ES2955841T3

ES2955841T3 - Célula de un roedor que presenta función de la neurona motora superior e inferior y percepción sensorial disminuidas

Info

Publication number: ES2955841T3
Application number: ES20159001T
Authority: ES
Inventors: Burcin Ikiz; Michael LaCroix-Fralish; Susan D Croll
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2015-03-16
Filing date: 2016-03-16
Publication date: 2023-12-07
Anticipated expiration: 2036-03-16
Also published as: ES2830173T3; JP7193509B2; EP3685662C0; EP3685662A1; US20160270377A1; MX2021002852A; BR112017019620A2; EP3270688A1; AU2016233250B2; EP3685662B9; US10285387B2; JP6600694B2; WO2016149398A1; IL274285A; EP3270688B1; MX2017011918A; NZ734906A; SG11201706809WA; RU2017135557A3; IL274285B

Abstract

Un modelo animal para la disfunción de la neurona motora en una enfermedad, por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), que comprende un animal no humano genéticamente modificado que comprende un alelo DR6 genéticamente modificado y exhibe fenotipos normales al nacer y durante algunas semanas o meses después del nacimiento. Sin embargo, a medida que el animal no humano envejece, desarrolla una disfunción de la neurona motora que se presenta como uno o más síntomas similares a los de la ELA, que pueden progresar rápidamente después de su aparición. También se proporcionan métodos para identificar agentes candidatos que pueden usarse para prevenir, retrasar o tratar la ELA. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Célula de un roedor que presenta función de la neurona motora superior e inferior y percepción sensorial disminuidas

Campo técnico

La presente solicitud se refiere generalmente a un animal no humano que desarrolla neurona motora superior, neurona motora inferior, y/o percepción sensorial disminuidas con el paso del tiempo, dicho animal puede proporcionar un modelo útil para el trastorno neurodegenerativo, por ejemplo, una enfermedad de las neuronas motoras, tal como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA).

Antecedentes de la invención

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA), también conocida como enfermedad de Lou Gehrig, es una enfermedad neurodegenerativa mortal resultante de la destrucción de neuronas motoras en la médula espinal, el bulbo raquídeo y el córtex que son responsables del movimiento voluntario. Esta enfermedad clínicamente se manifiesta por debilidad muscular progresiva y atrofia, conduciendo a parálisis y muerte en 3-5 años de la aparición de la enfermedad.

Aproximadamente 20.000 personas en los Estados Unidos tienen ELA y 5.000 personas son diagnosticados de ELA cada año. ELA es común mundialmente, y afecta a personas de todas las razas y orígenes étnicos. La edad media de aparición de ELA es entre 40 y 60 años de edad, pero ELA puede sobrevenir a hombres y mujeres tanto jóvenes como mayores. En el 90-95 % de los casos de ELA, la enfermedad es aparentemente aleatoria (conocida como ELA esporádica (ELAe)). En dichos casos de ELAe, no hay historial familiar de la enfermedad ni factores de riesgo claramente asociados. En el 5-10 % de los casos de ELA, hay un vínculo genético hereditario (conocido como ELA familiar (ELAf)).

Entre las mutaciones asociadas con ELA, aquellas en el gen de la superoxidasa dismutasa (SOD1) con Cobre-Zinc se ha pensado durante mucho tiempo que causan la enfermedad de ELA a través de un aumento tóxico de la función más que el deterioro de la función antioxidante de la enzima SOD1. Otros genes con mutaciones asociadas con la ELAf incluyen alsina (ALS2), senataxina (ALS4), proteína de membrana asociada a vesícula (VAPB, ALS8), angiogenina y la subunidad p150 de dinactina (DCTN1). Recientemente, se han identificado más de treinta mutaciones en la región codificante de TDP-43 de Tardbp en pacientes de ELA con o sin historial familiar evidente, que corresponden a aproximadamente 4 % de ELAf y menos del 1 % de ELAe. .La mayoría de los pacientes con mutación(es) en TDP-43 desarrollan fenotipo ELA clásico sin déficit cognitivo lo que sugiere un papel importante de TDP-43 en el desarrollo de ELA. Adicionalmente, el hexanucleótido GGGGCC extendido se repite en el promotor del gen C9ORF72 y aparece como causa muy común de ELAf y ELAe, así como demencia frontotemporal asociada a ELA (ELA-DFT).

Se han establecido varios modelos de ratón para la enfermedad de ELA, los cuales incluyen cepas de roedores que tienen mutaciones en SOD1, TDP43, o FUS, ratones nuligénicos para ("knockout") ALS2, y ratones con genes modificados por ingeniería genética que codifican las subunidades de neurofilamento. Entre estos, el modelo de ratón transgénico de SOD1 mutante (mSOD1) humano actualmente es el más ampliamente usado debido a que comparte varios fenotipos clínicos con los pacientes de ELA. El primer síntoma de los ratones mSOD1 es un sutil "escalofrío/temblor" en una o más de las extremidades, lo cual aparece a aproximadamente 90 a 100 días de vida. En estadios tardíos, el ratón comienza un curso clínico, primero con debilidad muscular y/o paresia en las extremidades posteriores, seguido de ausencia de paresia en las extremidades anteriores y finalmente tetraplejia grave. Ninguno de los modelos animales actuales, sin embargo, se traducen en enfermedad humana en el sentido en el que los animales no presentan síntomas de neurona motora superior, agregados de TDP43 y/o SOD1, y/o pérdida de neurona no motora. Por consiguiente, es necesario un modelo animal que refleje más de cerca ELA en seres humanos.

Sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones. En el presente documento se proporciona una célula de roedor genéticamente modificada de acuerdo con la reivindicación 1. Específicamente, el roedor, por ejemplo, una rata o una célula de ratón, puede comprender un locus de DR6 endógeno modificado, en el que el locus de DR6 modificado carece de (por ejemplo, no comprende, le falta, etc.) una primera secuencia de nucleótidos (por ejemplo, un primer ADN, un primer ADNc, un primer ADN genómico, etc.) que codifica un dominio de muerte citoplasmático de DR6, o un dominio citoplasmático de DR6, en su totalidad, por ejemplo, el locus de DR6 modificado carece de una secuencia de nucleótidos que codifica cualquier parte de un dominio de muerte citoplasmático de DR6, o un dominio citoplasmático de DR6. El locus de DR6 modificado además puede carecer de (i) una segunda secuencia de nucleótidos (por ejemplo, un segundo ADNc, un segundo ADN, un segundo ADN genómico) que codifica un dominio transmembrana de DR6 en su totalidad, por ejemplo, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica cualquier parte de un dominio transmembrana de DR6; (ii) una tercera secuencia de nucleótidos (por ejemplo, un tercer ADNc, un tercer ADN, un tercer ADN genómico) que codifica un dominio extracelular de DR6, o cualquier parte del mismo, por ejemplo, una tercera secuencia de nucleótidos que codifica cualquier parte de un dominio extracelular de DR6 (iii) una cuarta secuencia de nucleótidos, por ejemplo, una cuarta secuencia genómica que se extiende desde la totalidad del exón 3 a la totalidad del exón 6, incluidos los intrones intermedios, del gen DR6 del roedor endógeno; y/o (iv) una quinta secuencia de nucleótidos, por ejemplo, una cuarta secuencia genómica, que se extiende desde parte del exón 2, por ejemplo, base 4103, a la totalidad del exón 6, por ejemplo, el codón de terminación, incluidos los intrones intermedios, del gen DR6 del roedor endógeno, en el que la quinta secuencia de nucleótidos codifica la proteína DR6 de roedor endógena de longitud completa y madura. En algunas realizaciones, el roedor es un ratón y el alelo DR6 modificado carece de una primera secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de muerte citoplasmático DR6, por ejemplo, el alelo DR6 modificado carece de una primera secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 388-454 de la SEQ ID NO:15 o cualquier parte de la misma. En algunas realizaciones, se proporciona una célula de ratón que comprende un alelo DR6 modificado que carece de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio citoplasmático, por ejemplo, un dominio citoplasmático que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como los aminoácidos 330-614 de la SEQ ID NO:15. En algunas realizaciones, una célula de ratón proporcionada en el presente documento comprende un alelo DR6 modificado que carece de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína DR6 madura, por ejemplo, expuesta por los aminoácidos 1-614 de la SEQ ID NO:15. En algunas realizaciones, el alelo DR6 modificado carece de más de 5 kb de una secuencia genómica endógena. En algunas realizaciones, el alelo DR6 modificado carece de más de 10 kb de una secuencia genómica endógena. En algunas realizaciones, el alelo DR6 modificado carece de más de 20 kb de una secuencia genómica endógena. En algunas realizaciones, el alelo DR6 modificado carece de más de 30 kb de una secuencia genómica endógena. En algunas realizaciones, el alelo DR6 modificado carece de más de 40 kb de una secuencia genómica endógena. En algunas realizaciones, el alelo DR6 modificado carece de más de 50 kb de una secuencia genómica endógena. En algunas realizaciones, el roedor es heterocigótico u homocigótico para el locus de DR6 modificado que carece de una secuencia de nucleótidos que codifica cualquier parte de un dominio extracelular de DR6 endógeno, un dominio transmembrana endógeno y/o un dominio citoplasmático de DR6 endógeno.

Una célula de roedor genéticamente modificada como se proporciona en el presente documento puede expresar un ácido nucleico, que está operativamente unido a una secuencia reguladora transcripcional de DR6 endógena, en un locus de DR6 endógeno (por ejemplo, un locus de DR6 endógeno modificado como se describe en el presente documento), en el que el ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende un péptido señal de DR6 funcional (por ejemplo, un péptido señal de DR6 heterólogo funcional, un péptido señal de DR6 endógeno funcional, un péptido señal de DR6 de rata funcional, un péptido señal de DR6 de ratón funcional, etc.), un dominio transmembrana (por ejemplo, un dominio transmembrana de DR6 o un dominio transmembrana heterólogo (por ejemplo, un dominio transmembrana de ROR1)) y una proteína indicadora (por ejemplo, una proteína p-galactosidasa), y en el que el polipéptido carece de (por ejemplo, no está fusionado operativamente a, no comprende, etc.) un dominio citoplasmático de DR6 funcional, o cualquier parte de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido también carece de un dominio extracelular de DR6 funcional, o cualquier parte del mismo. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste básicamente o consiste en un péptido señal de DR6 funcional fusionado operativamente a un dominio transmembrana, que está fusionado operativamente a una proteína indicadora. En algunas realizaciones, el péptido señal de DR6 es un péptido señal de d R6 de roedor, por ejemplo, un péptido señal de DR6 de ratón, por ejemplo, expuesto como los aminoácidos -1 a -41 de la SEQ ID NO:15 (o cualquier parte de la misma), por ejemplo, se codifica por la secuencia expuesta como SEQ ID NO:6 o una variante degenerada de la misma que codifica la misma secuencia de aminoácidos pero difiere de la SEQ ID NO:6 únicamente debido a la degeneración del código genético. En algunas realizaciones, un roedor como se proporciona en el presente documento comprende y expresa un ácido nucleico que comprende una secuencia expuesta como SEQ ID NO:6 o una variante degenerada de la misma que codifica la misma secuencia de aminoácidos pero difiere de la SEQ ID NO:6 únicamente debido a la degeneración del código genético. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de ROR1, por ejemplo, se codifica por la secuencia expuesta como SEQ ID NO:7 o una variante degenerada de la misma que codifica la misma secuencia de aminoácidos pero difiere de la SEQ ID NO:7 únicamente debido a la degeneración del código genético. En algunas realizaciones la secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia expuesta como SEQ ID NO:7 o una variante degenerada de la misma que codifica la misma secuencia de aminoácidos pero difiere de la SEQ ID NO:7 únicamente debido a la degeneración del código genético. En algunas realizaciones, la proteína indicadora es p-galactosidasa, por ejemplo, se codifica por la secuencia expuesta como SEQ ID NO:8 o una variante degenerada de la misma que codifica la misma secuencia de aminoácidos pero difiere de la SEQ ID NO:8 únicamente debido a la degeneración del código genético. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico comprende la SEQ ID NO:8 o una variante degenerada de la misma que codifica la misma secuencia de aminoácidos pero difiere de la SEQ ID NO:8 únicamente debido a la degeneración del código genético. En algunas realizaciones, un roedor como se proporciona en el presente documento comprende y expresa un ácido nucleico que codifica un péptido señal de DR6 fusionado operativamente a un dominio transmembrana de ROR1, el cual se fusiona operativamente a una p-galactosidasa, por ejemplo, un roedor como se proporciona en el presente documento comprende y expresa una secuencia de ácido nucleico expuesta como S^eQ ID NO:17, o una variante degenerada de la misma que codifica la misma secuencia de aminoácidos pero difiere de la SEQ ID NO:17 únicamente debido a la degeneración del código genético.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico está en un locus de DR6 endógeno, unido operativamente a uno o más elementos reguladores de DR6 endógenos, por ejemplo, un elemento regulador transcripcional endógeno, de modo que el roedor es heterocigótico u homocigótico para un locus de DR6 modificado que comprende el ácido nucleico pero que carece de al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio citoplasmático de DR6 endógeno en su totalidad o cualquier parte del mismo en su totalidad, (por ejemplo, un dominio de muerte citoplasmático de DR6 en su totalidad), y que opcionalmente además carece de una secuencia de nucleótidos adicional que codifica un dominio transmembrana de DR6 endógeno o cualquier parte del mismo en su totalidad y/o un dominio extracelular de DR6 endógeno en su totalidad.

La modificación de un locus de DR6 endógeno y/o la expresión del ácido nucleico como se describe en el presente documento puede afectar a la función de una neurona, una célula glial, o una combinación de las mismas. La expresión del ácido nucleico da como resultado función disminuida, por ejemplo, disfunción, de neuronas motoras superiores y/o inferiores, que puede presentarse como, por ejemplo, (a) cifosis; (b) agarrotamiento anormal de las extremidades posteriores; (c) deficiencia en la coordinación motora y la capacidad de aprendizaje motor (d) pérdida de peso y (e) percepción sensorial disminuida en comparación con un roedor control que es del mismo trasfondo genético, por ejemplo, es la misma cepa, que el roedor genéticamente modificado. Un roedor que comprende un locus de DR6 modificado y/o que expresa el ácido nucleico como se describe en el presente documento puede presentar uno o más síntomas de la disfunción neuromotora, por ejemplo, disfunción de la neurona motora superior y/o neurona motora inferior. El síntoma puede ser (a) cifosis; (b) agarrotamiento anormal de las extremidades posteriores; (c) deficiencia en la coordinación motora y la capacidad de aprendizaje motor (d) pérdida de peso y/o (e) percepción sensorial disminuida en comparación con un roedor control que es del mismo trasfondo genético, por ejemplo, es la misma cepa, que el roedor genéticamente modificado. El uno o más síntomas puede ser un síntoma similar a ELA que implica la disfunción neuromotora seleccionada del grupo que consiste en temblores, parálisis espástica (rigidez), reflejos anormales, y una combinación de los mismos y/o un síntoma similar a ELA que implica disfunción de neurona motora inferior seleccionado entre el grupo que consiste en debilidad y desgaste muscular, fasciculaciones, y una combinación de los mismos. Dichos síntomas similares a ELA se pueden visualizar usando uno o más de puntuación neurológica de ALS-TDI subjetiva con enmascaramiento, ensayo de rotarod, ensayo de pasarela, ensayo en campo abierto. Adicionalmente, un roedor como se divulga en el presente documento puede presentar aumento reducido de peso en comparación con los animales tipo silvestre control entre 8 y 20 semanas de vida. Un roedor como se describe en el presente documento también puede presentar una latencia deficiente de respuesta a estímulos dolorosos, independientemente de si el roedor presenta o no función neuromotora disminuida que se presenta como tiempo insuficiente sobre un rotarod, función locomotora deteriorada, capacidades en pasarela disminuidas, y una combinación de los mismos

El roedor parece que puede ser sumamente normal al nacer, (por ejemplo, parece ser normal a simple vista, por ejemplo, la disfunción neuromotora y/o la percepción sensorial disminuidas no es evidente en un ensayo de puntuación neurológica subjetiva con enmascaramiento, ensayo de rotarod, ensayo de pasarela, ensayo en campo abierto, medición de peso y/o ensayo de sometimiento al dolor) y desarrolla uno o más síntomas similares a ELA visibles cuando envejece, por ejemplo, el roedor puede desarrollar uno o más síntomas similares a ELA después de 2 semanas de vida, 3 semanas de vida, 4 semanas de vida, 5 semanas de vida, 6 semanas de vida, etc. Un roedor como se describe en el presente documento puede ser más joven de 4 semanas de vida y no presenta ningún síntoma similar a ELA. Un roedor como se describe en el presente documento puede ser más joven de 8 semanas de vida y no presenta ningún síntoma similar a ELA. El roedor puede desarrollar uno o más síntomas similares a ELA antes de 22 semanas de vida. El roedor puede tener al menos 16 semanas o es mayor y presenta uno o más de los siguientes fenotipos: (a) cifosis; (b) agarrotamiento anormal de las extremidades posteriores; (c) deficiencia en la coordinación motora y la capacidad de aprendizaje motor (d) pérdida de peso y (e) latencia retrasada de respuesta a un estímulo doloroso en comparación con un roedor control.

