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JP2020528743A - 修飾されたｌ−アスパラギナーゼ - Google Patents

修飾されたｌ−アスパラギナーゼ Download PDF

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JP2020528743A JP2019571042A JP2019571042A JP2020528743A JP 2020528743 A JP2020528743 A JP 2020528743A JP 2019571042 A JP2019571042 A JP 2019571042A JP 2019571042 A JP2019571042 A JP 2019571042A JP 2020528743 A JP2020528743 A JP 2020528743A
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Abstract

【課題】本発明は、修飾されたＬ−アスパラギナーゼに関する。【解決手段】本発明は、（ｉ）Ｌ−アスパラギナーゼと（ｉｉ）１以上の（ポリ）ペプチドとの組み合わせである修飾されたタンパク質に関するものであり、（ポリ）ペプチドは単にプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る。修飾されたタンパク質は、Ｌ−アスパラギナーゼと（ポリ）ペプチドとの間の化学的コンジュゲートまたは融合タンパク質として修飾されたタンパク質を発現させることによるものを含むいくつかの方法で形成することができる。本明細書で提供されるのはまた、修飾されたタンパク質をコードする核酸、それを含むベクター及び／または宿主細胞、ならびにそれらの製造のためのプロセスである。修飾されたタンパク質を含む組成物、及び医学、特にがんの治療でのそれらの使用が開示される。本発明の別の態様では、Ｌ−アスパラギナーゼはＥｒｗｉｎｉａに由来することができ、及び／またはそれは配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する。【選択図】なし

Description

本発明は（ｉ）Ｌ−アスパラギナーゼと（ｉｉ）１以上の（ポリ）ペプチドとの組み合わせである修飾されたタンパク質に関するものであり、（ポリ）ペプチドはプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る。修飾されたタンパク質は、Ｌ−アスパラギナーゼと（ポリ）ペプチドとの間での化学的コンジュゲートまたはまたは融合タンパク質として修飾されたタンパク質を発現させることによるものを含むいくつかの方法で形成することができる。本明細書で提供されるのはまた、修飾されたタンパク質をコードする核酸、それを含むベクター及び／または宿主細胞、ならびにそれらの製造のためのプロセスである。修飾されたタンパク質を含む組成物及び医学、特にがんの治療におけるそれらの使用が開示される。本発明の別の態様では、Ｌ−アスパラギナーゼはＥｒｗｉｎｉａに由来し、及び／またはそれは配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する。
Ｌ−アスパラギナーゼとして一般に知られるＬ−アスパラギンアミノ加水分解酵素活性を持つタンパク質は小児における急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の治療に長年にわたって上手く使用されている。ＡＬＬは最も一般的な小児悪性がんである（Ａｖｒａｍｉｓ，（２００５），Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．４４，３６７−３９３）。
Ｌ−アスパラギナーゼはホジキン病、急性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、慢性リンパ性白血病、リンパ肉腫、細網肉腫、及び黒色肉腫を治療するのにも使用されている（Ｋｏｔｚｉａ，（２００７），Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２７，６５７−６６９）。Ｌ−アスパラギナーゼの抗腫瘍活性は、ある特定の悪性細胞がＬ−アスパラギンを合成する能力がないことまたは低下した能力に起因すると考えられている（同文献）。これらの悪性細胞はＬ−アスパラギンの細胞外供給を依存する。しかしながら、Ｌ−アスパラギナーゼ酵素はＬ−アスパラギンのアスパラギン酸とアンモニアへの加水分解を触媒し、それによってＬ−アスパラギンの循環しているプールを枯渇させ、Ｌ−アスパラギンなしではタンパク質合成を行うことができない腫瘍細胞を殺傷する（同文献）。
Ｅ．ｃｏｌｉに由来するＬ−アスパラギナーゼはＡＬＬの治療法で最初に使用された酵素薬であり、米国ではＥｌｓｐａｒ（登録商標）として、または欧州ではＫｉｄｒｏｌａｓｅ（登録商標）及びＬ−アスパラギナーゼＭｅｄａｃ（登録商標）として市販されている。Ｌ−アスパラギナーゼはまた、他の微生物からも単離されており、たとえば、Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質はＥｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉに由来し、クリサンタスパーゼと命名され、Ｅｒｗｉｎａｓｅ（登録商標）として市販されている（Ｗｒｉｓｔｏｎ，（１９８５），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１３，６０８−６１８、Ｇｏｗａｒｄ，（１９９２），Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，２，３３５−３４１）。たとえば、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ３９３７（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＳ６７０２８）、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ＮＣＰＰＢ １１２５（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＣＡＡ３１２３９）、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＰ９２６６６）、及びＥｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｓｕｂｓｐ．ａｒｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＳ６７０２７）を含むＥｒｗｉｎｉａの他の種に由来するＬ−アスパラギナーゼも特定されている。これらＥｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのＬ−アスパラギナーゼは互いに約９１〜９８％のアミノ酸配列同一性を有する一方で、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａのＬ−アスパラギナーゼはＥｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのＬ−アスパラギナーゼとおよそ７５〜７７％アミノ酸配列同一性を有する（Ｋｏｔｚｉａ，（２００７），Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２７，６５７−６６９）。
細菌起源のＬ−アスパラギナーゼは高い免疫原性及び抗原性の潜在力を有し、感作された患者にて穏やかなアレルギー反応からアナフィラキシーショックまで及ぶ有害反応を引き起こすことが多い（Ｗａｎｇ，（２００３），Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１７，１５８３−１５８８）。Ｅ．ｃｏｌｉのＬ−アスパラギナーゼは特に免疫原性であり、静脈内投与または筋肉内投与の後、成人の７８％及び小児の７０％もの高さに達するＥ．ｃｏｌｉのＬ−アスパラギナーゼに対する抗アスパラギナーゼ抗体の存在の報告がある（同文献）。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ及びＥｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉに由来するＬ−アスパラギナーゼはその薬物動態特性で異なり、それぞれ異なる免疫原性プロファイルを有する（Ｋｌｕｇ Ａｌｂｅｒｔｓｅｎ，（２００１），Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１１５，９８３−９９０）。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するＬ−アスパラギナーゼで治療した後に発生する抗体はＥｒｗｉｎｉａに由来するＬ−アスパラギナーゼと交差反応しないことが示されている（Ｗａｎｇ，（２００３），Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１７，１５８３−１５８８）。従って、Ｅｒｗｉｎｉａに由来するＬ−アスパラギナーゼ（クリサンタスパーゼ）はＥ．ｃｏｌｉのＬ−アスパラギナーゼに反応する患者におけるＡＬＬの二次選択治療として使用されている（Ｄｕｖａｌ，（２００２），Ｂｌｏｏｄ，１５，２７３４−２７３９；Ａｖｒａｍｉｓ，（２００５），Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．４４，３６７−３９３）。
微生物のＬ−アスパラギナーゼの投与に伴う免疫原性を低下させる別の試みでは、メトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）によって修飾されているＥ．ｃｏｌｉのＬ−アスパラギナーゼが開発されている。このいわゆるｍＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーまたはＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（Ｅｎｚｏｎ Ｉｎｃ．）として市販されているペガスパルガーゼは１９９４年ＡＬＬの二次選択治療のために米国で最初に認可され、２００６年以来、小児及び成人におけるＡＬＬの一次選択療法のために認可されている。
Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）は、５ｋＤａのｍＰＥＧ−コハク酸スクシンイミジル（ＳＳ−ＰＥＧ）を用いて複数のリシン残基で修飾されているＥ．ｃｏｌｉのＬ−アスパラギナーゼである（米国特許第４，１７９，３３７号）。ＳＳ−ＰＥＧは酵素による加水分解にまたはわずかなアルカリ性ｐＨ値で感受性である不安定なエステル結合を含有する第１世代のＰＥＧ試薬である（米国特許第４，６７０，４１７号）。これらの特性は試験管内及び生体内の双方での安定性を低下させ、薬剤の安全性を損ない得る。
さらに、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するＬ−アスパラギナーゼに対して発生する抗体はＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）と交差反応するであろうことが明らかにされている（Ｗａｎｇ，（２００３），Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１７，１５８３−１５８８）。これらは中和抗体ではなかったが、これらの知見は生体内での交差過敏性または交差不活化の高い可能性を明瞭に示した。実際、報告の１つでは、ペガスパルガーゼ治療を受けた小児の３０〜４１％がアレルギー反応を有した（同文献）。
外見上のアレルギー反応に加えて、「無症状の過敏症」の問題が最近報告されたが、それによって患者は過敏症反応の臨床的な証拠を示すことなく抗アスパラギナーゼ抗体を生じさせる（Ｗａｎｇ，（２００３），Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１７，１５８３−１５８８）。この反応はＥ．ｃｏｌｉのＬ−アスパラギナーゼ及びペガスパルガーゼに対する中和抗体の形成を生じ得るが、過敏症の外見上の兆候がないために、これらの患者はＥｒｗｉｎｉａのＬ−アスパラギナーゼに移行されず、従って、彼らが受ける有効な治療はさらに短い期間である（Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇ，（２００４），Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．２６，２７３−２７４）。
Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのＬ−アスパラギナーゼによる治療は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するＬ−アスパラギナーゼに対する過敏性がある場合に使用されることが多い。しかしながら、ＥｒｗｉｎｉａのＬ−アスパラギナーゼ治療を受けている患者の３０〜５０％もの多くが抗体陽性であることが観察されている（Ａｖｒａｍｉｓ，（２００５），Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．４４，３６７−３９３）。さらに、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのＬ−アスパラギナーゼはＥ．ｃｏｌｉのＬ−アスパラギナーゼよりも短い消失半減期を有するので、それをさらに頻繁に投与しなければならない（同文献）。Ａｖｒａｍｉｓらによる研究では、Ｅｒｗｉｎｉａのアスパラギナーゼは劣った薬物動態特性を伴った（Ａｖｒａｍｉｓ，（２００７），Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．２９，２３９−２４７）。従って、Ｅ．ｃｏｌｉのＬ−アスパラギナーゼ及びペガスパルガーゼはＥｒｗｉｎｉａのＬ−アスパラギナーゼに比べてＡＬＬに対する好ましい一次選択療法となっている。
多数のバイオ医薬品が上手くペグ化され、長年、市販されている。しかしながら、多くの場合、ペグ化したバイオ医薬品は修飾されていないバイオ医薬品と比べて著しく低下した活性を示す。Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａに由来するＬ−アスパラギナーゼの場合、ペグ化は試験管内でのその活性をおよそ５７％に低下させたことが観察されている（Ｋｕｃｈｕｍｏｖａ，（２００７），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（Ｍｏｓｃｏｗ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｂ：Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１，２３０−２３２）。Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａに由来するＬ−アスパラギナーゼはＥｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのＬ−アスパラギナーゼ（クリサンタスパーゼ）に対して約７５％の相同性しか有さない。Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）については、その試験管内の活性はＥ．ｃｏｌｉの修飾されていないＬ−アスパラギナーゼと比べておよそ５０％であることも知られている。
従って、本発明の根底にある技術的課題は、従来技術の治療法、特に一部のペグ化されたアスパラギナーゼの限界及び短所を回避する、たとえば、白血病または非ホジキンリンパ腫のようながんを治療する手段及び方法の提供である。
この技術的課題は特許請求の範囲にて特徴付けられる実施形態の提供によって解決される。
一態様では、本発明は、（ｉ）Ｌ−アスパラギナーゼと（ｉｉ）１以上の（ポリ）ペプチドとを含む修飾されたタンパク質に関するものであり、（ポリ）ペプチドはプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る。好ましい態様では、本発明は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＬ−アスパラギナーゼと（ｉｉ）１以上の（ポリ）ペプチドとを含む修飾されたタンパク質に関するものであり、（ポリ）ペプチドはプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る。
本発明は、とりわけ、以下の項目に関する。
１．（ｉ）Ｌ−アスパラギナーゼと（ｉｉ）１以上の（ポリ）ペプチドとを含む修飾されたタンパク質であって、前記（ポリ）ペプチドがプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る、前記修飾されたタンパク質。
２．前記Ｌ−アスパラギナーゼが配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する項目１に記載の修飾されたタンパク質。
３．前記Ｌ−アスパラギナーゼが配列番号１のアミノ酸配列を有する項目１または２に記載の修飾されたタンパク質。
４．前記修飾されたタンパク質が、未修飾のＬ−アスパラギナーゼのものより高いアスパラギナーゼ活性またはグルタミナーゼ活性を有する項目１〜３のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
５．前記修飾されたタンパク質が、未修飾のＬ−アスパラギナーゼよりも少なくとも約２０％高いＬ−アスパラギン枯渇活性を有する項目１〜４のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
６．前記Ｌ−アスパラギナーゼが四量体である項目１〜５のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
７．前記Ｌ−アスパラギナーゼとポリペプチドとの修飾されたタンパク質であり、前記ポリペプチドがプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る項目１〜６のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
８．前記ポリペプチドが、約１００〜６００のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基、特に約２００〜約４００のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基から成る項目７に記載の修飾されたタンパク質。
９．前記ポリペプチドが、合計約２００のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基、または合計約４００のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基から成る項目７に記載の修飾されたタンパク質。
１０．前記プロリン残基がポリペプチドの約１０％を超えて且つ約７０％未満を構成する項目７〜９のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
１１．前記ポリペプチドが複数のアミノ酸反復を含み、前記反復がプロリン及びアラニンの残基から成り、６以下の連続するアミノ酸残基が同一である項目７〜１０のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
１２．前記ポリペプチドが、アミノ酸配列ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ（配列番号５）または前記配列の全体もしくは一部としての配列の円順列型もしくは多量体（複数可）を含むまたはそれから成る項目７〜１１のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
１３．（ａ）前記ポリペプチドが配列番号７または９で示されるようなアミノ酸配列を含み、またはそれから成り、
（ｂ）前記ポリペプチドが配列番号８または１０で示されるようなヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含み、またはそれから成る
項目７〜１２のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
１４．（ａ）前記修飾されたタンパク質が配列番号１１または１３で示されるようなアミノ酸配列を含み、またはそれから成り、
（ｂ）前記修飾されたタンパク質が配列番号１２または１４で示されるようなヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含み、またはそれから成る
項目７〜１３のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
１５．前記ポリペプチドがランダムコイルのポリペプチドである項目７〜１４のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
１６．前記修飾されたタンパク質がＬ−アスパラギナーゼとポリペプチドとの融合タンパク質である項目７〜１５のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
１７．Ｌ−アスパラギナーゼと、それぞれが独立してペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣである１以上のペプチドとの修飾されたタンパク質であり、
（Ｐ／Ａ）はプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成るアミノ酸配列であり、ＲＮは前記アミノ酸配列のＮ末端アミノ基に連結される保護基であり、
ＲＣは前記アミノ酸配列のＣ末端カルボキシ基にそのアミノ基を介して結合されるアミノ酸残基であり、
各ペプチドは、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸残基ＲＣのカルボキシ基と前記Ｌ−アスパラギナーゼの遊離のアミノ基とによって形成されるアミド結合を介してＬ−アスパラギナーゼにコンジュゲートされ、
前記ペプチドがコンジュゲートされる前記遊離のアミノ基の少なくとも１つは前記Ｌ−アスパラギナーゼのＮ末端αアミノ基ではない、項目１〜６のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
１８．前記アミノ酸配列が合計１５〜４５のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基から成る項目１７に記載の修飾されたタンパク質。
１９．前記アミノ酸配列が２０のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基から成る項目１７または１８に記載の修飾されたタンパク質。
２０．前記アミノ酸配列が４０のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基から成る項目１７または１８に記載の修飾されたタンパク質。
２１．前記プロリン残基が前記アミノ酸配列の約１０％を超えて且つ約７０％を構成する項目１７〜２０のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
２２．前記アミノ酸配列がＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ（配列番号５）またはＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ（配列番号１５）である項目１７〜２１のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
２３．ＲＮがピログルタモイルまたはアセチルであり、及び／または
ＲＣがε−アミノヘキサン酸である項目１７〜２２のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
２４．前記修飾されたタンパク質に含まれるペプチドがランダムコイル構造を採用する項目１７〜２３のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
２５．前記修飾されたタンパク質に含まれるペプチドのすべてが同一である項目１７〜２４のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
２６．前記ペプチドがコンジュゲートされる前記遊離のアミノ基の少なくとも１つが、前記Ｌ−アスパラギナーゼのリシン残基のε−アミノ基である項目１７〜２５のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
２７．前記ペプチドがコンジュゲートされる前記遊離のアミノ基が、前記Ｌ−アスパラギナーゼの任意リシン残基（複数可）のε−アミノ基（複数可）及び前記Ｌ−アスパラギナーゼのＮ末端αアミノ基（複数可）を含む群から選択される項目１７〜２６のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
２８．前記Ｌ−アスパラギナーゼが４つのサブユニットで構成され、項目１５〜２４のいずれか１項で定義されたような９〜１３のペプチドが前記Ｌ−アスパラギナーゼの各サブユニットにコンジュゲートされる項目１７〜２７のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
２９．前記ポリペプチドまたはペプチドが前記修飾されたタンパク質の免疫原性の低下に介在する項目１〜２８のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
３０．項目１〜１６のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質をコードする核酸。
３１．前記核酸が、
（ａ）配列番号１２または１４のヌクレオチド配列を含む核酸、
（ｂ）（ａ）で定義されたようなヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸、及び
（ｃ）（ａ）または（ｂ）で定義されたようなヌクレオチド配列に対する遺伝暗号の結果として縮重である核酸
から成る群から選択される項目３０に記載の核酸。
３２．項目３０または３１に記載の核酸を含むベクター。
３３．項目３０または３１に記載の核酸または項目３２に記載のベクターを含む宿主細胞。
３４．前記宿主細胞がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍから成る群から選択される項目３３に記載の宿主細胞。
３５．項目１〜１６、２９のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質または項目３０もしくは３１に記載の核酸の調製のためのプロセス。
３６．項目３３または３４に記載の宿主細胞を培養することと、培養物または前記細胞から前記修飾されたタンパク質を単離することとを含む項目３５に記載のプロセス。
３７．項目１７〜２９のいずれか１項で定義されたタンパク質を調製するプロセスであって、
前記プロセスが、（ａ）式ＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣ−ａｃｔ（式中、ＲＣ−ａｃｔはＲＣのカルボキシ活性化形態であり、ＲＣ及び（Ｐ／Ａ）は調製される修飾されたタンパク質で定義されたとおりであり、ＲＮは（Ｐ／Ａ）のＮ末端アミノ基に連結される保護基である）の活性化されたペプチドをＬ−アスパラギナーゼとカップリングして、前記Ｌ−アスパラギナーゼとＲＮが保護基であるペプチドとの修飾されたタンパク質を得ることを含む前記プロセス。
３８．前記活性化されたペプチドにおける前記アミノ酸残基ＲＣ−ａｃｔの前記活性化されたカルボキシ基が活性のあるエステル基である項目３７に記載のプロセス。
