JP2020516901A

JP2020516901A - 検出方法および検出装置

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Publication number: JP2020516901A
Application number: JP2019556001A
Authority: JP
Inventors: ミカエルレビ，
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2017-04-14
Filing date: 2017-04-14
Publication date: 2020-06-11
Also published as: WO2018189911A1

Abstract

検出方法は、試料における、アルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物、および／または前記レニンのタンパク質分解の二次生成物を、液体クロマトグラフと質量分析計とを用い同時並行して検出することを含む。【選択図】図１

Description

本発明は、検出方法および検出装置に関する。

レニン−アンジオテンシン−−アルドステロン系（renin-angiotensin--aldosterone system; ＲＡＡＳ）は、血液の量および全身の血管抵抗の調節において重要な役割を果たしており、これらは共に心拍出量および動脈圧にも影響する。

図１１は、ＲＡＡＳにおける反応を模式的に示す。タンパク質分解酵素であるレニンは、主に腎臓により血液へと放出される。レニンはアンジオテンシン類の前駆体であるアンジオテンシノゲンに作用し、アンジオテンシンＩ（Ａｎｇ１）を産生する。アンジオテンシンＩは酵素によりさらに切断され、アンジオテンシンＩＩ（Ａｎｇ２）が生じる。アンジオテンシンＩＩは強力な血圧上昇ペプチドであり、副腎皮質からのアルドステロン放出含むいくつかの反応に関与している。この放出されたアルドステロンは、腎臓におけるナトリウムイオンおよび水の保持を促進し、これにより血液量および心拍出量が増加して動脈圧が高まる。

ＲＡＡＳの機能不全は正常でない動脈圧をもたらす（例えば、もしＲＡＡＳが異常に活性化すると、血圧は高くなり過ぎる）。高血圧、低血圧等に内在するこのようなＲＡＡＳの機能不全を検出するため、アルドステロンの血漿レニン活性に対する比（アルドステロン／レニン比、aldosterone-to-renin ratio; ＡＲＲ）を測定するアルドステロンおよびレニン検査が重要な診断ツールとして用いられている。これらのアルドステロンおよびレニン検査は、コン症候群としても知られる原発性アルドステロン症を含む様々な病気の検査に有用である。

アルドステロンは血中または２４時間尿サンプルから直接測定される一方、血漿レニン活性は、通常、所定のインキュベーション時間において生成されるアンジオテンシンＩの測定から算出される。

先行技術では、例えば、特許文献１においてアルドステロンは質量分析により定量され、特許文献２においてアンジオテンシンＩは質量分析により定量される。

国際公開第２０１６／１２３２７５号国際公開第２０１０／０１７４９９号

しかし、先行技術では、アルドステロンおよびアンジオテンシンＩは別々に測定されている。このような場合、測定の数が増えたり、かつ／または試料が異なる前処理に供される際に、データのばらつきが問題となり得る。とりわけ、アルドステロンおよびアンジオテンシンＩのデータが比較されたり、アルドステロンおよびアンジオテンシンＩのデータを用いてアルドステロン／レニン比のようなパラメータが算出される場合、このような比較またはパラメータの精度は影響を受け得る。

本発明の第１の態様によると、検出方法は、試料における、アルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物、および／または前記レニンのタンパク質分解の二次生成物を、液体クロマトグラフと質量分析計とを用い同時並行して検出することを備える。
本発明の第２の態様によると、第１の態様の検出方法において、前記レニンのタンパク質分解の生成物はアンジオテンシンＩであり、前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物はアンジオテンシンＩＩであることが好ましい。
本発明の第３の態様によると、第１または第２の態様の検出方法において、前記試料は、血漿または血清から調製されることが好ましい。
本発明の第４の態様によると、第１から第３までのいずれかの態様の検出方法において、前記液体クロマトグラフに前記試料が導入される前に、前記試料をオクタデシルシリルカラムに導入することをさらに備えることが好ましい。
本発明の第５の態様によると、第１から第４までのいずれかの態様の検出方法において、前記オクタデシルシリルカラムから出力される前記試料は、オンライン制御により前記液体クロマトグラフに導入されることが好ましい。
本発明の第６の態様によると、第１から第５までのいずれかの態様の検出方法において、アルドステロン、前記レニンのタンパク質分解の生成物、および、前記二次生成物が同時並行して検出され、前記方法は、前記試料に、前記レニンのタンパク質分解の生成物の第１内部標準を加えることと、前記試料に、前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物の第２内部標準を加えることとをさらに備え、前記第１内部標準は、分解された第１内部標準と前記第２内部標準とを分離して検出可能に設計されることが好ましい。
本発明の第７の態様によると、第６の態様の検出方法において、前記レニンのタンパク質分解の生成物は、アンジオテンシンＩであり、前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物は、アンジオテンシンＩの切断型であり、アンジオテンシンＩの前記切断型に対応する前記第１内部標準の一部と、前記第２内部標準は安定同位体により異なって標識されることが好ましい。
本発明の第８の態様によると、第１から第７までのいずれかの態様の検出方法において、アルドステロン、および前記レニンのタンパク質分解の生成物、および／または前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物の検出量に基づいて、アルドステロン／レニン比を算出することをさらに備えることが好ましい。
本発明の第９の態様によると、第１から第８までのいずれかの態様の検出方法において、前記レニンのタンパク質分解の生成物は、アンジオテンシンＩであり、前記方法は、アンジオテンシンＩのイオン化と、アルドステロンのイオン化との間に、正イオンモードから負イオンモードへとイオン化のモードを切り替えることをさらに備えることが好ましい。
本発明の第１０の態様によると、検出装置は、アルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物、および／または前記レニンのタンパク質分解の二次生成物を含む試料が導入される入力部と、液体クロマトグラフと、前記試料における、アルドステロン、および前記レニンのタンパク質分解の生成物、および／または前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物を同時並行して検出する質量分析計とを備える。
本発明の第１１の態様によると、第１０の態様の検出装置において、前記液体クロマトグラフに接続されたオクタデシルシリルカラムであって、アルドステロン、および前記レニンのタンパク質分解の生成物、および／または前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物をオンライン方式で抽出する前記カラムを備えることが好ましい。
本発明の第１２の態様によると、第１０または第１１の態様の検出装置において、アルドステロン、および前記レニンのタンパク質分解の生成物、および／または前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物の検出量に基づいて、アルドステロン／レニン比を算出する算出部と、前記算出部により算出された前記アルドステロン／レニン比を送信する送信部とをさらに備えることが好ましい。
本発明の第１３の態様によると、第１２の態様の検出装置において、前記アルドステロン／レニン比を出力する出力部をさらに備えることが好ましい。
本発明の第１４の態様によると、第１３の態様の検出装置において、前記出力部は、アルドステロン、および前記レニンのタンパク質分解の生成物、および／または前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物の量を、前記アルドステロン／レニン比と共に出力することが好ましい。

