JP2019506877A - アデノウイルスの複製動態を測定するための高スループットアッセイ - Google Patents

Abstract

異種オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および自己切断ペプチドコーディング配列を含む、組換えアデノウイルスゲノムが、記載される。組換えアデノウイルスゲノムおよび開示されるゲノムによって産生される組換えアデノウイルスは、例えば、ウイルス複製動態を測定するための高スループットアッセイにおいて使用することができる。組換えアデノウイルスの複製動態を測定するための方法もまた、記載される。一局面において、異種オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および自己切断ペプチドコーディング配列を、いずれも内因性アデノウイルスＯＲＦと同じリーディングフレーム内に、それと作動可能に連結した状態で含む、組換えアデノウイルスゲノムが提供される。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２０１６年２月２３日に出願された米国仮出願第６２／２９８，６４９号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。

技術分野
本開示は、組換えアデノウイルス構築物における外因性オープンリーディングフレームの最適な配置、およびアデノウイルスの複製動態を測定するためのアッセイにおける組換えウイルスの使用に関する。

アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）は、基礎研究適用、マウス肺がんモデル、およびヒト遺伝子療法の治験において最適なベクターである。アデノウイルスは、感染を特定の細胞型上の受容体に標的化するＡｄファイバータンパク質突起（ｓｐｉｋｅ）で覆われたタンパク質キャプシドによって保護された安定な３６ｋｂの二本鎖ＤＮＡゲノムを有する。アデノウイルスは、宿主ＤＮＡに組み入れられず、確立されたプロトコールを使用して高い力価で産生させることができ、ヒト遺伝子療法およびがんでの適用における安全性が証明されている。したがって、Ａｄに基づくベクターは、がんの診断および治療法において非常に有望である。しかしながら、臨床上および治療上の使用のために設計された組換えアデノウイルスの複製動態を評価する高速かつ高スループットな手段に対する必要性が存在する。

異種オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および自己切断ペプチドコーディング配列を含む、組換えアデノウイルスゲノムが、本明細書において開示される。組換えアデノウイルスゲノムおよび開示されるゲノムによって産生される組換えアデノウイルスは、例えば、ウイルス複製動態を測定するためのアッセイにおいて使用することができる。

異種ＯＲＦおよび自己切断ペプチドコーディング配列を、いずれも内因性アデノウイルスＯＲＦと同じリーディングフレーム内に、それと作動可能に連結した状態で含む、組換えアデノウイルスゲノムが、本明細書において提供される。自己切断ペプチドコーディング配列は、異種ＯＲＦと内因性ＯＲＦとの間に位置する。一部の実施形態では、内因性ＯＲＦが、Ｅ１Ｂ−５５ｋであり、異種ＯＲＦが、Ｅ１Ｂ−５５ｋの３’にあるか、内因性ＯＲＦが、ＤＮＡポリメラーゼであり、異種ＯＲＦが、ＤＮＡポリメラーゼの５’にあるか、内因性ＯＲＦが、ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）であり、異種ＯＲＦが、ＤＢＰの３’にあるか、内因性ＯＲＦが、アデノウイルス死タンパク質（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＤＰ）であり、異種ＯＲＦが、ＡＤＰの５’にあるか、内因性ＯＲＦが、Ｅ３−１４．７ｋであり、異種ＯＲＦが、Ｅ３−１４．７ｋの３’にあるか、または内因性ＯＲＦが、Ｅ４−ＯＲＦ２であり、異種ＯＲＦが、Ｅ４−ＯＲＦ２の５’にある。

本明細書に開示される組換えアデノウイルスゲノムを含む、組換えアデノウイルスが、本明細書においてさらに提供される。

組換えアデノウイルスの複製動態を測定するための方法もまた、提供される。一部の実施形態では、組換えアデノウイルスのゲノムは、蛍光タンパク質をコードする異種ＯＲＦおよび自己切断ペプチドコーディング配列を、いずれもＥ１Ｂ−５５ｋ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＢＰ、ＡＤＰ、Ｅ３−１４．７ｋ、およびＥ４−ＯＲＦ２から選択される内因性アデノウイルスＯＲＦと同じリーディングフレーム内に、それらと作動可能に連結した状態で、含む。自己切断ペプチドコーディング配列は、異種ＯＲＦと内因性アデノウイルスＯＲＦとの間に位置する。一部の実施例では、本方法は、細胞に、組換えアデノウイルスのゲノムをトランスフェクトするか、または細胞に、組換えアデノウイルスの粒子を感染させることと、トランスフェクトした細胞または感染させた細胞を少なくとも２日間培養することと、培養期間の間、規則的な間隔で蛍光を測定することと、蛍光測定値から対数スロープを計算することとを含む。本方法を使用して、例えば、腫瘍細胞を得て（例えば、生検によって）、腫瘍細胞において、組換えアデノウイルスの複製動態を測定することによって、腫瘍の処置に適切な治療用アデノウイルス（腫瘍溶解性アデノウイルスなど）を選択することができ、この組換えアデノウイルスは、治療用アデノウイルスの治療用ＯＲＦが蛍光タンパク質をコードするＯＲＦと置き換えられていることを除き、治療用アデノウイルスに相当する。同様に、本方法を使用して、特定の治療用アデノウイルスでの処置に応答するであろうがん患者を選択するか、または特定の腫瘍に対して最も有効な治療用アデノウイルスを特定することができる。

本開示の上述およびその他の目的および特性は、以下の詳細な説明、続いて添付の図面への参照により、さらに明らかとなろう。

図１は、アデノウイルス構築物を試験するための例示的な作業フローの概略図である。全ウイルスゲノムプラスミドを産生し、マルチウェルプレートにおいて、好適な細胞、例えば、２９３−Ｅ４細胞にトランスフェクトする。トランスフェクトした細胞が増えると、それらを、凍結／解凍に供して、ウイルス粒子を放出させ、続いて、遠心分離によって細胞残屑をペレットにする。上清（ウイルス粒子を含有する）を、複数のより大きな培養プレートに移す。ウイルス粒子を、トランスフェクトした細胞から採取し、ＣｓＣｌ精製し、感染ウイルス力価を、ＥＬＩＳＡによって測定する。次いで、目的の細胞型に、精製したウイルスを公知のＭＯＩで感染させる。感染の４８時間後または７２時間後に、アデノウイルス後期タンパク質、アデノウイルスゲノム、またはプラークを、それぞれ、ウエスタンブロット、ｑ−ＰＣＲ、またはプラークアッセイによって測定する。

図２は、指数関数的ウイルス増殖を示す概略図である。腫瘍内のすべての細胞の腫瘍溶解性殺滅には、指数関数的ウイルス増殖が必要である。しかしながら、ほとんどの事例において、腫瘍細胞のうち、初回に感染されるものはわずかな割合のみである。したがって、１回の複製当たりの子孫の数のわずかな違いが、たった数回の複製後でも粒子の総数に大きな違いをもたらす。１サイクル当たり３ビリオンを産生するウイルスと、１サイクル当たり５ビリオンを産生するウイルスとの間の比較を示す。グラフに示されているように、５〜６回の複製後に、これら２つのウイルスのウイルス力価は、有意に異なる。

図３は、本明細書において開示される蛍光に基づくウイルス動態（ＦＢＶＫ）アッセイの作業フローを示す概略図である。全ウイルスゲノムプラスミドを産生し（例えば、ＡｄｓｅｍｂｌｙまたはＡｄＳＬＩＣによって）、これを、マルチウェルプレートにおいて目的の細胞型にトランスフェクトするために使用する。あるいは、細胞に、組換えアデノウイルス粒子を感染させる。アデノウイルスゲノムは、ウイルス複製動態を実質的に変化させないウイルスゲノム内の位置に、蛍光タンパク質をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。蛍光を経時的にモニタリングして、ウイルス複製動態を計算する。

図４Ａ〜４Ｂは、アデノウイルスゲノムプラスミドを用いて開始した場合の例示的な動態アッセイ環境を概説する。このアッセイは、初回トランスフェクション効率の把握を必要としない。トランスフェクション条件は、細胞のうちのおよそ５〜１０％が、初回にトランスフェクトされるように選択される。示されている実施例では、４８ウェルプレートを使用しており、これにより、３つの模擬感染ウェルおよびツール感度変動を補償するためのＦＬＵＯＲＥＳＢＲＩＴＥ（商標）ビーズを有する３つのウェルとともに、１４種類の異なるウイルス構築物を３連で試験することが可能となる。（図４Ａ）４８ウェルプレートの上半分のウェルは、６種類の異なるウイルスのゲノムプラスミドをトランスフェクトした細胞、模擬感染細胞、およびブランク（ＦＬＵＯＲＥＳＢＲＩＴＥ（商標）ビーズ）を、それぞれ３連で含有する。（図４Ｂ）４８ウェルプレートの下半分のウェルは、８種類の異なるウイルスのゲノムプラスミドをトランスフェクトした細胞を、３連で含有する。マルチウェルプレートは、継続的な蛍光モニタリングのために、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮプレートリーダーなど）に設置する。 図４Ａ〜４Ｂは、アデノウイルスゲノムプラスミドを用いて開始した場合の例示的な動態アッセイ環境を概説する。このアッセイは、初回トランスフェクション効率の把握を必要としない。トランスフェクション条件は、細胞のうちのおよそ５〜１０％が、初回にトランスフェクトされるように選択される。示されている実施例では、４８ウェルプレートを使用しており、これにより、３つの模擬感染ウェルおよびツール感度変動を補償するためのＦＬＵＯＲＥＳＢＲＩＴＥ（商標）ビーズを有する３つのウェルとともに、１４種類の異なるウイルス構築物を３連で試験することが可能となる。（図４Ａ）４８ウェルプレートの上半分のウェルは、６種類の異なるウイルスのゲノムプラスミドをトランスフェクトした細胞、模擬感染細胞、およびブランク（ＦＬＵＯＲＥＳＢＲＩＴＥ（商標）ビーズ）を、それぞれ３連で含有する。（図４Ｂ）４８ウェルプレートの下半分のウェルは、８種類の異なるウイルスのゲノムプラスミドをトランスフェクトした細胞を、３連で含有する。マルチウェルプレートは、継続的な蛍光モニタリングのために、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮプレートリーダーなど）に設置する。

図５は、組換えウイルスを用いて開始した場合の例示的な動態アッセイ環境を概説する。このアッセイは、ウイルス力価の把握を必要としない。組換えウイルスを連続希釈し、これを使用して、マルチウェルプレートに播種した細胞に感染させる。示されている実施例では、９６ウェルプレートを使用しており、各ウイルスを１：１００、１：３００、１：９００、１：２７００、１：８１００、１：２４，３００、１：７２，９００、および１：２１８，７００に希釈し、１１種類のウイルスを同時に試験することが可能である。４つのウェルは模擬感染であり、ツールの感度および変動を補償するために、ＦＬＵＯＲＥＳＢＲＩＴＥ（商標）ビーズを４つのウェルに入れる。マルチウェルプレートは、継続的な蛍光モニタリングのために、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮプレートリーダーなど）に設置する。

