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JP2022024040A - 疾患細胞不均一性を示す疾患の検出および処置、ならびに通信試験結果のためのシステムおよび方法 - Google Patents

疾患細胞不均一性を示す疾患の検出および処置、ならびに通信試験結果のためのシステムおよび方法 Download PDF

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Abstract

【課題】疾患細胞不均一性を示す疾患の検出および処置、ならびに通信試験結果のためのシステムおよび方法を提供する。【解決手段】ある態様では、（ａ）対象の生物学的試料由来の癌細胞からのポリヌクレオチドを配列決定するステップと、（ｂ）このポリヌクレオチドにおける体細胞変異を識別および定量化するステップと、（ｃ）このポリヌクレオチドにおける複数の体細胞変異の存在および相対量を示す、対象における腫瘍不均一性のプロファイルを展開するステップであって、異なる相対量が、腫瘍不均一性を示すステップと、（ｄ）腫瘍不均一性を示す癌のための治療介入を決定するステップであって、治療介入が、決定された腫瘍不均一性のプロファイルを有する癌に対して有効であるステップと、を含む方法が提供される。【選択図】図１０Ｌ

Description

（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１４年１２月３１日に出願された米国仮出願番号第６２／０９８，４２６号および２０１５年５月１日に出願された米国仮出願番号第６２／１５５，７６３号に基づく利益を主張しており、これら仮出願の各々は、全体が参考として本明細書中に援用される。
（背景）
医療は、疾患の診断および処置のためにヒトゲノム由来の情報をようやく有効に使用し始めたばかりである。癌の処置ほどこれが重要になる場合は他になく、癌により、米国において毎年７６０万人が死亡し、米国は、癌の処置に年間８７０億ドルを費やしている。癌は、周囲の組織に侵入し、新たな身体部位へと転移する傾向がある未分化細胞の増殖によって特徴付けられる様々な悪性新生物のいずれかの障害および斯かる成長によって特徴付けられる病態を指す。
癌の処置が困難である理由の１つは、医師が、特異的な癌を有効な薬物処置とマッチさせる際に、現在の検査方法が役立たない場合があることである。そして、癌が動いている標的であることである、つまり、癌細胞は、絶えず変化および変異している。癌は、例えば、体細胞変異による遺伝子バリアントを蓄積することができる。斯かるバリアントは、例えば、配列バリアントおよびコピー数バリアントを含む。腫瘍の分析は、腫瘍における異なる細胞が、異なる遺伝子バリアントを有し得ることを示した。腫瘍細胞間の斯かる分化は、腫瘍不均一性と称されてきた。
癌は、経時的に進化し、治療介入に対し抵抗性になり得る。ある特定のバリアントは、特異的な治療介入に対する応答性または抵抗性と相関することが公知である。腫瘍不均一性を示す癌のためには、より有効な処置が有益となるであろう。斯かる癌は、この癌が応答する第２の異なる治療介入で処置することができる。
ＤＮＡ配列決定方法は、腫瘍細胞由来のＤＮＡにおける遺伝子バリアントの検出を可能にする。癌腫瘍は、血流にその特有のゲノム材料を頻繁に脱落させる。残念ながら、このような証拠となるゲノム「シグナル」は、非常に弱いため、次世代配列決定を含む現在のゲノム分析技術では、斯かるシグナルを散発的に、または末期的に高い腫瘍負荷を有する患者において検出することしかできない。この主な理由は、斯かる技術が、癌に関連するｄｅ ｎｏｖｏゲノム変化の確実な検出に必要とされるものより数桁も高くなり得る、誤り率およびバイアスに悩まされていることである。
それと平行した傾向において、遺伝子検査の臨床的意義を理解するために、処置専門家は、遺伝の基本原則の実務知識および確率的データの解釈による妥当な能力を持たなければならない。一部の研究は、多くの処置専門家が、疾患易罹患性に関して遺伝子検査を解釈するために適切な準備ができていないことを示唆する。一部の医者は、実験室検査の陽性または陰性適中率等、診断検査の臨床有用性に関する確率的データの解釈に困難を感じている。
癌に関連するｄｅ ｎｏｖｏゲノム変化の検出における誤り率およびバイアスは、癌に関する遺伝子検査の不適切な説明または暗示と共に、癌患者のためのケアの質を下げてきた。米国病理医協会（College of American Pathologists）（ＣＡＰ）や米国臨床遺伝学会（American College of Medical Genetics）（ＡＣＭＧ）等、専門家学会は、遺伝子検査を提供する実験室のための標準またはガイドラインを公表し、これは、遺伝子情報を含有する報告が、一般医によって理解できる解釈的コンテンツを含むことを要求している。
（要旨）
ある態様では、（ａ）対象の生物学的試料由来の癌細胞からのポリヌクレオチドを配列決定するステップと、（ｂ）このポリヌクレオチドにおける体細胞変異を識別および定量化するステップと、（ｃ）このポリヌクレオチドにおける複数の体細胞変異の存在および相対量を示す、対象における腫瘍不均一性のプロファイルを展開するステップであって、異なる相対量が、腫瘍不均一性を示すステップと、（ｄ）腫瘍不均一性を示す癌のための治療介入を決定するステップであって、治療介入が、決定された腫瘍不均一性のプロファイルを有する癌に対して有効であるステップと、を含む方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、癌細胞は、空間的に別個である。一部の実施形態では、治療介入は、体細胞変異の全てではなくいずれか１種を提示する癌に対するよりも、複数の体細胞変異を提示する癌に対して有効である。一部の実施形態では、本方法は、（ｅ）対象における腫瘍不均一性の変化を経時的にモニタリングするステップ、および変化に基づき異なる治療介入を経時的に決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、（ｅ）治療介入を表示するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、（ｅ）治療介入を実装するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、（ｅ）腫瘍プロファイルに基づき腫瘍進化の系統樹を生成するステップであって、治療介入を決定するステップが、系統樹を考慮に入れるステップをさらに含む。
一部の実施形態では、決定するステップは、コンピュータの実行するアルゴリズムの助けを借りて行われる。一部の実施形態では、配列決定によって生成された配列読み取り値は、識別および定量化するステップの前にノイズ低減に付される。一部の実施形態では、ノイズ低減は、試料における単一のポリヌクレオチドから生成された配列を分子追跡することを含む。
一部の実施形態では、治療介入を決定するステップは、腫瘍関連の遺伝子変化の相対頻度を考慮に入れる。一部の実施形態では、治療介入は、組み合わせてまたは順次、複数の薬物を投与するステップであって、各薬物が、異なる相対頻度で生じる体細胞変異の異なる１種を提示する癌に対して相対的により有効であることを含む。一部の実施形態では、より高い相対頻度で生じる体細胞変異を提示する癌に対して相対的により有効な薬物は、より多い量で投与される。一部の実施形態では、薬物は、ＤＮＡにおけるバリアントの相対量を反映するように層別化された用量で送達される。一部の実施形態では、遺伝子バリアントの少なくとも１種を提示する癌は、薬物の少なくとも１種に対し抵抗性である。一部の実施形態では、治療介入を決定するステップは、癌の起源の組織を考慮に入れる。一部の実施形態では、治療介入は、体細胞変異のそれぞれによって特徴付けられる腫瘍不均一性を有する癌のための治療であることが示される介入のデータベースに基づき決定される。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、血液試料由来のｃｆＤＮＡを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、空間的に別個の癌細胞由来のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、異なる転移性腫瘍部位由来のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、固形腫瘍または拡散した腫瘍由来のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、血液試料または固形腫瘍生検に含まれる。
一部の実施形態では、識別するステップは、試料由来の親ポリヌクレオチドのための複数の配列読み取り値（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｄｓ）を生成するステップと、配列読み取り値を縮小して、各親ポリヌクレオチドにおける塩基のためのコンセンサスコール（call）を生成するステップとを含む。一部の実施形態では、定量化するステップは、生物学的試料由来のポリヌクレオチドの集団における体細胞変異が検出される頻度を決定することを含む。一部の実施形態では、生物学的試料は、非疾患細胞由来の生物学的分子を含む。一部の実施形態では、生物学的試料は、複数の異なる組織由来の生物学的分子を含む。一部の実施形態では、生体分子は、１種の生物学的試料に含まれる。一部の実施形態では、生体分子は、複数の生物学的試料に含まれる。一部の実施形態では、複数の生物学的試料は、複数の転移由来の腫瘍である。
一部の実施形態では、配列決定するステップは、対象のゲノムにおける遺伝子のサブセットの全体または一部を配列決定することを含む。一部の実施形態では、体細胞変異は、一ヌクレオド塩基変異（ＳＮＶ）、挿入、欠失、逆位、トランスバージョン、転位置、コピー数バリエーション（ＣＮＶ）（例えば、異数性、部分的異数性、倍数性）、染色体不安定性、染色体構造変化、遺伝子融合、染色体融合、遺伝子トランケーション、遺伝子増幅、遺伝子重複、染色体損傷、ＤＮＡ損傷、核酸化学修飾の異常な変化、エピジェネティックパターンの異常な変化および核酸メチル化の異常な変化から選択される。一部の実施形態では、遺伝子座は、単一のヌクレオチド、遺伝子および染色体から選択される。
一部の実施形態では、癌は、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫および中枢神経系癌（例えば、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、脳癌、食道癌、頭頸部癌、膀胱癌、婦人科系の癌、脂肪肉腫および多発性骨髄腫）から選択される。一部の実施形態では、腫瘍の癌細胞は、共通の親疾患細胞に由来する。一部の実施形態では、腫瘍の癌細胞は、同じまたは異なる癌型の異なる親癌細胞に由来する。一部の実施形態では、本方法は、相対含量相対量を決定するために１種または複数の対照参照に対する体細胞変異の測定値を決定するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、循環癌ポリヌクレオチドおよび固形腫瘍生検の両方から供給される。一部の実施形態では、プロファイルは、循環癌ポリヌクレオチドおよび固形腫瘍生検から供給されるポリヌクレオチドに対して別々に作製される。
ある態様では、腫瘍不均一性が推定され得る腫瘍プロファイルを有する癌を有する対象に、治療介入を提供するステップであって、治療介入が、この腫瘍プロファイルを有する癌に対して有効であるステップを含む方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、腫瘍プロファイルは、複数のより多くの体細胞変異の相対頻度を示す。一部の実施形態では、本方法は、対象における相対頻度の変化を経時的にモニタリングするステップ、および変化に基づき異なる治療介入を経時的に決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、治療介入は、体細胞変異の全てではなくいずれか１種を提示する癌に対するよりも、体細胞変異のそれぞれを提示する癌に対して有効である。一部の実施形態では、治療介入は、組み合わせてまたは順次、複数の薬物を投与することであって、各薬物が、異なる相対頻度で生じる体細胞変異の異なる１種を提示する癌に対して相対的により有効であることを含む。一部の実施形態では、より高い相対頻度で生じる体細胞変異を提示する癌に対して相対的により有効な薬物は、より多い量で投与される。一部の実施形態では、薬物は、ＤＮＡにおけるバリアントの相対量を反映するように層別化された用量で送達される。一部の実施形態では、遺伝子バリアントの少なくとも１種を提示する癌は、薬物の少なくとも１種に対し抵抗性である。一部の実施形態では、癌は、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫および中枢神経系癌（例えば、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、脳癌、食道癌、頭頸部癌、膀胱癌、婦人科系の癌、脂肪肉腫および多発性骨髄腫）から選択される。
ある態様では、腫瘍不均一性を示す腫瘍に対して有効な治療介入を対象に投与するステップであって、治療介入が、ポリヌクレオチドにおける複数の体細胞変異の存在および相対量を示す、対象における腫瘍不均一性のプロファイルに基づき、異なる相対量が、腫瘍不均一性を示すステップを含む方法が本明細書に提供される。
ある態様では、コンピュータプロセッサによる実装により、（ａ）遺伝子座にマッピングされるポリヌクレオチドの配列読み取り値をメモリに受け取るステップと、（ｂ）前記配列読み取り値の間で、遺伝子座にマッピングされる総ての数の配列読み取り値の、遺伝子座における参照配列の塩基とは異なる塩基の同一性を決定するステップと、（ｃ）決定された塩基の同一性および相対量ならびにゲノムにおけるそれらの位置を報告するステップと、（ｄ）（ｃ）における情報に基づき、所定の試料の不均一性を推定するステップと、を含む方法を実装する、機械実行可能コードを含むコンピュータ可読媒体を含むシステムが本明細書に提供される。一部の実施形態では、実装される方法は、複数の異なる時点における試料に由来する配列読み取り値をメモリに受け取るステップ、および２種の試料の間の複数の塩基の相対量および同一性における差異を計算するステップをさらに含む。
ある態様では、第１の医薬物および第２の医薬物を含むキットであって、第１の薬物および第２の薬物の組合せが、体細胞変異の全てではなくいずれか１種を提示する癌に対するよりも、第１および第２の体細胞変異を提示する癌に対して治療上有効であるキットが本明細書に提供される。一部の実施形態では、組合せは、混合物中に含有されるか、または各薬物は、別々の容器内に含有される。
ある態様では、（ａ）対象由来の疾患細胞（例えば、空間的に別個の疾患細胞）からの生体分子ポリマーの生体分子分析を行うステップと、（ｂ）生体分子高分子における生体分子バリアントを識別および定量化するステップと、（ｃ）生体分子高分子における複数のバリアントの存在および相対量を示す、対象における疾患細胞不均一性のプロファイルを展開するステップであって、異なる相対量が、疾患細胞不均一性を示すステップと、（ｄ）疾患細胞不均一性を示す疾患のための治療介入を決定するステップであって、治療介入が、決定された疾患細胞不均一性のプロファイルを有する疾患に対して有効であるステップとを含む方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、疾患細胞は、空間的に別個の疾患細胞である。一部の実施形態では、治療介入は、体細胞変異のそれぞれによって特徴付けられる腫瘍不均一性を有する癌のための治療であることが示される、介入のデータベースに基づき決定される。
ある態様では、対象における疾患細胞不均一性を検出する方法であって、ａ）対象由来の試料からのポリヌクレオチドにおける複数の遺伝子座のそれぞれに配列バリアントを有するポリヌクレオチドを定量化するステップであって、試料が、体細胞および疾患細胞由来のポリヌクレオチドを含むステップと、ｂ）各遺伝子座について、配列バリアントを有するポリヌクレオチドのためのコピー数バリエーション（ＣＮＶ）の測定値を決定するステップと、ｃ）各遺伝子座について、遺伝子座におけるＣＮＶの関数として、遺伝子座に配列バリアントを有するポリヌクレオチドの量の加重された測定値を決定するステップと、ｄ）複数の遺伝子座のそれぞれにおける加重された測定値を比較するステップであって、異なる加重された測定値が、疾患細胞不均一性を示すステップとを含む方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、疾患細胞は、腫瘍細胞である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｃｆＤＮＡを含む。
ある態様では、ａ）１回または複数のパルス化治療サイクルに対象を付すステップであって、各パルス化治療サイクルが、（ｉ）１種または複数の薬物が第１の量で投与される第１の期間および（ｉｉ）１種または複数の薬物が第２の低減された（例えば、完全に投与されない）量で投与される第２の期間を含み、（Ａ）第１の期間が、第１の臨床レベルを上回って検出される腫瘍負荷によって特徴付けられ、（Ｂ）第２の期間が、第２の臨床レベルを下回って検出される腫瘍負荷によって特徴付けられるステップを含む方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、腫瘍負荷は、腫瘍ポリヌクレオチドにおける選択された体細胞バリアントの量の関数として測定される。一部の実施形態では、１種または複数の薬物は、複数の薬物であり、各サイクルにおける各薬物の各量は、腫瘍ポリヌクレオチドにおける複数の異なる選択された体細胞バリアントのそれぞれの量の関数として測定される腫瘍負荷の関数として決定される。一部の実施形態では、本方法は、複数のパルス化治療サイクルに対象を付すステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、ｂ）対象が、１種または複数の薬物に対し抵抗性を示す場合、１回または複数のパルス化治療サイクルに対象を付すステップであって、各パルス化治療サイクルが、（ｉ）異なる１種または複数の薬物が第１の量で投与される第１の期間および（ｉｉ）異なる１種または複数の薬物が第２の低減された（例えば、完全に投与されない）量で投与される第２の期間を含み、（Ａ）第１の期間が、第１の臨床レベルを上回って検出される腫瘍負荷によって特徴付けられ、（Ｂ）第２の期間が、第２の臨床レベルを下回って検出される腫瘍負荷によって特徴付けられるステップをさらに含む。
ある態様では、（ａ）対象由来の癌細胞由来のポリヌクレオチドを配列決定するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドにおける体細胞変異を識別および定量化するステップと、（ｃ）腫瘍不均一性を示す癌に有効な治療介入の決定における使用のための、対象における腫瘍不均一性のプロファイルを展開するステップであって、プロファイルが、ポリヌクレオチドにおける複数の体細胞変異の存在および相対量を示し、異なる相対量が、腫瘍不均一性を示すステップとを含む方法が本明細書に提供される。
ある態様では、対象に治療介入を提供するステップであって、治療介入が、対象における疾患細胞不均一性のプロファイルから決定され、プロファイルが、ポリヌクレオチドにおける複数の体細胞変異の存在および相対量を示し、異なる相対量が、疾患細胞不均一性を示し、治療介入が、決定された疾患細胞不均一性のプロファイルを有する疾患に対して有効である、例えば、体細胞変異の全てではなくいずれか１種を提示する疾患に対するよりも、複数の体細胞変異を提示する疾患に対して有効であるステップを含む方法が本明細書に提供される。
ある態様では、ａ）ゲノムの少なくとも１ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１ｍｂ、少なくとも１０ｍｂまたは少なくとも１００ｍｂの領域にわたり、試料におけるポリヌクレオチドにおけるコピー数の中心傾向の値からの偏差の測定値（例えば、標準偏差、分散）を決定するステップと、ｂ）偏差の測定値に基づき、試料における細胞分裂を行っている細胞由来のＤＮＡの負荷の測定値を推定するステップとを含む方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、中心傾向の値は、平均値、中央値または最頻値である。一部の実施形態では、決定するステップは、領域を複数の非重複区間へとパーティションし、各区間におけるコピー数の測定値を決定し、各区間におけるコピー数の測定値に基づき偏差の測定値を決定することを含む。一部の実施形態では、この区間は、１塩基、１０塩基、１００塩基、１ｋｂ塩基または１０ｋｂのいずれか以下である。
ある態様では、試料における細胞分裂を行っている細胞由来のＤＮＡの負荷の測定値を推定する方法であって、細胞の複製起点への１種または複数のゲノム遺伝子座の近接によって誘導されるコピー数バリエーションを測定するステップを含み、ＣＮＶ増加が、細胞分裂を行っている細胞を示す方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、負荷は、無細胞（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ）ＤＮＡにおいて測定される。一部の実施形態では、負荷の測定値は、試料における腫瘍細胞のフラクションまたは腫瘍細胞由来のＤＮＡのゲノム当量に関連する。一部の実施形態では、複製起点に近接していることによるＣＮＶは、対照試料または細胞株のセットから推定される。一部の実施形態では、隠れマルコフモデル、回帰モデル、主成分分析に基づくモデルまたは遺伝子型修飾モデルを使用して、複製起点に起因する変異を近似する。一部の実施形態では、負荷の測定値は、細胞分裂を行っている細胞の存在または非存在である。一部の実施形態では、近接は、複製起点の１ｋｂ以内である。
ある態様では、複製起点に近接していることに起因するバリエーションの影響を和らげることにより、遺伝子関連のコピー数バリエーションの決定の感度および／または特異性を増加させる方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、本方法は、遺伝子座におけるＣＮＶを測定し、遺伝子座が複製起点に近接していることに起因するＣＮＶの量を決定し、例えば、細胞分裂に起因し得るＣＮＶの量を減算することにより、ゲノムＣＮＶを反映するように測定されたＣＮＶを補正するステップを含む。一部の実施形態では、ゲノムデータは、無細胞ＤＮＡから得られる。一部の実施形態では、負荷の測定値は、試料における腫瘍細胞のフラクションまたはＤＮＡのゲノム当量に関係する。一部の実施形態では、複製起点によるバリエーションは、対照試料または細胞株のセットから推定される。一部の実施形態では、隠れマルコフモデル、回帰モデル、主成分分析に基づくモデルまたは遺伝子型修飾モデルを使用して、複製起点に起因するバリエーションを近似する。
ある態様では、ａ）１種または複数の対照試料由来の１種または複数の遺伝子座におけるＤＮＡ分子のコピーのベースライン測定値を決定するステップであって、遺伝子座のうちの１種または複数が、複製起点を含み、それぞれが、既定のレベルの細胞分裂を行っている細胞由来のＤＮＡを含有するステップと、ｂ）被験試料におけるＤＮＡ分子の被験測定値を決定するステップであって、被験試料における測定値が、１種または複数のパーティション化された１種または複数の遺伝子座に由来し、遺伝子座のうちの１種または複数が、複製起点を含むステップと、ｃ）被験測定値およびベースライン測定値を比較するステップであって、ベースライン測定値を上回る被験測定値が、対照試料にＤＮＡを提供する細胞よりも速い速度で分裂している細胞由来の被験試料におけるＤＮＡを示すステップとを含む方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、測定値は、分子計数値、区画にわたる分子計数値の中心傾向の測定値、または区画にわたる分子計数値のバリエーションの測定値から選択される。
ある態様では、（ａ）対象の循環における腫瘍由来のＤＮＡの量を増加させる介入を対象に投与するステップと、（ｂ）前記量が増加された場合、腫瘍由来のＤＮＡを含有する試料を対象から収集するステップとを含む方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、介入は、腫瘍細胞を優先的に死滅させる。一部の実施形態では、介入は、対象または対象の疑われる罹患区域を放射線に曝露するステップを含む。一部の実施形態では、介入は、対象または対象の疑われる罹患区域を超音波に曝露するステップを含む。一部の実施形態では、介入は、対象または対象の疑われる罹患区域を物理的激越（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）に曝露するステップを含む。一部の実施形態では、介入は、低用量の化学療法を対象に投与するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料収集前の１週間以内に介入を対象に投与するステップを含む。一部の実施形態では、試料は、血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液、腟分泌物、粘液および精液から選択される。
