JP2005526099A - 癌治療のための、ｖａ遺伝子が変異したアデノウイルスの使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、癌の処置のためのアデノウイルスの使用に関し、このアデノウイルスは、そのウイルス関連（ＶＡ）ＲＮＡを欠失している。前記アデノウイルスは、ＶＡＩ遺伝子配列もしくはＶＡＩＩ遺伝子配列、またはその両方に変異を有する。このアデノウイルスはまた、ＶＡ ＲＮＡの発現を制御する配列に変異を有し得る。このアデノウイルスは、腫瘍内、腫瘍が局在化する腔内、または癌患者の血流内に注入される。このアデノウイルスはまた、化学療法または放射線療法のような他の癌の処置様式と併用される。

Description

（発明の目的）
本発明の分野は、概して腫瘍生物学の分野に関する。特に、本発明は、ＶＡ ＲＮＡの遺伝子において変異したアデノウイルス、および癌を抑制するためのこれらの使用に関する。

（先行技術の状態）
現在の癌の処置は、主に、化学療法、放射線療法および外科的手術に基づいている。初期段階の癌の高い治癒率にもかかわらず、最も進行した癌の場合は、外科的に除去し得ないためか、または放射線の線量もしくは投与される化学療法剤の用量が正常細胞への毒性により制限されるために、不治である。腫瘍を抑制または破壊するような遺伝的物質の送達は、非常に有望な代替療法である。従来のストラテジーと比較して、この遺伝子治療ストラテジーは、より特異的に悪性細胞を標的化し、腫瘍細胞における遺伝的欠陥を攻撃するように探求されている。ＤＮＡを治療剤として用いるいくつかのストラテジーが存在する：抗腫瘍性免疫応答を刺激する遺伝子の送達、薬物の毒性を活性化する毒性遺伝子の送達、および腫瘍の発達に関する遺伝子（癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、抗血管新生遺伝子など）の発現をブロックまたは回復するようなＤＮＡの送達。治療的ＤＮＡに加え、遺伝子治療の他の成分は、このＤＮＡを送達するビヒクルであるベクターである。標的細胞へのＤＮＡの送達を増加させるために、合成ベクターおよびウイルス誘導体が用いられている。ＤＮＡの送達または腫瘍細胞の形質導入には、後者がより効率的である。ウイルスベクターは、とりわけ、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびアデノウイルスを含む種々の型のウイルスから開発されている。癌の遺伝子治療において、アデノウイルスは、大半の固形腫瘍の原因である上皮細胞への高い感染能力から好まれる。アデノウイルスベクターの他の利点は、ＤＮＡがまだ分裂状態でない細胞に送達され得ること、ベクターＤＮＡが形質導入された細胞のゲノムに挿入されないこと、これらのベクターが１ｍｌあたり１０^１３ウイルス粒子の濃度まで精製し得ること、そしてこれらが脂質エンベロープを欠いているために、血流において安定であることである。

アデノウイルスは、脂質エンベロープを持たず、約３６ｋｂの直鎖状の二本鎖ＤＮＡを同封する正十二面体のキャプシドにより特徴付けられるＤＮＡウイルスである。５０のヒトアデノウイルス血清型が存在し、これらは、その構造特性および機能特性（例えば、赤血球凝集）に基づいて、６つの亜群（Ａ〜Ｆ）に分類される。遺伝子治療において、アデノウイルス５型が好まれる。なぜならば、分子的によく定義されており、かつヒトにおける病原性が低いからである。実際、人口の８５％がアデノウイルスに感染しており、そしてアデノウイルス抗体の存在について血清陽性である。特に、アデノウイルス５型は、子供に風邪を引き起こし、これは、大抵の場合無症候性である。

種々のＥ１欠失アデノウイルスベクターが、ほとんど首尾良く癌を処置することなく、臨床試験において用いられている。これらの制限された効力は、ベクターが到達する細胞数がわずかであることに起因する。ウイルス粒子の大きなサイズ（直径８０ｎｍ）は、拡散することを困難にし、そしてベクターは注入部位または血管を越えたところの少しの層の腫瘍細胞にのみ到達する。この制限は、付随的な細胞傷害性作用が形質導入された細胞の近くの形質導入されていない細胞において見出された事実にもかかわらず、細胞傷害性遺伝子または腫瘍抑制因子の導入に基づく治療ストラテジーにおいて特に関連性がある。複数の高用量のベクターが注入された場合でさえ、腫瘍細胞の多くはベクターによって影響されないままであった。近年、このベクターの腫瘍細胞における選択的な増殖が、この制限を解決するためのストラテジーとして提案されている（Ｒ．Ａｌｅｍａｎｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０００、Ｖｏｌ．１８、７２３−７頁）。ウイルスに複製は本来、細胞壊死性であり、それゆえ、細胞傷害性遺伝子または腫瘍抑制因子は、抗腫瘍効果を得るために必要とされない。この様式において、非ウイルス遺伝子を運搬することなく、腫瘍細胞において自身を選択的に複製するというアデノウイルスのこの構想は、より正確には、遺伝子治療の分野というよりも、ウイルス療法または癌のウイルス療法の分野に属する。しかし、細胞傷害性遺伝子、免疫賦活因子、または腫瘍抑制因子は複製型アデノウイルスの選択的な毒性を増加させ得、上記遺伝子は、複製型アデノウイルスのゲノムに挿入されている。従って、これらの選択的複製型のベクターは、ウイルス療法と遺伝子治療の構想を連結する。