Los patrones de expresión génica de un roedor divulgado en el presente documento, por ejemplo, los distintivos génicos de los órganos del sistema nervioso (cerebro, médula espinal, etc.) pueden ser similares a los patrones de expresión génica de (1) un paciente con ELA o los distintivos génicos de los órganos del paciente (cerebro, médula espinal, etc.), respectivamente y/o (2) otro modelo animal de ELA, por ejemplo, un animal no humano con SOD1, o el distintivo génico de los órganos del animal no humano (cerebro, médula espinal, etc.), respectivamente. Por ejemplo, el(los) patrón(es) de expresión génica de un cerebro y/o médula espinal de un roedor divulgado en el presente documento se puede(n) correlacionar con los bioconjuntos de ELA humanos y/o bioconjuntos de SOD1 murinos, que pueden estar ligados a una respuesta inmunitaria. La correlación con los bioconjuntos de ELA humanos y/o SOD1 murinos sugiere que la patología observada en los roedores divulgados en el presente documento es muy similar a la vista en animales con ELA o el modelo animal de SOD1. Un roedor como se divulga en el presente documento puede tener una respuesta inmunitaria ligada al distintivo genético, pero no puede presentar una respuesta inmunitaria anormal periféricamente en comparación con los roedores tipo silvestre.

El número de neuronas motoras en un roedor como se divulga en el presente documento puede ser similar a, por ejemplo, no significativamente mayor o menor que, el número de neuronas motoras en un roedor tipo silvestre. Las neuronas motoras de un roedor como se divulga en el presente documento pueden presentar estrés oxidativo incrementado en comparación con una motora de un roedor tipo silvestre.

En un aspecto, un roedor como se describe en el presente documento es una rata o un ratón. En algunas realizaciones, el roedor es un ratón de una cepa seleccionada del grupo que consiste en una cepa 129, una cepa C57BL/6, y una cepa C57BL/6 x 129 mezclada.

En el presente documento se proporciona un tejido o célula, por ejemplo, una célula madre embrionaria, una neurona motora, etc., aislado o derivado de un roedor descrito en el presente documento, por ejemplo, que se examina histológicamente y/o se cultiva.

También se divulgan métodos que comprenden cultivar una célula o una población de células aislada de un roedor descrito en el presente documento, los cuales pueden dar como resultado, por ejemplo, neuronas motoras útiles para la manipulación in vitro. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos de producción de una población de neuronas motoras que presentan estrés oxidativo incrementado en comparación con las neuronas motoras control, comprendiendo el método establecer cuerpos embrioides derivados del roedor proporcionado en el presente documento y diferenciar los cuerpos embrioides dentro de las neuronas motoras. En algunas realizaciones, los cuerpos embrioides se desarrollan a partir de células madre embrionarias de la masa interna. En algunas realizaciones, las células madre embrionarias de la masa interna se aíslan y se cultivan, por ejemplo, en medio de célula madre embrionaria (ESM: DMEM 15 % de Suero fetal bovino Penicilina/Estreptomicina Glutamina Aminoácidos no esenciales nucleósidos p-mercaptoetanol Piruvato de sodio LIF) durante 2 días, para formar cuerpos embrioides. Los cuerpos embrioides pueden cultivarse posteriormente en medio de diferenciación (DMEM avanzado/F 12 Medio neurobasal 10 % de Suero de inactivación Penicilina/Estreptomicina Glutamina p-mercaptoetanol) por ejemplo, durante 1-3 días, por ejemplo, 2 días antes del cultivo adicional en ácido retinoico y agonistas de smoothened, por ejemplo, durante 5 días. Las neuronas motoras diferenciadas desarrolladas de las células madre embrionarias de la masa interna aisladas de un roedor proporcionado en el presente documento pueden madurarse, por ejemplo, en medio de neurona motora derivada de célula madre embrionaria (ESMN: Medio neurobasal 2 % de Suero de caballo B27 Glutamina Penicilina/Estreptomicina p-mercaptoetanol 10 ng/ml de GDNF, BDNF, CNTF) para formar líneas celulares de neurona motora estables que presentan estrés oxidativo incrementado en comparación con las neuronas motoras desarrolladas de roedores que no comprenden el alelo DR6 modificado y/o el ácido nucleico.

Métodos de determinación de si el agente previene, inhibe, retrasa y/o revierte al menos uno de los síntomas similares a ELA en el roedor en comparación con los roedores control pueden comprender examinar tejido y/o una célula aislada del roedor, por ejemplo, análisis del tejido y/o la célula para entender la microanatomía, la función y la estructura del tejido y/o la célula, por ejemplo, por histoquímica; técnicas microscópicas celulares, de tejido y/u órgano, y/o evaluación de la expresión de proteínas, por ejemplo, proteína de unión a mielina (MBP), receptor del factor de crecimiento nervioso (NGFR), colina acetiltransferasa (Chat), Mnx homeobox, subunidad 3B del receptor (Grin3b) del glutamato [NMDA], y receptor 2 (Gria2) del glutamato. La célula evaluada puede ser una neurona, una célula glial, o una combinación de las mismas. El tejido evaluado puede ser el cerebro y/o la médula espinal. Métodos de determinación de si el agente previene, inhibe, retrasa y/o revierte al menos uno de los síntomas similares a ELA en el roedor en comparación con los roedores control pueden también incluir puntuación neurológica ALS-TDI subjetiva, ensayo de rotarod, ensayo de pasarela, ensayo en campo abierto, medición de peso, y/o determinación de la latencia de respuesta a un estímulo doloroso.

El al menos un síntoma ensayado puede ser indicativo de una disfunción de neurona motora superior, por ejemplo, el al menos un síntoma se selecciona del grupo que consiste en temblores, parálisis espástica (rigidez), reflejos anormales, y una combinación de los mismos. El al menos un síntoma ensayado puede ser indicativo de una disfunción de neurona motora inferior, por ejemplo, el al menos un síntoma puede seleccionarse del grupo que consiste en debilidad y desgaste muscular, fasciculaciones, y una combinación de los mismos. El al menos un síntoma evaluado puede ser el aumento de peso reducido. La al menos una función ensayada puede ser nocicepción disminuida.

En el presente documento se describe un vector de direccionamiento que comprende (a) un brazo de direccionamiento 5' y un brazo de direccionamiento 3', en el que los brazos de direccionamiento 5' y 3' dirigen el vector para inserción en un locus de DR6 endógeno en dirección 3' de la secuencia de péptido señal de DR6 endógeno, (b) un casete de selección y (c) una secuencia codificante del dominio transmembrana. La secuencia codificante del dominio transmembrana puede codificar un dominio transmembrana de ROR1. La secuencia codificante del dominio transmembrana está unida operativamente a un gen indicador. El casete de selección puede comprender un gen indicador, un gen de resistencia a fármacos o una combinación de los mismos. El casete de selección puede comprender un gen de neomicina fosfotransferasa. El vector de direccionamiento puede no comprender un casete de selección. Un vector de direccionamiento puede comprender una secuencia expuesta como SEQ ID NO:5.

En el presente documento se divulgan células de roedor que comprenden un vector de direccionamiento como se describe en el presente documento, tal como una célula madre embrionaria, por ejemplo, una célula madre embrionaria murina, por ejemplo, una célula madre embrionaria C57BL/6NTac.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 ilustra una estrategia para la alteración dirigida del locus DR6. El locus DR6 de ratón tipo silvestre se ilustra (no a escala) como la línea superior, que muestra de 5' a 3' una UTR 5' (caja blanca), el codón de inicio (ATG), exones 1-6 (cajas punteadas), un codón de terminación (TAG) y la UTR 3'. Como se muestra, la secuencia señal de ratón endógena se codifica por el exón 1 y parte del exón 2 (-4103 bases desde el codón de inicio), y la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido señal permanece después de la recombinación con un casete Zen-Ub1, el cual se representa (no a escala) como la línea inferior. Como se muestra en la FIG. 1, el vector de direccionamiento ZEN-Ub1 (SEQ ID NO:5) comprende (de 5' a 3') un brazo de homología 5' (brazo 5'; SEQ ID NO:1), una secuencia codificante de dominio transmembrana de ROR1 (TM; SEQ ID NO:7) unida operativamente a un gen indicador LacZ de E. coli (LacZ; SEQ ID NO:8),el cual se une operativamente a una señal de poliadenilación (pA; SEQ ID NO:9). El casete Zen-Ub1 también comprende un casete de selección que comprende un promotor del gen de la ubiquitina C humana (hUB; SEQ ID NO:11) unida operativamente a un gen de resistencia de neomicina fosfotransferasa (Neo; SEQ ID NO:12) unida operativamente a una señal de poliA (pA; SEQ ID NO:13), y el casete de selección está flanqueado por secuencias de ácido nucleico loxP idénticas (SEQ ID NO:10). El brazo de homología 3' del casete Zen-UB1 (brazo 3') se expone como SEQ ID NO:14. Tras la recombinación homóloga, el alelo resultante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia señal de DR6 endógena unida operativamente a la secuencia codificante del dominio transmembrana de ROR1 y el gen indicador LacZ, y la secuencia de ácido nucleico está expuesta como SEQ ID NO:17 y carece de la secuencia genómica endógena entera que empieza desde la base 4103 en el exón 2 hasta el codón de terminación del exón 6, por ejemplo, carece de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio citoplasmático endógeno, un dominio transmembrana y un dominio extracelular.

Las FIG. 2A-2I muestran deterioro motor similar a la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en ratones DR6-/" que progresa rápidamente con el paso del tiempo independientemente del sexo. La FIG. 2A muestra las puntuaciones medias del deterioro motor (eje y) de ratones tipo silvestre y DR6/_ (“■“ ) en diferentes momento (eje x), mientras que la FIG. 2B muestra las puntuaciones medias del deterioro motor de ratones machos (-*-) y hembras DR6 /_ en diferentes momentos (eje x). La FIG. 2C muestra las puntuaciones medias de la rigidez (eje y) de ratones tipo silvestre (-•-'.) y DR6/_ (“■“ ) en diferente momentos (eje x), mientras que la FIG. 2D muestra las puntuaciones medias de rigidez de ratones machos (-A-) y hembras (--•- ') DR6 /_ en diferente momentos (eje x). La FIG. 2E muestra las puntuaciones medias de temblor (eje y) de ratones tipo silvestre (-•-'.) y DR6 /_ (“■“ ) en diferentes momento mientras que la FIG. 2F muestra las puntuaciones medias de temblor de ratones machos (-*-) y hembras (--•--) DR6 /_ en diferente momentos (eje x). La FIG.2G muestra las puntuaciones medias de deterioro motor (eje y) de ratones tipo silvestre(-*-) y DR6 /_ (“■“ ) entre 9 y 21 semanas de vida (eje x). La FIG. 2H muestra las puntuaciones medias de rigidez (eje y) de ratones tipo silvestre (-•-'.) y DR6 /_ (“■“ ) entre 9 y 21 semanas de vida (eje x). La FIG. 2I muestra las puntuaciones medias de temblor de ratones tipo silvestre (-•-'.) y DR6 /_ (“■“ ) entre 9 y 21 semanas (eje x). Para el experimento 1 (FIG. 2A-2F), n=12 para ratones tipo silvestre y n=16 para ratones DR6-/" (n=8 para ratones DR6-/" machos; n=8 para ratones DR6-/" hembras), y en cada momento, los animales tipo silvestre registraron un 0 para cada ensayo. Para el experimento 2 (FIG. 2G-2I), n=14 para ratones tipo silvestre y n=18 para ratones DR6'/_. Todos los datos se presentan como media ± EEM. Se realiza una ANOVA bidireccional para el análisis estadístico que compara los valores de los ratones tipo silvestre con aquellos ratones nuligénicos con * para P < 0,05, ** para P < 0,01, *** para P < 0,001, y **** para P < 0,0001.

Las FIG. 3A-3F muestran fenotipos tipo ALS de ratones DR6-/" que presentan peso reducido y anormalidades motoras significativas. FIG. 3A: Los paneles izquierdo y derecho muestran el peso corporal (eje y; gramos) de ratones tipo silvestre (tnsfr21+/+) y DR6-/" (tnsfr21'/_) el 29 de mayo de 2014, y el 11 de junio de 2014, respectivamente. FIG. 3B: Los paneles derecho e izquierdo muestran respectivamente la latencia máxima y media de caída de un rotarod (eje y; segundos) para ratones tipo silvestre (tnsfr21+/+; barras rayadas) y DR6-/" (tnsfr21'/_; barras sólidas). FIG. 3C: Se muestran la inmovilidad (eje y), los movimientos básicos (eje y), y los movimientos motores finos de ratones tipo silvestre (tnsfr21+/+; barras rayadas) y DR6-/" (tnsfr21'/_; barras sólidas) durante 60 minutos. FIG. 3D: Se muestran las deambulaciones X+Y (eje y) durante una hora para ratones tipo silvestre (tnsfr21+/+; barras rayadas) y DR6-/" (tnsfr21'/_; barras sólidas). FIG. 3E: Los paneles derecho e izquierdo muestran respectivamente la suma de las crías (eje y) y el tiempo de cría total (eje y; segundos) de tipo silvestre (tnsfr21+/+; barras rayadas) y DR6-/" (tnsfr21'/_; barras sólidas). FIG. 3F: Los paneles derecho e izquierdo muestran respectivamente la distancia total recorrida y el tiempo de descanso total (eje y; suma de 60 minutos) de tipo silvestre (tnsfr21+/+; barras rayadas) y DR6-/" (tnsfr21'/_; barras sólidas). * (p<0.05) indica las diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos.

Las FIG. 4A-C muestran (A) el peso corporal medio (eje y; peso en gramos) (B) la latencia media de caída de un rotarod (eje y; segundos) y (C) tiempo máximo de caída de un rotarod (eje y; segundo) de ratones tipo silvestre ( n=14) y DR6 /_ (-■-; n=18) (eje x) a 9 a 21 semanas de vida. El tiempo máximo pasado en el rotarod fue de 180 segundos. Todos los datos se presentan como media ± EEM. Se realiza una ANOVA bidireccional para el análisis estadístico que compara los valores de los ratones tipo silvestre con aquellos ratones nuligénicos con * para P < 0,05, ** para P < 0,01, *** para P < 0,001, y **** para P < 0,0001.

Las FIG. 5A-H muestran el comportamiento locomotor en campo abierto de ratones tipo silvestre y DR6-/", por ejemplo, la distancia total (FIG. 5^a), la inmovilidad (FIG. 5B), el tiempo de cría total (FIG. 5C), los movimientos básicos (FIG. 5D), los movimientos finos (FIG. 5E), la deambulación X+Y (FIG. 5F), el descanso total(FIG. 5G), y la cría (FIG. 5H) durante una hora de animales tipo silvestre ( -• - ; n=14) y DR6 /_ (nuligénicos; n=16) entre 10 21 semanas de vida. Todos los datos se presentan como media ± EEM. Se realiza una ANOVA bidireccional para el análisis estadístico que compara los valores de los ratones tipo silvestre con aquellos ratones nuligénicos con * para P < 0,05, ** para P < 0,01, *** para P < 0,001, y **** para P < 0,0001.

Las FIG. 6A-F muestran el comportamiento en pasarela, por ejemplo, coordinación entre extremidades (FIG. 6A), presión de pata (FIG. 6B), área de huella de pata (FIG. 6C), longitud de paso (FIG. 6D), fase de apoyo (FIG. 6E), fase de balanceo (FIG. 6F), velocidad de balanceo (FIG.6G), y ciclo de trabajo (FIG. 6H) de animales tipo silvestre (-•-'.; n=14) y DR6 /_ (nuligénicos; n=18) entre 10-21 semanas de vida. Todos los datos se presentan como media ± EEM. Se realiza una ANOVA bidireccional para el análisis estadístico que compara los valores de los ratones tipo silvestre con aquellos ratones nuligénicos con * para P < 0,05, ** para P < 0,01, *** para P < 0,001, y **** para P < 0,0001.

Las FIG. 7A-G muestran la capacidad de dar un paso de las patas delanteras y traseras de animales tipo silvestre (•, n=14) y DR6-/-(■; n=18) entre 9 y 21 semanas de vida (eje x). La FIG. 7A proporciona las presiones de pata de las extremidades anteriores y posteriores medias. La FIG. 7B proporciona las áreas de huella de pata de las extremidades anteriores y posteriores medias. La FIG. 7C proporciona las longitudes de paso de las extremidades anteriores y posteriores medias. La FIG. 7D proporciona las fases de apoyo de las extremidades anteriores y posteriores medias. La FIG. 7E proporciona las velocidades de balanceo de las extremidades anteriores y posteriores medias. La FIG. 7F proporciona fases de balanceo de las extremidades anteriores y posteriores medias. La FIG. 7G proporciona los ciclos de trabajo de las extremidades anteriores y posteriores medios. Todos los datos se presentan como media ± EEM. Se realiza una ANOVA bidireccional para el análisis estadístico que compara los valores de los ratones tipo silvestre con aquellos ratones nuligénicos con * para P < 0,05, ** para P < 0,01, *** para P < 0,001, y **** para P < 0,0001

La FIG. 8 muestra la puntuación neurológica, por ejemplo, puntuación de deterioro motor, puntuación de temblor, y puntuación de rigidez, de animales tipo silvestre y DR6 /_ (nuligénicos; “■“ ) entre 10-21 semanas de vida. Todos los datos se presentan como media ± EEM. Se realiza una ANOVA bidireccional para el análisis estadístico que compara los valores de los ratones tipo silvestre con aquellos ratones nuligénicos con * para P < 0,05, ** para P < 0,01, *** para P < 0,001, y **** para P < 0,0001

La FIG. 9 muestra en el panel superior un portaobjetos representativo de un cerebro aislado de un animal tipo silvestre (izquierda) o DR6-/-(derecha) e inmunoteñido con hematoxilina y eosina. También se muestran en el panel inferior el número de neuronas motoras en las médulas espinales (eje y; número medio de neuronas motoras) de animales tipo silvestre (barra izquierda) o DR6-/-(nuligénicos; barra derecha).