ある態様では、データベースをコンパイルするステップであって、データベースが、癌を有する複数の対象のそれぞれに対して、対象につき２つまたはそれを超える時間間隔で収集された体細胞変化を含む腫瘍ゲノム検査データ、１つまたは複数の時間で対象のそれぞれに投与された１種または複数の治療介入、および治療介入の有効性を含み、データベースが、腫瘍ゲノムプロファイルを有する対象における治療介入の有効性の推定に有用であるステップを含む方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、複数は、少なくとも５０、少なくとも５００または少なくとも５０００である。一部の実施形態では、腫瘍ゲノム検査データは、連続的生検、無細胞ＤＮＡ、無細胞ＲＮＡまたは循環腫瘍細胞により収集される。一部の実施形態では、検出された遺伝子バリアントの相対頻度は、処置有効性の分類に使用される。一部の実施形態では、体重、有害処置効果、組織学的検査、血液検査、Ｘ線検査情報、以前の処置および癌型が挙げられるが、これらに限定されない、追加的な情報が、処置有効性の分類に役立つように使用される。一部の実施形態では、患者当たりの処置応答が、追加的な検査により定量的に収集および分類される。一部の実施形態では、追加的な検査は、血液または尿に基づく検査である。
ある態様では、癌を有する対象のための１種または複数の有効な治療介入を識別するためのデータベースの使用を含む方法であって、データベースが、癌を有する複数の対象のそれぞれに対して、対象につき２つまたはそれを超える時間間隔で収集された体細胞変化を含む腫瘍ゲノム検査データ、１つまたは複数の時間で対象のそれぞれに投与された１種または複数の治療介入、および治療介入の有効性を含む方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、識別された治療介入は、有効性によって層別化される。一部の実施形態では、予測される治療介入有効性またはその欠如に関する定量的限界が報告される。一部の実施形態では、治療介入は、処置に応答する同様の患者における予測される腫瘍ゲノム進化または獲得された抵抗性機構の情報を使用する。
一部の実施形態では、本方法は、分類アルゴリズム、例えば、線形回帰プロセス（例えば、多重線形回帰（ＭＬＲ）、部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰および主成分回帰（ＰＣＲ））、二分決定木（例えば、ＣＡＲＴ－分類および回帰ツリー等、再帰分割プロセス）、誤差逆伝搬（back propagation）ネットワーク等の人工のニューラルネットワーク、判別分析（例えば、ベイジアン分類子またはフィッシャー分析）、ロジスティック分類子およびサポートベクター分類子（例えば、サポートベクターマシン）を使用して、処置の有効性を分類するステップを含む。
ある態様では、１つまたは複数の遺伝子検査の結果を報告するための方法であって、遺伝子分析計を使用して、１つまたは複数の検査ポイントにわたる遺伝子バリアントおよびその定量的測定値を含む遺伝子情報を捕捉するステップと、１つまたは複数の検査ポイントによるレンダリングのために定量的測定値を正規化し、スケールファクターを生成するステップと、腫瘍応答マップをレンダリングするためにスケールファクターを適用するステップと、遺伝子バリアントの要約を生成するステップとを含む方法が本明細書に開示されている。一部の実施形態では、本方法は、非ＣＮＶ（コピー数バリエーション）変異体対立遺伝子頻度を分析するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、腫瘍応答マップをレンダリングするために絶対値を相対計量値へと変換するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、変異体対立遺伝子頻度に既定値を乗じ、その対数を取るステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、各遺伝子についてスケールファクターに変換値を乗じて、腫瘍応答マップ上にレンダリングされる量インジケータを決定するステップと、視覚的パネル上に各変化について特有の視覚的インジケータを割り当てるステップとを含む。一部の実施形態では、本方法は、連続性を示す隣接して置かれたパネルにおける量インジケータをＹセンタリングまたは垂直方向にセンタリングするステップを含む。一部の実施形態では、割り当てるステップは、各変化について特有の色を与えるステップをさらに含む。
一部の実施形態では、本方法は、別の検査ポイントまたは検査時由来の遺伝子情報を分析するステップを含む。一部の実施形態では、新たな検査結果が、以前の検査結果と異ならない場合、本方法は、以前の視覚的パネルをレンダリングするステップを含む。一部の実施形態では、変化が同じままであるが、量が変化した場合、本方法は、順序および各変化について特有の視覚的インジケータを維持するステップと、新たな量インジケータを決定し、全検査ポイントに対して新たな視覚的パネルを生成するステップとを含む。一部の実施形態では、本方法は、遺伝子情報における新たな変化を決定し、この変化を現存する変化の最上位に加えるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、遺伝子情報における新たな変化を決定し、新たな変換値およびスケールファクターを決定し、新たな各変化について特有の視覚的インジケータを割り当てるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、遺伝子情報における新たな変化を決定し、現在の検査ポイントにおいて依然として検出される以前の検査ポイント由来の変化および新たな変化を含む腫瘍応答マップを再度生成するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、以前の変化がもはや存在しないか決定するステップを含み、そうである場合、その後の検査ポイントのために以前の変化の、変化の量をレンダリングする際に、ゼロの高さを使用するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、以前の変化がもはや存在しないか決定するステップと、そうである場合、将来の使用のために以前の変化に関連する特有の視覚的インジケータを保留するステップとを含む。
一部の実施形態では、本方法は、ＣＮＶ変異体対立遺伝子頻度およびメチル化変異体対立遺伝子頻度を分析するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、先ず腫瘍応答マップにおけるレンダリングのための最大変異体対立遺伝子頻度のグループ分けを含む。一部の実施形態では、本方法は、変化の減少する変異体対立遺伝子頻度の順序で遺伝子の変化をレンダリングするステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、減少する順序で遺伝子の変化をレンダリングするステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、次に高い変異体対立遺伝子頻度を有する次の遺伝子を選択するステップを含む。
一部の実施形態では、報告された各変化について、本方法は、異なる検査ポイントにわたる変化の傾向インジケータを生成するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、変化の要約を生成するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、処置選択肢の要約を生成するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、変異体対立遺伝子頻度、無細胞増幅、臨床承認適応症および臨床治験の要約を生成するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、生物学的経路に基づきパネルを生成するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、根拠レベルに基づきパネルを生成するステップを含む。一部の実施形態では、遺伝子情報は、一ヌクレオチド変異、コピー数バリエーション、挿入および欠失ならびに遺伝子再編成のうちの１種または複数を含む。一部の実施形態では、本方法は、検出された変化に基づき臨床関連性報告を生成するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、治療結果要約を生成するステップを含む。
ある態様では、遺伝子報告を生成するための方法であって、遺伝子分析計を使用して、非コピー数バリエーション（ＣＮＶ）データを生成するステップと、各非ＣＮＶ変異体対立遺伝子頻度についてスケールファクターを決定するステップと、第１の検査に対して、スケールファクターを使用して各非ＣＮＶ変化の視覚的パネルを生成するステップと、その後の検査のそれぞれに対して、スケールファクターを使用して視覚的パネルの非ＣＮＶ変化を変更するステップと、を含む方法が本明細書に提供される。
一部の実施形態では、本方法は、レンダリングのために絶対値を相対計量値へと変換するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、変異体対立遺伝子頻度に既定値を乗じ、既定値の対数を取るステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、最大観察値を使用してスケールファクターを決定するステップを含む。一部の実施形態では、各非ＣＮＶ変化について、本方法は、遺伝子バリアントを視覚化するための量インジケータとして、遺伝子バリアント毎にスケールファクターに変換値を乗じるステップを含む。
一部の実施形態では、本方法は、各変化について特有の視覚的インジケータを割り当てるステップを含む。一部の実施形態では、その後の検査に対して、検査結果が変化しない場合、本方法は、視覚的パネルを使用するステップを含む。一部の実施形態では、その後の検査において変化が同じままである場合、本方法は、順序および各変化について特有の視覚的インジケータを維持するステップと、該バリアントを視覚化するために量インジケータを再度算出し、現存するパネル（複数可）および最新の検査のための新たなパネルにおいて更新された値を再度レンダリングするステップとを含む。一部の実施形態では、新たな変化が、その後の検査において見出された場合、本方法は、変化を全ての現存する変化の最上位に加えるステップと、変換値およびスケールファクターを算出するステップと、新たな各変化について特有の視覚的インジケータを割り当てるステップとを含む。
一部の実施形態では、本方法は、以前の検査ポイントにおける変化および新たな変化を再度レンダリングするステップと、連続性を示す隣接して置かれたパネルにおける変化の画像を垂直方向にセンタリングするステップとを含む。一部の実施形態では、以前の変化が、その後の検査において存在しない場合、本方法は、その後のレンダリングのための変化の量としてゼロの高さを使用するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、変化変更に関連する対象または介入情報をレンダリングするステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、最大変異体対立遺伝子頻度を有する変化を識別するステップを含む。
一部の実施形態では、本方法は、非ＣＮＶ変化の減少する変異体対立遺伝子頻度の順序で該遺伝子の変化を報告するステップと、ＣＮＶ値の減少する順序で該遺伝子のＣＮＶ変化を報告するステップとを含む。一部の実施形態では、本方法は、次に高い非ＣＮＶ変異体対立遺伝子頻度を有する次の遺伝子を選択するステップであって、非ＣＮＶ変化の減少する変異体対立遺伝子頻度の順序で該遺伝子の変化を報告するステップと、ＣＮＶ値の減少する順序で該遺伝子のＣＮＶ変化を報告するステップとを含む。
一部の実施形態では、本方法は、異なる検査日にわたり変化の傾向インジケータをレンダリングするステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、最大変異体対立遺伝子頻度のグループ分けと、生物学的経路または根拠レベルを含む注釈の生成を含む。一部の実施形態では、本方法は、根拠レベルに基づきパネルを生成するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、生物学的経路に基づきパネルを生成するステップを含む。一部の実施形態では、遺伝子情報は、一ヌクレオチド変異、コピー数バリエーション、挿入および欠失ならびに遺伝子再編成のうちの１種または複数を含む。
ある態様では、ａ）対象由来の複数の核酸試料を提供するステップであって、試料が、連続的時点で収集されるステップと、ｂ）配列を作成生成するために試料由来のポリヌクレオチドを配列決定するステップと、ｃ）各試料におけるポリヌクレオチドの間で複数の遺伝子バリアントのそれぞれの定量的測定値を決定するステップと、ｄ）コンピュータにより、連続的時点の少なくとも１つにおいて非ゼロ量で存在する体細胞変異の各連続的時点における遺伝子バリアントの相対量をグラフ表示するステップと、を含む方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、定量的測定値は、同じ遺伝子座にマッピングされる全配列の間の遺伝子バリアントの頻度である。一部の実施形態では、相対量は、積み重ね面積グラフとして表される。一部の実施形態では、相対量は、最も早い時点において、最高から最低へと、グラフの下から上に積み重ねられ、後の時点において非ゼロ量で最初に出現する遺伝子バリアントは、グラフの最上位に積み重ねられる。一部の実施形態では、面積は、異なる色によって表される。一部の実施形態では、グラフ表示することは、時点毎に、優勢な遺伝子バリアントの定量的測定値をさらに示す。一部の実施形態では、グラフ表示することは、グラフ上に表される鍵となる識別用遺伝子バリアントをさらに含む。一部の実施形態では、グラフ表示することは、定量的測定値正規化すること、およびスケーリングすることを含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｃｆＤＮＡを含む。一部の実施形態では、遺伝子座は、癌遺伝子に位置する。一部の実施形態では、複数の遺伝子バリアントは、ゲノムにおける異なる遺伝子にマッピングされる。一部の実施形態では、複数の遺伝子バリアントは、ゲノムにおける同じ遺伝子にマッピングされる。一部の実施形態では、少なくとも１０種の異なる癌遺伝子が配列決定される。
一部の実施形態では、決定することは、コンピュータメモリへと配列を受け取ること、コンピュータプロセッサを使用して、ソフトウェアを実行して、定量的測定値を決定することを含む。一部の実施形態では、グラフ表示することは、コンピュータプロセッサを使用して、定量的測定値をグラフフォーマットに変換するソフトウェアを実行し、電子グラフィカル・ユーザー・インターフェース、例えば、表示画面上にグラフフォーマットを表すことを含む。
ある態様では、遺伝子分析計によって生成されたデータから書面または電子的患者検査報告を生成するための方法であって、ａ）２つまたはそれを超える検査時点由来のデータを要約するステップであって、それによって、全ての非ゼロ検査結果の結合が、第１の検査後のその後の検査ポイントのそれぞれにおいて報告されるステップと、ｂ）書面または電子的患者検査報告上に検査結果をレンダリングするステップとを含む方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、要約することおよびレンダリングすることは、コンピュータプロセッサによりコードを実行して、（ｉ）全ての非ゼロ検査結果を識別し、（ｉｉ）検査報告を生成し、（ｉｉｉ）グラフィカル・ユーザー・インターフェースに検査報告を表示することにより、コンピュータにおいて行われる。
ある態様では、遺伝子分析計によって生成されたデータから、対象における腫瘍の遺伝子バリアントの進化をグラフ表示する方法であって、ａ）コンピュータにより、対象における複数の時点のそれぞれにおいて検出された遺伝子バリアントの積み重ねられた表示を生成するステップであって、遺伝子バリアントに対応する積み重ねにおける各層の高さまたは幅が、各時点における遺伝子バリアントの総量に対する遺伝子バリアントの定量的寄与を表すステップと、ｂ）コンピュータのモニタまたは書面の報告上に積み重ねられた表示を表示するステップと、を含む方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、本方法は、疾患負荷を推量推定するために体液に基づく検査において検出された遺伝子バリアントの規模の組合せを使用するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、疾患負荷を推量推定するために、検出された変異の対立遺伝子フラクション、対立遺伝子不均衡、遺伝子特異的カバレージを使用するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、全体的な積み重ねの高さは、対象における全体的な疾患負荷または疾患負荷スコアの表示である。一部の実施形態では、別個の色を使用して、各遺伝子バリアントを表す。一部の実施形態では、検出された遺伝子バリアントのサブセットのみが、プロットされる。一部の実施形態では、サブセットは、ドライバー変化である見込みまたは処置に対する応答の増加もしくは低減との関連に基づき選択される。
一部の実施形態では、本方法は、ゲノム検査に関する検査報告を生成するステップを含む。一部の実施形態では、非線形スケールが、表された遺伝子バリアントのそれぞれの高さまたは幅を表すために使用される。一部の実施形態では、以前の検査ポイントのプロットが、報告上に描写される。一部の実施形態では、本方法は、各検査結果の変化の速度および／または定量的精度に基づき疾患進行または寛解を推定するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、介在する検査ポイントの間に治療介入を表示するステップを含む。一部の実施形態では、表示するステップは、ａ）検出された腫瘍遺伝子バリアントを表すデータをコンピュータメモリへと受け取るステップと、ｂ）コンピュータプロセッサによりコードを実行するステップであって、時点における各遺伝子バリアントの定量的寄与を、相対寄与に比例する線または面積としてグラフ表示するステップと、ｃ）グラフィカル・ユーザー・インターフェース上にグラフ表示を表示するステップとを含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）対象の生物学的試料由来の癌細胞からのポリヌクレオチドを配列決定するステップと、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドにおける体細胞変異を識別および定量化するステップと、
（ｃ）前記ポリヌクレオチドにおける複数の前記体細胞変異の存在および相対量を示す、前記対象における腫瘍不均一性のプロファイルを展開するステップであって、異なる相対量が、腫瘍不均一性を示すステップと、
（ｄ）前記腫瘍不均一性を示す癌のための治療介入を決定するステップであって、前記治療介入が、決定された腫瘍不均一性の前記プロファイルを有する癌に対して有効であるステップと
を含む方法。
（項目２）
配列決定によって生成された配列読み取り値が、識別および定量化前にノイズ低減に付される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記治療介入を決定するステップが、腫瘍関連の遺伝子変化の相対頻度を考慮に入れる、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記治療介入が、組み合わせてまたは順次、複数の薬物を投与することを含み、各薬物が、異なる相対頻度で生じる体細胞変異の異なる１種を提示する癌に対して相対的により有効である、項目１に記載の方法。
（項目５）
より高い相対頻度で生じる体細胞変異を提示する癌に対して相対的により有効な薬物が、より多い量で投与される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記薬物が、ＤＮＡにおけるバリアントの相対量を反映するように層別化された用量で送達される、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記遺伝子バリアントのうちの少なくとも１種を提示する癌が、前記薬物のうちの少なくとも１種に対し抵抗性である、項目４に記載の方法。
（項目８）
前記治療介入を決定するステップが、前記癌の起源の組織を考慮に入れる、項目１に記載の方法。
（項目９）
腫瘍不均一性が推定され得る腫瘍プロファイルを有する癌を有する対象に、治療介入を提供するステップであって、前記治療介入が、前記腫瘍プロファイルを有する癌に対して有効であるステップを含む方法。
（項目１０）
前記腫瘍プロファイルが、複数のさらなる体細胞変異の相対頻度を示す、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記対象における前記相対頻度の変化を経時的にモニタリングするステップ、および前記変化に基づき異なる治療介入を経時的に決定するステップをさらに含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記治療介入が、前記体細胞変異の全てではなくいずれか１種を提示する癌に対するよりも、前記体細胞変異のそれぞれを提示する癌に対して有効である、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記治療介入が、組み合わせてまたは順次、複数の薬物を投与することを含み、各薬物が、異なる相対頻度で生じる体細胞変異の異なる１種を提示する癌に対して相対的により有効である、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
腫瘍不均一性を示す腫瘍に対して有効な治療介入を対象に投与するステップであって、前記治療介入が、ポリヌクレオチドにおける複数の体細胞変異の存在および相対量を示す、前記対象における腫瘍不均一性のプロファイルに基づき、異なる相対量が、腫瘍不均一性を示すステップを含む方法。
（項目１５）
コンピュータプロセッサによる実行により、
（ａ）遺伝子座にマッピングされるポリヌクレオチドの配列読み取り値をメモリに受け取るステップと、
（ｂ）前記配列読み取り値の間で、遺伝子座にマッピングされる総ての数の配列読み取り値の、前記遺伝子座における参照配列の塩基とは異なる塩基の同一性を決定するステップと、
（ｃ）決定された塩基の前記同一性および相対量ならびにゲノムにおけるその位置を報告するステップと
（ｄ）（ｃ）における情報に基づき、所定の試料の不均一性を推定するステップと
を含む方法を実装する機械実行可能コードを含むコンピュータ可読媒体を含むシステム。
（項目１６）
実装される前記方法が、複数の異なる時点における試料に由来する配列読み取り値をメモリに受け取るステップ、および２種の試料の間の複数の塩基の相対量および同一性における差を計算するステップをさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
第１の医薬物および第２の医薬物を含むキットであって、前記第１の薬物および前記第２の薬物の組合せが、体細胞変異の全てではなくいずれか１種を提示する癌に対するよりも、第１および第２の体細胞変異を提示する癌に対して治療上有効であるキット。
（項目１８）
前記組合せが、混合物中に含有されるか、または各薬物が、別々の容器内に含有される、項目１７に記載のキット。
（項目１９）
（ａ）対象由来の疾患細胞（例えば、空間的に別個の疾患細胞）由来の生体分子ポリマーの生体分子分析を行うステップと、
（ｂ）前記生体高分子における生体分子バリアントを識別および定量化するステップと、（ｃ）前記生体高分子における複数の前記バリアントの存在および相対量を示す、前記対象における疾患細胞不均一性のプロファイルを展開するステップであって、異なる相対量が、疾患細胞不均一性を示すステップと、
（ｄ）前記疾患細胞不均一性を示す疾患のための治療介入を決定するステップであって、前記治療介入が、決定された疾患細胞不均一性の前記プロファイルを有する疾患に対して有効であるステップと
を含む方法。
（項目２０）
対象における疾患細胞不均一性を検出する方法であって、
ａ）前記対象由来の試料からのポリヌクレオチドにおける複数の遺伝子座のそれぞれに配列バリアントを有するポリヌクレオチドを定量化するステップであって、前記試料が、体細胞および疾患細胞由来のポリヌクレオチドを含むステップと、
ｂ）各々の遺伝子座について、前記配列バリアントを有するポリヌクレオチドのコピー数バリエーション（ＣＮＶ）の測定値を決定するステップと、
ｃ）各々の遺伝子座について、前記遺伝子座におけるＣＮＶの関数として、前記遺伝子座に配列バリアントを有するポリヌクレオチドの量の加重された測定値を決定するステップと、