図６Ａ〜６Ｃは、組換えアデノウイルスのコンビナトリアルアセンブリのためのＡｄｓｅｍｂｌｙ技法およびＡｄＳＬＩＣ技法の概略図を示す。（図６Ａ）アデノウイルスゲノムを、４つのモジュール−Ｅ１、コア、Ｅ３、およびＥ４に分ける。（図６Ｂ）Ａｄｓｅｍｂｌｙは、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ反応を使用したゲノムの再アセンブリを伴う。（図６Ｃ）ＡｄＳＬＩＣは、配列およびライゲーション非依存性クローニング（ＳＬＩＣ）を利用して、アデノウイルスモジュールをアセンブリする。 図６Ａ〜６Ｃは、組換えアデノウイルスのコンビナトリアルアセンブリのためのＡｄｓｅｍｂｌｙ技法およびＡｄＳＬＩＣ技法の概略図を示す。（図６Ａ）アデノウイルスゲノムを、４つのモジュール−Ｅ１、コア、Ｅ３、およびＥ４に分ける。（図６Ｂ）Ａｄｓｅｍｂｌｙは、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ反応を使用したゲノムの再アセンブリを伴う。（図６Ｃ）ＡｄＳＬＩＣは、配列およびライゲーション非依存性クローニング（ＳＬＩＣ）を利用して、アデノウイルスモジュールをアセンブリする。 図６Ａ〜６Ｃは、組換えアデノウイルスのコンビナトリアルアセンブリのためのＡｄｓｅｍｂｌｙ技法およびＡｄＳＬＩＣ技法の概略図を示す。（図６Ａ）アデノウイルスゲノムを、４つのモジュール−Ｅ１、コア、Ｅ３、およびＥ４に分ける。（図６Ｂ）Ａｄｓｅｍｂｌｙは、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ反応を使用したゲノムの再アセンブリを伴う。（図６Ｃ）ＡｄＳＬＩＣは、配列およびライゲーション非依存性クローニング（ＳＬＩＣ）を利用して、アデノウイルスモジュールをアセンブリする。

図７は、Ｅ１領域における蛍光タンパク質をコードする組換えアデノウイルスの自然対数スロープ（ｌｎ−ｓｌｏｐｅ）を示す、棒グラフである。直接的な融合による構築物ＹＰｅｔ−Ｅ１Ａ、ならびにそれぞれＰ２Ａ部位を含有するＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−Ｅ１Ａ、Ｅ１Ａ−Ｐ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ、およびＥ１Ｂ−５５ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ構築物の値を示す。ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ構築物は、比較のために示される。

図８は、蛍光に基づくウイルス動態アッセイの動態データの分析および解釈の概略図である。

図９Ａ〜９Ｃは、Ａｄ５、Ａｄ９、またはＡｄ３４に由来し、Ｅ３−１４．７ｋ（またはＡｄ９およびＡｄ３４におけるその同等物）ＯＲＦの３’に異種ＯＲＦを含有する、組換えアデノウイルスの自然対数スロープ値を示す、棒グラフである。２９３細胞（図９Ａ）、Ａ５４９細胞（図９Ｂ）、およびＵ２ＯＳ細胞（図９Ｃ）におけるＡｄ５（Ｅ３−１４．７ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、ＰＣＭＮ−８８７）、Ａｄ９（Ｅ３−１５ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、ＰＣＭＮ−８８８）、およびＡｄ３４（Ｅ３−１４．８ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、ＰＣＭＮ−８８９）の値を示す。Ａｄ５コア（Ｅ３−１４．７ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔを含む）、ならびにＡｄ９（Ａｄ５／Ａｄ９）またはＡｄ３４（Ａｄ５／Ａｄ３４）のいずれかに由来するファイバーシャフト／ノブを含む、キメラウイルスの値もまた、それぞれの図に示す。 図９Ａ〜９Ｃは、Ａｄ５、Ａｄ９、またはＡｄ３４に由来し、Ｅ３−１４．７ｋ（またはＡｄ９およびＡｄ３４におけるその同等物）ＯＲＦの３’に異種ＯＲＦを含有する、組換えアデノウイルスの自然対数スロープ値を示す、棒グラフである。２９３細胞（図９Ａ）、Ａ５４９細胞（図９Ｂ）、およびＵ２ＯＳ細胞（図９Ｃ）におけるＡｄ５（Ｅ３−１４．７ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、ＰＣＭＮ−８８７）、Ａｄ９（Ｅ３−１５ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、ＰＣＭＮ−８８８）、およびＡｄ３４（Ｅ３−１４．８ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、ＰＣＭＮ−８８９）の値を示す。Ａｄ５コア（Ｅ３−１４．７ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔを含む）、ならびにＡｄ９（Ａｄ５／Ａｄ９）またはＡｄ３４（Ａｄ５／Ａｄ３４）のいずれかに由来するファイバーシャフト／ノブを含む、キメラウイルスの値もまた、それぞれの図に示す。 図９Ａ〜９Ｃは、Ａｄ５、Ａｄ９、またはＡｄ３４に由来し、Ｅ３−１４．７ｋ（またはＡｄ９およびＡｄ３４におけるその同等物）ＯＲＦの３’に異種ＯＲＦを含有する、組換えアデノウイルスの自然対数スロープ値を示す、棒グラフである。２９３細胞（図９Ａ）、Ａ５４９細胞（図９Ｂ）、およびＵ２ＯＳ細胞（図９Ｃ）におけるＡｄ５（Ｅ３−１４．７ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、ＰＣＭＮ−８８７）、Ａｄ９（Ｅ３−１５ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、ＰＣＭＮ−８８８）、およびＡｄ３４（Ｅ３−１４．８ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、ＰＣＭＮ−８８９）の値を示す。Ａｄ５コア（Ｅ３−１４．７ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔを含む）、ならびにＡｄ９（Ａｄ５／Ａｄ９）またはＡｄ３４（Ａｄ５／Ａｄ３４）のいずれかに由来するファイバーシャフト／ノブを含む、キメラウイルスの値もまた、それぞれの図に示す。

（配列表）
添付の配列表に列挙されている核酸配列およびアミノ酸配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されるように、ヌクレオチド塩基の標準的な略字およびアミノ酸の３文字コードを使用して示されている。それぞれの核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は、提示された鎖に対する任意の参照により含まれると理解される。配列表は、２０１７年２月２１日に作成された６０９ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出されており、参照により本明細書に組み込まれる。添付の配列表においては、以下の通りである。

配列番号１は、合成アデノウイルスゲノムＣＭＢＴ−３７９（ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−Ｅ１Ａ）のヌクレオチド配列である。

配列番号２は、合成アデノウイルスゲノムＣＭＢＴ−４３２（Ｅ１Ａ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）のヌクレオチド配列である。

配列番号３は、合成アデノウイルスゲノムＣＭＢＴ−４５６（Ｅ１Ｂ−５５ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）のヌクレオチド配列である。

配列番号４は、合成アデノウイルスゲノムＣＭＢＴ−４９９（Ｅ１Ｂ−５５ｋ−Ｐ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ）のヌクレオチド配列である。

配列番号５は、合成アデノウイルスゲノムＣＭＢＴ−５３０（ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−（ＤＮＡポリ））のヌクレオチド配列である。

配列番号６は、合成アデノウイルスゲノムＣＭＢＴ−８８６（ＤＢＰ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）のヌクレオチド配列である。

配列番号７は、合成アデノウイルスゲノムＣＭＢＴ−４０３（ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ）のヌクレオチド配列である。

配列番号８は、合成アデノウイルスゲノムＣＭＢＴ−４２９（ＡＤＰ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）のヌクレオチド配列である。

配列番号９は、合成アデノウイルスゲノムＰＣＭＮ−８８７（Ｅ３−１４．７ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）のヌクレオチド配列である。

配列番号１０は、合成アデノウイルスゲノムＣＭＢＴ−４５７（ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−Ｅ４−ＯＲＦ２）のヌクレオチド配列である。

配列番号１１は、合成アデノウイルスゲノムＣＭＢＴ−６３３（ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｐ２Ａ−Ｅ４−ＯＲＦ２）のヌクレオチド配列である。

配列番号１２は、Ｐ２Ａのアミノ酸配列である。

配列番号１３は、Ｆ２Ａのアミノ酸配列である。

配列番号１４は、Ｅ２Ａのアミノ酸配列である。

配列番号１５は、Ｔ２Ａのアミノ酸配列である。

配列番号１６は、Ｎ末端にＧＳＧを含む修飾されたＰ２Ａのアミノ酸配列である。

配列番号１７は、Ｎ末端にＧＳＧを含む修飾されたＦ２Ａのアミノ酸配列である。

配列番号１８は、Ｎ末端にＧＳＧを含む修飾されたＥ２Ａのアミノ酸配列である。

配列番号１９は、Ｎ末端にＧＳＧを含む修飾されたＴ２Ａのアミノ酸配列である。

配列番号２０は、合成アデノウイルスゲノムＰＣＭＮ−８８８（Ａｄ９ Ｅ３−１５ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）のヌクレオチド配列である。

配列番号２１は、合成アデノウイルスゲノムＰＣＭＮ−８８９（Ａｄ３４ Ｅ３−１４．８ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）のヌクレオチド配列である。

Ｉ．略語
Ａｄ アデノウイルス
ＡＤＰ アデノウイルス死タンパク質
ＢＦＰ 青色蛍光タンパク質
ＤＢＰ ＤＮＡ結合タンパク質
Ｅ２Ａ ウマ鼻炎Ａウイルス２Ａ
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着法
ＥＲＡＶ ウマ鼻炎Ａウイルス
Ｆ２Ａ 口蹄疫ウイルス２Ａ
ＦＡＣＳ 蛍光活性化細胞分取
ＦＭＤＶ 口蹄疫ウイルス（ｆｏｏｄ ａｎｄ ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）
ＧＦＰ 緑色蛍光タンパク質
ＭＯＩ 感染多重度
ＯＤ 光学密度
ＯＲＦ オープンリーディングフレーム
Ｐ２Ａ ブタテッショウウイルス−１ ２Ａ
ｐＩＸ タンパク質ＩＸ
ＰＴＶ１ ブタテッショウウイルス−１
ＲＦＰ 赤色蛍光タンパク質
ＳＬＩＣ 配列およびライゲーション非依存性クローニング
Ｔ２Ａ Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ
ＴａＶ Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス
ＹＦＰ 黄色蛍光タンパク質

ＩＩ．用語および方法
別途注記されない限り、技術用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓによって１９９４年に刊行されたＢｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ Ｖ（ＩＳＢＮ ０−１９−８５４２８７−９）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．によって１９９４年に刊行されたＫｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＳＢＮ ０−６３２−０２１８２−９）；およびＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．によって１９９５年に刊行されたＲｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＩＳＢＮ １−５６０８１−５６９−８）に見出すことができる。

本開示の様々な実施形態の考察を容易にするために、特定の用語の説明を、以下に提供する。

２Ａペプチド：一部のＲＮＡウイルス、例えば、ピコルナウイルスによってコードされる自己切断ペプチドの一種である。２Ａペプチドは、リボソームが２ＡエレメントのＣ末端におけるペプチド結合の合成をスキップするようにし、２Ａ配列の末端と下流のペプチドとの分離をもたらすことによって機能する（Ｋｉｍら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、６巻（４号）、ｅ１８５５６、２０１１年）。「切断」は、２ＡペプチドのＣ末端に見出されるグリシン残基とプロリン残基との間に生じる。例示的な２Ａペプチドとしては、本明細書において配列番号１２〜１５として記載されている、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ１）、および口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）によってコードされる２Ａペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、２Ａペプチドは、切断効率を改善するために、Ｎ末端に、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙを含む（配列番号１６〜１９）。

アデノウイルス：線形二本鎖ＤＮＡゲノムおよび正二十面体キャプシドを有する、非エンベロープ型ウイルスである。現在、ヒトアデノウイルスには、６８種類の血清型が公知であり、７つの種（種Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ）に分類される。異なる血清型のアデノウイルスは、異なる種類の疾患と関連付けられており、一部の血清型は、呼吸器疾患（主として種ＢおよびＣ）、結膜炎（種ＢおよびＤ）、ならびに／または胃腸炎（種ＦおよびＧ）を引き起こす。

アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）：他の細胞に感染するために細胞の溶解およびアデノウイルスの放出を媒介する、アデノウイルス感染の後期に合成されるタンパク質である。ＡＤＰは、核膜、小胞体、およびゴルジ体に局在化する、１０１個のアミノ酸の内在性膜糖タンパク質である。ＡＤＰは、以前、Ｅ３−１１．６Ｋと称されていた）。

