JP2022048157A - 上位及び下位運動ニューロン機能並びに知覚の減衰を示す非ヒト動物 - Google Patents

Abstract

【課題】上位及び下位運動ニューロン機能並びに知覚の減衰を示す非ヒト動物を提供する。【解決手段】上位運動ニューロン、下位運動ニューロン、及び／又は知覚の機能障害の継続的な症状を現し、したがって、運動ニューロンに影響を及ぼす１つ又は２つ以上の神経変性病、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症、進行性筋ジストロフィなどのモデルとして有益であり得る、遺伝子修飾された非ヒト動物が提供される。本明細書には、修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座を含むラット又はマウスなどのげっ歯類が提供され、修飾されたＤＲ６遺伝子座は、ＤＲ６細胞質デスドメイン又はＤＲ６細胞質ドメイン全体をコードする第１のヌクレオチド配列を欠いている。【選択図】なし

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、米国仮出願シリアル番号第６２／１３３，９０９号（２０１５年３月１６日出願）及び同第６２／２５０，２２９号（２０１５年１１月３日出願）の利益を主張し、それらのそれぞれの出願は、参照により本明細書に組み込まれる。

（配列表）
配列表の正式なコピーは、２０１６年３月１６日に作成され、かつ約６８５キロバイトのサイズを有する、ファイル名「２０１６－０３－１６－Ｔ００４１ＷＯ０１－ＳＥＱ－ＬＩＳＴ ＳＴ２５．ｔｘｔ」のＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で電子的に提出され、かつ本明細書と同時に出願される。このＡＳＣＩＩ形式の文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、かつ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

（技術分野）
本出願は、概ね、時間の経過とともに上位運動ニューロン、下位運動ニューロン、及び／又は知覚の減衰を現す非ヒト動物に関するものであり、この動物は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のような運動ニューロン疾患など、神経変性疾患に有益なモデルを提供し得る。

（発明の背景）
ルー・ゲーリック病としても知られる筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、随意運動を担う脊髄、脳幹、及び皮質内の運動ニューロンの破壊がもたらす、致命的な神経変性病である。この疾病は臨床上、進行性筋衰弱及び萎縮症として現れ、発病から３～５年以内に麻痺及び死亡をもたらす。

米国では約２０，０００人がＡＬＳを有し、毎年５，０００人がＡＬＳと診断されている。ＡＬＳは、世界中に広まっており、あらゆる人種及び民族的背景の人々に影響を及ぼす。ＡＬＳの平均発病年齢は、４０～６０歳の間であるが、ＡＬＳは、より若い及びより年配の男女の両方を襲う場合もある。ＡＬＳ症例の９０～９５％において、疾病は明らかに無作為である（突発性ＡＬＳ（ｓＡＬＳ）として知られる）。かかるＳＡＬＳ症例には、疾病の家族歴も、明らかに関連する危険因子もない。ＡＬＳ症例の５～１０％には、遺伝的連関（家族性ＡＬＳ（ｆＡＬＳ）として知られる）が存在する。

ＡＬＳに関連付けられた突然変異の中で、銅・亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）遺伝子における突然変異は、ＳＯＤ１酵素の酸化防止機能の障害よりもむしろ、毒性機能獲得を介してＡＬＳ疾病をもたらすと長い間考えられてきた。ｆＡＬＳに関連付けられた突然変異を有する他の遺伝子としては、アルシン（ＡＬＳ２）、セナタキシン（ＡＬＳ４）、小胞会合膜蛋白質（ＶＡＰＢ、ＡＬＳ８）、アンギオゲニン及びダイナクチンのｐ１５０サブユニット（ＤＣＴＮ１）が挙げられる。最近、ＴａｒｄｂｐのＴＤＰ－４３－コード領域において３０を超える突然変異が、約４％のｆＡＬＳ及び１％未満のｓＡＬＳに対応する、明白な家族歴のある又はないＡＬＳ患者内で同定された。ＴＤＰ－４３突然変異（複数の場合あり）を有するほとんどの患者は、ＡＬＳの進行におけるＴＤＰ－４３の重要な役割を示唆する認知障害のない、従来のＡＬＳ表現型を現す。また、拡張されたＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のプロモーター内で反復し、ｆＡＬＳ及びｓＡＬＳ、並びにＡＬＳに関連する前頭側頭葉認知症（ＡＬＳ－ＦＴＤ）によく見られる原因として現れる。

いくつかのマウスモデルは、ＡＬＳ疾病用に確立されており、これには、ＳＯＤ１、ＴＤＰ４３、又はＦＵＳに突然変異を有するげっ歯類の系統、ＡＬＳ２ノックアウトマウス、及びニューロフィラメントサブユニットの遺伝子組み換えされた遺伝子コードを有するマウスが挙げられる。これらの中で、ヒト変異体ＳＯＤ１（ｍＳＯＤ１）トランスジェニックマウスモデルは、ＡＬＳ患者と複数の臨床表現型を共有することから、現在最も広く使用されている。ｍＳＯＤ１マウスの第１の症状は、四肢の１本又は２本以上の微細な「振動／振戦」であり、これは、生後約９０～１００日で現れる。後の段階で、マウスは臨床経過を開始し、最初に後肢の筋力低下及び／又は麻痺、次に前肢への麻痺の上昇、最後に重症の四肢麻痺が現れる。しかしながら、現在の動物モデルはいずれも、それらの動物は上位運動ニューロン症状、ＴＤＰ４３及び／若しくはＳＯＤ１集合体、並びに／又は非運動ニューロン損失を示さないことから、ヒト疾病に翻訳しない。したがって、ヒトにおけるＡＬＳをより密に反映する動物モデルが必要とされる。

本明細書には、上位運動ニューロン、下位運動ニューロン、及び／又は知覚の機能障害の継続的な症状を現し、したがって、運動ニューロンに影響を及ぼす１つ又は２つ以上の神経変性病、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（primary lateral sclerosis, primary lateral sclerosis）、進行性筋ジストロフィなどのモデ
ルとして有益であり得る、遺伝子修飾された非ヒト動物が提供される。具体的に、本明細書には、修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座を含むラット又はマウスなどのげっ歯類が提供され、修飾されたＤＲ６遺伝子座は、ＤＲ６細胞質デスドメイン又はＤＲ６細胞質ドメイン全体をコードする第１のヌクレオチド（例えば、第１のＤＮＡ、第１のｃＤＮＡ、第１のゲノムＤＮＡなど）配列を欠いており（例えば、含まない、存在しないなど）、例えば、修飾されたＤＲ６遺伝子座は、ＤＲ６細胞質デスドメイン又はＤＲ６細胞質ドメインのいずれかの部分をコードするヌクレオチド配列を欠いている。修飾されたＤＲ６遺伝子座は、（ｉ）ＤＲ６膜貫通ドメイン全体をコードする第２のヌクレオチド（例えば、第２のｃＤＮＡ、第２のＤＮＡ、第２のゲノムＤＮＡ）配列、例えば、ＤＲ６膜貫通ドメインのいずれかの部分をコードする第２のヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＤＲ６細胞外ドメインをコードする第３のヌクレオチド（例えば、第３のｃＤＮＡ、第３のＤＮＡ、第３のゲノムＤＮＡ）配列、又はそのいずれかの部分、例えば、ＤＲ６細胞外ドメインのいずれかの部分をコードする第３のヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）第４のヌクレオチド配列、例えば、介在するイントロンを含む、内因性のげっ歯類ＤＲ６遺伝子のエキソン３の全体からエキソン６の全体までまたがる第４のゲノム配列、及び／又は（ｉｖ）第５のヌクレオチド配列、例えば、介在するイントロンを含む、内因性げっ歯類ＤＲ６遺伝子の、エキソン２の一部（例えば、塩基４１０３）からエキソン６の全体（例えば、終止コドン）にまたがる第４のゲノム配列であって、完全長の成熟した内因性げっ歯類ＤＲ６タンパク質をコードする、第５のヌクレオチド配列を、更に欠いている可能性がある。いくつかの実施形態では、げっ歯類はマウスであり、修飾されたＤＲ６対立遺伝子は、ＤＲ６細胞質デスドメインをコードする第１のヌクレオチド配列を欠いており、例えば、修飾されたＤＲ６対立遺伝子は、配列番号１５のアミノ酸３８８～４５４をコードする第１のヌクレオチド配列、又はそのいずれかの部分を欠いている。いくつかの実施形態では、細胞質ドメイン、例えば、配列番号１５のアミノ酸３３０～６１４として記述されたアミノ酸配列を有する細胞質ドメインをコードするヌクレオチド配列を欠いている、修飾されたＤＲ６対立遺伝子を含むマウスが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるマウスは、例えば、配列番号１５のアミノ酸１～６１４として記述されるように、成熟したＤＲ６タンパク質をコードするヌクレオチド配列を欠いている、修飾されたＤＲ６対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＤＲ６対立遺伝子は、５ｋｂを超える内因性ゲノム配列を欠いている。いくつかの実施形態では、修飾されたＤＲ６対立遺伝子は、１０ｋｂを超える内因性ゲノム配列を欠いている。いくつかの実施形態では、修飾されたＤＲ６対立遺伝子は、２０ｋｂを超える内因性ゲノム配列を欠いている。いくつかの実施形態では、修飾されたＤＲ６対立遺伝子は、３０ｋｂを超える内因性ゲノム配列を欠いている。いくつかの実施形態では、修飾されたＤＲ６対立遺伝子は、４０ｋｂを超える内因性ゲノム配列を欠いている。いくつかの実施形態では、修飾されたＤＲ６対立遺伝子は、５０ｋｂを超える内因性ゲノム配列を欠いている。いくつかの実施形態では、げっ歯類は、内因性ＤＲ６細胞外ドメイン、内因性膜貫通ドメイン、及び／又は内因性ＤＲ６細胞質ドメインのいずれかの部分をコードするヌクレオチド配列を欠いている、修飾されたＤＲ６遺伝子座に関してヘテロ接合型又はホモ接合型である。

本明細書に提供されるような、遺伝子的に修飾されたげっ歯類は、核酸を発現し得、例えば、核酸は、げっ歯類のゲノムに無作為に挿入され得るか、又は、例えば、内因性ＤＲ６遺伝子座（例えば、本明細書に記載されているように、修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座）で内因性ＤＲ６転写制御遺伝子に操作可能に連結され得、核酸は、機能性ＤＲ６シグナルペプチド（例えば、機能性ヘテロ接合型ＤＲ６シグナルペプチド、機能性ホモ接合型ＤＲ６シグナルペプチド、機能性ラットＤＲ６シグナルペプチド、機能性マウスＤＲ６シグナルペプチドなど）、膜貫通ドメイン（例えば、ＤＲ６膜貫通ドメイン又はヘテロ接合型膜貫通ドメイン（例えば、ＲＯＲ１膜貫通ドメイン））、レポータータンパク質（例えば、β－ガラクトシダーゼタンパク質）、又はこれらの組み合わせをコードし、ポリペプチドは、機能性ＤＲ６細胞質ドメイン、又はそのいずれかの部分を欠いている（例えば、それに操作可能に融合されていない、それを含まない、など）。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはまた、機能性ＤＲ６細胞外ドメイン、又はそのいずれかの部分を欠いている。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、機能性ＤＲ６シグナルペプチドから本質的に構成されるか、又はそれから構成される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、膜貫通ドメインに操作可能に融合された機能性ＤＲ６シグナルペプチドから本質的に構成されるか、又はそれから構成される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、膜貫通ドメインに操作可能に融合された機能性ＤＲ６シグナルペプチドから本質的に構成されるか、又はそれから構成され、膜貫通ドメインはレポータータンパク質に操作可能に融合される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、膜貫通ドメインに操作可能に融合された機能性ＤＲ６シグナルペプチドから本質的に構成されるか、又はそれから構成される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、膜貫通ドメインから本質的に構成されるか、又はそれから構成される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、レポータータンパク質に操作可能に融合された膜貫通ドメインから本質的に構成されるか、又はそれから構成される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、レポータータンパク質から本質的に構成されるか、又はそれから構成される。いくつかの実施形態では、ＤＲ６シグナルペプチドは、例えば、配列番号１５のアミノ酸－１～－４１（又はそのいずれかの部分）として記述されているように、げっ歯類ＤＲ６シグナルペプチド、例えば、マウスＤＲ６シグナルペプチドであり、例えば、配列番号６、又は同一アミノ酸配列をコードするが、遺伝暗号の縮重のために配列番号６のみとは異なる、その縮重変異型として記述された配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるようなげっ歯類は、配列番号６、又は同一のアミノ酸配列をコードするが、遺伝暗号の縮重のために配列番号６のみとは異なる、その縮重変異型として記述された配列を含むか、それから本質的に構成されるか、又はそれから構成される、核酸を含み、かつ、発現する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはＲＯＲ１膜貫通ドメインであり、例えば、配列番号７、又は同一のアミノ酸配列をコードするが、遺伝暗号の縮重のために配列番号７のみとは異なる、その縮重変異型として記述された配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号７、又は同一のアミノ酸配列をコードするが、遺伝暗号の縮重のために配列番号７のみとは異なるその縮重変異型として記述された配列を含むか、それから本質的に構成されるか、又はそれから構成される。いくつかの実施形態では、レポータータンパク質はβ－ガラクトシダーゼであり、例えば、配列番号８、又は同一のアミノ酸配列をコードするが、遺伝暗号の縮重のために配列番号８のみとは異なる、その縮重変異型として記述された配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号８又は、同一のアミノ酸配列をコードするが、遺伝暗号の縮重のために配列番号８のみとは異なるその縮重変異型を含むか、それから本質的に構成されるか、又はそれから構成される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるようなげっ歯類は、ＲＯＲ１膜貫通ドメインに操作可能に融合されたＤＲ６シグナルペプチドをコードする核酸を含み、かつ、発現し、ＲＯＲ１膜貫通ドメインは、β－ガラクトシダーゼに操作可能に融合され、例えば、本明細書に提供されているげっ歯類は、配列番号１７、又は同一のアミノ酸配列をコードするが、遺伝暗号の縮重のために配列番号１７のみとは異なる、その縮重変異型として記述された核酸配列を含み、かつ、発現する。

いくつかの実施形態では、核酸は、内因性ＤＲ６遺伝子座にあり、必要に応じて１つ又は２つ以上の内因性ＤＲ６制御因子、例えば、内因性転写制御因子などに操作可能に連結され、それにより、げっ歯類は、核酸を含むが、内因性ＤＲ６細胞室ドメイン全体又はその全体のいずれかの部分（例えば、ＤＲ６細胞質デスドメイン全体）をコードする少なくともヌクレオチド配列を欠いており、かつ、必要に応じて、内因性ＤＲ６膜貫通ドメイン全体若しくはそのいずれかの部分、及び／又は内因性ＤＲ６細胞外ドメイン全体をコードする付加的なヌクレオチド配列を更に欠いている、修飾されたＤＲ６遺伝子座に関してヘテロ接合型又はホモ接合型である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、内因性ＤＲ６遺伝子座の修飾及び／又は核酸の発現は、ニューロン、グリア細胞、又はこれらの組み合わせの機能（the
function a neuron, a glial cell, or a combination thereof）に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、核酸の発現は、上位及び／又は下位運動ニューロンの機能の減衰、例えば機能障害をもたらし、この機能の減少は、例えば、遺伝子修飾されたげっ歯類と同一の遺伝背景、例えば、同一系統の対照げっ歯類と比較した（ａ）後弯症、（ｂ）異常後肢クラスピング、（ｃ）運動調整及び運動学習能力の欠失、（ｄ）体重減少、並びに（ｅ）知覚の減衰などとして現れる。いくつかの実施形態では、修飾されたＤＲ６遺伝子座を含む、及び／又は本明細書に記載されている核酸を発現するげっ歯類は、運動ニューロン機能障害、例えば、上位運動ニューロン及び／又は下位運動ニューロン機能障害の１つ又は２つ以上の症状を示し得る。いくつかの実施形態では、症状は、遺伝子修飾されたげっ歯類と同一遺伝背景、例えば、同一系統の対照げっ歯類と比較した（ａ）後弯症、（ｂ）異常後肢クラスピング、（ｃ）運動調整及び運動学習能力の欠失、（ｄ）体重減少、並びに／又は（ｅ）知覚の減衰である。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の症状は、振戦、痙性麻痺（硬直）、異常反射、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される上位運動ニューロン機能障害を含むＡＬＳに似た症状、並びに／又は筋力低下及び衰弱、束性収縮、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される下位運動ニューロン機能障害を含むＡＬＳに似た症状である。このようなＡＬＳに似た症状は、盲検化主観的ＡＬＳ－ＴＤＩ神経学的スコアリング、ロータロッド試験、キャットウォーク試験、オープンフィールド試験のうちの１つ又は２つ以上を使用して可視化され得る。また、本明細書に開示されたようなげっ歯類は、８～２０週齢の対照野生型動物と比較して、体重増加の低下を示し得る。本明細書に開示されたようなげっ歯類はまた、げっ歯類がロータロッドでの欠損時間、歩行機能障害、キャットウォーク能力の減衰、及びこれらの組み合わせとして存在する、運動ニューロン機能の減衰を示しているかどうかに関わらず、疼痛刺激に反応するまでの潜時欠失を示し得る。

一態様では、げっ歯類は、出生時は極めて正常であり（例えば、肉眼では正常に見える、例えば、盲検化主観的神経学的スコアリングアッセイ、ロータロッド試験、キャットウォーク試験、オープンフィールド試験、体重測定、及び／又は疼痛服従試験では、運動ニューロン機能障害及び／又は知覚の減衰は見られない）、加齢とともに、１つ又は２つ以上の可視のＡＬＳに似た症状を現し、例えば、げっ歯類は、生後２週間、生後３週間、生後４週間、生後５週間、生後６週間などで１つ又は２つ以上のＡＬＳに似た症状を現し得る。一態様では、本明細書に記載されているげっ歯類は、４週齢よりも若く、いずれのＡＬＳに似た症状も示さない。一態様では、本明細書に記載されているげっ歯類は、８週齢よりも若く、いずれのＡＬＳに似た症状も示さない。別の態様では、げっ歯類は、２２週齢になる前にＡＬＳに似た症状を現す。一実施形態では、げっ歯類は、少なくとも１６週齢以上であり、対照げっ歯類と比較して、次の表現型のうちの１つ又は２つ以上を示す：（ａ）後弯症、（ｂ）異常後肢クラスピング、（ｃ）運動調整及び運動学習能力の欠失、（ｄ）体重減少、並びに（ｅ）疼痛刺激に反応するまでの潜時遅延。

本明細書に開示されたげっ歯類の遺伝子発現パターン、例えば、神経系の器官（脳、脊髄など）の遺伝子特徴は、（１）ＡＬＳを患う患者若しくは患者の器官（脳、脊髄など）の遺伝子特徴のそれぞれ、及び／又は（２）ＡＬＳの別の動物モデル、例えば、ＳＯＤ１非ヒト動物、又は非ヒト動物の器官（脳、脊髄など）の遺伝子特徴のそれぞれ、の遺伝子発現パターンに類似し得る。例えば、本明細書に開示されたげっ歯類の脳及び／又は脊髄の遺伝子発現パターン（複数の場合あり）は、ヒトＡＬＳ ｂｉｏｓｅｔ及び／又はマウスＳＯＤ１ ｂｉｏｓｅｔと相関し得、これらのｂｉｏｓｅｔは免疫反応に連結し得る。ヒトＡＬＳ及び／又はマウスＳＯＤ１ ｂｉｏｓｅｔとの相互関係は、本明細書に開示されたげっ歯類に観察される病理が、ＡＬＳを患うヒト又はＳＯＤ１動物モデルに見られるものと非常に似ていることを示唆する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるげっ歯類は、免疫反応に連結した遺伝子特徴を有し得るが、野生型げっ歯類と比較して末梢的に異常な免疫反応は示し得ない。

一態様では、本明細書に開示されるようなげっ歯類の運動ニューロンの数は、野生型げっ歯類の運動ニューロンの数に類似しており、例えば、それより有意に多くも少なくもない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるげっ歯類の運動ニューロンは、野生型げっ歯類の運動と比較して酸化的ストレスの増加を示す。

一態様では、本明細書に記載されるようなげっ歯類は、ラット又はマウスである。いくつかの実施形態では、げっ歯類は、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、及び混合型Ｃ５７ＢＬ／６×１２９系統からなる群から選択される系統のマウスである。

また、本明細書には、例えば、胚幹細胞、運動ニューロンセルなど、例えば、組織学的に調査され得る及び／若しくは培養され得る、本明細書に記載されたげっ歯類から単離された若しくはそれに由来する、組織又は細胞が提供される。また、本明細書に記載された核酸が提供される。