本発明によれば、別々の試料によりアルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物、および／または当該タンパク質分解の二次生成物を測定するのと比較し、これらの分子のより精密な測定を行うことができる。

図１は、本発明の一実施形態の検出装置の構成を模式的に示す図である。図２は、本発明の一実施形態の検出方法を示すフローチャートである。図３は、アンジオテンシン類に関するアミノ酸配列とタンパク質分解反応を示す図である。図４は、アンジオテンシン類の内部標準のアミノ酸配列を示す図である。図５は、本発明の変形例の検出装置の構成を模式的に示す図である。図６（Ａ）は、実施例で得られたアンジオテンシンＩの較正曲線を示す図であり、図６（Ｂ）は、図６（Ａ）におけるそれぞれの黒丸に対応する各点の精度を示す表である。図７（Ａ）は、実施例で得られたアルドステロンの較正曲線を示す図であり、図７（Ｂ）は、図７（Ａ）におけるそれぞれの黒丸に対応する各点の精度を示す表である。図８は、実施例で得られたアンジオテンシンＩとその内部標準のクロマトグラムを示す図である。図９は、実施例で得られたアンジオテンシンＩＩとその内部標準のクロマトグラムを示す図である。図１０は、実施例で得られたアルドステロンとその内部標準のクロマトグラムを示す図である。図１１は、レニン−アンジオテンシン−−アルドステロン系の反応を示す図である。

第１実施形態
以下、図を参照して本発明の検出方法の第１実施形態を説明する。本実施形態の検出方法では、試料における、アルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物、および／または当該レニンのタンパク質分解の二次生成物が液体クロマトグラフおよび質量分析計を用いて同時並行して検出される。以下では、本実施形態の検出方法に係る検出装置が図に示される。なお、本実施形態の検出方法に用いられる検出装置の構成は、当該装置によりアルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物、および／または当該レニンのタンパク質分解の二次生成物（以下では、「アルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物、および／または当該レニンのタンパク質分解の二次生成物」は「ＡＲＲ関連分子」と呼ぶ）の同時並行の測定が可能であれば限定されない。

本書において、「同時並行して測定される」または「同時並行して検出される」との用語は、一つの注入された試料からの複数の分子が質量分析により分離して測定または検出されることを指す。

図１は、本実施形態の検出装置１００の構成を示す図である。検出装置１００は、測定部１０ａと、データ処理部４０とを備える。測定部１０ａは、移動相容器１５ａおよび１５ｂと、供給ポンプ１６ａおよび１６ｂと、注入器１７と、液体クロマトグラフ２０と、質量分析計３０とを備える。データ処理部４０は、制御部５０と、出力部４１と、送信部４２と、記憶部４３とを備える。制御部５０は、算出部４１と、測定制御部４２とを備える。

測定部１０ａは、液体クロマトグラフィと質量分析により測定を行う。移動相容器１５ａおよび１５ｂは、それぞれ溶媒Ａおよび溶媒Ｂを備える。溶媒Ａおよび溶媒Ｂは、それぞれ供給ポンプ１６ａおよび１６ｂにより送出され、管の中を流れ、混合されて移動相を構成する。なお、測定部１０ａに係る流れのシステムは、グラジエント、イソクラティック、またはポリティピック溶離等の測定条件に応じて適宜選択され得る。

注入器１７は、オートサンプラーまたは手動のサンプラーとすることができ、ＡＲＲ関連分子を含む試料を移動相に注入する。試料の注入の後、移動相は液体クロマトグラフ２０に導入される。なお、測定の精度を改善するため、試料には上記ＡＲＲ関連分子に対応する内部標準が含まれてもよい。

液体クロマトグラフ（Liquid Chromatograph; ＬＣ）２０は、導入された試料における分子の溶出を選択的に遅らせることにより、試料における各ＡＲＲ関連分子を精製する。液体クロマトグラフ２０の構成は、所望のＡＲＲ関連分子の精製が可能であれば限定されない。例えば、ナノ−液体クロマトグラフ（ｎａｎｏＬＣ）、マイクロ−液体クロマトグラフ（ｍｉｃｒｏＬＣ）、高速液体クロマトグラフ（High-performance liquid chromatograph; ＨＰＬＣ）または超高速液体クロマトグラフ（ultra High-performance liquid chromatograph; ＵＨＰＬＣ）等を検出装置１００に用いることができる。

