆｆの割合が高い（たとえばＣＤを患う対象において）が、健康体のコントロールにおいては、α４β７^＋ＴｒｅｇとＴｅｆｆとの間に実質的により均等なバランスがある。したがって、本発明は、α４β７^＋ＴｒｅｇのレベルとＴｅｆｆのレベルとがより同等になるようバランスを回復することを目的とする。

疾患治療の方法はまた、本発明のＴｒｅｇ、エクスビボ増殖させたＴｒｅｇと改変Ｔｒｅｇの両方についての治療目的の使用に関する。これに関して、免疫介在性の腸管障害に関連する少なくとも一つの症状を少なくしたり、軽くしたり、または改善するために、および／または前記状態の進行を遅めたり、軽減したり、または遮断したりするために、前記障害を持つ対象に、前記細胞を投与してもよい。

疾患を予防するための方法は、本発明のエクスビボ増殖させたＴｒｅｇまたは改変Ｔｒｅｇ細胞を予防目的で使用することに関連する。これに関して、まだ罹患していない、および／または疾患の症状を示していない対象に対して、前記疾患を予防したり、またはその原因を減じたり、前記疾患に関連する少なくとも一つの症状を軽くしたり、または予防したりするために、前記Ｔｒｅｇを投与してもよい。対象は、前記疾患にかかりやすい体質であること、または、前記疾患を発症する危険性を教示されているかもしれない。かかる予防目的の使用は、大腸炎（チェックポイント関連の大腸炎（チェックポイント阻害剤（抗ＣＴＬＡ４、および／または抗ＰＤ１／ＰＤＬ１／Ｌなど）で治療した固形癌のための治療に関連する大腸炎）や、治療抵抗性のクロストリジウム・ディフィシル関連の大腸炎）、腸管が関係するＧｖＨＤなどを予防するのに特に適していてもよい。

好適には、本発明の治療方法は、本発明に係る、または本発明に係る方法により取得可能な（たとえば、取得された）、エクスビボ増殖させたＴｒｅｇおよび／または改変Ｔｒｅｇおよび／または医薬組成物、または腸管ホーミング分子を含み（過剰）発現できる（たとえば、上述の医薬組成物中の）ポリヌクレオチドまたはベクターを、対象に投与する工程を含んでいてもよい。

本発明の第六の態様によると、本明細書において定義されているような、免疫介在性の腸管障害の治療、改善または予防に使用されるための、本発明にかかるエクスビボ増殖させたＴｒｅｇ、改変Ｔｒｅｇ、医薬組成物、ＲＡＲαアゴニストおよびその類似体と誘導体、が提供される。

本発明はまた、本明細書において定義されているような、免疫介在性の腸管障害の治療、改善または予防のための薬品の製造における、本発明にかかるエクスビボ増殖させたＴｒｅｇ、改変Ｔｒｅｇ、医薬組成物、ＲＡＲαアゴニストおよびその類似体と誘導体の使用を提供する。

本発明の第七の態様によると、エクスビボ増殖させたＴｒｅｇの産生に使用するための、培養および／または増殖の培地であって、少なくとも一つのＲＡＲαアゴニスト、またはその機能的類似体または誘導体を含む培地が提供される。前記ＲＡＲαアゴニストまたはその機能的類似体または誘導体は、本明細書において定義されるとおりである。
本明細書および請求の範囲全体で、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ， ｃｏｎｔａｉｎ）」という語句およびその変形、たとえばｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇやｃｏｍｐｒｉｓｅｓは、「含むが、それに限定されるわけではない」ことを意味し、他の構成部分、数値（integer）、または工程を除外するものではない。

さらに、文脈上別段の解釈を必要としない限り、単数は複数の場合も含む。特に、不定冠詞が使用される場合、文脈上別段の解釈を必要としない限り、単数と同様に複数も予期していると明細書は理解されるべきである。本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかと関連して記載されている通りであってもよい。本願の範囲内において、先行する段落、請求の範囲、および／または下記の記載および図面に記載されている様々な態様、実施形態、実施例および変形例、そして特にその個々の特徴は、独立して、または何らかの組み合わせで理解されてもよいことは明白である。すなわち、すべての実施形態、および／または、いずれかの実施形態の特徴は、かかる特徴が矛盾しない限り、いかようにも、どんな組み合わせであろうと、組み合わせることができる。