また、本明細書に記載されたげっ歯類から単離した細胞又は細胞集団を培養することを含む方法が提供されるが、この方法は、例えば、生体外操作に有益な運動ニューロンなどをもたらし得る。いくつかの実施形態では、対照運動ニューロン細胞と比較して酸化的ストレスの増加を示す運動ニューロンの集団を作製する方法が提供され、方法には、本明細書に提供されたげっ歯類由来の胚様体を確立し、胚様体を運動ニューロンに分化させることが含まれる。いくつかの実施形態では、胚様体は、内部細胞塊の胚幹細胞から展開される。いくつかの実施形態では、内細胞塊の胚幹細胞は、胚様体を形成するため、例えば、胚幹細胞培地（ＥＳＭ：ＤＭＥＭ＋１５％ウシ胎児血清＋ペニシリン／ストレプトマイシン＋グルタミン＋可欠アミノ酸＋ヌクレオシド＋β－メルカプトエタノール＋ピルビン酸ナトリウム＋ＬＩＦ）中で、２日間単離され、培養される。胚様体は、次いで、分化培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地＋１０％ノックアウト血清＋ペニシリン／ストレプトマイシン＋グルタミン＋β－メルカプトエタノール）などの中に、１～３日間、例えば、レチノイン酸及びスムーズンドアゴニスト中で、例えば５日間更に培養する前の２日間、培養され得る。本明細書に提供されたげっ歯類から単離された内細胞塊の胚幹細胞から展開された分化運動ニューロンは、修飾されたＤＲ６対立遺伝子及び／又は核酸を含まないげっ歯類から展開された運動ニューロン細胞と比較して酸化的ストレスの増加を示す、安定した運動ニューロン細胞系を形成するため、例えば、胚幹細胞由来の運動ニューロン培地（ＥＳＭＮ：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地＋２％ウマ血清＋Ｂ２７＋グルタミン＋ペニシリン／ストレプトマイシン＋β－メルカプトエタノール＋１０ｎｇ／ｍＬ ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ）中で成熟され得る。

また、本明細書には、運動ニューロン機能障害を調節するための候補薬剤を同定する方法が提供されるが、この方法は、（ａ）本明細書に開示されたげっ歯類に薬剤を投与することと、（ｂ）同一のゲノム構造を有するが、候補薬剤を受けていない試験対照げっ歯類と比較した、げっ歯類における候補薬剤の効果を決定すること、例えば、薬剤が、対照げっ歯類と比較して、げっ歯類における少なくとも１つのＡＬＳに似た症状を防止する、抑制する、遅延させる、及び／又は反転させるかどうかを決定することと、を含む、ＡＬＳの治療、防止、及び／又は抑制に有益であり得、げっ歯類における、少なくとも１つのＡＬＳに似た症状、例えば、後弯症、異常後肢クラスピオング、運動調整欠失、運動学習能力欠失、体重減少、及び知覚欠失などの運動ニューロン機能障害の症状の防止、抑制、遅延、及び／又は反転は、ＡＬＳの防止及び／又は抑制などの運動ニューロン機能障害の治療に有益であり得る候補薬剤を示す。薬剤は、げっ歯類がＡＬＳに似た症状を発症する前か、それと同時か、又はその後、例えば、盲検化主観的ＡＬＳ－ＴＤＩ神経学的スコアリング、ロータロッド試験、キャットウォーク試験、オープンフィールド試験、体重測定、若しくは、例えば、２つ以上の異なる時点での、疼痛刺激に反応するまでの潜時の決定による、運動ニューロン機能障害の少なくとも１つの症状の検知の前か、それと同時か、又はその後に投与され得る。

いくつかの実施形態では、候補薬剤は、運動ニューロン機能障害の少なくとも１つの症状を、少なくとも１０％、例えば、少なくとも１５％、例えば、少なくとも２０％調節する。他の実施形態では、候補薬剤の存在は、運動ニューロン機能障害の少なくとも１つの症状（the symptom the at least one symptom）を、例えば、少なくとも５０％、例えば、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９９％調節する。いくつかの実施形態では、候補薬剤は、運動ニューロン機能障害の少なくとも１つを防止する。（１）後弯症及び異常後肢クラスピングの少なくとも１つを防止する及び／若しくは抑制すること、かつ／あるいは（２）運動調整欠失、運動学習能力欠失、体重減少、及び／若しくは知覚欠失を防止する並びに／又は修復することによって、少なくとも１つの症状を調節する候補薬剤は、ＡＬＳなどの神経変性病の治療に有益であり得る。

薬剤が、対照げっ歯類と比較してげっ歯類におけるＡＬＳに似た症状の少なくとも１つを防止する、抑制する、遅延させる、及び／又は反転させるかどうかを決定する方法は、げっ歯類から単離した組織及び／又は細胞を調査すること、例えば、組織化学などによる組織及び／若しくは細胞の微小解剖、機能、並びに構造を理解するための組織及び／若しくは細胞の分析、細胞、組織、及び／若しくは器官の培養、顕微鏡的手法、並びに／又はタンパク質の発現、例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（Ｃｈａｔ）、Ｍｎｘホメオボックス、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体サブユニット３Ｂ（Ｇｒｉｎ３ｂ）、及びグルタミン酸受容体２（Ｇｒｉａ２）などの評価、を含み得る。一態様では、評価される細胞は、ニューロン、グリア細胞、又はこれらの組み合わせである。別の態様では、評価される組織は脳及び／又は脊髄である。薬剤が、対照げっ歯類と比べ、げっ歯類におけるＡＬＳに似た症状の少なくとも１つを防止する、抑制する、遅延させる、及び／又は反転させるかどうかを決定する方法は、主観的ＡＬＳ－ＴＤ１神経学的スコアリング、ロータロッド試験、キャットウォーク試験、オープンフィールド試験、体重測定、及び／又は疼痛刺激に反応するまでの潜時の決定も含み得る。

いくつかの実施形態では、試験される少なくとも１つの症状は、上位運動ニューロン機能障害を示し、例えば、少なくとも１つの症状は、振戦、痙性麻痺（硬直）、異常反射、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、試験される少なくとも１つの症状は、下位運動ニューロン機能障害を示し、例えば、少なくとも１つの症状は、筋力低下及び衰弱、束性収縮、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、評価される少なくとも１つの症状は、体重増加の低下である。いくつかの実施形態では、試験される少なくとも１つの機能は、侵害受容器の減衰である。

また、本明細書には、運動ニューロンにおける酸化的ストレスを軽減するための候補薬剤を同定する方法であって、（ａ）薬剤の存在下又は非存在下で、本明細書に開示されるような非ヒト動物モデル由来の運動ニューロンを培養することと、（ｂ）薬剤の非存在下で培養された対照運動ニューロンと比較して、薬剤が運動ニューロンにおける酸化的ストレスを防止する、抑制する、及び／又は軽減するかどうかを決定することと、を含み、運動ニューロンにおける酸化的ストレスの防止、抑制、及び／又は軽減が、例えば、運動ニューロンにおける酸化的ストレスを軽減するための候補薬剤を示し、かつ、ＡＬＳを治療、防止、及び／又は抑制するために有益な候補薬剤であり得る、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、候補薬剤は、運動ニューロンにおける酸化的ストレスが少なくとも１０％、例えば、少なくとも１５％、例えば、少なくとも２０％軽減する。他の実施形態では、候補薬剤の存在は、運動ニューロンによる酸化的ストレスを、例えば、少なくとも５０％、例えば、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９９％抑制する。いくつかの実施形態では、候補薬剤は、運動ニューロンにおける酸化的ストレスを防止し、例えば、酸化的ストレスのレベルは野生型運動ニューロンのものと類似する。

また、本明細書には、（ａ）５’標的化アーム及び３’標的化アーム（５’及び３’標的化アームは、内因性ＤＲ６シグナルペプチド配列の下流にある内因性ＤＲ６遺伝子座に挿入するためのベクターを指向する）と、（ｂ）選択カセットと、必要に応じて（ｃ）膜貫通ドメインコード配列と、を含む、標的化ベクターが提供される。一実施形態では、膜貫通ドメインコード配列は、ＲＯＲ１膜貫通ドメインをコードする。別の実施形態では、膜貫通ドメインコード配列は、レポーター遺伝子に操作可能に連結される。一実施形態では、選択カセットはレポーター遺伝子、薬剤耐性遺伝子、又はこれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、選択カセットは薬剤耐性遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、選択カセットはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるような標的化ベクターは、配列番号１６として記述された配列を含む。いくつかの実施形態では、標的化ベクターは、選択カセットを含まない。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるような標的化ベクターは、配列番号５として記述された配列を含む。

また、本明細書には、本明細書に記載されるような標的化ベクター、例えば、胚幹細胞、例えば、マウス胚幹細胞、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ胚幹細胞などを含む、げっ歯類細胞が提供される。
特定の実施形態において、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ＤＲ６タンパク質の細胞質ドメイン全体をコードする第１のヌクレオチド配列を欠いている、修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座をゲノム内に含む、遺伝子組み換えされたげっ歯類。
（項目２）
前記修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座が、成熟ＤＲ６タンパク質全体をコードする、第２のヌクレオチド配列を更に欠いている、項目１に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類。
（項目３）
前記修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座が、膜貫通ドメイン及びレポータータンパク質のうちの少なくとも１つに操作可能に融合された機能性ＤＲ６シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む、項目１又は項目２に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類。
（項目４）
前記核酸配列が、前記膜貫通ドメインに操作可能に融合された前記機能性ＤＲ６シグナルペプチドをコードし、かつ、前記膜貫通が前記レポータータンパク質に操作可能に融合されている、項目３に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目５）
前記機能性ＤＲ６シグナルペプチドが内因性ＤＲ６シグナルペプチドである、項目３又は項目４に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目６）
前記膜貫通ドメインが内因性ＤＲ６膜貫通ドメインではない、項目３～５のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目７）
前記膜貫通ドメインがＲＯＲ１膜貫通ドメインである、項目３～６のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目８）
前記レポータータンパク質がβガラクトシダーゼである、項目３～７のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目９）
前記核酸配列が、内因性ＤＲ６転写制御配列に操作可能に連結される、項目３～８のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目１０）
前記遺伝子修飾されたげっ歯類が、前記修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座に関してヘテロ接合型である、項目１～９のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目１１）
前記げっ歯類が運動ニューロンの機能障害を示す、項目１～１０のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目１２）
前記運動ニューロンが上位運動ニューロン又は下位運動ニューロンである、項目１１に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目１３）
前記げっ歯類が４週齢を超えるまで、前記運動ニューロンの機能障害が、盲検化主観的スコアリングアッセイ、ロータロッド試験、キャットウォーク試験、オープンフィールド試験、及び体重測定において現れない、項目１２に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目１４）
前記げっ歯類が、対照げっ歯類と比較して侵害受容の減少を示す、項目１～１３のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目１５）
前記げっ歯類がラット又はマウスである、項目１に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。（項目１６）
前記げっ歯類が、成熟したＤＲ６タンパク質全体をコードする第１のヌクレオチド配列を欠いている、修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座を含むマウスであり、
前記内因性マウスＤＲ６遺伝子座が、少なくとも１つの内因性ＤＲ６転写制御配列に操作可能に連結され、β－ガラクトシダーゼに操作可能に融合されたＲＯＲ１膜貫通ドメインに、操作可能に融合された内因性ＤＲ６シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む、項目１５に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目１７）
前記マウスが、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、及び混合型Ｃ５７ＢＬ／６×１２９系統からなる群から選択される系統由来であり、前記マウスが、８～２０週齢の間に対照野生型動物と比較して体重増加の低下を示す、項目１６に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目１８）
項目１～１７のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類由来の細胞又は組織。（項目１９）
前記細胞が運動ニューロン又は胚幹細胞である、項目１８に記載の細胞又は組織。
（項目２０）
項目１に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類を作製する方法であって、前記げっ歯類の内因性ＤＲ６遺伝子座から、ＤＲ６細胞質ドメイン全体をコードする第１の内因性ヌクレオチド配列を欠失させる工程を含む、方法。
（項目２１）
前記欠失させる工程が、全長かつ内因性の成熟したＤＲ６タンパク質をコードする第２の内因性ヌクレオチド配列を、膜貫通ドメイン及び／又はレポーター遺伝子をコードする核酸配列に置き換えることを含み、前記核酸が、内因性ＤＲ６転写制御配列及びシグナルペプチド配列と操作可能に連結する、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
対照運動ニューロン細胞と比較して酸化的ストレスの増加を示す、運動ニューロンの集団を作製する方法であって、項目１～１７のいずれか一項に記載の前記げっ歯類から単離された内部細胞塊の胚幹細胞から胚様体を確立することと、前記胚様体を前記運動ニューロンの集団に分化させることと、を含む、方法。
（項目２３）
運動ニューロン機能障害を調節するための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）そのゲノム内に、ＤＲ６細胞質ドメイン全体をコードする第１のヌクレオチド配列を欠いている、修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座を含むげっ歯類に、候補薬剤を投与することであって、前記げっ歯類が運動ニューロン機能障害を発現する、ことと、
（ｂ）試験対照げっ歯類と比較して、前記げっ歯類における前記運動ニューロン機能障害の少なくとも１つの症状に対する、前記候補薬剤の何らかの調節効果を決定することと、を含み、
前記試験対照げっ歯類と比較して、前記げっ歯類における前記運動ニューロン機能障害の前記少なくとも１つの症状に対する調節効果の存在が、前記候補薬剤が運動ニューロン機能障害を調節するのに有益であることを示す、方法。
（項目２４）
前記修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座が、成熟した内因性ＤＲ６タンパク質全体をコードする第２のヌクレオチド配列を更に欠いている、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座が、膜貫通ドメイン及びレポータータンパク質のうちの少なくとも１つに操作可能に融合された機能性ＤＲ６シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む、項目２３又は項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記薬剤が、盲検化主観的ＡＬＳ－ＴＤＩ神経学的スコアリング、ロータロッド試験、キャットウォーク試験、オープンフィールド試験、体重測定、又は疼痛刺激に反応するまでの潜時の決定による、前記症状の検知の前に投与される、項目２３～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記薬剤が、盲検化主観的ＡＬＳ－ＴＤＩ神経学的スコアリング、ロータロッド試験、キャットウォーク試験、オープンフィールド試験、体重測定、又は疼痛刺激に反応するまでの潜時の決定のうちの１つ又は２つ以上による、前記症状の検知の後に投与される、項目２３～２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記薬剤が２回以上の異なる時点で投与される、項目２３～２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記少なくとも１つの症状が、前記げっ歯類と同一の系統を有するが、そのゲノム内に前記核酸を含まない対照げっ歯類と比較した、後弯症、異常後肢クラスピング、運動調整欠失、運動学習能力欠失、体重減少、及び知覚欠失から選択される、項目２３～２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記少なくとも１つの症状が上位運動ニューロン機能障害の結果である、項目２３～２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記少なくとも１つの症状が、振戦、痙性麻痺（硬直）、異常反射、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記少なくとも１つの症状が下位運動ニューロン機能障害の結果である、項目２３～２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記少なくとも１つの症状が、筋力低下及び衰弱、線維束性収縮、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記運動ニューロン機能障害の少なくとも１つの症状が、体重増加の低下である、項目２３～３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記運動ニューロン機能障害の少なくとも１つの症状が、侵害受容の減少である、項目２３～３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記げっ歯類が、成熟したＤＲ６タンパク質全体をコードする第１のヌクレオチド配列を欠いている、修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座を含むマウスであり、
前記内因性マウスＤＲ６遺伝子座が、少なくとも１つの内因性ＤＲ６転写制御配列に操作可能に連結され、β－ガラクトシダーゼに操作可能に融合されたＲＯＲ１膜貫通ドメインに、操作可能に融合された内因性ＤＲ６シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む、項目２３～３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記マウスが、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、及び混合型Ｃ５７ＢＬ／６×１２９系統からなる群から選択される系統由来のマウスである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
運動ニューロンにおける酸化的ストレスを軽減するための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）薬剤の存在下又は非存在下で、項目１に記載のげっ歯類由来の運動ニューロンを培養することと、
（ｂ）前記薬剤が、前記げっ歯類由来であるが、前記薬剤非存在下で培養された対照運動ニューロンと比較したときに、前記運動ニューロンにおける酸化的ストレスを防止、抑制、及び／又は軽減するかどうかを決定することと、を含み、前記運動ニューロンにおける酸化的ストレスの防止、抑制、及び／又は軽減が、運動ニューロンにおける酸化的ストレスを軽減するための候補薬剤を示す、方法。
（項目３９）
操作可能に連結され、５’から３’へ、ＤＲ６シグナルペプチドをコードする第１の核酸配列、膜貫通ドメインをコードする第２の核酸、レポーター遺伝子をコードする第３の核酸、及び／又は薬剤選択カセットをコードする第４の核酸を含む、核酸。
（項目４０）
前記第１の核酸配列が、配列番号６に記述され、前記第２の核酸配列が配列番号７に記述され、前記第３の核酸配列が配列番号８に記述され、かつ／又は前記第４の核酸が配列番号３に記述される、項目３９に記載の核酸配列。
（項目４１）
第１の標的化アーム及び第２の標的化アームを更に含み、前記第１の標的化アームが前記第１、第２、及び／又は第３の核酸配列の５’であり、そこに操作可能に連結しており、前記第２の標的化アームが前記第１、第２、及び／又は第３の核酸配列の３’であり、そこに操作可能に連結しており、前記第１及び第２の標的化アームが、少なくとも１つの内因性非ヒト動物制御要素に操作可能に連結する、内因性非ヒト動物ＤＲ６遺伝子座への挿入用として前記核酸を標的化するものである、項目３９又は項目４０に記載の核酸。
（項目４２）
前記非ヒト動物がげっ歯類である、項目４１に記載の核酸。
（項目４３）
前記げっ歯類がマウスである、項目４２に記載の核酸配列。
（項目４４）
前記核酸が配列番号５又は配列番号１７に記述された配列を含む、項目４３に記載の核酸配列。
（項目４５）
項目３９～４４のいずれか一項に記載の前記核酸を含む、げっ歯類細胞。
（項目４６）
前記げっ歯類細胞が胚幹細胞である、項目４５に記載のげっ歯類細胞。

ＤＲ６遺伝子座の標的破壊の方法を示す。野生型マウスＤＲ６遺伝子座は、５’から３’へ、５’ＵＲＴ（白いボックス）、開始コドン（ＡＴＧ）、エキソン１～６（点付きボックス）、終止コドン（ＴＡＧ）、及び３’ＵＲＴを示す上部線として示されている（縮尺通りではない）。示されているように、内因性マウスシグナル配列は、エキソン１及びエキソン２の一部分（開始コドンから４１０３塩基まで）によってコードされ、シグナルペプチドをコードする核酸配列は、下部線として示されている（縮尺通りではない）Ｚｅｎ－Ｕｂ１カセットと組み換えた後に残存する。図１に示すように、Ｚｅｎ－Ｕｂ１標的化ベクター（配列番号５）は、（５’から３’への）５’ホモロジーアーム（５’アーム；配列番号１）、ポリアデニル化シグナル（ｐＡ；配列番号９）に操作可能に連結された、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬａｃＺレポーター遺伝子（ＬａｃＺ；配列番号８）に操作可能に連結されたＲＯＲ１膜貫通ドメインコード配列（ＴＭ；配列番号７）を含む。Ｚｅｎ－Ｕｂ１カセットはまた、ポリＡシグナル（ｐＡ；配列番号１３）に操作可能に連結された、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性遺伝子（Ｎｅｏ；配列番号１２）に操作可能に連結された、ヒトユビキチンＣ遺伝子（ｈＵＢ；配列番号１１）からのプロモーターを含む選択カセットを含み、選択カセットは、同一のｌｏｘＰ核酸配列（配列番号１０）に隣接している。Ｚｅｎ－ＵＢ１カセットの３’ホモロジーアーム（３’アーム）は、配列番号４と記述されている。相同組み換え時に、結果として生じる対立遺伝子は、ＲＯＲ１膜貫通ドメインコード配列及びＬａｃＺレポーター遺伝子に操作可能に連結された内因性ＤＲ６シグナル配列をコードする核酸配列を含み（核酸配列は、配列番号１７と記述されている）、エキソン２内の塩基４１０３からエキソン６の終止コドンまでの内因性ゲノム配列全体を欠いている、例えば、内因性細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を欠いている。