液体クロマトグラフ２０は、導入された試料が通過しＡＲＲ関連分子が精製に供される分析カラムを備える。この分析カラムの充填剤は、当該精製が可能であれば限定されないが、当該充填剤は、Ｃ−４、Ｃ−８、Ｃ−１２またはＣ−１８等が結合されたアルキル基等の疎水基を含む、疎水性の表面を備えることが好ましい。当該分析カラムは、オクタデシルシリル（octadecylsilyl; ＯＤＳ）カラム、またはＣ−１８カラムであってその充填剤の表面にオクタデシルシリル基を備えるものが特に好ましい。

質量分析計（Mass spectrometer; ＭＳ）はＡＲＲ関連分子をイオン化し、フィルターし、これらのイオン化された分子を検出する。液体クロマトグラフ２０の構成は、所望のＡＲＲ関連分子のイオン化、フィルター、および検出が可能であれば限定されない。例えば、シングル四重極質量分析計（single quadrupole mass spectrometer; シングルＱＭＳ）、トリプル四重極質量分析計（triple quadrupole mass spectrometer; トリプルＱＭＳ）、イオントラップ質量分析計（ion trap mass spectrometer; ＩＴＭＳ）、飛行時間型質量分析計（time of flight mass spectrometer; ＴＯＦ−ＭＳ）、四重極−飛行時間型質量分析計（quadruple-time of flight mass spectrometer; Ｑ−ＴＯＦ−ＭＳ）を検出装置１００に用いることができる。

測定に用いる質量分析計の種類に応じて、液体クロマトグラフィ−質量分析（liquid chromatograpy-mass spectrometry; ＬＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析（liquid chromatograph-tandem mass spectrometry; ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）、および液体クロマトグラフィ−多段階質量分析（liquid chromatography-multiple stage mass spectrometry; ＬＣ／ＭＳ^ｎ）等の様々な測定のデザインを適宜用いることができる。好ましくは、質量分析計３０はトリプル四重極質量分析計であり、検出装置１００はＬＣ／ＭＳ／ＭＳが可能である。

イオン化の方法は、ＡＲＲ関連分子がイオン化されて所望の生成物を生じれば限定されないが、検出装置１００はエレクトロスプレー法（electrospray ionization; ＥＳＩ）が可能であることが好ましい。

図１の破線矢印により模式的に示されるように、検出されたイオン、すなわち、イオン化されたＡＲＲ関連分子またはイオン化されたＡＲＲ関連分子に由来する生成イオンの量のデータ（ＭＳデータ）は、アナログ−デジタル変換に供され、電子通信手段等を介してデータ処理部４０の制御部５０に送られる。

制御部５０は、ＣＰＵ等のプロセッサを備え、記憶部４３に格納されたプログラムに基づいて機能し、検出装置１００の全般的な動作を制御する。

制御部５０の算出部５１は、各ＡＲＲ関連分子のピーク面積および／またはピーク値を算出し、ＡＲＲ関連分子の量および／または濃度を導出する。本書に用いられる「ピーク面積」は、このピークに対応する質量電荷比を有するイオンの検出に対応する、クロマトグラムの面積を指す。なお、当該クロマトグラムからの検出された分子の定量が可能であれば、算出方法は限定されない。

好ましくは、算出部５１はさらに、所定の時間のインキュベーション後に調製された試料におけるアンジオテンシンＩの濃度と、インキュベーションなしの試料におけるアンジオテンシンＩの濃度との差を算出することが好ましい。算出部５１は、この差をこの所定の時間で割り、これにより試料が調製された由来となる血漿または血清の血漿レニン活性を導出する。例えば、もし所定のインキュベーション時間が３時間であれば、血漿レニン活性（plasma renin activity; ＰＲＡ）は次式により算出される。ＰＲＡ（ｎｇ／ｍＬ／ｈｒ）＝（Ｃ_ＡＴ−Ｉ（３ｈｒ）−Ｃ_ＡＴ−Ｉ（０））／３（ｈｒ）、ここでＣ_ＡＴ−Ｉ（ｔ）は、インキュベーション時間（生成時間（generation time））ｔにおけるアンジオテンシンＩの濃度である。

算出部５１は、アルドステロンの濃度を血漿レニン活性で割ることにより、アルドステロン／レニン比（ＡＲＲ）を算出する。なお、アルドステロンの濃度は、インキュベーションの前後の試料のＭＳデータから得てもよいし、導出されたアルドステロンの濃度等を平均することにより、これらの試料のＭＳデータから算出してもよい。

アルドステロン／レニン比、血漿レニン活性、および／またはＡＲＲ関連分子の濃度を含む算出された値は、算出部５１から出力部４１、送信部４２および／または記憶部４３に出力される。

測定制御部５２は、注入器１７、液体クロマトグラフ２０、質量分析計３０および上記流れのシステム等が、本実施形態の検出方法に係る測定を完了させるため適切に機能するように測定部１０ａを制御する。

出力部４１は、表示モニタまたはプリンター等の出力装置を備え、ＭＳデータに関する情報を出力する。好ましくは、出力部は測定されたアルドステロン／レニン比を出力し、さらにアルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物および／または当該レニンのタンパク質分解の二次生成物の測定量を、アルドステロン／レニン比と共に出力し、測定結果をユーザーに知らせる。

送信部４２は、インターネット等に接続された通信装置を備え、アルドステロン／レニン比等を含むＭＳデータに関する情報を送信し、測定結果を異なる場所等にいるユーザーに知らせる。

