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JP2022554042A - バイオマーカー型治療用組成物 - Google Patents

バイオマーカー型治療用組成物 Download PDF

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JP2022554042A JP2020560797A JP2020560797A JP2022554042A JP 2022554042 A JP2022554042 A JP 2022554042A JP 2020560797 A JP2020560797 A JP 2020560797A JP 2020560797 A JP2020560797 A JP 2020560797A JP 2022554042 A JP2022554042 A JP 2022554042A
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Abstract

本発明は、プロテインキナーゼ阻害剤に対して耐性のある患者を治療するための抗癌剤であって、チエノピリジン誘導体化合物またはその薬学的に許容される塩を活性成分として含む抗癌剤、を提供する。ここで、患者は、活性ＲＯＮを保有する患者であり得る。さらに、患者は、正常なＫＲＡＳを保有する患者であり得る。さらに、抗癌剤は、ＥＧＦＲ阻害剤に対して耐性のある患者に適用され得る。特に、抗癌剤は、治療剤セツキシマブに対して耐性のある患者を治療するために有用に使用され得る。

Description

本発明は、活性ＲＯＮキナーゼを保有する癌患者に適用可能なチエノピリジン誘導体、およびそれを含む医薬組成物に関する。
セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の阻害剤である。特に、ＥＧＦＲは、転移性結腸癌、転移性非小細胞肺癌、および頭頸部癌の癌細胞において過剰発現しているため、セツキシマブは、そのような疾患の治療に主に使用される。しかしながら、セツキシマブは、抗がん剤に耐性のある患者には使用できない。セツキシマブに対する耐性は、いくつかの理由で生じる。典型的には、ＥＧＦＲシグナル伝達系にあるＫＲＡＳなどのタンパク質に変異がある癌細胞は、セツキシマブに対する耐性がある。したがって、効果的な癌治療のために、従来の抗癌剤に耐性のある患者に適した新しい抗がん剤が求められる。
一方、細胞内シグナル伝達系で最も重要なタンパク質の１つは、プロテインキナーゼである。プロテインキナーゼは、他のタンパク質をリン酸化して、タンパク質の活性、位置および機能を調節し、それによって細胞内シグナル伝達プロセスを制御する。プロテインキナーゼとしては、例えば、ＡＢ１、ＡＣＫ、ＡＬＫ、ＡＲＧ、ＡＲＫ５、ＡＵＲＯＲＡ、ＡＸ１、ＢＭＸ、ｃ－ＭＥＴ、ｃ－ＲＡＦ、ｃ－ＳＲＣ、ＥＧＦＲ、ＦＡＫ、ＦＥＳ、ＦＧＦＲ、ＦＬＴ３、ＧＳＫ３、ＩＧＦ、ＩＫＫ、ＪＡＫ、ＬＣＫ、ＬＩＭＫ、ＬＹＮ、ＭＥＫ、ＭＥＲ、ＭＫ－２、ＲＥＴ、ＲＯＮ、ＲＯＳ、ＲＳＥ、などが挙げられる。これらのプロテインキナーゼの変異は、癌、免疫疾患、神経疾患、代謝疾患、および感染症などの疾患をもたらす可能性がある。
これらの中で、癌細胞における異常なｃ－ＭＥＴ活性化は、抗癌療法の予後の悪化と密接に関連していると報告されている。特に、ｃ－ＭＥＴの過剰発現と変異は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などのいくつかの癌疾患において観察されている。腫瘍の浸潤と転移は、癌患者の主な死因であり、したがって、ｃ－ＭＥＴシグナル伝達の阻害は、癌治療に有効である可能性がある。特に、ＲＯＮ（ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ ｎａｎｔａｉｓ）は、ｃ－ＭＥＴファミリーに属するタンパク質受容体を意味し、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）の受容体、血清タンパク質であり、肝臓から分泌され、マクロファージの作用を調節する。ＲＯＮ活性は、腫瘍の発生、進行および転移に重要な役割を果たす。特に、結腸癌および乳癌におけるその過剰発現または過剰活性は、腫瘍の浸潤と転移を誘発し、アポトーシスを阻害することの一因となることが報告されている。
したがって、異常に活性化したＲＯＮの活性を特異的に阻害することが可能な物質を用いることにより、ＲＯＮに関連する様々な疾患、特に結腸癌などの腫瘍を効果的に治療することが可能である。そのため、異常に活性化したＲＯＮの活性を阻害することができる抗癌剤を開発することが緊急に必要とされている。
本発明は、異常に活性化したＲＯＮの活性を阻害することが可能な化合物またはその薬学的に許容される塩を活性成分として含む、癌治療用医薬組成物を提供することを目的とする。特に、本発明は、セツキシマブなどの抗癌剤に耐性のある患者においてその作用を効果的に発揮することができる医薬組成物を提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、セツキシマブなどのプロテインキナーゼ阻害剤に対して耐性のある患者を治療するための抗癌剤であって、式１で表されるチエノピリジン誘導体化合物またはたはその薬学的に許容される塩を活性成分として含む抗癌剤、が提供される。
本開示による抗癌医薬組成物は、活性ＲＯＮキナーゼを保有する癌患者に適用可能である。特に、医薬組成物は、抗癌療法に従来使用されているセツキシマブに耐性のある患者を治療するために有用に使用することができる。
図１は、ＲＯＮ変異体（Δ１６０）を保有する結腸癌腫瘍細胞株（ＫＭ１２Ｃ）における、サンプル化合物の濃度（１μＭおよび５μＭ）に応じた細胞死率（％）を示すグラフである。 図２は、ＲＯＮ変異体（Δ１６０）を保有するＫＭ１２Ｃ細胞株に対して複数の濃度で実施例１８の処理を行い、次いで、活性ＲＯＮ（ｐＴｙｒ－ＲＯＮ）の発現の減少を測定することによって得られた結果を表す。 図３は、ＲＯＮ変異体（Δ１６０）についてキナーゼアッセイを実施することによって得られた結果を表す。 図４は、ＲＯＮ変異体（Δ１５５）についてキナーゼアッセイを実施することによって得られた結果を表す。 図５は、Ｃｏｌｏ３２０ＨＳＲ細胞株についてＲＯＮ変異体（ｍｔ＃１：Δ１６０、ｍｔ＃２：Δ１５５）を過剰発現させて、次いで、実施例１８の有効性を測定することによって得られた結果を表す。 図６は、Ｃｏｌｏ３２０ＨＳＲ細胞株についてＲＯＮ変異体（ｍｔ＃１：Δ１６０、ｍｔ＃２：Δ１５５）を過剰発現させて、次いで、実施例１８の有効性をウェスタンブロッティングで測定することによって得られた結果を表す。 図７は、ＲＯＮ変異体（Δ１６０）を保有するＫＭ１２Ｃ細胞株に対して実施例１８の処理を行い、次いで、実施例１８の作用機序を分析するために、活性ＲＯＮ（ｐＴｙｒ－ＲＯＮ）の発現の減少を測定することによって得られた結果を表す。 図８は、ＫＭ１２Ｃ細胞株が移植された動物モデルにおいて、実施例１８の腫瘍増殖阻害効果を測定することによって得られた結果を表す。 図９は、ＫＭ１２Ｃ細胞株が移植された動物モデルにおいて、実施例１８の腫瘍増殖阻害効果を測定することによって得られた結果を表す。 図１０は、ＫＭ１２Ｃ細胞株が移植された動物モデルに実施例１８を投与した場合における、マウスの体重変化を測定することによって得られた結果を表す。 図１１は、ＫＭ１２Ｃ細胞株が移植された動物モデルに実施例１８による処置を行った場合における、活性ＲＯＮ（ｐＴｙｒ－ＲＯＮ）、ｐ－ＥＲＫ、および切断カスパーゼ３の発現の変化を測定することによって得られた結果を表す。 図１２は、ＫＭ１２Ｃ細胞株が移植された動物モデルに実施例１８を投与し、投与終了後に腫瘍を摘出し、活性ＲＯＮ（ｐＴｙｒ－ＲＯＮ）および切断カスパーゼ３の発現の変化を測定することによって得られた結果を表す。 図１３は、ＫＭ１２Ｃ細胞が移植された動物モデルに実施例１８を投与した場合における、実施例１８の腫瘍増殖阻害効果を分析することによって得られた結果を表す。 図１４は、ＫＭ１２Ｃ細胞が移植された動物モデルに実施例１８を投与し、その後、マウスの状態およびそれぞれのマウスから摘出した腫瘍のサイズを分析することによって得られた結果を表す。 図１５は、ＫＭ１２Ｃ細胞株が移植された動物モデルに実施例１８を投与した場合における、マウスの体重変化を測定することによって得られた結果を表す。 図１６は、ＫＭ１２Ｃ細胞株が移植された動物モデルにおいて、有効用量濃度を確認することによって得られた結果を表す。 図１７は、ＫＭ１２Ｃ細胞株が移植された動物モデルにおいて、有効用量濃度を確認することによって得られた結果を表す。 図１８は、結腸癌患者の組織が移植された動物モデルにおいて、実施例１８の有効性を分析することによって得られた結果を表す。 図１９は、結腸癌患者の組織が移植されたマウスに実施例１８を投与し、その後、マウスの状態およびそれぞれのマウスから摘出した腫瘍のサイズを分析することによって得られた結果を表す。 図２０は、結腸癌患者の組織が移植された動物モデルにおいて、実施例１８の有効性を分析することによって得られた結果を表す。 図２１は、結腸癌患者の組織が移植された動物モデルから摘出した腫瘍のサイズを分析することによって得られた結果を表す。 図２２は、結腸癌患者由来の細胞株において、活性ＲＯＮの発現に応じた、実施例１８の細胞殺傷効果を分析することによって得られた結果を表す 図２３は、結腸癌患者由来の細胞株において、活性ＲＯＮの発現に応じた、実施例１８の有効性を分析することによって得られた結果を表す。 図２４は、ＲＯＮが発現されていない結腸癌患者由来の細胞株において、実施例１８の細胞殺傷効果を分析することによって得られた結果を表す。 図２５は、ＲＯＮが発現されていない結腸癌患者由来の細胞株において、実施例１８の有効性を分析することによって得られた結果を表す。 図２６は、結腸癌細胞株において、バイオマーカー（ＲＯＮ変異体）の遺伝子分析を実施することによって得られた結果を表す。 図２７は、韓国人の結腸癌患者群において、ＲＯＮ変異体の遺伝子分析を実施することによって得られた結果を表す。 図２８は、韓国人の結腸癌患者群において、ＲＯＮ変異体およびＫＲＡＳ変異体の遺伝子分析を実施することによって得られた結果を表す。 図２９は、白人の結腸癌患者群において、ＲＯＮ変異体の遺伝子分析を実施することによって得られた結果を表す。 図３０は、白人の結腸癌患者群において、ＲＯＮ変異体およびＫＲＡＳ変異体の遺伝子分析を実施することによって得られた結果を表す。 図３１は、結腸癌患者の腫瘍細胞が移植された動物モデルから得た組織において、遺伝子分析を実施して、ＲＯＮ変異体およびＫＲＡＳ変異体を測定することによって得られた結果を表す。
以下、本発明についてより詳細に説明する。
用語の定義
本明細書において、「ハロゲン」との用語は、特に断りのない限り、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩを意味する。
「アルキル」との用語は、特に断りのない限り、直鎖または分枝の飽和炭化水素基を意味する。例えば、「Ｃ１－１０アルキル」とは、１～１０個の炭素原子からなる骨格を有するアルキルを意味する。具体的には、Ｃ１－１０アルキルとして、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｉ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｉ－ペンチル、ｔ－ペンチル、ｓｅｃ－ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、などを挙げることができる。
「ハロアルキル」との用語は、１つまたは複数のハロゲン原子で置換されたアルキルを意味する。具体的には、ハロアルキルは、同種の２つ以上のハロゲン原子で置換されたアルキル、または、２種以上のハロゲン原子で置換されたアルキル、であってもよい。
「ヘテロ環」との用語は、１つまたは複数のヘテロ原子を有する芳香族環または非芳香族環を意味し、これは、飽和または不飽和であってよく、単環式または多環式であってもよい。例えば、「４～１０員のヘテロ環」は、ヘテロ原子と炭素原子を含む合計４～１０個の原子からなる骨格を有するヘテロ環を意味する。具体的には、４～１０員のヘテロ環として、例えば、アゼチジン、ジアゼチジン、ピロリジン、ピロール、イミダゾリジン、イミダゾール、ピラゾリジン、ピラゾール、オキサゾリジン、オキサゾール、イソオキサゾリジン、イソオキサゾール、チアゾリジン、チアゾール、イソチアゾリジン、イソチアゾール、ピペリジン、ピリジン、ピペラジン、ジアジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパン、ジアゼパン、などを挙げることができる。
「ヘテロ原子」との用語は、炭素（Ｃ）以外の原子を意味し、具体的には、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、または硫黄（Ｓ）原子であってよい。
「置換」との用語は、化学的に安定な化合物が、指定された原子の原子価を超えずに得られるように、分子構造内の水素原子を置換基で置き換えることを意味する。例えば、「Ａ基が置換基Ｂで置換されている」との表現は、Ａ基の骨格を構成する炭素原子などの原子に結合している水素原子が、置換基Ｂに置き換えられ、Ａ基と置換基Ｂとが共有結合を形成することを意味する。
医薬組成物
本発明の一態様において、式１：
Figure 2022554042000002
 ［式中、
ＲＡは、Ｃ１－１０アルキル、フェニル、またはベンジルであり、ここで、ＲＡは、任意に、ハロゲンおよびＣ１－１０アルコキシから選択される１つまたは複数の置換基を有していてもよく；
Ｘは、－Ｃ（－ＲＢ’）＝、または－Ｎ＝であり；
ＲＢおよびＲＢ’は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１－１０アルキル、またはＣ１－１０アルコキシであり；
ＲＣは、Ｈ、ハロゲン、またはＣ１－１０アルキルであり；
Ｌは、単結合、またはＣ１－６アルキレンであり；
Ｒは、ＮおよびＳから選択される１つまたは２つのヘテロ原子を有する、５～８員のヘテロ環であり；
ＲＤは、Ｈ、Ｃ１－１０アルキル、－（ＣＨ２）ｎＹ－ＲＧ、または－ＣＨ２－ＮＲＥＲＦであり；
ＲＥおよびＲＦは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１－１０アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＹ－ＲＧであるか、あるいは、ＲＥおよびＲＦが互いに繋がって、それらが結合するＮ原子と一緒になって４～１０員のヘテロ環を形成し；
ここで、ｎは、０～１０の整数であり；Ｙは、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－、または－Ｓ（＝Ｏ）２－であり；ＲＧは、直鎖または分岐のＣ１－１０アルキルであり、ただし、ＲＧは、非置換であるか、あるいは、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシル、およびＣ１－６アルコキシからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換されており；そして、
該４～１０員のヘテロ環は、ＲＥおよびＲＦが結合しているＮ原子に加えて、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１つまたは２つのヘテロ原子を任意にさらに含んでよく、非置換であるか、あるいは、ハロゲン、およびＣ１－６アルキルから選択される１つまたは複数の置換基により置換されている。］
により表される化合物、またはその薬学的に許容される塩を活性成分として含む、プロテインキナーゼ阻害剤に対して耐性のある癌患者を治療するための、医薬組成物、が提供される。
一実施形態によれば、式１において、ＲＡが、メチル、フェニル、ハロベンジル、またはハロフェニルであり得る。
一実施形態によれば、式１において、ＲＢおよびＲＢ’が、それぞれ独立して、Ｈ、メチル、メトキシ、またはエトキシであり得る。
一実施形態によれば、式１において、Ｘが、－Ｃ（－ＲＢ’）＝であり得；そして、ＲＢおよびＲＢ’が、それぞれ独立して、Ｈ、メチル、メトキシ、またはエトキシであり得、任意に、ＲＢおよびＲＢ’は同時にＨでなくてよい。
一実施形態によれば、式１において、ＲＣが、Ｈまたはハロゲンであり得る。ここで、ハロゲンは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩであり得る。
一実施形態によれば、式１において、Ｌが、単結合またはメチレンであり得；そして、Ｒが、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピペラジニル、またはチアゾリルであり得る。
一実施形態によれば、式１において、ＲＤが、Ｈ、メチル、エチル、メトキシメチル、または－ＣＨ２－ＮＲＥＲＦであり得；そして、ＲＥおよびＲＦが、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、または－Ｃ１－６アルキレン－Ｏ－Ｃ１－１０アルキルであり得、任意に、ＲＥおよびＲＦは同時にＨでなくてよい。
一実施形態によれば、式１において、ＲＥおよびＲＦが、それらが結合するＮ原子と一緒になって
Figure 2022554042000003
 ［式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｃ１－３アルキレンであり；そして、Ａは、－Ｎ（－Ｃ１－６アルキル）－、または－Ｏ－である。］
を形成し得る。
一実施形態によれば、式１において、ＲＡが、メチル、フェニル、ハロベンジル、またはハロフェニルであり得；Ｘが、－ＣＨ＝であり得；ＲＢが、Ｈ、メチル、メトキシ、またはエトキシであり得；ＲＣが、Ｈ、またはハロゲンであり得；Ｌが、単結合、またはメチレンであり得；Ｒが、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、チアゾリル、またはピペラジニルであり得；ＲＤが、Ｈ、メチル、エチル、メトキシメチル、または－ＣＨ２－ＮＲＥＲＦであり得、ここで、ＲＥが、－Ｃ２Ｈ４－Ｏ－ＣＨ３であり得、ＲＦが、Ｈまたはメチルであり得、あるいは、ＲＥおよびＲＦが互いに繋がって、それらが結合するＮ原子と一緒になって、モルホリンまたはメチルピペラジニルを形成し得る。ここで、ハロゲンは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩであり得る。
本発明には、式１により表される化合物の薬学的に許容される塩が含まれる。薬学的に許容される塩は、ヒトに対する毒性が低く、親化合物の生物学的活性および物理化学的特性に悪影響を及ぼさないものである。
例えば、薬学的に許容される塩としては、薬学的に許容される遊離酸で形成された酸付加塩が挙げられる。遊離酸としては、無機酸または有機酸を用いることができ、ここで、無機酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、過塩素酸、臭素酸、などが挙げられ；有機酸としては、酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、フマル酸、マレイン酸、マロン酸、フタル酸、コハク酸、乳酸、クエン酸、グルコン酸、酒石酸、サリチル酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、エンボン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、などが挙げられる。
酸付加塩は、従来の方法、例えば、式１の化合物を過剰量の酸性水溶液に溶解し、得られた塩を、メタノール、エタノール、アセトン、またはアセトニトリルなどの水混和性有機溶媒を用いて、沈殿させることによって製造することができる。
さらに、薬学的に許容される塩は、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩）、またはアルカリ土類金属塩（例えば、カリウム塩）であってもよい。アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩は、例えば、式１の化合物を過剰量のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物の溶液に溶解し、溶解しない化合物の塩をろ別し、その後、ろ液をエバポレートおよび乾燥することによって、得ることができる。
さらに、本発明の化合物は、キラル炭素中心を有していてもよく、したがって、ＲまたはＳの異性体、ラセミ化合物、個々のエナンチオマーまたはその混合物、または、個々のジアステレオマーまたはその混合物、の形態で存在し得る。そのような立体異性体およびその混合物はすべて、本発明の範囲内に含まれ得る。
さらに、本発明の化合物には、式１の化合物の水和物および溶媒和物が含まれ得る。水和物および溶媒和物は、公知の方法を用いて製造することができ、好ましくは、無毒性で水溶性である。特に、水和物および溶媒和物は、好ましくは、１～５分子の水およびアルコール溶媒（特に、エタノールなど）のそれぞれと組み合わせることによって、形成することができる。
一実施形態によれば、式１により表される化合物の具体例は、以下の通りである：
１） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
２） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
３） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
４） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
５） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（ピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
６） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（ピリジン－３－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
７） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（チアゾール－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
８） ４－エトキシ－Ｎ－（４－（２－（１－エチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）－３－フルオロフェニル）－１－（４－フルオロベンジル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
９） ４－メトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（１－（メトキシメチル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－フェニル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
１０） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（ピペラジン－１－イルメチル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
１１） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
１２） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－｛［２－（５－｛［（２－メトキシエチル）アミノ］メチル｝ピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル］オキシ｝フェニル）－２－オキソ－１－フェニル－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
１３） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－｛［２－（５－｛［（２－メトキシエチル）アミノ］メチル｝ピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル］オキシ｝フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
１４） Ｎ－（３－クロロ－４－｛［２－（５－｛［（２－メトキシエチル）アミノ］メチル｝ピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル］オキシ｝フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－４－メトキシ－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