キメラ：起源が異なる少なくとも２つの部分から構成されるものである。本開示の文脈において、「キメラアデノウイルス」とは、少なくとも２つの異なる血清型に由来する（例えば、Ａｄ５および第２の血清型のアデノウイルスに由来する）遺伝物質および／またはタンパク質を有するアデノウイルスである。この文脈において、「キャプシド交換型」アデノウイルスとは、キャプシドタンパク質が、１つの血清型のアデノウイルスに由来し、残りのタンパク質が、別のアデノウイルス血清型に由来する、キメラアデノウイルスを指す。同様に、「キメラファイバー」とは、少なくとも２つの異なる血清型のアデノウイルスに由来するアミノ酸配列を有するファイバータンパク質である。例えば、キメラファイバーは、Ａｄ５由来のファイバーシャフトおよび第２の血清型のアデノウイルスに由来するファイバーノブから構成され得る。別の実施例では、キメラファイバーは、Ａｄ５テール、ならびに第２の血清型のアデノウイルス（Ａｄ９またはＡｄ３４など）に由来するファイバーシャフトおよびノブから構成される。

接触させること：直接的な物理的会合におくことであり、固体形態および液体形態の両方を含む。

縮重バリアント：本開示の文脈において、「縮重バリアント」とは、遺伝子コードの結果として縮重となる配列を含むペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。天然のアミノ酸が２０個あり、その大半が、１つを上回るコドンによって指定される。したがって、ヌクレオチド配列によってコードされるペプチドのアミノ酸配列が変化しない限り、そのペプチドをコードするすべての縮重ヌクレオチド配列が、含まれる。

欠失した：「欠失した」タンパク質（Ｅ４ｏｒｆ１またはＥ４ｏｒｆ６／７タンパク質など）をコードするアデノウイルスゲノムは、タンパク質コーディング配列の完全な欠失、またはタンパク質発現の不在をもたらす部分的欠失を有するアデノウイルスを指す。

Ｅ２Ｆの脱制御（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）：Ｅ２Ｆ転写因子および下流の標的遺伝子の活性の増加を指し、これは、ほぼすべての種類のヒトのがんにおいて生じる。Ｅ２Ｆ経路活性および転写の脱制御は、Ｒｂ、ｐ１０７、およびｐ１３０腫瘍抑制因子の機能喪失変異および欠失など、経路の上流の任意の構成要素における様々な異なる変異の結果として生じ得る。Ｒｂは、特定された最初の腫瘍抑制因子であり、ヒト腫瘍の少なくとも３分の１で、不在であるか、または変異している。加えて、ｐ１６変異および／またはエピジェネティックサイレンシングは、腫瘍細胞においてＥ２Ｆを活性化し得る。サイクリンＤおよびＣＤＫ４の変異、遺伝子増幅、または過剰発現もまた、ヒト腫瘍においてＥ２Ｆ活性の脱制御をもたらし得る。加えて、Ｅ２Ｆは、ＥＧＦＲ、ＲＴＫ、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＰＩ−３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＲＡＦ、ＭＹＣを含む、増殖因子受容体経路の変異によって活性化される。ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}−サイクリンＤ：ｃｄｋ４／６−ＲＢ−Ｅ２Ｆ経路における変異は、概して、相互排他的様式で生じるため、一方の「ヒット」（例えば、ｐ１６）が、他方（例えば、Ｒｂ変異またはサイクリンＤ：ｃｄｋ過剰発現）を伴うことはない。しかしながら、現在の化学療法はほとんどが、Ｅ２Ｆの転写標的を阻害するが、正常な細胞に対しても毒性であり、破壊的な医原性合併症を有することの多い、増殖性の毒である。本明細書において開示されるように、代替的な治療的アプローチは、ｐ１６−サイクリンＤ：ｃｄｋ４−ＲＢ−Ｅ２Ｆ経路の脱制御を有するがん細胞病変部において選択的な溶解性複製を起こすウイルスを使用することである。

ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）：このアデノウイルスタンパク質は、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに二本鎖ＤＮＡに結合する。７２キロダルトンのタンパク質であるＤＢＰは、アデノウイルスＤＮＡの複製に必須である。

Ｅ１Ａ：アデノウイルス初期領域１Ａ（Ｅ１Ａ）遺伝子およびこの遺伝子から発現されるポリペプチドである。Ｅ１Ａタンパク質は、細胞を、細胞周期に入れることによって、ウイルスゲノム複製における役割を果たす。本明細書において使用されるとき、「Ｅ１Ａタンパク質」という用語は、Ｅ１Ａ遺伝子から発現されるタンパク質を指し、この用語には、あらゆるアデノウイルス血清型によって産生されるＥ１Ａタンパク質が含まれる。

Ｅ３−ＲＩＤα／ＲＩＤβおよびＥ３−１４．７ｋ：Ｅ３遺伝子によって産生される初期発現タンパク質である。Ｅ３−ＲＩＤα、Ｅ３−ＲＩＤβ、およびＥ３−１４．７ｋタンパク質は、受容体内部移行分解複合体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＲＩＤ）を成し、これが、核膜に局在化し、感染した細胞を宿主の抗ウイルス応答から保護するように、ＣＤ９５（ＦａｓＬ受容体）ならびにＴＮＦＲ１および２（ＴＮＦ／ＴＲＡＩＬ受容体）を含む様々な受容体のエンドサイトーシスおよび分解を引き起こす。Ｅ３−ＲＩＤα、Ｅ３−ＲＩＤβ、およびＥ３−１４．７ｋのコーディング配列は、この順序で、互いに隣接している。

Ｅ４ｏｒｆ１：Ｅ４遺伝子によって産生されるアデノウイルスタンパク質である。「Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質」という用語には、あらゆるアデノウイルス血清型に由来するＥ４遺伝子によって産生されるＥ４ｏｒｆ１タンパク質が含まれる。

Ｅ４ｏｒｆ６／７：アデノウイルスＥ４遺伝子によってコードされるタンパク質である。「Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質」という用語には、あらゆるアデノウイルス血清型に由来するＥ４遺伝子によって産生されるＥ４ｏｒｆ６／７タンパク質が含まれる。

蛍光タンパク質：特定の波長の光に曝露したときに、ある特定の波長の光を放出するタンパク質である。蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ１、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、ＴａｇＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、およびＺｓＧｒｅｅｎなど）、青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ａｚｕｒｉｔｅ、およびｍＴａｇＢＦＰなど）、シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ、ｍＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ−Ｉｓｈｉ Ｃｙａｎ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、およびｍＴＦＰ１など）、黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｔｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＴａｇＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、およびｍＢａｎａｎａ）、橙色蛍光タンパク質（Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、およびｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＲｕｂｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｄＫｅｉｍａ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｕｍ、ＡＱ１４３、ｔｄＴｏｍａｔｏ、およびＥ２−Ｃｒｉｍｓｏｎ）、橙色／赤色蛍光タンパク質（ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ−Ｔａｎｄｅｍ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔ１）、およびＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ）、ならびにこれらの修飾されたバージョンが挙げられるが、これらに限定されない。

融合タンパク質：少なくとも２つの異なる（異種）タンパク質またはペプチドに由来するアミノ酸配列を含有するタンパク質である。融合タンパク質は、例えば、２つの異なる（異種）タンパク質の少なくとも一部分をコードする核酸配列から操作された核酸配列の発現によって、生成することができる。融合タンパク質を作出するためには、核酸配列は、同じリーディングフレーム内になければならず、内部終止コドンを含有してはならない。融合タンパク質、特に、短い融合タンパク質は、化学的合成によって生成することもできる。

異種：異種タンパク質または異種ポリペプチドとは、異なる供給源または種に由来するタンパク質またはポリペプチドを指す。

ヘキソン：主要なアデノウイルスキャプシドタンパク質である。

単離された：「単離された」生物学的構成要素（核酸分子、タンパク質、ウイルス、または細胞など）は、その構成要素が天然に存在する、生物の細胞もしくは組織または生物自体における他の生物学的構成要素、例えば、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質、ならびに細胞から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製されたものが含まれる。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸分子およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子およびタンパク質を包含する。

修飾：核酸の配列またはタンパク質配列における変化である。例えば、アミノ酸配列の修飾には、例えば、置換、挿入、および欠失、またはそれらの組合せが含まれる。挿入には、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合、ならびに配列内への単一もしくは複数のアミノ酸残基の挿入が含まれる。欠失は、タンパク質配列からの、１つまたは複数のアミノ酸残基の除去によって特徴付けられる。本明細書における一部の実施形態では、修飾（置換、挿入、または欠失など）は、タンパク質の特定の活性の低減または強化など、機能の変化をもたらす。本明細書において使用されるとき、「Δ」または「デルタ」は、欠失を指す。置換修飾は、少なくとも１つの残基が、除去され、その場所に異なる残基が挿入されているものである。アミノ酸置換は、典型的に、単一の残基のものであるが、いくつかの異なる位置で同時に生じてもよい。置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組合せを、最終的な変異体の配列に到達するように組み合わせてもよい。これらの修飾は、タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの修飾によって調製することができ、それによって、この修飾をコードするＤＮＡが産生される。公知の配列を有するＤＮＡの所定の部位において、挿入、欠失、および置換の変異を行うための技法は、当該技術分野において周知である。「修飾された」タンパク質、核酸、またはウイルスは、上記に概説された１つまたは複数の修飾を有するものである。

新形成、悪性疾患、がん、および腫瘍：新生物は、過剰な細胞分裂の結果として生じる、組織または細胞の異常な増殖である。新生物性増殖により、腫瘍が産生され得る。個体における腫瘍の量は、「腫瘍量」であり、腫瘍の数、体積、または重量として測定することができる。転移しない腫瘍は、「良性」と称される。周囲の組織に侵入する、および／または転移し得る腫瘍は、「悪性」と称される。悪性腫瘍は、「がん」とも称される。

血液系がんは、血液または骨髄のがんである。血液系（または造血系）がんの例としては、白血病、例えば、急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、ならびに骨髄芽球性、前骨髄球性（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ）、骨髄単球性、単球性、および赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病など）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性および高悪性度形態）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞性白血病、ならびに脊髄形成異常が挙げられる。一部の事例では、リンパ腫は、固形腫瘍とみなされる。

固形腫瘍は、通常は嚢胞も液体区域も含有しない、異常な組織の塊である。固形腫瘍は、良性の場合も悪性の場合もある。異なる種類の固形腫瘍は、それらを形成する細胞の種類に応じて命名される（肉腫、癌腫、およびリンパ腫など）。肉腫および癌腫など、固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、および他の肉腫、滑膜性腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性疾患、膵臓がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭状癌、褐色細胞腫、脂腺癌、乳頭状癌、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染新形成、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、ウイルムス腫瘍、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、黒色腫、ならびにＣＮＳ腫瘍（膠腫など（脳幹膠腫および混合性膠腫など）、膠芽腫（多形性膠芽腫としても公知である）星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、神経鞘腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、および脳転移など）が挙げられる。

腫瘍溶解性ウイルス：増殖性障害の細胞、例えば、がん／腫瘍細胞を、選択的に殺滅させるウイルスである。がん細胞の殺滅は、任意の方法、例えば、生存細胞数を決定すること、またはがん細胞における細胞変性効果、アポトーシス、もしくはウイルスタンパク質の合成（例えば、複製に必要なウイルス遺伝子の代謝標識、イムノブロット、もしくはＲＴ−ＰＣＲによって）または腫瘍のサイズの低減を検出することによって、検出することができる。

作動可能に連結した：第１の核酸配列が、第２の核酸配列との機能的関係にある場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結している。例えば、プロモーターが、コーディング配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コーディング配列に作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結したＤＮＡ配列は、連続的であり、２つのタンパク質コーディング領域を接合する必要がある場合、同じリーディングフレーム内にある。

ポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質：モノマーがアミノ酸残基であり、それらが、アミド結合を通じて一緒に接合された、ポリマーである。アミノ酸が、アルファアミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体のいずれも使用することができる。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において互換可能に使用される。これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマー、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。「残基」または「アミノ酸残基」という用語には、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに組み込まれているアミノ酸への参照が含まれる。

ポリペプチドにおける保存的置換は、タンパク質配列における１つのアミノ酸残基を、類似の生物学的特質を有する異なるアミノ酸残基の代わりに使用することである。典型的に、保存的置換は、結果として得られるポリペプチドの活性にほとんど影響を及ぼさないかまたは全く影響を及ぼさない。例えば、１つまたは複数の保存的置換（例えば、１つを上回らない、２つを上回らない、３つを上回らない、４つを上回らない、または５つを上回らない置換）を含むタンパク質またはペプチドは、野生型のタンパク質またはペプチドの構造および機能を保持する。ポリペプチドは、例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲなどの標準的な手順を使用して、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することによって、１つまたは複数の保存的置換を含有するように産生させることができる。一実施例では、そのようなバリアントは、抗体の交差反応性または抗体が免疫応答を誘導する能力を試験することによって、容易に選択することができる。保存的置換の例を、以下に示す。

保存的置換は、一般に、（ａ）置換の区域における、例えば、シートコンフォメーションもしくはヘリックスコンフォメーションとしての、ポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さを維持する。

一般に、タンパク質特質に最も大きな変化をもたらすことが予測される置換は、非保存的なもの、例えば、（ａ）親水性残基、例えば、セリルもしくはスレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、もしくはアラニルを置換する（もしくはそれらによって置換される）変化、（ｂ）システインもしくはプロリンが、任意の他の残基を置換する（もしくはそれらによって置換される）変化、（ｃ）電気陽性の側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル、もしくはヒスタジルが、電気陰性の残基、例えば、グルタミルもしくはアスパルチルを置換する（もしくはそれらによって置換される）変化、または（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有さないもの、例えば、グリシンを置換する（もしくはそれらによって置換される）変化であろう。

プロモーター：核酸（例えば、遺伝子）の転写を導く／開始するＤＮＡの領域である。プロモーターは、転写の開始部位の近傍の必要な核酸配列を含む。典型的に、プロモーターは、転写する遺伝子の近傍に位置する。プロモーターはまた、任意選択で、転写開始部位から数千塩基対程度離れて位置し得る、遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含む。「構成的プロモーター」は、継続的に活性であり、外部シグナルまたは分子による制御に供されないプロモーターである。対照的に、「誘導的プロモーター」の活性は、外部シグナルまたは分子（例えば、転写因子またはテトラサイクリン）によって制御される。

タンパク質ＩＸ（ｐＩＸ）：ヘキソンタンパク質と会合するアデノウイルスキャプシドの主要ではない構成要素である。

精製された：「精製された」という用語は、絶対的な純度を必要とするものではなく、相対的な用語として意図される。したがって、例えば、精製されたペプチド、タンパク質、ウイルス、または他の活性化合物は、天然に会合するタンパク質および他の混入物質から、全体または部分的に単離されているものである。ある特定の実施形態では、「実質的に精製された」という用語は、細胞、細胞培養培地、または他の粗調製物から単離されており、初期調製物の様々な構成要素、例えば、タンパク質、細胞残屑、および他の構成要素を除去するために分画に供されている、ペプチド、タンパク質、ウイルス、または他の活性化合物を指す。

組換え：組換え核酸分子、タンパク質、またはウイルスは、天然に存在しない配列を有するもの、または他の点で別個である配列の２つのセグメントの人工的な組合せによって作製された配列を有するものである。この人工的な組合せは、化学的合成によって、または単離された核酸分子のセグメントの人工的な操作によって、例えば、遺伝子操作技法によって、達成することができる。「組換え」という用語には、天然の核酸分子、タンパク質、またはウイルスの一部分の付加、置換、または欠失のみによって変化されている、核酸、タンパク質、およびウイルスも含まれる。

複製欠損：（腫瘍細胞と比較して）非腫瘍細胞において「複製欠損」を呈するアデノウイルスは、正常細胞において、腫瘍細胞と比較して低減されたウイルス複製を呈するアデノウイルスを指す。複製欠損は、例えば、腫瘍細胞と比較して、正常細胞におけるウイルス後期タンパク質発現の欠如、ウイルスＤＮＡ合成の低減、Ｅ２Ｆ標的遺伝子（例えば、サイクリンＡおよびＢ）を誘導する能力の低減、Ｓ期進入を誘起する能力の低減、ならびに／または細胞殺滅を誘導する能力の低減によって、明らかである。

複製欠乏ウイルス：所与の表現型を有する所定の細胞集団（例えば、Ｅ２Ｆ経路の脱制御を有する腫瘍細胞）において、細胞増殖を優先的に阻害するか、細胞溶解を引き起こすか、またはアポトーシス（集合的に、殺滅とみなされる）を誘導する、ウイルスである。そのようなウイルスは、細胞増殖の低減もしくは阻害、細胞溶解の発生、アポトーシスの誘導、またはそれ以外では所定の細胞表現型を有さない細胞（正常な非腫瘍細胞など）における複製を行うことができないか、またはその能力が限定されている。

自己切断ペプチド：リボソームがＣ末端におけるペプチド結合の合成をスキップするように誘導し、そのペプチド配列と下流のポリペプチドとの分離をもたらす、ペプチドである。ウイルスによってコードされる２Ａペプチドは、自己切断ペプチドの一種である。ウイルスによってコードされる２Ａペプチドとしては、例えば、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ１）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、およびＴｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）に由来する２Ａペプチドが挙げられる。

配列同一性：２つもしくはそれよりも多い核酸配列間または２つもしくはそれよりも多いアミノ酸配列間における同一性または類似性は、配列間の同一性または類似性として表される。配列同一性は、同一性の割合として測定することができ、割合が高いほど、配列がより同一である。配列類似性は、類似性（保存的アミノ酸置換を考慮に入れる）の割合として測定することができ、割合が高いほど、配列がより類似している。核酸配列またはアミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準的な方法を使用してアラインメントした場合に、比較的高い程度の配列同一性／類似性を有する。この相同性は、オルソロガスなタンパク質またはｃＤＮＡが、より緊密に関連する種に由来する場合に（例えば、ヒト配列およびマウス配列）、関連性がより遠い種（例えば、ヒト配列およびＣ．Ｅｌｅｇａｎｓ配列）と比較して、より顕著である。

比較のための配列のアラインメント方法は、当該技術分野において周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、説明されている：ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．、２巻４８２頁、１９８１年；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４８巻、４４３頁、１９７０年；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５巻、２４４４頁、１９８８年；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ、７３巻、２３７〜４４頁、１９８８年；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ、５巻、１５１〜３頁、１９８９年；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６巻、１０８８１〜９０頁、１９８８年；Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｓ． ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、８巻、１５５〜６５頁、１９９２年；ならびにＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ．、２４巻、３０７〜３１頁、１９９４年。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５巻、４０３〜１０頁、１９９０年は、配列アラインメント方法および相同性の計算に関する詳細な考察を提示している。

ＮＣＢＩのＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５巻、４０３〜１０頁、１９９０年）が、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）およびインターネットを含む、複数の供給元から、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘと併せて使用するために、入手可能である。追加の情報は、ＮＣＢＩのウェブサイトにおいて見出すことができる。

血清型：特徴的な抗原セットによって区別される緊密に関連する微生物（ウイルスなど）の群である。

被験体：ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含むカテゴリーの、生きた多細胞脊椎動物の生物である。

合成：研究室において人工的な手段によって産生されたものであり、例えば、合成核酸またはタンパク質は、研究室において化学的に合成され得る。

Ｕエクソン（Ｕｅｘｏｎ）：ｌ鎖（左方向への転写）において初期Ｅ３領域とファイバー遺伝子との間に位置するオープンリーディングフレームである（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、８１巻（２３号）、１２９１８〜１２９２６頁）。

別途説明されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という用語は、文脈により別途明確に示されない限り、複数形の参照物を含む。「ＡまたはＢを含む」とは、Ａ、もしくはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドに関して与えられる、すべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子質量値は、およそのものであり、説明のために提供されることを、さらに理解されたい。本明細書において記載されるものに類似であるかまたはそれと同等である方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が、以下に記載されている。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾が生じた場合には、用語の説明を含め、本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。

ＩＩＩ．実施形態の概要
異種オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および自己切断ペプチドコーディング配列を含む、組換えアデノウイルスゲノムが、本明細書において開示される。組換えアデノウイルスゲノムおよび開示されるゲノムによって産生される組換えアデノウイルスは、例えば、ウイルス複製動態を測定するための高スループットアッセイにおいて使用することができる。

異種ＯＲＦおよび自己切断ペプチドコーディング配列を、いずれも内因性アデノウイルスＯＲＦと同じリーディングフレーム内に、それと作動可能に連結した状態で含む、組換えアデノウイルスゲノムが、本明細書において提供される。自己切断ペプチドコーディング配列は、異種ＯＲＦと内因性ＯＲＦとの間に位置する。一部の実施形態では、内因性ＯＲＦが、Ｅ１Ｂ−５５ｋであり、異種ＯＲＦが、Ｅ１Ｂ−５５ｋの３’にあるか、内因性ＯＲＦが、ＤＮＡポリメラーゼであり、異種ＯＲＦが、ＤＮＡポリメラーゼの５’にあるか、内因性ＯＲＦが、ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）であり、異種ＯＲＦが、ＤＢＰの３’にあるか、内因性ＯＲＦが、アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）であり、異種ＯＲＦが、ＡＤＰの５’にあるか、内因性ＯＲＦが、Ｅ３−１４．７ｋであり、異種ＯＲＦが、Ｅ３−１４．７ｋの３’にあるか、または内因性ＯＲＦが、Ｅ４−ＯＲＦ２であり、異種ＯＲＦが、Ｅ４−ＯＲＦ２の５’にある。

一部の実施形態では、自己切断ペプチドは、２Ａペプチドまたはそのバリアントである。一部の実施例では、２Ａペプチドは、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ１）２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチド、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）ペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）ペプチド、またはＴｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）２Ａ（Ｔ２Ａ）ペプチド、またはそれらのバリアントを含む。特定の実施例では、Ｐ２Ａペプチド配列は、配列番号１２または配列番号１６のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。一部の実施例では、２Ａペプチドバリアントは、Ｎ末端に追加のアミノ酸配列（ＧＳＧなど）を含む。

特定の実施例では、Ｆ２Ａペプチド配列は、配列番号１３または配列番号１７のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。特定の実施例では、Ｅ２Ａペプチド配列は、配列番号１４または配列番号１８のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。特定の実施例では、Ｔ２Ａペプチド配列は、配列番号１５または配列番号１９のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。特定の非限定的な実施例では、自己切断ペプチドは、配列番号１２〜１９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

一部の実施形態では、異種ＯＲＦは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、または青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）などであるがこれらに限定されない、蛍光タンパク質をコードする。例示的な蛍光タンパク質は、当該技術分野において公知であり、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：
ＢＦＰ−ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＴａｇＢＦＰ、
シアン蛍光タンパク質−ＥＣＦＰ、ｍＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ−Ｉｓｈｉ Ｃｙａｎ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴＦＰ１、
ＧＦＰ−ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ１、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、ＴａｇＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ、
ＹＦＰ−ＥＹＦＰ、Ｔｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＴａｇＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ｍＢａｎａｎａ、
橙色蛍光タンパク質−Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、
橙色または赤色蛍光タンパク質−ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ−Ｔａｎｄｅｍ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔ１）、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、および
ＲＦＰ−ｍＲｕｂｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｄＫｅｉｍａ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｕｍ、ＡＱ１４３、ｔｄＴｏｍａｔｏ、Ｅ２−Ｃｒｉｍｓｏｎ。

