JP2019041777A

JP2019041777A - ヌクレアーゼ媒介ゲノム遺伝子操作のための送達方法および組成物

Info

Publication number: JP2019041777A
Application number: JP2018240822A
Authority: JP
Inventors: シー．ホームズマイケル; C Holmes Michael; ワンジアンビン; Jianbin Wang
Original assignee: Sangamo Biosciences Inc
Current assignee: Sangamo Therapeutics Inc
Priority date: 2013-10-17
Filing date: 2018-12-25
Publication date: 2019-03-22
Also published as: WO2015057980A1; CN116836957A; IL244796A0; JP2021010383A; CN110713995A; JP2016539627A; JP6875362B2; JP2022190071A; EP3441468A3; CA3194037A1; EP3058072B1; CA2926094C; AU2014337248B2; EP3441468B1; JP2019041776A; HK1226102A1; US20150110762A1; CN105899665B; US10494648B2; IL274182A

Abstract

【課題】毒性が低く効率的がより高い、細胞のゲノム遺伝子操作、特に、細胞のゲノムの標的化された改変のための組成物および方法を提供する。【解決手段】本発明の一態様では、単離された細胞のゲノム中に１種または複数種の導入遺伝子を組み込む方法が提供され、該方法では、（ａ）該１種または複数種の導入遺伝子を含むドナーベクター、および（ｂ）少なくとも１種のヌクレアーゼを該細胞中に導入するステップを含み、該少なくとも１種のヌクレアーゼにより該細胞の該ゲノムが開裂され、したがって、該１種または複数種の導入遺伝子が該細胞の該ゲノム中に組み込まれる。【選択図】図１

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１３年１０月１７日に出願された米国仮出願第６１／８９２，３４８号および２０１４年８月５日に出願された米国仮出願第６２／０３３，４２４号の利益を主張し、その開示はそれらの全体が本明細書に参考として援用される。

技術分野
本開示は、ゲノム遺伝子操作、特に、細胞のゲノムの標的化された改変の分野にある。

背景
ゲノムＤＮＡの標的化された開裂のための種々の方法および組成物が説明されてきた。かかる標的化された開裂事象を使用して、例えば、標的化された変異誘発を誘導し、細胞ＤＮＡ配列の標的化された欠失を誘導し、所定の染色体遺伝子座における標的化された組換えを容易にすることができる。例えば、あらゆる目的でその開示が参照によりその全体が組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号；同第８，３２９，９８６号；同第８，３９９，２１８号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号および同第２０１３０１７７９６０号、ならびに米国出願第１４／２７８，９０３号を参照されたい。

これらの方法は、多くの場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）等、エラーボーン過程による切断の修復または修復鋳型を使用した修復（相同組換え修復またはＨＤＲ）が、遺伝子のノックアウトまたは目的の配列の挿入（標的化組込み）をもたらし得るような、標的ＤＮＡ配列に二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを誘導するための遺伝子操作された開裂系の使用に関与する。遺伝子操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）等の特異的ヌクレアーゼの使用により、特異的開裂をガイドするための遺伝子操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）によるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、および／あるいは、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ系に基づくヌクレアーゼ（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来、「ＴｔＡｇｏ」として公知；Ｓｗａｒｔｓら（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ５０７巻（７４９１号）：２５８〜２６１頁）を使用して、開裂を生じることができる。

上述のヌクレアーゼ系の１つを使用する標的化された開裂は、ＨＤＲまたはＮＨＥＪ媒介性の過程のいずれかを使用して、特異的標的位置に核酸を挿入するために利用できる。しかし、細胞にヌクレアーゼ系およびドナーの両方を送達することは、問題であり得る。例えば、細胞中へのプラスミドの形質導入によるドナーまたはヌクレアーゼの送達は、レシピエント細胞、特に、初代細胞であり、したがって細胞株由来の細胞ほどには頑強でない細胞に対して、毒性であり得る。
ＣＤ３４＋幹細胞または前駆細胞は、自己再生し、かつ／またはリンパ系譜の細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）ならびに骨髄系譜の細胞（例えば、単球、赤血球、好酸球、好塩基球、および好中球）に分化する能力を特徴とする不均一な細胞のセットである。それらの不均一性は、ＣＤ３４＋幹細胞集団内には、特定の群の多分化能（系譜にコミットした（lineage committed）かどうかにかかわらず）を反映することも多い多数のサブグループが存在するという事実から生じる。例えば、ＣＤ３８−であるＣＤ３４＋細胞は、より原始的な未成熟ＣＤ３４＋前駆細胞であり（長期造血前駆細胞とも呼ばれる）、一方、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋である細胞（短期造血前駆細胞）は系譜にコミットする（Stellaら、（１９９５年）Hematologica ８０巻：３６７〜３８７頁を参照されたい）。次いでこの集団が分化経路をさらに進むと、ＣＤ３４マーカーは失われる。ＣＤ３４＋幹細胞には臨床的細胞療法における巨大な潜在性がある。しかし、それらの不均一性に一部起因して、細胞に対して遺伝子ノックアウト、導入遺伝子の挿入などのような遺伝子操作を実施することは難しい場合がある。具体的には、これらの細胞は、従来の送達ベクターでは形質導入が不十分であり、最も原始的な幹細胞は改変に対して感受性であり、誘導されたＤＮＡＤＳＢ後のＨＤＲが限定され、また、長期標準培養条件でのＨＳＣ維持が不十分である。さらに、他の目的の細胞（単に非限定的な例として、心筋細胞、中型有棘ニューロン、初代肝細胞、胚性幹細胞、人工多能性（puripotent）幹細胞および筋肉細胞）は、他の細胞よりも、ゲノム編集のための形質導入に成功しない場合がある。
したがって、毒性が低く効率的がより高い、ＣＤ３４＋細胞および他の目的の細胞のゲノム遺伝子操作のための組成物および方法が、いまだ必要とされている。

米国特許第８，５８６，５２６号明細書米国特許第８，３２９，９８６号明細書米国特許第８，３９９，２１８号明細書米国特許第６，５３４，２６１号明細書米国特許第６，５９９，６９２号明細書米国特許第６，５０３，７１７号明細書米国特許第６，６８９，５５８号明細書米国特許第７，０６７，３１７号明細書米国特許第７，２６２，０５４号明細書米国特許第７，８８８，１２１号明細書米国特許第７，９７２，８５４号明細書米国特許第７，９１４，７９６号明細書米国特許第７，９５１，９２５号明細書米国特許第８，１１０，３７９号明細書米国特許第８，４０９，８６１号明細書米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号明細書米国特許出願公開第２００５／０２０８４８９号明細書米国特許出願公開第２００５／００２６１５７号明細書米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書米国特許出願公開第２００６／００６３２３１号明細書米国特許出願公開第２００８／０１５９９９６号明細書米国特許出願公開第２０１０／０２１８２６４号明細書米国特許出願公開第２０１２／００１７２９０号明細書米国特許出願公開第２０１１／０２６５１９８号明細書米国特許出願公開第２０１３／０１３７１０４号明細書米国特許出願公開第２０１３／０１２２５９１号明細書米国特許出願公開第２０１３／０１７７９８３号明細書米国特許出願公開第２０１３／０１７７９６０号明細書

Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来、「ＴｔＡｇｏ」として公知；Ｓｗａｒｔｓら（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ５０７巻（７４９１号）：２５８〜２６１頁 Stellaら、（１９９５年）Hematologica ８０巻：３６７〜３８７頁

概要
本発明は、遺伝子療法およびゲノム遺伝子操作における使用のための組成物および方法を記載する。具体的には、記載されている方法および組成物は、造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＣ／ＰＣ）およびＴ細胞を含めた初代細胞などの細胞への核酸の導入に関する。さらに、本発明の方法および組成物は、そのような細胞への目的のドナーＤＮＡを含むＡＡＶ粒子の送達に有用である。

一部の態様では、本発明は、ゲノム遺伝子操作の目的で細胞（例えば、ＨＳＣ／ＰＣ）に少なくとも１種のヌクレアーゼを送達することを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼをペプチドとして送達し、他の実施形態では、ヌクレアーゼを、ヌクレアーゼをコードする核酸として送達する。一部の実施形態では、２種以上のヌクレアーゼを使用する。一部の好適な実施形態では、ヌクレアーゼをコードする核酸はｍＲＮＡであり、一部の例では、ｍＲＮＡは保護されている。ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴｔＡｇｏヌクレアーゼ系またはこれらの組合せを含み得る。好適な実施形態では、ヌクレアーゼ（複数可）をコードする核酸をエレクトロポレーションによって送達する。

