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JP2020138983A - 安定したエクソソーム製剤の製造方法 - Google Patents

安定したエクソソーム製剤の製造方法 Download PDF

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Abstract

【課題】安定したエクソソーム製剤の提供。【解決手段】少なくとも106のエクソソームを含むヒトへの投与に適した安定した凍結乾燥エクソソーム製剤であって、凍結乾燥エクソソームが、凍結乾燥前のエクソソーム製剤の少なくとも90%レベルのmiR−210 RNA及びmiR−146Aを維持する、製剤。【選択図】なし

Description

エクソソームは膜結合小胞である(Hong et al., PLoS ONE 9(8): e103310. doi:10.1371/journal.pone.0103310.)。エクソソームは、尿、血漿及び腹水などの体液中で発見される(同上)。エクソソームはエンドソーム多小胞体の内側への出芽によって生成される(同上)。エクソソームのカーゴとしては、細胞膜上で発現したタンパク質/糖タンパク質、並びに親細胞のサイトゾルに存在する分子及び可溶性因子が挙げられる(同上)。エクソソームは通常40−100nmの範囲の直径をもつ。Zhang et al., Oncology Letters 8:1701 −1706 2014 エクソソームは特異的タンパク質、脂質、RNA及びマイクロRNAを含有する(同上)。
心筋球由来細胞(Cardiosphere‐Derived Cell)から生成したエクソソームは脈管形成を増強し、心筋細胞の生存及び増殖を促進する。参照により本明細書に組み込まれるIbrahim et al., 2014 May 8;2(5):606−19。心筋球由来細胞から生成されたエクソソームはmiR−146aが豊富である。
米国における主要な死因は依然として心臓病である。Kochanek et al., Natl Vital Stat Rep. 2011;60:1−116.老人人口に合わせて、虚血性心疾患の全世界の発生率及び死亡率は、主要有害心イベント(MACE)における現在のケア基準の改善によって減少している(Moran et al., Circulation.2014;129:1493−1501.)。しかし、その結果、非致死性虚血性心疾患に起因する心臓発作生存者数及び身体障害年齢が増加し、このことは全体として虚血性心疾患の世界的な経済負担に大きく関わっている(同上)。このことは、現在のケア基準に対するMACEの改善から、慢性狭心症及び心不全を罹患した生存患者のクオリティオブライフ、適応度及び生命力の改善への移行が必要とされていることを示唆する(同上)。
心筋球由来細胞(CDC)は臨床実験中である。2つの臨床試験(CADUCEUS及びALLSTAR)において心筋梗塞(MI)後に投与したCDCが梗塞サイズの減少及び生存可能な心筋の増加に安全かつ有効であることが示されている。エクソソームは代表的な再生医療の次世代治療プラットフォームである。これらのナノサイズの細胞外膜小胞は、機能的メッセンジャーRNA(mRNA)、マイクロRNA(miRNA)及びDNA分子の強力な輸送媒体であり、増えてきた証拠が、これらの細胞外膜小胞は親細胞として類似の治療的利益を付与しうることを示唆する。CDC由来エクソソームは、現在多数の前臨床モデルでCDCの効果を再現することが示されている。de Couto et al., Circulation.2014;130; Ibrahim et al., Stem Cell Reports].2014;2:606−619; Tseliou et al., Circulation.2014;130.調査から、CDCは、心筋細胞増殖、分岐血管新生を刺激し、及びMIモデルにおける機能回復を改善する特定のmiRNAを含有するエクソソームを分泌することがわかった。前臨床データの全体性は、エクソソームがCDCの心臓組織修復と関連する主要作用機序(MOA)に必須な分泌有効成分(API)であることを示す。
CDC及びそれらの単離エクソソームは、心臓疾病の世界的負担を軽減する大きな治療的可能性を保持する。第1相CADUCEUS及びALLSTAR臨床試験では、CDCが梗塞サイズを縮小し、心筋組織生存能力を増加させることが示された(図1参照)。Malliaras et al., J Am Coll Cardiol.2014;63:110−122; Makkar R et al., Lancet.2012;379:895−904; Makkar et al., Journal of the American College of Cardiology.2014;64.
CADUCEUSは、治療再生 を示唆する生存可能な心筋の増加を観察するための最初の臨床試験である。Makkar R et al., Lancet.2012;379:895−904.5年のサブスタディと共に進行中のALLSTAR第2相試験は、クオリティオブライフ指標並びに入院期間及び死亡率に与える影響力を評価するであろう。
ナノサイズのエクソソームは、微生物捕捉フィルタ(例えば0.22μm以下のフィルタ)を使用する方法で滅菌保証を増加させる能力など、細胞に対する大きな生成利点及び毒物学利点を有する。非生物エクソソームは、まさに非生物としての特質に起因して悪性腫瘍形成及び免疫原性応答リスクが潜在的に低下する。また、エクソソームは、細胞と比較して、安定した薬物貯蔵温度の選択肢でより大きい柔軟性(例えば室温及び低温対液体窒素)を有する。CDC−エクソソーム生成に関する現在の研究過程は、ウシ胎児血清(FBS)含有条件下での初めての播種及びコンフルエントまでのCDC増殖が関わる。エクソソーム生成では、CDCのコンフルエント層を洗浄し、無血清(FBS−エクソソームを含まない)下で培養し、通常酸素圧条件の下で15日間培養した。次いで、沈降法(研究だけに用いることにした)によって、解凍した条件培地(エクソソーム含有)からエクソソームを単離し、基本無血清培地(研究グレード試薬)で定式化した。
CDCエクソソームは、心臓機能を改善し、血管形成及び心筋細胞増殖を刺激し、及び心筋細胞アポトーシスを阻害することが可能であるが、正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)由来エクソソームは否定的である。エクソソーム分泌がGW4869で阻害されるとCDCの心臓機能的利点が縮小された。