３９．項目１〜２９のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質または項目３５〜３８のいずれか１項に記載のプロセスによって調製される修飾されたタンパク質を含む組成物。
４０．任意でさらに薬学上許容できる担体（複数可）または賦形剤（複数可）を含む医薬組成物である項目３９に記載の組成物。
４１．薬物として使用するための項目１〜２９のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質または項目３５〜３８のいずれか１項に記載のプロセスによって調製される修飾されたタンパク質、または項目３９もしくは４０に記載の組成物。
４２．患者にて疾患、たとえば、Ｌ−アスパラギンの枯渇によって治療できる疾患の治療で使用するための項目１〜２９のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質または項目３５〜３８のいずれか１項に記載のプロセスによって調製される修飾されたタンパク質、または項目３９もしくは４０に記載の組成物。
４３．患者にてＬ−アスパラギンの枯渇によって治療できる疾患を治療する方法であって、前記方法が、前記患者に有効量の、項目１〜２９のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質または項目３５〜３８のいずれか１項に記載のプロセスによって調製される修飾されたタンパク質、または項目３９もしくは４０に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
４４．Ｌ−アスパラギンの枯渇によって治療できる前記疾患ががんである、項目４２に記載の使用のための修飾されたタンパク質、項目４２に記載の使用のための組成物、または項目４３に記載の方法。
４５．がんの治療での使用のための項目１〜２９のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質、項目３５〜３８のいずれか１項に記載のプロセスによって調製される修飾されたタンパク質、または項目３９もしくは４０に記載の組成物。
４６．がんを治療する方法であって、項目１〜２９のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質、項目３５〜３８のいずれか１項に記載のプロセスによって調製される修飾されたタンパク質、または項目３９もしくは４０に記載の組成物の対象への投与を含む、前記方法。
４７．前記がんが非固形がんである項目４４もしくは４５に記載の使用のための修飾されたタンパク質または項目４４もしくは４５に記載の使用のための組成物、または前記がんが非固形がんである項目４４もしくは４６に記載の方法。
４８．前記非固形がんが白血病または非ホジキンリンパ腫である項目４７に記載の使用のための修飾されたタンパク質もしくは項目４７に記載の使用のための組成物、または前記非固形がんが白血病または非ホジキンリンパ腫である項目４７に記載の方法。
４９．前記白血病が急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）もしくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である項目４８に記載の使用のための修飾されたタンパク質もしくは項目４８に記載の使用のための組成物、または前記白血病が急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）もしくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である項目４８に記載の方法。
５０．前記修飾されたタンパク質が未修飾のＬ−アスパラギナーゼと比べて前記患者にてより低い免疫原性反応を引き起こす、項目４２、４４、４５及び４７〜４９のいずれか１項に記載の使用のための修飾されたタンパク質、または項目４２、４４、４５及び４７〜４９のいずれか１項に記載の使用のための組成物、または項目４３、４４及び４６〜４９のいずれか１項に記載の方法。
５１．前記修飾されたタンパク質が未修飾のＬ−アスパラギナーゼと比べて単回投与の後、生体内でのより長い循環半減期を有する項目４２、４４、４５及び４７〜５０のいずれか１項に記載の使用のための修飾されたタンパク質、または項目４２、４４、４５及び４７〜５０のいずれか１項に記載の使用のための組成物、または項目４３、４４及び４６〜５０のいずれか１項に記載の方法。
５２．前記修飾されたタンパク質が未修飾のＬ−アスパラギナーゼと比べて単回投与の後、より大きなＡＵＣ値を有する項目４２、４４、４５及び４７〜５１のいずれか１項に記載の使用のための修飾されたタンパク質、または項目４２、４４、４５及び４７〜５１のいずれか１項に記載の使用のための組成物、または項目４３、４４及び４６〜５１のいずれか１項に記載の方法。
５３．前記患者が、Ｅ．ｃｏｌｉのＬ−アスパラギナーゼまたはそのペグ化された形態に対して過敏性の既往を有している項目４２、４４、４５及び４７〜５２のいずれか１項に記載の使用のための修飾されたタンパク質、または項目４２、４４、４５及び４７〜５２のいずれか１項に記載の使用のための組成物、または項目４３、４４及び４６〜５２のいずれか１項に記載の方法。
５４．前記患者がＥｒｗｉｎｉａのＬ−アスパラギナーゼに対して過敏性の既往を有している項目４２、４４、４５及び４７〜５３のいずれか１項に記載の使用のための修飾されたタンパク質、または項目４２、４４、４５及び４７〜５３のいずれか１項に記載の使用のための組成物、または項目４３、４４及び４６〜５３のいずれか１項に記載の方法。
５５．前記治療が前記修飾されたタンパク質の静脈内投与を含む項目４２、４４、４５及び４７〜５４のいずれか１項に記載の使用のための修飾されたタンパク質、または項目４２、４４、４５及び４７〜５４のいずれか１項に記載の使用のための組成物、または項目４３、４４及び４６〜５４のいずれか１項に記載の方法。
アミノ基を介したクリサンタスパーゼのＮ末端保護Ｐ／Ａペプチドとのコンジュゲートの化学を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、固相ペプチド合成によって得られた、（それぞれ）２０または４０のＰｒｏ／Ａｌａの残基を含有するＰ／Ａペプチド（配列番号１６及び１７、アミノ酸配列は配列番号５及び１５にて示される）の化学構造を示す。Ｃ末端の化学的活性化の際のペプチドの重合を回避するために、Ｎ末端をピログルタミル（Ｐｇａ）残基で保護した。アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）をペプチドのＣ末端に組み込んでリンカーとした。（Ｃ）非求核塩基であるＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、Ｈｕｎｉｇの塩基）の存在下で、溶媒としてのＤＭＳＯを伴ってＣ末端にてベンゾトリアゾール誘導体であるテトラフルオロホウ酸Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム（ＴＢＴＵ）によって、Ｎ末端保護したＰ／Ａペプチドを活性化する。遊離のヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を放出しながら、その後、ペプチドのＨＯＢｔ活性エステルを用いて、ペプチド結合またはイソペプチド結合の形成を介してＰ／Ａペプチドによってクリサンタスパーゼのアミノ基（リシン残基のε−アミノ基またはＮ末端のα−アミノ基）を誘導体化する。このカップリングステップは、有機溶媒の含量が３０％以下の水溶液（たとえば、ＰＢＳ緩衝液）で実施される。Ｐ／Ａ−クリサンタスパーゼの修飾されたタンパク質は、透析及び／またはクロマトグラフィー（たとえば、イオン交換クロマトグラフィー）によって残留するＰ／Ａペプチド／カップリング試薬から精製されてもよい。 クリサンタスパーゼ／Ｐｇａ−Ｐ／Ａ（２０）−Ａｈｘのカップリング比の最適化を示す図である。実施例１に記載されているように、Ｅ．ｃｏｌｉで産生された組換えクリサンタスパーゼをＰｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）−Ａｈｘペプチド（配列番号１６及び１７、アミノ酸配列は配列番号５及び１５にて示される）とコンジュゲートした。ペプチド対タンパク質の比は１ｍｇのクリサンタスパーゼ当たり３．５ｍｇ〜１０ｍｇの間でのＰ／Ａペプチドで変化させた。各カップリング反応に由来する７μｇのクリサンタスパーゼをゲルに負荷した。さらに、タンパク質のｍｇ当たり０．３〜１０ｍｇのペプチドの比でのカップリング反応のミックスをサイズ基準（「Ｓｔｄ」）として適用した。カップリングしたＰ／Ａペプチドの数は右側で指し示したようなコンジュゲートされていないクリサンタスパーゼから出発しているそのラダーにおけるバンドを数えることによって決定することができる。レーン「ｋＤａ」：Ｐｉｅｒｃｅ（商標）の未染色タンパク質分子量マーカー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。 アニオン交換クロマトグラフィーを介したクリサンタスパーゼ／Ｐｇａ−Ｐ／Ａ（４０）−Ａｈｘペプチドカップリング生成物の精製を示す図である。実施例２に記載されているように、Ｅ．ｃｏｌｉで産生された組換えクリサンタスパーゼをＰｇａ−Ｐ／Ａ（４０）−Ａｈｘペプチド（図１Ｂ）（配列番号１７、アミノ酸配列は配列番号１５にて示される）とコンジュゲートした。ＡＩＸランニング緩衝液（２５ｍＭのホウ酸／ＮａＯＨ、ｐＨ９．０，１ｍＭのＥＤＴＡ）に対する透析の後、８５ｍＬのＳｏｕｒｃｅ（商標）１５Ｑカラムにてアニオン交換クロマトグラフィーを行った（Ａ）。ＮａＣｌ濃度勾配を適用することによって、酵素修飾されたタンパク質は、２８０ｎｍでのＵＶトレースによって明らかにされたように単一の鋭いピークで溶出した。残りのカップリングしなかったペプチド及び２８０ｎｍでのＵＶ吸収を欠いている化学コンジュゲートの他の非タンパク性副産物の分離は２２５ｎｍでのＵＶトレースによってモニターした。（Ｂ）アニオン交換クロマトグラフィーによる精製後のクリサンタスパーゼ／Ｐｇａ−Ｐ／Ａ（４０）−Ａｈｘの修飾されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（レーン１）。タンパク質のｍｇ当たり０．３〜１０ｍｇのペプチドの比でのカップリング反応のミックスをレーン２に適用してクリサンタスパーゼ単量体当たりのカップリングしたＰ／Ａペプチドの数を決定できるようにした。ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｌｕｓの予め染色したマーカー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をレーン「Ｍ」に適用した。 アニオン交換クロマトグラフィーを介したクリサンタスパーゼ／Ｐｇａ−Ｐ／Ａ（２０）−Ａｈｘペプチドカップリング生成物の精製を示す図である。実施例３に記載されているように、Ｅ．ｃｏｌｉで産生された組換えクリサンタスパーゼをＰｇａ−Ｐ／Ａ（２０）−Ａｈｘペプチド（図１Ａ）（配列番号１６、アミノ酸配列は配列番号５にて示される）とコンジュゲートした。ＡＩＸランニング緩衝液（２５ｍＭのホウ酸／ＮａＯＨ、ｐＨ９．０，１ｍＭのＥＤＴＡ）に対する透析の後、８５ｍＬのＳｏｕｒｃｅ（商標）１５Ｑカラムにてアニオン交換クロマトグラフィーを行った（Ａ）。ＮａＣｌ濃度勾配を適用することによって、酵素修飾されたタンパク質は、２８０ｎｍでのＵＶトレースによって明らかにされたように単一の鋭いピークで溶出した。残りのカップリングしなかったペプチド及び２８０ｎｍでのＵＶ吸収を欠いている化学コンジュゲートの他の非タンパク性副産物の分離は２２５ｎｍでのＵＶトレースによって明らかにした。（Ｂ）アニオン交換クロマトグラフィーによる精製後のクリサンタスパーゼ／Ｐｇａ−Ｐ／Ａ（２０）−Ａｈｘの修飾されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（レーン１）。タンパク質のｍｇ当たり０．３〜１０ｍｇのペプチドの比でのカップリング反応のミックスをレーン２に適用してクリサンタスパーゼ単量体当たりのカップリングしたＰ／Ａペプチドの数を決定できるようにした。ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｌｕｓの予め染色したマーカー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をレーン「Ｍ」に適用した。 Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＡＳ化したクリサンタスパーゼの産生のために発現ベクターのクローニングを示す図である。（Ａ）２つの逆に方向付けられたＳａｐＩ制限部位を介したＰＡ＃１ｃ／１ｂ（４００）（配列番号１０）の遺伝子カセットへのシームレスな挿入の後の（Ａ）ｐＡＳＫ７５−ＳａｐＩ−クリサンタスパーゼ（配列番号４）及び（Ｂ）その誘導体ｐＡＳＫ７５−ＰＡ４００−クリサンタスパーゼ（配列番号１４）のプラスミドマップを示す図である。４０１のアミノ酸残基を伴うＰＡ＃１ポリペプチドをコードする反復性の低いヌクレオチド配列及びクリサンタスパーゼの構造遺伝子と同様に細菌のＥｎｘシグナル配列（ＳＰＥｎｘ）のコーディング領域を含む生物学的に／薬理学的に活性がある（プレ）タンパク質ＰＡ＃１（４００）−クリサンタスパーゼ（配列番号１３）の構造遺伝子をｔｅｔプロモーター／オペレーター（ｔｅｔｐ／ｏ）の転写制御下でクローニングする。ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が隣接する発現カセットの外側のプラスミド主鎖は遺伝子発現ベクターｐＡＳＫ７５のそれと同一である（Ｓｋｅｒｒａ，（１９９４），Ｇｅｎｅ，１５１：１３１−１３５）。ＰＡ＃１（２００）（配列番号１１）に融合したクリサンタスパーゼの発現のためのプラスミドをＰＡ＃１ｂ（２００）遺伝子カセット（配列番号１２）を用いて同じ方法でクローニングした。 ＰＡ２００またはＰＡ４００に遺伝子融合した組換えクリサンタスパーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。（Ａ）ペリプラズム抽出（ＰＰＥ）、硫酸アンモニウム沈殿（ＡＳＰ）及びアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）の後の成熟ＰＡ＃１（４００）−クリサンタスパーゼ融合タンパク質（配列番号１３）の１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析。（Ｂ）ゲルは精製した成熟ＰＡ＃１（２００）−クリサンタスパーゼ（レーン１）（配列番号１１）またはＰＡ＃１（４００）−クリサンタスパーゼ（レーン２）（配列番号１３）の５μｇの試料を示す。マーカータンパク質（Ｍ）のサイズを左に示す。ＰＡ＃１（２００）−クリサンタスパーゼ及びＰＡ＃１（４００）−クリサンタスパーゼの融合タンパク質はそれぞれ約１０５ｋＤａ（レーン１）及び２００ｋＤａ（レーン２）の見かけの分子サイズを持つ単一の均質なバンドとして現れる。不十分なＳＤＳ結合に起因して、ＰＡ融合タンパク質は一般に、たとえば、ＰＡ＃１（２００）−クリサンタスパーゼ単量体について算出された質量５１ｋＤａまたはＰＡ＃１（４００）−クリサンタスパーゼ単量体について算出された質量６７ｋＤａよりも有意に大きいサイズを示す（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ，（２０１３），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２６：４８９−５０１）。 ＰＡＳ化したクリサンタスパーゼ変異体のサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。（Ａ）未修飾のクリサンタスパーゼ、ならびにＰｇａ−Ｐ／Ａ（２０）−ＡｈｘまたはＰｇａ−Ｐ／Ａ（４０）−Ａｈｘ（それぞれ実施例３及び２に記載されている）のいずれかに化学的にコンジュゲートされたクリサンタスパーゼ、及びＰＡ＃１（２００）（配列番号７）またはＰＡ＃１（４００）（配列番号９）のポリペプチド（実施例５に記載されている）に遺伝子融合した組換えクリサンタスパーゼの溶出特性の重ね合わせである。１ｍｇ／ｍＬの濃度での１５０μＬの精製タンパク質をＰＢＳ緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）Ｓ２００ １０／３００ＧＬカラムにか供した。２８０ｎｍでの吸収をモニターし、各クロマトグラフィー設定でのピークを１００％に対して正規化した。（Ｂ）ＳｕｐｅｒｄｅｘＳ２００ １０／３００ＧＬカラムを用いた（Ａ）からのクロマト図についての較正曲線である。マーカータンパク質（オボアルブミン：４３．０ｋＤａ、ウシ血清アルブミン：６６．３ｋＤａ、アルコール脱水素酵素：１５０ｋＤａ、β−アミラーゼ：２００ｋＤａ、アポフェリチン：４４０ｋＤａ）の分子量の対数をその溶出体積（黒丸）に対してプロットし、直線によって当てはめた。四量体クリサンタスパーゼ、そのＰＡ＃１ペプチド修飾タンパク質及びその組換えＰＡ＃１融合タンパク質（黒四角）の観察された溶出体積から、それらの見かけの分子サイズを以下のように決定した。クリサンタスパーゼ：１０５ｋＤａ（真の質量１４０ｋＤａ）、クリサンタスパーゼ／Ｐｇａ−Ｐ／Ａ（２０）−Ａｈｘ修飾タンパク質：５３１ｋＤａ（真の質量２２８ｋＤａ）、クリサンタスパーゼ／Ｐｇａ−Ｐ／Ａ（４０）−Ａｈｘ修飾タンパク質：８２０ｋＤａ（真の質量２８４ｋＤａ）、ＰＡ２００−クリサンタスパーゼ：５９５ｋＤａ（真の質量２０５ｋＤａ）、ＰＡ４００−クリサンタスパーゼ：１０８７ｋＤａ（真の質量２６９ｋＤａ）。これらのデータは、化学的にコンジュゲートされたＰ／Ａペプチド及びＰＡ＃１ポリペプチドとの遺伝子融合は双方とも大きく拡大された流体力学的体積を付与することを示している。 ＰＡＳ化したクリサンタスパーゼ変異体のＥＳＩ−ＭＳ解析を示す図である。（Ａ）実施例３に記載されているように調製した精製クリサンタスパーゼ／Ｐｇａ−Ｐ／Ａ（２０）−Ａｈｘ修飾タンパク質の電子スプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって得られた生のｍ／ｚスペクトルは質量スペクトルを得ることにデコンボリューションされた（Ｂ）。観察された質量種は９〜１４のペプチドとコンジュゲートされたクリサンタスパーゼに明確に割り当てることができた（表３参照）。しかしながら、主要なピークは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるペプチドカップリングの比の決定に相当するものである、１０〜１３のペプチドを伴うタンパク質種についてのみ観察された（図４Ｂ参照）。（Ｃ）及び（Ｅ）は実施例５で調製したＰＡ２００−クリサンタスパーゼ及びＰＡ４００−クリサンタスパーゼの融合タンパク質の生のｍ／ｚスペクトルを示す。デコンボリューションした質量スペクトル（Ｄ）及び（Ｆ）はそれぞれ５１１６４．７５Ｄａ及び６７１９９．１７Ｄａの質量を示したが、それは５１１６３．５８Ｄａの算出された質量にほぼ完璧に対応する。 オスＣＤ−１マウスへの単回ＩＶボーラス投与に続く時間プロファイルに対する平均（±ＳＤ）血漿濃度を示す図である。図はオスマウスへの単回ＩＶボーラス投与に続くＰＡ・クリサンタスパーゼのコンジュゲートの血漿アスパラギナーゼ活性を示す。
一態様では、本発明は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する組換えＬ−アスパラギナーゼと、（ｉｉ）１以上の（ポリ）ペプチドとを含む修飾されたタンパク質に関するものであり、（ポリ）ペプチドはプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る。本明細書で提供されている「修飾されたタンパク質」、「Ｌ−アスパラギナーゼ」、「（ポリ）ペプチド」等の用語に関して本明細書で与えられる説明及び定義が準用される。「組換えＬ−アスパラギナーゼ」という用語は本明細書で使用されるとき、天然のＥｒｗｉｎｉａのＬ−アスパラギナーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＬ−アスパラギナーゼの組換え形態を指す。「組換えの」という用語は組換えで産生されたＬ−アスパラギナーゼ、たとえば、Ｌ−アスパラギナーゼをコードする核酸を含む宿主細胞にて産生されるＬ−アスパラギナーゼを指し得る。
修飾されたタンパク質はさらに向上した血漿半減期を示すので、コンジュゲートされていない各Ｌ−アスパラギナーゼと比べて作用の延長された持続時間を示す。これは投与頻度、従って副作用の負荷の減少を可能にする。本発明はまた本明細書に記載されているような修飾されたタンパク質を調製するプロセスも提供する。
ある特定の態様では、本発明は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列に対する少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するＬ−アスパラギナーゼと、（ｉｉ）１以上の（ポリ）ペプチドとを含む修飾されたタンパク質に関するものであり、（ポリ）ペプチドはプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る。「プロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る」という用語は、少なくとも１つのプロリン残基と少なくとも１つのアラニン残基が存在する、すなわち、少なくとも１つのプロリン残基と少なくとも１つのアラニン残基の双方が存在しなければならないことを意味する。好ましい態様では、本発明は、(ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えＬ−アスパラギナーゼと、（ｉｉ）１以上の（ポリ）ペプチドとを含む修飾されたタンパク質に関するものであり、（ポリ）ペプチドはプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る。一態様では、Ｌ−アスパラギナーゼは四量体（すなわち、４つのサブユニットまたは単量体で構成されるＬ−アスパラギナーゼ）である。例となるサブユニットまたは単量体は配列番号１のアミノ酸配列を有する。
一態様では、（ポリ）ペプチドは（すなわち、ポリペプチドまたはペプチド）は、本明細書に記載されている修飾されたタンパク質の免疫原性の低下、たとえば、コンジュゲートされていないＬ−アスパラギナーゼと比べた修飾されたタンパク質の免疫原性の低下に介在する。
添付の実施例で示すように、未修飾のクリサンタスパーゼと比べてＰＡ＃１（２００）−クリサンタスパーゼタンパク質は１０９％の、及びＰＡ＃１（４００）クリサンタスパーゼタンパク質は１１８％の酵素活性を有した。実施例５を参照のこと。このことは、本明細書に記載されているようなアスパラギナーゼのポリペプチドとの融合が酵素活性に影響を及ぼさないことを実証している。驚くべきことに、活性はＰＡ−ポリペプチドの長さと共に上昇さえした。
さらに一般的に、本明細書で提供されている修飾されたタンパク質は未修飾のアスパラギナーゼと比べて同じまたは実質的に同じ（酵素）活性を有する。（酵素）活性はＮｅｓｓｌｅｒアッセイによって評価されてもよい。Ｎｅｓｓｌｅｒアッセイの詳細は添付の実施例で提供されており、及び／または従来技術、たとえば、Ｍａｓｈｂｕｒｎ，（１９６３），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２，５０（全体が参照によって本明細書に組み入れられる）にて開示されている。従って、一態様では、本明細書で提供されている修飾されたタンパク質はＮｅｓｓｌｅｒアッセイによって評価されたとき、未修飾のアスパラギナーゼと比べて同じまたは実質的に同じ（酵素）活性を有する。「未修飾のアスパラギナーゼ」という用語は本明細書で使用されるとき、天然のアスパラギナーゼ、すなわち、本明細書で定義されているような（ポリ）ペプチドとの融合／コンジュゲートによって修飾されていないアスパラギナーゼを指す。
たとえば、「未修飾のアスパラギナーゼ」は配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＬ−アスパラギナーゼである。好ましい態様では、「未修飾のアスパラギナーゼ」は配列番号１のアミノ酸配列を有するＬ−アスパラギナーゼである。
一部の態様では、本明細書で提供されている修飾されたタンパク質は未修飾のＬ−アスパラギナーゼの（酵素）活性よりも高い（酵素）活性を有する。（酵素）活性は、たとえば、Ｎｅｓｓｌｅｒアッセイによって評価されてもよい。Ｎｅｓｓｌｅｒアッセイの詳細は添付の実施例で提供されており、及び／または従来技術、たとえば、Ｍａｓｈｂｕｒｎ，（１９６３），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２，５０（全体が参照によって本明細書に組み入れられる）にて開示されている。従って、一態様では、本明細書で提供されている修飾されたタンパク質はＮｅｓｓｌｅｒアッセイによって評価されたとき、未修飾のＬ−アスパラギナーゼの（酵素）活性よりも高い（酵素）活性を有する。「未修飾のアスパラギナーゼ」という用語は本明細書で使用されるとき、天然のアスパラギナーゼ、すなわち、本明細書で定義されているような（ポリ）ペプチドとの融合／コンジュゲートによって修飾されていないアスパラギナーゼを指す。たとえば、「未修飾のアスパラギナーゼ」は配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＬ−アスパラギナーゼである。好ましい態様では、「未修飾のアスパラギナーゼ」は配列番号１のアミノ酸配列を有するＬ−アスパラギナーゼである。たとえば、修飾されたタンパク質は、特にＮｅｓｓｌｅｒアッセイによって評価されるとき、Ｌ−アスパラギナーゼの（酵素）活性よりも、特に未修飾のアスパラギナーゼ（酵素）活性よりも少なくとも５％及び／または３０％まで（たとえば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、（またはそれ以上）高くあり得る（酵素）活性を有する。上記の説明は特に本明細書で提供されている融合タンパク質（たとえば、Ｌ−アスパラギナーゼとポリペプチドの修飾されたタンパク質であって、ポリペプチドがプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成るもの）に適用されるが、それらに限定されない。
一部の態様では、修飾されたタンパク質は未修飾のＬ−アスパラギナーゼのアスパラギナーゼ活性またはグルタミナーゼ活性よりも高いアスパラギナーゼ活性またはグルタミナーゼ活性を有する。たとえば、修飾されたタンパク質は、特にＮｅｓｓｌｅｒアッセイによって評価されるとき、Ｌ−アスパラギナーゼのアスパラギナーゼ活性またはグルタミナーゼ活性よりも、特に未修飾のＬ−アスパラギナーゼのアスパラギナーゼ活性またはグルタミナーゼ活性よりも少なくとも５％及び／または３０％まで（たとえば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、（またはそれ以上））高いアスパラギナーゼ活性またはグルタミナーゼ活性を有することができる。一部の実施形態では、アスパラギナーゼ活性またはグルタミナーゼ活性はＮｅｓｓｌｅｒアッセイによって測定されてもよい。アスパラギンの加水分解の速度は放出されるアンモニアを測定することによって決定されてもよく、本明細書で開示されている修飾されたタンパク質を用いてそれから放出されるアンモニアの量を、Ｌ−アスパラギナーゼまたは未修飾のＬ−アスパラギナーゼを用いたアンモニアの量と比較してもよい。追加の態様では、前記修飾されたタンパク質は未修飾のＬ−アスパラギナーゼのＬ−アスパラギン枯渇活性よりも高いＬ−アスパラギン枯渇活性を有する。たとえば、修飾されたタンパク質は、特にＮｅｓｓｌｅｒアッセイによって評価されるとき、Ｌ−アスパラギナーゼのＬ−アスパラギン枯渇活性よりも、特に未修飾のＬ−アスパラギナーゼのＬ−アスパラギン枯渇活性よりも少なくとも５％及び／または３０％まで（たとえば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、（またはそれ以上））高いＬ−アスパラギン枯渇活性を有する。本発明はまた、修飾されたタンパク質を含む医薬組成物、及び治療法で使用するための、薬物として使用するための、または医学で使用するための修飾されたタンパク質または医薬組成物にも関する。