図面の簡単な説明
本発明の一つ以上実施形態を、例示として、付随する下記図面を参照しながら説明する。
図１は、ＣＤにおける腸管ホーミング分子の発現を示す。（ａ）ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆの集団と、そのインテグリンβ７の発現とを画定するためのゲーティングストラテジー （ｂ）ＣＤ患者の末梢血と結腸における、インテグリンβ７の発現差異。ウィルコクソンマッチドペア符号順位検定を使用して、マッチした値のすべてについて統計的有意性を判定した。全体を通して＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．００５、＊ｐ＜０．０５、ｎｓ＝ｐ＞０．０５が使用された。（Ｎ＝６３ ＣＤ末梢血、Ｎ＝２０ ＣＤ結腸）（ｂ）ＣＤ患者におけるインテグリンβ７ＭＦＩおよびα４β７^＋の発現を、ＨＣと比較した、代表的なフロープロット。 （ｃ）クローン病患者の循環におけるα４β７陽性のＴｒｅｇが、健康なコントロールと比較して、有意に少ない（ｐ＝０．００６）。両側Ｐ値を使用したマン－ホイットニー検定を使用して、すべて不一致の値における有意を判定する。（Ｎ＝５６ ＣＤ末梢血， Ｎ＝４１ ＨＣ末梢血， Ｎ＝２４活性ＣＤ） （ｄ）クローン病患者の粘膜固有層において、Ｔｒｅｇよりもα４β７^＋Ｔｅｆｆｓの割合が高い（ｐ＝０．００１）。健康なコントロールにおいてα４β７^＋ＴｒｅｇとＴｅｆｆｓでは割合に違いがない（Ｎ＝１５ ＣＤ結腸， Ｎ＝１６ ＨＣ結腸）。 （ｅ）活性クローン病の患者は、健康なコントロールよりも、有意に多くＴｒｅｇを循環させている（ｐ＝０．０４）。ＨＣと比較して、ＣＤでは循環しているＴｅｆｆの割合が小さい（ｐ＝０．０１ ＨＣ対活性ＣＤ， ｐ＝０．０３ ＨＣ対非活性ＣＤ）。（Ｎ＝６４ ＣＤ、Ｎ＝４１ ＨＣ）（ｆ）ＨＣと比較してＣＤでは、より大きな割合のＴｅｆｆで、結腸ホーミングマーカーＧＰＲ１５が発現している（ｐ＝０．０４）。（Ｎ＝６４ ＣＤ、Ｎ＝４１ ＨＣ） （ｇ）Ｔｅｆｆと比較して、より高い割合のＴｒｅｇが、小腸ホーミング分子ＣＣＲ９を発現する（ｐ＝０．０３ Ｔｒｅｇ， ｐ＝０．０００４ Ｔｅｆｆ）。（Ｎ＝４３ ＣＤ、Ｎ＝３７ ＨＣ）（ｈ）ＣＤの結腸において、Ｔｅｆｆと比較して、より高い割合のＴｒｅｇが、ＧＰＲ１５を発現する（ｐ＝０．００３９、Ｎ＝１９）。ＨＣと比較して、ＣＤのＴｅｆｆは、より多くのＧＰＲ１５を発現する（ｐ＝０．０２、Ｎ＝１９ ＣＤ、Ｎ＝２２ ＨＣ）。 図２は、ＲＡＲαが、インビトロ培養中にα４β７を誘発するのにより効率的であることを示す。（ａ）単離されたばかりのＣＤ２５^ｈｉｇｈＣＤ１２７^ｌｏｗＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔｒｅｇおよび増殖後のＣＤ２５^ｈｉｇｈＣＤ１２７^ｌｏｗＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔｒｅｇでのα４β７の発現を画定するためのゲーティングストラテジー、 （ｂ）ＲＡＲ５６８で処理された培養におけるα４β７の有意で一貫した誘導を示す累積データ、（ｃ）インテグリンβ７の発現を誘導する際、ＲＡＲ５６８がより大きい効能を有することを示す用量反応曲線、（ｄ）ＦＯＸＰ３の発現は、標準条件と比較して、レチノイドの存在下で増殖させたＴｒｅｇにおいて変化しない。（ｅ）および（ｆ）は、レチノイドを使用したインビトロの処理が、抑制能力と表現型安定性を維持することを示す。（ｅ）ＡＴＲＡまたはＲＡＲ５６８の存在下で増殖させた細胞を比較する抑制アッセイ、 （ｆ）レチノイドで処理された細胞が、炎症促進性条件下でその表現型を維持することを示す安定性アッセイ。 図３は、ＲＡＲ５６８を使用した処理が、オフターゲットレチノイド効果を減少させることを示す。遺伝子は、２倍以上の増加に上方制御された（ｐ≦０．０５）。ＲＡＲ５６８またはＡＴＲＡで処理された細胞をラパマイシンのみで処理された細胞と比較した。遺伝子発現は、ＲＡＲγ標的遺伝子の公開リストと対比して比較した。（ａ）ＡＴＲＡで処理された細胞において炎症促進性Ｔ細胞株関連の遺伝子の発現の増加（上パネル）と、ＲＡＲ５６８で処理された細胞においてα４のさらに特異的な上方制御とを示す、火山型プロット。 （ｂ）ＡＴＲＡで処理された細胞におけるＲＡＲγ標的遺伝子の発現の増加。 図４は、α４β７の誘導が、インビトロで機能的に適切であることを示す。（ａ）Ｒａｐａのみで処理された細胞と比較して、α４β７リガンドであるＭａｄＣＡＭに曝露した時に、ＲＡＲ５６８で処理されたＴｒｅｇのゆっくりとした移動（crawling）、移動（rolling）、付着に、有意の改善があることを示す、インビトロトラフィッキングアッセイ。 （ｂ）Ｎ＝３トラフィッキングアッセイからの蓄積データ。 図５は、α４β７の誘導が、インビボで機能的に適切であることを示す。（ａ）実験デザイン：ヒト胎児小腸を移植し、１２～１６週かけて成熟させた、Ｃ．Ｂ１７ ＳＣＩＤマウスは、Ｔｒｅｇを移入する３日前に、マイコバクテリウム アビウム・パラ結核菌（ＭＡＰ）でその異種移植片に炎症を誘発させた。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を枯渇させるために、移入２日前に、マウスに抗アシアロＧＭ１抗体を注射する。Ｔｒｅｇ移入の日に、ラパマイシンのみで、またはＲＡＲ５６８を追加したラパマイシンで、増殖させたＴｒｅｇで、マウスを処理した。循環中のＴｒｅｇを維持するために、Ｔｒｅｇ移入の日に、ｒｈＩＬ－２ ＩＰを１０００ＩＵマウスに投与した。３日間の循環の後、消化された異種移植サンプルにおいてＦＡＣＳにより、また凍結切片において免疫蛍光法により、ＣＦＳＥ標識されたＴｒｅｇの存在について評価した。 （ｂ）ＲａｐａまたはＲａｐａ＋ＲＡＲ５６８で処理された細胞の移入後の異種移植片において、ＣＦＳＥ標識されたヒトＴｒｅｇが存在することを示す、ヒト胎児小腸を異種移植したＳＣＩＤマウスへのＴｒｅｇ移入からの代表的なＦＡＣＳプロット。 （ｃ）二つの独立した実験からの蓄積データ、Ｎ＝５ Ｒａｐａ、Ｎ＝６ Ｒａｐａ＋ＲＡＲ５６８（ｄ）炎症を誘発させた異種移植片への、ＲＡＲ５６８で処理された細胞のトラフィッキングが増加していることを示す、累積データ。α４β７の誘導が、インビボで機能的に適切である。 （ｅ）コントロール ＸＧ，Ｔｒｅｇなし（ｆ）Ｒａｐａ Ｔｒｅｇで処理されたマウスからのＸＧ（ｇ）Ｒａｐａ＋ＲＡＲ５６８で処理されたマウスからのＸＧ。 図６は、ＲＡＲαアゴニストＡＭ８０、ＡＭ５８０、およびＲＡＲ５６８によって、Ｔｒｅｇ表面上にインテグリンα４β７を誘導する効果の比較を示す。バルクＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ ＣＤ１２７－） Ｔｒｅｇ（１ウェルにつき５０，０００個）を、アゴニストの濃度を減らしながらインビトロで増殖させた。培養条件：Ｘ－ｖｉｖｏ １５中に、２ ａＣＤ３／ａＣＤ２８ビーズ／細胞、１０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２、０．１ｎＭラパマイシン＋アゴニスト。１２日間刺激を与えた後、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＦＯＸＰ３、インテグリンａ４、インテグリンｂ７、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６１について細胞を染色し、ＢＤｓｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメーターで取得した。データは、ＦｌｏｗＪｏおよびＰｒｉｓｍにて解析した。 図７は、ＣＤおよびＨＣのサンプルについて、α４β７発現とβ７ＭＦＩについてのゲーティングストラテジーを示す。 図７つづき 図８は、腸管ホーミング分子の発現、末梢血中のＣＣＲ９の発現に対する、ＣＤ疾患の活動性、チオプリン、生物製剤の影響を示す。 図８つづき 図９は、ＣＤ６２Ｌの高発現が、増殖に続いて維持され、ＲＡＲ５６８の処理によって影響されないことを示す。 図１０は、ＭＡｄＣＡＭ－１でコーティングされたｉｂｉｄｉフローチャンバーを使用した、インビトロでの細胞移動実験のための実験準備を示す。 図１１は、Ｒａｐａ ＴｒｅｇまたはＲａｐａ＋ＲＡＲ５６８ Ｔｒｅｇで治療されたマウスの脾臓からの代表的なプロットを示す。