CDCエクソソームマイクロRNA組成物をmiRNAアレイで特徴付けた。miR−210及びmiR−146aは、NHDFエクソソームと比較してCDCエクソソームでアップレギュレーションされることがわかった。
miR−210は細胞性低酸素応答の中心的存在であり、内皮及び心筋細胞の細胞生存率及びミトコンドリア代謝を調節することができる。低酸素誘導性因子1−α(HIF1α)は、近位miR−210プロモータ上で低酸素応答性領域(Hypoxia Response Element(HRE))に直接結合する。HIF1α経路の下流標的はストロマ細胞由来因子1(SDF−1)及び血管内皮成長因子(VEGF)である。miR−210は、プロセスパラメータを評価するための主要CDCエクソソームmiRNA定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)パネルの一部である。
miR−146aは、様々な疾患の重要免疫調節分子であり、インターロイキン1(IL−1)受容体関連キナーゼ1(IRAK1)のダウンレギュレーションをもたらす活性化B細胞核因子カッパ−軽鎖エンハンサー(NF−κB)依存性シグナル伝達経路におけるトール様受容体4(TLR4)の活性化と同時に誘導される。miR−146aの分子標的は、先天性及び適応性免疫応答並びに、SDF−1の7回膜貫通型受容体Gタンパク質共役受容体であるCXCR4経路に関与する。miR−146aは、プロセスパラメータを評価するための主要CDCエクソソームmiRNA定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)パネルの一部である。
特に臨床用途の技術分野では、より良好で安定したエクソソーム標品が必要である。本発明は、当該技術分野でこの必要性を満たす。
本発明は、安定したエクソソーム製剤の生成方法及び安定したエクソソーム製剤を包含する。
本発明は、少なくとも10のエクソソームを含有するヒトへの投与に適した安定した凍結乾燥エクソソーム製剤であって、凍結乾燥エクソソームは、凍結乾燥前のエクソソーム製剤の少なくとも90%レベルのmiR−210 RNA及びmiR−146Aを維持することを包含する。
本発明は、少なくとも10のエクソソームを含むヒトへの投与に適した安定した凍結乾燥エクソソーム製剤であって、凍結乾燥エクソソームは、凍結乾燥前のエクソソーム標品の少なくとも90%レベルのインビトロ生物活性を維持することを包含する。
本発明は、少なくとも10のエクソソームを含むヒトへの投与に適した安定した凍結乾燥エクソソーム製剤であって、凍結乾燥エクソソームは、凍結乾燥前のエクソソーム標品の少なくとも90%レベルのインビボ生物活性を維持することを包含する。
本発明は、少なくとも10CDCエクソソームを含むヒトへの投与に適した安定した液体心筋球由来細胞(CDC)エクソソーム製剤であって、エクソソーム製剤は、4℃、30日間で開始エクソソーム製剤の少なくとも75%レベルのmiR−210 RNA及びmiR−146Aを維持することを包含する。
好ましくは、エクソソーム製剤が少なくとも10のエクソソームを包含する。
好ましくは、エクソソーム製剤は心筋球由来細胞(CDC)から生成され、最も好ましくは、限外濾過及び透析濾過によって生成される。
図1A及びBは、ナノサイトによるナノ粒子追跡分析を用いたブラウン運動で定量された、限外濾過(UFC)分離後の種々の温度条件(4〜−80℃)におけるDC由来エクソソーム安定性を示す。 図1C及びDは、ナノサイトによるナノ粒子追跡分析を用いたブラウン運動で定量された、限外濾過(UFC)分離後の種々の温度条件(4〜−80℃)におけるDC由来エクソソーム安定性を示す。 図2は、−80℃で7〜90日間貯蔵した濃縮CDC由来エクソソームにおける安定したmiR−146A及びmiR−210発現を示す。濃縮CDC由来エクソソームを−20℃及び4℃で30〜90日間貯蔵したときにmiR−210及びmiR−146Aの発現が低下した。 図3は、限外濾過(UFC)コントロールと比較して、PLASMALYTE A、RINGERS及びPLASMALYTE A+デキストロース注射剤溶液又はBSSプラスフラッシュ溶液の製剤化CDC由来エクソソームにおける類似のアップレギュレーションmiR−146A及びmiR−210発現を示す。 図4は、UFCコントロールと比較して、4℃、−20℃及び−80℃で約30日間貯蔵したPLASMALYTE A、RINGERS及びPLASMALYTE A+デキストロースの製剤化CDC由来エクソソームにおける安定したmiR−146A及びmiR−210発現を示す。 図5及び6は、UFCコントロールと比較して、PLASMALYTE A (プラズマライト)、RINGERS (リンゲル液)及びPLASMALYTE A+デキストロース(P+D)の製剤化CDC由来エクソソームの生物活性を示す。マクロファージ表現型の心臓保護的表現型への変化によって示された生物活性がArg 1及びNos 2アップレギュレーションによって示された。点線は初代マクロファージのベースライン発現(1)を示す。 図5及び6は、UFCコントロールと比較して、PLASMALYTE A (プラズマライト)、RINGERS (リンゲル液)及びPLASMALYTE A+デキストロース(P+D)の製剤化CDC由来エクソソームの生物活性を示す。マクロファージ表現型の心臓保護的表現型への変化によって示された生物活性がArg 1及びNos 2アップレギュレーションによって示された。点線は初代マクロファージのベースライン発現(1)を示す。 図7A−Cは、A)Arg 1及びNos 2アップレギュレーションによって示された、マクロファージ表現型の心臓保護的表現型への変化、及びB)ラットAMI再灌流モデルにおける梗塞量の減少によって示された凍結乾燥(フリーズドライ)CDC由来エクソソームの生物活性を示す。C)miR−146A及びmiR−210の発現は、遠心分離による限外濾過(UFC)とUFC凍結乾燥エクソソームで類似した。 図8は、凍結乾燥前(Pre−Lyo)及び凍結乾燥後(Post−Lyo)のCDC由来エクソソームに関して、アップレギュレーションしたmiR−146A及びmiR−210発現を示す。 図9は、透析濾過の有り無しでのpH変化を示す。濾過したCM:限外濾過による濃縮前に回収した後の出発物質。UFC:透析濾過なしで濃縮されたエクソソーム産物。透析濾過前の開始pHの代表。プラズマライト(PlasmaLyte):6.9−7.2の範囲で得られた一貫した結果。プラズマライト+デキストロース:プラズマライト単独使用のときに見られた結果と類似した結果。リンゲル液:他の緩衝剤と比べて割合に大きなpH変化。必要に応じて非常に広範な緩衝能力の潜在性。BSSプラス:pHの大きな上方シフト。
