JP2021080290A - アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび赤血球レベルを増加させるためのその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】患者における赤血球を増加させるための代替的な組成物および方法を提供する。【解決手段】本発明は、患者における赤血球およびヘモグロビンのレベルを増加させるため、そして、処置を必要とする患者における低い赤血球もしくはヘモグロビンのレベルに伴う障害を処置するための、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド、アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド、抗アクチビン抗体、抗ＡｃｔＲＩＩａ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩｂ抗体、アクチビン、ＡｃｔＲＩＩｂもしくはＡｃｔＲＩＩａを標的とする低分子およびアプタマー、ならびに、アクチビン、ＡｃｔＲＩＩｂもしくはＡｃｔＲＩＩａの発現を低下させる核酸を含む）の使用を提供する。【選択図】なし

Description

（関連出願）
本願は、２００６年１２月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／８７５，６８２
号の優先権を主張し、この仮出願は、その全体が本明細書により参考として援用される。

（発明の背景）
成熟赤血球（ｍａｔｕｒｅ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ，ｏｒ ｅｒｙｔｈｒｏｃ
ｙｔｅ）は、脊椎動物の循環系において酸素の輸送を担っている。赤血球は、肺において
比較的高い酸素分圧（ｐＯ_２）で酸素を結合し、そして、比較的低いｐＯ_２で身体の領域
へと酸素を運搬するタンパク質であるヘモグロビンを高濃度で有する。

成熟赤血球は、赤血球生成と呼ばれるプロセスにおいて、多能性の造血幹細胞から生成
される。出生後の個体において、赤血球生成は、主として、骨髄および赤脾臓において生
じる。種々のシグナル伝達経路の連繋した作用により、細胞の増殖、分化、生存および死
のバランスが制御される。正常な条件下では、赤血球は、身体において一定の赤血球質量
を維持する速度で生成され、そして、この生成は、種々の刺激（酸素分圧の増減または組
織の要求を含む）に応じて増減し得る。赤血球生成のプロセスは、系統が拘束された前駆
体細胞の形成から始まり、そして、一連の別個の前駆体細胞型を通って進行する。赤血球
生成の最終段階は、網状赤血球が血流へと放出されるときに生じ、成熟赤血球の形態を帯
びながら、そのミトコンドリアおよびリボソームを失う。血中での網状赤血球レベルの上
昇、または、網状赤血球：赤血球の比の上昇は、赤血球生成速度の増加を示す。

エリスロポエチン（Ｅｐｏ）は、出生後の脊椎動物における赤血球生成の最も重要な正
の調節因子として広く認識されている。Ｅｐｏは、組織酸素分圧の低下（低酸素）および
低い赤血球レベルまたは低いヘモグロビンレベルに対し、これを補う赤血球生成性の応答
を調節する。ヒトでは、Ｅｐｏレベルの上昇は、骨髄および脾臓における赤血球先駆細胞
の生成を刺激することによって、赤血球の形成を促進する。マウスでは、Ｅｐｏは、主と
して脾臓における赤血球生成を増強する。

種々の臨床的状況において赤血球レベルを増加させるため、そして、特に、貧血の処置
のために、組み換え型Ｅｐｏの種々の形態が医師によって使用されている。貧血は、血中
のヘモグロビンまたは赤血球が正常レベルよりも低いことによって特徴付けられる、広く
定義される状態である。ある場合には、貧血は、赤血球の生成または生存における原発性
の障害によって引き起こされる。より一般的には、貧血は、他の系の疾患に対して続発的
である（非特許文献１）。貧血は、赤血球の生成速度の低下もしくは破壊速度の増加から
、または、出血に起因する赤血球の喪失によって生じ得る。貧血は、例えば、慢性腎不全
、骨髄異形成症候群、慢性関節リウマチおよび骨髄移植を含む種々の障害から生じ得る。

Ｅｐｏを用いた処置は、代表的に、数週間の期間にわたり、健康なヒトにおいて約１〜
３ｇ／ｄＬのヘモグロビンの上昇をもたらす。貧血の個体に投与された場合、この処置レ
ジメンは、しばしば、ヘモグロビンおよび赤血球のレベルのかなりの増加を提供し、そし
て、クオリティオブライフの改善と生存の延長につながる。Ｅｐｏは、一様に有効ではな
く、多くの個体は、高用量に対してさえも不応性である（非特許文献２）。５０％を超え
る癌を有する患者がＥｐｏに対して不十分な応答を有し、末期の腎疾患を有する患者の約
１０％が低反応性であり（非特許文献３；非特許文献４）、そして、骨髄異形成症候群を
有する患者の１０％未満が有利に応答する（非特許文献５）。炎症、鉄およびビタミンの
欠乏、不適切な透析、アルミニウムの毒性、および副甲状腺機能亢進を含むいくつかの要
因で、治療応答が乏しいことが予測され得、そして、Ｅｐｏに対する抵抗性の分子機構は
未だにはっきりとしていない。

Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ ＆ Ｐｒｏｖａｎ（２０００）Ｌａｎｃｅｔ ３５５，１１６９−１１７５ Ｈｏｒｌら（２０００）Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １５，４３−５０ Ｇｌａｓｐｙら（１９９７）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １５，１２１８−１２３４ Ｄｅｍｅｔｒｉら（１９９８）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １６，３４１２−３４２５ Ｅｓｔｅｙ（２００３）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １０，６０−６７

したがって、患者における赤血球を増加させるための代替的な組成物および方法を提供
することが本開示の一つの目的である。

（発明の要旨）
本開示は、一部分で、アクチビンアンタゴニスト、ならびにＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃ
ｔＲＩＩｂのアンタゴニストが、赤血球およびヘモグロビンのレベルを増加させるために
使用され得ることを実証する。具体的には、本開示は、ＡｃｔＲＩＩａの可溶性形態がア
クチビンのインヒビターとして作用し、そして、インビボで投与された場合に、血中の赤
血球レベルを増加させることを実証する。可溶性のＡｃｔＲＩＩａよりも低い親和性でア
クチビンＡに結合するＡｃｔＲＩＩｂの可溶性形態では、穏やかな作用が観察された。可
溶性のＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔＲＩＩｂはアクチビンとの拮抗とは別の機構によって
赤血球レベルに影響を及ぼし得るが、それにもかかわらず、本開示は、望ましい治療因子
が、アクチビンとの拮抗もしくはＡｃｔＲＩＩとの拮抗、またはその両方に基づいて選択
され得ることを実証する。このような因子は、まとめてアクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタ
ゴニストと呼ばれる。したがって、特定の実施形態では、本開示は、患者における赤血球
およびヘモグロビンのレベルを増加させるため、そして、処置を必要とする患者における
低い赤血球もしくはヘモグロビンのレベルに伴う障害を処置するための、アクチビン−Ａ
ｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド、アク
チビン結合ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド、抗アクチビン抗体、抗ＡｃｔＲＩＩａ抗体、抗
ＡｃｔＲＩＩｂ抗体、アクチビン、ＡｃｔＲＩＩｂもしくはＡｃｔＲＩＩａを標的とする
低分子およびアプタマー、ならびに、アクチビン、ＡｃｔＲＩＩｂもしくはＡｃｔＲＩＩ
ａの発現を低下させる核酸を含む）を使用するための方法を提供する。米国特許出願第１
１／６０３，４８５号（本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、アク
チビン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストは、骨成長を促進し、そして、骨密度を増加させ
るために使用され得る。本明細書中に記載されるように、このようなアンタゴニストの赤
血球レベルに対する作用は、より迅速であり、そして、このようなアンタゴニストの骨に
対する作用よりも低い用量で生じる。したがって、特定の実施形態では、本開示は、骨密
度の有意な増加を引き起こすことなく、赤血球またはヘモグロビンのレベルを増加させる
ための、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストの使用方法を提供する。例えば、方
法は、骨密度の３％未満、５％未満、１０％未満または１５％未満の増加を引き起こし得
る。この選択的な作用は、例えば、より低用量のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニ
ストを、より低い頻度で用いることによって、または、より短い半減期を有するアクチビ
ン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストを、より低い血清濃度を提供すると計算される用量お
よび頻度で使用することによって、達成され得る。

特定の局面では、本開示は、アクチビンに結合する可溶性のアクチビン結合ＡｃｔＲＩ
Ｉポリペプチドを含むポリペプチドを提供する。アクチビン結合ポリペプチドは、Ａｃｔ
ＲＩＩａポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドであり得る。ＡｃｔＲＩＩポリ
ペプチドは、アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリ
アを含む薬学的調製物として処方され得る。アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは
、１マイクロモル濃度未満、または、１００ナノモル濃度未満、１０ナノモル濃度未満、
もしくは１ナノモル濃度未満のＫ_Ｄでアクチビンに結合し得る。必要に応じて、アクチビ
ン結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、ＧＤＦ１１および／もしくはＧＤＦ８に対してアク
チビンに選択的に結合し、そして、必要に応じて、アクチビンに対するＫ_Ｄは、ＧＤＦ１
１および／もしくはＧＤＦ８に対するＫ_Ｄよりも少なくとも１０倍、２０倍もしくは５０
倍より低い。特定の作用機構に束縛されることは望まないが、ＧＤＦ１１／ＧＤＦ８を上
回るアクチビンの阻害のための選択性のこの度合いは、一貫して筋肉に対して測定可能な
作用を伴うことなく、骨または赤血球生成に対して作用することの説明となることが予想
される。多くの実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、赤血球レベルに対する所望
の効果を達成する用量において、筋肉における１５％未満、１０％未満もしくは５％未満
の増加を引き起こすものが選択される。組成物は、サイズ排除クロマトグラフィーによっ
て評価したとき、他のポリペプチド成分に対して少なくとも９５％純粋であり得、そして
、必要に応じて、組成物は、少なくとも９８％純粋である。このような調製物において使
用するためのアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、配列番号２、３、７もしく
は１２から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または、配列番号２、３、７
もしくは１２から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、
９５％、９７％もしくは９９％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドのような、本明
細書中に開示される任意のものであり得る。アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド
は、天然のＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの機能的フラグメント（例えば、配列番号１〜３
から選択される配列の少なくとも１０、２０もしくは３０のアミノ酸を含むもの、または
、Ｃ末端の１０〜１５アミノ酸（「テイル」）を欠く配列番号２の配列を含むもの）を含
み得る。このような調製物において使用するためのアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩｂポリペ
プチドは、配列番号１６、１７、２０もしくは２１から選択されるアミノ酸配列を有する
ポリペプチド、または、配列番号１６、１７、２０もしくは２１から選択されるアミノ酸
配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％もしくは９９％同一な
アミノ酸配列を有するポリペプチドのような、本明細書中に開示される任意のものであり
得る。アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドは、天然のＡｃｔＲＩＩｂポリペプチ
ドの機能的フラグメント（例えば、配列番号１５〜１７の少なくとも１０、２０もしくは
３０のアミノ酸を含むもの、または、配列番号１７のようなＣ末端の１０〜１５アミノ酸
（「テイル」）を欠く配列を含むもの）を含み得る。

可溶性のアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、天然に存在するＡｃｔＲＩＩポ
リペプチドに対して、（例えば、リガンド結合ドメインにおいて）アミノ酸配列に１以上
の変更を含み得る。変更されたＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドの例は
、それぞれ、ＷＯ ２００６／０１２６２７（本明細書中に参考として援用される）のｐ
ｐ．５９〜６０およびｐｐ．５５〜５８に提供される。アミノ酸配列の変更は、例えば、
哺乳動物、昆虫もしくは他の真核生物細胞において生成される場合にポリペプチドのグリ
コシル化を変更し得るか、または、天然に存在するＡｃｔＲＩＩポリペプチドに対して、
ポリペプチドのタンパク質分解による切断を変更し得る。

アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、１つのドメインとして、ＡｃｔＲＩＩポ
リペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩａまたはＡｃｔＲＩＩｂのリガンド結合部分）と、所
望の特性（例えば、改善された薬物動態，より容易な精製，特定の組織への標的化など）
を提供する１以上のさらなるドメインとを有する融合タンパク質であり得る。例えば、融
合タンパク質のドメインは、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、組織局
在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成および／または精製のうちの１以上を増強し
得る。アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩ融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメイン（野
生型または変異型）、または血清アルブミン、または所望の特性（例えば、改善された薬
物動態、改善された溶解性または改善された安定性）を提供する他のポリペプチド部分を
含み得る。好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃ融合物は、Ｆｃドメインと細胞外
ＡｃｔＲＩＩドメインとの間に位置する比較的構造の定まらない（ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅｄ）リンカーを含む。この構造の定まらないリンカーは、ＡｃｔＲＩＩの細胞外ドメイ
ンのＣ末端におよそ１５アミノ酸の構造の定まらない領域（「テイル」）に対応し得るか
、または、１、２、３、４もしくは５アミノ酸、または、比較的二次構造が自由な、５〜
１５、２０、３０、５０もしくはそれ以上の長さのアミノ酸の人工配列であり得るか、あ
るいはこの両方の混合物であり得る。リンカーは、グリシン残基およびプロリン残基が豊
富であり得、そして例えば、スレオニン／セリンおよびグリシンの単一の配列、または、
スレオニン／セリンおよびグリシンの繰り返し配列（例えば、ＴＧ_４もしくはＳＧ_４の単
一体もしくは繰り返し）を含み得る。融合タンパク質は、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ
、ポリヒスチジン配列、または、ＧＳＴ融合物のような精製配列を含み得る。必要に応じ
て、可溶性のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、
ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合さ
れたアミノ酸または有機誘導体化因子（ｏｒｇａｎｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｚｉｎｇ ａ
ｇｅｎｔ）に結合されたアミノ酸から選択される１以上の修飾されたアミノ酸残基を含む
。薬学的調製物はまた、骨障害を処置するために使用される化合物のような１以上のさら
なる化合物を含み得る。好ましくは、薬学的調製物は、発熱物質を実質的に含まない。一
般に、ＡｃｔＲＩＩタンパク質は、患者における望ましくない免疫応答の可能性を無くす
ために、ＡｃｔＲＩＩタンパク質の天然のグリコシル化を適切に媒介する哺乳動物細胞株
において発現されることが好ましい。ヒトおよびＣＨＯの細胞株は、首尾よく使用されて
おり、そして、他の一般的な哺乳動物発現系が有用であることが予想される。

本明細書中に記載されるように、ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃと称されるＡｃｔＲＩＩａタン
パク質（ＡｃｔＲＩＩａ部分とＦｃ部分との間に最小のリンカーを有する形態）は、所望
の特性（ＧＤＦ８および／もしくはＧＤＦ１１に対するアクチビンへの選択的な結合、高
親和性でのリガンド結合、および動物モデルにおける２週間より長い血清半減期を含む）
を有する。特定の実施形態では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃのポリペプチド、および
、このようなポリペプチドと薬学的に受容可能な賦形剤とを含む薬学的調製物を提供する
。

特定の局面では、本開示は、可溶性のアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例え
ば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド）をコードする核酸
を提供する。単離されたポリヌクレオチドは、上述のような可溶性のアクチビン結合Ａｃ
ｔＲＩＩポリペプチドのコード配列を含み得る。例えば、単離された核酸は、ＡｃｔＲＩ
Ｉの細胞外ドメイン（例えば、リガンド結合ドメイン）をコードする配列、および、Ａｃ
ｔＲＩＩの、膜貫通ドメインおよび／もしくは細胞外ドメインの一部もしくは全体をコー
ドする配列を含み得るが、膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメイン内、または、細胞外ド
メインと膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメインとの間に位置する終止コドンは除く。例
えば、単離されたポリヌクレオチドは、全長ＡｃｔＲＩＩａポリヌクレオチド配列（例え
ば、配列番号４または５）、または、全長ＡｃｔＲＩＩａポリヌクレオチド配列（例えば
、配列番号１８）、または、ＡｃｔＲＩｌａもしくはＡｃｔＲＩＩｂの部分的に短縮され
たバージョンを含み得、前記単離されたポリヌクレオチドはさらに、３’末端の前の少な
くとも６００ヌクレオチド、または、ポリヌクレオチドの翻訳により必要に応じて全長Ａ
ｃｔＲＩＩの短縮された部分に融合された細胞外ドメインが生じるように他の方法で位置
決めされた、転写終止コドンを含む。ＡｃｔＲＩＩａに対する好ましい核酸配列は、配列
番号１４である。本明細書中に開示される核酸は、発現のためのプロモーターに作動可能
に連結され得、そして、本開示は、このような組換えポリヌクレオチドで形質転換された
細胞を提供する。好ましくは、細胞は、ＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞である。

特定の局面では、本開示は、可溶性のアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを作製
するための方法を提供する。このような方法は、適切な細胞（例えば、チャイニーズハム
スター卵巣（ＣＨＯ）細胞）において、本明細書中に開示される任意の核酸（例えば、配
列番号４、５、１４、１８もしくは１９）を発現させる工程を包含し得る。このような方
法は、ａ）可溶性のＡｃｔＲＩＩポリペプチドの発現に適した条件下で細胞を培養する工
程であって、前記細胞が、可溶性ＡｃｔＲＩＩ発現構築物で形質転換される、工程と；ｂ
）このようにして発現された可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを回収する工程とを包含し
得る。可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、粗製であるか、部分的に精製されたか、また
は、高度に精製された画分として回収され得る。精製は、例えば、以下のうちの１、２、
もしくは３またはそれ以上を任意の順序で含む一連の精製工程によって達成され得る：プ
ロテインＡクロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｑセファロ
ース）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、フェニルセファロース）、サイズ
排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィー。