癌の処置のためのウイルス療法、またはウイルスの使用は、遺伝子治療よりも歴史が古い。ウイルスを用いた腫瘍の処置の最初の観察は、前世紀の始めを端緒とする。いくつかのウイルスは、天然に腫瘍親和性である。例えば、パルボウイルスの複製は、未知の機構による細胞の悪性転換に結び付いているようである。水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、インターフェロンの抗ウイルス作用に関連する腫瘍親和性を有する。ＶＳＶは、インターフェロンによる抑制に非常に感受性であり、そして、腫瘍細胞は、インターフェロンの作用に対して反応せず、抗ウイルス応答を欠失させる。近年腫瘍親和性であると同定された別のウイルスは、レオウイルスである（ＮｏｒｍａｎおよびＬｅｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ２０００、Ｖｏｌ．１０５、１０３５−８頁）。感染した細胞は、レオウイルスまたはｄｓＲＮＡ依存性キナーゼ（ＰＫＲ）を活性化する他のウイルスの感染の間に産生される、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生に反応する。従って活性化されたＰＫＲは、ｅＩＦ２転写因子のαユニットのリン酸化を介してタンパク質合成をブロックする。このｍＲＮＡ転写のブロックはまた、ウイルスＲＮＡの転写をブロックし、それと共に、ウイルスの複製もブロックする。多くの型のウイルスが、ＰＫＲを不活性にする遺伝子を発現するが、レオウイルスは発現しない。しかし、ＰＫＲは、Ｒａｓシグナル伝達経路において見出される他のタンパク質によって不活性にさせられ得る。それゆえ、活性なＲａｓを有する細胞において、多くの腫瘍細胞の場合のように、レオウイルスは増殖し得る。他のウイルスは、天然の腫瘍親和性を示さないが、遺伝的に操作され得、その結果、腫瘍において選択的に複製する。例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子（活性な増殖状態にある細胞（例えば、腫瘍細胞）においては不要な酵素活性）を欠失することによって腫瘍親和性にさせられる。ＨＳＶはまた、ＰＫＲによる活性な転写ブロックを相殺するタンパク質ＩＣＰ３４．５を欠失することによって腫瘍親和性にさせられている。この欠失は、レオウイルスの機構と類似の機構によって腫瘍親和性を生じる。最近、インフルエンザＡウイルスが操作されて腫瘍親和性になった（Ｂｅｒｇｍａｎｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅｒｃｈ ２００１、Ｖｏｌ．６１、８１８８−９３頁）。このウイルスのウイルスタンパク質ＮＳ１はまた、ＰＫＲによる転写ブロックを相殺し、その欠失は、活性なＲａｓに依存するウイルスを生じる。しかし、腫瘍における選択的な複製を獲得するために、最も遺伝的操作が行われてきたのは、アデノウイルスである。癌の遺伝子治療におけるアデノウイルスの中心的な役割は、臨床試験において蓄積された経験と合わせて、これらの新しい複製型アデノウイルスベクターの普遍化に寄与している。

アデノウイルスの複製を腫瘍細胞に制限するために、２つの方法が用いられている：腫瘍選択的なプロモーターでのウイルスプロモーターの置換、および、腫瘍細胞において不必要なウイルス機能の欠失。両方のストラテジーにおいて、調節されるべきまたは変異されるべき好ましい遺伝子は、Ｅ１ａである。なぜならば、Ｅ１ａは、残存遺伝子の発現を制御するからである。多くの組織特異的または腫瘍特異的プロモーターがＥ１ａ発現を制御するために用いられている。腫瘍細胞においては不必要であるウイルス機能の欠失のストラテジーの点では、選択的な複製のために提案された最初の変異体は、Ｅ１ｂ−５５Ｋ欠失であった。このタンパク質は、ｐ５３に結合して不活性化し、感染した細胞に細胞周期のＳ期に入るように誘導し、そして、この誘導の結果として誘発されるｐ５３媒介性のアポトーシスを阻害する。Ｅ１ｂ−５５Ｋ変異を有するアデノウイルスは、ｄｌ１５２０またはＯｎｙｘ−０１５として公知であり、これは、ｐ５３を欠失している腫瘍を処置するのに用いられている。腫瘍における選択的な複製を獲得するために、アデノウイルスのゲノム上で行われた別の変異は、Ｅ１ａのＣＲ１ドメインおよびＣＲ２ドメインに影響を及ぼす。Ｅ１ａのこれらのドメインは、網膜芽細胞腫（ＲＢ）ファミリーのタンパク質の結合を媒介する。このＲＢタンパク質は、周期のＧｏ／Ｇ１期からＳ期への移行をブロック子、Ｅ２Ｆと共に転写の複合インヒビターを形成する。Ｅ１ａがＲＢと結合する場合、Ｅ２Ｆ転写因子がＲＢ−Ｅ２Ｆ複合体から放出され、Ｅ２ＦはＳ期への移行を担う遺伝子およびＥ２のようなウイルス遺伝子の転写活性因子として作用する。従って、Ｅ２Ｆの放出は、アデノウイルスの複製の重要な段階である。腫瘍細胞において、ＲＢが存在しないか、または過リン酸化によって不活性化されており、かつＥ２Ｆが放出されているために、細胞周期は制御不能である。これらの細胞において、Ｅ１ａのＲＢ不活性化機能はもはや必要とされない。それゆえ、ＲＢとの結合を妨げるＥａ１変異を有するアデノウイルスは、通常、不活性なＲＢを有する細胞において増殖され得る。これらの変異体の選択的な複製が示されている（Ｆｕｅｙｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０００、Ｖｏｌ．１９、２−１２頁）。

