KR102450255B1

KR102450255B1 - 폴리디알릴 디알킬암모늄 염을 이용한 아데노-관련 바이러스의 분리방법

Info

Publication number: KR102450255B1
Application number: KR1020187036182A
Authority: KR
Inventors: 원링 동; 아난디타 세스; 로버트 제이. 밀크자렉; 프란체스카 피. 비텔리
Original assignee: 론자 휴스턴 아이엔씨.
Priority date: 2016-05-25
Filing date: 2017-05-25
Publication date: 2022-10-04
Also published as: AU2017269371B2; US11427809B2; WO2017205573A1; AU2017269371A1; US20200407695A1; CN109153978B; EP3464571A1; EP3464571A4; IL262960A; JP6908331B2; CN109153978A; KR20190012181A; IL262960B; EP3464571B1; JP2019519213A; CA3023473A1

Abstract

본 발명은 응집제를 이용하여 수성 바이오매스로부터 아데노-관련 바이러스(AAV)를 선택적으로 정제하는 방법에 관한 것이다. 구현예에서, 응집제는 폴리디알릴 디알킬암모늄 염, 예컨대, 염화 폴리디알릴 디메틸암모늄 (pDADMAC)이다.

Description

폴리디알릴 디알킬암모늄 염을 이용한 아데노-관련 바이러스의 분리방법

본 발명은 응집제를 이용하여 수성 바이오매스(biomass)로부터 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus, AAV)를 선택적으로 정제하는 방법에 관한 것이다. 구현예에서, 응집제는 폴리디알릴 디알킬암모늄 염, 예컨대, 염화 폴리디알릴 디메틸암모늄 (pDADMAC)이다.

아데노-관련 바이러스(AAV)는 분열 및 비분열 세포를 형질도입하는 능력, 저면역원성 및 광범위 또는 협소범위의 조직특이성을 가진 AAV 혈청형(serotype)을 생성하는 능력 때문에, 유전자 치료법에서 벡터로 이용되는 헬퍼-바이러스 의존적 파르보바이러스이다. 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 이용한 다수의 성공적인 조직 배양 및 소형 동물 연구가 임상실험까지 진행된 경우는 드물다. 특히, 대형 동물 모델과 독성학 연구에서의 임상전 효능 검사는 실험실 및 대부분의 연구소 수준의 벡터 코어 시설에서는 용이하게 생산할 수 없는 다량의 벡터를 필요로 한다.

AAV는 임상 연구에서 안정되고 효과적인 유전자 전달을 나타냈다. AAV에 대한 관심이 높아지면서 임상 공급을 위한 벡터의 대량생산을 향상시킬 필요가 있게 되었다. AAV 유전자 치료 제품을 생산하는 가장 뛰어난 확대가능한 방법 중 하나는 재조합 AAV 조립에 필요한 핵심 유전적 요소, 예를 들어, 레플리카제(복제효소) 및 캡시드 단백질 코딩 서열과 더불어, 관심대상인 표적 전이 유전자(transgene)를 생성하는 재조합 생산자 세포주를 이용하는 것이다. 이들 유전적 요소 및 관심대상인 전이 유전자는 침해성 숙주 세포주로 안정되게 형질주입되었다. 그러나, AAV의 패키징 및 방출을 유발하기 위해서는 AAV-헬퍼 바이러스 코딩 영역, 예컨대 E1, E2a 및 E4가 필요하며, 이를 위해 생산자 세포주를 AAV-헬퍼 바이러스로 감염시켜야 한다. 비록 이 공정은 매우 활발하고, 표적 전이 유전자를 함유하는 80% 이상의 전체 AAV 캡시드를 생성하지만, 안전성, 순도 및 AAV 산물의 품질을 확보하려면, 후속의 정제단계에서 AAV-헬퍼 바이러스를 완전히 제거해야 한다. 이 중요한 단계를 수행하기 위해서, 현재 업계의 표준 방법은 크로마토그래피, 바이러스 제거 필터 및 열처리 비활성화 반응의 각각 또는 이의 조합에 의존한다.

구현예에서, 본 발명은 아데노-관련 바이러스(AAV) 및 하나 이상의 AAV-헬퍼 바이러스를 함유하는 수성 바이오매스로부터 상기 아데노-관련 바이러스를 정제하는 방법을 제공하며, 이 방법은: (a) 상기 바이오매스를 폴리디알릴 디알킬암모늄 염과 접촉시켜 응집물과 정화액을 형성하고, 상기 응집물은 상기 하나 이상의 AAV-헬퍼 바이러스를 포함하며; (b) 상기 응집물을 상기 정화액으로부터 제거하고; 및 (c) AAV를 상기 정화액으로부터 추가로 분리하는 단계들을 포함한다.