記憶部４３は、制御部５０が機能する際に基づくプログラムおよび、測定パラメータおよび結果となるデータ等の測定に関する情報を内部に格納する。

図２は、本実施形態の検出方法を示すフローチャートである。ステップＳ１００１において、アルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物、および／または当該レニンのタンパク質分解の二次生成物（ＡＲＲ関連分子）を備える試料が調製される。好ましくは、測定の精度を高めるため、これらのＡＲＲ関連分子の内部標準が試料に加えられる。

試料が取得される対象は、ほ乳類とすることができ、人間が好ましく、アルドステロンおよびレニン検査に供される人間が最も好ましい。対象は、健康でもよいし、高血圧若しくは低血圧、または他の血液血管系に関する症状に罹っていてもよい。

図３は、アンジオテンシン類に関するタンパク質分解反応の一部を示す図である。アンジオテンシンＩの前駆体であるアンジオテンシノゲンは、レニンによるタンパク質分解（レニンのタンパク質分解）に供され、デカペプチドでありアミノ酸配列が「ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ」（配列表の配列番号（ＳＥＣＩＤＮｏ．）１）であるアンジオテンシンＩが生じる。アンジオテンシンＩはアンジオテンシン変換酵素１（ＡＣＥ１）により切断され、オクタペプチドであり配列が「ＤＲＶＹＩＨＰＦ」（配列表の配列番号２）であるアンジオテンシンＩＩとなる。他の場合では、アンジオテンシンＩはアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）により切断され、配列が「ＤＲＶＹＩＨＰＦＨ」（配列表の配列番号３）であるアンジオテンシン（１−９）か、または配列が「ＤＲＶＹＩＨＰ」（配列表の配列番号４）であるアンジオテンシン（１−７）を生じる。アンジオテンシンＩＩはアミノペプチダーゼＡにより切断され、配列が「ＲＶＹＩＨＰＦ」（配列表の配列番号５）であるアンジオテンシンＩＩＩとなる。

本書で用いられる「レニンのタンパク質分解の生成物」の語は、アンジオテンシンＩ等のレニンの酵素活性により生成される生成物を指す。

本書で用いられる「レニンのタンパク質分解の二次生成物」の語は、上記レニンのタンパク質分解の生成物のさらなるタンパク質分解により生成される生成物を指す。レニンのタンパク質分解の二次生成物は、アンジオテンシンＩＩ、アンジオテンシン（１−９）およびアンジオテンシン（１−７）を含む。

本検出方法においてアルドステロンと共に同時並行して測定されるアンジオテンシン類は、配列「ＲＶＹＩＨＰＦ」を含むことが好ましく、「ＤＲＶＹＩＨＰ」を含むことがより好ましく、「ＤＲＶＹＩＨＰＦ」を含むことがより一層好ましい。

ＡＲＲ関連分子の内部標準は、分解された複数の内部標準が検出装置により分離されて検出できるように設計されることが好ましい。検出するレニンのタンパク質分解の生成物の内部標準を第１内部標準とし、検出する当該レニンのタンパク質分解の二次生成物の内部標準を第２内部標準とすると、第１内部標準は、分解された第１内部標準と第２内部標準とが分離して検出できるように設計されることが好ましい。

図４は、このような戦略に基づいて設計される内部標準の例示的な配列を示す表である。この例において、レニンのタンパク質分解の生成物はアンジオテンシンＩであり、当該レニンのタンパク質分解の二次生成物は、アンジオテンシンＩの切断型の一つであるアンジオテンシンＩＩである。もし、アンジオテンシンＩの内部標準（ＩＳＴＤ１）が、バリンとイソロイシンが安定同位体で標識され、アミノ酸配列「ＤＲ［Ｖ^１３Ｃ，^１５Ｎ］Ｙ［Ｉ^１３Ｃ，^１５Ｎ］ＨＰＦＨＬ」（配列表の配列番号６）を含むように設計されたとすると、ＩＳＴＤ１のＮ末端切断型はアミノ酸配列「ＤＲ［Ｖ^１３Ｃ，^１５Ｎ］Ｙ［Ｉ^１３Ｃ，^１５Ｎ］ＨＰＦ」（配列表の配列番号７）を有する。この場合、もしアンジオテンシンＩＩの内部標準（ＩＳＴＤ２）が、アミノ酸配列「ＤＲ［Ｖ^１３Ｃ，^１５Ｎ］ＹＩＨＰＦ」（配列表の配列番号８）を有するように設計され、ＩＳＴＤ１のアミノ酸配列におけるアンジオテンシンＩＩに対応する部分と比較して異なるように安定同位体により標識されていると、ＩＳＴＤ１とＩＳＴＤ２とは、異なる質量電荷比により質量分析計３０によって分離して検出される。

試料は、血液、とりわけ血漿または血清から調製されることが好ましい。ＡＣＥ活性はＥＤＴＡおよび／またはＡＣＥ阻害剤等のカルシウムをキレートする薬剤により阻害されるべきである。これらの血漿または血清は、少なくとも２つの試料に分けられ、そのうちの一つが所定の時間インキュベーションされる。この所定の時間は、３時間または１８時間が好ましいが適宜設計され得る。アンジオテンシン類は短い時間で分解され得るから、測定の精度を保証するため試料は適宜凍結され得る。検出装置１００に注入される前に、レニンおよびＡＣＥは不活性化のまま保たれており、試料は有機溶媒または酸等を用いて除タンパクに供され、上清が試料として測定に用いられる。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３が行われる。

ステップＳ１００３において、試料は適宜前処理に供される。前処理の方法は、本実施形態に係る測定が可能であれば限定されない。ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５が行われる。

