JP2022551153A - 活性ポリペプチド化合物 - Google Patents

Abstract

本発明は、医薬品技術分野に属し、特に、Ｙ－ＩＤ－Ｘ又はＸ－ＩＤ－Ｙである活性ポリペプチド化合物に関する。ここで、Ｙは、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体アゴニスト又は破骨細胞阻害剤であり、ＩＤは、ＸとＹを連結する分子内のペプチド結合又はリンカーであり、Ｘは、オステオゲニック成長ペプチド受容体アゴニスト、骨髓間葉系幹細胞刺激剤、又は造血幹細胞刺激剤である。本発明は、このような化合物を含む医薬組成物、ならびに骨形成不全、骨密度の低下に関連する疾患又は障害を予防、治療又は軽減ための医薬品の調製における前記化合物及び医薬組成物の使用も関する。

Description

相互参照

この出願は、２０１９年１０月１０日に出願された、出願番号ＣＮ．２０１９１０９５８６８０．０、発明の名称「活性ポリペプチド化合物」、及び２０１９年１２月２６日に出願された、出願番号ＵＳ１６／７２７,０７８、発明の名称「活性ポリペプチド化合物」の優先権を主張し、その全内容を援用により本出願に組み込まれる。

本発明は、医薬品の技術分野に属し、具体的に、骨形成を効果的に促進できる化合物、及びこの化合物を含む医薬組成物に関する。特に、本発明に係る化合物は、二重特異性融合ポリペプチド類化合物である。

骨粗鬆症は、骨量の低下と骨組織の微細構造の破壊で特徴づけられ、全身の骨痛と骨脆性の増加、骨折しやくなる代謝性骨疾患である。現在では、世界中の骨粗鬆症の患者が１０．２億人を超えているが、２０３０年までは、１３．６億人に上昇し、骨粗鬆症による骨折患者も２８９０００人に達し、これで毎年に経済の負担が数十億に達するだろうと予想されている。中国では、２０１６年に－２．０ＳＤを診断基準とした研究によると、全国で４０歳以上の骨粗鬆症の人数が約１．４億人であり、総人数の２４．６２％を占めているという同様に厳しい状況になっている。

この病気に対する認識が深まるにつれて、骨粗鬆症は、様々な原因に引き起こされ、一般的に以下の３種類に分けられると考えられている。一番目は、年齢とともに発生する生理学的変性疾患である原発性骨粗鬆症であり、２番目は、他の疾患又は医薬品などの要因により誘発される続発性骨粗鬆症であり、３番目は、８～１４歳の青少年に多く見られる特発性骨粗鬆症であり、この場合、家族遺伝歴のある方が多く、また、女性が男性のほうより多い。原発性骨粗鬆症は、閉経後骨粗鬆症で高変換型骨粗鬆症に属するＩ型、老年性骨粗鬆症で低変換型に属し、一般的に６５歳以上の高齢者に発生するＩＩ型という２種類に分けることができる。閉経後骨粗鬆症の発症メカニズムは、比較的簡単であり、主にエストロゲンの欠乏が破骨細胞の機能を増強させ、骨吸収を促進して骨の喪失を加速させることに関与しており、また、加齢とともに骨流失がまずまず増加し、骨量が減少して骨密度がピークからはるかに下回り、長期臥床で骨の流失が加速することにも関与している。骨粗鬆症の臨床的兆候としては、(1)腰背痛又は体全体の骨格の痛み、負荷が重くなると痛みが重くなり、重症の場合はひっくり返し、立ち上がり、歩き困難になることとして現れる痛み、(2)身長の短縮、猫背、脊椎奇形や伸び制限などの脊椎変形、(3)骨折、が主に挙げられる。

骨粗鬆症は、人類の寿命の延長及び社会の老齢化にとともに、人類の重要な健康問題になっている。現在、中国では、６０歳以上の人数が約１．７３億人であり、世界で高齢者人口の絶対数が一番多い。２００３～２００６年に行われた全国的な大規模な流行病学調査によると、５０歳以上の椎体と大腿骨頸骨密度値をベースにする骨粗鬆症の総罹患率は、女性が２０．７％、男性が１４．４％であった。６０歳以上の人、特に女性の中で骨粗鬆症の罹患率は明らかに高くなってきた。その調査によると、全国で２００６年に、骨粗鬆症を持つ５０歳以上の人が約６９４４万人で、低骨量を患う人数が約２億１０００万人であると推測される。今後数十年、中国人の股関節骨折率はさらに明らかに増加することが見込まれる。女性の一生には、骨粗鬆症性骨折の発生リスク（４０％）が、乳がん、子宮内膜癌、卵巣がんの発生リスク総和より高い。

骨粗鬆症は、単一の要因により引き起こされるのではなく、病因に関与する要因には、(1)遺伝要因、(2)カルシウムとビタミンＤの欠乏、(3)エストロゲン不足（エストロゲン不足は骨粗鬆症を引き起こし、エストロゲン代替の治療効果は明らかに認識されている）、(4)アンドロゲン不足（アンドロゲンが男性の骨粗鬆症に関与する）、(5)老人性変性メカニズムなどが含まれる。

骨粗鬆症はできるだけ早く治療する必要がある。その理由は、完全及び部分的に消失した骨ユニット（皮質骨の直径０．２ｍｍの円カラム状の骨ユニットと海綿骨）が再生できないが、細くなった骨ユニットが治療により回復できることにある。従って、消失した骨ユニット（骨粗鬆症が形成した）を逆転させることが不可能であるが、早期の介入によければ多数の人の骨粗鬆症を防ぐことができる。女性では、閉経周辺期（４５歳）で治療を始め、男性ではそれより１０年遅れて治療を始める必要がある。

骨粗鬆症の進行を治療及び阻止するための医薬品は、３つの種類に分けられる。第一種類としては、例えば、カルシトニン、ビスホスホネート、エストロゲン及びイソフラボンなどの骨吸収抑制薬が挙げられる。第二種類としては、フッ化物、合成ステロイド、副甲状腺ホルモン及びイソフラボンなどの骨形成促進薬が挙げられる。第三種類としては、カルシウム剤、ビタミンＤ及び活性ビタミンＤなどの骨ミネラリゼーション促進薬が挙げられる。それらの中で、抗骨粗鬆症の治療薬としては、主にカルシトニン、骨カルシウム調節剤、選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭＳ）及び副甲状腺ホルモン（ＰＴＨｓ）である。エストロゲンは、乳がんと子宮内膜癌を引き起こし、カルシトニンは、副甲状腺機能亢進症と抗体産生を引き起こす恐れがある。ラロキシフェンなどの選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭ）は、新発生の脊椎骨折症例を低下させることができるが（脊椎骨折を３０～５０％降下）、股関節及び他の非椎体骨折に対する治療効果は明確ではない。ビスホスホネート類医薬品は、生体利用率が悪く、空腹時に水と一緒に服用しなければならないし、少なくとも３０分間非臥位を維持しかつ食事しない必要もあるし、その使用が患者にとって不便である。副甲状腺素（ＰＴＨ）は、骨密度、骨マーカーを増加させ、骨折のリスクを低下させるために、高リスク骨折の閉経後骨粗鬆症の治療における骨合成促進剤としても使用され、高リスク骨折の男性の原発性又は性腺機能低下性骨粗鬆症の治療に用いられることも承認されている。研究により、副甲状腺素が新発生の脊椎症例を６５％～６９％減らすことができることが確認されている。現在、市販されている副甲状腺素類似体系の医薬品としては、テリパラチドがある。テリパラチドは、骨形成と骨吸収を刺激し、閉経後の女性の骨折の発生率を減少することができ、投与形態によっては骨密度を増減させることもできる。テリパラチドの一般的な有害反応には、吐き気、手足の痛み、めまい及び目が回ることである。ただし、骨肉腫のリスクが増加する場合、副甲状腺素が使用不可になり、また、小児患者、骨幹端未閉鎖、腫瘍骨転移や骨悪性腫瘍、骨粗鬆症以外の他の代謝性骨疾患、高カルシウム血症を患っている患者、又は骨格放射治療を受けたことがある患者に対しては、副甲状腺素が使用不可になることに注意しなければならない。

デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）といったＲＡＮＫＬ阻害剤類の薬剤は、ヒト由来のＩｇＧ２モノクローナル抗体で、ＲＡＮＫＬとの特異的結合により破骨細胞の形成、活性化及び生存を阻害し、骨折の発生率を低下させることができる。デノスマブは、特異的ＲＡＮＫＬ阻害剤として、骨吸収を抵抗する新しいメカニズムを開く。Ｂｅａｕｄｏｉｎらは、１２～２４ヶ月の治療後、骨折リスクの低減において、デノスマブとビスホスホネート系薬剤との間に有意差がないことを見出した。ただし、ＯＰＧ／ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬシグナル経路もヒトの免疫応答に関与するため、この経路の阻害剤としての該薬剤は、免疫性疾患を引き起こす恐れがあり、長期投与の安全性についてはさらなる研究が必要とされている。

ところで、副甲状腺ホルモン様ホルモン（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ－ｌｉｋｅ ｈｏｒｍｏｎｅ，ＰＴＨＬＨ）とも呼ばれる副甲状腺ホルモン関連蛋白（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＰＴＨｒＰ）は、共通のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体への連結を含む、ＰＴＨと多くの生物学的効果を共有する。現在、副甲状腺ホルモン関連蛋白アナログ薬は、新しい骨粗鬆症薬の研究方向の一つになっている。

骨粗鬆症の治療には極めて大きな進展を遂げているが、依然として骨密度の低下、骨粗鬆症を完全かつ継続的に治すことができなく、ほとんどの骨粗鬆症患者の病状がタイムリーかつ効果的にコントロールされておらず、骨粗鬆症の治療が理想的な目標に到達していないという現在の事情に鑑みて、研究を深く進める必要である。現在、骨粗鬆症の治療、骨粗鬆症性骨折の治療や予防においては、より良い治療効果、より少ない副作用で骨生成を促進するポリペプチド化合物の開発が、重要である。

一態様では、本発明は、活性ポリペプチド化合物提供することを目的とし、本発明で提供される活性ポリペプチド化合物は、マルチターゲット活性を有し、同時に複数の異なる態様で発揮調節又は治療の役割を果たすことができる。

上記の発明の目的を達成するために、本発明は以下のような技術案を採用する。

本発明は、まず、下記の式（Ｉａ）又は式（Ｉｂ）で示される構造又はその薬学的に許容される塩である活性ポリペプチド化合物を提供する。
Ｙ－ＩＤ－Ｘ 式（Ｉａ）又は
Ｘ－ＩＤ－Ｙ 式（Ｉｂ）
式中、Ｙは、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体アゴニスト又は破骨細胞阻害剤であり、
ＩＤは、ＸとＹを連結する分子内のペプチド結合又はリンカーであり
Ｘは、オステオゲニック成長ペプチド受容体アゴニスト、骨髓間葉系幹細胞刺激剤、又は造血幹細胞刺激剤である。

本発明に係る活性ポリペプチド化合物Ｙ－ＩＤ－Ｘ（Ｉａ）又はＸ－ＩＤ－Ｙ（Ｉｂ）では、一方で、一部の化合物は、全体的に二重作用活性を発揮し、異なる活性領域を通じて異なる生理作用を発揮し、他方で、一部の化合物の分子内のＩＤ構造は、体内で分解され、ＩＤがペプチド結合である場合には、加水分解により切断されると、それぞれ作用する、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体アゴニスト又は破骨細胞阻害剤であるポリペプチドＹと、オステオゲニック成長ペプチド受容体アゴニスト、骨髓間葉系幹細胞刺激剤、又は造血幹細胞刺激剤であるポリペプチドＸとが得られ、或いは、ＩＤがリンカーである場合には、ＩＤが加水分解又は酵素分解されると、同様に活性ペプチドＸ及び活性ペプチドＹが放出されることができる。本発明に係る活性ポリペプチド化合物は、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体と結合してＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体を刺激したり、破骨細胞を阻害したりすることにより骨形成作用を促進し、骨密度を高めることができ、しかも、オステオゲニック成長ペプチド受容体を刺激し、造血幹細胞を刺激することにより単球、リンパ球及び白血球などの末梢血中の核細胞のレベルを維持する役割を果たすこともできる。

いくつかの実施形態において、本発明に係る活性ポリペプチド化合物における前記のＹは、Ｍ－ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子、コロニー刺激因子－１とも呼ばれる。）拮抗剤、ＲＡＮＫＬ（核因子κＢ受容体活性化因子リガンド）阻害剤、ＲＡＮＫＬ抗体、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）阻害剤、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、又は副甲状腺ホルモン関連蛋白である。

幾つかの別実施形態では、本発明に係る活性ポリペプチド化合物における前記Ｙは、下記の式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を有するペプチド鎖である。
Ａ_１－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ａ_８－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ａ_１７－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａ_２２－Ａ_２３－Ｌｅｕ－Ａ_２５－Ａ_２６－Ｌｅｕ－Ａ_２８－Ａ_２９－Ａ_３０－Ａ_３１－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ａｌａ 式（ＩＩ）
式中、Ａ_１は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
Ａ_８は、Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
Ａ_１７は、Ａｓｐ又はＧｌｕであり、
Ａ_２２は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＰｈｅであり、
Ａ_２３は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＰｈｅであり、
Ａ_２５は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＨｉｓであり、
Ａ_２６は、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｒｇであり、
Ａ_２８は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＶａｌであり、
Ａ_２９は、Ａｌａ、（Ｎ－Ｍｅ）Ａｌａ又はＡｉｂであり、
Ａ_３０は、Ｌｙｓ又はＧｌｕであり、
Ａ_３１は、Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
前記ペプチド鎖Ｙのアミノ末端は、遊離又は化学修飾されており、前記ペプチド鎖Ｙのカルボキシル末端は、遊離又は化学修飾されている。

本発明の特定の実施形態において、本発明に係る活性ポリペプチド化合物では、前記ペプチド鎖Ｙにおけるアミノ酸がいずれもＬ－型アミノ酸である。

本発明のいくつかの特定の実施形態において、本発明に係る活性ポリペプチド化合物では、前記Ｙは、配列番号１６～配列番号２２に示される構造のポリペプチドのうちの１種である。

いくつかの実施形態において、本発明に係る活性ポリペプチド化合物における前記Ｘは、造血幹細胞刺激剤であり、即ち、Ｘは、造血成長因子、血小板コロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターロイキン-３（ＩＬ３）又は組換えヒトインターロイキン－１１である。

いくつかの実施形態において、本発明に係る活性ポリペプチド化合物における前記Ｘは式（ＩＩＩａ）又は（ＩＩＩｂ）で示されるアミノ酸配列を有するペプチド鎖である。
Ｔｙｒ－（Ａｒｇ）_ｍ－（Ｇｌｙ）_ｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ 式（ＩＩＩａ）
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－（Ｇｌｙ）_ｎ－（Ａｒｇ）_ｍ－Ｔｙｒ 式（ＩＩＩｂ）
式中、ｍ及びｎは、それぞれ独立して０、１又は２であり、
前記ペプチド鎖Ｘのアミノ末端は、遊離又は化学修飾されており、前記ペプチド鎖Ｘのカルボキシル末端は、遊離又は化学修飾されている。

いくつかの実施形態において、本発明に係る活性ポリペプチド化合物における前記Ｘは、５～６個のアミノ酸からなるペプチド鎖であり、以下の配列番号１～配列番号８で示されるアミノ酸配列のうちの１種を有する。

いくつかの実施形態において、本発明に係る活性ポリペプチド化合物におけるＩＤは、ＸとＹとの間のリンカーである。前記リンカーは、アミノ置換Ｃ_１－８アルキル酸、ポリエチレングリコールポリマー鎖、又は１～１０個のアミノ酸からなるペプチドセグメントである。前記ペプチドセグメントにおけるアミノ酸は、プロリン、アルギニン、アラニン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、グルタミン、アスパラギン及びグリシンからなる群より選択される。