구현예에서, 본 발명은 추가로 표적 전이 유전자를 함유하는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 분리하는 방법을 제공하며, 이 방법은: (a) 생산자 세포를 AAV 및 AAV-헬퍼 바이러스를 이용하여 형질주입하여 형질주입된 생산자 세포(transfected producer cell)를 생성하고; (b) 상기 형질주입된 생산자 세포를 배양하고; (c) 상기 형질주입된 생산자 세포를 용해처리하여 수성 바이오매스를 생성하고; (d) 폴리디알릴 디알킬암모늄 염을 상기 바이오매스에 도입하여 AAV-헬퍼 바이러스를 포함한 응집물 및 AAV를 포함한 정화액을 생성하고; 및 (e) 상기 정화액을 정제 컬럼에 접촉시켜 분리된 AAV를 생성하는 단계들을 포함한다.

구현예에서, 본 발명은 추가로 표적 전이 유전자를 함유하는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 분리하는 방법을 제공하며, 이 방법은: (a) 생산자 세포를 AAV 및 AAV-헬퍼 바이러스를 이용하여 형질주입하여 형질주입된 생산자 세포를 생성하고; (b) 상기 형질주입된 생산자 세포를 배양하여 수성 바이오매스를 생성하고; (c) 폴리디알릴 디알킬암모늄 염을 상기 바이오매스에 도입하고; 및 (d) 상기 정화액을 정제 컬럼으로 처리하여 분리된 AAV를 생성하는 단계들을 포함한다.

도 1은 클라리솔브(Clarisolve) 용해물의 분석 HPLC 크로마토그래피 프로파일을 도시한다: 비 pDADMAC (대조군); 예상 체류시간인 약 16분에 Ad5 피크가 검출되었다.
도 2는 클라리솔브 용해물 (pDADMAC 함유)의 분석 HPLC 크로마토그래피 프로파일을 도시한다. 예상 체류시간인 약 16분에 Ad5 바이러스 피크가 검출되지 않았다.
도 3은 용해물의 분석 HPLC 크로마토그래피 프로파일을 도시한다: 0.01% 및 0.025% pDADMAC의 효과; 대조군 시료의 경우 예상 체류시간인 약 16분에 Ad5 피크가 검출된 반면, 0.01% 및 0.025% pDADMAC로 처리한 시료의 경우 상기 피크가 검출되지 않았다.
도 4는 용해물의 분석 HPLC 크로마토그래피 프로파일을 도시한다: 0.05% 및 0.1% pDADMAC의 효과; 대조군 시료의 경우 예상 체류시간인 약 16분에 Ad5 피크가 검출된 반면, 0.05% 및 0.1% pDADMAC로 처리한 시료의 경우 상기 피크가 검출되지 않았다.

본 발명은 아데노-관련 바이러스(AAV)를, 이 AAV 및 AVV-헬퍼 바이러스를 함유한 수성 바이오매스 내에서 하나 이상의 AAV-헬퍼 바이러스로부터 분리정제하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 상기 바이오매스를 강한 양이온성 및 활성화된 흡착제 라디칼기를 가진 고분자, 예컨대, 염화 폴리디알릴 디메틸암모늄 (pDADMAC)과 접촉시켜 AAV-헬퍼 바이러스를 포함한 응집물을 형성하고, 이 응집물을 제거하여 정화액을 형성하는 것을 포함한다. 일단 응집물이 제거되면, 남아있는 정화액은 실질적으로 헬퍼 바이러스가 없는 AAV를 함유하며, 따라서 여액을 크로마토그래피 처리하여 AAV를 추가로 분리할 수 있다.

강 양이온성 및 활성화된 흡착제 그룹을 함유하는 다양한 고분자를 본 발명의 선택적 응집제로서 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 고분자는 폴리디알릴 디알킬암모늄 염, 예컨대, 폴리디알릴 디알킬암모늄 불화물, 염화물 또는 브롬화물이다. 일부 구현예에서, 상기 고분자는 폴리디알릴 디메틸암모늄 염, 폴리디알릴 디에틸암모늄 염 또는 폴리디알릴 디프로필암모늄 염 등이며, 예를 들면, 염화 폴리디알릴 디메틸암모늄, 불화 폴리디알릴 디메틸암모늄 또는 브롬화 폴리디알릴 디메틸암모늄이다. 일부 구현예에서, 고분자는 염화 폴리디알릴 디메틸암모늄이다. 염화 폴리디알릴 디메틸암모늄(pDADMAC)은 분자량이 큰 수용성 폴리양이온성 동종 중합체이다. 고분자체는 강 양이온성 및 활성화된 흡착제 라디칼기를 함유하며, 이 라디칼기는 탈안정화되어 액상내 현탁 고형물 및 음전하를 띠는 수용성 물질을 응집시키는 한편, AAV의 응집을 최소화할 수 있다. 특별한 이론에 연계하지 않아도, 폴리디알릴 디알킬암모늄염, 예컨대 pDADMAC는 적절한 농도로 사용할 경우, 음전하를 띠는 세포 및 세포 잔해들을 이온 상호반응 메카니즘 (전기적 중화반응 및 가교 흡착반응)을 통해 신속히 응집하여 더 큰 입자로 만들며, 결과적으로 효율적이고 간단하게 분해 및 제거할 수 있게 한다. 폴리디알릴 디알킬암모늄 염, 예컨대, pDADMAC는 액체의 탈색, 및 오수 처리, 수처리 및 제지 산업과 같은 다양한 산업에서 실트, 점토, 조류, 박테리아 및 바이러스와 같은 무기 및 유기 입자들을 응고 및 응집하는데 있어서 효과적인 것으로 이미 밝혀졌다. 그러나, 본 발명은 폴리디알릴 디알킬암모늄 염이 실질적으로 AAV는 응집하지 않으면서 AAV-헬퍼 바이러스를 선택적으로 응집할 수 있는 사실을 최초로 확인하였으며, 이를 기초로 AAV-헬퍼 바이러스로부터 AAV를 선택적으로 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