一態様では、単離された細胞のゲノム中に１種または複数種の導入遺伝子を組み込む方法であって、導入遺伝子と少なくとも１種のヌクレアーゼを細胞中に逐次的に導入し、したがってヌクレアーゼにより導入遺伝子の標的化された組込みが媒介されるステップを含む方法が本明細書で提供される。したがって、単離された細胞のゲノム中に１種または複数種の導入遺伝子を組み込む方法であって、（ａ）１種または複数種の導入遺伝子を含むドナーベクター、および、（ｂ）少なくとも１種のヌクレアーゼを細胞中に導入するステップを含み、少なくとも１種のヌクレアーゼにより細胞のゲノムが開裂され、したがって、１種または複数種の導入遺伝子が細胞のゲノム中に組み込まれ、さらに、（ｉ）ドナーベクターを少なくとも１種のヌクレアーゼよりも前に細胞中に導入する場合、少なくとも１種のヌクレアーゼを、ドナーベクターの導入後４８時間以内に細胞中に導入し、（ｉｉ）少なくとも１種のヌクレアーゼをドナーベクターよりも前に導入する場合、ドナーベクターを、少なくとも１種のヌクレアーゼの導入後４時間以内に細胞中に導入する、方法。ある特定の実施形態では、方法は、（ａ）細胞中に１種または複数種の導入遺伝子を含むドナーベクターを導入するステップと、（ｂ）細胞を４８時間未満（例えば、数秒〜４８時間またはそれらの間の任意の時間）にわたって培養するステップと、（ｃ）細胞中に少なくとも１種のヌクレアーゼを導入するステップとを含んでよく、少なくとも１種のヌクレアーゼにより細胞のゲノムが開裂され、したがって、１種または複数種の導入遺伝子が細胞のゲノム中に組み込まれる。あるいは、方法は、（ａ）細胞中に少なくとも１種のヌクレアーゼを導入するステップと、（ｂ）細胞を２４時間未満（例えば、数秒〜２４時間またはそれらの間の任意の時間）にわたって培養するステップと、（ｃ）細胞中に１種または複数種の導入遺伝子を含むドナーベクターを導入するステップとを含んでよく、少なくとも１種のヌクレアーゼにより細胞のゲノムが開裂され、したがって、１種または複数種の導入遺伝子が細胞のゲノム中に組み込まれる。追加的な導入遺伝子を同じ遺伝子座および／または異なる遺伝子座に組み込むために、方法のステップを繰り返すことができる。ある特定の実施形態では、細胞を２４時間未満（例えば、数秒〜２４時間またはそれらの間の任意の時間）にわたって培養する（ステップ（ｂ））。さらに別の実施形態では、例えば、ドナーベクターを導入する前にヌクレアーゼ（複数可）を導入する場合、細胞を４時間未満にわたって培養する。

任意の細胞、例えば、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）またはＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞）を使用することができる。ドナーベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ６ベクターまたはＡＡＶ２／６などのＡＡＶ６キメラベクターなど）として導入することができる。ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）も、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを使用して、例えば、ｍＲＮＡ形態で導入することができる。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、セーフハーバー遺伝子（例えば、ＣＣＲ５遺伝子、ＡＡＶＳ１遺伝子、Ｒｏｓａ遺伝子、アルブミン遺伝子など）を標的とする。導入遺伝子は、タンパク質、例えば、障害（例えば、リソソーム蓄積症、異常ヘモグロビン症、血友病など）を有する被験体では欠如または欠損している治療タンパク質をコードし得る。ある特定の実施形態では、１種または複数種のタンパク質の提供が必要な被験体に１種または複数種のタンパク質を提供する方法であって、本明細書に記載のいずれかの方法に従って、単離された細胞に１種または複数種のタンパク質をコードする１種または複数種の導入遺伝子を導入するステップと、細胞を被験体に導入し、したがって、１種または複数種のタンパク質が被験体に提供されるステップとを含む方法が記載される。

他の態様では、本発明は、標的細胞へのドナー核酸の送達を含む。ドナーは、ヌクレアーゼ（複数可）をコードする核酸よりも前に、それよりも後に、またはそれと一緒に送達することができる。ある特定の実施形態では、ドナーをヌクレアーゼ（複数可）と同時に送達する。他の実施形態では、ドナーをヌクレアーゼ（複数可）よりも任意の時間前、例えば、直前、１〜６０分前（またはそれらの間の任意の時間）、１〜２４時間前（またはそれらの間の任意の時間）、１〜４８時間前（またはそれらの間の任意の時間）または４８時間超前を含め、ヌクレアーゼ（複数可）よりも前に送達する。ある特定の実施形態では、ドナーをヌクレアーゼよりも後に、好ましくは４時間以内に送達する。ドナー核酸は、細胞のゲノム、例えば、内因性遺伝子座中に組み込まれる外因性配列（導入遺伝子）を含む。導入遺伝子は、ヌクレアーゼ（複数可）による開裂部位またはその近傍（例えば、１〜５０塩基対以内）に組み込まれることが好ましい。一部の実施形態では、ドナーは、標的化された開裂部位との相同性の領域が隣接する全長遺伝子またはその断片を含む。一部の実施形態では、ドナーは、相同な領域を欠き、相同性非依存的機構（即ちＮＨＥＪ）によって標的遺伝子座中に組み込まれる。他の実施形態では、ドナーは、細胞における使用のため（即ち、遺伝子補正のため）の相同な領域が隣接する、核酸のより小さい一片を含む。一部の実施形態では、ドナーは、機能的または構造的構成成分、例えば、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡなどをコードする遺伝子を含む。他の実施形態では、ドナーは、目的の遺伝子に結合し、かつ／またはその発現をモジュレートする調節エレメントをコードする遺伝子を含む。

他の態様では、ウイルスおよび／または非ウイルス遺伝子移入方法によってドナーを送達する。好適な実施形態では、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）を介してドナーを細胞に送達する。以下に限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびこれらの組合せを含めた任意のＡＡＶベクターを使用することができる。一部の例では、ＡＡＶは、カプシド血清型と比較して異種血清型であるＬＴＲ（例えば、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、またはＡＡＶ８カプシドを有するＡＡＶ２ＩＴＲ）を含む。ドナーは、ヌクレアーゼを送達するために使用するものと同じ遺伝子移入系を使用して送達することもでき（同じベクター上に含める）、ヌクレアーゼに対して使用する異なる送達系を使用して送達することもできる。ある特定の実施形態では、ドナーはウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）を使用して送達し、ヌクレアーゼ（複数可）はｍＲＮＡ形態で送達する。

ドナー分子の目的の配列は、プロモーターありまたはなしで、機能的ポリペプチドをコードする１種または複数種の配列（例えば、ｃＤＮＡ）を含み得る。ある特定の実施形態では、核酸配列は、抗体、抗原、酵素、増殖因子、受容体（細胞表面または核）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーター、上記のいずれかの機能的断片、および上記の組合せをコードする配列を含む。機能的ポリペプチドコード配列がプロモーターなしである実施形態では、組み込まれた配列の発現は、次いで、目的の領域中の内因性プロモーターまたは他の制御エレメントによって駆動される転写によって確実にされる。他の実施形態では、「タンデム」カセットが、選択された部位中にこの様式で組み込まれ、カセットの第１の構成成分は、上記のようにプロモーターなし配列を含み、その後転写終結配列、および自律的発現カセットをコードする第２の配列が続く。２Ａペプチド、ＳＡ部位、ＩＲＥＳ等をコードする配列が含まれるがこれらに限定されないさらなる配列（コード配列または非コード配列）が、相同性アーム間で、ドナー分子中に含まれ得る。

別の態様では、相同性非依存的機構によって細胞のゲノム中にドナー核酸を組み込む方法が、本明細書に記載される。これらの方法は、細胞のゲノム中に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じるステップと、ヌクレアーゼを使用してドナー分子を開裂させるステップとを含み、その結果、ドナー核酸は、ＤＳＢの部位において組み込まれる。ある特定の実施形態では、ドナー核酸は、相同性非依存的方法（例えば、ＮＨＥＪ）によって組み込まれる。上述のように、ｉｎｖｉｖｏ開裂の際に、これらのドナー配列は、ＤＳＢの位置において、細胞のゲノム中に標的化された様式で組み込まれ得る。ドナー配列は、ＤＳＢを生じさせるために使用される１種または複数種のヌクレアーゼと同じ１つまたは複数の標的部位を含み得る。したがって、ドナー配列は、組込みが望まれる内因性遺伝子を開裂させるために使用されるのと同じ１種または複数種のヌクレアーゼによって開裂され得る。ある特定の実施形態では、ドナー配列は、ＤＳＢを誘導するために使用されるヌクレアーゼとは異なるヌクレアーゼ標的部位を含む。標的細胞のゲノム中のＤＳＢは、任意の機構によって生じ得る。ある特定の実施形態では、ＤＳＢは、１種または複数種のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、目的の領域内の配列に結合するように遺伝子操作されたジンクフィンガー結合ドメインを含む融合タンパク質、および開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインによって生じる。他の実施形態では、ＤＳＢは、ヌクレアーゼドメインに融合された１つまたは複数のＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン（天然起源または非天然起源）（ＴＡＬＥＮ）によって生じる。なおさらなる実施形態では、ＤＳＢは、遺伝子操作された単一ガイドＲＮＡまたはその機能的相当部分がゲノム中の標的化された部位にこのヌクレアーゼをガイドするために必要に応じて使用される、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴｔＡｇｏヌクレアーゼ系を使用して生じる。

他の態様では、ヌクレアーゼ（複数可）は、哺乳動物細胞においてセーフハーバー遺伝子、例えば、ＣＣＲ５遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても公知である）遺伝子、Ｒｏｓａ遺伝子もしくはアルブミン遺伝子に結合し、かつ／またはそれを開裂する。さらに、哺乳動物系における選択を補助するために、ＨＰＲＴ遺伝子座を使用することができる。

一態様では、ドナーは、目的の遺伝子に結合しおよび／またはその発現をモジュレートする、目的の調節タンパク質（例えば、ＺＦＰＴＦ、ＴＡＬＥＴＦまたはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＴＦ）である。一実施形態では、調節タンパク質は、ＤＮＡ配列に結合し、他の調節因子の結合を防止する。別の実施形態では、調節タンパク質の結合は、標的ＤＮＡの発現をモジュレート（即ち、誘導または抑制）し得る。