特定の局面では、本明細書中に開示されるアクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（
例えば、可溶性のアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドまたは可溶性のアクチビン
結合ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド）は、被験体における赤血球の生成を促進するか、また
は赤血球のレベルを上昇させるための方法において使用され得る。特定の実施形態では、
本開示は、必要とする患者において、低い赤血球数もしくは低いヘモグロビンレベルに伴
う障害（例えば、貧血）を処置するため、または、赤血球の生成を促進するための方法を
提供する。方法は、それを必要とされる被験体に、有効量のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩア
ンタゴニストを投与する工程を包含し得る。特定の局面では、本開示は、本明細書中に記
載されるような障害もしくは状態の処置のための医薬を作製するためのアクチビン−Ａｃ
ｔＲＩＩアンタゴニストの使用を提供する。

特定の局面では、本開示は、赤血球の生成を刺激する因子を同定するための方法を提供
する。方法は、ａ）アクチビンまたはＡｃｔＲＩＩポリペプチドのリガンド結合ドメイン
に結合する試験因子を同定する工程；ならびに、ｂ）赤血球、ヘモグロビン、および／ま
たは、赤血球前駆体のレベル（例えば、網状赤血球のレベル）に対する因子の作用を評価
する工程、を包含する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
ヒト患者における赤血球レベルを増加させるための方法であって、該方法は、該赤血球レ
ベルの増加を必要とするヒト患者に、以下：
ａ）配列番号２に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号３に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；お
よび
ｃ）配列番号２から選択される少なくとも５０の連続するアミノ酸を含むポリペプチド
；
ｄ）配列番号１６に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｅ）配列番号１７に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
および
ｆ）配列番号１６から選択される少なくとも５０の連続するアミノ酸を含むポリペプチ
ド
からなる群より選択される有効量のＡｃｔＲＩＩポリペプチドを投与する工程を包含する
、方法。
（項目２）
上記ポリペプチドが、以下の特徴：
ｉ）少なくとも１０^−７のＫ_ＤでＡｃｔＲＩＩリガンドに結合する、および
ｉｉ）細胞内のＡｃｔＲＩＩシグナル伝達を阻害する
のうち１つ以上を有する、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記ポリペプチドが、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインに加えて、インビボ安定性、イ
ンビボ半減期、取り込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成およ
び／または精製のうちの１以上を増強する１以上のポリペプチド部分を含む融合タンパク
質である、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記融合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃドメインおよび血清アルブミンからなる群よ
り選択されるポリペプチド部分を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記ポリペプチドが、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ
酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合されたアミノ酸または有
機誘導体化因子に結合されたアミノ酸から選択される１以上の修飾されたアミノ酸残基を
含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
上記赤血球レベルの増加が、血中のヘモグロビンレベルの増加として測定される、項目１
に記載の方法。
（項目７）
貧血を処置するための方法であって、該方法は、該貧血の処置を必要とする被験体に、有
効量のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
（項目８）
上記アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストが、アクチビンまたはＡｃｔＲＩＩのアン
タゴニストポリペプチドである、項目７に記載の方法。
（項目９）
上記アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストポリペプチドが、以下：
ａ）配列番号２に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号３に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；お
よび
ｃ）配列番号２から選択される少なくとも５０の連続するアミノ酸を含むポリペプチド
；
ｄ）配列番号１６に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｅ）配列番号１７に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
および
ｆ）配列番号１６から選択される少なくとも５０の連続するアミノ酸を含むポリペプチ
ド
からなる群より選択される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストポリペプチドが、以下の特徴：
ｉ）少なくとも１０^−７のＫ_ＤでＡｃｔＲＩＩリガンドに結合する、および
ｉｉ）細胞内のＡｃｔＲＩＩシグナル伝達を阻害する
のうち１つ以上を有する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
上記アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストポリペプチドが、該アクチビン−ＡｃｔＲ
ＩＩアンタゴニストポリペプチドに加えて、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み
／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成および／または精製のうちの
１以上を増強する１以上のポリペプチド部分を含む融合タンパク質である、項目９に記載
の方法。
（項目１２）
上記融合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃドメインおよび血清アルブミンからなる群よ
り選択されるポリペプチド部分を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
上記アクチビンまたはＡｃｔＲＩＩのアンタゴニストポリペプチドが、グリコシル化アミ
ノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化ア
ミノ酸、脂質部分に結合されたアミノ酸または有機誘導体化因子に結合されたアミノ酸か
ら選択される１以上の修飾されたアミノ酸残基を含む、項目８に記載の方法。
（項目１４）
赤血球レベルを増加させる因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
ａ）ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのリガンド結合ドメインに対して、ＡｃｔＲＩＩリガン
ドと競合的に結合する試験因子を同定する工程；および
ｂ）動物における赤血球レベルに対する該因子の効果を評価する工程
を包含する、方法。
（項目１５）
ヒト患者における赤血球レベルを増加させるための医薬を作製するための、アクチビンま
たはＡｃｔＲＩＩのアンタゴニストポリペプチドの使用。
（項目１６）
ヒト患者における赤血球レベルを増加させるための方法であって、該方法は、有効量のＡ
ｃｔＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を該患者に投与する工程を包含し、該ＡｃｔＲＩＩ−Ｆ
ｃ融合タンパク質は、以下：
ａ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列、
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列、
ｃ）配列番号３のアミノ酸配列３、
ｄ）配列番号２のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号７のアミノ酸配列、
ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列、
ｇ）配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列、
ｈ）配列番号１７のアミノ酸配列、
ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列、
ｊ）配列番号２０のアミノ酸配列、および
ｋ）配列番号２１のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
（項目１７）
上記患者の骨格筋量の１５％未満の増加をもたらす、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
上記ＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質が、約２０〜３０日の期間にわたって、上記患者
において少なくとも１００ｎｇ／ｍｌの血清濃度に達するように投与される、項目１６に
記載の方法。
（項目１９）
上記ＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質が、上記患者において、１００ｎｇ／ｍｌ〜１０
００ｎｇ／ｍｌの範囲の血清濃度に達するように投与される、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
上記ＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質が、１５日と３０日との間の血清半減期を有する
、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
上記ＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質が、週に１回以下の頻度で上記患者に投与される
、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
上記ＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質が、月に１回以下の頻度で上記患者に投与される
、項目２０に記載の方法。

図１は、ＣＨＯ細胞において発現されたＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの精製を示す。タンパク質は、サイジングカラム（左パネル）およびクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（右パネル）（左レーン：分子量標準物質；右レーン：ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃ）によって視覚化されるように、単一の十分に画定されたピークとして精製される。 図２は、ＢｉａＣｏｒｅ^ＴＭアッセイによって測定された、アクチビンおよびＧＤＦ−１１に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの結合を示す。 図３は、雌性非ヒト霊長類における赤血球数に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの作用を示す。雌性カニクイザル（各群５匹のサルの４つの群）を、プラセボ、または、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇもしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃで、０日目、７日目、１４日目および２１日目に処置した。図３Ａは、赤血球（ＲＢＣ）数を示す。図３Ｂは、ヘモグロビンレベルを示す。統計的有意差は、各処置群についての基線に対するものである。５７日目に、各群に２匹のサルが残っていた。 図３は、雌性非ヒト霊長類における赤血球数に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの作用を示す。雌性カニクイザル（各群５匹のサルの４つの群）を、プラセボ、または、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇもしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃで、０日目、７日目、１４日目および２１日目に処置した。図３Ａは、赤血球（ＲＢＣ）数を示す。図３Ｂは、ヘモグロビンレベルを示す。統計的有意差は、各処置群についての基線に対するものである。５７日目に、各群に２匹のサルが残っていた。 図４は、雄性非ヒト霊長類における赤血球数に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの作用を示す。雄性カニクイザル（各群５匹のサルの４つの群）を、プラセボ、または、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇもしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃで、０日目、７日目、１４日目および２１日目に処置した。図４Ａは、赤血球（ＲＢＣ）数を示す。図４Ｂは、ヘモグロビンレベルを示す。統計的有意差は、各処置群についての基線に対するものである。５７日目に、各群に２匹のサルが残っていた。 図４は、雄性非ヒト霊長類における赤血球数に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの作用を示す。雄性カニクイザル（各群５匹のサルの４つの群）を、プラセボ、または、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇもしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃで、０日目、７日目、１４日目および２１日目に処置した。図４Ａは、赤血球（ＲＢＣ）数を示す。図４Ｂは、ヘモグロビンレベルを示す。統計的有意差は、各処置群についての基線に対するものである。５７日目に、各群に２匹のサルが残っていた。 図５は、雌性非ヒト霊長類における網状赤血球数に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの作用を示す。カニクイザル（各群５匹のサルの４つの群）を、プラセボ、または、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇもしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃで、０日目、７日目、１４日目および２１日目に処置した。図５Ａは、絶対的な網状赤血球数を示す。図５Ｂは、ＲＢＣに対する網状赤血球の割合を示す。統計的有意差は、各処置群についての基線に対するものである。５７日目に、各群に２匹のサルが残っていた。 図５は、雌性非ヒト霊長類における網状赤血球数に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの作用を示す。カニクイザル（各群５匹のサルの４つの群）を、プラセボ、または、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇもしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃで、０日目、７日目、１４日目および２１日目に処置した。図５Ａは、絶対的な網状赤血球数を示す。図５Ｂは、ＲＢＣに対する網状赤血球の割合を示す。統計的有意差は、各処置群についての基線に対するものである。５７日目に、各群に２匹のサルが残っていた。 図６は、雄性非ヒト霊長類における網状赤血球数に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの作用を示す。カニクイザル（各群５匹のサルの４つの群）を、プラセボ、または、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇもしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃで、０日目、７日目、１４日目および２１日目に処置した。図６Ａは、絶対的な網状赤血球数を示す。図６Ｂは、ＲＢＣに対する網状赤血球の割合を示す。統計的有意差は、各処置群についての基線に対するものである。５７日目に、各群に２匹のサルが残っていた。 図６は、雄性非ヒト霊長類における網状赤血球数に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの作用を示す。カニクイザル（各群５匹のサルの４つの群）を、プラセボ、または、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇもしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃで、０日目、７日目、１４日目および２１日目に処置した。図６Ａは、絶対的な網状赤血球数を示す。図６Ｂは、ＲＢＣに対する網状赤血球の割合を示す。統計的有意差は、各処置群についての基線に対するものである。５７日目に、各群に２匹のサルが残っていた。 図７は、実施例５に記載されるヒトの臨床治験からの結果を示し、この図において、曲線下面積（ＡＵＣ）とＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの投与された用量とは、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃが静脈内（ＩＶ）投与されたか皮下（ＳＣ）投与されたかに関わらず、線形の相関性を有する。 図８は、ＩＶもしくはＳＣで投与された患者におけるＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの血清レベルの比較を示す。 図９は、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの異なる用量レベルに応答した、骨アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）レベルを示す。ＢＡＰは、同化作用性の骨成長についてのマーカーである。 図１０は、実施例５に記載されるヒトの臨床治験からの、ヘマトクリットレベルの基線からのメジアン変化を示す。ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、示される投薬量で静脈内（ＩＶ）投与された。 図１１は、実施例５に記載されるヒトの臨床治験からの、ヘモグロビンレベルの基線からのメジアン変化を示す。ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、示される投薬量で静脈内（ＩＶ）投与された。 図１２は、実施例５に記載されるヒトの臨床治験からの、ＲＢＣ（赤血球）数の基線からのメジアン変化を示す。ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、示される投薬量で静脈内（ＩＶ）投与された。 図１３は、実施例５に記載されるヒトの臨床治験からの、網状赤血球数の基線からのメジアン変化を示す。ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、示される投薬量で静脈内（ＩＶ）投与された。

（発明の詳細な説明）
１．概要
トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーは、共通の配列
エレメントと構造モチーフを共有する、種々の増殖因子を含む。これらのタンパク質は、
脊椎動物および無脊椎動物の両方における広範な種々の細胞型に対して生物学的作用を発
揮することが知られる。このスーパーファミリーのメンバーは、胚発生の間に、パターン
形成および組織の特殊化において重要な機能を果たし、そして、脂質生成、筋発生、軟骨
形成、心臓発生、造血、神経発生および上皮細胞分化を含む種々の分化プロセスに影響を
及ぼし得る。このファミリーは、一般に２つの枝：ＢＭＰ／ＧＤＦの枝およびＴＧＦ−β
／アクチビン／ＢＭＰ１０の枝、に分けられ、これらのメンバーは、多様な、しばしば相
補的な作用を有する。ＴＧＦ−βファミリーのメンバーの活性を操作することによって、
しばしば、生物において有意な生理学的変化を引き起こすことが可能である。例えば、ウ
シのＰｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅおよびＢｅｌｇｉａｎ Ｂｌｕｅ品種は、ＧＤＦ８（ミオス
タチンとも呼ばれる）に機能喪失変異を有しており、筋肉質量の顕著な増加を引き起こし
ている。Ｇｒｏｂｅｔら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９７，１７（１）：７１−４。さら
に、ヒトでは、ＧＤＦ８の不活性な対立遺伝子は、筋肉質量の増加、および、報告によれ
ば、非常に優れた強度と関連している。Ｓｃｈｕｅｌｋｅら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ
２００４，３５０：２６８２−８。

アクチビンは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する二量体ポリペプチド増殖因子で
ある。３つの主なアクチビン形態（Ａ、ＢおよびＡＢ）が存在し、これらは、２つの密接
に関連するβサブユニットのホモ二量体／ヘテロ二量体（それぞれ、β_Aβ_A、β_Bβ_Bおよ
びβ_Aβ_B）である。ヒトゲノムはまた、アクチビンＣおよびアクチビンＥもコードしてい
るが、これらは、主として肝臓で発現されており、そして、β_Ｃもしくはβ_Ｅを含むヘテ
ロ二量体形態もまた知られる。ＴＧＦ−βスーパーファミリーにおいて、アクチビンは、
卵巣および胎盤の細胞におけるホルモン生成を刺激し得、神経細胞の生存を支援し得、細
胞周期の進行に対して細胞型に依存して正もしくは負に影響を及ぼし得、そして、少なく
とも両生類の胚において中胚葉分化を誘導し得る、独特かつ多機能の因子である（ＤｅＰ
ａｏｌｏら、１９９１，Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．１９８：５００−
５１２；Ｄｙｓｏｎら、１９９７，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．７：８１−８４；Ｗｏｏｄｒｕ
ｆｆ，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５：９５３−９６３）。さら
に、刺激されたヒト単球性白血病細胞から単離された赤血球分化因子（ＥＤＦ）は、アク
チビンＡと同一であることが分かった（Ｍｕｒａｔａら、１９８８，ＰＮＡＳ，８５：２
４３４）。アクチビンＡは、骨髄における赤血球生成を促進することが示唆されている。
いくつかの組織では、アクチビンのシグナル伝達は、その関連するヘテロ二量体であるイ
ンヒビンによって拮抗される。例えば、下垂体からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出
の間に、アクチビンは、ＦＳＨの分泌および合成を促進するが、インヒビンは、ＦＳＨの
分泌および合成を抑制する。アクチビンの生活性を調節し得、そして／または、アクチビ
ンに結合し得る他のタンパク質としては、フォリスタチン（ＦＳ）、フォリスタチン関連
タンパク質（ＦＳＲＰ）およびα_２−マクログロブリンが挙げられる。

ＴＧＦ−βシグナルは、Ｉ型およびＩＩ型のセリン／スレオニンキナーゼレセプターの
異種複合体（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘ）によって媒介され、これらのレ
セプターは、リガンド刺激の際に、下流のＳｍａｄタンパク質をリン酸化および活性化す
る（Ｍａｓｓａｇｕｅ，２０００，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１：
１６９−１７８）。これらのＩ型およびＩＩ型レセプターは、システインリッチな領域を
持つリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および、推定のセリン／スレオニン
特異性を持つ細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。Ｉ型レセプターは
、シグナル伝達に必須であり；そして、ＩＩ型レセプターは、リガンド結合およびＩ型レ
セプターの発現に必要とされる。Ｉ型およびＩＩ型のアクチビンレセプターは、リガンド
結合後に安定な複合体を形成し、ＩＩ型レセプターによるＩ型レセプターのリン酸化をも
たらす。

２つの関連するＩＩ型レセプター（ＡｃｔＲＩＩ）であるＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔ
ＲＩＩｂが、アクチビンに対するＩＩ型レセプターとして同定されている（Ｍａｔｈｅｗ
ｓおよびＶａｌｅ，１９９１，Ｃｅｌｌ ６５：９７３−９８２；Ａｔｔｉｓａｎｏら、
１９９２，Ｃｅｌｌ ６８：９７−１０８）。アクチビンに加えて、ＡｃｔＲＩＩａおよ
びＡｃｔＲＩＩｂは、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１を含むいくつか
の他のＴＧＦ−βファミリータンパク質と生化学的に相互作用し得る（Ｙａｍａｓｈｉｔ
ａら、１９９５，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３０：２１７−２２６；ＬｅｅおよびＭｃ
Ｐｈｅｒｒｏｎ，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：９３０６−
９３１１；ＹｅｏおよびＷｈｉｔｍａｎ，２００１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ７：９４９−９
５７；Ｏｈら、２００２，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：２７４９−５４）。ＡＬＫ４は、
アクチビン、特にアクチビンＡに対する主たるＩ型レセプターであり、そして、ＡＬＫ−
７もまた、アクチビン、特にアクチビンＢに対するレセプターとして機能し得る。