本発明のいくつかの特定の実施形態において、前記リンカーは以下のいずれかである。
（１）（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_ｐ(ここで、ｐは１、２、３、４又は５である)、
（２）（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_ｔ(ここで、ｔは１、２又は３である)、
（３）Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ａｌａ、
（４）４－アミノ酪酸又は６－アミノカプロン酸、
（５）（ＰＥＧ）_ｑ、(ここで、ｑは１、２、３、４又は５である)。

いくつかの実施形態において、本発明に係る活性ポリペプチド化合物は、式（ＩＶ）で示される構造を有するか、又は式（ＩＶ）で示される化合物の薬学的に許容される塩である。
Ａ_１－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ａ_８－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ａ_１７－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａ_２２－Ａ_２３－Ｌｅｕ－Ａ_２５－Ａ_２６－Ｌｅｕ－Ａ_２８－Ａ_２９－Ａ_３０－Ａ_３１－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａ_３５ 式（ＩＶ）
式中、
Ａ_１は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
Ａ_８は、Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
Ａ_１７は、Ａｓｐ又はＧｌｕであり、
Ａ_２２は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＰｈｅであり、
Ａ_２３は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＰｈｅであり、
Ａ_２５は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＨｉｓであり、
Ａ_２６は、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｒｇであり、
Ａ_２８は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＶａｌであり、
Ａ_２９は、Ａｌａ、（Ｎ－Ｍｅ）Ａｌａ又はＡｉｂであり、
Ａ_３０は、Ｌｙｓ又はＧｌｕであり、
Ａ_３１は、Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
前記Ａ_３５は、下記の式（ＩＩＩａ）又は（ＩＩＩｂ）で示されるアミノ酸配列のペプチド鎖を有する。
Ｔｙｒ－（Ａｒｇ）_ｍ－（Ｇｌｙ）_ｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ 式（ＩＩＩａ）
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－（Ｇｌｙ）_ｎ－（Ａｒｇ）_ｍ－Ｔｙｒ 式（ＩＩＩｂ）
式中、ｍ及びｎそれぞれ独立して０、１又は２であり、
Ａ_１で示されるアミノ酸のアミノ末端は、遊離又は化学修飾されており、Ａ_３５のペプチド鎖のカルボキシル末端は、遊離又は化学修飾されている。

いくつかの実施形態において、本発明に係る活性ポリペプチド化合物では、ペプチドはＮ末端（アミノ末端）、Ｃ末端（カルボキシル末端）又は両方の末端で修飾されることができる。アミノ末端の化学修飾には、アシル化、スルホニル化、アルキル化及びＰＥＧ修飾が含まれる。前記カルボキシル末端の化学修飾には、アミド化、スルホニル化及びＰＥＧ修飾が含まれる。

さらに、前記アミノ末端の化学修飾は、アミノ基がアセチル化、ベンゾイル化又はスルホニル化されることである。前記アミノ末端のアルキル化は、Ｃ_１－６アルキル化又は芳香族アルキル化である。前記カルボキシル末端の化学修飾は、カルボキシル基におけるＯＨがＮＨ_２又はスルホンアミドで置換されているか、又はカルボキシル基におけるＯＨが官能化されたＰＥＧ分子に連結することである。

本発明の特定の実施形態において、本発明で式（Ｉａ）又は式（Ｉｂ）で示される化合物は、以下の配列番号９～配列番号１５のうちの１種の化合物、又はその薬学的に許容される塩である。

さらに、本発明に係る活性ポリペプチド化合物は、前記ポリペプチド化合物の各アミノ酸の側鎖基に化学修飾により改造された化合物、又は
前記ポリペプチド化合物と金属イオンとからなる配位化合物、錯体若しくはキレート、又は
前記ポリペプチド化合物により形成される水和物若しくは溶媒和物、をさらに含む。

いくつかの実施形態において、前記ポリペプチド化合物のアミノ酸の側鎖基に化学修飾により改造された化合物は、前記ポリペプチド化合物におけるシステインが持っているスルフィドリル基から形成されたチオエーテル、チオグリコシド、或いはシステイン若しくはシステインを含むペプチドと形成されたジスルフィド結合を含む化合物、又は
前記ポリペプチド化合物におけるチロシンが持っているフェノール性ヒドロキシ基から形成されたエステル、エーテル、グリコシド系化合物、又は
前記ポリペプチド化合物におけるチロシン若しくはフェニルアラニンが持っているベンゼン環が置換されて形成された化合物である。

なお、本発明に開示されるポリペプチド化合物の他の変異体、特に、保存性アミノ酸の置換のみにより得られる任意の変異体も本発明の範囲に含まれることに留意されたい。

本発明で提供される活性ポリペプチド化合物は、遊離ポリペプチドの形態又は塩の形態で存在することができる。いくつかの実施形態において、前記塩とは、薬学的に許容される塩を指す。

「薬学的に許容される」という用語とは、物質又は組成物は、製剤を包含する他の成分及び／又はそれにより治療される哺乳動物と化学的に及び／又は毒理学的に適合しなければならないことを意味する。

本発明の「薬学的に許容される塩」は、母体化合物、塩基性又は酸性部分から通常の化学方法で合成することができる。一般的には、このような塩は、これらの化合物の遊離酸形態を、化学量論量の適切な塩基（例えば、Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ又はＫの水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩など）と反応させることにより、又はこれらの化合物の遊離塩基形態を化学量論量の適切な酸と反応させることにより調製することができる。このような反応は、通常水又は有機溶媒又は両方の混合物中で行われる。一般的には、適当な場合、例えばジエチルエーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール又はアセトニトリルなどの非水性媒体を使用することが必要である。前記の塩の例には、有機酸（例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸又はパモイン酸）、無機酸（例えば、塩酸、硫酸又はリン酸）及び高分子酸（例えば、タンニン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、又はポリ乳酸－グリコール酸コポリマー）が含まれるが、これらに限定されない。他の適切な塩のリストとしては、例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，（１９８５）、及び「薬用塩ハンドブック：特性、選択及び適用（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ）」，Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｗｅｒｍｕｔｈ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００２）で見つけることができる。

本発明で提供される活性ポリペプチド化合物は、構造を連結することにより構築され、マルチターゲットの活性ポリペプチドに属し、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体を刺激するか、又は破骨細胞を阻害することだけではなく、オステオゲニック成長ペプチド受容体を刺激したり、骨髓間葉系幹細胞を刺激したり、造血幹細胞を刺激したりすることもできる。本発明で提供される活性ポリペプチド化合物は、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体を刺激し、骨形成細胞、破骨細胞、骨格裏打ち細胞、骨細胞などの複数の細胞系に影響を与え、また、ＡＣ－Ｃａｍｐ－ＰＫＡ経路を活性化することにより、骨形成細胞活性の増加、骨量の増加、骨密度の増加及び骨強度の改善などの骨（骨と軟骨）形成を促進する役割を果たす。その一方で、本発明ポリペプチド化合物は、骨髓間葉系幹細胞に作用して骨形成細胞への分化を促進することができ、例えば、ＡＬＰの活性の増加、Ｉ型コラーゲン、オステオカルシン、Ｃｂｆα１ ｍＲＮＡの転写のアップレギュレーション、カルシウム塩沈着とマトリックス鉱化の促進、骨形成の促進、骨折治癒の加速、骨密度の増加などが挙げられ、また、骨髓造血幹細胞に作用し、骨形成細胞と他の骨髓細胞系をアップレギュレーションすることにより造血刺激因子を産生し、骨髓造血の微細環境を改善する。

本発明の薬効活性実験においては、本発明で提供される活性ポリペプチド化合物は、卵巣が除去された骨粗鬆症モデルラットの腰椎骨密度、大腿骨骨密度を著しく高めることができ、本発明に係る活性ポリペプチド化合物投与群の大腿骨骨密度及び骨密度の増加パーセント率と陽性対照アバロパラチド群に相当することが確信された。アバロパラチドは、投与期間において、単球、リンパ球及び白血球などの末梢血単核細胞に対して、有意な阻害作用を有するのに対して、本発明に係る活性ポリペプチド化合物は、末梢血単核細胞に対して悪影響を及ぼすことがないことから、本発明に係る活性ポリペプチド化合物は、アバロパラチドによる有害反応を克服し、投与期間中の免疫力への影響を回避できることが示される。

さらに、本発明の薬効活性試験においては、本発明に係る活性ポリペプチド化合物は、レチノイン酸誘導骨粗鬆症ラットの大腿骨の最大応力を増加させることができ、また、骨表面積／骨体積比（ＢＳ／ＢＶ）、骨梁数（Ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ Ｎｕｍｂｅｒ、ＴｂＮ）、骨梁間隙（Ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ （Ｔｂ．Ｓｐ））を具体的に包含する骨微細構造を改善することができ、かつ、その効果が市販の医薬品であるアバロパラチドより優れていることが確信される、また、本発明に係る活性ポリペプチド化合物は、アバロパラチドにより引き起こされる骨髓阻害の有害反応を回避することができることも確信される。

また、本発明は、本発明に係る活性ポリペプチド化合物を含む医薬組成物をさらに提供する。場合により、前記医薬組成物は、薬学的に許容されるアジュバント、賦形剤、担体及び溶媒の少なくとも１つをさらに含む。

いくつかの実施形態において、本発明に係る医薬組成物は、さらに他の治療剤を含む。前記の他の治療剤は、骨吸収抑制薬、骨形成促進薬、骨ミネラリゼーション促進薬、又は副甲状腺ホルモン関連蛋白から選択される。

ここで、骨吸収抑制薬には、カルシトニン、ジホスホネート、エストロゲン、選択的エストロゲン受容体調節剤、及びイソフラボンが含まれ、前記の骨形成促進薬には、フッ化物、合成ステロイド、副甲状腺ホルモン、及び副甲状腺ホルモン関連蛋白が含まれ、前記の骨ミネラリゼーション促進薬には、カルシウム剤、ビタミンＤ及び活性ビタミンＤが含まれ、前記の副甲状腺ホルモン関連蛋白は、テリパラチド又はアバロパラチドである。

本発明で使用される「薬学的に許容されるアジュバント」とは、投与剤形又は医薬組成物の一貫性に関連する薬学的に許容される材料、混合物又は溶媒を意味する。各アジュバントは、患者に投与される時に本発明に開示される前記の活性ポリペプチド化合物の薬能を大幅に低下させる相互作用及び非薬学的に許容される医薬組成物をもたらす相互作用を避けるために、混合時に医薬組成物の他の成分と適合しなければならない。さらに、各アジュバントは、薬学的に許容されるものでなければならなく、例えば、十分に高い純度を有しなければならない。適切な薬学的に許容されるアジュバントは、選択される具体的な剤形により異なる。さらに、薬学的に許容されるアジュバントは、組成物におけるそれらの特定の機能により選択される。例えば、均一な剤形の生成を容易にするいくつかの薬学的に許容されるアジュバントを選択することができる。安定な剤形の生成を容易にするいくつかの薬学的に許容されるアジュバントを選択することができる。患者に投与される時に、本発明に開示される前記の活性ポリペプチド化合物を体の１つの器官又は部分から体の別の器官又は部分への搬送又は輸送を容易にするいくつかの薬学的に許容されるアジュバントを選択することができる。患者の依存性を増強するいくつかの薬学的に許容されるアジュバントを選択することができる。適切な薬学的に許容されるアジュバントには、以下のタイプのアジュバント：希釈剤、填充剤、バインダー剤、崩壊剤、潤滑剤、流動促進剤、造粒剤、コーティング剤、湿潤剤、溶媒、共溶媒、沈殿防止剤、乳化剤、甘味剤、矯味剤、味覚マスキング剤、着色剤、固結防止剤、保湿剤、キレート剤、可塑剤、増稠剤、酸化防止剤、防腐剤、安定剤、界面活性剤及び緩衝剤が含まれる。なお、当業者であれば分かるように、いくつかの薬学的に許容されるアジュバントは、一つ以上の機能を提供できるし、選択可能な機能も提供でき、これは、製剤にどのぐらいこのアジュバントが存在するか、また製剤にどのような他のアジュバントが存在するかによって決める。

別の態様においては、本発明は、骨生長の欠陥、骨密度の低下に関連する疾患又は障害を予防、治療又は軽減するための医薬品の調製における前記の活性ポリペプチド化合物及び前記の医薬組成物の使用をさらに提供する。前記疾患には、骨粗鬆症が含まれる。

別の態様においては、本発明は、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体を刺激し、破骨細胞を阻害し、オステオゲニック成長ペプチド受容体を活性化し、骨髓間葉系幹細胞又は造血幹細胞を刺激するための医薬品の調製における前記の活性ポリペプチド化合物及び前記の医薬組成物の使用をさらに提供する。

本発明は、治療有効量の本発明に係る活性ポリペプチド化合物又は前記の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、骨生長の欠陥、骨密度の低下に関連する疾患又は障害を予防、治療又は軽減するための方法をさらに提供する。

本発明に係る医薬組成物は、被検者の骨生長を刺激するために使用することができる。従って、それらは、骨粗鬆症などの骨生長の欠陥に関連する疾患又は障碍を治療するために使用することができる。

いくつかの実施形態において、本発明は、有効量の本発明に係る医薬組成物を被検者に投与することを含む、被検者の骨粗鬆症を治療する方法に関する。

別段の説明がない限り、本発明で使用されるすべての技術用語は、本発明の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明に言及されるすべての特許及び出版物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明で使用される「アミノ酸」とは、天然及び非天然アミノ酸を指す。二十種類の天然に存在するアミノ酸（Ｌ－異性体）は、三文字略語又は大文字の一文字略号により表され、特に説明がない限り、三文字略語に代表されるアミノ酸は、アキラルなグリシンを除くＬ型異性体である。アラニン（「Ａｌａ」又は「Ａ」）、アルギニン（「Ａｒｇ」又は「Ｒ」）、アスパラギン（「Ａｓｎ」又は「Ｎ」）、アスパラギン酸（「Ａｓｐ」又は「Ｄ」）、システイン（「Ｃｙｓ」又は「Ｃ」）、グルタミン（「Ｇｌｎ」又は「Ｑ」）、グルタミン酸（「Ｇｌｕ」又は「Ｅ」）、グリシン（「Ｇｌｙ」又は「Ｇ」）、ヒスチジン（「Ｈｉｓ」又は「Ｈ」）、イソロイシン（「Ｉｌｅ」又は「Ｉ」）、ロイシン（「Ｌｅｕ」又は「Ｌ」）、リジン（「Ｌｙｓ」又は「Ｋ」）、メチオニン（「Ｍｅｔ」又は「Ｍ」）、フェニルアラニン（「Ｐｈｅ」又は「Ｆ」）、プロリン（「Ｐｒｏ」又は「Ｐ」）、セリン（「Ｓｅｒ」又は「Ｓ」）、スレオニン（「Ｔｈｒ」又は「Ｔ」）、トリプトファン（「Ｔｒｐ」又は「Ｗ」）、チロシン（「Ｔｙｒ」又は「Ｙ」）及びバリン（「Ｖａｌ」又は「Ｖ」）。Ｌ－ノルロイシン及びＬ－ノルバリンは、それぞれ（ＮＬｅｕ）及び（ＮＶａｌ）と表すことができる。