実施例
下記実施例を参照して本発明を説明する。

材料および方法
患者サンプル
ＣＤ ＰＢＭＣおよび組織サンプルは、ガイズ・アンド・セントトーマスＮＨＳ財団で内視鏡検査を受けた患者および外来患者から得た。ヒト血液および組織の収集の倫理的承認は、ＮＲＥＳ委員会－ロンドン、リバーサイド（ＲＥＣ参照番号：１５／ＬＯ／０１５１）およびガイズ・アンド・セントトーマスＮＨＳ財団トラスト研究開発部（研究開発部参照番号：ＲＪ１１５／Ｎ１２２）から得た。
細胞培養培地および緩衝剤
エクスビボＴｒｅｇ増殖、Ｔｒｅｇサイトカインチャレンジ実験、およびＴｒｅｇ抑制アッセイに、「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｘ－ＶＩＶＯ－１５」（Lonza, Walkersville, MD）を使用した。これに、１００ｎＭまたは１０ｎＭのラパマイシンと全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）を２μＭまたは１ｎＭ、または、ラパマイシンとＲＡＲ５６８を１ｎＭ、追加した。
ＲＰＭＩ １６４０培地（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、オーストリア、パッシング）に、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ， サーモフィッシャー・サイエンティフィック社（ThermoFisher Scientific），ラフバラー、イギリス）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｇ／ｍｌ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸（０．１ｍＭ）、および１０％ウシ胎仔血清（すべてＰＡＡ）を追加したもので、他の実験を行った。

ＣＤ４単離およびセルソーティング
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅで単離した。
製造者の指示通りに、ＭＡＣＳ富化によりＣＤ４^＋細胞を富化した。
ＣＤ４^＋細胞は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｈｉｇｈＣＤ１２７^ｌｏｗＣＤ４５ＲＡ^＋およびエフェクターＴ細胞（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^－）集団に、ＦＡＣＳソーティング（BD FACSAria; BD Biosciences社、ニュージャージー州、フランクリン・レイクス）された。

ＬＰＭＣ単離
ＣＤ患者およびＨＣから収集された結腸生検を、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で洗浄した。コラゲナーゼＩａ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）、１ｍｇ／ｍｌ、およびＤＮＡｓｅ Ｉ（ロシュ（Roche）社）、１μｌ／ｍｌを使用して、サンプルを消化した。消化の後、１００μｍの細胞フィルターに細胞を通し、カウントした。

インビトロＴｒｅｇ増殖
ＦＡＣＳでソーティングされたＴｒｅｇ集団を、１×１０^６または０．５×１０^６でＸ－ＶＩＶＯ－１５培地に播き、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８でコーティングしたビーズ（Dynabeads（登録商標）、インビトロジェン（Invitrogen）社、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）で、ビーズ対細胞比１：１で活性化した。ラパマイシンは、培養０日目に、最終濃度１００ｎＭ／Ｌ＋／－ＡＴＲＡ １ｎＭ／Ｌ又はＲＡＲ５６８ １ｎＭ／Ｌで添加した。次に、培養５日目に、１，０００ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）（Proleukin（登録商標）、ノバルティス（Novartis）社、イギリス、キャンバリー）を添加した。１０～１２日ごとに細胞を再刺激し、計２４～３０日間かけて増殖させた。培養期間の終了時に、表現型と抑制能力について評価した。

Ｔｒｅｇ抑制能力の評価
標準的なプロトコルに準拠して、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）を、カルボキシフルオセイン・スクシニミジル・エステル（ＣＦＳＥ、インビトロジェン社）で標識した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄し、余分なタンパク質を除去した。その後、４分間室温で暗所にて、細胞を１μＭ／ＬのＣＦＳＥ溶液でインキュベートした。その反応を、９ｍｌの完全培地で止めた。
Ｔｅｆｆは、ビーズ対Ｔｅｆｆ比が０．０２：１の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８マイクロビーズで活性化された。１×１０^５個のＴｅｆｆを、Ｔｅｆｆ単独で、または段階希釈したＴｒｅｇとともに、培養した。Ｔｅｆｆ対Ｔｒｅｇ比は、１：１、２：１、４：１、および８：１であった。これは、Ｘ－ＶＩＶＯ－１５中にて行われ、５日間のインキュベーションの後にフローサイトメトリーにて増殖率について評価した。
増殖の抑制率（Ｓ）を、下記式を使用して算出した。
Ｓ＝１００－［（ｃ／ｄ）×１００］
上記式において、ｃ は、Ｔｒｅｇ存在下における、増殖している前駆体の割合であり、ｄはＴｒｅｇ非存在下における、増殖している前駆体の割合である。

Ｔｒｅｇのフローサイトメトリー分析
ＣＤの患者における制御性Ｔ細胞の亜型と、腸管ホーミング分子の発現とを評価するために、フローサイトメトリーパネルを設計した。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｈｉｇｈＣＤ１２７^ｌｏｗ集団と、ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔｒｅｇ集団とについて評価する際に、天然の集団に基づいてゲーティングを行った。さらに、腸管ホーミングマーカーおよび転写因子の発現について評価する際のバイアスを最小にするために、行われた各実験において目的の各マーカーに蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）パネルを追加した。

Ｉｂｉｄｉフローチャンバー実験
Ｉｂｉｄｉ（マルティンスリート（Martinsreid）社、ドイツ）μ－スライドＶＩ^０．４を、１０μｇ／ｍｌの濃度で、組み換えヒトＭＡｄＣＡＭ－１（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems）社、米国ミネソタ州、ミネアポリス）でコーティングし、一晩インキュベートした。
二人のＣＤ患者からの細胞を、二つの同等の条件（Ｒａｐａと、Ｒａｐａ＋ＲＡＲ５６８）下で事前にエクスビボ増殖し、液体窒素で冷凍したものを、解凍して一晩静置した。静置した細胞を、ｒｈＣＣＬ２５（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D systems）社）で活性化し、１ｄｙｎｅ／ｃｍ^２の速度で、コーティングされたＩｂｉｄｉフローチャンバーを通過させた。処理ごとに、任意に選択した６箇所の視野から、細胞の総数、ならびに移動した（rolling）細胞の数、付着した細胞の数、およびゆっくりと移動した（crawling）細胞の数を定量化した。

サイトカイン濃度の推定
サイトカイン濃度は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＲｅａｄｙ－ＳＥＴ－ＧｏサンドイッチＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。

炎症促進性条件下のＩＬ－１７およびＩＦＮγ産生の評価
エクスビボ増殖させたＴｒｅｇを、１：２０の比率でＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用して活性化させ、３７℃／５％ＣＯ_２で、下記サイトカインカクテルを追加したＸ－ＶＩＶＯにて１０^６細胞／ｍｌで５日間培養した。Ａ）ＩＬ－２（１０ＩＵ／ｍＬ，プロロイキン）（Ｂ）ＩＬ－２、ＩＬ－１（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－６（４ｎｇ／ｍＬ）および形質転換増殖因子β（ＴＧＦ－β）（５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－２１（２５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－２３（２５ｎｇ／ｍＬ）（すべてＲ＆Ｄシステムズ社）。培養上清ＩＬ－１７とインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の濃度をＥＬＩＳＡで測定した。