本発明は、ｐ５３およびＲＢ経路とは異なる確固たる遺伝的欠失を有する腫瘍細胞における選択的な複製を達成するための、新型の変異を記載する。当該分野に存在する他の構築物とは異なり、本発明においては、変異のある標的ＤＮＡは、任意のウイルスタンパク質を産生しないが、ウイルス関連ＲＮＡを産生し、そして、このウイルス関連（ＶＡ）ＲＮＡは、アデノウイルスの初期遺伝子には属さず、後期遺伝子に属する。実験データはないが、ＷＯ ０１／３５９７０は、ＶＡＩ遺伝子が転写されない、改変したアデノウイルスの使用について言及するが、この技術に関して、アデノウイルスとＶＡＩ遺伝子およびＶＡＩＩ遺伝子の同時変異とを組み合せた使用は、述べられていない。本発明において取り組まれる遺伝的欠失は、Ｒａｓ癌遺伝子の伝達経路であり、この経路は、これまでにアデノウイルスで取り組まれていない。多くの増殖因子レセプターがＲａｓタンパク質（Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ ＡおよびＫ−Ｒａｓ Ｂ）を活性化して、細胞の外側から核への増殖シグナルを伝達する。Ｒａｓタンパク質は、低分子のＧＴＰアーゼであり、ＧＴＰに結合したとき、一連のエフェクターを活性化し得る。このエフェクターの活性化は、分裂促進的なシグナルを生じる。Ｒａｓは、９０％の膵臓腫瘍、５０％の結腸腫瘍、３０％の肺腫瘍および、他の割合で多くの他の型の腫瘍において、不可逆的に活性形態に変異している。変異したＲａｓを有する多数の腫瘍に加え、Ｒａｓ経路は、Ｒａｓ調節タンパク質またはＲａｓ経路のベクターの構成的な活性化によって、他の場合において活性化される。例えば、ＥＧＦレセプターをコードするｃ−ｅｒｂＢ遺伝子は、５０％の膠芽細胞腫で過剰発現しており、そして、そのホモログであるｃ−ｅｒｂＢ２は、乳癌および卵巣癌において頻繁に過剰発現している。一般に、８０％の腫瘍が活性化されたＲａｓ経路を有すると考えられる。これらの型の腫瘍の多くは、膵臓癌の場合と同様に、従来の治療への応答性を欠いていると仮定すると、新しい治療を必要とする。

（発明の説明）
本発明は、癌の処置のためのアデノウイルスの使用に関し、この使用は、アデノウイルスがその関連（ＶＡ）ＲＮＡを欠失しているという事実により特徴付けられる。

本発明はまた、前記アデノウイルスがＶＡＩおよびＶＡＩＩ遺伝子の配列に変異を有する、アデノウイルスの使用にも関する。

本発明の別の目的は、アデノウイルスの使用であり、前記アデノウイルスは、ＶＡ ＲＮＡの発現を制御する配列に変異を有する。

本発明の別の目的は、アデノウイルスの使用であり、前記アデノウイルスは、腫瘍内にか、腫瘍が局在化する腔内にか、または癌患者の血流内に注入される。

本発明の別の目的は、アデノウイルスの使用であり、前記アデノウイルスは、化学療法または放射線療法のような他の癌の処置様式と併用される。

本発明のなお別の目的は、活性なＲａｓ経路を有するか、またはインターフェロンの作用に応答しない腫瘍細胞における選択的な複製を獲得するために、ＶＡ ＲＮＡの遺伝子に遺伝的変異を有するアデノウイルスを含む組成物である。

本発明のなお別の目的は、腫瘍における選択的な複製を獲得するために、ＶＡ ＲＮＡの遺伝子ならびにＥ１ａ群、Ｅ１ｂ群およびＥ４群由来の１つ以上の遺伝子に遺伝的変異を有するアデノウイルスを含む、癌の処置に使用するための組成物である。

本発明のなお別の目的は、腫瘍における選択的な複製を獲得するために、ＶＡ ＲＮＡの遺伝子に遺伝的変異を有し、従って、Ｅ１ａ群、Ｅ１ｂ群およびＥ４群の１つ以上の遺伝子を含むプロモーターに変異を有するアデノウイルスを含む、癌の処置に使用するための組成物である。

本発明のなお別の目的は、腫瘍細胞における選択的な複製を獲得するために、ＶＡ ＲＮＡの遺伝子に遺伝的変異を有し、かつ、その感染力を増すためか、または、腫瘍細胞のレセプターに方向付けるためのキャプシドの改変を有するアデノウイルスを含む組成物である。

本発明のなお別の目的は、ＶＡ ＲＮＡの遺伝子に遺伝的変異を有するアデノウイルスを含む組成物であって、この遺伝的変異が、腫瘍細胞での選択的な複製を与え、次いで、プロドラッグ活性因子、腫瘍抑制因子または免疫賦活因子のような癌遺伝子治療の分野で通常用いられる他の遺伝子を含む組成物である。

本発明のなお別の目的は、腫瘍細胞上での選択的な複製を与える、ＶＡ ＲＮＡの遺伝子に遺伝的変異を有する、１〜５０の血清型由来のヒトアデノウイルスを含む、組成物である。

本発明は、癌の処置におけるＶＡ ＲＮＡの遺伝子からの変異体アデノウイルスの使用を記載する。このＶＡ ＲＮＡ変異は、活性なＲａｓ経路の存在またはインターフェロンへの感受性に起因するＰＫＲ活性化の欠如に供されたアデノウイルスの複製を可能にする。本発明は、膵臓癌、結腸癌、肺癌および他の型の腫瘍のためのよりよい処置を見出す必要性に関する。

本発明は、ウイルス関連（ＶＡ）ＲＮＡの機能を不活性化するＰＫＲを排除するゲノムに変異を有するアデノウイルスを含む。アデノウイルスのゲノムには、ＶＡ ＲＮＡをコードする２つの遺伝子（ＶＡＩおよびＶＡＩＩ）が存在し、これらはウイルスゲノムの約３０マップ単位に位置する。両方が、ウイルス周期（ｖｉｒａｌ ｃｙｃｌｅ）の後期にＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって合成される、（１６０リボヌクレオチド程度の）短いＲＮＡを生じる。各ＶＡ ＲＮＡは、ループ状に保持され、これらは、ＲＮＡ依存性キナーゼ（ＰＫＲ）に結合する。増殖の目的について、このアデノウイルスは、ＰＫＲを阻害するためにＶＡ ＲＮＡを用いる。これは、そうでなければ、このキナーゼがｅＩＦ２タンパク質の転写因子をリン酸化し、ｅＩＦ２を不活性化し、そして、タンパク質合成全体をブロックするためである。それゆえ、本発明に記載されるＶＡ変異体は、正常細胞ではほとんど増殖しない。逆に、これらの変異体は、ＰＫＲがＲａｓ経路によって不活性化されている細胞においては、多くの腫瘍細胞において起こるように、正常に増殖する。ＶＡ変異体はまた、ＰＫＲ誘導型アデノウイルスの感染に応答しない細胞においても正常に増殖する。