ステップＳ１００５において、試料は液体クロマトグラフ３０に導入され、アルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物、および／または当該レニンのタンパク質分解の二次生成物を精製する。液体クロマトグラフィの条件は、ＡＲＲ関連分子の精製が可能であれば限定されないが、逆相クロマトグラフィが行われることが好ましい。より好ましくは、充填剤の表面にオクタデシルシリル基を有する分析カラム。ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７が行われる。

ステップＳ１００７において、液体クロマトグラフから出力された試料は質量分析計３０に導入され、アルドステロン、レニンのタンパク質分解の生成物、および／または当該レニンのタンパク質分解の二次生成物が同時並行して検出される。質量分析の条件は、ＡＲＲ関連分子の同時並行した検出が可能であれば限定されない。

好ましくは、ＡＲＲ関連分子はエレクトロスプレー法（ＥＳＩ）によりイオン化され、ここでアンジオテンシンＩおよび／またはアンジオテンシンＩＩは正イオンモードでイオン化され、アルドステロンは負イオンモードでイオン化される。この場合、イオン化のモードは、アンジオテンシンＩまたはアンジオテンシンＩＩのイオン化と、アルドステロンのイオン化との間に、正イオンモードから負イオンモードに切り替えられる。人間の血液におけるアルドステロンの定量は、負イオンモードにおいて低ｐｐｔ範囲の高い感度が必要とされるために通常困難となり得るが、本発明の発明者はこの測定を成し遂げた。

好ましくは、ＡＲＲ関連分子の質量分析は、第１質量分離部Ｑ１、イオン解離部Ｑ２、および第２質量分離部Ｑ３を有するトリプル四重極質量分析計（トリプルＱＭＳ）により多重反応モニタリング（multiple reaction monitoring; ＭＲＭ）モードにより行われる。ＭＲＭモードでは、イオン化されたＡＲＲ関連分子がＱ１でプリカーサーイオンとして選択され、衝突誘起解離（collision-induced dissociation; ＣＩＤ）に供され、Ｑ２で生成イオンを生じる。これらの生成された生成イオンはＱ３で検出される。選択されるプリカーサーイオンの質量電荷比と、その生成イオンの質量電荷比との組み合わせはＭＲＭトランジションと呼ばれる。実施例で用いられているように、ＭＲＭトランジションは、プリカーサーイオンの質量電荷比に記号「＞」および生成イオンの質量電荷比を続けることで表現される。

好ましくは、本実施形態の質量分析において、アルドステロンの検出のため質量分析計３０において検出されるイオンの一つは、３３０．９と３３１．９の間の質量電荷比を有し、および／または１８８．８と１８９．８の間の質量電荷比を有する。

好ましくは、本実施形態の質量分析において、アンジオテンシンＩの検出のため質量分析計３０において検出されるイオンの一つは、６４６．７と６４７．７の間の質量電荷比を有し、および／または６１８．８と６１９．８の間の質量電荷比を有する。

好ましくは、本実施形態の質量分析において、アンジオテンシンＩＩの検出のため質量分析計３０において検出されるイオンの一つは、２６２．６と２６３．６の間の質量電荷比を有する。

好ましくは、本実施形態の質量分析において、アルドステロンの内部標準の検出のため質量分析計３０において検出されるイオンの一つは、１９３．８と１９４．８の間の質量電荷比を有する。

好ましくは、本実施形態の質量分析において、アンジオテンシンＩの内部標準の検出のため質量分析計３０において検出されるイオンの一つは、６５９．９と６６０．９の間の質量電荷比を有する。

好ましくは、本実施形態の質量分析において、アンジオテンシンＩＩの内部標準の検出のため質量分析計３０において検出されるイオンの一つは、１０９．８と１１０．８の間の質量電荷比を有する。ステップＳ１００７が終了したら、ステップＳ１００９が行われる。

ステップＳ１００９において、他の試料が所定の時間インキュベーションされ、ステップＳ１００３−Ｓ１００７を含む上記測定と同様の測定が行われる。このステップは、増加したアンジオテンシンＩの定量を可能にし、これにより、血漿レニン活性の定量を可能にする。なお、インキュベーションされる試料は、インキュベーションされない試料の測定の前にインキュベーションされてもよい。ステップＳ１００９が終了したら、ステップＳ１０１１が行われる。

ステップＳ１０１１において、算出部５１は、アルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物、および／または当該レニンのタンパク質分解の二次生成物の検出量に基づいて、アルドステロン／レニン比を算出する。ステップＳ１０１１が終了したら、ステップＳ１０１３が行われる。

ステップＳ１０１３において、算出されたアルドステロン／レニン比および／または質量分析計３０による測定に関するその他の情報が、送信部４１により送信され、および／または出力部４１により出力される。

以上で説明した実施形態によると、以下の有利な効果が得られる。
（１）本実施形態の検出方法は、単一の試料における、アルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物、および／または当該レニンのタンパク質分解の二次生成物（ＡＲＲ関連分子）を、液体クロマトグラフ２０および質量分析計３０を用いて同時並行して検出することを備える。これにより、これらのＡＲＲ関連分子を別々の試料を用いて測定した場合と比較して、これらのＡＲＲ関連分子のより精密な測定を行うことができる。

（２）本実施形態の検出方法では、レニンのタンパク質分解の生成物がアンジオテンシンＩであり、当該レニンのタンパク質分解の二次生成物がアンジオテンシンＩＩであることが好ましい。これにより、アルドステロンおよびアンジオテンシンＩおよび／またはアンジオテンシンＩＩを別々の試料を用いて測定した場合と比較して、これらの分子に関する値のより精密な測定を行うことができる。