他の態様では、本明細書に記載されているように、例えば、遺伝子改変を導入するためにヌクレアーゼを使用して遺伝子改変された（例えば、トランスジェニック）細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、細胞は、本明細書に記載の方法によって作製される。ある特定の実施形態では、細胞は、ＣＣＲ５、ＡＡＶＳ１、ＡＬＢ、Ｒｏｓａ２６および／またはＨＰＲＴなどのセーフハーバー遺伝子座に組み込まれた導入遺伝子を含む。組み込まれた導入遺伝子を含む細胞は、内因性プロモーターから導入遺伝子を発現し得る、あるいは、導入遺伝子は、導入遺伝子の発現を駆動する外因性プロモーターなどの調節エレメントおよび制御エレメントを含み得る（例えば、セーフハーバー遺伝子座に組み込まれている場合）。ある特定の実施形態では、導入遺伝子を含む細胞では、ゲノム中に組み込まれたウイルスベクター配列を全く含まない。細胞は、任意の真核生物細胞、例えば、ＣＤ３４＋幹細胞（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）もしくは他の動員剤投与を介して患者において骨髄から末梢血中に動員されたまたは骨髄もしくは臍帯から直接採取した患者由来幹細胞）であり得る。任意の適切な方法によって細胞を採取し、精製し、培養し、ヌクレアーゼおよび／またはドナーを細胞中に導入することができる。

本明細書に記載されている遺伝子改変された細胞を含む医薬組成物などの組成物も提供される。一部の実施形態では、組成物は、ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＰＣまたはＨＳＣ／ＰＣ細胞集団を含む。他の実施形態では、組成物は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）を含む。さらに別の実施形態では、Ｔ細胞組成物は、ＣＤ４＋細胞のみを含む、またはＣＤ８＋細胞のみを含む。

別の態様では、本明細書に記載されるとおりの遺伝子改変された細胞を使用する方法が提供される。ある特定の実施形態では、遺伝子改変された血液細胞前駆体（「ＨＳＣ／ＰＣ」）が、骨髄移植において与えられ、これらのＨＳＣ／ＰＣは、ｉｎｖｉｖｏで分化および成熟する。一部の実施形態では、これらのＨＳＣ／ＰＣは、Ｇ−ＣＳＦ誘導された動員の後に単離され、他の実施形態では、これらの細胞は、ヒト骨髄または臍帯から単離される。一部の態様では、これらのＨＳＣ／ＰＣは、特定の遺伝子または調節配列をノックアウトするように設計されたヌクレアーゼによる処理によって編集される。他の態様では、これらのＨＳＣ／ＰＣは、野生型遺伝子もしくは他の目的の遺伝子が挿入および発現され、ならびに／または内因性の異常な遺伝子が補正されるように、遺伝子操作されたヌクレアーゼとドナー核酸とで改変される。一部の実施形態では、これらの改変されたＨＳＣ／ＰＣは、穏やかな骨髄破壊的前処理の後に患者に投与される。他の態様では、移植後に、造血細胞の１００％が改変されたＨＳＣ／ＰＣに由来するように、これらのＨＳＣ／ＰＣは、完全な骨髄破壊後に投与される。さらに、細胞は、細胞周期のＧ２期において停止され得る。

一部の実施形態では、トランスジェニックのＨＳＣ／ＰＣ細胞および／または動物は、ヒト遺伝子をコードする導入遺伝子を含む。一部の例では、トランスジェニック動物は、外因性導入遺伝子に対応する内因性遺伝子座においてノックアウトを含み、それによって、ヒトタンパク質が単離状態で研究され得るｉｎｖｉｖｏ系の開発を可能にする。かかるトランスジェニックモデルは、小分子もしくは大きい生体分子または目的のヒトタンパク質と相互作用し得るもしくは目的のヒトタンパク質を改変し得る他の実体を同定するために、スクリーニング目的で使用され得る。一部の態様では、導入遺伝子は、本明細書に記載される方法のいずれかによって得られた幹細胞（例えば、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、造血幹細胞または前駆細胞等）または動物胚中に、選択された遺伝子座（例えば、セーフハーバー）中に組み込まれ、次いで、胚は、生きた動物が出生するように移植される。次いで、動物は、性的成熟になるまで育てられ、子孫を生じるようになり、ここで、子孫の少なくとも一部は、編集された内因性遺伝子配列または組み込まれた導入遺伝子を含む。

本発明のＡＡＶおよび核酸を含むキットもまた提供される。キットは、ヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ分子、または適切な発現ベクター中に含有されるＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系コード遺伝子）、またはヌクレアーゼタンパク質のアリコート、ドナー分子、適切な幹細胞性改変因子（stemness modifier）、本発明の方法を実施するための指示書などを含み得る。これらのキットは、選択マーカーまたはスクリーニングマーカー等の目的のドナー分子もまた含み得る。

これらおよび他の態様は、全体としての開示を踏まえて、当業者に容易に明らかである。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
単離された細胞のゲノム中に１種または複数種の導入遺伝子を組み込む方法であって、（ａ）該１種または複数種の導入遺伝子を含むドナーベクター、および（ｂ）少なくとも１種のヌクレアーゼを該細胞中に導入するステップを含み、ここで、該少なくとも１種のヌクレアーゼにより該細胞の該ゲノムが開裂され、したがって、該１種または複数種の導入遺伝子が該細胞の該ゲノム中に組み込まれ、さらに、ここで、
（ｉ）該ドナーベクターを該少なくとも１種のヌクレアーゼよりも前に該細胞中に導入する場合、該少なくとも１種のヌクレアーゼを、ドナーベクターの導入後４８時間以内に該細胞中に導入し、
（ｉｉ）該少なくとも１種のヌクレアーゼを該ドナーベクターよりも前に導入する場合、該ドナーベクターを、該少なくとも１種のヌクレアーゼの導入後４時間以内に該細胞中に導入する、方法。
（項目２）
前記ドナーベクターを前記少なくとも１種のヌクレアーゼよりも前に前記細胞中に導入し、該細胞を、該ドナーベクターを該細胞中に導入した後１時間〜２４時間にわたって培養する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞が造血幹細胞またはＴ細胞である、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ドナーベクターがＡＡＶベクターである、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ６を含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
少なくとも１種のヌクレアーゼを前記細胞中にｍＲＮＡとして導入する、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記少なくとも１種のヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記ヌクレアーゼが、セーフハーバー遺伝子を開裂する、項目１〜７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記セーフハーバー遺伝子が、ＣＣＲ５遺伝子、ＡＡＶＳ１遺伝子、Ｒｏｓａ遺伝子およびアルブミン遺伝子からなる群から選択される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記導入遺伝子が治療タンパク質をコードする、項目１〜９のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
項目１〜１０のいずれかに記載の方法によって作製された細胞。
（項目１２）
１種または複数種のタンパク質の提供が必要な被験体に１種または複数種のタンパク質を提供する方法であって、
項目１〜１１のいずれかに記載の方法に従って、単離された細胞中に該１種または複数種のタンパク質をコードする１種または複数種の導入遺伝子を導入するステップと、
該細胞を該被験体に導入し、したがって、該１種または複数種のタンパク質が該被験体に提供されるステップと
を含む方法。
（項目１３）
項目１１に記載の細胞を含む医薬組成物。

図１のパネルＡおよびＢは、ＺＦＮ−ＡＡＶで改変されたＣＤ３４＋細胞におけるＧＦＰ発現を示す。図１Ａは、ＣＭＶにより駆動されるｅＧＦＰ導入遺伝子を含有する、示されているＡＡＶベクターを用いて形質導入した、動員された末梢血ＣＤ３４＋細胞（ｍＰＢＣＤ３４＋）におけるＧＦＰ発現を示す。図１Ａに示されているデータは、形質導入の２日後の細胞からのデータである。次いで、感染の２日後および５日後（ｄｐｉ）に細胞を収集し、フローサイトメーター（Ｇｕａｖａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して分析した。図１Ｂは、各集団におけるＧＦＰ陽性である細胞のパーセントを示す。

図２のパネルＡ〜Ｃは、ＣＤ３４＋細胞へのＺＦＮ媒介性ＡＡＶドナー挿入を示す。図２Ａは、この試験で使用したＡＡＶ６−Ｒ５−１６０−ＸｈｏＩドナー構築物の略図を示す。これらの試験で使用したＡＡＶ６は、ＡＡＶ２ＩＴＲおよびＡＡＶ６カプシドを含む偽型ウイルスであった（即ち、「ＡＡＶ２／６」）。ＡＡＶ２の左のＩＴＲ（Ｌ−ＩＴＲ）と右のＩＴＲ（Ｒ−ＩＴＲ）の間にドナーＤＮＡを構築し、そこでＣＣＲ５特異的ＺＦＮ結合部位の間にＸｈｏＩ部位を導入する。ＣＣＲ５の左アームおよび右アームは、ＣＣＲ５ＺＦＮ結合部位に隣接するＣＣＲ５遺伝子座のゲノム配列に由来する配列を示す。第２のＸｈｏＩ部位（図２Ａにおいて、ＣＣＲ５の左の相同性アームの左側に）は、相同性アームの外側にあるのでドナー組込み後に組み込まれない。図２Ｂおよび図２Ｃは、ＡＡＶ６−Ｒ５−１６０−ＸｈｏＩドナーを３００〜１×１０^５ｖｇ／細胞の間の用量で用いて形質導入し、その後、形質導入の２４時間後にＣＣＲ５特異的ＺＦＮｍＲＮＡ（１２０μｇ／ｍｌ）をＢＴＸＥＣＭ８３０（ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ）を使用したエレクトロポレーションによって導入したＣＤ３４＋細胞を示す。細胞を５ｄｐｉの時点でゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）精製のために収集し、その後の図２Ｂに示されているＲＦＬＰアッセイおよび図２Ｃに示されているＩｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングのために処理した。図２Ｂに野生型（消化されなかったＤＮＡ）およびＲＦＬＰバンドが矢印で示され、同様に、検出されたＲＦＬＰのパーセントが示されている。図２Ｃは、Ｉｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングによって見出されたゲノム改変またはインデルのパーセントを示すグラフである。