本発明のＶＡ ＲＮＡの変異は、ＶＡＩおよびＶＡＩＩ遺伝子に影響を及ぼし得る。あるいは、もしくは同時に、この変異は、ＶＡＩまたはＶＡＩＩ遺伝子のプロモーターまたは、その発現をブロックするための転写終結配列に影響を及ぼし得る。

ＶＡ変異体アデノウイルスは、活性なＲａｓ経路を有する細胞株（例えば、ヒト膵臓癌細胞株ＮＰ９）において増殖および増幅させる。細胞培養での増幅の後、この変異体は、アデノウイルス学の分野における標準の方法に従って、抽出および精製される。

癌の処置は、腫瘍へのＶＡ変異体の直接注入によってか、またはアデノウイルス遺伝子治療の分野における標準の方法を用いて、癌患者に日常的な静脈内投与によって実施される。

本発明に含まれる図面は、本発明の特徴、利点および構成を示す目的で添付され、その結果、本発明は明白になり、詳細に理解される。これらの図面は、明細書の一部を成し、好ましい発明を例示するが、本発明の範囲を限定するとみなすべきでない。

（実施形態の詳細な説明）
（変異したウイルス関連（ＶＡ）ＲＮＡを有するアデノウイルスの構造）
本発明は、癌の処置のための、変異した（すなわち、機能的に欠失した）ウイルス関連（ＶＡ）ＲＮＡをコードする遺伝子を有するアデノウイルスの使用を記載する。この処置は、活性なＲａｓ経路を有する細胞におけるＶＡ変異体の選択的な複製に基づく。

さらに、インターフェロン（α、βおよびγインターフェロン）の抗ウイルス作用に抵抗性の腫瘍がまた、これらの変異体を用いて処置され得る。この活性なＲａｓ依存性の複製またはインターフェロン抵抗性依存性の複製を可能にする機構を以下に記載する。アデノウイルスが感染した細胞の細胞質において、ウイルス関連（ＶＡ）ＲＮＡと呼ばれる、大量の小さなＲＮＡが、アデノウイルスのゲノムの約３０マップ単位に位置するいくつかのアデノウイルス遺伝子を転写することによって、細胞ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより合成される。いくつかのアデノウイルス血清型は、１つのＶＡ遺伝子のみを含む（これらは、亜群ＡおよびＦ、ならびに亜群Ｂ由来のいくつかの血清型に属する）が、他のアデノウイルス血清型は、２つのＶＡ遺伝子を含む（ＶＡＩおよびＶＡＩＩは、亜群Ｂのいくつかの血清型に、そして亜群Ｃ、ＤおよびＥの全て血清型に、存在する）。ＶＡ ＲＮＡは、１６０ほどのリボヌクレオチドを有し、そして、２本鎖のステム（ｓｔｅｍ）および１本鎖のループによって特徴付けられる二次構造を形成する（図１を参照のこと）。このＶＡ ＲＮＡは、アデノウイルスの感染の間に産生される他の２本鎖ＲＮＡとの結合において、ＰＫＲと呼ばれるプロテインキナーゼと競合する。ＰＫＲは、リン酸化活性が２本鎖ＲＮＡに依存するキナーゼタンパク質であるが、ＶＡ ＲＮＡとの結合は、リン酸化を活性化するよりはむしろ、リン酸化を阻害する。ＶＡ ＲＮＡのこの機能は、ウイルスの複製に必要である。なぜならば、活性化されたＰＫＲは、ｅＩＦ２タンパク質伝達の開始因子をリン酸化して不活性化し、そして、タンパク質合成をブロックするからである。さらに、ＲａｓによるＰＫＲの阻害が記載されている（ＭｕｎｄｓｃｈａｕおよびＦａｌｌｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９２、Ｖｏｌ．２６７、２３０９２−８頁）。ＰＫＲの阻害に関して、多数の腫瘍で活性化されていることが見出されているＲａｓ伝達経路は、ＶＡ ＲＮＡと機能的に類似している。これらの所見をまとめると、本発明は、活性なＲａｓ経路を有する腫瘍細胞において、ＶＡ ＲＮＡの機能が、ウイルスの複製に影響を及ぼすことなく、排除され得ることを確立する。それゆえ、本発明は、ＶＡ ＲＮＡが腫瘍を処置するために使用され得ることを記載する。

上の段落に説明されているＶＡ変異体の、腫瘍における選択的な複製機構は、ＲａｓエフェクターがＰＫＲを不活性化するという事実に基づく。多くの腫瘍において、本発明者らはまた、ＰＫＲの活性化を停止する別の機構：インターフェロンへの応答性の欠如を見出した。α、βまたはγインターフェロン（ＩＦＮ）の分泌は、先天性免疫系のウイルスに対する最初の応答である。ＩＦＮはＰＫＲの発現を誘導し、そして、アデノウイルスのＶＡ ＲＮＡの遺伝子は、ＰＫＲを阻害することによってＩＦＮの抗ウイルス作用に拮抗する。インターフェロンに応答しない細胞において、ＰＫＲは誘導されず、そして細胞質中のＰＫＲの量は、非常に低いレベルのままである。次いで、ＶＡ ＲＮＡの遺伝子は、もはやウイルスの複製に必要ではなくなる。腫瘍細胞がＩＦＮに対する応答性を欠いているということは、十分に確立されている。実際、ＩＦＮの阻害作用に対して非常に感受性であるウイルスは、腫瘍細胞の選択的な溶解および腫瘍の処置のために使用されている（Ｓｔｏｊｄｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０００、Ｖｏｌ．６、８２１−５頁）。これらの所見を本発明の実施形態と結びつけると、インターフェロン経路に欠陥を有する腫瘍を処置するためのＶＡ ＲＮＡ変異体アデノウイルスの使用になる。