性別に関係なく時間の経過とともに迅速に進行する、ＤＲ６^－／－マウスにおける筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に似た運動障害を示す。
異なる時点（ｘ軸）での野生型（●）及びＤＲ６^－／－マウス（■）の平均運動障害スコア（ｙ軸）を示す。 異なる時点（ｘ軸）での雄（Ψ）及び雌（－－●－－）ＤＲ６^－／－マウスの平均運動障害スコアを示す。 異なる時点（ｘ軸）での野生型（●）及びＤＲ６^－／－マウス（■）マウスの平均硬直スコア（ｙ軸）を示す。 異なる時点（ｘ軸）での雄（Ψ）及び雌（－－●－－）ＤＲ６^－／－マウスの平均硬直スコアを示す。 異なる時点（ｘ軸）での野生型（●）及びＤＲ６^－／－マウス（■）マウスの平均振戦スコア（ｙ軸）を示す。 異なる時点（ｘ軸）での雄（Ψ）及び雌（－－●－－）ＤＲ６^－／－マウスの平均振戦スコアを示す。 ９～２１週齢（ｘ軸）の野生型（●）及びＤＲ６^－／－マウス（■）の平均運動障害スコア（ｙ軸）を示す。 ９～２１週齢（ｘ軸）の野生型（●）及びＤＲ６^－／－マウス（■）の平均硬直スコア（ｙ軸）を示す。 ９～２１週間（ｘ軸）の野生型（●）及びＤＲ６^－／－マウス（■）の平均振戦障害スコア（ｙ軸）を示す。 実験１（図２Ａ～２Ｆ）では、野生型マウスの場合はｎ＝１２及びＤＲ６^－／－マウスの場合はｎ＝１６（雄ＤＲ６^－／－マウスの場合、ｎ＝８；雌ＤＲ６^－／－マウスの場合、ｎ＝８）であり、それぞれの時点において、野生型動物はそれぞれの試験でスコア０となった。実験２（図２Ｇ～２Ｉ）では、野生型マウスの場合はｎ＝１４、ＤＲ６^－／－マウスの場合はｎ＝１８となる。すべてのデータは、平均±ＳＥＭとして報告される。２要因分散分析は、Ｐ≦０．０５の場合は^＊、Ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、Ｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊、Ｐ≦０．０００１の場合は^＊＊＊＊とする、野生型マウスの値と、ノックアウトマウスの値とを比較した統計分析の目的で実行される。

体重減少及び有意な運動異常として現れる、ＤＲ６^－／－マウスのＡＬＳに似た表現型を示す。
左及び右のパネルは、野生型（ｔｎｓｆｒ２１^＋／＋）マウス及びＤＲ６^－／－（ｔｎｓｆｒ２１^－／－）マウスのそれぞれ２０１４年５月２９日及び２０１４年６月１１日の体重（ｙ軸；グラム）を示す。 左及び右のパネルはそれぞれ、野生型（ｔｎｓｆｒ２１^＋／＋；縞のある棒線）マウス及びＤＲ６－／－（ｔｎｓｆｒ２１^－／－；無地の棒線）マウスに関するロータロッド（ｙ軸；秒）が低下するまでの最大潜時及び中位潜時を示す。 野生型（ｔｎｓｆｒ２１^＋／＋；縞のある棒線）マウス及びＤＲ６^－／－（ｔｎｓｆｒ２１－／－；無地の棒線）マウスの、６０分に及ぶ合計不動（ｙ軸）、基本運動（ｙ軸）、及び微細運動を示す。 野生型（ｔｎｓｆｒ２１^＋／＋；縞のある棒線）マウス及びＤＲ６－／－（ｔｎｓｆｒ２１^－／－；無地の棒線）マウスの、１時間に及ぶＸ＋Ｙ歩行（ｙ軸）を示す。 左及び右のパネルはそれぞれ、野生型（ｔｎｓｆｒ２１^＋／＋；縞のある棒線）及びＤＲ６^－／－（ｔｎｓｆｒ２１^－／－；無地の棒線）の立ち上がりの集計（ｙ軸）及び合計立ち上がり時間（ｙ軸；秒）を示す。 左及び右のパネルはそれぞれ、野生型（ｔｎｓｆｒ２１^＋／＋；縞のある棒線）及びＤＲ６－／－（ｔｎｓｆｒ２１^－／－；無地の棒線）の総移動距離及び総休止時間（ｙ軸；６０分の集計）を示す。^＊（ｐ＜０．０５）は、２つのグループ間の統計的な有意差を示す。

野生型（●；ｎ＝１４）マウス及びＤＲ６－／－（■；ｎ＝１８）マウス（ｘ軸）の、９～２１週齢での平均体重（ｙ軸；グラム重量）を示す。 野生型（●；ｎ＝１４）マウス及びＤＲ６－／－（■；ｎ＝１８）マウス（ｘ軸）の、９～２１週齢でのロータロッドが低下するまでの中位潜時（ｙ軸；秒）を示す。 野生型（●；ｎ＝１４）マウス及びＤＲ６－／－（■；ｎ＝１８）マウス（ｘ軸）の、９～２１週齢でのロータロッドが低下するまでの最大潜時（ｙ軸；秒）を示す。 ロータロッドで費やされた最大時間は、１８０秒である。すべてのデータは、平均±ＳＥＭとして報告される。２要因分散分析は、Ｐ≦０．０５の場合は^＊、Ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、Ｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊、Ｐ≦０．０００１の場合は^＊＊＊＊とする、野生型マウスの値と、ノックアウトマウスの値とを比較した統計分析の目的で実行される。

野生型マウス及びＤＲ６^－／－マウスのオープンフィールド自発運動行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝１４）動物及びＤＲ６－／－（ノックアウト；■；ｎ＝１６）動物の１時間にわたる（over an hour an hour）合計距離を示す。 野生型マウス及びＤＲ６^－／－マウスのオープンフィールド自発運動行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝１４）動物及びＤＲ６－／－（ノックアウト；■；ｎ＝１６）動物の１時間にわたる（over an hour an hour）不動を示す。 野生型マウス及びＤＲ６^－／－マウスのオープンフィールド自発運動行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝１４）動物及びＤＲ６－／－（ノックアウト；■；ｎ＝１６）動物の１時間にわたる（over an hour an hour）合計立ち上がり時間を示す。 野生型マウス及びＤＲ６^－／－マウスのオープンフィールド自発運動行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝１４）動物及びＤＲ６－／－（ノックアウト；■；ｎ＝１６）動物の１時間にわたる（over an hour an hour）基本運動を示す。 野生型マウス及びＤＲ６^－／－マウスのオープンフィールド自発運動行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝１４）動物及びＤＲ６－／－（ノックアウト；■；ｎ＝１６）動物の１時間にわたる（over an hour an hour）微細運動を示す。 野生型マウス及びＤＲ６^－／－マウスのオープンフィールド自発運動行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝１４）動物及びＤＲ６－／－（ノックアウト；■；ｎ＝１６）動物の１時間にわたる（over an hour an hour）Ｘ＋Ｙ歩行を示す。 野生型マウス及びＤＲ６^－／－マウスのオープンフィールド自発運動行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝１４）動物及びＤＲ６－／－（ノックアウト；■；ｎ＝１６）動物の１時間にわたる（over an hour an hour）合計静止を示す。 野生型マウス及びＤＲ６^－／－マウスのオープンフィールド自発運動行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝１４）動物及びＤＲ６－／－（ノックアウト；■；ｎ＝１６）動物の１時間にわたる（over an hour an hour）立ち上がりを示す。 すべてのデータは、平均±ＳＥＭとして報告される。２要因分散分析は、Ｐ≦０．０５の場合は^＊、Ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、Ｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊、Ｐ≦０．０００１の場合は^＊＊＊＊とする、野生型マウスの値と、ノックアウトマウスの値とを比較した統計分析の目的で実行される。

キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝１４）動物及びＤＲ６－／－（ノックアウト；■ｎ＝１８）動物の四肢間協調を示す。 キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝１４）動物及びＤＲ６－／－（ノックアウト；■ｎ＝１８）動物の足圧力を示す。 キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝１４）動物及びＤＲ６－／－（ノックアウト；■ｎ＝１８）動物の足跡面積を示す。 キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝１４）動物及びＤＲ６－／－（ノックアウト；■ｎ＝１８）動物のストライド長を示す。 キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝１４）動物及びＤＲ６－／－（ノックアウト；■ｎ＝１８）動物の立脚相を示す。 キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝１４）動物及びＤＲ６－／－（ノックアウト；■ｎ＝１８）動物の遊脚相を示す。 キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝１４）動物及びＤＲ６－／－（ノックアウト；■ｎ＝１８）動物の旋回速度を示す。 キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝１４）動物及びＤＲ６－／－（ノックアウト；■ｎ＝１８）動物の衝撃係数を示す。 すべてのデータは、平均±ＳＥＭとして報告される。２要因分散分析は、Ｐ≦０．０５の場合は^＊、Ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、Ｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊、Ｐ≦０．０００１の場合は^＊＊＊＊とする、野生型マウスの値と、ノックアウトマウスの値とを比較した統計分析の目的で実行される。

９～２１週齢（ｘ軸）の野生型（●；ｎ＝１４）動物及びＤＲ６^－／－（■；ｎ＝１８）動物の前肢及び後肢の歩行能力を示す。
平均前及び後足圧力を示す。 平均前及び後足跡面積を示す。 平均前及び後ストライド長を示す。 平均前及び後立脚相を示す。 平均前及び後旋回速度を示す。 平均前及び後遊脚相を示す。 平均前及び後衝撃係数を示す。 すべてのデータは、平均±ＳＥＭとして報告される。２要因分散分析は、Ｐ≦０．０５の場合は^＊、Ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、Ｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊、Ｐ≦０．０００１の場合は^＊＊＊＊とする、野生型マウスの値と、ノックアウトマウスの値とを比較した統計分析の目的で実行される。

神経学的スコアリング、例えば、１０～２１週齢の野生型（●）動物及びＤＲ６^－／－（ノックアウト；■）動物の運動障害スコア、振戦スコア、及び硬直スコアを示す。すべてのデータは、平均±ＳＥＭとして報告される。２要因分散分析は、Ｐ≦０．０５の場合は^＊、Ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、Ｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊、Ｐ≦０．０００１の場合は^＊＊＊＊とする、野生型マウスの値と、ノックアウトマウスの値とを比較した統計分析の目的で実行される。

上部パネルは、野生型（左）動物又はＤＲ６^－／－（右）動物から単離され、ヘマトキシリン及びエオシンで免疫染色された、脳の代表的なスライドを示す。また、下部パネルでは、野生型（左の棒線）動物及びＤＲ６^－／－（ノックアウト；右の棒線）動物の脊髄内の運動ニューロンの数（ｙ軸；運動ニューロンの平均数）を示す。

野生型（左の棒線）動物又はＤＲ６^－／－（ノックアウト；右の棒線）動物の脊髄（左パネル）及び脳（右パネル）内におけるＭＢＰ（上部パネル）又はＮＧＦＲ（下部パネル）のｍＲＮＡのレベル（β－アクチンに対する平均ｍＲＮＡレベル；ｙ軸）を示す。

野生型（左の棒線）動物又はＤＲ６^－／－（ノックアウト；右の棒線）動物の脊髄（左パネル）及び脳（右パネル）内におけるＣｈａｔ（上部パネル）又はＭｎｘ（下部パネル）のｍＲＮＡのレベル（β－アクチンに対する平均ｍＲＮＡレベル；ｙ軸）を示す。

野生型（左の棒線）動物又はＤＲ６^－／－（ノックアウト；右の棒線）動物の脊髄（左パネル）及び脳（右パネル）内におけるＧｒｉｎ３ｂ（上部パネル）又はＧｒｉａ２（下部パネル）のｍＲＮＡのレベル（β－アクチンに対する平均ｍＲＮＡレベル；ｙ軸）を示す。

野生型（ＷＴ；ｘ軸）マウス又はＤＲ６^－／－（ＫＯ；ｘ軸）マウスの胸腺、脾臓、又は抹消から得られる親細胞のパーセント（親の％；ｙ軸）として、異なる細胞の数を示す。

野生型（ＷＴ；ｘ軸）マウス又はＤＲ６^－／－（ＫＯ；軸）マウスの胸腺、脾臓、又は抹消から得られる親細胞のパーセント（親の％；ｙ軸）として、異なる細胞の数を示す。

野生型（ｎ＝６；黒色の棒線）動物又はＤＲ６^－／－（ｎ＝６；グレーの棒線）動物の血清中の異なるサイトカイン又はケモカイン（ｘ軸）の濃度（平均観測濃度；ｙ軸）を示す。

野生型動物（ＤＲ６^＋／＋；黒色の棒線）及びＤＲ６^＋／－動物（ＤＲ６^＋／－；格子縞の棒線；ｘ軸）から得られる胚幹細胞由来の運動ニューロンの培養後に得られた、生細胞の数（ｙ軸）を示す。 胚幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）培地における、生後１日目又は７日目（ｘ軸）の野生型（ＤＲ６^＋／＋；黒色の棒線）及びヘテロ接合動物（ＤＲ６^＋／－；格子縞の棒線）から得られる胚幹細胞由来の運動ニューロの酸化的ストレス（平均光学的密度；ｙ軸）を示す。Ｐ≦０．０００１の場合、^＊＊＊＊。

神経学的スコアリング、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６^＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６^－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の運動障害スコア、振戦スコア、及び硬直スコアを示す。 １０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６^{＋ ／－}（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６^－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の平均体重（ｙ軸；グラム重量）を示す。 上部パネルは、ロータロッド（ｙ軸；秒）が低下するまでの野生型（●；ｎ＝１３）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６^＋／－（■；ｎ＝１４）、及びホモ接合型ＤＲ６^－／－（Ψ；ｎ＝１５）動物の中位潜時を示し、下部パネルは、１２～２１週齢の野生型（●；ｎ＝１３）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６^＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６^－／－（Ψ；ｎ＝１５）動物のロータロッド（ｙ軸；秒）が低下するまでの最大時間を示す。ロータロッドで費やされた最大時間は、１８０秒である。 野生型マウス、ヘテロ接合型ＤＲ６^＋／－マウス、及びホモ接合型ＤＲ６^－／－マウスのオープンフィールド自発運動行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の、１時間にわたる立ち上がりを示す。 野生型マウス、ヘテロ接合型ＤＲ６^＋／－マウス、及びホモ接合型ＤＲ６^－／－マウスのオープンフィールド自発運動行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の、１時間にわたる合計立ち上がり時間を示す。 野生型マウス、ヘテロ接合型ＤＲ６^＋／－マウス、及びホモ接合型ＤＲ６^－／－マウスのオープンフィールド自発運動行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の、１時間にわたる基本運動を示す。 野生型マウス、ヘテロ接合型ＤＲ６^＋／－マウス、及びホモ接合型ＤＲ６^－／－マウスのオープンフィールド自発運動行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の、１時間にわたる不動を示す。 野生型マウス、ヘテロ接合型ＤＲ６^＋／－マウス、及びホモ接合型ＤＲ６^－／－マウスのオープンフィールド自発運動行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の、１時間にわたる微細運動を示す。 野生型マウス、ヘテロ接合型ＤＲ６^＋／－マウス、及びホモ接合型ＤＲ６^－／－マウスのオープンフィールド自発運動行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の、１時間にわたるＸ＋Ｙ歩行を示す。 野生型マウス、ヘテロ接合型ＤＲ６^＋／－マウス、及びホモ接合型ＤＲ６^－／－マウスのオープンフィールド自発運動行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の、１時間にわたる合計距離を示す。 野生型マウス、ヘテロ接合型ＤＲ６^＋／－マウス、及びホモ接合型ＤＲ６^－／－マウスのオープンフィールド自発運動行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の、１時間にわたる合計静止を示す。 キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物のストライド長を示す。 キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物のストライド長を示す。 キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の旋回速度を示す。 キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の旋回速度を示す。 キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の四肢間協調を示す。 キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の遊脚相を示す。 キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の遊脚相を示す。 キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の衝撃係数を示す。 キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の衝撃係数を示す。 キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の足跡面積を示す。 キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の足跡面積を示す。 キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の立脚相を示す。 キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の立脚相を示す。 キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の足圧力を示す。 キャットウォーク行動、例えば、１０～２１週齢の野生型（●；ｎ＝２７）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６＋／－（■；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６－／－（Ψ；ｎ＝３３）動物の足圧力を示す。 すべてのデータは、平均±ＳＥＭとして報告される。２要因分散分析は、Ｐ≦０．０５の場合は^＊、Ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、Ｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊、Ｐ≦０．０００１の場合は^＊＊＊＊とする、野生型マウスの値と、ノックアウトマウスの値とを比較した統計分析の目的で実行される。

４８℃、５２℃、又は５５℃の一定温度に温められた金属プレート（metal plat）にさらされた、野生型（左の棒線；ｎ＝１３）動物、ヘテロ接合型ＤＲ６^{＋／ －}（中央の棒線；ｎ＝１４）動物、及びホモ接合型ＤＲ６^－／－（右の棒線；ｎ＝１５）動物の侵害受容反応までの潜時（時間；ｙ軸）を示す。すべてのデータは、平均±ＳＥＭとして報告される。２要因分散分析は、Ｐ≦０．０５の場合は^＊、Ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、Ｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊、Ｐ≦０．０００１の場合は^＊＊＊＊とする、野生型マウスの値と、ノックアウトマウスの値とを比較した統計分析の目的で実行される。

説明
ルー・ゲーリック病とも呼ばれる筋萎縮性側索硬化症（「ＡＬＳ」）は、毎年新しい症例が５，０００件発生し、２０，０００人ものアメリカ人に影響を及ぼしている進行性の致命的な神経疾患である。この疾患は、運動ニューロン疾患として知られる疾患の分類に属する。随意運動を制御する脳及び脊髄内の特定の神経細胞が次第に縮退すると、ＡＬＳを発症する。脳及び脊髄の両方が、体内の筋へのメッセージを生み、送り届ける能力を失う。機能できない筋は、次第に萎縮し、単収縮を起こす。

ＡＬＳは、どの筋が最初に弱まるかにより、様々な形で現れる。症状としては、つまずき及び転倒、手及び腕の運動制御の喪失、発話、嚥下及び／又は呼吸困難、持続的疲労、並びに単収縮及び痙攣が挙げられ得、時にはかなり重症となる。最終的に、隔壁及び胸壁内の筋が弱り過ぎると、患者は呼吸するために人工呼吸器を必要とする。ＡＬＳを患うほとんどの患者は、通常、診断されてから３～５年で呼吸不全により死亡するが、診断後１０年以上生き延びる人もいる。ＡＬＳは、中年期を襲う。男性のほうが、女性よりも約１．５倍この病気にかかりやすい。

ＡＬＳに治療法はなく、疾患の経過を防止する又は反転させるであろう、実証された療法もない。アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）は最近、ＡＬＳ患者の生存期間を延ばすことが示された最初の薬、リルゾールを承認した。患者はまた、それらの症状の一部に取り組む支持療法を受けることができる。

本明細書には、ヒトのＡＬＳ治療に有益であり得る候補薬剤の発見に有益であり得る、ＡＬＳの動物モデルが提供される。

本明細書で記載又は参照されている手技及び手順は、当業者により、従来の方法論、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている、幅広く使用される分子クローニング方法論などを使用して、概ねよく理解され、一般的に採用されている。必要に応じて、市販のキット及び試薬の使用を伴う手順が、別途記載のない限り、概ね、製造業者が定義した実施要綱及び／又はパラメーターに従って実行される。

本方法及びアッセイを記載する前に、本発明が特定の方法論、実施要綱、細胞系、動物種又は類、構成物に限定されず、そういうものとして記載される試薬は当然ながら変更され得ることを理解すべきである。単数形の「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ（遺伝子変異）」の言及は、複数のかかる変異を含み、「ａ ｐｒｏｂｅ（プローブ）」の言及は、１つ又は２つ以上のプローブと、当業者に既知であるその等価物との言及を含む、というようになる。本明細書及び関連する請求項に列挙されたすべての番号（例えば、アミノ酸２２～８１、１～３５４など）は、用語「約」によって変更されることが理解される。

本明細書で言及するすべての出版物は、引用された出版物に関連する方法及び／又は材料を開示並びに説明するため、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用されている出版物は、本出願の出願日より前にそれらの開示に引用されている。発明より先の優先日又は前の日付であるという理由から、発明者が出版物を先行する権利がないことを承認するものとして、本明細書が解釈されるべきではない。更に、実際の出版日は、表示されている日付とは異なる可能性があり、個別の確認が必要である。

定義
用語「胚幹細胞」又は「ＥＳ細胞」は、胚内への導入後に発達中の胚の任意の組織に寄与することが可能である胚由来全能性又は多能性細胞を含む。用語「多能性細胞」には、複数の分化細胞のタイプへと発達する能力を有する未分化細胞が含まれる。