１９種類の天然に存在するキラルアミノ酸は、対応するＤ－異性体を有し、本発明において、接頭辞「Ｄ－」を含む三文字略語又は小文字の一文字略号により表される。Ｄ型アラニン（「Ｄ－Ａｌａ」又は「ａ」）、Ｄ型アルギニン（「Ｄ－Ａｒｇ」又は「ｒ」）、Ｄ型アスパラギン（「Ｄ－Ａｓｎ」又は「ａ」）、Ｄ型アスパラギン酸（「Ｄ－Ａｓｐ」又は「ｄ」）、Ｄ型システイン（「Ｄ－Ｃｙｓ」又は「ｃ」）、Ｄ型グルタミン（「Ｄ－Ｇｌｎ」又は「ｑ」）、Ｄ型グルタミン酸（「Ｄ－Ｇｌｕ」又は「ｅ」）、Ｄ型ヒスチジン（「Ｄ－Ｈｉｓ」又は「ｈ」）、Ｄ型イソロイシン（「Ｄ－Ｉｌｅ」又は「ｉ」）、Ｄ型ロイシン（「Ｄ－Ｌｅｕ」又は「ｌ」）、Ｄ型リジン（「Ｄ－Ｌｙｓ」又は「ｋ」）、Ｄ型メチオニン（「Ｄ－Ｍｅｔ」又は「ｍ」）、Ｄ型フェニルアラニン（「Ｄ－Ｐｈｅ」又は「ｆ」）、Ｄ型プロリン（「Ｄ－Ｐｒｏ」又は「ｐ」）、Ｄ型セリン（「Ｄ－Ｓｅｒ」又は「ｓ」）、Ｄ型スレオニン（「Ｄ－Ｔｈｒ」又は「ｔ」）、Ｄ型トリプトファン（「Ｄ－Ｔｒｐ」又は「ｗ」）、Ｄ型チロシン（「Ｄ－Ｔｙｒ」又は「ｙ」）、及びＤ型バリン（「Ｄ－Ｖａｌ」又は「ｖ」）。

一般にペプチド、ポリペプチド又はタンバク質モノマーサブユニットについては「アミノ酸残基」が使用され、一般に遊離分子については「アミノ酸」が使用されるが、本発明において、「アミノ酸」及び「アミノ酸残基」という用語は、互換的に使用することができる。

２つのアミノ酸が互いに結合して１つのペプチド結合を形成し、複数のアミノ酸が互いに結合して複数のペプチド結合を形成し、複数のアミノ酸が互いに結合して形成される複数のペプチド結合を含む１本の鎖状構造を「ペプチド鎖」又は「ペプチドセグメント」と呼ぶ。

本明細書で使用される「ペプチド」及び「ポリペプチド」とは、分子サイズにかかわらず、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基鎖からなるポリマーを指す。本発明における「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語は、互換的に使用することができる。

特に明記しない限り、ペプチド配列は、アミノ末端（Ｎ末端）からカルボキシル末端（Ｃ末端）の順で与えられる。

ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体アゴニストの骨形成細胞（又は間質細胞前駆体）に位置するＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体スーパーファミリーのメンバーであり、内因性天然リガンドＰＴＨ及びＰＴＨｒＰ（１～３６）により活性化されることができ、リガンドがＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体に結合すると、アデニル酸シクラーゼ／ｃＡＭＰ／Ｇｓに関連するプロテインキナーゼＡの経路、及びイノシトールトリスリン酸／細胞内カルシウム／Ｇｑに関連するプロテインキナーゼＣの経路という細胞内の２つのシグナル伝達経路が活性化される。ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体アゴニストとは、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体と結合して細胞内シグナル伝達経路を活性化できる物質を指す。例としては、本発明に係るペプチド鎖Ｙ、ＰＴＨｒＰ（１－３６）、ＰＴＨ（１－３４）、テリパラチドなどであるが、これらに限定されない。

破骨細胞阻害剤、破骨細胞（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ、ＯＣ）は、骨吸収の主な機能細胞であり、ミネラルと有機骨基質の溶解を担当する。破骨細胞阻害剤は、破骨細胞の形成又は活性を阻害することにより骨吸収を阻害することができ、破骨細胞活性を阻害してアポトーシスを促進するアレンドロネート、ゾメタ、ピロホスファート類似体などのビスホスホネート（ＢＰ）、Ｍ－ＣＳＦ抗体などのＭ－ＣＳＦ拮抗剤、ＲＡＮＫＬ抗体などのＲＡＮＫＬ阻害剤、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤を包括する。

オステオゲニック成長ペプチド受容体アゴニスト（オステオゲニック成長ペプチド受容体活性剤）とは、オステオゲニック成長ペプチド受容体シグナル経路を活性化し、骨形成細胞の増殖や分化を促進し、骨髓造血幹細胞および骨髓間葉系幹細胞の分裂増殖を刺激することができ、また、造血幹細胞における自己回復能力を維持しかつ巨核細胞成長を阻害することができる物質を指す。オステオゲニック成長ペプチド受容体アゴニストは、小分子化合物又はポリペプチド分子であってもよい。骨形成生長ペプチド受容体は、骨形成細胞に位置するＧタンパク質共役型受容体であり、オステオゲニック成長ペプチド受容体アゴニストがオステオゲニック成長ペプチド受容体に結合すると、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ，ＭＡＰＫ）、Ｓｒｃ及びＲｈｏＡ経路が活性化される。ＭＡＰ経路の活性化は、有糸分裂を増加させ、骨形成細胞、骨髓造血幹細胞、骨髓間葉系幹細胞に対して分裂増殖促進作用を有する。ＳｒｃおよびＲｈｏＡ経路の活性化は、骨形成細胞内因性オステオゲニック成長ペプチドの自己分泌発現を調節し、アルカリホスファターゼ分泌を促進し、Ｉ型コラーゲン、オステオカルシン、Ｃｂｆα１ ｍＲＮＡの転写をアップレギュレートし、カルシウム塩沈着及びマトリックス鉱化を促進し、骨形成を促進し、骨折治癒を加速し、骨密度を増加することができる。オステオゲニック成長ペプチド受容体アゴニストには、具体例として、遊離ＯＧＰ、ＯＧＰ（１０～１４）、組換えＯＧＰ及びＯＧＰ－骨形成生長ペプチド結合タンパク質（ＯＧＰ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＯＧＰＢＰ）を含む免疫応答性ＯＧＰ、及びそれと類似な活性を有する天然又は人工合成のポリペプチド類化合物（例えば、本発明の化合物におけるペプチド鎖Ｘ）が含まれるが、これらに限定されない。

骨髓間葉系幹細胞刺激剤、骨髓間葉系幹細胞は、骨髓間質細胞とも呼ばれる。骨髓間葉系幹細胞は、骨髓中の造血幹細胞（ＨＳＣ）を機械的に支持し、様々な造血を調節するサイトカイン（例えばＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＬＩＦ、Ｍ－ＣＳＦ及びＳＣＦなど）を分泌して造血を支持することもでき、骨形成系細胞、線維芽細胞、網状細胞、脂肪細胞、及び内皮細胞に分化する可能性も持っている。骨髓間葉系幹細胞刺激剤とは、骨髓間葉系幹細胞を刺激して造血を調節するサイトカインを分泌し、さらに造血機能を促進し、かつ／又は骨髓間葉系幹細胞の増殖や分化を誘導することができる物質である。骨髓間葉系幹細胞刺激剤には、具体例として、遊離ＯＧＰ、ＯＧＰ（１０～１４）、組換えＯＧＰ及びＯＧＰ－骨形成生長ペプチド結合タンパク質（ＯＧＰ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＯＧＰＢＰ）を含む免疫応答性ＯＧＰ、及びそれと類似の活性を有する天然又は人工合成のポリペプチド類化合物（例えば、本発明の化合物におけるペプチド鎖Ｘ）が含まれるが、これらに限定されない。

造血幹細胞刺激剤：造血幹細胞（ＨＳＣｓ）は、自己更新能力及びすべての血球又は免疫細胞に分化する能力を持つ細胞の群で、骨髓、末梢血及び臍帯血から由来することができ、そして、造血幹細胞を刺激して造血機能の活性を促進できる物質は、造血幹細胞刺激剤と呼ばれる。本発明に係る造血幹細胞刺激剤には、造血成長因子（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ、ＨＧＦｓ）、血小板コロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターロイキン-３（ＩＬ３）、組換えヒトインターロイキン－１１（ＩＬ１１）、ＴＡＴ－Ｈ０ＸＢ４Ｈ組換えタンバク質、及び本発明に係る化合物におけるペプチド鎖Ｘなどが含まれる。造血幹細胞刺激剤は、造血幹細胞の増殖を促進し、血液白血球、赤血球及び血小板などの血細胞の減少を補う。

本発明で使用される「リンカー」という用語は、ポリペプチドフラグメントＸとポリペプチドフラグメントＹを連結するための連結フラグメントであり、ペプチド鎖Ｘ及びペプチド鎖Ｙの生理活性に影響を及ぼさなければよく、その長さ及び構造に制限はない。リンカーは、互いに干渉せずに正しく折りたたむ傾向になるように、２つのペプチドセグメントに一定の空間間隔を提供することができる。また、リンカーは、２つのペプチドセグメントにより多くの相互作用の可能性も提供し、それらの間の相乗作用を促進する。リンカーには、疎水性リンカー、柔軟な親水性リンカー及びペプチドフラグメントリンカーが含まれる。本発明における疎水性リンカーとしては、主に、４－アミノ酪酸や６－アミノカプロン酸などのアミノ置換Ｃ_１－８アルキル酸である。親水性リンカーとしては、通常、（ＰＥＧ）_ｑなどのＰＥＧポリマー鎖であり、ここで、ｑは１、２、３、４又は５である。ペプチドフラグメントリンカーとしては、１～１０個のアミノ酸からなるペプチドフラグメントである。調製の容易さなどの観点から、リンカーとしては、制限酵素切断部位を含む、長さが１～１０個のアミノ酸のポリペプチドフラグメントである。いくつかの実施形態において、リンカーとしては、長さが２～８のアミノ酸のフラグメントである。幾つかの別実施形態では、リンカーとしては、長さが２～７のアミノ酸のフラグメントである。本発明の実施形態において、リンカーを構成するアミノ酸は、プロリン、アルギニン、フェニルアラニン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、グルタミン、アスパラギン及びグリシンからなる群より選択される。本発明の調製実施例において、前記リンカーとしては、（１）（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_ｐ(ここで、ｐは１、２、３、４又は５である)、（２）（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_ｔ(ここで、ｔは１、２又は３である)、又は（３）Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ａｌａである。より具体的には、Ｇｌｙ－Ｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ、（Ｇｌｙ－Ｌ－Ｓｅｒ）_２、（Ｇｌｙ－Ｌ－Ｓｅｒ）_３、又はＬ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｌ－Ｓｅｒである。前記のリンカーは、ペプチド鎖の２つの部分を分離し、相互の立体障害効果を低減させ、また、リンカーは、生体内で加水分解することができ、各ペプチドセグメントがそれぞれに活性効果を発揮することに役に立つ。

本発明で使用される「化学修飾」又は「封止」という用語は、交換可能に使用され、共有修飾により化合物の１つ又は２つの末端に保護基を導入することを意味する。適切な保護基は、ペプチド末端を封止するが、ペプチドの生物活性を低下させない役割を果たす。化学修飾は、前記化合物のアミノ末端、又はカルボキシル末端、或いはその両方の任意の残基で行うことができ、なお、スルフィドリル基含有アミノ酸を包括する。

ペプチド治療剤は、ペプチダーゼによる攻撃を受けやすい。エキソペプチダーゼは、一般に、ペプチド又はタンバク質のアミノ末端又はカルボキシル末端からアミノ酸残基を切断する非特異的酵素である。アミノ酸配列内で切断するエンドペプチダーゼも非特異的であってもよいが、エンドペプチダーゼは、特定のアミノ配列（認識部位）を認識し、それらの部位又はその近くでペプチドを切断することが多い。そこで、化合物を修飾してタンパク質加水分解による分解を避けるように保護することが考えられる。タンパク質加水分解による分解からペプチドを保護する１つの方法としては、化学修飾、又はペプチドのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端に「封止（ｃａｐｐｉｎｇ）」を与えることを含む。

いくつかの実施形態において、本発明のペプチドセグメントのＮ末端（Ｎ末端）およびＣ末端（Ｃ末端）は、遊離してもよい。Ｃ末端が遊離している場合は、置換基が付加されず、又は「－ＯＨ」で表され、Ｎ末端が遊離している場合は、置換基が付加されず、又は「Ｈ」で表される。幾つかの別実施形態では、本発明のペプチドセグメントは、化学的に修飾されることができる。

いくつかのより具体的な実施形態において、化合物のアミノ末端をアセチル化の化学修飾することにより、Ｎ－アセチルペプチド（本発明の構造又は式中で「Ａｃ－」として表す）を生成する。幾つかの別実施形態では、前記のペプチドのカルボキシル末端をアミド化の化学修飾することにより、Ｃ末端に第1級カルボキシルアミド（本発明のペプチド配列、構造又は式中で「－ＮＨ_２」として表す）を生成する。いくつかの実施形態において、アミノ末端及びカルボキシル末端の両端は、それぞれアセチル化及びアミド化により化学的に修飾される。ただし、他の封止基も可能である。例えば、アミノ末端は、アセチル基、ベンゾイル基などの原子団でアシル化することにより封止するか、又はアセチル基で封止されたβ－アラニンなどの天然又は非天然アミノ酸で封止するか、又はベンジル基又はブチル基などの原子団でアルキル化することにより封止するか、又はスルホニル化してスルホンアミドを形成することにより封止することができる。同様に、カルボキシル末端は、第２級アミド及びアシルスルホンアミドなどにエステル化又は変換されることが可能である。いくつかの実施形態において、アミノ末端又はカルボキシル末端は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を結合するための部位を含むことができ、即ち、アミノ末端又はカルボキシル末端は、適切に官能化されたＰＥＧとの反応により化学的に修飾することができる。

本発明に係るように、「治療」は、予防的及び治療的処理を含み得る。例えば、治療的処理は、骨粗鬆症の進行の遅延、阻害又は防止、骨粗鬆症に関連する症状の減少又は除去を含み得る。予防的処理は、骨粗鬆症の発生の防止、阻害又は遅延を含み得る。

本発明に係る「治療有効量」とは、所望の応答を引き起こすのに十分な投与量を指す。本発明において、期待される生物学的応答としては、骨損失速度の低下及び／又は被検者の骨量の増加、ならびに骨密度の向上である。

本発明に係る骨粗鬆症（ｏｓｔｅoｐｏｒｏｓｉｓ）は、複数の原因により引き起こされる一群の骨疾患であり、骨組織に正常なカルシウム化があり、カルシウム塩とマトリックスが正常な割合を示し、単位体積内での骨組織量が減少することを特徴とする代謝性骨疾患である。発症原因によって特発性（原発性）骨粗鬆症と続発性骨粗鬆症に分けられ、原発性骨粗鬆症には、若年型／成年型骨粗鬆症、更年期骨粗鬆症、老年性骨粗鬆症が含まれる。続発性骨粗鬆症の病因には、(1)内分泌コルチゾール増加症、甲状腺機能亢進症、原発性副甲状腺機能亢進症、アクロメガリー、性腺機能低下、糖尿病など；(2)妊娠、授乳；(3)栄養タンバク質欠乏、ビタミンＣ、Ｄ欠乏、低カルシウム食、アルコール依存症など；(4)遺伝性骨形成不完全染色体異常；(5)肝疾患；(6)腎臓病、慢性腎炎、血液透析；(7)医薬品コルチコステロイド、抗てんかん薬、抗腫瘍薬（例えばメトトレキサート）、ヘパリンなど；(8)長期臥床、パラプレジア、宇宙飛行などに見られる退行性全身性骨粗鬆症、骨折後、Ｓｕｄｅｃｋｓ骨萎縮、損傷後骨萎縮などに見られる局部的骨粗鬆症；(9)胃腸吸収不良による胃切除；(10)関節リウマチ、が含まれる。