다양한 농도의 폴리디알릴 디알킬암모늄 염을 본 발명에 따라 이용할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 바이오매스는 세포 용해물이며, 폴리디알릴 디알킬암모늄 염, 예컨대, pDADMAC를 약 0.01 내지 약 0.5%, 또는 약 0.025 내지 약 0.1% (w/v)의 농도로 상기 바이오매스에 첨가한다. 일부 구현예에서, 폴리디알릴 디알킬암모늄 염, 예컨대, pDADMAC의 농도는 0.025%, 0.03%, 0.035%, 0.04%, 0.05%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4% 또는 0.5% (w/v)이다.

아데노-관련 바이러스(AAV)는 디펜더파르보바이러스 속의 소형, 복제-결손, 비-외피형 바이러스이며, 이는 파르보비리다에 (Parvoviridae)과에 속한다 (파르보바이러스). 일부 구현예에서, AAV는 재조합 AAV(recombinant AAV, rAAV)이다. 본원 전반에 걸쳐 AAV는 적절한 경우 rAAV로 대체할 수도 있다. 일부 구현예에서, rAAV는 전이 유전자를 포함한다. AAV는 증식에 있어서 AAV 헬퍼-바이러스에 의존한다. 일부 구현예에서, AAV는 활성적이다. "활성적" 이라는 용어는 플레이트에 도포시 역가를 형성할 수 있는 AAV의 능력을 말한다.

AAV 생산은 형질도입 벡터로서의 AAV의 용도가 최초 보고된 이래 계속 발전해 왔으나, 기본적인 필요조건은 아직도 변화가 없다. 현재 모든 AAV 생산 방법은 벡터 게놈과 관련하여 트랜스 역할을 하는 공통의 인자 집단이 필요하다. 일부 구현예에서, 이들 성분은 AAV 비구조 단백질, AAV 구조 단백질, 헬퍼-바이러스 유전자 산물 집단 및, 벡터 게놈 복제용 DNA 폴리머라제 성분들을 포함한, 거대분자 합성에 필요한 세포성 인자들로 구성된다. AAV 게놈과 벡터 게놈은 모두, 차단된 말단 팰린드롬(회문구조)를 가진 선형 단일가닥 DNA이며, 대개는 역말단 반복단위(inverted terminal repeats, ITRs)라고 칭한다. ITRs는 이중 형태로부터 AAV DNA의 분리 및 후속의 복제, 패키징, 가능하게는 형질도입된 세포 내에서 vg를 안정화하는데 필요한 유일한 시스(cis) 성분이다.

AAV-헬퍼 바이러스는 포유동물 세포내 증식형 AAV 감염에 필요한 또 다른 트랜스-작용 인자를 제공한다. 일부 구현예에서, AAV-헬퍼 바이러스는 아데노바이러스, 헤르페스 심플릭스 바이러스 및 바큘로바이러스로 이루어진 군에서 선택된다.

AAV 감염을 위한 동일한 아데노바이러스 유전자 산물 집단이 유효 재조합 AAV(rAAV) 생산에도 필요하다. AAV 헬퍼-바이러스를 제공하는 아데노바이러스 유전자는 Ela, Elb55k, E4orf6, E2a 및 VA RNA를 제공할 수 있다. 기타 세포성 유전자의 프로모터 활성화를 향상시키는 것과 더불어, E1A는 또한 전사 활성자/억제자 단백질 YY1의 조절 분야에서 명확히 규정된 역할을 한다.

각종 세포를 AAV의 생산에 사용할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서 AAV는 포유동물 세포 내에서 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, AAV는 곤충 세포 내에서 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, AAV는 HeLa 세포 내에서 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, AAV 생산에 사용되는 세포, 즉, "생산자 세포"는 HeLa 세포, 인간 태아 신장세포, 예컨대, HEK293, 및 조밤나방 (Spodoptera frugiperda) (Sf9) 세포 같은 곤충 세포이다. 일부 구현예에서, 생산자 세포는 HEK293 세포이다. 일부 구현예에서, 생산자 세포는 Sf9 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 CHO, Per.C6을 포함한 기타 다른 유형의 포유동물일 수 있다. 일부 구현예에서는, 헬퍼 바이러스가 필요하다.