本明細書中に示されるように、ＧＤＦ８もしくはＧＤＦ１１のような他のＴＧＦ−βフ
ァミリーメンバーとは対照的にアクチビンＡへの結合にかなりの選択性を示す可溶性Ａｃ
ｔＲＩＩａポリペプチド（ｓＡｃｔＲＩＩａ）は、インビボで赤血球レベルを増加させる
のに有効である。任意の特定の機構に束縛されることは望まないが、これらの研究におい
て使用される特定のｓＡｃｔＲＩＩａ構築物によって示される非常に強力なアクチビンの
結合（ピコモル濃度の解離定数）を考慮すると、ｓＡｃｔＲＩＩａの作用は、主としてア
クチビンアンタゴニスト作用によって引き起こされるものであることが予想される。機構
によらず、ＡｃｔＲＩＩａ−アクチビンアンタゴニストが、げっ歯類、サルおよびヒトに
おいて赤血球レベルを増加させることは、本開示から明らかである。造血は、エリスロポ
エチン、Ｇ−ＣＳＦおよび鉄のホメオスタシスを含む種々の要因によって調節される複雑
なプロセスであることに注意すべきである。用語「赤血球レベルを増加させる」および「
赤血球の形成を促進する」とは、ヘマトクリット、赤血球数およびヘモグロビン測定値の
ような臨床的に観察可能な測定基準を指し、このような変化が生じる機構に関しては不特
定であることが意図される。

また、本明細書中に示されるように、可溶性ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド（ｓＡｃｔＲ
ＩＩｂ）は、インビボで網状赤血球レベルを増加させるのに有効であり、この作用は、長
時間にわたり、ヘマトクリットレベルの増加を引き起こすことが予測される。

本明細書中に報告される非ヒト霊長類に関するデータは、マウス、ラットおよびヒトで
も再現可能であり、それゆえ、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよび他のアクチビ
ン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを用いて、げっ歯類からヒトまでに及ぶ哺乳動物におい
て赤血球の生成を促進し、そして、赤血球レベルを増加させるための方法を提供する。ア
クチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストとしては、例えば、以下が挙げられる：アクチビ
ン結合可溶性ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド、アクチビン結合可溶性ＡｃｔＲＩＩｂポリペ
プチド、アクチビン（特に、アクチビンＡもしくはＢサブユニット、または、β_Ａもしく
はβ_Ｂとも呼ばれる）に結合し、ＡｃｔＲＩＩａおよび／もしくはＡｃｔＲＩＩｂの結合
を破壊する抗体、ＡｃｔＲＩＩａに結合しアクチビンの結合を破壊する抗体、ＡｃｔＲＩ
Ｉｂに結合しアクチビンの結合を破壊する抗体、アクチビン、ＡｃｔＲＩＩｂもしくはＡ
ｃｔＲＩＩａの結合について選択された非抗体タンパク質（例えば、このようなタンパク
質、ならびに、このようなタンパク質の設計および選択の方法については、例えば、ＷＯ
／２００２／０８８１７１、ＷＯ／２００６／０５５６８９およびＷＯ／２００２／０３
２９２５を参照のこと）、アクチビン、ＡｃｔＲＩＩｂもしくはＡｃｔＲＩＩａの結合に
ついて選択されたランダム化ペプチド（しばしば、Ｆｃドメインに付加される）。アクチ
ビン、ＡｃｔＲＩＩｂもしくはＡｃｔＲＩＩａの結合活性を持つ２つの異なるタンパク質
（または他の部分）、特に、それぞれ、Ｉ型（例えば、可溶性Ｉ型アクチビンレセプター
）およびＩＩ型（例えば、可溶性ＩＩ型アクチビンレセプター）の結合部位をブロックす
るアクチビン結合因子は、二機能性の結合分子を生じるように互いに連結され得る。アク
チビン−ＡｃｔＲＩＩシグナル伝達軸を阻害する核酸アプタマー、低分子および他の因子
が、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストとして含まれる。種々のタンパク質がアク
チビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト活性を有し、インヒビン（すなわち、インヒビンα
サブユニット）（インヒビンは、全ての組織において例外なくアクチビンと拮抗するわけ
ではないが）、フォリスタチン（例えば、フォリスタチン−２８８およびフォリスタチン
−３１５）、ＦＳＲＰ、アクチビンＣ、α（２）−マクログロブリンおよびＭ１０８Ａ（
１０８位におけるメチオニンからアラニンへの変化）変異型アクチビンＡが挙げられる。
一般に、アクチビンの代替的な形態、特に、Ｉ型レセプター結合ドメインに変化を有する
ものは、ＩＩ型レセプターに結合し得るが、活性な３次元複合体を形成できず、したがっ
て、アンタゴニストとして機能する。さらに、アクチビンＡ、Ｂ、ＣもしくはＥ、または
、特に、ＡｃｔＲＩＩａもしくはＡｃｔＲＩＩｂの発現を阻害する核酸（例えば、アンチ
センス分子、ｓｉＲＮＡまたはリボザイム）は、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニス
トとして使用され得る。使用されるべきアクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、Ｔ
ＧＦ−βファミリーの他のメンバー、特に、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１に関して、アクチ
ビン媒介性のシグナル伝達の阻害についての選択性を示し得る。

本明細書中で使用される用語は、一般に、本開示の文脈の範囲内で、かつ、各々の用語
が使用される特定の文脈において、当該分野におけるその通常の意味を有する。本開示の
組成物および方法、ならびに、これらの作成方法および使用方法の記載において、専門家
にさらなる案内を提供するために、特定の用語が以下または本明細書中の他の場所で論じ
られている。用語の任意の使用の範囲および意味は、その用語が使用される特定の文脈か
ら明らかである。

「約」および「およそ」は、一般に、測定の性質または正確さを仮定して、測定された
量についての誤差の容認可能な程度を意味する。代表的には、例示的な誤差の程度は、所
与の値または値の範囲の、２０パーセント（％）内、好ましくは１０パーセント（％）内
、そしてより好ましくは５％内である。

あるいは、そして、特に生物学的な系において、用語「約」および「およそ」は、所与
の値のあるオーダーの大きさの範囲内、好ましくは、５倍以内、そしてより好ましくは２
倍以内の値を意味し得る。本明細書中に与えられる数量は、特に明記しない限り近似値で
あり、明白に記述されない場合には、用語「約」または「およそ」は、推量され得ること
を意味する。

本開示の方法は、配列を互いに比較する工程を包含し得、この比較には、野生型配列の
１以上の変異体／配列改変体に対する比較を含む。このような比較は代表的には、例えば
、当該分野で周知の配列アラインメントのプログラムおよび／またはアルゴリズム（例え
ば、少数の名を挙げれば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＭＥＧＡＬＩＧＮ）を用いた、
ポリマー配列のアラインメントを含む。当業者は、変異が残基の挿入または欠失を含むよ
うなこのようなアラインメントにおいて、配列のアラインメントは、挿入もしくは欠失さ
れた残基を含まないポリマー配列中に「ギャップ」（代表的には、―または「Ａ」で表さ
れる）を導入することを容易に理解し得る。

「相同」は、そのあらゆる文法的な形態および語の綴りのバリエーションにおいて、同
種の生物におけるスーパーファミリーに由来するタンパク質、ならびに、異なる種の生物
に由来する相同なタンパク質を含む、「共通する進化の起源」を有する２タンパク質間の
関係をいう。このようなタンパク質（およびこれをコードする核酸）は、％同一性の観点
であれ、特定の残基もしくはモチーフおよび保存された位置の存在によるものであれ、そ
の配列類似性によって反映されるように、配列の相同性を有する。

用語「配列類似性」は、そのあらゆる文法的な形態において、共通する進化の起源を共
有していても共有していなくても、核酸もしくはアミノ酸間の同一性もしくは対応性の程
度をいう。

しかし、一般的な用法および本願において、用語「相同」は、「高度に」のような副詞
で修飾されるとき、配列の類似性を指す場合があり、そして、共通する進化の起源に関連
していてもしていなくてもよい。

２．ＡｃｔＲＩＩポリペプチド
特定の局面では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドに関する。本明細書中で使用さ
れる場合、用語「ＡｃｔＲＩＩ」は、ＩＩ型アクチビンレセプターのファミリーを指す。
このファミリーは、アクチビンレセプターＩＩａ型およびアクチビンレセプターＩＩｂ型
の両方を含む。

特定の局面では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドに関する。本明細書中で使用
される場合、用語「ＡｃｔＲＩＩａ」は、任意の種に由来するアクチビンレセプターＩＩ
ａ型（ＡｃｔＲＩＩａ）タンパク質、および、突然変異誘発もしくは他の修飾法によって
このようなＡｃｔＲＩＩａタンパク質から誘導された改変体のファミリーを指す。本明細
書におけるＡｃｔＲＩＩａに対する参照は、現在同定されている形態のうちの１つに対す
る参照であるものと理解される。ＡｃｔＲＩＩａファミリーのメンバーは、一般に、シス
テインリッチな領域を持つリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび推定のセ
リン／スレオニンキナーゼ活性を持つ細胞質ドメインから構成される、膜貫通タンパク質
である。

用語「ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩａファミリーメンバーの任意の
天然に存在するポリペプチド、ならびに、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異
体、フラグメント、融合物およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを包含す
る。例えば、ＷＯ／２００６／０１２６２７を参照のこと。例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリ
ペプチドは、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの配列に対して少なくとも約８０％同一な、そ
して、必要に応じて、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％もしくはそれ
より高い同一性を持つ配列を有する任意の公知のＡｃｔＲＩＩａの配列から誘導されたポ
リペプチドを包含する。例えば、本発明のＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩ
ａタンパク質および／またはアクチビンに結合し、これらの機能を阻害し得る。ＡｃｔＲ
ＩＩａポリペプチドは、インビボで赤血球の形成を促進する際の活性について選択され得
る。ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの例としては、ヒトＡｃｔＲＩＩａ前駆体ポリペプチド
（配列番号１）および可溶性ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド（例えば、配列番号２、３、７
および１２）が挙げられる。

ヒトＡｃｔＲＩＩａ前駆体タンパク質配列は以下のとおりである：

シグナルペプチドに一重下線を付す；細胞外ドメインは太字で示し、そして、潜在的な
Ｎ連結グリコシル化部位に二重下線を付す。

ヒトＡｃｔＲＩａｂの可溶性（細胞外）の、プロセシング後のポリペプチド配列は以下
のとおりである：

細胞外ドメインのＣ末端「テイル」に下線を付す。「テイル」が欠失された配列（Δ１
５配列）は以下のとおりである：

ヒトＡｃｔＲＩＩａ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は以下のとおりである：
（ＧｅｎｂａｎｋエントリーＮＭ＿００１６１６のヌクレオチド１６４〜１７０５）

ヒトＡｃｔＲＩＩａ可溶性（細胞外）ポリペプチドをコードする核酸配列は以下のとお
りである：

特定の局面では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドに関する。本明細書中で使用
される場合、用語「ＡｃｔＲＩＩｂ」は、任意の種に由来するアクチビンレセプターＩＩ
ｂ型（ＡｃｔＲＩＩｂ）タンパク質、および、突然変異誘発もしくは他の修飾法によって
このようなＡｃｔＲＩＩｂタンパク質から誘導された改変体のファミリーを指す。本明細
書におけるＡｃｔＲＩＩｂに対する参照は、現在同定されている形態のうちの１つに対す
る参照であるものと理解される。ＡｃｔＲＩＩｂファミリーのメンバーは、一般に、シス
テインリッチな領域を持つリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび推定のセ
リン／スレオニンキナーゼ活性を持つ細胞質ドメインから構成される、膜貫通タンパク質
である。

用語「ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩｂファミリーメンバーの任意の
天然に存在するポリペプチド、ならびに、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異
体、フラグメント、融合物およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを包含す
る。例えば、ＷＯ／２００６／０１２６２７を参照のこと。例えば、ＡｃｔＲＩＩｂポリ
ペプチドは、ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドの配列に対して少なくとも約８０％同一な、そ
して、必要に応じて、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％もしくはそれ
より高い同一性を持つ配列を有する任意の公知のＡｃｔＲＩＩｂの配列から誘導されたポ
リペプチドを包含する。例えば、本発明のＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩ
ｂタンパク質および／またはアクチビンに結合し、これらの機能を阻害し得る。ＡｃｔＲ
ＩＩｂポリペプチドは、インビボで赤血球の形成を促進する際の活性について選択され得
る。ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドの例としては、ヒトＡｃｔＲＩＩｂ前駆体ポリペプチド
（配列番号１５）および可溶性ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド（例えば、配列番号１６、１
７、２０および２１）が挙げられる。

ヒトＡｃｔＲＩＩｂ前駆体タンパク質の配列は以下のとおりである：

シグナルペプチドに一重下線を付す；細胞外ドメインは太字で示し、そして、潜在的な
Ｎ連結グリコシル化部位は四角で囲む。

ヒトＡｃｔＲＩＩｂの可溶性（細胞外）の、プロセシング後のポリペプチド配列は以下
のとおりである：

細胞外ドメインのＣ末端「テイル」に下線を付す。「テイル」が欠失された配列（Δ１
５配列）は以下のとおりである：

ヒトＡｃｔＲＩＩｂ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は以下のとおりである：
（ＧｅｎｂａｎｋエントリーＮＭ＿００１１０６のヌクレオチド５〜１５４３）

ヒトＡｃｔＲＩＩｂ可溶性（細胞外）ポリペプチドをコードする核酸配列は以下のとお
りである：

特定の実施形態では、本発明は、可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチドに関する。本明細書
中で使用される場合、用語「可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチド」は、一般に、ＡｃｔＲＩ
ＩａもしくはＡｃｔＲＩＩｂタンパク質の細胞外ドメインを含むポリペプチドを指す。用
語「可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチド」は、本明細書中で使用される場合、ＡｃｔＲＩＩ
ａもしくはＡｃｔＲＩＩｂタンパク質の任意の天然に存在する細胞外ドメインならびに任
意のその改変体（変異体、フラグメントおよびペプチド模倣形態を含む）を包含する。ア
クチビン結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、アクチビン（例えば、アクチビンＡＡ、ＡＢ
、ＢＢ、または、ＣもしくはＥサブユニットを含む形態を含む）に結合する能力を保持す
るものである。必要に応じて、アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、１ｎＭ以下
の解離定数でアクチビンＡＡに結合する。ＡｃｔＲＩＩタンパク質の細胞外ドメインは、
アクチビンに結合し、そして、一般に可溶性であり、したがって、可溶性のアクチビン結
合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと呼ばれ得る。可溶性のアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリ
ペプチドの例としては、配列番号２、３、７、１２および１３に示される可溶性ポリペプ
チドが挙げられる。配列番号７は、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃと呼ばれ、そして、実施例に
おいてさらに記載される。可溶性のアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの他の例
は、ＡｃｔＲＩＩａタンパク質の細胞外ドメインに加え、シグナル配列（例えば、ミツバ
チメリチンのリーダー配列（配列番号８）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰ
Ａ）リーダー（配列番号９）、またはネイティブなＡｃｔＲＩＩａリーダー（配列番号１
０））を含む。配列番号１３に示されるＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃポリペプチドは、ＴＰＡ
リーダーを使用する。可溶性のアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドの例としては
、配列番号１６、１７、２０に示される可溶性ポリペプチドが挙げられる。アクチビン結
合ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドもまた、ＡｃｔＲＩＩｂの細胞外ドメインに加え、シグナ
ル配列（例えば、ミツバチメリチンのリーダー配列（配列番号８）、または組織プラスミ
ノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）リーダー（配列番号９））を含み得る。

ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの機能的に活性なフラグメントは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチ
ドをコードする核酸の対応するフラグメントから組換えにより生成されるポリペプチドを
スクリーニングすることによって得られ得る。さらに、フラグメントは、従来のＭｅｒｒ
ｉｆｉｅｌｄ固相ｆ−Ｍｏｃもしくはｔ−Ｂｏｃ化学のような当該分野で公知の技術を用
いて化学的に合成され得る。フラグメントは、（組換えにより、または、化学合成により
）生成され得、そして、ＡｃｔＲＩＩタンパク質またはアクチビンにより媒介されるシグ
ナル伝達のアンタゴニスト（インヒビター）として機能し得るペプチジルフラグメントを
同定するために試験され得る。

ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの機能的に活性な改変体は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコ
ードする対応する変異誘発を起こした核酸から組換えにより生成される修飾ポリペプチド
のライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。改変体は、生成され得、
そして、ＡｃｔＲＩＩタンパク質またはアクチビンにより媒介されるシグナル伝達のアン
タゴニスト（インヒビター）として機能し得るものを同定するために試験され得る。特定
の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの機能的改変体は、配列番号２または３か
ら選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含む。特定の
場合、機能的改変体は、配列番号２または３から選択されるアミノ酸配列に対して少なく
とも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一な
アミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドの機能的改変
体は、配列番号１６または１７から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同
一なアミノ酸配列を含む。特定の場合、機能的改変体は、配列番号１７または１８から選
択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９
８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列を有する。