一般に、修飾されたタンパク質は化学的カップリングまたは遺伝子融合（別のタンパク質またはペプチドとのコンジュゲートの場合）によって得ることができる。「融合タンパク質」という用語は本明細書で使用されるとき、（ｉ）Ｌ−アスパラギナーゼと（ｉｉ）１以上のポリペプチドとを含む修飾されたタンパク質に主として関し、ポリペプチドはプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る。この文脈では、ポリペプチドは約２００〜約４００のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基から成ることができる。そのようなポリペプチドの例となるアミノ酸配列は配列番号７または９にて示されている。
修飾されたタンパク質が化学的カップリングによって得られるならば、それは（ｉ）Ｌ−アスパラギナーゼと（ｉｉ）１以上のペプチドとを含み、ペプチドはプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る。この文脈では、ペプチドは、合計１０〜１００のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基、約１５〜約６０のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基、約１５〜約４５のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基、たとえば、約２０〜約４０、たとえば、２０のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基、または４０のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基から成ることができる。そのようなペプチドの例となるアミノ酸配列は、ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ（配列番号５）またはＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ（配列番号１５）である。
特に「修飾されたタンパク質」という用語が化学的カップリングによってまたは融合タンパク質として得られる修飾されたタンパク質を指すならば、すなわち、主としてそれが（ｉ）Ｌ−アスパラギナーゼと（ｉｉ）１以上の（ポリ）ペプチドとを含むのであれば、「修飾されたタンパク質」という用語は本明細書で使用されるとき、「コンジュゲート」という用語と相互交換可能に使用することができ、（ポリ）ペプチドはプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る。同様に、「未修飾の」及び「コンジュゲートされていない」という用語は本明細書では相互交換可能に使用することができる。
本発明はまた、（ａ）式ＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣ−ａｃｔの活性化されたペプチドをＬ−アスパラギナーゼとカップリングして、Ｌ−アスパラギナーゼとＲＮが保護基であるペプチドとの修飾されたタンパク質を得ることを含む、修飾されたタンパク質を調製するプロセスにも関するものであり、式中、ＲＣ−ａｃｔはＲＣのカルボキシ活性化形態であり、ＲＣ及び（Ｐ／Ａ）は調製される修飾されたタンパク質にて定義されたとおりであり、ＲＮは（Ｐ／Ａ）のＮ末端アミノ基に連結される保護基である。
添付の実施例（参照．実施例１、表１）では、修飾されたタンパク質は種々の質量比の活性化されたペプチドとアスパラギナーゼとを用いて調製することができることが実証されている。たとえば、１０：１（活性化ペプチド：アスパラギナーゼ）、７．５：１、５：１または３．５：１の質量比を使用することができる。５：１以下の比を使用すれば、修飾されたタンパク質の（酵素）活性が最も高いことが観察された（参照．実施例１、表２）。従って、上記の本明細書に記載されているプロセスでは、５：１以下、たとえば、５：１、４：１、３．５：１または３：１の活性化ペプチド：アスパラギナーゼの質量比を使用することが有利であり得る。「質量比」という用語は本明細書で使用されるとき、本明細書で定義されているような活性化ペプチドと本明細書で定義されているようなアスパラギナーゼ（たとえば、配列番号１で示されるようなアスパラギナーゼ及び配列番号１に対して少なくとも８５％の同一性を持つタンパク質）の分子量の比を指す。「分子量」は通常、科学単位ダルトン（Ｄａ）を用いて本明細書で示される。ダルトン（Ｄａ）で本明細書にて示されるようなアスパラギナーゼまたはペプチドの分子量単位は統一原子質量単位（ｕ）の代替名であることは周知である。従って、たとえば、５００Ｄａの分子量は５００ｇ／モルと同等である。「ｋＤａ」（キロダルトン）という用語は１０００Ｄａを指す。
アスパラギナーゼまたはペプチドの分子量は、当該技術で既知の方法、たとえば、質量分光法（たとえば、エレクトロスプレーイオン化質量分析、ＥＳＩ−ＭＳ、またはマトリクス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、ゲル電気泳動（たとえば、ドデシル硫酸ナトリウムを用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、流体力学法（たとえば、ゲル濾過／サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＥＣ、または勾配沈殿）、または動的（ＤＬＳ）もしくは静的な光散乱（たとえば、多角光散乱、ＭＡＬＳ）を用いて決定することができ、あるいは、アスパラギナーゼまたはペプチドの分子量はアスパラギナーゼまたはペプチドの既知のアミノ酸配列（及び存在するならば、既知の翻訳後修飾）から算出することができる。好ましくは、アスパラギナーゼまたはペプチドの分子量は質量分光法を用いて決定される。
本発明はまた、修飾されたタンパク質、または修飾されたタンパク質をコードする核酸の調製のためのプロセスにも関する。一部の態様では、プロセスは、たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＰｉｃｈｉａ Ｐｉｓｔｏｒｉｓのような酵母、ならびにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ及び以下の属、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ及びＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓの細菌宿主を含む細菌、放線菌、真菌、藻類、及び他の微生物を含む群から選択される宿主にてＬ−アスパラギナーゼを産生させることを含む。グルタミナーゼ活性を欠いているアスパラギナーゼの変異体を発現するＮｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ａｌｂａ（全体が参照によって本明細書に組み入れられるＭｅｅｎａ，ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｙｓｔ．Ｅｎｇ．Ｏｃｔｏｂｅｒ，２０１４，Ａｒｔｉｃｌｅ）及び全体が参照によって本明細書に組み入れられるＳａｖｉｔｒｉ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｉｎｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２，１８４−１９４にて開示されたものを含む他の宿主が当業者に既知である。
修飾されたタンパク質は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＬ−アスパラギナーゼと（ｉｉ）１以上のポリペプチドとを含む融合タンパク質であることができ、ポリペプチドはプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る。
プロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成るポリペプチドにおけるプロリン残基はポリペプチドの約１０％を超えて且つ約７０％未満を構成してもよい。従って、ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の総数の１０％〜７０％がプロリン残基であることが好ましく、さらに好ましくはポリペプチドに含まれるアミノ酸残基の総数の２０〜５０％がプロリン残基であり、一層さらに好ましくは、ポリペプチドに含まれるアミノ酸残基の総数の３０％〜４０％（たとえば、３０％、３５％または４０％）がプロリン残基である。
ポリペプチドは複数のアミノ酸反復を含んでもよく、前記反復はプロリン残基及びアラニン残基から成り、６以下の連続するアミノ酸残基が同一である。特に、ポリペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ（配列番号５）または配列の全体または一部として配列の円順列型または多量体（複数可）を含んでもよく、またはそれから成ってもよい。
好ましくは、ポリペプチドは配列番号７もしくは９で示されるようなアミノ酸配列を含むもしくはそれから成り、またはポリペプチドは配列番号８もしくは１０で示されるようなヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むもしくはそれから成る。修飾されたタンパク質は、（ａ）配列番号１１もしくは１３で示されるようなアミノ酸配列を含むもしくはそれから成り、または（ｂ）配列番号１２もしくは１４で示されるようなヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むもしくはそれから成ることが本明細書では好ましい。一態様では、ポリペプチドはランダムコイルポリペプチドである。
一部の態様では、修飾されたタンパク質、たとえば、融合タンパク質はコンジュゲートされていないＬ−アスパラギナーゼのアスパラギナーゼ活性またはグルタミナーゼ活性よりも高いアスパラギナーゼ活性またはグルタミナーゼ活性を有する。たとえば、修飾されたタンパク質は、特にＮｅｓｓｌｅｒアッセイによって評価されるとき、未修飾のＬ−アスパラギナーゼのそれよりも少なくとも５％及び／または３０％まで（たとえば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、（またはそれ以上））高いアスパラギナーゼ活性またはグルタミナーゼ活性を有することができる。さらなる態様では、修飾されたタンパク質、たとえば、融合タンパク質におけるＬ−アスパラギナーゼはアミン結合によってポリペプチドの末端残基に直接、共有結合され、及び／または融合タンパク質は組換えで製造される。好ましい態様では、修飾されたタンパク質、たとえば、融合タンパク質はＬ−アスパラギナーゼとポリペプチドとの間にリンカーを含む。例となるリンカーはアラニンアミノ酸残基であってもよい。本発明はまた、修飾されたタンパク質、たとえば、融合タンパク質を含む医薬組成物、または治療法におけるその使用、または薬物としての使用のための医薬組成物、または医学における使用のための医薬組成物にも関する。
本発明は、本明細書で定義されているような修飾されたタンパク質、特に融合タンパク質をコードする核酸にも関する。好ましくは、核酸は、（ａ）配列番号１２または１４を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子、（ｂ）（ａ）において定義されているようなヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子、及び（ｃ）（ａ）において定義されているようなヌクレオチド配列に対する遺伝暗号の結果として縮重である核酸分子から成る群から選択される。
本発明の一態様はさらに、本明細書で定義されているような修飾されたタンパク質または本明細書で定義されているような核酸の調製のためのプロセスに関する。プロセスは本明細書で定義されているような宿主細胞を培養することと、培養物または前記細胞から前記修飾されたタンパク質を単離することとを含んでもよい。本明細書で定義されているような修飾されたタンパク質、特に融合タンパク質を調製するプロセスは、修飾されたタンパク質、特に融合タンパク質の発現を引き起こす条件下で修飾されたタンパク質、特に融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターで形質転換された宿主細胞またはそのベクターを含む宿主細胞を培養することを含むことができる。一部の態様では、宿主細胞は上で列挙した群から選択される。
本発明はさらに、患者にてＬ−アスパラギンの枯渇によって治療できる疾患を治療する方法に関するものであり、前記方法は前記患者に有効量の、本明細書で定義されているような修飾されたタンパク質、たとえば、融合タンパク質を投与することを含む。Ｌ−アスパラギンの枯渇によって治療できる疾患はがんであり得る。本明細書で定義されているような修飾されたタンパク質は、コンジュゲートされていないＬ−アスパラギナーゼと比べて患者にて低い免疫原性反応を引き出し得、コンジュゲートされていないＬ−アスパラギナーゼと比べて単回投与の後、生体内での長い循環半減期を有し得、及び／またはＬ−アスパラギナーゼ（特にコンジュゲートされていないＬ−アスパラギナーゼ）と比べて単回投与の後、大きなＡＵＣ値を有し得る。
本発明によって解決される課題は、試験管内での高い生物活性、安定なタンパク質・修飾因子の結合、生体内での長い半減期、たとえば、反復投与に続くＬ−アスパラギナーゼ製剤に対する抗体反応の低下または消失によって証拠付けされるような有意に低下した免疫原性、及び／または、たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉに由来しないＬ−アスパラギナーゼを用いた第１選択治療に感受性を発生している患者のための二次選択治療としての有用性を持つＬ−アスパラギナーゼ製剤の提供であると見なすことができる。
この課題は、特許請求の範囲にて特徴付けられる実施形態によって、特に、Ｌ−アスパラギナーゼと、修飾因子、すなわち、（ｉｉ）（ポリ）ペプチドがプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る１以上の（ポリ）ペプチドとを含む修飾されたタンパク質を提供することによって、及びそれを調製する方法及びそれを使用する方法を提供することによって本発明に従って解決される。
一態様では、本明細書に記載されているのは、未修飾のＬ−アスパラギナーゼタンパク質と比べて改善された薬理学的特性を持つ修飾されたＬ−アスパラギナーゼである。
「修飾されたＬ−アスパラギナーゼ」という用語は本明細書で使用されるとき、本明細書で定義され、記載されているような「（ポリ）ペプチドがプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る、（ｉ）Ｌ−アスパラギナーゼと（ｉｉ）１以上の（ポリ）ペプチドとを含む修飾されたタンパク質」を指す。本発明の一態様では、Ｌ−アスパラギナーゼは、Ｅｒｗｉｎｉａに由来し、配列番号１に対して少なくとも８５％の同一性を有する。
本明細書に記載されている修飾されたＬ−アスパラギナーゼ、たとえば、（ポリ）ペプチドがプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る１以上の（ポリ）ペプチドにコンジュゲートされたまたは融合されたＬ−アスパラギナーゼは、特に、Ｅｒｗｉｎｉａ及び／またはＥ．ｃｏｌｉに由来するＬ−アスパラギナーゼまたはペグ化Ｌ−アスパラギナーゼ、またはＥｒｗｉｎｉａに由来する未修飾のＬ−アスパラギナーゼによる治療に過敏性（たとえば、アレルギー反応または無症状の過敏性）を示す患者における使用のための治療剤として役立つ。本明細書に記載されている修飾されたＬ−アスパラギナーゼはまた、疾患の再発、たとえば、ＡＬＬの再発を有している及び別の形態のアスパラギナーゼで以前治療されたことがある患者における使用のための治療剤としても有用である。
Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉとしても知られる）はＤｉｃｋｅｙａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉと改名されている。従って、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ及びＤｉｃｋｅｙａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉという用語は本明細書では相互交換可能に使用される。
特別に定義されない限り、本明細書で使用される用語は当該技術での普通の意味に従って理解される。
本明細書で使用されるとき、文脈が別様に必然的に決定しない限り、用語「含む（ｉｎｌｕｃｄｉｎｇ）」は「限定せずに含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｗｉｔｈｏｕｔ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）」を意味し、単数で使用される用語は複数を含むものとし、逆もまた同様である。
本明細書で使用されるとき、用語、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を有する」という用語、またはそれらの文法的変形は、述べられた特徴、完全体、ステップまたは成分を特定すると解釈されるべきであるが、１以上の追加の特徴、完全体、ステップ、成分またはそれらの群の追加を排除しない。「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」／「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」／「〜を有する」という用語は「〜から成る」及び「実質的に〜から成る」を包含する。従って、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」／「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」／「〜を有する」という用語が本明細書で使用されるときはいつでも、それらは「実質的に〜から成る」または好ましくは「〜から成る」によって置き換えることができる。
「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」／「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」／「〜を有する」という用語は任意のさらなる成分（または同様の特徴、完全体、ステップ、等）が存在することができることを意味する。
「〜から成る」はさらなる成分（または同様の特徴、完全体、ステップ、等）が存在できないことを意味する。
「実質的に〜から成る」またはその文法的変形は本明細書で使用されるとき、述べられた特徴、完全体、ステップまたは成分を特定すると解釈されるべきであるが、追加の特徴、完全体、ステップ、成分またはそれらの群が請求される生成物、組成物、装置または方法、等の基本的な特徴及び新規の特徴を物質的に変化させない場合に限り、１以上の追加の特徴、完全体、ステップ、成分またはそれらの群の追加を排除しない。
従って、「実質的に〜から成る」は、具体的なさらなる成分（または同様の特徴、完全体、ステップ、等）、すなわち、生成物、組成物、装置または方法の本質的な特徴に物質的に影響を及ぼさないものは存在できることを意味する。言い換えれば、「実質的に〜から成る」という用語（用語「実質的に〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」と相互交換可能に本明細書で使用することができる）は、生成物、組成物、装置または方法の本質的な特徴が他の成分の存在によって物質的に影響を受けないという条件で、必須の成分（または同様の特徴、完全体、ステップ、等）に加えて生成物、組成物、装置または方法にて他の成分の存在を許す。
本明細書で使用されるとき、用語「約」は本明細書で別様に指示されない限り、±１０％を指す。
本明細書で使用されるとき、「ａ」または「ａｎ」は１以上を意味し得る。
本明細書で使用されるとき、「アスパラギンの枯渇によって治療できる疾患」という用語は、状態または疾病に関与するか、その原因となる細胞がＬ−アスパラギンを合成する能力を欠いているまたは低下した能力を有する状態または疾病を指す。Ｌ−アスパラギンの枯渇または喪失は部分的であることができ、または実質的に完全で（たとえば、当該技術で既知である方法及び装置を用いて検出できないレベルまで）あることができる。
本明細書で使用されるとき、「治療上有効な量」という用語は所望の治療効果を生じるのに必要とされるタンパク質（たとえば、アスパラギナーゼまたはその修飾されたタンパク質）の量を指す。
本明細書で使用されるとき、「Ｌ−アスパラギナーゼ」という用語はＬ−アスパラギンアミノ加水分解酵素活性を有する酵素である。Ｌ−アスパラギナーゼの酵素活性は、アスパラギンからアスパラギン酸とアンモニアへの脱アミド化だけでなく、グルタミンからグルタミン酸とアンモニアの脱アミド化も含み得る。アスパラギナーゼは通常４つの単量体で構成される（が、一部は５つまたは６つで報告されている）。各単量体は約３２，０００〜約３６，０００ダルトンであることができる。
微生物から既知の方法によって単離された多数のＬ−アスパラギナーゼタンパク質が当該技術で同定されている（たとえば、全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｓａｖｉｔｒｉ及びＡｚｍｉ，Ｉｎｄｉａｎ Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２，（２００３），１８４−１９４を参照のこと）。最も広く使用され、市販されているＬ−アスパラギナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＥｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉに由来し、その双方は５０％以下の構造的相同性を共有する。
以下は本発明に従って使用される「Ｌ−アスパラギナーゼ」に関する。Ｅｒｗｉｎｉａ種間では、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉとＥｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａに由来する酵素の間で通常、７５〜７７％の配列同一性が報告され、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉの異なる亜種間ではおよそ９０％の配列同一性が見いだされた（全体が参照によって本明細書に組み入れられるＫｏｔｚｉａ，（２００７），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２７，６５７−６６９）。一部の代表的なＥｒｗｉｎｉａのＬ−アスパラギナーゼには、たとえば、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ＮＣＰＰＢ１０６６に対する配列同一性のパーセントを開示している以下の表１で提供されているものが挙げられる。
表１のＥｒｗｉｎｉａのＬ−アスパラギナーゼの配列及びＧｅｎＢａｎｋの登録は参照によって本明細書に組み入れられる。治療法で使用される例となるＬ−アスパラギナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉから、及びＥｒｗｉｎｉａ、具体的にＥｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉから単離されるＬ−アスパラギナーゼである。
Ｌ−アスパラギナーゼは微生物から単離される天然の酵素であってもよい。それらは、Ｅ．ｃｏｌｉのような微生物を作り出す組換え酵素技術によっても製造することもできる。例として、本発明の修飾されたタンパク質で使用されるタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ株で産生される組換えタンパク質、好ましくは、組換えＥ．ｃｏｌｉ株で産生されるＥｒｗｉｎｉａ種、特にＥｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉに由来するタンパク質であることができる。
酵素はその比活性によって同定することができる。従って、この定義には、他の生物、さらに詳しくは他の微生物にも存在する定義された比活性を有するポリペプチドすべてが含まれる。類似の活性を持つ酵素は、ＰＦＡＭまたはＣＯＧとして定義される特定のファミリーへのグループ分けによって同定できることが多い。ＰＦＡＭ（配列比較のタンパク質ファミリーのデータベース及び隠れマルコフモデル、ｐｆａｍ．ｓａｎｆｆｅｒａｃ．ｕｋｌ）はタンパク質の配列比較の大きな収集を表す。各ＰＦＡＭは、複数の配列比較を視覚化する、タンパク質のドメインを確認する、生物間の分布を評価する、他のデータベースへのアクセスを得る、及び既知のタンパク質構造を視覚化するのを可能にする。ＣＯＧ（タンパク質のオーソロガス群のクラスター、ｖｖ−ｗｗ．ｎｅｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＣＯＧ／）は、３０の主要な系統発生株を表す４３の完全に配列決定したゲノムに由来するタンパク質配列を比較することによって得られる。各ＣＯＧは、前の保存されたドメインの同定を可能にする少なくとも３つの株から定義される。
配列同一性の比率を同定する手段は当業者に周知であり、それには、特にＢＬＡＳＴプログラムが挙げられ、それは、ウェブサイトで示される初期設定パラメーターと共にウェブサイトｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｏｌｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉから使用することができる。次いで、たとえば、初期設定パラメーターでのプログラムＣＬＵＳＴＡＬＷ（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いて、得られた配列を利用する（たとえば、並べる）ことができる。既知の遺伝子についてＧｅｎＢａｎｋで与えられた参照を用いて、当業者は、他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳類、植物、等にて同等の遺伝子を決定することができる。この日常の作業は、他の微生物に由来する遺伝子との配列比較を実施すること、及び縮重プローブを設計して別の生物における対応する遺伝子をクローニングすることによって決定することができるコンセンサス配列を用いて有利に行われる。
当業者は、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を実質的に保持するタンパク質を選択し、設計するやり方を理解するであろう。Ｌ−アスパラギナーゼ活性を測定するアプローチの１つは、Ｍａｓｈｂｕｒｎ，（１９６３），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２，５０（全体が参照によって本明細書に組み入れられる）によって記載されたようなＮｅｓｓｌｅｒアッセイである。
本発明の修飾されたタンパク質の特定の態様では、Ｌ−アスパラギナーゼは配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％の相同性または配列同一性を有し、さらに具体的には添付の配列表で述べられているような配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の相同性または配列同一性を有する。「相同性」及び「配列同一性」という用語は本明細書では相互交換可能に使用される。