上記の疾患又は障害を治療するための本発明に係る活性ポリペプチド化合物の投与量は、投与形態、被験者の年齢及び体重、ならびに治療される被験者の健康状態に応じて変化し、最終的に主治医又は獣医により決定される。本発明の範囲内では、骨粗鬆症などの骨形成不全などに関連する疾患又は障害の治療のために、上記の一般式に含まれるペプチドを使用することも考えられる。

本発明に開示される活性ポリペプチド化合物は、一般に、所望の経路で患者に投与するのに適する剤形に調製される。治療有効量の本発明に係るペプチドと、薬剤に許容される担体物質（例えば、治療化合物をコロイド分子団に形成させる炭酸マグネシウム、ラクトース、又は脂質）とを組み合わせて、被検者に（経口、静脈内、経皮、肺内、膣内、皮下、鼻腔内、イオントフォレーシス、又は経気管により）投与される治療組成物（例えば、ピル、錠剤、カプセル、又は液体）を形成する。経口投与されるピル、錠剤又はカプセルは、保護物質で被覆されることができ、ここで、前記保護物質は、活性組成物が胃中の胃酸又は腸酵素に消化されずに小腸に入るのに十分な時間を置かせるように活性組成物を保護することができる。また、治療組成物としては、皮下又は筋肉投与用の生分解型又は非生分解型徐放性製剤の形態であってもよい。例えば、米国特許第３７７３９１９号及び第４７６７６２８号ならびにＰＣＴ出願ＷＯ９４／１５５８７を参照されたい。連続投与は、埋め込み型又は外部ポンプ（例えば、ＩＮＦＵＳＡＯＤＴＭポンプ）によっても実現することができる。１日１回などの定期的に注射するか、又は徐放性製剤などの低投与量で連続的に投与することができる。本発明に係る医薬組成物の投与経路には、皮下注射、皮下長時間作用型製剤、静脈内注射、静脈内又は皮下注入、眼内注射、皮膚内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、気管内投与、脂質内投与、動脈内投与、髄腔内投与、硬脳膜外投与、吸入、鼻腔内投与、舌下投与、口腔内投与、直腸投与、膣内投与、頭蓋内投与及び局所投与、経皮投与又は局所送達（例えば、カテーテル又はステントを介すること）による投与が含まれるが、これらに限定されない。体への医薬品の経皮送達は、生物学的に活性な物質を被検者の全身に送達するための、特に経口生体利用率が低い物質（例えば、タンバク質及びペプチド）の送達のための、望ましくて便利な方法である。化合物は、経皮送達経路を介して、物質が体内に入るのに効果的なバリアとして機能する皮膚の角質層の外層に浸透することができる。角質層の下には、血管を含んでいないが幾つかの神経を含む活気のある表皮がある。より深いのは、血管、リンパ系及び神経を含む真皮である。角質層バリアを越える医薬品は、一般に吸収及び全身分布のために真皮の毛細血管に拡散することができる。

「皮膚内」という用語は、本明細書に係る治療方法において、治療有効量の活性ポリペプチド化合物を皮膚に投与して該化合物を角質層の下の皮膚層に送達することにより、所望の治療効果を達成することを意味する。「皮下」という用語は、本明細書に係る治療方法において、治療有効量の活性ポリペプチド化合物を皮膚に投与して該化合物を角質層の下の皮下組織に送達することにより、所望の治療効果を達成することを意味する。

本発明に係る活性ポリペプチド化合物は、単独の活性剤として投与してもよく、他の治療剤と併用して投与してもよい。前記他の治療剤としては、同じ又は類似の治療活性を有しかつそのような併用投与に対して安全かつ効果的であると判断される他の化合物である。一態様では、本発明は、本発明に開示される活性ポリペプチド化合物と１つまたは複数の治療活性剤とを含む安全かつ有効量の併用薬を投与することを含む、疾患又は障害を治療、予防又は改善する方法を提供する。いくつかの実施形態において、併用薬としては、１つ又は２つの他の治療剤を含む。前記の他の治療剤は、骨吸収抑制薬、骨形成促進薬、骨ミネラリゼーション促進薬、又は副甲状腺ホルモン関連蛋白などから選択される。

併用療法で使用される治療法（治療又は手順）の具体的な組み合わせは、所望の治療及び／又は手順の適合性ならびに達成しようとする所望の治療効果を考慮しなければならない。本明細書で定義される本発明の併用療法は、該療法の各成分を同時、順次又は別々に投与することにより達成することができる。

本発明のいずれのペプチドも、被験者（言い換えると、患者などの哺乳動物）の骨生長を刺激することができる。従って、単独投与の場合、或いは、骨吸収抑制薬、骨形成促進薬、骨ミネラリゼーション促進薬、又は副甲状腺ホルモン関連蛋白などと併用して投与される場合、骨粗鬆症や骨折の治療に有効である。本発明に係る活性ポリペプチド化合物は、同様の効果を有するこれらの治療剤と共に使用される場合、順次的に適用されることが骨密度の向上により有利である。

本発明の実施例又は従来技術における技術案をより明確に説明するために、以下、実施例又は従来技術の説明に使用される図面について簡単に説明する。

図１は、対照群、モデル群、アバロパラチド群（Ａｂａ群）、実施例１の２０μｇ／ｋｇ投与量群、実施例２の２０μｇ／ｋｇ投与量群及び実施例５の２０μｇ／ｋｇ投与量群における大腿骨滑車部位のミクロンＸ線三次元イメージングシステムによる走査図を示す。

以下、特定の実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の実施形態は、これらに限定されない。本発明の実施例は、本発明を説明するために提供されるものであり、本発明を限定するものではないので、本発明の方法を前提とした本発明に対する任意の改良も本発明の保護範囲に属するものとする。一般的に、本発明の化合物は、本発明に係る方法により製造することができ、当業者も、公知の方法を用いて、順序又は順序の異なる合成工程を選択して、本発明に係る構造を有するポリペプチド化合物を生成することができる。以下の反応態様及び実施例は、本発明の内容をさらに例示するために使用される。

当業者は、本発明に係るポリペプチド化合物が固相合成法（ＳＰＰＳ）、液相合成法及び酵素合成法により調製可能であることを認識するであろう。異なる調製方法により調製された本発明に係るポリペプチド化合物は、いずれも本発明の範囲内にある。例えば、ポリペプチド化合物は、通常、固相合成法により調製される。前記の固相合成は、従来のポリスチレン－ジビニルベンゼン架橋樹脂、ポリアクリルアミド、ポリエチレン－エチレングリコール類樹脂などを選択することができ、例としては、王氏樹脂（Ｗａｎｇ Ｒｅｓｉｎ）、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＣＴＣ、Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ Ｌｉｎｋｅｒ ＭＢＨＡ樹脂などである。連結順序によって、適切な樹脂を選択する。例えば、まず、カルボキシル末端アミノ酸のカルボキシ基を高分子固相担体に共有結合で連結し、α－アミノの保護基としてＦｍｏｃ、Ｂｏｃ又はＺを使用し、Ｃ末端からＮ末端まで、特定の順序で脱保護、縮合、再脱保護、縮合の繰り返し過程を経て保護基付けペプチド鎖樹脂を得、さらに樹脂を切断して保護基を除去する工程を経て、所望のペプチドセグメントを得る。また、アミノ末端アミノ酸のアミノ基を高分子固相担体に共有結合で連結し、逆合成により、Ｎ末端からＣ末端まで、特定の順序で脱保護、縮合、再脱保護、縮合の繰り返し過程を行って保護基付けペプチド鎖樹脂を得、さらに樹脂を切断して保護基を除去する工程を経て、所望のペプチドセグメントを得る。異なる種類の樹脂から合成したペプチド鎖の末端は相違している場合があり、例えば、Ｗａｎｇ樹脂で調製されたのは、カルボキシル末端遊離のペプチドセグメントであり、同様に、Ｒｉｎｋ－ＡＭアミノ樹脂を固定相として用いて得られたのは、カルボキシル末端がＮＨ_２化されたペプチドセグメントである。

ポリペプチド化合物の合成に必要とするアミノ酸原料は、吉爾生化（上海）有限公司から購入された。固相合成樹脂は、西安藍暁技術新材料股フン有限公司から購入された。アミノ酸縮合触媒として使用されるＴＢＴＵ及びＤＩＥＡは、蘇州昊帆生物技術有限公司から購入された。ＨＰＬＣの調製に使用される溶離剤は、クロマトグラフィーグレードのものである。試薬は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ａｒｃｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ及びＡｌｆａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙなどの商品サプライヤーから購入され、特に明記しない限り、さらなる精製せずにそのままで使用した。使用される分析、検出機器は、いずれも当分野の従来の機器設備である。以下に説明される実施例は、特に明記しない限り、すべての温度がセルシウス度に設定され、記載された温度は、±５℃の変動範囲を有することができる。

ポリペプチド化合物の構造を同定するには、ＱＥ同定解析、質量分析法タンバク質Ｎ末端配列解析、ポリペプチドタンバク質Ｎ－端配列解析を使用して一次構造を確認し、円二色性走査分析を使用して二次構造を確認した。

本発明の実施例のポリペプチド化合物に関する円二色性走査分析には、円二色性分散計Ｃｈｉｒａｓｃａｎ Ｐｌｕｓ Ｖ１００（英国Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ社製）を用いて、遠紫外（１９０～２６０ｎｍ）及び近紫外（２５０～３４０ｎｍ）におけるタンバク質試験品の円二色性（Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ：ＣＤ）吸収スベクトルを採取し、ソフトウェアにて二次構造を解析した。具体的な測定では、走査波長を１８０～３４０ｎｍとしてバックグラウンド、ブランク緩衝液を測定し、その後、１ｍｇ／ｍＬのＣＳＡ標準溶液の１８０～３４０ｎｍの範囲における円二色性遠近紫外吸収を採取した。スキャンされたすべてのスベクトルに対して、ソフトウェアＰｒｏ－Ｄａｔａ Ｖｉｅｗｅｒを用いてベースライン減算、平滑化処理を行った。標準品のピークとバレーとのＣＤ値の比を計算し、有効比の範囲が２．０８±０．０６であった。ＣＤＮＮソフトウェアを用いて試験品の二次構造をフィッティング計算し、Ｍｉｌｌｉ－Ｄｅｇｒｅｓｓモードで、異なる波長間隔で、螺旋（Ｈｅｌｉｘ）、折りたたみ（Ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ＋Ｐａｒａｌｌｅｌ）、回転角（Ｂｅｔａ－ｔｕｒｎ）及びランダムコイル（Ｒａｎｄｏｍ ｃｏｉｌ）の割合をそれぞれ算出する。

本発明の実施例のポリペプチド化合物のＱＥ同定分析は、タンバク質エンドヌクレアーゼ（一般にトリプシン）を用いてタンバク質ポリペプチドサンプルを酵素分解した後、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ｎａｎｏＬＣ－ＱＥ）を用いて酵素分解されたサンプルを分析した。最後に、ＭＡＳＣＯＴなどのマススペクトル整合ソフトウェアを用いてＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを解析し、標的タンバク質ポリペプチド分子の定性的同定情報を得た。具体的な測定では、試験品を還元及びアルキル化した後、トリプシン（質量比１：５０）を加え、３７℃で２０時間酵素分解した。酵素分解生成物を脱塩してフリーズドライし、０．１％ＦＡ溶液に再溶解し、－２０℃で保存しておいた。機器Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及びＥａｓｙ－ｎＬＣ １０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、ポリペプチド及びポリペプチドのフラグメントの質量電荷比を、フルスキャン（ｆｕｌｌ ｓｃａｎ）ごとに２０個のフラグメントスベクトル（ＭＳ２ ｓｃａｎ）を採取するように、採取した。マススペクトルテストの生ファイル（ｒａｗ ｆｉｌｅ）は、Ｍａｓｃｏｔ２．２ソフトウェアを用いて対応するデータベースを検索し、最終的に同定されたタンバク質の結果を得た。

本発明の実施例のポリペプチド化合物に関するマススペクトル法タンバク質Ｎ末端配列解析に用いられる実験方法では、タンバク質をそれぞれトリプシン、キモトリプシン及びＧｌｕ－Ｃ酵素で酵素分解した後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（Ｘｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ ＱＴｏｆ、Ｗａｔｅｒｓ）を用いて、酵素分解されたペプチドセグメントサンプルを解析した。酵素分解方法：５０μｇの試験品を適量の塩酸グアニジンに溶解して変性させ、ＤＴＴ及びＩＡＭ反応後、ジスルフィド結合を還元してアルキル化修飾により保護し、希釈された１μｇのトリプシン、１μｇのキモトリプシン、および１μｇのＧｌｕ－Ｃ酵素を加え、３７℃で２０時間反応させた。最後に、ＵＮＩＦＩ（１．８．２、Ｗａｔｅｒｓ）ソフトウェアを用いてＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータを解析し、アルゴリズムの結果に基づいて、試験品のＮ末端アミノ酸配列が理論配列に一致するかどうかを判断した。具体的な測定では、（１）高分解能質量分析計：ＸｅｖｏＧ２－ＸＳ ＱＴｏｆ（Ｗａｔｅｒｓ社）、（２）超高速液体クロマトグラフィー：ＵＰＬＣ（Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｉ－Ｃｌａｓｓ）（Ｗａｔｅｒｓ社）を使用した。

本発明の実施例のポリペプチド化合物に関するポリペプチドタンバク質Ｎ－端配列解析では、全自動タンバク質ポリペプチド配列分析装置により試験品のＮ末端配列を分析した。本発明の実施例では、ＰＰＳＱ全自動タンバク質ポリペプチド配列分析装置（島津製）を用いた。ソフトウェアＰＰＳＱ Ａｎａｌｙｓｉｓにより、サンプル名、サンプル番号、テストサイクル数、メソッドファイルの選択を設定し、設定完了後にテストを開始した。データ及びスベクトル処理：ＰＰＳＱにより生成された生データ及びスベクトルについて、ＰＰＳＱ ＤａｔａＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇソフトウェアによりピークを識別し、対応するスベクトルを導出した。

本発明の実施例では、ポリペプチド化合物の初次構造の決定時に、マススペクトル法により検出を行い、高分解能マススペクトルには、ＡＢＳｃｉｅｘ ５８００ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦを用いてタンバク質の相対分子量を測定し、ポリペプチドの相対分子量情報を正確かつ確実に得た。

以下の略語は、本明細書に使用される。
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基
ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＣＨ_３ＣＮ：アセトニトリル
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＥＰＢＴ：３－（ジエトキシホスホリルオキシ）－１，２，３－ベンゾトリアジン－４（３Ｈ）－オン
ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
Ｅｔ_２Ｏ：ジエチルエーテル
ＥＤＴ：エチレンジチオール
Ｆｍｏｃ：９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル基
Ｈ_２Ｏ：水
ＨＢＴＵ：ヘキサフルオロりん酸２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム
ＮＭＰ：１－メチル－ピロリジン－２－オン
Ｏｔ－Ｂｕ：ｔ－ブトキシ基
ＰｙＢＯＰ：１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート
Ｐｂｆ：２，２，４，６，７－ペンタメチルジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル基
ｔ－Ｂｕ：ｔ－ブチル基
Ｔｒｔ：トリチル基
ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン
Ｔ３Ｐ：１－プロピルリン酸無水物
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
Ｔｒｔ：トリチル基
ｒ．ｔ：室温
ＴＡ：チオアニソール

調製実施例
以下の特定の実施形態において、本発明のペプチドは、標準的な固相合成法により調製することができる。以下に、調製プロセスについて詳細に説明する。本発明の他のペプチドは、当業者であれば同様の方法により調製することができる。
実施例１：Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－（Ｎ－Ｍｅ）Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号９で示されるポリペプチド配列）の調製