機能的改変体は、治療効率または安定性（例えば、エキソビボ貯蔵寿命およびインビボ
でのタンパク質分解に対する抵抗性）の増強のような目的のために、ＡｃｔＲＩＩポリペ
プチドの構造を修飾することによって作製され得る。このような改変されたＡｃｔＲＩＩ
ポリペプチドは、アクチビン結合を保持するように選択される場合、天然に存在するＡｃ
ｔＲＩＩポリペプチドの機能的な等価物とみなされる。改変されたＡｃｔＲＩＩポリペプ
チドはまた、例えば、アミノ酸の置換、欠失または付加によって生成され得る。例えば、
ロイシンのイソロイシンもしくはバリンでの孤立した置換、アスパラギン酸のグルタミン
酸での孤立した置換、スレオニンのセリンでの孤立した置換、または、あるアミノ酸の、
構造的に関連したアミノ酸での同様の置換（例えば、保存的変異）は、結果として生じる
分子の生物学的活性に対して大きな影響を及ぼさないもの予想するのは理にかなっている
。保存的置換は、その側鎖が関連しているアミノ酸のファミリー内で行われる置換である
。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのアミノ酸配列の変化が機能的なホモログを生じるかどうか
は、改変型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドが細胞において野生型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと
同様の様式で応答を生じる能力を評価することによって容易に決定され得る。

特定の実施形態では、本発明は、ポリペプチドのグリコシル化を変更するようなＡｃｔ
ＲＩＩポリペプチドの特定の変異を帰途する。このような変異は、１以上のグリコシル化
部位（例えば、Ｏ−連結もしくはＮ−連結のグリコシル化部位）を導入もしくは排除する
ように選択され得る。アスパラギン連結グリコシル化認識部位は、一般に、トリペプチド
配列、アスパラギン−Ｘ−スレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリン（ここで、「Ｘ」
は任意のアミノ酸である）を含み、この配列は、適切な細胞のグリコシル化酵素によって
特異的に認識される。変化はまた、（Ｏ−連結グリコシル化部位については）野生型Ａｃ
ｔＲＩＩポリペプチドの配列への、１以上のセリンもしくはスレオニン残基の付加、また
は、１以上のセリンもしくはスレオニン残基での置換によってなされ得る。グリコシル化
認識部位の第１位もしくは第３位のアミノ酸の一方もしくは両方における種々のアミノ酸
置換もしくは欠失（および／または、第２位におけるアミノ酸の欠失）は、改変されたト
リペプチド配列において非グリコシル化をもたらす。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドにおける
糖質部分の数を増加させる別の手段は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドへのグリコシドの化学
的もしくは酵素的なカップリングによるものである。使用されるカップリング様式に依存
して、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）遊
離スルフヒドリル基（例えば、システインのもの）；（ｄ）遊離ヒドロキシル基（例えば
、セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのもの）；（ｅ）芳香族残基（例えば、
フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのもの）；または（ｆ）グルタミンの
アミド基に付加され得る。ＡｃｔＲＩＩポリペプチド上に存在する１以上の糖質部分の除
去は、化学的および／または酵素的に達成され得る。化学的な脱グリコシル化は、例えば
、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物へのＡｃｔＲＩＩポリペプチ
ドの曝露を含み得る。この処理は、アミノ酸配列をインタクトなままにしつつ、連結糖（
Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどもしくは
全ての糖の切断を生じる。ＡｃｔＲＩＩポリペプチド上の糖質部分の酵素的切断は、Ｔｈ
ｏｔａｋｕｒａら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０に記載される
ように、種々のエンドグリコシダーゼもしくはエキソグリコシダーゼの使用により達成さ
れ得る。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの配列は、適切な場合、使用される発現系のタイプに
応じて調節され得る。というのも、哺乳動物、酵母、昆虫および植物の細胞は全て、ペプ
チドのアミノ酸配列によって影響され得る異なるグリコシル化パターンを導入し得る。一
般に、ヒトにおいて使用するためのＡｃｔＲＩＩタンパク質は、適切なグリコシル化を提
供する哺乳動物細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３細胞株またはＣＨＯ細胞株）において発現
され得るが、他の哺乳動物発現細胞株も同様に有用であることと期待される。

本開示はさらに、変異、特に、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのコンビナトリアル変異のセ
ット、ならびに、短縮型変異（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ）を作製する方法を
企図する；コンビナトリアル変異のプールは、機能的改変体の配列を同定するために特に
有用である。このようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例
えば、アクチビンまたは他のリガンドに結合するＡｃｔＲＩＩポリペプチド改変体を作製
するため、であり得る。種々のスクリーニングアッセイが以下に提供され、そして、この
ようなアッセイは、改変体を評価するために使用され得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペ
プチド改変体は、ＡｃｔＲＩＩリガンドに結合する能力、ＡｃｔＲＩＩリガンドのＡｃｔ
ＲＩＩポリペプチドへの結合を妨害する能力、または、ＡｃｔＲＩＩリガンドにより引き
起こされるシグナル伝達と干渉する能力についてスクリーニングされ得る。

ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはその改変体の活性はまた、細胞ベースのアッセイまた
はインビボアッセイにおいて試験され得る。例えば、造血に関与する遺伝子の発現に対す
るＡｃｔＲＩＩポリペプチド改変体の作用が評価され得る。これは、必要な場合、１以上
の組換えＡｃｔＲＩＩリガンドタンパク質（例えば、アクチビン）の存在下で行われ得、
そして、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよび／またはその改変体、そして必要に応じてＡｃ
ｔＲＩＩリガンドを生成するように細胞がトランスフェクトされ得る。同様に、ＡｃｔＲ
ＩＩポリペプチドは、マウスもしくは他の動物に投与され得、そして、１以上の血液測定
値（例えば、ＲＢＣ数、ヘモグロビン、または網状赤血球数）が評価され得る。

天然に存在するＡｃｔＲＩＩポリペプチドに対して、選択性を有するか、または全体的
に効力が増加された、コンビナトリアル由来の（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｌｙ−ｄｅ
ｒｉｖｅｄ）改変体が作製され得る。同様に、突然変異誘発は、対応する野生型ＡｃｔＲ
ＩＩポリペプチドとは劇的に異なる細胞内半減期を有する改変体を生じ得る。例えば、変
更されたタンパク質は、タンパク質分解、または、ネイティブなＡｃｔＲＩＩポリペプチ
ドの崩壊もしくは他の方法で不活性化をもたらす他の細胞プロセスに対してより安定性で
あるかもしくは安定性が低いかのいずれかにされ得る。このような改変体およびこれをコ
ードする遺伝子は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの半減期を調節することによってＡｃｔＲ
ＩＩポリペプチドレベルを変更するために利用され得る。例えば、短い半減期は、より一
過性の生物学的作用を生じ得、そして、誘導性の発現系の一部である場合、細胞内での組
換えＡｃｔＲＩＩポリペプチドレベルのより厳しい制御を可能にし得る。Ｆｃ融合タンパ
ク質では、変異は、タンパク質の半減期を変更するために、リンカー（存在する場合）お
よび／またはＦｃ部分において作製され得る。

コンビナトリアルライブラリーは、各々が少なくとも潜在的なＡｃｔＲＩＩポリペプチ
ド配列の一部を含むポリペプチドライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリー（
ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｌｉｂｒａｒｙ）によって生成され得る。例えば、合成オリゴヌ
クレオチドの混合物は、潜在的なＡｃｔＲＩＩポリペプチドのヌクレオチド配列の縮重セ
ットが、個々のポリペプチドとして、あるいは、（例えば、ファージディスプレイのため
の）より大きな融合タンパク質のセットとして発現可能となるように、遺伝子配列中に酵
素的にライゲーションされ得る。

縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なホモログのライブラリーが作製され得る数多
くの方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成装置において行われ
得、そしてその後、合成遺伝子が、適切な発現ベクター中にライゲーションされ得る。縮
重オリゴヌクレオチドの合成は当該分野で周知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，ＳＡ（１
９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８１）Ｒｅｃｏ
ｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐｒｏｃ．３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａ
ｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ＡＧ Ｗａｌｔｏｎ編，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ ｐｐ２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１
０５６；Ｉｋｅら、（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を参
照のこと）。このような技術は、他のタンパク質の有向の進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖ
ｏｌｕｔｉｏｎ）において用いられ得る（例えば、Ｓｃｏｔｔら、（１９９０）Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓら、（１９９２）ＰＮＡＳ ＵＳＡ
８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４
０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら、（１９９０）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：６３７８−６３
８２；ならびに、米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号および同
第５，０９６，８１５号を参照のこと）。

あるいは、コンビナトリアルライブラリーを作製するために、他の形態の突然変異誘発
が利用され得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド改変体は、例えば、アラニン走査突
然変異誘発などを用いるスクリーニングによって（Ｒｕｆら、（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ３３：１５６５−１５７２；Ｗａｎｇら、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６９：３０９５−３０９９；Ｂａｌｉｎｔら、（１９９３）Ｇｅｎｅ １３７
：１０９−１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら、（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２
１８：５９７−６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６８：２８８８−２８９２；Ｌｏｗｍａｎら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
３０：１０８３２−１０８３８；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら、（１９８９）Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）、リンカー走査突然変異誘発によって（Ｇｕｓ
ｔｉｎら、（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３：６５３−６６０；Ｂｒｏｗｎら、（
１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：２６４４−２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔ
ら、（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３１６）；飽和突然変異誘発によって（Ｍｅ
ｙｅｒｓら、（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：６１３）；ＰＣＲ突然変異誘発によ
って（Ｌｅｕｎｇら、（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １：１
１−１９）；または、ランダム突然変誘発（化学突然変異誘発などを含む）によって（Ｍ
ｉｌｌｅｒら、（１９９２）Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，
ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒら、（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂ
ｉｏｌ ７：３２−３４）、ライブラリーから作製および単離され得る。（特に、コンビ
ナトリアルな設定における）リンカー走査突然変異誘発は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの
短縮型（生物活性）形態を同定するための魅力的な方法である。

点突然変異および短縮によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物
をスクリーニングするため、また、その状況のために、特定の特性を持つ遺伝子産物につ
いてのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための、広範囲の技術が当該分野で公
知である。このような技術は、一般に、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのコンビナトリアル突
然変異誘発によって作製された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能で
ある。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための最も広く使用される技術は
、代表的に、複製発現ベクター中への遺伝子ライブラリーのクローニング、得られたベク
ターライブラリーを用いた適切な細胞の形質転換、および、所望される活性の検出が、遺
伝子（その産物が検出される）をコードするベクターの比較的簡単な単離を容易にする条
件下でのコンビナトリアル遺伝子発現を含む。好ましいアッセイとしては、アクチビン結
合アッセイおよびアクチビン媒介性細胞シグナル伝達アッセイが挙げられる。

特定の実施形態では、本発明のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、さらに、ＡｃｔＲＩＩポ
リペプチド中に天然に存在するものに加えて、翻訳後修飾を含み得る。このような修飾と
しては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、ホスホリル化、脂質化（ｌｉｐｉ
ｄａｔｉｏｎ）およびアシル化が挙げられるがこれらに限定されない。結果として、修飾
されたＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、ポリエチレングリコール、脂質、多糖類もしくは単
糖類およびリン酸のような非アミノ酸成分を含み得る。このような非アミノ酸成分の、Ａ
ｃｔＲＩＩポリペプチドの機能に対する影響は、他のＡｃｔＲＩＩポリペプチド改変体に
ついて本明細書中に記載されるようにして試験され得る。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの発
生直後の形態を切断することによってＡｃｔＲＩＩポリペプチドが細胞内で生成される場
合、翻訳後プロセシングもまた、このタンパク質の正確な折り畳みおよび／または機能に
とって重要となり得る。異なる細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、Ｗ
Ｉ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ２９３）は、このような翻訳後の活性のための特定
の細胞機構および特徴的なメカニズムを有し、そして、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの正確
な修飾およびプロセシングを保証するように選択され得る。

特定の局面では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの機能的改変体または改変された形態は、
少なくともＡｃｔＲＩＩポリペプチドの一部分と１以上の融合ドメインとを有する融合タ
ンパク質を含む。このような融合ドメインの周知の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ
−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテイン
Ａ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（
ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンが挙げられるがこれらに限定されない。融合ドメイ
ンは、所望される特性を与えるように選択され得る。例えば、いくつかの融合ドメインが
、アフィニティクロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフ
ィニティ精製の目的では、グルタチオン−、アミラーゼ−、およびニッケル−もしくはコ
バルト−結合化樹脂のような、アフィニティクロマトグラフィーのための適切なマトリク
スが使用される。このようなマトリクスの多くは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＧＳＴ精製シス
テムおよび（ＨＩＳ_６）融合パートナーと共に有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ^ＴＭシステム
（Ｑｉａｇｅｎ）のような「キット」の形態で利用可能である。別の例としては、融合ド
メインは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの検出を容易にするように選択され得る。このよう
な検出ドメインの例としては、種々の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、ならびに、「
エピトープタグ」（特定の抗体に利用可能な通常は短いペプチド配列である）が挙げられ
る。特定のモノクローナル抗体に容易に利用可能な周知のエピトープタグとしては、ＦＬ
ＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）およびｃ−ｍｙｃタグが挙げられ
る。いくつかの場合、融合ドメインは、関連のプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に
消化し、それによって、そこから組換えタンパク質を解放することを可能にする、第Ｘａ
因子またはトロンビンのようなプロテアーゼ切断部位を有する。解放されたタンパク質は
、次いで、その後のクロマトグラフィーによる分離によって、融合ドメインから単離され
得る。特定の好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、インビボでＡｃｔＲ
ＩＩポリペプチドを安定化させるドメイン（「安定化」ドメイン）と融合される。「安定
化」とは、それが、崩壊の減少によるものであるか、腎臓によるクリアランスの減少によ
るものであるか、他の薬物動態作用によるものであるかとは無関係に、血清半減期を増加
させる何かを意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合は、広範囲のタンパク質に対
して所望の薬物動態特性を与えることが知られる。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合
は、所望の特性を与え得る。選択され得る融合ドメインの他のタイプとしては、多量体化
（例えば、二量体化、四量体化）ドメインおよび機能的ドメイン（例えば、筋肉増殖のさ
らなる刺激のような付加的な生物学的機能を与えるもの）が挙げられる。

具体例として、本発明は、Ｆｃドメインに融合されたＡｃｔＲＩＩａの可溶性細胞外ド
メインを含む融合タンパク質（例えば、配列番号６）を提供する。

別の具体例として、本発明は、Ｆｃドメインに融合されたＡｃｔＲＩＩｂの可溶性細胞
外ドメインを含む融合タンパク質（例えば、配列番号２１）を提供する。

必要に応じて、Ｆｃドメインは、Ａｓｐ−２６５、リジン３２２およびＡｓｎ−４３４
のような残基における１以上の変異を有する。特定の場合、これらの変異のうち１以上（
例えば、Ａｓｐ−２６５変異）を持つ変異型Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインに対す
る、Ｆｃγレセプターへの結合能の低下を有する。他の場合では、これらの変異のうち１
以上（例えば、Ａｓｎ−４３４変異）を持つ変異型Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメイン
に対する、ＭＨＣクラスＩ関連のＦｃレセプター（ＦｃＲＮ）への結合の増加を有する。

融合タンパク質の異なる成分は、所望の機能と両立するあらゆる様式で配列され得るこ
とが理解される。例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、異種ドメインに対してＣ末端側
に配置されても、あるいは、異種ドメインが、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドに対してＣ末端
側に配置されてもよい。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインと異種ドメインとは、融合タ
ンパク質において隣接している必要はなく、そして、さらなるドメインもしくはアミノ酸
配列が、いずれかのドメインに対してＣ末端もしくはＮ末端側に、または、これらのドメ
イン間に含められてもよい。

特定の実施形態では、本発明のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチ
ドを安定化させ得る１以上の修飾を含む。例えば、このような修飾は、ＡｃｔＲＩＩポリ
ペプチドのインビトロ半減期を増強させるか、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの循環半減期を
増強させるか、または、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのタンパク質分解を減少させる。この
ような安定化修飾としては、融合タンパク質（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと安定
化ドメインとを含む融合タンパク質が挙げられる）、グリコシル化部位の修飾（例えば、
ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのグリコシル化部位の付加が挙げられる）、および糖質部分の
修飾（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドからの糖質部分の除去が挙げられる）が挙げら
れるがこれらに限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「安定化ドメイン」は
、融合タンパク質の場合のように融合ドメイン（例えば、Ｆｃ）を指すだけでなく、糖質
部分のような非タンパク質性修飾、または、ポリエチレングリコールのような非タンパク
質性部分も含む。

特定の実施形態では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの単離および／または精製
された形態（他のタンパク質から単離されたか、他の方法で他のタンパク質を実質的に含
まないもの）を利用可能にする。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは一般に、組換え核酸からの
発現によって生成される。

３．ＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコードする核酸
特定の局面では、本発明は、本明細書中に開示されるフラグメント、機能的改変体およ
び融合タンパク質を含むＡｃｔＲＩＩポリペプチドのいずれか（例えば、可溶性ＡｃｔＲ
ＩＩａポリペプチドおよび可溶性ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド）をコードする単離された
および／または組換えの核酸を提供する。例えば、配列番号４は、天然に存在するヒトＡ
ｃｔＲＩＩａ前駆体ポリペプチドをコードするが、配列番号５は、ＡｃｔＲＩＩａのプロ
セシングを受けた細胞外ドメインをコードする。例えば、配列番号１８は、天然に存在す
るＡｃｔＲＩＩｂ前駆体ポリペプチドをコードするが、配列番号１９は、ＡｃｔＲＩＩｂ
のプロセシングを受けた細胞外ドメインをコードする。本発明の核酸は、一本鎖もしくは
二本鎖であり得る。このような核酸は、ＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子であり得る。これ
らの核酸は、例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを作製するための方法において、また、
（例えば、遺伝子治療アプローチにおいて）直接的な治療剤として使用され得る。

特定の局面では、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドをコードする本発明の核酸はさらに、配
列番号４または５の改変体である核酸を含むものと理解される。特定の局面では、Ａｃｔ
ＲＩＩｂポリペプチドをコードする本発明の核酸はさらに、配列番号１８または１９の改
変体である核酸を含むものと理解される。改変体ヌクレオチド配列は、対立遺伝子改変体
のような、１以上のヌクレオチドの置換、付加もしくは欠失によって異なる配列を含む。