いくつかの標的化ベクターは、「大型標的化ベクター」又は「ＬＴＶＥＣ」であり、真核細胞内で相同組み換えを実施することを意図した他の手法により通常使用される核酸配列よりも大きな核酸配列に相当し、かつ核酸配列に由来するホモロジーアームを含む真核細胞の大型標的化ベクターを含む。ＬＴＶＥＣの例としては、限定されるものではないが、細菌相同染色体（ＢＡＣ）及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられる。ＬＴＶＥＣを使用する標的化された遺伝子改変を起こす例は、例えば、あらゆる目的のためにそれぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／０８８６４３号、米国特許第２０１５／０１５９１７５号、同第２０１５／０１５９１７４号、同第２０１４／０３１０８２８号、同第２０１４／０３０９４８７号、及び同第２０１３－０３０９６７０号を参照されたい。ＬＴＶＥＣはまた、細胞内で相同組み換えを実施することを意図した他の手法により通常使用される核酸配列よりも大きな核酸配列を有する核酸挿入物を含む標的化ベクターも含む。例えば、ＬＴＶＥＣは、それらのサイズ制限のため、従来のプラスミド系標的化ベクターが対応することができない大型遺伝子座の修飾を可能にする。例えば、標的化された遺伝子座は、ヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）によって引き起こされる切れ目若しくは二本鎖切断が存在しなければ、従来法を用いて標的化できないか、又は誤って若しくは顕著に低い効率性でのみ標的化される可能性がある、細胞の遺伝子座であってもよい（即ち、５’及び３’ホモロジーアームは、細胞の遺伝子座に対応してもよい）。

ＬＴＶＥＣの例には、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体、又は酵母人工染色体（ＹＡＣ）に由来するベクターが挙げられるが、これらに限定されない。ＬＴＶＥＣ及びそれらを作製するための方法の非限定的な例は、例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、同第６，５９６，５４１号、同第７，１０５，３４８号、及び国際公開第２００２／０３６７８９号（ＰＣＴ／ＵＳ０１／４５３７５）に記載され、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。ＬＴＶＥＣは、直線形状又は円形形状であってもよい。

ＬＴＶＥＣは、例えば、少なくとも１０ｋｂ又は約５０ｋｂ～約４００ｋｂ以上を含む、任意の長さであってもよい。ＬＴＶＥＣのサイズは、従来のアッセイ、例えばサザンブロッティング及びロングレンジ（例えば、１ｋｂ～５ｋｂ）ＰＣＲ）による標的化イベントのスクリーニングを可能とするにはあまりに大きい恐れがある。５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームの総計は、例えば、少なくとも１０ｋｂであってもよい（それぞれのホモロジーアームは、例えば、約５ｋｂ～約２００ｋｂの範囲であってもよい）。ＬＴＶＥＣ及び酢酸インサートは、約５ｋｂ～約３Ｍｂ（例えば、約５００ｋｂ以上）の長さの標的遺伝子座での欠失を見込むように設計され得る。同様に、ＬＴＶＥＣ及び核酸インサートは、約５ｋｂ～約４００ｋｂ以上の長さの外因性核酸配列の標的遺伝子座へのインサートを見込むように設計され得る。

「組み換え部位」という用語には、部位特異的リコンビナーゼによって認識され、組み換え事象のための基質として使用できるヌクレオチド配列が含まれる。

「部位特異的リコンビナーゼ」という用語には、「組み換え部位」間の組み換えを促進し得る酵素群を含む。「部位特異的リコンビナーゼ」の例としては、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、及びＤｒｅリコンビナーゼが挙げられるがこれらに限定されない。

核酸配列に関する用語「生殖細胞系」には、子孫に継承できる核酸配列が含まれる。

「操作可能に連結」という句は、構成要素が、それらの意図する方法で一緒に機能するように連結されることを意味する。一事例において、タンパク質をコードする核酸配列は、制御配列（例えばプロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列等）に操作可能に連結させてもよく、それにより、適切な転制御が維持される。別の事例において、シグナルペプチドをコードする核酸配列は、例えば、膜貫通ドメインをコードする核酸配列に操作可能に連結され得、それにより、膜貫通ドメインに操作可能に融合されたシグナルペプチドを含むポリペプチドに翻訳され、シグナルペプチド及び膜貫通ドメインの両方は、それらの対応の生物学的機能を維持する。

「遺伝子座」という用語は、ゲノムＤＮＡ内のＤＮＡ断片として定義される。例えば、ＤＲ６遺伝子座は、ＤＲ６をコードするゲノムＤＮＡ内のＮＤＮＡ断片であり、ＤＲ６の発現と関連する非翻訳及び／又は制御ＤＮＡを含む。

細胞死受容体６（ＤＲ６）と呼ばれるＴＮＦＲファミリーメンバー（文献では「ＴＲ９」とも称される。また、文献ではＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー２１又はＴＮＦＲＳ２１として知られる）は、４つの細胞外システインリッチモチーフ及び細胞質デスドメイン構造を有するＩ型膜貫通受容体として記述されている（Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４３１：３５１～３５６（１９９８）；米国特許第６，３５８，５０８号、同第６，６６７，３９０号；同第６，９１９，０７８号；同第６，９４９，３５８号も参照のこと）。特定のトランスフェクト細胞株内のＤＲ６の過剰発現は、ＮＦ－ｋＢ及びＪＮＫの両方のアポトーシス及び活性化をもたらしたことが報告されている（Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４３１：３５１～３５６（１９９８））。ＤＲ６減衰のマウスモデルでは、Ｔ細胞はＪＮＫ活性化において実質的に損なわれ、ＤＲ６（－／－）マウスがタンパク質抗原でチャレンジされると、それらのＴ細胞は過剰増殖し、Ｔｈ２反応への重大な極性化を示すことが発見された（反して、Ｔｈ１の分裂は、同等の影響を及ぼさなかった）（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９４：１４４１～１４４８（２００１））。ＤＲ６の標的分裂は、生体外での拡張された２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）の分化をもたらした（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ）。Ｂ細胞媒介状態又は神経学的状態の調節におけるＤＲ６アゴニスト及びアンタゴニストの様々な用法が、２００５年３月３１日公開の米国特許第２００５／００６９５４０号と、２０１０年８月１２日公開の同第２０１０／０２０３０４４号と、に記載されている。

マウスＤＲ６受容体遺伝子座は、染色体１７で発見され、６つのエキソンを有する。この遺伝子座は、推定シグナル配列（アミノ酸１～４１；配列番号１５のアミノ酸－４１～－１）、細胞外ドメイン（アミノ酸４２～３４９；配列番号１５のアミノ酸１～３０８）、膜貫通ドメイン（アミノ酸３５０～３７０；配列番号１５のアミノ酸３０９～３２９）、次いで細胞質ドメイン（アミノ酸３７１～６５５；配列番号１５のアミノ酸３３０～６１４）を有する、６５５アミノ酸タンパク質（配列番号１５）をコードする。成熟したＤＲ６タンパク質は、そのシグナルタンパク質の開裂後に翻訳されたポリペプチドを指し、例えば、成熟したマウスＤＲ６タンパク質は、アミノ酸４２～６５５；配列番号１５のアミノ酸１～６１４を指す。

下の表１に、配列番号によって同定された配列の簡単な説明を示す。

Ｉ．少なくとも１つのＤＲ６遺伝子座の遺伝子修飾を含む組成物
内因性ＤＲ６細胞質ドメインのいずれかの部分をコードするヌクレオチド配列を欠いている修飾されたＤＲ６遺伝子座を含み、ＤＲ６シグナルペプチド、膜貫通ドメイン、及び／又はレポータータンパク質をコードする核酸配列を更に含み得る、非ヒト動物、細胞、組織、及び胚が提供される。ＤＲ６発現を操作するための方法及び組成物が提供される。ＤＲ６を修飾することを目的とした標的組成物も提供される。ＤＲ６機能の調節に関連付けられた、運動ニューロン機能障害、例えばＡＬＳに似た表現型を示す、非ヒト動物、細胞、及び組織が提供される。以下の説明は、ある特定のＤＲ６の調査に関連しているが、方法及び組成物は任意のＤＲ６を用いて実施され得る。

本明細書には、ＤＲ６機能に影響を及ぼし得る、又はＤＲ６遺伝子座における標的化された遺伝子修飾（例えば、レポーターノックイン）に使用され得る、修飾されたＤＲ６遺伝子座及び／又は核酸を含む非ヒト動物、細胞、組織、及び胚が提供される。このような場合、修飾されたＤＲ６遺伝子座は、ＤＲ６をコードする核酸配列に機能欠失型変異体を含む。また、ＤＲ６の機能欠失型変異体を含む非ヒト動物由来の細胞、組織、及び胚が提供される。

「機能欠失型」という用語は、ＤＲ６に関連するとき、ＤＲ６の発現の減少若しくは欠如及び／又はＤＲ６の活性／機能の減少又は欠如をもたらす、導入遺伝子のＤＲ６遺伝子座及び／又は発現におけるいずれかの修飾を含み得る。ＤＲ６の発現レベルは、例えば、細胞若しくは生物中のＤＲ６のレベルについて分析することによって直接、測定されてもよい。

概して、ＤＲ６の発現レベル及び／又は活性は、ＤＲ６の発現レベル及び／又はＤＲ６の活性レベルが、ＤＲ６の発現及び／又は活性を抑制するように遺伝子修飾又は突然変異されていない適切な対照細胞又は生物中のＤＲ６レベルよりも統計的に低い（ｐ≦０．０５）場合、減少する。特定の実施形態では、ＤＲ６の濃度及び／又は活性は、ＤＲ６のレベル及び／又は活性の減少を有するように修飾されていない対照細胞又は生物に対して、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上減少する。

他の場合において、ＤＲ６の発現レベル及び／又は活性を低減する標的化された遺伝子修飾を有する細胞又は生物は、サザンブロット解析、ＤＮＡ配列決定法、ＰＣＲ解析、又は表現型解析が挙げられるがこれらに限定されない方法を使用して選択される。次いで、そのような細胞又は生物は、本明細書に記載される様々な方法及び組成物において採用される。

「対象細胞」又は「対象生物」は、本明細書に開示される遺伝子修飾などの遺伝子修飾がもたらされている細胞／生物か、又はそのように変異させた細胞／生物の子孫であり、かつその変異を含む細胞／生物である。「対照」又は「対照細胞」又は「対照生物」は、対象細胞又は生物の表現型の変化を測定するための基準点を提供する。一実施形態では、対照細胞／生物は、それが発現及び／又は活性の減少をもたらす遺伝子修飾又は突然変異を欠くことを除いて、ＤＲ６における遺伝子修飾を有する細胞／生物と可能な限り厳密に一致している（例えば、個々の細胞は、同じ細胞株に由来し得る）。他の事例においては、対照細胞／生物は、例えば、（ａ）野生型細胞／生物、すなわち、対象細胞／生物をもたらした遺伝子変異の出発材料と同じ遺伝子型のものか、（ｂ）出発物質と同じ遺伝子型であるが、ヌル構築物により（すなわち、マーカー遺伝子を含む構築物など、対象となる形質に対する効果が知られていない構築物により）遺伝子修飾された細胞／生物か、（ｃ）対象細胞／生物の非遺伝子修飾子孫である細胞／生物（すなわち、対照細胞及び対象細胞が同じ細胞株に由来する）か、（ｄ）対象細胞／生物と遺伝学的に同一であるが、対象となる遺伝子の発現を誘導するであろう条件又は刺激にさらされていない細胞／生物か、又は、（ｅ）遺伝子修飾が対象となるポリヌクレオチドの発現に変異をもたらさない条件下での対象細胞／生物自体か、を含んでもよい。

動物、細胞、組織、又は胚に関連する「動物」という用語は、哺乳類、魚類、及び鳥類を含む。哺乳動物としては、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、シカ、バイソン、ヒツジ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、家畜（例えば、ウシ種、例えば、乳牛、去勢雄牛など、ヒツジ種、例えば、ヒツジ、ヤギなど、及びブタ種、例えば、ブタ及びイノシシ）が挙げられる。鳥類としては、例えば、鶏、七面鳥、ダチョウ、ガン、アヒルなどが挙げられる。家畜及び農業用動物もまた含まれる。動物、細胞、組織、又は胚に関連した句「非ヒト動物」は、ヒトを除外する。

一実施形態では、動物は非ヒト動物である。別の実施形態では、非ヒト動物は哺乳類である。別の実施形態では、哺乳類はげっ歯類である。更に別の実施形態では、げっ歯類はマウス、ラット、又はハムスターである。更に別の実施形態では、げっ歯類はマウス又はラットである。いくつかの実施形態では、げっ歯類はマウスである。

本明細書に記載される遺伝子修飾は、ＤＲ６遺伝子座からの１つ又は２つ以上の欠失、ＤＲ６遺伝子座への付加、ＤＲ６遺伝子座若しくはその一部分の置換、及び／又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。遺伝子座は、コード領域又は非コード制御領域を含み得る。本明細書に記載される遺伝子修飾は、また、ＤＲ６遺伝子座の外側のゲノム内への導入遺伝子の挿入を含み得、導入遺伝子の発現は、内因性ＤＲ６タンパク質のリガンド結合、細胞膜内での置換などを妨害、例えば、競合する。

本明細書に提供される遺伝子修飾は、ＤＲ６遺伝子座を標的とし得る。ＤＲ６の機能欠失は、ＤＲ６遺伝子中の標的化された遺伝子修飾（すなわち、制御領域、コード領域、エキソン、及び／又はイントロンなどにおける遺伝子修飾）に起因し得る。そのような標的化された修飾には、１つ若しくは２つ以上のヌクレオチドの付加、１つ若しくは２つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ若しくは２つ以上のヌクレオチドの置換、ＤＲ６遺伝子座の分裂、ＤＲ６遺伝子座若しくはその一部分のノックアウト、ＤＲ６遺伝子座若しくはその一部分のノックイン、異種核酸配列による内因性ＤＲ６核酸配列若しくはその一部分の置換、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、７、８、９、１０、５０、１００、４００個、又はそれよりも多くのヌクレオチドが、標的化されたゲノム修飾を形成するように変化させられる。

一実施形態では、機能欠失型変異体は、少なくとも１つのＤＲ６機能の分裂又はノックアウトによって特性化される。

ＤＲ６遺伝子座は概ね、修飾がＤＲ６機能の調節をもたらすように、遺伝子座のいずれかの領域で遺伝子修飾され得る。一実施形態では、ＤＲ６遺伝子座の修飾は、ＤＲ６コード領域全体又はその一部分の欠失を含む。一実施形態では、修飾されたＤＲ６遺伝子座は、成熟したＤＲ６タンパク質又はその一部分をコードする１つ又は２つ以上のエキソンの欠失を含む。別の実施形態では、欠失は、ＤＲ６遺伝子座の第１、第２、第３、第４、第５、及び／又は第６のエキソンから始まる、ＤＲ６遺伝子座内の１つ又は２つ以上のエキソンの欠失を含む。他の実施形態では、欠失は、ＤＲ６遺伝子座の第２のエキソンから始まる、ＤＲ６遺伝子座内の１つ又は２つ以上のエキソンの欠失を含む。

いくつかの症例では、ＤＲ６遺伝子座又はその一部分は、挿入核酸に置換される。このような症例では、置換は、ＤＲ６遺伝子座のＲＮＡコード領域全体若しくはその一部分の挿入核酸との置換、ＤＲ６遺伝子座の１つ若しくは２つ以上のエキソンの挿入核酸との置換、ＤＲ６遺伝子座の第１のエキソンから始まるＤＲ６遺伝子座内の１つ若しくは２つ以上のエキソンの挿入核酸との置換、又は第２のエキソンから始まるＤＲ６遺伝子座内の１つ又は２つ以上のエキソンの挿入核酸との置換であり得る。

いくつかの事例では、挿入核酸は、内因性ＤＲ６プロモーターが挿入核酸の発現を駆動するように、内因性ＤＲ６プロモーターと操作可能に連結するよう、ＤＲ６遺伝子座内に位置付けられる。このような場合には、核酸配列の発現は、ＤＲ６の発現パターンに従う。

一実施形態では、ＤＲ６遺伝子座又はその一部分は、レポーターをコードする第１の核酸配列を含む挿入核酸に置換される。例えば、挿入核酸がレポーター遺伝子を含み、ＤＲ６プロモーターに操作可能に連結してＤＲ６遺伝子座に配置される場合、レポーター遺伝子の発現は、内因性ＤＲ６プロモーターによって駆動される。あるいは、挿入核酸は、内因性ＤＲ６プロモーターと操作可能に連結して挿入されない。このような場合、挿入核酸は、プロモーターを含み得る。一実施形態では、挿入核酸は、レポーター遺伝子の発現を駆動するプロモーターに操作可能に連結されたレポーター遺伝子を含む。

いくつかの実施形態では、挿入核酸は、内因性ＤＲ６シグナル配列を含み得、例えば、内因性ＤＲ６シグナル配列、及び必要に応じて内因性ＤＲ６膜貫通ドメインに操作可能に連結するようにＤＲ６遺伝子座内に位置付けられ得る。このような場合、ＤＲ６遺伝子座に外因的に位置する又は内因性ＤＲ６遺伝子にある、挿入核酸によってコードされるいずれかのタンパク質（複数の場合あり）の宛先（例えば、レポーター）は、ＤＲ６の宛先と類似する（例えば、膜内に、例えば、内因性膜貫通ドメインと一緒に固定される）。一実施形態では、挿入核酸は、内因性膜貫通ドメインを置換し得る。このような場合及び他の場合には、挿入核酸は、異種膜貫通ドメインをコードする第２の核酸を含み得る。一実施形態では、挿入核酸は、異種膜貫通ドメイン遺伝子に操作可能に連結されたレポーター遺伝子を含み、挿入核酸は、内因性ＤＲ６シグナル配列に操作可能に連結されたＤＲ６遺伝子に挿入され、それにより、挿入核酸の発現は内因性ＤＲ６プロモーターによって駆動され、挿入核酸によってコードされるタンパク質（複数の場合あり）は、シグナル配列に従って膜内に固定される。

一実施形態では、ＤＲ６遺伝子座又はその一部分は、選択可能マーカーをコードする更なる核酸配列を含む挿入核酸に置換される。このような場合、更なる核酸配列は、選択可能マーカーの発現を駆動するプロモーターに操作可能に連結される。

別の実施形態では、ＤＲ６遺伝子座又はその一部分は、膜貫通遺伝子、レポーター遺伝子、及び選択可能マーカー遺伝子を含む挿入核酸に置換される。このような場合、レポーター遺伝子及び／又は選択可能マーカー遺伝子は、プロモーターに操作可能に連結されても、されなくてもよい。

方法及び組成物に採用され得る様々なプロモーターが、本明細書の別の個所に提供されている。

このような遺伝子修飾（標的ＤＲ６の発現及び／又は活性における減少又は修飾をもたらすものを含む）はまた、生殖細胞系を介して送達されることもできる。特定の実施形態では、遺伝子修飾は、所望の標的遺伝子座のノックアウトをもたらす。このような非ヒト動物は、例えば、本明細書の別の個所で考察されるように多様な実験系で用途を見出す（find use in in）。

例えば、ＤＲ６ノックアウトは、ＤＲ６機能、発生におけるＤＲ６の役割、並びに様々な細胞経路及び疾病、特にＡＬＳなどの運動ニューロン機能障害におけるＤＲ６の役割を調査するための動物モデルを提供する。

本明細書には、非ヒト動物、細胞、組織、又は胚内のＤＲ６遺伝子座の遺伝子修飾に関する方法及び組成物が提供される。

ＤＲ６遺伝子座の遺伝子修飾は、本明細書の別の個所で詳細に説明している、遺伝子座の任意の修飾（すなわち、欠失、挿入、置換など）であり得る。このような場合、遺伝子修飾は、ＤＲ６の機能欠失をもたらす。一実施形態では、遺伝子修飾は、ＤＲ６の分裂又はノックアウトを含む。

Ａ．レポーターノックイン対立遺伝子の設計及び構成
非限定的な例として、欠失開始点は、挿入核酸が、内因性シグナル配列に操作可能に連結されることを可能にするように、第２のエキソンに設定され得る。図１は、ＤＲ６をコードする配列のすべて又はほとんどの標的欠失と、ＲＯＲ１（受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１）遺伝子からの膜貫通ドメイン配列を含むカセット、β－ガラクトシダーゼをコードするＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子からの配列、及びＧ４１８耐性ＥＳ細胞コロニーの選択のためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼを発現するカセット（ｎｅｏ^ｒ）との置換と、の例を示す。表現型分析の前にＣｒｅ媒介切除を可能にするＬｏｘＰリコンビナーゼ認識部位は、薬剤選択カセットに隣接する。

ＬＴＶＥＣ標的化ベクターは、ＥＳ細胞に導入され、対立遺伝子アッセイの修飾によって適切に標的化されたクローンのためのスクリーニングが行われ得る（Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ４７６，２９５～３０７）。

様々な方法が、欠失又は挿入などの標的化修飾を有する細胞を同定するために使用され得る。そのような方法は、標的遺伝子座における標的化修飾を有する１つの細胞を同定することを含むことができる。修飾ゲノム遺伝子座を有するそのような細胞を同定するために、スクリーニングが行われ得る。

スクリーニング工程は、親染色体の対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含むことができる。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量的ＰＣＲを介して実施され得る。リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１プライマーセットと、標的化されない参照遺伝子座を認識する第２プライマーセットとを採用することができる。プライマーセットは、増幅された配列を認識するための蛍光プローブを含むことができる。