本調製例では、Ｃ末端からＮ末端に合成を行った。

（１－１）樹脂の前処理：２－ＣＴＡ樹脂（置換度０．９３ｍｍｏｌ／ｇ、２７ｍｍｏｌ）３０ｇを秤量し、２５０ｍＬの反応試験管に入れ、ＤＣＭ １８０ｍＬで樹脂を３０分間膨潤させ、溶媒を減圧下で吸い取った後、ＤＣＭ（１００ｍＬ）を加え、窒素ガスを導入して加熱し、２５℃まで昇温し、ＳＯＣｌ_２（１０ｍＬ、５．０ｅｑ）を滴下し、温度を３０～３５℃に保ちながら、２時間反応させた。反応終了後、圧力下乾燥のために窒素ガスを導入した。ＤＣＭ（１００ｍＬ×３）を加えて樹脂を洗浄した。なお、洗浄後、毎回に溶媒を吸い取った。

（１－２）Ｓ１アミノ酸の連結：Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（３２．５ｇ、１０８ｍｍｏｌ）を秤量して１００ｍＬのＤＣＭで溶解し、完全に溶解した後、ＤＩＥＡ（２３ｍＬ、１３５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を反応試験管に入れ、窒素ガスを導入しながら攪拌反応させ、２０℃～３０℃で反応させ、反応時間を２時間とした。メタノールとＤＩＥＡの混合溶媒１２ｍＬ（メタノール：ＤＩＥＡ＝９：１）を滴下し、未反応部位を１０分間閉鎖し、溶媒を吸い取り、ＤＣＭ（１５０ｍＬ×２）で樹脂を洗浄した後、、溶媒を吸い取り、次にＤＭＦ（１５０ｍＬ×２）で樹脂を洗浄した後、溶媒を吸い取った。次に、１２０ｍＬのＤＭＦで樹脂を３０分間膨潤させ、溶媒を吸い取った後、体積比が２０％であるピペリジン／ＤＭＦ溶液（１２０ｍＬ）で反応温度を２０℃～３０℃として２回（１０分間と１５分間）脱保護を行った。脱保護後、試薬を吸い取り、ＤＭＦ（１２０ｍＬ×６）で樹脂を洗浄した。洗浄後、溶媒を吸い取り、樹脂を反応管に残し、ニンヒドリンで樹脂の色を検出したところ、樹脂は紫黒色を示した。続いて、次の操作を行った。分光光度法で吸光度を検出して算出したところ、樹脂の置換度は０．８６４１ｍｍｏｌ／ｇであった。

（１－３）Ｓ２アミノ酸の連結：

Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１９．０ｇ、６３．９ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）とＰｙＢＯＰ（３３．２５ｇ、６３．９ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）を秤量し、５０ｍＬのＤＭＦで溶解し、完全に溶解した後、ＤＩＥＡ（１０．５ｍＬ、６３．９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を反応試験管に入れ、窒素ガスを導入しながら攪拌反応させ、２０℃～３０℃２時間反応させた。ニンヒドリンで樹脂の色を検出したところ、樹脂は透明黄色を示した。反応後、溶媒を吸い取り、ＤＭＦ（１２０ｍＬ×３）で樹脂を洗浄し、洗浄後、溶媒を吸い取った。次に、体積比が２０％であるピペリジン／ＤＭＦ溶液（１２０ｍＬ）で反応温度を２０℃～３０℃として２回（１０分間と１５分間）脱保護を行った。脱保護後、試薬を吸い取り、ＤＭＦ（１２０ｍＬ×６）で樹脂を洗浄した。洗浄後、溶媒を吸い取り、樹脂を反応管に残し、ニンヒドリンで樹脂の色を検出したところ、樹脂は紫黒色を示した。続いて、次の操作を行った。

（１－４）Ｓ３アミノ酸の連結：

Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ（２４．７５ｇ、６３．９ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）とＰｙＢＯＰ（３３．２５ｇ、６３．９ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）を秤量し、５０ｍＬのＤＭＦで溶解し、完全に溶解した後、ＤＩＥＡ（１０．５ｍＬ、６３．９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を反応試験管に入れ、窒素ガスを導入しながら攪拌反応させ、反応温度を２０℃～３０℃とし、反応時間を２時間とした。ニンヒドリンで樹脂の色を検出したところ、樹脂は透明黄色を示した。反応後、溶媒を吸い取り、ＤＭＦ（１２０ｍＬ×３）で樹脂を洗浄し、洗浄後、溶媒を吸い取った。次に、体積比が２０％であるピペリジン／ＤＭＦ溶液（１２０ｍＬ）で反応温度を２０℃～３０℃として２回（１０分間と１５分間）脱保護を行った。脱保護後、試薬を吸い取り、ＤＭＦ（１２０ｍＬ×６）で樹脂を洗浄した。洗浄後、溶媒を吸い取り、樹脂を反応管に残し、ニンヒドリンで樹脂の色を検出したところ、樹脂は紫黒色を示した。続いて、次の操作を行った。

（１－５） 工程（１－４）を繰り返し、Ｓ４アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｓ５アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ６アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｓ７アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ８アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｓ９アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ１０アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｓ１１アミノ酸Ｆｍｏｃ－（Ｎ－Ｍｅ）Ａｌａ－ＯＨ、Ｓ１２アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ１３アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ１４アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｓ１５アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ１６アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ１７アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ１８アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ１９アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｓ２０アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｓ２１アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｓ２２アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ２３アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｓ２４アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｓ２５アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｓ２６アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｓ２７アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｓ２８アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｓ２９アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｓ３０アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ３１アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｓ３２アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ３３アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ３４アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｓ３５アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｓ３６アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ３７アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ３８アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ及びＳ３９アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨを順次に連結し、ペプチド樹脂を得た。続いて、次の操作を行った。

（１－６）樹脂の収縮：先に反応管にメタノール（８０ｍＬ）を加え、樹脂を５分間収縮させ、溶媒を吸い取った。収縮は、毎回に１０分間、３回繰り返して行われる。また、毎回の収縮後に溶媒を吸い取りてから次の収縮を行うようにした。そして、収縮された樹脂を真空乾燥オープンに入れ、３５℃で乾燥させた。ペプチド樹脂１８．２５ｇを得た。

（１－７）ペプチドセグメントの切断：１５５ｍＬのＴＦＡ、８ｍＬのＴＩＳ、４．１２ｍＬのＥＤＴ、２ｍＬのＴＡ、４．１２ｍＬの水及び２ｍＬのアニソールを均一に混合してライセートを調製した。工程（１－６）で調製されたペプチド樹脂を１８．８２ｇ秤量し、ライセートとペプチド樹脂を混合した後、密封および遮光の条件下で、温度を２５℃～３５℃に保ちながら、２時間攪拌反応させた。反応終了後、樹脂をサンドコアファンネルでろ過除去した。溶媒を減圧下で除去した後、残液にメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（４５０ｍＬ）を加え、低温０℃～１０℃で２時間晶析させた。晶析溶液を遠心分離して除去し、得られた沈殿物をメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテルで３回洗浄した。沈殿物を収集し、３５℃で真空乾燥させて、ポリペプチド（配列番号９）Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－（Ｎ－Ｍｅ）Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙを得た。

（１－８）精製：工程（１－７）で得られたペプチド粗溶液を０．４５μｍフィルター膜でろ過した後、１０μｍのＣ－１８シリカゲルを充填した２０ｍｍ×１５０ｍｍカラムで分取ＨＰＬＣにより精製した。検出波長は２２０ｎｍとした。移動相Ａを０．１％ＴＦＡ、移動相Ｂをアセトニトリルとして、下表Ａに従ってグラジエント溶離を行った。

標的ポリペプチド生成物を含む画分を収集し、純度が９５．８％であった。収集された画分を合わせ、溶媒を減圧下で除去した後、ポリペプチド化合物をフリーズドライした。得られた最終生成物は、分析型ＲＰ－ＨＰＬＣ（保持時間）及びＬＣ－ＭＳ、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ－ＭＳにより同定された。

ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ－ＭＳ（ＥＳＩ）：４４４１．２２３６［Ｍ＋Ｈ］^＋。

ＱＥ同定解析で得られたポリペプチド化合物の配列は、配列番号９で示される通りであった。

含有量の測定：水分含有量は水分滴定器で『中国薬局方』の水分測定法を参照し、ＴＦＡ含有量の測定は『中国薬局方』の氷酢酸含有量の検出法を参照して測定したところ、ポリペプチド含有量は８３．７％であった。
実施例２：Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｉｂ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号１０で示されるポリペプチド配列）の調製

Ｃ末端からＮ末端に合成された：

（２－１）樹脂の前処理：２－ＣＴＡ樹脂（置換度０．９３ｍｍｏｌ／ｇ、２７ｍｍｏｌ）３０ｇを秤量し、２５０ｍＬの反応試験管に入れ、ＤＣＭ ２００ｍＬで樹脂を３０分間膨潤させ、溶媒を減圧下で吸い取った後、ＤＣＭ（１００ｍＬ）を加え、窒素ガスを導入して加熱し、２５℃まで昇温し、ＳＯＣｌ_２（１０ｍＬ、５．０ｅｑ）を滴下し、温度を３０～３５℃に保ちながら、２時間反応させた。反応終了後、圧力下乾燥ために窒素ガスを導入した。ＤＣＭ（１００ｍＬ×３）を加えて樹脂を洗浄した。なお、洗浄後、毎回に溶媒を吸い取った。

（２－２）Ｓ１アミノ酸の連結：Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（３２．５ｇ、１０８ｍｍｏｌ）を秤量して１００ｍＬのＤＣＭで溶解し、完全に溶解した後、ＤＩＥＡ（２３ｍＬ、１３５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を反応試験管に入れ、窒素ガスを導入しながら攪拌反応させ、２０℃～３０℃で、２時間反応させた。メタノールとＤＩＥＡの混合溶媒１２ｍＬ（メタノール：ＤＩＥＡ＝９：１）を滴下し、未反応部位を１０分間閉鎖し、溶媒を吸い取り、ＤＣＭ（１５０ｍＬ×２）で樹脂を洗浄した後、溶媒を吸い取り、次にＤＭＦ（１５０ｍＬ×２）で樹脂を洗浄した後、溶媒を吸い取った。次に、１２０ｍＬのＤＭＦで樹脂を３０分間膨潤させ、溶媒を吸い取った後、体積比が２０％であるピペリジン／ＤＭＦ溶液（１２０ｍＬ）で反応温度を２０℃～３０℃として２回（１０分間と１５分間）脱保護を行った。脱保護後、試薬を吸い取り、ＤＭＦ（１２０ｍＬ×６）で樹脂を洗浄した。洗浄後、溶媒を吸い取り、樹脂を反応管に残し、ニンヒドリンで樹脂の色を検出したところ、樹脂は紫黒色を示した。続いて、次の操作を行った。分光光度法で吸光度を検出して算出したところ、樹脂の置換度は０．８６４１ｍｍｏｌ／ｇであった。

（２－３）Ｓ２アミノ酸の連結：

Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１９．０ｇ、６３．９ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）とＤＥＰＢＴ（１９．１７ｇ、６３．９ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）を秤量し、５０ｍＬのＤＭＦで溶解し、完全に溶解した後、ＤＩＥＡ（１０．５ｍＬ、６３．９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を反応試験管に入れ、窒素ガスを導入しながら攪拌反応させ、温度を２０℃～３０℃として２時間反応させた。ニンヒドリンで樹脂の色を検出したところ、樹脂は透明黄色を示した。反応後、溶媒を吸い取り、ＤＭＦ（１２０ｍＬ×３）で樹脂を洗浄し、洗浄後、溶媒を吸い取った。次に、体積比が２０％であるピペリジン／ＤＭＦ溶液（１２０ｍＬ）で反応温度を２０℃～３０℃として２回（１０分間と１５分間）脱保護を行った。脱保護後、試薬を吸い取り、ＤＭＦ（１２０ｍＬ×６）で樹脂を洗浄した。洗浄後、溶媒を吸い取り、樹脂を反応管に残し、ニンヒドリンで樹脂の色を検出したところ、樹脂は紫黒色を示した。続いて、次の操作を行った。

（２－４）Ｓ３アミノ酸の連結：

Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ（２４．７５ｇ、６３．９ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）とＤＥＰＢＴ（１９．１７ｇ、６３．９ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）を秤量し、５０ｍＬのＤＭＦで溶解し、完全に溶解した後、ＤＩＥＡ（１０．５ｍＬ、６３．９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を反応試験管に入れ、窒素ガスを導入しながら攪拌反応させ、反応温度を２０℃～３０℃とし、反応時間を２時間とした。ニンヒドリンで樹脂の色を検出したところ、樹脂は透明黄色を示した。反応後、溶媒を吸い取り、ＤＭＦ（１２０ｍＬ×３）で樹脂を洗浄し、洗浄後、溶媒を吸い取った。次に、体積比が２０％であるピペリジン／ＤＭＦ溶液（１２０ｍＬ）で反応温度を２０℃～３０℃として２回（１０分間と１５分間）脱保護を行った。脱保護後、試薬を吸い取り、ＤＭＦ（１２０ｍＬ×６）で樹脂を洗浄した。洗浄後、溶媒を吸い取り、樹脂を反応管に残し、ニンヒドリンで樹脂の色を検出したところ、樹脂は紫黒色を示した。続いて、次の操作を行った。

（２－５）工程（２－４）を繰り返し、Ｓ４アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｓ５アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ６アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｓ７アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ８アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｓ９アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ１０アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｓ１１アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｉｂ－ＯＨ、Ｓ１２アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ１３アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ１４アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｓ１５アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ１６アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ１７アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ１８アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ１９アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｓ２０アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｓ２１アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｓ２２アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ２３アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ２４アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｓ２５アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｓ２６アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ２７アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｓ２８アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｓ２９アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｓ３０アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ３１アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｓ３２アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ３３アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ３４アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｓ３５アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｓ３６アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ３７アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ３８アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ及びＳ３９アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨを順次に連結し、ペプチド樹脂を得た。続いて、次の操作を行った。

（２－６）樹脂の収縮：先に反応管にメタノール（８０ｍＬ）を加え、樹脂を５分間収縮させ、溶媒を吸い取った。収縮は、毎回に１０分間、３回繰り返して行われる。また、毎回の収縮後に溶媒を吸い取りてから次の収縮を行うようにした。そして収縮された樹脂を真空乾燥オープンに入れ、３５℃で乾燥させた。ペプチド樹脂１８．８２ｇを得た。

（２－７）ペプチドセグメントの切断：１５５ｍＬのＴＦＡ、８ｍＬのＴＩＳ、４．１２ｍＬのＥＤＴ、２ｍＬのＴＡ、４．１２ｍＬの水及び２ｍＬのアニソールを均一に混合してライセートを調製した。工程（２－６）で調製されたペプチド樹脂を１８．８２ｇ秤量し、ライセートとペプチド樹脂を混合した後、密封および遮光の条件下で、温度を２５℃～３５℃に保ちながら、２時間攪拌反応させた。反応終了後、樹脂をサンドコアファンネルでろ過除去した。溶媒を減圧下で除去した後、残液にメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（４５０ｍＬ）を加え、低温０℃～１０℃で２時間晶析させた。晶析溶液を遠心分離して除去し、得られた沈殿物をメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテルで３回洗浄した。沈殿物を収集し、３５℃で真空乾燥させて、ポリペプチド（配列番号１０）Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｉｂ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙを得た。