特定の非限定的な実施例では、ＹＦＰが、ＹＰｅｔであるか、またはＲＦＰが、ｍＣｈｅｒｒｙである。

一部の実施形態では、組換えアデノウイルスゲノムは、５’から３’の方向に、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ−Ｐ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ、ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ（ＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＢＰ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ、Ｅ３−１４．７ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−Ｅ４−ＯＲＦ２、またはｍＣｈｅｒｒｙ−Ｐ２Ａ−Ｅ４−ＯＲＦ２を含む。一部の実施例では、組換えアデノウイルスゲノムのヌクレオチド配列は、配列番号３〜７、９〜１１、２０、および２１のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。特定の非限定的な実施例では、組換えアデノウイルスゲノムのヌクレオチド配列は、配列番号３〜７、９〜１１、２０、および２１のうちのいずれか１つを含むか、またはそれからなる。

一部の実施形態では、アデノウイルスは、アデノウイルス５型（Ａｄ５）である。他の実施形態では、アデノウイルスは、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ９、Ａｄ１１、Ａｄ１２、またはＡｄ３４である。さらに他の実施形態では、アデノウイルスは、キメラアデノウイルス、例えば、Ａｄ５／Ａｄ９またはＡｄ５／Ａｄ３４キメラアデノウイルスであるが、これらに限定されない。

本明細書において開示される組換えアデノウイルスゲノムを含む、組換えアデノウイルスが、本明細書においてさらに提供される。

組換えアデノウイルス、例えば、本明細書において開示される組換えアデノウイルスの複製動態を測定するための方法もまた、提供される。一部の実施形態では、組換えアデノウイルスのゲノムは、蛍光タンパク質をコードする異種ＯＲＦおよび自己切断ペプチドコーディング配列を、いずれもＥ１Ｂ−５５ｋ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）、アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）、Ｅ３−１４．７ｋ、およびＥ４−ＯＲＦ２から選択される内因性アデノウイルスＯＲＦと同じリーディングフレーム内に、それらと作動可能に連結した状態で含む。自己切断ペプチドコーディング配列は、異種ＯＲＦと内因性アデノウイルスＯＲＦとの間に位置する。一部の実施形態では、本方法は、細胞に、組換えアデノウイルスのゲノムをトランスフェクトするか、または細胞に、組換えアデノウイルスの粒子を感染させることと、トランスフェクトした細胞または感染させた細胞を少なくとも２日間培養することと、培養期間の間、規則的な間隔で蛍光を測定することと、蛍光測定値から対数スロープを計算することとを含む。一部の実施例では、細胞は、マルチウェルプレートにおいて培養される。

一部の実施形態では、内因性ＯＲＦが、Ｅ１Ｂ−５５ｋであり、異種ＯＲＦが、Ｅ１Ｂ−５５ｋの３’にあるか、内因性ＯＲＦが、ＤＮＡポリメラーゼであり、異種ＯＲＦが、ＤＮＡポリメラーゼの５’にあるか、内因性ＯＲＦが、ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）であり、異種ＯＲＦが、ＤＢＰの３’にあるか、内因性ＯＲＦが、アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）であり、異種ＯＲＦが、ＡＤＰの５’にあるか、内因性ＯＲＦが、Ｅ３−１４．７ｋであり、異種ＯＲＦが、Ｅ３−１４．７ｋの３’にあるか、または内因性ＯＲＦが、Ｅ４−ＯＲＦ２であり、異種ＯＲＦが、Ｅ４−ＯＲＦ２の５’にある。一部の実施例では、組換えアデノウイルスは、第２の異種ＯＲＦをさらに含む。

一部の実施形態では、組換えアデノウイルスの複製動態は、第１の細胞型および第２の細胞型において測定される。一部の実施例では、第１の細胞型は、腫瘍細胞（上記に列挙された腫瘍型のうちのいずれかに由来するなど）であり、第２の細胞型は、非腫瘍細胞（正常な哺乳動物細胞など）である。

一部の実施形態では、トランスフェクトした細胞または感染させた細胞は、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、または少なくとも７日間、培養される。一部の実施例では、トランスフェクトした細胞または感染させた細胞は、約２日間〜約１４日間、例えば、約４日間〜約１２、または約６日間〜約１０日間、培養される。特定の非限定的な実施例では、トランスフェクトした細胞または感染させた細胞は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、または約１４日間、培養される。

一部の実施形態では、蛍光は、およそ２分ごと、４分ごと、６分ごと、８分ごと、１０分ごと、１５分ごと、２０分ごと、３０分ごと、４５分ごと、６０分ごと、９０分ごと、または１２０分ごとに測定される。一部の実施例では、蛍光は、ＴＥＣＡＮ（商標）蛍光プレートリーダーなどの蛍光プレートリーダーを使用して測定される。

ウイルス複製動態アッセイの一部の実施形態では、本方法は、細胞に、組換えアデノウイルスのゲノムをトランスフェクトすることを含む。一部の実施例では、トランスフェクションにより、細胞のうちのおよそ５〜１０％がトランスフェクトされる。

ウイルス複製動態アッセイの他の実施形態では、本方法は、細胞に、組換えアデノウイルスの粒子を感染させることを含む。一部の実施例では、細胞に、組換えアデノウイルス粒子の連続希釈物を感染させる。好適な数のウイルス希釈物が、当業者によって選択され得る。一部の実施例では、ウイルスの約４回〜約２４回希釈物、例えば、約４回〜約２０回、約６回〜約１６回、または約８回〜約１２回希釈物が、アッセイにおいて使用される。特定の実施例では、少なくとも４回、少なくとも５回、約６回、約７回、または少なくとも８回希釈物が、アッセイにおいて使用される。特定の非限定的な実施例では、希釈は、１：１００、１：３００、１：９００、１：２７００、１：８１００、１：２４，３００、１：７２，９００、および１：２１８，７００である。

一部の実施形態では、本方法は、患者から得られた腫瘍細胞において組換えアデノウイルスの複製動態を測定することによって、患者の腫瘍の処置に適切な治療用アデノウイルスを選択することを含み、ここで、組換えアデノウイルスは、治療用アデノウイルスの治療用ＯＲＦが蛍光タンパク質をコードするＯＲＦと置き換えられていることを除き、治療用アデノウイルスに相当する。一部の実施例では、治療用アデノウイルスは、腫瘍溶解性アデノウイルスである。一部の実施例では、腫瘍細胞は、生検によって得られる。

一部の実施形態では、本方法は、患者から得られた腫瘍細胞において組換えアデノウイルスの複製動態を測定することによって、治療用アデノウイルスでの処置に応答するであろうがん患者を選択することを含み、ここで、組換えアデノウイルスは、治療用アデノウイルスの治療用ＯＲＦが蛍光タンパク質をコードするＯＲＦと置き換えられていることを除き、治療用アデノウイルスに相当する。この方法は、例えば、がん患者を、特定の治療用アデノウイルスに対する予測レスポンダーおよび予測非レスポンダーに層別化するために使用することができる。一部の実施例では、治療用アデノウイルスは、腫瘍溶解性アデノウイルスである。一部の実施例では、腫瘍細胞は、生検によって得られる。

一部の実施形態では、本方法は、患者から得られた腫瘍細胞において組換えアデノウイルスのパネルの複製動態を測定することによって、患者の腫瘍にとって最も有効な治療用アデノウイルスを特定することを含み、ここで、組換えアデノウイルスは、治療用アデノウイルスの治療用ＯＲＦが蛍光タンパク質をコードするＯＲＦと置き換えられていることを除き、治療用アデノウイルス候補に相当する。一部の実施例では、治療用アデノウイルスは、腫瘍溶解性アデノウイルスである。一部の実施例では、腫瘍細胞は、生検によって得られる。

本明細書において開示される組換えアデノウイルスゲノムまたは組換えアデノウイルスと、細胞、細胞培養培地、および／またはマルチウェルプレートとを含む、キットが、本明細書においてさらに提供される。一部の実施形態では、細胞は、腫瘍細胞（本明細書において列挙される腫瘍型のうちのいずれかに由来する細胞など）である。一部の実施形態では、細胞は、非腫瘍細胞である。一部の実施形態では、細胞培養培地は、高いシグナル対バックグラウンド比をもたらすように選択される。一部の実施例では、細胞培養培地は、フェノールレッド不含である。一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、４８ウェル、９６ウェル、または３８４ウェルのプレートである。特定の実施例では、マルチウェルプレートは、ＴＥＣＡＮ（商標）蛍光プレートリーダーなどの蛍光プレートリーダーで読み取ることができる任意のプレートである。

ＩＶ．外因性ＯＲＦの最適な配置
３６ｋｂのアデノウイルスゲノムは、小型であり、様々な遺伝子のコーディングにトップストランド（ｔｏｐ ｓｔｒａｎｄ）とボトムストランド（ｂｏｔｔｏｍ ｓｔｒａｎｄ）の両方を使用する。アデノウイルスゲノム内の多数の位置において、トップストランドとボトムストランドとの両方が、別個の遺伝子のコーディングに同時に使用される。ゲノムのサイズは、そのキャプシドへの挿入に最適となるように進化してきた。結果として、外因性遺伝子の挿入は、キャプシドのサイズ容量によって制限されるが、これは、外因性核酸の過剰な追加により、キャプシドへのゲノムローディング（ｇｅｎｏｍｅ ｌｏａｄｉｎｇ）が不完全となり、ウイルス動態が低減されるためである。

アデノウイルスゲノムにおいて利用できる空間が制限されていることにより提示される課題の解決策は、外因性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、融合生成物として本来のアデノウイルスＯＲＦ内に位置づけることである。この戦略は、すでにゲノムにコードされているアデノウイルスプロモーター、５’ＵＴＲ、およびポリＡ尾部を利用する。しかしながら、本来のアデノウイルスタンパク質と外因性タンパク質との融合体の発現は、一方または両方のタンパク質機能に有害となり得、アデノウイルス複製動態の有意な減少をもたらし得る。

本開示は、本来のＯＲＦと外因性ＯＲＦとの間に配置される自己切断ペプチド配列を使用することによって、この問題に対する解決策を提供する。単一のｍＲＮＡ上の２つのＯＲＦの間に配置された場合、自己切断ペプチド配列の存在により、リボソームスキップが生じ、第１のタンパク質が第２のタンパク質とは別個に放出される。本明細書において開示される一部の実施形態では、自己切断ペプチドは、２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）である。

アデノウイルスゲノム内における外因性ＯＲＦの最適な配置部位の特定もまた、本明細書において開示される。自己切断ペプチド配列と、外因性ＯＲＦの良好な配置とを組み合わせることにより、高い発現がもたらされ、ウイルス動態に及ぼす影響が最小限となるか全くなくなる。ウイルス複製動態を測定するための高スループットアッセイにおける、外因性遺伝子を発現する組換えアデノウイルスの使用が、本明細書においてさらに開示される。

以下の実施例１に記載されるように、異種ＯＲＦを挿入したときにアデノウイルス複製動態が阻害されなかった、アデノウイルスゲノム内の複数の部位が、特定された。具体的には、異種ＯＲＦは、Ｅ１Ｂ−５５ｋ ＯＲＦのＣ末端側、ＤＮＡポリメラーゼＯＲＦのＮ末端側、ＤＢＰ ＯＲＦのＣ末端側、ＡＤＰ ＯＲＦのＮ末端側、Ｅ３−１４．７ｋ ＯＲＦのＣ末端側、またはＥ４−ＯＲＦ２のＮ末端側に挿入することができると決定された。それぞれの事例において、自己切断ペプチド配列（Ｐ２Ａ部位）を、アデノウイルスＯＲＦと異種ＯＲＦとの間に挿入した。したがって、本開示は、複製動態を測定するためのアッセイにおける、以下の組換えアデノウイルスの使用を企図する（「ＳＣ」は、Ｐ２Ａなど、自己切断ペプチドをコードする配列を指す）。
Ｅ１Ｂ−５５ｋ−ＳＣ−異種ＯＲＦ
異種ＯＲＦ−ＳＣ−（ＤＮＡポリメラーゼ）
ＤＢＰ−ＳＣ−異種ＯＲＦ
異種ＯＲＦ−ＳＣ−ＡＤＰ
Ｅ３−１４．７ｋ−ＳＣ−異種ＯＲＦ
異種ＯＲＦ−ＳＣ−Ｅ４−ＯＲＦ２