アデノウイルス血清型５のＶＡ ＲＮＡの遺伝子配列を、図２に示す。アデノウイルス５型のＶＡＩ遺伝子は、アデノウイルスのゲノム配列中の１０，６２０塩基対〜１０，７７９塩基対の１６０塩基対からなる。ＶＡＩＩ遺伝子は、１０，８７６塩基対〜１１，０３６塩基対の１６１塩基対からなる。本発明の１つの実施形態は、これらの配列に欠失を有する。他の実施形態は、これらの周囲の配列に影響を及ぼし、ＶＡ遺伝子の発現を制御する欠失を有する。特に、ＶＡ遺伝子の前の３０塩基対の配列は、上記の発現の調節に関与しているとして記載されている（ＦｏｗｌｋｅｓおよびＳｈｅｎｋ、Ｃｅｌｌ １９８０，Ｖｏｌ．２２、４０５−１３頁）。別の実施形態は、ＶＡ遺伝子の後ろの配列に欠失を有し、この配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによってその転写の終止を制御する（Ｇｕｎｎｅｒｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９９、Ｖｏｌ．２８６、７４５−５７頁）。

ＶＡ ＲＮＡの機能の研究の間、その機能を排除したいくつかの変異体が構築された。本発明は、そのＰＫＲ阻害性作用を排除した、以前に確立されたＶＡ遺伝子変異体が、癌を処置するために試用され得ることを確立する。新規のＶＡ ＲＮＡ変異体がまた、本発明に記載される適用のために使用され得る。アデノウイルスのゲノムを操作するいくつかの方法が存在する。ＶＡ変異体は、例えば、本発明者らによって以前に公開されたプロトコールを用いて変異を方向付けることによってか、その代わりに、そこに記載されている、アデノウイルスのヘキソンまたは繊維のフラグメントを使用すること（ＶＡ遺伝子を含むフラグメントを使用する）によって構築され得る。この手順は、以下の通りであり得る：標準の方法を用い、ＳＤＳ−プロテイナーゼＫを介して、アデノウイルス５型から精製ＤＮＡを得る。このウイルスＤＮＡをＫｐｎＩ制限酵素で切断し、そして、ＶＡ ＲＮＡの遺伝子を含む、２７４９ｂｐのフラグメント（Ａｄ５の＃８，５３７−１１，２８６ｂｐ）を、ゲル電気泳動を用いて精製した。このフラグメントを、同じ制限酵素を用いてｐＣＵ１９プラスミドに方向付けて結合させることによってクローニングする。上記のＶＡ配列のいずれかを検出するために方向付けられた変異は、市販のプロトコール（「Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ｓｉｔｅ−ｄｅｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））を用いて、このプラスミド上でなされる。次いで、この変異したＫｐｎＩフラグメントをＲｓｒＩＩで部分的に切断した全長のＡｄ５ゲノムを含むプラスミドを用いる相同組み換えによってウイルスのゲノムに導入する（１０，９４４ｂｐにある標的は、相同組み換えを介して修復される）。２９３細胞または活性なＲａｓ経路を有する細胞にトランスフェクトすることによって、得られたプラスミドからＶＡ変異体を得る。

本発明に記載されているＶＡ ＲＮＡの遺伝子変異以外の、さらなる型の遺伝的変異および操作が、腫瘍における選択的な複製を獲得するために行われている。これらは、腫瘍細胞において活性であり、ウイルスの遺伝子発現、ならびに、ＲＢおよびｐ５３経路をブロックする初期の機能（「初期のＥ１およびＥ４」）の欠失を制御するプロモーターの挿入であり得る。本発明の１つの実施形態は、腫瘍における選択的な複製を獲得するために、他の操作と組み合わせてＶＡ ＲＮＡの遺伝子の変異を使用することである。

本発明の別の実施形態において、ＶＡ ＲＮＡ変異体は、そのキャプシドに改変を有し、その感染性を増加し得るか、または腫瘍細胞に存在するレセプターに方向付け得る。アデノウイルスのキャプシドタンパク質は、感染性を増加するか、またはウイルスを腫瘍細胞のレセプターに方向付けるリガンドを含むように遺伝的に改変されている。アデノウイルスを腫瘍に方向付けることはまた、片側でウイルスに結合し、そして逆側で腫瘍レセプターに結合する、二機能性リガンドで達成され得る。さらに、このキャプシドは、血中のアデノウイルスの残留性を増加させ、そして、播種性の腫瘍小結節への到達機会を増加するために、ポリエチレングリコールのようなポリマーで覆われ得る。これらの改変は、ＶＡ ＲＮＡ変異体において構成されえる。本発明の別の実施形態は、５０以上のヒトアデノウイルス血清型のＡｄ５以外のアデノウイルス血清型のＶＡ ＲＮＡ変異体の使用であり、ＶＡ ＲＮＡの遺伝子配列がよく規定されている、少なくとも４７血清型が存在する（ＭａおよびＭａｔｈｅｗｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９６、Ｖｏｌ．７０、５０８３−９９頁）。これらの血清型のＶＡ遺伝子の変異を用いて、活性なＲａｓまたはインターフェロンへの抵抗性の影響を受ける複製を獲得し得る。

本発明の別の実施形態は、腫瘍細胞における細胞傷害性を増殖するために他の遺伝子(例えば、チミジンキナーゼあるいはシトシンデアミナーゼ遺伝子、アポトーシス促進性遺伝子、免疫刺激因子、または腫瘍抑制因子)を有するＶＡ ＲＮＡ変異体アデノウイルスの使用を記載する。