（２－８）精製：工程（２－７）得られたペプチド粗溶液を０．４５μｍフィルター膜でろ過した後、１０μｍのＣ－１８シリカゲルを充填した２０ｍｍ×１５０ｍｍカラムで分取ＨＰＬＣにより精製した。検出波長は２２０ｎｍとした。移動相Ａを０．１％ＴＦＡ、移動相Ｂをアセトニトリルとして、下表Ａに従ってグラジエント溶離を行った。

標的ポリペプチド生成物を含む画分を収集し、純度が９５．８％であった。収集された画分を合わせ、溶媒を減圧下で除去した後、ポリペプチド化合物をフリーズドライした。得られた最終生成物は、分析型ＲＰ－ＨＰＬＣ（保持時間）及びＬＣ－ＭＳ、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ－ＭＳにより同定された。

ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ１１１２．２［Ｍ／４＋Ｈ］^＋。

ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ－ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ４４４１．４１７５［Ｍ＋Ｈ］^＋。

ＱＥ同定分析で得られたポリペプチド化合物の配列は、配列番号１０で示される通りであった。

含有量の測定：水分含有量は水分滴定器で『中国薬局方』の水分測定法を参照し、ＴＦＡ含有量の測定は『中国薬局方』の氷酢酸含有量の検出法を参照して測定したところ、ポリペプチド含有量は８５．９％であった。
実施例３：Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号１１で示されるポリペプチド配列）の調製

Ｃ末端からＮ末端に合成された：

（３－１）樹脂の前処理：２－ＣＴＡ樹脂（置換度０．９３ｍｍｏｌ／ｇ、２７ｍｍｏｌ）３０ｇを秤量し、２５０ｍＬの反応試験管に入れ、ＤＣＭ ２００ｍＬ）で樹脂を３０分間膨潤させ、溶媒を減圧下で吸い取った後、ＤＣＭ（１００ｍＬ）を加え、窒素ガスを導入して加熱し、２５℃まで昇温し、ＳＯＣｌ２（１０ｍＬ、５．０ｅｑ）を滴下し、温度を３０～３５℃に保ちながら、２時間反応させた。反応終了後、圧力下乾燥ために窒素ガスを導入した。ＤＣＭ（１００ｍＬ×３）を加えて樹脂を洗浄した。なお、洗浄後、毎回に溶媒を吸い取った。

（３－２）Ｓ１アミノ酸の連結：Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（３２．５ｇ、１０８ｍｍｏｌ）を秤量して１００ｍＬのＤＣＭで溶解し、完全に溶解した後、ＤＩＥＡ（２３ｍＬ、１３５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を反応試験管に入れ、窒素ガスを導入しながら攪拌反応させ、２０℃～３０℃反応させ、反応時間は２時間であった。メタノールとＤＩＥＡの混合溶媒１２ｍＬ（メタノール：ＤＩＥＡ＝９：１）を滴下、未反応部位を１０分間閉鎖し、溶媒を吸い取り、ＤＣＭ（１５０ｍＬ×２）で樹脂を洗浄した後、溶媒を吸い取り、次にＤＭＦ（１５０ｍＬ×２）で樹脂を洗浄し、洗浄後、溶媒を吸い取った。次に、１２０ｍＬのＤＭＦで樹脂を３０分間膨潤させ、溶媒を吸い取った後、体積比が２０％であるピペリジン／ＤＭＦ溶液（１２０ｍＬ）で反応温度を２０℃～３０℃として２回（１０分間と１５分間）脱保護を行った。脱保護後、試薬を吸い取り、ＤＭＦ（１２０ｍＬ×６）で樹脂を洗浄した。洗浄後、溶媒を吸い取り、樹脂を反応管に残し、ニンヒドリンで樹脂の色を検出したところ、樹脂は紫黒色を示した。続いて、次の操作を行った。分光光度法で吸光度を検出して算出したところ、樹脂の置換度は０．８６４１ｍｍｏｌ／ｇであった。

（３－３）アミノ酸の連結のＳ２：

Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１９．０ｇ、６３．９ ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）とＴ_３Ｐ（２０．３３ｇ、６３．９ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）を秤量し、５０ｍＬのＤＭＦで溶解し、完全に溶解した後、ＤＩＥＡ（１０．５ｍＬ、６３．９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を反応試験管に入れ、窒素ガスを導入しながら攪拌反応させ、反応温度を２０℃～３０℃とし、反応時間を２時間とした。ニンヒドリンで樹脂の色を検出したところ、樹脂は透明黄色を示した。反応後、溶媒を吸い取り、ＤＭＦ（１２０ｍＬ×３）で樹脂を毎回３ｍｉｎで洗浄し、洗浄後、溶媒を吸い取った。体積比が２３％であるピペリジン／ＤＭＦ溶液（１２０ｍＬ）で反応温度を２０℃～３０℃として２回（１０分間と１５分間）脱保護を行った。脱保護後、試薬を吸い取り、ＤＭＦ（１２０ｍＬ×６）で樹脂を洗浄した。洗浄後、溶媒を吸い取り、樹脂を反応管に残し、ニンヒドリンで樹脂の色を検出したところ、樹脂は紫黒色を示した。続いて、次の操作を行った。

（３－４）Ｓ３アミノ酸の連結：

Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ（２４．７５ｇ、６３．９ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）とＴ_３Ｐ（１９．１７ｇ、６３．９ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）を秤量し、５０ｍＬのＤＭＦで溶解し、完全に溶解した後、ＤＩＥＡ（１０．５ｍＬ、６３．９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を反応試験管に入れ、窒素ガスを導入しながら攪拌反応させ、反応温度を２０℃～３０℃とし、反応時間を２時間とした。ニンヒドリンで樹脂の色を検出したところ、樹脂は透明黄色を示した。反応後、溶媒を吸い取り、ＤＭＦ（１２０ｍＬ×３）で樹脂を洗浄し、洗浄後、溶媒を吸い取った。次に、体積比が２０％であるピペリジン／ＤＭＦ溶液（１２０ｍＬ）で反応温度を２０℃～３０℃として２回（１０分間と１５分間）脱保護を行った。脱保護後、試薬を吸い取り、ＤＭＦ（１２０ｍＬ×６）で樹脂を洗浄した。洗浄後、溶媒を吸い取り、樹脂を反応管に残し、ニンヒドリンで樹脂の色を検出したところ、樹脂は紫黒色を示した。続いて、次の操作を行った。

（３－５） 工程（３－４）を繰り返し、Ｓ４アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｓ５アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｓ６アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ７アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｓ８アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ９アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｓ１０アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ１１アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｓ１２アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｓ１３アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ１４アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ１５アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｓ１６アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ１７アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ１８アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ１９アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ２０アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｓ２１アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｓ２２アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｓ２３アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ２４アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ２５アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｓ２６アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｓ２７アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ２８アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｓ２９アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｓ３０アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｓ３１アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ３２アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｓ３３アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ３４アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｓ３５アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｓ３６アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｓ３７アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ３８アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｓ３９アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ及びＳ４０アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨを順次に連結し、ペプチド樹脂を得た。続いて、次の操作を行った。

（３－６）樹脂の収縮：先に反応管にメタノール（８０ｍＬ）を加え、樹脂を５分間収縮させ、溶媒を吸い取った。収縮は、毎回に１０分間、３回繰り返して行われる。また、毎回の収縮後に溶媒を吸い取りてから次の収縮を行うようにした。、そして収縮された樹脂を真空乾燥オープンに入れ、３５℃で乾燥させた。ペプチド樹脂１９．５６ｇを得た。

（３－７）ペプチドセグメントの切断：１５５ｍＬのＴＦＡ、８ｍＬのＴＩＳ、４．１２ｍＬのＥＤＴ、２ｍＬのＴＡ、４．１２ｍＬの水及び２ｍＬのアニソールを均一に混合してライセートを調製した。工程（３－６）で調製されたペプチド樹脂を１８．８２ｇ秤量し、ライセートとペプチド樹脂を混合した後、密封および遮光の条件下で、温度を２５℃～３５℃に保ちながら、２時間攪拌反応させた。反応終了後、樹脂をサンドコアファンネルでろ過除去した。溶媒を減圧下で除去した後、残液にメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（４５０ｍＬ）を加え、低温０℃～１０℃で２時間晶析させた。晶析溶液を遠心分離して除去し、得られた沈殿物をメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテルで３回洗浄した。沈殿物を収集し、３５℃で真空乾燥させて、ポリペプチド（配列番号１１）Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙを得た。

（３－８）精製：工程（３－７）で得られたペプチド粗溶液を０．４５μｍフィルター膜でろ過した後、１０μｍのＣ－１８シリカゲルを充填した２０ｍｍ×１５０ｍｍカラムで分取ＨＰＬＣにより精製した。検出波長は２２０ｎｍとした。移動相Ａを０．１％ＴＦＡ、移動相Ｂをアセトニトリルとして、下表Ａに従ってグラジエント溶離を行った。

標的ポリペプチド生成物を含む画分を収集し、純度が９６．１％であった。収集された画分を合わせ、溶媒を減圧下で除去した後、ポリペプチド化合物をフリーズドライした。得られた最終生成物は、分析型ＲＰ－ＨＰＬＣ（保持時間）及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより同定された。

ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ－ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ４５８５．２［Ｍ＋Ｈ］^＋。

ＱＥ同定解析で得られたポリペプチド化合物の配列は、配列番号１１で示される通りであった。

含有量の測定：水分含有量は水分滴定器で『中国薬局方』の水分測定法を参照し、ＴＦＡ含有量の測定は『中国薬局方』の氷酢酸含有量の検出法を参照して測定したところ、ポリペプチド含有量は８１．９７％であった。
実施例４：Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号１２で示されるポリペプチド配列）の調製。

実施例２の製造工程に従って、置換度が０．９３ｍｍｏｌ／ｇである２－ＣＴＡ樹脂を用い、まず樹脂を膨潤させ、２－ＣＴＡ樹脂をＣＴＣ樹脂に調製した。次に、側鎖が保護されたアミノ酸：Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨを順次に連結してペプチド樹脂を得た。最後に、ＴＦＡ、ＴＩＳ、ＥＤＴ、ＴＡ、水及びアニソールを均一に混合して調製したライセートでペプチド樹脂を処理し、側鎖保護基を除去しながら、樹脂を切断し、ペプチド粗生成物（配列番号１２）：Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙを得た。

ポリペプチド粗生成物を逆相分取高圧液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、検出波長を２２０ｎｍ、移動相Ａを０．１％ＴＦＡ、移動相Ｂをアセトニトリルとし、精製を行った。純粋な生成物を含む画分を合わせ、凍結乾燥し、ポリペプチド生成物を得た。ＨＰＬＣにより測定した純度は９４．８％であった。得られた最終生成物は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ－ＭＳにより同定された。

ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ－ＭＳ（ＥＳＩ）（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ４４５０．１２［Ｍ＋Ｈ］^＋。

ＱＥ同定解析で得られたポリペプチド化合物の配列は、配列番号１２で示される通りであった。
実施例５：Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ａｉｂ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号１３で示されるポリペプチド配列）の調製。

実施例２の製造工程に従って、置換度が０．９３ｍｍｏｌ／ｇである２－ＣＴＡ樹脂を用い、まず樹脂を膨潤させ、２－ＣＴＡ樹脂をＣＴＣ樹脂に調製した。次に、側鎖が保護されたアミノ酸：Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｉｂ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨを順次に連結してペプチド樹脂を得た。最後に、ＴＦＡ、ＴＩＳ、ＥＤＴ、ＴＡ、水及びアニソールを均一に混合して調製したライセートでペプチド樹脂を処理し、側鎖保護基を除去しながら、樹脂を切断し、ペプチド粗生成物（配列番号１３）：Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ａｉｂ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙを得た。

ポリペプチド粗生成物を逆相分取高圧液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、検出波長を２２０ｎｍ、移動相Ａを０．１％ＴＦＡ、移動相Ｂをアセトニトリルとし、精製を行った。純粋な生成物を含む画分を合わせ、凍結乾燥し、ポリペプチド生成物を得た。ＨＰＬＣにより測定した純度は９４．８％であった。得られた最終生成物は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ－ＭＳにより同定された。

ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ－ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ４５９９．２５３［Ｍ＋Ｈ］^＋。

ＱＥ同定解析で得られたポリペプチド化合物の配列は、配列番号１３で示される通りであった。
実施例６：Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ａｉｂ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号１４で示されるポリペプチド配列）の調製。

実施例２の製造工程に従って、置換度が０．９３ｍｍｏｌ／ｇである２－ＣＴＡ樹脂を用い、まず樹脂を膨潤させ、２－ＣＴＡ樹脂をＣＴＣ樹脂に調製した。次に、側鎖が保護されたアミノ酸：Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｉｂ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨを順次に連結してペプチド樹脂を得た。最後に、ＴＦＡ、ＴＩＳ、ＥＤＴ、ＴＡ、水及びアニソールを均一に混合して調製したライセートでペプチド樹脂を処理し、側鎖保護基を除去しながら、樹脂を切断し、ペプチド粗生成物（配列番号１４）：Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ａｉｂ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙを得た。

ポリペプチド粗生成物を逆相分取高圧液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、検出波長を２２０ｎｍ、移動相Ａを０．１％ＴＦＡ、移動相Ｂをアセトニトリルとし、精製を行った。純粋な生成物を含む画分を合わせ、凍結乾燥し、ポリペプチド生成物を得た。ＨＰＬＣにより測定した純度は９４．８％であった。得られた最終生成物は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ－ＭＳにより同定された。

ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ－ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ４５１４．１５［Ｍ＋Ｈ］^＋。

ＱＥ同定解析で得られたポリペプチド化合物の配列は、配列番号１４で示される通りであった。
実施例７：Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号１５で示されるポリペプチド配列）の調製。

実施例２の製造工程に従って、置換度が０．９３ｍｍｏｌ／ｇである２－ＣＴＡ樹脂を用い、まず樹脂を膨潤させ、２－ＣＴＡ樹脂をＣＴＣ樹脂に調製した。次に、側鎖が保護されたアミノ酸：Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨを順次に連結してペプチド樹脂を得た。最後に、ＴＦＡ、ＴＩＳ、ＥＤＴ、ＴＡ、水及びアニソールを均一に混合して調製したライセートでペプチド樹脂を処理し、側鎖保護基を除去しながら、樹脂を切断し、ペプチド粗生成物（配列番号１５）：Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ａｉｂ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙを得た。

ポリペプチド粗生成物を逆相分取高圧液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、検出波長を２２０ｎｍ、移動相Ａを０．１％ＴＦＡ、移動相Ｂをアセトニトリルとし、精製を行った。純粋な生成物を含む画分を合わせ、凍結乾燥し、ポリペプチド生成物を得た。ＨＰＬＣにより測定した純度は９４．８％であった。得られた最終生成物は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ－ＭＳにより同定された。

ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ－ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ４５１４．１５［Ｍ＋Ｈ］^＋。

ＱＥ同定解析で得られたポリペプチド化合物の配列は、配列番号１５で示される通りであった。
効果実施例
（一）卵巣摘出ＳＤラットへの本発明に係る化合物の骨粗鬆症の治療効果に関する研究