La FIG. 10 muestra el nivel de ARNm (nivel de ARNm medio relativo a p-actina; ejes y) de MBP (paneles superiores) o NGFR (paneles inferiores) en las médulas espinales (paneles izquierdos) y los cerebros (paneles derechos) de animales tipo silvestre (barras izquierdas) o DR6-/" (nuligénicos; barras derechas).

La FIG. 11 muestra el nivel de ARNm (nivel de ARNm medio relativo a p-actina; ejes y) de Chat (paneles superiores) o Mnx (paneles inferiores) en las médulas espinales (paneles izquierdos) y los cerebros (paneles derechos) de animales tipo silvestre (barras izquierdas) o d R6-/" (nuligénicos; barras derechas).

La FIG. 12 muestra el nivel de ARNm (nivel de ARNm medio relativo a p-actina; ejes y) de Grin3b (paneles superiores) o Gria2 (paneles inferiores) en las médulas espinales (paneles izquierdos) y los cerebros (paneles derechos) de animales tipo silvestre (barras izquierdas) o d R6'/_ (nuligénicos; barras derechas).

La FIG. 13 muestra el número de células diferentes como porcentaje de células parentales (% de parental; eje y) obtenidas del timo, el bazo o la periferia de ratones tipo silvestre (WT; eje x) o d R6'/_ (KO; eje x).

La FIG. 14 muestra el número de células diferentes como porcentaje de células parentales (% de parental; eje y) obtenidas del timo, el bazo o la periferia de ratones tipo silvestre (WT; eje x) o ^dR6'/_ (KO; eje).

La FIG. 15 muestra la concentración (concentración observada media; eje y) de citocinas o quimiocinas diferentes (eje x) en el suero de animales tipo silvestre (n=6; barras negras) o DR6'/_ (n=6; barras grises).

La FIG. 16A muestra el número de células vivas (eje y) obtenidas después del cultivo de neuronas motoras derivadas de célula madre embrionaria obtenidas de animales tipo silvestre (DR6+/+; barra negra; eje) y animales DR6+/-(DR6+/-; barra cuadriculada; eje x). La FIG. 16B muestra el estrés oxidativo (densidad óptica media; eje y) de neuronas motoras derivadas de célula madre embrionaria obtenidas de animales tipo silvestre (DR6+/+; barras negras) y heterocigóticos (DR6+/-; barras cuadriculadas) el día 1 o día 7 (eje x) en medio de neurona motora derivada de célula madre embrionaria (ESMN). **** para P < 0,0001.

La FIG. 17A muestra la puntuación neurológica, por ejemplo, puntuación de deterioro motor, puntuación de temblor, y puntuación de rigidez, de animales tipo silvestre n = 27), DR6+/_ heterocigóticos n=14), y DR6/_ homocigóticos (-A-; n=33) entre 10-21 semanas de vida. La FIG. 17B muestra el peso corporal medio (eje y; peso en gramos) de animales tipo silvestre (-•-'.; n = 27), DR6+/_ heterocigóticos (“■“ ; n=14), y DR6 /_ homocigóticos (-*-; n=33) entre 10-21 semanas de vida. El panel superior de la FIG. 17C muestra la latencia media de animales tipo silvestre (-•-'.; n = 13), DR6+/_ heterocigóticos (-■-; n=14), y DR6 /_ homocigóticos (-A-; n=15) de caída de un rotarod (eje y; segundos); el panel inferior muestra el tiempo máximo de animales tipo silvestre ( -• - ; n = 13), DR6+/_ heterocigóticos (-■-; n=14), y DR6 /_ homocigóticos (-A-; n=15) de caída de un rotarod (eje y; segundo) a 12 a 21 semanas de vida. El tiempo máximo pasado en el rotarod fue de 180 segundos. Las FIG. 17D-17K muestran el comportamiento locomotor en campo abierto de ratones tipo silvestre, DR6+/- heterocigóticos y DR6'/_ homocigóticos, por ejemplo, cría (FIG. 17D), tiempo de cría total (FIG. 17E), movimientos básicos (FIG. 17F), inmovilidad (FIG. 17(3), movimientos finos (FIG. 17H), deambulación X+Y (FIG. 171), distancia total (FIG. 17J), y descanso total (FIG. 17K) durante una hora para animales tipo silvestre (-•-'.; n = 27), DR6+/_ heterocigóticos (-■-; n=14), y DR6/_ homocigóticos (-A-; n=33) entre 10-21 semanas de vida. Las FIG. 17L-17Z muestran el comportamiento en pasarela, por ejemplo, longitud de paso (FIG. 17L y 17M), velocidad de balanceo (FIG. 17N y 17O), coordinación entre extremidades (FIG. 17P), fase de balanceo (FIG. 17Q y 17R), ciclo de trabajo (FIG. 17S y 17T),área de huella de pata (FIG. 17U y 17V), fase de apoyo (FIG. 17W y 17X), y presión de pata (FIG. 17Y y 17Z) de animales tipo silvestre (-•-'.; n = 27), DR6+/_ heterocigóticos (“■“ ; n=14), y DR6 /_ homocigóticos (-A-; n=33) entre 10-21 semanas de vida. Todos los datos se presentan como media ± EEM. Se realiza una ANOVA bidireccional para el análisis estadístico que compara los valores de los ratones tipo silvestre con aquellos ratones nuligénicos con * para P < 0,05, ** para P < 0,01, *** para P < 0,001, y **** para P < 0,0001.

La FIG 18 muestra la latencia de una respuesta nociceptiva (tiempo; eje y) de animales tipo silvestre (barras izquierdas; n = 13), DR6+/_ heterocigóticos (barras del medio; n=14), y DR6'/_ homocigóticos (barras derechas; n=15) sometidos a un placa de metal calentada a una temperatura constante de 48 °C, 52 °C o 55 °C. Todos los datos se presentan como media ± EEM. Se realiza una ANOVA bidireccional para el análisis estadístico que compara los valores de los ratones tipo silvestre con aquellos ratones nuligénicos con * para P < 0,05, ** para P < 0,01, *** para P < 0,001, y **** para P < 0,0001.

Descripción

La esclerosis lateral amiotrófica ("ELA"), también denominada enfermedad de Lou Gehrig, es una enfermedad neurológica mortal progresiva que afecta tantos como 20.000 estadounidenses y se dan 5.000 nuevos casos en los Estados Unidos cada año. El trastorno pertenece a una clase de trastornos conocidos como enfermedades de las neuronas motoras. ELA se da cuando las células nerviosas específicas en el cerebro y la médula espinal que controlan el movimiento voluntario degeneran gradualmente. Tanto el cerebro como la médula espinal pierden la capacidad de iniciar y enviar mensajes a los músculos en el cuerpo. Los músculos, los cuales son incapaces de funcionar, gradualmente se atrofian y contraen.

La ELA se manifiesta por sí misma de diferentes maneras, dependiendo de qué músculos se debilita primero. Los síntomas pueden incluir tropezones y caídas, pérdida de control motor en manos y brazos, dificultad al hablar, al tragar y/o al respirar, fatiga persistente, y tirones y calambres, algunas veces bastantes graves. Finalmente, cuando los músculos en el diafragma y la pared del pecho llegan a ser débiles, los pacientes requieren de un ventilador para respirar. La mayoría de las personas con ELA mueren de insuficiencia respiratoria, normalmente 3 a 5 años después de ser diagnosticados; sin embargo, algunas personas sobreviven 10 o más años después del diagnóstico. ELA sobreviene en la mediana edad. Los hombres tienen aproximadamente una vez y media más de probabilidades de padecer la enfermedad que las mujeres.

No hay cura para ELA, ni hay una terapia probada que preverá el transcurso de la enfermedad. La "Food and Drug Administration" (FDA) recientemente aprobó riluzol, el primer fármaco que se ha mostrado que prolonga la supervivencia de los pacientes de ELA. Los pacientes también pueden recibir tratamientos de apoyo que abordan algunos de sus síntomas.

Las técnicas y los procedimientos descritos o referenciados en el presente documento generalmente son bien entendidos y habitualmente empleados usando metodología convencional por los expertos en la materia, tal como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2a Edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Según sea adecuado, los procedimientos que implican el uso de kits y reactivos disponibles en el mercado generalmente se llevan a cabo de acuerdo con los protocolos y/o parámetros del fabricante salvo que se indique lo contrario.

Antes de describir los presentes métodos y ensayos, debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos, líneas celulares, especie o género animal, construcciones, y reactivos particulares descritos ya que tales pueden, por supuesto, variar. Se debe indicar que las formas singulares "un", "y" y "el/la" incluyen las referencias en plural salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una alteración genética" incluye una pluralidad de dichas alteraciones y la referencia a "una sonda" incluye la referencia a una o más sondas y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la materia, etc. Todos los números citados en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones asociadas (por ejemplo, aminoácidos 22-81, 1-354 etc.,) se entiende que están modificados por el término "aproximadamente".

Las publicaciones citadas en el presente documento se citan para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo aquí expuesto debe interpretarse como una admisión de que los inventores no tienen derecho a antedatar las publicaciones en virtud de una fecha de prioridad previa o una fecha anterior de invención. Además, las fechas reales de publicación pueden ser diferentes de las indicadas y requieren una verificación independiente.

Definiciones

El término "célula madre embrionaria" o "célula ES" incluye una célula totipotente o pluripotente derivada de embrión que es capaz de contribuir en el desarrollo embrionario de cualquier tejido tras la introducción en un embrión. El término "célula pluripotente" incluye una célula no diferenciada que posee la capacidad de desarrollarse en más de un tipo celular diferenciado.

Algunos vectores de direccionamiento son "vectores de direccionamiento grandes"o" LTVEC", que incluye grandes vectores de direccionamiento para las células eucariotas que comprenden brazos de homología que corresponden y se derivan de secuencias de ácido nucleico mayores que aquellas normalmente usadas por otras estrategias destinadas a realizar modificaciones dirigidas del gen homólogo en células eucariotas. Ejemplos de LTVEC, incluyen, pero sin limitación, cromosoma homólogo bacteriano (BAC) y cromosoma artificial de levadura (YAC). Ejemplos de generación de modificaciones genéticas dirigidas usando LTVEC se describen, por ejemplo, en los documentos WO 2015/088643, US 2015/0159175, US 2015/0159174, US 2014/0310828, US 2014/0309487, y US 2013-0309670. Los LTVEC también incluyen vectores de direccionamiento que comprenden insertos de ácido nucleico que tienen secuencias de ácido nucleico más grandes que las usadas normalmente por otras estrategias destinadas a realizar recombinación homóloga en células. Por ejemplo, los LTVEC hacen posible la modificación de grandes loci que no pueden ser alojados por los vectores de direccionamiento tradicionales basados en plásmidos debido a sus limitaciones de tamaño. Por ejemplo, un locus dirigido puede ser (es decir, los brazos de homología 5' y 3' pueden corresponder a) un locus de la célula que no se puede someter a modificación dirigida usando un método convencional o que puede ser modificado únicamente de forma incorrecta o únicamente con una eficacia significativamente baja en ausencia de una muesca o rotura de doble hebra inducida por un agente nucleasa (por ejemplo, Proteína Cas).

Ejemplos de LTVEC incluyen vectores derivados de un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial humano, o un cromosoma artificial de levadura (YAC). Ejemplos no limitativos de LTVEC y métodos para producirlos se describen, por ejemplo, en la Patente de EE.Uu . N.° 6.586.251; la Patente de EE.UU. N.° 6.596.541; la Patente de EE.UU. N.° 7.105.348; y/o el documento WO/2002/036789 (PCT/US01/45375). Los LTVEC pueden tener forma lineal o circular.

Los LTVEC pueden tener cualquier longitud, incluyendo, por ejemplo, al menos 10 kb o de aproximadamente 50 kb a aproximadamente 400 kb o más. El tamaño de un LTVEC puede ser demasiado grande para permitir el cribado de eventos de direccionamiento mediante ensayos convencionales, por ejemplo, transferencia Southern y PCR de largo alcance (por ejemplo, 1 kb a 5 kb). La suma total del brazo de homología 5' y el brazo de homología 3' puede ser, por ejemplo, al menos 10 kb (cada brazo de homología puede oscilar, por ejemplo, de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 200 kb). El LTVEC y el inserto de ácido nucleico pueden estar diseñados para permitir una deleción en el locus diana de una longitud, por ejemplo, de 5 aproximadamente kb a aproximadamente 3 kb (por ejemplo, aproximadamente 500 kb o más). Asimismo, el LTVEC y el inserto de ácido nucleico pueden estar diseñados para permitir una inserción en el locus diana de una secuencia de ácido nucleico exógena de una longitud, por ejemplo, que oscila de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 400 kb o más.

El término "sitio recombinante" incluye una secuencia de nucleótidos que es reconocida por una recombinasa específica de sitio y que puede servir como sustrato para un evento de recombinación.

El término "recombinasa específica de sitio" incluye un grupo de enzimas que pueden facilitar la recombinación entre "sitios de recombinación". Ejemplos de "recombinasa de sitio específico" incluyen, pero sin limitación, recombinasas Cre, Flp, y Dre.

El término "línea germinal" en referencia a una secuencia de ácido nucleico incluye una secuencia de ácido nucleico que se puede pasar a la progenie.

La expresión "unido operativamente" significa que los componentes están unidos para funcionar juntos en su manera prevista. Una secuencia del ácido nucleico que codifica una proteína puede estar unida operativamente a secuencias reguladoras (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencia silenciadora, etc.) con el fin de conservar la regulación transcripcional adecuada. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal puede estar unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica, por ejemplo, un dominio transmembrana, con el fin de traducirse en un polipéptido que comprende el péptido señal fusionado operativamente al domino transmembrana, en el que tanto el péptido señal como el dominio transmembrana conservan sus respectivas funciones biológicas.

El término "locus" se define como un segmento de ADN dentro del ADN genómico. Por ejemplo, un locus de DR6 es un segmento de ADN dentro del ADN genómico que codifica DR6, e incluye ADN no traducido y/o regulador implicado con la expresión de DR6.

El miembro de la familia TNFR denominado Receptor de Muerte 6 (DR6) (también referido en la bibliografía como "TR9"; también conocido en la bibliografía como miembro 21 de la superfamilia del receptor de TNF o TNFRS21) se ha descrito como un receptor transmembrana tipo I que tiene cuatro motivos ricos en cisteína extracelulares y una estructura dominio de muerte citoplasmática (Pan et al., FEBS Lett., 431:351-356 (1998); véase también las Patentes de EE.UU. N.° 6.358.508; 6.667.390; 6.919.078; 6.949.358). Se ha publicado que la sobreexpresión de DR6 en ciertas líneas celulares transfectadas daban como resultado apoptosis y activación de tanto NF-kB como JNK (Pan et al., FEBS Letters, 431:351-356 (1998)). En un modelo de ratón deficiente en DR6, los linfocitos T estaban sustancialmente dañados en la activación de JNK, y cuando los ratones DR6 (-/-) se expusieron a antígeno proteico, se encontró que sus linfocitos T hiperproliferaban y mostraban una polarización profunda hacia una respuesta Th2 (mientras que la diferenciación de Th1 no estaba equivalentemente afectada) Zhao et al., J. Exp. Med., 194:1441-1448 (2001)). Además se publicó que la alteración dirigida de DR6 daba como resultado diferenciación aumentada de linfocito T auxiliar 2 (Th2) in vitro(Zhao et al., supra). Se describieron diferentes usos de agonistas o antagonistas de DR6 en la modulación de afecciones mediadas por linfocitos B o neurológicas en el documento US 2005/0069540 publicado el 31 de marzo de 2005 y el documento U^s2010/0203044 publicado el 12 de agosto de 2010.

El locus del receptor DR6 murino se encuentra en el cromosoma 17 y tiene 6 exones. Codifica una proteína de 655 aminoácidos (SEQ ID NO:16) que tiene una secuencia señal putativa (aminoácidos 1-41), un dominio extracelular (aminoácidos 42-349), un dominio transmembrana (aminoácidos 350-370), seguido de un dominio citoplasmático (aminoácidos 370-655). Una proteína DR6 madura se refiere al polipéptido traducido después de la escisión de su proteína señal, por ejemplo, una proteína DR6 murina madura se refiere a los aminoácidos 42-655 de la SEQ ID NO:16.

En la Tabla 1 a continuación se proporciona una breve descripción de las secuencias identificadas por número de secuencia.

Tabla 2. Descri ción de Secuencias.

I. Composiciones que comprenden modificación genética de al menos un locus de DR6

Se proporcionan células de roedores que comprenden un locus de DR6 modificado, que carece de una secuencia de nucleótidos que codifica cualquier parte de un dominio citoplasmático DR6 endógeno y además comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de DR6, un dominio transmembrana y/o una proteína indicadora como se define en las reivindicaciones. Aunque la siguiente descripción es con referencia a una supervivencia de ciertos DR6 particulares, los métodos y las composiciones se pueden poner en práctica con cualquier DR6.

La expresión, "pérdida de función" cuando se refiere a un DR6 puede incluir cualquier modificación en un locus de DR6 y/o expresión de un transgén que da como resultado una reducción o falta de expresión del DR6 y/o una reducción o falta de actividad/función del d R6. El nivel de expresión de un DR6 se puede medir directamente, por ejemplo, evaluando el nivel de DR6 en la célula u organismo.