「配列番号１の配列を含む」という用語（たとえば、Ｌ−アスパラギナーゼは配列番号１のアミノ酸配列に対して１００％の相同性または配列同一性を有するならば）は、アスパラギナーゼのアミノ酸配列が配列番号１に厳密に限定されなくてもよく、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上の追加のアミノ酸を含有してもよいことを意味する。言い換えれば、本明細書で使用されるＬ−アスパラギナーゼが配列番号１のアミノ酸配列に対して１００％の相同性または配列同一性を有するならば、Ｌ−アスパラギナーゼは配列番号１のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る。「含む」という用語はこの文脈では配列番号１のＬ−アスパラギナーゼのアミノ酸配列が１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上の追加のアミノ酸を含有してもよいことを意味する。
特定の態様では、タンパク質は配列番号１のアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＥｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｒｎｉのＬ−アスパラギナーゼである。別の態様では、Ｌ−アスパラギナーゼは、シグナルペプチド及び／またはリーダー配列の有無にかかわらず、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｒｎｉのＮＣＰＰＢ１０６６（全体が参照によって本明細書に組み入れられるＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ３２８８４）に由来する。
Ｌ−アスパラギナーゼ、好ましくは配列番号１のＬ−アスパラギナーゼの断片も本発明の修飾されたタンパク質で使用されるＬ−アスパラギナーゼの定義の範囲内に含まれる。「アスパラギナーゼの断片」という用語（たとえば、配列番号１のアスパラギナーゼの断片）は、アスパラギナーゼの配列が本明細書で例示されているアスパラギナーゼ（たとえば、配列番号１のアスパラギナーゼ）におけるよりも少ないアミノ酸を含み得るが、依然としてＬ−アスパラギナーゼ活性を付与するのに十分なアミノ酸を含み得ることを意味する。たとえば、「アスパラギナーゼの断片」は、本明細書で例示されているアスパラギナーゼ（たとえば、配列番号１のアスパラギナーゼ）の１つの少なくとも約１５０または２００の隣接するアミノ酸（たとえば、約１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６の隣接するアミノ酸）である／それらから成る断片であり、及び／または前記断片は本明細書で例示されている前記アスパラギナーゼ（たとえば、配列番号１のアスパラギナーゼ）のＮ末端から５０までの（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０までの）アミノ酸が欠失されており、及び／または前記断片は本明細書で例示されている前記アスパラギナーゼ（たとえば、配列番号１のアスパラギナーゼ）のＣ末端から７５または１００までの（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００までの）アミノ酸が欠失されており、及び／または本明細書で例示されている前記アスパラギナーゼ（たとえば、配列番号１のアスパラギナーゼ）のＮ末端及びＣ末端の双方でアミノ酸が欠失されており、欠失したアミノ酸の総数が１２５または１５０までのアミノ酸であることができる断片である。
ポリペプチドは、その酵素活性を保持しながら、１以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失及び／または付加によって修飾することができることは当該技術で周知である。この文脈における「１以上のアミノ酸」という用語は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、またはそれ以上のアミノ酸を指すことができる。たとえば、タンパク質の機能的特性に影響を及ぼさない化学的に同等のアミノ酸による所与の位置でのアミノ酸１つの置換は一般的である。置換は以下の群の１つの範囲内での交換として定義されてもよい。
・小型の脂肪族で非極性またはやや極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ
・極性で負に荷電した残基及びそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
・極性で正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
・大型の脂肪族で非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ
・大型の芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
従って、１つの負に荷電した残基を他の負に荷電した残基に置換すること（たとえば、グルタミン酸のアスパラギン酸との置換）、または１つの正に荷電した残基を他の正に荷電した残基に置換すること（たとえば、リシンのアルギニンとの置換）を生じる変化は機能的に同等の生成物を生じると予想することができる。
アミノ酸配列におけるアミノ酸が修飾される位置及び修飾の対象となるアミノ酸の数は特に限定されない。技量のある熟練者はタンパク質の活性に影響を与えることなく導入することができる修飾を認識することができる。たとえば、タンパク質のＮ末端またはＣ末端の部分における修飾は、ある特定の状況下ではタンパク質の活性を変えないと予想され得る。アスパラギナーゼに関して、特に、多くの特性評価が、特に活性がある触媒部位を形成する配列、構造及び残基に関して行われている。これは、酵素の活性に影響を与えることなく修飾することができる残基に関する手引きを提供する。細菌起源に由来する既知のＬ−アスパラギナーゼはすべて共通する構造的特徴を有する。すべてが、２つの隣接する単量体のＮ末端とＣ末端のドメイン間で４つの活性部位を持つホモ四量体である（全体が参照によって本明細書に組み入れられるＡｇｈａｉｐｏｕｒ，（２００１），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０，５６５５−５６６４）。すべてが、その三次構造及び四次構造にて高度の類似性を有する（全体が参照によって本明細書に組み入れられるＰａｐａｇｅｏｒｇｉｏｕ，（２００８），ＦＥＢＳ Ｊ．２７５，４３０６−４３１６）。Ｌ−アスパラギナーゼの触媒部位の配列は、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、及びＥ．ｃｏｌｉのＬ−アスパラギナーゼ（ＩＩ）の間で高度に保存されている（同文献）。活性部位の柔軟なループはアミノ酸残基１４〜３３を含有し、構造解析はＴｈｒ１５、Ｔｈｒ９５、Ｓｅｒ６２、Ｇ１ｕ６３、Ａｓｐ９６、及びＡ１ａ１２０がリガンドに接触することを示している（同文献）。Ａｇｈａｉｐｏｕｒらは、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのＬ−アスパラギナーゼの４つの活性部位の詳細な解析を、その基質と複合体化した酵素の高分解能の結晶構造を調べることによって行っている（Ａｇｈａｉｐｏｕｒ，（２００１），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０，５６５５−５６６４）。Ｋｏｔｚｉａらは、Ｅｒｗｉｎｉａの幾つかの種及び亜種に由来するＬ−アスパラギナーゼの配列を提供し、タンパク質はＥｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉとＥｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａとの間で約７５〜７７％の同一性しか有さないにもかかわらず、それらはそれぞれ依然としてＬ−アスパラギナーゼ活性を有する（Ｋｏｔｚｉａ，（２００７），Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２７，６５７−６６９）。ＭｏｏｌａらはＥｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ３９３７Ｌ−アスパラギナーゼのエピトープマッピング試験を行い、アスパラギナーゼの免疫原性を低下させる試みにて種々の抗原性配列を変異させた後でさえ酵素活性を保持することができた（Ｍｏｏｌａ，（１９９４），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０２，９２１−９２７）。Ｌ−アスパラギナーゼで行われてきた広範な特性評価を考慮して、当業者は酵素活性を保持しながら断片を作り、及び／または配列置換を行うやり方を決定し得る。
本明細書で使用されるとき、たとえば、組成物における成分の寸法、体積、量、濃度、プロセス温度、プロセス時間、収量、流速、圧力及び類似の値、及びそれらの範囲を修飾する「約」という用語は、化合物、組成物、濃縮物または使用製剤を作るのに使用される典型的な測定及び取り扱いの手順を介して、これらの手順における不注意な誤りを介して、方法を実施するのに使用される出発物質または成分の製造、供給源または純度における差異を介して発生し得る数量、及び類似の検討事項における変動を指す。「約」という用語はまた、たとえば、特定の当初濃度または混合の組成物、製剤または細胞培養物の経時劣化によって異なる量、及び特定の当初の濃度または混合の組成物または製剤を混合するまたは処理することによって異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されようとされまいと、本明細書に添付されるクレームはこれらの量に対する同等物を含む。「約」という用語はさらに述べられた参照値に類似する値の範囲を指してもよい。ある特定の実施形態では、「約」という用語は述べられた参照値の１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１パーセント以内に入る値の範囲を指す。
本発明の文脈では、驚くべきことに、プロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る１以上のペプチドの特定のＣ末端アミノ酸残基（ＲＣ）を介したＬ−アスパラギナーゼへの化学的コンジュゲートは、アスパラギナーゼの分子当たり前記ペプチドの特に高いカップリング比を有するので、かなり低下した免疫原性及び向上した血漿半減期を有するＬ−アスパラギナーゼで修飾されたタンパク質を提供できるようにすることが見いだされている。この新規の技法はその触媒活性を損なうことなくＬ−アスパラギナーゼに適用することもでき、それは本明細書に記載されている対応する修飾されたタンパク質の治療価値を大きく高めることがさらに見いだされている。
一態様では、本明細書に記載されているのは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するＬ−アスパラギナーゼと、（ｉｉ）１以上のペプチドとを含む修飾されたタンパク質であり、ペプチドはプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る。
好ましい態様では、修飾されたタンパク質はＬ−アスパラギナーゼと、それぞれが独立してペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣである１以上のペプチドとの修飾されたタンパク質であり、式中、（Ｐ／Ａ）はプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成るアミノ酸配列であり、ＲＮはアミノ酸配列のＮ末端アミノ基に連結される保護基であり、ＲＣはそのアミノ基を介してアミノ酸配列のＣ末端カルボキシ基に結合されるアミノ酸残基であり、各ペプチドは、ペプチドのＣ末端アミノ酸残基ＲＣのカルボキシ基とＬ−アスパラギナーゼの遊離のアミノ基とから形成されるアミド結合を介してＬ−アスパラギナーゼにコンジュゲートされ、ペプチドがコンジュゲートされる遊離のアミノ基の少なくとも１つはＬ−アスパラギナーゼのＮ末端のαアミノ基ではない。
一部の態様では、修飾されたタンパク質の単量体は、修飾の後、約３５０、４００、４５０、５００のアミノ酸から約５５０、６００、６５０、７００または７５０のアミノ酸までを有する。追加の態様では、修飾されたタンパク質は約３５０〜約７５０のアミノ酸、または約５００〜約７５０のアミノ酸を有する。
本明細書に記載されているような修飾されたタンパク質に含まれる各ペプチドは独立してペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣである。従って、本明細書に記載されている修飾されたタンパク質に含まれるペプチドのそれぞれについては、Ｎ末端保護基であるＲＮ、アミノ酸配列（Ｐ／Ａ）、及びＣ末端アミノ酸残基であるＲＣはそれぞれ独立してそれらのそれぞれの意図から選択される。従って、修飾されたタンパク質に含まれる２以上のペプチドは同一であってもよく、またはそれらは互いに異なってもよい。一態様では、修飾されたタンパク質に含まれるペプチドのすべてが同一である。
さらに、修飾されたタンパク質に含まれるペプチドは好ましくは、特に修飾されたタンパク質が水性環境（たとえば、水溶液または水性緩衝液）に存在する場合、ランダムコイル構造を採用する。ランダムコイル構造の存在は、当該技術で既知の方法を用いて、特に、たとえば、円偏光二色性分光法（ＣＤ）のような分光技法によって決定することができる。
ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣに含まれる、化学的にコンジュゲートされた修飾されたタンパク質における部分（Ｐ／Ａ）は、合計１０〜１００の間のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基、合計１５〜６０のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基、合計１５〜４５のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基、たとえば、合計２０のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基、たとえば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基から成ることができるアミノ酸配列である。好ましい態様では、アミノ酸配列は２０のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基から成る。別の好ましい態様では、前記アミノ酸配列は４０のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基から成る。ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣでは、部分（Ｐ／Ａ）に含まれるプロリン残基の数の（Ｐ／Ａ）に含まれるアミノ酸残基の総数に対する比は好ましくは１０％以上且つ７０％以下、さらに好ましくは２０％以上且つ５０％以下、及び一層さらに好ましくは２５％以上且つ４０％以下である。従って、（Ｐ／Ａ）におけるアミノ酸残基の総数の１０％〜７０％がプロリン残基であることが好ましく、さらに好ましくは（Ｐ／Ａ）におけるアミノ酸残基の総数の２０％〜５０％がプロリン残基であり、一層さらに好ましくは（Ｐ／Ａ）におけるアミノ酸残基の総数の２５％〜４０％（たとえば、２５％、３０％、３５％または４０％）がプロリン残基である。さらに、（Ｐ／Ａ）は連続したプロリン残基を含有しない（すなわち、それは部分配列ＰＰを含有しない）ことが好ましい。好ましい態様では、（Ｐ／Ａ）はアミノ酸配列ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ（配列番号５）である。別の好ましい態様では、（Ｐ／Ａ）はアミノ酸配列ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ（配列番号１５）である。
ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣにおけるＲＮ基は、アミノ酸配列（Ｐ／Ａ）のＮ末端アミノ基、特にＮ末端αアミノ基に連結される保護基であってもよい。ＲＮはピログルタモイルまたはアセチルであることが好ましい。
ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣにおけるＲＣ基は、そのアミノ基を介して（Ｐ／Ａ）のＣ末端カルボキシ基に結合され、そのアミノ基とそのカルボキシ基の間で少なくとも２つの炭素原子を含むアミノ酸残基である。ＲＣのアミノ基とカルボキシ基の間での少なくとも２つの炭素原子は、ＲＣのアミノ基とカルボキシ基の間で少なくとも２つの炭素原子の距離を提供してもよいこと（たとえば、ＲＣがω−アミノ−Ｃ３−１５アルカン酸、たとえば、ω−アミノヘキサン酸である場合である）が理解されるであろう。ＲＣはω−アミノヘキサン酸であることが好ましい。
一実施形態では、ペプチドは、Ｐｇａ−ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ−Ａｈｘ−ＣＯＯＨ（配列番号１６）またはＰｇａ−ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ−Ａｈｘ−ＣＯＯＨ（配列番号１７）である。「Ｐｇａ」という用語は「ピログルタモイル」または「ピログルタミン酸」の略語である。「Ａｈｘ」という用語は「ω−アミノヘキサン酸」の略語である。
添付の実施例でも明らかにされているように、特にω−アミノヘキサン酸を含む本明細書で定義されているようなＣ末端アミノ酸残基ＲＣの使用は、アスパラギナーゼの分子当たりの、プロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成るペプチドの有利に高いカップリング比を修飾されたタンパク質に提供するのを可能にするので、有利に低下した免疫原性及び有利に向上した血漿半減期を修飾されたタンパク質に提供するのを可能にする。
本明細書に記載されているような修飾されたタンパク質では、各ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣは、ペプチドのＣ末端アミノ酸残基ＲＣのカルボキシ基とＬ−アスパラギナーゼの遊離のアミノ基とから形成されるアミド結合を介してＬ−アスパラギナーゼにコンジュゲートすることができる。Ｌ−アスパラギナーゼの遊離のアミノ基は、たとえば、Ｌ−アスパラギナーゼのＮ末端α−アミノ基または側鎖のアミノ基（たとえば、Ｌ−アスパラギナーゼに含まれるリシン残基のε−アミノ基）であってもよい。Ｌ−アスパラギナーゼが複数のサブユニットで構成されるならば、たとえば、Ｌ−アスパラギナーゼが四量体であるならば、複数のＮ末端α−アミノ基（すなわち、各サブユニットに１つ）があってもよい。一態様では、本明細書で定義されているような９〜１３のペプチド（たとえば、９、１１、１２または１３のペプチド）をＬ−アスパラギナーゼに（たとえば、Ｌ−アスパラギナーゼの各サブユニット／単量体に）化学的にコンジュゲートすることができる。
上記によれば、一態様では、ペプチドが化学的にコンジュゲートされる遊離のアミノ基の少なくとも１つはＬ−アスパラギナーゼのＮ末端α−アミノ基ではない（すなわち、それとは異なる）。従って、ペプチドがコンジュゲートされる遊離のアミノ基の少なくとも１つはＬ−アスパラギナーゼの側鎖アミノ基であることが好ましく、ペプチドがコンジュゲートされる遊離のアミノ基の少なくとも１つはＬ−アスパラギナーゼのリシン残基のε−アミノ基であることが特に好ましい。
さらに、ペプチドがコンジュゲートされる遊離のアミノ基は、Ｌ−アスパラギナーゼのリシン残基（複数可）のε−アミノ基（複数可）、Ｌ−アスパラギナーゼまたはＬ−アスパラギナーゼの任意のサブユニット（複数可）のＮ末端α−アミノ基（複数可）、及びそれらの組み合わせから選択されることが好ましい。ペプチドがコンジュゲートされる遊離のアミノ基の１つはＮ末端α−アミノ基である一方で、ペプチドがコンジュゲートされる遊離のアミノ基の他のもの（複数可）はそれぞれＬ−アスパラギナーゼのリシン残基のε−アミノ基であることが特に好ましい。あるいは、ペプチドがコンジュゲートされる遊離のアミノ基のそれぞれはＬ−アスパラギナーゼのリシン残基のε−アミノ基であることが好ましい。
本明細書に記載されているような修飾されたタンパク質は、本明細書で定義されているようなＬ−アスパラギナーゼと１以上のペプチドとで構成される。対応する修飾されたタンパク質は、たとえば、Ｌ−アスパラギナーゼ１つと、それぞれＬ−アスパラギナーゼにコンジュゲートされる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５（以上）のペプチドとから成ってもよい。Ｌ−アスパラギナーゼは、たとえば、単量体タンパク質であってもよいし、または複数のサブユニットで構成されるタンパク質、たとえば、四量体であってもよい。Ｌ−アスパラギナーゼが単量体タンパク質であるならば、対応する修飾されたタンパク質は、たとえば、単量体Ｌ−アスパラギナーゼ１つと、それぞれ単量体Ｌ−アスパラギナーゼにコンジュゲートされる９〜１３（以上）（たとえば、９、１１、１２または１３）のペプチドとから成ってもよい。単量体Ｌ−アスパラギナーゼの例となるアミノ酸配列は配列番号１に示される。Ｌ−アスパラギナーゼが複数のサブユニット、たとえば、４つのサブユニットで構成されるタンパク質であるならば（すなわち、前記Ｌ−アスパラギナーゼが四量体であるならば）、対応する修飾されたタンパク質は、たとえば、４つのＬ−アスパラギナーゼのサブユニットと、それぞれＬ−アスパラギナーゼの各サブユニットにコンジュゲートされる本明細書で定義されているような９〜１３（以上）（たとえば、９、１１、１２または１３）のペプチドとから成ってもよい。Ｌ−アスパラギナーゼのサブユニットの例となるアミノ酸配列は配列番号１に示される。同様に、Ｌ−アスパラギナーゼが複数のサブユニット、たとえば、４つのサブユニットで構成されるタンパク質であるならば（すなわち、前記Ｌ−アスパラギナーゼが四量体であるならば）、対応する修飾されたタンパク質は、たとえば、４つのＬ−アスパラギナーゼのサブユニットと、それぞれＬ−アスパラギナーゼ四量体にコンジュゲートされる３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５（またはそれ以上）のペプチドとから成ってもよい。一態様では、本発明はＬ−アスパラギナーゼと複数の化学的に連結されたペプチド配列とを有する修飾されたタンパク質に関する。さらなる態様では、ペプチド配列の長さは約１０〜約１００、約１５〜約６０または約２０〜約４０である。
プロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成るペプチドは、前記Ｌ−アスパラギナーゼの１以上のアミノ酸、たとえば、リシン残基及び／またはＮ末端残基に共有結合されてもよく、及び／またはプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成るペプチドは、Ｌ−アスパラギナーゼの表面におけるリシン残基及び／またはＮ末端残基のアミノ基を含む接触可能なアミノ基の少なくとも約４０、５０、６０、７０、８０または９０％から約６０、７０、８０、９０または１００％までに共有結合されてもよい。たとえば、Ｌ−アスパラギナーゼ当たり、接触できる約１１〜１２のリシン残基があり得、プロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成るペプチドにコンジュゲートされるであろう約９〜１２のリシンがあり得る。さらなる態様では、プロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成るペプチドは、前記Ｌ−アスパラギナーゼの全リシン残基の約２０、３０、４０、５０、または６０％から約３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％までに共有結合される。さらなる実施形態では、プロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成るペプチドはリンカーを介してＬ−アスパラギナーゼに共有結合される。例となるリンカーには、全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願公開番号２０１５／００３７３５９で開示されるリンカーが挙げられる。
加えて、前記修飾されたタンパク質は、約２５μｇのタンパク質／ｋｇの用量で少なくとも約５、１０、１２、１５、２４、３６、４８、６０、７２、８４または９６時間の半減期、及び／または未修飾のＬ−アスパラギナーゼと比べて生体内での長い循環半減期を有し得る。さらに、前記修飾されたタンパク質はＬ−アスパラギナーゼと比べて血漿薬剤濃度−時間曲線下の大きな面積（ＡＵＣ）を有し得る。
本発明に係る修飾されたタンパク質は当該技術で既知の方法を用いて調製することができる。特に、それは、以下に記載されるプロセスを用いて、及び／または実施例に記載される手順に従って、またはそれと同様に調製することができる。
本発明はさらに、本明細書で定義されているような修飾されたタンパク質を調製するプロセスに関するものであり、該プロセスは（ａ）式ＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣ−ａｃｔの活性化されたペプチドをＬ−アスパラギナーゼとカップリングして、Ｌ−アスパラギナーゼとＲＮが保護基であるペプチドとの修飾されたタンパク質を得ることを含み、式中、ＲＣ−ａｃｔはＲＣのカルボキシ活性化形態であり、ＲＣ及び（Ｐ／Ａ）は調製される修飾されたタンパク質で定義されたとおりであり、ＲＮは（Ｐ／Ａ）のＮ末端アミノ基に連結される保護基である。
活性化されたペプチドに含まれるカルボキシ活性化Ｃ末端アミノ酸残基ＲＣ-ａｃｔはペプチドに関して本明細書で記載され、且つ定義されているようなアミノ酸残基ＲＣであってもよく、ＲＣのカルボキシ基は活性化されたカルボキシ基の形態である。好ましくは、活性化されたペプチドにおけるアミノ酸残基ＲＣ-ａｃｔの活性化されたカルボキシ基は活性があるエステル基である。
ＲＣ-ａｃｔの活性化されたカルボキシ基が、活性があるエステル基であるならば、それは好ましくは以下の活性があるエステル基：

のいずれか１つから選択される。
特に好ましい活性があるエステル基は１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）活性エステル基である。従って、ＲＣ−ａｃｔの活性化されたカルボキシ基は以下の式：

（ＨＯＢｔ活性エステル基）の基である。
プロセスはさらに、ステップ（ａ）の前に、ＲＣ及び（Ｐ／Ａ）が調製される修飾されたタンパク質で定義されたとおりであり、ＲＮが（Ｐ／Ａ）のＮ末端アミノ基に連結される保護基である式ＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣのペプチドを活性化されたＰ／Ａペプチドに変換するさらなるステップを含んでもよい。
たとえば、ＲＣ−ａｃｔの活性化されたカルボキシ基として１−ヒドロキシベンゾトリアゾール活性エステル基を有する活性化されたペプチドを得るために、ペプチドを活性化ペプチドに変換するステップは、ペプチドを塩基の存在下で１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）のホスホニウムエステル、ウロニウムエステルまたはイモニウムエステルの塩と反応させることによって実施することができる。ＨＯＢｔのホスホニウム、ウロニウムまたはイモニウム誘導体の塩は好ましくは、テトラフルオロホウ酸Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウム（ＴＢＴＵ）である。