일부 구현예에서, AAV는 필수적인 바이러스 단백질과 바이러스 게놈을 코딩하는 플라스미드로 화학적 공동-형질주입된 HEK 293 세포를 이용하여 생성한다. 그러나 세포-세포간 전송이 결핍되면, AAV 생산은 초기에 플라스미드 DNAs가 형질주입되고, 또한 딸 세포에서 충분한 복제수가 유지된 세포에만 국한하여 이루어진다. 플라스미드는 전형적으로 포유동물 세포내 복제가 불가능하므로, rep 및 cap 유전자의 복제수가 기하급수적으로 팽창되지는 않는다. 마찬가지로, 일부 구현예에서 아데노바이러스 헬퍼 유전자는 비감염성 플라스미드인 HEK 293 세포에 도입되므로,생산시 헬퍼 유전자 용량은 일정하게 유지된다.

AAV 생산 규모의 확대는 기본적으로 상류(upstream) 생산공정과 호환적인 방식으로 세포수를 증대하는 것이 요구된다. AAV 생산은 보통 부착세포나 현탁 배양에서 수행된다.

화학적 형질주입 기반 공정의 경우, 부착세포는 일반적으로 플라스틱 세포배양 플레이트나 회전병에서 단일층으로 성장한다. 유효한 표면적에 의해 최대 세포수가 결정되고, 이에 따라 생성되는 AAV의 양이 결정된다.

대안적으로, 현탁 배양은 면적이 아닌 부피에 기초하여 세포를 확장시킨다. 현탁 세포수로의 부착 세포수에 관한 전환상수는 각 포맷의 세포 밀도에 따라 달라지며, 약 10 내지 50 cm² = 1 cm³일 수 있다. 인산칼슘 같은 무기 화합물, 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI) 같은 유기화합물, 또는 비화학적 방법, 예컨대, 전기영동법 등을 이용하여 AAV를 생성하는 형질주입법은 부착세포를 이용하는 것으로 광범위하게 기재되어 있다. 그러나, 현탁 세포의 경우, 인산칼슘이나 PEI를 이용한 형질주입이 가장 일반적으로 사용된다. PEI가 자주 이용되는데, 이는 복잡한 (및 특이성이 있는) 인산칼슘 형질주입법 대신, 시판되는 단일 시약을 이용하므로써, 재현성과 신뢰성을 추정할 수 있기 때문이다.

일부 구현예에서, AAV-헬퍼 바이러스는 바큘로바이러스 발현 벡터이며, 이는 조밤나방 (Sf9) 세포에서 AAV를 생성하는데 이용된다. 우선, 재조합 바큘로바이러스는 증식성 감염을 개시하고, 이어서 바큘로바이러스의 후손이 이차적으로 배양중인 또다른 세포를 감염시킬 수 있다. 세포당 약 100개의 감염성 바큘로바이러스 입자가 방출되면, 초기의 다수 감염에 따라 1회 또는 2회의 감염 사이클 중에 전체 세포배양 집단이 감염된다. 일부 구현예에서, Sf9 숙주세포는 HEK 293 세포보다 훨씬 더 효율적으로 벡터 DNA를 복제한다. 또한, 바큘로바이러스는 AAV 구조 단백질 생산, 바이러스 조립 및 전이 유전자의 패키징에 필요한 서열을 가진 곤충세포를 제공할 수 있다.

일부 구현예에서, Sf9 세포-생성 AAV의 물리적, 생화학적 및 생물학적 특징들은 Sf9 세포에서 생성된 AAV가 HEK 293 세포에서 생성된 AAV와 동등하다는 것을 보여준다. 벡터 유래의 게놈을 분석한 결과, 최대 4.7 kb의 선형 단일가닥 DNA가 효과적으로 패키지되어 있음이 확인되었다.

개괄적으로 말해서, 수성 세포 배양 바이오매스로부터 AAV를 회수하는 방법은, (i) 필요시 세포로부터 AAV를 해방시키고, (ii) 다른 세포 잔해 및 배지 성분으로부터 AAV를 분리하고, 및 (iii) 이 AAV를 농축 및 정제하는 단계들을 포함한다. AAV 캡시드는 탄력이 있고 단단하므로, 하류 공정에서는 승온에서 장기간 노출, 반복적인 동결 및 해동 사이클, 산성 조건 및 유기용매에 대한 노출 등과 같이 기피되는 조건도 이용할 수 있다. 그러나, AAV를 회수하는 경우, 다른 바이러스류, 예컨대 AAV-헬퍼 바이러스 등이 함께 분리되지 않도록 주의해야 한다.