試験方法：２２週齢前後の雌性ＳＤラットを実験に使用した。飼育条件：動物室の温度を２１±５℃とし、相対湿度を３５±１０％とし、動物室を毎日１２ｈ明条件／１２ｈ暗条件とし、動物に水を自由に摂取させた。ＳＤラットに卵巣摘出術（ＯＶＸ）を施し、さらに３ヶ月間飼育し、ラット骨粗鬆症モデルを誘導した。大腿骨骨密度によって、(1)等体積の生理食塩水を皮下投与したＳｈａｍ群（偽手術群）、(2)等体積の生理食塩水を皮下投与したＯＶＸ群（モデル群）、(3)５μｇ／ｋｇのアバロパラチド（Ａｂａ）を皮下投与した陽性薬アバロパラチド５μｇ投与量群（Ａｂａ－５）、に群分けした。各被験化合物には、被験化合物を２．５μｇ／ｋｇ皮下投与した被験化合物２．５μｇ／ｋｇ投与量群、被験化合物を５μｇ／ｋｇ皮下投与した被験化合物５μｇ／ｋｇ投与量群、被験化合物を１０μｇ／ｋｇ皮下投与した被験化合物１０μｇ／ｋｇ投与量群という３つの用量の投与群を設定した。週５回、２５週間連続投与した。被験化合物は、実施例１～５（配列番号９～配列番号１３で示される）のポリペプチド化合物であった。アバロパラチド（Ａｂａｌｏｐｔｉｄｅ）は、閉経後骨粗鬆症を治療するための市販薬であった。

検出法：検出指標の時間と内容は以下の通りであった。

１）骨密度（ＢＭＤ：ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）は、モデル確立前（－１３ｗ）、投与前（０ｗ）及び投与６ｗ、１２ｗ、２５ｗ、３７ｗ、４９ｗにおいて、二重エネルギーＸ線骨密度測定装置（ＤＸＡ）で検出された。

２）投与前（０ｗ）及び投与２５ｗに眼窩から採血し、全血で血液ルーチン検査を行った；

３）投与２５ｗ後、血清を使用して骨代謝マーカー：ＣＴｘ（β－ＣＴＸ、血清）、ＯＣ（血清）及び血清Ｉ型プロコラーゲンアミノ末端ペプチド（ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ １ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ、ＰＩＮＰ）の検出及びカルシウム、リン、アルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＡＬＰ）の検出を行った。

４）投与終了後、両側の大腿骨及びラット腰椎を採取し、ＭｉｃｒｏＣＴ、組織形態学及び生物力学検出を行った。

データの統計分析：ＳＰＳＳ ２０ソフトウェアでデータを処理し、正規性検定（ｎｏｒｍａｌｉｔｙ ｔｅｓｔ）に一致する場合、一元配置分散分析を実行し、正規性検定に一致しない場合、順位和検定（ｒａｎｋ ｓｕｍ ｔｅｓｔ）を実行した。データは、平均値±基準誤差で表された。

実験結果：

（１）大腿骨及び腰椎の骨密度を統計し、各検出時点の大腿骨及び腰椎の密度変化パーセント率を算出し、表１を得た。

骨密度変化パーセント率＝（検出時点での骨密度－投与前の骨密度）／投与前の骨密度×１００％

注：＊Ｐ＜０．０５ ＊＊Ｐ＜０．０１ ＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｓｈａｍ群と比較した）；＃Ｐ＜０．０５ ＃＃Ｐ＜０．０１ ＃＃＃Ｐ＜０．００１（ＯＶＸ群と比較した）；＆Ｐ＜０．０５ ＆＆Ｐ＜０．０１ ＆＆＆Ｐ＜０．００１（Ａｂａ－５μ／ｋｇ群と比較した）。

結果と考察：表１により、ＯＶＸモデル群と比較して、実施例１～５の被験化合物は、２．５μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ及び１０μｇ／ｋｇの投与量で２５週間投与されることで、ＯＶＸによるラット骨粗鬆症モデルに対して大腿骨及び腰椎の骨密度を有意に増加することができた。また、実施例１～５の被験化合物は、骨粗鬆症ラットの骨密度の増加に対して用量反応関係を有する。

偽手術群と比較して、実施例１～５の被験化合物を使用した群は、２．５μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ及び１０μｇ／ｋｇの投与量で２５週間投与されることで、骨粗鬆症ラットの大腿骨及び腰椎の骨密度を向上させ、最終的に偽手術群の骨密度と有意差が見られなく、また、一部の投与群のラットの骨密度が偽手術群よりも高くなり、それによって、投与２５週間後、骨粗鬆症ラットの大腿骨及び腰椎の骨密度が正常レベルに近づいたことが示される。その結果、本発明のポリペプチド化合物が骨形成作用を促進し、骨密度を向上することができることが証明された。

市販薬であるアバロパラチドは、５μｇ／ｋｇの投与量で２５週間投与した後、骨粗鬆症ラットの大腿骨の骨密度を３０．２８±２％向上させることができ、それに対して、被験化合物１～５は、５μｇ／ｋｇの投与量で投与した場合、骨粗鬆症ラットの大腿骨の骨密度をそれぞれ３７．６７±２．７０％、２９．１７±１．８６％、２７．１９±１．３３％、３１．６１±１．５４及び４６．２９±２．４２％と向上させた。アバロパラチドは、５μｇ／ｋｇの投与量で２５週間投与した後、骨粗鬆症ラットの腰椎の骨密度を２１．６６±２．１２％向上させることができ、それに対して、被験化合物１～５は、５μｇ／ｋｇの投与量で投与した場合、骨粗鬆症ラットの腰椎の骨密度をそれぞれ２４．８２±４．９３％、２９．６１±２．２６％、２０．４１±２．５６％、２５．７９±２．０６％及び３４．２９±７．１５％を向上させた。

（２）各群の動物の血液ルーチン検査結果を統計し、表２を得た。

注：ＷＢＣ：白血球、Ｌｙｍｐｈリンパ球、Ｇｒａｎ 好中球
＊Ｐ＜０．０５ ＊＊Ｐ＜０．０１ ＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｓｈａｍ群と比較した）
＃Ｐ＜０．０５ ＃＃Ｐ＜０．０１ ＃＃＃Ｐ＜０．００１（ＯＶＸ群と比較した）
＆Ｐ＜０．０５ ＆＆Ｐ＜０．０１ ＆＆＆Ｐ＜０．００１（Ａｂａ－５μ／ｋｇ群と比較した）

結果と考察：表２により、Ｓｈａｍ群と比較して、ＯＶＸ群の骨粗鬆症ラットの白血球、リンパ球及び好中球の数は、有意に変化しなかったことが分かった。それによって、骨粗鬆症ラットは自然状態で末梢血中の核細胞レベルが正常に維持されていたことが示される。

アバロパラチド対照群は、２５週間投与後、白血球の数がＯＶＸ骨粗鬆症モデル対照群及びＳｈａｍ対照群と比較して有意に減少し、リンパ球数がＳｈａｍ対照群と比較して有意に減少し、好中球数がＯＶＸ群と比較して有意に減少した。

ＯＶＸモデル群及びＳｈａｍ対照群と比較して、実施例１～５の被験化合物を２．５μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ及び１０μｇ／ｋｇの投与量で２５週間投与した後、白血球、リンパ球及び好中球の数が正常に維持され、それによって、本発明に係る化合物が骨粗鬆症ラットの骨形成を促進し、骨密度を向上するとともに、末梢血単核細胞の数を安定化したことが示される。

アバロパラチドの５μｇ／ｋｇ投与群と比較して、実施例１～５の被験化合物を２．５μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ及び１０μｇ／ｋｇの投与量で２５週間投与した後、末梢血中の白血球、リンパ球及び好中球の細胞レベルがアバロパラチド群よりも有意に多かった。アバロパラチドの投与期間中には、末梢血中の単球、リンパ球及び白血球が有意に減少したが、本発明に係る化合物は、末梢血細胞中の核細胞のレベルを安定化し、アバロパラチドの有害反応を回避した。
（二）レチノイン酸で誘導した骨粗鬆症骨粗鬆症への本発明に係る化合物の治療効果に関する研究

試験方法：ＳＤラットにレチノイン酸を強制経口投与してラット骨粗鬆症モデルを誘導した。モデルを構築した後、大腿骨の骨密度によって、(1)試験化合物と等体積の生理食塩水を皮下投与し、レチノイン酸と等体積の大豆油を強制経口投与したＶｅｈｉｃｌｅ群（対照群）、(2)等体積の生理食塩水を皮下投与し、１日おきにレチノイン酸（ＲＡ）を強制経口投与し、骨粗鬆症状態を維持したモデル群、(3)１０μｇ／ｋｇのアバロパラチドを皮下投与し、１日おきにレチノイン酸を強制経口投与した陽性薬アバロパラチド２０μｇ投与量群（Ａｂａ－２０）として、ランダムに群分けした。各被験化合物には、１０μｇ／ｋｇ被験化合物を皮下投与し、１日おきにレチノイン酸を強制経口投与した被験化合物－１０μｇ／ｋｇ投与量群、２０μｇ／ｋｇ被験化合物を皮下投与し、１日おきにレチノイン酸を強制経口投与した被験化合物－２０μｇ／ｋｇ投与量群、４０μｇ／ｋｇ被験化合物を皮下投与し、１日おきにレチノイン酸を強制経口投与した被験化合物－４０μｇ／ｋｇ投与量群という３つの用量の投与群を設定した。被験化合物群には、週５回、生理食塩水を試験薬の希釈剤として、１２週間連続投与した。レチノイン酸の誘導量を約８０ｍｇ／ｋｇ、モデル確立後の維持投与量を約３０ｍｇ／ｋｇ、誘導剤の溶媒を大豆油とした。

検出指標の時刻と内容：

（１）骨密度（ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ，ＢＭＤ）は、投与前（０ｗ）及び投与１２ｗ後において二重エネルギーＸ線骨密度測定装置（ＤＸＡ）で検出を行った。

（２）投与前（０ｗ）及び投与１２ｗ後に眼窩から採血し、血清を除去してカルシウム、リン、アルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＡＬＰ）測定を行い、また、他の部分について全血で血液ルーチン検出を行った。

（３）投与１２ｗ後、眼窩から採血した血清を骨代謝マーカー：ＣＴｘ（β－ＣＴＸ、血清）、ＯＣ（血清）及び血清Ｉ型プロコラーゲンアミノ末端ペプチド（ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ １ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ、ＰＩＮＰ）の検出を行った。

（４）投与終了後、左側の脛骨に骨髓塗抹標本を作成し、左側の大腿骨を３点力学試験、右側の大腿骨をＣＴスキャンして病理学的切片を作成した。

データの統計分析：ＳＰＳＳ ２０ソフトウェアでデータを処理し、正規性検定に一致する場合、一元配置分散分析を実行し、正規性検定に一致しない場合、順位和検定を実行した。データは、平均値±基準誤差で表された。

実験結果：

（１）レチノイン酸で誘発した骨粗鬆症ラットの骨髓核細胞に対する化合物の影響

レチノイン酸で誘発した骨粗鬆症ラットの骨髓腔内の核細胞の数を統計し、表３を得た。

注：Ａｂａ：陽性薬アバロパラチド；ＲＡ：レチノイン酸；＊＊＊ｐ＜０．００１（対照群と比較した）；＃ｐ＜０．０５（ＲＡと比較した）；＆＆ｐ＜０．０１（Ａｂａ－２０μｇ／ｋｇと比較した）；＆ｐ＜０．０５（Ａｂａ－２０μｇ／ｋｇと比較した）

結果と考察：投与１２ｗ後、対照群と比較して、アバロパラチド２０μｇ／ｋｇ群は、骨髓腔内の核細胞数が有意に減少し（Ｐ＜０．００１）、また、モデル群と比較して、アバロパラチド２０μｇ／ｋｇ群は、骨髓腔内の核細胞数が有意に減少した（Ｐ＜０．０５）。レチノイン酸で誘発した骨粗鬆症ラットに骨髓抑制が生じなかったことから、アバロパラチドは、正常ラットと骨粗鬆症ラットの骨髓に対して明らかな抑制効果を有する。

アバロパラチド２０μｇ／ｋｇと比較して、被験化合物１～５の１０μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ群は、細胞核細胞数が有意に増加し（Ｐ＜０．０５）、また、被験化合物１～５投与群は、骨髓核細胞数が正常レベルに近づいた（対照群と有意差がなかった）。これから、本発明に係る化合物が骨髓内核細胞の数を安定化する効果を有することが分かる。

（２）レチノイン酸で誘発した骨粗鬆症ラットの骨微細構造に対する化合物の影響

実験終了後、ラット右側の大腿骨を採取し、ＣＴ検出を行い、骨表面積／骨体積比（ＢＶ／ＴＶ）、骨梁数（ＴｂＮ）、骨梁間隙（ＴｂＳｐ）を算出した。その結果を表４に示す。対照群、モデル群、アバロパラチド群、実施例１の２０μｇ／ｋｇ投与量群、実施例２の２０μｇ／ｋｇ投与量群及び実施例５の２０μｇ／ｋｇ投与量群から一例を選択し、それらの大腿骨の滑車部位のミクロンＸ線三次元イメージングシステムによるスキャン図を図１に示した。

注：^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１（対照群と比較した）
^＃ｐ＜０．０５、^＃＃ｐ＜０．０１、^＃＃＃ｐ＜０．００１（ＲＡ群と比較した）
^＆ｐ＜０．０（ Ａｂａ－２０μｇ／ｋｇと比較した）、ｎ＝６－８

結果と考察：表４より、投与１２ｗ後、対照群と比較して、ＲＡ群は、骨体積／総体積ＢＶ／ＴＶ（Ｐ＜０．０１）、骨梁数ＴｂＮ（Ｐ＜０．００１）が有意に減少し、骨梁間隙ＴｂＳｐ（Ｐ＜０．００１）が有意に増加したことが分かった。これによって、モデル群（ＲＡ）ラットの骨組織の微細構造が重篤な損傷を受けたことが認められた。

モデル群／ＲＡと比較して、被験化合物１～５の各投与量群は、骨体積／総体積ＢＶ／ＴＶ、骨梁数ＴｂＮが有意に増加し、骨梁間隙ＴｂＳｐ（Ｐ＜０．００１）が有意に減少した。これによって、本発明の被験化合物を投与した後にラット大腿骨の骨量が増加し、骨組織の微細構造の損傷が修復されたことが認められた。

同じ投与量（２０μｇ／ｋｇ）で、被験化合物１～５は、骨表面積／骨体積比（ＢＶ／ＴＶ）、骨梁数（ＴｂＮ）、骨梁間隙（ＴｂＳｐ）への改善の点で、アバロパラチドよりも明らかに優れていた。これによって、本発明に係る化合物が高代謝回転型骨粗鬆症の治療においてアバロパラチドよりも優れたことが認められた。

（３）レチノイン酸で誘発した骨粗鬆症ラットの生体力学に対する化合物の影響

実験終了後、ラット左側の大腿骨を採取して３点力学試験を行い、実験結果を表５に示した。

注：Ａｂａ：陽性薬アバロパラチド；ＲＡ：モデル誘導剤であるレチノイン酸；＊＊ｐ＜０．０１ ＊＊＊ｐ＜０．００１（対照群と比較した）；＃ｐ＜０．０５ ＃＃ｐ＜０．０１（ＲＡと比較した）；ｎ＝５－１４

結果と考察：投与１２ｗ後の大腿骨の３点力学測定の結果、対照群と比較して、モデル群は、最大応力（Ｐｅａｋ ｌｏａｄ）が有意に減少し（Ｐ＜０．００１）、これによって、レチノイン酸誘発性の骨粗鬆症ラットの大腿骨の最大応力が有意に減少したことが認められた。

モデル群と比較して、被験化合物の２０μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ投与量群は、ラットの大腿骨の最大応力（ｐｅａｋ ｌｏａｄ）が有意に増加した（Ｐ＜０．０５）。アバロパラチド２０μｇ／ｋｇは、モデル群と比較して、Ｐｅａｋ ｌｏａｄが有意に増加しなかった。これによって、骨粗鬆症ラットの大腿骨の最大応力を改善する点において、本発明に係る化合物の効果はアバロパラチドよりも優れたことが認められた。