好適な定量的アッセイの他の例としては、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化プローブ（複数の場合あり）であるＩｎｖａｄｅｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）への定量的ハイブリダイゼーション、ＭＭＰアッセイ（登録商標）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ、又はＥｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国第２００５／０１４４６５５号を参照されたい）。

ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）方法（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ，Ｗ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５，９１～９９）は、標的化されたＥＳ細胞を、ｌａｃＺ発現プロファイリング又はホモ接合への育種に対応する完全ＥＳ細胞由来のＦ０世代ヘテロ接合マウスに変換するため、８細胞胚期注入に適用され得る。ＺＥＮ－Ｕｂ１カセットを有するマウスは、あらゆるＦｌｏｘｅｄ ｎｅｏ^ｒカセットを除去するため、Ｃｒｅデリーターマウス株（例えば、国際公開第２００９／１１４４００号を参照されたい）に育種され得る。

ＤＲ６レポーターノックイン動物を生成する方法の更なる詳細は、本明細書の実施例１に提供される。

Ｂ．レポーター発現プロファイリング
本明細書の別の個所に記載されるように、ＤＲ６遺伝子座の遺伝子修飾は、ＤＲ６遺伝子座又はその一部分を挿入核酸と置換すること、又はそこに挿入／付加することを含み得る。いくつかの場合、挿入核酸は、レポーター遺伝子を含む。一実施形態では、レポーター遺伝子は、内因性ＤＲ６プロモーターと操作可能に連結するＤＲ６遺伝子座内に位置付けられる。このような修飾は、内因性ＤＲ６プロモーターによって駆動されるレポーター遺伝子の発現を可能にする。あるいは、レポーター遺伝子は、内因性ＤＲ６プロモーターと操作可能に連結して配置されない。

任意のレポーター（又は感知可能な部分）が、周知の方法及び組成物で使用され得る。レポーターの非限定的な例としては、例えば、β－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子よりコード化）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、又はこれらの組み合わせを含む。

本明細書に記載の方法及び組成物は、レポーター遺伝子の欠損時に、又は任意のレポーター遺伝子とともに実行され得る。以下の説明は、β－ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺレポーター遺伝子を使用する、非限定的な例である。

Ｃ．表現型
内因性ＤＲ６遺伝子座の遺伝子修飾は、本明細書に提供される非ヒト動物における様々な表現型をもたらし得る。一実施形態では、内因性ＤＲ６遺伝子座の遺伝子修飾は、出生時に相対的に正常であるが、加齢時、例えば、生後１週間、生後２週間、生後３週間、生後４週間、生後５週間、生後６週間、生後７週間、生後８週間などでＡＬＳに似た症状を現す、非ヒト動物をもたらす。別の実施形態では、内因性ＤＲ６遺伝子座の遺伝子修飾は、１つ又は２つ以上の細胞型、例えば、ニューロン及び／若しくは膠細胞、並びに／又はその一部分、例えばミエリンの異常な機能をもたらす。ニューロンは、感覚ニューロン、運動ニューロン、及び介在ニューロンと一般に称されるその他すべてのニューロン型を含む。膠細胞は、星状膠細胞、乏突起神経膠細胞などを含む。

「ＡＬＳに似た症状」という用語又はそれに類する用語は、概ね、「ＡＬＳに関連付けられた症状」又は「上位及び／又は下位運動ニューロン機能障害がもたらす症状」を意味するものである。ＡＬＳに似た症状は、運動ニューロン、感覚ニューロン、及び／又は介在ニューロンなどのニューロン障害を伴い得る。例えば、上位運動ニューロンを伴うＡＬＳに似た症状は、痙直（例えば、痙性麻痺、硬直）、反射増加及び／又は異常（例えば、バビンスキー徴候）、振戦、並びにそれらの組み合わせをもたらし得る。下位運動ニューロンの障害を伴うＡＬＳに似た症状は、筋力低下及び消耗、線維束性収縮、並びにそれらの組み合わせ、かつ／又は嚥下不能及び舌筋の線維束性収縮をもたらす延髄の障害をもたらし得る。ＡＬＳに似た症状は、また、以下の表現型のうちの１つ又は２つ以上を含み得る：ａ）後弯症、ｂ）異常後肢クラスピング、引きずり、又はつま先の曲がり、ｃ）運動調整及び運動学習能力の欠失、ロータロッド、キャットウォーク、及び／若しくはオープンフィールド試験における欠失、ｄ）脊髄内の運動ニューロン喪失、ｅ）脊髄内の星状細胞腫、ｆ）対照げっ歯類と比較した体重減少、ｇ）ポリユビキチンタンパク質の蓄積、ｈ）ＡＬＳ－ＴＤＩ神経学的スコアリングシステムを使用した神経学的スコアリングの増加、並びに／又はｉ）疼痛刺激に反応するまでの潜時の増加。

ＩＩ．非ヒト動物内の内因性ＤＲ６遺伝子座を修飾するための方法
非ヒト動物、細胞、組織、又は胚内の内因性ＤＲ６遺伝子座を遺伝子修飾する方法を本明細書に提供する。一実施形態において、多能性細胞中のＤＲ６遺伝子座を修飾するための方法が提供される。かかる方法は、（ａ）多能性細胞に、ＤＲ６遺伝子座で相同組み換えを起こし得る、５’及び３’ホモロジーアームに隣接する挿入核酸を含む標的化構築物を導入することと、（ｂ）ＤＲ６遺伝子座で標的化された遺伝子修飾を含む、修飾された多能性細胞を同定することと、を含む。かかる方法では、遺伝子修飾は、ＤＲ６の機能欠失をもたらす。一実施形態では、多能性細胞はげっ歯類胚幹細胞である。別の実施形態では、多能性細胞はヒト線ｉＰＳ細胞である。

Ａ．標的化ベクター及び挿入核酸
本明細書には、本明細書に提供される遺伝子修飾された非ヒト動物、細胞、組織、又は胚を作製する方法に採用される、標的化ベクター又は標的化構築物が更に提供される。

一実施形態では、ＤＲ６遺伝子座と相同組み換えを起こし得る５’及び３’ホモロジーアームに隣接する挿入核酸を含む、標的化ベクターが提供される。

標的化ベクター、及び標的化ベクターの構成要素の例（すなわち、挿入核酸、対象となるポリヌクレオチド、発現カセットなど）が、本明細書に詳細に後述されている。

ｉ．挿入核酸
「挿入核酸」又は「挿入ポリヌクレオチド」は、標的遺伝子座に組み込まれることが所望されるＤＮＡのセグメントを含む。一実施形態では、挿入核酸は、対象となる１つ又は２つ以上のポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、挿入核酸は、１つ又は２つ以上の発現カセットを含むことができる。所与の発現カセットは、発現に影響を及ぼす様々な制御成分とともに、対象となるポリヌクレオチド、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、及び／又はレポーター遺伝子を含むことができる。

あらゆる、対象となるポリヌクレオチドは、様々な挿入ポリヌクレオチドに含むことができ、それにより標的ゲノム遺伝子座に組み込むことができる。本明細書に開示される方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６個、又はそれよりも多くの対象となるポリヌクレオチドが標的化されたＤＲ６ゲノム遺伝子座に組み込まれることを可能にする。

一実施形態では、挿入核酸に含まれる対象となるポリヌクレオチドは、レポーターをコードする。別の実施形態では、対象となるポリヌクレオチドは、選択可能マーカーをコードする。

一実施形態では、対象となるポリヌクレオチドには、部位特異の組み換え部位が隣接し得る。特異の実施形態では、部位特異の組み換え部位は、レポーターをコードするセグメント及び／又は選択可能マーカーをコードするセグメントに隣接する。

挿入核酸内に含まれ得る、選択マーカー及びレポーター遺伝子を含む対象となるポリヌクレオチドの非限定的な例は、本明細書の別の個所で詳細に考察される。

挿入ポリヌクレオチドの範囲内の対象となるポリヌクレオチドは、標的ＤＲ６遺伝子座に組み込まれたとき、１つ又は２つ以上の遺伝子修飾を細胞に導入することができる。遺伝子修飾は、内因性核酸配列の欠失、及び／又は標的ゲノム遺伝子座への外因性若しくは異種若しくはオルソロガスポリヌクレオチドの付加を含むことができる。一実施形態において、遺伝子修飾は、標的ゲノム遺伝子座における、内因性核酸配列の、対象となる外因性ポリヌクレオチドとの置き換えを含む。したがって、本明細書で提供される方法は、標的ＤＲ６遺伝子座中のノックアウト、欠失、挿入、置換（「ノックイン」）、点突然変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせを含む、遺伝子修飾の発生を可能にする。そのような修飾は、標的ゲノム遺伝子座への第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、又は任意の後続の挿入ポリヌクレオチドの組み込み後に生じてもよい。

挿入ポリヌクレオチド内の、かつ／又は標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが導入される細胞を起源とする若しくは細胞に相同な配列を含んでもよいか、対象となるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが導入される細胞に対して異種であってもよいか、対象となるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが導入される細胞に対して外因性であってもよいか、対象となるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが導入される細胞に対してオルソロガスであってもよいか、又は、対象となるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが導入される細胞と異なる種由来であってもよい。配列に関する用語「相同な」は、細胞の生来の配列である。配列に関する用語「異種の」は、無縁の種に起源を有する配列であるか、又は、同じ種に由来する場合、構成及び／又はゲノム遺伝子座内の生来の形状から、慎重な人為的介入によって実質的に修飾されている。配列に関する用語「外因性」は、無縁の種に起源を有する配列である。用語「オルソロガス」は、他の種（すなわち種変異体）において既知の参照配列に機能的に同等の、ある種からのポリヌクレオチドである。対象となるポリヌクレオチドには、原核生物、真核生物、非ヒト、げっ歯動物、ハムスター、マウス、ラット、ヒト、サル、鳥類、農業用哺乳動物、又は非農業用哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない、対象となる任意の生物由来であってもよい。対象となるポリヌクレオチドは、コード領域、非コード領域、制御領域、又はゲノムＤＮＡを更に含むことができる。したがって、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、及び／又は後続の任意の挿入ポリヌクレオチドがそのような配列を含むことができる。

一実施形態において、対象となるポリヌクレオチドは、上記のように、約５００ヌクレオチド～約２００ｋｂの範囲に及んでもよい。対象となるポリヌクレオチドは、約５００ヌクレオチド～約５ｋｂ、約５ｋｂ～約２００ｋｂ、約５ｋｂ～約１０ｋｂ、約１０ｋｂ～約２０ｋｂ、約２０ｋｂ～約３０ｋｂ、約３０ｋｂ～約４０ｋｂ、約４０ｋｂ～約５０ｋｂ、約６０ｋｂ～約７０ｋｂ、約８０ｋｂ～約９０ｋｂ、約９０ｋｂ～約１００ｋｂ、約１００ｋｂ～約１１０ｋｂ、約１２０ｋｂ～約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ～約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ～約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ～約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ～約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ～約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ～約１９０ｋｂ、又は約１９０ｋｂ～約２００ｋｂであってもよい。

挿入ポリヌクレオチド内の、かつ／又は標的ゲノム遺伝子座において挿入された対象となるポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードすることができ、ＲＮＡをコードすることができ、又は対象となるポリヌクレオチドは、例えば、制御配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写リプレッサー結合配列、コザックコンセンサスセグメント、開始コドンを含む、対象となる任意の制御領域若しくは非コード領域、又は非タンパク質コード配列の欠失を含むことができるが、タンパク質コード配列の欠失を含まない。また、挿入ポリヌクレオチド内に存在し、及び／又は標的ゲノム遺伝子座に挿入された対象となるポリヌクレオチドは、神経系、骨格系、消化器系、循環系、筋系、呼吸器系、心臓血管系、リンパ系、内分泌系、泌尿器系、生殖器系、又はこれらの組み合わせにおいて発現するタンパク質をコードしてもよい。

一実施形態では、挿入核酸は、内因性遺伝子の少なくとも１つのエキソンのノックイン対立遺伝子を含む。一実施形態では、挿入核酸は、内因性遺伝子全体のノックイン対立遺伝子（すなわち、「遺伝子スワップノックイン」）を含む。

一実施形態では、挿入核酸は、例えば、プロモーター、エンハンサー、又は転写リプレッサー結合要素を含む制御要素を含む。

更なる実施形態では、挿入核酸は、条件付き対立遺伝子を含む。一実施形態では、条件付き対立遺伝子は、参照によりその全体が組み込まれる米国第２０１１／０１０４７９９号に記載されるように、多機能性対立遺伝子である。具体的な実施形態では、条件付き対立遺伝子は、（ａ）標的遺伝子の転写に関するセンス配向における作動配列、及びセンス配向又はアンチセンス配向における薬剤選択カセット、（ｂ）アンチセンス方向において、対象となるヌクレオチド配列（ＮＳＩ）及び反転モジュールによる条件（ＣＯＩＮ、エキソン分割イントロン及びジーントラップ様モジュールを利用する、例えば、参照によりその全体が組み込まれる米国特許第２０１１／０１０４７９９号を参照されたい）、並びに、（ｃ）第１のリコンビナーゼへの暴露時に組み換わり、（ｉ）作動配列及びＤＳＣを欠き、かつ（ｉｉ）センス配向においてＮＳＩを含み、アンチセンス配向においてＣＯＩＮを含む、条件付き対立遺伝子を形成する、組み換え可能単位、を含む。

一実施形態では、挿入核酸は、コード配列内に遺伝子修飾を含む。一実施形態では、遺伝子修飾は、コード配列の欠失変異体を含む。一実施形態では、遺伝子修飾は、２つの内因性コード配列の融合を含む。

一実施形態では、遺伝子修飾は、非タンパク質コード配列の欠失を含むが、タンパク質コード配列の欠失は含まない。一実施形態において、非タンパク質コード配列の欠失は、ＤＲ６遺伝子座又はその一部分の欠失を含む。一実施形態において、非タンパク質コード配列の欠失は、制御要素の欠失を含む。一実施形態では、遺伝子修飾は、プロモーターの欠失を含む。一実施形態では、遺伝子修飾は、プロモーター又は制御要素の付加を含む。一実施形態では、遺伝子修飾は、プロモーター又は制御要素の置換を含む。

一実施形態では、標的化ベクターの核酸配列はポリヌクレオチドを含み得、ゲノムに統合されたときに、哺乳類、非ヒト動物、又は非ヒト哺乳類ＤＲ６遺伝子座の領域の遺伝子修飾を生成することになり、ＤＲ６遺伝子座における遺伝子修飾は、ＤＲ６の機能欠失をもたらす。一実施形態では、ＤＲ６ノックアウト（「ヌル対立遺伝子」）が生成される。別の実施形態では、ＤＲ６遺伝子座における分裂が生成される。

更なる実施形態では、挿入核酸は、哺乳類、非ヒト動物、又は非ヒト哺乳類ＤＲ６遺伝子座の一部分の、挿入核酸配列との置換をもたらす。一実施形態では、挿入核酸配列は、レポーター核酸配列である。

所定の挿入ポリヌクレオチドと、置換される哺乳類、非ヒト、又は非ヒト哺乳類遺伝子座の対応する領域と、は、非コード領域、コード領域、イントロン、エキソン、非翻訳領域、制御領域、プロモーター、エンハンサー、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。更に、所定の挿入ポリヌクレオチド及び／又は欠失される哺乳類、非ヒト、又は非ヒト哺乳類遺伝子座の領域は、例えば、１０～１００ヌクレオチド長、１００～５００ヌクレオチド長、５００～１ｋｂヌクレオチド長、１ｋｂ～１．５ｋｂヌクレオチド長、１．５ｋｂ～２ｋｂヌクレオチド長、２ｋｂ～２．５ｋｂヌクレオチド長、２．５ｋｂ～３ｋｂヌクレオチド長、３ｋｂ～５ｋｂヌクレオチド長、５ｋｂ～８ｋｂヌクレオチド長、８ｋｂ～１０ｋｂヌクレオチド長、又はそれ以上の長さを含む、任意の所望の長さのものであってよい。他の事例では、挿入又は置換のサイズは、約５ｋｂ～約１０ｋｂ、約１０ｋｂ～約２０ｋｂ、約２０ｋｂ～約４０ｋｂ、約４０ｋｂ～約６０ｋｂである。他の実施形態では、所定の挿入ポリヌクレオチド及び／又は欠失される哺乳類、ヒト細胞、又は非ヒト哺乳類遺伝子座の領域は、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、若しくは９００ヌクレオチド、又は少なくとも１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ、１７ｋｂ、１８ｋｂ、１９ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ以上である。

一実施形態では、挿入核酸は、内因性ＤＲ６プロモーターに操作可能に連結されるように、対象となるＤＲ６遺伝子座に挿入される。このような場合には、ＤＲ６プロモーターは、挿入核酸配列の発言を駆動する。一実施形態では、挿入核酸配列は、レポーター核酸配列である。

いくつかの場合、挿入核酸は、プロモーターを含む。一実施形態では、挿入核酸は、対象となるポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモーターに操作可能に連結された、対象となるポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、対象となるポリヌクレオチドは、レポーター核酸配列を含む。別の実施形態では、対象となるポリヌクレオチドは、選択マーカー核酸配列を含む。

一実施形態では、プロモーターは、構成的に活発なプロモーターである。

一実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。一実施形態では、誘導性プロモーターは、化学的制御プロモーターである。一実施形態では、化学的制御プロモーターは、アルコール制御プロモーターである。一実施形態では、アルコール制御プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーターである。一実施形態では、化学的制御プロモーターは、テトラサイクリン制御プロモーターである。一実施形態では、テトラサイクリン制御プロモーターは、テトラサイクリン応答プロモーターである。一実施形態では、テトラサイクリン制御プロモーターは、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）である。一実施形態では、テトラサイクリン制御プロモーターは、ｔｅｔ－Ｏｎプロモーターである。一実施形態では、テトラサイクリン制御プロモーターは、ｔｅｔ－Ｏｆｆプロモーターである。一実施形態では、化学的制御プロモーターは、ステロイド制御プロモーターである。一実施形態では、ステロイド制御プロモーターは、ラットグルココルチコイド受容体のプロモーターである。一実施形態では、ステロイド制御プロモーターは、エストロゲン受容体のプロモーターである。一実施形態では、ステロイド制御プロモーターは、エクジソン受容体のプロモーターである。一実施形態では、化学的制御プロモーターは、金属制御プロモーターである。一実施形態では、金属制御プロモーターは、金属タンパク質プロモーターである。一実施形態では、誘導性プロモーターは、物理的制御プロモーターである。一実施形態では、物理的制御プロモーターは、温度制御プロモーターである。一実施形態では、温度制御プロモーターは、ヒートショックプロモーターである。一実施形態では、物理的制御プロモーターは、光制御プロモーターである。一実施形態では、光制御プロモーターは、光誘導性プロモーターである。一実施形態では、光誘導性プロモーターは、光抑圧プロモーターである。

一実施形態では、プロモーターは、組織特異性プロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、ニューロン特異性プロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、グリア特異性プロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、筋細胞特異性プロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、心臓細胞特異性プロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、腎臓細胞特異性プロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、骨細胞特異性プロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、内皮細胞特異性プロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、免疫細胞特異性プロモーターである。一実施形態では、免疫細胞プロモーターは、Ｂ細胞プロモーターである。一実施形態では、免疫細胞プロモーターは、Ｔ細胞プロモーターである。

一実施形態では、プロモーターは、発生制御プロモーターである。一実施形態では、発生制御プロモーターは、発生の胚形成期にのみ活性になる。一実施形態では、発生制御プロモーターは、成人細胞内でのみ活性になる。

特異的な実施形態では、プロモーターは、細胞型に基づいて選択され得る。したがって、様々なプロモーターが、真核細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発生的に制限されたヒト前駆細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、線維芽細胞、又はＣＨＯ細胞に用途を見出している。

いくつかの実施形態では、挿入核酸は、部位特異的組み換え標的配列が隣接した核酸を含む。挿入核酸全体に、そのような部位特異的組み換え標的配列が隣接してもよい一方で、挿入核酸内の任意の領域又は個々の対象となるポリヌクレオチドにもまた、そのような部位が隣接してもよいことが認識される。部位特異的リコンビナーゼは、リコンビナーゼポリペプチドを細胞に導入することによって、又は部位特異的リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することなどによって、任意の手段によって細胞に導入され得る。部位特異的リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドは、挿入核酸内、又は別個のポリヌクレオチド内に位置し得る。部位特異的リコンビナーゼは、例えば、誘導性プロモーター、細胞に内因性であるプロモーター、細胞に異種であるプロモーター、細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発達段階特異的プロモーターを含む、細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結され得る。挿入核酸又は挿入核酸中の任意の対象となるポリヌクレオチドに隣接することができる部位特異的組み換え標的配列としては、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘ、又はこれらの組み合わせが挙げられ得るがこれらに限定されない。