種々の濃度でのエクソソーム貯蔵の影響を調査した。(図1)本実験では、限外濾過で調製したエクソソームを、4℃、−20℃及び−80℃で7日間貯蔵した。エクソソームの合計数は、これらの時間帯の間、種々の温度で大幅に減少しなかった。
バルク濃縮CDC由来エクソソームを限外濾過によって調製した。−80℃で7〜90日間貯蔵したときに、濃縮CDC由来エクソソームは安定したmiR−146A及びmiR−210発現を示した。(図2)濃縮CDC由来エクソソームを−20℃及び4℃で30〜90日間貯蔵したときにmiR−210及びmiR−146Aの発現が低下した。−20℃及び4℃では、30日間でエクソソームに含まれるmiR−146A及びmiR−210は50%未満のレベルであった。
−20℃及び4℃でのエクソソーム安定性改良のために、CDC由来エクソソームの製剤化を 透析濾過によって PLASMALYTE A、RINGERS及びPLASMALYTE A+デキストロース注射剤溶液又はBSSプラスフラッシュ(Plus flush)溶液中で行い、限外濾過(UFC)コントロールと比較した。(図3)全製剤がmiR−146A及びmiR−210 RNAの類似レベルを示した。しかし、リンゲル液及びBSSでは相対的に大きなpH変化が見られた。(図9)
種々の製剤の長期安定性を比較するために、CDC由来エクソソームをPLASMALYTE A、RINGERS及びPLASMALYTE A+デキストロースで製剤化し、次いで30日間、4℃、−20℃及び−80℃で貯蔵した。UFCコントロールは、−80℃での貯蔵と比べて4℃及び−20℃で、約20−30%のmiR−146A及びmiR−210レベルの減少を示した(図4)。他の全ての製剤がより低い減少を示し、RNAの安定性がコントロールと比較して改善したことを示す。
PLASMALYTE A(プラズマライト)、RINGERS(リンゲル液)及びPLASMALYTE A+デキストロース(P+D)で製剤化したCDC由来エクソソームは、インビトロ生物活性モデルでUFCコントロールに匹敵した。(図5及び6)全標品が生物活性を示し、PLASMALYTE Aが最良の生物活性を示した。
エクソソームが凍結乾燥されて生物活性を保持できるかどうかを決定するために、最初の実験を行ってこの提案を評価した。SpeedVacの使用によってエクソソームの不安定度が増加し、エクソソーム生物活性が喪失した。バルクUFC濃縮CDC由来エクソソームを10で凍結乾燥した一方で、昇華状態の間は実施例5の凍結乾燥プロトコルを使用して低温を維持し、−80℃で少なくとも30日間貯蔵し、水で再水和した。次いで、インビトロでマクロファージ生物活性アッセイを試験した。(図7A)凍結乾燥エクソソームは、非凍結乾燥エクソソームと同様に、マクロファージ表現型の心臓保護的表現型への変化によって実証されたような優れた生物活性を示した。従って、エクソソームの凍結乾燥及び再水和に起因する少しの有意な減少もインビトロ生物活性にはなかった。
凍結乾燥エクソソームは、ラットAMI再灌流モデルでも生物活性について評価した。(図7B)凍結乾燥CDC由来エクソソームは、梗塞量の減少によって実証されたような優れた生物活性を示した。従って、エクソソームの凍結乾燥及び再水和に起因する少しの有意な減少もインビボでの生物活性にはなかった。
miR−146A及びmiR−210の発現もPCRで評価し、類似レベルの発現が、遠心分離による限外濾過(UFC)とUFC凍結乾燥エクソソームで観察された。(図7C)従って、予想外にも、エクソソームは凍結乾燥及び再水和が可能であり、インビトロアッセイ及びインビボアッセイの両方を用いて、有意なmiRNAの喪失及び生物活性の喪失を起こさなかった。
類似レベルのアップレギュレーションmiR−146A及びmiR−210発現が、凍結乾燥前(Pre−Lyo)と−80℃で少なくとも30 日間化貯蔵した凍結乾燥後(Post−Lyo)で観察された。(図8)従って、凍結乾燥エクソソームは、miRNAレベルを維持しながら長期間貯蔵が可能である。
本発明は、安定したエクソソーム製剤の生成を可能にする。本発明は、これらのエクソソーム製剤及びそれらの製造方法を包含する。
エクソソームの生成方法
本発明は細胞を培養することを含むエクソソームの生成方法を包含する。本発明は、20%未満の酸素で少なくとも2日間細胞を培養すること、及び細胞からエクソソームを採取することを含むエクソソームの生成方法を包含する。
好ましくは、細胞培養は、少なくとも10、10、10、10、1010、1011、又は1012の細胞を含む。
好ましくは、細胞は初代細胞である。初代細胞は、少なくとも継代数を2、3、4、5、6、7、8、9、又は10とすることができる。不死化細胞も本発明によって包含される。
好ましくは、細胞はヒト細胞である。特に好ましい細胞型は心筋球由来細胞(CDC)である。他の好ましい細胞型は、心臓組織由来幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、神経組織由来幹細胞及び他の組織由来幹細胞である。
1つの実施形態において、細胞は、ルーチンな培養条件、例えば20%O、37℃で、20%ウシ胎児血清(FBS)及びペニシリン/ストレプトマイシンを含むIMDM中にT175フラスコ当たり10の細胞を播種することによって増殖させることができる。
種々の実施形態において、酸素濃度は、1−2%、2−3%、4−5%、5−6%、6−7%、7−8%、8−9%、9−10%、10−11%、11−12%、12−13%、13−14%、14−15%、15−16%、17−18%、又は18−19%である。好ましくは、酸素濃度は2−8%、3−7%酸素、4−6%酸素、又は4.5−5.5%酸素である。
細胞は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20日間培養できる。好ましくは、細胞を5−15日間、5−10日間、又は10−15日間培養する。
好ましくは、細胞培養はインスリンサプリメン及び/又は化学的に定義された脂質濃縮物及びコレステロール脂質濃縮物を含む。
エクソソーム標品