カップリングステップ（ａ）及びペプチドを活性化ペプチドに変換する先行の任意のステップは、たとえば、Ｅｌ−Ｆａｈａｍ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１１１（１１），６５５７−６６０２、Ｍｏｎｔａｌｂｅｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，６１（４６），１０８２７−１０８５２、Ｋｌｏｓｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８，１８４７−１８４８、Ｖａｌｅｕｒ，ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｃａｒｐｉｎｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７（１９），５４０１−５４０２）、Ｖａｌｅｕｒ，ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，３８（２），６０６−６３１、またはＨｅｒｍａｎｓｏｎ，２０１３，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓのいずれかにおける文献に記載されたペプチドカップリングまたはアミド結合形成の手順を用いて実施することができる。そのような手順に好適な試薬及び反応条件は、前述の文献及びそれらの中で引用されたさらなる参考文献にさらに記載されている。追加の記載は、米国特許第８，５６３，５２１号、同第９，２６０，４９４号、及び同第９，２２１，８８２号に見いだされ、これらすべては、全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
任意のステップ（ｂ）で必要とされるような、保護基ＲＮを取り外す手順は当該技術で周知であり、たとえば、Ｗｕｔｓ，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｇｒｅｅｎｅ’Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ及び／またはＩｓｉｄｒｏ−Ｌｌｏｂｅｔ，ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０９（６），２４５５−２５０４に記載されている。従って、任意のステップ（ｂ）は、たとえば、前述の参考文献のいずれかにて対応する保護基ＲＮについて記載されているように実施することができる。
一部の態様では、本発明は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するＬ−アスパラギナーゼと、（ｉｉ）ポリペプチドとを含む修飾されたタンパク質に関するものであり、ポリペプチドはプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る。一態様では、修飾されたタンパク質は融合タンパク質である。プロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成るポリペプチドは、約２００〜約４００のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基の長さを有してもよい。言い換えれば、ポリペプチドは、約２００〜約４００のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基から成ってもよい。好ましい態様では、ポリペプチドは、合計約２００（たとえば、２０１）のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基から成り（すなわち、約２００（たとえば、２０１）のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基の長さを有し）、またはポリペプチドは、合計約４００（たとえば、４０１）のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基から成る（たとえば、約４００（たとえば、４０１）のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基の長さを有する）。一部の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号７または９で示されるようなアミノ酸配列を含み、もしくはそれから成り、またはポリペプチドは、配列番号８または１０で示されるようなヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含み、もしくはそれから成る。一部の態様では、好ましくは修飾されたタンパク質が融合タンパク質であり、各単量体が約３５０、４００、４５０、５００アミノ酸から約５５０、６００、６５０、７００、７５０または１０００までのアミノ酸を有する修飾されたタンパク質は単量体とＰ／Ａのアミノ酸配列とを含む。追加の態様では、修飾されたタンパク質は約３５０〜約８００のアミノ酸または約５００〜約７５０のアミノ酸を有する。
たとえば、ポリペプチドは米国特許第９，２２１，８８２号で調製されたペプチドを含む。
好ましい態様では、修飾されたタンパク質は、（ａ）配列番号１１または１３で示されるようなアミノ酸配列を含む、もしくはそれから成る、または（ｂ）配列番号１２または１４で示されるようなヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、もしくはそれから成る。本明細書では、修飾されたタンパク質は、（ａ）配列番号１１または１３で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質、（ｂ）アスパラギナーゼにて１〜６５のアミノ酸が欠失される、挿入される、付加されるまたは置換される（ａ）で定義されたようなタンパク質、（ｃ）配列番号１２または１４で示されるようなヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるタンパク質、（ｄ）（ｃ）で定義されたような核酸分子の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質、（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのタンパク質に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質、及び（ｆ）（ｃ）または（ｄ）で定義されたような核酸のヌクレオチド配列に対する遺伝暗号の結果として縮重である核酸によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むことが企図される。
本明細書で定義されているような修飾されたタンパク質は４つのサブユニットで構成されてもよく、サブユニットは（ａ）配列番号１で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質、（ｂ）アスパラギナーゼにて１〜６５のアミノ酸が欠失される、挿入される、付加されるまたは置換される（ａ）で定義されたようなタンパク質、（ｃ）配列番号２で示されるようなヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるタンパク質、（ｄ）（ｃ）で定義されたような核酸分子の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質、（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのタンパク質に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質、及び（ｆ）（ｃ）または（ｄ）で定義されたような核酸のヌクレオチド配列に対する遺伝暗号の結果として縮重である核酸によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質から成る群から選択される。
具体的には、修飾されたタンパク質がＬ−アスパラギナーゼとポリペプチドとの修飾されたタンパク質であるならば、本発明は本明細書で定義されているような修飾されたタンパク質をコードする核酸に関するものであり、ポリペプチドはプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る。好ましい態様では、修飾されたタンパク質は融合タンパク質である。好ましい態様では、核酸は、（ａ）配列番号１２または１４のヌクレオチド配列を含む核酸、（ｂ）（ａ）で定義されたようなヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸、及び（ｃ）（ａ）で定義されたようなヌクレオチド配列に対する遺伝暗号の結果として縮重である核酸から成る群から選択される。
さらなる態様では、本発明は、配列番号１２または１４から成る群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に関する。コードされるポリペプチドはランダムコイルを形成してもよい反復性のアミノ酸配列を含むが、コードする核酸は好ましくは反復性の低いヌクレオチド配列を含む。言い換えれば、核酸はＰＡが豊富なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができ、前記コーディングヌクレオチド配列は１４、１５、１６、１７、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０または約５５のヌクレオチドの最大長さを有するヌクレオチド反復を含む。本明細書で開示されているような反復性の低い核酸は反復性の高い核酸分子に比べて有利であることができる。特に、本明細書で使用される反復性の低い核酸分子の遺伝的安定性を改善することができる。
一部の態様では、ヌクレオチド配列はＬ−アスパラギナーゼとポリペプチドとを含む修飾されたタンパク質のいずれかをコードする配列であり、ポリペプチドはプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成り、好ましくは、このアミノ酸配列を有する融合タンパク質がＬ−アスパラギナーゼ活性を有するという条件で、１以上のアミノ酸が付加される、欠失される、挿入されるまたは置換されることを除いて、修飾されたタンパク質は本明細書に記載されている融合タンパク質である。
追加の態様では、本発明はＬ−アスパラギナーゼとポリペプチドとを含む修飾されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む（組換え）ベクターに関するものであり、ポリペプチドはプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成り、好ましくは、修飾されたタンパク質は本明細書に記載されているような融合タンパク質であり、ベクターは修飾されたタンパク質（たとえば、融合タンパク質）を発現することができる。さらなる態様では、本発明はまた、本明細書に記載されている（組換え）ベクターを含む宿主にも関する。宿主は、たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＰｉｃｈｉａ Ｐｉｓｔｏｒｉｓのような酵母、ならびにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍならびに以下の属Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、及びＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓの細菌宿主を含む細菌、放線菌、真菌、藻類、及び他の微生物であってもよい。他の宿主は当業者に既知であり、グルタミナーゼ活性を欠いているアスパラギナーゼの変異体を発現するＮｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ａｌｂａ（全体が参照によって本明細書に組み入れられるＭｅｅｎａ，ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｙｓｔ．Ｅｎｇ．Ｏｃｔｏｂｅｒ，２０１４，Ａｒｔｉｃｌｅ）及び全体が参照によって本明細書に組み入れられるＳａｖｉｔｒｉ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｉｎｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２，１８４−１９４にて開示されたものを含む。
本発明は、上記で本明細書に記載されている核酸、すなわち、本明細書で定義されているような修飾されたタンパク質をコードする核酸、特に、Ｌ−アスパラギナーゼとポリペプチドとの修飾されたタンパク質、たとえば、融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターに関するものであり、ポリペプチドはプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る。好ましい態様では、核酸は、（ａ）配列番号１２または１４のヌクレオチド配列を含む核酸、（ｂ）（ａ）で定義されたようなヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸、及び（ｃ）（ａ）で定義されたようなヌクレオチド配列に対する遺伝暗号の結果として縮重である核酸から成る群から選択される。
本発明は本明細書で定義されているような核酸を含む、または本明細書で定義されているようなベクターを含む宿主細胞に関する。例の宿主は上記で列挙されている。
本発明はさらに、本明細書に記載されているような修飾されたタンパク質、好ましくは融合タンパク質を調製するプロセス、またはそれをコードする核酸を調製するプロセスに関する。プロセスは、本明細書で定義されているような宿主細胞を培養することと、培養物または前記細胞から前記修飾されたタンパク質を単離することとを含むことができる。プロセスは、修飾されたタンパク質（好ましくは融合タンパク質）の発現を引き起こす条件下で宿主細胞（たとえば、修飾されたタンパク質（好ましくは融合タンパク質）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸及び／またはベクターで形質転換された宿主細胞またはそれを含む宿主細胞）を培養することを含むことができる。例の宿主は上記で列挙されている。
多数の好適なベクターが分子生物学の当業者に知られている。プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ及び遺伝子操作で従来使用されている他のベクターを含む好適なベクターの選択は所望の機能に左右される。
当業者に周知の方法を用いて種々のプラスミドを構築することができる。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，（２０１２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載された技法を参照のこと。典型的なプラスミドベクターには、たとえば、ｐＱＥ−１２、プラスミドのｐＵＣシリーズ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、発現ベクターのｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）またはｐＣＲＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１、ｐＪＯＥ、ｐＢＢＲ１−ＭＣＳシリーズ、ｐＪＢ８６１、ｐＢＳＭｕＬ、ｐＢＣ２、ｐＵＣＰＫＳ、ｐＴＡＣＴ１が挙げられる。哺乳類細胞での発現に適合する典型的なベクターには、Ｅ−０２７ ｐＣＡＧ Ｋｏｓａｋ−Ｃｈｅｒｒｙ（Ｌ４５ａ）ベクター系、ｐＲＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＢＰＶ−１、ｐｄＢＰＶＭＭＴｎｅｏ、ｐＲＳＶｇｐｔ、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＩＺＤ３５、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ｐＧＥＭＨＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＬＸＩＮ、ｐＳＩＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＥＡＫ−１０（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ｐＴｒｉＥｘ−Ｈｙｇｒｏ（Ｎｏｖａｇｅｎ）及びｐＣＩＮｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられる。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに好適なプラスミドベクターの非限定例は、たとえば、プラスミドｐＡＯ８１５、ｐＰＩＣ９Ｋ及びｐＰＩＣ３．５Ｋ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む。
一般に、ベクターは、クローニング及び発現のための１以上の複製開始点（ｏｒｉ）及び遺伝様式、宿主における選択のための１以上のマーカー、たとえば、抗生剤耐性、ならびに１以上の発現カセットを含有することができる。好適な複製開始点の例には、たとえば、完全長のＣｏｌＥ１、ｐＵＣプラスミドに存在するもののようなその切り詰め型、ＳＶ４０ウイルス及びＭ１３ファージの複製開始点が挙げられる。選択可能なマーカーの非限定例には、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、カナマイシン、ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ブラスチシジンまたはジェネティシンが挙げられる。さらに、前記ベクターは、前記ヌクレオチド配列または本明細書で定義されている核酸分子に操作可能に連結される調節性配列を含む。
ベクターに含まれるコーディング配列（複数可）、たとえば、ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、確立された方法を用いて転写制御配列（複数可）及び／または他のアミノ酸をコードする配列に連結することができる。そのような制御配列は当業者に周知であり、それには限定しないで、転写の開始を確保する制御配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び任意で、転写の終結及び転写物の安定化を確保する制御配列が挙げられる。転写の開始を確保するそのような制御配列の非限定例は、プロモーター、翻訳開始コドン、エンハンサー、インシュレーター及び／または転写の終結を確保する制御配列を含む。さらなる例には、Ｋｏｚａｋ配列及びＲＮＡのスプライシングのためのドナー部位とアクセプター部位が隣接する介在配列、分泌シグナルをコードする核酸配列、または使用される発現系に応じて、発現されたタンパク質を細胞区画または培養培地に向かわせることができるシグナル配列が挙げられる。
好適なプロモーターの例には、限定しないで、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ｌａｃＺプロモーター、ニワトリβアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター（ニワトリβアクチンのプロモーターとサイトメガロウイルス前初期エンハンサーの組み合わせ）、ヒト伸長因子１αプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＣａＭキナーゼプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーターまたはｔａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、Ｔ７またはＴ５プロモーター、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａの多核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）多面体プロモーター、または哺乳類及び他の動物の細胞におけるグロビンのイントロンが挙げられる。エンハンサーの一例は、たとえば、ＳＶ４０エンハンサーである。転写終結を確保する制御配列／配列の非限定の追加の例には、ＳＶ４０ポリＡ部位、ｔｋ ポリＡ部位、またはＡｃＭＮＰＶ多面体ポリアデニル化シグナルが挙げられる。
さらに、発現系に応じて、ポリペプチドを細胞区画に向かわせるまたはそれを培地に分泌させることができるリーダー配列を本明細書で提供されている核酸のコーディング配列に付加してもよい。リーダー配列（複数可）は翻訳の開始配列及び終結配列とインフレームで構築され、好ましくは、リーダー配列は翻訳されたタンパク質またはその一部の分泌をペリプラズムまたは細胞外培地に向かわせることができる。好適なリーダー配列は、たとえば、ＢＡＰ（細菌性アルカリホスファターゼ）、ＣＴＢ（コレラ毒素サブユニットＢ）のシグナル配列、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＤｓｂＡ、ＥＮＸ、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、ｓｔＩＩ、ＯｍｐＴ、ＰｅｌＢ、Ｔａｔ（ツインアルギニン転座）、及びウシ成長ホルモン、ヒトキモトリプシノーゲン、ヒト第ＶＩＩＩ因子、ヒトＩｇ−カッパ、ヒトインスリン、ヒトインターロイキン−２、ＭｅｔｒｉｄａまたはＶａｒｇｕｌａに由来するルシフェラーゼ、ヒトトリプシノーゲン−２、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓに由来するイヌリナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来する接合因子アルファ−１、メリチン、ヒトアズロシジン及び真核細胞における類似物のシグナル配列である。
ベクターはまた、正しいタンパク質の折り畳みを円滑にするための１以上のシャペロンをコードする追加の発現可能な核酸配列も含有してもよい。
一部の態様では、本発明のベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、本発明の核酸分子、たとえば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とアスパラギナーゼをコードするヌクレオチド配列とを含む核酸の複製及び発現を指図することができる。
上記で本明細書に記載されているような核酸分子及び／またはベクターは、たとえば、非化学的方法（エレクトロポレーション、ソノポレーション、光学形質移入、遺伝子の電気転写、本発明の核酸分子と細胞を接触させた際の流体力学的送達または自然に発生する形質転換）、化学に基づく方法（リン酸カルシウム、ＤＭＳＯ、ＰＥＧ、リポソーム、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン、ヌクレオフェクション、等）、粒子に基づく方法（遺伝子銃、マグネトフェクション、インパレフェクション）、ファージもしくはファージミドベクターに基づく方法及びウイルス法によって細胞への導入のために設計されてもよい。たとえば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔウイルス、またはウシパピローマウイルスのようなウイルスに由来する発現ベクターは標的とする細胞集団への核酸分子の送達に使用されてもよい。
本発明はまた、本明細書に記載されているベクターまたは核酸で形質転換される宿主細胞または非ヒト宿主にも関する。「ベクターで形質転換された宿主細胞または非ヒト宿主」という用語は本明細書に記載されているようなベクターまたは核酸を含む宿主細胞または非ヒト宿主に関することが十分に理解されるであろう。ポリペプチドの発現のための宿主細胞は当該技術で周知であり、真核細胞ならびに原核細胞を含む。上記に記載されている宿主細胞のための適切な培養培地及び培養条件は当該技術で既知である。
「宿主または宿主細胞を培養すること」には、宿主または宿主細胞における本明細書で定義されているような融合タンパク質を含む修飾されたタンパク質及び／または本明細書で定義されているようなポリペプチド及び／またはアスパラギナーゼの発現が含まれる。
本明細書で定義されているような修飾されたタンパク質及び／またはポリペプチド及び／またはアスパラギナーゼの単離の方法は、限定しないで、たとえば、アフィニティークロマトグラフィー（好ましくはＳｔｒｅｐ−タグＩＩまたはＨｉｓ６タグのような融合タグを用いた）、ゲル濾過（サイズ排除クロマトグラフィー）、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、硫酸アンモニウム沈殿または免疫沈降のような精製ステップを含む。これらの方法は当該技術で周知であり、たとえば、Ｓｃｏｐｅｓ，（１９９４），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒにて一般的に記載されている。そのような方法は実質的に純粋なポリペプチドを提供する。前記純粋なポリペプチドは好ましくは少なくとも約９０〜９５％（タンパク質レベルで）、さらに好ましくは少なくとも約９８〜９９％の均質性を有する。最も好ましくは、これらの純粋なポリペプチドは医薬品の用途／適用に好適である。
Ｌ−アスパラギナーゼとポリペプチドとを含む修飾されたタンパク質はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とアスパラギナーゼをコードする核酸配列とを含む核酸分子を発現させることによって調製することができることが想定される。発現された修飾されたタンパク質を単離することができる。あるいは、修飾されたタンパク質は、プロリン及びアラニンのみから成る前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または核酸配列を含む宿主を培養する／生じさせることによって調製することができる。従って、核酸は宿主で発現される。産生されたポリペプチドを単離することができる。産生されたポリペプチドは、たとえば、ペプチド結合または非ペプチド結合を介してアスパラギナーゼにコンジュゲートすることができる。
本明細書に記載されている修飾されたタンパク質はアスパラギンの枯渇によって治療できる疾患の治療に使用することができる。アスパラギンの枯渇によって治療できる疾患は好ましくは、たとえば、非固形がんのようながんである。好ましくは、非固形がんは白血病または非ホジキンリンパ腫である。白血病は好ましくは急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）または急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。たとえば、修飾されたタンパク質は、成人及び小児の双方における急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）または成人及び小児の双方における急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療で、または治療にて使用するための薬物の製造で有用である。アスパラギンの枯渇が有用な効果を有すると予想される他の状態の治療での本明細書に記載されている修飾されたタンパク質の使用が企図される。そのような状態には、以下：血液悪性腫瘍、ＮＫリンパ腫、膵臓癌、ホジキン病、急性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、慢性リンパ性白血病、リンパ肉腫、細網肉腫、黒色肉腫、及びびまん性大型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を含むが、これらに限定されない悪性腫瘍またはがんが挙げられるが、これらに限定されない。がんは、たとえば、肺癌または乳癌のような固形がんであってもよい。アスパラギンの枯渇に反応する代表的な非悪性の血液疾患には、免疫系が介在する血液疾患、たとえば、ＨＩＶ感染が原因で起きるもの（すなわち、ＡＩＤＳ）のような感染性疾患が挙げられる。アスパラギン依存性に関連する非血液疾患には、自己免疫疾患、たとえば、関節リウマチ、ＳＬＥ、自己免疫、コラーゲン血管疾患、等が挙げられる。他の自己免疫疾患には、変形性関節症、Ｉｓｓａｃ症候群、乾癬、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、硬化性全脳炎、全身性エリテマトーデス、リウマチ熱、炎症性腸疾患（たとえば、潰瘍性大腸炎及びクローン病）、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動型肝炎、糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、及びグレーブス病が挙げられる。疾患を引き起こすことが疑われる細胞を、好適な試験管内または生体内のアッセイ、たとえば、増殖培地がアスパラギンを欠く試験管内のアッセイにてアスパラギン依存性について調べることができる。