本明細書における一部の実施形態では、自己切断ペプチドは、ウイルスによってコードされる２Ａペプチド、または以下にさらに記載されるようなその修飾バージョンである。

Ｖ．自己切断ペプチド配列
自己切断ペプチドは、リボソームがＣ末端におけるペプチド結合の合成をスキップするように誘導し、そのペプチド配列と下流のポリペプチドとの分離をもたらす、ペプチドである。自己切断ペプチドの使用により、単一のＯＲＦから、自己切断ペプチドに隣接する複数のタンパク質の発現が可能となる。ウイルスによってコードされる２Ａペプチドは、自己切断ペプチドの一種である。

他の自己切断ペプチドと同様に、２Ａペプチドは、リボソームが２ＡエレメントのＣ末端におけるペプチド結合の合成をスキップするようにし、２Ａ配列の末端と下流のペプチドとの分離をもたらすことによって機能する（Ｋｉｍら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、６巻（４号）、ｅ１８５５６、２０１１年）。「切断」は、２ＡペプチドのＣ末端に見出されるグリシン残基とプロリン残基との間に生じる。例示的な２Ａペプチドとしては、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ１）、および口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）によってコードされる２Ａペプチド、またはそれらの修飾バージョンが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書における特定の実施例では、２Ａペプチドは、ＰＴＶ１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）、ＦＭＤＶ ２Ａ（Ｆ２Ａ）、ＥＲＡＶ ２Ａ（Ｅ２Ａ）、またはＴａＶ ２Ａ（Ｔ２Ａ）を含み、これらの配列は、配列番号１２〜１５として、以下に示され、本明細書に記載されている。
Ｐ２Ａ：ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１２）
Ｆ２Ａ：ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１３）
Ｅ２Ａ：ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１４）
Ｔ２Ａ：ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１５）

一部の実施例では、２Ａペプチドは、切断効率を改善するために、Ｎ末端に、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙを含むように修飾される。修飾されたＰ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ、およびＴ２Ａの配列は、配列番号１６〜１９として、以下に示され、本明細書に記載されている。
修飾されたＰ２Ａ：ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１６）
修飾されたＦ２Ａ：ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１７）
修飾されたＥ２Ａ：ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１８）
修飾されたＴ２Ａ：ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１９）

一部の実施形態では、２Ａポリペプチドは、本明細書において開示される２Ａポリペプチドのバリアントである。バリアントは、野生型または本明細書において開示される修飾された２Ａポリペプチドに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。バリアントは、例えば、配列番号１２〜１９のうちのいずれか１つの２Ａポリペプチドから、少なくとも１つのＮ末端アミノ酸が欠失しているもの、例えば、１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸（列挙された値のうちのいずれか２つの間の範囲を含む）が欠失しているものを含み得る。バリアントは、配列番号１２〜１９のうちのいずれか１つの２Ａポリペプチドから、少なくとも１つのＣ末端アミノ酸が欠失しているもの、例えば、１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸（列挙された値のうちのいずれか２つの間の範囲を含む）が欠失しているものを含み得る。バリアントは、少なくとも１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換も含み得る。

ＶＩ．組織培養物においてウイルス動態をモニタリングするための方法
選択的に複製するウイルスの評価のための重要な基準は、複数回の複製にわたり、がん細胞と正常細胞との間で、ウイルス増殖動態を比較することである。ウイルス複製におけるわずかな差は、高いＭＯＩではマスクされ得る。複数回のウイルス複製を測定することにより、この問題を克服することができる。

高速なウイルス動態アッセイの必要性に対処するためには、ウイルス複製動態の体系的高スループットスクリーニングが必要である。ウイルス複製を評価する現在の方法は、ルシフェラーゼまたはレポーターが組み込まれた特定の細胞株に頼ることが多い。しかしながら、コードされたレポーターによって付与される導入遺伝子発現の活性およびレベルは、ウイルス複製自体ではなく、細胞生存度を測定するものである。さらに、アデノウイルスタンパク質は、全体的な遺伝子発現（ｐ３００、Ｅ２Ｆ、ＣＢＰ、媒介因子、スプライシングなど）を破壊する。

アデノウイルス複製を評価する現在の方法は、ある特定の細胞型においてのみ使用することができ、Ａｄ５特異的抗体に依存し、全ウイルスライフサイクルを複数回にわたって測定するものではなく、ウイルス力価の把握を必要とし、ウイルスプラスミドのトランスフェクションを使用することができず、ウイルス複製を定量化するものではなく、細胞殺滅を予測するものではなく、異なるサブグループ間での比較が可能ではない、間接的で感度の低いエンドポイントアッセイである。

現在使用されているアッセイとしては、（１）ウエスタンブロットによるＡｄ５後期ウイルスタンパク質の測定、（２）ｑ−ＰＣＲによるアデノウイルスゲノムの測定、（３）特殊かつ限定された細胞型におけるプラークアッセイ、（４）細胞生存度アッセイを使用したウイルス複製の間接的な測定（ｗｓｔ−１／ｍｔｔなど）、ならびに（５）アデノウイルス特異的抗体を使用したＥＬＩＳＡおよび／またはＦＡＣＳが挙げられる。

これらのアッセイのそれぞれは、著しい欠点を有する。最初の２つの方法は、ウイルス取込み、遺伝子発現、ウイルス遺伝子複製、キャプシドアセンブリ、キャプシドへのゲノムローディング、溶解、拡散、および生産的二次感染などのステップを含む、全ウイルスライフサイクルを測定するものではなく、したがって、これらの方法の有用性は著しく制限される。

プラークアッセイは、特殊な細胞株ならびに効率的なウイルス感染および相補性が必要なため、６８種類ある異なるＡｄ血清型の複製を比較することが困難となっている。加えて、プラークアッセイは、細胞が、寒天のオーバーレイに耐える必要があるが、これは、限られた細胞型でしか可能ではない。さらに、プラークアッセイは、本質的に、主観的であり、手がかかり、ウイルス複製が選択的に減損されているかまたは強化されている場合（例えば、初回感染、遺伝子発現、複製、溶解など）に関する見識は提供しない。さらに、プラークアッセイまたはＥＬＩＳＡなどの方法によるキャプシド交換型ウイルスの適正な力価の決定は、細胞型の選択が、ウイルス進入に影響を及ぼし得るため、可能ではない。また、Ａｄ５抗体は、ウイルス親和性を変化させるために用いられたファイバー交換を認識しない。

ＥＬＩＳＡアッセイおよびＦＡＣＳアッセイに関して、これらの方法は、アデノウイルスタンパク質に特異的な抗体を使用し、ＦＡＣＳまたはＥＬＩＳＡにより抗体の結合を検出することによって力価を定量化することに依存する。しかしながら、従来のアッセイにおいて使用される抗体は、特定の血清型しか認識せず、ウイルスの動態または異なるアデノウイルスを比較するためには使用することができない。なぜなら、それらが、利用可能な抗体によって認識されないためである。

本明細書において開示されるように、１つまたは複数のウイルスタンパク質と同時に発現される蛍光レポーターを組み込むことにより、細菌または酵母の増殖を測定するために使用されるものと類似の方法を使用して、ウイルス動態を測定することが可能となる。本明細書において開示される方法では、細菌または酵母培養物の光学密度（ＯＤ）を測定して対数スロープ増殖速度を決定するのと同様に、蛍光発現レベルを経時的にモニタリングし、対数増殖曲線に当てはめる。対数スロープが、唯一の関連パラメーターであるため、この方法は、初期感染力価における変動または誤差に対してロバストであり、精製されたビリオンによる感染ではなく、全ゲノムプラスミドのトランスフェクションを用いることすら可能である。

組織培養物において経時的にフルオロフォアの発現をモニタリングすることにより、非侵襲的な複数時点でのウイルス進行に関する尺度が得られる。これらの測定値は、複数回の複製にわたるウイルス動態に関する詳細な情報を提供し、したがって、ウイルスのライフサイクルのすべての態様を含む。

本明細書において開示される蛍光に基づくアッセイは、高スループットであり、初期ウイルス力価およびウイルス進入の変動に寛容である。このアッセイは、初期条件に対する寛容性が非常に高いため、ビリオン産生および精製をスキップし、単純に、これまでに説明されているＡｄｓｅｍｂｌｙおよびＡｄＳＬＩＣプロトコールによって産生した全ゲノムプラスミドの直接的なトランスフェクションを使用することが可能である（国際公開第２０１２／０２４３５１号を参照されたく、これは、参照により本明細書に組み込まれる）。数週間の時間、多量の試薬、培地、および組織培養の供給物質が、このプロセスでは省かれる。本明細書において開示されるアッセイは、高速かつ正確なウイルス構築物の評価になくてはならないツールである。

加えて、ウイルス動態を評価する方法は、あらゆるアデノウイルス血清型、ならびにあらゆる細胞型に適用することができ、開始ウイルス力価、選択されたフルオロフォアの種類、およびウイルスタンパク質の半減期に依存することがない。

ウイルス動態は、一部の事例では、最大約１０日間にわたる、複数の時点にわたって測定された蛍光の対数スロープから決定される。それぞれがおよそ４８時間続く複数のウイルスライフサイクルを捕捉するためには、この時間の長さが、最適であることが多い。一部の実施形態では、蛍光は、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、または少なくとも７日間、測定される。一部の実施例では、蛍光は、約２日間〜約１４日間、例えば、約４日間〜約１２、または約６日間〜約１０日間、測定される。特定の非限定的な実施例では、蛍光は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、または約１４日間、測定される。

それぞれが潜在的に異なるフルオロフォアおよびシグナルレベルを有する異なるウイルス構築物間での動態の比較は、対数スロープの使用によって対処することができる。時間に対する蛍光シグナルの指数関数的増殖の対数のスロープを取得することにより、それぞれのウイルス構築物に対して単一の値を得、この値を、シグナルの規模または指数関数的増殖が開始する前に生じる可能性のある任意の初期時間遅延に関係なく、交差比較することができる。データ解釈のこの特性により、このアッセイは、初期開始点に感受性とはならない。調節不良または初期ウイルス力価の把握ですら、指数関数的増殖中の対数スロープには影響を及ぼさない。組織培養皿におけるわずかな割合の細胞の形質導入をもたらす初期感染（またはトランスフェクション）のみが、必要である。残りの感染しなかった細胞は、二次感染および三次感染に利用可能である。

このアッセイは、数日間の期間にわたって複数の時点で蛍光測定を行うことを要するため、データ点にわたり正規化が可能な参照標準物を見出さなければならない。この参照標準物は、蛍光測定に使用される時間、温度、湿度、および励起放射に対する曝露に対して安定でなければならない。一部の実施形態では、参照標準物は、空のウェルのポリスチレンからのバックグラウンド蛍光である。他の実施形態では、フルオロフォアが包埋された市販入手可能なラテックスビーズが、参照標準物である。