本発明は、本発明の細胞培養から生成されたエクソソーム標品を包含する。種々の実施形態において、エクソソーム標品は直径50〜250nmのエクソソームを含有する。好ましくは、少なくとも25%、50%、65%、75%、80%、85%、90%、又は95%のエクソソームは、少なくとも50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、又は160nmである。好ましくは、少なくとも25%、50%、65%、75%、80%、85%、90%、又は95%のエクソソームは、直径で少なくとも250nm未満、240nm、230nm、220nm、210nm、200nm、190nm、180nm、170nm、160nm、150nm、又は140nmである。従って、本発明は、少なくとも25%、50%、65%、75%、80%、85%、90%、又は95%のエクソソームが直径50〜250nm、直径60〜250nm、直径60〜240nm、直径50〜240nmなどであるエクソソーム標品を含む。
いくつかの実施形態において、エクソソーム標品は、少なくとも10、5x10、10、5x10、10、 5x10、10、5x10、10、5x10、1010、5x1010、1011、5x1011、又は1012、又は5x1012のエクソソームを含有する。いくつかの実施形態において、エクソソーム標品は、10、10、10、10、10、1010、又は1011〜10、10、10、10、1010、1011、又は1012などのエクソソームを含有する。
いくつかの実施形態において、エクソソーム標品は、マイクロRNAを含有する1つ以上のエクソソームを含む。種々の実施形態において、これらのマイクロRNAはmiR−146A及び/又はmiR−210を含みうる。いくつかの実施形態において、エクソソーム標品は、miR−210が濃縮されたエクソソームを含む。
種々の実施形態において、エクソソームを生成する細胞培養での酸素濃度は、1−2%、2−3%、4−5%、5−6%、6−7%、7−8%、8−9%、9−10%、10−11%、11−12%、12−13%、13−14%、14−15%、15−16%、17−18%、又は18−19%である。好ましくは、酸素濃度は2−8%、3−7%酸素、4−6%酸素、又は4.5−5.5%酸素である。より低い酸素濃度(例えば2−8%酸素)で培養した細胞から生成されたエクソソームは、20%酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームと、RNA及びタンパク質構成成分が異なる。
1つの実施形態において、2−8%酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームのタンパク質含量は、20%酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームのものより高い。1つの実施形態において、2−8%酸素で培養した細胞から生成したエクソソームの全RNA含量は20%酸素で培養した細胞から生成したエクソソームの全RNA含量より高い。1つの実施形態において、2−8%酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームのmiR−146A RNA含量は20%酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームのものより高い。1つの実施形態において、2−8%酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームのmiR−210 RNA含量は20%酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームのものより高い。
安定した液体CDCエクソソーム製剤
いくつかの実施形態において、本発明は安定した液体エクソソーム製剤を包含する。本発明の「安定した液体CDCエクソソーム製剤」の文脈内で、「液体」という用語は、20℃での製剤の状態を意味する。従って、安定した液体CDCエクソソーム製剤は−20℃で凍結するときに液体の場合がある。「ヒトへの投与に適した」という句は、製剤が、製剤の無菌性を維持する条件下で薬剤的に許容される組成で調製されたことを意味する。
安定した液体CDCエクソソーム製剤は、少なくとも10、5x10、10、 5x10、10、5x10、 10、5x10、10、5x10、1010、5x1010、1011、5x1011、又は1012、又は5x1012のCDCエクソソームを含有しうる。いくつかの実施形態において、安定した液体CDCエクソソーム製剤は、10、10、10、10、10、1010、又は1011から10、10、10、10、1010、1011、又は1012など迄のエクソソームを含有する。CDCエクソソーム 好ましくは、安定した液体CDCエクソソーム製剤は、少なくとも10又は10エクソソームを含む。
いくつかの実施形態において、安定した液体エクソソーム製剤中のmiR−210 RNA及びmiR−146Aレベルは、少なくとも7、14、21、23、30、60、90日間などの間、少なくとも開始レベルの10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%などのレベルで維持される。安定した液体エクソソーム製剤中のmiR−210 RNA及びmiR−146Aのレベルが、少なくとも7、14日間などの間、開始レベルの少なくとも10%、20%などのレベルで維持されるかどうかを実施例に記載されたアッセイ、及び類似のアッセイを用いて測定することができる。
いくつかの実施形態において、miR−210 RNA及びmiR−146Aのレベルは、20℃、10℃、4℃、0℃、−10℃、−20℃、−40℃、−80℃などで、少なくとも7、14日間などの間、開始レベルの少なくとも10%、20%などのレベルで維持される。好ましくは、miR−210 RNA及びmiR−146Aのレベルは、4℃、−20℃、又は−80℃で、少なくとも30日間開始レベルの少なくとも30%のレベルで維持される。
いくつかの実施形態において、安定した液体エクソソーム製剤は、1.0%未満、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%などのポリエチレングリコール(w/v)を含む。好ましくは、安定した液体エクソソーム製剤は0.01%未満のポリエチレングリコールを含む。
好ましくは、安定した液体エクソソーム製剤は限外濾過によって生成される。最も好ましくは、安定した液体エクソソーム製剤は、限外濾過による心筋球由来細胞(CDC)からの限外濾過によって生成される。
好ましくは、安定した液体エクソソーム製剤は、2200−3000mgの塩化ナトリウム、160−200mgの塩化カリウム、約150mgの塩化マグネシウム六水和物、70mEqのナトリウム、約1800mgの酢酸ナトリウム三水和物、及び約2500のグルコン酸ナトリウムのレベル(500ml当たり)で含有する溶液を含む。