図３のパネルＡおよびＢは、ヌクレアーゼ投与とドナー投与のタイミングおよび順序に応じたヌクレアーゼ改変を示すグラフである。ＡＡＶ６−Ｒ５−１６０−ＸｈｏＩドナーを、ＢＴＸＥＣＭ８３０（ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ）を使用したＣＤ３４＋細胞へのＣＣＲ５特異的ＺＦＮｍＲＮＡのエレクトロポレーション（ＥＰ）の最大４８時間前（−４８時間）〜２０時間後（＋２０時間）に導入した（図３Ａの−４８時間〜−６時間および図３Ｂの−２０時間〜＋２０時間）。後で細胞をゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）精製のために収集し、その後のＩｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングのために処理した。図３Ａおよび図３Ｂはどちらも、Ｉｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングによって検出されたゲノム改変の量：挿入もしくは欠失（「インデル」）、または示されている時点においてドナー分子によってもたらされるＲＦＬＰの標的化された組込み（ＴＩ）のいずれかを示すグラフである。

図４のパネルＡ〜Ｄは、ＺＦＮおよびＡＡＶドナーによって改変されたＣＤ３４＋の結果を示す。図４Ａは、この試験において使用したＲ５−ｐｇｋ−ＧＦＰ−ｐＡドナー構築物の略図を示す。ドナーＤＮＡをＡＡＶ２のＬ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲの間に構築し、ここで、ＰＧＫプロモーターにより駆動されるｅＧＦＰ発現カセット（１．６ｋｂ）をＣＣＲ５ＺＦＮ結合部位の間に挿入した。ＣＣＲ５の左アームおよび右アームは、ＣＣＲ５ＺＦＮ結合部位に隣接するＣＣＲ５遺伝子座のゲノム配列に由来する配列を示す。図４ＢはＡＡＶ６−Ｒ５−ｐｇｋ−ＧＦＰ−ｐＡドナーを３００〜３×１０^３ｖｇ／細胞の間の用量で用いて形質導入したＣＤ３４＋細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。２４時間後、ＣＣＲ５特異的ＺＦＮｍＲＮＡ（１２０μｇ／ｍｌ）を、形質導入された細胞中に、ＢＴＸＥＣＭ８３０（ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ）を使用したエレクトロポレーションによって導入した。１５ｄｐｉの時点で細胞をフローサイトメトリー分析のために収集した。グラフの左下の四分の一区内の数は、生細胞集団（ＰＩ−）内に存在するｅＧＦＰ＋細胞の百分率を示す。図４Ｃは、半定量的「Ｉｎ−Ｏｕｔ」ＰＣＲアッセイを使用したＣＣＲ５遺伝子座中へのＧＦＰカセットの標的化された組込みの検出を示すゲルを示す。標準対照のセットを、改変されていない野生型ゲノムＤＮＡを用いた、ＣＣＲ５遺伝子座におけるＧＦＰ導入遺伝子組込みの頻度が分かっている（サザンブロットにより決定される）ゲノムＤＮＡプールの段階希釈によって調製した。等量のゲノムＤＮＡならびにポリＡ領域（ｅＧＦＰカセット内に存在する）内に存在するプライマーおよびＺＦＮ標的部位の３’側のＣＣＲ５相同アーム領域の外側に位置するプライマーを使用してＰＣＲを実施した。図４Ｄは、プライマー対の両方のプライマーが標的部位の５’側になり、そのうちの１つがＣＣＲ５相同な領域の外側に位置するように１つの追加的なプライマー対を利用したＰＣＲ反応の第２のセットを使用した結果を示すゲルを示す。この第２の対を図２Ｃのものと同じＰＣＲ反応に含め、したがって、２つのプライマー対が存在した。第２のプライマー対をゲノムＤＮＡインプットの測定値（measurement）として使用した。ＧＦＰ−ＴＩ特異的ＰＣＲ産物およびＴＩ非特異的ＰＣＲ産物（全体）が矢印によって示されている。図４のパネルＡ〜Ｄは、ＺＦＮおよびＡＡＶドナーによって改変されたＣＤ３４＋の結果を示す。図４Ａは、この試験において使用したＲ５−ｐｇｋ−ＧＦＰ−ｐＡドナー構築物の略図を示す。ドナーＤＮＡをＡＡＶ２のＬ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲの間に構築し、ここで、ＰＧＫプロモーターにより駆動されるｅＧＦＰ発現カセット（１．６ｋｂ）をＣＣＲ５ＺＦＮ結合部位の間に挿入した。ＣＣＲ５の左アームおよび右アームは、ＣＣＲ５ＺＦＮ結合部位に隣接するＣＣＲ５遺伝子座のゲノム配列に由来する配列を示す。図４ＢはＡＡＶ６−Ｒ５−ｐｇｋ−ＧＦＰ−ｐＡドナーを３００〜３×１０^３ｖｇ／細胞の間の用量で用いて形質導入したＣＤ３４＋細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。２４時間後、ＣＣＲ５特異的ＺＦＮｍＲＮＡ（１２０μｇ／ｍｌ）を、形質導入された細胞中に、ＢＴＸＥＣＭ８３０（ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ）を使用したエレクトロポレーションによって導入した。１５ｄｐｉの時点で細胞をフローサイトメトリー分析のために収集した。グラフの左下の四分の一区内の数は、生細胞集団（ＰＩ−）内に存在するｅＧＦＰ＋細胞の百分率を示す。図４Ｃは、半定量的「Ｉｎ−Ｏｕｔ」ＰＣＲアッセイを使用したＣＣＲ５遺伝子座中へのＧＦＰカセットの標的化された組込みの検出を示すゲルを示す。標準対照のセットを、改変されていない野生型ゲノムＤＮＡを用いた、ＣＣＲ５遺伝子座におけるＧＦＰ導入遺伝子組込みの頻度が分かっている（サザンブロットにより決定される）ゲノムＤＮＡプールの段階希釈によって調製した。等量のゲノムＤＮＡならびにポリＡ領域（ｅＧＦＰカセット内に存在する）内に存在するプライマーおよびＺＦＮ標的部位の３’側のＣＣＲ５相同アーム領域の外側に位置するプライマーを使用してＰＣＲを実施した。図４Ｄは、プライマー対の両方のプライマーが標的部位の５’側になり、そのうちの１つがＣＣＲ５相同な領域の外側に位置するように１つの追加的なプライマー対を利用したＰＣＲ反応の第２のセットを使用した結果を示すゲルを示す。この第２の対を図２Ｃのものと同じＰＣＲ反応に含め、したがって、２つのプライマー対が存在した。第２のプライマー対をゲノムＤＮＡインプットの測定値（measurement）として使用した。ＧＦＰ−ＴＩ特異的ＰＣＲ産物およびＴＩ非特異的ＰＣＲ産物（全体）が矢印によって示されている。

図５のパネルＡおよびＢは、ＣＤ３４＋細胞のＺＦＮ−ＡＡＶ改変を示す。図５Ａは、この試験において使用したＡＡＶＳ１−ＨｉｎｄＩＩＩドナーの略図を示す。ドナーＤＮＡをＡＡＶ２のＬ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲの間に挿入し、ここで、ＨｉｎｄＩＩＩ部位をＡＡＶＳ１特異的ＺＦＮ対の結合部位間に導入した。ＡＡＶＳ１の左アームおよび右アームは、ＡＡＶＳ１ＺＦＮ結合部位に隣接するＡＡＶＳ１遺伝子座のゲノム配列に由来する相同性アーム配列を示す。図５Ｂは、ＡＡＶ６−ＡＡＶＳ１−ＨｉｎｄＩＩＩドナーを１０００ｖｇ／ｍｌまたは３０００ｖｇ／ｍｌで用いて形質導入したＣＤ３４＋細胞のグラフを示す。２４時間後、ＡＡＶＳ１ＺＦＮｍＲＮＡ（４０μｇ／ｍｌ）を、形質導入された細胞中に、ＢＴＸＥＣＭ８３０（ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ）を使用したエレクトロポレーションによって導入した。５ｄｐｉの時点で細胞をゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）精製のために収集し、その後のＩｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングのために処理した。グラフは、インデル形成または標的化された組込みのいずれかによって測定されたゲノム改変の量を示す。

図６は、示されているＴＡＬＥＮ対を用いたＣＤ３４＋細胞のＣＣＲ５改変を示すグラフである。グラフは、Ｉｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングによって検出されたゲノム改変の量：挿入もしくは欠失（「インデル」）、またはドナー分子によってもたらされるＲＦＬＰの標的化された組込み（ＴＩ）のいずれかを示す。

図７のパネルＡおよびＢは、示されているヌクレアーゼを使用した、ＡＡＶ６ドナーによってもたらされるＲＦＬＰ（ＨｉｎｄＩＩＩ部位）のＡＡＶＳ１遺伝子座へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性の標的化された組込みを示すグラフである。同じＡＡＶＳ１領域（開裂部位は２５ｂｐ未満離れている）をＡＡＶＳ１ＺＦＮ対（３００５４：３００３５）ならびにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬（「Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ−Ｔ１」および「Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ−Ｔ２」）によって標的化する。「Ｔ−１」および「Ｔ−２」は異なるガイドＲＮＡを示す。図７Ａは、示されている条件下での標的化された組込み（「ＴＩ」）と挿入／欠失（「インデル」）の両方についてのゲノム改変の百分率を示す。図７Ｂは、示されている条件下での標的化された組込みの百分率（「％ＴＩ」）を示す。