Ｃ．Ｂ－１７ ＳＣＩＤマウス・ヒト腸異種移植モデル
Ｃ．Ｂ－１７ ＳＣＩＤマウス・ヒト腸異種移植モデルについては前述のとおりである^{２８，２９}。施設内審査委員会（Institutional Review Board（IRB））および動物実験委員会（Institutional Animal Care and Use Committee（IACUC））の承認を、将来を見越して得た（動物実験倫理委員会（Ethics Committee for Animal Experimentation）、エルサレム・ヘブライ大学、ＭＤ－１１－１２６９２－４、およびハダサー大学病院のヘルシンキ委員会、８１－２３／０４／０４）。Ｔｒｅｇは移入前にＣＦＳＥ（インビトロジェン社）で、製造者の指示にしたがって標識した。異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ）は、ＬＰＭＣ消化プロトコルにしたがって処理した。ＣＦＳＥ陽性の細胞を、フローサイトメトリーにより検出した。さらに、ＣＦＳＥ陽性の細胞を、処理された異種移植片からの凍結切片に対する免疫蛍光法により検出した。

免疫蛍光染色
新鮮な異種移植切片を固定しＯＣＴに保存した。固定したクライオスタット片を、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）でブロックし、ラット抗ヒトＣＤ４５（インビトロジェン社）およびマウス抗ヒトＦＯＸＰ３（バイオレジェンド（Biolegend）社）で染色し、その後、ロバ抗ラットＡＦ５９４（インビトロジェン社）およびロバ抗マウスＮＬ６３７（RnDシステムズ（RnD systems）社）で染色した。Ｔｒｅｇの移入を受けていない異種移植片からの切片から、ネガティブコントロールを得た。

統計分析
フローサイトメトリーのデータを、ＭａｃＯｓＸ用のＦｌｏｗＪｏ１０．４．２で解析した。統計的な分析を、ＭａｃＯｓＸ用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ｈで行った。連続的に（ほぼ）対称的に分布した変数については平均値±標準偏差として、また、偏った変数については中央値と四分位範囲として、連続データ（continuous data）が示されている。平均値および／または中央値の比較は、必要に応じて、対応のあるパラメトリック検定と、ノンパラメトリック検定を使用して行った（それぞれ、対応のあるｔ検定、またはウィルコクソン符号順位検定）。対応する値（matched values）（同じ患者のＴｒｅｇとＴｅｆｆなど）の比較には、ウィルコクソン・マッチドペア符号順位検定（Wilcoxon matched pairs signed rank test）を使用した。両側Ｐ値を有するマン・ホイットニー検定を使用して、対応しない値（ＣＤとＨＣとの間の比較など）すべてにおいて有意のレベルを判定する。ＣＤグループとＨＣグループは、年齢と性別で広くマッチした。０．０５より小さいｐ値は、全体で統計的に有意であるとみなされる。
一元配置分散分析（1-way ANOVA）を含むＰａｒｔｅｋ（登録商標）ソフトウエアを使用して、遺伝子アレイ解析を行い、差次的遺伝子発現について評価した。

ＲＮＡ抽出と遺伝子アレイ
１）Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＥａｓｙミニ／マクロキットを使用し、製造者の指示にしたがって、ＲＮＡ抽出を行った。アジレント２１００バイオアナライザー（Agilent 2100 Bioanalyzer）を使用してＲＮＡの質について前記サンプルをチェックし、ナノドロップ（Nanodrop、ND-1000、分光光度計）を使用して定量化した。各サンプルの投入量が３ｎｇになるように、ＱＣ（ＲＩＮ＞８）を通ったサンプルを選択した。
２）Nugen社の「Ovation Pico WTA System V2」キットを使用して、製造者の指示にしたがってＳＰＩＡ ｃＤＮＡを生成した。
３）ＳＰＩＡ ｃＤＮＡをＱＣチェックにかけ、次のステージのために、質（アジレント２１００バイオアナライザー）と、量（ナノドロップ（Nanodrop、ND-1000、分光光度計））を評価した。
４）SPIA cDNAを断片化し、Nugen社の「Encore Biotin Module」を使用して、製造者の指示にしたがってビオチン標識し、ＱＣチェックを通して断片サイズを評価した（アジレント２１００バイオアナライザー）。
６）前記断片化され標識されたｃＤＮＡから、Nugen社推奨にしたがってハイブリダイゼーションカクテルを調製し、オーブンで一晩４５℃でハイブリダイズした。
７）洗浄プロトコルＦＳ４５０＿０００２（GeneChipフルイディクスステーション（Fluidics station）450のHuman Gene 2.0 Arraysに推奨されるAffymetrixプロトコル）を使用して、前記アレイを洗浄し染色した。
８）Affymetrix GeneChipスキャナを使用して、前記アレイをスキャンした。

結果
クローン病（ＣＤ）の患者は、腸管に輸送（traffic）するようにライセンス化されたＴｒｅｇの割合がＴｅｆｆよりも低い
ガイズ・アンド・セントトーマスＮＨＳ財団で外来診療、ＩＢＤ輸液ユニット、または内視鏡検査を受けている６４人のＣＤ患者、および４１人の健康なコントロール（ＨＣ）（過敏性腸症候群（ＩＢＳ）の管理、または、ポリープの経過観察／陽性の便潜血反応検査のために外来に来る患者）から、末梢血サンプルを採取した。下記表１は、患者の構成の概要を示す。ＨＣは、年齢と性別でマッチさせた。

１９人のＣＤ患者および２２人のＨＣから結腸生検も得た。ＰＢＭＣおよびＬＰＭＣは、標準Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配およびＤＮＡｓｅ／コラゲナーゼ消化プロトコルをそれぞれ使用して単離した。ＴｒｅｇはＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｈｉＣＤ１２７^ｌｏＦＯＸＰ３^＋であると識別された。Ｔｅｆｆは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^－ＣＤ１２７^＋ＦＯＸＰ３^－集団であると識別された（ゲーティングストラテジーを、図１ａに示す）。インテグリンβ７を発現した末梢血中のＴｅｆｆは、Ｔｒｅｇと比較して、有意に多かった（２７．９１±１８．１９対１０．８１±７．９１９、ｐ＜０．０００１）。β７を発現する細胞の割合が減少したことに加え、また、β７の平均蛍光強度（ＭＦＩ）により評価されたように、細胞あたりの発現に違いがあった（９３２±８００．７対５７５．４±５０９．４、ｐ＜０．０００１）（図１ａ：代表的なフロープロット、図１ｂ：サマリーデータ）。同様に、ＣＤ患者の粘膜固有層において、Ｔｒｅｇに比べてβ７陽性のＴｅｆｆの割合が有意に大きかった（３０．９４±２６．４対２３．７５±２５．５６、＝０．０００４）。この違いもまた、ＭＦＩで評価されたように、Ｔｒｅｇにおけるβ７の細胞あたりの発現が減少していることに関連している（ｐ＜０．０５）（図１ｂ）。ＨＣと比較してＣＤ患者の循環においては、α４β７陽性のＴｒｅｇの割合が低い。図７にα４β７ゲーティングの代表的なフロープロットを示し、サマリーデータを図１ｃに示す（５．２６［３．６１－８．７３］対６．７５［５．２５－９．６５］、ｐ＜０．０５）。活動性疾患を有するＣＤ患者のみをＨＣと比較した場合、その違いはさらに大きい（４．５１［３．８－７．０５］対６．７１［５．１－９．６５］、ｐ＝０．００６３）（図１ｃ）。α４β７^＋である循環しているＴｒｅｇの割合は、チオプリンまたは生物療法による影響を受けなかった（図８）。ＣＤにおける抗α４β７モノクローナル抗体ベドリズマブの有効性を考慮して、ＨＣと比較するために、ＣＤ患者の粘膜固有層における制御性Ｔ細胞とエフェクターＴ細胞とのバランスを検証した。ＣＤ患者の粘膜固有層にあるα４β７^＋Ｔｅｆｆの割合が、Ｔｒｅｇに比べて、有意に大きかった（３０．９４±２６．４０対２３．７５±２５．５６、ｐ＝０．００１６）（図１ｄ）。ＨＣでは、このような違いが無かった（図１ｄ）。ＨＣと比較して、ＣＤ患者の粘膜固有層は、α４β７^＋Ｔｒｅｇの割合が有意に増加した（１４．２［６．２９－３０］対６．３８［３．６２－１０．３２］、ｐ＝０．０４９）。ただし、ＨＣと比較して、ＣＤにおけるα４β７^＋Ｔｅｆｆｓの割合はさらに大きいな増加があり、（２１．３０［１４．７－３４．１］対５．０５［２．７６－１０．８］、ｐ＝０．０００２）（図１ｄ）、患部の組織におけるＴｅｆｆとＴｒｅｇのバランス障害を示唆している。