特定の実施形態では、本発明は、配列番号４、５、１８または１９に対して少なくとも
８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な単離さ
れたまたは組換えの核酸配列を提供する。当業者は、配列番号４、５、１８または１９に
対して相補的な核酸配列、および配列番号４、５、１８または１９の改変体もまた、本発
明の範囲内であることを理解する。さらなる実施形態では、本発明の核酸配列は、異種ヌ
クレオチド配列と共に、または、ＤＮＡライブラリーにおいて、単離、組換えおよび／ま
たは融合され得る。

他の実施形態では、本発明の核酸はまた、配列番号４、５、１８または１９に指定され
るヌクレオチド配列に対して高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌク
レオチド配列、配列番号の相補配列４、５、１８または１９、あるいは、これらのフラグ
メントを含む。上述のように、当業者は、ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適
切なストリンジェンシー条件が変更され得ることを容易に理解する。当業者は、ＤＮＡの
ハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変更され得ることを
容易に理解する。例えば、約４５℃における６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウ
ム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーションの後に、５０℃における２．０×ＳＳＣの洗浄
を行い得る。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃における約２．０×ＳＳＣの低
ストリンジェンシーから、５０℃における約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで
選択され得る。さらに、洗浄工程における温度は、室温（約２２℃）の低ストリンジェン
シー条件から、約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで上昇され得る。温度と塩の両方
が変更されても、温度または塩濃度が一定に保たれ、他方が変更されてもよい。一実施形
態では、本発明は、室温における６×ＳＳＣとその後の室温で２×ＳＳＣでの洗浄の低ス
トリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。

遺伝子コードにおける縮重に起因して配列番号４、５、１８または１９に示される核酸
と異なる単離された核酸もまた、本発明の範囲内である。例えば、多数のアミノ酸が１以
上のトリプレットによって示される。同じアミノ酸を特定するコドンまたは同義語（例え
ば、ＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンに対する同義語である）は、タンパク質のアミノ酸
配列に影響を及ぼさない「サイレント」変異を生じ得る。しかしながら、哺乳動物細胞の
中には、本発明のタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列の多型が存在す
ることが予想される。当業者は、天然の対立遺伝子改変に起因して、所与の種の個体間に
、特定のタンパク質をコードする核酸の１以上のヌクレオチド（約３〜５％までのヌクレ
オチド）におけるこれらの改変がし得ることを理解する。任意およびあらゆるこのような
ヌクレオチドの改変と、結果として生じるアミノ酸の多型とは、本発明の範囲内である。

特定の実施形態では、本発明の組換え核酸は、発現構築物において１以上の調節性ヌク
レオチド配列に作動可能に連結され得る。調節性のヌクレオチド配列は、一般に、発現の
ために使用される宿主細胞に対して適切なものである。種々の宿主細胞について、多数の
タイプの適切な発現ベクターおよび適切な調節性配列が当該分野で公知である。代表的に
は、上記１以上の調節性ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダー配列も
しくはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始
配列および翻訳終結配列、ならびに、エンハンサー配列もしくはアクチベーター配列が挙
げられるがこれらに限定されない。当該分野で公知の構成的もしくは誘導性のプロモータ
ーが、本発明によって企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、また
は、１以上のプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかで
あり得る。発現構築物は、プラスミドのようにエピソーム上で細胞中に存在し得るか、ま
たは、発現構築物は、染色体中に挿入され得る。好ましい実施形態では、発現ベクターは
、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含む
。選択可能なマーカー遺伝子は、当該分野で周知であり、そして、使用される宿主細胞に
より変化する。

本発明の特定の局面では、本発明の核酸は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコードし、そ
して、少なくとも１つの調節性配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現
ベクターにおいて提供される。調節性配列は当該分野で認識され、そして、ＡｃｔＲＩＩ
ポリペプチドの発現を誘導するように選択される。したがって、用語調節性配列は、プロ
モーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。例示的な調節性配列は、
Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ，ＣＡ（１９９０）に記載される。例えば、作動可能に連結されたときにＤＮＡ配列の
発現を制御する広範な種々の発現制御配列のいずれかが、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列を発現させるためにこれらのベクターにおいて使用され得る。このよ
うな有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔ
ｅｔプロモーター、アデノウイルスもしくはサイトメガロウイルスの最初期プロモーター
、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣもしくはＴＲＣシステ
ム、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによってその発現が誘導されるＴ７プロモーター、ファー
ジλの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、
３−ホスホグリセリン酸キナーゼもしくは他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファ
ターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α−接合因子（ｍａｔｉｎｇ ｆａｃ
ｔｏｒ）のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、ならびに、原核生
物もしくは真核生物の細胞、または、そのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知ら
れる他の配列、ならびにこれらの種々の組み合わせが挙げられる。発現ベクターの設計は
、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現されることが所望されるタンパク質
のタイプのような要因に依存し得ることが理解されるべきである。さらに、ベクターのコ
ピー数、コピー数を制御する能力およびベクターによってコードされる任意の他のタンパ
ク質（例えば、抗生物質マーカー）の発現もまた考慮される。

本発明の組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部を、原核生物細胞、
真核生物細胞（酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物）のいずれか、または両方において発現
させるために適切なベクター中に連結することによって生成され得る。組換えＡｃｔＲＩ
Ｉポリペプチドの生成のための発現ビヒクルとしては、プラスミドおよび他のベクターが
挙げられる。例えば、適切なベクターとしては、以下のタイプのプラスミドが挙げられる
：原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のための、ｐＢＲ３２２由来のプ
ラスミド、ｐＥＭＢＬ由来のプラスミド、ｐＥＸ由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ由来のプ
ラスミドおよびｐＵＣ由来のプラスミド。

いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を促進するための原核
生物の配列と、真核生物細胞において発現される１以上の真核生物の転写単位の両方とを
含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ
、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶ
Ｔ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来のベクターは、真核生物細胞のトランスフェク
ションに適切な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、原核
生物細胞および真核生物細胞の両方における複製および薬物耐性選択を容易にするために
、細菌プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２）からの配列を用いて改変される。あるいは、
ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン−バーウイルスのようなウイ
ルスの誘導体（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）が、真核生物細胞におけるタ
ンパク質の一過的な発現のために使用され得る。他のウイルス（レトロウイルスを含む）
発現系の例は、遺伝子治療送達系の説明において以下に見出され得る。プラスミドの調製
および宿主生物の形質転換において用いられる種々の方法は、当該分野で周知である。原
核生物細胞および真核生物細胞の両方についての他の適切な発現系、ならびに、一般的な
組換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉ
ａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，２００１）を参照のこと。いくつかの場合において、バキュロウイルス発現系を用い
て組換えポリペプチドを発現させることが望ましくあり得る。このようなバキュロウイル
ス発現系の例としては、ｐＶＬ由来のベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９
３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来のベクター（例えば、ｐＡｃＵＷｌ）およびｐ
ＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター（例えば、β−ｇａｌを含むｐＢｌｕｅＢａｃ ＩＩＩ）
が挙げられる。

好ましい実施形態では、ベクターは、ＣＨＯ細胞における本発明のＡｃｔＲＩＩポリペ
プチドの生成のために設計される（例えば、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｅ））。明らかであるように、本発明の遺伝子構築物
は、例えば、タンパク質（融合タンパク質または改変体タンパク質を含む）を生成するた
め、精製のために、培養物において増殖させた細胞において本発明のＡｃｔＲＩＩポリペ
プチドの発現を引き起こすために使用され得る。

本開示はまた、１以上の本発明のＡｃｔＲＩＩポリペプチドのコード配列（例えば、配
列番号４、５、１８または１９）を含む組換え遺伝子をトランスフェクトされた宿主細胞
に関する。宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、本
発明のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（例えば
、バキュロウイルス発現系を用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得
る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。

したがって、本発明はさらに、本発明のＡｃｔＲＩＩポリペプチドを生成する方法に関
する。例えば、ＡｃｔＲＩＩａもしくはＡｃｔＩＩｂポリペプチドをコードする発現ベク
ターでトランスフェクトされた宿主細胞は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの発現を起こすこ
とが可能な適切な条件下で培養され得る。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩポ
リペプチドを含む細胞および培地の混合物から分泌および単離され得る。あるいは、Ａｃ
ｔＲＩＩポリペプチドは、細胞質または膜画分に保持され得、そして、細胞が回収、溶解
され、そして、タンパク質が単離される。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産
物を含む。細胞培養に適切な培地は、当該分野で周知である。本発明のＡｃｔＲＩＩポリ
ペプチドは、タンパク質の精製についての当該分野で公知の技術（イオン交換クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ＡｃｔＲＩＩポリペプチ
ドの特定のエピトープに特異的な抗体を用いた免疫親和性精製、および、ＡｃｔＲＩＩポ
リペプチドに融合させたドメインに結合する因子を用いた親和性精製（例えば、ＡｃｔＲ
ＩＩａ−ＦｃまたはＡｃｔＲＩＩｂ−Ｆｃ融合物を精製するために、プロテインＡカラム
が使用され得る）を含む）を用いて、細胞培養培地、宿主細胞またはこの両方から単離さ
れ得る。好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、その精製を促進するドメ
インを含む融合タンパク質である。好ましい実施形態では、精製は、例えば、以下のうち
の３またはそれ以上を任意の順序で含む一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達
成され得る：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フ
ェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン
交換クロマトグラフィー。精製は、ウイルス濾過およびバッファの交換により完了され得
る。本明細書中に示されるように、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃタンパク質は、サイズ排除ク
ロマトグラフィーによって決定すると、９８％を超える純度、そして、ＳＤＳ ＰＡＧＥ
によって決定すると、９５％を超える純度まで精製された。このレベルの純度は、マウス
、ラットおよび非ヒト霊長類において所望の結果を達成するのに十分であった。

別の実施形態では、精製用リーダー配列（例えば、組換えＡｃｔＲＩＩポリペプチドの
所望の部分のＮ末端に位置するポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位の配列）を
コードする融合遺伝子は、Ｎｉ^２＋金属樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーによる、
発現された融合タンパク質の精製を可能にし得る。その後、精製用リーダー配列は、引き
続いて、エンテロキナーゼでの処理によって除去され、精製ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを
提供し得る（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら、（１９８７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｙ ４１１：１７７；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：８９７２
を参照のこと）。

融合遺伝子を作製するための技術は周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列
をコードする種々のＤＮＡフラグメントの接合は、ライゲーションのための平滑末端もし
くはジグザグの（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化
、必要に応じた粘着末端の充填、所望されない接合を回避するためのアルカリ性ホスファ
ターゼ処理、および酵素によるライゲーション、を用いる従来の技術に従って行われる。
別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術によって合成さ
れ得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子フラグメ
ント間の相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて行われ得、これら
のフラグメントは、その後、キメラ遺伝子配列を生じるようにアニーリングされ得る（例
えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２を参照のこと
）。

４．代替的なアクチビンおよびＡｃｔＲＩＩのアンタゴニスト
本明細書中に示されるデータは、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩシグナル伝達のアンタゴニ
ストが、赤血球またはヘモグロビンのレベルを増加させるために使用され得ることを示す
。可溶性のＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔＩＩｂポリペプチド、特に、ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆ
ｃおよびＡｃｔＩＩｂ−Ｆｃが好ましいアンタゴニストであり、そして、このようなアン
タゴニストは、アクチビン拮抗以外の機構によって赤血球レベルに影響を及ぼし得る（例
えば、アクチビンの阻害は、ある因子があるスペクトルの分子（おそらくは、ＴＧＦ−β
スーパーファミリーの他のメンバーを含む）の活性を阻害する傾向の指標となり得、そし
て、このような集合的な阻害が造血に対して所望の作用をもたらし得る）が、抗アクチビ
ン（例えば、アクチビンβ_Ａ、β_Ｂ、β_Ｃおよびβ_Ｅ）抗体、抗ＡｃｔＲＩＩａ抗体、抗
ＡｃｔＲＩＩｂ抗体、アンチセンス、ＲＮＡｉもしくはリボザイム核酸、ならびに、アク
チビン、ＡｃｔＲＩＩｂもしくはＡｃｔＲＩＩａの他のインヒビター（特に、アクチビン
−ＡｃｔＲＩＩａおよび／またはアクチビン−ＡｃｔＲＩＩｂ結合を破壊するもの）を含
む他のタイプのアクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストが有用であることが期待される
。

ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、可溶性のＡｃｔＲＩＩａもしくはＡｃｔＲＩＩｂ
ポリペプチド）と特異的に反応性であり、そして、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと、リガン
ドに対して競合的に結合するか、または、他の方法で、ＡｃｔＲＩＩ媒介性のシグナル伝
達を阻害するかのいずれかである抗体は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド活性のアンタゴニス
トとして使用され得る。同様に、アクチビンβ_Ａ、β_Ｂ、β_Ｃまたはβ_Ｅポリペプチドま
たはその任意のヘテロ二量体と特異的に反応性であり、そして、ＡｃｔＲＩＩａおよび／
またはＡｃｔＲＩＩｂの結合を破壊する抗体は、アンタゴニストとして使用され得る。

ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドに由来する免疫原を使用することによって、ＡｃｔＲＩＩ
ｂポリペプチドまたはアクチビンポリペプチド、抗タンパク質／抗ペプチドの抗血清また
はモノクローナル抗体は、標準的なプロトコルによって作製され得る（例えば、Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ
編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ：１９８８）を参照のこと）。
哺乳動物（例えば、マウス、ハムスターまたはウサギ）は、アクチビン、ＡｃｔＲＩＩａ
またはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド、抗体応答を誘発し得る抗原性フラグメント、または
融合タンパク質の免疫原性形態を用いて免疫され得る。タンパク質またはペプチドに対し
て免疫原性を与えるための技術としては、キャリアに対する結合、または、当該分野で周
知の他の技術が挙げられる。ＡｃｔＲＩＩもしくはアクチビンポリペプチドの免疫原性部
分は、アジュバントの存在下で投与され得る。免疫の進行は、血漿もしくは血清中の抗体
の力価の検出によって監視され得る。免疫原として抗原を用いた標準的なＥＬＩＳＡまた
は他のイムノアッセイが、抗体のレベルを評価するために使用され得る。

アクチビン、ＡｃｔＲＩＩａもしくはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドの抗原性調製物を用
いた動物の免疫の後、抗血清が得られ得、そして、必要に応じて、血清からポリクローナ
ル抗体が単離され得る。モノクローナル抗体を生成するためには、抗体産生細胞（リンパ
球）が免疫された動物から回収され、そして、標準的な体細胞融合手順によって骨髄腫細
胞のような不死化細胞と融合されて、ハイブリドーマ細胞を生じ得る。このような技術は
当該分野で周知であり、そして、例えば、ハイブリドーマ技術（最初に、Ｋｏｈｌｅｒお
よびＭｉｌｓｔｅｉｎによって開発された：ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９
７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏ
ｚｂａｒら、（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２）およびヒトモ
ノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、（１９８
５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａ
ｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６）が挙げられる。ハイブリド
ーマ細胞は、アクチビン、ＡｃｔＲＩＩａまたはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドと特異的に
反応性の抗体の生成について免疫化学的にスクリーニングされ、そして、このようなハイ
ブリドーマ細胞を含む培養物からモノクローナル抗体が単離され得る。

用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、例えば、任意のアイソタイプ（ＩｇＧ
、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）の抗体全体、および、選択された抗原と反応性の免疫グ
ロブリンのフラグメントもしくはドメインを含むことが意図される。抗体は、従来の技術
を用いてフラグメント化され得、そして、フラグメントは、関心のある特定のエピトープ
との有用性および／または相互作用についてスクリーニングされ得る。したがって、この
用語は、特定のタンパク質と選択的に反応し得る抗体分子の、タンパク質分解により切断
されたか、または、組換えにより調製された部分のセグメントを含む。このようなタンパ
ク質分解および／または組換えのフラグメントの非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａ
ｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ならびにペプチドリンカーによって結合されたＶ［Ｌ］およ
び／またはＶ［Ｈ］ドメインを含む単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。ｓｃＦｖは、２
以上の結合部位を有する抗体を形成するように共有結合もしくは非共有結合により連結さ
れ得る。用語抗体はまた、抗体のポリクローナル調製物、モノクローナル調製物、または
他の精製された調製物、および組換え抗体を含む。用語「組換え抗体」は、分子生物学の
技術を用いて構築された核酸から発現される、抗体、または、免疫グロブリンの抗原結合
ドメイン（例えば、単鎖抗体から発生させたヒト化抗体または完全ヒト抗体）を意味する
。単一ドメインの抗体および単鎖抗体もまた、用語「組換え抗体」に含まれる。

特定の実施形態では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体であり、そして、特定の実
施形態では、本発明は、新規抗体を作製するための方法を利用可能にする。例えば、Ａｃ
ｔＲＩＩａポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドまたはアクチビンポリペプチドに
特異的に結合するモノクローナル抗体を作製するための方法は、検出可能な免疫応答を刺
激するのに有効な抗原ポリペプチドを含む免疫原性組成物の量をマウスに投与する工程と
、このマウスから抗体産生細胞（例えば、脾臓からの細胞）を得る工程と、この抗体産生
細胞を骨髄腫細胞と融合して抗体産生ハイブリドーマを得る工程と、この抗体産生ハイブ
リドーマを試験して、抗原に対して特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマを同定する工程と、を包含し得る。一度得られると、ハイブリドーマは、必要
に応じて、ハイブリドーマ由来の細胞が、抗原に対して特異的に結合するモノクローナル
抗体を産生する培養条件下で、細胞培養において増殖させられ得る。モノクローナル抗体
は、細胞培養物から精製され得る。