（ＶＡ ＲＮＡにおいて変異したアデノウイルスの産生、精製および処方）
ＶＡ ＲＮＡ変異体アデノウイルスは、アデノウイルス学およびアデノウイルスベクターの分野の標準の方法に従って増殖される。増殖の好ましい方法は、ＶＡ ＲＮＡ変異体の複製を可能にする細胞株に感染させることによってである。上記細胞株は、例えば、変異したかまたは活性なＲａｓ癌遺伝子を有する。ＮＰ９膵臓癌株は、上記細胞株の１つの例である。増殖は、例えば、以下の方法において実施される：ＮＰ９細胞をプラスチック製の細胞培養プレートにて増殖させ、１細胞あたり５０ウイルス粒子を用いて感染させる。２日後、ウイルスの産生を示す細胞変性効果が細胞のクラスターとして見える。細胞をチューブに集めて保存する。１０００×ｇで５分間遠心分離した後、細胞沈殿物を、３回凍結および溶解し、細胞を破壊する。得られた細胞抽出物を１０００×ｇで５分間遠心分離し、ウイルスを含む上清を塩化セシウム勾配の表面上に充填し、３５，０００×ｇで１時間遠心分離する。勾配中のウイルスのバンドを、再度別の塩化セシウム勾配上に充填し、３５，０００×ｇで１６時間遠心分離する。ウイルスのバンドを回収してＰＢＳ−１０％グリセロールに対して透析する。透析したウイルスをアリコートして−８０℃にて保存する。プラーク形成粒子および単位の数の定量を、標準のプロトコールに従って行う。１０％グリセロールを含むリン酸緩衝化生理食塩水が、アデノウイルスの保存のための標準の処方である。

（癌の処置のためのＶＡ ＲＮＡ変異体アデノウイルスの使用）
本発明は、癌を処置するためにＶＡ ＲＮＡの遺伝子に欠失を有するアデノウイルスの使用を記載する。この処置は、活性なＲａｓ経路またはインターフェロンの作用に対する抵抗性を有する細胞におけるＶＡ ＲＮＡ変異体の選択的な複製に基づく。

癌の処置におけるＶＡ変異体を使用するためのプロトコールは、アデノウイルス治療およびアデノウイルス遺伝子治療の分野で用いられているものと同じ手順に従う。位電子治療の分野における、非複製型および複製型のアデノウイルスの使用の広範な経験が存在する。特に、本発明で提案されるものとは異なる選択的な複製機構を有するアデノウイルスが癌を処置するために使用されている。培養において、動物モデルにおいて、および患者での臨床試験における腫瘍細胞の処置に関して、多くの刊行物が存在する。インビトロでの培養細胞の処置のために、上記の処方のいずれかの精製アデノウイルスを、培養培地に添加して、腫瘍細胞に感染させる。動物モデルまたはヒト患者における腫瘍を処置するために、アデノウイルスは、腫瘍内、もしくは腫瘍が局在する体腔内に注射することによって局所的にか、または、血流に注射することによって全身に、投与され得る。他の選択的複製型アデノウイルスを用いて実施されているように、本発明に記載されるＶＡ ＲＮＡ変異体を用いる腫瘍の処置は、化学療法または放射線療法のような他の処置様式と併用され得る。

（実施例１：ＶＡＩ遺伝子の変異したアデノウイルスは、Ｒａｓ依存性の複製を示す）
活性化されたＲａｓ経路についてのＶＡＩ ＲＮＡ変異体（ｄｌ３３１）の複製の依存性を示すために、本発明者らは、ヒト細胞における活性化状態を調節した。約１．０×１０^７個のヒト胚性幹細胞（２９３株）を直径１０ｃｍのプレートに撒き、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、構成的に活性形態のＲａｓ（Ｈ−Ｒａｓ Ｖ１２）またはＲａｓのドミナントネガティブ（Ｈ−Ｒａｓ Ｎ１７）のいずれかを含む、２４μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションに、リン酸カルシウムの標準的なプロトコールを用いた。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を新しいプレートに移した。Ｒａｓ経路についてのプラスミドのトランスフェクション効果を示すために、本発明者らは、ウェスタンブロットによって細胞溶解物のＥＲＫ（Ｒａｓエフェクター）の発現レベルおよびリン酸化を観察した。溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％ グリセロール、５ｍＭ ＮａＦ、１００μＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン）を用いて、４℃で１時間インキュベートすることにより、乾燥溶解物を得た。１４，０００×ｇで遠心分離した後、上清のタンパク質（１０μｇ／トラック（Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて決定））を１０％ ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルで電気泳動により分離し、そして、ＰＶＤＦメンブレンに移した。ＥＲＫおよびリン酸ＥＲＫの量は、Ａｍｅｒｓｈａｍのｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅキット（ＥＣＬ）を用いて明らかにした。一次抗体として、ＥＲＫに対するモノクローナル抗体（Ａｂ）（Ｚｙｍｅｄ）またはリン酸ＥＲＫに対するポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈ．）を用いた。ラディッシュペルオキシダーゼと結合体化したマウス抗ＩｇＧまたはラビット抗ＩｇＧを二次抗体として用いた。これらの手順に従って、本発明者らは、トランスフェクトしていない２９３細胞が、低レベルのＥＲＫのリン酸化を有していることを示し、これは、低いＲａｓ経路活性を示す。ＧＦＰを用いるコントロールトランスフェクションは、これらの結果に影響を及ぼさなかった。Ｈ−Ｒａｓ Ｖ１２を用いるトランスフェクションは、ＥＲＫのリン酸化を増加させた（これはＲａｓ経路の活性化を示す）。対照的に、Ｈ−Ｒａｓ Ｎ１７を用いたトランスフェクションは、Ｒａｓ経路の阻害を生じた（本発明の図４、上パネル）。