하류 공정의 초기 단계는 세포배양 포맷에 의해 부분적으로 결정된다. 부착세포는 그대로 용해되거나, 성장 기질로부터 분리되어 동결-해동 용해반응, 기계적 균질화 또는 계면활성제를 이용한 화학적 반응을 통해 소형의 일회용 용기 내에서 용해할 수도 있다. 큰 부피의 현탁 배양물은 계면활성제, 예컨대, 트리톤 X-100, Tween 20 등으로 처리하거나, 또는 기계장치로 균질화 처리할 수 있다. 뉴클레아제 처리, 예컨대, 벤조나제 처리를 용해처리 뒤에 도입하여 DNA 오염물을 감소시켜, 후속의 여과 및 크로마토그래피 단계의 진행을 용이하게 할 수 있다.

일부 구현예에서, Ad 헬퍼 바이러스를 이용하여 AAV를 생성할 때, 세포 용해처리후 용해된 세포 바이오매스는 폴리디알릴 디알킬암모늄 염, 예컨대, pDADMAC를 첨가하여 응집시킬 수 있다. 세포 성분들의 응집물을 여과 제거하거나 (부피가 클 때 편리함), 또는 원심 분리하여 제거할 수 있으며, AAV는 대체로 바이오매스 정화액에 남는다. 일부 구현예에서, 공극 크기가 점차 감소하는 직렬형 필터를 이용하여 세포 성분들에 의한 막힘 현상(clogging)을 방지한다. 일부 구현예에서, 접선유동 여과법(tangential flow filtration, TFF)을 사용한다. 구현예에서, 바이오매스 응집으로 형성된 응집물을, 예를 들어 클라리솔브 여과법 등으로 여과 제거한다. 대부분의 응집제 및 응집물은 여과에 의해 제거되며, 잔류하는 응집제는 후속의 크로마토그래피 단계에서 제거할 수 있다. 구현예에서, 비레솔브(Viresolve) 등의 바이러스 제거 필터를 본 발명의 방법과 조합하여 사용함으로써, AAV를 분리한다. 일부 구현예에서, 분석기술, 예컨대 HPLC, PCR 및/또는 생물학적 검사 등을 이용하여, 정화된 바이오매스 용해물에 본질적으로 AAV-헬퍼 바이러스가 존재하지 않는 것을 입증할 수 있다. 질랑 분광학과 같은 기타 분석법을 이용하여 응집제 제거를 확인할 수 있다.

응집물 제거후, 남아있는 바이오매스, 예컨대, 정화액 내의 AAV는 당해 분야의 공지 기술, 예를 들어 크로마토그래피 정제법 등을 이용하여 추가로 분리, 농축 및/또는 정제할 수 있다. 정화된 세포 용해물로부터 캡시드를 이온교환 크로마토그래피로 회수하며, 여기서는 양이온 및 음이온 교환 매질 모두 사용할 수 있다. 재조합 단일 사슬 항체를 이용하여 제조한 면역친화성 크로마토그래피 매질은 AAV1, AAV2, AAV6 및 AAV8을 포함한 여러가지 AAV 캡시드 혈청형을 결합시키는 것으로 공지되어 있다. 이 항체는 높은 특이성 및 친화성으로 캡시드를 결합시킬 수 있다. 한정되지 않으나, 크기 배제, IEX 또는 기타 크로마토그래피법 등을 포함하는 "연마(polishing)" 단계를 통해 거의 균질한 최종 AAV 산물을 생성한다. TFF 농축 및 멸균 여과후, 이들 방법에 의해 생성된 AAV를 전임상시험 단계 및 cGMP 규정 실행(compliant practice)이 포함된 임상연구에 사용할 수 있다.

일부 구현예에서, 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 정화액으로부터 AAV를 침전시킬 수 있다. 저속 원심분리후, AAV를 함유한 펠릿을 완충액에 재현탁하고 이를 밀도구배 원심분리, 예컨대, 염화세슘 동위원소구배 또는 이오딕사놀 단계구배법 등을 이용하여 추가로 농축 및 정제할 수 있다. 일부 구현예에서, 공극 크기가 점차 감소하는 직렬형 필터를 이용하여 막힘 현상을 방지하고 AAV 회수율을 증가시킨다. 접선유동 여과법(TFF)은 편리한 AAV 농축기술이며, 완충제 교환도 가능하다.