（３）本実施形態の検出方法では、試料は、血漿または血清から調製されることが好ましい。これにより、血漿または血清におけるアルドステロンおよびアンジオテンシンＩおよび／またはアンジオテンシンＩＩを別々の試料を用いて測定した場合と比較して、これらの分子に関する値のより精密な測定を行うことができる。

（４）本実施形態の検出方法において、この方法は、レニンのタンパク質分解の生成物の第１内部標準を試料に加えることと、当該レニンのタンパク質分解の二次生成物の第２内部標準を試料に加えることとをさらに備え、第１内部標準は、分解された第１内部標準と第２内部標準が分離して検出できるように設計されることが好ましい。これにより、レニンのタンパク質分解の生成物の分解が精度よく定量され、ＡＲＲ関連分子のより精密な測定が可能となる。

（５）本実施形態の検出方法において、レニンのタンパク質分解の生成物は、アンジオテンシンＩであり、当該レニンのタンパク質分解の二次生成物はアンジオテンシンＩの切断型であり、アンジオテンシンＩの切断型に対応する第１内部標準の一部と、第１内部標準とは、安定同位体により異なって標識されることが好ましい。これにより、アンジオテンシンＩの切断が精度よく定量され、ＡＲＲ関連分子のより精密な測定が可能となる。

（６）本実施形態の検出方法において、この方法は、アルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物、および／または当該レニンのタンパク質分解の二次生成物の検出量に基づいて、アルドステロン／レニン比を算出することをさらに備えることが好ましい。これにより、これらのＡＲＲ関連分子を別々の試料を用いて測定するのと比べて、より精密なアルドステロン／レニン比の測定が可能となる。

（７）検出装置１００は、アルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物、および／または当該レニンのタンパク質分解の二次生成物（ＡＲＲ関連分子）を含む試料が導入される入力部としての注入器１７と、液体クロマトグラフ２０と、試料におけるこれらのＡＲＲ関連分子を同時並行して検出する質量分析計３０とを備える。これにより、これらのＡＲＲ関連分子を別々の試料を用いて測定するのと比べて、これらのＡＲＲ関連分子のより精密な測定が可能となる。

第２実施形態
以下に、本発明の検出方法の第２の実施形態が説明される。本実施形態の検出方法において、前処理としてオンライン固相抽出が行われる。本実施形態の検出装置の構成は、検出装置１００と類似しているが、オンライン方式による固相抽出カラム等が追加されている点が異なっている。構成において第１実施形態と同一の部分は同一の参照符号で参照し、関連する説明は適宜省略される。

図５は、第２実施形態の検出装置１０１の構成を模式的に示す図である。検出装置１０１は測定部１０ｂと、データ処理部４０とを備える。測定部１０ｂは、前処理用移動相容器１１と、前処理用供給ポンプ１２と、切替バルブ１３と、前処理カラム１４と、移動相容器１５ａおよび１５ｂと、供給ポンプ１６ａおよび１６ｂと、液体クロマトグラフ２０と、質量分光３０とを備える。

前処理用移動相容器１１は、前処理用移動相を備え、この前処理用移動相は、注入器１７により注入された試料を前処理用カラム１４へと運ぶ。前処理用供給ポンプ１２は、前処理用移動相を送出する。

切替バルブ１３は、検出装置１０１の流れのモードを切り替える。１つの流れのモードは、前処理用移動相が、注入された試料を前処理用カラム１４へと運ぶ前処理モードである。他の流れのモードは、移動相が、前処理用カラム１４の充填剤の表面に吸着された試料の成分を液体クロマトグラフィへと運ぶクロマトグラフィモードである。図５に例示された切替バルブでは、当該切替バルブにおける３つの実線で表現された流路から、３つの破線で表現された流路へと、あるいはその逆に、切替バルブ１３が流路を切り替え、これにより、モードの切替を可能にしている。なお、オンライン固相抽出が可能であれば、切替バルブ１３はいずれの種類のバルブでもよい。

前処理カラム１４は、オンライン固相抽出とＡＲＲ関連分子の同時並行の検出が可能であればいずれの種類のカラムでもよい。しかし、前処理カラムは、充填剤が、Ｃ−４、Ｃ−８、Ｃ−１２またはＣ−１８が結合されたアルキル基等の疎水基を含む疎水性表面を備える固相抽出カラムであることが好ましい。前処理カラム１４は、オクタデシルシリル（ＯＤＳ）カラム、または、充填剤の表面がオクタデシルシリル基を備えるＣ−１８カラムであることが特に好ましい。

当該ＯＤＳカラムは、液体クロマトグラフ２０における分析カラムの充填剤よりも疎水性の低い充填剤を有することがさらに好ましい。

本実施形態の検出方法では、注入された試料が前処理カラム１４に導入され、前処理の後、前処理用カラム１４において吸着された試料の成分が、オンライン制御により液体クロマトグラフ２０に運ばれ導入されるように測定制御部５２が測定部１０ｂを制御する。

以上で説明した第２実施形態では、第１実施形態について記載した有利な効果の他に、以下の有利な効果がもたらされる。
（１）本実施形態の検出方法は、試料が液体クロマトグラフ２０に導入される前に、試料をオクタデシルシリルカラム１４に導入することを備える。これにより、ＡＲＲ関連分子の測定の精度を高めることができる。

（２）本実施形態の検出方法では、オクタデシルシリルカラム１４から出力された試料がオンライン制御により液体クロマトグラフ２０に導入される。これにより、ＡＲＲ関連分子の測定におけるリカバリーを改善することができる。さらに、オンライン制御によるこの検出方法は、アルドステロン／レニン比等の測定を簡素なプロトコルにより提供し、このため、医療施設に導入されると、この検出方法は医療サービスの効率化に寄与する。