好ましくは、安定した液体エクソソーム製剤は、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%などの開始エクソソーム製剤のインビトロ生物活性レベル を、少なくとも7、14、21、23、30、60、90日間などの間維持する。インビトロ生物活性レベルは参照により本明細書に組み込まれるde Couto et al., J Clin Invest.2015 Aug 3;125(8):3147−62の技術を用い、実施例に記載したマクロファージアッセイを用いて測定することができる。
好ましくは、安定した液体エクソソーム製剤は、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%などの開始エクソソーム製剤のインビボ生物活性レベルを、少なくとも7、14、21、23、30、60、90日間などの間維持する。インビボ 生物活性レベルは、参照により本明細書に組み込まれるde Couto et al., J Clin Invest.2015 Aug 3;125(8):3147−62の技術による実施例に記載したラットAMI再灌流モデルアッセイを用いて測定することができる。
安定した凍結乾燥エクソソーム製剤
いくつかの実施形態において、本発明は安定した凍結乾燥エクソソーム製剤を包含する。本発明の「安定した凍結乾燥エクソソーム製剤」の文脈内で、「凍結乾燥された(lyophilized)」という用語は、予め凍結乾燥(すなわちフリーズドライ)処置を受けたエクソソームの標品を意味する。従って、「安定した凍結乾燥エクソソーム製剤」は、乾燥エクソソーム標品又は凍結乾燥を受けて、その後水溶液中に懸濁されたエクソソームの標品を意味する場合がある。「ヒトへの投与に適した」という句は、製剤が、製剤の無菌性を維持する条件下で薬剤的に許容される組成で調製されたことを意味する。
安定した凍結乾燥エクソソーム製剤は、少なくとも10、5x10、10、5x10、10、5x10、 10、5x10、10、5x10、1010、5x1010、1011、5x1011、又は1012、又は5x1012のエクソソームを含有しうる。いくつかの実施形態において、安定した凍結乾燥エクソソーム製剤は、10、10、10、10、10、1010、又は1011から10、10、10、10、1010、1011、又は1012など迄のエクソソームを含有する。好ましくは、安定した凍結乾燥エクソソーム製剤は、少なくとも10又は10のエクソソームを含む。
いくつかの実施形態において、安定した凍結乾燥エクソソーム製剤中のmiR−210 RNA及びmiR−146Aレベルは、凍結乾燥前製剤の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%などのレベルを、好ましくは、少なくとも7、14、21、23、30、60、90日間など間、維持される。安定した凍結乾燥エクソソーム製剤中のmiR−210 RNA及びmiR−146Aのレベルが、少なくとも 7、14日間などの間、凍結乾燥前製剤の少なくとも10%、20%などのレベルで維持されるかどうかを実施例に記載されたアッセイ及び類似アッセイ、すなわち凍結乾燥前後でmiRNAを測定することによって決定することができる。
いくつかの実施形態において、miR−210 RNA及びmiR−146Aのレベルは、20℃、10℃、4℃、0℃、−10℃、−20℃、−40℃、−80℃などで、少なくとも7、14日間などの間、凍結乾燥前製剤の少なくとも10%、20%などのレベルで維持される。いくつかの実施形態において、miR−210 RNA及びmiR−146Aのレベルは、冷凍なしで少なくとも7、14日間などの間、凍結乾燥前製剤の少なくとも10%、20%などのレベルで維持される。好ましくは、miR−210 RNA及びmiR−146Aのレベルは4℃、−20℃、又は−80℃で少なくとも7日間、 凍結乾燥前製剤の少なくとも70%のレベルで維持される。更に好ましくは、miR−210 RNA及びmiR−146Aのレベルは、4℃、−20℃、又は−80℃で少なくとも7日間、凍結乾燥前製剤の少なくとも90%のレベルで維持される。最も好ましくは、miR−210 RNA及びmiR−146Aのレベルは、冷凍なしで少なくとも7日間、凍結乾燥前製剤の少なくとも90%で維持される。
本発明は、少なくとも10のエクソソームを含む安定した凍結乾燥エクソソーム製剤であって、凍結乾燥エクソソームが凍結乾燥前エクソソーム製剤の少なくとも90%のレベルのmiR−210 RNA及びmiR−146Aを維持することを包含する。
好ましくは、安定した凍結乾燥エクソソーム製剤は、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%などの凍結乾燥前のエクソソーム製剤のインビトロ生物活性レベルを、好ましくは少なくとも7、14、21、23、30、60、90日間などの間維持する。凍結乾燥前後のインビトロ生物活性レベルは参照により本明細書に組み込まれるde Couto et al., J Clin Invest.2015 Aug 3;125(8):3147−62の技術による実施例に記載したマクロファージアッセイを使用して測定することができる。
好ましくは、安定した凍結乾燥エクソソーム製剤は、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%などの凍結乾燥前のエクソソーム製剤のインビボ生物活性レベルを、好ましくは少なくとも7、14、21、23、30、60、90日間などの間維持する。凍結乾燥前後のインビボ生物活性レベルは 参照により本明細書に組み込まれるde Couto et al., J Clin Invest.2015 Aug 3;125(8):3147−62の技術による実施例に記載したラットAMI再灌流モデルアッセイを用いて測定することができる。
本発明は、少なくとも10のエクソソームを含む安定した凍結乾燥エクソソーム製剤であって、凍結乾燥エクソソームは、凍結乾燥前エクソソーム標品の少なくとも90%のレベルのインビトロ生物活性を維持することを包含する。
本発明は、少なくとも10のエクソソームを含む安定した凍結乾燥エクソソーム製剤であって、凍結乾燥エクソソームは、凍結乾燥前エクソソーム標品の少なくとも90%のレベルのインビボ生物活性を維持することを包含する。
いくつかの実施形態において、安定した凍結乾燥エクソソーム製剤は、1.0%未満、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%などのポリエチレングリコール(w/v)を含む。好ましくは、安定した凍結乾燥エクソソーム製剤は0.01%未満のポリエチレングリコールを含む。