このように、本発明に係る化合物は、アバロパラチドと比較して、骨髓及び末梢血の核細胞レベルを明らかに安定化させることができる。また、本発明に係る化合物は、レチノイン酸で誘発した骨粗鬆症ラットの大腿骨の最大応力を向上させることができ、その効果がアバロパラチドよりも優れている。また、本発明に係る化合物は、骨表面積／骨体積比（ＢＶ／ＴＶ）、骨梁数（ＴｂＮ）、骨梁間隙を含む骨微細構造を改善することもでき、その効果が市販薬であるアバロパラチドよりも優れている。

以上の内容は、具体的な好ましい実施形態と組み合わせた本発明のさらなる詳細な説明であり、本発明の具体的な実施はこれらの説明に限定されるものとは認められない。当業者にとって、本発明の思想を逸脱することなく、いくつかの単純な推論又は置換を行うことができ、いずれも本発明の保護範囲に属するものと見なすべきである。

Claims (19)

1. 下記の式（Ｉａ）又は式（Ｉｂ）で示される構造又はその薬学的に許容される塩である活性ポリペプチド化合物。
   Ｙ－ＩＤ－Ｘ 式（Ｉａ）又は
   Ｘ－ＩＤ－Ｙ 式（Ｉｂ）
   （式中、Ｙは、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体アゴニスト又は破骨細胞阻害剤であり、
   ＩＤは、ＸとＹを連結する分子内のペプチド結合又はリンカーであり、
   Ｘは、オステオゲニック成長ペプチド受容体アゴニスト、骨髓間葉系幹細胞刺激剤、又は造血幹細胞刺激剤である。）
2. 前記Ｙは、Ｍ－ＣＳＦ拮抗剤、ＲＡＮＫＬ阻害剤、ＲＡＮＫＬ抗体、ＭＭＰ阻害剤、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、又は副甲状腺ホルモン関連蛋白である、請求項１に記載の活性ポリペプチド化合物。
3. 前記Ｙは、下記の式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を有するペプチド鎖であり、
   Ａ_１－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ａ_８－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ａ_１７－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａ_２２－Ａ_２３－Ｌｅｕ－Ａ_２５－Ａ_２６－Ｌｅｕ－Ａ_２８－Ａ_２９－Ａ_３０－Ａ_３１－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ａｌａ 式（ＩＩ）、
   式中、Ａ_１は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
   Ａ_８は、Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
   Ａ_１７は、Ａｓｐ又はＧｌｕであり、
   Ａ_２２は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＰｈｅであり、
   Ａ_２３は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＰｈｅであり、
   Ａ_２５は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＨｉｓであり、
   Ａ_２６は、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｒｇであり、
   Ａ_２８は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＶａｌであり、
   Ａ_２９は、Ａｌａ、（Ｎ－Ｍｅ）Ａｌａ又はＡｉｂであり、
   Ａ_３０は、Ｌｙｓ又はＧｌｕであり、
   Ａ_３１は、Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
   前記ペプチド鎖Ｙのアミノ末端は、遊離又は化学修飾されており、前記ペプチド鎖Ｙのカルボキシル末端は、遊離又は化学修飾されている、請求項１に記載の活性ポリペプチド化合物。
4. 前記Ｘは、造血幹細胞刺激剤、造血成長因子、血小板コロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターロイキン-３、又は組換えヒトインターロイキン－１１である、請求項１に記載の活性ポリペプチド化合物。
5. 前記Ｘは、下記の式（ＩＩＩａ）又は（ＩＩＩｂ）で示されるアミノ酸配列を有するペプチド鎖であり、
   Ｔｙｒ－（Ａｒｇ）_ｍ－（Ｇｌｙ）_ｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ 式（ＩＩＩａ）
   Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－（Ｇｌｙ）_ｎ－（Ａｒｇ）_ｍ－Ｔｙｒ 式（ＩＩＩｂ）
   式中、ｍ及びｎは、それぞれ独立して０、１又は２であり、
   前記ペプチド鎖Ｘのアミノ末端は、遊離又は化学修飾されており、前記ペプチド鎖Ｘのカルボキシル末端は、遊離又は化学修飾されている、請求項１に記載の活性ポリペプチド化合物。
6. 前記Ｘは、５～６個のアミノ酸からなるペプチド鎖であり、
   Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ （配列番号１）
   Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ （配列番号２）
   Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ （配列番号３）
   Ｔｙｒ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ （配列番号４）
   Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ （配列番号５）
   Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－Ｔｙｒ （配列番号６）
   Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｔｙｒ （配列番号７）
   Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ （配列番号８）
   上記の配列番号１～配列番号８で示されるアミノ酸配列のうちの１種を有する、請求項５に記載の活性ポリペプチド化合物。
7. 前記ＩＤは、アミノ置換Ｃ_１－８アルキル酸、ポリエチレングリコールポリマー鎖、又は１～１０個のアミノ酸からなるペプチドセグメントであり、
   前記ペプチドセグメントにおけるアミノ酸は、プロリン、アルギニン、アラニン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、グルタミン、アスパラギン及びグリシンからなる群より選択されるＸとＹとの間のリンカーである、請求項１に記載の活性ポリペプチド化合物。
8. 前記リンカーは、
   （１）（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_ｐ（ここで、ｐは１、２、３、４又は５である）、
   （２）（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_ｔ（ここで、ｔは１、２又は３である）、
   （３）Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ａｌａ、
   （４）４－アミノ酪酸又は６－アミノカプロン酸、
   （５）（ＰＥＧ）_ｑ（ここで、ｑは１、２、３、４又は５である）、
   上記の（１）～（５）のいずれか一種である、請求項７に記載の活性ポリペプチド化合物。
9. 下記の式（ＩＶ）で示される構造を有するか、又は式（ＩＶ）で示される化合物の薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の活性ポリペプチド化合物。
   Ａ_１－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ａ_８－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ａ_１７－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａ_２２－Ａ_２３－Ｌｅｕ－Ａ_２５－Ａ_２６－Ｌｅｕ－Ａ_２８－Ａ_２９－Ａ_３０－Ａ_３１－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａ_３５ 式（ＩＶ）
   （式中、Ａ_１は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
   Ａ_８は、Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
   Ａ_１７は、Ａｓｐ又はＧｌｕであり、
   Ａ_２２は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＰｈｅであり、
   Ａ_２３は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＰｈｅであり、
   Ａ_２５は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＨｉｓであり、
   Ａ_２６は、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｒｇであり、
   Ａ_２８は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＶａｌであり、
   Ａ_２９は、Ａｌａ、（Ｎ－Ｍｅ）Ａｌａ又はＡｉｂであり、
   Ａ_３０は、Ｌｙｓ又はＧｌｕであり、
   Ａ_３１は、Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
   前記Ａ_３５は、下記の式（ＩＩＩａ）又は（ＩＩＩｂ）で示されるアミノ酸配列のペプチド鎖を有し、
   Ｔｙｒ－（Ａｒｇ）_ｍ－（Ｇｌｙ）_ｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ 式（ＩＩＩａ）
   Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－（Ｇｌｙ）_ｎ－（Ａｒｇ）_ｍ－Ｔｙｒ 式（ＩＩＩｂ）
   式中、ｍ及びｎは、それぞれ独立して０、１又は２であり、
   Ａ_１で示されるアミノ酸のアミノ末端は、遊離又は化学修飾されており、Ａ_３５のペプチド鎖のカルボキシル末端は、遊離又は化学修飾されている。）
10. 前記アミノ末端の化学修飾には、アシル化、スルホニル化、アルキル化及びＰＥＧ修飾が含まれ、
    前記カルボキシル末端の化学修飾には、アミド化、スルホニル化及びＰＥＧ修飾が含まれる、請求項９に記載の活性ポリペプチド化合物。
11. 前記アミノ末端の化学修飾は、アミノ基に対するアセチル化、ベンゾイル化又はスルホニル化であり、
    前記アミノ末端のアルキル化は、Ｃ_１－６アルキル化又は芳香族アルキル化であり、
    前記カルボキシル末端の化学修飾は、カルボキシル基におけるＯＨがＮＨ_２又はスルホンアミドで置換されること、又はカルボキシル基におけるＯＨが官能化されたＰＥＧ分子に連結することである、請求項１０に記載の活性ポリペプチド化合物。
12. 以下の配列番号９～配列番号１５のうちの１種の化合物、又はその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の活性ポリペプチド化合物。
    （１）配列番号９
    Ａｌａ-Ｖａｌ-Ｓｅｒ-Ｇｌｕ-Ｈｉｓ-Ｇｌｎ-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ｈｉｓ-Ａｓｐ-Ｌｙｓ-Ｇｌｙ-Ｌｙｓ-Ｓｅｒ-Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ａｓｐ-Ｌｅｕ-Ａｒｇ-Ａｒｇ-Ａｒｇ-Ｇｌｕ-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-Ｌｙｓ-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ－（Ｎ－Ｍｅ）Ａｌａ-Ｌｙｓ-Ｌｅｕ-Ｈｉｓ-Ｔｈｒ-Ａｌａ-Ｔｙｒ-Ｇｌｙ-Ｐｈｅ-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ
    （２）配列番号１０
    Ａｌａ-Ｖａｌ-Ｓｅｒ-Ｇｌｕ-Ｈｉｓ-Ｇｌｎ-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ｈｉｓ-Ａｓｐ-Ｌｙｓ-Ｇｌｙ-Ｌｙｓ-Ｓｅｒ-Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ａｓｐ-Ｌｅｕ-Ａｒｇ-Ａｒｇ-Ａｒｇ-Ｇｌｕ-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-Ｌｙｓ-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ａｉｂ-Ｌｙｓ-Ｌｅｕ-Ｈｉｓ-Ｔｈｒ-Ａｌａ-Ｔｙｒ-Ｇｌｙ-Ｐｈｅ-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ
    （３）配列番号１１
    Ａｌａ-Ｖａｌ-Ｓｅｒ-Ｇｌｕ-Ｈｉｓ-Ｇｌｎ-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ｈｉｓ-Ａｓｐ-Ｌｙｓ-Ｇｌｙ-Ｌｙｓ-Ｓｅｒ-Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ａｓｐ-Ｌｅｕ-Ａｒｇ-Ａｒｇ-Ａｒｇ-Ｇｌｕ-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-Ｌｙｓ-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ａｌａ-Ｌｙｓ-Ｌｅｕ-Ｈｉｓ-Ｔｈｒ-Ａｌａ-Ｔｙｒ-Ａｒｇ-Ｇｌｙ-Ｐｈｅ-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ
    （４）配列番号１２
    Ａｌａ-Ｖａｌ-Ｓｅｒ-Ｇｌｕ-Ｈｉｓ-Ｇｌｎ-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ｈｉｓ-Ａｓｐ-Ｌｙｓ-Ｇｌｙ-Ｌｙｓ-Ｓｅｒ-Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ａｓｐ-Ｌｅｕ-Ａｒｇ-Ａｒｇ-Ａｒｇ-Ｐｈｅ-Ｐｈｅ-Ｌｅｕ-Ｈｉｓ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｉｌｅ-Ａｌａ-Ｇｌｕ-Ｉｌｅ-Ｈｉｓ-Ｔｈｒ-Ａｌａ-Ｔｙｒ-Ｇｌｙ-Ｐｈｅ-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ
    （５）配列番号１３
    Ａｌａ-Ｖａｌ-Ｓｅｒ-Ｇｌｕ-Ｈｉｓ-Ｇｌｎ-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ｈｉｓ-Ａｓｐ-Ｌｙｓ-Ｇｌｙ-Ｌｙｓ-Ｓｅｒ-Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ａｓｐ-Ｌｅｕ-Ａｒｇ-Ａｒｇ-Ａｒｇ-Ｐｈｅ-Ｐｈｅ-Ｌｅｕ-Ｈｉｓ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｉｌｅ-Ａｉｂ-Ｇｌｕ-Ｉｌｅ-Ｈｉｓ-Ｔｈｒ-Ａｌａ-Ｔｙｒ-Ａｒｇ-Ｐｈｅ-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ
    （６）配列番号１４
    Ａｌａ-Ｖａｌ-Ｓｅｒ-Ｇｌｕ-Ｈｉｓ-Ｇｌｎ-Ｌｅｕ-Ｉｌｅ-Ｈｉｓ-Ａｓｐ-Ｌｙｓ-Ｇｌｙ-Ｌｙｓ-Ｓｅｒ-Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ｇｌｕ-Ｌｅｕ-Ａｒｇ-Ａｒｇ-Ａｒｇ-Ｐｈｅ-Ｐｈｅ-Ｌｅｕ-Ｈｉｓ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｉｌｅ-Ａｉｂ-Ｇｌｕ-Ｉｌｅ-Ｈｉｓ-Ｔｈｒ-Ａｌａ-Ｔｙｒ-Ｇｌｙ-Ｐｈｅ-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ
    （７）配列番号１５
    Ａｌａ-Ｖａｌ-Ｓｅｒ-Ｇｌｕ-Ｈｉｓ-Ｇｌｎ-Ｌｅｕ-Ｉｌｅ-Ｈｉｓ-Ａｓｐ-Ｌｙｓ-Ｇｌｙ-Ｌｙｓ-Ｓｅｒ-Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ｇｌｕ-Ｌｅｕ-Ａｒｇ-Ａｒｇ-Ａｒｇ-Ｐｈｅ-Ｐｈｅ-Ｌｅｕ-Ｈｉｓ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ａｌａ-Ｇｌｕ-Ｉｌｅ-Ｈｉｓ-Ｔｈｒ-Ａｌａ-Ｔｙｒ-Ｇｌｙ-Ｐｈｅ-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ
13. 前記ポリペプチド化合物のアミノ酸の側鎖基に化学修飾により改造された化合物、又は
    前記ポリペプチド化合物と金属イオンとからなる配位化合物、錯体若しくはキレート、又は
    前記ポリペプチド化合物により形成される水和物若しくは溶媒和物、をさらに含む、請求項１に記載の活性ポリペプチド化合物。
14. 前記ポリペプチド化合物のアミノ酸の側鎖基に化学修飾により改造された化合物は、前記ポリペプチド化合物におけるシステインが持っているスルフィドリル基から形成されたチオエーテル若しくはチオグリコシド、又はシステイン若しくはシステインを含むペプチドと形成されたジスルフィド結合を含む化合物、或いは
    前記ポリペプチド化合物におけるチロシンが持っているフェノール性ヒドロキシ基から形成されたエステル、エーテル、グリコシド、或いは
    前記ポリペプチド化合物におけるチロシン若しくはフェニルアラニンが持っているベンゼン環が置換されて形成された化合物である、請求項１３に記載の活性ポリペプチド化合物。
15. 請求項１に記載の活性ポリペプチド化合物と、薬学的に許容されるアジュバント、賦形剤、担体及び溶媒の少なくとも１種とを含む、医薬組成物。
16. 骨吸収抑制薬、骨形成促進薬、骨ミネラリゼーション促進薬、又は副甲状腺ホルモン関連蛋白から選択される他の治療剤を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 前記骨吸収抑制薬には、カルシトニン、ジホスホネート、エストロゲン、選択的エストロゲン受容体調節剤及びイソフラボンが含まれ、
    前記骨形成促進薬には、フッ化物、合成ステロイド、副甲状腺ホルモン及び副甲状腺ホルモン関連蛋白が含まれ、
    前記骨ミネラリゼーション促進薬には、カルシウム剤、ビタミンＤ及び活性ビタミンＤが含まれ、
    前記副甲状腺ホルモン関連蛋白は、テリパラチド又はアバロパラチドである、請求項１６に記載の医薬組成物。
18. 請求項１に記載の化合物を必要とする対象に投与することを含む、骨形成不全、骨密度の低下に関連する疾患又は障害を予防、治療又は軽減する方法。
19. 疾患が骨粗鬆症である、請求項１８に記載の方法。

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