以下の実施例では、行われた実験の結果が記載される。なお、本発明は、実施例の条件に限定されない。

実施例１
試料の調製
３つのレベルの既知のレニン活性と既知のアルドステロン活性を有する血清試料をバイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社から購入した。１つの試料は低温で保管し、参照（ｔ０）として用い、他はレニンが活性を有する温度で３時間インキュベーションした。試料は２体積のアセトニトリル（ＡＣＮ）を用いてタンパク質沈殿により抽出し、蒸発と再構成に供した。オンライン固相抽出は行わなかった。

ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定
調製された試料は、超高速液体クロマトグラフ（ＵＨＰＬＣ）および多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードのトリプル四重極質量分析計（トリプルＱＭＳ）を用いてＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定に供した。

ＵＨＰＬＣの条件
システム：ＮｅｘｅｒａＸ２（島津製作所）
カラム：Ｓｈｉｍ−ＰａｃｋＧＩＳＴ（島津ジーエルシー）（オクタデシルシリルカラム、粒径；２μｍ、カラムの長さ；５０ｍｍ、内径；２．１ｍｍ）
カラム温度：５０℃
移動相：
（Ａ）水＋０．０１％ギ酸
（Ｂ）メタノール
流速：０．４ｍＬ／分
グラジエント：
５％Ｂ（０−０．５分）、５０％Ｂ（２分）、６０％Ｂ（３分）、９５％Ｂ（３．５−４分）、５％Ｂ（４．１分）
総測定時間（ｔｏｔａｌｒｕｎｔｉｍｅ）：７（分）
ニードルのリンス（ＮｅｅｄｌｅＲｉｎｓｅ）：
Ｒ３（ＭｅＯＨ／ＡＣＮ／イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）／ＨＣＯＯＨ：３３／３３／３３／１）
Ｒ１（水／ＡＣＮ：９／１）
オートサンプラー温度：＋５℃
注入量：１５μＬ

ＭＳ／ＭＳの条件
システム：加熱ＥＳＩ（ＨｅａｔｅｄＥＳＩ）を備えるＬＣＭＳ−８０６０（島津製作所）
取得モード：ＭＲＭ
温度：
脱溶媒管（ＤｅｓｏｌｖａｔｉｏｎＬｉｎｅ；ＤＬ）温度：１５０℃
ヒートブロック温度：３００℃
インターフェイス温度：４００℃
ガス流量：
ネブライザー；３Ｌ／分
ドライング；５Ｌ／分
ヒーティング；１５Ｌ／分
ＣＩＤ；３００ｋＰａ
インターフェイス電圧：＋／− １．５ｋＶ
正イオンモードのＥＳＩに関する分子のＭＲＭトランジション
アンジオテンシンＩ；４３３．０＞６４７．２４３３．０＞６１９．３
^１３Ｃ_１１，^１５Ｎ_２−アンジオテンシンＩ；４３７．３＞６６０．４
アンジオテンシンＩＩ；５２４．２＞２６３．１
^１３Ｃ_６，^１５Ｎ_１−アンジオテンシンＩＩ；５２７．２＞１１０．３（１）
^１３Ｃ_１１，^１５Ｎ_２−アンジオテンシンＩＩ；５３０．６＞１１０．３（２）
負イオンモードのＥＳＩに関する分子のＭＲＭトランジション
アルドステロン；３５９．４＞３３１．４３５９．４＞１８９．３
^２Ｈ_７−アルドステロン；３６５．２＞１９４．３

較正曲線の導出
ウシ血清アルブミン／緩衝液に所定の量のアンジオテンシンＩおよびアルドステロンを加え、アンジオテンシンＩおよびアルドステロンの標準濃度溶液を得た。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定を行い、標準溶液の濃度と、測定された面積比との間の関係を導出した（アンジオテンシンＩのピーク面積／その内部標準のピーク面積、および、アルドステロンのピーク面積／その内部標準のピーク面積）。

図６（Ａ）は、実施例で得られたアンジオテンシンＩの較正曲線を示す図である。図６（Ｂ）は、図６（Ａ）におけるそれぞれの黒丸に対応する各点の精度を示す表である。この精度は、各標準の測定値を、理論的な値で割ることにより測定された。

図７（Ａ）は、実施例で得られたアルドステロンの較正曲線を示す図である。図７（Ｂ）は、図７（Ａ）におけるそれぞれの黒丸に対応する各点の精度を示す表である。

３つのレベルの既知のレニン活性と既知のアルドステロン濃度を有する試料に関するアンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩおよびアルドステロンの同時並行のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定の結果
測定された血漿レニン活性およびアルドステロン濃度は以下に示される。測定値は８回の測定の平均値である。製造者により提供された参照値は異なる方法（免疫アッセイ）により得られたものであった。

血漿レニン活性（ＰＲＡ）の結果
参照ＰＲＡ（ｎｇ／ｍＬ／ｈｒ）測定ＰＲＡ（ｎｇ／ｍＬ／ｈｒ）精度
１．８０１．７２９５．７％
５．６０５．２５９３．７％
２８．５２０．７７２．５％