ｄ）前記複数の遺伝子座のそれぞれにおける前記加重された測定値を比較するステップとを含み、異なる加重された測定値が、疾患細胞不均一性を示す方法。
（項目２１）
ａ）１回または複数のパルス化治療サイクルに対象を付すステップであって、各パルス化治療サイクルが、（ｉ）１種または複数の薬物が第１の量で投与される第１の期間および（ｉｉ）前記１種または複数の薬物が第２の低減された（例えば、完全に投与されない）量で投与される第２の期間を含み、
（Ａ）前記第１の期間が、第１の臨床レベルを上回って検出される腫瘍負荷によって特徴付けられ、
（Ｂ）前記第２の期間が、第２の臨床レベルを下回って検出される腫瘍負荷によって特徴付けられるステップ
を含む方法。
（項目２２）
１種または複数の薬物が、複数の薬物であり、各サイクルにおける各薬物の各量が、腫瘍ポリヌクレオチドにおける複数の異なる選択された体細胞バリアントのそれぞれの量の関数として測定された腫瘍負荷に応じて決定される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
ｂ）前記対象が、前記１種または複数の薬物に対し抵抗性を示す場合、１回または複数のパルス化治療サイクルに前記対象を付すステップであって、各パルス化治療サイクルが、（ｉ）異なる１種または複数の薬物が第１の量で投与される第１の期間および（ｉｉ）前記異なる１種または複数の薬物が第２の低減された（例えば、完全に投与されない）量で投与される第２の期間を含み、
（Ａ）前記第１の期間が、第１の臨床レベルを上回って検出される腫瘍負荷によって特徴付けられ、
（Ｂ）前記第２の期間が、第２の臨床レベルを下回って検出される腫瘍負荷によって特徴付けられるステップ
をさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
（ａ）対象由来の癌細胞由来のポリヌクレオチドを配列決定するステップと、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドにおける体細胞変異を識別および定量化するステップと、
（ｃ）腫瘍不均一性を示す癌に有効な治療介入の決定における使用のための、前記対象における腫瘍不均一性のプロファイルを展開するステップであって、前記プロファイルが、前記ポリヌクレオチドにおける複数の前記体細胞変異の存在および相対量を示し、異なる相対量が、腫瘍不均一性を示すステップと
を含む方法。
（項目２５）
対象に治療介入を提供するステップであって、前記治療介入が、前記対象における疾患細胞不均一性のプロファイルから決定され、前記プロファイルが、ポリヌクレオチドにおける複数の体細胞変異の存在および相対量を示し、異なる相対量が、疾患細胞不均一性を示し、前記治療介入が、決定された疾患細胞不均一性の前記プロファイルを有する疾患に対して有効である、例えば、前記体細胞変異の全てではなくいずれか１種を提示する疾患に対するよりも、前記複数の体細胞変異を提示する疾患に対して有効であるステップを含む方法。
（項目２６）
ａ）ゲノムの少なくとも１ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１ｍｂ、少なくとも１０ｍｂまたは少なくとも１００ｍｂの領域にわたり、試料におけるポリヌクレオチドにおけるコピー数の中心傾向の値からの偏差の測定値（例えば、標準偏差、分散）を決定するステップと、
ｂ）前記偏差の測定値に基づき、前記試料における細胞分裂を行っている細胞由来のＤＮＡの負荷の測定値を推定するステップと
を含む方法。
（項目２７）
前記中心傾向の値が、平均値、中央値または最頻値である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記決定するステップが、前記領域を複数の非重複区間にパーティション化し、各区間におけるコピー数の測定値を決定し、各区間におけるコピー数の測定値に基づき前記偏差の測定値を決定することを含む、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記区間が、１塩基、１０塩基、１００塩基、１ｋｂ塩基または１０ｋｂのいずれか以下である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
試料における細胞分裂を行っている細胞由来のＤＮＡの負荷の測定値を推定する方法であって、細胞の複製起点への１種または複数のゲノム遺伝子座の近接によって誘導されるコピー数バリエーションを測定するステップを含み、ＣＮＶ増加が、細胞分裂を行っている細胞を示す方法。
（項目３１）
複製起点に近接していることに起因するバリエーションの影響を和らげることにより、遺伝子関連のコピー数バリエーションの決定の感度および／または特異性を増加させる方法。
（項目３２）
ａ）１種または複数の対照試料由来の１種または複数の遺伝子座におけるＤＮＡ分子のコピーのベースライン測定値を決定するステップであって、前記遺伝子座のうちの１種または複数が、複製起点を含み、それぞれ、既定のレベルの細胞分裂を行っている細胞由来のＤＮＡを含有するステップと、
ｂ）被験試料におけるＤＮＡ分子の被験測定値を決定するステップであって、被験試料における前記測定値が、１種または複数のパーティションされる１種または複数の遺伝子座に由来し、前記遺伝子座のうちの１種または複数が、複製起点を含むステップと、
ｃ）前記被験測定値および前記ベースライン測定値を比較するステップであって、ベースライン測定値を上回る被験測定値が、前記対照試料にＤＮＡを提供する細胞よりも速い速度で分裂している細胞由来の前記被験試料におけるＤＮＡを示すステップと
を含む方法。
（項目３３）
前記測定値が、分子計数値、区画にわたる分子計数値の中心傾向の測定値、または区画にわたる分子計数値の変異の測定値から選択される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
（ａ）対象の循環における腫瘍由来のＤＮＡの量を増加させる介入を前記対象に投与するステップと、
（ｂ）前記量が増加した場合、前記対象から腫瘍由来のＤＮＡを含有する試料を収集するステップと
を含む方法。
（項目３５）
データベースをコンパイルするステップであって、前記データベースが、癌を有する複数の対象のそれぞれに対して、対象につき２つまたはそれを超える時間間隔で収集された体細胞変化を含む腫瘍ゲノム検査データ、１つまたは複数の時点で前記対象のそれぞれに投与された１種または複数の治療介入、および前記治療介入の有効性を含み、前記データベースが、腫瘍ゲノムプロファイルを有する対象における前記治療介入の有効性を推定す
るために有用であるステップを含む方法。
（項目３６）
癌を有する対象のための１種または複数の有効な治療介入を識別するためのデータベースの使用を含む方法であって、前記データベースが、癌を有する複数の対象のそれぞれに対して、対象につき２つまたはそれを超える時間間隔で収集された体細胞変化を含む腫瘍ゲノム検査データ、１つまたは複数の時点で前記対象のそれぞれに投与された１種または複数の治療介入、および前記治療介入の有効性を含む、方法。
（項目３７）
識別された治療介入が、有効性によって層別化される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
予測される治療介入有効性またはその欠如に関する定量的限界が報告される、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記治療介入が、処置に応答する同様の患者における予測される腫瘍ゲノム進化または獲得された抵抗性機構の情報を使用する、項目３６に記載の方法。
（項目４０）
１つまたは複数の遺伝子検査の結果を報告するための方法であって、
遺伝子分析計を使用して、１つまたは複数の検査ポイントにわたる遺伝子バリアントおよびその定量的測定値を含む遺伝子情報を捕捉するステップと、
前記１つまたは複数の検査ポイントによりレンダリングするために前記定量的測定値を正規化し、そしてスケールファクターを生成するステップと、
前記スケールファクターを適用して、腫瘍応答マップをレンダリングするステップと、
遺伝子バリアントの要約を生成するステップと
を含む方法。
（項目４１）
非ＣＮＶ（コピー数バリエーション）変異体対立遺伝子頻度を分析するステップを含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
遺伝子報告を生成するための方法であって、
遺伝子分析計を使用して、非コピー数バリエーション（ＣＮＶ）データを生成するステップと、
各非ＣＮＶ変異体対立遺伝子頻度についてスケールファクターを決定するステップと、
第１の検査に対して、前記スケールファクターを使用して、各非ＣＮＶ変化の視覚的パネルを生成するステップと、
その後の検査のそれぞれに対して、前記スケールファクターを使用して、前記視覚的パネルのために前記非ＣＮＶ変化における変更を生成するステップと
を含む方法。
（項目４３）
ａ）対象由来の複数の核酸試料を提供するステップであって、前記試料が、連続的時点で収集されるステップと、
ｂ）前記試料由来のポリヌクレオチドを配列決定するステップであって、配列を生成するステップと、
ｃ）各試料における前記ポリヌクレオチドの間で複数の遺伝子バリアントのそれぞれの定量的測定値を決定するステップと、
ｄ）コンピュータにより、前記連続的時点のうちの少なくとも１つにおいて非ゼロ量で存在する体細胞変異に関して、連続的時点の各々における遺伝子バリアントの相対量をグラフ表示するステップと
を含む方法。
（項目４４）
前記定量的測定値が、同じ遺伝子座にマッピングされる全配列の間の前記遺伝子バリアントの頻度である、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記相対量が、積み重ね面積グラフとして表される、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
前記相対量が、最も早い時点において、最高から最低へと、前記グラフの下から上に積み重ねられ、後の時点において非ゼロ量で最初に出現する遺伝子バリアントが、前記グラフの最上位に積み重ねられる、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
遺伝子分析計によって生成されたデータから書面または電子的患者検査報告を生成するための方法であって、
ａ）２つまたはそれを超える検査時点由来のデータを要約するステップであって、それによって、全ての非ゼロ検査結果の結合が、第１の検査後のその後の検査ポイントのそれぞれにおいて報告されるステップと、
ｂ）前記書面または電子的患者検査報告上に前記検査結果をレンダリングするステップとを含む方法。
（項目４８）
要約するステップおよびレンダリングするステップが、コンピュータプロセッサによりコードを実行して、（ｉ）全ての非ゼロ検査結果を識別し、（ｉｉ）前記検査報告を生成し、（ｉｉｉ）グラフィカル・ユーザー・インターフェース上に前記検査報告を表示することにより、コンピュータにおいて行われる、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
遺伝子分析計によって生成されたデータから、対象における腫瘍の遺伝子バリアントの進化をグラフ表示する方法であって、
ａ）コンピュータによって、前記対象における複数の時点のそれぞれにおいて検出される遺伝子バリアントの積み重ねられた表示を生成するステップであって、遺伝子バリアントに対応する前記積み重ねにおける各層の高さまたは幅が、各時点における遺伝子バリアントの総量に対する前記遺伝子バリアントの定量的寄与を表すステップと、
ｂ）コンピュータモニタまたは書面の報告上に前記積み重ねられた表示を表示するステップと
を含む方法。
（項目５０）
表示するステップが、
ａ）検出された腫瘍遺伝子バリアントを表すデータをコンピュータメモリに受け取ることと、
ｂ）コンピュータプロセッサによりコードを実行することであって、ある時点における各遺伝子バリアントの定量的寄与を、相対寄与に比例する線または面積としてグラフ表示することと、
ｃ）グラフィカル・ユーザー・インターフェース上に前記グラフ表示を表示することと
を含む、項目４９に記載の方法。
図１は、治療介入の決定および使用の例示的な方法のフローチャートを示す。
図２は、遺伝子座でのＣＮＶに基づいて補正した試料中のバリアントの頻度を決定する例示的方法のフローチャートを示す。
図３は、薬物抵抗性を遅らせることができるパルス化治療サイクルを提供する例示的方法のフローチャートを示す。
図４は、分裂細胞からＤＮＡを検出するために複製の起点でのＣＮＶを使用して腫瘍負荷を検出する例示的方法のフローチャートを示す。
図５は、例示的なコンピュータシステムを示す。
図６は、静止状態および細胞分裂状態の細胞を含有する試料からのゲノムの領域全体のＣＮＶの例示的なスキャンを示す。ゲノムＣＮＶは遺伝子座ａおよびｂで見られないが、遺伝子座ｃは遺伝子重複を示す。静止状態の細胞では、コピー数は、遺伝子重製の遺伝子座で重複している区間以外は、領域中の全ての区間で比較的等しい。細胞分裂中の腫瘍細胞からのＤＮＡを含有する試料では、コピー数は複製の起点の直後から増加するようであり、領域にわたってＣＮＶの変動を提供する。複製の起点（ｃ）でＣＮＶを示す遺伝子座で、偏差は特に劇的である。
図７は、例示的な、対象の疾患のモニタリングおよび処置の経過を示す。
図８は、癌で遺伝子バリエーションを示す７０個の遺伝子の例示的なパネルを示す。
図９Ａは、癌検査結果を通信するための例示的なシステムを示す。
図９Ｂは、ＤＮＡ配列読み取り値の誤り率および偏りを低減し、ユーザーのために遺伝子の報告を生成するための例示的な過程を示す。
図１０Ａ～１０Ｃは、遺伝子検査結果をユーザーに報告するための例示的な過程を示す。 図１０Ａ～１０Ｃは、遺伝子検査結果をユーザーに報告するための例示的な過程を示す。 図１０Ａ～１０Ｃは、遺伝子検査結果をユーザーに報告するための例示的な過程を示す。
図１０Ｄ～１０Ｉ－２は、例示的な遺伝子検査報告書からのページを示す。 図１０Ｄ～１０Ｉ－２は、例示的な遺伝子検査報告書からのページを示す。 図１０Ｄ～１０Ｉ－２は、例示的な遺伝子検査報告書からのページを示す。 図１０Ｄ～１０Ｉ－２は、例示的な遺伝子検査報告書からのページを示す。 図１０Ｄ～１０Ｉ－２は、例示的な遺伝子検査報告書からのページを示す。 図１０Ｄ～１０Ｉ－２は、例示的な遺伝子検査報告書からのページを示す。 図１０Ｄ～１０Ｉ－２は、例示的な遺伝子検査報告書からのページを示す。 図１０Ｄ～１０Ｉ－２は、例示的な遺伝子検査報告書からのページを示す。 図１０Ｄ～１０Ｉ－２は、例示的な遺伝子検査報告書からのページを示す。 図１０Ｄ～１０Ｉ－２は、例示的な遺伝子検査報告書からのページを示す。 図１０Ｄ～１０Ｉ－２は、例示的な遺伝子検査報告書からのページを示す。 図１０Ｄ～１０Ｉ－２は、例示的な遺伝子検査報告書からのページを示す。 図１０Ｄ～１０Ｉ－２は、例示的な遺伝子検査報告書からのページを示す。 図１０Ｄ～１０Ｉ－２は、例示的な遺伝子検査報告書からのページを示す。 図１０Ｄ～１０Ｉ－２は、例示的な遺伝子検査報告書からのページを示す。 図１０Ｄ～１０Ｉ－２は、例示的な遺伝子検査報告書からのページを示す。 図１０Ｄ～１０Ｉ－２は、例示的な遺伝子検査報告書からのページを示す。
図１０Ｊ～１０Ｐは、様々な例示的な改変されたストリームグラフを示す。 図１０Ｊ～１０Ｐは、様々な例示的な改変されたストリームグラフを示す。 図１０Ｊ～１０Ｐは、様々な例示的な改変されたストリームグラフを示す。 図１０Ｊ～１０Ｐは、様々な例示的な改変されたストリームグラフを示す。 図１０Ｊ～１０Ｐは、様々な例示的な改変されたストリームグラフを示す。 図１０Ｊ～１０Ｐは、様々な例示的な改変されたストリームグラフを示す。 図１０Ｊ～１０Ｐは、様々な例示的な改変されたストリームグラフを示す。
図１１Ａ～１１Ｂは、変異を検出して、検査結果をユーザーに報告するための例示的な過程を示す。 図１１Ａ～１１Ｂは、変異を検出して、検査結果をユーザーに報告するための例示的な過程を示す。
（詳細な説明）
本開示の方法は、細胞の不均一ゲノム集団またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）等、生物学的試料における生体分子モザイク現象（例えば、遺伝子モザイク現象）を検出することができる。遺伝子モザイク現象は、生物レベルで存在し得る。例えば、発生初期に生じる遺伝子バリアントは、異なるゲノムを有する異なる体細胞をもたらし得る。個体は、例えば、２個の接合子の融合によって産生されるキメラであり得る。同種異系ドナーからの臓器移植は、遺伝子モザイクをもたらし得、これは、移植された臓器から血液へと脱落するポリヌクレオチドを試験することによっても検出され得る。罹患細胞が異なる遺伝子バリアントを有する疾患細胞不均一性は、遺伝子モザイク現象の別の形態である。本明細書に提供される方法は、モザイク現象を検出することができ、疾患の場合は、治療介入を提供することができる。ある特定の実施形態では、本開示は、対象の身体の多様な位置における細胞に由来する、さもなければそれに起源をもつ可能性がある循環ポリヌクレオチドの使用により、生体分子モザイク現象の全身に及ぶプロファイリングを行うための方法を提供する。
腫瘍等、罹患細胞は、経時的に進化し、新たな遺伝子および表現型的特徴を有する異なるクローン性亜集団をもたらすことができる。これは、細胞が分裂する際の天然の変異に起因し得るか、あるいは、処置に対しクローンをより抵抗性にして負の選択によって増殖させる、ある特定のクローン性亜集団を標的とする処置によって駆動され得る。異なる遺伝子型または表現型的特徴を有する罹患細胞の亜集団の存在は、本明細書において疾患細胞不均一性と称されるか、または癌の場合は、腫瘍不均一性と称される。
現在、癌は、癌生検に見出されるバリアント型に基づき処置されている。例えば、少量であっても乳癌細胞のＨｅｒ２＋の発見は、乳癌を示すことができ、これは、抗Ｈｅｒ２＋治療法を使用した処置を遂行することができる。別の例として、少量のＫＲＡＳバリアントが見出される結腸直腸癌は、ＫＲＡＳが応答性である治療法で処置することができる。
罹患細胞（例えば、腫瘍）の細密な分析のためのツールは、疾患細胞不均一性の検出を可能にする。さらに、身体の至る所に位置する罹患細胞から供給されるポリヌクレオチドの分析は、疾患細胞不均一性の全身プロファイルを可能にする。血液中のポリヌクレオチドは、身体的に局在した細胞から供給される訳ではないため、無細胞ＤＮＡまたは循環ＤＮＡの使用は、特に強力である。むしろ、これらは、身体の至る所の転移性部位由来の細胞を含む。例えば、分析は、乳癌細胞の集団が、Ｈｅｒ２＋の９０％と、Ｈｅｒ２－の１０％を含むことを示すことができる。これは、例えば、試料における形態毎にＤＮＡ、例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を定量化し、これにより、腫瘍における不均一性を検出することにより、決定することができる。
医療提供者、例えば、医者はこの情報を使用して、治療介入を開発することができる。例えば、不均一な腫瘍を有する対象は、あたかも２種の腫瘍を有しているかのように処置することができ、治療介入は、腫瘍のそれぞれを処置することができる。治療介入は、例えば、第１の腫瘍型に対して有効な第１の薬物と、第２の腫瘍型に対して有効な第２の薬物とを含む併用療法を含むことができる。薬物は、検出された変異体型の相対量を反映する量を与えることができる。例えば、より多い相対量で見出される変異体型を処置するための薬物は、より少ない相対量のバリアント型を処置するための薬物よりも多い用量で送達することができる。あるいは、より少ない相対量のバリアントのための処置は、より多い量のバリアントに対して遅延またはずらすことができる。
疾患細胞不均一性のプロファイルの経時的な変化のモニタリングは、治療介入を、進化する腫瘍に対して較正させる。例えば、分析は、薬物抵抗性変異体を有する増加する量のポリヌクレオチドを示すことができる。この場合、治療介入は、抵抗性変異体を有さない腫瘍の処置に有効な薬物の量を減少させ、抵抗性マーカーを有する腫瘍を処置する薬物の投与を増加させるように修飾することができる。
治療介入は、医療提供者もしくはコンピュータアルゴリズムまたはこれら２種の組合せによって決定され得る。データベースは、疾患細胞不均一性の様々なプロファイルを有する疾患に対する治療介入の結果を含有することができる。データベースは、特定のプロファイルを有する疾患のための治療介入の決定において閲覧することができる。
本開示は、とりわけ、疾患細胞不均一性、例えば、腫瘍不均一性を示す、癌等の疾患を有する対象のための治療介入を決定する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、疾患を有する対象由来の疾患細胞（例えば、空間的に別個の疾患細胞）の生物学的高分子を分析するステップ（例えば、ポリヌクレオチドを配列決定するステップ）を伴う。疾患細胞に特異的な遺伝子バリアントの存在および互いに対するこれらのバリアントの量を示す、疾患細胞不均一性のプロファイルが作製される。この情報は、続いて、このプロファイルを考慮に入れる治療介入の決定に使用される。
疾患細胞
本開示の方法の対象は、任意の多細胞生物である。より具体的には、対象は、植物または動物、脊椎動物、哺乳動物、マウス、霊長類、サルまたはヒトであってよい。動物として、家畜、競技用（sport）動物およびペットが挙げられるが、これらに限定されない。対象は、健康な個体、疾患もしくは疾患の素因を有するもしくはそれを有すると疑われる個体、または治療法を必要とするもしくは治療法を必要とすると疑われる個体であってよい。対象は、患者、例えば、専門家の医療提供者のケア下にある対象であってよい。
対象は、病態（疾患）を有し得る。疾患の病理を示す細胞は、本明細書において、疾患細胞と称される。
特に、疾患は、癌であってよい。癌は、制御不能で分裂する異常細胞によって特徴付けられる状態である。癌は、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫および中枢神経系癌を限定することなく含む。癌のより具体的な例は、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、脳癌、食道癌、頭頸部癌、膀胱癌、婦人科系の癌、脂肪肉腫および多発性骨髄腫である。
他の癌は、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、カポジ肉腫、肛門癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳癌、頭蓋咽頭腫、上衣芽細胞腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮腫（medulloeptithelioma）、松果体実質細胞腫瘍、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、カルチノイド腫瘍、子宮頸部癌、脊索腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、乳管内上皮内癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング肉腫、眼癌、眼球内メラノーマ、網膜芽細胞腫、線維性組織球腫、胆嚢癌、胃癌、神経膠腫、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、口唇癌、口腔癌、肺癌、非小細胞癌、小細胞癌、メラノーマ、口内（mouth）癌、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、髄芽腫、鼻腔癌、副鼻腔癌、神経芽細胞腫、鼻咽頭癌、口腔内（oral）癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腫、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞新生物、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、セザリー症候群、皮膚癌、非メラノーマ、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、腟癌、外陰部癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症および／またはウィルムス腫瘍を含む。
腫瘍は、癌細胞（癌疾患細胞）の集合である。これは、例えば、単一の細胞塊（例えば、固形腫瘍）内の細胞の集合、異なる転移性腫瘍部位（転移性腫瘍）由来の細胞の集合および拡散した腫瘍（例えば、循環腫瘍細胞）を含む。腫瘍は、単一の癌（例えば、結腸直腸癌）または複数の癌（例えば、結腸直腸癌および膵臓癌）の細胞を含むことができる。腫瘍は、単一の本来の体細胞または異なる体細胞に起源をもつ細胞を含むことができる。
ある特定の実施形態では、対象における疾患細胞は、空間的に別個である。細胞が、身体内で、例えば、異なる組織もしくは臓器、または同じ組織もしくは臓器において、少なくとも１ｃｍ、少なくとも２ｃｍ、少なくとも５ｃｍまたは少なくとも１０ｃｍ離れて位置する場合、疾患細胞は、空間的に別個である。癌の場合は、空間的に別個の癌細胞の例として、拡散した癌（白血病等）由来の癌細胞、異なる転移性部位における癌細胞、および少なくとも１ｃｍ離間した同じ腫瘍細胞塊由来の癌細胞が挙げられる。