En general, el nivel de expresión y/o actividad del DR6 se reduce si el nivel de expresión de DR6 y/o el nivel de actividad del DR6 es estadísticamente más bajo (p<0,05) que el nivel de DR6 en una célula u organismo control apropiado que no se ha modificado genéticamente o sometido a mutación para inhibir la expresión y/o la actividad del DR6. La concentración y/o la actividad del DR6 se puede reducir en al menos un 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más en relación con una célula u organismo control que no se ha modificado para tener el nivel y/o la actividad reducida del DR6.

Las células de roedor que tienen la modificación genética dirigida que reduce el nivel de expresión y/o la actividad del DR6 se pueden seleccionar usando métodos que incluyen, pero sin limitación, análisis de transferencia Southern, secuenciación de ADN, análisis por PCR, o análisis fenotípico. A continuación, dichas células se pueden emplear en los diferentes métodos y composiciones descritos en el presente documento.

Una "célula sujeto" u "organismo sujeto" es aquel que ha sido afectado por una alteración genética, tal como una modificación genética divulgada en el presente documento, o es una célula/organismo que desciende de una célula/organismo así alterada y que comprende la alteración. Un "control" o "célula control" u "organismo control" proporciona un punto de referencia para medir los cambios en el fenotipo de la célula u organismo sujeto. Una célula/organismo control puede estar tan cercanamente emparejada como sea posible con la célula/organismo con la modificación genética en el DR6 excepto que carece de la modificación genética o mutación dando como resultado la expresión y/o la actividad reducida (por ejemplo, las respectivas células pueden originarse de la misma línea celular). La célula/organismo control puede comprender, por ejemplo: (a) una célula/organismo tipo silvestre, es decir, del mismo genotipo que el material de partida para la alteración genética que dio como resultado la célula/organismo sujeto; (b) una célula/organismo del mismo genotipo que el material de partida pero que se ha modificado genéticamente con una construcción nula (es decir, con una construcción que no tiene efecto conocido sobre el rasgo de interés, tal como una construcción que comprende un gen marcador); (c) una célula/organismo que es una progenie no genéticamente modificada de una célula/organismo sujeto (es decir, la célula control y la célula sujeto se originan de la misma línea celular); (d) una célula/organismo genéticamente idéntica a la célula/organismo sujeto pero que no se expone a las condiciones o estímulos que inducirían la expresión del gen de interés; o (e) la propia célula/organismo sujeto, bajo condiciones en las que la modificación genética no da como resultado una alteración en la expresión del polinucleotídico de interés.

El término "animal", en referencia a animales, células, tejidos o embriones, incluye mamíferos, peces, y pájaros. Los mamíferos incluyen, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, mono, simios, gato, perro, caballo, toro, ciervo, bisonte, oveja, roedores (por ejemplo, ratones, ratas, hámsteres, cobayas), ganado (por ejemplo, especies bovinas, por ejemplo, vaca, novillo, etc.; especies ovinas, por ejemplo, oveja, cabras, etc.; y especies porcinas, por ejemplo, cerdos y jabalíes). Pájaros incluyen, por ejemplo, pollos, pavos, avestruces, gansos, patos, etc. También se incluyen animales domesticados y animales agrícolas. La expresión "animal no humano", en referencia a animales, células, tejidos o embriones, excluye seres humanos.

En todas las realizaciones, el animal no humano es un roedor. En una realización adicional, el roedor es un ratón, una rata o un hámster. En una realización adicional, el roedor es un ratón o una rata. En algunas realizaciones, el roedor es un ratón.

Modificaciones genéticas como se describen en el presente documento pueden incluir una o más deleciones de un locus de DR6, adiciones a un locus de DR6, reemplazo de un locus de DR6 o una parte del mismo, y/o cualquier combinación de los mismos. El locus puede comprender regiones codificantes o regiones reguladoras no codificantes. Una modificación genética como se describe en el presente documento también puede incluir inserción de un transgén en el genoma fuera del locus de DR6, en el que la expresión del transgén interfiere con, por ejemplo, compite con, la proteína DR6 endógena por la unión a ligando, colocación en la membrana celular, etc.

Las modificaciones genéticas proporcionadas en el presente documento pueden estar dirigidas a un locus de DR6. Una pérdida de función de DR6 puede resultar de una modificación genética dirigida en el gen de DR6 (es decir, una modificación genética en una región reguladora, la región codificante, exones, y/o intrones, etc.). Dichas modificaciones dirigidas incluyen, pero sin limitación, adiciones de uno o más nucleótidos, deleciones de uno o más nucleótidos, sustituciones de uno o más nucleótidos, una alteración del locus de DR6, una inactivación del locus de DR6 o una parte del mismo, una sustitución del locus de DR6 o una parte del mismo, un reemplazo de una secuencia de ácido nucleico de DR6 endógena o una parte de la misma con una secuencia de ácido nucleico heteróloga, o una combinación de los mismos.

La mutación pérdida de función puede caracterizarse por una alteración o una inactivación ("knockout") de al menos una función de DR6.

El locus de DR6 puede modificarse genéticamente en cualquier región del locus de modo que la modificación de como resultado modular la función de DR6. En una realización, la modificación del locus de DR6 comprende una deleción de la región codificante de DR6 entera o una parte de la misma. En una realización, el locus de DR6 modificado comprende una deleción de uno o más exones que codifican la proteína DR6 madura, o una parte de la misma. En otra realización, la deleción comprende una deleción de uno o más exones dentro del locus de DR6 que comienza en un primer, segundo, tercer, cuarto, quinto y sexto exón del locus de DR6. En otras realizaciones, la deleción comprende una deleción de uno o más exones dentro del locus de DR6 que comienza en un segundo exón del locus de DR6.

En algunos casos, el locus de DR6 o una parte del mismo está reemplazado por un ácido nucleico inserto.

El ácido nucleico inserto se coloca en el locus de DR6 de modo que está en unión operativa con un promotor de DR6 endógeno de modo que el promotor de DR6 endógeno conduce a la expresión del ácido nucleico inserto. En estos casos, la expresión de la secuencia de ácido nucleico sigue un patrón de expresión del DR6.

En una realización, el locus de DR6 o parte del mismo está reemplazado por un ácido nucleico inserto que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un indicador. Por ejemplo, en el caso en el que el ácido nucleico inserto comprende un gen indicador y se coloca dentro del locus de DR6 en unión operativa con el promotor de DR6, la expresión del gen indicador está conducida por el promotor de DR6 endógeno.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico inserto puede comprender una secuencia señal de DR6 endógena, por ejemplo, puede estar colocado en el locus de DR6 de modo que está en unión operativa con una secuencia señal de DR6 endógena, y opcionalmente un dominio transmembrana de DR6 endógeno. En estos casos, el destino de alguna(s) proteína(s) (por ejemplo, indicador) codificada(s) por el ácido nucleico inserto, localizada(s) de manera exógena al locus de d R6 o en un locus de DR6 endógeno, es similar al destino de DR6 (por ejemplo, anclado en la membrana, por ejemplo, con un dominio transmembrana endógeno). En una realización, el ácido nucleico inserto puede reemplazar el dominio transmembrana endógeno. En estos y otros casos, el ácido nucleico inserto puede comprender un segundo ácido nucleico que codifica un dominio transmembrana heterólogo. En una realización, el ácido nucleico inserto comprende un gen indicador unido operativamente a un gen del dominio transmembrana heterólogo, y el ácido nucleico inserto se inserta en el gen de DR6 unido operativamente a una secuencia señal de DR6 endógena de modo que la expresión del ácido nucleico inserto está conducida por un promotor de DR6 endógeno y la(s) proteína(s) codificada(s) por el ácido nucleico inserto se anclan en la membrana de acuerdo con la secuencia señal.

En una realización, el locus de DR6 o parte del mismo está reemplazado con un ácido nucleico inserto que comprende una secuencia de ácido nucleico adicional que codifica un marcador seleccionable. En estos casos, la secuencia de ácido nucleico adicional está unida operativamente a un promotor que conduce la expresión del marcador seleccionable.

En otra realización, el locus de DR6 o parte del mismo está reemplazado por un ácido nucleico inserto que comprende un gen transmembrana, un gen indicador y un gen marcador seleccionable.

Diferentes promotores que se pueden emplear en los métodos y las composiciones se proporcionan en otras partes en el presente documento.

Dichas modificaciones genéticas (incluidas las que dan como resultado una reducción o una modulación en la expresión y/o actividad del DR6 diana) son también capaces de transmitirse a través de la línea germinal. Las modificaciones genéticas dan como resultado una inactivación del locus diana deseado. Dichos animales no humanos, por ejemplo, encuentran uso en una diversidad de sistemas experimentales como se han divulgado en otras partes en el presente documento.

Por ejemplo, las inactivaciones de DR6 ofrecen un modelo animal para estudiar la función de DR6, el papel del DR6 en el desarrollo, y el papel del DR6 en diversas rutas celulares y enfermedades, particularmente trastornos de disfunción neuromotora, por ejemplo, ELA.

La modificación genética del locus de DR6 puede ser cualquier modificación del locus como se describe en detalle en otras partes en el presente documento (es decir, deleción, inserción, reemplazo, etc.). En dichos casos la modificación genética da como resultado la pérdida de función de DR6. La modificación genética puede comprender una alteración o una inactivación de DR6.

A. Diseño y construcción de alelo sustitutivo ("knock-in") indicador

Como ejemplo no limitativo, un punto de comienzo de deleción se puede fijar en el segundo exón para permitir que el ácido nucleico inserto se una operativamente a una secuencia señal endógena. La FIG. 1 muestra un ejemplo de una deleción dirigida de toda o la mayor parte de la secuencia que codifica DR6 y el reemplazo por un casete que contiene una secuencia de dominio transmembrana del gen ROR1 (receptor huérfano 1 similar al receptor de la tirosina quinasa), una secuencia del gen lacZ de E. coli que codifica p-galactosidasa y un casete (neor) que expresa neomicina fosfotransferasa para la selección de colonias de célula ES resistentes a G418. Los sitios de reconocimiento de la recombinasa LoxP que posibilitan la escisión medida por Cre antes del análisis fenotípico flanquean el casete de selección de fármaco.

Los vectores de direccionamiento LTVEC se pueden introducir en células ES y se investigan para clones correctamente dirigidos por el ensayo de modificación de alelo (Frendewey, D., et al. (2010), Methods Enzymol 476, 295-307).

Se pueden usar diversos métodos para identificar células que tienen una modificación dirigida, tal como una deleción o una inserción. Dichos métodos pueden comprender identificar una célula que tiene la modificación dirigida en un locus diana. Se puede realizar cribado para identificar dichas células con loci genómicos modificados.

La etapa de cribado puede comprender un ensayo cuantitativo para evaluar la modificación del alelo (MOA) de un cromosoma parental. Por ejemplo, el ensayo cuantitativo puede llevarse a cabo por una PCR cuantitativa, tal como una PCR a tiempo real (qPCR). La PCR a tiempo real puede utilizar un primer conjunto cebador que reconoce el locus diana y un segundo conjunto cebador que reconoce un locus de referencia no dirigido. El conjunto cebador puede comprender una sonda fluorescente que reconoce la secuencia amplificada.

Otros ejemplos de ensayos cuantitativos adecuados incluyen hibridación in situ mediada por fluorescencia (FISH), hibridación genómica comparativa, amplificación isotérmica del ADN, hibridación cuantitativa con una sonda(s) inmovilizada(s), Invader Probes®, MMP assays®, Baliza molecular TaqMan®, o tecnología de sonda Eclipse™ (véase, por ejemplo, el documento US2005/0144655).

El método VelociMouse® (Poueymirou, W.T., et al. (2007), Nat Biotechnol 25, 91-99) puede aplicarse para inyección en fase embrionaria de 8 células para convertir las células ES dirigidas en ratones heterocigóticos de generación F0 derivados completamente de célula ES para el perfil de expresión de lacZ o cría para homocigosidad. Los ratones portadores del casete ZEN-Ub1 se pueden criar para una cepa de ratón con deleción de Cre (véase, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud de Patente Internacional N.° WO 2009/114400) para eliminar cualquier casete neor floxed.

En el Ejemplo 1 del presente documento se proporcionan detalles adicionales de los métodos para generar animales con sustitución de indicadores de DR6.

B. Perfil de expresión del indicador

Como se describe en otras partes del presente documento, la modificación genética del locus de DR6 puede comprender un reemplazo del locus de d R6 o una parte del mismo con un ácido nucleico inserto. En todos los casos, el ácido nucleico inserto comprende un gen indicador. En una realización, el gen indicador está colocado en el locus de DR6 en unión operativa con el promotor de DR6 endógeno. Dicha modificación permite la expresión del gen indicador conducida por el promotor de DR6 endógeno.

Cualquier indicador (o parte detectable) puede usarse en métodos y composiciones bien conocidos. Ejemplos no limitativos de indicadores incluyen, por ejemplo, p-galactosidasa (codificada por el gen lacZ), Proteína fluorescente verde (GFP), Proteína fluorescente verde potenciada (eGFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrina, Venus, YPet, proteína fluorescente amarilla potenciada (EYFP), Emerald, CyPet, proteína fluorescente cian (CFP), Ceruleano, T-Zafiro, luciferasa, fosfatasa alcalina o una combinación de las mismas.

Los métodos y composiciones descritos en el presente documento se pueden realizar con cualquier gen indicador. La siguiente descripción es un ejemplo no limitativo que utiliza un gen indicador lacZ que codifica p-galactosidasa.

C. Fenotipos

La modificación genética del locus de DR6 endógeno puede dar como resultado diferentes fenotipos en los roedores proporcionados en el presente documento. La modificación genética del locus de DR6 endógeno da como resultado animales no humanos que son sumamente normales al nacer, pero que desarrollan síntomas similares a ELA tras envejecer, por ejemplo, después de 1 semana de vida, después de 2 semanas de vida, después de 3 semanas de vida, después de 4 semanas de vida, después de 5 semanas de vida, después de 6 semanas de vida, después de 7 semanas de vida, después de 8 semanas de vida, etc. La modificación genética del locus de DR6 endógeno puede dar como resultado funciones anormales de uno o más tipos celulares, por ejemplo, una neurona y/o una célula glial, y/o una parte de las mismas, por ejemplo, mielina. Una neurona incluye una neurona sensorial, una neurona motora, y todos los otros tipos de neuronas habitualmente denominados interneuronas. La célula glial incluye astrocitos, oligodendrocitos, etc.

La expresión "síntoma similar a ELA" o similares generalmente significará un "síntoma asociado con ELA" o un "síntoma resultante de disfunción de neurona motora superior y/o inferior". Un síntoma similar a ELA puede implicar neuronas deterioradas, por ejemplo, neuronas motoras, neuronas sensoriales, y otras interneuronas. Por ejemplo, un síntoma similar a ELA que implica neuronas motoras superiores puede dar como resultado espasticidad (por ejemplo, parálisis espástica, rigidez madura), reflejos incrementados /o anormales (por ejemplo, señal de Babinski), temblores y una combinación de los mismos. Un síntoma similar a ELA que implica deterioro de las neuronas motoras inferiores puede dar como resultado la debilidad y el desgaste muscular, fasciculaciones y una combinación de los mismos, y/o deterioro bulbar dando como resultado una incapacidad de tragar y fasculaciones en la lengua. Un síntoma similar a ELA también puede comprender uno o más de los siguientes fenotipos: a) cifosis; b) agarrotamiento anormal de las extremidades posteriores, arrastre o curvado de dedo; c) deficiencia en la coordinación motora y capacidad de aprendizaje motor, deficiencia en ensayos de rotarod, de pasarela y/o en campo abierto; d) pérdida de neuronas motoras en la médula espinal; e) astrocitosis en la médula espinal; f) pérdida de peso en comparación con un roedor control; g) acumulación de proteínas poli ubiquitinadas; (h) puntuación neurológica incrementada usando el sistema de puntuación neurológica ALS-TDI y/o (i) latencia incrementada de respuesta a un estímulo doloroso.

Sistema de puntuación neurológica ALS-TDI

Puntuación Extensión completa de las patas posteriores más allá de la línea media lateral cuando el ratón se de 0: suspende por su cola, y el ratón puede mantener esto durante dos segundos, suspendido dos a tres veces.

Puntuación Colapso o colapso parcial de la extensión de pata hacia la línea media lateral (debilidad) o temblor de 1: de las patas posteriores durante la suspensión por la cola.

Puntuación Los dedos se curvan hacia abajo al menos dos veces mientras camina 12 pulgadas (30,48 cm), o de 2: cualquier parte del pie se está arrastrando a lo largo del fondo/tabla de la jaula*.

Puntuación Parálisis rígida o mínimo movimiento de articulación, no se está usando el pie para generar de 3: movimiento hacia delante.

Puntuación El ratón no puede enderezarse por sí mismo en 30 segundos después de colocarlo sobre de 4: cualquier lateral.

II. Métodos para modificar el locus de DR6 endógeno en animales no humanos

En el presente documento se divulgan métodos para modificar genéticamente el locus de DR6 endógeno en células de roedores. Se divulga un método para modificar el locus de DR6 en una célula pluripotente. Dicho método comprende (a) introducir en la célula pluripotente una construcción de direccionamiento que comprende un ácido nucleico inserto flanqueado con brazos de homología 5' y 3' que pueden experimentar recombinación homóloga con el locus de DR6; y (b) identificar una célula pluripotente modificada que comprenda una modificación genética dirigida en el locus de DR6. En dichos métodos, la modificación genética da como resultado la pérdida de función del DR6. La célula pluripotente puede ser una célula madre embrionaria de roedor.

