JP2021176890A - タンパク質のｐｅｇ化に用いるための添加物系 - Google Patents

Abstract

【課題】タンパク質のＰＥＧ化に用いるための添加物系を提供する。【解決手段】添加物系は、単体で、または３，５−ジアミノ安息香酸などの芳香族アミンと、または塩化アンモニウムもしくは酢酸アンモニウムなどのアンモニウム塩との組み合わせで用いられるｐ−アミノ安息香酸ヒドラジドを含む。本開示の添加物の組み合わせは、上昇した反応速度、高い収率、および結合反応に競合するのに必要とされるアミノオキシ−ＰＥＧ当量の減少などのいくつかの利益を提供する。典型的な反応は、添加物または添加物系を、タンパク質およびアミノオキシ−ＰＥＧ試薬の溶液と合わせることによって進行させることができる。溶液をｐＨ４に調整し、２０−２５℃で、完了するまで、一般には２４時間以内、攪拌を行わずに保つ。【選択図】図６

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、仮特許出願第６２／２５８６４４号（２０１５年１１月２３日出願）の利益を主張し、その教示は引用によって本明細書に具体的に援用される。

本開示はタンパク質のＰＥＧ化反応に用いるための、改良された添加物系に関する。特に、本開示はｐ−アセチルフェニルアラニン残基を含むタンパク質とアミノオキシ−ＰＥＧ化合物との間の結合反応のための添加物を特定する。

タンパク質のＰＥＧ化は、ポリエチレングリコール誘導体を治療用タンパク質に結合させて、クリアランス率を減少させ、タンパク質分解酵素および免疫系の認識からの立体遮蔽を提供することによって、その安定性および薬物動態を改善することに関わる結合方法である（Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｍ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ， ５４：４５９（２００２））。一般に、ＰＥＧ化技術は２種類、すなわち無作為および部位特異的な結合に分類することができる。無作為なＰＥＧ化によってＰＥＧ化試薬はリシンまたはシステインなどの反応性アミノ酸に任意に結合され、ＰＥＧ化生成物の混合物を生じる。一方で、部位特異的な結合は、タンパク質に結合するＰＥＧ残基の位置および数を制御するために、天然の官能基（例えば、ＮまたはＣ末端基）または非天然アミノ酸（例えば、ｐ−アセチルフェニルアラニン−ｐＡｃＦ）の一義的な反応性を利用する。ＰＥＧ化試薬とｐＡｃＦ残基との間のケトキシム形成などの部位特異的な結合反応は、遺伝暗号の拡張によって基質タンパク質に組み込まれる（Ｌｉｕ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ７９：４１３ （２０１０）； Ｔｉａｎ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．，‘‘Ａｃｃｅｌｅｒａｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ’’，米国特許第７，４６８，４５８号（２００８年１２月２３日出願））。これらおよび証明された有用性に関わらず、ケトキシムの形成に基づく結合は遅い速度および不完全な変換に悩まされている（Ｃｒｉｓａｌｌｉ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ７８：１１８４（２０１３））。ケトキシム形成を改良するための試みとしては、過剰量のＰＥＧ化試薬の使用、高温または毒性触媒の高濃度が挙げられる。これらの溶液は、しかしながら、生成物から過剰量のＰＥＧ化試薬または毒性触媒を除去するステップをさらに含み、しばしばタンパク質の安定性を損なう。さらに、古い方法は添加物を用いない、変性剤（尿素）を用いる、および／またはアセチルヒドラジド（ＡｃＮＨＮＨ_２）を添加物として用いる。ＡｃＮＨＮＨ_２および関連する構造は、ＰＣＴ出願第ＷＯ２００７／０５６４４８号において定義されている。

当技術分野において今必要であるのは、失速に影響する機構的原理を調べることによって、および反応を加速させ、低いＰＥＧ：タンパク質のモル比での高変換を促進する新たな添加物を特定することによって、ｐＡｃＦ残基を含むタンパク質（レラキシンおよびＦＧＦ２１）のＰＥＧ化の収率および速度を向上させる新たな方法である。この方法は経済的であり、かなり少量のＰＥＧ化剤で高い変換率を促進し、高い反応温度および遺伝毒性物質を除去する必要性を回避する、より早い反応を促進するべきである。

第一の実施態様において、本開示はタンパク質のＰＥＧ化反応のための改良された添加物系であって、ｐ−アミノ安息香酸ヒドラジドを単体で、または芳香族アミンもしくはアンモニウム塩との組み合わせで含む前記添加物系を提示する。

別の実施態様において、本開示はＰＥＧ化タンパク質を得るための方法であって、以下のステップ：タンパク質、ＰＥＧ試薬、および添加物系を特定すること；およびタンパク質を溶解させ、次いで、添加物系の存在下でＰＥＧ試薬と組み合わせて、ＰＥＧ化タンパク質を高収率で得ることを含む前記方法を提示する。

さらなる実施態様において、本開示は治療を必要とする対象の治療に用いるための、前記実施態様に記述された方法によって得られるＰＥＧ化タンパク質を含む医薬組成物を提示する。

ケトキシム形成の一般的なメカニズム。 ２０ｋＤａのＰＥＧ−ＯＡ試薬による、レラキシン（水中の４ｍｇ／ｍＬ）のＰＥＧ化のクロマトグラム。 空気の連続気流に曝された場合の、水中での２０ｋＤａ ＰＥＧ−ＯＡの分解の時間経過。 インサイチュＩＲおよび^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを用いたアセチルヒドラジドの安定性試験。 添加物スクリーニングのためのモデル反応。反応条件：室温（２３℃）、１．０ｍＬの酢酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ４．０）中に、１（３．６ｍｍｏｌ）および２（３．６ｍｍｏｌ）。

異なる添加物について観測された相対速度（ｋ_ｒｅｌ）。アセチルヒドラジド（ｋ_ｒｅｌ〜２）を四角の中に示す。 （ａ）１当量のピラゾールアミン（赤）；（ｂ）１当量のＭＣＨ（青）；（ｃ）１当量のピラゾールアミンおよび１当量のＭＣＨ（緑）の存在下で、ジペプチド１とＯ−ベンジルヒドロキシルアミン（２）との反応の時間経過。添加物の非存在下で得られた反応プロファイルは、グレーで示す。 ジペプチド１（ａ）と、（ｂ）１当量のＭＣＨ（緑）；（ｃ）１当量のＭＣＨおよび１当量のピラゾールアミン（グレー）；（ｄ）１当量のピラゾールアミン（赤）とを含むサンプルの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルの芳香族領域。ＭＣＨとピラゾールアミン添加物との相乗効果によって、１つの添加物のみを含むサンプルと比較して活性な中間体を高濃度で含む混合物生じる。 左：３０当量のＰＡＢＨおよび１．２当量の２０ｋＤａのＰＥＧ−ＯＡによるジペプチド１のＰＥＧ化；ヒドラゾン中間体は緑の点として示す。右：ジペプチドを３０当量のＰＡＢＨで一晩平衡化した後、１．２当量のＰＥＧ化試薬を加えたＰＥＧ化反応。 左：ジペプチド１のＰＥＧ化のための、ヒドラゾン濃度対ＰＡＢＨの当量のプロット；青の点はピラゾールアミンを除く反応混合物を示す。中央：ＰＡＢＨおよびピラゾールアミンの異なる組み合わせの、反応速度への影響。右：ＰＡＢＨおよびピラゾールアミンを含む反応混合物中の、ジペプチド１およびそのヒドラゾン誘導体の最終濃度。