１５） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－｛［２－（５－｛［（２－メトキシエチル）アミノ］メチル｝ピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル］オキシ｝フェニル）－１－（３－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
１６） Ｎ－（３－フルオロ－４－｛［２－（５－｛［（２－メトキシエチル）アミノ］メチル｝ピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル］オキシ｝フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－４－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
１７） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－｛［２－（５－｛［（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ］メチル｝ピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル］オキシ｝フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
１８） ４－エトキシ－Ｎ－［３－フルオロ－４－（｛２－［５－（モルホリノメチル）ピリジン－２－イル］チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル｝オキシ）フェニル］－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
１９） ４－エトキシ－Ｎ－［３－フルオロ－４－（｛２－［５－（モルホリノメチル）ピリジン－２－イル］チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル｝オキシ）フェニル］－２－オキソ－１－フェニル－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
２０） ４－エトキシ－Ｎ－｛３－フルオロ－４－［（２－｛５－［（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル］ピリジン－２－イル｝チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル）オキシ］フェニル｝－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；および、
２１） ４－エトキシ－Ｎ－｛３－フルオロ－４－［（２－｛５－［（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル］ピリジン－２－イル｝チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル）オキシ］フェニル｝－２－オキソ－１－フェニル－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド。
医薬組成物の適用範囲
プロテインキナーゼは、他のタンパク質をリン酸化して、タンパク質の活性、位置、および機能を調節し、それによってさまざまな細胞内プロセスを制御する酵素である。これらのプロテインキナーゼの制御機能の異常は、癌、免疫疾患、神経疾患、代謝疾患、感染症などの疾患メカニズムと密接に関連している。プロテインキナーゼとしては、例えば、ＡＢｌ、ＡＣＫ、ＡＬＫ、ＡＲＧ、ＡＲＫ５、ＡＵＲＯＲＡ、ＡＸｌ、ＢＭＸ、ＢＴＫ、ＣＤＫ、ＣＨＫ、ｃ－ＫＩＴ、ｃ－ＭＥＴ、ｃ－ＲＡＦ、ｃ－ＳＲＣ、ＥＧＦＲ、ＦＡＫ、ＦＥＳ、ＦＧＦＲ、ＦＬＴ３、ＧＳＫ３、ＩＧＦ、ＩＫＫ、ＪＡＫ、ＬＣＫ、ＬＩＭＫ、ＬＹＮ、ＭＥＫ、ＭＥＲ、ＭＫ－２、Ｐ３８ＡＬＰＨＡ、ＰＤＧＦＲ、ＰＤＫ、ＰＩＭ、ＰＫＡ、ＰＫＢ、ＰＫＣＲ、ＰＬＫ－１／３、ＲＥＴ、ＲＯＳ、ＲＳＥ、ＴＩＥ、ＴＲＫ、ＴＹＲＯ３、ＶＥＧＦＲ、ＹＥＳ、などが挙げられる。ここで、プロテインキナーゼは、好ましくはＥＧＦＲであり得る。
さらに、医薬組成物が適用される癌患者は、活性ＲＯＮ（Ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ ｄ’Ｏｒｉｇｉｎｅ Ｎａｎｔａｉｓ）を保有していてよい。さらに、患者は、正常なＫＲＡＳを保有する患者であってよい。好ましくは、医薬組成物は、活性ＲＯＮおよび正常なＫＲＡＳを保有する患者に適用され得る。特に、患者は、セツキシマブに耐性のある患者であり得る。
ＲＯＮ（Ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ ｄ’Ｏｒｉｇｉｎｅ Ｎａｎｔａｉｓ）は、ＭＥＴ（ｃ－ＭＥＴ）ファミリーに属するプロテインレセプターを意味し、肝臓から分泌されてマクロファージの作用を調節する血清タンパク質、ＭＳＰの受容体である。本明細書において、「活性ＲＯＮ」との用語は、通常のＲＯＮとは異なり、常に活性化されたＲＯＮを意味する。このようなＲＯＮの活性の程度は、真核生物の遺伝子発現を調節するための重要なプロセスの１つである選択的スプライシングによって、調節される。
活性ＲＯＮとしては、例えば、ＲＯＮΔ１５５、ＲＯＮΔ１６０、ＲＯＮΔ１６５などを挙げることができる。活性ＲＯＮは、スプライシングによるエクソン（ｅｘｏｎ）のスキップによって発生する形態であり、リガンドなしで構造的に常に活性化されている。したがって、癌患者により保有される活性ＲＯＮの実施形態は、これに限定されるものではないが、ＲＯＮΔ１５５、ＲＯＮΔ１６０、ＲＯＮΔ１６５、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか１つであり得る。さらに、活性ＲＯＮは、変異したＲＯＮであってもよい。「変異したＲＯＮ」とは、ＲＯＮのアミノ酸の一部が、置換、削除、または挿入され、ＲＯＮが常に活性化されることを意味する。さらに、ＭＳＰが存在する場合は、通常のＲＯＮさえも活性化される。本発明の医薬組成物は、活性ＲＯＮに作用することができ、それにより、活性ＲＯＮの活性を阻害することができる。
さらに、医薬組成物は、乳癌、肺癌、胃癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌、腎臓癌、膵臓癌、肝臓癌、結腸癌、皮膚癌、頭頸部癌、および甲状腺癌からなる群から選択されるいずれか１つの癌を治療するための組成物であり得る。ここで、癌は、活性ＲＯＮを保有し得る。好ましくは、癌は、ＲＯＮΔ１５５、ＲＯＮΔ１６０、およびＲＯＮΔ１６５からなる群から選択されるいずれか１つの活性ＲＯＮを保有し得る。
医薬組成物の製剤
本発明の医薬組成物は、式１により表される化合物、またはその薬学的に許容される塩を、活性成分として、組成物の総重量を基準として、約０．１重量％～約９０重量％の量で、特に、約０．１重量％～約７５重量％の量で、さらに特に、約１重量％～約５０重量％の量で、含み得る。
本発明の医薬組成物は、従来の方法に従って製剤に組み合わされる従来の非毒性の薬学的に許容される添加剤を含み得る。例えば、医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含み得る。
本発明の組成物に用いられる添加剤としては、例えば、甘味料、結合剤、溶媒、可溶化剤、湿潤剤、乳化剤、等張剤、吸収剤、崩壊剤、抗酸化剤、保存剤、潤滑剤、流動促進剤、充填剤、香味料などを挙げることができる。例えば、添加剤として、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、グリシン、シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン、ステアリン酸マグネシウム、ケイ酸アルミン酸マグネシウム、デンプン、ゼラチン、トラガンドガム、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、水、エタノール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、オレンジエッセンス、ストロベリーエッセンス、バニラフレーバーなどを挙げることができる。
本発明の組成物は、経口投与用（例えば、錠剤、ピル、粉末、カプセル、シロップ、または乳濁液）、または非経口投与用（例えば、筋肉内注射、静脈注射、または皮下注射）の様々な製剤形態に製剤化することができる。
好ましくは、本発明の組成物は、経口投与製剤に製剤化することができ、この目的のための添加剤としては、例えば、セルロース、ケイ酸カルシウム、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、デキストロース、リン酸カルシウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ゼラチン、タルク、界面活性剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤などを挙げることができる。具体的には、流動促進剤としては、例えば、コロイド状二酸化ケイ素、ケイ酸マグネシウムなどが挙げられ；希釈剤としては、例えば、結晶セルロース、Ｆａｓｔ Ｆｌｏラクトース、無水ラクトース、ラクトース一水和物、ケイ化（ｓｉｌｉｃｉｆｉｅｄ）ＭＣＣ ＨＤ９０などが挙げられ；崩壊剤としては、例えば、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドンなどが挙げられ；潤滑剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸などが挙げられる。
さらに、経口投与用の液体製剤として、例えば、懸濁液、乳濁液、シロップなどを挙げることができ、液体製剤は、簡単な希釈剤として一般的に使用される流動パラフィンおよび水に加えて、湿潤剤、甘味料、香料、保存剤などの様々な賦形剤を含んでいてもよい。
さらに、非経口投与のための製剤として、例えば、滅菌水溶液、非水系溶液、懸濁液、乳濁液、凍結乾燥製剤、および坐剤を挙げることができる。非水系溶液および懸濁液のために、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどを用いることができる。坐剤基剤として、ウイテプゾール（Ｗｉｔｅｐｓｏｌ）（商標）、マクロゴール、ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）（商標）６１、カカオバター、ラウリン脂肪、グリセロゼラチンなどを用いることができる。一方、注射剤は、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、および保存剤などの従来の添加剤を含んでいてもよい。
医薬組成物の用量および用法
本発明の化合物または組成物は、治療有効量または薬学的有効量で、患者に投与することができる。
本明細書において、「治療有効量」または「薬学的有効量」との用語は、医薬治療に適用され得る合理的な利益／リスク比で疾患を治療するのに十分で、副作用を引き起こさない、問題となる疾患を予防または治療するのに有効な、化合物または組成物の量を意味する。有効量のレベルは、患者の健康状態、疾患の種類および重症度、薬物の活性、薬物に対する患者の感受性、投与方法、投与時間、投与経路および排泄率、治療期間、製剤または同時に使用される薬物、および医薬分野で周知のその他の要因を含む要因に応じて決めることができる。
本発明の化合物または組成物は、個々の治療剤として、または他の治療剤と組み合わせて、投与することができ、従来の治療剤と同時にまたは連続して投与することができ、そして、単回または複数回の投与で投与することができる。上記の要因をすべて考慮し、最大の効果を副作用なしに得ることができる最小量の量で投与することが重要であり、そのような量は、当業者によって容易に決めることができる。
具体的には、本発明の組成物中の化合物の有効量は、患者の年齢、性別、および体重に応じて変わってよく；通常、体重１ｋｇあたり、約０．１ｍｇ～約１，０００ｍｇ、または約５ｍｇ～約２００ｍｇを、毎日または一日おきに、あるいは１日１～３回で、投与することができる。しかしながら、有効量は、投与経路、疾患の重症度、患者の性別、体重、年齢などに応じて増減し得るため、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
好ましくは、本発明の化合物または組成物は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、骨髄移植、幹細胞補充療法、その他の生物学的療法、外科的処置、またはそれらの組み合わせ、と組み合わせた腫瘍療法のために投与することができる。例えば、本発明の化合物または組成物は、他の長期治療戦略と組み合わせた補助療法として用いることができ、あるいは、重症患者における腫瘍退縮または化学的予防療法の後の患者の状態を維持するために用いることができる。
組み合わせ投与のための医薬組成物
本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの活性成分をさらに含有していてもよく、さらに含まれる活性成分としては、これに限定されるものではないが、例えば、抗増殖性化合物、例えば、アロマターゼ阻害剤、抗エストロゲン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、微小管活性化合物、アルキル化化合物、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、細胞分化プロセスを誘導する化合物、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ＭＭＰ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗腫瘍薬、抗代謝物、プラチン（ｐｌａｔｉｎ）化合物、タンパク質または脂質キナーゼの活性を標的／減少させる化合物、抗血管新生化合物、タンパク質または脂質ホスファターゼの活性を標的として減少または阻害させる化合物、ゴナドレリンアゴニスト、抗アンドロゲン、メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤、ビスホスホネート、生体応答調節物質、抗増殖抗体、ヘパラナーゼ阻害剤、Ｒａｓ発癌性アイソタイプ阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、血液学的悪性腫瘍の治療に用いられる化合物、Ｆｌｔ－３活性を標的として減少または阻害させる化合物、Ｈｓｐ９０阻害剤、キネシンスピンドルタンパク質阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ロイコボリン、ＥＤＧ結合剤、抗白血病化合物、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤、Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ阻害剤、止血ステロイド、コルチコステロイド、その他の化学療法化合物、および光感作化合物、を挙げることができる。
さらに含まれる活性成分は、公知の抗がん剤であってもよい。抗癌剤としては、これに限定されるものではないが、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、メクロレタミン、クロラムブシル、フェニルアラニン、マスタード、シクロホスファミド、イホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ストレプトゾトシン、ブスルファン、チオテパ、シスプラチン、およびカルボプラチンなど；抗癌抗生物質、例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、マイトマイシンＣ、およびブレオマイシンなど；および、植物アルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、テニポシド、トポテカン、およびイリノテカンなど、が挙げられる。
本発明の別の態様では、式１により表される化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、癌を治療するための医薬組成物であって、さらにプロテインキナーゼ阻害剤を含む医薬組成物、が提供される。
医薬組成物を用いた治療方法
本発明のさらに別の態様では、以下のステップ：ｉ）癌患者が活性ＲＯＮを保有しているかどうかを確認すること；および、ｉｉ）活性ＲＯＮを保有している患者に、上記の式Ｉにより表される化合物またはその薬学的に許容される塩を活性成分として含む抗癌剤を投与すること、を含む、プロテインキナーゼ阻害剤に対して耐性のある患者の治療方法、が提供される。
ここで、プロテインキナーゼは上記で説明した通りであり、活性ＲＯＮは、ＲＯＮΔ１５５、ＲＯＮΔ１６０、ＲＯＮΔ１６５、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか１つであり得る。
以下、本発明について、以下の実施例により詳細に説明する。ただし、以下の実施例は、理解を容易にするために本発明を説明しようとしたものにすぎず、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
製造例１：４－エトキシ－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボン酸の製造
工程１：エチル ４－エトキシ－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキシレートの製造
Figure 2022554042000004
 オルト酢酸トリエチル（２４９．６ｍＬ、１．３２ｍｍｏｌ）および酢酸（１９．６ｍＬ、０．３３ｍｏｌ）を、シアノ酢酸エチル（７０．５ｍＬ、０．６６ｍｏｌ）に加え、１２０℃で、１２時間以上、撹拌を行った。反応混合物を濃縮し、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドジエチルアセタール（ＤＭＦＤＥＡ）（１４１ｍＬ、０．５５ｍｏｌ）を加えた。７０℃で、２時間以上、撹拌を行った。反応混合物に酢酸５００ｍＬと蒸留水６０ｍＬを加え、これを１２時間以上還流した。反応混合物を室温に冷却し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液と水を加えた。得られたものをジクロロメタンとメタノールの混合溶媒（９：１）で抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮した。酢酸エチル１００ｍＬを加え、得られたものを濃縮した。得られた固体をろ過して、化合物、エチル ４－エトキシ－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキシレート（３７ｇ、収率：２６％）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.61 (bs, 1H), 7.46 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.21 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.14(m, 4H), 1.22 (m, 6H)
MS (ESI) m/z 212.12 (M + H)+
工程２：エチル ４－エトキシ－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキシレートの製造
Figure 2022554042000005
 炭酸セシウム（１１４ｇ、０．３５ｍｏｌ）に、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１００ｍＬを加え、これに窒素ガスを充填した。室温で１０分間撹拌を行った。工程１で得た化合物、エチル ４－エトキシ－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキシレート（１０．２ｇ、０．０７ｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド２００ｍＬに溶解させ、混合物に加え、ヨウ化銅（１０ｇ、０．０５ｍｏｌ）、４－フルオロ－ヨードベンゼン５８．３ｇ（０．２６ｍｏｌ）、および上記で得た化合物（３７ｇ、０．１７ｍｏｌ）を加えた。１１０℃で２４時間、撹拌を行った。反応終了後、得られたものを室温に冷却し、酢酸エチルを加え、１０分間撹拌を行った。反応混合物をセライトパッドを通してろ過し、水および酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。その後、減圧下で溶媒を除去した。
工程３：４－エトキシ－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボン酸の製造
Figure 2022554042000006
 溶媒を完全に除去した工程２の化合物を２００ｍＬのエタノールに溶解し、それに４００ｍＬの３Ｎ塩化水素水溶液を加えた。６０℃で２４時間、撹拌を行った。得られた固体をろ過して、４－エトキシ－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボン酸（２１ｇ、２工程の収率：４３％）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.95 (d, J = 76 Hz, 1H), 7.48 (m, 2H), 7.35 (m, 2H), 6.58 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.28 (q, J = 68 Hz, 2H), 1.32 (t, J = 68 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 276.09 (M + H)+
製造例２：４－エトキシ－２－オキソ－１－フェニル－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボン酸の製造
製造例１の工程２において、４－フルオロ－ヨードベンゼンの代わりにヨードベンゼンを用いたことを除いて、製造例１と同様の方法により、下記の化合物を製造した。
Figure 2022554042000007
 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.98 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.56-7.41 (m, 5H), 6.60 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.30(q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.34 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 260.05 (M + H)+
製造例３：１－（４－フルオロフェニル）－４－メトキシ－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボン酸の製造
工程１：メチル ４－メトキシ－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキシレートの製造
エチル ４－エトキシ－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキシレート（０．３７ｇ、１．２０ｍｍｏｌ）を、２８％のＮａＯＭｅの溶液で処理を施し、その後、室温で１０分間、撹拌した。減圧下で濃縮して溶媒を除去することにより、下記の化合物（０．２６ｇ、収率７７％）を得た。
Figure 2022554042000008
工程２：４－メトキシ－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボン酸の製造
メチル ４－メトキシ－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキシレート（０．３３ｇ、１．１８ｍｍｏｌ）を、５ｍＬのエタノールで処理し、次いで、１０ｍＬの２．７５Ｎ塩酸溶液を室温で滴下して加えた。６０℃で４時間、撹拌を行った後、得られた固体をろ過して、下記の化合物（０．１６ｇ、収率：５２％）を得た。
Figure 2022554042000009
 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.89 (bs, 1H), 8.02 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.53-7.48 (m, 2H), 7.40-7.34 (m, 2H), 6.63 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.02 (s, 3H)