一旦Ｒａｓ経路の調節が上記の手順に従って評価されると、本発明者らは、以下に記載するようなＶＡ ＲＮＡ変異体の選択的な複製を示すことに進んだ。上の段落で記載したようなトランスフェクトした細胞を、１０プラーク形成単位／細胞を用いて、ＶＡＩ ＲＮＡ変異体ｄｌ３３１または野生型アデノウイルスで感染させた。ウイルスの産生を、２９３上でのプラーク形成アッセイによって、上清中のアデノウイルスの量を測定することによって毎日分析した。野生型アデノウイルスは、コントロールの２９３細胞またはＧＦＰでトランスフェクトした細胞において、ＶＡＩ変異体よりも７〜１０倍複製した。Ｈ−Ｒａｓ Ｖ１２によって誘導されるＲａｓ経路の活性化は、ＶＡ変異体の複製効率を１０倍上昇させ、その結果、その複製レベルは、野生型アデノウイルスのレベルに達した。逆に、Ｈ−Ｒａｓ Ｎ１７でのＲａｓ経路の阻害は、ＶＡ変異体の複製を２倍低下させた。それゆえ、野生型アデノウイルスの複製と比較して、ＶＡＩ ＲＮＡ変異体の複製は、本発明者らが認識するよりも、２０倍以上Ｒａｓ経路の活性化に依存する。

（実施例２：活性なＲａｓ経路を有するヒト腫瘍細胞は、変異したＶＡＩ ＲＮＡを有するアデノウイルスの効率的な複製を可能にする）
ＶＡＩ ＲＮＡの遺伝子が変異したアデノウイルス（ｄｌ３３１）の複製を、Ｋ−Ｒａｓ遺伝子のコドン１２に変異を有する（ＧＧＴ→ＧＡＴ）ＮＰ９ヒト膵臓癌株において定量した。複製は、細胞の単層におけるタンパク質の量の減少として測定される、ウイルスが誘導する細胞変性効果（ＣＰＥ）によって見積もる（ＢＣＡ法）。簡単に言えば、ＮＰ−９細胞を１ウェルあたり３０，０００細胞で９６ウェルプレートに撒く。次の日、ｄｌ３３１または野生型のアデノウイルスの、１細胞あたり１０００プラーク形成単位の濃度からの限界希釈を用いて細胞に感染させる。感染させた細胞を５日間インキュベートし、そして、培養培地を除去して、ウェルに残るタンパク質の量を測定する。図５は、ウイルス種菌の希釈と比較した感染させていないウェルに関してのタンパク質の百分率として得られた結果を示す。５０％の死亡率（タンパク質含量の５０％の減少、ＩＣ_５０）を生じる希釈は、最初のウイルス調製物の細胞溶解性力価の推定値である。変異したＲａｓを有する細胞（ＮＰ９）において、ＶＡＩ ＲＮＡ変異体ｄｌ３３１および野生型アデノウイルスに対して得られたＩＣ_５０は、それぞれ０．０４および０．７であり、これは、ＶＡＩ ＲＮＡ変異体の力価が１８倍増えていることを示している（図５、上パネルおよび下パネルの実線）。低いＲａｓ活性を有する細胞（２９３）において、これらの値は、０．０１８および０．００３であり、これは、ＶＡＩ ＲＮＡの力価が６倍減少することを示している。該して、この結果は、本発明者らが、活性なＲａｓを有する細胞またはほとんど不活性なＲａｓを有する細胞における、ＶＡＩ ＲＮＡ変異体と野生型アデノウイルスの細胞溶解性力価を比較する場合、Ｒａｓの活性化が、ＶＡＩ変異体の複製をおよそ１００倍増加させることを示す。

（実施例３：ＶＡＩ ＲＮＡの遺伝子が変異したアデノウイルスは、癌を効率的に処置するのに使用され得る）
以下に、本発明者らは、ＶＡＩ ＲＮＡ変異体アデノウイルス（ｄｌ３３１）の抗腫瘍効果を示す。活性化されたＲａｓ経路（ＮＰ９）を有する腫瘍を含む、Ｂａｌｂ／ｃ系統の胸腺欠損マウスを用いて、インビボでの実験を行った。全ての実験は、ＦＥＬＡＳＡガイドライン（「Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ」）に従って行った。合計１．２×１０^７個のＮＰ−９細胞株の腫瘍細胞をマウスの各後側面に、皮下に注射した。1日後に形成された腫瘍（７０〜８０ｍｍ^３に達した）を異なる実験群（各群あたりｎ＝１０）間で分布した。コントロール群の腫瘍は、２回の生理緩衝化食塩水の腫瘍内注射を受けた（２×１０μｌ）。ＶＡ変異体で処置した群の腫瘍は、２回のｄｌ３３１（１腫瘍あたり１０^９ウイルス粒子）の腫瘍内注射を受けた（２×１０μｌ）。図６は、最初の処置（０日目）と比較した腫瘍容積を示す。結果は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示す。結果間の有意差の存在は、ノンパラメトリックな、非対称データＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ試験を用いて計算した。増殖曲線を分散分析を用いて比較した。結果は、ｐ＜０．０５である場合に有意であるとみなした。ＳＰＳＳ統計パッケージ（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を用いて計算を行った。１６日目および２１日目の腫瘍サイズの間に、有意差がある。ＶＡＩ ＲＮＡ変異体ｄｌ３３１で処置した腫瘍は、後退を示した。

アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）のＶＡ ＲＮＡの二次構造。ワトソンとクリックの対形成規則に従う塩基の対形成によって形成された、ステムおよびループの構造。中央ドメインは、ＶＡ機能に重大な意味を有し、そして先端のステムはまた、ＶＡ ＲＮＡのＰＫＲとの相互作用に関する。 Ａｄ５ ＶＡ領域の配列。示されるＤＮＡ配列は、アデノウイルス血清型５のゲノムの１０，５００〜１１，１００の塩基対に対応する。この配列は、ＶＡ領域を含む（ＶＡ遺伝子寄りの鎖のみを示す）。示される配列は、ＶＡＩ遺伝子の転写の開始に対して、−１１８塩基対（ｂｐ）前に進み、ＶＡＩＩの終止点を６４ｂｐ超える。転写の開始点から終止点までのＶＡＩ遺伝子（１６０ｂｐ）に下線を施し、イタリック体を用いている。９６ｂｐの配列は、ＶＡＩおよびＶＡＩＩをコードする配列を分離する。ＶＡＩＩ（１６１ｂｐ）は、ＶＡＩの後ろに見出され、これには下線を施して、かつ太字で示している。 ＶＡ ＲＮＡを欠失しているアデノウイルスの、活性なＲＡＳ経路を有するかまたはインターフェロンに応答しない細胞における複製選択性機構。ウイルス関連（ＶＡ）ＲＮＡ変異体がＲａｓ活性化に供されて複製を示す機構。アデノウイルスの感染は、２本鎖ＲＮＡを生じ、これが、リン酸化によってＰＫＲの活性化を誘導する。活性化されたＰＫＲは、ｅＩＦ２タンパク質の転写因子をリン酸化して不活性化し、従って、タンパク質の伝達全体をブロックする。アデノウイルスのＶＡ ＲＮＡは、ＰＫＲに結合して不活性化し、感染細胞の抗ウイルス応答を相殺する。ＶＡ ＲＮＡ変異体アデノウイルスは、ＰＫＲを阻害し得ず、そしてタンパク質合成の完全なブロックを回避し得ない。さらに、癌遺伝子Ｒａｓの活性化はまた、ＰＫＲを阻害し、Ｒａｓが活性である場合、ＶＡ変異体は、正常に増殖する。 ＶＡ ＲＮＡ変異体の増殖に際するＲａｓ活性化の効果。グラフは２９３におけるウイルスの産生を示す（複製、２日目）。細胞株２９３は、低レベルの活性化されたＲａｓを示す。Ｒａｓのドミナントネガティブ変異体（ＲａｓＮ１７）の発現カセットを含有するプラスミドが２９３にトランスフェクトされ、そして、ＶＡＩ ＲＮＡ変異体アデノウイルス（ｄｌ３３１）の増殖効率を評価した。ウェスタンブロットで見られ得るＲａｓ阻害は、ｄｌ３３１の増殖を阻害し得る。逆に、２９３が構成的に活性なＲａｓ変異体（ＲａｓＶ１２）の発現カセットを含有するプラスミドでトランスフェクトされた場合、ウェスタンブロットによってＲａｓの活性化が、そしてｄｌ３３１増殖の減少が観察された。 低いＲＡＳ活性を有する細胞（２９３）または高いＲＡＳ活性を有する細胞（ＮＰＡ）におけるＶＡ ＲＮＡ変異アデノウイルスの増殖。ＢＣＡによって定量化した細胞変性効果（ＣＰＥ）のグラフ（５日目）。低いＲａｓ活性を有する細胞および、高いレベルの活性なＲａｓを有する膵臓癌細胞におけるＶＡ ＲＮＡ変異体の増殖の比較。野生型アデノウイルスＡｄ５の増殖を、ＶＡ変異に帰し得ない感染力および複製の差異を較正するための標準化コントロールとして使用する。 ＶＡ ＲＮＡ変異体を用いる腫瘍の処置。ＮＰ９ヒト膵臓癌腫瘍を免疫抑制したマウス（Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス）に移植した。腫瘍が７０〜８０ｍｍ^３の容積に達したとき、ＶＡＩ ＲＮＡ変異体アデノウイルス（ｄｌ３３１）またはコントロールビヒクルを注入した。腫瘍の増殖（腫瘍の容積）を測定した後、ＶＡ ＲＮＡ変異体の抗腫瘍効果を実証した。

Claims (11)

1. 癌の処置のためのアデノウイルスの使用であって、該アデノウイルスがそのＶＡＩおよびＶＡＩＩというウイルスに随伴するＲＮＡを欠失しているという事実により特徴付けられる、使用。
2. 前記アデノウイルスが前記ＶＡＩおよびＶＡＩＩ ＲＮＡの遺伝子の配列に変異を有する、請求項１に記載の使用。
3. 前記アデノウイルスが前記ＶＡＩおよびＶＡＩＩ ＲＮＡの遺伝子の発現を制御する配列に変異を有する、請求項１に記載の使用。
4. 前記アデノウイルスが、腫瘍内、該腫瘍が局在する腔内、または癌患者の血流中に注入される、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
5. 前記アデノウイルスが、化学療法または放射線療法などの他の癌治療様式と併用される、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
6. 活性なＲａｓ経路を有するかまたはインターフェロンの作用に応答しない腫瘍細胞における選択的な複製を獲得するために、ＶＡ ＲＮＡの遺伝子に遺伝的変異を有するアデノウイルスを含む、組成物。
7. 腫瘍における選択的な複製を獲得するために、Ｅ１ａ群、Ｅ１ｂ群およびＥ４群の１つ以上の遺伝子において前記ＶＡ ＲＮＡの遺伝子に遺伝的変異を有するアデノウイルスを含む、請求項１〜３に記載の使用のための、組成物。
8. 腫瘍における選択的な複製を獲得するために、前記ＶＡ ＲＮＡの遺伝子に変異を有し、そして、Ｅ１ａ群、Ｅ１ｂ群およびＥ４群の１つ以上の遺伝子を調節するプロモーターに変異を有するアデノウイルスを含む、請求項１〜３に記載の使用のための、組成物。
9. 腫瘍細胞における選択的な複製を獲得するために、ＶＡ ＲＮＡの遺伝子に遺伝的変異を有し、かつ、その感染力を増すためか、または、腫瘍細胞上に存在するレセプターに方向付けるためにキャプシドに改変を有するアデノウイルスを含む、組成物。
10. ＶＡ ＲＮＡの遺伝子に遺伝的変異を有するアデノウイルスを含む組成物であって、該遺伝的変異が、腫瘍細胞での選択的な複製を与え、次いで、プロドラッグ活性因子、腫瘍抑制因子または免疫賦活因子のような癌遺伝子治療の分野で通常用いられる他の遺伝子を含む、組成物。
11. 腫瘍細胞上での選択的な複製を与える、ＶＡ ＲＮＡの遺伝子に遺伝的変異を有する、１〜５０の間の血清型由来のヒトアデノウイルスを含む、組成物。

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