図８のパネルＡおよびＢは、ＣＤ４＋初代Ｔ細胞へのヌクレアーゼ媒介性組込みの結果を示す。図８Ａは、示されている条件下での、ＣＣＲ５特異的ＺＦＮおよびＡＡＶ２、ＡＡＶ６またはＩＤＬＶを含むドナーの導入後の、標的化された組込み（「ＴＩ」）と挿入／欠失（「インデル」）の両方についての、ＣＣＲ５のゲノム改変の百分率を示す。図８Ｂは、示されている条件下での、ＡＡＶＳ１ヌクレアーゼおよびＡＡＶ６ドナーの導入後のＡＡＶＳ１のゲノム改変、標的化された組込み（「ＴＩ」）と挿入／欠失（「インデル」）の両方の百分率を示す。これらの条件下で、ＡＡＶ６ドナーを使用すると、ＡＡＶ２またはＩＤＬＶドナーと比較してＴＩの増加が観察される。

図９のパネルＡおよびＢは、ＣＤ８＋初代Ｔ細胞へのヌクレアーゼ媒介性組込みの結果を示す。図９Ａは、示されている条件下での、ＣＣＲ５特異的ＺＦＮおよびＡＡＶ２、ＡＡＶ６またはＩＤＬＶを含むドナーの導入後の、標的化された組込み（「ＴＩ」）と挿入／欠失（「インデル」）の両方についての、ＣＣＲ５のゲノム改変の百分率を示す。図９Ｂは、示されている条件下での、ＡＡＶＳ１ヌクレアーゼおよびＡＡＶ６ドナーの導入後の、標的化された組込み（「ＴＩ」）と挿入／欠失（「インデル」）の両方についての、ＡＡＶＳ１のゲノム改変の百分率を示す。これらの条件下で、ＡＡＶ６ドナーを使用すると、ＡＡＶ２またはＩＤＬＶドナーと比較してＴＩの増加が観察される。

詳細な説明
遺伝子療法またはゲノム遺伝子操作における使用のための細胞の形質導入のための組成物および方法が本明細書に開示されている。特に、標的化された開裂、その後の非相同末端結合による外因性配列またはゲノム変更のヌクレアーゼ媒介性の（即ち、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）標的化された組込みが細胞において効率的に実現される。当該方法および組成物は、ＨＳＣ／ＰＣおよびＴ細胞の形質導入および遺伝子操作のために特に有用であるが、他の細胞型ためにも使用することができる。

ＺＦＮおよびドナー鋳型ＤＮＡの送達は詳細の通り最適化されており、細胞型は、ＣＤ３４＋細胞を含めた任意の造血幹細胞または前駆体細胞を含む。ＣＤ３４＋細胞は、原始的（ＣＤ１３３＋ＣＤ９０＋、またはＣＤ９０−）、初期（ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋）およびコミットした（ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−）のＣＤ３４＋サブセットならびにＴ細胞を含み得る。本明細書に記載の方法により、改変された細胞を用いて処置した動物における長期間にわたる多系譜の生着がもたらされる。

概要
本明細書に開示される方法、ならびに組成物の調製および使用の実施は、特に示さない限り、本技術分野の技術範囲内の、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算機化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９８９年および第３版、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８７年および定期的更新；シリーズＭＥＴＨＯＤＳＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ、ＣＨＲＯＭＡＴＩＮＳＴＲＵＣＴＵＲＥＡＮＤＦＵＮＣＴＩＯＮ、第３版、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、１９９８年；ＭＥＴＨＯＤＳＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、３０４巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ．ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ編）、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、１９９９年；ならびにＭＥＴＨＯＤＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ、１１９巻、「ＣｈｒｏｍａｔｉｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ編）ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、１９９９年を参照されたい。

定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、相互交換可能に使用され、直鎖状または環状コンフォメーションの、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。本開示の目的のため、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈すべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対合特異性を有する；即ち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対合する。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、相互交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１または複数のアミノ酸が、対応する天然起源のアミノ酸の化学的アナログまたは修飾された誘導体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。

「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有結合相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全ての構成成分が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基と接触する）必要はない。かかる相互作用は一般に、１０^−６Ｍ^−１またはそれ未満の解離定数（Ｋ_ｄ）を特徴とする。「親和性」とは、結合の強度を指す：増加した結合親和性は、より低いＫ_ｄと相関する。

「結合タンパク質」は、別の分子と結合できるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合できる。タンパク質結合タンパク質の場合、これは、それ自体と結合でき（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成する）および／または異なるタンパク質（単数もしくは複数）の１もしくは複数の分子に結合できる。結合タンパク質は、１つよりも多い型の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性およびタンパク質結合活性を有する。

「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインであり、その構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１または複数のジンクフィンガーを介して配列特異的様式でＤＮＡに結合する。用語、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。

「ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１または複数のＴＡＬＥリピートドメイン／単位を含むポリペプチドである。これらのリピートドメインは、その同族標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関与する。単一の「リピート単位」（「リピート」とも呼ぶ）は、典型的には、３３〜３５アミノ酸長であり、天然起源のＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥリピート配列と少なくともいくらかの配列相同性を示す。

ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然起源のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の遺伝子操作（１または複数のアミノ酸を変更する）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「遺伝子操作され」得る。したがって、遺伝子操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、非天然起源のタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を遺伝子操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が合理的基準から主に生じる、天然起源でないタンパク質である。設計のための合理的基準には、置換ルールの適用、ならびに既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥの設計および結合データの情報を記憶するデータベース中の情報を処理するためのコンピューターアルゴリズムが含まれる。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、同第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；および同第６，５３４，２６１号を参照されたい；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６もまた参照されたい。

「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生がファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などの実験過程から主に生じる、天然には見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；同第５，７８９，５３８号；ＵＳ第５，９２５，５２３号；ＵＳ第６，００７，９８８号；ＵＳ第６，０１３，４５３号；ＵＳ第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０ＷＯ０１／８８１９７、ＷＯ０２／０９９０８４を参照されたい。

「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられる原核生物アルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する。（例えば、Swartsら、同書、G. Shengら、（２０１３年）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. １１１巻、６５２頁を参照されたい）。「ＴｔＡｇｏ系」は、例えば、ＴｔＡｇｏ酵素による開裂のためのガイドＤＮＡを含めた、必要な構成成分の全てである。

「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の過程を指し、限定するものではないが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組み換えによるドナー捕捉を含む。本開示の目的のため、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同性指向性の修復機構を介した細胞における二本鎖切断の修復の間に行われる、かかる交換の特殊化された形態を指す。この過程は、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、「標的」分子（即ち、二本鎖切断を経験したもの）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移入をもたらすので、「非乗換え遺伝子変換」または「ショートトラクト（ｓｈｏｒｔｔｒａｃｔ）遺伝子変換」として様々に公知である。いかなる特定の理論に制約されることも望まないが、かかる移入は、切断された標的とドナーとの間に形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／もしくは標的の一部となる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存的鎖アニーリング」、ならびに／または関連する過程に関与し得る。かかる特殊化されたＨＲは、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチド中に取り込まれるように、標的分子の配列の変更をもたらす。

本開示の方法では、本明細書に記載される１または複数の標的化されたヌクレアーゼは、所定の部位において標的配列（例えば、細胞クロマチン）中に二本鎖切断を生じ、切断の領域中のヌクレオチド配列に対する相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドが、細胞中に導入され得る。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の組込みを容易にすることが示されている。このドナー配列は、物理的に組み込まれ得、またはあるいは、このドナーポリヌクレオチドは、相同組換えによる切断の修復のための鋳型として使用されて、細胞クロマチン中への、ドナーと同様のヌクレオチド配列の全てまたは一部の導入を生じる。したがって、細胞クロマチン中の第１の配列は、変更され得、ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド中に存在する配列へと変換され得る。したがって、用語「置き換える」または「置き換え」の使用は、別のヌクレオチド配列による１つのヌクレオチド配列の置き換え（即ち、情報的な意味での配列の置き換え）を示すと理解され得、別のポリヌクレオチドによる１つのポリヌクレオチドの物理的または化学的置き換えを必ずしも必要としない。

本明細書に記載される方法のいずれかでは、さらなるジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥＮの対が、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖開裂に使用され得る。

本明細書に記載される方法のいずれかは、任意のサイズのドナーの挿入、および／または目的の遺伝子（複数可）の発現を破壊するドナー配列の標的化された組込みによる細胞中の１種もしくは複数種の標的配列の部分的もしくは完全な不活性化に使用され得る。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞株もまた提供される。

さらに、本明細書に記載される標的化された組込みの方法は、１種または複数種の外因性配列を組み込むためにも使用され得る。外因性核酸配列は、例えば、１種もしくは複数種の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の型のコード配列もしくは非コード配列、および１種もしくは複数種の制御エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。さらに、この外因性核酸配列は、１種または複数種のＲＮＡ分子（例えば、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害的ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等）を産生し得る。

細胞クロマチン中の目的の領域中の配列の標的化された組換えおよび／または置き換えおよび／または変更のための方法のある特定の実施形態では、染色体配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列との相同組換えによって変更される。かかる相同組換えは、切断の領域と相同な配列が存在する場合に、細胞クロマチン中の二本鎖切断の存在によって刺激される。

本明細書に記載される方法のいずれかでは、外因性ヌクレオチド配列（「ドナー配列」または「導入遺伝子」）は、目的の領域中のゲノム配列と相同ではあるが同一ではない配列を含み得、それによって、目的の領域において非同一配列を挿入するように相同組換えを刺激する。したがって、ある特定の実施形態では、目的の領域中の配列と相同なドナー配列の一部分は、置き換えられるゲノム配列に対して、約８０〜９９％の間（またはそれらの間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、ドナー配列とゲノム配列との間の相同性は、例えば、１ヌクレオチドのみが１００個を超える連続する塩基対のドナー配列とゲノム配列との間で異なる場合、９９％よりも高い。ある特定の場合、ドナー配列の非相同部分は、新たな配列が目的の領域中に導入されるように、目的の領域中に存在しない配列を含み得る。これらの例では、非相同配列には、一般に、目的の領域中の配列と相同または同一な、５０〜１，０００塩基対（またはそれらの間の任意の整数値）または１，０００よりも大きい任意の数の塩基対の配列が隣接する。他の実施形態では、このドナー配列は、第一の配列とは非相同であり、非相同組換え機構によってゲノム中に挿入される。