A. Vectores de direccionamiento y ácidos nucleicos insertos

Además se divulgan vectores de direccionamiento o construcciones de direccionamiento para emplearse en los métodos para la producción de las células de roedor genéticamente modificadas proporcionadas en el presente documento.

Un vector de direccionamiento puede comprender un ácido nucleico inserto flanqueado por los brazos de homología 5' y 3' que pueden experimentar recombinación homóloga con un locus de DR6.

Los vectores de direccionamiento y los ejemplos de los componentes de los vectores de direccionamiento (es decir, ácidos nucleicos insertos, polinucleótidos de interés, casetes de expresión, etc.) se describen a continuación en detalle en el presente documento.

i. Ácido nucleico inserto

El "ácido nucleico inserto"o "polinucleótido inserto" comprende un segmento del ADN que se desea integrar en el locus diana. Un casete de expresión dado puede comprender un polinucleótido de interés, un polinucleótido que codifica un marcador de selección y/o un gen indicador junto con los diferentes componentes reguladores que influyen en la expresión.

Cualquier polinucleótido de interés puede estar contenido en los diferentes polinucleótidos insertos y de ese modo integrado en el locus genómico diana. Los métodos divulgados en el presente documento, proporcionan al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más polinucleótidos de interés para ser integrados en el locus genómico de DR6 dirigido.

El polinucleótido de interés puede estar flanqueado por sitios de recombinación específicos de sitio.

Ejemplos no limitativos de polinucleótidos de interés, incluyendo los marcadores de selección y los genes indicadores que se pueden incluir dentro del ácido nucleico inserto se discuten en detalle en otras partes del presente documento.

El polinucleótido de interés dentro del polinucleótido inserto cuando se integra en el locus de DR6 diana puede introducir una o más modificaciones dentro de la célula. La modificación genética puede comprender una deleción de una secuencia de ácido nucleico endógena y/o la adición de un polinucleótido exógeno o heterólogo u ortólogo dentro del locus genómico diana. La modificación genética puede comprender un reemplazo de una secuencia de ácido nucleico endógena con un polinucleótido exógeno de interés en el locus genómico diana. Por tanto, los métodos permiten la generación de una modificación genética comprendiendo una inactivación, una deleción, una inserción, una sustitución ("knock-in"), una mutación puntual, un intercambio de dominio, un intercambio de exón, un intercambio de intrón, un intercambio de secuencia reguladora, un intercambio de gen, o una combinación de los mismos en un locus de DR6 diana. Dichas modificaciones pueden darse tras la integración del primer, segundo, tercer, cuarto, quinto, sexto, séptimo, o algún polinucleótido inserto posterior en el locus genómico diana.

El polinucleótido de interés dentro del polinucleótido inserto y/o integrado en el locus genómico diana puede comprender una secuencia que es natural de u homóloga de la célula en la que se introduce; el polinucleótido de interés puede ser heterólogo a la célula en la que se introduce; el polinucleótido de interés puede ser exógeno a la célula en la que se introduce; el polinucleótido de interés puede ser ortólogo a la célula en la que se introduce; o el polinucleótido de interés puede ser de una especie diferente de la célula en la que se introduce. El término "homólogo" en referencia a una secuencia es una secuencia que es natural de la célula. El término "heterólogo" en referencia a una secuencia es una secuencia que se origina a partir de una especie extraña, o, si es de la misma especie, está sustancialmente modificada con respecto a su forma natural en cuanto a su composición y/o locus genómico mediante intervención humana deliberada. El término "exógeno " en referencia a una secuencia es una secuencia que se origina a partir de una especie extraña. El término "ortólogo" es un polinucleótido de una especie que es funcionalmente equivalente a una secuencia de referencia conocida en otra especie (es decir, una variante de especie). El polinucleótido de interés puede ser de cualquier organismo de interés incluyendo, pero sin limitación, un procariota, un eucariota, un no ser humano, un roedor, un hámster, un ratón, una rata, un ser humano, un mono, un ave, un mamífero agrícola o un mamífero no agrícola. El polinucleótido de interés además puede comprender una región codificante, una región no codificante, una región reguladora, o un ADN genómico. Por tanto, el 1er, 2°, 3er, 4°, 5°, 6°, 7°, y/o cualquiera de los polinucleótidos inserto posteriores pueden comprender dichas secuencias.

El polinucleótido de interés puede oscilar de aproximadamente 500 nucleótidos a aproximadamente 200 kb como se ha descrito anteriormente. El polinucleótido de interés puede ser de aproximadamente 500 nucleótidos a aproximadamente 5 kb, de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 200 kb, de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 10 kb, de aproximadamente 10 kb a aproximadamente 20 kb, de aproximadamente 20 kb a aproximadamente 30 kb, de aproximadamente 30 kb a aproximadamente 40 kb, de aproximadamente 40 kb a aproximadamente 50 kb, de aproximadamente 60 kb a aproximadamente 70 kb, de aproximadamente 80 kb a aproximadamente 90 kb, de aproximadamente 90 kb a aproximadamente 100 kb, de aproximadamente 100 kb a aproximadamente 110 kb, de aproximadamente 120 kb a aproximadamente 130 kb, de aproximadamente 130 kb a aproximadamente 140 kb, de aproximadamente 140 kb a aproximadamente 150 kb, de aproximadamente 150 kb a aproximadamente 160 kb, de aproximadamente 160 kb a aproximadamente 170 kb, de aproximadamente 170 kb a aproximadamente 180 kb, de aproximadamente 180 kb a aproximadamente 190 kb, o de aproximadamente 190 kb a aproximadamente 200 kb.

El polinucleótido de interés dentro del polinucleótido inserto y/o insertado en el locus genómico diana puede codificar un polipéptido, puede codificar un ARN, o puede comprender alguna región reguladora o regiones no codificantes de interés que incluyen, por ejemplo, una secuencia reguladora, una secuencia promotor, una secuencia potenciador, una secuencia de unión de represor transcripcional, un segmento consenso Kozak, un codon de inicio, o una deleción de una secuencia no codificante de proteína, pero no comprende una deleción de una secuencia codificante de proteína. Además, el polinucleótido de interés dentro del polinucleótido inserto y/o insertado en el locus genómico diana puede codificar una proteína expresada en el sistema nervioso, el sistema esquelético, el sistema digestivo, el sistema circulatorio, el sistema muscular, el sistema respiratorio, el sistema cardiovascular, el sistema linfático, el sistema endocrino, el sistema urinario, el sistema reproductor, o una combinación de los mismos.

El ácido nucleico inserto puede dar como resultado la sustitución de una porción del locus de DR6 de roedor con una secuencia de ácido nucleico inserto.

El polinucleótido inserto dado y la correspondiente región del locus de roedor a reemplazar puede ser una región no codificante, una región codificante, un intrón, un exón, una región no traducida, una región reguladora, un promotor, o un potenciador o cualquier combinación de los mismos. Además, el polinucleótido inserto dado y/o la región del locus de roedor a someter a deleción puede ser de cualquier longitud deseada, incluyendo, por ejemplo, entre 10-100 nucleótidos de longitud, 100-500 nucleótidos de longitud, 500-1 kb nucleótidos de longitud, 1 kb a 1,5 kb nucleótidos de longitud, 1,5 kb a 2 kb nucleótidos de longitud, 2 kb a 2,5 kb nucleótidos de longitud, 2,5 kb a 3 kb nucleótidos de longitud, 3 kb a 5 kb nucleótidos de longitud, 5 kb a 8 kb nucleótidos de longitud, 8 kb a 10 kb nucleótidos de longitud o más. En otros casos, el tamaño de la inserción o reemplazo es de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 10 kb, de aproximadamente 10 kb a aproximadamente 20 kb, de aproximadamente 20 kb a aproximadamente 40 kb, de aproximadamente 40 kb a aproximadamente 60 kb. En otras realizaciones, el polinucleótido inserto dado y/o la región del locus de mamífero, de célula humana, o de mamífero no humano a someter a deleción es de al menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, o 900 nucleótidos o de al menos 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 16 kb, 17 kb, 18 kb, 19 kb, 20 kb, 25 kb, 30 kb, 35 kb, 40 kb, 45 kb, 50 kb o más.

En todas las realizaciones, el ácido nucleico inserto se inserta en el locus de DR6 de interés de modo que se une operativamente al promotor de DR6 endógeno. En estos casos, el promotor de DR6 conduce a la expresión de la secuencia de ácido nucleico inserto.

El ácido nucleico inserto puede comprender un ácido nucleico flanqueado por secuencias diana de recombinación específica de sitio. Se reconoce que mientras el ácido nucleico inserto entero puede estar flanqueado por dichas secuencias diana de recombinación específica de sitio, cualquier región o polinucleótido individual de interés dentro del ácido nucleico inserto también puede estar flanqueado por dichos sitios. La recombinasa específica de sitio puede introducirse en la célula por cualquier medio, incluida la introducción del polipéptido de recombinasa en la célula o mediante introducción de un polinucleótido que codifica la recombinasa específica de sitio en la célula hospedadora. El polinucleótido que codifica la recombinasa específica de sitio puede estar localizado dentro del ácido nucleico inserto o dentro de un polinucleótido separado. La recombinasa específica de sitio puede unirse operativamente a un promotor activo en la célula incluyendo, por ejemplo, un promotor que es endógeno a la célula. Las secuencias diana de recombinación específica de sitio, que pueden flanquear el ácido nucleico inserto o cualquier polinucleótido de interés en el ácido nucleico inserto incluyen, pero sin limitación, loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox o una combinación de las mismas.

En algunas realizaciones, los sitios de recombinación específica de sitio flanquean un polinudeótido que codifica un marcador de selección y/o un gen indicador contenido dentro del ácido nucleico inserto. En dichos casos tras la integración del ácido nucleico inserto en el locus dirigido se pueden retirar las secuencias entre los sitios de recombinación específica de sitio.

El ácido nucleico inserto puede comprender un polinucleótido que codifica un marcador de selección. El marcador de selección puede estar contenido en un casete de selección. Dichos marcadores de selección incluyen, pero sin limitación, neomicina fosfotransferasa (neo1), higromicina B fosfotransferasa (hygr), puromicina-N-acetiltransferasa (purof), blasticidina S deaminasa (bsrr), xantina/guanina fosforibosil transferasa (gpt), o timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-k), o una combinación de los mismos.

El ácido nucleico inserto además puede comprender un gen indicador unido operativamente a un promotor, en el que el gen indicador codifica una proteína indicadora seleccionada del grupo que consiste en o que comprende pgalactosidasa (codificada por el gen lacZ), GFP, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrina, Venus, YPet, proteína fluorescente amarilla potenciada (EYFP), Emerald, proteína fluorescente verde potenciada (EGFP), CyPet, proteína fluorescente cian (CFP), Ceruleano, T-Zafiro, luciferasa, fosfatasa alcalina y/o una combinación de las mismas. Dichos genes indicadores pueden estar unidos operativamente a un promotor activo en la célula. Dichos promotores pueden ser un promotor que es endógeno a la célula.

ii. Casetes de expresión

En el presente documento las expresiones "polinucleótido", "secuencia de polinucleótido", "secuencia de ácido nucleico", y "fragmento de ácido nucleico" se usan indistintamente. Estas expresiones abarcan las secuencias de nucleótidos y similares. Un polinucleótido puede ser un polímero de ARN o ADN que es monocatenario o bicatenario, que opcionalmente contiene bases de nucleótido sintéticas, no naturales o alteradas. Un polinucleótido en forma de un polímero de ADN puede estar comprendido de uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico, ADN sintético o mezclas de los mismos. Los polinucleótidos pueden comprender desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos incluyen tanto moléculas de origen natural como análogos sintéticos, y cualquier combinación de estos. Los polinucleótidos proporcionados en el presente documento también abarcan todas las formas de secuencias que incluyen, pero sin limitación, formas monocatenarias, formas bicatenarias, horquillas, estructuras de tallo y bucle, y similares.

Además se divulgan polinucleótidos recombinantes que comprenden los diferentes componentes del sistema de integración genómica dirigida para modificar un locus de DR6. En el presente documento las expresiones "polinucleótido recombinante" y "construcción de ADN recombinante" se usan indistintamente. Una construcción recombinante comprende una combinación artificial o heteróloga de secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, secuencias reguladoras y codificantes que se encuentran juntas en la naturaleza. Una construcción recombinante puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que derivan de diferentes fuentes o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a la encontrada en la naturaleza. Dicha construcción puede usarse sola o puede usarse en conjunto con un vector. En caso de que se use un vector, entonces la elección del vector es dependiente del método que se use para transformar las células hospedadoras, como es bien sabido por los expertos en la materia. Por ejemplo, puede usarse un vector plasmídico. Se proporcionan también elementos genéticos requeridos para transformar, seleccionar y propagar con éxito las células hospedadoras que comprenden cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico aislados proporcionados en el presente documento. El cribado se puede llevar a cabo por análisis Southern de ADN, análisis Northern de la expresión de ARNm, análisis de inmunotransferencia de la expresión de proteína, o análisis fenotípico, entre otros.

Uno o más de los componentes del sistema de integración genómica dirigida para modificar un locus de DR6 descrito en el presente documento pueden proporcionarse en un casete de expresión para la expresión en una célula procariota, una célula eucariota, una bacteria, una célula de levadura, o una célula de mamífero u otro organismo o tipo celular de interés. El casete puede incluir secuencias reguladoras 5' y 3' unidas operativamente a un polinucleótido proporcionado en el presente documento. "Unido operativamente" comprende una relación en la que los componentes unidos operativamente funcionan en su manera prevista. Por ejemplo, una unión operativa entre un polinucleótido de interés y una secuencia reguladora (es decir, un promotor) es un enlace funcional que permite la expresión del polinucleótido de interés. Los elementos unidos operativamente pueden ser contiguos o no contiguos. Cuando se utiliza para hacer referencia a la unión de dos regiones codificantes de proteína, unido operativamente significa que las regiones codificantes están en el mismo marco de lectura. En otro caso, una secuencia del ácido nucleico que codifica una proteína puede estar unida operativamente a secuencias reguladoras (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencia silenciadora, etc.) con el fin de conservar la regulación transcripcional adecuada. El casete puede contener adicionalmente al menos un polinucleótido adicional de interés para introducirse conjuntamente en el organismo. Como alternativa, el polipéptido adicional de interés puede proporcionarse sobre múltiples casetes de expresión. Dicho casete de expresión puede estar provisto de una pluralidad de sitios de restricción y/o sitios de recombinación para que la inserción del polinucleótido recombinante esté bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. El casete de expresión puede contener adicionalmente genes marcadores de selección.

El casete de expresión puede incluir en la dirección de transcripción 5'-3', una región de inicio de la transcripción y la traducción (es decir, un promotor), un polinucleótido recombinante proporcionado en el presente documento, y una región de terminación de la transcripción y la traducción (es decir, una región de terminación) funcional en célula mamífera o una célula hospedadora de interés. Las regiones reguladoras (es decir, promotores, regiones reguladoras de la transcripción, secuencia Kozak, y regiones de terminación de la traducción) y/o un polinucleótido proporcionado en el presente documento pueden ser naturales/análogos de la célula hospedadora o entre sí. Como alternativa, las regiones reguladoras y/o un polinucleótido proporcionado en el presente documento pueden ser heterólogos a la célula hospedadora o entre sí. Por ejemplo, un promotor unido operativamente a un polinucleótido heterólogo es de una especie diferente de la especie de la que se obtuvo el polinucleótido o, si es de la misma especie o una análoga, uno o ambos están sustancialmente modificados con respecto a su forma y/o locus genómico original, o el promotor no es el promotor natural para el polinucleótido unido operativamente. Como alternativa, las regiones reguladoras y/o un polinucleótido recombinante proporcionado en el presente documento pueden ser completamente sintéticos.

La región de terminación puede ser natural con la región de inicio de la transcripción, puede ser natural con el polinucleótido recombinante unido operativamente, puede ser natural con la célula hospedadora o puede derivar de otra fuente (es decir, exógena o heteróloga) al promotor, el polinucleótido recombinante, la célula hospedadora, o cualquier combinación de los mismos.

En la preparación del casete de expresión, los diferentes fragmentos de ADN pueden manipularse, con el fin de proporcionar las secuencias de ADN en la orientación apropiada. Para este fin, pueden emplearse adaptadores o conectores para unir los fragmentos de ADN o pueden estar implicadas otras manipulaciones para proporcionar sitios de restricción convenientes, retirada de ADN superfluo, retirada de sitios de restricción, o similares. Para este fin, pueden estar implicadas la mutagénesis in vitro, reparación de cebador, restricción, alineamiento, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones.

Se pueden usar un número de promotores en los casetes de expresión proporcionados en el presente documento. Los promotores pueden seleccionarse basándose en el resultado deseado. Se reconoce que aplicaciones diferentes pueden ser aumentadas por el uso de promotores diferentes en los casetes de expresión para modular el momento, la localización y/o el nivel de expresión del polinucleótido de interés. Dichas construcciones de expresión también pueden contener, si se desea, una región reguladora promotora (por ejemplo, una que confiere una expresión inducible, constitutiva, regulada por el entorno o el desarrollo, o selectiva/específica de célula o tejido), un sitio de inicio de la transcripción, una secuencia consenso Kozak, un sitio de unión al ribosoma, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de la transcripción y/o una señal de poliadenilación.