MS (ESI) m/z 264.06 (M + H)+
製造例４：４－メトキシ－２－オキソ－１－フェニル－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボン酸の製造
製造例３の工程１において、エチル ４－エトキシ－１－フェニル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキシレートの代わりに、製造例２で用いたエチル ４－エトキシ－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキシレートを用いたことを除いて、製造例３と同様の方法で、下記の化合物を製造した。
Figure 2022554042000010
 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.96 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.55-7.45 (m, 5H), 6.58 (d, J = 78 Hz, 1H), 3.99 (s, 3H)
MS (ESI) m/z 246.06 (M + H)+
製造例５：４－エトキシ－１－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボン酸の製造
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド３０ｍＬおよび炭酸セシウム（１５．４ｇ、０．０５ｍｏｌ）を、製造例１の工程１で得た化合物（エチル ４－エトキシ－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキシレート）（５ｇ、２３．７ｍｍｏｌ）に加え、室温で１０分間、撹拌した。ヨードメタン（６．７ｇ、４７．３ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間、撹拌した。反応終了後、混合物を濃縮し、５０ｍＬの酢酸エチルを加えた後、これを再度濃縮した。濃縮混合物にイソプロピルエーテル５０ｍＬを加え、撹拌した。得られたものをろ過して、スラリーの形態の固体を得た。得られた固体にテトラヒドロフラン２０ｍＬと３Ｎ塩化水素水溶液１０ｍＬを加えた。これを８０℃で５時間、撹拌し、濃縮した。ジクロロメタン１８０ｍＬとメタノール１０ｍＬを加え、有機層を分離した。分離した有機層に無水硫酸マグネシウムを加え、ろ過してろ液を得た。得られたろ液を濃縮し、得られた固体をろ過して、下記の化合物（３ｇ、収率：６４％）を得た。
Figure 2022554042000011
 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.04 (d, J = 8 Hz, 1H), 6.56 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.24 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 1.32 (t, J = 7.2 Hz, 1H)
MS (ESI) m/z 198.17 (M + H)+
製造例６：４－エトキシ－１－（４－フルオロベンジル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボン酸の製造
ヨードメタンおよび炭酸セシウムの代わりに、４－フルオロベンジルブロミドおよび水素化ナトリウムを用いたことを除いて、製造例５と同様の方法により、下記の化合物を製造した。
Figure 2022554042000012
 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.50 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 7.29 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 6.29 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.15 (s, 2H), 4.28 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.52 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 289.98 (M + H)+
製造例７：４－エトキシ－１－（３－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボン酸の製造
Figure 2022554042000013
 工程２において、４－フルオロ－ヨードベンゼンの代わりに３－フルオロ－ヨードベンゼンを用いたことを除いて、製造例１の合成経路に従って製造を行い、表題の化合物（１９２ｍｇ、収率：７３％、白色固体）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 13.70 (brs, 1H), 7.99 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.60-7.56 (m, 1H), 7.43 (dt, J = 10.0 and 5.0 Hz, 1H), 7.36 (td, J = 10.0 and 5.0 Hz, 1H), 7.30 (dd, J = 10.0 and 5.0 Hz, 1H), 6.61 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.30 (qt, J = 5.0 Hz, 2H), 1.34 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
製造例８：４－メチル－２－オキソ－１－（４－フルオロフェニル）－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボン酸の製造
工程１：エチル ２－（４－フルオロアニリノカルボニル）－３－メチル－２－ブチレートの合成
Figure 2022554042000014
 ４－フルオロアニリン（０．２０ｍＬ、２．０５ｍｍｏｌ）、イソプロピリデンマロン酸ジエチル（１．６０ｍＬ、８．２０ｍｍｏｌ）、およびイミダゾール（１３９ｍｇ、２．０５ｍｍｏｌ）の混合物を、２００℃で５時間撹拌した。得られたものを室温に冷却し、減圧下で濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題の化合物（１５１ｍｇ、収率：２８％、黄色の油）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.25 (s, 1H), 7.65-7.62 (m, 2H), 7.17-7.13 (m, 2H), 4.12 (qt, J = 5.0 Hz, 2H), 2.16 (s, 3H), 1.88 (s, 3H), 1.16 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
工程２：エチル ４－メチル－２－オキソ－１－（４－フルオロフェニル）－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキシレートの合成
Figure 2022554042000015
 工程１で製造した化合物（９６ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、および１，１－ジメトキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルメタンアミン（７２μＬ、０．５４ｍｍｏｌ）の混合物を、１００℃で１時間撹拌した。得られたものを室温に冷却し、減圧下で濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題の化合物（３４ｍｇ、収率：３４％、褐色の固体）を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.36-7.33 (m, 2H), 7.27-7.26 (m, 1H), 7.17-7.13 (m, 2H), 6.13 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.39 (qt, J = 5.0 Hz, 2H), 2.28 (s, 3H), 1.37 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
工程３：４－メチル－２－オキソ－１－（４－フルオロフェニル）－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボン酸の合成
Figure 2022554042000016
 出発物質として工程２で製造した化合物（３４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を用いたことを除いて、製造例１の工程３と同様の方法で反応を行うことにより、表題の化合物（２９ｍｇ、収率：１００％、黄色の固体）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.90 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.56-7.52 (m, 2H), 7.42-7.37 (m, 2H), 6.56 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 2.52 (s, 3H)
実施例１：４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミドの製造
工程１：７－クロロチエノ［３，２－ｂ］ピリジンの製造
Figure 2022554042000017
 塩化ホスホリル２５ｍＬを６０℃に加熱し、チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－オール（１５ｇ、９９．２ｍｍｏｌ）を加えた。同じ温度で１時間撹拌し、次いで、室温に冷却した。反応混合物を減圧下で濃縮し、氷冷水１００ｍＬを加えて完全に溶解させた。アンモニア水を加えて塩基性化させ、得られた固体をろ過した。ろ過した固体を酢酸エチルに溶解し、ろ過した。ろ液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮して、白色の固体として、７－クロロチエノ［３，２－ｂ］ピリジン（１５ｇ、８９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.66 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 8.26 (d, J = 56 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 4.8 Hz, 1H)
MS (ESI) m/z 169.92 (M + H)+
工程２：７－クロロ－２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジンの製造
Figure 2022554042000018
 ７－クロロチエノ［３，２－ｂ］ピリジン（５０ｇ、２９４．８ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン５００ｍＬに溶解し、次いで、これを－７８℃に冷却した。ｎ－ブチルリチウム（２５Ｍ、ヘキサン溶液）（１１８ｍＬ、２９４．８ｍｍｏｌ）を同じ温度でゆっくり加え、１０分間撹拌した。塩化亜鉛（１Ｍ、ジエチルエーテル溶液）（２９５ｍＬ、２９４．８ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、１０分間撹拌した。得られたものの温度をゆっくりと室温まで上昇させ、１時間撹拌した。次に、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（２８ｇ、２９．５ｍｍｏｌ）、および４－ヨード－１－メチル－１Ｈ－イミダゾール（５１ｇ、２４５．６ｍｍｏｌ）を加え、これを４時間還流して撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、減圧下で濃縮した。酢酸エチル５００ｍＬと水２０ｍＬを加えて撹拌し、セライトパッドでろ過した。ろ液を減圧下で濃縮し、ジクロロメタンを加え、次いで、これを１Ｎ塩化水素水溶液で酸性化した。得られた固体をろ過した。ろ過した固体をアンモニア水および水で洗浄して、オフホワイトの固体、７－クロロ－２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン（２９ｇ、収率：３９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.55 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 7.90 (S, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.45(d, J = 4.8 Hz, 1H), 3.73 (s, 3H)
MS (ESI) m/z 249.98 (M + H)+, 252.02 (M + Na)+
工程３：７－（２－フルオロ－４－ニトロフェノキシ）－２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジンの製造
Figure 2022554042000019
 無水炭酸カリウム６４ｇ（４６４．５ｍｍｏｌ）、および２－フルオロ－４－ニトロフェノール（３６ｇ、２３２．２ｍｍｏｌ）を、ジフェニルエーテル２００ｍＬ、および７－クロロ－２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン（２９ｇ、１１６．１ｍｍｏｌ）の混合物に加えた。反応混合物を２００℃に加熱し、３時間撹拌した。得られたものを室温に冷却し、水を加えて撹拌した。得られた固体をろ過して、７－（２－フルオロ－４－ニトロフェノキシ）－２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン（１６．６ｇ、収率：３９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.53 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 8.46 (dd, J = 10.4 and 2.8 Hz, 1H), 8.21-8.18 (m, 1H), 7.88 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.72 (d, J = 12 Hz, 1H), 7.68 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 3.73 (s, 3H)
MS (ESI) m/z 370.91 (M + H)+
工程４：３－フルオロ－４－（（２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル）オキシ）アニリンの製造
Figure 2022554042000020
 ７－（２－フルオロ－４－ニトロフェノキシ）－２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン（１６．２ｇ、４３．７ｍｍｏｌ）、鉄（７ｇ、１３１．２ｍｍｏｌ）、および塩化アンモニウム（２３．４ｇ、４３７．４ｍｍｏｌ）を、エタノール４００ｍＬおよび水２００ｍＬの混合液に加えた。混合物の温度を１００℃まで上昇させ、混合物を１時間撹拌した。これを室温に冷却し、セライトパッドでろ過し、減圧下で濃縮した。水を加えて撹拌した。その後、得られたものをろ過して、３－フルオロ－４－（（２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル）オキシ）アニリン、８．３ｇ（５６％）、を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.40 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 7.84 (S, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.10 (t, J = 88 Hz, 1H), 6.55-6.43 (m, 3H), 5.52 (s, 2H), 3.72 (s, 3H)
MS (ESI) m/z 34111 (M + H)+
工程５：４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミドの製造
Figure 2022554042000021
 塩化チオニル（１１６ｇ、９７．５ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン１００ｍＬ、および４－エトキシ－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボン酸（１０ｇ、３６．６ｍｍｏｌ）の混合物に加えた。これを室温で２時間撹拌し、次いで、減圧下で濃縮して、４－エトキシ－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボニルクロリドを合成した。３－フルオロ－４－（（２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル）オキシ）アニリン（８．３ｇ、２４．４ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン１００ｍＬに溶解し、次いで、トリエチルアミン（４．９３ｇ、４８．８ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２時間撹拌した。反応混合物に、減圧下の濃縮により得られた４－エトキシ－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボニルクロリドを加え、２時間撹拌した。得られた固体をろ過し、水で洗浄して、オフホワイトの固体として、４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド（１０．４ｇ、収率：７１％）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.61 (s, 1H), 8.42 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 7.92 (dd, J = 2.0 and 13.6 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.72 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.50-7.43 (m, 4H), 7.37 (t, J= 8.8 Hz, 1H), 6.59 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.26 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.73 (s, 1H), 1.31 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 600.16 (M + H)+
実施例２：４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミドの製造
実施例１と同様の方法により、下記の化合物を製造した。
Figure 2022554042000022
 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.58 (s, 1H), 8.43 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 7.87 (t, J = 4.0 Hz, 2H), 7.73 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.46 (m, 2H), 6.60 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 6.39 (d, J =8.0 Hz, 1H), 4.19 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.44 (s, 3H), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 520.15 (M + H)+
実施例３：４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミドの製造
実施例１と同様の方法により、下記の化合物を製造した。
Figure 2022554042000023
 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.65 (s, 1H), 8.47 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.97 (dd, J = 12.8 Hz, 2.4 Hz, 1H), 7.72-7.68 (m, 3H), 7.54-7.50 (m, 3H), 7.38-7.35 (m, 2H), 7.34-7.31 (m, 1H), 7.24-7.12 (m, 3H), 7.03 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 6.37 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.37 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.96 (s, 3H), 1.63 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 599.99 (M + H)+
実施例４：４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミドの製造
実施例１と同様の方法により、下記の化合物を製造した。
Figure 2022554042000024
 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.60 (s, 1H), 8.44 (d, 1H, J = 5.6 Hz, 1H), 8.31 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.93 (dd, J = 2.8 Hz, J = 12.8 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.47 (m, 5H), 7.37 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 6.60 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.27 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.90 (s, 3H), 1.31(t, J = 7.2 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 600.10 (M + H)+
実施例５：４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（ピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミドの製造
実施例１と同様の方法により、下記の化合物を製造した。
Figure 2022554042000025
 1H NMR (400 MHz, MeOH-d4) δ 8.61 (dd, J = 4.8 Hz, 0.4 Hz, 1H), 8.47 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 8.1 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.95-7.91 (m, 2H), 7.77 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.46-7.37 (m, 5H), 7.27 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 6.65 (dd, J = 0.8, 5.6 Hz, 1H), 6.58 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.32 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 1.46 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 597.16 (M + H)+