形容詞「〜と特異的に反応性の」は、抗体に関して使用される場合、当該分野で一般に
理解されるように、抗体は、関心のある抗原（例えば、アクチビン、ＡｃｔＲＩＩａまた
はＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド）と、関心のものではない他の抗原との間で十分に選択的
であり、その抗体が、最小限でも、特定のタイプの生物学的サンプルにおいて関心のある
抗原の存在を検出するために有用であることを意味することが意図される。治療用途のよ
うな抗体を用いる特定の方法において、より高い低度の結合の特異性が望ましくあり得る
。モノクローナル抗体は、一般に、所望される抗原と、交差反応するポリペプチドとの間
を効率的に区別する傾向が高い（ポリクローナル抗体と比較して）。抗体：抗原相互作用
の特異性に影響する１つの特徴は、抗原に対する抗体の親和性である。所望される特異性
はある範囲の多様な親和性で達され得るが、一般に好ましい抗体は、約１０^−６Ｍ、１０
^−７Ｍ、１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍまたはそれ以下の親和性（解離定数）を有する。

さらに、所望の抗体を同定するための抗体のスクリーニングに使用される技術は、得ら
れる抗体の特性に影響し得る。たとえば、抗体が溶液中の抗原を結合するために使用され
る場合、溶液の結合を試験することが望ましくあり得る。抗体と抗原との間の相互作用を
試験して、特定の所望される抗体を同定するためには、種々の多様な技術が利用可能であ
る。このような技術としては、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、
Ｂｉａｃｏｒｅ^ＴＭ結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅ
ｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、ＩＧＥＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ
．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄの常磁性ビーズシステム）、ウェスタ
ンブロット、免疫沈降アッセイおよび免疫組織化学が挙げられる。

アクチビンまたはＡｃｔＲＩＩアンタゴニストである核酸化合物のカテゴリーの例とし
ては、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ構築物および触媒性の核酸構築物が挙げられる。核酸
化合物は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖の化合物はまた、鎖の一方も
しくは他方が一本鎖であるオーバーハングまたは非相補的な領域を含み得る。一本鎖の化
合物は、自己相補的な領域を含み得、これは、その化合物が二本鎖のらせん構造の領域と
共にいわゆる「ヘアピン」または「ステム−ループ」構造を形成することを意味する。核
酸化合物は、全長のＡｃｔＲＩＩ核酸配列またはアクチビンβ_Ａ、β_Ｂ、β_Ｃもしくはβ
_Ｅの核酸配列のうち、１０００以下、５００以下、２５０以下、１００以下、または、５
０以下、３５以下、２５以下、２２以下、２０以下、１８以下もしくは１５以下のヌクレ
オチドから構成される領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含み得る。相補的な領域
は、好ましくは、少なくとも８ヌクレオチドであり、任意に、約１８〜３５ヌクレオチド
である。相補的な領域は、コード配列部分のような標的転写物のイントロン、コード配列
または非コード配列内に入り得る。一般に、核酸化合物は、約８〜約５００のヌクレオチ
ドまたは塩基対の長さを有し、そして、任意に、その長さは、約１４〜約５０ヌクレオチ
ドである。核酸は、ＤＮＡ（特にアンチセンスとしての使用について）、ＲＮＡ、または
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドであり得る。任意の一本鎖は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物
、ならびに、ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかとして容易に分類できない修飾された形態
を含み得る。同様に、二本鎖の化合物は、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡまたはＲＮＡ
：ＲＮＡであり得、そして、任意の一本鎖もまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物、ならび
に、ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかとして容易に分類できない修飾された形態を含み得
る。核酸化合物は、バックボーン（ヌクレオチド間結合を含む、天然の核酸中の糖−リン
酸部分）または塩基部分（天然の核酸のプリンまたはピリミジン部分）に対する１以上の
修飾を含む、種々の修飾のいずれかを含み得る。アンチセンス核酸化合物は、好ましくは
、約１５〜約３０ヌクレオチドの長さを有し、そしてしばしば、血清中、細胞中、または
、化合物が送達される可能性のある場所（例えば、経口送達される化合物の場合には胃、
および吸入される化合物については肺）において、安定性のような特徴を改善するための
１以上の修飾を含む。ＲＮＡｉ構築物の場合には、標的転写物に対して相補的な鎖は、一
般に、ＲＮＡまたはその修飾物である。他方の鎖は、ＲＮＡであってもＤＮＡであっても
任意の他のバリエーションであってもよい。二本鎖もしくは一本鎖の「ヘアピン」ＲＮＡ
ｉ構築物の二重鎖部分は、一般に、Ｄｉｃｅｒ基質として機能する限りは、長さ１８〜４
０ヌクレオチドの長さを有し、そして、任意に、約２１〜２３ヌクレオチドの長さを有す
る。触媒的または酵素的な核酸は、リボザイムまたはＤＮＡ酵素であり得、そしてまた、
修飾された形態を含み得る。核酸化合物は、生理学的条件下で、かつ、ナンセンスもしく
はセンスの制御がほとんどもしくは全く効果がない濃度で細胞と接触されたときに、標的
の発現を約５０％、７５％、９０％またはそれ以上阻害し得る。核酸化合物の作用を調べ
るための好ましい濃度は、１マイクロモル濃度、５マイクロモル濃度および１０マイクロ
モル濃度である。核酸化合物はまた、例えば赤血球レベルに対する作用について試験され
得る。

５．スクリーニングアッセイ
特定の局面では、本発明は、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａおよび／またはアクチビン−
ＡｃｔＲＩＩｂシグナル伝達経路のアゴニストまたはアンタゴニストである化合物（因子
）を同定するための、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、可溶性のＡｃｔＲＩＩａポリ
ペプチドまたはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド）およびアクチビンポリペプチドの使用に関
する。このスクリーニングによって同定された化合物は、インビボまたはインビトロでの
、赤血球、ヘモグロビンおよび／または網状赤血球のレベルを調節する能力を評価するた
めに試験され得る。これらの化合物は、例えば、動物モデルにおいて試験され得る。

アクチビンおよびＡｃｔＲＩＩのシグナル伝達を標的化することによって、赤血球また
はヘモグロビンのレベルを増加させるための治療剤についてスクリーニングするための多
数のアプローチが存在する。特定の実施形態では、選択された細胞株に対するアクチビン
またはＡｃｔＲＩＩ媒介性の作用を摂動する因子を同定するために、化合物のハイスルー
プットスクリーニングが行われ得る。特定の実施形態では、アッセイは、アクチビンに多
雨するＡｃｔＲＩＩａもしくはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドの結合を特異的に阻害もしく
は減少させる化合物をスクリーニングおよび同定するために行われる。あるいは、アッセ
イは、アクチビンに対するＡｃｔＲＩＩａもしくはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドの結合を
増強する化合物を同定するために使用され得る。さらなる実施形態では、化合物は、アク
チビン、ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩａポリペプチドと相互作用する
能力によって同定され得る。

種々のアッセイ形式が十分であり、そして、本開示を考慮すれば、本明細書中に明示的
に記載されない形式は、本明細書中に記載されていないにもかかわらず、当業者によって
理解される。本明細書中に記載されるように、本発明の試験化合物（因子）は、任意のコ
ンビナトリアル化学の方法によって作製され得る。あるいは、本発明の化合物は、インビ
ボまたはインビトロで合成された天然に存在する生体分子であり得る。組織増殖の調節因
子として作用する能力について試験される化合物（因子）は、例えば、細菌、酵母、植物
または他の生物によって生成されても（例えば、天然の生成物）、化学的に生成されても
（例えば、ペプチド模倣物を含む低分子）、組換えにより生成されてもよい。本発明によ
って企図される試験化合物としては、非ペプチジル有機分子、ペプチド、ポリペプチド、
ペプチド模倣物、糖、ホルモンおよび核酸分子が挙げられる。特定の実施形態では、試験
因子は、約２０００ダルトン未満の分子量を持つ小さな有機分子である。

本発明の試験化合物は、単一の別個の実体として提供され得るか、または、コンビナト
リアル化学によって作製されたような、より複雑度の高いライブラリーにおいて提供され
得る。これらのライブラリーは、例えば、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミン、ア
ミド、エステル、アルデヒド、エーテルおよび有機化合物の他の分類を含み得る。試験シ
ステムに対する試験化合物の提示は、特に、最初のスクリーニング段階において、単離さ
れた形態または化合物の混合物としてのいずれかであり得る。必要に応じて、化合物は、
必要に応じて他の化合物で誘導体化され得、そして、化合物の単離を容易にする誘導体化
基を有し得る。誘導体化基の非限定的な例としては、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキ
シゲニン、緑色蛍光タンパク質、同位体、ポリヒスチジン、磁気ビーズ、グルタチオンＳ
トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光活性化クロスリンカー、またはこれらの任意の組み合
わせが挙げられる。

化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラ
ムにおいて、所与の期間に調査される化合物の数を最大にするためには、ハイスループッ
トアッセイが望ましい。精製もしくは半精製されたタンパク質で誘導体化され得るような
、無細胞のシステムにおいて行われるアッセイは、試験化合物によって媒介される分子標
的における変更の迅速な発生と比較的容易な検出とを可能にするように生成され得るとい
う点で、しばしば、「一次」スクリーニングとして好ましい。さらに、試験化合物の細胞
障害性またはバイオアベイラビリティの作用は、一般に、インビトロのシステムでは無視
され得るが、その代わりに、このアッセイは主として、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドとア
クチビンとの間、および／または、ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドとアクチビンとの間の結
合親和性の変更において出現し得るような、分子標的に対する薬物の作用に焦点を当てて
いる。

単なる例示として、本発明の例示的なスクリーニングアッセイでは、関心のある化合物
は、通常アクチビンに結合し得る単離および精製されたＡｃｔＲＩＩａポリペプチドと接
触される。その後、化合物とＡｃｔＲＩＩａポリペプチドとの混合物に、ＡｃｔＲＩＩａ
リガンドを含む組成物が加えられる。ＡｃｔＲＩＩａ／アクチビン複合体の検出および定
量は、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドとアクチビンとの間の複合体の形成の阻害（または助
長）における化合物の効力を決定するための手段を提供する。化合物の効力は、種々の濃
度の試験化合物を用いて得られたデータから用量応答曲線を生成することによって評価さ
れ得る。さらに、比較のための基線を提供するためのコントロールアッセイもまた行われ
得る。例えば、コントロールアッセイでは、単離および精製されたアクチビンは、Ａｃｔ
ＲＩＩａポリペプチドを含む組成物に加えられ、そして、ＡｃｔＲＩＩａ／アクチビン複
合体の形成は、試験化合物の非存在下で定量される。一般に、反応物が混合され得る順序
は変化し得、そして、同時に混合され得ることが理解される。さらに、適切な無細胞アッ
セイ系を与えるように、精製したタンパク質の代わりに、細胞の抽出物および溶解物が使
用され得る。ＡｃｔＲＩＩｂシグナル伝達に影響を及ぼす化合物は、ＡｃｔＲＩＩｂポリ
ペプチドおよびＡｃｔＲＩＩｂリガンドを用いて、同様の様式で同定され得る。

ＡｃｔＲＩＩポリペプチドとアクチビンとの間の複合体の形成は、種々の技術によって
検出され得る。例えば、複合体の形成の調節は、例えば、検出可能に標識されたタンパク
質（例えば、放射標識（例えば、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１４Ｃまたは^３Ｈ）、蛍光標識もの（
例えば、ＦＩＴＣ）、または、酵素標識されたＡｃｔＲＩＩａまたはＡｃｔＲＩＩｂポリ
ペプチドまたはアクチビンを用いて、イムノアッセイによって、あるいは、クロマトグラ
フィーによる検出によって定量され得る。

特定の実施形態では、本発明は、直接的または間接的のいずれかで、ＡｃｔＲＩＩポリ
ペプチドとその結合タンパク質との間の相互作用の程度を測定する、蛍光偏光アッセイお
よび蛍光共鳴エネルギー遷移（ＦＲＥＴ）アッセイの使用を企図する。さらに、光導波管
（ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２６４３２および米国特許第５，６７７，１９６号）、表面プラ
ズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面電荷センサ、および表面力センサに基づくもののような、他
の検出様式が、本発明の多くの実施形態と適合性がある。

さらに、本発明は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドとその結合タンパク質との間の相互作用
を妨害または助長する因子を同定するための、「ツーハイブリッドアッセイ」としても知
られる相互作用トラップアッセイの使用を企図する。例えば、米国特許第５，２８３，３
１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら
（１９９３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ
ら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４；およびＩｗａｂｕ
ｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６を参照のこと。特定の
実施形態では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドとその結合タンパク質との間の相互
作用を解離させる化合物（例えば、低分子またはペプチド）を同定するための、逆ツーハ
イブリッドシステムの使用を企図する。例えば、ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ（１９
９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：９１９−２９；ＶｉｄａｌおよびＬ
ｅｇｒａｉｎ（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：３７４−８１；
ならびに米国特許第５，５２５，４９０号；同第５，９５５，２８０号；および同第５，
９６５，３６８号を参照のこと。

特定の実施形態では、本発明の化合物は、本発明のＡｃｔＲＩＩまたはアクチビンポリ
ペプチドと相互作用する能力によって同定される。化合物と、ＡｃｔＲＩＩａ、ＡｃｔＲ
ＩＩｂまたはアクチビンポリペプチドとの間の相互作用は、共有結合性であっても非共有
結合性であってもよい。例えば、このような相互作用は、光架橋、放射標識リガンド結合
、およびアフィニティクロマトグラフィーを含むインビトロの生化学的な方法を用いて、
タンパク質レベルで同定され得る（Ｊａｋｏｂｙ ＷＢら、１９７４，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４６：１）。特定の場合には、化合物は、アクチビンまた
はＡｃｔＲＩＩポリペプチドに結合する化合物を検出するためのアッセイのような、機構
ベースのアッセイにおいてスクリーニングされ得る。これは、固相もしくは液相の結合事
象を含み得る。あるいは、アクチビンまたはＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコードする遺伝
子は、レポーターシステム（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたは緑色
蛍光タンパク質）と共に細胞中にトランスフェクトされ、そして、必要に応じて、ハイス
ループットスクリーニングによって、ライブラリーに対して、または、ライブラリーの個
々のメンバーを用いてスクリーニングされ得る。他の機構ベースの結合アッセイ（例えば
、自由エネルギーの変化を検出する結合アッセイ）が使用され得る。結合アッセイは、ウ
ェル、ビーズもしくはチップに固定されているか、または、固定された抗体によって捕捉
されている標的を用いて行われ得るか、あるいは、キャピラリー電気泳動によって分解さ
れ得る。結合した化合物は通常、比色または蛍光または表面プラズモン共鳴を用いて検出
され得る。

６．例示的な治療的用途
特定の実施形態では、本発明のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、Ａ
ｃｔＲＩＩａポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド）は、げっ歯類および霊長
類、特に、ヒト患者のような哺乳動物における赤血球のレベルを増加させるために使用さ
れ得る。特定の実施形態では、本発明は、治療上有効量のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａア
ンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド）、または、治療上有効量のアクチ
ビン−ＡｃｔＲＩＩｂアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド）を個体に
投与することによって、処置または予防を必要とする個体における貧血を処置または予防
する方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、治療上有効量のアクチビン−Ａｃ
ｔＲＩＩアンタゴニスト、特に、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを個体に投与することによっ
て、個体における赤血球の形成を促進する方法を提供する。これらの方法は、哺乳動物、
特に、ヒトの治療的および予防的な処置に使用され得る。

本明細書中で使用される場合、障害または状態を「予防する」治療薬は、統計的標本に
おいて、未処置の対照標本に対して、処置標本における障害もしくは状態の出現を低下さ
せるか、あるいは、未処置の対照標本に対して、障害もしくは状態の１以上の症状の発症
を遅延させるか、または、重篤度を低下させるような化合物を指す。用語「処置する」は
、本明細書中で使用される場合、指定された状態の予防、または、一度確立された状態の
改善もしくは除去を含む。いずれの場合にも、予防または処置は、医師または他の医療提
供者によって提供される診断、および、治療剤の投与の意図される結果において認識され
得る。

本明細書中で示されるように、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストおよびアク
チビン−ＡｃｔＲＩＩｂアンタゴニストは、健康な個体における赤血球、ヘモグロビンま
たは網状赤血球のレベルを増加させるために使用され得、そして、このようなアンタゴニ
ストは、選択された患者集団において使用され得る。適切な患者集団の例としては、貧血
を有する患者のような望ましくない低い赤血球またはヘモグロビンレベルを有する患者、
および、大きな外科手術またはかなりの血液喪失を生じ得る他の処置を受ける予定の患者
のような、望ましくない低い赤血球またはヘモグロビンレベルを生じる危険性のある患者
、が挙げられる。一実施形態では、適切な赤血球レベルを有する患者は、赤血球レベルを
増加させるためにアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストで処置され、その後、血液
が採血され、そして、後に輸血に使用するために保存される。一実施形態では、適切な赤
血球レベルを有する患者は、赤血球レベルを増加させるためにアクチビン−ＡｃｔＲＩＩ
ｂアンタゴニストで処置され、その後、血液が採血され、そして、後に輸血に使用するた
めに保存される。