本発明はさらに、患者にてＬ−アスパラギンの枯渇によって治療できる疾患を治療する方法に関するものであり、前記方法は前記患者に有効量の修飾されたタンパク質を投与することを含む。一部の好ましい態様では、Ｌ−アスパラギンの枯渇によって治療できる前記疾患は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または非ホジキンリンパ腫である。一部の態様では、Ｌ−アスパラギンの枯渇によって治療できる前記疾患は、ＮＫリンパ腫及び膵臓癌を含むが、これらに限定されないがんである。追加の実施形態では、本明細書に記載されている修飾されたタンパク質は、前記修飾されたタンパク質のＬ−アスパラギナーゼと比べて前記患者にて免疫原性の低い応答を引き出す。
一部の態様では、上記に記載されている修飾されたタンパク質は、前記修飾されたタンパク質の未修飾のＬ−アスパラギナーゼと比べて単回投与の後、生体内での長い循環半減期を有する。本明細書に記載されている修飾されたタンパク質は、５Ｕ／ｋｇ（体重（ｂｗ））または１０μｇ／ｋｇ（タンパク質含量ベース）の用量で投与されると、少なくとも約１２、２４、４８、７２、９６または１２０時間の間、血漿Ｌ−アスパラギンのレベルを低下させることができる。本明細書に記載されている修飾されたタンパク質は、２５Ｕ／ｋｇ（ｂｗ）または５０μｇ／ｋｇ（タンパク質含量ベース）の用量で投与されると、少なくとも約１２、２４、４８、７２、９６、１２０または１４４時間の間、血漿Ｌ−アスパラギンのレベルを検出不能のレベルまで低下させることができる。本明細書に記載されている修飾されたタンパク質は、５０Ｕ／ｋｇ（ｂｗ）または１００μｇ／ｋｇ（タンパク質含量ベース）の用量で投与されると、少なくとも約１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６または２４０時間の間、血漿Ｌ−アスパラギンのレベルを低下させることができる。本明細書に記載されている修飾されたタンパク質は、約１０，０００から約１５，０００ＩＵ／ｍ２（約２０〜３０ｍｇのタンパク質／ｍ２）までに及ぶ用量で投与されると、少なくとも約１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６または２４０時間の間、血漿Ｌ−アスパラギンのレベルを検出不能のレベルまで低下させることができる。
本明細書に記載されている修飾されたタンパク質は、単回投与の後、ある期間（たとえば、２４、４８または７２時間）の間Ｌ−アスパラギンの枯渇の類似のレベルを生じることができる。
本明細書に記載されている修飾されたタンパク質は、同等のタンパク質用量で投与された未修飾のＬ−アスパラギナーゼよりも長いｔ１／２を有することができる。上記に記載されている修飾されたタンパク質は、前記未修飾のタンパク質のＬ−アスパラギナーゼと比べて単回投与後、大きなＡＵＣ値（たとえば、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍）を有することできる。
一部の態様では、本明細書に記載されている修飾されたタンパク質は、単回用量の投与の後、特定の期間の間、たとえば、約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間以上、有意な抗体反応を生じない。たとえば、修飾されたタンパク質は、少なくとも８週間、有意な抗体反応を生じない。一例では、「有意な抗体反応を生じない」は、修飾されたタンパク質を受け入れている対象が抗体陰性として当該技術で認識されているパラメーターの範囲内で特定されることを意味する。抗体のレベルは当該技術で既知の方法、たとえば、ＥＬＩＳＡまたは表面プラスモン共鳴アッセイによって決定することができる（そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＺａｌｅｗｓｋａ−Ｓｚｅｗｃｚｙｋ，（２００９），Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．９，１１３−１１６、Ａｖｒａｍｉｓ，（２００９），Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，２９９−３０２）。修飾されたタンパク質はこれらの特性の任意の組み合わせを有してもよい。
一部の態様では、本明細書に記載されている修飾されたタンパク質による治療は一次選択治療法として投与される。別の態様では、修飾されたタンパク質による治療は、患者にて、特にＡＬＬの患者にて二次選択治療法として投与されるが、その際、「無症状の過敏症」を含むアレルギーまたは過敏性の客観的な兆候が、他のアスパラギナーゼ製剤、特にネイティブのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに由来するＬ−アスパラギナーゼまたはそのペグ化変異体（ペガスパルガーゼ）に対して発生している。アレルギーまたは過敏性の客観的な兆候の非限定例には、アスパラギナーゼ酵素に対する「抗体陽性」を調べることが挙げられる。具体的な態様では、修飾されたタンパク質は、ペガスパルガーゼによる治療の後、二次選択治療法で使用される。患者は、Ｅ．ｃｏｌｉのＬ−アスパラギナーゼに対する過敏症の既往があってもよいし、及び／またはＥｒｗｉｎｉａのＬ−アスパラギナーゼに対する過敏性の既往があってもよい。過敏性はアレルギー反応、アナフィラキシーショック及び無症状の過敏性から成る群から選択されてもよい。
Ｌ−アスパラギナーゼによる治療に続くＡＬＬ患者における再発の発生率は高いままであり、小児ＡＬＬ患者のおよそ１０〜２５％が早期（たとえば、導入療法後３０〜３６ヵ月での維持療法段階の間での一部）の再発を有する（Ａｖｒａｍｉｓ，（２００５），Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．４４，３６７−３９３）。Ｅ．ｃｏｌｉに由来するＬ−アスパラギナーゼで治療された患者が再発すると、Ｅ．ｃｏｌｉ製剤によるその後の治療は「ワクチン接種」効果をもたらし得、それによってＥ．ｃｏｌｉ製剤はその後の投与の間に免疫原性を高めていく。本明細書に記載されている修飾されたタンパク質は、他のアスパラギナーゼ製剤で以前治療された再発ＡＬＬの患者、特にＥ．ｃｏｌｉに由来するＬ−アスパラギナーゼで以前治療された者を治療する方法で使用されてもよい。疾患の再発は、Ｅ．ｃｏｌｉのＬ−アスパラギナーゼまたはそのペグ化形態による治療の後、発生し得る。
別の態様では、本発明は、治療を必要とする患者に治療上有効な量の上記に記載されている修飾されたタンパク質を投与することを含む、急性リンパ芽球性白血病を治療する方法を対象とする。具体的な態様では、週に約２回から月に約１回に及ぶ、通常、週に１回から２週に１回のスケジュールで約１５００ＩＵ／ｍ２〜約１５，０００ＩＵ／ｍ２、通常約１０，０００〜約１５，０００ＩＵ／ｍ２（約２０〜３０ｍｇのタンパク質／ｍ２）の用量で治療が施される。上記に記載されている修飾されたタンパク質は、単剤として投与されてもよく（単剤療法）、またはグルココルチコイド、コルチコステロイド、抗癌化合物を含むが、これらに限定されない化学療法剤、またはメソトレキセート、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、ビンクリスチン、サイクロホスファミド及びアントラサイクリンを含むが、これらに限定されない他の作用物質の併用の一部として投与されてもよい。例として、ＡＬＬ患者は、導入、補助または強化、及び維持を含む３つの化学療法フェーズの間での多剤化学療法の成分として上記に記載されている修飾されたタンパク質を投与されるであろう。具体例では、上記に記載されている修飾されたタンパク質は、アスパラギンシンターゼ阻害剤（たとえば、全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ２００７／１０３２９０にて述べられたような）と共に投与されない。別の具体例では、上記に記載されている修飾されたタンパク質は、アスパラギンシンターゼ阻害剤と共に投与されず、他の化学療法剤と共に投与される。上記に記載されている修飾されたタンパク質は、多剤化学療法投薬計画の一部として他の化合物の前に、後で、またはそれと同時に投与することができる。
具体的な実施形態では、方法は、約１Ｕ／ｋｇ〜約２５Ｕ／ｋｇ（たとえば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５Ｕ／ｋｇ）の量またはそれと同等の量（たとえば、タンパク質含量ベースで）の上記に記載されている修飾されたタンパク質を投与することを含む。送達される修飾されたタンパク質の量は、多数の要因、たとえば、化合物のＩＣ５０、ＥＣ５０、生物学的半減期、患者の年齢、大きさ、体重及び身体状態、ならびに治療される疾患または障害に左右されるであろう。考慮されるこれらの要因及び他の要因の重要性は当業者に周知である。ある特定の実施形態では、投与される修飾されたタンパク質の量は患者の身体の表面積の平方メートル当たり約１０国際単位（ＩＵ／ｍ２）から５０，０００ＩＵ／ｍ２までに及んでもよい。追加の態様では、修飾されたタンパク質は、約５、約１０及び約２５Ｕ／ｋｇから成る群から選択される量で投与される。別の具体的な態様では、修飾されたタンパク質は、約１，０００ＩＵ／ｍ２から約２０，０００ＩＵ／ｍ２までに及ぶ（たとえば、１，０００ＩＵ／ｍ２、２，０００ＩＵ／ｍ２、３，０００ＩＵ／ｍ２、４，０００ＩＵ／ｍ２、５，０００ＩＵ／ｍ２、６，０００ＩＵ／ｍ２、７，０００ＩＵ／ｍ２、８，０００ＩＵ／ｍ２、９，０００ＩＵ／ｍ２、１０，０００ＩＵ／ｍ２、１１，０００ＩＵ／ｍ２、１２，０００ＩＵ／ｍ２、１３，０００ＩＵ／ｍ２、１４，０００ＩＵ／ｍ２、１５，０００ＩＵ／ｍ２、１６，０００ＩＵ／ｍ２、１７，０００ＩＵ／ｍ２、１８，０００ＩＵ／ｍ２、１９，０００ＩＵ／ｍ２、または２０，０００ＩＵ／ｍ２）用量で投与される。別の具体的な態様では、上記に記載されている修飾されたタンパク質は、当該技術で既知の方法及び装置を用いてＬ−アスパラギンが検出不能であるレベルまで枯渇させる用量で、単回用量で約３日間〜約１０日間（たとえば、３、４、５、６、７、８、９または１０日間）の期間投与される。
修飾されたタンパク質は、Ｌ−アスパラギンを検出不能のレベルまで枯渇させる用量で約３日間〜約１０日間、約５日間〜２０日間、約１日間〜１５日間、または約２日間〜３０日間、投与されてもよい。修飾されたタンパク質は、Ｌ−アスパラギンを検出不能のレベルまで枯渇させる用量で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間から約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０日間までの期間投与されてもよい。修飾されたタンパク質は、静脈内にまたは筋肉内に投与されてもよい。追加の実施形態では、前記修飾されたタンパク質は、週当たり１回もしくは２回、週当たり１回未満、または単剤療法として投与されてもよい。
本発明は、本明細書で定義されているような修飾されたタンパク質または本明細書に記載されているようなプロセスによって調製される修飾されたタンパク質を含む組成物に関する。組成物は、任意でさらに薬学上許容できる担体（複数可）または賦形剤（複数可）を含む医薬組成物であってもよい。
本発明はまた、上記に記載されている修飾されたタンパク質を含む医薬組成物にも関する。具体的な態様では、その製造にどんな細菌供給源が使用されていても、たとえば、現在利用できる自然のＬ−アスパラギナーゼ（たとえば、Ｋｉｄｒｏｌａｓｅ（登録商標）、Ｅｌｓｐａｒ（登録商標）、Ｅｒｗｉｎａｓｅ（登録商標））のような医薬組成物は、溶媒で再構成される凍結乾燥粉末としてバイアルに含有される。別の態様では、たとえば、ペガスパルガーゼ（Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標））のような医薬組成物は、適当な取り扱い、たとえば、筋肉内、静脈内（点滴及び／またはボーラス）、脳室内（ｉｃｖ）、皮下の経路を介した投与を可能にする「使用準備済み」の溶液である。
修飾されたタンパク質は、それを含む組成物（たとえば、医薬組成物）を含めて、標準の技法を用いて患者に投与することができる。技法及び製剤は一般にＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｎｄ ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，（２０１２）にて見いだされ得る。好適な剤形は、用途または投与経路、たとえば、経口、経皮、経粘膜の経路、または注射による（非経口の）経路にある程度依存する。そのような剤形は、治療剤が標的細胞に到達できるようにすべきであり、または別様に所望の治療効果を有するべきである。たとえば、血流に注入される医薬組成物は好ましくは可溶性である。本発明に係る医薬組成物は薬学上許容できるその塩及び錯体として製剤化することができる。薬学上許容できる塩はそれらが投与される量及び濃度で存在する非毒性の塩である。そのような塩の製剤は、それがその生理的効果を発揮するのを妨げることなく化合物の物理的特徴を変えることによって薬学上の使用を円滑にすることができる。物性の有用な変化には、融点を下げて経粘膜投与を容易にすること、及び溶解度を上げて高い濃度の薬剤の投与を容易にすることが挙げられる。本明細書に記載されているような修飾されたタンパク質の薬学上許容できる塩は、当業者が十分に理解するであろうように、錯体として存在してもよい。薬学上許容できる塩には、たとえば、硫酸塩、塩酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リン酸塩、スルファミン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩、及びキナ酸塩を含有するもののような酸付加塩が挙げられる。薬学上許容できる塩は、塩酸、マレイン酸、硫酸、リン酸、スルファミン酸、酢酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、マロン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキシルスルファミン酸、フマル酸及びキナ酸を含む酸から得ることができる。薬学上許容できる塩にはまた、カルボン酸またはフェノールのような酸性官能基が存在する場合、たとえば、ベンザチン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン、プロカイン、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、アンモニウム、アルキルアミン、及び亜塩を含有するもののような塩基付加塩も挙げられる。たとえば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記を参照のこと。そのような塩は適当な対応する塩基を用いて調製することができる。薬学上許容できる担体及び／または賦形剤も本発明に係る医薬組成物に組み込んで特定のアスパラギナーゼの投与を容易にすることができる。本発明の実践で使用するのに好適な担体の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、たとえば、ラクトース、グルコース、もしくはスクロースのような種々の糖、または種々のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、及び生理的に適合する溶媒が挙げられる。生理的に適合する溶媒の例には、注射用水（ＥＦＩ）、生理食塩水及びデキストロースの無菌溶液が挙げられる。本発明に係る医薬組成物は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経口、局所（経皮）または経粘膜の投与を含む種々の経路によって投与することができる。全身性投与については、経口投与が好ましい。経口投与については、たとえば、化合物は、たとえば、カプセル剤、錠剤、ならびにたとえば、シロップ、エリキシル、及び濃縮ドロップのような液状製剤のような従来の経口剤形に製剤化することができる。あるいは、注射（非経口投与）、たとえば、筋肉内、静脈内、腹腔内及び皮下の注射が使用されてもよい。注射については、医薬組成物は、液体溶液、好ましくは、たとえば、生理食塩水、ハンクス溶液、リンガー溶液のような生理的に適合する緩衝液または溶液にて製剤化される。加えて、化合物は固形形態で製剤化され、使用直前に再溶解または懸濁されてもよい。たとえば、修飾されたタンパク質の凍結乾燥形態を製造することができる。具体的な態様では、修飾されたタンパク質は筋肉内に投与される。好ましい具体的な態様では、修飾されたタンパク質は静脈内に投与される。
全身性投与は経粘膜または経皮の手段によっても達成することができる。経粘膜または経皮の投与については、透過されるバリアに適する浸透剤が製剤で使用される。そのような浸透剤は当該技術で周知であり、それには、たとえば、経粘膜投与用での胆汁塩及びフシジン酸誘導体が挙げられる。加えて、透過を促進するのに界面活性剤が使用されてもよい。経粘膜投与は、たとえば、鼻内噴霧器、吸入器（肺送達用）、直腸坐薬または膣坐薬を介してもよい。局所投与については、化合物は、当該技術で周知のように軟膏、膏薬、ジェル、またはクリームに製剤化することができる。
一態様では、本発明は治療法における本明細書に記載されているような修飾されたタンパク質の使用にも関する。使用は、Ｌ−アスパラギンの枯渇によって治療できる疾患を治療する方法として上記に記載されているＬ−アスパラギンの枯渇によって治療できる疾患を治療することのためであってもよい。一態様では、本発明は、薬物として使用するための／治療法で使用するための／医学で使用するための本明細書に記載されているような修飾されたタンパク質または本明細書に記載されているようなプロセスによって調製される修飾されたタンパク質、または本明細書に記載されているような修飾されたタンパク質を含む組成物に関する。
一態様では、本発明は、患者にてＬ−アスパラギンの枯渇によって治療できる疾患の治療で使用するための本明細書に記載されているような修飾されたタンパク質または本明細書に記載されているようなプロセスによって調製される修飾されたタンパク質、または本明細書に記載されているような修飾されたタンパク質を含む組成物に関する。本発明はまた、患者にてＬ−アスパラギンの枯渇によって治療できる疾患を治療するための薬物の調製における本明細書に記載されているような修飾されたタンパク質または本明細書に記載されているようなプロセスによって調製される修飾されたタンパク質、または本明細書に記載されているような修飾されたタンパク質を含む組成物の使用に関する。本発明はまた、患者にてＬ−アスパラギンの枯渇によって治療できる疾患を治療する方法にも関するものであり、前記方法は前記患者に有効量の本明細書に記載されているような修飾されたタンパク質、本明細書に記載されているようなプロセスによって調製される修飾されたタンパク質、または本明細書に記載されているような組成物を投与することを含む。好ましくは、Ｌ−アスパラギンの枯渇によって治療できる疾患はがんである。
好ましい態様では、本発明は、がんの治療で使用するための本明細書に記載されているような修飾されたタンパク質または本明細書に記載されているようなプロセスによって調製される修飾されたタンパク質、または本明細書に記載されているような修飾されたタンパク質を含む組成物に関する。本発明はまた、がんを治療するための薬物の調製における本明細書に記載されているような修飾されたタンパク質または本明細書に記載されているようなプロセスによって調製される修飾されたタンパク質、または本明細書に記載されているような修飾されたタンパク質を含む組成物の使用にも関する。本発明はまた、対象に本明細書に記載されているような修飾されたタンパク質または本明細書に記載されているようなプロセスによって調製される修飾されたタンパク質、または本明細書に記載されているような組成物を投与することを含む、がんを治療する方法にも関する。
本明細書では、治療される対象は哺乳類、特にヒトであることが好ましい。
がんは非固形がんであってもよく、たとえば、白血病または非ホジキンリンパ腫である。好ましくは、前記白血病は急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）または急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
修飾されたタンパク質は、コンジュゲートされていないＬ−アスパラギナーゼと比べて患者にて免疫原性が低い反応を引き出し得る。修飾されたタンパク質は、コンジュゲートされていないＬ−アスパラギナーゼと比べて単回投与の後、生体内での長い循環半減期を有し得る。修飾されたタンパク質は、コンジュゲートされていないＬ−アスパラギナーゼと比べて単回投与の後、大きなＡＵＣ値を有することができる。患者は、Ｅ．ｃｏｌｉのＬ−アスパラギナーゼまたはそのペグ化形態に対して過敏性の既往を有し得る。
本発明は、以下の非限定の図及び実施例を参照してさらに説明される。
以下の実施例は本発明を説明する。
実施例１：ピログルタモイル−Ｐ／Ａ（２０）−アミノヘキサノイル−クリサンタスパーゼの調製のためのカップリング比の最適化
４．３８ｍｇのＰｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）−Ａｈｘペプチド（図１Ａ、ＴＦＡ塩、純度９８％、ＰＳＬ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（配列番号１６、アミノ酸配列は配列番号５に示す）を６６．３μＬのＤＭＳＯに溶解した。その末端カルボン酸基を介したＰ／Ａペプチドの化学的活性化は、５００ｍＭのＴＢＴＵ（ＣＡＳ＃１２５７００−６７−６；Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍａｒｋｔｒｅｄｗｉｔｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＤＭＡＯ溶液２３．７μＬとＤＩＰＥＡ２．７μＬとのペプチド溶液への添加及びボルテックス撹拌によって開始した（図１Ｃ参照）。この設定で、ペプチドの濃度は２５．８ｍＭであり、ＤＩＰＥＡ、ＴＢＴＵ及びＰｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）−Ａｈｘの間でのモル比は５：５：１であった。２５℃での１０分間のインキュベートの後、表１に従ってエッペンドルフチューブにて混合物を希釈した。
２ｍｇ／ｍＬの濃度でのＤｉｃｋｅｙａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのＬ−アスパラギナーゼ（クリサンタスパーゼ、配列番号１、Ｅ．ｃｏｌｉにて産生された組換え（ロットＲＥ−ＬＡＰ−Ｐ５７Ｄ）の溶液をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ：１１５ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４及び１６ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．４）にて調製し、表１で述べられた体積に従って各エッペンドルフチューブにピペットで入れた。反復ピペッティング及びボルテックス撹拌によって混合した後、２５℃で３０分間カップリング反応を行わせた。２５０ｍＭの最終濃度にグリシン（Ｔｒｉｓ塩基で調整したｐＨ８．０）を添加することによって反応を止めた。
修飾されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を図２に示す。個々のバンドはそれぞれ１つのカップリングしたＰ／Ａペプチドが異なるタンパク質で修飾されたタンパク質に対応する。タンパク質のｍｇ当たりの０．３〜１０ｍｇのペプチドの比によるカップリング反応のミックスの追加の適用は、コンジュゲートされなかったタンパク質から出発する連続したラダーにおけるバンドの計数を可能にしたので、カップリングしたＰ／Ａペプチドの数を正確に決定することができた。バンドの強度はＱｕａｎｔ ｖ１２ソフトウェア（ＴｏｔａｌＬａｂ、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｕｐｏｎ Ｔｙｎｅ，ＵＫ）を用いてデンシトメーターで定量し、そのバンド強度について加重したクリサンタスパーゼ当たりのカップリングしたペプチドの数の算術平均値を算出した（表２参照）。クリサンタスパーゼのｍｇ当たり３．５ｍｇのＰ／Ａペプチドはクリサンタスパーゼ単量体当たり９〜１２のＰ／Ａペプチド（平均値：１０．４）の範囲でのカップリング比を生じた。クリサンタスパーゼのｍｇ当たり１０ｍｇのＰ／Ａペプチドまで適用する質量比を高めることがクリサンタスパーゼの当たり１０〜１３のＰ／Ａペプチド（平均値：１２．０）のカップリング比を生じるというわずかな上昇にしかつながらなかったということは、アクセスできるアミノ基の飽和を示している。
ランニング緩衝液として２５ｍＭのＮａ−ホウ酸、ｐＨ９．０，１ｍＭのＥＤＴＡ及びタンパク質を溶出するために０〜１ＭのＮａＣｌの濃度勾配を用いたＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）におけるアニオン交換クロマトグラフィーによって、修飾されたタンパク質を精製した。各クリサンタスパーゼ修飾タンパク質のＬ−アスパラギナーゼのアミノ加水分解酵素活性は、Ｌ−アスパラギン酵素活性を介して遊離するアンモニアのＮｅｓｓｌｅｒ試薬との反応によって決定した。手短には、５０μＬの酵素溶液を、０．０１５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含有する１００ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．６における２０ｍＭのＬ−アスパラギンと混合し、３７℃で１５分間インキュベートした。２００μＬのＮｅｓｓｌｅｒ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の添加によって反応を止めた。この溶液の吸光度を４５０ｎｍで測定した。活性は、参照としての硫酸アンモニウムから得られた較正曲線から算出した。結果を表２で要約する。
実施例２：ピログルタモイル−Ｐ／Ａ（４０）−アミノヘキサノイル−クリサンタスパーゼの調製
２８ｍｇのピログルタモイル−Ｐ／Ａ＃１（４０）−Ａｈｘペプチド（配列番号１７、アミノ酸配列は配列番号１５で示す）、図１Ｂ、ＴＦＡ塩、純度９８％、Ａｌｍａｃ Ｇｒｏｕｐ、Ｃｒａｉｇａｖｏｎ，ＵＫ）を１３２４μＬの無水ＤＭＳＯ（９９．９％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に溶解した。その末端カルボン酸基を介したＰ／Ａペプチドの化学的活性化を達成するために、５００ｍＭのＴＢＴＵ（ＣＡＳ＃１２５７００−６７−６、Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍａｒｋｔｒｅｄｗｉｔｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＤＭＳＯ溶液１６２μＬを加え、混合した後、１４μＬのＤＩＰＥＡ（９９．５％，バイオテクノロジー等級，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。混合物全体を手短にボルテックス撹拌し、２５℃で２０分間インキュベートした（図１Ｃ参照）。この設定で、ペプチドの濃度は５．４１ｍＭであり、ＤＩＰＥＡ、ＴＢＴＵ及びＰｇａ−Ｐ／Ａ＃１（４０）−Ａｈｘの間でのモル比は１０：１０：１であった。