疾患細胞負荷（例えば、「腫瘍負荷」）は、対象における疾患細胞の量の定量的測定値である。疾患細胞負荷の一測定値は、疾患生物学的高分子である、試料における総生物学的高分子のフラクションである、例えば、無細胞ポリヌクレオチドの試料における腫瘍ポリヌクレオチドの相対量である。例えば、第１の対象由来のｃｆＤＮＡが、１０％癌ポリヌクレオチドを有する場合、この対象は、１０％の無細胞腫瘍負荷を有すると言うことができる。第２の対象由来のｃｆＤＮＡが、５％癌ポリヌクレオチドを有する場合、第２の対象は、第１の対象の半分の無細胞腫瘍負荷を有すると言うことができる。疾患負荷の異なるレベルにもかかわらず、ある１つの個体における無細胞腫瘍負荷は、別の個体よりもはるかに高くまたは低くなり得るため、これらの測定値は、対象内基盤において、対象間基盤におけるよりもはるかに関連性がある。しかし、これらの測定値は、個体内の疾患負荷のモニタリングに非常に有効に使用することができ、例えば、５％から１５％への無細胞ＤＮＡ腫瘍負荷の増加は、疾患の有意な進行を示すことができる一方、１０％から１％への減少は、処置に対する部分的応答を示すことができる。
配列決定されるべきポリヌクレオチドは、空間的に別個の部位から供給され得る。これは、単一の腫瘍塊における異なる位置の生検から供給されるポリヌクレオチドを含む。これは、異なる転移性腫瘍部位における細胞から供給されるポリヌクレオチドも含む。細胞は、ポリヌクレオチドを血液中に脱落させ、血液中でこれは、無細胞ポリヌクレオチド（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ）として検出可能となる。無細胞ポリヌクレオチドは、尿等、他の体液中に見出すこともできる。したがって、ｃｆＤＮＡは、単一の腫瘍位置から供給されるＤＮＡよりも、疾患細胞集団全体にわたる腫瘍不均一性のより正確なプロファイルを提供する。身体における疾患細胞集団にわたる細胞から試料採取されたＤＮＡは、「疾患負荷ＤＮＡ」と称される、または癌の場合は、「腫瘍負荷ＤＮＡ」と称される。
腫瘍等、疾患細胞は、同じか、または同様の生体分子プロファイルを共有することができる。例えば、腫瘍は、１、２、３種またはそれを超える遺伝子バリアントを共有することができる。斯かるバリアントは、同じ層別化、例えば、最高頻度、２番目に高い頻度等を共有することができる。プロファイルは、同様の疾患細胞負荷、例えば、１５％以内、１０％以内、５％以内または２％以内の、例えば、ｃｆＤＮＡ負荷を共有することもできる。
分析物
本明細書において使用される場合、高分子は、単量体サブユニットから形成された分子である。生物学的高分子を形成する単量体サブユニットは、例えば、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖および脂肪酸を含む。生物学的高分子は、例えば、バイオポリマーおよび非ポリマー高分子を含む。
ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドのポリマーを含む高分子である。ポリヌクレオチドは、例えば、ポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含む。ポリペプチドは、アミノ酸のポリマーを含む高分子である。多糖は、単糖のポリマーを含む高分子である。脂質は、水と認識できるほどに相互作用しないという機能的特徴を共有する、例えば、脂肪、油およびホルモンを含む有機化合物の多様な群である。例えば、トリグリセリドは、３本の脂肪酸鎖から形成された脂肪である。
癌ポリヌクレオチド（例えば、癌ＤＮＡ）は、癌細胞に由来するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）である。癌ＤＮＡおよび／またはＲＮＡは、腫瘍、単離された癌細胞または生体液（例えば、唾液、血清、血液または尿）から、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または無細胞ＲＮＡの形態で抽出することができる。
無細胞ＤＮＡは、体液、例えば、血液または尿における、細胞の外側に位置するＤＮＡである。循環核酸（ＣＮＡ）は、血流中に見出される核酸である。血液中の無細胞ＤＮＡは、循環核酸の形態である。無細胞ＤＮＡは、自身のＤＮＡを血液中に脱落させる瀕死の細胞から生じると考えられる。空間的に別個の癌細胞は、ＤＮＡを血液等の体液中に脱落させるであろうことから、癌対象のｃｆＤＮＡは、典型的には、空間的に別個の癌細胞由来の癌ＤＮＡを含む。
生物学的試料
本開示の方法における分析のための分析物は、生物学的試料、例えば、生物学的高分子を含む試料に由来することができる。生物学的試料は、いずれかの臓器、組織または生体液に由来することができる。生物学的試料は、例えば、体液または固形組織試料を含むことができる。固形組織試料の例は、例えば、固形腫瘍生検に由来する腫瘍試料である。体液は、例えば、血液、血清、腫瘍細胞、唾液、尿、リンパ液、前立腺液、精漿、乳汁、痰、糞便および涙を含む。身体の多くの位置由来の斯かる細胞は、このような分子を体液中に脱落させることができるため、体液は、空間的に別個の疾患細胞由来の生物学的高分子の特に優れた供給源である。例えば、血液および尿は、無細胞ポリヌクレオチドの優れた供給源である。斯かる供給源由来の高分子は、局在した疾患細胞塊に由来する高分子よりも、罹患細胞のより正確なプロファイルを提供することができる。
体液試料における疾患ポリヌクレオチドの量は、増加し得る。斯かる増加は、疾患ポリヌクレオチドの検出感度を増加させることができる。一方法において、疾患細胞を溶解させ、そのＤＮＡを周囲の流体中に出させる、治療介入等の介入が対象に投与される。斯かる介入は、化学療法の投与を含むことができる。これは、対象の全身に、または腫瘍もしくは罹患臓器への方向づけ等、対象の身体の部分に、放射線または超音波を投与するステップを含むこともできる。介入の投与後に、また、流体中における疾患ポリヌクレオチドの量が増加した場合、流体試料が分析のために収集される。介入の投与および収集の間の間隔は、疾患ポリヌクレオチドが増加するのに十分なほど長くなることができるが、これが身体から排除されるほどには長くない。例えば、低用量の化学療法は、試料収集の約１週間前に投与することができる。
分析方法
本開示は、例えば、ゲノミクス、エピジェネティクス（例えば、メチル化）、ＲＮＡ発現およびプロテオミクスを含む、数種類の生体分子分析を企図する。ゲノム分析は、例えば、ＤＮＡ配列決定を使用した、例えば、遺伝子分析計によって行うことができる。メチル化分析は、例えば、メチル化塩基の変換と、続くＤＮＡ配列決定によって行うことができる。ＲＮＡ発現分析は、例えば、ポリヌクレオチドアレイハイブリダイゼーションによって行うことができる。プロテオミクス分析は、例えば、質量分析によって行うことができる。
本明細書において使用される場合、用語「遺伝子分析計」は、ＤＮＡ配列情報を生成するためのＤＮＡシーケンサーと、ＤＮＡ配列情報に関してバイオインフォマティクス分析を行うソフトウェアを含むコンピュータとを含むシステムを指す。バイオインフォマティクス分析は、配列データのアセンブル、生殖系列バリアント（例えば、ヘテロ接合性）および体細胞バリアント（例えば、癌細胞バリアント）のいずれか含む、試料における遺伝子バリアントの検出および定量化を限定することなく含むことができる。
分析方法は、遺伝子情報の生成および捕捉を含むことができる。遺伝子情報は、遺伝子配列情報、倍数性状態、１種または複数の遺伝子バリアントの同一性、およびバリアントの定量的測定値を含むことができる。用語「定量的測定値」は、絶対および相対測定値を含む量のいずれかの測定値を指す。定量的測定値は、例えば、数（例えば、計数値）、パーセンテージ、頻度、程度または閾値量であってよい。
ポリヌクレオチドは、本技術分野で公知のいずれかの方法によって分析することができる。典型的には、ＤＮＡシーケンサーは、次世代配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、４５４、Ｉｏｎ ｔｏｒｒｅｎｔ、ＳＯＬｉＤ）を用いる。配列分析は、少なくとも１００，０００、百万、１千万、１億または十億種のポリヌクレオチド分子のいずれかを同時に（または素早く連続して）配列決定する、大規模並列配列決定によって行うことができる。配列決定方法として、ハイスループット配列決定、ピロシーケンス、合成による配列決定、単一分子配列決定、ナノポア配列決定、半導体配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ＲＮＡ－Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、デジタル遺伝子発現（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代配列決定、合成による単一分子配列決定（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、大規模並列配列決定、クローナル単一分子アレイ（Ｓｏｌｅｘａ）、ショット癌配列決定、マクサム・ギルバートまたはサンガー配列決定、プライマーウォーキング、ＰａｃＢｉｏ、ＳＯＬｉＤ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｇｅｎｉｕｓ（ＧｅｎａｐＳｙｓ）またはナノポア（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ）プラットフォームを使用した配列決定、および他のいずれかの本技術分野で公知の配列決定方法を挙げることができるが、これらに限定されない。
ＤＮＡシーケンサーは、ＤＮＡの化学修飾と、続く特異的塩基の切断に基づくギルバートの配列決定方法を適用することができるか、またはジデオキシヌクレオチド鎖終結に基づくサンガーの技法を適用することができる。サンガー法は、その効率増加および低い放射能のため一般的になった。ＤＮＡシーケンサーは、ＤＮＡ増幅（ポリメラーゼ連鎖反応－ＰＣＲ）を必要としない技法を使用することができ、これにより、配列決定前の試料調製を迅速化し、誤りを低減する。加えて、配列決定データは、リアルタイムでの相補鎖におけるヌクレオチドの付加によって引き起こされる反応から収集される。例えば、ＤＮＡシーケンサーは、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）と呼ばれる方法を利用することができ、これによると、配列決定データは、蛍光色素を含有する、酵素によって相補鎖にヌクレオチドが付加される際に放射される光（カメラによって捕捉される）によって生成される。
ゲノムの配列決定は、目的のゲノムの部分に対し選択的であってよく、例えば、その部分に対するものであってよい。例えば、多くの遺伝子（およびこれらの遺伝子の変異体型）は、様々な癌に関連することが公知である。選択された遺伝子または遺伝子の部分の配列決定は、所望の分析に十分であり得る。目的の対象であるゲノム中の特異的な遺伝子座にマッピングされるポリヌクレオチドは、配列決定のために、例えば、配列捕捉または部位特異的増幅により単離することができる。
ヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ配列）は、未加工の配列読み取り値または未加工の配列読み取り値から推定される特有の分子計数値等の加工済の配列読み取り値を指すことができる。
配列決定から生成される配列読み取り値は、例えば、遺伝子バリアントを識別することを含む分析に付される。これは、配列バリアントを識別することと、各遺伝子座における塩基コールの数の定量化することとを含むことができる。定量化することは、例えば、特定の遺伝子座にマッピングされる読み取り値の数を計数することを伴うことができる。異なる遺伝子座における異なる数の読み取り値は、コピー数バリエーション（ＣＮＶ）を示すことができる。
試料における標的ポリヌクレオチドの数が、非標的ポリヌクレオチドと比較して小さい場合、ノイズおよび歪みを低減する配列決定およびバイオインフォマティクス方法が特に有用である。標的分子の数が少ない場合、標的由来のシグナルは弱くなり得る。例えば、少数の腫瘍ポリヌクレオチドが、健康な細胞由来のはるかに多数のポリヌクレオチドと混合され得る無細胞ＤＮＡの場合、これが問題となり得る。分子追跡方法は、斯かる状況下で有用となり得る。分子追跡は、配列決定プロトコールから、読み取り値が由来する本来の試料（例えば、増幅および／または配列決定前の）における分子へと遡った配列読み取り値の追跡を伴う。ある特定の方法は、本来の分子から生成された複数の配列読み取り値を、本来の分子に由来する配列のファミリーへとグループ分けすることができるような仕方での分子のタグ付けを伴う。このようにして、ノイズを表す塩基コールをフィルタリング除去することができる。斯かる方法は、例えば、ＷＯ２０１３／１４２３８９（Schmittら）、ＵＳ２０１４／０２２７７０５（Vogelsteinら）およびＷＯ２０１４／１４９１３４（Talasazら）においてより詳細に記載されている。アップサンプリング（Up-sampling）方法も、試料における分子の計数値をより正確に決定するのに有用である。一部の実施形態では、アップサンプリング方法は、両方の鎖（ワトソン・クリック鎖）が検出される個々のＤＮＡ分子の定量的測定値を決定するステップと、一方のＤＮＡ鎖のみが検出される個々のＤＮＡ分子の定量的測定値を決定するステップと、これらの測定値から、どちらの鎖も検出されなかった個々のＤＮＡ分子の定量的測定値を推定するステップと、これらの測定値を使用するステップであって、試料における多数の個々の二本鎖ＤＮＡ分子を示す定量的測定値を決定するステップとを伴う。この方法は、２０１４年１２月２４日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７２３８３においてより詳細に記載されている。
遺伝子バリアント
本開示の方法は、遺伝子バリアント（「遺伝子変化」とも称される）の検出において使用することができる。遺伝子バリアントは、遺伝子座における代替形態である。ヒトゲノムにおいて、ヌクレオチドポジションのおよそ０．１％は多型である、すなわち、集団の少なくとも１％において生じる第２の遺伝子形態で存在する。変異は、遺伝子バリアントを生殖系列に導入し得、癌等の疾患細胞にも導入し得る。ｈｇ１９またはＮＣＢＩ Ｂｕｉｌｄ ３７もしくはＢｕｉｌｄ ３８等、参照配列は、「野生型」または「正常」ゲノムを表すことを意図する。しかし、単一の配列を有する程度まで、これらは、正常と考慮されてもよい共通多型を識別しない。
遺伝子バリアントは、配列バリアント、コピー数バリアントおよびヌクレオチド修飾バリアントを含む。配列バリアントは、遺伝子ヌクレオチド配列におけるバリエーションである。コピー数バリアントは、ゲノムの部分のコピー数における野生型からの偏差である。遺伝子バリアントは、例えば、一ヌクレオチド変異（ＳＮＰ）、挿入、欠失、逆位、トランスバージョン、転位置、遺伝子融合、染色体融合、遺伝子トランケーション、コピー数バリエーション（例えば、異数性、部分的異数性、倍数性、遺伝子増幅）、核酸化学修飾の異常な変化、エピジェネティックパターンの異常な変化および核酸メチル化の異常な変化を含む。
遺伝子バリアントは、試料におけるポリヌクレオチド由来の配列を、参照、例えば、参照ゲノム配列、指標または公知の変異のデータベースと比較することにより検出することができる。一実施形態では、参照配列は、ヒトゲノム配列ＨＧ－１９またはＮＣＢＩ Ｂｕｉｌｄ ３７等、公開されている参照配列である。別の実施形態では、参照配列は、非公共データベースにおける配列である。別の実施形態では、参照配列は、生物由来のポリヌクレオチドの配列決定から推定または決定される、その生物の生殖系列配列である。
体細胞変異または体細胞変化は、体細胞において生じる遺伝子バリアントである。体細胞変異は、個体の生殖系列細胞（すなわち、精子または卵）または接合子のゲノムにおいて生じる変異から区別される。体細胞変異、例えば、癌細胞に見出される体細胞変異は、癌が生じた対象の生殖系列ゲノムから区別可能である。これらは、癌ゲノムを、生殖系列ゲノムまたは参照ゲノムと比較することにより検出することもできる。癌細胞に共通の公知の遺伝子バリアントも存在する。ヒト癌におけるＳＮＶのデータベースは、ウェブサイト：cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/に見出すことができる。
図８は、癌において、点変異、増幅、融合およびインデル（挿入欠失）を示すことが公知の遺伝子を示す。
急速に分裂している細胞におけるＣＮＶ偏差
細胞周期のＳ期の間に、細胞は、ＤＮＡを複製する。ＤＮＡが複製された２Ｎ染色体を有する二倍体細胞は、約４Ｘ ＤＮＡ含量に対応することができる一方、ＤＮＡが複製されていない２Ｎ染色体を有する二倍体細胞は、約２Ｘ ＤＮＡ含量に対応することができる。複製は、複製起点から進行する。哺乳動物において、複製起点は、約１５ｋｂ～３００ｋｂの間隔で離れて配置される。この期間の間に、ゲノムの部分は、倍数体形態で存在する。複製起点およびポリメラーゼのポジションの間の区域は重複するが、ポリメラーゼのポジションを越えた（または複製起点の直前の）区域は、複製を行っている鎖において依然として単一コピー数である。ゲノムにわたって走査した場合、コピー数は、不均等または歪んでいると思われ、倍数性形態で存在する領域および二倍体形態で存在する領域を有する。斯かる走査は、ノイズが多い（noisy）と思われる。これは、静止状態においてゲノムにコピー数バリエーションがない細胞に対してであっても当てはまる。対照的に、Ｇ０期の細胞におけるＣＮＶの走査は、ゲノムにわたりコピー数が相対的に一律であるまたは歪みがないプロファイルを示す。癌細胞は、急速に分裂するため、ゲノムが、ある特定の遺伝子座にＣＮＶも有するか否かにかかわらず、ゲノムにわたるそのＣＮＶプロファイルは、歪みを示す。
この事実を活用して、ｃｆＤＮＡ等、不均一ＤＮＡ、例えば、疾患ＤＮＡおよび健康なＤＮＡの混合物を含む試料由来のＤＮＡにおける腫瘍負荷を検出することができる。腫瘍負荷を検出するための一方法は、試験される遺伝子座（単数または複数）が様々な複製起点に近接していることに起因するコピー数バリエーションを決定するステップを伴う。複製起点を含む領域は、該遺伝子座に４コピーのＤＮＡに非常に近いものを有し得る（二倍体細胞において）が、複製起点から遠く離れた領域は、２コピーに近いものを有し得る（二倍体細胞において）。ある特定の実施形態では、試験される遺伝子座（単数または複数）は、染色体全体またはゲノム全体にわたって少なくとも１ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１ｍｂ、少なくとも１０ｍｂ、少なくとも１００ｍｂを含む。この領域にわたる複製起点ＣＮＶ（ＲＯＣＮＶ）の測定値が決定される。これは、例えば、中心傾向の値からのコピー数における偏差の測定値であってよい。中心傾向の値は、例えば、平均値、中央値または最頻値であってよい。偏差の測定値は、例えば、分散または標準偏差であってよい。この測定値は、例えば、健康な個体または静止状態の細胞由来の対照試料における同じ領域にわたるＲＯＣＮＶの測定値と比較することができる。ＲＯＣＮＶは、分析されている領域（単数または複数）を様々な長さの非重複パーティションにパーティション化し、このパーティションにおけるＣＮＶの測定値を採用することにより決定することができる。ＣＮＶのこの測定値は、配列決定後にこれらの領域にマッピングされると決定される読み取り値または断片の数に由来することができる。パーティションは、様々なレベルの分解能、例えば、単一塩基レベル（塩基毎（base-per-base））、１０塩基、１００塩基、１ｋｂ、１０ｋｂまたは１００ｋｂを産生するために、様々なサイズを有することができる。対照よりも大きい偏差は、複製を行っているＤＮＡの存在を示し、これは延いては、悪性度を示す。偏差の程度が大きいほど、試料中の細胞分裂を行っている細胞由来のＤＮＡの量が大きい。
様々な方法を使用して、複製起点に基づく歪みとは異なる真の遺伝子コピー数バリエーションを計算することができる。例えば、影響されるＣＮＶ遺伝子座におけるヘテロ接合性ＳＮＰポジションを使用して、これらの遺伝子座における５０％からの偏差または対立遺伝子不均衡を計算することにより、コピー数バリエーションを推定することができる。両方のコピーは一般に、同様の時間間隔でコピーされ、よって、自己正規化（self-normalizing）である（対立遺伝子変化は、おそらく、２個の対立遺伝子バリアントの間で起点の複製を変化させるが）ため、複製起点近接に起因する歪みは、この不均衡に影響を与えるはずはない。例えば、ＳＮＰを含有する染色体セグメントの重複は、読み取り値の６７％前後において検出することができるが、ＲＯＣＮＶに起因する重複は、読み取り値の約５０％において検出されるであろう。別の方法において、ある特定の遺伝子座における検出された断片または読み取り値の密度を使用する計数に基づく技法は、相対コピー数の計算に使用される。これらの技法は一般に、ＤＮＡ試料調製および配列決定バイアスによるポアソンノイズおよび系統的バイアスによって限定される。これらの方法の組合せはまた、さらにより優れた正確性を得るはずである。
ＲＯＣＮＶは、所定の試料に関して計算することができ、ＳＮＶ、遺伝子特異的ＣＮＶ、ゲノム再編成、エピジェネティックバリアント、ヘテロ接合性の損失等、伝統的体細胞バリアントの検出の欠如にもかかわらず、無細胞腫瘍負荷に関する値を得るために使用することができる。ＲＯＣＮＶを使用して、所定の試料の歪みを減算して、細胞における真のコピー数変化に起因するよりはむしろ複製起点近接に関するバリエーションを除去することにより、所定のＣＮＶ検出／推定方法の感度および／または特異性を増加させることもできる。参照にわたり公知のコピー数変化を有するか、またはコピー数変化がない細胞株は、所定の試料に対するその寄与の推定における使用のためのＲＯＣＮＶの参照として使用することもできる。
一実施形態では、本方法は、既定のレベルの細胞分裂を行っている細胞、例えば、静止状態の細胞または急速に分裂している腫瘍細胞由来のＤＮＡをそれぞれ含有する、１種または複数の対照試料由来の１種または複数の遺伝子座におけるＤＮＡ分子のコピーのベースラインレベルを決定するステップを伴う。被験試料におけるＤＮＡ分子のコピーの測定値も決定される。被験試料における測定値は、１種または複数のパーティション化された１種または複数のパーティションに由来し得る。それぞれの事例において、複数の遺伝子座はそれぞれ、複製起点を含む。被験試料由来のコピーの測定値は、全パーティションにわたる平均または遺伝子座にわたる分散のレベルであってよい。被験試料におけるコピー数における中心傾向または変異の測定値（例えば、分散または標準偏差）は、対照試料と比較される。被験試料において、静止状態のまたはゆっくり分裂している細胞の対照におけるものよりも大きい測定値は、被験試料におけるＤＮＡを生成している細胞が、対照試料にＤＮＡを提供している細胞よりも急速に分裂している、例えば、癌性であることを示す。同様に、活発に分裂している状態の細胞の被験試料および対照の間で同様の測定値は、被験試料におけるＤＮＡを生成している細胞が、急速に分裂している細胞と同様の速度で分裂している、例えば、癌性であることを示す。
疾患細胞不均一性
疾患細胞不均一性、例えば、腫瘍不均一性は、異なる遺伝子バリアントを有する罹患細胞の存在である。疾患細胞不均一性は、罹患細胞から単離されたポリヌクレオチドの検査およびそれらのゲノムの差の検出により決定することができる。疾患細胞不均一性は、体細胞変異の相対頻度の差に基づき、罹患および健康な細胞両方由来のポリヌクレオチドを含有する試料由来のポリヌクレオチドの検査から推定することもできる。例えば、癌は、遺伝子レベルでの、例えば、細胞の異なるクローン群における体細胞変異の蓄積による変化によって特徴付けられる。このような変化は、癌細胞の調節されない成長に寄与するか、または様々な治療介入に対する応答性もしくは非応答性のマーカーとして機能することができる。
腫瘍不均一性は、遺伝子変異体の異なる組合せ、例えば、体細胞変異の異なる組合せを含有する癌細胞によって特徴付けられる腫瘍の状態である。すなわち、腫瘍は、異なる遺伝子において変化を含有する、または同じ遺伝子において異なる変化を含有する異なる細胞を有することができる。例えば、第１の細胞は、ＢＲＡＦの変異体型を含むことができる一方、第２の細胞は、ＢＲＡＦおよびＥＲＢＢ２の両方の変異体型を含むことができる。あるいは、第１の癌細胞は、一ヌクレオチド多型ＥＧＲＦ ５５２４９０６３ Ｇ＞Ａを含むことができる一方、第２の細胞は、一ヌクレオチド多型ＥＧＲＦ ５５２３８８７４ Ｔ＞Ａを含むことができる（数字は、ゲノム参照配列におけるヌクレオチドポジションを指す）。
例えば、当初の腫瘍細胞は、遺伝子、例えば、癌遺伝子における遺伝子バリアントを含むことができる。細胞が分裂し続けるにつれて、当初の変異を保有する一部の後代細胞は、他の遺伝子においてまたは同じ遺伝子の異なる部分において遺伝子バリアントを独立して発生し得る。その後の分裂において、腫瘍細胞は、さらになお多くの遺伝子バリアントを蓄積し得る。