「開裂」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を指す。開裂は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解が含まれるがこれらに限定されない種々の方法によって開始され得る。一本鎖開裂および二本鎖開裂の両方が可能であり、二本鎖開裂は、２つの個別の一本鎖開裂事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ開裂は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生を生じ得る。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドが、標的化された二本鎖ＤＮＡ開裂に使用される。

「開裂ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なるのいずれか）と協同して、開裂活性（好ましくは二本鎖開裂活性）を有する複合体を形成する、ポリペプチド配列である。用語「第１および第２の開裂ハーフドメイン」；「＋および−の開裂ハーフドメイン」ならびに「右および左の開裂ハーフドメイン」は、相互交換可能に使用されて、二量体形成する開裂ハーフドメインの対を指す。

「遺伝子操作された開裂ハーフドメイン」は、別の開裂ハーフドメイン（例えば、別の遺伝子操作された開裂ハーフドメイン）と偏性ヘテロ二量体を形成するように改変された開裂ハーフドメインである。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７０２１８５２８号、同第２００８／０１３１９６２号および同第２０１１／０２０１０５５号もまた参照されたい。

用語「配列」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得；直鎖状、環状または分枝状であり得、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。用語「ドナー配列」とは、ゲノム中に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２ヌクレオチド長と１００，０００，０００ヌクレオチド長との間（またはそれらの間もしくはそれらを上回る任意の整数値）、好ましくは約１００ヌクレオチド長と１００，０００ヌクレオチド長との間（またはそれらの間の任意の整数）、より好ましくは約１００ヌクレオチド長と５，０００ヌクレオチド長との間（またはそれらの間の任意の値）、およびさらにより好ましくは、約１００塩基対と２，０００塩基対との間（またはそれらの間の任意の値）のものであり得る。

「相同非同一配列」は、第２の配列とある程度の配列同一性を共有するが、その配列が第２の配列と同一ではない第１の配列を指す。例えば、変異体遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、変異体遺伝子の配列と相同かつ非同一である。ある特定の実施形態において、２種の配列の間の相同性の程度は、正常な細胞機序を利用して、その間の相同組換えを可能にするために十分なものである。２種の相同非同一配列は、いかなる長さであってもよく、それらの非相同性の程度は、単一のヌクレオチドほどに小さくても（例えば、標的化相同組換えによるゲノム点変異の補正のため）、１０キロベースまたはそれを超えるほどに大きくてもよい（例えば、染色体の所定の異所性部位における遺伝子の挿入のため）。相同非同一配列を含む２種のポリヌクレオチドは、同じ長さである必要はない。例えば、２０〜１０，０００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対の間の外因性ポリヌクレオチド（即ち、ドナーポリヌクレオチド）を使用することができる。

核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための技法は、本技術分野において公知である。典型的には、かかる技法は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列の決定および／またはそれにコードされるアミノ酸配列の決定、ならびに第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列とのこのような配列の比較を含む。この様式でゲノム配列を決定および比較することもできる。一般に、同一性は、それぞれ２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、正確なヌクレオチド−対−ヌクレオチドまたはアミノ酸−対−アミノ酸の一致を指す。２種またはそれを超える配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらのパーセント同一性を決定することにより比較することができる。典型的には、配列間のパーセント同一性は、少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、さらにより好ましくは９２％、なおより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％配列同一性である。

あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度は、相同領域間に安定的二重鎖の形成を可能にする条件下におけるポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションと、続く一本鎖特異的ヌクレアーゼ（複数可）による消化および消化した断片のサイズ決定により決定することができる。当該分野で公知の方法を使用して決定される通り、配列が、定義される長さの分子にわたり少なくとも約７０％〜７５％、好ましくは８０％〜８２％、より好ましくは８５％〜９０％、さらにより好ましくは９２％、なおより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性を提示する場合、２種の核酸または２種のポリペプチド配列は、互いに実質的に相同である。ハイブリダイゼーションの条件は、当業者に周知のものである。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション条件が、ミスマッチしたヌクレオチドを含有するハイブリッドの形成を嫌う程度を指し、より高いストリンジェンシーは、ミスマッチしたハイブリッドに対するより低い耐容能と相関する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える因子は、当業者に周知のものであり、その例として、温度、ｐＨ、イオン強度ならびに例えば、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシド等の有機溶媒の濃度が挙げられるがこれらに限定されない。当業者に公知の通り、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、より高い温度、より低いイオン強度およびより低い溶媒濃度により増加する。

「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核生物細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、各々２つのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を含む八量体と会合したおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含む：リンカーＤＮＡ（生物に依存して変動する長さのもの）が、ヌクレオソームコア間に延びる。１分子のヒストンＨ１が、一般に、リンカーＤＮＡと会合する。本開示の目的のため、用語「クロマチン」は、原核生物および真核生物の両方の、全ての型の細胞核タンパク質を包含することを意味する。細胞クロマチンには、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方が含まれる。

「染色体」は、細胞のゲノムの全てまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、細胞のゲノムを構成する全ての染色体のコレクションであるその核型によって特徴付けられる。細胞のゲノムは、１または複数の染色体を含み得る。

「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む、複製性の核酸、核タンパク質複合体または他の構造である。エピソームの例には、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが含まれる。

「到達できる領域」は、核酸に存在する標的部位が、該標的部位を認識する外因性分子に結合され得る、細胞クロマチンにおける部位である。いかなる特定の理論に制約されることも望まないが、到達できる領域が、ヌクレオソーム構造へとパッケージされない領域であることが考えられる。到達できる領域の明確な構造は、多くの場合、化学的および酵素的プローブ、例えば、ヌクレアーゼに対するその感受性により検出することができる。

「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在する場合に、結合分子が結合する核酸の一部分を規定する核酸配列である。

「外因性」分子は、細胞中に通常は存在しない分子であるが、１または複数の遺伝学的方法、生化学的方法または他の方法によって細胞中に導入され得る。「細胞中での通常の存在」は、特定の発生段階または細胞の環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成人筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に、ヒートショックによって誘導される分子は、ヒートショックされていない細胞に関して、外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能障害性内因性分子の機能性バージョン、または正常に機能する内因性分子の機能障害性バージョンを含み得る。

外因性分子は、とりわけ、例えば、コンビナトリアルケミストリー過程によって生成されるような小分子、または巨大分子、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾された誘導体、あるいは上記分子のうちの１または複数を含む任意の複合体であり得る。核酸には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、一本鎖または二本鎖であり得；直鎖状、分枝状または環状であり得；任意の長さのものであり得る。核酸には、二重鎖を形成することが可能な核酸、ならびに三重鎖形成性核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが含まれるがこれらに限定されない。

外因性分子は、内因性分子と同じ型の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、細胞中に導入された感染性ウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、または細胞中に通常は存在しない染色体を含み得る。細胞中への外因性分子の導入のための方法は、当業者に公知であり、脂質媒介性移入（即ち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接的注射、細胞融合、微粒子銃、バイオポリマーナノ粒子送達（NittaおよびNumata(2013年)Int J Mol Sci 14巻:1629頁を参照)、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が含まれるがこれらに限定されない。外因性分子はまた、内因性分子と同じ型の分子であり得るが、細胞が由来するのとは異なる種に由来し得る。例えば、ヒト核酸配列は、マウスまたはハムスターに元々由来する細胞株中に導入され得る。

対照的に、「内因性」分子は、特定の発生段階で特定の環境条件下で特定の細胞中に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリアもしくは他のオルガネラのゲノム、または天然起源のエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子には、タンパク質、例えば、転写因子および酵素が含まれ得る。

本明細書で使用する場合、用語「外因性核酸の産物」には、ポリヌクレオチド産物およびポリペプチド産物の両方、例えば、転写産物（ＲＮＡなどのポリヌクレオチド）および翻訳産物（ポリペプチド）が含まれる。

「融合」分子は、２つまたはそれ超のサブユニット分子が、好ましくは共有結合によって連結された分子である。これらのサブユニット分子は、同じ化学型の分子であり得るか、または異なる化学型の分子であり得る。第１の型の融合分子の例には、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインと１または複数の活性化ドメインとの間の融合物）および融合核酸（例えば、上記融合タンパク質をコードする核酸）が含まれるがこれらに限定されない。第２の型の融合分子の例には、三重鎖形成性核酸とポリペプチドとの間の融合物、および副溝結合剤と核酸との間の融合物が含まれるがこれらに限定されない。

細胞における融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達から、または細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達によって生じ得、このポリヌクレオチドは転写され、この転写物は翻訳されて、融合タンパク質を生じる。トランス−スプライシング、ポリペプチド開裂およびポリペプチドライゲーションもまた、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの送達のための方法は、本開示の他の場所に示される。

「遺伝子」には、本開示の目的のために、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（以下を参照）、ならびにかかる調節配列がコード配列および／または転写された配列に隣接してもしなくても、遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域が含まれる。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位ならびに遺伝子座制御領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。

「遺伝子発現」とは、遺伝子中に含まれる情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡまたは任意の他の型のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集などの過程によって修飾されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質もまた含まれる。

遺伝子発現の「モジュレーション」とは、遺伝子の活性における変化を指す。発現のモジュレーションには、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、開裂、変更、不活性化、ランダム変異）が、発現をモジュレートするために使用され得る。遺伝子不活性化とは、本明細書に記載されるＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含まない細胞と比較して、遺伝子発現における任意の低下を指す。したがって、遺伝子不活性化は、部分的または完全であり得る。