３．５ｍＬの氷冷クリサンタスパーゼ溶液（配列番号１）（ＰＢＳにて２ｍｇ／ｍＬ）を活性化したペプチド溶液（１．５ｍＬ）と混合し、５：１のＰｇａ−Ｐ／Ａ＃１（４０）−Ａｈｘとクリサンタスパーゼの質量比を生じ、室温で３０分間インキュベートしてカップリングさせた。再生セルロース膜透析管（ＭＷＣＯ ５０ｋＤａ，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、５ＬのＡＥＸランニング緩衝液（２５ｍＭのＮａ−ホウ酸、ｐＨ９．０，１ｍＭのＥＤＴＡ）に対して溶液を透析し、Ｓｏｕｒｃｅ（商標）１５Ｑ樹脂を詰めたＨｉＳｃａｌｅ（商標）１６／４０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのアニオン交換クロマトグラフィーに供した。カラムはＡＥＸランニング緩衝液で平衡化し、タンパク質で修飾されたタンパク質は１カラム容量での０〜１５０ｍＭ及び０．２５カラム体積での１５０〜１０００ｍＭのＮａＣｌの区分化濃度勾配を用いて溶出した（図３Ａ）。
タンパク質のｍｇ当たり０．３〜１０ｍｇのペプチドの比でのカップリング反応のミックスから得られたラダーと並行して溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用することは、クリサンタスパーゼ単量体当たりの９〜１１のＰＡペプチド（平均値：１０．０）のカップリング比の決定を可能にした（図３Ｂ）。実施例１に記載されているＮｅｓｓｌｅｒアッセイを用いて決定されたクリサンタスパーゼ／ＰＡ（４０）修飾タンパク質の酵素活性は、同様にアッセイされた未修飾のクリサンタスパーゼの活性の７８．２％だった。
実施例３：ピログルタモイル−Ｐ／Ａ（２０）−アミノヘキサノイル−クリサンタスパーゼの調製
２１ｍｇのピログルタモイル−Ｐ／Ａ＃１（２０）−Ａｈｘペプチド（配列番号５、図１Ａ、ＴＦＡ塩、純度９８％、ＰＳＬ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を１３７６μＬの無水ＤＭＳＯ（９９．９％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に溶解した。その末端カルボン酸基を介したＰ／Ａペプチドの化学的活性化を達成するために、５００ｍＭのＴＢＴＵ（ＣＡＳ＃１２５７００−６７−６、Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍａｒｋｔｒｅｄｗｉｔｚ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入した）のＤＭＳＯ溶液１１４μＬを加え、混合した後、１０μＬのＤＩＰＥＡ（９９．５％、バイオテクノロジー等級、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。混合物全体を手短にボルテックス撹拌し、２５℃で２０分間インキュベートした（図１Ｃ）。この設定で、ペプチド濃度は７．５８ｍＭであり、ＤＩＰＥＡ、ＴＢＴＵ及びＰｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）−Ａｈｘの間でのモル比は５：５：１であった。
３．５ｍＬの氷冷クリサンタスパーゼ溶液（配列番号１）（ＰＢＳにて２ｍｇ／ｍＬ）を活性化されたペプチド溶液（１．５ｍＬ）と混合して５：１のＰｇａ−Ｐ／Ａ＃１（４０）−Ａｈｘとクリサンタスパーゼの間での質量比を生じ、室温にて３０分間インキュベートしてカップリングさせた。再生セルロース膜透析管（ＭＷＣＯ ５０ｋＤａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、５ＬのＡＥＸランニング緩衝液（２５ｍＭのＮａ−ホウ酸、ｐＨ９．０，１ｍＭのＥＤＴＡ）に対して溶液を透析し、Ｓｏｕｒｃｅ（商標）１５Ｑ樹脂を詰めたＨｉＳｃａｌｅ（商標）１６／４０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのアニオン交換クロマトグラフィーに供した。カラムはＡＥＸランニング緩衝液で平衡化し、タンパク質で修飾されたタンパク質は１カラム体積での０〜１５０ｍＭ及び０．２５カラム体積での１５０〜１０００ｍＭのＮａＣｌの区分化濃度勾配を用いて溶出した（図４Ａ）。
タンパク質のｍｇ当たり０．３〜１０ｍｇのペプチドの比でのカップリング反応のミックスから得られたラダーと並行して溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用することは、クリサンタスパーゼ単量体当たりの１０〜１３のＰＡペプチドのカップリング比（平均値：１１．９）の決定を可能にした（図４Ｂ）。実施例１に記載されているＮｅｓｓｌｅｒアッセイを用いて決定されたクリサンタスパーゼ／ＰＡ（２０）修飾タンパク質の酵素活性は、同様にアッセイされた未修飾のクリサンタスパーゼの活性の９１．２％だった。
実施例４：様々な長さのＰ／Ａ配列にＮ末端融合したクリサンタスパーゼのペリプラズム産生のための発現プラスミドのクローニング
Ｄｉｃｋｅｙａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのＬ−アスパラギナーゼの成熟アミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤＰ０６６０８）をコードする合成ＤＮＡ断片を遺伝子合成供給業者（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。この遺伝子断片（配列番号４）は、ＸｂａＩ制限部位と、それに続くリボソーム結合部位と、Ｅｎｘシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と、それに続くＧＣＣアラニンコドンと、非コーディング鎖上の第１のＳｐａＩ認識配列ＧＣＴＣＴＴＣと、１１のヌクレオチドのスペーサーと、コーディング鎖上のその認識配列ＧＣＴＣＴＴＣとは逆相補性の方向での第２のＳｐａＩ制限配列と、それに続く、成熟Ｌ−アスパラギナーゼのコーディング配列に直接連結されるＧＣＣアラニンコドンと、最終的にそれに続くＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とを含んだ。
標準の手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，（２０１２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に従って、隣接する制限部位ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを介してこの遺伝子断片をｐＡＳｋ７５にクローニングした。得られたプラスミド（図５Ａ）をＳｐａＩで消化し、それはＳｐａＩ認識部位と、Ｌ−アスパラギナーゼのコードされた成熟Ｎ末端の直前の位置で適合５’−ＧＣＣ／５’−ＧＧＣ付着末端を持つ切断されたベクター主鎖とを含有する小さな（３０ｂｐ）のＤＮＡ挿入断片の遊離につながったが、それは理想的にプロリン／アラニンが豊富なアミノ酸反復配列をコードする反復性が低い核酸分子の挿入に適する。双方とも製造元の指示書に従ったＰｒｏｍｅｇａ Ｗｉｚａｒｄゲル抽出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたベクター断片の単離及び熱感受性のアルカリホスファターゼＦａｓｔＡＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）による脱リン酸化の後、ＥａｒＩ制限消化を介して、それをｐＸＬ２−ＰＡ＃１ｂ（２００）（配列番号８）から切り出したＰＡ＃１ｂ（２００）遺伝子カセット、またはｐＸＬ２−ＰＡ＃１ｃ／１ｂ（４００）（配列番号１０）から切り出したＰＡ＃１ｃ／１ｂ（４００）遺伝子カセットにライゲーションした。得られたプラスミド（配列番号１２及び配列番号１４）（図５Ｂ）は、生物学的に活性があるタンパク質クリサンタスパーゼに融合したプロリン／アラニンが豊富なアミノ酸反復配列から成る融合タンパク質（配列番号１１及び配列番号１３）の（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるペリプラズムでの分泌の際Ｅｎｘシグナルペプチドの生体内での処理の後）細菌での発現を可能にする。
実施例５：ＰＡ＃１（２００）配列またはＰＡ＃１（４００）配列のいずれかとクリサンタスパーゼとの間での融合タンパク質の細菌での産生及び精製
ＰＡ＃１（２００）−クリサンタスパーゼ及びＰＡ＃１（４００）−クリサンタスパーゼの融合タンパク質（算出質量：それぞれ、５１ｋＤａ及び６７ｋＤａ）は双方とも、公開された手順（Ｓｃｈｉｗｅｃｋ，（１９９５），Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２３：５６１−５６５）に従って、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンで補完した合成グルコース無機培地を伴った８Ｌの卓上発酵槽を用いて実施例４に由来する発現プラスミドｐＡＳＫ７５−ＰＡ２００−クリサンタスパーゼまたはｐＡＳＫ７５−ＰＡ４００−クリサンタスパーゼ（図５Ｂ）を内部に持つＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０にて２５℃で産生された。組換え遺伝子の発現は、培養物がＣＤ５５０＝４０に達するとすぐ５００μｇ／Ｌのアンヒドロテトラサイクリン（Ｓｋｅｒｒａ，（１９９４），ｌｏｃ． ｃｉｔ.）を加えることによって誘導した。２．５時間のインキュベート時間の後、遠心分離によって細胞を回収し、氷冷ペリプラズム分画緩衝液（５００ｍＭのスクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのホウ酸／ＮａＯＨ、ｐＨ８．０、２ｍｌ／Ｌ及びＯＤ５５０）にて１０分間再懸濁させた。１５ｍＭのＥＤＴＡ及び２５０μｇ／ｍＬのリゾチームを加えた後、細胞懸濁液を氷上で２０分間インキュベートし、数回遠心分離し、組換えタンパク質を含有する透明な上清を回収した。
１ｍＭのＥＤＴＡを含有する１５ＬのＰＢＳに対して４℃で少なくとも６時間、ペリプラズム抽出物をそれぞれ２回透析し、０．２μｍの硝酸セルロース膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて濾過し、硫酸アンモニウム（欧州薬局方グレード、Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を２５℃で２５％の飽和まで加えることによって沈殿させた。遠心分離の後、上清を取り除き、沈殿物をＡＥＸランニング緩衝液（２５ｍＭのＮａ−ホウ酸、ｐＨ９．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁し、５ＬのＡＥＸランニング緩衝液に対して４℃にて少なくとも６時間透析した。透析したタンパク質溶液を遠心分離によって残りの不溶性物質から清澄化し、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ樹脂を詰め、Ａｋｔａ（商標）純化装置システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続され、ＡＥＸランニング緩衝液によって平衡化した８５ｍＬのＨｉＳｃａｌｅ（商標）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた減法アニオン交換クロマトグラフィーに供した。純粋なタンパク質を含有するカラム通過画分（図６Ａ及び６Ｂ参照）を５ＬのＰＢＳに対して２回透析した。
凝集の兆候がない均質なタンパク質調製物が、それぞれ８Ｌの発酵槽１つからＰＡ＃１（２００）−クリサンタスパーゼについては１２８ｍｇ及びＰＡ＃１（４００）−クリサンタスパーゼについては４８ｍｇの最終収量で得られた。タンパク質濃度は、１９３７０Ｍ−１ｃｍ−１の算出された吸光係数（Ｇｉｌｌ，（１９８９），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２：３１９−３２６）を用いて２８０ｎｍでの吸収を測定することによって決定した。融合タンパク質の酵素活性は実施例１に記載されているＮｅｓｓｌｅｒアッセイを用いて決定した。この設定で、同様にアッセイされた未修飾のクリサンタスパーゼに比べてＰＡ＃１（２００）−クリサンタスパーゼ融合タンパク質は１０９％の酵素活性を有し、ＰＡ＃１（４００）−クリサンタスパーゼは１１８％の酵素活性を有した。これは、少なくとも４０１アミノ酸の長さまでのＰ／ＡポリペプチドとのクリサンタスパーゼのＮ末端融合が酵素活性に影響を及ぼさないことを実証している。
実施例６：分析用ゲル濾過による遺伝的に及び化学的にＰＡＳ化したクリサンタスパーゼ双方についての流体力学的体積の測定
ランニング緩衝液としてのＰＢＳ（１１５ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１６ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）と共にＡｋｔａ（商標）純化装置１０システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、０．５ｍＬ／分の流速でＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）Ｓ２００上昇１０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。再生セルロースの使い捨て限外濾過装置（ＭＷＣＯ １０ｋＤａ；Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ＰＡ＃１（２００）またはＰＡ＃１（４００）のポリペプチドに遺伝子融合させた組換えクリサンタスパーゼ（実施例５に記載されている）及びＰｇａ−Ｐ／Ａ（４０）−Ａｈｘペプチド（実施例２に記載されている）またはＰｇａ−Ｐ／Ａ（２０）−Ａｈｘペプチド（実施例３に記載されている）と化学的にコンジュゲートされたクリサンタスパーゼをＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した。濃縮したＰＡＳ化酵素及びＰＡＳ化していない酵素の１５０μＬの試料を個々にカラムに供し、クロマトグラフィーのトレースを重ね合わせた（図７Ａ）。５つのタンパク質はすべて単一の均質なピークとして溶出した。
カラムの較正（図７Ｂ）については、以下の球状タンパク質（Ｓｉｇｍａ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の適切な混合物を０．５ｍｇ／ｍＬ〜１．０ｍｇ／ｍＬの間のタンパク質濃度でＰＢＳにて適用した：チトクロームｃ：１２．４ｋＤａ、オボアルブミン：４３．０ｋＤａ、ウシ血清アルブミン：６６．３ｋＤａ、アルコール脱水素酵素：１５０ｋＤａ、β−アミラーゼ：２００ｋＤａ、アポフェリチン：４４０ｋＤａ、サイログロブリン：６６０ｋＤａ。
結果として、組換えＰＡ融合タンパク質及び化学的にコンジュゲートした酵素調製物は双方とも、同じ分子量の対応する球状タンパク質よりも有意に大きなサイズを示した。Ｐ／Ａ（ポリ）ペプチド部分のサイズが増すとともに、この分子量／流体力学的体積の不均衡はさらに大きくなった。ＰＡ（２００）−クリサンタスパーゼについての見かけのサイズ上昇は融合していないクリサンタスパーゼと比べて５．１倍だったのに対して、真の質量は１．５倍大きいに過ぎなかった。融合していないクリサンタスパーゼと比べたＰＡ（４００）−クリサンタスパーゼについての見かけのサイズ上昇は１０．４倍だったのに対して真の質量は１．９倍大きいに過ぎなかった。この観察は、本発明に係るＰｒｏ／Ａｌａポリペプチドのセグメントによって生物学的に活性があるクリサンタスパーゼ酵素に付与された大きく増大した流体力学的体積を明瞭に示している。
実施例７：化学的にまたは遺伝的にＰＡＳ化したクリサンタスパーゼのＥＳＩ−ＭＳ解析
すべて１ｍｇ／ｍＬの濃度での、実施例３に由来するＰｇａ−Ｐ／Ａ（２０）−Ａｈｘを伴ったクリサンタスパーゼの精製した化学修飾タンパク質２５０μＬ、及び実施例５に由来する組換えＰＡ２００融合タンパク質２５０μＬとＰＡ４００融合タンパク質２５０μＬを、ランニング緩衝液として２％ｖ／ｖのアセトニトリル、１％ｖ／ｖのギ酸を用い、Ａｋｔａ（商標）純化装置システムに接続された１ｍＬのＲｅｓｏｕｒｃｅ（商標）ＲＰＣカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に供した。２０カラム体積にわたる２％ｖ／ｖのアセトニトリル、１％ｖ／ｖのギ酸から８０％ｖ／ｖのアセトニトリル、０.１％ｖ／ｖのギ酸までのアセトニトリル勾配を用いてタンパク質を溶出した。陽イオンモードを用いたｍａＸｉｓ（商標）ｍｉｃｒＯＴＯＦ機器（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ、Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でのＥＳＩ質量分析を介して、溶出したタンパク質を直接分析した。クリサンタスパーゼ／Ｐｇａ−Ｐ／Ａ（２０）−Ａｈｘ化学修飾タンパク質の生のｍ／ｚスペクトルを図８Ａに示す。デコンボリューションした質量スペクトル（図８Ｂ）によって明らかにされた質量は表３にて与えられる。質量の分布は実施例２に記載されているＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって決定されたカップリング比に一致する。
組換えＰＡ＃１（２００）−クリサンタスパーゼ（配列番号１１）融合タンパク質の生のｍ／ｚスペクトルを図８Ｃに示す。デコンボリューションした質量スペクトルは５１１６４．７５Ｄａの質量を明らかにしたが（図８Ｄ）、それはこのタンパク質の計算上の質量（５１１６３．５８Ｄａ）と本質的に一致する。組換えＰＡ＃１（４００）−クリサンタスパーゼ融合タンパク質（配列番号１３）の生のｍ／ｚスペクトルを図８Ｅに示す。デコンボリューションしたスペクトル（図８Ｆ）は６７１９９．１７Ｄａの質量を明らかにしたが、それはこのタンパク質の計算上の質量（６７２０１．９９Ｄａ）と本質的に一致する。これは、ＰＡ２００またはＰＡ４００のいずれかに遺伝子融合したインタクトなクリサンタスパーゼ酵素が高度に均質な形態でＥ．ｃｏｌｉにて産生され得ることを明瞭に明らかにしている。
実施例８：アスパラギナーゼ活性
ＰＡＳ化されたＬ−アスパラギナーゼの酵素活性をＬ−アスパラギンのＬ−アスパラギン酸への変換の触媒によって決定した。この反応は変換されたＬ−アスパラギンのモル当たり１モルのアンモニアを遊離する。Ｎｅｓｓｌｅｒ試薬を用いて放出されたアンモニアを検出する。Ｎｅｓｓｌｅｒ試薬の存在下で、アンモニアは４５０ｎｍでの吸光度測定によって定量することができる水溶性の黄色の錯体を形成する（Ｍａｓｈｂｕｒｎ，ｅｔ ａｌ．（１９６３），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２，５０）。Ｌ−アスパラギナーゼ酵素活性の１単位（国際単位またはＩＵ）は分当たり１μｍｏｌのＬ−アスパラギンの変換を触媒する酵素の量として定義される。試料の比活性（ＩＵ／ｍｇ）はＩＵ／ｍＬで表されるＬ−アスパラギナーゼ活性の値をｍｇ／ｍＬで表されるタンパク質濃度で除すことによって決定される。ＰＡＳ化された配列を持つタンパク質単量体の質量を測定した。
Ｌ−アスパラギナーゼ活性の測定は、試料が、その後、飽和Ｌ−アスパラギン濃度のもとで３７℃にて１５分間インキュベートされる一連の最終酵素濃度に希釈されるエンドポイントアッセイに基づく。反応はＮｅｓｓｌｅｒ試薬の添加によって停止され、反応によって生成されるアンモニアの量は、基準として使用される硫酸アンモニウムの既知の量から構築される較正曲線から外挿される。次いで各試料についてアンモニアに対する酵素濃度のプロットを作成し、曲線の傾きを反応時間で除してＩＵ／ｍｇでの比活性を得る。比活性はＩＵ／ｍｇとして報告され、四捨五入した整数で報告される。
修飾されたタンパク質または融合タンパク質のそれぞれについて、当初の試験結果を以下の表に示す。
実施例９：薬物動態
ＰＡＳ化された融合タンパク質（ＰＡ−２００）としての、またはＰＡ−ペプチド（ＰＡ−２０）に化学的にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉで発現された組換えクリサンタスパーゼの薬物動態プロファイルをＣＤ−１マウスに対する単回静脈内ボーラス用量の投与に続いて特徴付けた。ＣＤ−１マウスは健常マウスのモデルである。
動物はすべて、投与に先立って得た体重に基づいて尾静脈側面を介した単回静脈内（ＩＶ）ボーラス（１０ｍＬ／ｋｇ）を受け入れた。個々の用量は最も最近の体重に基づいて算出し、適正な用量を提供した。投与の１日目は試験０日目の体重に基づいた。動物はすべて、死亡、異常、及び疼痛や苦痛の兆候について１日２回、朝１回と午後１回観察した。
ＰＡＳ化したアスパラギナーゼを２５ＩＵ／体重ｋｇの単回ＩＶ用量としてマウスに投与した。マウスの群に２５ＩＵ／体重ｋｇで投与し、投与に続いて１０日（２４０時間）までの計画された時間に血漿試料を採取した。マウスの血漿におけるアスパラギナーゼ活性を、前の実施例に記載されているような適格な生化学的アッセイを用いて測定した。時間データに対する平均血漿アスパラギナーゼ活性（ｎ＝４）をプロットし（図１）、薬物動態解析を行った。
投与に先立って及び投与の後およそ６時間、２４時間（１日目）、４８時間（２日目）、５１時間（２日目）、５４時間（２日目）、６０時間（２日目）、９６時間（４日目）、１６８時間（７日目）、及び２４０時間（１０日目）に血液試料を採取した。尾切断（尾端切断）採血法を採用した。最初の採血のために尾の遠位端でおよそ１〜２ｍｍ切断し、逐次の採血はすべて痂疲を取り除き、尾をなでることにより血流を促すことによって同じ部位から採取した。時点当たりおよそ１００μＬの血液を冷Ｋ３ＥＤＴＡ（Ｍｉｎｉｖｅｔｔｅ）試料採取管に採取した。血液を遠心分離に適した管に移した。血漿の単離のために、試料はすべて試料採取のおよそ２０分以内に、およそ４℃を維持するように設定された冷却遠心機にて３，０００×ｇでおよそ１０分間遠心分離した。遠心分離に続いて、血漿の最大量を回収し（３０μＬを目標とする）、プラスチックバイアルに入れた。プラスチックバイアルを試験まで−６５℃〜−８５℃で保存した。
以前記載された（Ａｌｌａｓ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｂｌｏｏｄ，１１４，２０３３）ように血漿試料にてアスパラギナーゼ活性をアスパラギナーゼの濃度として測定した。Ｒ２（終末消失速度定数、λｚを推定するのに使用される線形回帰用の相関係数の平方）が０．８より大きい場合にのみ、濃度対時間プロファイル（ｔ１／２、ＣＬ及びＶｓｓ）の終末相の十分な特徴付けに依存するパラメーターの報告を行った。薬物動態のデータを解析のためにＰｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎｖ６．４（Ｃｅｒｔａｒａ／Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）に取り込んだ。ＩＶボーラス投与のモデルにてわずかな試料採取での非コンパートメント法を用いて時間データに対する血漿アスパラギナーゼ活性を分析した。アッセイの定量の限界（１０Ｕ／Ｌ）を下回る活性値を群平均の計算ではゼロに設定した。名目上の用量レベル及び試料採取時間を計算に使用した。ｔ１／２の推定値はＰＡ−２０クリサンタスパーゼについては５０．２時間であり、ＰＡ−２００クリサンタスパーゼについては１７．９時間であった。
本発明は以下のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を参照する。
本明細書で提供されている一部の配列はＮＣＢＩのデータベースで利用することができ、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅから読み出すことができる。これらの配列はまた、注釈付きの配列及び修飾された配列にも関係する。本発明はまた、本明細書で提供されている相同性配列、及び簡潔な配列の変異体を使用する技法及び方法も提供する。好ましくは、そのような「変異体」は遺伝的変異体である。
配列番号１：
Ｄｉｃｋｅｙａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのＬ−アスパラギナーゼのアミノ酸配列
ＡＤＫＬＰＮＩＶＩＬＡＴＧＧＴＩＡＧＳＡＡＴＧＴＱＴＴＧＹＫＡＧＡＬＧＶＤＴＬＩＮＡＶＰＥＶＫＫＬＡＮＶＫＧＥＱＦＳＮＭＡＳＥＮＭＴＧＤＶＶＬＫＬＳＱＲＶＮＥＬＬＡＲＤＤＶＤＧＶＶＩＴＨＧＴＤＴＶＥＥＳＡＹＦＬＨＬＴＶＫＳＤＫＰＶＶＦＶＡＡＭＲＰＡＴＡＩＳＡＤＧＰＭＮＬＬＥＡＶＲＶＡＧＤＫＱＳＲＧＲＧＶＭＶＶＬＮＤＲＩＧＳＡＲＹＩＴＫＴＮＡＳＴＬＤＴＦＫＡＮＥＥＧＹＬＧＶＩＩＧＮＲＩＹＹＱＮＲＩＤＫＬＨＴＴＲＳＶＦＤＶＲＧＬＴＳＬＰＫＶＤＩＬＹＧＹＱＤＤＰＥＹＬＹＤＡＡＩＱＨＧＶＫＧＩＶＹＡＧＭＧＡＧＳＶＳＶＲＧＩＡＧＭＲＫＡＭＥＫＧＶＶＶＩＲＳＴＲＴＧＮＧＩＶＰＰＤＥＥＬＰＧＬＶＳＤＳＬＮＰＡＨＡＲＩＬＬＭＬＡＬＴＲＴＳＤＰＫＶＩＱＥＹＦＨＴＹ
配列番号２：
Ｄｉｃｋｅｙａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのＬ−アスパラギナーゼをコードするヌクレオチド配列
ＧＣＡＧＡＴＡＡＡＣＴＧＣＣＧＡＡＴＡＴＴＧＴＴＡＴＴＣＴＧＧＣＡＡＣＣＧＧＴＧＧＣＡＣＣＡＴＴＧＣＡＧＧＴＡＧＣＧＣＡＧＣＡＡＣＣＧＧＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＴＡＴＡＡＡＧＣＣＧＧＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＴＴＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＴＴＡＡＴＧＣＡＧＴＴＣＣＧＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＴＧＡＡＣＡＧＴＴＴＡＧＣＡＡＴＡＴＧＧＣＣＡＧＣＧＡＡＡＡＴＡＴＧＡＣＣＧＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＴＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＧＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＣＣＧＡＴＡＣＣＧＴＴＧＡＡＧＡＡＡＧＣＧＣＣＴＡＴＴＴＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＡＣＣＧＴＧＡＡＡＡＧＣＧＡＴＡＡＡＣＣＧＧＴＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＧＣＡＧＣＡＡＴＧＣＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＣＧＣＡＡＴＴＡＧＣＧＣＡＧＡＴＧＧＴＣＣＧＡＴＧＡＡＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＡＴＡＡＡＣＡＧＡＧＣＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＧＴＴＡＴＧＧＴＴＧＴＴＣＴＧＡＡＴＧＡＴＣＧＴＡＴＴＧＧＴＡＧＣＧＣＡＣＧＣＴＡＴＡＴＴＡＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＴＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＧＧＡＴＡＣＣＴＴＴＡＡＡＧＣＣＡＡＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴＴＡＴＣＴＧＧＧＣＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＣＡＡＴＣＧＣＡＴＴＴＡＴＴＡＴＣＡＧＡＡＴＣＧＣＡＴＴＧＡＴＡＡＡＣＴＧＣＡＴＡＣＣＡＣＣＣＧＴＡＧＣＧＴＴＴＴＴＧＡＴＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＣＣＧＡＡＡＧＴＴＧＡＴＡＴＴＣＴＧＴＡＴＧＧＣＴＡＴＣＡＧＧＡＴＧＡＴＣＣＧＧＡＡＴＡＴＣＴＧＴＡＴＧＡＴＧＣＡＧＣＣＡＴＴＣＡＧＣＡＴＧＧＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＡＴＴＧＴＧＴＡＴＧＣＡＧＧＴＡＴＧＧＧＴＧＣＡＧＧＴＡＧＣＧＴＴＡＧＣＧＴＴＣＧＴＧＧＴＡＴＴＧＣＡＧＧＴＡＴＧＣＧＴＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＡＡＡＧＧＣＧＴＴＧＴＴＧＴＴＡＴＴＣＧＴＡＧＣＡＣＣＣＧＴＡＣＣＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＧＣＣＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＴＴＡＧＣＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡＴＣＣＧＧＣＡＣＡＴＧＣＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＧＣＡＣＴＧＡＣＣＣＧＴＡＣＣＡＧＣＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＴＧＡＴＴＣＡＧＧＡＡＴＡＴＴＴＴＣＡＴＡＣＣＴＡＴ