添加物の総当量およびピラゾールアミン：ＰＡＢＨ比に対する、反応終了時における残留したジペプチド１のプロット。 左：（ａ）３０当量のアセチルヒドラジド（青）；（ｂ）３０当量のＭＣＨ（赤）の存在下での、２０ｋＤａ ＰＥＧ−ＯＡ（１．５当量）とレラキシンの反応の時間経過；添加物の非存在下で得た反応プロファイルはグレーで示す。中央：（ａ）３０当量のピラゾールアミン（青）；（ｂ）３０当量のＭＣＨ（赤）；（ｃ）１０当量のＭＣＨ（紫）；（ｄ）３０当量のピラゾールアミンおよび１０当量のＭＣＨ（緑）；（ｅ）３０当量のＭＣＨおよび３０当量のピラゾールアミンの存在下での、ＰＥＧ−ＯＡ（１．５当量）とレラキシンの反応の時間経過。右：（ａ）４０℃；（ｂ）１０℃；（ｃ）２５℃における、３０当量のピラゾールアミンおよび１０当量のＭＣＨの存在下での、ＰＥＧ−ＯＡ（１．５当量）とレラキシンの反応の時間経過。 左：６Ｍの尿素中の（ａ）３０当量のＭＰＣＨおよび３０当量のピラゾールアミン（緑）；（ｂ）３０当量のＰＨおよび３０当量のピラゾールアミン（青）；および（ｃ）３０当量のＭＣＨおよび３０当量のピラゾールアミン（赤）の存在下での、２０ｋＤａのＰＥＧ−ＯＡ（１．２当量）とレラキシンとの反応の時間経過。右：（ａ）３０当量のＰＨおよび６０当量のピラゾールアミン（青）；（ｂ）３０当量のアセチルヒドラジドおよび６０当量のピラゾールアミン（緑）；および（ｃ）３０当量のＰＡＢＨおよび６０当量のピラゾールアミン（赤）の存在下での、ＰＥＧ−ＯＡ（１．２当量）とレラキシンとの反応の時間経過。 終点においてＭＣＨによって加速する、レラキシンのＰＥＧ化のＨＲＭＳ解析。オキシムのピークは残留したレラキシンと重なる。レラキシンのピークについての０．０４分の遅れは、遅く溶出する不純物によるものというよりは、クロマトグラフィーの挙動に対する反応マトリクスの影響によるものである。 左：６Ｍの尿素と、（ａ）３０当量のＭＣＨおよび３０当量のピラゾールアミン（赤）；（ｂ）３０当量のＭＣＨ、３０当量のピラゾールアミン、および３０当量のＮＨ_２ＯＨ（青）の存在下での、２０ｋＤａのＰＥＧ−ＯＡ（１．２当量）とレラキシンの反応の時間経過。右：６Ｍの尿素と、３０当量のＭＣＨおよび３０当量のピラゾールアミン（青）の存在下での、ＰＥＧ−ＯＡ（１．２当量）とのレラキシンの減少の時間経過；オキシムのピーク（赤）が反応中に増大し、ＰＥＧ−ＯＡ分解からヒドロキシルアミンの同時形成が示唆される。

左：３０当量のＰＡＢＨと（ａ）６０当量のエチレンジアミン（グレー）；（ｂ）６０当量の３，５−ジアミノ安息香酸（緑）；（ｃ）６０当量のｍ−フェニレンジアミン（青）；および６０当量のピラゾールアミン（赤）の存在下での、２０ｋＤａのＰＥＧ−ＯＡ（１．２当量）とレラキシンの反応の時間経過。右：（ａ）３０当量のＰＡＢＨおよび６０当量の３，５−ジアミノ安息香酸（緑）；および（ｂ）６０当量のＰＡＢＨおよび１２０当量のＮＨ_４Ｃｌ（青）の存在下での、ＰＥＧＯＡ（１．２当量）とレラキシンの反応の時間経過。 予備的ＰＥＧ化スクリーニングのためのスキーム。 レラキシンおよびＦＧＦ２１の異なるアミンによるＰＥＧ化のスキーム。 総当量対アミン：ＰＡＢＨ比対ＦＧＦ２１の最終濃度の曲率プロットで示す、ｏ−およびｍ−フェニレンジアミンのＰＥＧ化の結果。左：ｏ−フェニレンジアミン。右：ｍ−フェニレンジアミン。 添加物の総当量対アミン：ＰＡＢＨ比、並びにＰＡＢＨおよび３，５−ジアミノ安息香酸を用いたＰＥＧ化の変換のプロット。左：３０ｋＤａのＰＥＧ−ＯＡとＦＧＦ２１。右：２０ｋＤａのＰＥＧ−ＯＡとレラキシン。

左：１２０当量の塩および６０当量のＰＡＢＨ触媒の存在下での、（ａ）６Ｍの尿素（緑）；（ｂ）ＮＨ_４Ｃｌ（グレー）；および（ｃ）（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を用いた、２０ｋＤａのＰＥＧ−ＯＡ（１．２当量）とレラキシンとの反応の時間経過。 添加物の非存在下（青）、および（ａ）１２０当量のＮＨ_４Ｃｌ（赤）、（ｂ）６０当量のアセチルヒドラジド（グレー）、および（ｃ）６０当量のアセチルヒドラジドおよび１２０当量のＮＨ_４Ｃｌ（緑）の存在下での、２０ｋＤａのＰＥＧ−ＯＡ（１．２当量）とレラキシンの反応の時間経過。 左：１２０当量のＮＨ_４Ｃｌを加える前および後（それぞれ、青および赤）のレラキシンのＵＶスペクトル。右：芳香族残基を赤で強調した、レラキシンのアミノ酸配列。 左：１２０当量のＮＨ_４Ｃｌを加える前および後（それぞれ、青および紫）のレラキシンのＩＲスペクトル。右：構造変化の暫定的な帰属を含む、１２０当量のＮＨ_４Ｃｌを加えた後のＩＲスペクトルの挿入図。 １２０当量のＮＨ_４Ｃｌを加える前および後（それぞれ、赤および青）のレラキシンの^１５Ｎ ＮＭＲ ＨＳＱＣスペクトル。

１２０当量のＮＨ_４Ｃｌを加える前（青）および後（それぞれ、青および緑）のレラキシンの近ＵＶ ＣＤスペクトル。 市販のＰＡＢＨに存在する可能性のある不純物の構造。

本出願の他の箇所で特に明記されていない限り、以下の用語が本明細書で用いられ、以下の意味を有するものとする。
略称
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール
ＰＥＧ−ＯＡ：ポリエチレングリコール−オキシアミン
ｍＰＥＧ：メトキシポリエチレングリコール
ＭＣＨ：モルホリン ４−カルボヒドラジド
ＭＰＣＨ：４−メチルピペラジン−１−カルボヒドラジド
ＰＨ：ピバルヒドラジド
ＰＡＢＨ：ｐ−アミノ安息香酸ヒドラジド
ＰＭＢＨ：ｐ−メトキシ安息香酸ヒドラジド