いくつかの実施形態では、部位特異的組み換え部位は、挿入核酸内に含まれる選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドに隣接する。かかる事例においては、標的遺伝子座への挿入核酸の組み込み後、部位特異的組み換え部位間の配列は除去され得る。

一実施形態では、挿入核酸は、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含む。選択マーカーは、選択カセット内に含まれてもよい。そのような選択マーカーには、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ^ｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ^ｒ）、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏ^ｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒ^ｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、若しくは単純ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｋ）、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結される。一実施形態では、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドに、部位特異的組み換え標的配列が隣接する。

挿入核酸は、プロモーターに操作可能に連結されたレポーター遺伝子を更に含むことができ、レポーター遺伝子は、β－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子によりコード）、ＧＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ，ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、及び／又はこれらの組み合わせからなる群から選択されるレポータータンパク質をコードする。そのようなレポーター遺伝子は、細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結され得る。このようなプロモーターは、誘導性プロモーター、レポーター遺伝子若しくは細胞に内因性のプロモーター、レポーター遺伝子若しくは細胞とは異種のプロモーター、細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発達段階特異的プロモーターであり得る。

ｉｉ．発現カセット
本明細書には、ＤＲ６遺伝子を標的化するための、本明細書に提供される標的ゲノム組み込み系に採用される様々な構成要素を含む、ポリヌクレオチド又は核酸分子が提供される（すなわち、ヌクレアーゼ剤、認識部位、挿入核酸、対象となるポリヌクレオチド、レポーター配列、標的化ベクター、選択マーカー、及びその他の構成要素）。

用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、及び「核酸フラグメント」は、本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、合成、非天然、又は改変ヌクレオチド塩基を任意に含有する一本鎖又は二本鎖である、ＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーであってもよい。ＤＮＡのポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はこれらの混合物の１つ以上のセグメントからなってもよい。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドを含むことができ、リボヌクレオチドは、自然発生的な分子及び合成類似体の両方、並びにこれらの任意の組み合わせを含む。本明細書に提供されるポリヌクレオチドはまた、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、ステム・ループ構造などが挙げられるがこれらに限定されない、すべての形態の配列を包含する。

ＤＲ６遺伝子座を標的化するための、標的ゲノム組み込み系の様々な構成要素を含む組み換えポリヌクレオチドが更に提供される。用語「組み換えポリヌクレオチド」及び「組み換えＤＮＡ構築物」は、本明細書において互換的に使用される。組み換え構築物は、核酸配列の人工又は異種の組み合わせ、例えば、自然界で一緒に見出されない制御配列及びコード配列を含む。他の実施形態において、組み換え構築物は、異なる源由来である制御配列及びコード配列、又は同じ源由来であるが、自然界で見出されるものとは異なる様式で配列された制御配列及びコード配列を含んでもよい。そのような構築物は、それ自体で使用されてもよく、又はベクターと併用されてもよい。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知であるような宿主細胞を変換するために使用される方法によって決まる。例えば、プラスミドベクターが使用され得る。宿主細胞を好適に形質転換し、選択し、増殖させるのに必要な、本明細書に提供される何らかの単離された核酸断片を含む遺伝的要素も提供される。スクリーニングは、とりわけ、ＤＮＡのサザン解析、ｍＲＮＡ発現のノザン解析、タンパク質発現の免疫ブロット解析、又は表現型解析によって達成されてもよい。

具体的実施形態では、本明細書に記載のＤＲ６遺伝子座を標的化するための標的ゲノム組み込み系の構成要素の１つ又は２つ以上を、原核細胞、真核細胞、細菌、酵母細胞、若しくは哺乳動物細胞、又は対象となる他の生物型又は細胞型における発現用の発現カセットとして提供することができる。カセットは、本明細書に提供されるポリヌクレオチドに操作可能に連結された５’及び３’制御配列を含むことができる。「操作可能に連結」とは、構成要素が、意図された方法で機能に操作可能に連結された関係を含む。例えば、対象となるポリヌクレオチドと制御配列（すなわち、プロモーター）との間の操作可能な連結は、対象となるポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的な連結である。操作可能に連結された要素は、隣接していてもよく、又は隣接していなくてもよい。２つのタンパク質コード領域の結合に言及するために使用されるとき、「操作可能に連結された」は、コード領域が同じリーディングフレームにあることを意味する。別の例において、タンパク質をコードする核酸配列は、調節配列（例えばプロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列等）に操作可能に連結させてもよく、それにより、適切な転写調節が維持される。カセットは、生物に共導入される少なくとも１つの追加の目的ポリヌクレオチドを追加で含んでもよい。あるいは、追加の対象となるポリヌクレオチドが、複数の発現カセット上に提供され得る。そのような発現カセットは、組み換えポリヌクレオチドの挿入が制御領域の転写制御下にあるための複数の制限部位及び／又は組み換え部位が提供される。発現カセットは、選択マーカー遺伝子を更に含有してもよい。

発現カセットは、転写の５’－３’方向に、転写及び翻訳開始領域（すなわち、プロモーター）、本明細書に提供される組み換えポリヌクレオチド、並びに対象となる哺乳類細胞又は宿主細胞中で機能的な転写及び翻訳終止領域（すなわち、終止領域）を含むことができる。制御領域（すなわち、プロモーター、転写制御領域、コザック配列、及び翻訳終結領域）及び／又は、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、宿主細胞に対して又は互いに、生来のものであっても類似のものであってもよい。あるいは、制御領域及び／又は本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、宿主細胞に対して又は互いに異種であってもよい。例えば、異種ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターは、ポリヌクレオチドが由来した種とは異なる種由来であるか、又は同じ／類似の種由来の場合、一方又は両方は、それらの元の形態及び／若しくはゲノム遺伝子座から実質的に修飾されるか、又はプロモーターは、操作可能に連結されたポリヌクレオチドのための天然プロモーターではない。あるいは、制御領域及び／又は本明細書に提供される組み換えポリヌクレオチドは、完全に合成であってもよい。

終結領域は、転写開始領域に生来のものであってもよく、操作可能に連結された組み換えポリヌクレオチドに生来のものであってもよく、宿主細胞に生来のものであってもよく、又は、プロモーター、組み換えポリヌクレオチド、宿主細胞又はそのあらゆる組み合わせとは別の給源に由来する（即ち無縁の若しくは異種の）ものであってもよい。

発現カセットの調製において、適切な配向でＤＮＡ配列を提供するために、様々なＤＮＡフラグメントが操作されてもよい。この目的で、アダプター若しくはリンカーがＤＮＡフラグメントを結合するために採用されてもよく、又は好都合な制限部位、不必要なＤＮＡの除去、制限部位の除去などを提供するために、他の操作が関与してもよい。この場合、インビトロ変異導入、プライマー修復、制限酵素処理、アニーリング、再置換（例えば塩基転移及び塩基転換）を行ってもよい。

多くのプロモーターが、本明細書に提供される発現カセット中で使用され得る。プロモーターは、所望の結果に基づき選択され得る。対象となるポリヌクレオチドのタイミング、位置、及び／又は発現レベルを調節するために、発現カセット中の異なるプロモーターの使用によって、異なる適用が強化され得ることが認識される。そのような発現構築物はまた、必要に応じて、プロモーター制御領域（例えば、誘導性、構成的、環境若しくは発生制御、又は細胞若しくは組織特異的／選択的発現を与えるもの）、転写開始起始部位、コザックコンセンサス配列、リボソーム結合部位、ＲＮＡ処理シグナル、転写終止部位、及び／又はポリアデニル化シグナルを含有してもよい。

本明細書で提供されるポリヌクレオチドを含む発現カセットは、形質転換された細胞の選択用の選択マーカーを含んでもよい。選択可能マーカー遺伝子は、形質転換された細胞又は組織の選択に利用される。

必要に応じて、本発明の方法及び組成物で使用される配列（即ち目的ポリヌクレオチド、ヌクレアーゼ剤等）は、細胞内での更なる発現のために最適化され得る。すなわち、遺伝子は、発現向上のために、哺乳動物に好適なコドン、ヒトに好適なコドン、げっ歯類に好適なコドン、マウスに好適なコドン、ラットに好適なコドン、ハムスターに好適なコドンなど、所与の対象となる細胞内での好適なコドンを使用して合成され得る。

本明細書に提供される様々な方法及び組成物は、選択マーカーを採用できる。様々な選択マーカーが、本明細書に開示される方法及び組成物で使用できる。かかる選択マーカーは、例えば、抗生物質（例えばＧ４１８、ハイグロマイシン、ブラストシジン、ネオマイシン又はピューロマイシン）に対する抵抗性を付与できる。かかる選択マーカーとしては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ^ｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ^ｒ）、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏ^ｒ）及びブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒ^ｒ）が挙げられる。更に他の実施形態において、選択マーカーは、誘導性プロモーターに操作可能に連結され、選択マーカーの発現は、細胞に対する毒性を示す。かかる選択マーカーの非限定的な例としては、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、ヒポキサンチン（hahypoxanthine）グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）が挙げられる。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結される。

ｉｉｉ．標的化ベクター
標的化ベクターは、真核、非ヒト、哺乳類、非ヒト哺乳類、ヒト、げっ歯類、マウス、ラット、又はハムスター核酸のＤＲ６遺伝子座に、挿入核酸を導入するために採用される。標的化ベクターは、挿入核酸を含み、挿入核酸に隣接する５’及び３’ホモロジーアームを更に含む。挿入核酸に隣接するホモロジーアームは、真核、非ヒト、哺乳類、非ヒト哺乳類、ヒト、げっ歯類、マウス、ラット、又はハムスター核酸の標的ＤＲ６遺伝子座内の領域に対応する。参照を容易にするために、標的化されたゲノム遺伝子座内の対応する同系ゲノム領域は、「標的部位」と称される。例えば、標的化ベクターは、第１及び第２標的部位に相補的な第１及び第２ホモロジーアームに隣接する第１の挿入核酸を含み得る。したがって、それにより、標的化ベクターは、細胞のゲノム内のホモロジーアームと相補的標的部位との間で生じる相同組み換え事象を通じて、標的遺伝子核酸への挿入核酸の組み込みを補助する。

一実施形態では、真核、哺乳類、非ヒト哺乳類、ヒト、げっ歯類、マウス、又はハムスター核酸の標的遺伝子座は、５’ホモロジーアームに相補的な第１の核酸配列と、３’ホモロジーアームに相補的な第２の核酸配列を含む。一実施形態では、第１及び第２の核酸配列は、少なくとも５ｋｂだけ隔てられる。別の実施形態では、第１及び第２の核酸配列は、少なくとも１ｋｂ、ただし５０ｋｂ未満だけ隔てられる。一実施形態では、第１及び第２の核酸配列は、少なくとも２ｋｂだけ隔てられる。一実施形態では、第１及び第２核酸配列は、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、又は少なくとも５０ｋｂだけ隔てられる。なお更なる実施形態では、第１及び第２の核酸配列は、少なくとも１ｋｂであるが２ｋｂ未満、少なくとも２ｋｂであるが３ｋｂ未満、少なくとも４ｋｂであるが５ｋｂ未満、少なくとも５ｋｂであるが６ｋｂ未満、少なくとも６ｋｂであるが７ｋｂ未満、少なくとも７ｋｂであるが８ｋｂ未満、少なくとも約８ｋｂであるが９ｋｂ未満、又は少なくとも９ｋｂであるが１０ｋｂ未満、少なくとも１０ｋｂであるが１５ｋｂ未満、少なくとも約１５ｋｂであるが約２０ｋｂ未満、少なくとも約２０ｋｂであるが約３０ｋｂ未満、又は約少なくとも約４０ｋｂであるが約５０ｋｂ未満だけ隔てられる。

標的化ベクターのホモロジーアームは、例えば少なくとも５～１０ｋｂ、５～１５ｋｂ、１０～２０ｋｂ、２０～３０ｋｂ、３０～４０ｋｂ、４０～５０ｋｂ、５０～６０ｋｂ、６０～７０ｋｂ、７０～８０ｋｂ、８０～９０ｋｂ、９０～１００ｋｂ、１００～１１０ｋｂ、１１０～１２０ｋｂ、１２０～１３０ｋｂ、１３０～１４０ｋｂ、１４０～１５０ｋｂ、１５０～１６０ｋｂ、１６０～１７０ｋｂ、１７０～１８０ｋｂ、１８０～１９０ｋｂ、１９０～２００ｋｂの長さ、又はそれ以上を含む、対応する標的部位との相同組み換え事象を促進するために充分な任意の長さであってよい。以下で更に詳細に概説されるように、大きな標的化ベクターは、より大きい長さの標的化アームを採用することができる。特異的な実施形態では、５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームの総計は、少なくとも１０ｋｂであり、５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームの総計は、少なくとも約１６ｋｂ～約１００ｋｂ、又は約３０ｋｂ～約１００ｋｂである。他の実施形態では、ＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計の総計のサイズは、約１０ｋｂ～約１５０ｋｂ、約１０ｋｂ～約１００ｋｂ、約１０ｋｂ～約７５ｋｂ、約２０ｋｂ～約１５０ｋｂ、約２０ｋｂ～約１００ｋｂ、約２０ｋｂ～約７５ｋｂ、約３０ｋｂ～約１５０ｋｂ、約３０ｋｂ～約１００ｋｂ、約３０ｋｂ～約７５ｋｂ、約４０ｋｂ～約１５０ｋｂ、約４０ｋｂ～約１００ｋｂ、約４０ｋｂ～約７５ｋｂ、約５０ｋｂ～約１５０ｋｂ、約５０ｋｂ～約１００ｋｂ、約５０ｋｂ～約７５ｋｂ、約１０ｋｂ～約３０ｋｂ、約２０ｋｂ～約４０ｋｂ、約４０ｋｂ～約６０ｋｂ、約６０ｋｂ～約８０ｋｂ、約８０ｋｂ～約１００ｋｂ、約１００ｋｂ～約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ～約１５０ｋｂ、である。一実施形態では、欠失のサイズは、ＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計のサイズと同じ又は同様である。

ホモロジーアーム及び標的部位（すなわち、同系ゲノム領域）は、２つの領域が相同組み換え反応の基質として機能するために、相互に対して十分なレベルの配列同一性を共有するとき、互いに「相補する」又は「相補的」である。「相同性」とは、対応する又は「相補的な」配列に対して同一であるか、又は配列同一性を共有するかのいずれかであるＤＮＡ配列を意味する。所与の標的部位と標的化ベクター上で見出される対応するホモロジーアームとの間の配列同一性は、相同組み換えが生じることを可能にする任意の程度の配列同一性であってもよい。例えば、標的化ベクターのホモロジーアーム（又はそのフラグメント）及び標的部位（又はそのフラグメント）によって共有される配列同一性の量は、配列が相同組み換えを受けるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性であってもよい。更に、ホモロジーアームと相補的標的部位との間の相同性の相補的領域は、開裂された認識部位における相同組み換えを促進するのに十分である任意の長さであってもよい。例えば、所定のホモロジーアーム及び／又は相補的標的部位は、ホモロジーアームが、細胞のゲノム内の対応する標的部位と相同組み換えを起こすために充分な相同性を有するよう、（例えば、本明細書の別の箇所に述べられるＬＴＶＥＣベクターにおいて述べられるように）少なくとも５～１０ｋｂ、５～１５ｋｂ、１０～２０ｋｂ、２０～３０ｋｂ、３０～４０ｋｂ、４０～５０ｋｂ、５０～６０ｋｂ、６０～７０ｋｂ、７０～８０ｋｂ、８０～９０ｋｂ、９０～１００ｋｂ、１００～１１０ｋｂ、１１０～１２０ｋｂ、１２０～１３０ｋｂ、１３０～１４０ｋｂ、１４０～１５０ｋｂ、１５０～１６０ｋｂ、１６０～１７０ｋｂ、１７０～１８０ｋｂ、１８０～１９０ｋｂ、１９０ｋｂ～２００ｋｂ、２００ｋｂ～３００ｋｂの長さ又はそれ以上の相補的な相同性領域を含むことができる。参照を容易にするために、ホモロジーアームは、本明細書において５’及び３’ホモロジーアームと称される。この用語は、標的化ベクター内の挿入核酸に対するホモロジーアームの相対位置に関する。

標的化ベクターのホモロジーアームは、したがって、標的化された遺伝子座の標的部位に相補的になるよう設計される。ゆえに、ホモロジーアームは細胞の生来の遺伝子座に相補的であり得るか、又は、限定されるものではないが、導入遺伝子、発現カセット又はゲノムＤＮＡの異種領域若しくは外因性領域などの細胞のゲノムに組み込まれた、ＤＮＡの異種若しくは外因性セグメントの領域に相補的であり得る。あるいは、標的化ベクターのホモロジーアームは、ヒト人工染色体の領域、又は適切な宿主細胞中に含有された任意の他の操作されたゲノム領域に相補的であってよい。なお更に、標的化ベクターのホモロジーアームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリー、又はＰ１ファージライブラリーの領域に相補的であってもよいか、又はそれに由来してもよい。したがって、特異的な実施形態では、標的化ベクターのホモロジーアームは、所定の細胞に対して生来、異種、又は外因性の真核、非ヒト、哺乳類、非ヒト哺乳類、ヒト、げっ歯類、マウス、又はラットゲノム遺伝子座に相補的である。一実施形態では、ホモロジーアームは、合成ＤＮＡ由来である。

標的化ベクター（大きな標的化ベクターなど）はまた、本明細書の別の個所で考察されるように、選択カセット又はレポーター遺伝子を含むことができる。選択カセットは、選択マーカーをコードする核酸配列を含むことができ、核酸配列は、本明細書の別の個所で考察されるように、プロモーターに操作可能に連結される。標的化ベクターの選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子は、５’若しくは３’ホモロジーアームが隣接し得るか、又はホモロジーアームに５’若しくは３’のいずれかで見出され得る。

別の実施形態では、標的化ベクターは、レポーターをコードする第１のヌクレオチド配列を含む挿入核酸を含む。いくつかの場合において、ＤＲ６遺伝子座との相同組み換えに次いで、レポーターをコードする第１のヌクレオチド配列は、ＤＲ６遺伝子座におけるＤＲ６の発現を駆動する内因性プロモーターに操作可能に連結される。

別の実施形態では、標的化ベクターは、レポーターをコードする第２のヌクレオチド配列と操作可能に連結された膜貫通ドメインをコードする、第１のヌクレオチド配列を含む挿入核酸を含む。いくつかの場合において、ＤＲ６遺伝子座との相同組み換えに次いで、膜貫通ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列は、膜貫通ドメイン及びレポーターの指定を駆動する、内因性ＤＲ６シグナル配列に操作可能に連結される。

別の実施形態では、標的化ベクターの挿入核酸は、選択可能マーカーをコードする付加的なヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合において、付加的な核酸は、プロモーターに操作可能に連結される。

一実施形態では、挿入核酸の第１及び／又は付加的なヌクレオチド配列は、コザックコンセンサス配列を含む。

一実施形態では、標的化ベクター（大型標的化ベクターなど）は、本明細書の別の個所に記載されるように、プロモーターに操作可能に連結されたレポーター遺伝子及び／又は選択可能マーカー遺伝子を含む。このようなレポーター遺伝子及び／又は選択可能マーカー遺伝子は、本明細書の別の個所に記載されるように、細胞内で活性であるプロモーターに操作可能に連結され得る。

一実施形態では、標的化ベクターは、サイト特異的なリコンビナーゼ遺伝子を含む。一実施形態では、サイト特異的なリコンビナーゼ遺伝子は、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする。一実施形態では、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子はＣｒｅｉであり、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエキソンは、原核細胞内でのその発現を防止するため、イントロンによって隔てられる。一実施形態では、サイト特異的なリコンビナーゼ遺伝子は、Ｄｒｅリコンビナーゼをコードする。

一実施形態では、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子は、Ｃｒｅ（又は任意のリコンビナーゼ若しくはヌクレアーゼ剤）の核への局在を促進するため、核局在シグナルを更に含む（例えば、遺伝子はＮＬＳ－Ｃｒｅ遺伝子である）。特異的な実施形態では、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子は、核局在シグナル（ＮＬＳ）及びイントロン（例えば、ＮＬＳ－Ｃｒｅｉ）を更に含む。