α４β７^＋である循環しているＴｒｅｇの減少が、単独の悪化なのか、それとも全体的なＴｒｅｇの欠乏の結果なのかを確認するために、ＣＤ患者における循環しているＴｒｅｇの割合を解析し、ＨＣのそれと比較した。ＣＤ患者とＨＣとでは、循環しているＴｒｅｇの割合に違いはないことがわかった（７．２４［６．００－９．０７］対６．５２［５．６５－７．４３］、ｐ＝ｎｓ）。ただし、ＣＤ患者はＨＣよりも、循環しているＴｅｆｆの割合が有意に小さかった（９０．９５［８８．２０－９２．５８］対９２．２［９１．００－９３．５］、ｐ＜０．０５）。ＣＤ患者を疾患の活動性に基づいて分けると、活動性疾患の患者は、ＨＣと比較して循環しているＴｒｅｇの割合が有意に高かった（７．４３［６．２６－９．２５］対６．５２［５．６５－７．４４］、ｐ＜０．０５）（図１ｅ）。このように、α４β７^＋である循環しているＴｒｅｇの減少は、ＣＤにおける全体的なＴｒｅｇの欠乏のためではないと結論付けられる。これらの知見は、ＣＤにおいて循環しているＴｒｅｇの割合が全体的に増加し、疾患が活動性である期間に減少するが、ＨＣの循環しているＴｒｅｇの割合よりは高いままである、という、以前の報告とは逆である^{１９，３０，３１}。

この欠乏がα４β７の発現に特異的なのか、それとも他の主要な腸管トラフィッキング分子にも及ぶものなのかを評価するために、ＣＤ患者のＴｒｅｇおよびＴｅｆｆ上での腸ホーミングケモカイン受容体ＧＰＲ１５およびＣＣＲ９の発現を評価し、ＨＣ患者のものと比較した。循環におけるＧＰＲ１５^＋Ｔｒｅｇの割合は、ＣＤ患者とＨＣの間では違いが無かった。ただし、ＣＤ患者におけるＧＰＲ１５^＋である循環しているＴｅｆｆの割合は、有意に高かった（２．１１［０．８６－５．９３］対１．０６［０．４３－３．４５］、ｐ＜０．０５）（図１ｆ）。ＣＣＲ９の発現の評価では、ＣＤ患者においてＣＣＲ９を発現したＴｒｅｇ（１．８２［０．７３－４．５］対１．２３［０．６７－２．０９］、ｐ＜０．０５）およびＴｅｆｆ（１．５５［０．４３－１７．３］対０．４９［０．２８－１．２４］、ｐ＝０．０００４）が、ＨＣと比較して有意に多いことがわかった（図１ｇ）。また、粘膜固有層におけるＧＰＲ１５^＋細胞の割合を評価した。ＣＤ患者は、Ｔｅｆｆよりも、ＧＰＲ１５^＋Ｔｒｅｇの割合が高かった（２０．３７±１７．０３対１２．８３±１０．７７、ｐ＝０．００３９）。粘膜固有層におけるＧＰＲ１５^＋Ｔｒｅｇの割合は、ＣＤ患者とＨＣでは同様であったが、ＧＰＲ１５^＋Ｔｅｆｆの割合に有意の違いがあった（９．６１［４．５６－１８．８］対４．２１［３．０２－８．２７］、ｐ＜０．０５）。

ＣＤにおける腸管ホーミングＴｒｅｇとＴｅｆｆのダイナミクスを完全に理解するために、α４β７^＋ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆの割合がチオプリンまたは抗ＴＮＦ治療によって影響されるかどうかを評価した。チオプリンも抗ＴＮＦ治療も、腸管にトラフィッキングするようにライセンスされたＴｒｅｇまたはＴｅｆｆの割合に影響を与えているようには見えず（図７）、トラフィッキングと炎症促進性経路とは、機構的に別であることを示唆している。

ＲＡＲ５６８は、ＡＴＲＡよりも、より効率良くかつ強力にα４β７を誘導する
ＣＤ患者の粘膜固有層の制御性およびエフェクターＴ細胞のバランスに対処するために、α４β７の高度な発現により腸管へのトラフィッキングをライセンスされた、自家エクスビボ増殖させたＴｒｅｇの、高度に抑制性の、表現型が安定している集団を開発しようとした。これら細胞は、その後、自家細胞を利用したＣＤの治療に利用することができうる。α４β７の誘導の際のＡＴＲＡの影響をＲＡＲ５６８と比較し、ＣＤに対するＴｒｅｇ治療の臨床治験において下流の用途により適した薬剤を判定した。以前に定義したように^２２、我々の標準的な培養条件はＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｈｉＣＤ１２７^ｌｏＣＤ４５ＲＡ^＋ナイーブＴｒｅｇのサブセットを使用し、ラパマイシン（ＲＡＰＡ）および高用量のＩＬ－２の存在下で培養をおこなった。標準条件（ＲＡＰＡ）下で培養された細胞と比較して、標準的な培養条件にＲＡＲ５６８を追加して（Ｒａｐａ＋ＲＡＲ５６８）培養された細胞は、α４β７を有意に多く発現した（９５．９±１．９３対５．９４７±３．１８、ｐ＜０．０００１； ゲーティングストラテジーを図２ａに示す）。加えて、ＲＡＲ５６８の存在下で培養された細胞は、ＡＴＲＡの存在下で培養された細胞よりも、より多くのα４β７を累積的に発現した（９５．８９±１．９３対７４．２１±２５．８９、ｐ＝０．０２４；図２ｂ）。インテグリンβ７の発現を誘導するＲＡＲ５６８の影響は、ＡＴＲＡと比較して、はるかに低い濃度で顕著であり（図２ｃ）、ＲＡＲ５６８についてはＥＣ５０が０．０１ｎＭ／Ｌであるのに対し、ＡＴＲＡについてはＥＣ５０が１．５ｎＭ／Ｌであった。重要なことに、ＲＡＲ５６８の存在下で培養された細胞についてα４β７の発現の標準偏差は、ＡＴＲＡの存在下で培養された細胞よりもかなり低かった（１．９３対２５．８９）が、これはこれらの薬剤が細胞療法に使用された場合の下流での質の管理（quality control）と大きな関係がある。ＣＤ６２Ｌの発現は、リンパ節へのホーミングおよびインテグリンα４β７とそのＭＡｄＣＡＭ－１リガンドとの効果的な相互作用に必要であるが、それはレチノイド処理に左右されず、その後のエクスビボ増殖に維持される（図９）。