本明細書で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から明らかにそうでないと示されない限り、複数の指示対象を含むことに注意すべきである。特に明示されない限り、本明細書で用いられる全ての技術および化学用語は、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。特に言及されない限り、本明細書に記載される全ての範囲は特定の端点を含む。以下の用語を下に示す。

約：用語「約」は本明細書において、およそ、ざっと、近く、またはその辺りを意味して用いられる。用語「約」が数値範囲と組み合わせて用いられる場合、記載される数値範囲の上および下の境界を拡張することによってその範囲を変更する。一般に、用語「約」は本明細書において、５パーセントの上下（高低）の分散だけ、記載された値の上下の数値を修正して用いられる。

添加物系：用語「添加物系」は本明細書において、「触媒化合物」を意味し、単体、または組み合わせのいずれかを意味して用いられる。例えば、ｐ−アミノ安息香酸ヒドラジド単体、または芳香族アミン、すなわち３，５−ジアミノ安息香酸、Ｏ−フェニレンジアミン、１−ピリジン−２−イル−エチルアミン、２−（ジメチルアミノ）エチルヒドラジン、ｍ−フェニレンジアミンもしくは２−ピコリルアミンとの組み合わせ、またはアンモニウム塩、すなわち酢酸アンモニウムもしくは塩化アンモニウムとの組み合わせである。好ましい触媒化合物としては、ｐ−アミノ安息香酸ヒドラジドと３，５−ジアミノ安息香酸との組み合わせ、またはｐ−アミノ安息香酸ヒドラジドと塩化アンモニウムとの組み合わせが挙げられる。

含む：用語「含む」は「含有する」を意味し、例えば、Ｘを「含む」組成物はもっぱらＸから構成されてもよく、または、例えばＸ＋Ｙのように、追加のものを含んでもよい。

ＰＥＧ：用語「ＰＥＧ」は、本開示の文脈で用いられる場合、ポリエチレングリコールまたは誘導体化ポリエチレングリコールをいう。
ＰＥＧ化またはＰＥＧ化方法：用語「ＰＥＧ化」または「ＰＥＧ化方法」は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖を、他の分子、本開示の文脈においては、ｐーアセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＦ）残基を含むタンパク質、例えば、これらに限定はされないが、レラキシンおよびＦＧＦ２１に結合させる方法をいう。

結合：本明細書で用いられる用語「結合」（conjugation）は、ｐ−アセチルフェニルアラニン残基を含むタンパク質と、アミノオキシ−ＰＥＧ化合物との結合反応をいう。

これは一般に、ＰＥＧの活性化、および活性化ＰＥＧ中間体を直接、標的タンパク質／ペプチド、または後で活性化され、標的タンパク質／ペプチドに結合されるリンカーと結合させることに関する（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５２：３５７１ （１９７７） ａｎｄ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５２：３５８２ （１９７７）， Ｚａｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｃｈａｐｔｅｒｓ ２１ ａｎｄ ２２， Ｈａｒｒｉｓ， Ｊ．Ｍ．， ｅｄ．， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ（１９９２）を参照されたい）。ＰＥＧ分子が結合していないタンパク質は、未結合または遊離と称されうるが、ＰＥＧ分子を含むポリペプチドはまた、結合またはＰＥＧ化タンパク質としても知られていることに注意されたい。
ＰＥＧ試薬またはＰＥＧ化試薬：ＰＥＧ化反応を補助する試薬。

当然のことながら、任意の示される例示的な実施態様は、１つ以上のさらなる例示的な実施態様と組み合わせることができる。
第１の局面において、本開示はタンパク質のＰＥＧ化反応のための改良された添加物系であって、ｐ−アミノ安息香酸ヒドラジドを単体で、または芳香族アミンまたはアンモニウム塩との組み合わせで含む前記添加物系を提示する。
第１の局面の第１の実施態様において、芳香族アミンは３，５−ジアミノ安息香酸、Ｏ−フェニレンジアミン、１−ピリジン−２−イル−エチルアミン、２−（ジメチルアミノ）エチルヒドラジン、ｍ−フェニレンジアミンおよび２−ピコリルアミンから成る群から選択される。

第１の局面の第２の実施態様において、アンモニウム塩は酢酸アンモニウムおよび塩化アンモニウムから成る群から選択される。
第１の局面の第３の実施態様において、好ましい添加物系の組み合わせとしては、ｐ−アミノ安息香酸ヒドラジドと３，５−ジアミノ安息香酸、またはｐ−アミノ安息香酸ヒドラジドと塩化アンモニウムが挙げられる。

第１の局面の第４の実施態様において、反応はｐ−アセチルフェニルアラニン残基を含むタンパク質とアミノオキシ−ＰＥＧ化合物との結合反応である。
第１の局面の第５の実施態様において、添加物系は結合反応速度を増大させ、高収率の結合生成物を提供し、結合反応の競合に必要とされるアミノオキシ−ＰＥＧ等価物の減少を促進する。

第２の局面において、本開示はＰＥＧ化タンパク質を得るための方法であって、以下のステップ：タンパク質、ＰＥＧ試薬、および添加物系を特定すること；並びにタンパク質を溶解させ、次いで、添加物系の存在下でＰＥＧ試薬を組み合わせて、ＰＥＧ化タンパク質を高収率で得ることを含む前記方法を提示する。
第２の局面の第１の実施態様において、タンパク質は、ｐＡｃＦ残基を含むレラキシンまたはＦＧＦ２１である。

第２の局面の第２の実施態様において、ＰＥＧ試薬と合わせた可溶化タンパク質溶液を、約４のｐＨで維持する。
第２の局面の第３の実施態様において、反応混合物を約２０℃から約２５℃の範囲の温度で維持する。
第２の局面の第４の実施態様において、添加物系としては、ｐ−アミノ安息香酸ヒドラジド単体、または３，５−ジアミノ安息香酸などの芳香族アミン、または酢酸アンモニウムもしくは塩化アンモニウムなどのアンモニウム塩との組み合わせが挙げられる。

第２の局面の第５の実施態様において、高品質のｐ−アミノ安息香酸ヒドラジドと塩化アンモニウムとの組み合わせの添加物が、ＰＥＧ化タンパク質の大規模生産における使用に好ましい。
第２の局面の第６の実施態様において、ＰＥＧ試薬はＰＥＧ−ＯＡ、およびアミノオキシ基を有する他のＰＥＧ誘導体から成る群から選択される。
第３の局面において、本開示は第２の局面に列挙された方法によって得られるＰＥＧ化タンパク質を含む医薬組成物、および治療を必要とする対象の治療に用いるための実施態様を提示する。