일부 구현예에서, 본 발명은 표적 전이 유전자를 함유하는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 분리하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은: (a) AAV 구조/복제 성분, 전이 유전자 및 AAV-헬퍼 바이러스 같은 필요한 DNA 성분을 가진 AAV 생산자 세포를 제공하여 생산자 세포를 생성하고; (b) 상기 형질주입된 생산자 세포를 배양하고; (c) 상기 형질주입된 생산자 세포를 용해하여 수성 바이오매스를 생성하고; (d) 폴리디알릴 디알킬암모늄 염을 상기 바이오매스에 도입하여 상기 AAV-헬퍼 바이러스를 포함한 응집물 및 AAV를 포함한 정화액을 생성하고; 및 (e) 상기 정화액을 정제 컬럼에서 처리하여 분리된 AAV를 생성하는 단계들을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 표적 전이 유전자를 함유하는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 분리하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은: (a) 생산자 세포를 AAV 및 AAV-헬퍼 바이러스로 형질주입하여 형질주입된 생산자 세포를 생성하고; (b) 상기 형질주입된 생산자 세포를 배양하여 수성 바이오매스를 생성하고; (c) 상기 형질주입된 생산자 세포를 용해하여 세포 용해물을 생성하고, 이때 세포 용해물은 상기 AAV-헬퍼 바이러스를 포함한 응집물 및 AAV를 포함한 정화액을 형성하고; (d) 폴리디알릴 디알킬암모늄 염을 상기 바이오매스에 도입하고; 및 (e) 상기 정화액을 정제 컬럼과 접촉시켜 분리된 AAV를 생성하는 단계들을 포함한다.

본 발명은 하기의 실시예에서 추가로 예시한다. 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공하는 것이며, 이를 제한하는 것으로 해석하지 않아야 한다.

실시예

이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 기술하기로 한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 개시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석하지 않아야 한다.

실시예 1

AAV, AAV-헬퍼 바이러스(Ad5) 및 세포 성분들로 이루어진 세포 용해물을 포함한 수성 바이오매스로부터 정제된 AAV를 분리하는 것을 아래에서 설명한다.

조작 단계를 피하고 산물의 손실을 최소화하기 위하여, pDADMAC를 이용하여 생산 반응기 세포 배양 현탁액의 응집을 제어함으로써, 수득/상류 공정을 최적화함과 아울러, 하류 크로마토그래피 처리를 개선할 수 있다.

AAV 및 Ad5 바이러스를 함유한 세포 용해물을 0.025% pDADMAC (EMD Millipore, 카탈로그 번호 137069.0100)로 처리했다. 다음에, 클라리솔브 60 필터로 세포 용해물을 여과했다. 도 2는 pDADMAC를 세포 용해물에 첨가하여 Ad5 역가를 대폭 감소시킨 결과를 HPCL로 나타내며, 즉, 대조군과 비교시 pDADMAC로 처리한 정화액의 경우 Ad5를 검출할 수 없음을 보여준다 (도 1 및 도 2).

여과 시험의 데이터 요약

공정 단계	변수	대조군 클라리솔브 60	시험군 클라리솔브 60/pDADMAC
용해물	출발 탁도 (NTU)	189	717
	용해물 (g)	5929	2000
	Ad5 용해물 역가 (E10 vp/mL)	9.49	ND
	용해물내 총 vp (E14)	5.63	NA
정화	최종 압력(psi)	16 - 22	9.80
	여액 (g)	6245	1995
	필터 부하 (L/m²)	73.2	869.6
	여액 탁도 (NTU)	16.2	5.37
	Ad5 여액 역가 (E10 vp/mL)	5.95	ND
	여액내 총 vp (E14)	3.72	NA
	단계 수율 (%)	66	NA

이들 데이터는, 예컨대 생산자 세포주를 이용한 AAV 생성 과정과 같이 Ad5 바이러스 제거가 바람직한 경우, pDADMAC가 Ad5 헬퍼-바이러스를 세포 용해물로부터 제거하는데 효과적임을 보여준다.

실시예 2

헬퍼 바이러스의 존재하에 AAV 회수공정 (역가에 부정적인 영향이 없는)에서 pDADMAC의 사용 가능성을 보이기 위해, pDADMAC가 존재하거나 하지 않는 Ad5 함유 세포 용해물을 공지된 양의 AAV을 이용한 스파이크 실험으로 시험했다. 다양한 조건에서 세포 용해물을 원심분리 및 멸균 여과로 정화처리한 뒤, Ad5 (qPCR 및 HPLC)와 AAV(qPCR)에 대해 시험했다. 데이터는 AAV 역가가 0.01 내지 0.1% 농도에서 pDADMAC의 영향을 받지 않는 것을 보여준다. Ad5의 경우, 비록 HPLC의 결과는 Ad5가 검출되지 않는 것을 시사하지만, 이 분석은 qPCR만큼 민감하지는 않다. qPCR 결과는 Ad5 역가가 약 2 내지 3 로그 단위로 감소하는 것을 보였다. 또한, 사용한 pDADMAC의 양에 기초하여 Ad5 감소에 차이가 있는 것으로 관찰되었다. HPLC와 qPCR 결과는 모두, 0.05% 및 0.1% pDADMAC와 비교시 0.01% 및 0.025% pDADMAC일 때 Ad5 제거율이 높았음을 보였다. 이러한 결과를 표 2에 요약했다.