様々な実施形態では、上述のＣｒｅ又はＣｒｅｉリコンビナーゼの発現に好適なプロモーターは、Ｐｒｍ１、Ｂｌｉｍｐ１、Ｇａｔａ６、Ｇａｔａ４、Ｉｇｆ２、Ｌｈｘ２、Ｌｈｘ５、及び／又はＰａｘ３から選択されるか、これを含む。特異的な実施形態では、プロモーターは、Ｇａｔａ６又はＧａｔａ４プロモーターである。様々なプロモーターは、例えば、マウス若しくはラットなどのげっ歯類、真核生物、非ヒト哺乳類、哺乳類、ヒト、又はハムスターを含む、任意の生物由来であってよい。別の特異的な実施形態では、プロモーターは、Ｐｒｍ１プロモーターである。別の特異的な実施形態では、プロモーターは、マウスＰｒｍ１プロモーターである。別の特異的な実施形態では、プロモーターは、Ｂｌｉｍｐ１プロモーター又はその断片、例えば、Ｂｌｉｍｐ１プロモーターの１ｋｂ又は２ｋｂ断片である。例えば、それぞれが全体として参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第８，６９７，８５１号、同第９，２６７，１５２号、同第９，０９６，８７０号、同第８，３５４，３８９号、同第８，９４６，５０５号、同第８，９４６，５０４号、同第８，５１８，３９２号を参照されたい。

一実施形態では、挿入核酸は、２つの部位特異的組み換え部位が隣接したヌクレオチド配列を含む。部位特異的組み換え部位の例としては、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘ、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

ｉｖ．大型標的化ベクター
用語「大型標的化ベクター」又は「ＬＴＶＥＣ」は、細胞中で相同標的化を実施するよう意図される他のアプローチによって典型的に使用されるものよりも大きい核酸配列に対応し、かつそれら由来である、及び／又は細胞中で相同組み換え標的化を実施するよう意図される他のアプローチによって典型的に使用されるものよりも大きい核酸配列を含む挿入ポリヌクレオチドを含む、ホモロジーアームを含む、大型標的化ベクターを含む。特定の実施形態では、ＬＴＶＥＣのホモロジーアーム及び／又は挿入ポリヌクレオチドは、真核細胞のゲノム配列を含む。ＬＴＶＥＣのサイズは、従来のアッセイ（例えばサザンブロッティング及びロングレンジ（例えば１ｋｂ～５ｋｂ）ＰＣＲ）によるターゲッティングイベントのスクリーニングを行うにはあまりに大きい。ＬＴＶＥＣの例としては、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体、又は酵母人工染色体（ＹＡＣ）由来のベクターが挙げられるがこれらに限定されない。ＬＴＶＥＣ及びそれらを作製するための方法の非限定的な例は、例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、同第６，５９６，５４１号、同第７，１０５，３４８号、及び国際公開第２００２／０３６７８９号（ＰＣＴ／ＵＳ０１／４５３７５）に記載され、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。

ＬＴＶＥＣは、少なくとも約１０ｋｂ、約１５ｋｂ、約２０ｋｂ、約３０ｋｂ、約４０ｋｂ、約５０ｋｂ、約６０ｋｂ、約７０ｋｂ、約８０ｋｂ、約９０ｋｂ、約１００ｋｂ、約１５０ｋｂ、約２００ｋｂ、約１０ｋｂ～約１５ｋｂ、約１５ｋｂ～約２０ｋｂ、約２０ｋｂ～約３０ｋｂ、約３０ｋｂ～約５０ｋｂ、約５０ｋｂ～約３００ｋｂ、約５０ｋｂ～約７５ｋｂ、約７５ｋｂ～約１００ｋｂ、約１００ｋｂ～約１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ～約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ～約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ～約２００ｋｂ、約２００ｋｂ～約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ～約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ～約２７５ｋｂ、又は約２７５ｋｂ～約３００ｋｂを含むが、これらに限定されない任意の長さであってよい。

一実施形態では、ＬＴＶＥＣのホモロジーアームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリー、又はＰ１ファージライブラリー由来である。他の実施形態では、ホモロジーアームは、細胞の標的化されたＤＲ６ゲノム遺伝子座由来であり、場合によっては、ＬＴＶＥＣが標的化するように設計される標的ゲノム遺伝子座は、従来の方法を使用しては標的化できない。更に他の実施形態では、ホモロジーアームは、合成ＤＮＡ由来である。

一実施形態では、ＬＴＶＥＣ中の上流ホモロジーアーム及び下流ホモロジーアームの総計は、少なくとも１０ｋｂである。他の実施形態では、上流ホモロジーアームは、約５ｋｂ～約１００ｋｂに及ぶ。一実施形態では、下流ホモロジーアームは、約５ｋｂ～約１００ｋｂに及ぶ。他の実施形態では、上流ホモロジーアーム及び下流ホモロジーアームの総計は、約５ｋｂ～約１０ｋｂ、約１０ｋｂ～約２０ｋｂ、約２０ｋｂ～約３０ｋｂ、約３０ｋｂ～約４０ｋｂ、約４０ｋｂ～約５０ｋｂ、約５０ｋｂ～約６０ｋｂ、約６０ｋｂ～約７０ｋｂ、約７０ｋｂ～約８０ｋｂ、約８０ｋｂ～約９０ｋｂ、約９０ｋｂ～約１００ｋｂ、約１００ｋｂ～約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ～約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ～約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ～約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ～約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ～約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ～約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ～約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ～約１９０ｋｂ、又は約１９０ｋｂ～約２００ｋｂである。一実施形態では、欠失のサイズは、ＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計のサイズと同じ又は同様である。

一実施形態では、ＬＴＶＥＣは、本明細書の別の個所で考察されるように、選択カセット又はレポーター遺伝子を含む。

ＩＩＩ．配列の導入及びトランスジェニック動物の生成方法
上記で概説したように、本明細書には、ＤＲ６遺伝子座の標的化された遺伝子修飾を可能にする方法及び組成物が提供される。付加的な標的化された遺伝子修飾が作製され得ることが、更に認識される。これらの標的化された遺伝子修飾を可能にするそのような系は、様々な構成成分を採用することができ、参照を容易にするために、本明細書において、用語「標的化されたゲノム組み込み系」は、一般的に、組み込み事象のために必要とされるすべての構成成分を含む（すなわち、様々なヌクレアーゼ剤、認識部位、挿入ＤＮＡポリヌクレオチド、標的化ベクター、標的ゲノム遺伝子座、及び対象となるポリヌクレオチド）。

本明細書に提供される方法は、細胞中に、標的化されたゲノム組み込み系の様々な構成成分を含む１つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド構築物を導入することを含む。「導入すること」は、配列が細胞の内部に接近するような様式で、細胞に配列（ポリペプチド又はポリヌクレオチド）を提示することを意味する。本明細書に提供される方法は、ポリヌクレオチドが少なくとも１つの細胞の内部に接近する限り、細胞中に標的化されたゲノム組み込み系の任意の構成成分を導入するための特定の方法に依存しない。様々な細胞型にポリヌクレオチドを導入するための方法は、当該技術分野において既知であり、安定トランスフェクション方法、一過性トランスフェクション方法、及びウイルス媒介性方法が挙げられるがこれらに限定されない。

いくつかの実施形態では、方法及び組成物で採用される細胞は、それらのゲノムに安定的に組み込まれたＤＮＡ構築物を有する。「安定的に組み込まれた」又は「安定的に導入された」は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込み、その子孫によって遺伝されるような、細胞中へのポリヌクレオチドの導入を意味する。ＤＮＡ構築物又は標的化されたゲノム組み込み系の様々な構成成分の安定的な組み込みのために、任意のプロトコルが使用されてもよい。

トランスフェクションプロトコル並びに細胞中にポリペプチド又はポリヌクレオチド配列を導入するためのプロトコルは、異なり得る。非限定的なトランスフェクション法として、リポソーム、ナノ粒子、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（２）：４５６～６７，Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７４（４）：１５９０～４、及びＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１）．Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６～９７）、デンドリマー、又はＤＥＡＥ－デキストラン若しくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーの使用を含む、化学ベースのトランスフェクション法が挙げられる。非化学的方法としては、電気穿孔法、ソノポレーション、及び光学トランスフェクションが挙げられる。粒子系トランスフェクションとしては、遺伝子銃の使用、磁性補助トランスフェクション（Ｂｅｒｔｒａｍ，Ｊ．（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，２７７－２８）が挙げられる。ウイルス方法もまた、トランスフェクションのために使用され得る。

非ヒト動物は、本明細書に開示される様々な方法を採用して生成され得る。かかる方法は、（１）本明細書に開示される方法を採用して、非ヒト動物の多能性細胞の対象となる標的ＤＲ６ゲノム遺伝子座において対象となる１つ又は２つ以上のポリヌクレオチドを統合し、標的化されたＤＲ６ゲノム遺伝子座に挿入ポリヌクレオチドを含む遺伝子修飾された多能性細胞を生成することと、（２）標的化されたＤＲ６ゲノム遺伝子座において、対象となる１つ又は２つ以上のポリヌクレオチドを有する遺伝子修飾された多能性細胞を選択することと、（３）例えば、桑実期前に、遺伝子修飾された多能性細胞を非ヒト動物の宿主胚に導入することと、（４）遺伝子修飾された多能性細胞を含む宿主胚を代理母に移植して、遺伝子修飾された多能性細胞由来のＦ０世代を生成することと、を含む。同様の方法が、困難な標的染色体遺伝子座を標的化するために採用され得る。非ヒト動物は、非ヒト哺乳動物、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、サル、農業用哺乳動物若しくは家畜哺乳動物、又は魚類又は鳥類であってもよい。

多能性細胞は、ヒトＥＳ細胞、非ヒトＥＳ細胞、げっ歯類ＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞、ハムスターＥＳ細胞、サルＥＳ細胞、農業用哺乳動物ＥＳ細胞、又は家畜哺乳動物ＥＳ細胞であってもよい。他の実施形態では、多能性細胞は、非ヒト細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳類細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成体幹細胞、発達制限されたヒト前駆細胞、ヒトｉＰＳ細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞である。一実施形態では、標的化された遺伝子修飾は、ＤＲ６の機能欠失をもたらす。

マウス多能性細胞、全能性細胞、又は宿主胚は、例えば、近交種、交雑種、及び非近交種を含む、任意のマウスの系統のものであってよい。マウスの系統の例として、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ系統（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６系統）、１２９及びＣ５７ＢＬ／６の混合（例えば、５０％ １２９及び５０％ Ｃ５７ＢＬ／６）、ＢＡＬＢ／ｃ系統、並びにＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ系統が挙げられる。１２９系統の例として、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９５１／ＳＶ、１２９５１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９５９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、及び１２９Ｔ２が挙げられる（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｒｅｖｉｓｅｄ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｓｔｒａｉｎ １２９ ｍｉｃｅ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６を参照されたい）。Ｃ５７ＢＬ系統の例としては、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／０１ａが挙げられる。マウスは、前述の１２９系統（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）及び前述のＣ５７ＢＬ／６系統の混合、１つ若しくは２つ以上の前述の１２９系統の混合、又は１つ若しくは２つ以上の前述のＣ５７ＢＬ系統の混合であってよい。マウスは、１２９系統を除く系統由来であってもよい。

ラット多能性細胞、全能性細胞、又は宿主胚は、例えば、近交種、交雑種、及び非近交種を含む、任意のラットの系統由来であってよい。ラットの系統の例としては、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、ウィスターラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、又はＦｉｓｃｈｅｒ Ｆ３４４４若しくはＦｉｓｈｅｒ Ｆ６などのＦｉｓｃｈｅｒラット系統が挙げられる。ラット多能性細胞、全能性細胞、又は宿主胚はまた、上記で列挙された２つ以上の系統の混合由来の系統から得ることができる。例えば、ラット多能性細胞、全能性細胞、又は宿主胚は、ＤＡ系統及びＡＣＩ系統から選択された系統由来であってよい。ＡＣＩラット系統は、白色の腹及び足、並びにＲＴ１^ａｖ１ハプロタイプを有する、黒いアグーチを有するものと特徴付けられる。そのような系統は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給元から入手可能である。ＡＣＩラット由来のラットＥＳ細胞株の例は、ＡＣＩ．Ｇ１ラットＥＳ細胞である。Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチコート及びＲＴ１^ａｖ１ハプロタイプを有することを特徴とする。そのようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ及びＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給元から入手可能である。ＤＡラット由来のラットＥＳ細胞株の例は、ＤＡ．２ＢラットＥＳ細胞株及びＤＡ．２ＣラットＥＳ細胞株である。ラット系統の他の例は、それぞれが全体として参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第２０１４／０２３５９３３号、同第２０１４／０３１０８２８号、及び同第２０１４／０３０９４８７号に提供されている。

例えば、生殖細胞系伝達可能ラットＥＳ細胞は、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、約５０Ｕ／ｍＬ～約１５０Ｕ／ｍＬの白血病抑制因子（ＬＩＦ）、並びにＭＥＫ抑制物質及びＧＳＫ３抑制物質からなる抑制物質の組み合わせを含む培地を使用して、フィーダー細胞層の単離されたラットＥＳ細胞を培養することにより得ることができ、フィーダー細胞層は、ＬＩＦを発現するために修飾されず、ラットＥＳ細胞は（ｉ）選択マーカーを含む異種ポリヌクレオチドの、ラットＥＳセルのゲノムへの少なくとも１つの挿入を含み、かつ、生殖細胞系を介して標的化された遺伝子修飾を伝達できるように修飾されており、（ｉｉ）正常核型を有し、（ｉｉｉ）ｃ－Ｍｙｃの発現を欠き、（ｉｖ）培養中に球状の不動コロニーを形成する（例えば、それぞれが全体として参照により組み込まれている、米国特許第２０１４－０２３５９３３ Ａ１号及び同第２０１４－０３１０８２８ Ａ１号を参照されたい）。ラット胚幹細胞の誘導及び標的化修飾の他の例は、例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（「Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－２ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｒａｔｓ」Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．２１：７４３～７５５，２０１２）並びにＫｗａｍａｔａ及びＯｃｈｉｙａ（「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｒａｔｓ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０７（３２）：１４２２３～１４２２８，２０１０）に提供される。

核移植技術もまた、非ヒト動物を生成するために使用され得る。端的には、核移植方法は、（１）卵母細胞を除核する工程と、（２）除核した卵母細胞と組み合わされるドナー細胞又は核を単離する工程と、（３）細胞又は核を除核した卵母細胞に挿入して、再構成細胞を形成する工程と、（４）再構成細胞を動物の子宮に着床させて、胚を形成する工程と、（５）胚を発生させる工程と、を含むことができる。そのような方法において、卵母細胞は、概して、死亡動物から回収されるが、それらは、生存動物の卵管及び／又は卵巣のいずれかからも単離され得る。卵母細胞は、除核前に当業者に既知の様々な培地中で成熟させられ得る。卵母細胞の除核は、当業者に周知のいくつかの方法で実施され得る。再構成細胞を形成するための除核卵母細胞へのドナー細胞又は核の挿入は、通常、融合前の透明帯下でのドナー細胞の微量注射による。融合は、接触／融合面（電気融合）にわたるＤＣ電気パルスの印加によって、ポリエチレングリコールなどの融合促進化学物質への細胞の曝露によって、又はセンダイウイルスなどの不活性化ウイルスによって誘発されてもよい。再構成細胞は、典型的には、核ドナー及びレシピエント卵母細胞の融合前、中、及び／又は後に、電気及び／又は非電気手段によって活性化される。活性化方法としては、電気パルス、化学誘導ショック、精子による侵入、卵母細胞内の二価陽イオンのレベルの増加、及び卵母細胞内の（キナーゼ阻害剤などによる）細胞タンパク質のリン酸化の低減が挙げられる。活性化された再構成細胞又は胚は、典型的には、当業者に周知の培地中で培養され、次いで、動物の子宮に移される。例えば、米国第２００８００９２２４９号、国際公開第／１９９９／００５２６６Ａ２号、米国第２００４０１７７３９０号、国際公開第／２００８／０１７２３４Ａ１号、及び米国特許第７，６１２，２５０号を参照されたく、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載されるように、１つ又は２つ以上の遺伝子修飾をその生殖細胞系に含む非ヒト動物を作製する他の方法であって、（ａ）本明細書に記載の様々な方法を採用する原核細胞中の非ヒト動物の標的化されたゲノムＤＲ６遺伝子座を修飾することと、（ｂ）標的化されたゲノム遺伝子座における遺伝子修飾を含む、修飾された原核細胞を選択することと、（ｃ）修飾された原核細胞のゲノムから遺伝子修飾された標的化ベクターを単離することと、（ｄ）非ヒト動物の多能性細胞に遺伝子修飾された標的化ベクターを導入して、標的化されたＤＲ６ゲノム遺伝子座において挿入核酸を含む遺伝子修飾された多能性細胞を生成することと、（ｅ）遺伝子修飾された多能性細胞を選択することと、（ｆ）桑実期前に非ヒト動物の宿主胚に遺伝子修飾された多能性細胞を導入することと、（ｇ）遺伝子修飾された多能性細胞由来のＦ０世代を生成するため、遺伝子修飾された多能性細胞を含む宿主胚を代理母に移植することと、を含む、方法が提供される。かかる方法では、標的化ベクターは、大型標的化ベクターを含んでもよい。非ヒト動物は、非ヒト哺乳動物、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、サル、農業用哺乳動物、又は家畜哺乳動物であってもよい。多能性細胞は、ヒトＥＳ細胞、非ヒトＥＳ細胞、げっ歯類ＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞、ハムスターＥＳ細胞、サルＥＳ細胞、農業用哺乳動物ＥＳ細胞、又は家畜哺乳動物ＥＳ細胞であってもよい。他の実施形態では、多能性細胞は、非ヒト細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳類細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成体幹細胞、発達制限されたヒト前駆細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞である。一実施形態では、標的化された遺伝子修飾は、ＤＲ６の機能欠失をもたらす。

更なる方法では、単離工程（ｃ）は、（ｃ１）遺伝子修飾された標的化ベクター（すなわち、遺伝子修飾されたＬＴＶＥＣ）を線形化することを更に含む。なお更なる実施形態では、導入工程（ｄ）は、（ｄ１）相同組み換えを促進するため、多能性細胞中にヌクレアーゼ剤を導入することを更に含む。一実施形態では、選択工程（ｂ）及び／又は（ｅ）は、原核細胞又は多能性細胞に、本明細書に記載されるような選択可能な薬剤を適用することによって実施される。一実施形態では、選択工程（ｂ）及び／又は（ｅ）は、本明細書に記載されるような対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）アッセイを介して実施される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される標的ゲノム遺伝子座の様々な遺伝子修飾は、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術を使用した、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ由来のＬＴＶＥＣを使用した、細菌細胞中の一連の相同組み換え反応（ＢＨＲ）によって実施され得る（例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５８６，２５１号及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１（６）：６５２～６５９を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような様々な遺伝子修飾を含む、ＤＲ６標的化多能性及び／又は全能性細胞は、挿入ドナー細胞として使用され、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）方法を介して、対応する生物からの桑実期前の胚、例えば、８細胞期マウス胚に導入される（例えば、それらのすべてが全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５７６，２５９号、同第７，６５９，４４２号、同第７，２９４，７５４号、及び同第２００８－００７８０００ Ａ１号を参照されたい）。遺伝子修飾された多能性及び／又は全能性細胞を含む非ヒト動物胚は、胚盤胞期までインキュベートされ、次いで、代理母に移植されて、Ｆ０世代を生成する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような様々な遺伝子修飾を含む標的化された哺乳類ＥＳ細胞は、胚盤胞期の胚内に導入される。遺伝子修飾されたゲノム遺伝子座（すなわち、ＤＲ６遺伝子座）を有する非ヒト動物は、本明細書に記載されるように、対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）を介して同定され得る。遺伝的に修飾された多能性及び／又は全能性細胞に由来する、得られたＦ０世代の非ヒト動物を、野生型の非ヒト哺乳動物と交配させ、Ｆ１世代の子孫を得る。特異的プライマー及び／又はプローブによる遺伝型決定の後、遺伝的に修飾されたゲノム遺伝子座がヘテロ接合であるＦ１非ヒト動物を互いに交配し、遺伝的に修飾された遺伝子座がホモ接合であるＦ２世代の非ヒト動物を生成する。

一実施形態では、少なくとも１つのＤＲ６遺伝子座に遺伝子修飾を含む非ヒト動物を作製する方法が提供される。かかる方法は、（ａ）５’及び３’ホモロジーアームに隣接する挿入拡散を含む標的化構築物に、多能性細胞を接触させることであって、標的化構築物が、修飾された多能性細胞を形成するため、細胞のゲノム内のＤＲ６遺伝子座と相同組み換えを起こす、ことと、（ｂ）修飾された多能性細胞を宿主胚に導入することと、（ｃ）代理母に宿主胚を懐胎することであって、代理母は修飾されたＤＲ６遺伝子を含む子孫を生成し、その遺伝子修飾が少なくとも１つのＤＲ６の機能欠失をもたらす、ことと、を含む。