実施例
本開示はここで特定の実施態様に関連して記述され、これらはその範囲を限定することを意図するものではない。それどころか、本開示は特許請求の範囲内に含まれうる全ての代替物、変更物、および等価物を含有する。したがって、特定の実施態様を含む以下の実施例は、本開示の１つの実施を例示し、これは実施例が特定の実施態様を例示するためのものであり、その方法および概念的局面が、最も有用で容易に理解される記述であると考えられるものを提供するために提示されていると理解されるべきである。

カルボニル基とヒドロキシルアミン誘導体との反応の一般的な機構は、小分子反応物については周知である（Ｊｅｎｃｋｓ， Ｗ．Ｐ．， Ｐｒｏｇ． Ｐｈｙｓ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ２：６３ （１９６４）、およびそこで援用される引用）。この方法は酸に触媒され、一般的に、多段階平衡反応に先行して脱水を必要とする。ケチミンは、１，３−アリル歪みのため、アルジミンよりも遅い速度で形成されるが、単純なアルキルオキシアミンの場合、ケトン−ケチミン平衡は大きく脱水にシフトする（図１）。

実施例１
反応の失速の潜在的な原因としての、ＰＥＧ化試薬の分解を調べるための研究
ＰＥＧ化の失速の潜在的な原因の１つとして、ＰＥＧ化試薬の分解が挙げられる。ＰＥＧ試薬はＵＶ活性ではないため、反応中のその存在を追跡するための別の検出方法が必要である。蒸発光散乱検出は、ネブライザーを介してＨＰＬＣ移動相を通過して、溶媒を除去することを含む。検出器内のレーザービームから回折光を形成するあらゆる固体粒子は、シグナルを生じる。この方法によって、光を回折することのできる固体を形成するあらゆる化合物を検出することができる。ＰＥＧ化試薬は高分子量固体であるため、ＥＬＳ検出を用いたＨＰＬＣ解析の優れた候補である。これは図２において証明される。ＵＶでの追跡を緑で示し、ＥＬＳでの追跡を黒で示す。上部のクロマトグラム（緑）は２１０ｎｍにおけるＵＶでの追跡であり、黒のクロマトグラムは、ＵＶ検出と連続して得られた同じ混合物のＥＬＣでの追跡である。明らかに、下部の黒色の追跡は、特に、後で溶出するＰＥＧに基づく化合物について、多くの情報を提供する。

後期溶出ピークはＵＶ活性ではなく、反応の開始時においても存在していなかった。これはＰＥＧ化試薬の競合的な分解であると示唆される。確かに、この化合物は、ＰＥＧ化試薬の溶液が空気に曝された時に生成した（図３）。２０ｋＤａのＰＥＧ−ＯＡ試薬の変換率は、〜４ｍｇ／ｍＬの濃度において、＞９７％であり、ＰＥＧ化において反応しない副生成物を生じた。

この分解は、ＰＥＧ化試薬が溶媒中に溶解したガスと反応した結果であるため、分解速度と濃度には逆相関があるはずである。この仮説は、３０−４０ｍｇ／ｍＬのより反応に関連する濃度において、２０ｋＤａのＰＥＧ−ＯＡのサンプルがより安定である（＜５％の分解）という観察結果と一致する。分析中のサンプルの安定性を確保するために、この計画の分析作業にいくらかの影響が生じうるが、より反応に関連する条件下における最小限の分解によって、空気によるＰＥＧの分解が観測された反応失速の強力な原因ではないという結論が導かれる。ＰＥＧ化試薬の安定性はまた、ＰＥＧ化を活性化するために用いる添加物の存在中においても研究した。これらの実験は、標的のＰＥＧをレラキシンに対して１．２当量加えるという、予想される反応濃度において行った。全ての場合において、ＰＥＧ化試薬の分解は最小限であった。

ＰＥＧ化の失速は、反応加速添加物としてのアセチルヒドラジドの大過剰量の存在下で生じるため、反応条件下におけるこのヒドラジドの安定性を、インサイチュＩＲおよび^１Ｈ ＮＭＲ分光法によって試験した。この研究によって、アセチルヒドラジドが安定であることが示され、反応を促進するために必要な過剰量は、平衡反応の存在、および無触媒のバックグラウンドプロセスと比較して反応加速がわずかであることに関連している可能性が最も高いことが示唆される（図４）。

実施例２
ジペプチドモデル系（ＤＭＳ）を用いた、添加物のスクリーニング研究
レラキシン中のｐＡｃＦケトン反応点とアルコキシアミンとの反応を加速させる添加物を見つけるための最初の試みは、脱水によって対応するイミノ誘導体の形成を促進することができる、活性化Ｘ−ＮＨ_２部位を含む市販の化合物のスクリーニングに関する。これらの添加物の選択のための最小要件は、水性溶媒中の実際のタンパク質のＰＥＧ化を促進するために用いられる温度、緩衝液およびｐＨ条件下における、それらの十分な安定性および溶解性であった。分析工程を単純化し、ＨＰＬＣ−ＵＶおよびＮＭＲ分光法による反応の追跡を容易にするために、ジペプチドＡｌａ−ｐＡｃＦ（１）とＯ−フェニルヒドロキシルアミン（２、図５参照）との縮合を、添加物の選択を導きうるモデル変換として選択した。後のステップにおいて、モデル反応を改良する添加物を、レラキシンおよびＦＧＦ２１のＰＥＧ化において試験する。図５において、添加物のスクリーニングのためのモデル反応を示す。反応条件：１．０ｍＬ 酢酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ４．０）中に、１（３．６ｍｍｏｌ）および２（３．６ｍｍｏｌ）、室温（２３℃）。

Ｘ−ＮＨ_２部位のＸ置換基の性質に応じて、アニリン、ヒドラジン、ヒドラジドおよびヒドラジンカルボキサミンの４つの一般的なカテゴリーに分類される５０個の添加物について、反応速度および変換率を評価した。観測した速度を、添加物なしで測定した速度（ｋ_ｒｅｌ＝１）に対して標準化した。アセチルヒドラジド（ｋ_ｒｅｌ〜２）は、ベースライン許容性能を確立するための基準添加物であり；ｋ_ｒｅｌ＞２および高変換率（＞９５％）を生じる添加物のみを、その後のレラキシンおよびＦＧＦ２１のＰＥＧ化における応用および最適化において考慮する。結果のまとめを図６に示す。この反応は、タンパク質のＰＥＧ化条件を模倣して、攪拌せずに室温においてＨＰＬＣバイアル中で行われ、さらなるサンプル操作を避けるため、分割量をＨＰＬＣ自動サンプラーによって定期的に採取した。

ヒドラジド（青色）およびヒドラジンカルボキサミド（緑）が最善の結果を示した。一般に、アニリン（赤）はジペプチドの完全な変換を生じたが、反応を加速しなかった。さらに、ほどんどのアニリンは、高程度の望まないエピマー化を促進した。ヒドラジン（黄色）は反応条件下で、大量のヒドラゾンを形成し、さらなる研究から除外した。芳香族ヒドラジドおよび二級ヒドラジンカルボキサミンは、最大で５倍、速度を加速し、ジペプチドの消費がおよそ９５％で失速した高変換率を示した。特に、スクリーニングによって、モルホリン−４−カルボヒドラジド（ＭＣＨ、４）およびｐ−アミノ安息香酸ヒドラジド（ＰＡＢＨ、７）が、変換を促進する最適な試薬であることが発見された。それらの性能、ｐＨ４における溶解性、市販での入手可能性およびコストに基づいて、ＰＡＢＨおよびＭＣＨを、レラキシンおよびＦＧＦ２１のＰＥＧ化においてさらに評価した（以下参照）。