実施例６：４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（ピリジン－３－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミドの製造
実施例１と同様の方法により、下記の化合物を製造した。
Figure 2022554042000026
 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.68 (s, 1H), 9.02 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 8.63 (dd, J = 4.8 Hz, 1.2 Hz, 1H), 8.49 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 8.02 (dt, J = 8, 1.6 Hz, 1H), 7.96 (dd, J = 12.4 Hz, 2.4 Hz, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.51 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.41-7.31 (m, 4H), 7.25-7.15 (m, 3H), 6.53 (dd, J = 5.2 Hz, 0.8 Hz 1H), 6.36 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.36 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 1.58 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 597.13 (M + H)+
実施例７：４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（チアゾール－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミドの製造
実施例１と同様の方法により、下記の化合物を製造した。
Figure 2022554042000027
 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.65 (s, 1H), 8.49 (d, 1H, J = 5.6 Hz, 1H), 7.96 (dd, J = 2.8 Hz, J = 12.8 Hz, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.88 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 7.22-7.38 (m, 6H), 7.18 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 6.54 (dd, J = 1.2 Hz, J = 5.6 Hz, 1H), 6.37 (d, J = 8.0Hz, 1H), 4.37 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.59 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 603.15 (M + H)+
実施例８：４－エトキシ－Ｎ－（４－（２－（１－エチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）－３－フルオロフェニル）－１－（４－フルオロベンジル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミドの製造
実施例１と同様の方法により、下記の化合物を製造した。
Figure 2022554042000028
 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.76 (s, 1H), 8.43 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.95 (dd, J = 12.8 and 2.0 Hz, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.44 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.28-7.37 (m, 4H), 7.19 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 7.00 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 6.47 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 6.24 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.15 (s, 1H), 4.27 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 4.05 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.53 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 628.24 (M + H)+
実施例９：４－メトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（１－（メトキシメチル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－フェニル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミドの製造
実施例１と同様の方法により、下記の化合物を製造した。
Figure 2022554042000029
 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.66 (s, 1H), 8.44 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.95-7.89 (m, 3H), 7.77 (s, 1H), 7.56-7.40 (m, 7H), 6.61 (d, J = 56 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.37 (s, 2H), 3.94 (s, 1H), 3.27 (s, 3H)
MS (ESI) m/z 568.12 (M + H)+
実施例１０：４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（ピペラジン－１－イルメチル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド塩酸塩の製造
工程１：７－クロロチエノ［３，２－ｂ］ピリジン－２－カルバルデヒドの製造
Figure 2022554042000030
 ７－クロロチエノ［３，２－ｂ］ピリジン（１ｇ、５．８９ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのテトラヒドロフランに溶解し、－７０℃に冷却した。ｎ－ブチルリチウム（２５Ｍヘキサン溶液）（３．０６ｍＬ、７．６６ｍｍｏｌ）を加え、その後、１時間撹拌した。無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．６８ｍＬ、８．８４ｍｍｏｌ）を同じ温度で加え、その後、１時間撹拌した。得られたものを室温に冷却し、次いで、４０ｍＬの水を加えた。これを４０ｍＬの酢酸エチルで抽出し、次いで、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。得られたものをろ過し、減圧下で濃縮して、７－クロロチエノ［３，２－ｂ］ピリジン－２－カルバルデヒド（１．１７ｇ、収率：９８％）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.24(s, 1H), 8.82(d, J = 4.8 Hz, 1H), 8.64(s, 1H), 7.81(d, J = 4.8 Hz, 1H)
MS (ESI) m/z 197.99 (M + H)+
工程２：７－（２－フルオロ－４－ニトロフェノキシ）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－２－カルバルデヒドの製造
Figure 2022554042000031
 ２０ｍＬのジフェニルエーテルに、工程１で得た化合物（１．１７ｇ、５．９１ｍｍｏｌ）、２－フルオロ－４－ニトロフェノール（１．３９ｇ、８．８７ｍｍｏｌ）、および炭酸カリウム（２．４５ｇ、１７．７３ｍｍｏｌ）を加えた。これを１７０℃で２９時間、加熱還流した。反応終了後、得られたものを室温に冷却した。そこに水４０ｍＬを加え、４０ｍＬの酢酸エチルで抽出した。得られたものを無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離精製することにより、７－（２－フルオロ－４－ニトロフェノキシ）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－２－カルバルデヒド（１．０５ｇ、収率：５４％）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.26 (s, 1H), 8.75 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.49 (dd, J = 10.4 Hz, 2.8 Hz, 1H), 8.24 (m, 1H), 7.79 (t, J = 8 Hz, 1H), 7.11 (dd, J = 52 Hz, 0.4 Hz, 1H)
MS (ESI) m/z 351.08 (M + H)+
工程３：ｔｅｒｔ－ブチル ４－（（７－（２－フルオロ－４－ニトロフェノキシ）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－２－イル）メチル）ピペラジン－１－カルボキシレートの製造
Figure 2022554042000032
 工程２で得た化合物（１００ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を１ｍＬの無水ジクロロメタンに溶解し、ｔｅｒｔ－ブチル ピペラジン－１－カルボキシレート（６４．３ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を加えた。これを室温で１時間撹拌した。ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（９５．８ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間、撹拌した。飽和重炭酸ナトリウム水溶液２ｍＬを加え、１ｍＬのジクロロメタンで抽出した。得られたものを無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して、ｔｅｒｔ－ブチル ４－（（７－（２－フルオロ－４－ニトロフェノキシ）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－２－イル）メチル）ピペラジン－１－カルボキシレート（１４８．５ｍｇ、収率：９７％）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.54 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 8.46 (dd, J = 10.4 Hz, 24 Hz, 1H), 8.20 (m, 1H) 7.68 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 7.52 (s, 1H), 6.88 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 3.33 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 2.44 (t, J= 4.8 Hz, 4H), 1.39 (s, 9H)
MS (ESI) m/z 489.27 (M + H)+
工程４：ｔｅｒｔ－ブチル ４－（（７－（４－アミノ－２－フルオロフェノキシ）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－２－イル）メチル）ピペラジン－１－カルボキシレートの製造
Figure 2022554042000033
 工程３で得た化合物（１４０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのエタノール：水（２：１）に溶解し、次いで、鉄（４８ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）および塩化アンモニウム（１５２ｍｇ、２．８５ｍｍｏｌ）を加えた。１１０℃で１時間、撹拌した。反応終了後、得られたものを室温に冷却した。その後、酢酸エチルを加え、１０分間撹拌した。反応混合物をセライトに通過させ、酢酸エチルで洗浄した。セライトを通過した溶液に蒸留水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、次いで、減圧下で溶媒を除去して、ｔｅｒｔ－ブチル ４－（（７－（４－アミノ－２－フルオロフェノキシ）チエノ［３，２－ｂ）］ピリジン－２－イル）メチル）ピペラジン－１－カルボキシレート（１２０ｍｇ、収率：９３％）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.42 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 7.43 (s, 1H), 7.08 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 6.54-6.49 (m, 2H), 6.44 (dd, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz, 1H), 5.51 (bs, 2H), 3.86 (s, 1H), 3.33 (m, 4H), 2.43 (m, 4H), 1.39 (s, 9H)
MS (ESI) m/z 459.31 (M + H)+
工程５：ｔｅｒｔ－ブチル ４－（（７－（４－（４－エトキシ－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド）－２－フルオロフェノキシ）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－２－イル）メチル）ピペラジン－１－カルボキシレートの製造
Figure 2022554042000034
 ４－エトキシ－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボン酸（９０．６ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を４ｍＬのジクロロメタンに溶解し、次いで、塩化チオニル（４７．５ｕＬ、０．６５ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で１時間、撹拌した。減圧下で溶媒を除去し、得られたものを真空下で乾燥して、４－エトキシ－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボニルクロリドを合成した。
工程４で得た化合物（１００ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を２ｍＬのジクロロメタンに溶解した。これにトリエチルアミン（４５．６μＬ、０．３２ｍｍｏｌ）を加えた。室温で３０分間、撹拌した。減圧下で溶媒を除去して得られた酸塩化物を再度２ｍＬのジクロロメタンに溶解し、反応混合物に加えた。室温で１時間、撹拌した。水および飽和重炭酸ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離精製することにより、ｔｅｒｔ－ブチル ４－（（７－（４－（４－エトキシ－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド）－２－フルオロフェノキシ）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－２－イル）メチル）ピペラジン－１－カルボキシレート（１５０ｍｇ、収率：９９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.59 (s, 1H), 8.44 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 7.92 (dd, J = 12.8 Hz, 2 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.49-7.41 (m, 5H), 7.39-7.34 (m, 2H), 6.60 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 6.51 (d, J =7.6 Hz, 1H), 4.26 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 3.87 (s, 1H), 3.35 (bs, 4H), 2.45 (bs, 1H), 1.39 (s, 9H), 1.30 (t, J = 1.4 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 718.44 (M + H)+
工程６：４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（ピペラジン－１－イルメチル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド塩酸塩の製造
Figure 2022554042000035
 工程５で得た化合物（１２６ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）をジクロロメタンに溶解し、次いで、４Ｎ塩化水素水溶液のジオキサン液を加えた。室温で１２時間、撹拌を行った。減圧下で濃縮した後、ジエチルエーテルを加えた。得られた固体をろ過して、４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（（２－（ピペラジン－１－イルメチル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル）オキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド塩酸塩（１２３ｍｇ、収率：９５％）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.66 (s, 1H), 8.63 (d, J = 6 Hz, 1H), 8.05 (m, 2H), 7.87 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.55-7.44 (m, 5H), 7.40-7.34 (m, 2H), 6.90 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.26 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 3.23 (bs, 4H), 2.97 (bs, 4H), 1.30 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 652.02 (M + HCl)-
実施例１１：４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミドの製造
実施例１０と同様の方法により、下記の化合物を製造した。
Figure 2022554042000036
 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.65 (s, 1H), 8.45 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.96 (dd, J = 12.4 and 2.0 Hz, 1H), 8.45 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.40-7.24 (m, 6H), 7.15 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 6.49 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 6.39 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.39 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.90 (s, 1H), 2.87-2.52 (m, 8H), 1.61 (t, J = 72 Hz, 3H), 1.27 (s, 3H)
MS (ESI) m/z 632.25 (M + H)+
実施例１２：４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－｛［２－（５－｛［（２－メトキシエチル）アミノ］メチル｝ピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル］オキシ｝フェニル）－２－オキソ－１－フェニル－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド塩酸塩の製造
工程１：Ｎ－｛（６－ブロモピリジン－３－イル）メチル｝－２－メトキシエタンアミンの合成
Figure 2022554042000037
 ６－ブロモピリジン－３－カルボキシアルデヒド（５ｇ、２６．８８ｍｍｏｌ）を１，２－ジクロロエタンに溶解し、次いで、２－メトキシエチルアミン（３．５ｍＬ、４０．３２ｍｍｏｌ）および酢酸（１．６ｍＬ、２８．７６ｍｍｏｌ）を順次加えた。２０分間、撹拌を行った。次に、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（８．５ｇ、４０．３２ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。１Ｎ塩酸水溶液で反応を停止させ、これを２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ９に調整した。その後、ジクロロメタンで抽出した。分離した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題の化合物（４．０５ｇ、収率：７０％、淡赤色の油）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.31 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.70 (dd, J = 10.0 and 5.0 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 3.69 (s, 2H), 3.37 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 3.22 (s, 3H), 2.60 (d, J = 5.0 Hz, 2H)
工程２：ｔ－ブチル ［（６－ブロモピリジン－３－イル）メチル］（２－メトキシエチル）カルバメートの合成
Figure 2022554042000038
 工程１で製造した化合物（４．０５ｇ、１６．５２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランに溶解し、次いで、二炭酸ジ－ｔ－ブチル（３．９ｍＬ、１７．０２ｍｍｏｌ）を加えた。室温で３０分間、撹拌を行った。酢酸エチルで抽出した。分離した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィーで精製して、表題の化合物（５．５２ｇ、収率：９７％、無色の油）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.27 (s, 1H), 7.64-7.59 (m, 2H), 4.40 (s, 2H), 3.40 (m, 4H), 3.21 (s, 3H), 1.42-1.31 (m, 9H)