いくつかの実施形態において、安定した凍結乾燥エクソソーム製剤は心筋球由来細胞(CDC)から生成される。いくつかの実施形態において、安定した凍結乾燥エクソソーム製剤は間充織幹細胞(MSC)、心臓組織由来幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、神経組織由来幹細胞及び他の組織由来幹細胞から生成される。
好ましくは、安定した凍結乾燥エクソソーム製剤は限外濾過によって生成される。最も好ましくは、安定した凍結乾燥エクソソーム製剤は、限外濾過による心筋球由来細胞(CDC)からの限外濾過によって生成される。
エクソソーム採取
エクソソームは、ルーチン技術によって細胞培養から採取することができる。例えば、細胞はコンフルエントに達したときに、25mlのPBSで3回洗浄され、30mlのIMDMが加えられ(FBSなし)、特定の酸素濃度にある恒温器に戻すことができる。一定時間の後、IMDM培地を取り除き、50mlの円すい管に配置することができる。培地は、細胞残屑を除去するため3000xgで15分間遠心分離することができる。培地は、15mlの円すい管に10mlの画分で分割され、−80℃で保存される。
エクソソームは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15日間培養した後に採取することができる。
いくつかの実施形態において、エクソソームは、培養の2、3、4、又は5日おきに採取する。
エクソソーム精製
エクソソーム標品は、当該技術分野におけるルーチン技術によって調製することができる。いくつかの実施形態において、エクソソームの調製は、細胞の遠心分離及び/又は細胞によるコンディション化培地を含む。いくつかの実施形態において、超遠心分離法が使用される。いくつかの実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製はサイズ排除濾過による。いくつかの実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製は、不連続密度勾配、免疫親和性、限外濾過及び/又は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)の使用を含む。
いくつかの実施形態において、細胞由来のエクソソームからより大きいサイズの粒子を分離するために、少なくとも1000xg、2000xg、3000xg、4000xg、5000xg、6000xg,7000xg,8000xg,又は9000xgから2000xg,3000xg,4000xg、5000xg、6000xg、7000xg、8000xg、9000xg、10,000xg、又はそれ以上迄の遠心力を使用することを含め、異なる超遠心分離が使用される。
いくつかの実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製は、濾過又は限外濾過の使用を含む。特定の実施形態において、異なる細孔寸法のサイズ排除膜が使用される。例えば、サイズ排除膜は、少なくとも0.1、0.5μm、1.0μm、2.5μm、5μmから0.5μm、1.0μm、2.5μm、5μm、又はそれ以上迄の細孔寸法をもつフィルタの使用を含むことができる。いくつかの実施形態において、細孔寸法は約0.2μmである。いくつかの実施形態において、濾過又は限外濾過は、0.1kDa、0.5kDa、1kDa、2kDa、5kDa、10kDa、25kDa、50kDa,100kDa,又は250kDaから0.5kDa,1kDa,2kDa,5kDa,10kDa、25kDa、50kDa、100kDa、250kDa、500kDa、又はそれ以上迄の範囲のサイズ排除を含む。
好ましくは、単離したエクソソームは、0.22μmの微生物排除フィルタを用いてフィルタ滅菌される。好ましくは、エクソソームは、0.45μmを使用して細胞残屑を除去する。
種々の実施形態において、かかる系は可変流体流系を組み合わせて使用される。他の実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製は、エクソソーム画分を精製及び/又は濃縮するために使用される接線流濾過(TFF)系の使用を含む。他の実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製は、(HPLC)を使用してエクソソームを均一にサイズ化した粒子に精製することを含む。種々の実施形態において、使用される密度勾配は、例えばショ糖密度勾配での遠心分離又は調製で離散型糖クッション(discrete sugar cushion)の応用である。
他の実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製は沈殿剤の使用を含む。例えば、EXOQUICK(登録商標)などの沈殿剤は、コンディション化細胞培地に加えて、迅速かつ急速にエクソソーム集団を沈殿させることができる。いくつかの実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製は、容量排除ポリマー(例えばポリエチレングリコール(PEG))の使用を含む。別の実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製は、フローフィールドフローフラクショネーション(FlFFF)、溶出ベース技術の使用を含む。
いくつかの実施形態において、PEGを5%、10%、15%、又は20%の最終濃度で使用し、エクソソームを沈殿させる。いくつかの実施形態において、PEGは約4000、6000、8000、10000、12000、15000、又は23000ダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態において、PEGは約4000−6000、6000−8000、8000−10000、10000−12000、12000−15000、 又は15000−23000ダルトンの分子量を有する。
特定の実施形態において、エクソソームの調製は、特異的バイオマーカーを有する、又は特定の生体分子を含む1つ以上のエクソソームを単離するための1つ以上の捕捉剤の使用を含む。1つの実施形態において、1つ以上の捕捉剤が少なくとも1つの抗体を含む。例えば、エクソソーム関連抗原を認識する抗体免疫親和性を利用して特異的エクソソームを捕捉する。他の実施形態において、少なくとも1つの抗体が、電磁ビーズ、クロマトグラフィーマトリックス、プレート又はマイクロ流体デバイスなどの固定化表面に接合し、それによって対象の特異的エクソソーム集団の単離を可能にする。