この情報から、反応の失速を回避するための試みとして、以下の３つの局面に焦点をあてた：（ａ）可変量の添加物の添加、（ｂ）カオトロピック剤の効果、および（ｃ）添加物の組み合わせ。最初に、反応性の内在的な傾向を確認するため、モデルジペプチドおよびアセチルヒドラジドを用いて研究を行った。様々な分量のアセチルヒドラジドにおける反応速度を追跡することによって添加物の飽和特性が明らかになり、高濃度の試薬において、速度の上昇が閾値に達することが示唆された（スキーム１）。

さらに、アセチルヒドラジドの濃度が増加するとより高いレベルでの失速が促進され、これは、多段階連続可逆性イミン転移反応に関する一般的な機構と一致する。加速性の添加物の存在下において、そのような機構によって見かけの平衡を脱水にシフトさせることで、より高い変換を達成しうる可能性が示された。反応溶媒を変化させることによってこの平衡を変更させる実験的な試みは成功しなかった。例えば、６Ｍ尿素またはＮＨ_４Ｃｌの添加は反応を加速せず、元の変換率にも影響しなかった。いくつかのアニリンのスクリーニングによって、反応を加速しない完全な変換が生じ、これらのアニリンと加速性の添加物との組み合わせによって、基質のさらなる変換を促進することができることが予測された。実際に、アセチルヒドラジドおよびピラゾールアミン９の混合物の使用によって、より早い反応プロファイルと完全に近い変換がもたらされた（図６）。ジペプチド、ピラゾールアミン、ＭＣＨ添加物の等モル量を含む混合物、またはＭＣＨおよびピラゾールアミンの混合物の^１Ｈ ＮＭＲ解析によって、混合物を含むサンプルについて、イミンおよびヒドラゾン中間体の相乗的な増加が示され、加速性の添加物およびアニリンの組み合わせによる正の効果は、反応中間体への平衡経路のシフトと相関があることが示唆された（図８）。

ヒドラジドおよびアニリン部位の両方を含む添加物である、ＰＡＢＨを用いた、同様の^１Ｈ ＮＭＲスペクトル実験で、単一のヒドラゾン中間体の形成の阻害が示され、これはＤＦＴ計算と一致する。中性条件下において、Ｂ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ（ｄ）レベルの理論の計算によると、ｐＡｃＦおよびＰＡＢＨ間のヒドラゾン構造の形成の方が、同形のイミンよりも〜３ｋｃａｌ／ｍｏｌ有利である（スキーム２）。

アミノ酸−ＮＨ_２（ｐＫａ〜９）のプロトン化は、ヒドラゾン形成を〜９ｋｃａｌ／ｍｏｌ支持する。二重プロトン化（ｐＫａ：アニリン〜２．５、ヒドラジド＜２）によって、イミン形成を〜１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ有利にする。反応はそのような低いｐＨ値では行われないが、ＤＦＴ計算によって、脱水はｐＨ変化およびＨ結合効果に対して大きく影響されやすいことが示される。

ＰＡＢＨによるジペプチド１のＰＥＧ化の間、ヒドラゾン中間体を追跡することができた（図９）。ジペプチド１とＰＡＢＨの混合物を、ＰＥＧ化試薬なしで一晩平衡化させたコントロール実験によって、ヒドラゾンの形成、並びに２０ｋＤａのＰＥＧ−ＯＡの添加に応じた素早い消費による、目的の生成物の生成が示された。さらに、アミン添加物（例えば、ピラゾールアミン、図１０）の存在下でのヒドラゾン形成実験によって、ヒドラゾン形成の程度が反応に用いたピラゾールアミン：ＰＡＢＨ比に関連していることが示唆された。興味深いことに、ヒドラゾン形成の程度は、単純な様式で反応速度または変換率には相関していない。モデルジペプチド系において、１：１のピラゾールアミン：ＰＡＢＨ比がヒドラゾン形成に最適であった。しかしながら、反応速度の場合では、最適条件はアミン：ヒドラジドが１：２の比と一致した。アミンに対して多い分量のヒドラジドが必要であるのは、ヒドラジドがアミン添加物よりもはるかに高い反応速度を示すことが観測された、予備的スクリーニングによっても支持される。一方で、３：１の比のアミン：ヒドラジドがジペプチドの変換に最適であり、これは（ａ）低アミン：ヒドラジド比における反応の最後に、かなりの量のヒドラゾン中間体が残留していることの観測、および（ｂ）ヒドラジド添加物の「キッカーチャージ」の添加の後で検出される反応の可逆性と一致する。前記に提示される実験において、総当量はＰＢＡＨおよびピラゾールアミンの合計である。添加物の総当量の変化の効果は、アミン：ヒドラジド比、並びに組み合わせた添加物の総当量の両方を変化させて行った一連の実験によって調べた。結果を図１１にまとめる。図中の曲率は、アミンとヒドラジドとの協同効果が複雑であり、反応条件の最適化には添加物の総当量だけではなく、両者の比についての考察が必要でありうることを示唆している。

実施例３
添加物がタンパク質−レラキシンおよびＦＧＦ２１のＰＥＧ化を加速した
２０ｋＤａのＰＥＧ−ＯＡの当量数を最大で１．２当量に減少させ、反応率および生成物の品質を下げることなく、室温での反応時間を短縮することを目的として、モデル系で得られた教訓をレラキシンおよびＦＧＦ２１のＰＥＧ化に応用した。この目的のため、レラキシンとのモデル反応で同定された添加物を、大まかな実験から最初に発展させた反応条件下で試験した。１．５当量のＰＥＧ−ＯＡによる、レラキシン（２０ｍＭ ＡｃＯＮａ中に２１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ４．０）のＰＥＧ化は、３０当量のアセチルヒドラジドまたはＭＣＨの存在下で、室温、２４時間後に良好な変換率（〜９０％）を示した。触媒の非存在下で同一条件下において、反応は有意に低い変換率（〜７５％）を示した。モデル系研究と一致して、ＰＥＧ化は添加物によって加速され、ＭＣＨとの反応は、アセチルヒドラジドとの反応よりも２倍速かった。さらに、図６において提示される平衡は、以下の観測によって裏付けを得た：（ａ）触媒反応が同様の変換率において停止する、（ｂ）一度停止すると、３０当量の過剰な添加物の添加によって変換量が減少する、および（ｃ）一度停止すると、０．５当量のＰＥＧ−ＯＡの添加によって、反応が高い変換率（〜９５％）を示す。モデル反応におけるアニリンについて見られた傾向は、レラキシンのＰＥＧ化についても説明される：３０当量のピラゾールアミンの添加によって、加速されることなくレラキシン出発物質の大半が変換され、ＭＣＨとピラゾールアミンの組み合わせによって、たった８時間で９５％の変換率が得られた。反応条件を最適化する試みは、変数間の複雑な相互作用を明らかにし、より深い洞察を得るためにＤｏＥ研究を適用することを促進した（実施例４）。例えば、３０当量のピラゾールアミンと混合したＭＣＨの分量が多くても少なくても変換率は改善されず、より高い温度の使用は迅速な反応を促進しなかった（図１２）。ＰＥＧ−ＯＡの充填量を１．２当量に減少させると、添加物ＭＣＨ、ＭＰＣＨ（５）またはＰＨ（６）の存在下において１．５当量について最適化した条件下で、〜８５−９０％の変換率において失速が生じた。しかしながら、モデル系における無視できる効果とは対照的に、６Ｍの尿素中のＭＣＨの使用によって、反応の完了は最大で〜９５％に改善された（図１２）。