配列番号３：
Ｄｉｃｋｅｙａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのＬ−アスパラギナーゼのアミノ酸配列
シグナルペプチド：１〜２８；クローニング中に取り除いた：２９〜３９；４０〜３６６：アスパラギナーゼ
配列番号４
Ｄｉｃｋｅｙａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのＬ−アスパラギナーゼをコードするヌクレオチド配列（合成）
塩基１６０〜１１４０（太字）でコードされる成熟アスパラギナーゼ。従って、Ｌ−アスパラギナーゼをコードするヌクレオチド配列は１６０位から１１４０位までのヌクレオチドに及ぶ。
配列番号５：
ＰＡ（２０）ペプチドのアミノ酸配列
ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ
配列番号６：
ＰＡ（２０）ペプチドをコードするヌクレオチド配列
ＧＣＣＧＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣＣＧＣＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣ
配列番号７：
ＰＡ（２００）−ポリペプチドのアミノ酸配列
ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡ
配列番号８：
ＰＡ（２００）−ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
ＧＣＣＧＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣＣＧＣＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＣＧＣＣＧＧＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＴＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＣＧＣＧＧＣＧＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＧＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＧＧＣＴＧＣＧＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＣＣＣＣＣＧＣＴＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＡＧＣＧＣＣＣＧＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＣＧＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＣＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＣＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＧＧＣＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＧＣＧＧＣＴＣＣＡＧＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＣＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣ
配列番号９：
ＰＡ（４００）−ポリペプチドのアミノ酸配列
ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡ
配列番号１０：
ＰＡ（４００）−ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
ＧＣＣＧＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣＣＧＣＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＣＧＣＣＧＧＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＴＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＣＧＣＧＧＣＧＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＧＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＧＧＣＴＧＣＧＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＣＣＣＣＣＧＣＴＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＡＧＣＧＣＣＣＧＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＣＧＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＣＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＣＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＧＧＣＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＧＣＧＧＣＴＣＣＡＧＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＣＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＧＣＣＧＧＣＣＣＣＣＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣＧＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＣＧＣＧＧＣＡＣＣＧＧＣＴＧＣＣＧＣＧＣＣＣＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＣＧＧＣＴＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＣＧＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＴＧＣＣＣＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＣＧＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＣＧＣＴＧＣＣＣＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＡＣＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＧＣＣ
配列番号１１：
アスパラギナーゼ−ＰＡ（２００）−融合タンパク質のアミノ酸配列
ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＤＫＬＰＮＩＶＩＬＡＴＧＧＴＩＡＧＳＡＡＴＧＴＱＴＴＧＹＫＡＧＡＬＧＶＤＴＬＩＮＡＶＰＥＶＫＫＬＡＮＶＫＧＥＱＦＳＮＭＡＳＥＮＭＴＧＤＶＶＬＫＬＳＱＲＶＮＥＬＬＡＲＤＤＶＤＧＶＶＩＴＨＧＴＤＴＶＥＥＳＡＹＦＬＨＬＴＶＫＳＤＫＰＶＶＦＶＡＡＭＲＰＡＴＡＩＳＡＤＧＰＭＮＬＬＥＡＶＲＶＡＧＤＫＱＳＲＧＲＧＶＭＶＶＬＮＤＲＩＧＳＡＲＹＩＴＫＴＮＡＳＴＬＤＴＦＫＡＮＥＥＧＹＬＧＶＩＩＧＮＲＩＹＹＱＮＲＩＤＫＬＨＴＴＲＳＶＦＤＶＲＧＬＴＳＬＰＫＶＤＩＬＹＧＹＱＤＤＰＥＹＬＹＤＡＡＩＱＨＧＶＫＧＩＶＹＡＧＭＧＡＧＳＶＳＶＲＧＩＡＧＭＲＫＡＭＥＫＧＶＶＶＩＲＳＴＲＴＧＮＧＩＶＰＰＤＥＥＬＰＧＬＶＳＤＳＬＮＰＡＨＡＲＩＬＬＭＬＡＬＴＲＴＳＤＰＫＶＩＱＥＹＦＨＴＹ
配列番号１２：
アスパラギナーゼ−ＰＡ（２００）−融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（ＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）
塩基１２７〜１７１０（太字）でコードされた成熟融合タンパク質（配列番号１１）。従って、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は配列番号１２の１２７位から１７１０位までのヌクレオチドに及ぶことができる。その結果、本明細書で使用されるような「配列番号１２で示されるようなヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むまたはそれから成る修飾されたタンパク質」という用語は、「配列番号１２の１２７位から１７１０位までで示されるようなヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むまたはそれから成る修飾されたタンパク質」としてさらに狭く定義することができる。
配列番号１３：
アスパラギナーゼ−ＰＡ（４００）−融合タンパク質のアミノ酸配列
ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＤＫＬＰＮＩＶＩＬＡＴＧＧＴＩＡＧＳＡＡＴＧＴＱＴＴＧＹＫＡＧＡＬＧＶＤＴＬＩＮＡＶＰＥＶＫＫＬＡＮＶＫＧＥＱＦＳＮＭＡＳＥＮＭＴＧＤＶＶＬＫＬＳＱＲＶＮＥＬＬＡＲＤＤＶＤＧＶＶＩＴＨＧＴＤＴＶＥＥＳＡＹＦＬＨＬＴＶＫＳＤＫＰＶＶＦＶＡＡＭＲＰＡＴＡＩＳＡＤＧＰＭＮＬＬＥＡＶＲＶＡＧＤＫＱＳＲＧＲＧＶＭＶＶＬＮＤＲＩＧＳＡＲＹＩＴＫＴＮＡＳＴＬＤＴＦＫＡＮＥＥＧＹＬＧＶＩＩＧＮＲＩＹＹＱＮＲＩＤＫＬＨＴＴＲＳＶＦＤＶＲＧＬＴＳＬＰＫＶＤＩＬＹＧＹＱＤＤＰＥＹＬＹＤＡＡＩＱＨＧＶＫＧＩＶＹＡＧＭＧＡＧＳＶＳＶＲＧＩＡＧＭＲＫＡＭＥＫＧＶＶＶＩＲＳＴＲＴＧＮＧＩＶＰＰＤＥＥＬＰＧＬＶＳＤＳＬＮＰＡＨＡＲＩＬＬＭＬＡＬＴＲＴＳＤＰＫＶＩＱＥＹＦＨＴＹ
配列番号１４：
アスパラギナーゼ−ＰＡ（４００）−融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（ＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）
塩基１２７〜２１８４（太字）でコードされた成熟融合タンパク質（配列番号１３）。従って、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は配列番号１４の１２７位から２１８４位までのヌクレオチドに及ぶことができる。その結果、本明細書で使用されるような「配列番号１４で示されるようなヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むまたはそれから成る修飾されたタンパク質」という用語は、「配列番号１４の１２７位から２１８４位までで示されるようなヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むまたはそれから成る修飾されたタンパク質」としてさらに狭く定義することができる。


配列番号１５：ＰＡ（４０）ペプチドのアミノ酸配列
ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ
配列番号１６：修飾されたＰＡ（２０）ペプチド
Ｐｇａ−ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ−Ａｈｘ−ＣＯＯＨ
配列番号１７：修飾されたＰＡ（４０）ペプチド
Ｐｇａ−ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ−Ａｈｘ−ＣＯＯＨ
本明細書で引用されている参考文献はすべて参照によって完全に組み入れられる。今や本発明を完全に記載したが、本発明は、本発明及びその実施形態の精神または範囲に影響を及ぼすことなく、条件、パラメーター、等の広い且つ同等の範囲内で実践されてもよいことが当業者によって理解されるであろう。
参考文献の一覧
Ｃａｒｐｉｎｏ＆Ｅｌ−Ｆａｈａｍ，１９９５
Ｃａｒｐｉｎｏ，Ｌ．Ａ．及びＥｌ−Ｆａｈａｍ，Ａ．（１９９５），Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｆｌｕｏｒｏｆｏｒｍａｍｉｄｉｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ： ａ ｒａｐｉｄ−ａｃｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７（１９），５４０１−５４０２．
Ｅｌ−Ｆａｈａｍ，ｅｔ ａｌ．，２０１１
Ｅｌ−Ｆａｈａｍ，Ａ．＆Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，Ｆ．（２０１１），ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ，ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ａ ｌｅｔｔｅｒ ｓｏｕｐ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１１１（１１），６５５７−６６０２．
Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，２０１３
Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（２０１３），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ
Ｉｓｉｄｒｏ−Ｌｌｏｂｅｔ，２００９
Ｉｓｉｄｒｏ−Ｌｌｏｂｅｔ，Ａ．，Ａｌｖａｒｅｚ，Ｍ．＆Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，Ｆ．（２００９），Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０９（６），２４５５−２５０４．
Ｋｌｏｓｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９９
Ｋｌｏｓｅ，Ｊ．，Ｂｉｅｎｅｒｔ，Ｍ．，Ｍｏｌｌｅｎｋｏｐｆ，Ｃ．，Ｗｅｈｌｅ，Ｄ．，Ｚｈａｎｇ，Ｃ．−Ｗ．，Ｃａｒｐｉｎｏ，Ｌ．Ａ．＆Ｈｅｎｋｌｅｉｎ，Ｐ．（１９９９），２−Ｐｒｏｐａｎｅｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ（Ｔ３Ｐ）−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｅｇｍｅｎｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ａｎｄ ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ ｈｉｎｄｅｒｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８，１８４７−１８４８
Ｍｏｎｔａｌｂｅｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．，２００５
Ｍｏｎｔａｌｂｅｔｔｉ，Ｃ．Ａ．＆Ｆａｌｑｕｅ，Ｖ．（２００５），Ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，６１（４６），１０８２７−１０８５２
Ｖａｌｅｕｒ，ｅｔ ａｌ．，２００７
Ｖａｌｅｕｒ，Ｅ．＆Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｍ．（２００９），Ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ｂｅｙｏｎｄ ｔｈｅ ｍｙｔｈ ｏｆ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，３８（２），６０６−６３１
Ｖａｌｅｕｒ，ｅｔ ａｌ．，２００９
Ｖａｌｅｕｒ，Ｅ．＆Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｍ．（２００９），Ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ｂｅｙｏｎｄ ｔｈｅ ｍｙｔｈ ｏｆ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，３８（２），６０６−６３１
Ｗｕｔｓ，２０１２
Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．＆Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．（２０１２），Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ．

Claims (18)

  1. （ｉ）Ｌ−アスパラギナーゼと（ｉｉ）１以上の（ポリ）ペプチドとを含む修飾されたタンパク質であって、前記（ポリ）ペプチドがプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る、前記修飾されたタンパク質。
  2. 前記Ｌ−アスパラギナーゼが配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する請求項１に記載の修飾されたタンパク質。
  3. 前記修飾されたタンパク質がＬ−アスパラギナーゼとポリペプチドとの融合タンパク質であり、且つ前記ポリペプチドがプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成る請求項１または２に記載の修飾されたタンパク質。
  4. 前記ポリペプチドが約１００〜約６００のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基から成り、好ましくは、前記ポリペプチドが合計約２００のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基または合計約４００のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基から成り、好ましくは、前記プロリン残基が前記ポリペプチドの約１０％を超えて且つ約７０％未満を構成し、好ましくは、前記ポリペプチドがアミノ酸配列ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ（配列番号５）または前記配列の全体もしくは一部としての前記配列の円順列型もしくは多量体（複数可）を含むまたはそれから成る、請求項３に記載の修飾されたタンパク質。
  5. （ａ）前記ポリペプチドが配列番号７または９で示されるようなアミノ酸配列を含み、またはそれから成り、
    （ｂ）前記ポリペプチドが配列番号８または１０で示されるようなヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含み、またはそれから成る、
    請求項３または４に記載の修飾されたタンパク質。
  6. （ａ）前記修飾されたタンパク質が配列番号１１または１３で示されるようなアミノ酸配列を含み、またはそれから成り、
    （ｂ）前記修飾されたタンパク質が配列番号１２または１４で示されるようなヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含み、またはそれから成る、
    請求項３〜５のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
  7. Ｌ−アスパラギナーゼと、それぞれが独立してペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣである１以上のペプチドとの修飾されたタンパク質であり、
    （Ｐ／Ａ）はプロリン及びアラニンのアミノ酸残基のみから成るアミノ酸配列であり、ＲＮは前記アミノ酸配列のＮ末端アミノ基に連結される保護基であり、
    ＲＣはそのアミノ基を介して前記アミノ酸配列のＣ末端カルボキシ基に結合されるアミノ酸残基であり、
    各ペプチドは、前記ペプチドの前記Ｃ末端アミノ酸残基ＲＣのカルボキシ基と前記Ｌ−アスパラギナーゼの遊離のアミノ基とから形成されるアミド結合を介して前記Ｌ−アスパラギナーゼにコンジュゲートされ、
    前記ペプチドがコンジュゲートされる前記遊離のアミノ基の少なくとも１つが前記Ｌ−アスパラギナーゼのＮ末端αアミノ基ではなく、好ましくは前記アミノ酸配列が合計１５〜４５のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基から成り、好ましくは前記アミノ酸配列が２０のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基から成り、または前記アミノ酸配列が４０のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基から成り、且つ好ましくは前記プロリン残基が前記アミノ酸配列の約１０％を超えて且つ約７０％未満を構成する、請求項１または２に記載の修飾されたタンパク質。
  8. 前記アミノ酸配列が、ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ（配列番号５）またはＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ（配列番号１５）であり、好ましくはＲＮがピログルタモイルまたはアセチルであり、及び／またはＲＣがε−アミノヘキサン酸である請求項７に記載の修飾されたタンパク質。
  9. 前記ペプチドがコンジュゲートされる前記遊離のアミノ基の少なくとも１つが前記Ｌ−アスパラギナーゼのリシン残基のε−アミノ基であり、または
    前記ペプチドがコンジュゲートされる前記遊離のアミノ基が前記Ｌ−アスパラギナーゼの任意のリシン残基（複数可）のε−アミノ基（複数可）及び前記Ｌ−アスパラギナーゼのＮ末端α−アミノ基（複数可）を含む群から選択され、好ましくは前記Ｌ−アスパラギナーゼは４つのサブユニットで構成され、請求項７または８に記載の９〜１３のペプチドが前記Ｌ−アスパラギナーゼの各サブユニットにコンジュゲートされる、請求項７または８に記載の修飾されたタンパク質。
  10. 前記ポリペプチドまたはペプチドが前記修飾されたタンパク質の免疫原性の低下に介在する請求項１〜９のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質。
  11. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質をコードする核酸であって、
    好ましくは、前記核酸が
    （ａ）配列番号１２または１４のヌクレオチド配列を含む核酸、
    （ｂ）（ａ）で定義されるようなヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸、及び
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）で定義されるようなヌクレオチド配列に対する遺伝暗号の結果として縮重である核酸
    から成る群から選択される、前記核酸。
  12. 請求項１１に記載の核酸を含むベクター。
  13. 請求項１１に記載の核酸または請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞。
  14. 請求項１〜６及び１０のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質または請求項１１に記載の核酸の調製のためのプロセスであって、前記プロセスが請求項１３に記載の宿主細胞を培養することと、前記培養物または前記細胞から前記修飾されたタンパク質を単離することとを含む、前記プロセス。
  15. 請求項７〜１０のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質を調製するプロセスであって、
    前記プロセスが
    （ａ）式ＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣ−ａｃｔの活性化されたペプチドを前記Ｌ−アスパラギナーゼとカップリングしてＲＮが保護基である前記Ｌ−アスパラギナーゼとペプチドとの修飾されたタンパク質を得ることを含み、
    式中、ＲＣ−ａｃｔはＲＣのカルボキシ活性化形態であり、ＲＣ及び（Ｐ／Ａ）は調製される前記修飾されたタンパク質で定義されたとおりであり、ＲＮは（Ｐ／Ａ）のＮ末端アミノ基に連結される保護基であり、
    好ましくは、前記活性化されたペプチドにおける前記アミノ酸残基ＲＣ−ａｃｔの前記活性化されたカルボキシ基は活性があるエステル基である、前記プロセス。
  16. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質または請求項１４もしくは１５に記載のプロセスによって調製される前記修飾されたタンパク質を含み、任意でさらに薬学上許容できる担体（複数可）または賦形剤（複数可）を含む医薬組成物。
  17. 疾患の治療で使用するための請求項１〜１０のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質または請求項１４もしくは１５に記載のプロセスによって調製される前記修飾されたタンパク質または請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記疾患がＬ−アスパラギンの枯渇によって治療でき、且つがんである請求項１７に記載の使用のための修飾されたタンパク質もしくは請求項１７に記載の使用のための組成物、または
    がんの治療のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の修飾されたタンパク質、請求項１４もしくは１５に記載のプロセスによって調製される前記修飾されたタンパク質もしくは請求項１７に記載の組成物
    ［好ましくは前記がんが非固形がん、好ましくは白血病もしくは非ホジキンリンパ腫であり、前記白血病が急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）もしくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）であってもよく、
    好ましくは、前記修飾されたタンパク質が未修飾のＬ−アスパラギナーゼと比べて患者にて低い免疫原性反応を引き起こす］。
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