ＲＡＲ５６８による処理はＴｒｅｇ安定性または抑制能力に影響を及ぼさない
ＲＡＲ５６８の存在下での細胞増殖は、高レベルのＦＯＸＰ３を発現する（９６．９９％±３．５１）。この値は、標準条件下で増殖させた細胞（９６．０３±６．１８）やＡＴＲＡの存在下で増殖させた細胞（８６．１５±１９．８８）と、有意な差があるわけではない（図２ｄ）。しかしながら、ＡＴＲＡの存在下で増殖させたＴｒｅｇ（４０．２～９９．７の範囲、ＳＤ１９．８８）は、ＲＡＲ５６８の存在下で増殖させたもの（９１．５～９９．８の範囲、ＳＤ３．５１）と比較すると、ＦＯＸＰ３の発現レベルの一貫性が低かった。

ＲＡＲ５６８の存在下で増殖させた細胞は、もっとも低い用量設定（８：１）においても、高い抑制性をしめした。逆に、ＡＴＲＡの存在下で増殖させた細胞は、最も低い用量設定では抑制性が低くなった（ｐ＜０．００５）（図２ｅ）。ＡＴＲＡまたはＲＡＲ５６８の存在下でエクスビボで増殖させたＴｒｅｇは、炎症促進性サイトカインチャレンジ後にＩＬ－１７またはＩＦＮγを産生しなかった（図２ｆ）。

ＲＡＲ５６８による処理は、オフターゲットＲＡＲγ効果と炎症促進性表現型への偏りを回避する。
Ｒａｐａ＋ＡＴＲＡ、Ｒａｐａ＋ＲＡＲ５６８、またはラパマイシンのみの存在下で増殖させた、ＣＤ患者からのＴｒｅｇについて、遺伝子発現解析をおこなった（各群においてｎ＝３）。ＡＴＲＡで処理された細胞と、ＲＡＲ５６８で処理されたＴｒｅｇとの主要な違いは、ＡＴＲＡで処理された群は、ラパマイシンのみのものと比較してＣＤ１６１の転写産物が有意に増加していることであった（ｐ＜０．０５）。ＣＤ１６１は以前より、Ｔヘルパー（Ｔｈ）１７型のＴｒｅｇのマーカーとされている^３２。これは、ＲＡＲ５６８で処理された群では見られなかった。さらに、ＡＴＲＡで処理されたＴｒｅｇは、ＳＴＡＴ４、ＩＬ１８Ｒ１、ＣＤ３８、およびＧＰＲ１７４の発現が２倍以上に増加していた（ｐ＜０．０５）（図３ａ）。ＩＬー１８受容体１およびＳＴＡＴ４は、Ｔｈ１の分化系列決定とＩＦＮγの産生との要因であり、どちらもＧＷＡＳにおいてＩＢＤ疾患関連の遺伝子多型としてそれぞれ認識されてきた^{３３－３６}。ＣＤ３８は、成熟Ｔ細胞に関連するマーカーとして識別され、ＣＤ３８は、増殖が減少する一方で、ＩＦＮγのような炎症促進性サイトカインを産生する能力が増加していることを特徴づける^３７。ＧＰＲ１７４のライゲーションは、Ｔｒｅｇの蓄積および機能にネガティブな影響を及ぼす^３８。ＡＴＲＡで処理された細胞を、ＲＡＲ５６８で処理された細胞と比較すると、標準的な経路についての転写産物でははっきりした違いが認められなかった。

オフターゲットＲＡＲγ効果を評価するために、ＲＡＲ５６８で処理された細胞とＡＴＲＡで処理された細胞の遺伝子発現プロファイルを、ＲＡＲγ標的遺伝子の公開されているデータセットと比較した^３９。９４個のＲＡＲγ標的遺伝子のうちの１１個が、ＡＴＲＡで処理されたサンプルにおいて上方制御されていた一方、ＲＡＲ５６８で処理されたサンプルでは１個だけであった（図３ｂ）。α４β７の誘導に効果があり、オフターゲット効果が無いとすると、細胞療法のためのエクスビボＴｒｅｇ増殖に使用できる薬剤、という、目的となる製品プロフィールをＲＡＲ５６８が満たしている。したがって、機能的なインビトロおよびインビボトラフィッキングアッセイにおいて、ＣＤ患者からのＴｒｅｇに対するＲＡＲ５６８のこの効果を調査した。

α４β７の誘導は、インビトロでもインビボでも機能的に適切である。
ＲＡＲ５６８によるα４β７発現の誘導発の生理学上の関連性を評価するために、ＣＤ患者の処理済および未処理Ｔｒｅｇを、ＭＡｄＣＡＭ－１でコーティングされたフローチャンバーに通した（図１０）。前記チャンバーに付着した細胞の総数と、移動（rolling）、付着、およびゆっくりとした移動（crawling）という細胞のステージとを、標準条件下で増殖させた細胞と比較した。ＲＡＲ５６８で処理された細胞を前記チャンバーに通した時の細胞総数、および移動の各状況の細胞の数を、標準条件下で増殖させた細胞と比較すると、有意に多かった。細胞移動のステージはすべて、インテグリンα４β７に対するモノクローナル抗体（ベドリズマブ）で処理すると、遮断された（図４）。このことは、α４β７の誘導がインビトロに適しているということのみならず、生理学的せん断流れの条件下でα４β７とＭＡｄＣＡＭ－１との相互作用に依存しており、最大の相互作用がＲＡＲαの選択的ライゲーションによって誘発されることも、示している。

α４β７の誘導がインビボで機能的に適しているかどうかを評価するために、ＲＡＲ５６８で処理された細胞または標準条件下で増殖させた細胞を蛍光標識し、ヒト胎児小腸を異種移植したＳＣＩＤマウスに、静脈注射で移入した。マイコバクテリウム・アビウム・パラ結核菌（ＭＡＰ）により、異種移植片に炎症が誘発された。ＭＡＰが異種移植片に侵入して、組織学的にかつ炎症促進性サイトカインの産生により検出可能な炎症を誘発しうることは、以前より示されていた^２９。実験デザインを図５ａに示す。

ＲＡＲ５６８で処理された細胞は、標準条件下で増殖させたＴｒｅｇと比較して、Ｔｒｅｇの移入後７２時間で異種移植片にトラフィッキングする傾向が、有意に高い（ｐ＝０．００５６０；代表的なＦＡＣＳプロット：図５ｂ、累積データ：図５ｃ）。炎症の存在下では、異種移植片へのＴｒｅｇトラフィッキングにおける違いがさらに増加した。炎症を起こしている異種移植片へトラフィッキングされた、ＲＡＲ５６８で処理された細胞は、標準条件下で増殖させたものよりも、有意に増加した（ｐ＝０．００９５；図５ｄ）。ＣＦＳＥ標識したＦＯＸＰ３^＋Ｔｒｅｇの存在は、ＲＡＲ５６８で処理された細胞を移入されたマウスの、炎症を起こしている異種移植片からとった、免疫蛍光標識された凍結切片でも明らかだった（図５ｇ）が、コントロールの異種移植片や、Ｒａｐａで処理された細胞を移入されたものでは、明らかでなかった（図５ｅ～ｆ）。養子移入されたヒト細胞は、胃腸系の外に位置づけられるかもしれないという懸念があるため、脾臓へのＴｒｅｇのトラフィッキングを評価した。ヒトＣＤ４５陽性細胞は、標準条件下で増殖させた細胞で処理されたマウスの脾臓にも、ＲＡＲ５６８で処理された細胞で処理されたものにも、見られなかった（図１１）。