El casete de expresión que contiene los polinucleótidos proporcionados en el presente documento pueden comprender también un gen marcador de selección para la selección de células transformadas. Se utilizan genes marcadores seleccionables para la selección de células o tejidos transformados.

Cuando sea adecuado, las secuencias empleadas en los métodos y las composiciones (es decir, el polinucleótido de interés, el agente nucleasa, etc.) pueden optimizarse para la expresión incrementada en la célula. Es decir, los genes pueden sintetizarse usando codones preferidos en una célula dada de interés incluyendo, por ejemplo, codones preferidos de mamífero, codones preferidos humanos, codones preferidos de roedor, codones preferidos de ratón, codones preferidos de rata, codones preferidos de hámster, etc. para la expresión mejorada.

Se pueden usar diferentes marcadores de selección en los métodos y composiciones descritos en el presente documento. Dichos marcadores de selección pueden, por ejemplo, impartir resistencia a un antibiótico tal como G418, higromicina, blastocidina, neomicina o puromicina. Dichos marcadores de selección incluyen neomicina fosfotransferasa (neor), higromicina B fosfotransferasa (hygr), puromicina-N-acetiltransferasa (puror), y blasticidina S deaminasa (bsrr). En otras realizaciones más, el marcador de selección está unido operativamente a un promotor inducible y la expresión del marcador de selección es tóxica a la célula. Ejemplos no limitativos de dichos marcadores de selección incluyen xantina/guanina fosforibosil transferasa (gpt), hahipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (HGPRT) o timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-TK). El polinucleótido que codifica los marcadores de selección está unidos operativamente a un promotor activo en la célula.

iii. Vectores de direccionamiento

Los vectores de direccionamiento se emplean para introducir el ácido nucleico inserto en el locus de DR6 del ácido nucleico de roedor, de ratón, de rata o de hámster. El vector de direccionamiento comprende el ácido nucleico inserto y además comprende un brazo de homología 5' y uno 3', los cuales flanquean el ácido nucleico inserto. Los brazos de homología, los cuales flanquean el ácido nucleico inserto, corresponden a regiones dentro del locus de DR6 diana del ácido nucleico de roedor, de ratón, de rata o de hámster. Para facilitar la referencia, las correspondientes regiones genómicas cognadas dentro del locus genómico dirigido se denominan "sitios diana". Por ejemplo, un vector de direccionamiento puede comprender un primer ácido nucleico flanqueado por un primer y un segundo brazo de homología complementario a un primer y segundo sitio diana. Como tal, el vector de direccionamiento de ese modo ayuda en la integración del ácido nucleico inserto en el ácido nucleico del locus diana a través de un evento de recombinación homóloga que se da entre los brazos de homología y los sitios diana complementarios dentro del genoma de la célula.

El locus diana del ácido nucleico de roedor, de ratón o de hámster puede comprender una primera secuencia de ácido nucleico que es complementaria al brazo de homología 5' y una segunda secuencia de ácido nucleico que es complementaria al brazo de homología 3'. La primera y la segunda secuencia de ácido nucleico pueden estar separadas por al menos 5 kb. La primera y la segunda secuencia de ácido nucleico pueden estar separadas por al menos 1 kb pero menos de 50 kb. La primera y la segunda secuencia de ácido nucleico pueden estar separadas por al menos 2 kb. La primera y la segunda secuencia de ácido nucleico pueden estar separadas por al menos 3 kb, al menos 4 kb, al menos 5 kb, al menos 6 kb, al menos 7 kb, al menos 8 kb, al menos 9 kb, al menos 10 kb, al menos 15 kb, al menos 20 kb, al menos 30 kb, al menos 40 kb, o al menos 50 kb. La primera y la segunda secuencia de ácido nucleico están separadas por al menos 1 kb pero menos de 2 kb, al menos 2 kb pero menos de 3 kb, al menos 4 kb pero menos de 5 kb, al menos 5 kb pero menos de 6 kb, al menos 6 kb pero menos de 7 kb, al menos 7 kb pero menos de 8 kb, al menos aproximadamente 8 kb pero menos de 9 kb, al menos 9 kb pero menos de 10 kb, o al menos 10 kb pero menos de 15 kb, al menos aproximadamente 15 kb pero menos de aproximadamente 20 kb, al menos aproximadamente 20 kb pero menos de aproximadamente 30 kb, o al menos aproximadamente 40 kb pero menos de aproximadamente 50 kb.

Un brazo de homología del vector de direccionamiento puede ser de cualquier longitud que sea suficiente para promover un evento de recombinación homóloga con un correspondiente sitio diana, incluyendo, por ejemplo, de al menos 5-10 kb, 5-15 kb, 10-20 kb, 20-30 kb, 30-40 kb, 40-50 kb, 50-60 kb, 60-70 kb, 70-80 kb, 80-90 kb, 90-100 kb, 100-110 kb, 110-120 kb, 120-130 kb, 130-140 kb, 140-150 kb, 150-160 kb, 160-170 kb, 170-180 kb, 180-190 kb, 190 200 kb de longitud o más. Como se explica con más detalle a continuación, los vectores de direccionamiento grandes pueden emplear brazos de direccionamiento de mayor longitud. La suma total del brazo de homología 5' y el brazo de homología 3' puede ser de al menos 10 kb o la suma total del brazo de homología 5' y el brazo de homología 3' es de al menos aproximadamente 16 kb a aproximadamente 100 kb o aproximadamente 30 kb a aproximadamente 100 kb. El tamaño de la suma total del total de los brazos de homología 5' y 3' del LTVEC puede ser de aproximadamente 10 kb a aproximadamente 150 kb, aproximadamente 10 kb a aproximadamente 100 kb, aproximadamente 10 kb a aproximadamente 75 kb, aproximadamente 20 kb a aproximadamente 150 kb, aproximadamente 20 kb a aproximadamente 100 kb, aproximadamente 20 kb a aproximadamente 75 kb, aproximadamente 30 kb a aproximadamente 150 kb, aproximadamente 30 kb a aproximadamente 100 kb, aproximadamente 30 kb a aproximadamente 75 kb, aproximadamente 40 kb a aproximadamente 150 kb, aproximadamente 40 kb a aproximadamente 100 kb, aproximadamente 40 kb a aproximadamente 75 kb, aproximadamente 50 kb a aproximadamente 150 kb, aproximadamente 50 kb a aproximadamente 100 kb, o aproximadamente 50 kb a aproximadamente 75 kb, aproximadamente 10 kb a aproximadamente 30 kb, aproximadamente 20 kb a aproximadamente 40 kb, aproximadamente 40 kb a aproximadamente 60 kb, aproximadamente 60 kb a aproximadamente 80 kb, aproximadamente 80 kb a aproximadamente 100 kb, aproximadamente 100 kb a aproximadamente 120 kb, o de aproximadamente 120 kb a aproximadamente 150 kb. El tamaño de la deleción puede ser el mismo o similar al tamaño de la suma total de los brazos de homología 5' y 3' del LTVEC.

Un brazo de homología y un sitio diana (es decir, región genómica cognada) son "complemento" o son "complementarios" entre sí cuando las dos regiones comparten un nivel suficiente de identidad de secuencia entre sí para actuar como sustratos para una reacción de recombinación homóloga. Por "homología" se quiere decir secuencias de ADN que son o bien idénticas o comparten identidad de secuencia con una secuencia correspondiente o "complementaria". La identidad de secuencia entre una secuencia diana dada y el brazo de homología correspondiente que se encuentra en un vector de direccionamiento puede ser cualquier grado de identidad de secuencia que permita que se produzca la recombinación homóloga. Por ejemplo, la cantidad de identidad de secuencia compartida por el brazo de homología del vector de direccionamiento (o un fragmento del mismo) y el sitio diana (o un fragmento del mismo) puede ser de al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, el 99 % o 100 % de identidad de secuencia, de modo que las secuencias experimenten una recombinación homóloga. Además, una región complementaria de homología entre el brazo de homología y el sitio diana complementario puede ser de cualquier longitud que sea suficiente para promover la recombinación homóloga en el sitio de reconocimiento sometido a escisión. Por ejemplo, un brazo de homología dado y/o sitio diana complementario puede comprender regiones complementarias de homología que son de al menos 5-10 kb, 5-15 kb, 10-20 kb, 20-30 kb, 30-40 kb, 40-50 kb, 50-60 kb, 60-70 kb, 70-80 kb, 80-90 kb, 90-100 kb, 100-110 kb, 110-120 kb, 120-130 kb, 130-140 kb, 140-150 kb, 150-160 kb, 160-170 kb, 170-180 kb, 180-190 kb, 190-200 kb, 200 kb a 300 kb de longitud o más (tal como se describe en los vectores LTVEC descritos en otras partes en el presente documento) de modo que el brazo de homología tenga suficiente homología para experimentar recombinación homóloga con los correspondientes sitios diana dentro del genoma de la célula. Para facilitar la referencia los brazos de homología se refieren en el presente documento como un brazo de homología 5' y uno 3'. Esta terminología se refiere a la posición relativa de los brazos de homología respecto a un ácido nucleico inserto dentro del vector de direccionamiento.

Por lo tanto, los brazos de homología del vector de direccionamiento están diseñados para ser complementarios a un sitio diana con el locus dirigido. Por tanto, los brazos de homología pueden ser complementarios a un locus que es natural de la célula, o alternativamente pueden ser complementarios a una región de un segmento heterólogo o exógeno de ADN que se integró en el genoma de la célula, incluyendo, pero sin limitación, transgenes, casetes de expresión, o regiones heterólogas o exógenas de ADN genómico. Como alternativa, los brazos de homología del vector de direccionamiento pueden ser complementarios a una región de un cromosoma artificial humano o cualquier otra región genómica modificada por ingeniería genética contenida en una célula hospedadora apropiada. Es más, los brazos de homología de un vector de direccionamiento pueden ser complementarios a o derivar de una región de una genoteca de BAC, una genoteca de cósmidos o una genoteca de fagos PI. Por tanto, los brazos de homología del vector de direccionamiento pueden ser complementarios a un locus genómico de roedor, de ratón o de rata que es natural, heterólogo o exógeno de una célula dada. Los brazos de homología pueden derivar de un ADN sintético.

El vector de direccionamiento (tal como un vector de direccionamiento grande) también puede comprender un casete de selección o un gen indicador como se discute en otras partes en el presente documento. El casete de selección puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de selección, en el que la secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a un promotor como se discute en otras partes en el presente documento. El marcador de selección y/o el gen indicador del vector de direccionamiento puede estar flanqueado por los brazos de homología, 5' y 3' o se encuentra o bien 5' o 3' respecto a los brazos de homología.

En algunos casos, después de la recombinación homóloga con el locus de DR6, la primera secuencia de nucleótidos que codifica el dominio transmembrana se une operativamente a una secuencia señal de DR6 endógena que conduce el destino del dominio de transmembrana y el indicador.

En otra realización, el ácido nucleico inserto del vector de direccionamiento comprende una secuencia de nucleótidos adicional que codifica un marcador seleccionable. En algunos casos, el ácido nucleico adicional está unido operativamente a un promotor.

En una realización, la primera secuencia de nucleótidos y/o adicional del ácido nucleico inserto comprende una secuencia consenso Kozak.

El vector de direccionamiento puede comprender un gen recombinasa específica de sitio. El gen de recombinasa específica de sitio puede codificar una recombinasa Cre. En una realización, el gen de recombinasa Cre puede ser Crei, en el que dos exones que codifican la recombinasa Cre están separados por un intrón para prevenir su expresión en una célula procariota. El gen de recombinasa específica de sitio puede codificar una recombinasa Dre.

el gen de recombinasa Cre además puede comprender una señal de localización nuclear para facilitar la localización de Cre (o cualquier recombinasa o agente nucleasa) al núcleo (por ejemplo, el gen es un gen NLS-Cre). El gen de recombinasa Cre además puede comprender una señal de localización nuclear (NLS) y un intrón (por ejemplo, NLS-Crei).

Un promotor adecuado para la expresión de la recombinasa Cre o Crei discutida anteriormente se puede seleccionar de o comprende Prm1, Blimp 1, Gata6, Gata4, Igf2, Lhx2, Lhx5, y/o Pax3. El promotor puede ser el promotor Gata6 o Gata4. Los diferentes promotores pueden ser de cualquier organismo, incluyendo, por ejemplo, un roedor tal como un ratón o una rata, un eucariota, un mamífero no humano, un mamífero, un ser humano o hámster. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. 8.697.851, la Patente de EE.UU. 9.267.152, la Patente de EE.UU. 9.096.870, la Patente de EE.UU. 8.354.389, la Patente de EE.UU. 8.946.505, la Patente de EE.UU. 8.946.504, la Patente de EE.UU. 8.518.392.

El ácido nucleico inserto puede comprender una secuencia de nucleótidos flanqueada por dos sitios de recombinación especifica de sitio. Ejemplos de sitios de recombinación específica de sitio incluyen, pero sin limitación, loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox y una combinación de los mismos.

iv. Vectores de direccionamiento grandes

La expresión "vector de direccionamiento grande" o "LTVEC" incluye vectores de direccionamiento grandes que comprenden brazos de homología que corresponden a y se derivan de secuencias de ácido nucleico mayores que las normalmente usadas por otras estrategias destinadas a realizar modificación génica dirigida homóloga en células y/o que comprenden polinucleótidos inserto que comprenden secuencias de ácido nucleico mayores que las normalmente usadas por otras estrategias destinadas a realizar modificación génica dirigida de recombinación homóloga en células. Los brazos de homología y/o el polinucleótido inserto del LTVEC pueden comprender una secuencia genómica de una célula eucariota. El tamaño del LTVEC es demasiado grande para permitir el cribado de eventos de direccionamiento mediante ensayos convencionales, por ejemplo, transferencia Southern y PCR de largo alcance (por ejemplo, 1 kb-5 kb). Ejemplos del LTVEC, incluyen, pero sin limitación, vectores derivados de un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial humano o un cromosoma artificial de levadura (YAC). Ejemplos no limitativos de LTVEC y métodos para producirlos se describen, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. N.° 6.586.251, 6.596.541, 7.105.348 y el documento WO 2002/036789 (PCT/USO1/45375).

Los LTVEC pueden tener cualquier longitud, incluyendo, pero sin limitación, al menos alrededor de 10 kb, aproximadamente 15 kb, aproximadamente 20 kb, aproximadamente 30 kb, aproximadamente 40 kb, aproximadamente 50 kb, aproximadamente 60 kb, aproximadamente 70 kb, aproximadamente 80 kb, aproximadamente 90 kb, aproximadamente 100 kb, aproximadamente 150 kb, aproximadamente 200 kb, de aproximadamente 10 kb a aproximadamente 15 kb, aproximadamente 15 kb a aproximadamente 20 kb, aproximadamente 20 kb a aproximadamente 30 kb, de aproximadamente 30 kb a aproximadamente 50 kb, de aproximadamente 50 kb a aproximadamente 300 kb, de aproximadamente 50 kb a aproximadamente 75 kb, de aproximadamente 75 kb a aproximadamente 100 kb, de aproximadamente 100 kb a 125 kb, de aproximadamente 125 kb a aproximadamente 150 kb, de aproximadamente 150 kb a aproximadamente 175 kb, aproximadamente 175 kb a aproximadamente 200 kb, de aproximadamente 200 kb a aproximadamente 225 kb, de aproximadamente 225 kb a aproximadamente 250 kb, de aproximadamente 250 kb a aproximadamente 275 kb, o de aproximadamente 275 kb a aproximadamente 300 kb.

Los brazos de homología de los LTVEC pueden derivar de una genoteca BAC, una genoteca de cósmidos o una genoteca de fagos PI. Los brazos de homología pueden derivar del locus genómico de DR6 dirigidos de la célula y en algunos casos el locus genómico diana al que el LTVEC está diseñado para dirigirse no se puede someter a modificación dirigida usando un método convencional. Los brazos de homología pueden derivar de un ADN sintético.

Una suma total de un brazo de homología en dirección 5' y un brazo de homología en dirección 3' en el LTVEC puede ser de al menos 10 kb. El brazo de homología en dirección 5' puede oscilar de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 100 kb. El brazo de homología en dirección 3' puede oscilar de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 100 kb. La suma total del brazo de homología en dirección 5' y el brazo de homología en dirección 3' puede ser de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 10 kb, de aproximadamente 10 kb a aproximadamente 20 kb, de aproximadamente 20 kb a aproximadamente 30 kb, de aproximadamente 30 kb a aproximadamente 40 kb, de aproximadamente 40 kb a aproximadamente 50 kb, de aproximadamente 50 kb a aproximadamente 60 kb, de aproximadamente 60 kb a aproximadamente 70 kb, de aproximadamente 70 kb a aproximadamente 80 kb, de aproximadamente 80 kb a aproximadamente 90 kb, de aproximadamente 90 kb a aproximadamente 100 kb, de aproximadamente 100 kb a aproximadamente 110 kb, de aproximadamente 110 kb a aproximadamente 120 kb, de aproximadamente 120 kb a aproximadamente 130 kb, de aproximadamente 130 kb a aproximadamente 140 kb, de aproximadamente 140 kb a aproximadamente 150 kb, de aproximadamente 150 kb a aproximadamente 160 kb, de aproximadamente 160 kb a aproximadamente 170 kb, de aproximadamente 170 kb a aproximadamente 180 kb, de aproximadamente 180 kb a aproximadamente 190 kb, o de aproximadamente 190 kb a aproximadamente 200 kb. El tamaño de la deleción puede ser el mismo o similar al tamaño de la suma total de los brazos de homología 5' y 3' del LTVEC.