工程３：ｔ－ブチル ｛［６－（７－クロロチエノ［３，２－ｂ］ピリジン－２－イル）ピリジン－３－イル］メチル｝（２－メトキシエチル）カルバメートの合成
Figure 2022554042000039
 ７－クロロチエノ［３，２－ｂ］ピリジン（５．４ｇ、３１．８６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランに溶解し、次いで、２．５Ｍのｎ－ブチルリチウムヘキサン溶液（２．７ｍＬ、３１．８６ｍｍｏｌ）を－７８℃でゆっくり加えた。３０分間撹拌した。１Ｍ塩化亜鉛ジエチルエーテル溶液（３１．９ｍＬ、３１．８６ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、１０分後、得られたものの温度を徐々に室温に上昇させた。その後、１時間撹拌した。その後、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（９２０ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）、および工程２で製造した化合物（５．５ｇ、１５．９３ｍｍｏｌ）を加え、これを２時間還流した。得られたものを室温に冷却し、減圧下で濃縮した。得られた残渣をアセトニトリルでろ過し、乾燥して、表題の化合物（５．２ｇ、収率：７５％、オフホワイトの固体）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.66 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.54 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.29 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.82 (dd, J = 10.0 and 5.0 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.50 (s, 2H), 3.45-3.36 (m, 4H), 3.23 (s, 3H), 1.45-1.34 (m, 9H)
工程４：ｔ－ブチル ｛［６－［７－（２－フルオロ－４－ニトロフェノキシ）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－２－イル］ピリジン－３－イル］メチル｝（２－メトキシエチル）カルバメートの合成
Figure 2022554042000040
 工程３で製造した化合物（２．０ｇ、４．６１ｍｍｏｌ）をジフェニルエーテルに溶解し、無水炭酸カリウム（７６５ｍｇ、５．５３ｍｍｏｌ）および２－フルオロ－４－ニトロフェノール（１．４ｇ、９．２２ｍｍｏｌ）を順次加えた。１６０℃で５時間、撹拌を行った。得られたものを室温に冷却し、酢酸エチルで抽出した。分離した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮した。得られた残渣をテトラヒドロフランに溶解し、次いで二炭酸ジ－ｔ－ブチル（１．０６ｍＬ、４．６１ｍｍｏｌ）を加えた。室温で３０分間、撹拌を行った。減圧下で濃縮により得られた残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題の化合物（１．２ｇ、収率：４６％、オフホワイトの固体）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.62 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.50-8.48 (m, 2H), 8.39 (s, 1H), 8.28 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.21 (d, J = 10.0 and 5.0 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.72 (t, J = 10.0 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.48 (s, 2H), 3.43-3.35 (m, 4H), 3.23 (s, 3H), 1.44-1.33 (m, 9H)
工程５：ｔ－ブチル ｛［６－［７－（４－アミノ－２－フルオロフェノキシ）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－２－イル］ピリジン－３－イル］メチル｝（２－メトキシエチル）カルバメートの合成
Figure 2022554042000041
 工程４で製造した化合物（１．２ｇ、２．１６ｍｍｏｌ）をエタノールおよび水に溶解し、次いで、鉄（３６３ｍｇ、６．４９ｍｍｏｌ）および塩化アンモニウム（１．１６ｇ、２１．６４ｍｍｏｌ）を室温で順次加えた。得られたものの温度を１００℃に上昇し、３時間撹拌を行った。反応終了後、セライトパッドを用いて温かい状態でろ過し、減圧下で濃縮した。得られた残渣をジクロロメタンで抽出した。分離した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した後、ジエチルエーテルでろ過して、表題の化合物（８３３ｍｇ、収率：７３％、オフホワイトの固体）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.51-8.49 (m, 2H), 8.30 (s, 1H), 8.24 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.78 (dd, J = 10.0 and 5.0 Hz, 1H), 7.13 (t, J = 10.0 Hz, 1H), 6.60 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.53 (dd, J = 15.0 and 5.0 Hz, 1H), 6.45 (dd, J = 10.0 and 5.0 Hz, 1H), 5.55 (s, 2H), 4.48 (s, 2H), 3.43-3.33 (m, 4H), 3.23 (s, 3H), 1.44-1.34 (m, 9H)
工程６：ｔ－ブチル ［（６－｛７－［４－（４－エトキシ－２－オキソ－１－フェニル－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド）－２－フルオロフェノキシ］チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－２－イル｝ピリジン－３－イル）メチル］（２－メトキシエチル）カルバメート
Figure 2022554042000042
 製造例２の４－エトキシ－２－オキソ－１－フェニル－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボン酸（０．５７ｇ、２．２ｍｍｏｌ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（０．４２ｇ、２．２ｍｍｏｌ）、およびヒドロキシベンゾトリアゾール（０．３ｇ、２．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタンに溶解し、次いで、トリエチルアミン（０．２２ｇ、２．２ｍｍｏｌ）、および工程５で製造した化合物（０．５８ｇ、１．１ｍｍｏｌ）を順次加えた。室温で２４時間以上、撹拌を行った。飽和重炭酸ナトリウム水溶液で反応を停止し、ジクロロメタンで抽出した。次に、分離した有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題の化合物（０．６９ｇ、収率：８２％、オフホワイトの固体）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.64 (brs, 1H), 8.52-8.51 (m, 2H), 8.33 (s, 1H), 7.95 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.56-7.40 (m, 8H), 6.71 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.48 (s, 2H), 4.27 (qt, J = 7.5 Hz, 2H), 3.43-3.36 (m, 4H), 3.23 (s, 3H), 1.14-1.30 (m, 12H)
工程７：４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－｛［２－（５－｛［（２－メトキシエチル）アミノ］メチル｝ピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル］オキシ｝フェニル）－２－オキソ－１－フェニル－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド塩酸塩の合成
Figure 2022554042000043
 工程６で製造した化合物（０．６９ｇ、０．９ｍｍｏｌ）に、１０ｍＬの４Ｍ塩酸の１，４－ジオキサン液を加え、室温で１時間以上撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、少量のエタノールに溶解し、ジエチルエーテルを加えた。得られた固体をろ過し、乾燥して、表題の化合物（０．６１ｇ、収率：９６％、オフホワイトの固体）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.70 (brs, 1H), 9.50 (brs, 2H), 8.80 (s, 1H), 8.69 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.47 (s, 1H), 8.44 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.22 (dd, J = 10.0 and 5.0 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.57-7.40 (m, 7H), 6.97 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.29-4.25 (m, 4H), 3.65 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.31 (s, 3H), 3.16-3.12 (m, 2H), 1.31 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
実施例１３：４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－｛［２－（５－｛［（２－メトキシエチル）アミノ］メチル｝ピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル］オキシ｝フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド塩酸塩の製造
工程６の出発物質として、製造例１の４－エトキシ－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボン酸を用いたことを除いて、実施例１２の合成経路に従って製造を行い、表題の化合物（収率：５２．８％）を得た。
Figure 2022554042000044
 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.67 (br s, 1H), 9.32 (br s, 2H), 8.78 (s, 1H), 8.62 (d, J=5.0Hz, 1H), 8.46 (s, 1H), 8.41 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 8.18 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.99-7.96 (m, 1H), 7.90-7.88 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.53-7.39 (m, 6H), 6.86 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.55 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.30-4.26 (m, 4H), 3.64 (m, 2H), 3.33 (s, 3H), 3.19-3.14 (m, 2H), 1.32 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
実施例１４：Ｎ－（３－クロロ－４－｛［２－（５－｛［（２－メトキシエチル）アミノ］メチル｝ピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル］オキシ｝フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－４－メトキシ－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド塩酸塩の製造
工程６の出発物質として、製造例３の１－（４－フルオロフェニル）－４－メトキシ－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボン酸を用い、工程４で２－フルオロ－４－ニトロフェノールの代わりに２－クロロ－４－ニトロフェノールを用いたことを除いて、実施例１２の合成経路に従って製造を行い、表題の化合物（収率：８８．６％）を得た。
Figure 2022554042000045
 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.72 (brs, 1H), 9.44 (brs, 2H), 8.79 (s, 1H), 8.65 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.45 (s, 1H), 8.42 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 8.21-8.17 (m, 2H), 7.92 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.70 (dd, J = 10.0 and 5.0 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.49-7.36 (m, 4H), 6.84 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.56 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.27 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.65 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.31 (s, 3H), 3.16-3.12 (m, 2H)
実施例１５：４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－｛［２－（５－｛［（２－メトキシエチル）アミノ］メチル｝ピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル］オキシ｝フェニル）－１－（３－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド塩酸塩の製造
工程６の出発物質として、製造例７の４－エトキシ－１－（３－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボン酸を用いたことを除いて、実施例１２の合成経路に従って製造を行い、表題の化合物（収率：７３．５％）を得た。
Figure 2022554042000046
 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.70(s, 1H), 9.47(brs, 2H), 8.79(s, 1H), 8.66(d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.46(s, 1H), 8.43(d, J = 10.0 Hz, 1H), 8.21(dd, J = 10.0 Hz and 5.0 Hz, 1H), 7.98(d, J = 15.0 Hz, 1H), 7.91(d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.61-7.53(m, 3H), 7.39-7.33(m, 2H), 7.28(d, J = 10.0 Hz, 1H), 6.93(d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.55(d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.30-4.26(m, 4H), 3.65(t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.31(s, 3H), 3.16-3.12(m, 2H), 1.30(t, J = 5.0 Hz, 3H)
実施例１６：Ｎ－（３－フルオロ－４－｛［２－（５－｛［（２－メトキシエチル）アミノ］メチル｝ピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル］オキシ｝フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－４－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド塩酸塩の製造
工程６の出発物質として、製造例８の４－メチル－２－オキソ－１－（４－フルオロフェニル）－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボン酸を用いたことを除いて、実施例１２の合成経路に従って製造を行い、表題の化合物（収率：６７．４％）を得た。
Figure 2022554042000047
 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.95 (s, 1H), 9.24 (brs, 2H), 8.75 (s, 1H), 8.58 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.44 (s, 1H), 8.39 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 8.14 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.53-7.49 (m, 4H), 7.41-7.37 (m, 2H), 6.79 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.38 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.27 (t, J = 5.0 H, 2H), 3.63 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.32 (s, 3H), 3.17-3.13 (m, 2H), 2.31 (s, 3H)
実施例１７：４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－｛［２－（５－｛［（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ］メチル｝ピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル］オキシ｝フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド塩酸塩
Figure 2022554042000048
 実施例１３の化合物を１ｍＬのメタノールに溶解し、ホルムアルデヒド（０．０２ｍＬ、０．２８ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。撹拌を１時間行った。次に、ナトリウムシアノヒドリド（１２ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を加え、１２時間撹拌した。反応終了後、得られたものをジクロロメタンで抽出し、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、その後、０．２ｍＬの４Ｍ塩酸の１，４－ジオキサン液を用いて、表題の化合物（１７．５ｍｇ、収率：５０．５％、オフホワイトの固体）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.67 (s, 1H), 10.51 (brs, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.60 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.43 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 8.21 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.52-7.45 (m, 4H), 7.39-7.36 (m, 2H), 6.83 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.51-4.36 (m, 2H), 4.27 (q, J = 5.0 Hz, 2H), 3.73 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.38-3.29 (m, 2H), 3.32 (s, 3H), 2.75 (d, J = 5.0 Hz, 3H)
実施例１８：４－エトキシ－Ｎ－［３－フルオロ－４－（｛２－［５－（モルホリノメチル）ピリジン－２－イル］チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル｝オキシ）フェニル］－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド塩酸塩の製造
工程１：Ｎ－［４－（｛２－［５－（１，３－ジオキソラン－２－イル）ピリジン－２－イル］チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル｝オキシ）－３－フルオロフェニル］－４－エトキシ－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミドの合成
Figure 2022554042000049
 出発物質として、国際公開ＷＯ２００９／０２６７１７の製造方法により容易に製造可能な、４－（｛２－［５－（１，３－ジオキソラン－２－イル）ピリジン－２－イル］チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル｝オキシ）－３－フルオロアニリンを用い、実施例１２の工程６と同様の方法で反応を進行させることにより、表題の化合物（１３５ｍｇ、収率：６４％、オフホワイトの固体）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.63 (s, 1H), 8.70 (s, 1H), 8.52 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.32 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.99 (dd, J = 10.0 and 5.0 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.50-7.45 (m, 4H), 7.39-7.35 (m, 2H), 6.71 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 5.90 (s, 1H), 4.27 (qt, J = 5.0 H, 2H), 4.12-4.07 (m, 2H), 4.04-3.99 (m, 2H), 1.31 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
工程２：４－エトキシ－Ｎ－｛３－フルオロ－４－［２－（５－ホルミルピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル］オキシフェニル｝－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミドの合成
Figure 2022554042000050