세포 용해 정화처리후 pDADMAC로 처리한 증식 세포배양에서 AAV 및 Ad5 역가를 나타내는 데이터

시험 ID	응집제 (%)	AAV (vp/mL)	탁도 (NTU)	HPLC로 측정한 Ad GFP 역가 (E10 vp/mL)	GFP qPCR 분석 (vg/mL)	AAV qPCR GOI (vg/mL)
T1	0 (대조군)	NA	28.5	9.49	1.17E + 11	NA
T2	0.01	NA	5.12	0	5.51E + 08	NA
T3	0.025	NA	3.63	0	2.36E + 09	NA
T4	0.05	NA	142	4.85	9.33E + 10	NA
T5	0.1	NA	190	4.50	2.02E + 10	NA
T6	0 (대조군)	1.0E11	28.9	8.43	1.43E + 11	4.47E + 10
T7	0.01	1.0E11	5.95	0	2.36E + 09	4.12E + 10
T8	0.025	1.0E11	3.69	0	2.36E + 09	4.46E + 10
T9	0.05	1.0E11	155	4.13	2.62E + 10	4.91E + 10
T10	0.1	1.0E11	186	4.70	4.28E + 10	3.82E + 10

실시예 3

pDADMAC이 일반적으로 AAV 바이러스에 영향을 미치지 않으며, 따라서 기타 공정으로부터 AAV를 수득할 수 있음을 확인하기 위하여, 바큘로바이러스계 시스템을 이용하여 생성한 AAV에 대해 응집 공정을 시험했다. 이 경우, AAV는 곤충 세포에서 생성되었고, pDADMAC를 0, 0.025%, 0.050% 및 0.1% 농도의 배양 용해물에 첨가했다. 각 시료의 AAV를 qPCR로 분석했다 (표 3). 예상과 같이, 대조군 시료와 pDADMAC를 이용하여 수득한 시료 간에 AAV 역가 차이는 관찰되지 않았다.

바큘로바이러스 기반 AAV 생산을 이용하는 경우 AAV qPCR 역가에 대한 pDADMAC의 효과

시험 시료	응집제 농도 (pDADMAC)	qPCR에 의한 AAV 역가 (vg/mL)
대조군	N/A	2.39E + 11
실험 1	0.025	2.23E + 11
실험 2	0.05	2.26E + 11
실험 3	0.1	2.38E + 11

실시예 4

pDADMAC를 또한 재조합 바큘로바이러스(rBV)를 이용하여 바큘로바이러스 시스템에서 시험했다. 0, 0.025% 및 0.1%의 pDADMAC 농도를 갖는 배양 용해물을 시험했다. 각 시료의 재조합 바큘로바이러스(rBV)는 감염성 역가 분석법 (BacPAK)을 이용하여 pDADMAC 처리된 및 미처리된 (표준 필터 - 대조군을 이용하여 수득한) 시료에서 시험했으며, 그 결과를 표 4에 요약했다. 이 실험으로부터 얻은 데이터에서, rBV 감염성 역가는 표준 방법과 비교시 pDADMAC를 이용하여 수득하는 경우, 영향을 받지 않음을 보였다.

바큘로바이러스 역가에 대한 pDADMAC의 영향

시험 시료	응집제 농도 (pDADMAC)	BacPAK 역가 (IFU/mL)
대조군	N/A	7.73E7
실험 1	0.025%	6.32E7
실험 2	0.1%	7.77E7

결론적으로, pDADMAC를 응집제로 사용하면, 생산자 세포주 공정에서 사용한 Ad5 헬퍼 바이러스를 안전하게 제거하는 동시에, (HPLC 측정시 LOD 미만으로) 표적 AAV 역가에는 영향을 미치지 않음을 보여준다 (표 3). 마찬가지로, rBV-기반 시스템에서 생성된 AAV 역가 역시 pDADMAC 응집제 사용에 따른 영향을 받지 않는다 (표 4).

결론

상술한 바와 같은 다양한 구현예나 선택사양을 모두 임의의 어느 하나 및 모든 변형예에 조합할 수 있다. 본 발명은 일부 구현예를 참조하여 구체적으로 예시 및 기술하였으나, 당해 분야의 지식을 가진 자라면 이러한 기술이 단지 예시적인 것으로서, 이에 제한되지 않으며, 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않는 한도에서 형태와 세부 사항에 다양한 변화가 가능함을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 상술한 예시적인 구현예에 제한되지 않으며, 하기의 특허청구범위 및 그의 등가물에 의해서만 한정된다.

학회지 논문, 초록, 공개되거나 이에 상응하는 미국 또는 해외국의 특허출원, 등록 특허 또는 해외국 특허, 또는 그 밖의 기타 문헌들을 포함하여, 여기서 인용된 모든 문헌은 이에 포함된 모든 데이터, 도표, 도면 및 본문을 망라하여 그 내용의 전반을 본원에 참조로서 수록한다.