El LTVEC puede comprender un casete de selección o un gen indicador como se discute en otras partes en el presente documento.

III. Métodos de introducción de secuencias y generación de animales transgénicos

Como se ha explicado anteriormente, los métodos y composiciones permiten la modificación genética dirigida de un locus de DR6. Además se reconoce que se puede realizar modificación genética dirigida adicional. Dichos sistemas que permiten estas modificaciones genéticas dirigidas pueden emplear un diversidad de componentes y para facilitar la referencia, en el presente documento la expresión "sistema de integración genómica dirigida" generalmente incluye todos los componentes requeridos para un evento de integración (es decir, los diferentes agentes nucleasa, sitios de reconocimiento, polinucleótidos de ADN insertos, vectores de direccionamiento, locus genómicos diana, y polinucleótidos de interés).

Uno o más polinucléotidos o construcciones polipeptídicas que comprenden los diferentes componentes del sistema de integración genómica dirigida pueden introducirse en una célula. "Introducir" significa presentar a la célula la secuencia (polinucleótido o polipéptido) de dicha forma que la secuencia accede al interior de la célula. Los métodos proporcionados en el presente documento dependen de un método particular para introducir cualquier componente del sistema de integración genómica dirigida dentro de la célula, solo que el polinucleótido accede al interior de al menos una célula. Los métodos para introducir polinucleótidos dentro de diferentes tipos celulares son conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, métodos de transfección estable, métodos de transfección transitoria, y métodos mediados por virus.

Las células empleadas en los métodos y composiciones tienen una construcción de ADN establemente incorporada en su genoma. "Establemente incorporada" o "establemente introducida" significa la introducción de un polinucleótido en la célula de modo que la secuencia de nucleótidos se integra en el genoma de la célula y es capaz de ser heredado por la progenie de la misma. Se puede usar cualquier protocolo para la incorporación estable de las construcciones de ADN o los diferentes componentes del sistema de integración genómica dirigida.

Los protocolos de transfección así como los protocolos para introducir polipéptidos o secuencias de polinucleótidos en las células pueden variar. Métodos de transfección no limitativos incluyen métodos de transfección basados en química que incluyen el uso de liposomas; nanopartículas; fosfato de calcio (Graham et al. (1973). Virology 52 (2): 456-67, Bacchetti et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (4): 1590-4 y, Kriegler, M (1991). "Transfer and Expression: A Laboratory Manual". Nueva York: W. H. Freeman and Company. pp. 96-97); dendrímeros; o polímeros catiónicos tales como DEAE dextrano o polietilenimina. Métodos no químicos incluyen electroporación; sonoporación; y transfección óptica. Transfecciones basadas en partícula incluyen el uso de una pistola de gen, transfección asistida por imán (Bertram, J. (2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277-28). También se pueden usar métodos virales para la transfección.

Los animales no humanos pueden generarse empleando los diferentes métodos descritos en el presente documento. Dichos métodos comprenden (1) integrar uno o más polinucleótidos de interés en el locus genómico de DR6 diana de interés de una célula pluripotente del animal no humano para generar una célula pluripotente genéticamente modificada que comprende el polinucleótido inserto en el locus genómico de DR6 dirigido empleando los métodos descritos en el presente documento; (2) seleccionar la célula pluripotente genéticamente modificada que tiene uno o más polinucleótidos de interés en el locus genómico de DR6 diana; (3) introducir la célula pluripotente genéticamente modificada en un embrión hospedador del animal no humano, por ejemplo, en una fase premorula; y (4) implantar el embrión hospedador que comprende la célula pluripotente genéticamente modificada en una madre subrogada para generar una generación F0 derivada de la célula pluripotente genéticamente modificada. Se pueden emplear métodos similares para dirigir un locus cromosómico diana desafiante. El animal no humano puede ser un roedor, un ratón, una rata o un hámster.

La célula pluripotente puede ser una célula ES de roedor, una célula ES de ratón, una célula ES de rata, una célula ES de hámster. En otras realizaciones, la célula pluripotente es una célula de roedor, una célula de rata, una célula de ratón, una célula de hámster. La modificación genética dirigida puede dar como resultado la pérdida de función del DR6.

Una célula pluripotente de ratón, célula totipotente, o embrión hospedador puede ser de cualquier cepa de ratón incluyendo, por ejemplo, cepas endogámicas, cepas híbridas, y cepas exogámcas. Ejemplos de cepas de ratón incluyen una cepa 129, una cepa C57BL (por ejemplo, una cepa C57BL/6), una mezcla de 129 y C57BL/6 (por ejemplo, 50 % de 129 y 50 % de C57BL/6), una cepa BALB/c, y una cepa Swiss Webster. Ejemplos de cepas 129 incluyen 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (e.g., 12951/SV, 12951/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 12959/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, y 129T2 (véase, por ejemplo, Festing et al. (1999) "Revised nomenclature for strain 129 mice", Mammalian Genome 10:836). Ejemplos de cepas C57BL incluyen C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, y C57BL/01a. Los ratones pueden ser mezclas de una cepa 129 anteriormente mencionada (por ejemplo, una cepa 129S6 (129/SvEvTac)) y una cepa C57BL/6 anteriormente mencionada, mezclas de una o más cepas 129 anteriormente mencionadas, o mezclas de una o más cepas C57BL anteriormente mencionadas. Los ratones también pueden ser de una cepa excepto las cepas 129.

Una célula pluripotente de rata, célula totipotente, o embrión hospedador puede ser de cualquier cepa de rata, incluyendo, por ejemplo, cepas endogámicas, cepas híbridas, y cepas exogámcas. Ejemplos de cepas de rata incluyen una cepa de rata ACI, una cepa de rata Agutí Negro (DA), una cepa de rata Wistar, una cepa de rata LEA, una cepa de rata Sprague Dawley (SD), o una cepa de rata Fischer tal como Fisher F344 o Fisher F6. También se pueden obtener células pluripotentes, células totipotentes, o embriones hospedadores de rata de una cepa derivada de una mezcla de dos o más cepas anteriormente enumeradas. Por ejemplo, la célula pluripotente, la célula totipotente, o el embrión hospedador de rata puede ser derivado de una cepa seleccionada de una cepa DA y una cepa ACI. La cepa de rata ACI se caracteriza por tener agutí negro, con vientre y patas blancas y un haplotipo RT1av1. Dichas cepas están disponibles en una diversidad de fuentes incluidos los Harlan Laboratories. Un ejemplo de una línea de células ES de rata de una rata ACI es la célula ES de rata ACI.G1. La cepa de rata Agutí negro (DA) se caracteriza por tener un pelaje agutí y un haplotipo RT1av1. Dichas ratas están disponibles en una diversidad de fuentes incluidos los Charles River y Harlan Laboratories. Ejemplos de una línea de células ES de rata de una rata DA son la línea de células ES de rata DA.2B o la línea de células ES de rata DA.2C. Se proporcionan otros ejemplos de cepas de rata, por ejemplo, en los documentos US 2014/0235933, US 2014/0310828, y US 2014/0309487.

Por ejemplo, células ES de rata transmisibles por la línea germinal pueden obtenerse por cultivo de células ES de rata aisladas sobre una capa de célula alimentadora con un medio que comprender complemento N2, complemento B27, aproximadamente 50 U/ml a aproximadamente 150 U/ml de factor inhibidor de leucemia (LIF), y una combinación de inhibidores que consisten en un inhibidor MEK y un inhibidor GSK3, en el que la capa de célula alimentadora no está modificada para expresar LIF, y en el que las células ES de rata: (i) se han modificado para comprender una modificación genética dirigida que comprende al menos una inserción de un polinucleótido heterólogo que comprende un marcador de selección en el genoma de las células ES de rata y son capaces de transmitir la modificación genética dirigida a través de la línea germinal; (ii) tienen un cariotipo normal; (iii) carecen de la expresión de c-Myc; y (iv) forman colonias flotantes libres esféricas, en cultivo (Véase, por ejemplo, los documentos US 2014-0235933 A1 y US 2014 0310828 A1). Otros ejemplos de derivación de células madre embrionarias de rata y modificación dirigida se proporcionan, por ejemplo, en Yamamoto et al. ("Derivation of rat embryonic stem cells and generation of proteaseactivated receptor-2 knockout rats", Transgenic Res. 21:743-755, 2012) y Kwamata and Ochiya ("Generation of genetically modified rats from embryonic stem cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107(32):14223-14228, 2010).

También se pueden usar técnicas de transferencia nuclear para generar los animales no humanos. En resumen, los métodos para la transferencia nuclear incluyen las etapas de: (1) enucleación de un oocito; (2) aislar una célula donante o núcleo para ser combinada con el oocito enucleado; (3) insertar la célula o núcleo en el oocito enucleado para formar una célula reconstituida; (4) implantar la célula reconstituida en el útero de un animal para formar un embrión; y (5) dejar que el embrión se desarrolle. En dichos métodos los oocitos generalmente son recuperados de los animales fallecidos, aunque pueden aislarse también de oviductos y/o ovarios de animales vivos. Los oocitos pueden madurarse en una diversidad de medidos conocidos por los expertos en la materia antes de la enucleación. La enucleación del oocito puede realizarse en un número de maneras bien conocidas por los expertos en la materia. La inserción de la célula donante o núcleo dentro del oocito enucleado para formar una célula reconstituida normalmente es por microinyección de una célula donante bajo la zona pelúcida antes de la fusión. La fusión puede inducirse por aplicación de un pulso eléctrico DC a través de un plano de contacto/fusión (electrofusión), por exposición de las células a sustancias químicas promotoras de la fusión, tales como polietilenglicol, o por medio de un virus inactivado, tal como el virus Sendai. Una célula reconstituida normalmente se activa por medios eléctricos y/o no eléctricos antes, durante, y/o después de la fusión del donante nuclear y el oocito receptor. Los métodos de activación incluyen pulsos eléctricos, choque químicamente inducido, penetración por esperma, incremento de los niveles de cationes divalentes en el oocito, y reducción de la fosforilación de las proteínas celulares (como por medio de los inhibidores de quinasa) en el oocito. Las células reconstituidas activadas, o embriones, normalmente se cultivan en medio bien conocido por los expertos en la materia y, a continuación, se transfieren al útero de un animal. Véase, por ejemplo, los documentos US20080092249, WO 1999/005266A2, US20040177390, WO/2008/017234A1, y la Patente de EE.UU. No. 7,612,250.

Se pueden llevar a cabo diferentes modificaciones genéticas del loci genómico diana en el presente documento por una serie de reacciones de recombinación homóloga (BHR) en las células bacterianas usando un LTVEC derivado de ADN de cromosoma artificial bacteriano (BAC) usando tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. No. 6,586,251 y Valenzuela, D. M. et al. (2003), Nature Biotechnology 21(6): 652-659).

Las células pluripotentes y/o totipotenetes con DR6 dirigido que comprenden diferentes modificaciones genéticas como se describen en el presente documento se usan como células donantes inserto y se introducen en un embrión en fase premorula de un correspondiente organismo, por ejemplo, un embrión de ratón en fase de 8 células, por el método VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, lo documentos US 7.576.259, US 7.659.442, US 7,294,754, y US 2008-0078000 A1). El embrión animal no humano que comprende las células pluripotentes y/o totipotentes genéticamente modificadas se incuba hasta la fase de blastocisto y, a continuación, se implanta en una madre subrogada para producir una generación F0. Las células ES de mamífero dirigidas que comprenden diferentes modificaciones genéticas como se describe en el presente documento se introducen en un embrión en fase blastocisto. Los animales no humanos que portan el locus genómico genéticamente modificado (es decir, un locus de DR6) puede identificarse por ensayo de modificación de alelo (MOA) como se describe en el presente documento. El animal no humano de generación F0 resultante derivado de las células pluripotentes y/o totipotentes genéticamente modificadas se cruza con un animal no humano tipo silvestre para obtener la descendencia generación F1. Tras el genotipado con cebadores y/o sondas específicos, los animales no humanos F1 que son heterocigóticos para el locus genómico genéticamente modificado se cruzan entre sí para producir la descendencia animal no humana generación F2 que son heterocigóticos para el locus genómico genéticamente modificado.

IV. Células

Los diferentes métodos descritos en el presente documento emplean un sistema de modificación dirigida de locus genómico para modificar un locus de DR6 en una célula de roedor. Estas células incluyen, para los roedores para los que no se dispone fácilmente de células pluripotentes genéticamente modificadas adecuadas, se emplean otros métodos para reprogramar las células somáticas en células pluripotentes, por ejemplo, mediante introducción en células somáticas de una combinación de factores inductores de pluripotencia, incluyendo, pero sin limitación, Oct3/4, Sox2, KLF4, Myc, Nanog, LIN28 y Glis1. En dichos métodos, la célula también puede ser una célula de un roedor, una rata, un ratón, un hámster. En otras realizaciones, la célula es una célula pluripotente, incluyendo, por ejemplo, células madre embrionarias (ES) de ratón, células madre embrionarias (ES) de rata o una células embrionaria (ES) de roedor, una célula madre embrionaria (ES) de ratón, o una célula madre embrionaria (ES) de rata.

V. Modelos animales

Los animales pueden administrarse con el agente a ensayar por cualquier vía conveniente, por ejemplo, inyección sistémica, bombas para exposición a largo plazo, o inyección intracerebral directa. Estos animales pueden incluirse en un estudio de comportamiento, con el fin de determinar el efecto de la sustancia sobre el comportamiento, por ejemplo, comportamiento motor, de los animales en comparación con animales control apropiados que no recibieron el agente. También puede realizarse una biopsia o evaluación anatómica de la médula espinal, el músculo y/o el tejido cerebral del animal, y/o se puede recoger una muestra de sangre o CSF.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos únicamente y no están destinados a limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1: Modificación genética de un locus de DR6 (Tnfrs21)

Se emplearon métodos VelociGene®, como se han descrito anteriormente, que permiten la generación rápida y de alto rendimiento de mutaciones génicas a medida en ratones (Valenzuela, D.M., et al. (2003b), Nat Biotechnol 21:652-659). En resumen, se generaron vectores de direccionamiento grandes (LTVEC) usando clones BAC del ratón bMQ (129S7/SvEv Brd-Hprt b-m2) o genoteca RP23 BAC (Adams, D.J., et al. (2005), Genomics 86:753-758). El casete indicador/de selección lacZ/neor (FIG. 1) era idéntico al casete ZEN-Ub1 usado para NIH KOMP (secuencia disponible en internet en la página web URL "www.velocigene.com/komp/detail/10020") excepto que el extremo terminal amino de la secuencia codificante de p-galactosidasa en la parte lacZ se modificó para incluir dominio transmembrana de ROR1.

Un LTVEC se introduce en células ES C57BL/6NTac (Poueymirou et al. (2007); Valenzuela et al. (2003a)) con un dispositivo de electroporación multipocillos (Harvard Apparatus, Boston, MA) en tampón de electroporación (Millipore) 3,3 x 106 células, 0,67 |jg de ADN en un volumen de 0,125 ml seguido de cultivo en placas gelatinizadas de 15 cm. El medio de selección que contiene G418 se añadió 48 horas después de la electroporación y se cambió diariamente a partir de entonces. Las colonias resistentes a fármaco se recogieron 10 días después de la electroporación, se trataron con tripsina y se cultivaron en placas de 96 pocillos gelatinizadas durante al menos tres días antes de la extracción y purificación de ADN. Los clones de célula ES correctamente dirigidos se identificaron por el ensayo de modificación de alelo (MOA) (Frendewey et al. (2010), Methods in enzymology 476:295-307; Valenzuela et al. (2003a), Nat. Biotechnol. 21:652-659).

Se usó el método VelociMouse® (Dechiara, T.M., (2009), Methods Mol Biol 530:311-324; Poueymirou et al. (2007), Nat. Biotechnol. 25:91-99), en el cual se inyectaron células ES dirigidas en embriones Swiss Webster en fase de 8 células no compactadas para producir ratones de generación F0 derivados de célula ES completamente que portan las mutaciones de inactivación de DR6. Se usaron VelociMice® machos directamente para el perfil de expresión de lacZ o se cruzaron con hembras C57BL/129 para producir embriones o adultos para análisis de lacZ o para producir animales productores de F1 y se realizaron estudios fenotípicos en los ratones N2F1. Los cruces programados se llevaron a cabo asignando la mañana de identificación de tapones vaginales como día 0,5 (E0,5).

Ejemplo 2: Análisis fenotípico de animales que comprenden una mutación en un locus de DR6

Los estudios fenotípicos de ratones N2F1 comenzaron a las 6-8 semanas de vida. Para los cruces programados, asignamos la mañana de identificación de tapones vaginales como día embrionario 0,5 (E0,5). Se observaron los compañeros de camada DR6 KO y tipo silvestre desde el nacimiento para diferentes hitos del desarrollo (enanismo, respiración, anormalidades faciales y de extremidades, color de la piel, postura, enderezamiento y abertura del ojo) hasta aproximadamente 6-8 semanas de vida, cuando se guardaron en 12 h de luz por día a 69-74 °F (20,55-23,33 °C), y 40-60 % de humedad para el estudio. Todos los experimentos comenzaron a las 6-9 semanas de vida y todos los procedimientos se condujeron en cumplimiento con los protocolos aprobados por el "Regeneron Pharmaceuticals Institutional Animal Care and Use Committee".