本明細書において開示されるアッセイに使用される細胞培養培地は、高いシグナル対バックグラウンド比をもたらすことが理想的である。高いバックグラウンドをもたらす因子としては、培地中のフェノールレッドまたはＦＢＳが挙げられる。したがって、一部の実施形態では、ウイルス動態アッセイにおいて使用される培養培地は、フェノールレッド不含の培地である。フルオロフォアの選択もまた、培地からのバックグラウンド蛍光を克服するように選択され得る。例えば、ＹＰｅｔは、強化ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）よりも２倍明るい。したがって、一部の実施形態では、蛍光タンパク質は、ＹＰｅｔである。他の実施形態では、蛍光タンパク質は、ｍＣｈｅｒｒｙである。

ＶＩ．ＡｄｓｅｍｂｌｙおよびＡｄＳＬＩＣ
アデノウイルスゲノムは、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、およびＬ１−５とラベル付けされた複数の機能的な群に組織化される。Ｅ１領域は、すべての他のウイルス遺伝子の転写を調節するタンパク質をコードし、宿主細胞にＳ期を誘導する。Ｅ２領域は、ウイルスＤＮＡ複製を駆動させるタンパク質をコードする。Ｅ３領域のタンパク質は、宿主細胞の免疫応答をモジュレートし、細胞培養においては必須ではない。Ｅ４領域は、異なる機能セットの遺伝子を含有する。そしてＬ１−５領域は、ウイルス粒子の構造タンパク質をコードする。

機能性のこの天然の隔離を利用し、本発明者らは、これまでに、図６Ａに示されるように、Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４、およびコアの４つのプラスミドに分離することによって、３６ｋｂのＡｄゲノムの迅速かつ容易な操作を可能にする、組換えアデノウイルスアセンブリの方法を開発した（ＡｄｓｅｍｂｌｙおよびＡｄＳＬＩＣ、国際公開第２０１２／０２４３５１号を参照されたく、これは、参照により本明細書に組み込まれる）。それらのより合理的なサイズのため、これらのより小さなプラスミドは、標準的な技法を使用して操作することが容易である。

ＡｄｓｅｍｂｌｙおよびＡｄＳＬＩＣにより、適合性のあるゲノムライブラリーの部分から、４時間以内に、新規な特質を有するアデノウイルスのｉｎ ｖｉｔｒｏでのコンビナトリアルアセンブリを可能とする。ＡｄｓｅｍｂｌｙおよびＡｄＳＬＩＣは、新規な特質を有する合成ウイルスを、４つの機能的部分のライブラリーを使用してアセンブリすることを可能にする、一般的なゲノム設計プラットフォームを提供する（図６Ａ）。これらの部分のライブラリーは、複数部位特異的組換え部位（Ａｄｓｅｍｂｌｙ、図６Ｂ）または配列非依存性シームレスクローニング（ＡｄＳＬＩＣ、図６Ｃ）のいずれかを使用して、あらゆる可能な組合せで再アセンブリすることができる。

ＡｄｓｅｍｂｌｙおよびＡｄＳＬＩＣの技術は、固有の能力を有するアデノウイルスのモジュール設計および産生を可能にする。自動化された高スループットの様式でウイルスを設計、製造、および試験する能力を開発することにより、治療研究、診断研究、および調査研究のための新しいウイルスの開発が、加速し、拡大されるであろう。

クローニングステップは、かつては、新しいウイルス構築物の産生の障害であったが、ＡｄｓｅｍｂｌｙおよびＡｄＳＬＩＣの出現により、ウイルスゲノムを構築する能力は、それらを試験する能力を凌ぐようになった。同等に高スループットの動態アッセイは、ＡｄｓｅｍｂｌｙおよびＡｄＳＬＩＣの方法を使用して、合成の個別化されたウイルス治療および診断の最大限の可能性および高コンテンツなアセンブリを引き出すために、極めて重要である。

以下の実施例は、ある特定の具体的な特性および／または実施形態を例示するために提供される。これらの実施例は、本開示を、記載される特定の特性または実施形態に限定するとみなされるものではない。

（実施例１：アデノウイルスゲノムにおける外因性ＯＲＦの最適な位置の特定）
この実施例では、ウイルス動態を破壊することなく、自己切断ペプチド配列とともに、外因性ＯＲＦを挿入することができる、アデノウイルスゲノム内での特異的な位置の特定について記載する。

アデノウイルスベクターへの外因性遺伝子の挿入は、アデノウイルスキャプシドのサイズ容量によって制限される。外因性核酸の過剰な追加により、キャプシドへのゲノムローディングが不完全となり、ウイルス動態が低減される。アデノウイルスゲノムにおいて利用できる空間が制限されていることにより提示される課題の解決策は、外因性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、融合生成物として本来のアデノウイルスＯＲＦ内に位置づけることである。この戦略は、すでにゲノムにコードされているアデノウイルスプロモーター、５’ＵＴＲ、およびポリＡ尾部を利用する。しかしながら、本来のアデノウイルスタンパク質と外因性タンパク質との融合体の発現は、一方または両方のタンパク質機能に有害となり得、アデノウイルス複製動態の有意な減少をもたらし得る。実際に、本明細書において開示される研究は、外因性ＯＲＦのアデノウイルスＥ１Ａ、ＤＮＡポリメラーゼ、またはＡＤＰのＯＲＦへの直接的な融合が、アデノウイルス複製動態を有意に阻害することを実証している。加えて、本発明者らは、これまでに、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用して外因性ＯＲＦを挿入することを試みたが、これも、野生型動態を有する組換えウイルスの産生に失敗している。

この実施例では、本来のアデノウイルスＯＲＦと外因性ＯＲＦとの間に配置される自己切断ペプチド配列を使用することによる、この問題に対する解決策について記載する。単一のｍＲＮＡ上の２つのＯＲＦの間に配置された場合、自己切断ペプチド配列の存在により、リボソームスキップが生じ、第１のタンパク質が第２のタンパク質とは別個に放出される。この実施例において生成されるアデノウイルス構築物では、自己切断ペプチドＰ２Ａおよび外因性ＯＲＦとして蛍光タンパク質（例えば、ＹＰｅｔ、ｍＣｈｅｒｒｙ）を使用する。

以下の表は、生成した構築物の一覧を提供し、２９３−Ｅ４細胞およびＡ５４９細胞という２つの異なる細胞株における外因性ＯＲＦの発現レベル（低い、中等度、または高い）およびウイルス複製動態のレベル（低い、中等度、または高い）を示す。

両方の細胞型において「高い」複製動態（すなわち、野生型アデノウイルスに匹敵する複製動態）を呈する構築物を、実施例２に記載されるウイルス複製動態アッセイにおいて使用するための候補と考えた（候補構築物は、太字で示す）。

直接的な融合とＰ２Ａ部位の挿入との比較
蛍光タンパク質をアデノウイルスＯＲＦに直接的に融合したいくつかの構築物を、生成した。具体的には、以下の直接的融合体を、生成した：ＹＰｅｔ−Ｅ１Ａ、ＹＰｅｔ（ＤＮＡポリメラーゼ）、およびｍＣｈｅｒｒｙ−ＡＤＰ。

ＹＰｅｔ−Ｅ１Ａアデノウイルスは、ウイルス動態における有意な減損を呈した。Ｐ２Ａ部位をＹＰｅｔとＥ１Ａとの間に挿入すること（ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−Ｅ１Ａ）により、ウイルス動態は改善されたが、ウイルス動態が野生型レベルまで回復することはなかった。次いで、Ｅ１ＡのＣ末端へのＰ２ＡおよびＹＰｅｔの融合を試験するために、別の構築物を生成した（Ｅ１Ａ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）。この構築物は、ウイルス動態がさらに改善されたが、ここでも、動態が野生型アデノウイルスのレベルまで回復することはなかった。

ＹＰｅｔ−（ＤＮＡ−ポリ）ゲノムプラスミドをトランスフェクトする試みを数回行ったが、生存能力のあるウイルスの産生は失敗した（プラークが全く形成されなかった）。しかしながら、ＹＰｅｔ−Ｐ２ＡをＤＮＡポリメラーゼのＮ末端に融合させると（ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−（ＤＮＡポリ））、上記の表に示されるように、野生型動態を有するウイルスが産生された。

最後に、ｍＣｈｅｒｒｙのＡＤＰへの直接的な融合（ｍＣｈｅｒｒｙ−ＡＤＰ）により、有意に減損された動態を有するウイルスが産生された。しかしながら、Ｐ２Ａ部位をｍＣｈｅｒｒｙ ＯＲＦとＡＤＰ ＯＲＦとの間に挿入すると、野生型動態を有するウイルスが得られた（ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ）。異なる蛍光タンパク質を使用しても、同じ結果が得られ、ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ構築物は、野生型ウイルス動態を呈した。しかしながら、ＡＤＰのＣ末端側にＰ２Ａおよび異種ＯＲＦを配置すると、複製しないウイルスが産生された。したがって、ＡＤＰについては、異種ＯＲＦは、Ｎ末端に配置しなければならない。

野生型ウイルス動態を有する追加の構築物
図７は、５種類の異なる構築物の自然対数スロープの比較を示す：ＹＰｅｔ−Ｅ１Ａ、ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−Ｅ１Ａ、Ｅ１Ａ−Ｐ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｅ１Ｂ−５５ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、およびＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ。上述のように、ＹＰｅｔのＥ１Ａへの直接的な融合により、有意に減損された動態を有するウイルスが産生され、Ｐ２Ａ部位をＮ末端（ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−Ｅ１Ａ）またはＣ末端（Ｅ１Ａ−Ｐ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ）のいずれかに付加することにより、ウイルス動態は改善されたが、野生型レベルには至らなかった。しかしながら、Ｐ２Ａ部位および異種ＯＲＦを、Ｅ１Ｂ−５５ｋのＣ末端（Ｅ１Ｂ−５５ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）またはＡＤＰのＮ末端（ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ）に挿入することにより、野生型ウイルス動態を有する組換えウイルスが生成された。

Ｐ２Ａ部位および異種ＯＲＦをＤＢＰのＣ末端（ＤＢＰ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）もしくはＥ３−１４．７ｋのＣ末端（Ｅ３−１４．７ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）に有する構築物、またはＰ２Ａ部位および異種ＯＲＦをＥ４−ＯＲＦ２のＮ末端（ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−Ｅ４−ＯＲＦ２およびｍＣｈｅｒｒｙ−Ｐ２Ａ−Ｅ４−ＯＲＦ２）に有する構築物のウイルス動態の評価により、野生型複製動態を有するウイルスが得られた。

これらのデータの結果は、少なくとも以下のアデノウイルスゲノム構築物を、実施例２に記載されるウイルス複製アッセイに使用することができることを実証する。
Ｅ１Ｂ−５５ｋ−ＳＣ−異種ＯＲＦ
異種ＯＲＦ−ＳＣ−（ＤＮＡポリメラーゼ）
ＤＢＰ−ＳＣ−異種ＯＲＦ
異種ＯＲＦ−ＳＣ−ＡＤＰ
Ｅ３−１４．７ｋ−ＳＣ−異種ＯＲＦ
異種ＯＲＦ−ＳＣ−Ｅ４−ＯＲＦ２

本明細書において開示されるウイルス複製アッセイにおける使用に関して、異種ＯＲＦは、蛍光タンパク質、例えば、（限定されないが）ＹＰｅｔまたはｍＣｈｅｒｒｙをコードする。