ＩＶ．細胞
本明細書に記載される様々な方法は、細胞中のＤＲ６遺伝子座を修飾するためのゲノム遺伝子座標的化系を採用する。そのような細胞としては、大腸菌を含む細菌細胞などの原核細胞、又は酵母、昆虫、両生類、植物などの真核細胞、又はマウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、シカ細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、トリ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、フェレット細胞、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）細胞などが挙げられるがこれらに限定されない哺乳類細胞、及び家畜哺乳動物からの細胞、若しくは農業用哺乳動物からの細胞が挙げられる。いくつかの細胞は、非ヒト、特に、非ヒト哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、好適な遺伝学的に修飾可能な多能性細胞が容易に入手可能ではない哺乳動物に対して、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８、及びＧｌｉｓ１が挙げられるがこれらに限定されない、多能性誘導因子の組み合わせの体細胞への導入を介して、体細胞を多能性細胞に再プログラミングするために、他の方法が採用される。そのような方法では、細胞はまた、哺乳類細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳類細胞、非ヒト細胞、げっ歯類、ラット、マウス、ハムスターからの細胞、線維芽細胞、又は任意の他の宿主細胞であってもよい。他の実施形態では、細胞は、多能性細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞である。そのような細胞としては、例えば、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を含む多能性細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、ラット胚性幹（ＥＳ）細胞、ヒト胚（ＥＳ）細胞、又は発達制限されたヒト前駆細胞、げっ歯類胚性幹（ＥＳ）細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、若しくはラット胚性幹（ＥＳ）細胞が挙げられる。

Ｖ．動物モデル
本明細書には、ＡＬＳを治療、防止、及び／又は抑制するための候補薬剤を同定する方法も提供される。特異的な実施形態では、物質の抑制性効果は、ＤＲ６機能欠失を有し、出生時は表現型的に正常であり、生後８週間でＡＬＳに似た症状を現す動物に薬剤を投与することによって、生体内で決定される。

動物は、都合のよい経路で、例えば、全身注射、長期暴露用のポンプ、又は直接脳内注射により、薬剤を投与されて検査され得る。これらの動物は、薬剤を受けていない適切な対照動物と比較して、動物の行動、例えば、運動行動に対する物質の効果を決定するために、行動調査に含まれ得る。また、動物の脊髄、筋、及び／若しくは脳組織の生検又は解剖学評価が実施され得、かつ／あるいは血液又はＣＳＦの試料が採取され得る。

本発明は特に、多数の実施形態に関連して表示及び説明されてきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書に開示された様々な実施形態に対して、形状及び詳細の変更を加えられること、並びに本明細書に開示された様々な実施形態が、本請求の範囲に対する制限となることを意図するものではないことが、当業者に理解されるであろう。

以下の実施例は、例証目的のためのみに提供されており、決して本発明の範囲を限定することは意図されていない。

実施例１：ＤＲ６（Ｔｎｆｒ２１）遺伝子座の遺伝子修飾
前述のように、マウスにおけるカスタム遺伝子突然変異の高速及び高スループットの生成を可能にする、ＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）方法が採用された（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００３ｂ），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１：６５２～６５９）。端的には、大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）が、マウスｂＭＱ（１２９Ｓ７／ＳｖＥｖ Ｂｒｄ－Ｈｐｒｔ ｂ－ｍ２）又はＲＰ２３ ＢＡＣライブラリー（Ａｄａｍｓ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８６：７５３～７５８）からのＢＡＣクローンを使用して生成された。ｌａｃＺ／ｎｅｏ^ｒレポーター／選択カセット（図１）は、ｌａｃＺ部分のβ－ガラクトシダーゼコード配列のアミノ末端部が、ＲＯＲ１からの膜貫通ドメインを含むように修飾された点を除き、ＮＩＨ ＫＯＭＰ（ワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）上のインターネットを介し、ＵＲＬ「ｗｗｗ．ｖｅｌｏｃｉｇｅｎｅ．ｃｏｍ／ｋｏｍｐ／ｄｅｔａｉｌ／１００２０」で入手可能な配列）に使用されるＺＥＮ－Ｕｂ１カセットと同一であった。

ＬＴＶＥＣは、０．１２５ｍＬの容積中、エレクトロポレーションバッファー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）３．３×１０６細胞、０．６７μｇ ＤＮＡ内にマルチウェルエレクトロポレーションデバイス（Ｈａｒｖｅｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ ＥＳ細胞に導入され（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３ａ））、その後、１５ｃｍのゼラチンコートプレート上で培養された。Ｇ４１８を含む選択培地が、エレクトロポレーションの４８時間後に添加され、その後毎日変更された。薬剤耐性コロニーがエレクトロポレーションの１０日後に採集され、トリプシンで処理され、ＤＮＡ抽出及び生成前の少なくとも３日間、ゼラチンコートの９６ウェルプレートで培養された。適切に標的化されたＥＳ細胞クローンが、対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）アッセイ（Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７６：２９５～３０７；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３ａ），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：６５２～６５９）によって同定された。

ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）（Ｄｅｃｈｉａｒａ，Ｔ．Ｍ．，（２００９），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５３０：３１１～３２４；Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：９１～９９）が使用され、ＤＲ６ノックアウト変異体を帯びる完全ＥＳ細胞由来のＦ０世代マウスを生成するため、標的化されたＥＳ細胞が、非圧縮の８細胞期Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ胚に注入された。雄性のＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅ（登録商標）が、ｌａｃＺ分析用の胚若しくは成体を生成するため、又は、Ｆ１種を生成するために、ｌａｃＺ発現プロファイリングに直接使用され、又はＣ５７ＢＬ／１２９雌性との交配が行われ、Ｎ２Ｆ１マウスに対して表現型調査が実施された。膣栓の同定の朝を０．５日目（Ｅ０．５）として割り当てることによって、時限交配が実行された。

実施例２：ＤＲ６遺伝子座における変異体を含む動物の表現型分析
Ｎ２Ｆ１マウスの表現型に関する試験を、６～８週齢で開始した。時限交配のため、膣栓の同定の朝を胎生０．５日目（Ｅ０．５）として割り当てた。ＤＲ６ ＫＯ及び野生型同腹子を、出生から、調査のために２１～２３℃（６９～７４Ｆ）及び湿度４０～６０％の中で１日１２時間照明下で飼育したとき、約６～８週齢までに、様々な発達マイルストーン（ラント、ブリーシング、貌面及び肢部の異常、皮膚の色、姿勢、立ち直り、並びにアイ開口率）を観察した。すべての実験が６～９週齢で開始され、すべての動物処置が、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに承認されたプロトコルに準拠して行われた。

運動障害の分析は、ロータロッド試験、オープンフィールド自発運動試験、及びキャットウォーク試験を用いて行われた。キャットウォーク試験では、被検体が照明されたガラスプラットフォームを横断する間、下からビデオカメラで録画する。歩行関連のパラメーター（ストライドパターン、個々の足の旋回速度、スタンス期間、及び圧力など）が、動物ごとに報告される。この試験は、マウスのトランスジェニック株の表現型を決定し、運動能力に対するそれらの効果について新規化学成分を評価するために用いられる。ＣａｔＷａｌｋ ＸＴは、ラット及びマウスの足音並びに歩行の定量的な評価を行うシステムである。この試験は、中枢神経、末梢神経、筋層、又は骨格異常のほとんどすべての種類の実験モデルで、げっ歯類の自発運動能力を評価するために用いられる。

上位運動ニューロン障害は、痙性（すなわち、硬直）、反射増加、振戦、運動緩慢、及びバビンスキー徴候として現れる。下位運動ニューロン障害は、筋力低下、衰弱、足のクラスピング、曲がり、及び引きずり、並びに線維束性収縮として現れる。延髄障害は、嚥下困難、発語不明瞭、及び舌筋の線維束性収縮として現れる。表２は、試験時の動物の運動障害、振戦、及び硬直に関するスコアリング法を示す。全体的な運動機能の評価は、盲検化主観的スコアリングアッセイを用いて実施され、すべてのデータは平均＋／－ＳＥＭとして報告されている。

データからわかることは、ＤＲ６^－／－マウスは、野生型対照物と比較して不動の増加を示していないが、約１４週齢目にＡＳＬに似た神経系表現型（例えば、後肢麻痺を示唆する立ち上がり活動の少なさ）を示しており、早くも９週齢でロータロッドにおける時間及び体重の差を見ることができ、それぞれ時間の進行とともに着実に減少している（図４～７）。ただし、ＤＲ６^－／－マウスの運動ニューロンの喪失は、約１４週齢で臨床症状の閾値に達しており、運動障害、硬直、及び振戦のスコアが麻痺及び／又は重度の疾病進行を反映し始めているが、これは動物の性別には依存しない（図２）。症候性ＤＲ６^－／－動物は、上位及び下位運動ニューロン障害の両方を反映する体重減少及び有意な運動異常を有し（図３）、約２１週齢目に死亡する。

実施例３：ＤＲ６遺伝子座における変異体を含む動物の解剖学的分析
約２０週齢の８匹の野生型及び８匹のＤＲ６ノックアウトマウスを、５０ｍＬの食塩水で、次いで、ｐＨ６．５のアセテートバッファ中４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液５０ｍＬと、ｐＨ９．５のホウ酸バッファ中４％のＰＦＡ５０ｍＬとで灌流した。動物の灌流後、マウスの脳及び脊髄を採取し、それらが脱落するまで、ホウ酸バッファ中１５％、次いで３０％のスクロース溶液に入れた。その後、組織をＯＣＴに埋め込み、２－メチルブタンを使用して凍結させた。

凍結させた組織を切削し、スライドに載せ、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）及びルクソールファストブルーで免疫染色した。脊髄ごとに４枚のＨ＆Ｅ染色スライドを無作為に選択し、それぞれの脊髄中の運動ニューロンの数を数えた。

代表的なスライドが、図９に提供されている。野生型マウスの脊髄にある、スライドごとの運動ニューロンの平均数は、約１８個であり、ノックアウトマウスの場合は、ｐ値が０．０００１未満で約２つである（図９）。このことから、症候性ＤＲ６ノックアウトマウスは、野生型対照物と比較して、脊髄中の運動ニューロンの有意な喪失を有する。加えて、ノックアウトマウスの脊髄は、海綿状の病理を示し、これは、クロイツフェルト－ヤーコプ病患者のヒト脳の病理に似ており、これらの動物におけるプリオンに似た運動ニューロン疾患表現型の可能性を示唆している。

実施例４：ＤＲ６遺伝子座における変異体を含む動物の神経タンパク質の発現
総ｍＲＮＡを、約２０週齢の１０匹の野生型マウス及び７匹のＤＲ６ノックアウトマウスの脳及び脊髄から採取した。次に、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）を使用したＲＴ－ＰＣＲをこれらのｍＲＮＡ試料に対して実施した。次に、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（Ｃｈａｔ）、Ｍｎｘホメオボックス、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体サブユニット３Ｂ（Ｇｒｉｎ３ｂ）、及びグルタミン酸受容体２（Ｇｒｉａ２）遺伝子を、試料中のβアクチンの発現によって正常化した。

図１０～１２は、ＭＢＰ、Ｍｎｘ、及びＧｒｉｎ３ｂの発現は、ＤＲ６ノックアウトマウスの脊髄内では減少しているが、脳内では減少しておらず、症候性ＤＲ６ノックアウトマウスの脊髄における運動ニューロンの喪失の証拠が増強された。Ｎｇｆｒ、Ｃｈａｔ、及びＧｒｉ２ａの発現は、影響を受けない。

実施例５：内因性ＤＲ６遺伝子座における変異体を含む動物内の遺伝子発現パターン
遺伝子プロファイリングを、１０週齢の野生型マウス（ｎ＝５匹の雄）、症状が出る前の１０週齢のＤＲ６^－／－マウス（ｎ＝５匹の雄）、２０週齢の野生型マウス（ｎ＝６匹の雄及び３匹の雌）、及び症状を示す２０週齢のＤＲ６^－／－マウス（ｎ＝６匹の雄及び３匹の雌）の脳及び脊髄組織から抽出したＲＮＡを用いて実施した。

１０及び２０週齢のＤＲ６^－／－マウスの脳及び脊髄は、遺伝子発現の有意なオーバーラップを有し、類似の遺伝子発現特徴（データ表示なし）を共有する。１０週齢のＤＲ６^－／－マウスの脳及び脊髄の両方で有意な７３個の遺伝子が、疾患発症機序及び進行に潜在的に伴うものとして同定された。１０週齢のＤＲ６^－／－マウスの脊髄からの遺伝子特徴はまた、ヒトＡＬＳ及びマウスＳＯＤ１ ｂｉｏｓｅｔ（データ表示なし）と高い相互関係にあり、ＤＲ６^－／－マウスをＡＬＳマウスモデルとして更に確認する。１０週齢のＤＲ６^－／－マウスの脳及び脊髄は、炎症経路を伴う疾患プロセスを示唆した、免疫応答に連結する遺伝子発現特徴を示した。

実施例６：ＤＲ６^－／－動物による末梢性免疫細胞ホメオスタシスの表示
ＣＤ３、Ｂ２２０、ＣＤ２１及びＣＤ２に対する抗体（すべて、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ又はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手）を使用するフローサイトメトリー分析により、１０及び２０週齢の野生型マウス並びにＤＲ^－／－マウスから血液、骨髄、胸腺、及び脾臓組織を単離して表現型を求めた。また、２０週齢の野生型マウス及びＤＲ６^－／－マウスから単離した血清中のサイトカイン及びケモカイン濃度を、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｍｏｕｓｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｍａｇｎｅｔｉｃ ２０－Ｐｌｅｘ Ｐａｎｅｌを用いて、ＦＧＦ基準、ＧＭ－－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１２（ｐ４０／ｐ７０）、ＩＬ－１７、ＩＰ－１０、ＫＣ、ＭＣＰ－１、ＭＩＧ、ＭＩＰ－１α、ＴＮＦ－α、及びＶＥＧＦの同時定量的測定の目的で評価した。

１０週齢でも２０週齢でもないＤＲ６^－／－マウスは、末梢性免疫細胞恒常性における強固な影響を実証した（図１３～４１４）。ＤＲ６^－／－マウスは、骨髄における正常なＢ細胞発達及び初期の細胞前駆恒常性、胸腺におけるＢ細胞の２倍増加、脾臓移行１ Ｂ細胞の増加及び脾臓辺縁帯Ｂ細胞の減少、末梢好中球の減少及び抹消リンパ球の増加を示した（図１３）。骨髄において、ＤＲ６^－／－マウスは、巨核球／赤血球前駆体の１４％増加、骨髄前駆体の２０％減少を示したが、合計細胞数の有意な変化はない（図１４）。ＤＲ６^－／－動物は、胸腺における正常なＴ細胞発達及び分化を示したが、脾臓の共通／成熟樹状細胞の２０％増加、大食球及び好酸球の２５％増加、脾臓の好中球及び単球の７５％増加、並びにＣＤ４^＋Ｔ細胞の１９％増加があった。ただし、脾臓内の総細胞数に有意な変化はなかった（データの表示なし）。更に、２０週齢のＤＲ６^－／－マウスの血清中のサイトカイン及びケモカインレベルは、野生型動物と比較して変化していない（図１５）。これらのデータは、ＤＲ６^－／－マウスが、疾病進行中に全体的な炎症反応を通過せず、遺伝的プロファイリングに見られる炎症反応が局部的な神経炎症であり得ることを示唆している。

実施例７：ＤＲ６＋／－マウスからの胚幹細胞由来の運動ニューロンによる酸化的ストレス増加の実証
野生型（ＤＲ６^＋／＋）又はヘテロ接合ＤＲ６^＋／－動物から内部細胞塊の胚幹細胞を単離し、胚幹細胞培地（ＥＳＭ；ＤＭＥＭ＋１５％ウシ胎児血清＋ペニシリン／ストレプトマイシン＋グルタミン＋非必須アミノ酸＋ヌクレオシド＋β－メルカプトエタノール＋ピルビン酸ナトリウム＋ＬＩＦ）中で２日間培養し、胚様体（ＥＢ）の形成を可能にした。ＥＢを分化培地（ＤＭ：Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地＋１０％ノックアウト血清＋ペニシリン／ストレプトマイシン＋グルタミン＋β－メルカプトエタノール）中で２日間培養し、ＤＭ及びレチノイン酸及びスムーズンドアゴニスト中で更に５日間培養して、運動ニューロンを得た。分離された運動ニューロンは、胚幹細胞由来の運動ニューロン培地（ＥＳＭＩＮ；Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ媒体＋２％ウマ血清＋Ｂ２７＋グルタミン＋ペニシリン／ストレプトマイシン＋β－メルカプトエタノール＋１０ｎｇ／ｍＬ ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ）でめっきし、成熟させて、安定した運動ニューロン系を確立した。７日目に運動ニューロン数を決定し、安定した運動ニューロン系の確立から１日目及び７日目に酸化的ストレスを測定した。

データは、ＤＲ６^＋／－動物が野生型動物と同じ数の運動ニューロンを生成するが、野生型動物と比較して酸化的ストレスを増加させたことを示している（図１６）。

実施例８：ＤＲ６^＋／－及びＤＲ６^＋／＋動物の表現型比較
対照動物の運動機能と、実施例１に記載されているようなＤＲ６遺伝子修飾用のヘテロ接合マウス又はホモ接合マウスと、を、実施例２に記載されているような試験を用いて比較した。神経学的スコアは、図１７Ａで比較され、体重増加比較は図１７Ｂに示され、ロータロッド試験比較は図１７Ｃに示され、オープンフィールド測定は図１７Ｄ～１７Ｋに提供され、キャットウォーク測定は図１７Ｌ～１７Ｚに示されている。

ＤＲ６変異体の有意な「投与量依存」型効果は、動物の体重増加に（図１７Ｂ）、ロータロッド試験中に（図１７Ｃ）、オープンフィールド試験で測定された立ち上がり及び立ち上がり回数に（図１７Ｄ～１７Ｅ）、並びにキャットウォーク試験中の後肢のストライド長及び旋回速度に（図１７Ｌ～１７Ｎ）見られた。

全体的な運動機能を盲検化（blin, ded）主観的スコアリングアッセイ（図１７Ａ）で評価したとき、ヘテロ接合マウスは野生型動物と神経学的に類似して見えたが、２１週齢で、ヘテロ接合マウスの神経学的スコアは、ホモ接合マウスの神経学的スコアの傾向を示し始めた（図１７Ａ）。いくつかの他の測定は同じパターンをたどり、ヘテロ接合マウスの表現型は、生後約２０週間後のホモ接合マウスの表現型の傾向を示した（例えば、１７Ｆ～１７Ｋ、１７Ｏを参照のこと）。

このデータは、ＤＲ６変異体が、変異体のヘテロ接合マウスにおけるハプロ不全であることを示唆している。データはまた、ヘテロ接合ＤＲ６^＋／－マウスの加齢とともに、マウスは、最初は正常に見えたこれらの測定において、ホモ接合ＤＲ６^－／－マウスと類似する運動及び／又は神経学的欠陥を示し始めることを示唆している（例えば、図１７Ｏ～１７Ｐ、１７Ｒを参照のこと）。

実施例９：ＤＲ６^＋／－及びＤＲ６^＋／＋動物の知覚欠失
２０週齢のＤＲ６遺伝子修飾の対照動物、及びマウスのヘテロ接合体又はホモ接合体の温痛覚を、４８℃、５２℃、又は５５℃に維持した金属面上に動物を配置することによって試験した（ＩＩＴＣ、Ｗｏｏｄｌａｎｄ Ｈｉｌｌｓ，ＣＡ）。温熱刺激に反応するまでの潜時（動物が後足をなめる又は（of）はじくまでに経過した時間として定義されている）を測定した。マウスが２つの侵害防御行動、後足をなめる行動又は後足を振る行動のいずれかを取るまで、マウスはプレート上に残された。

図１８に示すように、ＤＲ６^＋／－動物及びＤＲ６^＋／＋動物は、感覚消失を示している。これらのマウスは、２０週齢で顕著な運動機能障害を示さないため、ＤＲ６^＋／－に見られる感覚消失は正確であり得る（例８を参照のこと）。ただし、ＤＲ６^－／－マウスにおける反応の遅延は、観察された運動欠失症状によるものであり得ることは指摘されるべきである。

本明細書に開示されたげっ歯類は、ヒトにおけるＡＬＳ進行のたどり方がより類似している新規の動物モデルを提供する。理論に束縛されるものではないが、いくつかの可能性のうちの１つとして、げっ歯類は、発達時に正常な刈り込みを示すことができない場合があり、したがって、げっ歯類は、結合性の増加及び軽度の興奮性亢進を伴って発達し、そのことが時間の経過とともに蓄積される低レベルの興奮毒性をもたらし得る。特に、成体ＤＲ６ノックアウト動物は、発達中の血液脳関門（ＢＢＢ）浸透性の増加及びＢＢＢマーカーの発達障害を示し得るが、本明細書に記載されるマウスのＡＬＳに似た表現型は、通常、運動ではなく、認知障害として現れる血液脳関門における消失として、脳血管発達中にＤＲ６が果たす役割の結果であるという可能性は低い。

Claims (1)

1. 本願明細書に記載の発明。

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