Claims

아데노-관련 바이러스(AAV) 및 하나 이상의 AAV-헬퍼 바이러스를 함유하는 수성 바이오매스로부터 상기 아데노-관련 바이러스를 정제하는 방법으로서,
(a) 상기 바이오매스를 폴리디알릴 디알킬암모늄 염과 접촉시켜 응집물과 정화액을 형성하고, 상기 응집물은 상기 하나 이상의 AAV-헬퍼 바이러스를 포함하며;
(b) 상기 응집물을 상기 정화액으로부터 제거하고; 및
(c) AAV를 상기 정화액으로부터 추가로 분리하는 단계들을 포함하는 방법.
삭제
제 1항에 있어서,
폴리디알릴 디알킬암모늄 염은 폴리디알릴 디메틸암모늄 염인 방법.
제 1항에 있어서,
폴리디알릴 디알킬암모늄 염은 염화 폴리디알릴 디메틸암모늄(pDADMAC)인 방법.
제 1항에 있어서,
상기 하나 이상의 AAV-헬퍼 바이러스는 아데노바이러스, 헤르페스 심플릭스 바이러스 및 바큘로바이러스로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
삭제
삭제
제 1항, 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 바이오매스는 세포 용해물인 방법.
제 1항, 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리디알릴 디알킬암모늄 염은 상기 바이오매스에 0.01% 내지 0.5% (w/v)의 농도로 존재하는 방법.
제 1항, 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리디알릴 디알킬암모늄 염은 상기 바이오매스에 0.025%, 0.050% 및 0.1% (w/v)으로 이루어진 군에서 선택된 농도로 존재하는 방법.
표적 전이 유전자를 함유하는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 분리하는 방법으로서,
(a) 생산자 세포를 AAV 및 AAV-헬퍼 바이러스를 이용하여 형질주입하여 형질주입된 생산자 세포를 얻고;
(b) 상기 형질주입된 생산자 세포를 배양하고;
(c) 상기 형질주입된 생산자 세포를 용해처리하여 수성 바이오매스를 생성하고;
(d) 상기 바이오매스를 폴리디알릴 디알킬암모늄 염과 접촉시켜 AAV-헬퍼 바이러스를 포함한 응집물 및 AAV를 포함한 정화액을 생성하고; 및
(e) 상기 정화액을 정제 컬럼에 접촉시켜 분리된 AAV를 생성하는 단계들을 포함하는 방법.
표적 전이 유전자를 함유하는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 분리하는 방법으로서,
(a) 생산자 세포를 AAV 및 AAV-헬퍼 바이러스를 이용하여 형질주입하여 형질주입된 생산자 세포를 얻고;
(b) 상기 형질주입된 생산자 세포를 배양하여 수성 바이오매스를 생성하고;
(c) 상기 바이오매스를 폴리디알릴 디알킬암모늄 염과 접촉시켜 AAV-헬퍼 바이러스를 포함한 응집물 및 AAV를 포함한 정화액을 생성하고; 및
(d) 상기 정화액을 정제 컬럼으로 처리하여 분리된 AAV를 생성하는 단계들을 포함하는 방법.
제 11항 또는 제 12항에 있어서,
상기 AAV-헬퍼 바이러스는 아데노바이러스, 헤르페스 심플릭스 바이러스 및 바큘로바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
제 11항 또는 제 12항에 있어서,
폴리디알릴 디알킬암모늄 염은 폴리디알릴 디메틸암모늄 염인 방법.
제 11항 또는 제 12항에 있어서,
폴리디알릴 디알킬암모늄 염은 염화 폴리디알릴 디메틸암모늄(pDADMAC)인 방법.
제 11항 또는 제 12항에 있어서,
상기 AAV-헬퍼 바이러스는 아데노바이러스인 방법.
제 11항 또는 제 12항에 있어서,
상기 AAV-헬퍼 바이러스는 바큘로바이러스인 방법.
제 11항 또는 제 12항에 있어서,
상기 생산자 세포는 HeLa 세포주, CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 조밤나방(Sf9) 세포주인 방법.
제 18항에 있어서,
상기 생산자 세포는 HeLa 세포인 방법.
제 18항에 있어서,
상기 생산자 세포는 조밤나방 세포인 방법
제 11항 또는 제 12항에 있어서,
상기 생산자 세포를 AAV 조립에 필요한 또다른 유전적 요소와 접촉시키는 단계를 더 포함하는 방법으로서, 상기 유전적 요소는 AAV 비구조 단백질, AAV 구조 단백질, 레플리카제 및 캡시드 단백질 코딩 서열로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
삭제
삭제
제 11항 또는 제 12항에 있어서,
AAV는 전이 유전자를 포함하는 방법.
제 24항에 있어서,
상기 전이 유전자는 유전자 치료법 표적인 방법.