他のアデノウイルス血清型
これまでに説明されているウイルス動態を測定する方法は、すべて、細胞型特異的アッセイに高度に依存し、したがって、それぞれのアデノウイルス血清型の多様な親和性に起因して、血清型特異的である。本明細書において開示されるアデノウイルス動態アッセイは、いずれか１つの細胞型に依存するものではなく、そのため、Ａｄ５以外の血清型に拡張することが可能である。すべてのアデノウイルス血清型は、Ａｄ５ Ｅ３−１４．７ｋと同等のＯＲＦを含有する。したがって、Ａｄ９（Ｅ３−１５ｋを含有する）およびＡｄ３４（Ｅ３−１４．８ｋを含有する）を使用して、Ａｄ５ Ｅ３−１４．７ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ（ＰＣＭＮ−８８７、配列番号９）と同等のウイルスを生成した：ＰＣＭＮ−８８８（Ａｄ９ Ｅ３−１５ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、配列番号２０）およびＰＣＭＮ−８８９（Ａｄ３４ Ｅ３−１４．８ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、配列番号２１）。Ａｄ５コア、ならびにＡｄ９またはＡｄ３４のいずれかに由来するファイバーシャフトおよびノブを含有するキメラウイルスもまた、生成した。次いで、４つの組換えウイルスを、２９３細胞（図９Ａ）、Ａ５４９細胞（図９Ｂ）、およびＵ２ＯＳ細胞（図９Ｃ）を使用して、ＦＢＶＫアッセイにおいて試験した。４つすべての組換えウイルスは、高いレベルのＹＰｅｔ発現を呈し、外因性ＯＲＦの挿入によって生じるウイルス動態への影響は最小限であった。

（実施例２：アデノウイルスの複製動態を評価するための方法）
組換えアデノウイルスをアセンブリするためのＡｄｓｅｍｂｌｙ方法およびＡｄＳＬＩＣ方法は、短時間で、多数の組換えウイルスゲノムおよびウイルスを生成するための手段を提供する。しかしながら、臨床上および治療上の使用のために設計された組換えアデノウイルスの複製動態を評価する高速かつ高スループットな方法に対する必要性が存在する。この実施例では、組換えアデノウイルスのウイルス複製動態を試験するために使用することができる、蛍光に基づくウイルス動態アッセイについて説明する（図３）。このアッセイは、組換えアデノウイルスゲノムプラスミドまたは組換えアデノウイルス粒子のいずれかを出発材料として用いて、行うことができる。

組換えアデノウイルスゲノムを用いて開始する場合、アッセイには、細胞にアデノウイルスゲノムプラスミド（実施例１において上述のものなど）をトランスフェクトし、フルオロフォアの発現を経時的にモニタリングすることが含まれる（図４Ａ〜４Ｂ）。トランスフェクション条件は、細胞のうちの約５〜１０％が、初回にトランスフェクトされるように、選択する。初回にトランスフェクトされなかった細胞は、初回のトランスフェクションによって産生されたウイルス粒子による二次感染に利用可能である。対数スロープを、二次感染、三次感染、および四次感染（など）に基づく動態の尺度として使用するため、初回にトランスフェクトされた細胞の割合を把握する必要はない。図４Ａおよび４Ｂは、組換えアデノウイルスゲノムプラスミドを用いて開始する例示的なウイルスに基づく動態アッセイを示す。この実施例では、４８ウェルプレートを使用しており、これにより、１４種類の異なるウイルス構築物を（３連で）同時に試験することが可能となる。４８ウェルプレートの上半分（図４Ａ）には、６種類の異なるウイルス、３つの模擬感染ウェル、およびツール感度変動を補償するＦＬＵＯＲＥＳＢＲＩＴＥ（商標）ビーズを有する３つの「ブランク」ウェルが含まれる。４８ウェルプレートの下半分（図４Ｂ）には、８種類の異なるウイルス構築物の３連のウェルが含まれる。細胞をトランスフェクトしたら、プレートを、継続的な蛍光モニタリングのために、ＴＥＣＡＮ（商標）プレートリーダーに設置する。収集したデータを使用して、各構築物の自然対数スロープを計算する（図８）。

このアッセイは、細胞に組換えウイルス粒子を感染させることによって行うこともできる。このバージョンのアッセイでは、細胞に、組換えウイルス粒子を感染させ、フルオロフォア発現を、経時的にモニタリングする（図５）。ゲノムプラスミドバージョンのアッセイと同様に、開始時のウイルスストックの正確な力価を把握する必要はない。典型的には、図５に示されるように、希釈系列、例えば、１：１００から１：２１８，７００の範囲の希釈系列を、初回感染に使用する。１：１００の希釈物では、一般に、すべての細胞の感染がもたらされ、一方で、１：２１８，７００の希釈物では、一般に、非常に少ない細胞の初回感染がもたらされる。この実施例では、９６ウェルプレートを使用しており、１１種類の異なるウイルス構築物を、８つの異なる希釈物（１：１００、１：３００、１：９００、１：２７００、１：８１００、１：２４，３００、１：７２，９００、および１：２１８，７００）で同時に試験する。プレートには、模擬感染細胞の４つのウェルおよびＦＬＵＯＲＥＳＢＲＩＴＥ（商標）ビーズの４つのウェルも含まれる。細胞を感染させたら、プレートを、継続的な蛍光モニタリングのために、ＴＥＣＡＮ（商標）プレートリーダーに設置する。収集したデータを使用して、各構築物の自然対数スロープを計算する（図８）。

ＴＥＣＡＮ（商標）プレートリーダーは、インキュベーション機能も提供する（適切な温度、ならびにＣＯ_２レベルおよびＯ_２レベルを維持する）。データ点を、１５分ごとに取得して、自然対数スロープを計算する。これらの方法を使用することで、多数の異なるウイルス間および異なる細胞型間で、動態を高速かつ効率的に比較することが可能である。例えば、特定の組換えアデノウイルスが、腫瘍溶解性ウイルスとして治療的に使用することができるかどうかを評価するためには、このアッセイを用いて、腫瘍細胞において高い複製動態を呈するが、非腫瘍細胞においては緩徐なウイルス動態を呈するウイルスを見出すことができる。さらに、組換えウイルスのウイルス動態は、このアッセイにおいて目的の腫瘍細胞型に感染またはトランスフェクトを行うことによって、評価することができる。

対数スロープの計算
対数スロープを測定するために、時間に対する蛍光強度の線形プロットを、それぞれの時点で測定した蛍光強度の自然対数を取得することによって、片対数プロットに変換する。蛍光強度は、ウイルス複製時には指数関数的増殖を呈するため、この変換は、時間に対する自然対数（蛍光強度）をプロットすると直線となる。次いで、この直線を、標準的な最小二乗法を使用して当てはめる。この当てはめにより産生された結果として得られるスロープは、時間に対する蛍光の自然対数スロープであり、したがって、時間に対するウイルス増殖の自然対数スロープである。式を、以下に示す。
式中、ＦＩは、測定された蛍光強度であり、ｔは時間であり、Ｆ_０は、時間＝ｔ_０における初期蛍光強度であり、αは自然対数スロープである。
両側の自然対数を取得すると：
右手側は、αの自然対数スロープを有する線形方程式となる。

本開示の原理を適用することができる多数の可能性のある実施形態を考慮して、例示された実施形態が、本開示の例にすぎず、本開示の範囲を限定するものとして捉えられるものではないことを認識されたい。むしろ、本開示の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定められる。したがって、本発明者らはこれらの特許請求の範囲の範囲および趣旨の範囲内のものすべてに関して権利を主張する。

Claims (24)

1. 異種オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および自己切断ペプチドコーディング配列を、いずれも内因性アデノウイルスＯＲＦと同じリーディングフレーム内に、それと作動可能に連結した状態で含む、組換えアデノウイルスゲノムであって、前記自己切断ペプチドコーディング配列が、前記異種ＯＲＦと前記内因性ＯＲＦとの間に位置し、かつ
   前記内因性ＯＲＦが、Ｅ１Ｂ−５５ｋであり、前記異種ＯＲＦが、Ｅ１Ｂ−５５ｋの３’にあるか、
   前記内因性ＯＲＦが、ＤＮＡポリメラーゼであり、前記異種ＯＲＦが、ＤＮＡポリメラーゼの５’にあるか、
   前記内因性ＯＲＦが、ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）であり、前記異種ＯＲＦが、ＤＢＰの３’にあるか、
   前記内因性ＯＲＦが、アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）であり、前記異種ＯＲＦが、ＡＤＰの５’にあるか、
   前記内因性ＯＲＦが、Ｅ３−１４．７ｋであり、前記異種ＯＲＦが、Ｅ３−１４．７ｋの３’にあるか、または
   前記内因性ＯＲＦが、Ｅ４−ＯＲＦ２であり、前記異種ＯＲＦが、Ｅ４−ＯＲＦ２の５’にある、組換えアデノウイルスゲノム。
2. 前記自己切断ペプチドが、２Ａペプチドまたはそのバリアントである、請求項１に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
3. 前記２Ａペプチドが、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ１）２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチド、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）ペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）ペプチド、またはＴｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）２Ａ（Ｔ２Ａ）ペプチド、またはそれらのバリアントを含む、請求項２に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
4. 前記自己切断ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１２〜１９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である、請求項３に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
5. 前記自己切断ペプチドが、配列番号１２〜１９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
6. 前記異種ＯＲＦが、蛍光タンパク質をコードする、請求項１から５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
7. 前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、または青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）である、請求項６に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
8. 前記ＹＦＰが、ＹＰｅｔであるか、または前記ＲＦＰが、ｍＣｈｅｒｒｙである、請求項７に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
9. ５’から３’の方向に、
   Ｅ１Ｂ−５５Ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、
   Ｅ１Ｂ−５５Ｋ−Ｐ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ、
   ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−（ＤＮＡポリメラーゼ）、
   ＤＢＰ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、
   ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ、
   Ｅ３−１４．７ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、
   ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−Ｅ４−ＯＲＦ２、または
   ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｐ２Ａ−Ｅ４−ＯＲＦ２を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
10. 配列番号３〜７、９〜１１、２０、および２１のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
11. 請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノムを含む、組換えアデノウイルス。
12. 請求項１に記載の組換えアデノウイルスゲノムを含む組換えアデノウイルスの複製動態を測定するための方法であって、前記異種ＯＲＦが、蛍光タンパク質をコードし、前記方法は、以下：
    （ｉ）細胞に、前記組換えアデノウイルスのゲノムをトランスフェクトするか、または細胞に、前記組換えアデノウイルスの粒子を感染させるステップと、
    （ｉｉ）トランスフェクトした前記細胞または感染させた前記細胞を、少なくとも２日間培養するステップと、
    （ｉｉｉ）前記培養期間の間、規則的な間隔で、蛍光を測定するステップと、
    （ｉｖ）前記蛍光測定値から対数スロープを計算し、それによって、前記組換えアデノウイルスの複製動態を測定するステップとを含む、方法。
13. 前記組換えアデノウイルスが、第２の異種ＯＲＦをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
14. 前記細胞が、マルチウェルプレートにおいて培養される、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
15. 前記組換えアデノウイルスの複製動態が、第１の細胞型および第２の細胞型において測定される、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記第１の細胞型が、腫瘍細胞であり、前記第２の細胞型が、非腫瘍細胞である、請求項１６に記載の方法。
17. 蛍光が、およそ１０分ごと、１５分ごと、３０分ごと、６０分ごと、または１２０分ごとに測定される、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の方法。
18. 蛍光が、ＴＥＣＡＮ（商標）蛍光プレートリーダーにおいて測定される、請求項１３から１８のいずれか一項に記載の方法。
19. 細胞に、前記組換えアデノウイルスのゲノムをトランスフェクトするステップを含む、請求項１３から１９のいずれか一項に記載の方法。
20. トランスフェクションにより、細胞のおよそ５〜１０％がトランスフェクトされる、請求項２０に記載の方法。
21. 細胞に、前記組換えアデノウイルスの粒子を感染させるステップを含む、請求項１３から１９のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記細胞に、前記組換えアデノウイルス粒子の連続希釈物を感染させる、請求項２２に記載の方法。
23. １：１００、１：３００、１：９００、１：２７００、１：８１００、１：２４，３００、１：７２，９００、および１：２１８，７００の希釈物を含む、請求項２３に記載の方法。
24. （ｉ）請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノムまたは請求項１１に記載の組換えアデノウイルスと、
    （ｉｉ）細胞、細胞培養培地、および／またはマルチウェルプレートと
    を含む、キット。