 工程１で製造した化合物（１００ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）をアセトンと水の混合溶液に溶解し、次いで、２ｍＬのトリフルオロ酢酸を室温で滴下して加えた。６０℃で１２時間、撹拌を行った。得られたものを室温に冷却し、得られた固体を減圧下でろ過した。次に、得られたものを水およびジエチルエーテルで洗浄し、乾燥して、表題の化合物（８２ｍｇ、収率：８８％、オフホワイトの固体）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.64 (s, 1H), 10.14 (s, 1H), 9.15 (s, 1H), 8.59-8.58 (m, 2H), 8.52 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.39 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.51-7.45 (m, 4H), 7.39-7.36 (m, 2H), 6.78 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.27 (qt, J = 5.0 H, 2H), 1.31 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
工程３：４－エトキシ－Ｎ－［３－フルオロ－４－（｛２－［５－（ヒドロキシメチル）ピリジン－２－イル］チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル｝オキシ）フェニル］－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミドの合成
Figure 2022554042000051
 工程２で製造した化合物（８２ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を１，２－ジクロロエタンに溶解し、次いで、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（８３ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１２時間、撹拌を行った。飽和重炭酸ナトリウム水溶液で反応を停止し、ジクロロメタンで抽出した。次に、得られたものを無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題の化合物（５３ｍｇ、収率：６４％、白色の固体）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.63 (s, 1H), 8.58 (s, 1H), 8.51 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.33 (s, 1H), 8.25 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.89-7.86 (m, 2H), 7.50-7.45 (m, 4H), 7.39-7.36 (m, 2H), 6.69 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 5.43 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 4.59 (d, J = 5.0 Hz, 2H), 4.27 (qt, J = 5.0 H, 2H), 1.31 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
工程４：Ｎ－［４－（｛２－［５－（クロロメチル）ピリジン－２－イル］チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル｝オキシ）－３－フルオロフェニル］－４－エトキシ－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミドの合成
Figure 2022554042000052
 工程３で製造した化合物（２９６ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）をジクロロメタンに溶解し、次いで、塩化チオニル（０．０７ｍＬ、０．９７ｍｍｏｌ）を加えた。室温で３時間、撹拌を行った。０℃の飽和重炭酸ナトリウム水溶液で反応を停止し、ジクロロメタンで抽出した。得られたものを無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮して、表題の化合物（２４０ｍｇ、収率：７８％、黄色の固体）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.63 (s, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.52 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.40 (s, 1H), 8.32 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 8.04 (dd, J = 10.0 and 5.0 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.50-7.46 (m, 4H), 7.39-7.36 (m, 2H), 6.71 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.88 (s, 2H), 4.27 (qt, J = 5.0 H, 2H), 1.31 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
工程５：４－エトキシ－Ｎ－［３－フルオロ－４－（｛２－［５－（モルホリノメチル）ピリジン－２－イル］チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル｝オキシ）フェニル］－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド塩酸塩の合成
Figure 2022554042000053
 工程４で製造した化合物（４０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）をアセトニトリルに溶解し、モルホリン（０．０１ｍＬ、０．１２ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１３ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を加えた。８０℃で５時間、撹拌を行った。得られたものを室温に冷却し、減圧下で濃縮した。次いで、ジクロロメタンと少量のメタノールで抽出した。分離した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、その後、０．２ｍＬの４Ｍ塩酸の１，４－ジオキサン液を用いて、表題の化合物（１６．６ｍｇ、収率：３０％、オフホワイトの固体）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.66 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.60 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.43 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.23 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.52-7.45 (m, 4H), 7.39-7.36 (m, 2H), 6.83 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.44 (s, 2H), 4.26 (qt, J = 5.0 H, 2H), 3.96-3.94 (m, 2H), 3.77 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 3.32-3.30 (m, 2H), 3.14 (qt, J = 10.0 2H), 1.31 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
実施例１９：４－エトキシ－Ｎ－［３－フルオロ－４－（｛２－［５－（モルホリノメチル）ピリジン－２－イル］チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル｝オキシ）フェニル］－２－オキソ－１－フェニル－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド塩酸塩の製造
工程１の出発物質として、製造例２の４－エトキシ－２－オキソ－１－フェニル－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボン酸を用いたことを除いて、実施例１８の合成経路に従って製造を行い、表題の化合物（収率：５２．３％）を得た。
Figure 2022554042000054
 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.66 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.58 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.47 (s, 1H), 8.43 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.56-7.47 (m, 5H), 7.43-7.40 (m, 2H), 6.80 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.44 (s, 2H), 4.26 (qt, J = 5.0 H, 2H), 3.97-3.95 (m, 2H), 3.74 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 3.33-3.30 (m, 2H), 3.14 (qt, J = 10.0 2H), 1.31 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
実施例２０：４－エトキシ－Ｎ－｛３－フルオロ－４－［（２－｛５－［（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル］ピリジン－２－イル｝チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル）オキシ］フェニル｝－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド塩酸塩の製造
工程５でモルホリンの代わりにＮ－メチルピペラジンを用いたことを除いて、実施例１８の合成経路に従って製造を行い、表題の化合物（収率：２２．２％）を得た。
Figure 2022554042000055
 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.67 (s, 1H), 8.81 (brs, 1H), 8.60 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.46 (s, 1H), 8.41 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.96 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.52-7.45 (m, 4H), 7.39-7.36 (m, 2H), 6.84 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.26 (qt, J = 5.0 H, 2H), 4.07 (brs, 8H), 3.56 (brs, 2H), 2.80 (s, 3H), 1.31 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
実施例２１：４－エトキシ－Ｎ－｛３－フルオロ－４－［（２－｛５－［（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル］ピリジン－２－イル｝チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル）オキシ］フェニル｝－２－オキソ－１－フェニル－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド塩酸塩の製造
工程５でモルホリンの代わりにＮ－メチルピペラジンを用いたことを除いて、実施例１８の合成経路に従って製造を行い、表題の化合物（収率：３１．４％）を得た。
Figure 2022554042000056
 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.68 (s, 1H), 8.82 (brs, 1H), 8.61 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.47 (s, 1H), 8.41 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.97 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.56-7.46 (m, 5H), 7.42-7.40 (m, 2H), 6.86 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.26 (qt, J = 5.0 H, 2H), 3.93 (brs, 8H), 3.58 (brs, 2H), 2.81 (s, 3H), 1.31 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
さらに、以下の公知の化合物を比較のために使用した。
比較例１
ＵＳ８，５３６，２００Ｂ２の化合物１、Ｎ－｛４－［（２－アミノ－３－クロロ－４－ピリジニル）オキシ］－３－フルオロフェニル｝－４－エトキシ－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－３－ピリジンカルボキサミド；比較例１の化合物は、ＲＯＮ阻害剤として知られているＢＭＳ－７７７６０７である。
比較例２
ＵＳ８，０８８，７９４Ｂ２の実施例７３の化合物、Ｎ－（３－フルオロ－４－（７－メトキシキノリン－４－イルオキシ）フェニル）－１－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－５－エチル－３－オキソ－２－フェニル－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－４－カルボキサミド。
比較例３
ＵＳ８，０３０，３０２Ｂ２の実施例１の化合物、Ｎ－（３－フルオロ－４－（１－メチル－６－（１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１Ｈ－インダゾール－５－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－６－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド。
実験例１．ＲＯＮ活性阻害アッセイ：実施例１および５
酵素反応を、ＲＯＮ酵素の基質として機能する、２ｎｇ／ｕＬの２５０ｕＭのＧ４Ｙ１ペプチド、および５０μＭのＡＴＰを含むアッセイ緩衝液（４０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、５０ｕＭのＤＴＴ）を用いて行った。得られたものを、実施例および比較例で製造した化合物で濃度を変えて処理し、室温で１時間、反応を進行させた。その後、ＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）試薬およびキナーゼ検出試薬を順次添加し、室温でそれぞれ４０分および３０分、反応させた。
続いて、Ｗａｌｌａａｃ Ｖｉｃｔｏｒ ２ＴＭ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１４２０－０４２）を使用して発光を測定した。データは、ＲＯＮ阻害剤の活性を確認するために測定したＲＬＵ値を用いて分析した。化合物で処理されていないサンプルのＲＬＵ値を１００％対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）として設定し、ＲＯＮ阻害活性を、試験された濃度で化合物により処理されたサンプル中のＲＯＮ酵素の残留活性のパーセンテージとして評価した。対照と比較して５０％のＲＯＮ酵素活性阻害が起こる化合物の濃度を、ＲＯＮ阻害剤のＩＣ５０値（ｎＭ）として求めた。結果を表１に示す。
Figure 2022554042000057
実験例２．ＲＯＮ活性阻害能アッセイ：実施例１２～２１
チエノピリジン誘導体の酵素活性阻害能（ＩＣ５０）は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）技術を用いて測定した。
ＲＯＮキナーゼ（カルナバイオサイエンス）を、キナーゼアッセイ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＤＴＴ、および０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０）で、最終反応濃度の２倍（０．４ｎＭ）の濃度に希釈し、希釈液を５μＬ／ウェルで３８４ウェルプレートに加えた。
サンプル化合物として、本発明の実施例で合成した化合物および比較例の化合物を使用した。サンプル化合物をそれぞれ１００％ＤＭＳＯに溶解し、１ｍＭのストック溶液を得て、これを８回の１０倍段階希釈にかけた。各サンプル化合物を、最終反応濃度の４倍の濃度にキナーゼアッセイ緩衝液で希釈し、次いで希釈液を２．５μＬ／ウェルで３８４ウェルプレートに加えた。続いて、プレートを室温で１５分間インキュベートした。
次に、０．２５Ｍ濃度で調製したＡＴＰ溶液（シグマアルドリッチ）を、キナーゼ反応緩衝液で、最終反応濃度の４倍（６０μＭ）の濃度に希釈し、チロシンペプチド基質（パーキン－エルマー）を、最終反応濃度の４倍（４００ｎＭ）の濃度に希釈した。希釈液を２．５μＬ／ウェルで３８４ウェルプレートに加えた。次に、３８４ウェルプレートを室温でインキュベートし、反応を６０分間進行させた。６０分後、ＥＤＴＡ（シグマアルドリッチ）を、ＴＲ－ＦＲＥＴ検出緩衝液（パーキン－エルマー）で、最終反応濃度の４倍（４０ｍＭ）の濃度に希釈した。
ユーロピウム含有抗ホスホチロシン抗体（パーキン－エルマー）をＥＤＴＡ希釈溶液で最終反応濃度の４倍（８ｎＭ）の濃度に希釈し、ＲＯＮキナーゼ反応の停止溶液を調製した。調製した停止溶液を３８４ウェルプレートに１０μＬ／ウェルで加えて反応を停止させ、次いで、プレートを室温で６０分間インキュベートした。６０分後、プレートをＶｉｃｔｏｒ Ｘ５プレートリーダー（パーキン－エルマー）で測定した。このとき、励起波長は３４０ｎｍ、発光波長は６２０ｎｍおよび６６５ｎｍ、とした。サンプル化合物のＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）５を用いて、６６５ｎｍでの発光エネルギーをサンプル化合物の濃度の関数として表してＩＣ５０値を計算することで、算出した。結果を表２に示す。
Figure 2022554042000058
 表２に示すように、実施例の化合物は、ＲＯＮチロシンキナーゼ酵素に対して非常に優れた阻害効果を有する。
実験例３．細胞増殖阻害アッセイ：実施例１～１１
本発明の化合物が、細胞外シグナル調節キナーゼ活性の阻害を介して癌細胞増殖阻害効果を有するかどうかを確認するために、ＭＴＳエッセイを行った。
以下のアッセイは、ヒト胃癌細胞株であるＭＫＮ４５細胞株（活性ＲＯＮを発現する細胞株）で実施した。ＭＫＮ４５細胞株を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む９６ウェルプレートに、５，０００細胞／ウェルの濃度で分注し、５％ＣＯ２、３７℃の条件で、プレートを２４時間インキュベートした。次に、各ウェルを、実施例で製造した化合物で、それぞれ１０μＭの高濃度から段階希釈したもので、処理した。溶媒対照として、各ウェルを、化合物の処理で用いたものと同じ濃度（％（Ｖ／Ｖ））のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処理した。その後、各細胞を４８時間インキュベートした。
細胞の生存率を確認するために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｏｕｓ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で提供されるフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）とＭＴＳとの混合物を、各培養細胞培地に加えた。インキュベーションをさらに、３７℃の条件で２時間３０分、行った。次に、４９０ｎｍで吸光度を測定した。各化合物の処理濃度に応じた細胞増殖阻害度を、化合物で処理されていない溶媒対照の細胞の吸光度に基づいて計算し、癌細胞の増殖を５０％阻害する各化合物の濃度をＩＣ５０（ｎＭ）値として求めた。結果を表３に示す。以下において、Ａは＜１０ｎＭ、Ｂは１０～５０ｎＭ、Ｃは＞５０ｎＭを表す。
Figure 2022554042000059
実験例４．細胞殺傷効果の測定：実施例１２～２１
変異体（Δ１６０）を保有するＫＭ１２Ｃ（８００１５、ＫＣＬＢ、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）結腸癌細胞を、６ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェルで調製した。２４時間後、培地交換を行い、細胞を各濃度（１μＭ、５μＭ）のサンプル化合物で４８時間処理した。
サンプル化合物として、本発明の実施例で合成した化合物および比較例の化合物を使用した。４８時間後、細胞懸濁液を収集し、遠心分離（１，５００ｒｐｍ、４分）して細胞を採取し、トリパンブルー（１５２５０－０６１、Ｇｉｂｃｏ）排除アッセイによって、生細胞および死細胞を定量した（ｎ＝２）。統計分析は、マイクロソフトのＥｘｃｅｌ（商標）のＴ検定を使用して行った。比較例１～３および実施例１の化合物の細胞死（％）を測定した結果を図１に示す。さらに、実施例および比較例の化合物の細胞死をそれぞれ測定し、比較例１と比較した比率として、その結果を表４に示す。
Figure 2022554042000060
 表４および図１に示すように、実施例の化合物は、従来の化合物と比較して、ＲＯＮ変異体（Δ１６０）を保有する結腸癌細胞株（ＫＭ１２Ｃ）において比較的高い抗癌効果を示す。
実験例５．ＭＴＳアッセイを用いた細胞毒性の確認
薬剤の特異的な細胞毒性を確認するために、培養細胞を０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（０．５％トリプシンＥＤＴＡ（１０Ｘ）、製品番号：１５４００－０５４、Ｇｉｂｃｏ）で処理して培養皿から剥がし、３，０００細胞（ＫＭ１２Ｃ）または２，０００細胞（ＨＴ２９、Ｃｏｌｏ３２０ＨＳＲ）を各ウェルに分注した。２４時間後、サンプル化合物を溶媒としてＤＭＳＯ（製品番号：Ｄ８４１８－２５０ＭＬ、ＳＩＧＭＡ）に溶解し、１０ｍＭのストック溶液を調製し、これを希釈して使用した。サンプル化合物として、本発明の実施例で合成した化合物および比較例の化合物を使用した。ストック溶液をそれぞれＤＭＳＯで、１０ｍＭから開始して１／１０倍していく８つの濃度（ＫＭ１２Ｃの場合）に、および１０ｍＭから開始して１／２倍していく９つの濃度（ＨＴ２９の場合）に、希釈した。希釈した薬剤は、最高濃度に基づくと１００μＭの濃度となった。細胞を薬剤で処理し、次いで、５％ＣＯ２インキュベーターで、３７℃で７２時間、インキュベートした。
７２時間後、２０μＬのＭＴＳ溶液（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ、製品番号：Ｇ３５８１、Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに分注し、よく混合した。次いで、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、３７℃で１～４時間、インキュベーションを行った。次いで、Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ５プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）を用いて、波長４９０ｎｍで吸光度を測定し、ＩＣ５０値を計算した。結果を表５に示す。