疾患不均一性のプロファイル
本開示の方法は、疾患モザイク現象、例えば、腫瘍不均一性の定量的および定性的なプロファイリングを可能にする。一実施形態では、プロファイルは、空間的に別個の疾患細胞由来のポリヌクレオチド由来の情報を含む。一実施形態では、プロファイルは、身体の至る所に分布する細胞由来の情報を含有する全身プロファイルである。ｃｆＤＮＡにおけるポリヌクレオチドの分析は、腫瘍の局在した区域の試料採取とは対照的に、腫瘍の地理的範囲全体にわたるＤＮＡの試料採取を可能にする。特に、これは、拡散したおよび転移性の腫瘍の試料採取を可能にする。これは、腫瘍の局在した試料採取により腫瘍不均一性の単なる存在を検出する方法と対照をなす。プロファイルは、バリアントの正確なヌクレオチド配列を示し得るか、または体細胞変異を有する遺伝子を単純に示し得る。
腫瘍細胞不均一性等、疾患細胞不均一性のプロファイルの一実施形態では、プロファイルは、遺伝子バリエーションおよび各バリアントの相対量を識別する。この情報から、異なる細胞亜集団におけるバリアントの可能な分布を推定し得る。例えば、癌は、体細胞変異Ｘを有する細胞から始まり得る。クローン進化の結果として、この細胞の一部の後代は、バリアントＹを発生し得る。他の後代は、バリアントＺを発生し得る。細胞レベルでは、分析後に、腫瘍は、５０％Ｘ、３５％ＸＹおよび１５％ＸＺとして特徴付けることができる。ＤＮＡレベルでは（また、腫瘍細胞由来のＤＮＡのみを考慮して）、プロファイルは、１００％Ｘ、３５％Ｙおよび１５％Ｚを示し得る。第１の遺伝子座におけるＣＮＶおよび第２の遺伝子座における配列バリアントの両方を検出し得る。
腫瘍不均一性は、異なる頻度で生じる異なる遺伝子座におけるゲノムバリエーションの存在に基づき、癌ポリヌクレオチドの配列の分析から検出することができる。例えば、無細胞ＤＮＡの試料において（これは、生殖系列ＤＮＡおよび癌ＤＮＡを含有する可能性がある）、ＢＲＡＦの配列バリアントが１７％の頻度で生じ、ＣＤＫＮ２Ａの配列バリアントが６％の頻度で生じ、ＥＲＢＢ２の配列バリアントが３％の頻度で生じ、ＡＴＭの配列バリアントが１％の頻度で生じることが判明する場合がある。配列バリアントのこれらの異なる頻度は、腫瘍不均一性を示す。同様に、異なる量のコピー数バリエーションを示す遺伝子配列も、腫瘍不均一性を示す。例えば、試料の分析は、ＥＧＦＲおよびＣＣＮＥ１遺伝子に関して異なるレベルの増幅を示し得る。これも、腫瘍不均一性を示す。
無細胞ＤＮＡの場合は、体細胞変異の検出は、試料における塩基コール（ｂａｓｅ ｃａｌｌ）を参照配列と、または内部的には、より低頻度の塩基コールとして、生殖系列配列に存在すると推測されるより一般的な塩基コールと比較することによって為すことができる。どちらの場合でも、異なる遺伝子座における、異なる頻度での準優勢な（sub-dominant）形態（例えば、総塩基コールの４０％未満）の存在は、疾患細胞不均一性を示す。
無細胞ＤＮＡは、典型的には生殖系列ゲノム配列を有する正常細胞由来のＤＮＡの優越を含み、癌等の疾患の場合は、がん癌細胞由来の、そしてがん癌ゲノム配列を有する少ないパーセンテージのＤＮＡを含む。ｃｆＤＮＡの試料におけるポリヌクレオチドから生成された配列は、参照配列と比較して、参照配列およびｃｆＤＮＡにおけるポリヌクレオチドの間の差を検出することができる。いずれかの遺伝子座において、被験試料由来のポリヌクレオチドの全てまたはほとんど全ては、参照配列におけるヌクレオチドと同一であってよい。あるいは、試料においてほとんど１００％頻度で検出されるヌクレオチドは、参照配列におけるヌクレオチドとは異なることができる。これは、この遺伝子座における正常多型形態を示す可能性が最も高い。参照ヌクレオチドとマッチする第１のヌクレオチドが、約５０％で検出され、参照ヌクレオチドとは異なる第２のヌクレオチドが、約５０％で検出される場合、これは、正常ヘテロ接合性を示す可能性が最も高い。ヘテロ接合性は、５０：５０とは相違する対立遺伝子比、例えば、６０：４０またはさらには７０：３０で存在することができる。しかし、試料が、明確にヘテロ接合体範囲を下回る（またはそれを上回る）頻度（例えば、約４５％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満または５％未満）でノイズを上回って検出可能なヌクレオチドを含む場合、これは、ＤＮＡをｃｆＤＮＡ集団に寄与させるあるパーセンテージの細胞における体細胞変異の存在に起因し得る。これは、疾患細胞、例えば、癌細胞に由来し得る（正確なパーセンテージは、腫瘍負荷の関数である）。２種の異なる遺伝子座における体細胞変異の頻度が異なる場合、例えば、一方の遺伝子座における１６％および別の遺伝子座における５％の場合、これは、疾患細胞、例えば、癌細胞が不均一であることを示す。
腫瘍ＤＮＡを優勢に含むことが予想される固形腫瘍由来のＤＮＡの場合は、体細胞変異は、参照配列との比較によって検出することもできる。腫瘍細胞の１００％において存在する体細胞変異の検出は、標準配列または公知の変異体に関する情報の参照を必要とし得る。しかし、異なる遺伝子座における異なる相対頻度での、ポリヌクレオチドプールの間の準優勢な配列の存在は、腫瘍不均一性を示す。
プロファイルは、治療薬があること（ａｃｔｉｏｎａｂｌｅ）が公知の遺伝子における遺伝子バリアントを含むことができる。治療法は、斯かるバリアントに対し標的化され得るため、斯かるバリアントの知識は、治療介入の選択に寄与することができる。癌の場合は、多くの治療薬が使用可能である遺伝子バリアントが既に公知である。
疾患細胞不均一性におけるＣＮＶおよびＳＮＶ
一般に、遺伝子のコピー数状態は、試料における遺伝子の遺伝子形態の頻度において反映されるべきである。例えば、配列バリアントは、コピー数バリエーションのない、ホモ接合性またはヘテロ接合性（例えば、それぞれ約１００％または約５０％）と一致した頻度で検出することができる。これは、生殖系列多型または変異と一致する。配列バリアントは、遺伝子座においてポリヌクレオチドの約６７％（あるいは約３３％）の頻度で、また、増加したコピー数（一般に、ｎ＝２）で測定される遺伝子において検出することができる。これは、生殖系列における遺伝子重複と一致する。例えば、トリソミーは、この様式で存在するであろう。しかし、配列バリアントが、ホモ接合性と一致したレベルで（例えば、約１００％）、ただしコピー数バリエーションと一致した量で検出される場合、これは、遺伝子増幅を行った疾患細胞ポリヌクレオチドの存在を反映する可能性が高い。同様に、配列バリアントが、ヘテロ接合性と一致しないレベルで（例えば、５０％から幾分逸脱する）、ただしコピー数バリエーションと一致した量で検出される場合、これも、疾患細胞ポリヌクレオチドの存在を反映する可能性が高い；罹患ポリヌクレオチドは、５０：５０から離れた対立遺伝子頻度で、あるレベルの不均衡を生じる。
この観察を使用して、配列バリアントが、生殖系列レベルで存在する可能性が高いか、例えば、癌細胞における体細胞変異に起因する可能性が高いか推定することができる。例えば、生殖系列におけるヘテロ接合性とほぼ間違いなく一致したレベルで検出される遺伝子における配列バリアントは、該遺伝子においてコピー数バリエーションも検出される場合、よりほぼ確実に、疾患細胞における体細胞変異の産物である。
また、本出願人らが、生殖系列における遺伝子重複が、遺伝子量増加（例えば、遺伝子座におけるトリソミーに対し約６７％）と一致したバリアントを有すると予想する程度まで、この予想される量から有意に逸脱する配列バリアント量（dose）を有する遺伝子増幅の検出は、ＣＮＶが、体細胞変異の結果として存在する可能性が高いことを示す。
異なる遺伝子座における体細胞変異が、同じ疾患細胞において単一または複数のコピー数で存在し得るという事実を使用して、腫瘍不均一性を推定することもできる。より具体的には、２種の遺伝子が異なる頻度で検出されるが、それらのコピー数が相対的に等しい場合、腫瘍不均一性を推定することができる。あるいは、２種の配列バリアントの間の頻度の差が、該２種の遺伝子に関するコピー数の差と一致する場合、腫瘍均一性を推定することができる。よって、ＥＧＦＲバリアントが１１％で検出され、ＫＲＡＳバリアントが５％で検出され、これらの遺伝子においてＣＮＶが検出されない場合、頻度の差は、腫瘍不均一性を反映する可能性がある（例えば、全腫瘍細胞が、ＥＧＦＲ変異体を保有し、腫瘍細胞の半分が、ＫＲＡＳ変異体も保有する）。あるいは、変異体を保有するＥＧＦＲ遺伝子が、増加したコピー数で検出される場合、一致した解釈の１つは、各細胞がＥＧＦＲおよびＫＲＡＳ遺伝子に変異体を保有するが、ＫＲＡＳ遺伝子が重複した、腫瘍細胞の均質集団である。したがって、試料における配列バリアントの頻度および配列バリアントの遺伝子座におけるＣＮＶの測定値の両方を決定することができる。次に、ＣＮＶの測定値から決定された細胞あたりの用量に基づき頻度に重み付けすることによって、頻度は、バリアントを有する細胞の相対数を反映するように補正することができる。すると、この結果は、バリアントを保有する細胞の数の観点から、コピー数が変動しない配列バリアントとさらに比較可能である。
検査結果の通信
遺伝子バリアント分析からの結果の報告（例えば、配列バリアント、ＣＮＶ、疾患細胞不均一性およびこれらの組合せ）を、報告生成装置によって、例えば、医療関係者、例えば、医者に提供して、検査結果（例えば、データ）の解釈および処置選択肢の選択を助けることができる。報告生成装置によって生成された報告は、疾患の診断および処置選択肢の選択に有用となり得る臨床ラボ結果等の追加的な情報を提供することができる。
ここで図９Ａを参照すると、例えば、癌検査結果およびそれから派生する処置選択肢について報告するための報告生成装置１を備えるシステムが、模式的に例証されている。報告生成システムは、通信用リンクを介して、遠隔データサイトもしくはラボ２、医療行為／医療提供者（処置の専門家）４および／または患者／対象６との直接的な通信を確立するように構成された中央データ処理システムであってよい。ラボ２は、対象臨床情報を生成することができる医学実験室、診断実験室、医学設備、医療行為、ポイントオブケア検査デバイスまたは他のいずれかの遠隔データサイトであってよい。対象臨床情報として、実験室検査データ、例えば、遺伝子バリアントの分析；イメージングおよびＸ線データ；試験結果；ならびに診断が挙げられるが、これらに限定されない。医療提供者または行為６は、医師、看護師、在宅介護者、技師および医者の助手等、医学サービス提供者を含むことができ、行為は、医療提供者が配属されているいずれかの医学ケア設備であってよい。ある特定の事例において、医療提供者／行為も、遠隔データサイトである。癌が、処置しようとする疾患である場合、対象は、他の可能な疾患または障害の中でも、癌を患うことができる。
癌対象６のための他の臨床情報は、実験室検査、例えば、遺伝子バリアント、代謝パネル、全血球計算値等の分析の結果；医学イメージングデータ；および／または状態の診断、予後の提供、疾患進行のモニタリング、再燃もしくは寛解の決定またはこれらの組合せを対象とする医学手技を含むことができる。癌の臨床情報の適切な供給源のリストとして、ＣＴスキャン、ＭＲＩスキャン、超音波スキャン、骨スキャン、ＰＥＴスキャン、骨髄検査、バリウムＸ線、内視鏡検査、リンパ管造影、ＩＶＵ（静脈性尿路造影）またはＩＶＰ（ＩＶ腎盂造影）、腰椎穿刺、膀胱鏡検査、免疫学的検査（抗マリグニン（malignin）抗体スクリーニング）および癌マーカー検査が挙げられるが、これらに限定されない。
対象６の臨床情報は、ラボ２から手動または自動で得ることができる。システムの単純さが所望される場合、情報は、既定のまたは規則的な時間間隔で自動に得ることができる。規則的な時間間隔は、時間、日、週、月、年等の時間測定に基づいて、本明細書に記載されている方法およびシステムによって、実験室データの収集が自動で行われる時間間隔を指すことができる。一実施形態では、データの収集および処理は、少なくとも１日１回行われる。一実施形態では、データの移行および収集は、毎月、隔週、毎週、１週間に数回または毎日のいずれかでほぼ行われる。あるいは、情報の検索は、規則的な時間間隔でなくてもよい既定の時間間隔で行うことができる。例えば、第１の検索ステップは、１週間後に生じることができ、第２の検索ステップは、１カ月後に生じることができる。データの移行および収集は、管理されている障害の性質ならびに対象の要求される検査および医学試験の頻度に従って注文に応じて作ることができる。
図９Ｂは、腫瘍応答マップおよび関連する変化の要約を含む遺伝子報告を生成するための例示的なプロセスを示す。腫瘍応答マップは、腫瘍由来の遺伝子情報の経時的な変化、例えば、定性的および定量的変化を示す遺伝子情報のグラフ表示である。斯かる変化は、治療介入に対する対象の応答を反映することができる。このプロセスは、癌に関連するｄｅ ｎｏｖｏ遺伝子バリアントの確実な検出に要求されるものよりも数桁高くなり得る、誤り率およびバイアスを低減することができる。プロセスは、遺伝子材料の供給源として体液試料（例えば、血液、唾液、汗、尿等）を収集することにより、先ず遺伝子情報を捕捉するステップを含むことができる。次に、プロセスは、材料を配列決定するステップを含むことができる（１１）。例えば、試料におけるポリヌクレオチドを配列決定し、複数の配列読み取り値を生成することができる。ポリヌクレオチドを含む試料における腫瘍負荷は、試料から生成される配列読み取り値の総数に対する、バリアントを有する配列読み取り値の相対数として推定することができる。コピー数バリアントが分析されると、腫瘍負荷は、被験および対照遺伝子座における配列読み取り値の総数の相対過剰（例えば、遺伝子重複の場合）または相対欠損（例えば、遺伝子排除の場合）として推定することができる。例えば、１ランは、癌遺伝子遺伝子座にマッピングされる１０００個の読み取り値を生成することができ、そのうちの９００個は野生型に対応し、１００個は癌変異体に対応し、この遺伝子におけるコピー数バリアントを示す。例示的な標本収集および遺伝子材料の配列決定に関するさらなる詳細については、図１０～図１１において後述する。
次に、遺伝子情報を加工することができる（１２）。続いて遺伝子バリアントを識別することができる。プロセスは、遺伝子材料を含有する試料における遺伝子バリアントの頻度を決定するステップを含むことができる。プロセスは、このプロセスにノイズが多い場合、ノイズから情報を分離するステップを含むことができる（１３）。
遺伝子分析のための配列決定方法は、誤り率を有し得る。例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのｍｙＳｅｑシステムは、１桁台前半のパーセント誤り率を生成することができる。遺伝子座にマッピングされる１０００個の配列読み取り値に対して、約５０個の読み取り値（約５％）が、誤りを含むと予想され得る。ＷＯ２０１４／１４９１３４に記載されている方法論等、ある特定の方法論は、誤り率を有意に低減することができる。誤りは、試料中に低レベルで存在する癌からの曖昧なシグナルを発し得るノイズを生じる。例えば、試料が、配列決定システム誤り率前後の、例えば、０．１％～５％前後のレベルの腫瘍負荷を有する場合、癌による遺伝子バリアントに対応するシグナルを、ノイズによるものから区別することは困難となり得る。
遺伝子バリアントの分析は、ノイズの存在下での診断に使用することができる。分析は、配列バリアントの頻度またはＣＮＶのレベルに基づくことができ（１４）、ノイズ範囲内で遺伝子バリアントを検出するための診断信頼性適応症またはレベルを確立することができる（１５）。
次に、プロセスは、診断信頼性を増加させるステップを含むことができる。これは、複数の測定値を使用して行って、診断の信頼性を増加させることができる（１６）、あるいは複数の時点における測定値を使用して、癌が進行しているか、寛解しているか、安定化されたか決定することができる（１７）。診断信頼性を使用して、疾患状態を識別することができる。例えば、対象から採取された無細胞ポリヌクレオチドは、正常細胞に由来するポリヌクレオチドと共に、癌細胞等の罹患細胞に由来するポリヌクレオチドを含むことができる。癌細胞由来のポリヌクレオチドは、体細胞変異およびコピー数バリアント等、遺伝子バリアントを有することができる。対象由来の試料からの無細胞ポリヌクレオチドが配列決定される際に、これらの癌ポリヌクレオチドは、配列バリアントまたはコピー数バリアントとして検出される。
パラメータの測定値はノイズ範囲内であるか否かにかかわらず、それらは信頼区間を備えることができる。経時的に検査すると、信頼区間を経時的に比較することにより、癌が進行しているか、安定化されたか、または寛解しているか決定することができる。信頼区間が重複する場合、これらの測定値の間に統計的有意差がないため、疾患が増加しているか減少しているか知ることはできない。しかし、信頼区間が重複しない場合、これは、疾患の方向性を示す。例えば、ある１時点の信頼区間における最低ポイントと、第２の時点の信頼区間における最高ポイントとの比較は、方向性を示す。
次に、プロセスは、遺伝子報告／診断を生成するステップを含むことができる。プロセスは、変異傾向を示す複数の測定の遺伝子グラフを生成するステップ（１８）と、処置結果および選択肢を示す報告を生成するステップ（１９）とを含むことができる。
図１０Ａ～図１０Ｃは、より詳細に、遺伝子報告および診断（例えば、報告／診断）を生成するための一実施形態を示す。一実装において、図１０Ｃは、非ＣＮＶ報告変異体対立遺伝子頻度を加工するための図９Ａのシステムによって実行される例示的な疑似コードを示す。しかし、システムは、ＣＮＶ報告変異体対立遺伝子頻度も同様に加工することができる。
ｃｆＤＮＡ等、遺伝子材料を含む試料は、複数の時点で、すなわち、連続的に対象から収集することができる。遺伝子材料は、例えば、ハイスループット配列決定システムを使用して、配列決定することができる。配列決定は、目的の遺伝子座を標的として、遺伝子バリアントを検出することができ、そのようなものとして、例えば、癌における、体細胞変異を有する遺伝子、コピー数バリエーションを行う遺伝子、または遺伝子融合に関与する遺伝子等が挙げられる。各時点において、見出された遺伝子バリアントの定量的測定値を決定することができる。例えば、ｃｆＤＮＡの場合、定量的測定値は、遺伝子座にマッピングされるポリヌクレオチドの間の遺伝子バリアントの頻度もしくはパーセンテージ、または遺伝子座にマッピングされる配列読み取り値もしくはポリヌクレオチドの絶対数であってよい。次に、少なくとも１時点で非ゼロ量を有する遺伝子バリアントを、全時点を通してグラフにより表すことができる。例えば、１０００種の配列の収集において、バリアント１は、時点１、２および３において、それぞれ５０、３０および０の量で見出すことができる。バリアント２は、これらの時点において、０、１０および２０の量で見出すことができる。これらの量は、バリアント１については、５％、３％および０％に対して、バリアント２については、０％、１％および２％に対して正規化することができる。全非ゼロ結果の結合を示すグラフ表示は、全時点における両方のバリアントの量を示すことができる。正規化された量は、各パーセンテージが、例えば高さ１ｍｍを有する層によって表されるように、スケーリングすることができる。そこで、例えば、この場合、高さは、時点１では：高さ５ｍｍ（バリアント１）および０ｍｍ（バリアント２）；時点２では：高さ３ｍｍ（バリアント１）および１ｍｍ（バリアント２）、時点３では：高さ０ｍｍ（バリアント１）および２ｍｍ（バリアント２）となるであろう。グラフ表示は、ストリームグラフ（streamgraph）等、積み重ね面積グラフの形態であってよい。「ゼロ」時点（第１の時点の前）は、全値が０のポイントによって表すことができる。グラフ表示におけるバリアントの量の高さは、例えば、相対的または互いに比例することができる。例えば、ある１時点におけるバリアント頻度５％は、同じ時点における２．５％の頻度を有するバリアントの２倍の高さにより表すことができる。積み重ねの順序は、理解し易くするために選択することができる。例えば、バリアントは、下から上に、多いから少ない量の順に積み重ねることができる。あるいは、これらは、ストリームグラフにおいて、最大初期量のバリアントを中間に、減少する量の他のバリアントを両側に積み重ねることができる。ある特定の実施形態では、面積は、バリアントに基づき色分けすることができる。同じ遺伝子におけるバリアントは、同じ色の異なる色相で示すことができる。例えば、ＫＲＡＳ変異体同士は、異なる色合いの青色で示すことができ、ＥＧＦＲ変異体同士は、異なる色合いの赤色で示すことができる。
次に、図１０Ａに移ると、プロセスは、ＤＮＡシーケンサーから遺伝子情報を受け取るステップを含むことができる（３０）。続いて、プロセスは、特異的遺伝子変化およびその量を決定するステップを含むことができる（３２）。
次に、腫瘍応答マップが生成される。マップを生成するために、プロセスは、全検査ポイントにわたりレンダリングするために遺伝子変化毎に量を正規化し、スケールファクターを生成するステップを含むことができる（３４）。本明細書において使用される場合、用語「正規化する」は一般に、異なるスケールで測定された値を、概念的に一般的なスケールに調整することを意味することを指す。例えば、異なるポイントで測定されたデータは、全ての値を一般的スケールへと再度サイズ分類することができるように変換／調整される。本明細書において使用される場合、用語「スケールファクター」は一般に、ある量をスケーリングするか、または乗じる数を指す。例えば、方程式ｙ＝Ｃｘにおいて、Ｃは、ｘに対するスケールファクターである。Ｃは、ｘの係数でもあり、ｘに対するｙの比例の定数と呼ぶこともできる。値は正規化されて、視覚的に分かり易い一般的スケールでのプロットを可能にする。また、スケールファクターは、プロットされる値に対応する正確な高さを知るために使用される（例えば、１０％変異体対立遺伝子頻度は、全体の高さが１０ｃｍである報告における１ｃｍを表すことができる）。スケールファクターは、全検査ポイントに適用されるため、普遍的なスケールファクターであると考慮される。検査ポイント毎に、プロセスは、腫瘍応答マップにおいて情報をレンダリングするステップを含むことができる（３６）。操作３６において、プロセスは、決定されたスケールファクターを使用して、変化および相対的な高さをレンダリングするステップ（３８）と、変化毎に特有の視覚的インジケータを割り当てるステップとを含むことができる（４０）。応答マップに加えて、プロセスは、変化および処置選択肢の要約を生成するステップを含むことができる（４２）。また、特定の遺伝子変化および他の有用な処置の示唆に役立つことができる臨床治験からの情報が提示されると共に、用語法の説明、検査方法論および他の情報が、報告に加えられ、ユーザーのためにレンダリングされる。
一実装において、コピー数バリエーションは、ゲノムにおける様々なポジションと、それぞれのポジションにおけるコピー数バリエーションの対応する増加または減少または維持を示すグラフとして報告することができる。その上、コピー数バリエーションを使用して、どれほどの疾患材料（またはコピー数バリエーションを有する核酸）が、無細胞ポリヌクレオチド試料に存在するか示すパーセンテージスコアを報告することができる。
別の実施形態では、報告は、医者が結果を解釈し、処置選択肢を推奨するのに役立つ注釈を含む。注釈付けは、ＮＣＣＮ腫瘍学臨床診療ガイドライン（NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology）（商標）またはアメリカ臨床腫瘍学会（American Society of Clinical Oncology）（ＡＳＣＯ）臨床診療ガイドラインにおける状態に関する報告の注釈付けを含むことができる。注釈付けは、適応外使用のための１種もしくは複数のＦＤＡ承認薬物、メディケア・メディケイド・サービス・センター（Centers for Medicare and Medicaid Services）（ＣＭＳ）抗癌処置コンペンディアに収載されている１種もしくは複数の薬物、および／または科学文献に見出される１種もしくは複数の実験薬物の、報告における収載を含むことができる。注釈付けは、収載された薬物処置選択肢を、薬物処置選択肢に関する科学情報を含有する参考文献に繋げるステップを含むことができる。科学情報は、医学雑誌の査読論文に由来することができる。注釈付けは、報告における薬物処置選択肢の臨床治験に関する情報へのリンクの提供を含むことができる。注釈付けは、電子に基づく報告において、提供された薬物処置選択肢の近くにポップアップボックスまたはフライオーバー（fly-over）ボックスにおける情報の提示を含むことができる。注釈付けは、１種または複数の薬物処置選択肢、１種または複数の薬物処置選択肢に関連する科学情報、１種または複数の薬物処置選択肢に関する科学情報への１種または複数のリンク、１種または複数の薬物処置選択肢に関する科学情報の引用への１種または複数のリンク、および１種または複数の薬物処置選択肢に関する臨床治験情報からなる群から選択される、報告への情報の付加を含むことができる。