El análisis del deterioro motor se condujo usando ensayo de rotarod, ensayo locomotor en campo abierto, y ensayo de pasarela. Durante el ensayo de pasarela, los sujetos caminan a través de una plataforma de vidrio iluminada mientras que una cámara de vídeo graba desde abajo. Los parámetros relacionados con los andares tales como el patrón de paso, la velocidad de balanceo de pata individual, la duración del apoyo y la presión se presentan para cada animal. Este ensayo se usa para cepas de ratones transgénicas fenotípicas y evalúa entidades químicas nuevas para su efecto sobre el comportamiento motor. CatWalk XT es un sistema para la evaluación cuantitativa de pisadas y andares en ratas y ratones. Se usa para evaluar la capacidad locomotora de roedores en casi cualquier tipo de modelo experimental de la anormalidad nerviosa central, nerviosa periférica, muscular o esquelética.

El deterioro de la neurona motora superior se presenta como espasticidad (es decir, rigidez), reflejos incrementados, temblor, bradiquinesia, y señales Babinski. El deterioro de la neurona motora inferior se presenta como debilidad muscular, desgaste, agarrotamiento, curvado y arrastre de los pies, y fasciculaciones. El deterioro bulbar se presenta como dificultad al tragar, mala pronunciación y fasciculacones de la lengua. La Tabla 2 proporciona la metodología de puntuación relativa a deterioro motor, temblor y rigidez de animales durante el ensayo. La evaluación de la función motora completa se realizó usando ensayos de puntuación subjetiva con enmascaramiento, y todos los datos se presentan como media /- EEM.

Tabla 2

Los datos muestran que los ratones DR6'A no muestran inmovilidad incrementada en comparación con sus homólogos tipo silvestre, pero demuestran un fenotipo neurológico similar a ELA (por ejemplo, menos actividad de cría que sugiere paresia de extremidad posterior) a aproximadamente 14 semanas de vida, aunque las diferencias en el tiempo sobre el rotarod y en el peso pueden verse tan pronto como a las 9 semanas de vida, cada una de las cuales reduce constantemente cuando progresa el tiempo (FIG.4-7). Sin embargo, la pérdida de neurona motora en ratones DR6-/" alcanza un umbral para los síntomas clínicos a aproximadamente 14 semanas de vida en el que el las puntuaciones de deterioro motor, la rigidez, y el temblor comienzan a reflejar parálisis y/o progresión grave de la enfermedad, lo cual no es dependiente del sexo del animal (FIG. 2). Los animales ^dR6-/" sintomáticos tienen peso reducido y anormalidades motoras significativas que reflejan tanto deterioro de neurona motora superior como inferior (FIG. 3), y mueren a aproximadamente 21 semanas de vida.

Ejemplo 3: Análisis anatómico de animales que comprenden una mutación en un locus de DR6

Ocho ratones tipo silvestre y ocho nuligénicos para DR6, de aproximadamente 20 semanas de vida, se sometieron a perfusión con 50 ml de solución salina seguido de 50 ml de solución de paraformaldehído (PFA) al 4 % en tampón acetato a pH 6,5 y 50 ml de solución de PFA al 4 % en tampón borato a pH 9,5. Después de la perfusión de los animales, se recogieron los cerebros y las médulas espinales de los ratones y se pusieron en 15 % seguido de 30 % de solución sacarosa en tampón borato hasta que se cogieron. A continuación, los tejidos se incrustaron en OCT y se congelaron usando 2-metilbutano.

Los tejidos congelados se cortaron, se montaron en portaobjetos, y se sometieron a inmunotinción con hematoxilina y eosina (H&E) y azul rápido Luxol. Se seleccionaron al azar cuatro portaobjetos teñidos con H&E por médula espinal para recontar el número de neuronas motoras en cada médula espina.

Un portaobjeto representativo se proporciona en la FIG. 9. La media del número de neuronas motoras por portaobjeto en las médulas espinales de ratones tipo silvestre es de aproximadamente 18, mientras que los ratones nuligénicos es de aproximadamente 2 con un valor p de menos de 0,0001 (FIG. 9). Esto muestra que los ratones nuligénicos para DR6 sintomáticos tienen una pérdida significativa de neuronas motoras en sus médulas espinales en comparación con sus homólogos tipo silvestre. Además, las médulas espinales de ratones nuligénicos presentan patología espongiforme, que reúne la patología del cerebro humano de pacientes de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, sugiriendo una posibilidad de fenotipo de enfermedad de neurona motora tipo prion en estos animales.

Ejemplo 4: Expresión de proteínas neuronales por animales que comprenden una mutación en un locus de DR6

Se recogió ARNm total de los cerebros y las médulas espinales de 10 ratones tipo silvestre y 7 nuligénicos para DR6 a aproximadamente 20 semanas de vida. A continuación, se realizó RT-PCR con Taqman® sobre estas muestras de ARNm. Los niveles medios de ARNm para genes de proteína de unión a mielina (MBP), receptor del factor de crecimiento nervioso (NGFR), colina acetiltransferasa (Chat), Mnx homeobox, subunidad 3B (Grin3b) del receptor del glutamato [NMDA], y del receptor 2 del glutamato (Gria2), a continuación, se normalizaron por la expresión de beta actina en las muestras.

Las FIG. 10-12 muestran que las expresiones de MBP, Mnx, y Grin3b se reducen en las médulas espinales pero no en los cerebros de ratones nuligénicos para DR6, fortaleciendo la evidencia de la pérdida de neuronas motoras en las médulas espinales de ratones nuligénicos para DR6 sintomáticos. Las expresiones de Ngfr, Chat y Gri2a no están afectadas.

Ejemplo 5: Patrones de expresión génica en animales que comprenden una mutación en el locus de DR6 endógeno

El perfil génico se realizó con ARN extraído de tejidos del cerebro y la médula espinal de ratones tipo silvestre de 10 semanas de vida (n=5 machos), ratones DR6'/_ de 10 semanas de vida presintomáticos (n=5 machos), ratones tipo silvestre de 20 semanas de vida (n=6 machos y 3 hembras), y ratones DR6'/_ de 20 semanas de vida sintomáticos (n=6 machos y 3 hembras).

Los cerebros y las médulas espinales de ratones DR6'/_ de 10 y 20 semanas de vida tienen solapamiento significativo de la expresión génica y comparten distintivos de expresión génica similares (datos no mostrados). Se identificaron setenta y tres genes significativos tanto en el cerebro como en las médulas espinales de ratones DR6'/_ de 10 semanas de vida como potencialmente implicados en el mecanismo y la progresión de la enfermedad. Los distintivos génicos de las médulas espinales de ratones DR6'/_ de 10 semanas de vida también se correlacionaron altamente con los bioconjuntos de ELA humana y SOD1 murina (datos no mostrados), confirmando además los ratones DR6'/_ como un modelo de ratón de ELA. El cerebro y las médulas espinales de ratones DR6'/_ de 10 semanas de vida mostraron un distintivo de expresión génica ligado a respuesta inmunitaria que sugirió que el proceso de la enfermedad implicaba una ruta inflamatoria.

Ejemplo 6: Los animales DR6-/- muestran homeostasis celular inmunitaria periférica

Se recogieron sangre, médula ósea, timo y tejidos esplénicos de ratones tipo silvestre y DR-/- de 10 y 20 semanas de vida para fenotipado por análisis por citometría de flujo usando anticuerpos para CD3, B220, CD21 y CD2 (todos obtenidos de BD Biosciences San José, CA o eBioscience San Diego, c A). Adicionalmente, se evaluaron las concentraciones de citocina y quimiocina en sueros aislados de ratones tipo silvestre y DR6-/- de 20 semanas de vida usando el Panel 20-Plex magnético de citocina de ratón Lumex para la determinación cuantitativa simultánea de FGF básico, GM-CSF, IFN-^y, IL-1a, IL-1 p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-12 (p40/p70), IL-17, IP-10, KC, MCP-1, MIG, MIP-1a, TNF-a, y VEGF.

Ni los ratones DR6-/- de 10 semanas de vida ni de 20 demostraron un efecto robusto en homeostasis celular inmunitaria periférica (FIG. 13-14). Los ratones DR6-/- mostraron desarrollo normal de linfocitos B y homeostasis progenitora celular temprana en la médula ósea, un incremento de 2 veces en los linfocitos B en el timo, un incremento en los linfocitos B transicionales esplénicos 1 y reducción en los linfocitos B de la zona marginal esplénica, una reducción en los neutrófilos periféricos y un incremento en los linfocitos periféricos (FIG. 13). En la médula ósea, los ratones DR6-/-mostraron un incremento del 14% en progenitores de megacariocitos/eritrocitos, una reducción del 20% en progenitores mieloides, pero no cambios significativos en el número celular total (FIG. 14). Aunque los animales DR6-/- mostraron desarrollo normal de linfocitos T y diferenciación en el timo, había un incremento del 20 % en células dendríticas maduras/comunes esplénicas, un incremento del 25 % en macrófagos y eosinófilos, un incremento del 75 % en neutrófilos esplénicos y monocitos, y una reducción del 19 % en linfocitos T CD4+. Sin embargo, no había cambio significativo en el número celular total en el bazo (datos no mostrados). Además, los niveles de citocina y quimiocina en los sueros de ratones DR6-/- de 20 semanas de vida no están cambiados en comparación con los animales tipo silvestre (FIG. 15). Estos datos indican que los ratones DR6-/- no van a través de una respuesta de inflamación general durante la progresión de la enfermedad, y sugiere que la respuesta de inflamación vista con el perfil genético puede ser neuroinflamación localizada.

Ejemplo 7: Neuronas motoras derivadas de célula madre embrionaria de ratones DR6+/- demuestran estrés oxidativo incrementado.

Células madre embrionarias de masa interna se aislaron de animales tipo silvestre (DR6+/+) o DR6+/- heterocigóticos y se cultivaron en medio de célula madre embrionaria (ESM; DMEM 15 % de Suero fetal bovino Penicilina/Estreptomicina Glutamina Aminoácidos no esenciales nucleósidos p-mercaptoetanol Piruvato de sodio LIF) durante 2 días para permitir la formación de cuerpos embrioides (EB). Los EB se cultivaron durante dos días en medio de diferenciación (DM: DMEM/F12 avanzado Medio neurobasal 10 % de suero de inactivación Penicilina/estreptomicina Glutamina p-mercaptoetanol), y durante unos 5 días adicionales en DM y ácido retinoico y agonista smoothened para obtener neuronas motoras. Las neuronas motoras disociadas se colocaron en placa y se maduraron en medio de neurona motora derivada de célula madre embrionaria (ESMN; Medio neurobasal 2 % de Suero de caballo B27 Glutamina Penicilina/Estreptomicina p-mercaptoetanol 10 ng/ml de GDNF, BDNF, CNTF) para establecer líneas de neurona motora estables. Los recuentos de neurona motora se determinaron el día 7 y el estrés oxidativo se midió 1 y 7 días después del establecimiento de líneas de neurona motora estables.

Los datos muestran que los animales DR6+/- generan el mismo número de neuronas motoras que los animales tipo silvestre, pero tienen estrés oxidativo incrementado en comparación con los animales tipo silvestre (FIG. 16).

Ejemplo 8: Comparación fenotípica de animales DR6+/- y DR6+/+.

La función motora de los animales control, y los ratones heterocigóticos u homocigóticos para la modificación genética de DR6 como se describe en el Ejemplo 1 se comparó usando el ensayo descrito en el Ejemplo 2. En la FIG. 17A se comparan las puntuaciones neurológicas, en la FIG. 17B se muestran las comparaciones del aumento de peso, en la FIG. 17C se muestran las comparaciones del ensayo de rotarod, en las FIG. 17D-17K se proporcionan las medidas en campo abierto, y en las FIG. 17L-17Z se muestran las medidas de pasarela.

Los efectos tipo "dependiente de la dosis" significativos de la mutación de DR6 se vieron en el aumento de peso de los animales (FIG. 17B), durante el ensayo de rotarod (FIG. 17C), en cría y tiempos de cría medidos en los ensayos en campo abierto (FIG. 17D-17E) y en la longitud de paso y velocidad de balanceo de las extremidades posteriores durante el ensayo de pasarela (FIG. 17L-17N).

Aunque los ratones heterocigóticos parecían neurológicamente similares a los animales tipo silvestre cuando se evaluó la función motora general en el ensayo de puntuación subjetiva con enmascaramiento (FIG. 17A), a las 21 semanas de vida, las puntuaciones neurológicas de ratones heterocigóticos comenzaron a tender hacia las puntuaciones neurológicas de los ratones homocigóticos (FIG. 17A). Varias otras medidas siguieron el mismo patrón, de ese modo el fenotipo de ratones heterocigóticos tendió hacia el de los ratones homocigóticos después de 20 semanas de vida (véase, por ejemplo, FIG. 17F-17K, 17O).

Esto sugiere que la mutación de DR6 es haploinsuficiente en ratones heterocigóticos para la mutación. Los datos también sugieren que cuando los ratones DR6+/- heterocigóticos envejecen, los ratones comenzarán a presentar defectos motores y/o neurológicos similares a ratones DR6'/_ homocigóticos en aquellas mediciones que parecen normales a primera vista (véase, por ejemplo, FIG., 17O-17P, 17R).

Ejemplo 9: Percepción sensorial deficiente de animales DR6+/- y DR6+,+

La nocicepción térmica de animales control, y ratones heterocigóticos u homocigóticos para la modificación genética de DR6 a las 20 semanas de vida se ensayó colocando los animales sobre una superficie metálica mantenida a 48 °C, 52 °C o 55 °C (IITC, Woodland Hills, CA). Se midió la latencia de respuesta, definida como el tiempo transcurrido hasta que el animal lamió o sacudió una pata trasera, al estímulo de calor. Los ratones permanecieron sobre la placa hasta que realizaron cualquiera de los dos comportamientos nocifensivos: lamer la pata trasera o agitar la pata trasera.

Como se muestra en la FIG. 18, tanto los animales DR6+/- como DR6+/+ muestran déficit sensorial. El déficit sensorial visto en DR6+/-es probablemente preciso puesto que estos ratones no presentan prominente disfunción motora a las 20 semanas de vida (véase, el Ejemplo 8). Sin embargo, se debería indicar que el retraso en la respuesta en ratones DR6-/- puede ser debida a los síntomas motores deficientes observados.

Los roedores divulgados en el presente documento proporcionan un nuevo modelo animal que sigue de manera más similar la progresión de ELA en seres humanos. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, una de varias posibilidades es que los roedores puedan fallar en mostrar recorte sináptico normal durante el desarrollo, y por tanto, los roedores se desarrollan con conectividad incrementada e hiperexcitabilidad leve, lo cual conduce a la excitotoxicidad de bajo nivel que se acumula con el tiempo. Notablemente, aunque los animales nuligénicos para DR6 adultos pueden mostrar permeabilidad de barrera cerebral sanguínea (BBB) incrementada y desarrollo deteriorado de marcadores de BBB durante el desarrollo, es probable que el fenotipo tipo ELA de los ratones descritos en el presente documento sea un resultado del papel que juega DR6 durante el desarrollo vascular cerebral, ya que los déficits en la barrera cerebral sanguínea normalmente se manifiestan como deterioros, cognitivos, no motores.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula de roedor modificada por ingeniería genética que comprende en su genoma un locus de DR6 endógeno modificado (i) que comprende una deleción de la región codificante de DR6 entera, o una porción de la misma, y (ii) que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de DR6 funcional fusionado operativamente a un dominio transmembrana, en la que el dominio transmembrana está fusionado operativamente a una proteína indicadora, en la que la secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a un promotor de DR6 endógeno, en la que cualquier polipéptido codificado por el locus de DR6 endógeno carece de un dominio citoplasmático de DR6 funcional.

2. La célula de roedor modificada por ingeniería genética de la reivindicación 1, en la que

(a) el péptido señal de DR6 funcional es un péptido señal de DR6 endógeno;

(b) el dominio transmembrana no es un dominio transmembrana de DR6 endógeno;

(c) el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de ROR1; y/o

(d) la proteína indicadora es beta galactosidasa.

3. La célula de roedor modificada por ingeniería genética de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la célula de roedor modificada por ingeniería genética es heterocigótica para el locus de DR6 endógeno modificado.

4. La célula de roedor modificada por ingeniería genética de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la célula de roedor es una célula de rata o una célula de ratón.

5. La célula de roedor modificada por ingeniería genética de la reivindicación 4, en la que la célula de roedor es una célula de ratón, y en la que el locus de DR6 de ratón endógeno comprende, unida operativamente a un promotor de DR6 endógeno, una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de DR6 endógeno fusionado operativamente a un dominio transmembrana de ROR1 que está fusionado operativamente a la p-galactosidasa.

6. La célula de roedor modificada por ingeniería genética de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la secuencia de ácido nucleico es como se expone en la SEQ ID NO: 17.

7. La célula de roedor modificada por ingeniería genética de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la célula de roedor es una célula madre embrionaria.

8. La célula de roedor modificada por ingeniería genética de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la célula de roedor es una neurona motora.

9. Un cuerpo embrioide de roedor desarrollado a partir de la célula madre embrionaria de roedor modificada por ingeniería genética de la reivindicación 7.

10. Una neurona motora de roedor diferenciada a partir del cuerpo embrioide de roedor de la reivindicación 9.

11. La célula de roedor modificada por ingeniería genética de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, el cuerpo embrioide de roedor de la reivindicación 9 o la neurona motora de roedor de la reivindicación 10, en la que la célula de roedor, el cuerpo embrioide de roedor o la neurona motora de roedor se cultiva.