Figure 2022554042000061
 表５に示すように、従来の化合物と比較して、実施例の化合物は、ＲＯＮ変異体（Δ１６０）を保有する結腸癌細胞株（ＫＭ１２Ｃ）において、比較的高い抗癌効果を示す。
実験例６．ＲＯＮ変異体（Δ１６０）を保有するＫＭ１２Ｃにおける実施例１８の効果の分析
実施例１８および比較例１のＭＴＳアッセイにおいて、ＫＭ１２Ｃ細胞を、１ウェルあたり１，０００細胞で９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞を、さまざまな濃度（０．０００００１μＭ～１０μＭ）の実施例１８および比較例１を含む、１０％ＦＢＳ－ＭＥＭ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ）により、１ウェルあたり１００μｌで処理した。次いで、細胞を７２時間インキュベートした。次に、２０μｌのＭＴＳ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、インキュベーションを２時間行った。次に、４９０ｎｍで吸光度を測定した。実施例１８及び比較例１のＩＣ５０値をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）５を用いて計算し、細胞毒性を調べた。
実施例１８および比較例１の細胞死誘導能を、セツキシマブ耐性細胞株であるＲＯＮ変異体（Δ１６０）を有するＫＭ１２Ｃ、およびＲＯＮを発現しない細胞株であるＣｏｌｏ３２０ＨＳＲ細胞株において、測定した。２つの結腸癌細胞株を、それぞれ、２×１０５個の細胞で、６０ｍｍのプレート上に播種した。２４時間後、培地交換を行い、細胞を各濃度（１μＭ、５μＭ）のサンプル化合物で４８時間処理した。４８時間後、細胞および細胞懸濁液を収集し（１，５００ｒｐｍ、３分）、トリパンブルー（１５２５０－０６１、Ｇｉｂｃｏ）排除アッセイによって、生細胞および死細胞を定量した（ｎ＝２）。
実施例１８および比較例１の細胞殺傷効果を分析し、次いで、細胞を収集した。ウエスタンブロッティングを実施して、活性ＲＯＮに対する実施例１８の阻害能力を確認した。溶解のため、ＲＩＰＡ溶解バッファー（Ｔ＆Ｉ）を各細胞に加えた。次いで、ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質を定量した。タンパク質を、タンパク質濃度４０μｇで６％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドにロードし、電気泳動を１２５Ｖで行った。
電気泳動で分離したタンパク質を、転写バッファー（２０％メタノール、２５ｍＭのトリスＨＣｌ、１９２ｍＭのグリシン）を用いて、２７０ｍＡで９０分間、ＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写し、５％無脂肪スキムミルク－ＴＢＳＴ溶液で１時間、ブロッキングを行った。次いで、タンパク質を、５％無脂肪スキムミルク－ＴＢＳＴ溶液で１：１，０００に希釈した一次抗体（活性ＲＯＮ、ベータアクチン）で、４℃で２４時間または４８時間、反応させた。その後、ＴＢＳＴによる洗浄を３回行った。得られたものを、１：１，０００に希釈した抗ウサギおよび抗マウスＩｇＧ結合ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）二次抗体で、室温で２時間、反応させた。その後、ＴＢＳＴによる洗浄を３回行った。次いで、メンブレンをＥＣＬ溶液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で処理し、Ｘ線フィルムに曝露して現像した。その後、バンドをチェックした。
結果は、表６、表７、および図２に示すとおりである。
Figure 2022554042000062
 比較例：ＢＭＳ７７７６０７
Figure 2022554042000063
 表６、表７、および図３により、セツキシマブ耐性細胞株である、ＲＯＮ変異体（Δ１６０）を保有して活性ＲＯＮを発現するＫＭ１２Ｃを、実施例１８で処理した場合に、細胞殺傷効果が観察されることが示された。実施例１８のＲＯＮキナーゼアッセイの結果から、実施例１８は、比較例１と比較して、キナーゼに対して高い阻害効果を示すことが分かった。ＭＴＳアッセイによる比較分析の結果、実施例１８は、６．９ｎＭの高い細胞増殖阻害効果を示すことが確認された。
上記の結果に見られるように、ＲＯＮネガティブのＣｏｌｏ３２０ＨＳＲの場合、薬剤との反応性は観察されなかった。さらに、活性ＲＯＮを発現する細胞株であるＫＭ１２Ｃを実施例１８で処理した場合、比較例１と比較して、細胞殺傷効果が観察された。ここで、ウエスタンブロッティングにより、活性ＲＯＮの発現が減少することが確認された（図２）。
実験例７．ＲＯＮ変異体のキナーゼアッセイ
ＲＯＮ変異体と置き換え可能な方法として、各変異体（Δ１６０、Δ１５５）を、ＲＯＮ陰性細胞株であるＣｏｌｏ３２０ＨＳＲに導入し、細胞を各濃度の実施例１８および比較例１で処理した。次に、免疫沈降およびウエスタンブロッティングによって、活性ＲＯＮの発現が減少するかどうかを確認した。詳細な方法は以下のとおりである。ＲＯＮ陰性Ｃｏｌｏ３２０ＳＨＲ結腸癌細胞株に、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃１１６６８－０１９）を用いて、ＲＯＮΔ１６０およびＲＯＮΔ１５５のそれぞれ１２ｕｇを導入した。同じ導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）効率のために、２４時間後、形質転換された株を６０ｍｍディッシュに分注した。導入後４８時間に、比較例１および実施例１８の薬剤による処理を、用量依存的にそれぞれ行った。薬剤処理の２時間後、細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄した。次に、洗浄した細胞をＲＩＰＡ溶解バッファー（Ｔ＆Ｉ、ｃａｔ＃ＢＲＩ－９００１）で溶解した。
タンパク質濃度を、ブラッドフォード法（ＢｉｏＲａｄ、ｃａｔ＃５０００２０５）を用いて定量化した。次いで、５００ｕｇのタンパク質、および１ｕｇのｍｙｃ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、ｃａｔ＃２２７６）をＲＩＰＡバッファーと混合し、４℃で一晩、反応させた。免疫沈降した溶液に、２０μｌのプロテインＧアガロースビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－２００２）を加えた。次に、スターラーを用いて、反応を４℃で２時間進行させた。ＲＩＰＡバッファーにより洗浄を５回行った。その後、２０μｌの２ＸＳＤＳサンプルバッファーを添加し、１００℃で５分間反応を進行させた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて電気泳動を行った後、タンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写した。次いで、ホスホチロシン抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、ｃａｔ＃９４１１）、およびｍｙｃ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、ｃａｔ＃２２７６）を、５％スキムミルクＴＢＳ－Ｔ（Ｔ＆Ｉ、ｃａｔ＃ＢＴＴ－９１２０）溶液で、それぞれ１：１，０００に希釈し、４℃で一晩反応させた。ＴＢＳ－Ｔ溶液による洗浄を、それぞれ１０分間、３回行った。次に、抗マウスＨＲＰ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、ｃａｔ＃７０７６）を、５％スキムミルク含有１ＸＴＢＳ－Ｔ溶液で、１：２，０００に希釈し、室温で２時間反応させた。１Ｘ ＴＢＳ－Ｔ溶液による洗浄を３回行った後、ＥＣＬ溶液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ｃａｔ＃ＲＰＮ２１０８）を使用してフィルムを現像した。現像したフィルムをＩｍａｇｅ－Ｊを用いたデンシトメトリーで分析した後、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．）を用いて、ＩＣ５０を計算した。
その結果、比較例１と比較して、実施例１８で処理した群では、薬剤処理による急激な減少が観察された（図３および図４）。これらの結果に基づき、ＲＯＮ活性の程度に基づくＩＣ５０値を計算した。その結果、実施例１８は、比較例１と比較して、高い阻害効果を示すことが確認された。
実験例８．Ｃｏｌｏ３２０ＨＳＲ細胞株におけるＲＯＮ変異体（ｍｔ＃１：Δ１６０、ｍｔ＃２：Δ１５５）の過剰発現後の薬剤効果の分析
ＲＯＮ変異体の効果の分析を、ＲＯＮ変異体を過剰発現させ、ウエスタンブロッティングにより細胞死誘導能を確認することにより行った。Ｃｏｌｏ３２０ＨＳＲ細胞株を１００ｍｍプレートに播種し、次いで、トランスフェクション溶液（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）を用いて、ＲＯＮ変異体＃１（Δ１６０）またはＲＯＮ変異体＃２（Δ１５５）を発現するベクターを細胞株に導入した。２４時間後、細胞株を６０ｍｍのプレートに２×１０５細胞で播種した。２４時間後、培地交換を行い、細胞を、各濃度（１μＭ、５μＭ）の実施例１８で、４８時間処理した。
４８時間後、細胞および細胞懸濁液を収集し（１，５００ｒｐｍ、３分間）、生細胞と死細胞をトリパンブルー排除アッセイによって定量した（ｎ＝２）。次いで、活性ＲＯＮの阻害能および細胞死誘導能をウエスタンブロッティングによって確認するために、残存する細胞を収集し、ＲＩＰＡ溶解バッファー（Ｔ＆Ｉ）を各細胞に添加して細胞を溶解した。次に、タンパク質をＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）で定量した。タンパク質を、タンパク質濃度４０μｇで８％または１５％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドにロードし、電気泳動を１２５Ｖで行った。電気泳動で分離したタンパク質を、転写バッファー（２０％メタノール、２５ｍＭのトリスＨＣｌ、１９２ｍＭのグリシン）を用いて、２７０ｍＡで９０分間、ＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写し、５％無脂肪スキムミルク－ＴＢＳＴ溶液で１時間、ブロッキングを行った。
その後、タンパク質を、５％無脂肪スキムミルク－ＴＢＳＴ溶液で１：１，０００に希釈した一次抗体（活性ＲＯＮ、切断カスパーゼ３、ベータアクチン）で、２４時間または４８時間、反応させた。次いで、ＴＢＳＴによる洗浄を３回行った。得られたものを、１：１０００に希釈した抗ウサギおよび抗マウスＩｇＧ結合ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）二次抗体で、室温で２時間反応させた。次に、ＴＢＳＴによる洗浄を３回行った。その後、メンブレンをＥＣＬ溶液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で処理し、Ｘ線フィルムに曝露して現像した。その後、バンドをチェックした。
その結果、ＲＯＮ陰性でＫＲＡＳ ｗｔである細胞株であるＣｏｌｏ３２０ＳＨＲに、リポフェクタミン２０００を用いて、ＲＯＮ変異体＃１（Δ１６０）またはＲＯＮ変異体＃２（Δ１５５）が導入され、実施例１８の薬剤の効果が分析された。細胞を各濃度の実施例１８で処理し、４８時間後に収集した。細胞死を、トリパンブルー排除アッセイによって確認した。その結果、ＲＯＮ変異体が導入された群では、各濃度での細胞死誘導が観察された（図５）。ここで、タンパク質発現の変化をウエスタンブロッティングで分析した。その結果、活性ＲＯＮは発現レベルの低下を示し、切断カスパーゼ３は発現レベルの増加を示すことが確認された（図６）。
実験例９．ＲＯＮ変異体（Δ１６０）を保有するＫＭ１２Ｃ細胞株における実施例１８の作用機構の分析
ＫＭ１２Ｃ細胞株を、１００ｍｍプレートに５×１０５細胞で播種した。２４時間後、細胞を、４８時間、各濃度（１μＭ、５μＭ）の実施例１８で処理した。４８時間後、細胞および細胞懸濁液を収集し（１，５００ｒｐｍ、３分）、関連するタンパク質の発現の変化をウエスタンブロッティングで確認した。溶解させるため、ＲＩＰＡ溶解バッファー（Ｔ＆Ｉ）を各細胞に加えた。次いで、ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質を定量した。次に、タンパク質を８％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドにロードし、電気泳動を１２５Ｖで行った。
電気泳動で分離したタンパク質を、転写バッファー（２０％メタノール、２５ｍＭのトリスＨＣｌ、１９２ｍＭのグリシン）を用いて、２７０ｍＡで９０分間、ＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。次いで、５％無脂肪スキムミルク－ＴＢＳＴ溶液で１時間ブロッキングを行った。次に、タンパク質を、５％無脂肪スキムミルク－ＴＢＳＴ溶液で１：１，０００に希釈した一次抗体で、４℃で２４時間または４８時間、反応させた。その後、ＴＢＳＴによる洗浄を３回行った。得られたものを、１：１，０００に希釈した抗ウサギおよび抗マウスＩｇＧ結合ＨＲＰ二次抗体で、室温で２時間、反応させた。その後、ＴＢＳＴによる洗浄を３回行った。次いで、メンブレンをＥＣＬ溶液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で処理し、Ｘ線フィルムに曝露して現像した。その後、バンドをチェックした。
その結果、セツキシマブ耐性細胞株であるＲＯＮ変異体（Δ１６０）を保有して活性ＲＯＮを発現するＫＭ１２Ｃは、各濃度の実施例１８で処理され、関連タンパク質の発現の変化がウエスタンブロッティングで確認された。その結果、活性ＲＯＮが減少し、そして、ｐ－ＥＲＫ、ｐ－Ｓｒｃ、ｐ－Ａｋｔ、およびｐ－Ｇａｂ１が減少することが確認された（図７）。
実験例１０．ＫＭ１２Ｃ細胞株を移植した動物モデルにおける腫瘍増殖阻害効果の確認
５週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを購入し、１週間順応させた。その後、ヒト由来結腸癌細胞株ＫＭ１２Ｃ（１．５×１０６細胞／マウス）（活性ＲＯＮ／ＲＯＮ変異（Δ１６０）発現細胞株）をＰＢＳで希釈し、マウスの右背部に皮下注射（１００μｌ）した。腫瘍が約１００ｍｍ３のサイズに達したときに、比較例１および実施例１８を経口投与した。薬剤を１日１回２週間投与し、腫瘍のサイズと体重を週２回測定した。その結果、薬剤投与による腫瘍増殖阻害効果が、実施例１８を摂取した群で観察された（図８）。さらに、薬剤投与の終了後、実験動物を屠殺し、腫瘍を摘出して秤量した。その結果、ビヒクル群と比較して、実施例１８の処置群では腫瘍重量の減少が観察された（図９）。ここで、マウスの体重に変化がないことが確認された（図１０）。
さらに、摘出した腫瘍組織の一部を１０％ホルマリンで固定し、パラフィンブロックを作製した。次に、免疫化学染色により各タンパク質の発現の変化を確認した。その結果、実施例１８を摂取した群では、活性ＲＯＮおよびｐ－ＥＲＫの発現が減少するのに対し、切断カスパーゼ３の発現が誘導されることが確認された（図１１）。ビヒクル群および５ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ）処置群から腫瘍組織を収集し、タンパク質発現の変化をウエスタンブロッティングによって比較した。その結果、活性ＲＯＮは発現レベルの低下を示し、切断カスパーゼ３は発現レベルの上昇を示すことが確認された（図１２）。
実験例１１．ＫＭ１２Ｃ細胞株を移植した動物モデルにおける実施例１８の有効性分析
５週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを購入し、１週間順応させた。次に、ヒト由来結腸癌細胞株ＫＭ１２Ｃ（１．５×１０６細胞／マウス）をＰＢＳで希釈し、マウスの右背部に皮下注射（１００μｌ）した。腫瘍が約１００ｍｍ３のサイズに達したときに、比較例１および実施例１８を経口投与した。薬剤を３０ｍｐｋおよび５０ｍｐｋで１日１回２週間投与し、腫瘍のサイズと体重を週２回測定した。その結果、比較例１および実施例１８の両方が非常に高い腫瘍増殖阻害効果を示すことが確認された（図１３と図１４、および表８）。ここで、マウスの体重にほとんど変化がないことが確認された（図１５）。薬剤投与の終了後、実験動物を屠殺し、次に腫瘍を摘出し、秤量して比較分析を行った。その結果、高い腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）効果が、比較例１と比較して、薬剤投与群において観察された。
Figure 2022554042000064
実験例１２．ＫＭ１２Ｃ細胞株を移植した動物モデルにおける有効用量濃度の確認
５週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを購入し、１週間順応させた。次に、ヒト由来結腸癌細胞株ＫＭ１２Ｃ（１．５×１０６細胞／マウス）をＰＢＳで希釈し、マウスの右背部に皮下注射（１００μｌ）した。腫瘍が約１００ｍｍ３のサイズに達したときに、実施例１８を各用量で経口投与した。薬剤を１日１回２週間投与し、腫瘍のサイズと体重を週２回測定し、比較分析を行った。薬剤投与の終了後、実験動物を屠殺し、腫瘍を摘出し、秤量して比較分析を行った。
その結果、腫瘍の増殖が濃度依存的に抑制されることが確認された（図１６）。ここで、腫瘍組織のサイズと重量も投与濃度とともに減少することが確認された。これらの結果から、有効用量濃度は５．２１４ｍｐｋであることが確認された（図１７）。
実験例１３．結腸癌患者の組織の腫瘍細胞を移植した動物モデルにおける実施例１８の有効性分析
５週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを購入し、１週間順応させた。次に、結腸癌患者由来の癌組織をマウスの右背部に移植した。腫瘍が約１００ｍｍ３のサイズに達したときに、実施例１８を経口投与した。薬剤を１日１回４週間投与し、腫瘍のサイズと体重を週２回測定して、比較分析を行った。薬剤投与の終了後、実験動物を屠殺し、次に腫瘍を摘出し、秤量して比較分析を行った。
その結果、結腸癌患者の腫瘍細胞が移植された動物モデル（ＲＯＮ変異体：Δ１６０）に実施例１８を投与した場合、腫瘍の増殖が阻害されることが確認された。薬剤は毎日経口投与され、使用された用量は５０ｍｐｋであった。４週間の薬剤投与の結果、腫瘍の増殖が８０％以上抑制されることが確認された（図１８）。さらに、薬剤投与の終了後、腫瘍組織を摘出し、秤量して比較分析を行った。その結果、ビヒクルと比較して、腫瘍増殖が約８３％抑制されることが確認された（図１９および図１８）。図１９の下の写真は、各群の代表的な個体から摘出した腫瘍を示している。
実験例１４．結腸癌患者の組織の腫瘍細胞を移植した動物モデルにおける実施例１８の有効性分析
結腸癌患者の組織の腫瘍細胞を移植した動物モデルにおけるのと同じ患者の組織（活性ＲＯＮ／ＲＯＮ変異体＃１：Δ１６０）の細胞を移植した動物モデルに、実施例１８および比較例１を、３０ｍｐｋで４週間、投与した。その結果、実施例１８を摂取した群は、約７３％の腫瘍増殖抑制効果を示すことが確認された（図２０）。一方、比較例１を摂取した群は、実施例１８と比較して約１８％の低い効果を示すことが確認された（図２１）。図２１の下の写真は、各群の代表的な個体から摘出した腫瘍を示している。
実験例１５．結腸癌患者由来の細胞株における活性ＲＯＮの発現に応じた実施例１８の有効性分析
次の条件および方法を用いて、本実験を行った。２つのヒト結腸癌由来細胞株（ＫＲＡＳ正常、ＲＯＮ活性および不活性）をＲＥＢＭ（Ｌｏｎｚａ）培地で培養した。次いで、各細胞株を、２４ウェルプレートに５×１０５細胞で播種し、滅菌した１２ｍｍφの顕微鏡用カバーガラスを各ウェル上に配置し、インキュベートした。インキュベーション下において、それぞれの結腸癌患者由来細胞株に、各５ｕｇの実施例１８および比較例１による処理を施し、４８時間インキュベートした。インキュベートした各プレートをＰＢＳで２回洗浄した後、１００％メタノールで室温で５分間固定した。
メタノールを除去し、ＰＢＳによる洗浄を５分間、３回行った。次に、１００μｌの０．１％トリトンＸ－１００（ＰＢＳ中）を分注し、透過処理を５分間行った。ＰＢＳによる洗浄を５分間、３回行った後、乾燥を防ぐためにＰＢＳを加えた。パラフィルムを２４ウェルプレートカバーに取り付けた後、３％ＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ＋０．１％ツイーン２０）を２０μｌずつパラフィルムに滴下した。各結腸癌患者由来細胞株を固定したカバーガラスを、細胞が付着している面を下に向けて３％ＢＳＡ上に置き、室温で３０分間ブロッキングを行った。
次いで、パラフィルムを新しい２４ウェルプレートカバーに取り付けた。一次抗体（サイトケラチン１８、切断カスパーゼ３）を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ＋０．１％ツィーン２０）で希釈し、希釈液をパラフィルム上に１０ｕＬで滴下した。次に、ブロックされたカバーガラスを、細胞が付着している面を下に向けてその上に置き、４℃で一晩、反応を進行させた。
一次抗体反応終了後の各カバーガラスを、ＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ＋０．１％ツィーン２０）を含む２４ウェルプレートに、細胞を付着させた面を上に向けて置き、洗浄を各５分間で３回行った。次いで、新しい２４ウェルプレートカバーにパラフィルムを取り付けた。二次抗体（免疫蛍光二次抗体）を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ＋０．１％ツィーン２０）で希釈し、希釈液を１０ｕｌでパラフィルムに滴下した。次に、細胞が付着している面を下に向けてカバーガラスを置き、室温で２時間反応させた。
二次抗体反応終了後の各カバーガラスを、ＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ＋０．１％ツィーン２０）を含む２４ウェルプレートに、細胞が付着している面を上に向けて置き、洗浄を各５分間で３回行った。次いで、１μｇ／ｍＬのヘキスト染色剤（ＤＡＰＩ）をＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ＋０．１％ツィーン２０）と混合し、混合物を２４ウェルプレートの各ウェルに１００ｕｌで添加した。反応を１分間進行させた。次に、ＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ＋０．１％ツィーン２０）で２回洗浄し、蛍光顕微鏡を用いて染色を確認した。その後、５μｌのマウント溶液をスライドガラスに滴下して染色を行った。その後、カバーガラスをその上に置き、蛍光顕微鏡を用いて蛍光画像を撮影した。
その結果、結腸癌患者由来細胞株のうち、活性ＲＯＮを発現する細胞株を実施例１８および比較例１で処理した場合、実施例１８で処理した群が細胞死誘導効果を示すことが確認された（図２２および図２３）。さらに、活性ＲＯＮが陰性の場合、薬剤処理による反応性は生じないことが確認された（図２４および図２５）。ここで、サイトケラチン１８は結腸癌のマーカーとして使用された。
実験例１６．結腸癌細胞株のＲＯＮバイオマーカー遺伝子の分析
３５種のヒト結腸癌細胞株（１９種のＫＲＡＳ正常型、および１６種のＫＲＡＳ変異型）を培養し、収集した。各細胞株を１×１０６～２×１０６細胞で、１．５ｍｌチューブに入れ、細胞ペレットを得た。次いで、各サンプルに１ｍｌのＴｒｉｚｏｌを加え、ピペッティングにより細胞を粉砕した。次に、２００μｌのクロロホルムを加え、１５秒間穏やかに混合した後、室温で３分間反応を進行させた。反応サンプルを１２，０００×ｇ、４℃で１５分間、遠心分離機を用いて遠心分離した。透明な上清を新しい１．５ｍｌチューブに入れた。次に、０．５ｍｌのイソプロパノールを加え、１５秒間穏やかに混合した後、室温で１０分間反応を進行させた。
反応サンプルを、１２，０００×ｇ、４℃で１分間、遠心分離機を用いて遠心分離し、チューブの底にある白色のＲＮＡペレットを確認した。次いで、上澄みを除去した。次に、１ｍｌの７５％エタノールを加え、ボルテックスミキサーを用いて１０秒間混合し、得られたものを、１２，０００×ｇ、４℃で１０分間、遠心分離した。次に、ＲＮＡペレットを確認し、上清を除去した。チューブを逆さにし、室温で乾燥させて、液体を除去した。水分を除去したＲＮＡペレットを、５０ｕｌ～１００ｕｌのＲＮａｓｅフリー水に溶解した。次に、抽出したトータルＲＮＡをナノドロップ装置で測定し、１ｕｇのトータルＲＮＡおよび１ｕｌのオリゴｄＴを新しいチューブで混合し、ヒートブロックまたは水浴を用いて７０℃の温度で５分間反応させた。次に、混合物を氷で冷却した。