いくつかの実施形態において、PEGは1−2%、2−3%、3−4%、4−5%、5−6%、6−7%、7−8%、8−9%、又は9−10%の最終濃度に調製した後、エクソソーム標品に加える。いくつかの実施形態において、PEGは約4000、6000、8000、10000、12000、15000、又は23000ダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態において、PEGは約4000−6000、6000−8000、8000−10000、10000−12000、12000−15000、又は15000−23000ダルトンの分子量を有する。
いくつかの実施形態において、エクソソームの凝集を起こす薬剤を、精製前又は精製後にエクソソーム標品に加える。
安定した液体エクソソーム製剤を製造する方法
本発明は、安定した液体エクソソーム製剤の製造方法を包含する。1つの実施形態において、エクソソームを限外濾過にかける。好ましくは、限外濾過は2、3、5、10、20、40、50、80、又は100kDフィルタを用いる。
いくつかの実施形態において、微生物排除膜を使用して予想される微生物汚染を除去する(0.22μmフィルタ)。
いくつかの実施形態において、安定した液体エクソソーム製剤は心筋球由来細胞(CDC)から生成される。いくつかの実施形態において、安定した液体エクソソーム製剤は間充織幹細胞(MSC)、心臓組織由来幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、神経組織由来幹細胞及び他の組織由来幹細胞から生成される。
いくつかの実施形態において、本方法は緩衝生理食塩水への緩衝剤の交換を含む。好ましくは、本方法は透析濾過を含む。
安定した凍結乾燥エクソソーム製剤を製造する方法
本発明は、安定した液体エクソソーム製剤の製造方法を包含する。好ましい実施形態において、昇華状態の間は低温が維持される。1つの実施形態において、実施例のプロトコルが凍結乾燥に使用される。
好ましい実施形態において、エクソソームはIMDM又はPLASMALYTEの溶液で提供される。
1つの実施形態において、エクソソームは昇華前に−70℃に冷凍される。
1つの実施形態において、本方法は、エクソソームを−70℃で200mTの真空にかけることを含む。種々の実施形態において、本方法は、−40℃〜−0℃、好ましくは、−40℃、−30℃、−10℃、又は0℃の温度で80−480分間、100mT/−70℃でエクソソームを保持することを含む。 好ましくは、凍結乾燥エクソソームを含むバイアルを窒素で充填(バックフィル)する。
好ましい実施形態では、凍結乾燥エクソソームを水溶液、好ましくは水に懸濁する。
安定したエクソソーム製剤を貯蔵する方法
いくつかの実施形態において、本発明は安定したエクソソーム製剤の貯蔵方法を包含する。いくつかの実施形態において、製剤は室温環境で維持される。いくつかの実施形態において、製剤は20℃又は以下、10℃、4℃、0℃、−10℃、−20℃、−40℃、−80℃などで維持される。いくつかの実施形態において、製剤は室温環境で維持される。いくつかの実施形態において、製剤は、少なくとも1週間、1か月、2か月、3か月、6か月、1年間など所定の温度で維持される。本発明は、20℃以下、10℃、4℃、0℃、−10℃、−20℃、−40℃、−80℃などで、少なくとも1週間、1か月、2か月、3か月、6か月、1年間など貯蔵されるエクソソーム標品を包含する。
エクソソーム分析
20%未満の酸素で培養した細胞のエクソソーム標品は、分析することができる。エクソソームは、20%酸素で培養した類似の細胞から調製したエクソソームと比較することができる。20%未満の酸素(例えば2−8%酸素)で培養した細胞から生成されたエクソソームのタンパク質又はRNA含量が、20%酸素で培養した細胞から生成されたものより高いかどうかは、本明細書に記載した技術又は他の類似の技術を用いて決定することができる。
エクソソームの数及びサイズは、例えばナノサイトによる定量法を用いて定量が可能である。
エクソソームのタンパク質含量は、総タンパク質レベルの測定に対してはルーチン技術を使用して、又は特異的タンパク質レベルの測定に対してはルーチンなタンパク質検出技術(例えばウエスタンブロット)を使用して分析することができる。
エクソソームのRNA含量は、全RNAレベルの測定に対してはルーチン技術を使用して、又は特異的RNAレベルの測定に対してはルーチンな核酸検出法(例えば、PCR又はプローブハイブリダイゼーション)を使用して分析することができる。好ましいRNAは、マイクロRNA、特にmiR−146A及びmiR−210 RNAである。
実施例1
エクソソーム標品
受領次第直ちに、心臓を肉眼的に解剖し、外植片と称した、それぞれ約25mg(500μπιx500μπιx500μπι;いくつかの実施形態では他のサイズを使用する)の生検サイズの塊に切断した。ヒト心臓は、以前に記載(米国特許US20150216905 A1を参照)した自動ティッシュスライサー(Zimmer(登録商標)Dermatome)及び自動ティッシュチョッパー(Mcllwain(商標)Tissue Chopper, Ted Pella, Inc.)を使用して切断した。次いで、外植片を、以前に記載(例えば、本明細書に参照として全体が組み込まれているSmith et al. 2007並びに米国特許出願第11/666,685号(2007年4月21出願)及び第13/412,051号(2012年3月5日出願)を参照)したように処理した。
同種異系のCDCを生成するために、外植片をCELLBIND(登録商標)CellSTACK(登録商標)容器(Corning Life Sciences)上に配置した。1−2週間後、外植片から新たに出現した細胞増生がコンフルエントになった。これらの外植片由来細胞(EDC)をIXTrypLE(商標)(Invitrogen)を使って採取した。EDCは、Master Cell Bank(MCB)として凍結保存し、次いで心筋球(CSps)として培養するか、又はCSp培養条件に直ちに配置した。CSpは、UltraLow(登録商標)CellSTACK(登録商標)容器(Corning Life Sciences)面で増殖させた。