図１０Ｂは、医療関係者、例えば医者が使用して、例えば患者ケアを決断することができる、腫瘍応答マップ経路を生成するための例示的なプロセスを示す。本実施形態では、プロセスは、先ず全般的スケールファクターを決定するステップを含むことができる（４３）。一実施形態では、全非ＣＮＶ（コピー数バリエーション）報告変異体対立遺伝子頻度に対して、プロセスは、絶対値を、プロットに対しより受け入れることができる相対計量／スケールへと変換するステップ（例えば、変異体対立遺伝子頻度に１００を乗じ、該値の対数を取る）と、最大観察値を使用して全般的スケールファクターを決定するステップとを含むことができる。次にプロセスは、最も早い検査データセット由来の情報を視覚化するステップを伴う（４４）。視覚化は、ユーザー・インターフェース（例えば、コンピュータスクリーン）または有形形式（例えば、紙片）における情報のグラフ表示を含むことができる。非ＣＮＶ各変化について、プロセスは、スケールファクターに遺伝子毎の変換値を乗じるステップと、該バリアントをプロットするための量インジケータとして使用するステップと、続いて変化毎に色／特有の視覚的インジケータを割り当てるステップとを含むことができる。続いて、プロセスは、次の疑似コードを使用して、その後の検査ポイントのために情報を視覚化するステップを含むことができる（４５）：
検査結果の変化しない組成の場合、新たなパネルにおいて以前のパネル日付の視覚を続ける、
変化が同じままであるが、量が変化した場合、
該バリアントをプロットするために量インジケータを再度算出し、最新の検査日のために現存するパネル（複数可）および新たなパネルにおいて全ての更新された値を再度プロットする。
新たな変化が付加される場合、
全ての現存する変化の最上位に変化を付加する
変換値を算出する
スケールファクターを再度算出する
応答マップを再度描き、現在の検査日において依然として検出される以前の検査日における変化と共に新たに出現する変化を再度プロットする
現存する以前の変化が、検出された変化のセット内にない場合、
ゼロの高さを使用し、全てのその後の検査日のための変化の量をプロットする
利用できない色のセットである色を依然として含む
検査日を表示するその後のパネルのそれぞれは、マップの残りに見られる変化変更と相関し得る、追加的な患者または介入情報を含むこともできる。同様のスケーリング、プロットおよび変換は、ＣＮＶおよび他のタイプのＤＮＡ変化（例えば、メチル化）に対して実装して、別々のまたは組み合わせたチャートにおいてこれらの量を表示することもできる。これらの追加的な注釈はそれら自体も定量化でき、マップにおいて同様にプロットすることができる。
続いてプロセスは、変化および処置選択肢の要約を決定するステップを含むことができる（４６）。一実施形態では、最大変異体対立遺伝子頻度を有する変化のため、次の行動を行う：
非ＣＮＶ変化の減少する変異体対立遺伝子頻度の順序で、該遺伝子に関する全ての変化を報告する
ＣＮＶ値の減少する順序で、該遺伝子に関する全てのＣＮＶ変化を報告する
未だ報告されていない次に高い非ＣＮＶ変異体対立遺伝子頻度を有する次の遺伝子に関して反復する
報告された変化毎に、プロセスは、異なる検査日ポイントにわたり該変化の傾向インジケータを含むステップを含むことができる
最大変異体対立遺伝子頻度のグループ分けは、生物学的経路、根拠レベル等、より優れたカプセル化注釈のために、これをもつ遺伝子のみを越えて拡張することもできる。
図１０Ｄ～図１０Ｉは、図９Ａのシステムによって生成される例示的な一報告を示す。図１０Ｄにおいて、患者識別セクション５２は、患者情報、報告日および医者接触情報を提供する。腫瘍応答マップ５４は、バリアント遺伝子毎に特有の色により腫瘍活性を示す修飾されたストリームグラフ５６を含む。グラフ５６は、添付の要約説明テキストボックス５８を有する。さらなる詳細は、変化および処置選択肢の要約セクション６０に提供されている。変化６２および６４は、変異傾向、変異体対立遺伝子頻度、無細胞増幅、ＦＤＡ承認薬物適応症、他の適応症を有するＦＤＡ承認薬物および臨床薬物治験情報と共に、セクション６０に提示される。図１０Ｄ－１、図１０Ｄ－２および図１０Ｄ－３は、図１０Ｄの拡大図を提供する。
図１０Ｅは、検査の定義、コメントおよび解釈を提供する例示的な報告セクションを示す。図１０Ｅ－１および図１０Ｅ－２は、図１０Ｅの拡大図を提供する。図１０Ｆは、報告の例示的な詳細な治療結果部分を示す。図１０Ｆ－１および図１０Ｆ－２は、図１０Ｆの拡大図を提供する。図１０Ｇは、検出された変化の臨床関連性の例示的な考察を示す。図１０Ｇ－１および図１０Ｇ－２は、図１０Ｇの拡大図を提供する。図１０Ｈは、臨床治験下にある潜在的に利用できる薬物療法を示す。図１０Ｉは、検査方法およびその制限を示す。図１０Ｉ－１および図１０Ｉ－２は、図１０Ｉの拡大図を提供する。
図１０Ｊ～図１０Ｐは、様々な例示的な修飾されたストリームグラフ５６を示す。ストリームグラフまたはストリーム・グラフは、中心軸の周りを変位し、流れるような有機的な形状を生じる、ある種の積み重ね面積グラフである。ストリームグラフは、ベースラインが自由な積み重ね面積グラフの一般化である。ベースラインをシフトすることにより、個々のシリーズにおける勾配の変化（または「小刻みな動き（wiggle）」）を最小化し、これにより、データにわたるいずれか所定の層の厚さの認知をより容易にすることが可能になる。
例えば、図１０Ｊは、３期間および「０」時点（全ての値が「０」）にわたる少なくとも８種の変異体を表す７層を示す。図１０Ｋは、４期間にわたる単一の変異体を示す。第２、第３および第４の時点において、変異体は検出されない。図１０Ｌは、各時点における優位な対立遺伝子の頻度を示す。図１０Ｍは、２種の遺伝子における合計４種の変異体による単一の時点を示す。変異体は、変化があるポジションにおけるアミノ酸によって識別される（すなわち、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ）。
一実施形態は、ｘ軸反映的とならないように、ストリームグラフをレンダリングする。修飾されたグラフは、比例的な性状を表示するために特有のスケーリングを適用する。グラフは、新たな性状の付加を経時的に示すことができる。変異の存在または非存在は、ゲノムにおける様々なポジションおよびそれぞれのポジションにおける変異の頻度の対応する増加または減少または維持を示す、グラフ形態で反映することができる。その上、変異を使用して、どれほどの疾患材料が、無細胞ポリヌクレオチド試料に存在するかを示すパーセンテージスコアを報告することができる。非疾患参照配列における報告されるポジションにおける典型的な分散の公知の統計を考慮すると、信頼スコアは、検出された変異のそれぞれを伴うことができる。変異は、対象における存在量の順にランク付けしても、または臨床的に使用可能な重要性によってランク付けしてもよい。
癌を有する対象に対するゲノムポジションおよびコピー数バリエーションのマッピングは、特定の癌が、高悪性度かつ処置に対し抵抗性であることを示すことができる。対象は、ある期間モニタリングし、再検査することができる。この期間の終わりに、例えば腫瘍応答マップに描写されるコピー数バリエーションプロファイルが、劇的に増加し始める場合、これは、現在の処置が機能していないことを示すことができる。比較は、他の対象の遺伝子プロファイルにより行うこともできる。例えば、このコピー数バリエーション増加が、癌が進行していることを示すことが決定される場合、処方された当初の処置レジメンは、もはや癌を処置することなく、新たな処置が処方される。
これらの報告は、インターネット経由で電子的に提出およびアクセスすることができる。配列データの分析は、対象の位置以外の場所で生じることができる。報告を生成し、対象の位置に伝達することができる。インターネット接続可能なコンピュータにより、対象は、自身の腫瘍負荷を反映する報告にアクセスすることができる。
次に、例示的な遺伝子検査プロセスに関する詳細が開示される。次に、図１１Ａに移ると、例示的なプロセスは、血液試料または他の身体試料由来の遺伝子材料を受け取る（１１０２）。プロセスは、遺伝子材料由来のポリヌクレオチドをタグ付けされた親ヌクレオチドへと変換するステップを含むことができる（１１０４）。タグ付けされた親ヌクレオチドが増幅されて、増幅された後代ポリヌクレオチドを産生する（１１０６）。増幅されたポリヌクレオチドのサブセットが配列決定されて、配列読み取り値を生成し（１１０８）、これは、特有のタグ付けされた親ヌクレオチドからそれぞれ生成されたファミリーへとグループ分けされる（１１１０）。選択された遺伝子座において、プロセスは、各ファミリーにファミリー毎の信頼スコアを割り当てるステップを含むことができる（１１１２）。次に、以前の読み取りを使用して、コンセンサスが決定される。これは、ファミリー毎に以前の信頼スコアを審査することにより行われ、一致する以前の信頼スコアが存在する場合、現在の信頼スコアが増加される（１１１４）。以前の信頼スコアが存在するが、不一致である場合、現在の信頼スコアは、一実施形態では修飾されない（１１１６）。他の実施形態では、信頼スコアは、一致していない以前の信頼スコアに対して既定の様式で調整される。ファミリーが初めて検出される場合、現在の信頼スコアは、偽の読み取りの可能性があるため低減され得る（１１１８）。プロセスは、信頼スコアに基づくタグ付けされた親ポリヌクレオチドのセットにおける遺伝子座におけるファミリーの頻度を推定するステップを含むことができる。続いて、上に記す通りに遺伝子検査報告が生成される（１１２０）。
時間的情報を図１１Ａ～図１１Ｂにおいて使用して、変異またはコピー数バリエーション検出の情報を増強したが、他のコンセンサス方法を適用してもよい。他の実施形態では、歴史的比較は、特定の参照配列にマッピングされる他のコンセンサス配列と併せて使用して、遺伝子変異の事例を検出することができる。特定の参照配列にマッピングされるコンセンサス配列を測定し、対照試料に対して正規化することができる。参照配列にマッピングされる分子の測定値をゲノムにわたって比較して、コピー数が変動するまたはヘテロ接合性が失われたゲノムにおける区域を識別することができる。コンセンサス方法は、例えば、デジタル通信理論、情報理論またはバイオインフォマティクスに由来する、コンセンサス配列を構築する線形または非線形方法（例えば、投票、平均化、統計的、最大事後もしくは最大尤度検出、動的プログラミング、ベイジアン、隠れマルコフまたはサポートベクターマシン方法等）を含む。配列読み取り値カバレージが決定された後に、ストカスティックモデリングアルゴリズムが適用されて、ウィンドウ領域毎の正規化された核酸配列読み取り値カバレージを別々のコピー数状態へと変換する。場合によっては、このアルゴリズムは、次のうちの１種または複数を含むことができる：隠れマルコフモデル、動的プログラミング、サポートベクターマシン、ベイジアンネットワーク、トレリス復号、ビタビ復号、期待値最大化、カルマンフィルタリング方法論およびニューラルネットワーク。
図１１Ｂに描写されている通り、対照試料または参照配列に対する配列カバレージの比較は、ウィンドウにわたる正規化を助けることができる。本実施形態では、無細胞ＤＮＡは、血液、汗、唾液、尿等、容易に入手可能な体液から抽出および単離される。例えば、無細胞ＤＮＡは、イソプロパノール沈殿および／またはシリカに基づく精製が挙げられるが、これらに限定されない、本技術分野で公知の種々の方法を使用して抽出することができる。無細胞ＤＮＡは、癌がない対象、癌のリスクがある対象、または癌を有することが公知の対象等、いずれかの数の対象から抽出することができる（例えば、他の手段により）。
単離／抽出ステップ後に、無細胞ポリヌクレオチド試料において、多数の異なる配列決定操作のいずれかを行うことができる。試料は、配列決定前に、１種または複数の試薬（例えば、酵素、特有の識別子（例えば、バーコード）、プローブ等）により加工することができる。場合によっては、試料が、バーコード等の特有の識別子により加工される場合、試料または試料の断片は、個々にまたはサブグループにおいて、特有の識別子をタグ付けすることができる。次に、配列決定反応等、下流適用において、タグ付けされた試料を使用することができ、個々の分子を親分子へと追跡することができる。
特定のポリヌクレオチドのその後の識別および起源決定を可能にするために、無細胞ポリヌクレオチドをタグ付けまたは追跡することができる。個々のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのサブグループへの識別子の割り当ては、特有の同一性が、個々の配列または配列の断片へと割り当てられることを可能にする。これは、個々の試料からのデータの獲得を可能にすることができ、試料の平均に限定されない。一部の例において、単一の鎖に由来する核酸または他の分子は、共通タグまたは識別子を共有することができ、したがって、この鎖に由来すると後に識別することができる。同様に、核酸の単一の鎖由来の断片は全て、同じ識別子またはタグをタグ付けし、これにより、親鎖からの断片のその後の識別を可能にすることができる。他の事例において、遺伝子発現産物（例えば、ｍＲＮＡ）は、発現を定量化するためにタグ付けすることができる。バーコードまたはこれが取り付けられた配列と組み合わせたバーコードを計数することができる。さらに他の事例において、システムおよび方法は、ＰＣＲ増幅対照として使用することができる。斯かる事例において、ＰＣＲ反応由来の複数の増幅産物は、同じタグまたは識別子をタグ付けすることができる。産物が後に配列決定され、配列の差を実証する場合、同じ識別子を有する産物の間の差は、ＰＣＲの誤りに起因し得る。その上、個々の配列は、読み取り値それ自体の配列データの特徴に基づき識別することができる。例えば、個々の配列決定読み取り値の初め（開始）および終わり（終止）部分における特有の配列データの検出は、単独で、または各配列読み取り値の塩基対の長さもしくは数と組み合わせて使用して、特有の同一性を個々の分子に割り当てることができる。これにより、特有の同一性を割り当てられた核酸の単一の鎖由来の断片は、親鎖由来の断片のその後の識別を可能にすることができる。これは、ボトルネックとなる初期出発遺伝子材料と併せて使用して、多様性を限定することができる。
さらに、個々の配列決定読み取り値の初め（開始）および終わり（終止）部分における特有の配列データを使用して、単独で、またはバーコードの使用と組み合わせて、配列決定読み取り値の長さを使用することができる。場合によっては、本明細書に記載されている通り、バーコードは特有のものであってよい。他の事例において、バーコードそれ自体は、特有のものでなくてよい。この場合、個々の配列決定読み取り値の初め（開始）および終わり（終止）部分における配列データと組み合わせた非特有のバーコードの使用および配列決定読み取り値の長さは、個々の配列への特有の同一性の割り当てを可能にすることができる。同様に、これにより、特有の同一性を割り当てられた核酸の単一の鎖由来の断片は、親鎖由来の断片のその後の識別を可能にすることができる。
一般に、本明細書に提供される方法およびシステムは、下流適用配列決定反応のための無細胞ポリヌクレオチド配列の調製に有用である。多くの場合、配列決定方法は、古典的なサンガー配列決定である。配列決定方法として、ハイスループット配列決定、ピロシーケンス、合成による配列決定、単一分子配列決定、ナノポア配列決定、半導体配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ＲＮＡ－Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、デジタル遺伝子発現（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代配列決定、合成による単一分子配列決定（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、大規模並列配列決定、クローナル単一分子アレイ（Ｓｏｌｅｘａ）、ショット癌配列決定、マクサム・ギルバート配列決定、プライマーウォーキングおよび本技術分野で公知の他のいずれかの配列決定方法を挙げることができるが、これらに限定されない。
配列決定方法は、典型的には試料調製、配列読み取り値を生成するための調製された試料におけるポリヌクレオチドの配列決定、ならびに試料に関する定量的および／または定性的遺伝子情報を生成するための配列読み取り値のバイオインフォマティクス操作を伴う。試料調製は、典型的には試料中のポリヌクレオチドの、使用される配列決定プラットフォームと適合性の形態への変換を伴う。この変換は、ポリヌクレオチドのタグ付けを伴うことができる。本発明のある特定の実施形態では、タグは、ポリヌクレオチド配列タグを含む。配列決定において使用される変換方法論は、１００％効率的でなくてもよい。例えば、試料中のポリヌクレオチドを、約１～５％の変換効率で変換することは珍しくない、すなわち、試料中のポリヌクレオチドの約１～５％が、タグ付けされたポリヌクレオチドへと変換される。タグ付けされた分子へと変換されないポリヌクレオチドは、配列決定のためにタグ付けされたライブラリーにおいて表されない。したがって、初期遺伝子材料において低頻度で表される遺伝子バリアントを有するポリヌクレオチドは、タグ付けされたライブラリーにおいて表されず、したがって、配列決定または検出されない場合がある。変換効率を増加させることにより、初期遺伝子材料中のポリヌクレオチドが、タグ付けされたライブラリーにおいて表され、結果的に、配列決定によって検出される確率が増加する。さらに、ライブラリー調製の低変換効率問題に直接的に取り組むよりもむしろ、多くのプロトコールは現在まで、入力材料として１マイクログラムを超えるＤＮＡを要求する。しかし、入力試料材料が限られている、または低表示でのポリヌクレオチドの検出が所望される場合、高変換効率は、試料を効率的に配列決定することができ、そして／または斯かるポリヌクレオチドを適切に検出することができる。
一般に、変異検出は、ゲノムの選択的に濃縮された領域または精製および単離されたトランスクリプトームに対して行うことができる（１３０２）。本明細書に記載されている通り、遺伝子、癌遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子、プロモーター、調節配列エレメント、非コード領域、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡその他を挙げることができるが、これらに限定されない特異的領域は、無細胞ポリヌクレオチドの総集団から選択的に増幅することができる。これは、本明細書の記載通りに行うことができる。一例において、個々のポリヌクレオチド配列に対するバーコード標識ありまたはなしで、マルチプレックス配列決定を使用することができる。他の例において、本技術分野で公知のいずれかの核酸配列決定プラットフォームを使用して、配列決定を行うことができる。このステップは、複数のゲノム断片配列読み取り値を生成する（１３０４）。その上、別の対象から採取された対照試料から参照配列が得られる。場合によっては、対照対象は、公知の遺伝子異常性または疾患がないことが公知の対象とすることができる。場合によっては、このような配列読み取り値は、バーコード情報を含有することができる。他の例において、バーコードは利用されない。
配列決定後に、読み取り値は、品質スコアを割り当てることができる。品質スコアは、これらの読み取り値が、閾値に基づきその後の分析において有用となり得るか示す読み取り値の表示であってよい。場合によっては、一部の読み取り値は、その後のマッピングステップを行うのに十分な品質または長さではない。少なくとも９０％、９５％、９９％、９９．９％、９９．９９％または９９．９９９％の品質スコアを有する配列決定読み取り値は、データセットからフィルタリング除去することができる。他の事例において、少なくとも９０％、９５％、９９％、９９．９％、９９．９９％または９９．９９９％の品質スコアを割り当てられた配列決定読み取り値は、データセットからフィルタリング除去することができる。ステップ１３０６において、指定の品質スコア閾値を満たすゲノム断片読み取り値は、参照ゲノム、または変異を含有しないことが公知の参照配列にマッピングされる。マッピング整列後に、配列読み取り値は、マッピングスコアを割り当てられる。マッピングスコアは、各ポジションが、特有にマッピング可能であるか否か示す、参照配列に戻しマッピングされる表示または読み取り値であってよい。一部の事例では、読み取り値は、変異分析とは無関係の配列であってよい。例えば、一部の配列読み取り値は、混入物ポリヌクレオチドに起源をもつことができる。少なくとも９０％、９５％、９９％、９９．９％、９９．９９％または９９．９９９％のマッピングスコアを有する配列決定読み取り値は、データセットからフィルタリング除去することができる。他の事例において、９０％、９５％、９９％、９９．９％、９９．９９％または９９．９９９％未満のマッピングスコアを割り当てられた配列決定読み取り値は、データセットからフィルタリング除去することができる。
マッピング可能塩基毎に、マッピング可能性の最小閾値を満たさない塩基または低品質塩基は、参照配列に見出される対応する塩基によって置き換えることができる。
読み取り値カバレージを確かめ、各読み取り値において対照配列と比べたバリアント塩基を識別した後に、バリアント塩基の頻度は、読み取り値の総数で割ったバリアントを含有する読み取り値の数として計算することができる（１３０８）。これは、ゲノムにおけるマッピング可能ポジション毎の比として表現することができる。
塩基ポジション毎に、参照配列と比較して、全４種のヌクレオチドであるシトシン、グアニン、チミン、アデニンの頻度を分析することができる。ストカスティックまたは統計的モデリングアルゴリズムを適用して、塩基バリアント毎の頻度状態を反映するように、マッピング可能ポジション毎の正規化された比を変換することができる。場合によっては、このアルゴリズムは、次のうちの１種または複数を含むことができる：隠れマルコフモデル、動的プログラミング、サポートベクターマシン、ベイジアンまたは確率的モデリング、トレリス復号、ビタビ復号、期待値最大化、カルマンフィルタリング方法論およびニューラルネットワーク。
各塩基ポジションの別々の変異状態を利用して、参照配列のベースラインと比較して高頻度の分散を有する塩基バリアントを識別することができる。場合によっては、ベースラインは、少なくとも０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１．０％、２．０％、３．０％、４．０％、５．０％、１０％または２５％の頻度を表すことができる。他の事例において、ベースラインは、少なくとも０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１．０％、２．０％、３．０％、４．０％、５．０％、１０％または２５％の頻度を表すことができる。場合によっては、塩基バリアントまたは変異を有する全ての隣接する塩基ポジションをセグメントへと統合して、変異の存在または非存在を報告することができる。場合によっては、他のセグメントと統合する前に様々なポジションをフィルタリングすることができる。
塩基ポジション毎の分散の頻度の計算後に、参照配列と比較して、対象に由来する配列における特異的ポジションに対し最大偏差を有するバリアントは、変異として識別することができる。場合によっては、変異は、癌変異であってよい。他の事例において、変異は、疾患状態と相関し得る。
変異またはバリアントは、単一塩基置換または小型のインデル、トランスバージョン、転位置、逆位、欠失、トランケーションまたは遺伝子トランケーションが挙げられるが、これらに限定されない遺伝子異常性を含むことができる。場合によっては、変異は、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０ヌクレオチドの長さであってよい。他の場合では、変異は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０ヌクレオチドの長さであってよい。
次に、以前の読み取りを使用して、コンセンサスが決定される。これは、対応する塩基の以前の信頼スコアを審査することによって為され、一致する以前の信頼スコアが存在する場合、現在の信頼スコアが増加される（１３１４）。以前の信頼スコアが存在するが不一致である場合、一実施形態では、現在の信頼スコアは修飾されない（１３１６）。他の実施形態では、信頼スコアは、一致していない以前の信頼スコアに関して既定の様式で調整される。ファミリーが初めて検出される場合、現在の信頼スコアは、偽の読み取りの可能性があるため低減され得る（１３１８）。プロセスは、その後に、塩基ポジション毎に各塩基の分散の頻度を別々のバリアント状態へと変換するステップを含むことができる（１３２０）。
本明細書に記載されている方法およびシステムを使用して、多数の癌を検出することができる。癌細胞は、大部分の細胞と同様に、古い細胞が死亡し、より新しい細胞によって置き換えられるターンオーバーの速度によって特徴付けることができる。一般に、所定の対象における脈管構造と接触した死細胞は、血流中にＤＮＡまたはＤＮＡの断片を放出することができる。これは、疾患の様々なステージにおける癌細胞にも当てはまる。癌細胞は、疾患のステージに依存して、コピー数バリエーションや変異等の様々な遺伝子異常性によって特徴付けることもできる。この現象を使用して、本明細書に記載されている方法およびシステムを使用して、個体における癌の存在または非存在を検出することができる。