本明細書中に開示されるアクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、そして特に、Ａｃ
ｔＲＩＩａ−ＦｃおよびＡｃｔＲＩＩｂタンパク質は、貧血を有する患者における赤血球
レベルを増加させるために使用され得る。ヒトにおけるヘモグロビンレベルを観察すると
き、適切な年齢および性別のカテゴリーにとっての正常値未満のレベルは貧血の指標とな
り得るが、個体の変動が考慮される。例えば、１２ｇ／ｄｌのヘモグロビンレベルは、一
般に、一般的な成人集団において正常の下限と考えられる。潜在的な原因としては、血液
喪失、栄養不良、薬物療法反応、骨髄および多くの疾患に伴う種々の問題が挙げられる。
より具体的には、貧血は、例えば、慢性腎不全、骨髄異形成症候群、慢性関節リウマチ、
骨髄移植を含む種々の障害に関連している。貧血はまた、以下の状態とも関連し得る：固
形腫瘍（例えば、乳癌、肺癌、結腸癌）；リンパ系の腫瘍（例えば、慢性リンパ球性白血
病、非ホジキンおよびホジキンリンパ腫）；造血系の腫瘍（例えば、白血病、骨髄異形成
症候群、多発性骨髄腫）；放射線治療；化学療法（例えば、白金を含むレジメン）；炎症
および自己免疫疾患（慢性関節リウマチ、他の炎症性関節炎、全身性エリテマトーデス（
ＳＬＥ）、急性もしくは慢性の皮膚疾患（例えば、乾癬）、炎症性腸疾患（例えば、クロ
ーン病および潰瘍性大腸炎）が挙げられるがこれらに限定されない）；急性もしくは慢性
の陣疾患または腎不全（特発性もしくは先天性の状態を含む）；急性もしくは慢性の肝臓
病；急性もしくは慢性の出血；患者の同種もしくは自己抗体および／または宗教上の理由
（例えば、いくつかのエホバの証人（Ｊｅｈｏｖａｈ Ｗｉｔｎｅｓｓ））に起因する赤
血球の輸血が可能ではない状況；感染（例えば、マラリア、骨髄炎）；異常ヘモグロビン
症（例えば、例えば、鎌状赤血球病、地中海貧血症を含む）；薬物の使用または乱用（例
えば、アルコールの誤用）；輸血を回避するためのあらゆる要因から貧血を有する小児患
者；ならびに、循環過負荷に関する問題に起因して輸血を受けることができない、老齢の
患者または貧血と共に根底にある心肺疾患を有する患者。

患者は、患者を標的とするヘモグロビンレベル（通常は、約１０ｇ／ｄｌと約１２．５
ｇ／ｄｌの間、代表的には約１１．０ｇ／ｄｌ（Ｊａｃｏｂｓら（２０００）Ｎｅｐｈｒ
ｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １５，１５−１９もまた参照のこと））まで回
復させることを意図した投薬レジメンで処置され得るが、より低い標的レベルでは、より
少ない心臓血管系の副作用が引き起こされ得る。あるいは、ヘマトクリットレベル（細胞
によって占有される血液サンプルの容積の割合）が、赤血球の状態の指標として使用され
得る。健康な個体についてのヘマトクリットレベルは、成人男性について４１〜５１％、
そして、成人女性について３５〜４５％の範囲である。標的ヘマトクリットレベルは、通
常、約３０〜３３％である。さらに、ヘモグロビン／ヘマトクリットレベルは、個々人で
変動する。したがって、最適には、標的ヘモグロビン／ヘマトクリットレベルは、患者ご
とに個別化され得る。

本明細書中に開示されるアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストの赤血球レベルに
対する迅速な作用は、これらの因子がＥｐｏとは異なる機構によって作用していることを
示す。したがって、これらのアンタゴニストは、Ａｐｏに対して上手く応答しない患者に
おいて赤血球およびヘモグロビンレベルを増加させるために有用であり得る。例えば、ア
クチビン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストは、通常〜増量した（＞３００ＩＵ／ｋｇ／週
）用量のＥｐｏの投与が標的レベルまでのヘモグロビンレベルの増加をもたらさない患者
に有益であり得る。不適切なＥｐｏ応答を有する患者は、全てのタイプの貧血について見
られるが、より多い数の不応者が、癌を有する患者および末期の腎疾患を有する患者にお
いて特に頻繁に観察されている。Ｅｐｏに対する不適切な応答は、構成的（すなわち、Ｅ
ｐｏでの最初の処置の際に観察される）、または後天的（例えば、Ｅｐｏでの反復処置の
際に観察される）のいずれかであり得る。

アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストはまた、Ｅｐｏの有害な作用に対して感受性
である患者を処置するために使用され得る。Ｅｐｏの主たる有害な作用は、ヘマトクリッ
トまたはヘモグロビンレベルの過剰な増加と、赤血球増加症である。ヘマトクリットレベ
ルの上昇は、高血圧（より具体的には、高血圧の深刻化）および脈管の血栓症につながり
得る。報告されているＥｐｏの他の有害な作用（このうちいくつかは、高血圧に関するも
のである）は、頭痛、インフルエンザ様症候群、バイパスの閉塞、血栓症に起因する心筋
梗塞および大脳痙攣、高血圧性脳障害、ならびに赤血球血球無形成（ｒｅｄ ｃｅｌｌ
ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ａｐｐｌａｓｉａ）である（Ｓｉｎｇｉｂａｒｔｉ，（１９９４
）Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ ７２（補遺６），Ｓ３６−Ｓ４３；Ｈｏｒｌら（２
０００）Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １５（補遺４），５１−５
６；Ｄｅｌａｎｔｙら（１９９７）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４９，６８６−６８９；Ｂｕｎ
ｎ（２００２）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４６（７），５２２−５２３）。

７．薬学的組成物
特定の実施形態では、本発明のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、Ａ
ｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔＲＩｌｂポリペプチド）は、薬学的に受容可能なキャリアと共
に処方される。例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、単独で、または、薬学的処方物（
治療用組成物）の成分として投与され得る。本発明の化合物は、ヒトまたは獣医学におけ
る医薬での使用のために任意の簡便な方法で投与するために処方され得る。

特定の実施形態では、本発明の治療方法は、全身に、または、移植物もしくはデバイス
として局所的に組成物を投与する工程を包含する。投与される場合、本発明において使用
するための治療用組成物は、当然のことながら、発熱物質を含まない生理学的に容認可能
な形態である。また上記の組成物中に必要に応じて含められ得るアクチビン−ＡｃｔＲＩ
Ｉアンタゴニスト以外の治療上有用な因子は、本発明の方法において、本発明の化合物（
例えば、ＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド）と同時に、または連続して
投与され得る。

代表的に、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、非経口投与される。非経口投
与に適した薬学的組成物は、１以上のＡｃｔＲＩＩポリペプチドを、１以上の薬学的に受
容可能な無菌かつ等張の水性もしくは非水性の溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルジョ
ン、または、使用直前に無菌の注射可能な溶液もしくは分散液へと再構成され得る無菌粉
末と組み合わせて含み得、この組成物は、抗酸化物質、緩衝液、静菌剤、処方物を意図さ
れるレシピエントの血液と等張にする溶質、または、懸濁剤もしくは増粘剤を含み得る。
本発明の薬学的組成物中で採用され得る適切な水性および非水性のキャリアの例としては
、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエ
チレングリコールなど）およびこれらの適切な混合物、植物油（例えば、オリーブ油）、
ならびに、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。適切な
流動性は、例えば、コーティング材料（例えば、レシチン）の使用によって、分散剤の場
合には必要とされる粒子径の維持によって、そして、界面活性剤の使用によって維持され
得る。

さらに、組成物は、カプセル化され得るか、または、標的組織部位（例えば、骨髄）へ
と送達するための形態で注射され得る。特定の実施形態では、本発明の組成物は、標的組
織部位（例えば、骨髄）に１以上の治療用化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド
またはＡｃｔＲＩＩｂポリペプチド）を送達し、発生中の組織（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ
ｔｉｓｓｕｅ）のための構造を提供し得、そして、最適には身体内へと吸収され得るマト
リクスを含み得る。例えば、マトリクスは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの遅速放出を提供
し得る。このようなマトリクスは、他の移植される医療用途に現在使用される材料から形
成され得る。

マトリクス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容上の外観および界
面の特性に基づく。本発明の組成物の特定の用途が、適切な処方物を画定する。組成物の
ための可能性のあるマトリクスは、生分解性でかつ化学的に画定された硫酸カルシウム、
リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であり得る。他
の可能性の有る材料は、生分解性でかつ生物学的に十分に画定されたもの（例えば、骨ま
たは皮膚のコラーゲンである。さらなるマトリクスは、純粋なタンパク質または細胞外マ
トリクスの成分から構成される。他の可能性のあるマトリクスは、非生分解性でかつ化学
的に画定されたもの（例えば、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオグラス、ミョウバン（
ａｌｕｍｉｎａｔｅ）、または他のセラミクス）である。マトリクスは、上述のタイプの
材料のいずれかの組み合わせ（例えば、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、または、
コラーゲンおよびリン酸三カルシウム）から構成され得る。生体機能性セラミクスは、組
成物中（例えば、カルシウム−ミョウバン−ホスフェート中）で変化され、孔径、粒子径
、粒子の形状および生分解性を変更するように加工され得る。

特定の実施形態では、本発明の方法は、例えば、カプセル、カシェ、丸剤、錠剤、ロゼ
ンジ（矯味矯臭薬を含む基材、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガントを用い
て）、散剤、顆粒剤、または、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、
または、水中油もしくは油中水の液体エマルジョンとして、または、エリキシルもしくは
シロップとして、または、香錠（ゼラチンおよびグリセリン、または、スクロースおよび
アカシアのような不活性基材を用いて）および／またはマウスウォッシュなどの形態（こ
の各々が、活性成分として所定量の因子を含む）で、経口投与され得る。因子はまた、ボ
ーラス、舐剤またはペーストとしても投与され得る。

経口投与のための固体投薬形態（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤など）
において、本発明の１以上の治療用化合物は、１以上の薬学的に受容可能なキャリア（例
えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム）および／または、以下のうちのい
ずれかと共に混合され得る：（１）充填剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトース
、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸）；（２）結合剤（例え
ば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スク
ロースおよび／またはアカシア）；（３）湿潤剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）（例えば、グリ
セロール）；（４）崩壊剤（例えば、アガー−アガー、炭酸カルシウム、ジャガイモもし
くはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）；（５）
溶液減速因子（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅｔａｒｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（例えば、パラフ
ィン）；（６）吸収加速剤（例えば、四級アンモニウム化合物）；（７）湿潤剤（ｗｅｔ
ｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロー
ル）；（８）吸着剤（例えば、カオリンおよびベントナイトクレイ）；（９）滑沢剤（例
えば、滑石、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレング
リコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびこれらの混合物）；および（１０）着色剤。カ
プセル、錠剤および丸剤の場合には、薬学的組成物はまた、緩衝剤を含み得る。同様のタ
イプの固形組成物もまた、ラクトースすなわち乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコ
ールなどのような賦形剤を用いて、軟充填ゼラチンカプセルおよび硬充填ゼラチンカプセ
ル中の充填物（ｆｉｌｌｅｒ）として用いられ得る。

経口投与のための液体投薬形態としては、薬学的に受容可能なエマルジョン、マイクロ
エマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルが挙げられる。活性成分に加え
、液体投薬形態は、当該分野で一般に用いられる不活性希釈剤（例えば、水または他の溶
媒）、可溶化剤および乳化剤（例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭
酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール
、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚
芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコ
ール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混
合物）を含み得る。不活性な希釈剤に加え、経口用組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および
懸濁剤、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤、芳香剤および保存剤のようなアジュバントを含み
得る。

懸濁液は、活性な化合物に加えて、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキ
シエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウム
メタヒドロキシド、ベントナイト、アガー−アガーおよびトラガント、ならびにこれらの
混合物のような懸濁剤を含み得る。

本発明の組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤のようなアジュバントを
含み得る。微生物の作用の阻止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、
クロロブタノール、ソルビン酸フェノールなど）を含めることによって保証され得る。糖
、塩化ナトリウムなどのような等張化剤を組成物中に含めることも望ましくあり得る。さ
らに、注射可能な薬学的形態の吸収の延長は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラ
チンのような吸収を遅らせる因子を含めることによってもたらされ得る。

投薬レジメンは、本発明の化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔＲＩＩｂポリ
ペプチド）の作用を変える種々の要因を考慮して主治医によって決定されることが理解さ
れる。種々の要因としては、患者の赤血球数、ヘモグロビンレベルまたは他の診断指標、
所望の標的赤血球数、患者の年齢、性別および食事、赤血球レベルの低下に寄与し得るあ
らゆる疾患の重篤度、投与時間、ならびに他の臨床的要因が挙げられるがこれらに限定さ
れない。最終組成物への他の既知の増殖因子の添加もまた、投薬量に影響を及ぼし得る。
進行は、赤血球およびヘモグロビンのレベルの周期的な評価、ならびに、網状赤血球レベ
ルおよび造血プロセスの他の指標の評価によって監視され得る。

霊長類およびヒトを用いた実験は、化合物が、少なくとも約２０〜３０日の期間にわた
って、約１００ｎｇ／ｍｌ以上の血清濃度を達成するために十分な間隔および量で投薬さ
れた場合に、赤血球レベルに対するＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃの作用が検出可能であることを
実証している。少なくとも２０〜３０日間の機関にわたって、２００ｎｇ／ｍｌ、５００
ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上の血清レベルを得る投薬もまた使用され
得る。骨への作用は、少なくとも約２０〜３０日の期間にわたって、約２００ｎｇ／ｍｌ
の血清レベルで観察され得、そして、実質的な作用は、約１０００ｎｇ／ｍｌ以上で始ま
る。したがって、骨に対してほとんど作用を有さない一方で、赤血球に対する作用を達成
することが望ましくあり得る場合、投薬スキームは、約２０〜３０日の期間にわたって、
約１００ｎｇ／ｍｌと約１０００ｎｇ／ｍｌとの間の血清濃度を送達するように設計され
得る。ヒトでは、２００ｎｇ／ｍｌの血清レベルは、０．１ｍｇ／ｋｇ以上の単回投薬で
達成され得、そして、１０００ｎｇ／ｍｌの血清レベルは、０．３ｍｇ／ｋｇ以上の単回
投薬で達成され得る。分子の実測血清半減期は、約２０日と３０日との間であって、実質
的に多くのＦｃ融合タンパク質よりも長く、したがって、例えば、毎週もしくは隔週ベー
スで約０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇの投薬によって持続的な有効血清レベルが達成され得
るか、または、より長い投薬間隔でより高い用量が使用され得る。例えば、０．１〜１ｍ
ｇ／ｋｇの用量は、毎月または隔月ベースで使用され得る。

特定の実施形態では、本発明はまた、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのインビボ産生のため
の遺伝子治療を提供する。このような治療は、上に列挙したような障害を有する細胞また
は組織中にＡｃｔＲＩＩａもしくはＡｃｔＲＩＩｂポリヌクレオチド配列を導入すること
によってその治療作用を達成する。ＡｃｔＲＩＩポリヌクレオチド配列の送達は、キメラ
ウイルスのような組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を用いて達成され得る。Ａｃ
ｔＲＩＩポリヌクレオチド配列の治療的送達には、標的化されたリポソームの使用が好ま
しい。

本明細書中で教示されるような遺伝子治療に利用され得る種々のウイルスベクターとし
ては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または、レトロウイルスのよう
なＲＮＡウイルスが挙げられる。レトロウイルスベクターは、マウスもしくはトリのレト
ロウイルスの誘導体であり得る。単一の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクタ
ーの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイ
ルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベーマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイ
ルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。多数のさらなるレトロウイル
スベクターが多数の遺伝子を組み込み得る。これらのベクターは全て、形質導入された細
胞が同定および生成され得るように、選択マーカーについての遺伝子を移送または組み込
みし得る。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を付着させ
ることによって、標的特異的とされ得る。好ましい標的化は、抗体を用いて達成される。
当業者は、ＡｃｔＲＩＩポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターの標的特異的な
送達を可能にするために、特定のポリヌクレオチド配列がレトロウイルスゲノム中に挿入
され得るか、または、ウイルスエンベロープに付着され得ることを認識する。

あるいは、組織培養細胞は、簡便なリン酸カルシウムトランスフェクション法によって
、レトロウイルスの構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをコードするプラスミドを用
いて直接トランスフェクトされ得る。これらの細胞は、次いで、関心のある遺伝子を含む
ベクタープラスミドでトランスフェクトされる。得られた細胞は、培養培地中にレトロウ
イルスベクターを放出する。

ＡｃｔＲＩＩポリヌクレオチドのための別の標的化送達システムは、コロイド分散系で
ある。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ
および脂質ベースの系（水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミセルおよびリポソームを
含む）が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは
、インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして有用な人工の膜ビヒクルである。ＲＮ
Ａ、ＤＮＡおよびインタクトなビリオンが、水性の内部に被包され得、そして、生物学的
に活性な形態で細胞へと送達され得る（例えば、Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．，６：７７，１９８１を参照のこと）。リポソームビヒクルを用い
た効率的な遺伝子移入のための方法は当該分野で公知であり、例えば、Ｍａｎｎｉｎｏら
、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２，１９８８を参照のこと。リポソームの組成
は、通常ステロイド（特に、コレステロール）との組み合わせでの、リン脂質の組み合わ
せである。他のリン脂質または他の脂質もまた使用され得る。リポソームの物理的特性は
、ｐＨ、イオン強度および二価のカチオンの存在に依存する。