同種異系CDCをフィブロネクチンコートNunc* TripleFlasks (Thermo Scientific)面に播種して増殖させ、コンフルエントになったときに細胞を継代した。様々な継代数でCDCをフィブロネクチンコートCellBind多層培養器上に播種し、エクソソーム生成用コンフルエントにすることができた。コンフルエントと同時に、培地を無血清条件(例えば、HEPES及びL−グルタミンを含むイスコフ改変ダルベッコ培地)と交換した。細胞は、5又は15日間で培地に順化できた。
実施例2
エクソソーム単離
エクソソームは、0.45μmを使用して濾過し、細胞残屑を除去した後、サイズ(2〜30kda)ベースの限外濾過、ポリエチレングリコール沈殿又はExoquick (SBI, Mountain View, CA)によって単離した。一定の状況で、単離したエクソソームを0.22μmの微生物排除フィルタでフィルタ滅菌した。エクソソームを幾つかの透析濾過を使用して定式化し、緩衝剤を、許容される注射剤溶液(例えば、PLASMALYTE、RINGERS溶液 )に置き替えた。
実施例3
エクソソーム分析
エクソソームタンパク質は、DCアッセイ(Bio−Rad, Hercules, CA)を使用して評価した。エクソソーム粒度及び濃度は、ブラウン運動及びナノサイトによる追跡分析(Malvern Instruments Ltd, Malvern UK)を使用して評価した。RNAは、miRNeasy micro kit (Qiagen, Valencia, CA)を用いて単離し、Nanodrop、Qubit又はAATI断片化アナライザ(Advance Analytics, Ankeny, IA)を使用して定量した。逆転写反応及びqPCR反応は、TaqMan miRプローブ(ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)を使用して行った。
実施例4
エクソソーム生物活性
生物活性は、以前に記載(de Couto et al., J Clin Invest.2015 .Aug 3;125(8):3147−62)したM1又はM2表現型に対する骨髄由来マクロファージの遺伝子発現によってインビトロで評価した。生物活性は、以前に記載(de Couto, et al 2015)したラットAMI再環流モデルを用いてインビボで評価した。全結果は、平均±標準偏差とした提示した。2群間の統計的有意性は、ANOVAを使用して決定し、次いでテューキー(Tukey)HSD法で全ての組合せを比較した。差異は、p<0.05の場合に有意とみなした。
実施例5
凍結乾燥プロトコル
培地中のエクソソーム製剤を凍結乾燥した一方、昇華状態の間は低温を維持した。凍結乾燥プロトコルは以下の通りであった。
できるだけ迅速に@−70℃で凍結させ、−70℃で60分間保持する。
@−70℃で90分間/真空(200mTで開始)で最終凍結させる。
1次乾燥:
工程1−@100mT、0分で−40℃に設定
工程2−@100mT、90分間、−40℃に保持
工程3−@100mT、0分で−30℃に設定
工程4−@100mT、480分間、−30℃に保持
工程5−@100mT、0分で−10℃に設定
工程6−@100mT、240分間、−10℃に保持
工程7−@100mT、0分で0℃に設定
工程8−@100mT、120分間、0℃に保持
工程9−@100mT、0分で+10℃に設定
工程10−@100mT、90分間、+10℃に保持
2次乾燥:
@100mTで9,999分間、+20℃(注意:無制限保持のための9,999入力)
バイアルを窒素@700,000mTで充填(バックフィル)し、真空下で塞栓し蓋をした。

Claims (15)

  1. 少なくとも10のエクソソームを含むヒトへの投与に適した安定した凍結乾燥エクソソーム製剤であって、前記凍結乾燥エクソソームは、凍結乾燥前のエクソソーム製剤の少なくとも90%レベルのmiR−210 RNA及びmiR−146Aを維持する前記製剤。
  2. 前記エクソソーム製剤は、少なくとも10のエクソソームを含む、請求項1に記載の安定した凍結乾燥エクソソーム製剤。
  3. 前記エクソソーム製剤は、心筋球由来細胞(CDC)から生成される、請求項1〜2のいずれか1項に記載の安定した凍結乾燥エクソソーム製剤。
  4. 前記エクソソーム製剤は、限外濾過及び透析濾過によって心筋球由来細胞(CDC)から生成される、請求項3に記載の安定した凍結乾燥エクソソーム製剤。
  5. 少なくとも10のエクソソームを含むヒトへの投与に適した安定した凍結乾燥エクソソーム製剤であって、前記凍結乾燥エクソソームは、凍結乾燥前のエクソソーム標品の少なくとも90%レベルのインビトロ生物活性を維持する前記製剤。
  6. 前記エクソソーム製剤は、少なくとも10のエクソソームを含む、請求項5に記載の安定した凍結乾燥エクソソーム製剤。
  7. 前記エクソソーム製剤は、心筋球由来細胞(CDC)から生成される、請求項5〜6のいずれか1項に記載の安定した凍結乾燥エクソソーム製剤。
  8. 前記エクソソーム製剤は、限外濾過及び透析濾過によって心筋球由来細胞(CDC)から生成される、請求項7に記載の安定した凍結乾燥エクソソーム製剤。
  9. 少なくとも10のエクソソームを含むヒトへの投与に適した安定した凍結乾燥エクソソーム製剤であって、前記凍結乾燥エクソソームは、凍結乾燥前のエクソソーム標品の少なくとも90%レベルのインビボ生物活性を維持する前記製剤。
  10. 前記エクソソーム製剤は、少なくとも10のエクソソームを含む、請求項9に記載の安定した凍結乾燥エクソソーム製剤。
  11. 前記エクソソーム製剤は、心筋球由来細胞(CDC)から生成される、請求項9〜10のいずれか1項に記載の安定した凍結乾燥エクソソーム製剤。
  12. 前記エクソソーム製剤は、限外濾過及び透析濾過によって心筋球由来細胞(CDC)から生成される、請求項11に記載の安定した凍結乾燥エクソソーム製剤。
  13. 少なくとも10のCDCエクソソームを含むヒトへの投与に適した安定した液体心筋球由来細胞(CDC)エクソソーム製剤であって、前記エクソソーム製剤は、4℃で30日間、開始エクソソーム製剤の少なくとも75%レベルのmiR−210 RNA及びmiR−146Aを維持する前記製剤。
  14. 前記エクソソーム製剤は、少なくとも10のエクソソームを含む、請求項13に記載の安定した液体CDCエクソソーム製剤。
  15. 前記エクソソーム製剤は、限外濾過及び透析濾過によって心筋球由来細胞(CDC)から生成される、請求項13〜14のいずれか1項に記載の安定した液体CDCエクソソーム製剤。
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