例えば、癌のリスクがある対象由来の血液を採取し、本明細書に記載されている通りに調製して、無細胞ポリヌクレオチドの集団を生成することができる。一例において、これは、無細胞ＤＮＡであってよい。本開示のシステムおよび方法を用いて、存在するある特定の癌に存在し得る変異またはコピー数バリエーションを検出することができる。本方法は、疾患の症状または他の特質の非存在にもかかわらず、身体における癌性細胞の存在の検出に役立つことができる。
検出され得る癌の型および数として、血液癌、脳癌、肺癌、皮膚癌、鼻癌、咽喉癌、肝臓癌、骨癌、リンパ腫、膵臓癌、皮膚癌、腸癌、直腸癌、甲状腺癌、膀胱癌、腎臓癌、口内癌、胃癌、固形状態の腫瘍、不均一な腫瘍、均一な腫瘍その他を挙げることができるが、これらに限定されない。
本システムおよび方法を使用して、癌を引き起こすまたはこれから引き起こされ得るいずれかの数の遺伝子異常性を検出することができる。そのようなものとして、感染および癌に関連する、変異、変異、インデル、コピー数バリエーション、トランスバージョン、転位置、逆位、欠失、異数性、部分的異数性、倍数性、染色体不安定性、染色体構造変化、遺伝子融合、染色体融合、遺伝子トランケーション、遺伝子増幅、遺伝子重複、染色体損傷、ＤＮＡ損傷、核酸化学修飾の異常な変化、エピジェネティックパターンの異常な変化、核酸メチル化の異常な変化を挙げることができるが、これらに限定されない。
その上、本明細書に記載されているシステムおよび方法は、ある特定の癌の特徴付けに役立つように使用することもできる。本開示のシステムおよび方法から生成される遺伝子データは、開業医が、癌の特異的形態のより十分な特徴付けに役立たせることを可能にすることができる。多くの場合、癌は、組成およびステージ分類の両方において不均一である。遺伝子プロファイルデータは、癌の特異的サブタイプの特徴付けを可能にすることができ、これは、該特異的サブタイプの診断または処置において重要となり得る。この情報は、対象または開業医に、特異的な型の癌の予後に関する手がかりを提供することもできる。
本明細書に提供されるシステムおよび方法を使用して、特定の対象における既に公知の癌または他の疾患をモニタリングすることができる。これは、対象または開業医のいずれかが、疾患の進行と合致するよう処置選択肢を適応させることを可能にすることができる。この例において、本明細書に記載されているシステムおよび方法を使用して、疾患の経過の特定の対象の遺伝子プロファイルを構築することができる。一部の事例では、癌は進行し、より高悪性度かつ遺伝子に不安定になる可能性がある。他の例において、癌は、良性、不活性または休止状態を維持する可能性がある。本開示のシステムおよび方法は、疾患進行の決定において有用であり得る。
さらに、本明細書に記載されているシステムおよび方法は、特定の処置選択肢の有効性の決定において有用であり得る。一例において、処置が、より多くの癌が死亡し、ＤＮＡを脱落させることができるものとして成功した場合、成功した処置選択肢は、対象の血液において検出されるコピー数バリエーションまたは変異の量を実際に増加させることができる。他の例において、これは生じない可能性がある。別の例において、おそらくある特定の処置選択肢は、経時的な癌の遺伝子プロファイルと相関することができる。この相関は、治療法の選択において有用となり得る。その上、癌が、処置後に寛解にあると観察される場合、本明細書に記載されているシステムおよび方法は、残存する疾患または疾患再発のモニタリングにおいて有用となり得る。
本明細書に記載されている方法およびシステムは、癌のみに関連する変異およびコピー数バリエーションの検出に限定されなくてよい。様々な他の疾患および感染は、初期検出およびモニタリングに適することができる他の種類の状態をもたらすことができる。例えば、ある特定の事例において、遺伝子障害または感染性疾患は、対象内のある特定の遺伝子モザイク現象を引き起こすことができる。この遺伝子モザイク現象は、観察され得るコピー数バリエーションおよび変異を引き起こすことができる。別の例において、本開示のシステムおよび方法を使用して、身体内の免疫細胞のゲノムをモニタリングすることもできる。Ｂ細胞等の免疫細胞は、ある特定の疾患の存在により急速なクローン性増大を行うことができる。クローン性増大は、コピー数バリエーション検出を使用してモニタリングすることができ、ある特定の免疫状態をモニタリングすることができる。この例において、コピー数バリエーション分析を経時的に行って、特定の疾患がどの程度進行しているかについてのプロファイルを生成することができる。
さらに、本開示のシステムおよび方法を使用して、細菌またはウイルス等の病原体によって引き起こされ得る全身性感染それ自体をモニタリングすることもできる。コピー数バリエーションまたはさらには変異検出を使用して、感染の経過において、病原体の集団がどの程度変化しているかについて決定することができる。これは、ＨＩＶ／ＡＩＤｓまたは肝炎感染等、慢性感染において特に重要となることができ、それによって、ウイルスは、感染の経過においてより病原性のある形態へとライフサイクル状態を変化させるおよび／または変異させることができる。
本開示のシステムおよび方法を使用することができるさらに別の例は、移植対象のモニタリングである。一般に、移植された組織は、移植後に身体によってある程度の拒絶を行う。免疫細胞は、移植された組織の破壊を試みるため、本開示の方法を使用して、宿主身体の拒絶活性を決定またはプロファイルすることができる。これは、移植された組織の状態のモニタリングと共に拒絶の処置または防止の経過の改変において有用となり得る。
さらに、本開示の方法を使用して、対象における異常状態の不均一性を特徴付けることができ、本方法は、対象における細胞外ポリヌクレオチドの遺伝子プロファイルを生成するステップであって、遺伝子プロファイルが、コピー数バリエーションおよび変異分析に起因する複数のデータを含むステップを含む。場合によっては、癌が挙げられるが、これらに限定されない疾患は不均一となり得る。疾患細胞は、同一でなくてもよい。癌の例において、一部の腫瘍は、異なる型の腫瘍細胞、癌の異なるステージの一部の細胞を含むことが公知である。他の例において、不均一性は、疾患の複数の病巣を含むことができる。重ねて、癌の例において、複数の腫瘍病巣が存在する場合があり、その場合おそらく、１個または複数の病巣は、原発部位から伝播した転移の結果である。
本開示の方法を使用して、不均一疾患における異なる細胞に由来する遺伝子情報の総和であるデータのフィンガープリントまたはセットを生成またはプロファイルすることができる。このデータセットは、単独のまたは組み合わせたコピー数バリエーションおよび変異分析を含むことができる。
その上、本開示のシステムおよび方法を使用して、胎児起源の癌または他の疾患を診断、予後予測、モニタリングまたは観察することができる。すなわち、妊娠中の対象においてこのような方法論を用いて、そのＤＮＡおよび他のポリヌクレオチドが母体分子と共に循環し得る、生まれる前の対象における癌または他の疾患を診断、予後予測、モニタリングまたは観察することができる。
さらに、これらの報告は、インターネット経由で電子的に提出およびアクセスされる。配列データの分析は、対象の位置以外の場所で生じる。報告は、生成され、対象の位置に伝達される。インターネット接続可能なコンピュータ経由で、対象は、自身の腫瘍負荷を反映する報告にアクセスする。
医療提供者は、注釈付けされた情報を使用して、他の薬物処置選択肢を選択する、および／または薬物処置選択肢に関する情報を保険会社に提供することができる。本方法は、例えば、ＮＣＣＮ腫瘍学臨床診療ガイドライン（商標）またはアメリカ臨床腫瘍学会（ＡＳＣＯ）臨床診療ガイドラインにおける状態に関して薬物処置選択肢を注釈付けするステップを含むことができる。
報告において層別化される薬物処置選択肢は、追加的な薬物処置選択肢を収載することにより、報告において注釈付けすることができる。追加的な薬物処置は、適応外使用のためのＦＤＡ承認薬物であってよい。１９９３年包括的予算調整法（Omnibus Budget Reconciliation Act）（ＯＢＲＡ）における条項は、メディケアが、標準医学コンペンディアに含まれる抗癌薬の適応外使用をカバーすることを要求する。リストの注釈付けに使用される薬物は、全米総合癌情報ネットワーク（National Comprehensive Cancer Network）（ＮＣＣＮ）Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ（商標）、Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｍｅｄｅｘ ＤｒｕｇＤｅｘ（登録商標）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｇｏｌｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ’ｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍおよびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ－Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ（登録商標）を含むＣＭＳ承認されたコンペンディアに見出すことができる。
薬物処置選択肢は、特定の状態の１種または複数の分子マーカーを有する癌の処置において有用となり得る実験薬物を収載することにより、注釈付けすることができる。実験薬物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏデータ、ｉｎ ｖｉｖｏデータ、動物モデルデータ、前臨床治験データまたは臨床治験データが利用できる薬物であってよい。データは、例えば、American Journal of Medicine、Annals of Internal Medicine、Annals of Oncology、Annals of Surgical Oncology、Biology of Blood and Marrow Transplantation、Blood、Bone Marrow Transplantation、British Journal of Cancer、British Journal of Hematology、British Medical Journal、Cancer、Clinical Cancer Research、Drugs、European Journal of Cancer（以前は、the European Journal of Cancer and Clinical Oncology）、Gynecologic Oncology、International Journal of Radiation, Oncology, Biology, and Physics、The Journal of the American Medical Association、Journal of Clinical Oncology、Journal of the National Cancer Institute、Journal of the National Comprehensive Cancer Network(NCCN)、Journal of Urology、Lancet、Lancet Oncology、Leukemia、The New England Journal of MedicineおよびRadiation Oncologyを含む、CMS Medicare Benefit Policy Manualに収載されている雑誌に見出される査読された医学文献において公表されていてよい。
薬物処置選択肢は、収載された薬物を該薬物に関する科学情報へと繋げる電子ベースの報告にリンクを提供することにより注釈付けすることができる。例えば、薬物の臨床治験に関する情報（clinicaltrials.gov）へのリンクを提供することができる。報告が、コンピュータまたはコンピュータウェブサイトを経由して提供される場合、リンクは、脚注、ウェブサイトへのハイパーリンク、ポップアップボックスまたは情報を有するフライオーバーボックス等であってよい。報告および注釈付けされた情報は、印刷形態に提供することができ、注釈は、例えば、参考文献への脚注であってよい。
報告における１種または複数の薬物処置選択肢に注釈付けするための情報は、科学情報を記憶する商業的実体によって提供され得る。医療提供者は、注釈付けされた情報に収載されている実験薬物により、癌患者等の対象を処置することができ、医療提供者は、注釈付けされた薬物処置選択肢にアクセスし、科学情報（例えば、医学雑誌論文の印刷物）を検索し、薬物処置を提供するための償還の要求と共にこれ（例えば、印刷された雑誌論文）を保険会社に提出することができる。医者は、償還を可能にするために種々の診断関連群（ＤＲＧ）コードのいずれかを使用することができる。
報告における薬物処置選択肢は、薬物が影響を与える経路における他の分子成分に関する情報（例えば、薬物標的である細胞表面受容体の下流のキナーゼを標的とする薬物に関する情報）により注釈付けすることもできる。薬物処置選択肢は、１種または複数の他の分子経路成分を標的とする薬物に関する情報により注釈付けすることができる。経路に関する情報の識別および／または注釈は、別の会社に外部委託または下請けに出すことができる。
注釈付けされた情報は、例えば、薬物名（例えば、適応外使用のためのＦＤＡ承認薬物；ＣＭＳ承認コンペンディアに見出される薬物、および／または科学（医学）雑誌論文に記載されている薬物）、１種または複数の薬物処置選択肢に関連する科学情報、１種または複数の薬物に関する科学情報への１つまたは複数のリンク、１種または複数の薬物に関する臨床治験情報（例えば、clinicaltrials.gov/由来の情報）、薬物に関する科学情報の引用への１つまたは複数のリンク等であってよい。
注釈付けされた情報は、報告におけるいずれかの位置に挿入することができる。注釈付けされた情報は、報告における複数の位置に挿入することができる。注釈付けされた情報は、報告の、層別化された薬物処置選択肢に関するセクション近くに挿入することができる。注釈付けされた情報は、報告の、層別化された薬物処置選択肢とは別々の頁に挿入することができる。層別化された薬物処置選択肢を含有しない報告は、情報により注釈付けすることができる。
本システムは、対象（例えば、癌患者）から単離された試料（例えば、腫瘍細胞）における薬物の効果に関する報告を含むこともできる。癌患者由来の腫瘍を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ培養は、当業者に公知の技法を使用して確立することができる。本システムは、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養および／または異種移植モデルを使用した、ＦＤＡ承認適応外薬物または実験薬物のハイスループットスクリーニングを含むこともできる。本システムは、再発検出のための腫瘍抗原のモニタリングを含むこともできる。
本システムは、癌を有する対象の報告のインターネット接続可能なアクセスを提供することができる。本システムは、手持ち式ＤＮＡシーケンサーまたは卓上型ＤＮＡシーケンサーを使用することができる。ＤＮＡシーケンサーは、ＤＮＡ配列決定プロセスの自動化に使用される科学機器である。ＤＮＡの試料が与えられると、ＤＮＡシーケンサーは、４種の塩基：アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンの順序の決定に使用される。ＤＮＡ塩基の順序は、読み取り値と呼ばれるテキスト文字列として報告される。一部のＤＮＡシーケンサーは、ヌクレオチドに取り付けられた蛍光色素に起源をもつ光シグナルを分析するため、光学機器と考慮することもできる。
データは、ＤＮＡシーケンサーによって、直接接続またはインターネットを通して、処理のためのコンピュータに送られる。システムのデータ処理態様は、デジタル電子回路において、またはコンピュータハードウェア、ファームウェア、ソフトウェアにおいて、またはこれらの組合せにおいて実装することができる。本発明のデータ処理装置は、プログラム可能プロセッサによる実装のための機械可読記憶デバイスにおいて有形具体化されたコンピュータプログラム製品において実装することができ；本発明のデータ処理方法ステップは、入力データにおいて操作し、出力を生成することにより本発明の機能を果たすための命令のプログラムを実行する、プログラム可能プロセッサによって行うことができる。本発明のデータ処理態様は、データ記憶システムからデータおよび命令を受け取り、それにデータおよび命令を伝達するようカップリングされた少なくとも１個のプログラム可能プロセッサと、少なくとも１個の入力デバイスと、少なくとも１個の出力デバイスとを含むプログラム可能システムにおいて実行可能な、１種または複数のコンピュータプログラムにおいて有利に実行することができる。各コンピュータプログラムは、所望であれば、高レベル手続き型またはオブジェクト指向型プログラミング言語またはアセンブリもしくは機械語において実装することができ；いずれの場合でも、言語は、コンパイルまたは解釈された言語となり得る。適したプロセッサは、例として、一般および特殊な目的のマイクロプロセッサの両方を含む。一般に、プロセッサは、リードオンリーメモリおよび／またはランダムアクセスメモリから命令およびデータを受け取るであろう。コンピュータプログラム命令およびデータの有形具体化に適した記憶デバイスは、例として、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭおよびフラッシュメモリデバイス等、半導体メモリデバイス；内蔵ハードディスクおよびリムーバブルディスク等、磁気ディスク；光磁気ディスク；ならびにＣＤ－ＲＯＭディスクを含む、全ての形態の不揮発性メモリを含む。前述のいずれかは、ＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）によって補足するまたはこれに取り込むことができる。
ユーザーとの相互作用を提供するために、本発明は、ユーザーに情報を表示するためのモニタまたはＬＣＤ（液晶ディスプレイ）スクリーン等の表示デバイスと、キーボード、マウスもしくはトラックボール等の二次元ポインティングデバイス、またはデータグローブもしくはジャイロスコープマウス等の三次元ポインティングデバイス等、ユーザーがコンピュータシステムに入力を提供することができる入力デバイスとを有するコンピュータシステムを使用して実装することができる。コンピュータシステムは、コンピュータプログラムがユーザーと相互作用するグラフィカル・ユーザー・インターフェースを提供するようにプログラムすることができる。コンピュータシステムは、バーチャル・リアリティ、三次元ディスプレイインターフェースを提供するようにプログラムすることができる。
治療介入
本開示の方法は、対象における疾患の形態により正確に方向づけられた治療介入の提供と、このような治療介入の経時的な較正とを可能にする。この精度は、一部には、腫瘍不均一性において反映される対象の全身腫瘍状態をプロファイルすることができる精度を反映する。よって、治療介入は、このプロファイルを有する癌に対して、これらのバリアントのうちいずれか１タイプを有する癌に対するよりも有効である。
治療介入は、治療効果を生成する介入である（例えば、治療上有効である）。治療上有効な介入は、癌等、疾患を防止する、その進行を遅らせる、その状態を改善する（例えば、その寛解を引き起こす）、またはそれを治癒する。治療介入は、例えば、化学療法、放射線療法、外科手術、免疫療法等の処置の投与、医薬品もしくは栄養補助食品の投与、または食事等の行動の変化を含むことができる。治療有効性の一測定値は、少なくとも１００名の対象にわたり介入を受けている対象の少なくとも９０％に対する有効性である。
癌における薬物標的およびこれらの標的に対し有効な薬物を表１および２に表記する（Baileyら、Discovery Medicine、１８巻＃９２、２／７／１４から抜粋）。
Figure 2022024040000002
Figure 2022024040000003
Figure 2022024040000004
Figure 2022024040000005
一実施形態では、疾患不均一性のプロファイルに基づき、疾患細胞に見出される遺伝子バリアントのタイプおよびその相対量（例えば、比率）の両方を考慮に入れる治療介入が決定される。治療介入は、各クローンバリアントが、独立して処置されるべき異なる癌であるかのように、対象を処置することができる。場合によっては、１種または複数の遺伝子バリアントが、無症候性（sub-clinical）量未満で、例えば、優位に検出されるクローンよりも少なくとも５×低い、少なくとも１０×低いまたは少なくとも１００×低い量で検出される場合、これらのバリアントは、臨床閾値または有意な相対頻度に上昇する（例えば、上述の閾値を超える）まで、治療介入から除外することができる。
複数の異なる遺伝子バリアントが、異なる量、例えば、異なる数または異なる相対量で見出される場合、治療介入は、遺伝子バリアントのそれぞれを有する疾患に対して有効な処置を含むことができる。例えば、癌の場合は、遺伝子または遺伝子増幅の変異体型等、遺伝子バリアントは、数個の遺伝子（例えば、多数クローンおよび少数クローン）において検出することができる。これらの形態のそれぞれは、使用可能であり得る、すなわち、処置は、特定のバリアントを有する癌が、それに対し応答性であることが公知であり得る。しかし、腫瘍不均一性のプロファイルは、バリアントの１種が、例えば、他の２種のバリアントのそれぞれの５倍のレベルでポリヌクレオチドに存在することを示すことができる。各薬物がバリアントのそれぞれを有する癌に対して相対的により有効な、３種の異なる薬物の対象への送達を伴う治療介入を決定することができる。薬物は、カクテルとしてまたは逐次に送達することができる。
さらなる実施形態では、薬物は、ＤＮＡにおけるバリアントの相対量を反映するように層別化された用量で投与することができる。例えば、最も一般的なバリアントに対して有効な薬物は、２種のより一般的でないバリアントに対して有効な薬物よりも多い量で投与することができる。
あるいは、腫瘍不均一性のプロファイルは、この疾患が典型的に応答する薬物に対し抵抗性の遺伝子バリアントを有する癌細胞の亜集団の存在を示すことができる。この場合、治療介入は、抵抗性バリアントがない腫瘍細胞に対して有効な第１の薬物と、抵抗性バリアントを有する腫瘍細胞に対して有効な第２の薬物の両方を含むステップを伴うことができる。重ねて、用量は、プロファイルにおいて検出される各バリアントの相対量を反映するように層別化することができる。
別の実施形態では、腫瘍不均一性のプロファイルの変化は、経時的に試験され、治療介入が、変化する腫瘍を処置するように開発される。例えば、疾患不均一性は、複数の異なる時点で決定することができる。本開示のプロファイリング方法を使用して、腫瘍進化に関してより正確な推定を行うことができる。特に、新たなクローン性亜集団は、治療法の第１の波によってもたらされる寛解後に出現するため、これは、開業医が、疾患の進化をモニタリングすることを可能にする。この場合、治療介入は、変化する腫瘍を処置するように経時的に較正することができる。例えば、プロファイルは、癌が、ある特定の処置に対し応答性の形態を有することを示すことができる。処置は送達され、腫瘍負荷は、経時的に減少すると観察された。いくつかの時点で、遺伝子バリアントは、処置に対し応答性でない癌細胞の集団の存在を示す腫瘍において見出された。すると、非応答性のマーカーを有する細胞を標的とする新たな治療介入が決定される。
化学療法に応答して、優位な腫瘍形態は、ダーウィン選択により、治療レジメンに対し癌を無応答性にする変異体を保有する癌細胞に最終的に取って代わられる場合がある。このような抵抗性変異体の出現は、本開示の方法により遅延され得る。本方法の一実施形態では、対象は、１回または複数のパルス化治療サイクルに付され、各パルス化治療サイクルは、第１の量で薬物が投与される第１の期間と、第２の低減された量で薬物が投与される第２のサイクルとを含む。第１の期間は、第１の臨床レベルを上回って検出される腫瘍負荷によって特徴付けられる。第２の期間は、第２の臨床レベルを下回って検出される腫瘍負荷によって特徴付けられる。第１および第２の臨床レベルは、異なるパルス化治療サイクルにおいて異なることができる。そこで、例えば、第１の臨床レベルは、続くサイクルにおいてより低くなることができる。複数のサイクルは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８回またはそれを超えるサイクルを含むことができる。例えば、ＢＲＡＦ変異体Ｖ６００Ｅは、ｃｆＤＮＡにおける５％の腫瘍負荷を示す量で、疾患細胞ポリヌクレオチドにおいて検出することができる。化学療法は、ダブラフェニブから開始することができる。その後の検査は、ｃｆＤＮＡにおけるＢＲＡＦ変異体の量が、０．５％を下回ってまたは検出不能レベルまで下落することを示すことができる。この時点で、ダブラフェニブ治療法は、停止することができるまたは有意に短縮することができる。さらにその後の検査は、ＢＲＡＦ変異を有するＤＮＡが、ｃｆＤＮＡにおけるポリヌクレオチドの２．５％に上昇したことを見出すことができる。この時点で、例えば、初期処置と同じレベルで、ダブラフェニブ治療法が再開される。その後の検査は、ＢＲＡＦ変異を有するＤＮＡが、ｃｆＤＮＡにおけるポリヌクレオチドの０．５％に減少したことを見出すことができる。重ねて、ダブラフェニブ治療法は、停止または低減される。サイクルは、何度も反復することができる。