しかしながら、ＰＥＧ化反応を完了まで進行させることによって、レラキシン出発物質と同じ保持時間を有するが、ＰＥＧ化試薬の存在下では未反応な不純物の形成が明らかになった。ＨＲＭＳ実験によって、不純物がｐＡｃＦのＮ末端残基のオキシムに一致することが示され、ＮＨ_２ＯＨの電位によって不純物がＰＥＧ化に対して非生産的であることが確認された（図１３）。ＮＨ_２ＯＨの供給源を説明するために、２つの仮説を設定した、すなわち：（ａ）ＰＥＧ化試薬中に混入した不純物として存在していること、および（ｂ）ＰＥＧ化反応の過程で形成すること。ＰＥＧ−ＯＡの詳細な分析によって、出発物質中のＮＨ_２ＯＨの量は＜０．０５ｐｐｍであることが証明され、第一の仮説は反証された。反応中のＰＥＧ化試薬の分解に一致して、オキシム不純物の形成を追跡すると、ＰＥＧ化の間に明確な増加が示された（図１４）。添加物４−９の体系的なＨＲＭＳ実験によって、ＭＣＨおよびＭＰＣＨがＰＥＧ−ＯＡの分解を促進し、一方でアセチルヒドラジド、ＰＨ、ＰＡＢＨ、ＰＭＢＨおよびピラゾールアミンは促進しなかったことが示された。そのため、ＰＡＢＨによって触媒されるＰＥＧ化の最適化において、ＰＡＢＨはＭＣＨと同程度の変換率を示すため（図６）、コストは後者よりもはるかに低い（１Ｕ＄／ｇ対６０Ｕ＄／ｇ）。最適化された条件は、３０当量のＰＡＢＨおよび６０当量のピラゾールアミンを用いた。これらの結果を、後にＤｏＥ研究によって確認する。

モデル系におけるスクリーニングの間に観測される反応の変換におけるアニリンの効果の改訂によって、ピラゾールアミンに加えて、３つのアミンが完了するレベルを改善させることができることが示された。これらはｍ−フェニレンジアミン、エチレンジアミン、および３，５−ジアミノ安息香酸であった。１．２当量のＰＥＧ−ＯＡおよび３０当量のＰＡＢＨを用いて、６０当量のアミンを加えると〜９５％の変換率が得られた（図１９）。添加物の化学量論比が低いほど、短い時間で低い変換率（〜９０％）が生じるが、２４時間で徐々に高い変換率が得られた。

実施例４
異なる添加物の組み合わせの相互作用を評価するためのＤｏＥ研究
４つの変数、すなわち（ａ）ヒドラジドの特定、（ｂ）アミンの特定、（ｃ）添加物の総当量、および（ｄ）用いた添加物のアミン：ヒドラジド比を考慮したＤＯＥ法を用いて、レラキシンおよびＦＧＦ２１のＰＥＧ化について、アミンとヒドラジド添加物との相互作用をさらに調べた。研究はレラキシンおよびＦＧＦ２１について行い、アミン：ヒドラジドのモル比、並びに速度および変換率におけるＰＥＧ−ＯＡの添加量の効果を調べ、モデル系において以前に同定した様々なアミンを解析した（図６）。これらの実験の結果によって、アミン：ヒドラジド比間の複雑な相互作用が示され、反応の最適化にはアミン並びに基質タンパク質の種類について慎重な検討を必要とすることが示唆された。

スクリーニングの第一段階において（表１）、レラキシンおよびＦＧＦ２１の両方のＰＥＧ化について、ＰＡＢＨ、アセチルヒドラジドおよびピバルヒドラジドを、ピラゾールアミンとの組み合わせで用いた（図１７）。ＰＥＧ−ＯＡの当量および尿素の濃度もまた考察した。本スクリーニングにおける添加物系のほとんどが良好な機能を発揮した。前記の研究（図７および１２）と一致して、２：１ アミン：ヒドラジド系が高い変換率を促進するのに最良であった。ピバルヒドラジドは高い変換率および速い反応速度を促進することができる優れたヒドラジド添加物であるが、ＰＡＢＨを用いた時には存在しなかった新たな不純物が反応混合物中に観測された。

このスクリーニングをＦＧＦ２１を用いて繰り返し、同様の結果を得た（表２）。ＰＡＢＨが反応を促進する顕著な添加物であることが示され、この構想の目的の１つは、広い範囲のタンパク質系に用いることのできる一般的なＰＥＧ化方法を開発することであったため、さらなる研究のためにＰＡＢＨを選択した。ヒドラジド成分としてＰＡＢＨを使用する根拠は、既知の強力な突然変異誘発剤であるアセチルヒドラジドとは異なり、ＡＭＥＳ試験において陰性であるという事実によってさらに支持される（Ｂｈｉｄｅ， Ｓ．Ｖ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．， ２３：２３５ （１９８４））。

ヒドラジドとしてＰＡＢＨを選択した後、レラキシンおよびＦＧＦ２１タンパク質の両方を用いて、広範囲のアミンとの組み合わせでスクリーニングした（スキーム３）。これらの実験について、以下の考察を行った：（ａ）モデル系において以前試験したアミン（図５）をスクリーニングし、（ｂ）添加物の総当量（ヒドラジドとアミンの合計）を２０から１２０の範囲とし、（ｃ）反応時間を２４時間に制限する。

最初のＤＯＥスクリーニングをＰＡＢＨおよびピラゾールアミンを用いて行ったため、どのアミン（またはアミンの種類）がＰＡＢＨとの添加物系において用いるのに最適化を決定することが主な関心事であった。レラキシンおよびＦＧＦ２１のスクリーニングからの実験結果を以下にまとめた（それぞれ、表３および４）。

レラキシンのＰＥＧ化についての結果は、様々なアミン間で一致しており、一般に変換率はかなり高い。一方で、ＦＧＦ２１については、３，５−ジアミノ安息香酸が、１．０および３．０の両方のアミン：ＰＡＢＨ比において、ＰＥＧ化の良好な促進剤であるように見える。総当量と比を一定に維持することで、アミンが変換率に与える影響をより正確に把握することができる。レラキシンについて、このデータを表５に表す。

レラキシンについて、アミン添加物の影響は明らかであるが、観測された全体的な変換率が高いことを考えると、この影響はやはり低い。ＦＧＦ２１については、影響はより大きい（表６）。