アルドステロンの結果
参照濃度（ｐｇ／ｍＬ）測定濃度（ｐｇ／ｍＬ）精度
３９．０３９．３１０１％
８６．０１０１１１８％
４２０４２１１００％

実施例２
試料の調製
インキュベーションでは、試料は３７℃に保持し穏やかに１時間撹拌した。試料を、１体積のアセトンを用いてタンパク質沈殿により抽出し、オンラインＳＰＥ−ＵＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供した。０．２ＭＥＤＴＡならびに、阻害剤であるＳＢＴＩ（大豆トリプシン阻害剤）およびＰＭＳＦ（フッ化フェニルメタンスルホニル（Phenylmethanesulfonylfluoride））を用いてアンジオテンシンＩの分解を停止させた。実施例２で用いたオンライン固相カラムはガードカラムＧＩＳＳＣ−１８（島津ジーエルシー）（オクタデシルシリルカラム、粒径；３μｍ、カラムの長さ；１０ｍｍ、内径；２．１ｍｍ）であり、その充填剤は実施例２で用いたＵＨＰＬＣカラムの疎水性よりも低い疎水性を有していた。その他のオンラインＳＰＥ条件は以下の通りである：
カラム温度：５０℃
移動相：
（Ａ；投入する際の相）水／メタノール９０／１０（ｖ／ｖ）＋０．０１％ギ酸（ｖ／ｖ）
（Ｂ；洗浄する際の相）アセトニトリル／イソプロパノール１／１（ｖ／ｖ）
流速：１．５ｍＬ／分
注入量：１５μＬ
ＵＨＰＬＣとＭＳ／ＭＳについては、実施例１と同様のシステムを用いた。

実施例２において、実質的に１００％の内部標準のリカバリーが達成され、この数字は、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩおよびアルドステロンの全てについて８０％未満であった実施例１における内部標準のリカバリーの値を大きく上回った。

１０ａ，１０ｂ…測定部、１４…固相抽出カラム、１７…注入器、２０…液体クロマトグラフ、３０…質量分析計、４０…データ処理部、４１…出力部、４２…送信部、５０…制御部、５１…算出部、１００，１０１検出装置。

本発明の第１の態様は、試料における、アルドステロン、レニンによるタンパク質分解の生成物、および前記レニンによるタンパク質分解の二次生成物を、液体クロマトグラフと質量分析計とを用い同時並行して検出することを備える検出方法に関する。
本発明の第２の態様は、アルドステロン、レニンによるタンパク質分解の生成物、および前記レニンによるタンパク質分解の二次生成物を含む試料が導入される入力部と、液体クロマトグラフと、前記試料における、アルドステロン、前記レニンによるタンパク質分解の生成物、および前記レニンによるタンパク質分解の前記二次生成物を同時並行して検出する質量分析計とを備える検出装置に関する。

Claims

試料における、アルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物、および／または前記レニンのタンパク質分解の二次生成物を、液体クロマトグラフと質量分析計とを用い同時並行して検出することを備える検出方法。
請求項１に記載の方法において、
前記レニンのタンパク質分解の生成物はアンジオテンシンＩであり、
前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物はアンジオテンシンＩＩである検出方法。
請求項１または２に記載の方法において、
前記試料は、血漿または血清から調製される検出方法。
請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法において、
前記液体クロマトグラフに前記試料が導入される前に、前記試料をオクタデシルシリルカラムに導入することをさらに備える検出方法。
請求項４に記載の方法において、
前記オクタデシルシリルカラムから出力される前記試料は、オンライン制御により前記液体クロマトグラフに導入される検出方法。
請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法において、
アルドステロン、前記レニンのタンパク質分解の生成物、および、前記二次生成物が同時並行して検出され、
前記方法は、
前記試料に、前記レニンのタンパク質分解の生成物の第１内部標準を加えることと、
前記試料に、前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物の第２内部標準を加えることとをさらに備え、
前記第１内部標準は、分解された第１内部標準と前記第２内部標準とを分離して検出可能に設計される検出方法。
請求項６に記載の方法において、
前記レニンのタンパク質分解の生成物は、アンジオテンシンＩであり、
前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物は、アンジオテンシンＩの切断型であり、
アンジオテンシンＩの前記切断型に対応する前記第１内部標準の一部と、前記第２内部標準は安定同位体により異なって標識される検出方法。
請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法において、
アルドステロン、および前記レニンのタンパク質分解の生成物、および／または前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物の検出量に基づいて、アルドステロン／レニン比を算出することをさらに備える検出方法。
請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法において、
前記レニンのタンパク質分解の生成物は、アンジオテンシンＩであり、
前記方法は、
アンジオテンシンＩのイオン化と、アルドステロンのイオン化との間に、正イオンモードから負イオンモードへとイオン化のモードを切り替えることをさらに備える検出方法。
アルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物、および／または前記レニンのタンパク質分解の二次生成物を含む試料が導入される入力部と、
液体クロマトグラフと、
前記試料における、アルドステロン、および前記レニンのタンパク質分解の生成物、および／または前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物を同時並行して検出する質量分析計とを備える検出装置。
請求項１０に記載の検出装置において、
前記液体クロマトグラフに接続されたオクタデシルシリルカラムであって、アルドステロン、および前記レニンのタンパク質分解の生成物、および／または前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物をオンライン方式で抽出する前記カラムを備える検出装置。
請求項１０または１１に記載の検出装置において、
アルドステロン、および前記レニンのタンパク質分解の生成物、および／または前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物の検出量に基づいて、アルドステロン／レニン比を算出する算出部と、
前記算出部により算出された前記アルドステロン／レニン比を送信する送信部とをさらに備える検出装置。
請求項１２に記載の検出装置において、
前記アルドステロン／レニン比を出力する出力部をさらに備える検出装置。
請求項１３に記載の検出装置において、
前記出力部は、アルドステロン、および前記レニンのタンパク質分解の生成物、および／または前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物の量を、前記アルドステロン／レニン比と共に出力する検出装置。