ｃＤＮＡ合成キットチューブ（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ＰｒｅＭｉｘ、ＢＩＯＮＥＥＲ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡについて、ＲＴ－ＰＣＲのプレミックスキットチューブ（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ Ｇｏｌｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ、ＢＩＯＮＥＥＲ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）、および、ＲＯＮのエクソン（ｅｘｏｎ）５－６（ＲＯＮ ｄ５＿６）またはエクソン１１（ＲＯＮ ｄ１１）の増幅のためのフォワードプライマー（１０ｐｍｏｌ）およびリバースプライマー（１０ｐｍｏｌ）を用いて、ＲＴ－ＰＣＲを行った。その後、増幅生成物を電気泳動し、シーケンシングを行った。
Figure 2022554042000065
 その結果、図２６に示すように、３５種の結腸癌細胞株のうち、ＲＯＮ正常遺伝子（野生型）およびＲＯＮ活性変異遺伝子（変異型；Δ１６０、Δ１５５、Δ１６５）の割合は次のとおりであることが分析された：ＲＯＮ正常遺伝子を保有する細胞株１１（３１．４％）、ＲＯＮ活性変異遺伝子を保有する細胞株２１（６０％）、およびＲＯＮ遺伝子を発現しない細胞株３（８．６％）。
さらに、ＫＲＡＳ遺伝子型（正常型と変異型）に基づいて分類した場合、１９種のＫＲＡＳ正常細胞株のうち、ＲＯＮ正常遺伝子を保有する細胞株が５（２６．３％）、ＲＯＮ活性変異遺伝子を保有する細胞株が１１（５７．９％）、およびＲＯＮ遺伝子を発現しない細胞株が３（１５．８％）、であることが分析された。１６種のＫＲＡＳ変異型細胞株のうち、ＲＯＮ正常遺伝子を保有する細胞株が６（３７．５％）、およびＲＯＮ活性変異遺伝子を保有する細胞株が１０（６２．５％）であり、ＲＯＮ遺伝子を発現しない細胞株は見られなかったことが分析された。
実験例１７．結腸癌患者におけるＲＯＮおよびＫＲＡＳバイオマーカー遺伝子の分析：韓国人患者からの組織
ソウルアサン病院施設内審査委員会（ＩＲＢ）によって承認された研究計画にしたがい、ソウルアサン病院のバイオリソースセンター（ＢＲＣ）により提供された韓国人結腸癌患者からの４０１個のがん組織を、０．５ｃｍ３～１ｃｍ３のサイズにカットし、１．５ｍｌチューブに入れた。これに１ｍｌのＴｒｉｚｏｌを加え、塊が見えなくなるまで、パワードリル式のホモジナイザーを用いて５～１０分間、組織を粉砕した。その後、クロロホルム２００μｌを加え、１５秒間穏やかに混合した後、室温で３分間反応を進行させた。反応サンプルを遠心分離機を用いて、１２，０００×ｇ、４℃で１５分間、遠心分離し、次いで、透明な上清を新しい１．５ｍｌチューブに入れた。これにイソプロパノール０．５ｍｌを加え、１５秒間穏やかに混合した後、室温で１０分間、反応を進行させた。
ｃＤＮＡ合成キットチューブ（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ＰｒｅＭｉｘ、ＢＩＯＮＥＥＲ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）を使用して、患者組織のｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡについて、ＲＴ－ＰＣＲプレミックスキットチューブ（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ Ｇｏｌｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ、ＢＩＯＮＥＥＲ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）、およびＲＯＮエクソン５－６またはエクソン１１の増幅のためのフォワードプライマー（１０ｐｍｏｌ）およびリバースプライマー（１０ｐｍｏｌ）を用いて、ＲＴ－ＰＣＲを行った。次に、増幅生成物を電気泳動し、シーケンシングを行った。
その結果、図２７に示すように。、４０１個の結腸癌患者組織のうち、ＫＲＡＳ正常型および変異型、ＲＯＮ正常遺伝子（野生型）およびＲＯＮ活性変異遺伝子（変異型；Δ１６０、Δ１５５、Δ１６５）の割合は、次のとおり：２６２（６５．３３％）のＫＲＡＳ正常患者組織、および１３９（３４．６７％）のＫＲＡＳ変異患者組織、であることが確認された。さらに、２６２のＫＲＡＳ正常患者組織の中では、１１０（４１．９８％）のＲＯＮ正常遺伝子保有組織、および１５２（５８．０２％）のＲＯＮ活性変異遺伝子保有組織があり、１３９のＫＲＡＳ変異患者組織の中では、６３（４５．３２％）のＲＯＮ正常遺伝子保有組織、および７６（５４．６７％）のＲＯＮ活性変異遺伝子保有組織があることが、分析された（図２８）。
実験例１８．結腸癌患者におけるＲＯＮ変異体の分析：白人患者組織
外国企業（Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｅｘ）を通じて購入した白人結腸癌患者からの１８２個の癌組織を、０．５ｃｍ３～１ｃｍ３のサイズにカットし、１．５ｍｌチューブに入れた。これに１ｍｌのＴｒｉｚｏｌを加え、塊が見えなくなるまで、パワードリル式のホモジナイザーを用いて５～１０分間、組織を粉砕した。その後、クロロホルム２００μｌを加え、１５秒間穏やかに混合した後、室温で３分間反応を進行させた。反応サンプルを遠心分離機を用いて、１２，０００×ｇ、４℃で１５分間、遠心分離し、次いで、透明な上清を新しい１．５ｍｌチューブに入れた。これにイソプロパノール０．５ｍｌを加え、１５秒間穏やかに混合した後、室温で１０分間、反応を進行させた。
ｃＤＮＡ合成キットチューブ（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ＰｒｅＭｉｘ、ＢＩＯＮＥＥＲ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）を使用して、患者組織のｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡについて、ＲＴ－ＰＣＲプレミックスキットチューブ（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ Ｇｏｌｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ、ＢＩＯＮＥＥＲ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）、およびＲＯＮエクソン５－６またはエクソン１１の増幅のためのフォワードプライマー（１０ｐｍｏｌ）およびリバースプライマー（１０ｐｍｏｌ）を用いて、ＲＴ－ＰＣＲを行った。次に、増幅生成物を電気泳動し、シーケンシングを行った。
その結果、図２９に示すように、白人患者組織の合計１８２例においてＫＲＡＳおよびＲＯＮ変異体を分析した場合、正常なＫＲＡＳ患者ではＲＯＮ変異体が約３４．３％の割合で存在することが確認された。さらに、ＫＲＡＳ変異体を保有する患者組織ではＲＯＮ変異体が約４０％の割合で存在することが確認された。図に示すように、各変異体の割合は、Δ１６０で１８．１％、Δ１５５で９．４％、Δ１６５で８．２％である（図３０）。
実験例１９．結腸癌患者の腫瘍細胞を移植した動物モデルからの組織におけるＲＯＮおよびＫＲＡＳバイオマーカー遺伝子の分析
韓国人の結腸癌患者からの癌組織を移植した動物モデルからの５つの癌組織を、０．５ｃｍ３～１ｃｍ３のサイズにカットし、１．５ｍｌチューブに入れた。これに１ｍｌのＴｒｉｚｏｌを加え、塊が見えなくなるまで、パワードリル式のホモジナイザーを用いて５～１０分間、組織を粉砕した。その後、クロロホルム２００μｌを加え、１５秒間穏やかに混合した後、室温で３分間反応を進行させた。反応サンプルを遠心分離機を用いて、１２，０００ｇ、４℃で１５分間、遠心分離した。透明な上清を新しい１．５ｍｌチューブに入れた。これにイソプロパノール０．５ｍＬを加え、１５秒間穏やかに混合した後、室温で１０分間、反応を進行させた。
ｃＤＮＡ合成キットチューブ（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ＰｒｅＭｉｘ、ＢＩＯＮＥＥＲ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）を使用して、患者組織のｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡについて、ＲＴ－ＰＣＲプレミックスキットチューブ（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ Ｇｏｌｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ、ＢＩＯＮＥＥＲ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）、およびＲＯＮエクソン５－６またはエクソン１１の増幅のためのフォワードプライマー（１０ｐｍｏｌ）およびリバースプライマー（１０ｐｍｏｌ）を用いて、ＲＴ－ＰＣＲを行った。次に、増幅生成物を電気泳動し、シーケンシングを行った。
その結果、図３１に示すように、結腸癌患者の腫瘍細胞を移植した動物モデルからの５つの組織の中で、ＫＲＡＳ正常型および変異型、およびＲＯＮ正常遺伝子（野生型）およびＲＯＮ活性変異遺伝子（変異型；Δ１６０、Δ１５５、Δ１６５）の割合は次のとおり：４つ（８０％）のＫＲＡＳ正常結腸癌患者の腫瘍細胞を移植した動物モデルからの組織、および、１つ（２０％）のＫＲＡＳ変異患者からの組織、であることが確認された。一方、４つのＫＲＡＳ正常患者組織のうち、ＲＯＮ正常遺伝子を保有する結腸癌患者の腫瘍細胞を移植した動物モデルの組織はなく、４つの組織すべて（１００％）が、ＲＯＮ活性変異遺伝子を保有する結腸癌患者の腫瘍細胞を移植した動物モデルの組織であった。１つのＫＲＡＳ変異患者の組織について、ＲＯＮ正常遺伝子を保有する結腸癌患者の腫瘍細胞を移植した動物モデルの組織は１つ（１００％）であり、ＲＯＮ活性変異遺伝子を保有する結腸癌患者の腫瘍細胞を移植した動物モデルの組織はなかった。

Claims (20)

  1. 式１：
    Figure 2022554042000066
     ［式中、
    ＲＡは、Ｃ１－１０アルキル、フェニル、またはベンジルであり、ここで、ＲＡは、任意に、ハロゲンおよびＣ１－１０アルコキシから選択される１つまたは複数の置換基を有していてもよく；
    Ｘは、－Ｃ（－ＲＢ’）＝、または－Ｎ＝であり；
    ＲＢおよびＲＢ’は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１－１０アルキル、またはＣ１－１０アルコキシであり；
    ＲＣは、Ｈ、ハロゲン、またはＣ１－１０アルキルであり；
    Ｌは、単結合、またはＣ１－６アルキレンであり；
    Ｒは、ＮおよびＳから選択される１つまたは２つのヘテロ原子を有する、５～８員のヘテロ環であり；
    ＲＤは、Ｈ、Ｃ１－１０アルキル、－（ＣＨ２）ｎＹ－ＲＧ、または－ＣＨ２－ＮＲＥＲＦであり；
    ＲＥおよびＲＦは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１－１０アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＹ－ＲＧであるか、あるいは、ＲＥおよびＲＦが互いに繋がって、それらが結合するＮ原子と一緒になって４～１０員のヘテロ環を形成し；
    ここで、ｎは、０～１０の整数であり；Ｙは、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－、または－Ｓ（＝Ｏ）２－であり；ＲＧは、直鎖または分岐のＣ１－１０アルキルであり、ただし、ＲＧは、非置換であるか、あるいは、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシル、およびＣ１－６アルコキシからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換されており；そして、
    該４～１０員のヘテロ環は、ＲＥおよびＲＦが結合しているＮ原子に加えて、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１つまたは２つのヘテロ原子を任意にさらに含んでよく、非置換であるか、あるいは、ハロゲン、およびＣ１－６アルキルから選択される１つまたは複数の置換基により置換されている。］
    により表される化合物、またはその薬学的に許容される塩を活性成分として含む、プロテインキナーゼ阻害剤に対して耐性のある癌患者を治療するための、医薬組成物。
  2. 該化合物において、ＲＡが、メチル、フェニル、ハロベンジル、またはハロフェニルである、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 該化合物において、ＲＢおよびＲＢ’が、それぞれ独立して、Ｈ、メチル、メトキシ、またはエトキシである、請求項１に記載の医薬組成物。
  4. 該化合物において、Ｘが、－Ｃ（－ＲＢ’）＝であり；そして、
    ＲＢおよびＲＢ’が、それぞれ独立して、Ｈ、メチル、メトキシ、またはエトキシであり、ただし、ＲＢおよびＲＢ’は同時にＨでない、請求項１に記載の医薬組成物。
  5. 該化合物において、ＲＣが、Ｈまたはハロゲンである、請求項１に記載の医薬組成物。
  6. 該化合物において、Ｌが、単結合またはメチレンであり；そして、
    Ｒが、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピペラジニル、またはチアゾリルである、請求項１に記載の医薬組成物。
  7. 該化合物において、ＲＤが、Ｈ、メチル、エチル、メトキシメチル、または－ＣＨ２－ＮＲＥＲＦであり；そして、
    ＲＥおよびＲＦが、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、または－Ｃ１－６アルキレン－Ｏ－Ｃ１－１０アルキルであり、ただし、ＲＥおよびＲＦは同時にＨでない、請求項１に記載の医薬組成物。
  8. 該化合物において、ＲＥおよびＲＦが、それらが結合するＮ原子と一緒になって
    Figure 2022554042000067
     ［式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｃ１－３アルキレンであり；そして、Ａは、－Ｎ（－Ｃ１－６アルキル）－、または－Ｏ－である。］
    を形成している、請求項１に記載の医薬組成物。
  9. 該化合物において、ＲＡが、メチル、フェニル、ハロベンジル、またはハロフェニルであり；
    Ｘが、－ＣＨ＝であり；
    ＲＢが、Ｈ、メチル、メトキシ、またはエトキシであり；
    ＲＣが、Ｈ、またはハロゲンであり；
    Ｌが、単結合、またはメチレンであり；
    Ｒが、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、チアゾリル、またはピペラジニルであり；
    ＲＤが、Ｈ、メチル、エチル、メトキシメチル、または－ＣＨ２－ＮＲＥＲＦであり、ここで、ＲＥが、－Ｃ２Ｈ４－Ｏ－ＣＨ３であり、ＲＦが、Ｈまたはメチルであるか、あるいは、ＲＥおよびＲＦが互いに繋がって、それらが結合するＮ原子と一緒になって、モルホリノまたはメチルピペラジニルを形成している、請求項１に記載の医薬組成物。
  10. 式１により表される化合物が、以下の化合物：
    １） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
    ２） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
    ３） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
    ４） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
    ５） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（ピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
    ６） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（ピリジン－３－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
    ７） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（チアゾール－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
    ８） ４－エトキシ－Ｎ－（４－（２－（１－エチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）－３－フルオロフェニル）－１－（４－フルオロベンジル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
    ９） ４－メトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（１－（メトキシメチル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－フェニル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
    １０） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（ピペラジン－１－イルメチル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
    １１） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－（２－（（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
    １２） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－｛［２－（５－｛［（２－メトキシエチル）アミノ］メチル｝ピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル］オキシ｝フェニル）－２－オキソ－１－フェニル－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
    １３） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－｛［２－（５－｛［（２－メトキシエチル）アミノ］メチル｝ピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル］オキシ｝フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
    １４） Ｎ－（３－クロロ－４－｛［２－（５－｛［（２－メトキシエチル）アミノ］メチル｝ピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル］オキシ｝フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－４－メトキシ－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
    １５） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－｛［２－（５－｛［（２－メトキシエチル）アミノ］メチル｝ピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル］オキシ｝フェニル）－１－（３－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
    １６） Ｎ－（３－フルオロ－４－｛［２－（５－｛［（２－メトキシエチル）アミノ］メチル｝ピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル］オキシ｝フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－４－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
    １７） ４－エトキシ－Ｎ－（３－フルオロ－４－｛［２－（５－｛［（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ］メチル｝ピリジン－２－イル）チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル］オキシ｝フェニル）－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
    １８） ４－エトキシ－Ｎ－［３－フルオロ－４－（｛２－［５－（モルホリノメチル）ピリジン－２－イル］チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル｝オキシ）フェニル］－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
    １９） ４－エトキシ－Ｎ－［３－フルオロ－４－（｛２－［５－（モルホリノメチル）ピリジン－２－イル］チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル｝オキシ）フェニル］－２－オキソ－１－フェニル－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；
    ２０） ４－エトキシ－Ｎ－｛３－フルオロ－４－［（２－｛５－［（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル］ピリジン－２－イル｝チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル）オキシ］フェニル｝－１－（４－フルオロフェニル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；または、
    ２１） ４－エトキシ－Ｎ－｛３－フルオロ－４－［（２－｛５－［（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル］ピリジン－２－イル｝チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イル）オキシ］フェニル｝－２－オキソ－１－フェニル－１，２－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド、
    である、請求項１に記載の医薬組成物。
  11. プロテインキナーゼが、ＥＧＦＲである、請求項１に記載の医薬組成物。
  12. 該患者が、活性ＲＯＮ（Ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ ｄ’Ｏｒｉｇｉｎｅ Ｎａｎｔａｉｓ）を保有している、請求項１に記載の医薬組成物。
  13. 活性ＲＯＮが、ＲＯＮΔ１５５、ＲＯＮΔ１６０、ＲＯＮΔ１６５、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１に記載の医薬組成物。
  14. 該患者が、正常なＫＲＡＳを保有する、請求項１に記載の医薬組成物。
  15. プロテインキナーゼ阻害剤が、セツキシマブである、請求項１に記載の医薬組成物。
  16. 癌が、乳癌、肺癌、胃癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌、腎臓癌、膵臓癌、肝臓癌、結腸癌、皮膚癌、頭頸部癌、および甲状腺癌からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
  17. プロテインキナーゼ阻害剤をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  18. プロテインキナーゼ阻害剤が、ＥＧＦＲ阻害剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
  19. ＥＧＦＲ阻害剤が、セツキシマブである、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 以下のステップ：
    ｉ）癌患者が活性ＲＯＮを保有しているかどうかを確認すること；および、
    ｉｉ）活性ＲＯＮを保有している患者に、上記の式Ｉにより表される化合物またはその薬学的に許容される塩を活性成分として含む抗癌剤を投与すること、
    を含む、プロテインキナーゼ阻害剤に対して耐性のある患者の治療方法。
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