これらのデータから、変換率が、ＰＡＢＨとの組み合わせで用いられるアミンの特性に大きく依存することは明らかである。これらの条件がＰＥＧ化反応に最適な条件を必ずしも反映していないことをふまえて、我々は変換を並び替えて、ＦＧＦ２１との組み合わせの上位５つの添加剤のリストを作成した（表７）。

エチレンジアミンおよび３，５−ジアミノ安息香酸が、スクリーニングされた条件下でのＦＧＦ２１のＰＥＧ化についての上位２つの化合物であった。３，５−ジアミノ安息香酸は、比較的高価でなく、容易に結晶固体が入手可能であるため、アミン：ＰＡＢＨの組み合わせに好ましい添加物であると考えた。総当量対アミン：ＰＡＢＨ比の詳細な解析によって、さらなる裏付けが得られる。モデル系において観測されるように、２つの添加物の協同効果は非常に複雑である。実際に、モデル系において観測された曲率は、レラキシンおよびＦＧＦ２１のＰＥＧ化についてより顕著であった。ＦＧＦ２１についてのデータおよび傾向を、図１９に示す。アニリンであるｏ−およびｍ−フェニレンジアミンは、ＦＧＦ２１のＰＥＧ化において用いられた場合、良好な添加物であった。興味深いことに、残存するタンパク質の最終濃度に対する総当量およびアミン：ＰＢＡＨ比のプロットからは完全に異なる結果が得られた。これらの２つの添加物間の構造的な違いは、アミノ基の配向のみである。

ｚ軸は反応混合物中のＦＧＦ２１の最終濃度であるので、理想的な条件はプロット中でｚ軸の値が最小であるものである。試薬の電荷のわずかな違いを許容することのできる安定した方法として、平坦なプロットまたは谷または井戸を有するプロットが理想的である。この前提を満たす添加物の１つが３，５−ジアミノ安息香酸である（図２０）。

レラキシンのＰＥＧ化に用いる場合、３，５−ジアミノ安息香酸もまた、妥当な反応時間で高い変換率を生じる。図２０の比較（左および右）によって、増加した変換率がタンパク質の特性にもまた関連していることが示される。

実施例５
単純なアンモニウム塩の使用
ｐＨ４におけるアミン添加物の有用な効果を踏まえて、我々は単純なアンモニウム塩もまた、レラキシンのＰＥＧ化を向上させることができると考えた。この目的のため、様々な分量のＰＡＢＨおよびＮＨ_４ＯＡｃまたはＮＨ_４Ｃｌを用いた一連の実験を行い、６０当量のＰＡＢＨおよび１２０当量のＮＨ_４Ｃｌの組み合わせの優位性が明らかになり、最も良好な変換率が１０時間で得られた（９７％、表８）。興味深いことに、ＮＨ_４Ｃｌの存在下におけるモデルジペプチドの反応の再試験によって、ＮＨ_４Ｃｌが存在しない場合に観測されたプロファイルと同一のプロファイルが得られ、これによってＮＨ_４Ｃｌの効果はレラキシンの構造変化に関連しうることが示唆された。確かに、尿素または（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４などの既知のカオトロピック剤の添加によって、同様の結果が得られた（図２１）。ＮＨ_４Ｃｌの正の効果は一般的であると考えられ、ヒドラジド添加物を含まない、またはアセチルヒドラジドの存在下におけるレラキシンのＰＥＧ化において再現する（図２２）。

ＮＨ_４Ｃｌの効果の原因をよりよく理解するための分光学的実験によって、溶液中で塩がレラキシンの立体構造を変化させていることが示唆された。ＵＶスペクトル解析によっては、１２０当量のＮＨ_４Ｃｌを添加した際の芳香族残基（２６０−２９０ｎｍ）の吸光度の変化を検出することはできなかったが（図２３）、ＩＲ分光分析によってアミドＩＩ結合のＨ結合に構造的な修飾が存在することが示唆された（図２４）。おそらく、ＵＶ分析によって芳香族残基の変化が検出できなかったことは、溶媒に残基を大きく露出しており、いずれの有意な分子内相互作用も存在しない、レラキシンの遠位部位のアミノ酸Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、およびＴｒｐ（Ｗ）に起因する。

レラキシンの構造上のわずかな変化は、ＮＨ_４Ｃｌの添加時にタンパク質のフォールディングが高い割合でランダムコイルになる（図２５）ことと一致する、^１５Ｎ ＮＭＲ ＨＳＱＣ分光学研究においてさらなる裏付けが存在し、近ＵＶ ＣＤ解析によって、レラキシンの三次構造の指紋領域における小さな変化が示され、これは二量体化の接触面の変化が原因である可能性がある（図２６）。

実施例６
典型的な方法および結果
本明細書に報告された研究に基づいて、ＰＡＢＨおよびＮＨ_４Ｃｌの組み合わせが大スケールにおける使用に推奨された。様々なタンパク質系での結果を以下の表に示す。

ＰＥＧ化反応においてＰＡＢＨを用いた場合の１つの考慮点は、市販の試薬の純度が販売会社ごとに同じでないことである。大スケールにおける９８％のＰＡＢＨの使用によって、クロマトグラフィー中に目的の生成物と同時に溶出する不純物のピークが生じた。これらの不純物を単離して、これらの構造がＰＡＢＨ中に存在するヒドラジドおよびアミド不純物であることを確認した（図２７）。

反応において高い当量を用いるため、この試薬中の少量の不純物であっても影響を及ぼしうる。そこで、入手可能な最高純度のＰＡＢＨを購入することが推奨される。

実施例７
典型的なスクリーニング方法
添加物の使用は操作上は単純である。ＦＧＦ２１ Ｇ１を３０ｋＤａのＰＥＧ−ＯＡでＰＥＧ化することによって、代表的な実施例を生じる。

方法
ｐＨ４の２０ｍＭ ＮａＯＡｃ、６Ｍ 尿素中の、ＦＧＦ２１（１．０ｍＬ、２０．３ｍｇ／ｍＬ、１．０４μｍｏｌ）の溶液を、きれいな１．５ｍＬのバイアル中で固体のＮＨ_４Ｃｌ（６．７ｍｇ、１２４．８μｍｏｌ）に加えた。全ての固体が溶解するまで、混合物をゆっくりと攪拌した。別のバイアルに、ＭＰＥＧ ３０ｋＤａ（３９．０ｍｇ、１．２６μｍｏｌ）およびＰＡＢＨ（４．７ｍｇ、３１．２μｍｏｌ）を合わせた。タンパク質溶液を、第一バイアルから、ＰＥＧ化試薬およびＰＡＢＨを含む第二バイアルに移し、混合物を固体が溶解するまでゆっくりと攪拌した（約２０分）。ｐＨを測定し、必要であれば、０．１Ｍ ＨＣｌを用いて混合物をｐＨ４に調整した。

典型的な反応混合物は均一な溶液であるため、反応溶液を２０−２５℃で攪拌せずに放置した。反応の進行をＥＬＳまたは２８０ｎｍのＵＶ検出のいずれかを用いて、ＨＰＬＣで追跡した。反応の完了を、外部標準に対してＨＰＬＣ分析によって評価した。