リポソームの生成において有用な脂質の例としては、ホスファチジル化合物（例えば、
ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファ
チジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシド）が挙げ
られる。例示的なリン脂質としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファ
チジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。例えば、臓器特
異性、細胞特異性および細胞小器官特性に基づいたリポソームの標的化もまた可能であり
、当該分野で公知である。

本発明は、ここで、一般的に記載されてきたが、単に特定の実施形態および本発明の実
施形態を例示する目的のために含められ、本発明を限定することは意図されない以下の実
施例を参照するとより容易に理解される。

実施例１：ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質
出願人は、間に最小限のリンカーを伴ってヒトもしくはマウスのＦｃドメインに融合さ
せたヒトＡｃｔＲＩＩａの細胞外ドメインを有する可溶性ＡｃｔＲＩＩａ融合タンパク質
を構築した。この構築物は、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩａ−
ｍＦｃと呼ばれる。

ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、ＣＨＯ細胞株から精製されたものとして以下に示される（
配列番号７）：

ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃのタンパク質を、ＣＨＯ細胞株
中で発現させた。３つの異なるリーダー配列を検討した：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（
配列番号８）
（ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬ
ＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号９）
（ｉｉｉ）ネイティブ：ＭＨＬＬＬＦＱＬＬＶＬＬＰＬＧＫＴ（配列番号１０）。

選択された形態では、ＴＰＡリーダーを採用し、そして、以下のプロセシングを受けて
いないアミノ酸配列を有する。

このポリペプチドは、以下の核酸配列によってコードされる：

ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃは共に、組換え発現にとって際
立って扱いやすかった。図１に示されるように、タンパク質は、単一の十分に画定された
タンパク質のピークとして精製された。Ｎ末端の配列決定は、−ＩＬＧＲＳＴＱＥ（配列
番号１１）の単一の配列を明らかにした。精製は、例えば、以下のうちの３またはそれ以
上を任意の順序で含む一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成され得る：プロ
テインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロー
スクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラ
フィー。精製は、ウイルス濾過およびバッファの交換により完了され得る。ＡｃｔＲＩＩ
ａ−ｈＦｃタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定すると、９８％を
超える純度、そして、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって決定すると、９５％を超える純度まで精
製された。

ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃは、リガンド（特に、アクチビ
ンＡ）に対する高い親和性を示した。標準的なアミンカップリングの手順を用いて、ＧＤ
Ｆ−１１またはアクチビンＡ（「ＡｃｔＡ」）をＢｉａｃｏｒｅ ＣＭ５チップ上に固定
した。ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃのタンパク質を、このシス
テム上にローディングし、そして、結合を測定した。ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、５×１
０^１２の解離定数（Ｋ_Ｄ）でアクチビンに結合し、そして、タンパク質は、９．９６×１
０^−９のＫ_ＤでＧＤＦ１１に結合した。図２を参照のこと。ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃも同
様に挙動した。

ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、薬物動態研究において非常に安定していた。ラットに、１
ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃタンパク質を
投薬し、そして、２４時間、４８時間、７２時間、１４４時間および１６８時間に、タン
パク質の血漿レベルを測定した。別の研究では、ラットに、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋ
ｇまたは３０ｍｇ／ｋｇを投薬した。ラットでは、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、１１〜１
４日の血清半減期を有し、そして、薬物の循環レベルは、２週間後に極めて高かった（１
ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇの初回投与について、それぞれ、１１
μｇ／ｍｌ、１１０μｇ／ｍｌまたは３０４μｇ／ｍｌ）。カニクイザルでは、血漿半減
期は１４日よりもかなり長く、そして、薬物の循環レベルは、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／
ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇの初回投与について、それぞれ、２５μｇ／ｍｌ、３０４μｇ
／ｍｌ、または１４４０μｇ／ｍｌであった。

実施例２：ＡｃｔＲＨａ−ｈＦｃは、非ヒト霊長類における赤血球レベルを増加させる
この研究では、各群雄性５匹および雌性５匹のカニクイザルの４つの群を用い、各群の
各性別につき３匹は２９日目に終結するように計画し、そして、各群の各性別につき２匹
は５７日目に終結するように計画した。各動物に、ビヒクル（第１群）または１ｍｇ／ｋ
ｇ、１０ｍｇ／ｋｇもしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ（それぞれ、第２群
、第３群および第４群）を、１日目、８日目、１５日目および２２日目に静脈内（ＩＶ）
注射により投与した。投薬容量は、３ｍＬ／ｋｇに維持した。最初の投与の２日前、なら
びに、最初の投与の後に、１５日目、２９日目、および５７日目（残存する２匹の動物に
ついて）に、赤血球レベルの種々の指標を評価した。

ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、全ての用量レベルおよび研究全体にわたる時点で、雄性お
よび雌性について、平均の赤血球パラメータ（赤血球数［ＲＢＣ］、ヘモグロビン［ＨＧ
Ｂ］およびヘマトクリット［ＨＣＴ］）における統計的に有意な増加を引き起こし、絶対
的および相対的な網状赤血球数における上昇を伴った。図３〜６を参照のこと。

統計的有意差は、基線における処置群についての平均に対して、各処置群について計算
した。

注目すべきことに、赤血球数およびヘモグロビンレベルの増加は、その強度がエリスロ
ポエチンで報告されている作用とほぼ等しい。これらの作用の開始は、エリスロポエチン
よりも、ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃの方がより迅速である。

同様の結果がラットおよびマウスで観察された。

実施例３：ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃはヒト患者における赤血球レベルを増加させる
主として健康な閉経後の女性におけるタンパク質の安定性を評価するために行われた、
無作為化された二重盲検のプラセボ対照を含む研究において、実施例１に記載されるＡｃ
ｔＲＩＩａ−ｈＦｃ融合タンパク質を、ヒト患者に投与した。４８人の被験体を、６つの
コホートに無作為化し、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃまたはプラセボ（５ 有効（ａｃｔｉｖ
ｅ）：１ プラセボ）のいずれかの単回用量を与えた。用量レベルは、０．０１〜３．０
ｍｇ／ｋｇ静脈内（ＩＶ）および０．０３〜０．１ｍｇ／ｋｇ皮下（ＳＣ）の範囲であっ
た。全ての被験体を、１２０日間追跡した。薬物動態（ＰＫ）解析に加え、骨の形成およ
び再吸収の生化学的マーカーおよびＦＳＨレベルの測定によって、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦ
ｃの生物学的活性もまた評価した。

潜在的な変化を調べるため、研究の経過にわたり、全被験体についてヘモグロビンおよ
びＲＢＣ数を詳しく検討し、基線レベルと比較した。対照と同じ時間にわたって、血小板
数を比較した。血小板数については、経時的に、基線値からの臨床上有意な変化は存在し
なかった。

ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃのＰＫ解析は、用量と共に線形のプロフィールと、約２５〜３
２日の平均半減期を示した。ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの曲線下面積（ＡＵＣ）は、用量に
対して線形的に関連しており、そして、ＳＣ投薬後の吸収は、本質的に完全であった（図
７および８を参照のこと）。これらのデータは、ＳＣがＩＶ投薬の最初の数日に伴う薬物
の血清濃度におけるスパイクを回避しつつ、薬物についての等価なバイオアベイラビリテ
ィおよび血清半減期を提供するので、ＳＣが望ましい投薬アプローチであることを示して
いる（図８を参照のこと）。ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、同化作用性の骨成長のマーカー
である骨特異的アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）の血清レベルの、迅速かつ持続的な
用量依存性の増加と、骨再吸収のマーカーであるＣ末端１型コラーゲンテロペプチド（ｔ
ｅｌｏｐｅｐｔｉｄｅ）および酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂレベルの用量依存性
の減少とをもたらした。ＰＩＮＰのような他のマーカーは、決定的でない結果を示した。
ＢＡＰレベルは、薬物の最高投薬量において飽和に近い作用を示し、この同化作用性の骨
バイオマーカーに対する最大の半分の作用が、０．３ｍｇ／ｋｇの投薬量において達成さ
れ得、その増加は３ｍｇ／ｋｇまでの範囲であることを示している。薬物についてのＡＵ
Ｃに対する薬力学的作用の関係性として計算すると、ＥＣ５０は、５１，４６５（日^＊ｎ
ｇ／ｍｌ）である。図９を参照のこと。これらの骨バイオマーカーの変化は、試験した最
高用量レベルにおいて約１２０日間持続された。また、アクチビンの阻害と一致して、結
成ＦＳＨレベルにおける用量依存性の減少もまた存在した。

全体として、ＩＶまたはＳＣのいずれで与えたとしても、おそらく０．０１ｍｇ／ｋｇ
の群と０．０３ｍｇ／ｋｇの群における瀉血を研究するために関連付けられた研究の第１
週にわたって、ヘモグロビンにおける非常に小さな薬物に関連しない減少が存在した。０
．１ｍｇ／ｋｇのＳＣおよびＩＶのヘモグロビンの結果は安定しており、８〜１５日目ま
でにあまり大きくない増加を示した。０．３ｍｇ／ｋｇのＩＶ用量レベルでは、早くも２
日目に見られ、そして、しばしば１５〜２９日目にピークを迎えるＨＧＢレベルのはっき
りとした増加が存在した（これは、プラセボ被験体では見られなかった）。この研究のこ
の時点では、この変化は統計的有意差には到達していなかった。

全体として、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、赤血球数および網状赤血球数に対して用量依
存性の作用を示した。血液学的変化のまとめについては、図１０〜１３を参照のこと。

実施例４：代替的なＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃタンパク質
本明細書中に記載される方法にしたがって使用され得る種々のＡｃｔＲＩＩａ改変体は
、ＷＯ２００６／０１２６２７として公開される国際特許出願（ｐｐ．５５〜５８を参照
のこと；その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されている。代替的な構
築物は、Ｃ末端テイル（ＡｃｔＲＩＩａの細胞外ドメインの最後から１５アミノ酸）の欠
失を有し得る。このような構築物の配列は以下に示される（Ｆｃ部分に下線を付す）（配
列番号１２）：

実施例５：ＡｃｔＲＩＩｂ−Ｆｃ融合タンパク質
出願人は、ヒトＦｃドメインに融合させたヒトＡｃｔＲＩＩｂの細胞外ドメインを有す
る可溶性ＡｃｔＲＩＩｂ融合タンパク質を構築した。アクチビンと細胞外ＡｃｔＲＩＩｂ
との共結晶構造は、リガンド結合における細胞外ドメインの最後（Ｃ末端）の１５アミノ
酸（本明細書において「テイル」と呼ばれる）に、何らかの役割を示さなかった。この配
列は、結晶構造上で分解できず、これらの残基が、結晶中で均一にパッケージングされな
かった可撓性ループ中に存在していることが示唆された。ＴｈｏｍｐｓｏｎらＥＭＢＯ
Ｊ．２００３ Ａｐｒ １；２２（７）：１５５５−６６。この配列はまた、ＡｃｔＲＩ
ＩｂとＡｃｔＲＩＩａとの間で、不完全に保存されている。したがって、これらの残基は
、基本的、または、バックグラウンドのＡｃｔＲＩＩｂ−Ｆｃ融合構築物においては省略
した。さらに、バックグラウンド融合物における６４位は、アラニンによって占有されて
おり、一般に「野生型」形態と考えられているが、Ａ６４Ｒ対立遺伝子が天然に生じる。
したがって、バックグラウンドＡｃｔＲＩＩｂ−Ｆｃ融合物は、以下の配列を有する（Ｆ
ｃ部分に下線を付す）（配列番号２０）：

驚くべきことに、Ｃ末端テイルは、アクチビンおよびＧＤＦ−１１の結合を増強するこ
とが見出され、したがって、ＡｃｔＲＩＩｂ−Ｆｃの好ましいバージョンは、以下の配列
を有する（Ｆｃ部分に下線を付す）（配列番号２１）：

本明細書中に記載される方法にしたがって使用され得る種々のＡｃｔＲＩＩｂ改変体は
、ＷＯ２００６／０１２６２７として公開される国際特許出願（例えば、ｐｐ．５９〜６
０を参照のこと；その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されている。

実施例６：ＡｃｔＲＩＩｂ−ｈＦｃは、非ヒト霊長類における赤血球生成を刺激する
雄性および雌性のカニクイザルに、ＡｃｔＲＩＩｂ−ｈＦｃ（ＩｇＧｌ）を、１ヶ月間
、週一回、皮下注射により投与した。４８匹のカニクイザル（２４匹／性別）を、４つの
処置群（６匹の動物／性別／群）のうちの１つに割り当て、そして、４週間にわたり、週
一回（合計５用量）、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたｈ３０ｍｇ／ｋｇの、ビヒクル
またはＡｃｔＲＩＩｂ−ｈＦｃのいずれかの皮下注射を施した。評価したパラメータには
、一般的な臨床病理学（血液学、臨床化学、凝固および尿検査）を含めた。ＡｃｔＲＩＩ
ｂ−ｈＦｃは、処置した動物において、１５日までに、平均の絶対的網状赤血球値の統計
的に有意な上昇を引き起こした。３６日までに、ＡｃｔＲＩＩｂ−ｈＦｃは、平均絶対的
網状赤血球および赤血球分泌幅の値の上昇、ならびに、平均血球ヘモグロビン濃度の低下
を含む、いくつかの血液学的変化を引き起こした。全ての処置群および両方の性別が影響
を受けた。これらの作用は、骨髄からの未成熟な網状赤血球の放出に対するＡｃｔＲＩＩ
ｂ−ｈＦｃの正の作用と一致している。この作用は、処置した動物から薬物を洗い出した
後に逆転した（研究の５６日目までに）。したがって、本発明者らは、ＡｃｔＲＩＩｂ−
ｈＦｃが赤血球生成を刺激すると結論付ける。

（参考としての援用）
本明細書中で言及される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が、具
体的かつ個別に参考として援用されると示されるかのように、その全体が本明細書により
参考として援用される。

主題の特定の実施形態が考察されてきたが、上記明細書は、例示的であり、限定的なも
のではない。本明細書および以下の特許請求の範囲を精査すれば、多くのバリエーション
が当業者に明らかとなる。本発明の完全な範囲は、その等価な範囲と共に特許請求の範囲
を、そして、このようなバリエーションと共に明細書を参照することによって決定される
べきである。

アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、１つのドメインとして、ＡｃｔＲＩＩポ
リペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩａまたはＡｃｔＲＩＩｂのリガンド結合部分）と、所
望の特性（例えば、改善された薬物動態，より容易な精製，特定の組織への標的化など）
を提供する１以上のさらなるドメインとを有する融合タンパク質であり得る。例えば、融
合タンパク質のドメインは、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、組織局
在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成および／または精製のうちの１以上を増強し
得る。アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩ融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメイン（野
生型または変異型）、または血清アルブミン、または所望の特性（例えば、改善された薬
物動態、改善された溶解性または改善された安定性）を提供する他のポリペプチド部分を
含み得る。好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃ融合物は、Ｆｃドメインと細胞外
ＡｃｔＲＩＩドメインとの間に位置する比較的構造の定まらない（ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅｄ）リンカーを含む。この構造の定まらないリンカーは、ＡｃｔＲＩＩの細胞外ドメイ
ンのＣ末端におよそ１５アミノ酸の構造の定まらない領域（「テイル」）に対応し得るか
、または、１、２、３、４もしくは５アミノ酸、または、比較的二次構造が自由な、５〜
１５、２０、３０、５０もしくはそれ以上の長さのアミノ酸の人工配列であり得るか、あ
るいはこの両方の混合物であり得る。リンカーは、グリシン残基およびプロリン残基が豊
富であり得、そして例えば、スレオニン／セリンおよびグリシンの単一の配列、または、
スレオニン／セリンおよびグリシンの繰り返し配列（例えば、ＴＧ_４ （配列番号２２）も
しくはＳＧ_４ （配列番号２３）の単一体もしくは繰り返し）を含み得る。融合タンパク質
は、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、または、ＧＳＴ融合物のよう
な精製配列を含み得る。必要に応じて、可溶性のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、グリコシ
ル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオ
チン化アミノ酸、脂質部分に結合されたアミノ酸または有機誘導体化因子（ｏｒｇａｎｉ
ｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）に結合されたアミノ酸から選択される１以
上の修飾されたアミノ酸残基を含む。薬学的調製物はまた、骨障害を処置するために使用
される化合物のような１以上のさらなる化合物を含み得る。好ましくは、薬学的調製物は
、発熱物質を実質的に含まない。一般に、ＡｃｔＲＩＩタンパク質は、患者における望ま
しくない免疫応答の可能性を無くすために、ＡｃｔＲＩＩタンパク質の天然のグリコシル
化を適切に媒介する哺乳動物細胞株において発現されることが好ましい。ヒトおよびＣＨ
Ｏの細胞株は、首尾よく使用されており、そして、他の一般的な哺乳動物発現系が有用で
あることが予想される。

ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃは共に、組換え発現にとって際
立って扱いやすかった。図１に示されるように、タンパク質は、単一の十分に画定された
タンパク質のピークとして精製された。Ｎ末端の配列決定は、−ＩＬＧＲＳＥＴＱＥ（配
列番号１１）の単一の配列を明らかにした。精製は、例えば、以下のうちの３またはそれ
以上を任意の順序で含む一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成され得る：プ
ロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロ
ースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグ
ラフィー。精製は、ウイルス濾過およびバッファの交換により完了され得る。ＡｃｔＲＩ
Ｉａ−ｈＦｃタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定すると、９８％
を超える純度、そして、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって決定すると、９５％を超える純度まで
精製された。

Claims (1)

1. 方法、組成物、または、ポリペプチド。

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