図７は、対象における疾患のモニタリングおよび処置の例示的な経過を示す。採血１の時点で検査した対象は、１．４％の腫瘍負荷を有し、遺伝子１、２および３における遺伝子変化を提示する。この対象は、薬物Ａで処置される。ある時間の後、処置は中断される。第２の後の時点において、第２の採血は、寛解した癌を示す。第３の後の時点において、第３の採血は、癌が再発したことを示し、この事例において、遺伝子４における遺伝子バリアントを提示する。そこで、この対象を、このバリアントを有する癌が応答性である薬物Ｂの経過に置く。
別の実施形態では、治療介入は、本来の薬物に対し抵抗性のバリアント型の上昇の検出後に変化させることができる。例えば、ＥＧＦＲ変異Ｌ８５８Ｒを有する癌は、エルロチニブによる治療法に応答する。しかし、ＥＧＦＲ変異Ｔ７９０Ｍを有する癌は、エルロチニブに対し抵抗性である。しかし、これは、ルキソリチニブに対し応答性である。本開示の方法は、腫瘍プロファイルの変化をモニタリングするステップと、薬物抵抗性に関連する遺伝子バリアントが、既定の臨床レベルまで上昇する場合、治療介入を変化させるステップとを伴う。
データベース
別の実施形態では、癌患者から収集された連続的試料由来の遺伝子情報が記録されたデータベースが構築される。このデータベースは、体重、有害効果、組織学的検査、血液検査、Ｘ線検査情報、以前の処置、癌型等、介在する処置および他の臨床的に関連性がある情報を含有することもできる。連続的検査結果を使用して、特に、血液試料により使用される際の、処置の有効性を推定することができ、これは、自己報告または医師によるＸ線検査報告よりもバイアスがない腫瘍負荷の推定をもたらすことができる。処置有効性は、同様のゲノムプロファイルを有する者によってクラスター化することができ、これは逆もまた同じである。ゲノムプロファイルは、例えば、一次遺伝子変化、二次遺伝子変化（複数可）、これらの遺伝子変化の相対量および腫瘍負荷を中心にして組織化することができる。このデータベースは、その後の患者の決断支持のために使用することができる。生殖系列および体細胞変化の両方は、同様に処置有効性を決定するために使用することができる。初期に有効であった処置が失敗し始めた場合、獲得された抵抗性変化は、データベースから推定することもできる。この失敗は、Ｘ線検査、血液または他の手段により検出することができる。獲得された抵抗性機構の推定に使用される一次データは、患者毎の処置後に収集されるゲノム腫瘍プロファイルである。このデータを使用して、可能性がある処置応答に定量的限界を設定すると共に、処置失敗までの時間を予測することもできる。所定の処置および腫瘍ゲノムプロファイルに関する可能性がある獲得された抵抗性変化に基づき、処置レジメンは、可能性が最も高い抵抗性変化の獲得を抑制するように修飾することができる。
コンピュータシステム
本開示の方法は、コンピュータシステムを使用して、またはその助けを借りて実装することができる。図５は、本開示の方法を実装するようにプログラムまたは他の仕方で構成された、コンピュータシステム１５０１を示す。コンピュータシステム１５０１は、中央処理ユニット（ＣＰＵ、本明細書において「プロセッサ」および「コンピュータプロセッサ」とも称される）１５０５を含む。コンピュータシステム１５０１は、メモリまたはメモリ位置１５１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ）と、電子記憶ユニット１５１５（例えば、ハードディスク）と、１種または複数の他のシステムと連絡するための連絡インターフェース１５２０（例えば、ネットワークアダプタ）と、キャッシュ、他のメモリ、データ記憶および／または電子ディスプレイアダプタ等の周辺デバイス１５２５も含む。メモリ１５１０、記憶ユニット１５１５、インターフェース１５２０および周辺デバイス１５２５は、連絡バス（実線）を介してＣＰＵ１５０５と連絡している。記憶ユニット１５１５は、データを記憶するためのデータ記憶ユニット（またはデータリポジトリ）であってよい。コンピュータシステム１５０１は、連絡インターフェース１５２０の助けを借りて、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）１５３０に作動可能にカップリングすることができる。ネットワーク１５３０は、インターネット、インターネットおよび／またはエクストラネット、あるいはインターネットと連絡したイントラネットおよび／またはエクストラネットであってよい。ネットワーク１５３０は、場合によっては、遠隔通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク１５３０は、クラウドコンピューティング等、分散コンピューティングを可能にし得る１個または複数のコンピュータサーバを含むことができる。ＣＰＵ１５０５は、プログラムまたはソフトウェアにおいて具体化することができる一連の機械可読命令を実行することができる。命令は、メモリ１５１０等、メモリ位置において記憶することができる。記憶ユニット１５１５は、ドライバー、ライブラリーおよび保存されたプログラム等、ファイルを記憶することができる。コンピュータシステム１５０１は、ネットワーク１５３０を介して１個または複数の遠隔コンピュータシステムと連絡することができる。本明細書に記載されている方法は、例えば、メモリ１５１０または電子記憶ユニット１５１５等、コンピュータシステム１５０１の電子記憶位置に記憶された、機械（例えば、コンピュータプロセッサ）実行可能コードによって実装することができる。機械実行可能または機械可読コードは、ソフトウェアの形態で提供することができる。コンピュータシステム１５０１等、本明細書に提供されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングにおいて具体化することができる。本技術の様々な態様は、典型的には、ある種の機械可読媒体において行われるまたは具体化される機械（またはプロセッサ）実行可能コードおよび／または関連するデータの形態の、「製品」または「製造品」であると考えることができる。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスク等、電子記憶ユニットにおいて記憶され得る。「記憶」型の媒体は、ソフトウェアプログラミングのためにいずれかの時点で非一過性記憶を提供することができる、様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブその他等、コンピュータ、プロセッサもしくは類似物のありと全ての有形メモリまたはその関連するモジュールを含むことができる。ソフトウェアの全体または部分は、ある時点で、インターネットまたは様々な他の遠隔通信ネットワークを介して連絡することができる。コンピュータシステム１５０１は、例えば、試料分析の１種または複数の結果を提供するためのユーザー・インターフェース（ＵＩ）を含む電子ディスプレイを含むことができる、またはそれと連絡することができる。
図２に表されるように、ゲノム中のヌクレオチドポジション（例えば、遺伝子座）は、数によって指定することができる。塩基コールの約１００％が参照配列と同一である、または塩基コールの約１００％が参照配列と異なるポジションは、ｃｆＤＮＡのホモ接合性を表すと推測される（正常と推定される）。塩基コールの約５０％が参照配列と同一であるポジションは、ｃｆＤＮＡのヘテロ接合性を表すと推測される（同様に正常と推定される）。遺伝子座での塩基コールのパーセンテージが実質的に５０％未満であり、塩基コーリング系の検出限界より上であるポジションは、腫瘍関連の遺伝子バリアントを表すと推測される。
（実施例１）
コピー数バリエーション検出のための方法
血液採取
１０～３０ｍＬの血液試料を室温で採取する。細胞を除去するために、試料を遠心分離する。遠心分離の後、血漿を収集する。
ｃｆＤＮＡ抽出
試料を、プロテイナーゼＫ消化に付す。ＤＮＡを、イソプロパノールで沈殿させる。ＤＮＡをＤＮＡ精製カラム（例えば、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ血液ミニキット）で捕捉し、１００μｌ溶液で溶出する。５００ｂｐ未満のＤＮＡを、Ａｍｐｕｒｅ ＳＰＲＩ磁気ビーズ捕捉（ＰＥＧ／塩）で選択する。結果として生じる生成物を、３０μｌのＨ２Ｏに懸濁させる。サイズ分布をチェックし（主ピーク＝１６６ヌクレオチド；マイナーピーク＝３３０ヌクレオチド）、定量化する。抽出したＤＮＡの５ｎｇは、概ね１７００個のハプロイドゲノム相当物（「ＨＧＥ」）を含有する。ＤＮＡとＨＧＥの量の間の一般的な相関は、以下の通りである：３ｐｇ ＤＮＡ＝１ＨＧＥ；３ｎｇ ＤＮＡ＝１Ｋ ＨＧＥ；３μｇ ＤＮＡ＝１Ｍ ＨＧＥ；１０ｐｇ ＤＮＡ＝３ＨＧＥ；１０ｎｇ ＤＮＡ＝３Ｋ ＨＧＥ；１０μｇ ＤＮＡ＝３Ｍ ＨＧＥ。
「単一分子」ライブラリープレップ
高効率ＤＮＡタグ付け（＞８０％）を、末端修復、Ａ－テーリングおよび過負荷ヘアピンアダプターによる２つの異なるオクトマー（octomers）（すなわち、４つの組合せ）との粘着末端ライゲーションによって実行する。出発材料として、２．５ｎｇのＤＮＡ（すなわち概ね８００ＨＧＥ）を使用する。各ヘアピンアダプターは、その非相補的部分にランダム配列を含む。各ＤＮＡ断片の両末端に、ヘアピンアダプターを付ける。タグを付けた各断片は、ヘアピンアダプターの上のオクトマー配列と挿入断片配列の内因性部分の組合せによって識別することができる。
タグを付けたＤＮＡを１２サイクルのＰＣＲによって増幅して、出発材料中の８００ＨＧＥの各々の概ね５００コピーを含有する約１～７μｇのＤＮＡを生成する。
ＰＣＲ反応を最適化するために、緩衝液最適化、ポリメラーゼ最適化およびサイクル低減を実行することができる。増幅偏り、例えば、非特異的偏り、ＧＣ偏りおよび／またはサイズ偏りも、最適化によって同様に低減される。ノイズ（複数可）（例えば、ポリメラーゼによって導入される誤り）は、高忠実度ポリメラーゼを使用することにより低減される。
配列は、以下の通りに濃縮することができる：ビオチン標識ビーズを目的領域（ＲＯＩ）へのプローブと使用して、ＲＯＩを有するＤＮＡを捕捉する。ＲＯＩを１２サイクルのＰＣＲで増幅して、２０００倍の増幅を生成する。
大規模並行配列決定
試料の０．１～１％（概ね１００ｐｇ）を、配列決定のために使用する。結果として生じるＤＮＡを次に変性し、８ｐＭまで希釈し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサーに加える。
デジタル生命情報科学
配列読み取り値をファミリーに分類し、各ファミリーに約１０個の配列読み取り値とする。ファミリーの各ポジションを選出する（例えば、偏った選出）ことによって、ファミリーをコンセンサス配列に崩壊させる。８または９メンバーが一致するならば、コンセンサス配列のために塩基が呼び出される。メンバーの６０％以下が一致するならば、コンセンサス配列のために塩基が呼び出されない。
結果として生じるコンセンサス配列を、ｈｇ１９などの参照ゲノムにマッピングする。コンセンサス配列中の各塩基は、約３０００の異なるファミリーによってカバーされる。各配列の品質スコアを計算し、それらの品質スコアに基づいて配列をフィルターにかける。コンセンサス配列中の各ポジションの塩基コールを、ＨＧ－１９参照配列と比較する。塩基コールが参照配列と異なる各ポジションにおいて、異なる１つまたは複数の塩基の同一性および遺伝子座の全塩基コールに対応するそれらのパーセンテージを決定し、報告する。
各遺伝子座で塩基の分布を数えることによって、配列変異を検出する。読み取り値の９８％が同じ塩基（ホモ接合）を有し、２％が異なる塩基を有するならば、遺伝子座はおそらく癌ＤＮＡからの配列バリアントを有する可能性がある。
遺伝子座にマッピングされる配列（塩基）の総数を数え、対照遺伝子座と比較することによって、ＣＮＶを検出する。ＣＮＶ検出を増加させるために、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡまたはＮＴＲＫ１遺伝子上の領域を含む特異的領域でＣＮＶ分析を実行する。
（実施例２）
試料中の目に見えない分子総数を決定することによって塩基コーリングを補正するための方法
断片を増幅し、増幅された断片の配列を読み取って整列した後に、断片を塩基コーリングに付す。増幅された断片および目に見えない増幅された断片の数の変異は、塩基コーリングに誤りを導入することがある。これらの変異は、目に見えない増幅された断片の数を計算することによって補正される。
遺伝子座Ａ（恣意的な遺伝子座）のための塩基コーリングのとき、Ｎ増幅断片があると先ず仮定する。配列リードアウトは、２種類の断片：二本鎖断片および一本鎖断片から来ることができる。以下は、試料中の目に見えない分子の総数を計算する理論的例である。
Ｎは、試料中の全分子数である。
１０００を、検出された二重鎖の数と仮定する。
５００を、検出された一本鎖分子の数と仮定する。
Ｐは、鎖を見る確率である。
Ｑは、鎖を検出しない確率である。
Ｑ＝１－Ｐ
１０００＝ＮＰ（２）
５００＝Ｎ２ＰＱ
１０００／Ｐ（２）＝Ｎ
５００÷２ＰＱ＝Ｎ
１０００／Ｐ（２）＝５００÷２ＰＱ
１０００＊２ＰＱ＝５００Ｐ（２）
２０００ＰＱ＝５００Ｐ（２）
２０００Ｑ＝５００Ｐ
２０００（１－Ｐ）＝５００Ｐ
２０００－２０００Ｐ＝５００Ｐ
２０００＝５００Ｐ＋２０００Ｐ
２０００＝２５００Ｐ
２０００÷２５００＝Ｐ
０．８＝Ｐ
１０００／Ｐ（２）＝Ｎ
１０００÷０．６４＝Ｎ
１５６２＝Ｎ
であるので、目に見えない断片の数＝６２。
（実施例３）
患者の癌関連体細胞バリアントでの遺伝子バリアントの識別
癌関連体細胞バリアントで遺伝子バリアントを高感度で識別するために遺伝子のパネルを分析するために、アッセイを使用する。
無細胞ＤＮＡを患者の血漿から抽出し、ＰＣＲによって増幅する。増幅された標的遺伝子の大規模並行配列決定によって、遺伝子バリアントを分析する。１セットの遺伝子について、そのような配列決定カバレージが臨床的有用性を有することを示したので、全てのエクソンを配列決定する（表３）。別のセットの遺伝子について、配列決定カバレージは、以前に報告された体細胞変異を有するエクソンを含んだ（表４）。最小限の検出可能な変異体対立遺伝子（検出限界）は患者試料の無細胞ＤＮＡ濃度に依存し、それは末梢血１ｍＬにつき１０未満から１，０００超まで異なることができる個数のゲノム相当物であった。増幅は、より少ない量の無細胞ＤＮＡおよび／または低レベルの遺伝子コピー増幅の試料では検出することができない。ある特定の試料またはバリアントの特徴は、分析感度の低減、例えば低い試料品質または不適切な収集をもたらした。
血液中を循環する無細胞ＤＮＡで見出される遺伝子バリアントのパーセンテージは、この患者の特有の腫瘍生物学に関係する。血液中の循環する無細胞ＤＮＡで検出された遺伝子バリアントの量／パーセンテージに影響した因子には、腫瘍増殖、ターンオーバー、サイズ、不均一性、血管化、疾患進行または処置が含まれる。表５は、この患者で検出された変化した循環無細胞ＤＮＡのパーセンテージ（％ｃｆＤＮＡ）または対立遺伝子頻度を注釈する。検出された遺伝子バリアントのいくつかは、％ｃｆＤＮＡによる下降順序で掲載される。
遺伝子バリアントは、この患者の血液検体から単離した循環無細胞ＤＮＡで検出される。これらの遺伝子バリアントは癌関連体細胞バリアントであり、そのいくつかは特定の処置に対する臨床応答の増加または低減と関連付けられた。「マイナー変化」は、「主要な変化」の対立遺伝子頻度の１０％未満で検出される変化と規定される。主要な変化は、遺伝子座で支配的な変化である。これらの変化で検出された対立遺伝子頻度（表５）およびこの患者の関連する処置が注釈される。
表３および４に掲載される全ての遺伝子は、検査の一部として分析される。増幅は、この患者の血液検体から単離した循環無細胞ＤＮＡのＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲまたはＭＥＴで検出されない。
遺伝子バリアントを含む患者検査結果を、表６に掲載する。
表４に関し、１３位で、試料で少なくとも９８．８％の頻度で検出されるヌクレオチドは、参照配列中のヌクレオチドとは異なり、これらの遺伝子座のホモ接合性を示す。例えば、ＫＲＡＳ遺伝子では、２５３４６４６２位で、症例の１００％において参照ヌクレオチドのＣではなくＴが検出された。
３５位では、試料で４１．４％～５５％の頻度で検出されるヌクレオチドは、参照配列中のヌクレオチドとは異なり、これらの遺伝子座のヘテロ接合性を示す。例えば、ＡＬＫ遺伝子では、２９４５５２６７位で、症例の５０％において参照ヌクレオチドのＡではなくＧが検出された。
３つのポジションで、９％未満の頻度で検出されるヌクレオチドは、参照配列のヌクレオチドとは異なる。これらには、ＢＲＡＦ（１４０４５３１３６ Ａ＞Ｔ、８．９％）、ＮＲＡＳ（１１５２５６５３０ Ｇ＞Ｔ ２．６％）およびＪＡＫ２（５０７３７７０ Ｇ＞Ｔ １．５％）でのバリアントが含まれる。それらは、癌ＤＮＡからの体細胞変異であると推定される。
腫瘍関連遺伝子バリアントの相対量を、計算する。ＢＲＡＦ：ＮＲＡＳ：ＪＡＫ２の量の比は、８．９：２．６：１．５または１：０．２９：０．１７である。この結果から、腫瘍不均一性の存在を推測することができる。例えば、１つの可能な解釈は、腫瘍細胞の１００％がＢＲＡＦでバリアントを含有し、８３％がＢＲＡＦおよびＮＲＡＳでバリアントを含有し、１７％がＢＲＡＦ、ＮＲＡＳおよびＪＡＫ２でバリアントを含有するということである。しかし、ＣＮＶの分析は、ＢＲＡＦの増幅を示すことができ、その場合には、腫瘍細胞の１００％はＢＲＡＦおよびＮＲＡＳでバリアントを有することができる。
Figure 2022024040000006
Figure 2022024040000007
Figure 2022024040000008
Figure 2022024040000009
（実施例４）
アッセイによって分析される遺伝子のための患者特異的検出限界の決定
実施例３の方法を使用して、患者の無細胞ＤＮＡで遺伝子変化を検出する。これらの遺伝子の配列読み取り値は、エクソンおよび／またはイントロン配列を含む。
（実施例５）
ワトソンおよびクリック配列を比較する配列の誤りを補正する
二本鎖の無細胞ＤＮＡを、患者の血漿から単離する。それぞれは特徴のあるバーコードを含む１６個の異なる気泡含有アダプターを使用して、無細胞ＤＮＡ断片にタグを付ける。気泡含有アダプターは、ライゲーションによって各無細胞ＤＮＡ断片の両末端に付ける。ライゲーションの後、無細胞ＤＮＡ断片の各々は、無細胞ＤＮＡ断片の各末端の明瞭なバーコードの配列および２つの２０ｂｐの内因性配列によって明確に識別することができる。
タグを付けた無細胞ＤＮＡ断片は、ＰＣＲによって増幅する。一群の癌関連遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを含むビーズを使用して、増幅された断片を濃縮する。したがって、癌関連遺伝子の群からの無細胞ＤＮＡ断片は、選択的に濃縮される。
それぞれは配列決定プライマー結合部位、試料バーコードおよび細胞流配列を含む配列決定アダプターを、濃縮されたＤＮＡ分子に付ける。結果として生じる分子を、ＰＣＲによって増幅する。
増幅された断片の両方の鎖を配列決定する。各気泡含有アダプターは非相補的部分（例えば、気泡）を含むので、気泡含有アダプターの１本の鎖の配列は他の鎖（相補体）の配列と異なる。したがって、元の無細胞ＤＮＡのワトソン鎖に由来するアンプリコンの配列読み取り値は、付着している気泡含有アダプター配列によって、元の無細胞ＤＮＡのクリック鎖からのアンプリコンから区別することができる。
元の無細胞ＤＮＡ断片の鎖からの配列読み取り値を、元の無細胞ＤＮＡ断片の他の鎖からの配列読み取り値と比較する。バリアントが元の無細胞ＤＮＡ断片の他の鎖でなく１本の鎖からの配列読み取り値だけに存在するならば、このバリアントは真のではなく誤り（例えば、ＰＣＲおよび／または増幅からもたらされる）の遺伝子バリアントとして識別される。
配列読み取り値を、ファミリーに分類する。配列読み取り値の誤りは、補正する。各ファミリーのコンセンサス配列は、崩壊によって生成される。
（実施例６）
治療介入
癌を処置するために、治療介入を決定する。ＢＲＡＦ変異体を有する癌は、ベムラフェニブ、レゴラフェニブ、トラネチニブおよびダブラフェニブによる処置に応答する。ＮＲＡＳ変異体を有する癌は、トラメチニブによる処置に応答する。ＪＡＫ２変異体を有する癌は、ルキソリチニブによる処置に応答する。トラメチニブおよびルキソリチニブの投与を含む治療介入は、前記薬物のいずれか単独による処置よりこの癌に対してより有効であると決定される。対象は、５：１の用量比のトラメチニブおよびルキソリチニブの組合せで処置される。
数回の処置の後、対象からのｃｆＤＮＡを腫瘍不均一性の存在について再び検査する。結果は、ＢＲＡＦ：ＮＲＡＳ：ＪＡＫ２の比が今では約４：２：１．５であることを示す。これは、治療介入がＢＲＡＦおよびＮＲＡＳ変異体を有する細胞の数を低減し、ＪＡＫ２変異体を有する細胞の成長を停止させたことを示す。トラメチニブおよびルキソリチニブが１：１の用量比で有効であると決定される、第２の治療介入を決定する。対象に、この比の量で化学療法クールを与える。その後の検査は、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳおよびＪＡＫ２変異体が１％未満の量でｃｆＤＮＡに存在することを示す。
（実施例７）
治療介入
メラノーマ前処置の個体から血液試料を採取し、無細胞ＤＮＡ分析を使用して、患者は、２．８％の濃度のＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異を有し、検出可能なＮＲＡＳ変異を有しないと決定される。患者を、抗ＢＲＡＦ療法（ダブラフェニブ）に置く。３週後、別の血液試料を採取して検査する。ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅレベルが０．１％に下落したと決定する。療法を停止し、検査を２週おきに繰り返す。ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅレベルが再び上昇し、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅレベルが１．５％に上昇するとき療法を再開する。レベルが再び０．１％に下落するとき、療法を再び停止する。このサイクルを繰り返す。
（実施例８）
ＲＯＣＮＶ測定値に基づいてＣＮＶを補正する
患者試料中のコピー数バリエーションを決定する。決定するための方法は、前記のように、分子追跡およびアップサンプリング（を含むことができる。患者試料中の推定されるコピー数バリエーションから複製起点近接の影響を除くために、複製の起点の予想される位置に基づく隠れマルコフモデルが使用される。各遺伝子のコピー数バリエーションの標準偏差は、その後４０％低減される。複製起点近接モデルは、患者で無細胞腫瘍負荷を推測するためにも使用される。
多くの場合、導かれる無細胞腫瘍のレベルは低いかまたは特定の技術の検出限界未満のことがある。これは、血漿中の腫瘍由来ＤＮＡのヒトゲノム相当物の数が５ｍＬにつき１コピー未満である場合のことがある。放射線および化学療法が、安定した健康な細胞より急速に分裂する細胞により影響し、それゆえに、進行した癌患者を処置するそれらの効能が示された。したがって、収集される腫瘍由来のＤＮＡの分画を優先的に増加させるために、最小限の有害効果だけの処置を血液採取前に患者に投与する。例えば、低い用量の化学療法を患者に投与し、２４時間、４８時間、７２時間または１週未満以内に血液試料を採取することができる。有効な化学療法のために、この血液試料は、癌細胞の細胞死の潜在的により高い率のために、無細胞腫瘍由来のＤＮＡのより高い濃度を含有する。あるいは、低用量化学療法の代わりに、全身Ｘ線撮影装置によってまたは局所的に罹患領域に低線量放射線療法が適用される。患者を超音波、音波、運動、ストレスなどに付すことを含む、他の処置が想定される。
この明細書で指摘される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的および個々に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の好ましい実施形態が本明細書で示され、記載されたが、そのような実施形態は例としてだけ提供されていることは当業者に明らかになる。本開示を逸脱しない範囲で、当業者は今では多くの変異形、変更および代替を思いつく。本明細書に記載される本発明の実施形態への様々な代替物を本発明の実施で用いることができることを理解すべきである。以下の請求項が本発明の範囲を規定し、これらの請求項の範囲内の方法および構造ならびにそれらの同等物はそれに含まれることを意図する。

Claims (1)

  1. 図面に記載の発明。
JP2021184052A 2014-12-31 2021-11-11 疾患細胞不均一性を示す疾患の検出および処置、ならびに通信試験結果のためのシステムおよび方法 Active JP7458360B2 (ja)

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