実施例８
ＰＥＧ化条件の比較
この取り組みの最終的な目的は、この研究の開始時における方法、並びに文献での「最新の」条件に対して、新たなＰＥＧ化方法の有用性を実証することであった。これは主に推奨される添加物の組み合わせを使用することによって、市販の高価なＰＥＧ化試薬の節約量を定量化することである。表１１は、レラキシンおよびＦＧＦ２１ Ｇ１のＰＥＧ化、並びにＰＡＢＨ添加物によって触媒されるＰＥＧ化に用いるための元の条件を含む。

レラキシン化合物についてのコスト削減の可能性は、用いるＰＥＧ ２０ｋＤａの分量に単に関係しており、いずれの方法においても変換率および収率は同等である。しかしながら、第一世代のＦＧＦ２１アセットのＰＥＧ化に関して、節約はかなり劇的である。ＰＥＧ添加量の５０％より多い減少と合わせて、反応収率の１３％の増加によって、生産に関連するコストは全体で７０％減少する。ＰＡＢＨおよびＮＨ_４Ｃｌのコストはいずれも、ＰＥＧ化試薬と比べてきわめて低いため、これらの使用は全体的な生産コストを最小にすることに寄与する。以下の表において、我々はこれらと共にアセチルヒドラジドを用いて、ＰＡＢＨの条件を比較する。

本開示における添加物系の利点のいくつかを以下に列挙する：
１）非常に高価なＰＥＧ化試薬のかなり少ない分量（１．５−２．５当量に対して１．２当量）での高い変換率の促進。以下の表に、従来の方法（標準的な条件）からの改善点を強調する比較を示す。

２つの添加物の組み合わせは、反応速度および変換率を大きく上昇させ、元の条件と比べて、ＰＥＧの添加量の大幅な減少を可能にした。

２）高い反応温度の必要性を回避する、より速い反応の促進。高温を避けることによって、反応中のタンパク質の構造変化および安定性に関する懸念が減少する。

３）アセチルヒドラジド（ＡＭＥＳ陽性）をＰＡＢＨ（予備的実験においてＡＭＥＳ陰性）に変更。最終生成物において、遺伝毒性物質および関連する対照の使用の排除。

医薬組成物
本開示に従って合成したＰＥＧ化タンパク質はさらに、さらなる薬学的に許容可能な担体または当技術分野において既知の溶媒との混合、または組み合わせによる注入に適切でありうる。本発明の生成物の製剤化に薬学的に許容可能な担体としては、食塩水、ヒト血清アルブミン、ヒト血漿タンパク質などが含まれる。本発明はまた、前記の結合体および薬学的に許容可能な添加物および／または担体を含む医薬組成物に関する。そのような薬学的に許容可能な担体は、水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンでありうる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルが挙げられる。水性担体としては、生理食塩水および緩衝液溶媒などの、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられる。非経口溶剤としては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストリン、デキストロース、および塩化ナトリウム、乳酸リンガー液または不揮発性油が挙げられる。静脈内溶剤としては、液体、栄養補充剤、リンガーデキストロースに基づくものなどの電解質補充剤が挙げられる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性化ガスなどの、防腐剤および他の添加物もまた存在しうる。本開示に従って調製したタンパク質結合体は、薬学的に許容可能な担体または当技術分野において既知の溶剤と共に、注入に適切な医薬組成物として製剤化されうる。例えば、ＷＯ９７／０９９９６、ＷＯ９７／４０８５０、ＷＯ９８／５８６６０、およびＷＯ９９／０７４０１（これらのそれぞれは、その全体が引用によって本明細書に援用される）を参照されたい。

本開示は前記の開示に限定されず、本開示の本質的な特性から逸脱することなく、他の特定の形態において具体化することができることが、当業者には明らかである。そのため、本開示は全ての点において、例示的で限定されないと考えられるのが望ましく、そのため、前記の開示ではなく、付属の特許請求の範囲についての記載、並びに特許請求の範囲の均等物の意味および範囲内で行われる全ての変更は、その中に含まれると意図される。

Claims (14)

1. タンパク質のＰＥＧ化反応のための改良された添加物系であって、ｐ−アミノ安息香酸ヒドラジドを単体で、または芳香族アミンもしくはアンモニウム塩との組み合わせを含む前記添加物系。
2. 前記芳香族アミンが、３，５−ジアミノ安息香酸、ｏ−フェニレンジアミン、１−ピリジン−２−イル−エチルアミン、２−（ジメチルアミノ）エチルヒドラジン、ｍ−フェニレンジアミンおよび２−ピコリルアミンから成る群から選択される、請求項１に記載の添加物系。
3. 前記アンモニウム塩が酢酸アンモニウムおよび塩化アンモニウムから成る群から選択される、請求項１に記載の添加物系。
4. 好ましい系の組み合わせが、ｐ−アミノ安息香酸ヒドラジドと３，５−ジアミノ安息香酸、またはｐ−アミノ安息香酸ヒドラジドと塩化アンモニウムを含む、請求項１に記載の添加物系。
5. 前記反応が、ｐ−アセチルフェニルアラニン残基を含むタンパク質とアミノオキシ−ＰＥＧ化合物との間の結合反応である、請求項１に記載の添加物系。
6. 添加物系が結合反応速度を増大させ、高収率の結合生成物を提供し、結合反応の完了に必要とされるアミノオキシ−ＰＥＧの当量の減少を促進する、請求項１に記載の添加物系。
7. ＰＥＧ化タンパク質を得るための方法であって、以下のステップ：
   （ａ）タンパク質、ＰＥＧ試薬、および添加物系を特定すること；および
   （ｂ）タンパク質を溶解させ、次いで、添加物系の存在下でＰＥＧ試薬を合わせて、ＰＥＧ化タンパク質を高収率で得ること
   を含む前記方法。
8. 前記タンパク質がｐ−アセチルフェニルアラニン残基を含むレラキシンまたはＦＧＦ２１である、請求項７に記載の方法。
9. ＰＥＧ試薬と合わせた可溶化タンパク質溶液を、約４のｐＨで維持する、請求項７に記載の方法。
10. 反応混合物を約２０℃から約２５℃の範囲の温度で維持する、請求項７に記載の方法。
11. 前記添加物系が、ｐ−アミノ安息香酸ヒドラジドを単体で、または３，５−ジアミノ安息香酸などの芳香族アミンとの組み合わせ、または酢酸アンモニウムもしくは塩化アンモニウムなどのアンモニウム塩との組み合わせで含む、請求項７に記載の方法。
12. 高品質のｐ−アミノ安息香酸ヒドラジドと塩化アンモニウムとの前記添加物の組み合わせが、ＰＥＧ化タンパク質の大規模生産に用いるのに好ましい、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ＰＥＧ試薬が、ＰＥＧ−ＯＡおよびアミノオキシ基を有する他のＰＥＧ誘導体を含む群から選択される、請求項６に記載の方法。
14. 治療を必要とする対象の治療に用いるための、請求項７から１３に記載の方法によって得られるＰＥＧ化タンパク質を含む医薬組成物。

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