考察
以前の報告^１８とは逆に、ＣＤ患者の末梢血内のエフェクターＴ細胞で、制御性Ｔ細胞よりもインテグリンβ７がより高く発現することがわかった。さらに、活動性のＣＤの患者は、循環しているα４β７^＋Ｔｒｅｇの割合が対応するＨＣよりも有意に低く、腸管にトラフィッキングするようライセンスされているＴｅｆｆの割合が有意に高い。この欠陥如は、循環中に同程度の割合のＧＰＲ１５^＋Ｔｒｅｇを有し、対応するＨＣよりも高い割合のＣＣＲ９^＋Ｔｒｅｇを有するＣＤ患者のすべての腸管ホーミング受容体に影響するわけではない。また、活動性のＣＤの患者では循環しているＴｒｅｇの割合がＨＣと比較して高いので、α４β７^＋Ｔｒｅｇの割合の減少は循環するＴｒｅｇの割合の全体的な減少と相関関係があるわけではない。このように、ＣＤ患者とＨＣコントロールとの間のα４β７^＋Ｔｒｅｇの割合の絶対的な違いは小さい。しかしその一方で、α４β７経路がＣＤ治療用のモノクローナル抗体で治療的にすでに活用されているという事実に加えて、この違いが他のマーカーには存在しないという事実は、この違いが有意であることを示唆している。ＴｒｅｇとＴｅｆｆとがアンバランスであることもまた、ＣＤ患者の粘膜固有層において明らかである。ＣＤにおいて、α４β７^＋Ｔｅｆｆの割合が高いが、ＨＣにおいては、α４β７^＋ＴｒｅｇとＴｅｆｆとの間に均等なバランスがある。この知見の限界は、ＨＣのＬＰＭＣドナーの年齢が対応するＣＤ患者と比べて高いことであり、これは、ＣＤの非存在下で大腸内視鏡検査を受ける患者との避けがたい相関である。年齢の高い対象でのＴｒｅｇの研究は、天然Ｔｒｅｇの増加とｉＴｒｅｇの減少を示唆している^４０。これがＨＣにおけるＴｒｅｇとＴｅｆｆとのよりよいバランスを説明するかもしれないが、しかしこれが、ＣＤ患者と比較してＨＣでは、Ｔｒｅｇがより少なく、Ｔｅｆｆが有意に少ないということを説明するわけではない。腸管ホーミングＴｒｅｇとＴｅｆｆとのアンバランスは、その疾患のうらにある潜在的な発病メカニズムであるかもしれない。このように、炎症を起こしている腸へ向かうようライセンスされているＴｒｅｇの循環集団の治療的増殖により、疾患の解決に寄与するかもしれない臓器における制御性Ｔ細胞とエフェクターＴ細胞とのバランスをリセットできるかもしれない。

ＲＡＲ５６８によりα４β７を確実に一貫して誘導することで、治療予定の患部臓器へトラフィッキングする能力が、Ｔｒｅｇに与えられる。ＲＡＲαの高度に特異的なアゴニストであるＲＡＲ５６８によりα４β７が非常に確実に誘導されることは、これが、ＲＡＲβやＲＡＲγではなく、ＲＡＲαの受容体の下流機能であるという事実と一貫している^４１。標準的なレチノイン酸（ＡＴＲＡ）はインテグリンα４β７の発現を誘導するのに幾分効果的であるが、Ｔｒｅｇを炎症促進性表現型へも偏らせるＡＴＲＡの能力についての懸念がある^{１３，２５}。ＡＴＲＡは、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、およびＲＡＲγと相互に作用しあえるが、しかしながらＲＡＲγに対して非常に高い親和性がある。ＲＡＲ５６８と比較してＡＴＲＡで細胞が処理されたときに、ＦＯＸＰ３の発現、ＩＬ１７およびＩＦＮγの産生において見られるより高い標準偏差は、細胞を炎症促進性表現型へと偏らせるという上記のＡＴＲＡの能力がＲＡＲγの活性化によるものであり、したがってＲＡＲα特異的アゴニストを使用すると回避できるであろうということを示唆している。ＦＯＸＰ３の発現に見られる不均質性は、単にサンプルの純度によるものであると論じられうるが、ＡＴＲＡまたはＲＡＲ５６８の存在下の増殖が同一のドナー由来のサンプルから起こり、従って同じフローソーティングプロトコルを経ることを考えると、その可能性は低い。

ＡＴＲＡで処理された細胞においてＣＤ１６１転写産物の発現が増加していることは、Ｔｈ１７産生表現型へそれらが偏っていることを表している。Ｔｈ１７応答へ偏った免疫のアンバランスがＣＤの発病に関係している^４２ため、ＩＬ１７を分泌する能力を有する増殖させた細胞集団（expanded cell population）を、ＣＤ患者の炎症を起こしている腸管へ導入することは、軽率であろう。同様に、ＡＴＲＡで処理された細胞にＳＴＡＴ４およびＩＬ－１８Ｒ１およびＣＤ３８を誘導すれば、炎症促進性の条件下での表現型のようなＴｈ１へ偏らせ、ＩＦＮγを分泌する能力を、それらに付与し増加させるかもしれない。インビトロでＡＴＲＡで細胞を処理する目的が、腸管への移動を引き起こすことであると考えると、Ｔｒｅｇの移動を妨げる、ＡＴＲＡによるＧＰＲ１７４の誘導は、その目的を妨害するだろう。ＲＡＲ５６８で処理された細胞においてＲＡＲγ標的遺伝子の誘導のほぼ完全な欠如は、アゴニストのアルファ選択性をさらに確定し、このことから、それが臨床治験における大規模なＴｒｅｇ製造に使用される時に、オフターゲット効果がないであろうことが確信される。

標準条件下で増殖させた患者由来のＴｒｅｇｓは、低いレベルのα４β７を発現するが、しかしながら、Ｉｂｉｄｉフローチャンバー実験においてＭＡｄＣＡＭ－１が存在するときに示した移動（rolling）、付着、および活性は無視してよいほどのレベルであった。対照的に、ＲＡＲ５６８で処理された細胞は、非常に効率的にこのリガンドと相互作用し、非選択的なＲＡＲアゴニストであるＡＴＲＡで処理された細胞よりもかなり大きな程度で相互作用した。このことは、内皮移動のステージを通じて細胞が進行するために、α４β７の高レベルの発現が必要とされることを示唆している。ベドリズマブによる処理によってフローチャンバー内のＭＡｄＣＡＭ－１とＲＡＲ５６８で処理されたＴｒｅｇとの間の相互作用を完全に遮断するということは、このプロセスがα４β７に依存していることを証明している。まとめると、ＲＡＲ５６８で処理された細胞を炎症促進性の環境に移入すると、その細胞は、ＣＤで炎症を起こしている腸管など、ＭＡｄＣＡＭ－１が上方制御されている組織へ向かうということである。

エクスビボ増殖させたＴｒｅｇが、インビボで生存し続け、炎症を起こしている腸へ移動する能力を有することを更に確認するために、標準条件下またはＲＡＲ５６８の存在下で増殖させた細胞を、ヒト胎児小腸を異種移植したＳＣＩＤマウスに移入した。このモデルにおける移植組織は、ＭＡｄＣＡＭ－１４３を発現して、通常の成人ヒト腸管と機能的および形態学的に同じ組織に発展することが知られている^{２８，２９}。異種移植片に炎症を誘発するようＭＡＰが選ばれたが、それは肉芽腫性の炎症を起こすからであり、これによってＣＤにおこる炎症の適切なモデルが提供される。また、杯細胞に侵入してこのモデルに炎症を誘発するＭＡＰの能力については、以前から説明されている^２９。

特に炎症が誘発されたときに、有意に多くのＲＡＲ５６８で処理された細胞が、異種移植片へ向かうことが見出された。したがって、ＭＡｄＣＡＭ－１の発現を誘導することによって、このモデルにおける炎症性プロセスが、ＲＡＲ５６８で処理された細胞（一様にα４β７^＋である）をより多く、炎症を起こしている異種移植ヒト腸管へ引き寄せる、と言えよう。これは、我々のインビトロの知見と類似しており、ＲＡＲ５６８での処理の後に、ＴｒｅｇがＣＤのための細胞療法の今後の治験で投与されれば、炎症を起こしている腸管へ向かうだろうということを示唆している。

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Claims (22)

1. 改善された機能を有する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を作製する方法であって、免疫介在性の腸管障害を有する対象由来のＴｒｅｇを、少なくとも一つのＲＡＲαアゴニスト、その機能的類似体または誘導体に接触させることを含み、前記ＲＡＲαアゴニストは、ＲＡＲβまたはＲＡＲγよりもＲＡＲαに対して選択的である、方法。
2. 前記Ｔｒｅｇは、末梢血、胸腺、リンパ節、脾臓、骨髄などの生体試料から得られる、請求項１に記載の方法。
3. 前記Ｔｒｅｇは、前記生体試料から単離され、場合によってはセルソーティングによって、好適にはフローサイトメトリーによって単離される、請求項２に記載の方法。
4. 前記単離されたＴｒｅｇは増殖され、前記増殖中に、少なくとも一つのＲＡＲαアゴニスト、その機能的類似体または誘導体の有効量に接触させる、請求項３に記載の方法。
5. エクスビボ増殖させた機能が改善されたＴｒｅｇを得る工程が後に続く、請求項４に記載の方法。
6. 前記エクスビボ増殖させたＴｒｅｇが、免疫介在性の腸管障害を患う対象に導入され、前記対象は、前記Ｔｒｅｇを含む生体試料が採取された対象と同じであってもよい、請求項５に記載の方法。
7. 前記対象の障害に結果として生じる改善を、モニタリングすること、または検出することが後に続く、請求項６に記載の方法。
8. 前記改善されたＴｒｅｇ機能は、増加した腸管ホーミング能力、および／または増加したα４β７インテグリン発現、および／または増加したＣＣＲ９発現、および／または向上したＴｒｅｇ保持力、および／または増加した力価を含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
9. 前記ＲＡＲαアゴニストは、ＲＡＲβまたはＲＡＲγに対する特異性よりもＲＡＲαに対する特異性が大きい、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
10. 前記ＲＡＲαアゴニストは、ＲＡＲ５６８、ＡＭ５８０、ＡＭ８０（タミバロテン）、ＲＸ－１９５１８３、ＢＭＳ７５３、ＢＤ４、ＡＣ－９３２５３、およびＡＲ７からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
11. 前記免疫介在性の腸管障害が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、特にクローン病（ＣＤ）；または大腸炎、たとえば潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、チェックポイント関連の大腸炎、治療抵抗性のクロストリジウム・ディフィシル関連の大腸炎など、または腸管が関係するＧｖＨＤ；セリアック病；自己免疫性胃炎から選択される、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
12. 前記Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ Ｔ細胞；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－／ｌｏｗ Ｔ細胞；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ１２７－／ｌｏｗ Ｔ細胞；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－ＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔ細胞；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔ細胞；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ Ｔ細胞；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ＋ Ｔ細胞から選択される、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
13. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法によって得られる、エクスビボ増殖させたＴｒｅｇであって、増加した腸管ホーミング能力、および／または増加したα４β７インテグリン発現、および／または向上したＴｒｅｇ保持力、および／または増加した力価を有する、Ｔｒｅｇ。
14. 腸管ホーミング分子、特にα４β７インテグリンおよび／またはＣＣＲ９を（過剰）発現するように改変された、改変Ｔｒｅｇ。
15. 増加した腸管ホーミング能力、および／または増加したα４β７インテグリン発現、および／または増加したＣＣＲ９発現、および／または向上したＴｒｅｇ保持力、および／または増加した力価を含む、請求項１４に記載の改変Ｔｒｅｇ。
16. 遺伝子編集により、または未改変ｔｒｅｇに少なくとも一つの腸管ホーミング分子を含むポリヌクレオチドまたはベクターを（たとえば、形質導入や遺伝子導入により）導入することにより、前記Ｔｒｅｇが改変され、場合によっては前記腸管ホーミング分子がα４β７インテグリンおよび／またはＣＣＲ９から選択される、請求項１４または１５に記載の改変Ｔｒｅｇ。
17. 免疫介在性の腸管障害の治療、改善または予防のための、請求項１３～１６のいずれか一項に記載のＴｒｅｇを含む医薬組成物。
18. 請求項１３に記載のエクスビボ増殖させたＴｒｅｇ、および／または請求項１３～１６のいずれか一項に記載の改変Ｔｒｅｇ、および／または請求項１７に記載の医薬組成物を、免疫介在性の腸管障害を有する対象に投与することを含む、免疫介在性の腸管障害の治療方法。
19. 前記治療は、治療以前のレベルと比較して、その同等以上のレベルのα４β７＋ ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆを回復する、請求項１８に記載の治療方法。
20. 免疫介在性の腸管障害の治療、改善または予防に使用するための、請求項１３に記載のエクスビボ増殖させたＴｒｅｇ、および／または請求項１３～１６のいずれか一項に記載の改変Ｔｒｅｇ、請求項１７に記載の医薬組成物、ＲＡＲαアゴニストおよびその類似体および誘導体。
21. 前記免疫介在性の腸管障害が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、特にクローン病（ＣＤ）；大腸炎、たとえば潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、チェックポイント関連の大腸炎、治療抵抗性のクロストリジウム・ディフィシル関連の大腸炎など、または腸管が関係するＧｖＨＤ；セリアック病；自己免疫性胃炎から選択される、請求項２０に記載の使用。
22. エクスビボ増殖させたＴｒｅｇの産生に使用するための、培養および／または増殖の培地であって、少なくとも一つのＲＡＲαアゴニスト、その機能的類似体または誘導体を含む培地。

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