「目的の領域」は、外因性分子に結合することが望まれる、細胞クロマチンの任意の領域、例えば、遺伝子または遺伝子内もしくは遺伝子に隣接した非コード配列などである。結合は、標的化されたＤＮＡ開裂および／または標的化された組換えを目的とすることができる。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染性ウイルスゲノム中に存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、例えばリーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの転写された非コード領域内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内に存在し得る。目的の領域は、単一のヌクレオチド対ほどの小ささもしくは最大２，０００ヌクレオチド対の長さ、または任意の整数値のヌクレオチド対であり得る。

「真核生物」細胞には、真菌細胞（例えば酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む動物細胞が含まれるがこれらに限定されない。

「分泌組織」とは、産物を個々の細胞から一般には上皮に由来する一部の型の管腔中に分泌する、動物内の組織である。胃腸管に局在化している分泌組織の例としては、腸、膵臓、および胆嚢を裏打ちする細胞が挙げられる。他の分泌組織としては、肝臓、眼に関連する組織および粘膜、例えば唾液腺、乳腺、前立腺、下垂体および内分泌系の他のメンバーが挙げられる。さらに、分泌組織は、分泌を行うことが可能な組織型の個々の細胞を含む。

用語「作動可能な連結」および「作動可能に連結した（「ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙｌｉｎｋｅｄ」または「ｏｐｅｒａｂｌｙｌｉｎｋｅｄ」）」は、２つまたはそれ超の構成成分（例えば、配列エレメント）の並置に関して相互交換可能に使用され、ここで、これらの構成成分は、両方の構成成分が正常に機能し、他の構成成分のうちの少なくとも１つに対して発揮される機能をこれらの構成成分のうちの少なくとも１つが媒介し得る可能性を許容するように、配置される。例示として、転写調節配列、例えばプロモーターは、転写調節配列が、１または複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、コード配列に作動可能に連結される。転写調節配列は、一般に、コード配列とシスで作動可能に連結されるが、このコード配列に直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、エンハンサーとコード配列とが連続していない場合であっても、コード配列に作動可能に連結した転写調節配列である。

融合ポリペプチドに関して、用語「作動可能に連結した」とは、構成成分の各々が、他の構成成分と連結して、そのように連結されていない場合にそれが果たすのと同じ機能を果たすという事実を指し得る。例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合された融合ポリペプチドに関して、このＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、この融合ポリペプチド中で、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合できるが、活性化ドメインは遺伝子発現を上方調節できる場合に、作動可能な連結状態にある。ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓＤＮＡ結合ドメインが開裂ドメインに融合した融合ポリペプチドの場合、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメインは、この融合ポリペプチド中で、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合できるが、開裂ドメインは標的部位の近位（例えば、標的部位のいずれかの側の１〜５００塩基対またはその間の任意の値）においてＤＮＡを開裂できる場合に、作動可能な連結状態にある。

タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、その全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持する、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応する天然の分子よりも多い、より少ない、もしくは同じ数の残基を有し得、および／または、１もしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含み得る。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、本技術分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフトまたは免疫沈降アッセイによって、決定され得る。ＤＮＡ開裂は、ゲル電気泳動によってアッセイされ得る。Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは遺伝学的および生化学的の両方の補完によって、決定され得る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ３４０巻：２４５〜２４６頁；米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴＷＯ９８／４４３５０を参照されたい。

「ベクター」は、標的細胞に遺伝子配列を移入させることが可能である。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指向することが可能であり、標的細胞に遺伝子配列を移入させることができる、任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびに組込みベクターを含む。

「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、好ましくは、慣用的なアッセイにおいてである必要はないが、容易に測定されるタンパク質産物を産生する任意の配列を指す。適切なレポーター遺伝子には、抗生物質抵抗性（例えば、アンピシリン抵抗性、ネオマイシン抵抗性、Ｇ４１８抵抗性、ピューロマイシン抵抗性）を媒介するタンパク質をコードする配列、着色または蛍光もしくは発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）ならびに増強された細胞成長および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコードする配列が含まれるがこれらに限定されない。エピトープタグには、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列の１または複数のコピーが含まれる。「発現タグ」には、目的の遺伝子の発現をモニタリングするために、所望の遺伝子配列に作動可能に連結され得るレポーターをコードする配列が含まれる。

「セーフハーバー」遺伝子座は、遺伝子が宿主細胞に対する任意の有害な影響なしに挿入され得る、ゲノム内の遺伝子座である。挿入された遺伝子配列の発現が隣接する遺伝子からのいずれのリードスルー発現によっても乱されないセーフハーバー遺伝子座が、最も有益である。哺乳動物細胞におけるセーフハーバー遺伝子座の非限定的な例は、ＡＡＶＳ１遺伝子（米国特許第８，１１０，３７９号）、ＣＣＲ５遺伝子（米国特許出願公開第２００８０１５９９９６号）、Ｒｏｓａ遺伝子座（ＷＯ２０１０／０６５１２３）および／またはアルブミン遺伝子座（米国特許出願公開第２０１３０１７７９６０号および同第２０１３０１７７９８３号）である。植物細胞におけるセーフハーバーはＺＰ１５遺伝子座（米国特許出願公開第２０１００１９９３８９号）である。

用語「被験体」および「患者」は、相互交換可能に使用され、哺乳動物、例えば、ヒト患者および非ヒト霊長類、ならびに実験動物、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウスおよび他の動物を指す。したがって、用語「被験体」または「患者」は、本明細書で使用する場合、本発明の幹細胞が投与され得る任意の哺乳動物の患者または被験体を意味する。本発明の被験体は、例えば神経毒素を含めた１種または複数種の化学的毒素に曝露されている被験体を含む。

「幹細胞性」（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）とは、任意の細胞の、幹細胞様の様式で働く相対的な能力、即ち、任意の特定の幹細胞が有し得る全能性、多能性、または少能性の程度および増大したまたは不定の自己再生を指す。

ヌクレアーゼ
導入遺伝子が標的化された様式でゲノム中に組み込まれるように、導入遺伝子と細胞のゲノムの開裂のためのヌクレアーゼとを保有するドナー分子のｉｎｖｉｖｏ開裂に有用な組成物、特にＺＦＮ、ＴＡＬＥ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｔｔａｇｏおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系等のヌクレアーゼが、本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、これらのヌクレアーゼの１種または複数種は、天然起源である。他の実施形態では、これらのヌクレアーゼの１種または複数種は、非天然起源である、即ち、ＤＮＡ結合ドメインおよび／または開裂ドメインにおいて遺伝子操作されている。例えば、天然起源のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位に結合するように変更され得る（例えば、同族結合部位とは異なる部位に結合するように遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ）。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、異種のＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメイン（例えば、異種開裂ドメインを有する、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬエフェクタードメインＤＮＡ結合タンパク質；メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含む。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴｔａｇｏ系などの系を含む。

Ａ．ＤＮＡ結合ドメイン
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ドナー分子に結合するためおよび／または細胞のゲノム中の目的の領域に結合するために、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインを使用する。天然起源のメガヌクレアーゼは、１５〜４０塩基対の開裂部位を認識し、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーへと一般に分類される。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼには、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが含まれる。それらの認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５巻：３３７９〜３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ８２巻：１１５〜１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２巻、１１２５〜１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．１２巻：２２４〜２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３巻：１６３〜１８０頁；Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０巻：３４５〜３５３頁およびＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓカタログもまた参照されたい。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、遺伝子操作された（非天然起源の）ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を含むヌクレアーゼを使用する。Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列は、公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５巻：３３７９〜３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ８２巻：１１５〜１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２巻、１１２５〜１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．１２巻：２２４〜２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３巻：１６３〜１８０頁；Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０巻：３４５〜３５３頁およびＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓカタログもまた参照されたい。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位に結合するように遺伝子操作され得る。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２年）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ１０巻：８９５〜９０５頁；Ｅｐｉｎａｔら（２００３年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３１巻：２９５２〜２９６２頁；Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６年）Ｎａｔｕｒｅ４４１巻：６５６〜６５９頁；Ｐａｑｕｅｓら（２００７年）ＣｕｒｒｅｎｔＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ７巻：４９〜６６頁；米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、全体としてヌクレアーゼに関して変更され得（即ち、ヌクレアーゼが同族開裂ドメインを含むように）、または異種開裂ドメインに融合され得る。

他の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において使用される１種または複数種のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、天然起源のまたは遺伝子操作された（非天然起源の）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。属Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの植物病原性細菌は、重要な作物植物において多くの疾患を引き起こすことが公知である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、植物細胞中に２５種よりも多い異なるエフェクタータンパク質を注入する、保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されたタンパク質のなかでも、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームを操作する、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターである（Ｋａｙら（２００７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ３１８巻：６４８〜６５１頁を参照されたい）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬエフェクターの１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ由来のＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓら（１９８９年）ＭｏｌＧｅｎＧｅｎｅｔ２１８巻：１２７〜１３６頁およびＷＯ２０１００７９４３０を参照されたい）。ＴＡＬエフェクターは、タンデムリピートの集中したドメインを含有し、各リピートは、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって重要なおよそ３４アミノ酸を含有する。さらに、これらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（概説については、ＳｃｈｏｒｎａｃｋＳ、ら（２００６年）ＪＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ１６３巻（３号）：２５６〜２７２頁を参照されたい）。さらに、植物病原性細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍでは、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍｂｉｏｖａｒ１株ＧＭＩ１０００およびｂｉｏｖａｒ４株ＲＳ１０００における、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と称される２つの遺伝子が、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが見出されている（Ｈｅｕｅｒら（２００７年）ＡｐｐｌａｎｄＥｎｖｉｒＭｉｃｒｏ７３巻（１３号）：４３７９〜４３８４頁を参照されたい）。これらの遺伝子は、互いにヌクレオチド配列において９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７のリピートドメインにおける１，５７５ｂｐの欠失が異なる。しかし、両方の遺伝子産物は、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。例えば、その全体が本明細書に参考として援用される米国特許公報第８，５８６，５２６号を参照されたい。

これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、これらのタンデムリピート中に見出される配列に依存する。リピートされる配列は、およそ１０２ｂｐを含み、これらのリピートは、典型的には、互いに９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓら、同書）。これらのリピートの多型は、１２位および１３位に通常位置し、１２位および１３位における超可変二残基の正体と、ＴＡＬエフェクターの標的配列中の連続ヌクレオチドの正体との間には、一対一の相関が存在するようである（ＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ、（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６巻：１５０１頁ならびにＢｏｃｈら（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６巻：１５０９〜１５１２頁を参照されたい）。実験的に、これらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識のための天然コードは、１２位および１３位におけるＨＤ配列が、シトシン（Ｃ）への結合をもたらし；ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、そしてＩＮＧがＴに結合するように、決定されている。これらのＤＮＡ結合リピートは、新たな配列と相互作用でき植物細胞において非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化できる人工の転写因子を作製するために、新たな組合せおよびリピート数を有するタンパク質へとアセンブルされている（Ｂｏｃｈら、同書）。遺伝子操作されたＴＡＬタンパク質は、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインに連結されて、酵母レポーターアッセイにおいて活性を示すＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）を生じている（プラスミドベースの標的）。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら（（２０１０年）＜Ｇｅｎｅｔｉｃｓｅｐｕｂ１０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１０．１２０７１７）を参照されたい。

ある特定の実施形態では、細胞のゲノムのｉｎｖｉｖｏ開裂および／または標的化された開裂に使用される１種または複数種のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択された標的部位に結合するように遺伝子操作されているという点で、非天然起源である。例えば、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２年）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０巻：１３５〜１４１頁；Ｐａｂｏら（２００１年）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０巻：３１３〜３４０頁；Ｉｓａｌａｎら（２００１年）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９巻：６５６〜６６０頁；Ｓｅｇａｌら（２００１年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２巻：６３２〜６３７頁；Ｃｈｏｏら（２０００年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０巻：４１１〜４１６頁；米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０３０，２１５号；同第６，７９４，１３６号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，０７０，９３４号；同第７，３６１，６３５号；同第７，２５３，２７３号；および米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号；同第２００７／０２１８５２８号；同第２００５／０２６７０６１号を参照されたい。

遺伝子操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然起源のジンクフィンガータンパク質と比較して、新規結合特異性を有し得る。遺伝子操作方法には、合理的設計および種々の型の選択が含まれるがこれらに限定されない。合理的設計には、例えば、トリプレット（またはクアドルプレット（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ））ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各トリプレットまたはクアドルプレットのヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの１種または複数種のアミノ酸配列と関連する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、共有に係る米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。

ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号および同第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；およびＷＯ０１／８８１９７中に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共有に係るＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。

さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば、５またはそれ超のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を使用して一緒に連結され得る。例示的なリンカー配列については、米国特許第８，７７２，４５３号；同第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。

標的部位の選択；融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのＺＦＰおよび方法は、当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，８１５号；同第５，７８９，５３８号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されている。

さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば、５またはそれ超のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を使用して、一緒に連結され得る。６またはそれ超のアミノ酸長の例示的なリンカー配列について、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号もまた参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。

ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の一部である。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号および米国特許出願第１４／２７８，９０３号を参照されたい。系のＲＮＡ構成成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎら、２００２年．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３巻：１５６５〜１５７５頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００２年．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３０巻：４８２〜４９６頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６年．Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ１巻：７頁；Ｈａｆｔら、２００５年．ＰＬｏＳＣｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．１巻：ｅ６０頁）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主中のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子およびＣＲＩＳＰＲ媒介性の核酸開裂の特異性をプログラムすることが可能な非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられた系の１つであり、４つの連続的ステップで、標的化されたＤＮＡ二本鎖切断を実施する。第１に、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、標的認識のためのさらなる要求、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーとプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合を介して、標的ＤＮＡにＣａｓ９を指向させる。最後に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの開裂を媒介して、プロトスペーサー内の二本鎖切断を生じる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップから構成される：（ｉ）「適応」と呼ばれる過程における、さらなる攻撃を防止するための、ＣＲＩＳＰＲアレイ中への異質ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連タンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、その後の、（ｉｉｉ）異質核酸によるＲＮＡ媒介性の干渉。したがって、細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然機能と関連し、異質ＤＮＡなどの挿入などの機能において役割を果たす。

ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然起源のＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であり得る。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通する定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」には、対応する天然配列ポリペプチドと共通した生物学的活性を有することを条件として、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドおよびその断片の誘導体が含まれるがこれらに限定されない。本明細書で企図される生物学的活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能的誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合的修飾、およびその融合物の両方を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の適切な誘導体には、Ｃａｓタンパク質またはその断片の変異体、融合物、共有結合的修飾が含まれるがこれらに限定されない。Ｃａｓタンパク質またはその断片を含むＣａｓタンパク質、およびＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体は、細胞から取得可能であり得るか、もしくは化学的に合成され得るか、またはこれらの２つの手順の組合せによって、取得可能であり得る。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、またはＣａｓタンパク質を天然に産生し、より高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を産生するように、もしくは外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であり得、この核酸は、内因性Ｃａｓと同じまたは異なるＣａｓをコードする。一部の場合には、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然には産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。

一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインはＴｔＡｇｏ系の一部である（Swartsら、同書；Shengら、同書を参照されたい）。真核生物では、遺伝子サイレンシングは、タンパク質のアルゴノート（Ａｇｏ）ファミリーによって媒介される。このパラダイムでは、Ａｇｏは小さな（１９〜３１ｎｔ）ＲＮＡに結合する。このタンパク質−ＲＮＡサイレンシング複合体は、標的ＲＮＡを、低分子ＲＮＡと標的の間のワトソン・クリック塩基対合を介して認識し、標的ＲＮＡをヌクレオチド鎖切断的に開裂する（Vogel（２０１４年）Science ３４４巻：９７２〜９７３頁）。対照的に、原核生物Ａｇｏタンパク質は、小さな一本鎖ＤＮＡ断片に結合し、外来（多くの場合ウイルス）ＤＮＡを検出し、除去するように機能するようである（Yuanら、（２００５年）Mol. Cell １９巻、４０５頁；Olovnikovら（２０１３年）Mol. Cell ５１巻、５９４頁；Swartsら、同書）。例示的な原核生物Ａｇｏタンパク質としては、Ａｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓ由来のもの、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のもの、およびＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のものが挙げられる。

最もよく特徴付けられている原核生物Ａｇｏタンパク質のうちの１つは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のもの（ＴｔＡｇｏ；Swartsら、同書）である。ＴｔＡｇｏは、５’リン酸基を伴う１５ｎｔまたは１３〜２５ｎｔの一本鎖ＤＮＡ断片と会合する。ＴｔＡｇｏが結合するこの「ガイドＤＮＡ」は、タンパク質−ＤＮＡ複合体と第３のＤＮＡ分子内のワトソン・クリック相補ＤＮＡ配列の結合を導くように機能する。これらのガイドＤＮＡ内の配列情報により標的ＤＮＡの同定が可能になったら、ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体が標的ＤＮＡを開裂する。そのような機構は、その標的ＤＮＡと結合する一方でＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体の構造によっても支持される（G. Shengら、同書）。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のＡｇｏ（ＲｓＡｇｏ）は同様の特性を有する（Olivnikovら、同書）。

任意のＤＮＡ配列の外因性ガイドＤＮＡをＴｔＡｇｏタンパク質に負荷することができる（Swartsら、同書）。ＴｔＡｇｏ開裂の特異性はガイドＤＮＡによって導かれるので、したがって、外因性の研究者指定のガイドＤＮＡと形成されるＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体により、相補的な研究者指定の標的ＤＮＡへのＴｔＡｇｏ標的ＤＮＡ開裂が導かれる。このように、ＤＮＡにおいて標的化された二本鎖切断を生じさせることができる。ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ系（または他の生物由来のオルソロガスなＡｇｏ−ガイドＤＮＡ系）の使用により、細胞内のゲノムＤＮＡの標的化された開裂が可能になる。そのような開裂は、一本鎖のものでも二本鎖のものでもあり得る。哺乳動物ゲノムＤＮＡの開裂のためには、哺乳動物細胞における発現についてコドン最適化されたＴｔＡｇｏのバージョンを使用することが好ましい。さらに、ＴｔＡｇｏタンパク質を細胞透過性ペプチドと融合する場合には、細胞を、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて形成されたＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体で処理することが好ましい場合がある。さらに、３７摂氏温度における活性が改善されるように変異誘発によって変更されたＴｔＡｇｏタンパク質のバージョンを使用することが好ましい場合がある。Ａｇｏ−ＲＮＡ媒介性ＤＮＡ開裂を使用して、ＤＮＡ切断を活用するための、当技術分野における標準の技法を使用した遺伝子ノックアウト、標的化された遺伝子付加、遺伝子補正、標的化された遺伝子欠失を含めた転帰のひと揃い（panopoly）をもたらすことができる。

したがって、ヌクレアーゼは、ドナー（導入遺伝子）を挿入することが望まれる任意の遺伝子中の標的部位に特異的に結合するという点で、ＤＮＡ結合ドメインを含む。

Ｂ．開裂ドメイン
任意の適切な開裂ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに作動可能に連結されて、ヌクレアーゼを形成し得る。例えば、ＺＦＰＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼドメインに融合されて、ＺＦＮ−その遺伝子操作された（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメインを介してその意図した核酸標的を認識でき、ヌクレアーゼ活性を介してＺＦＰ結合部位の近くでＤＮＡが切断されるようにする、機能的実体−を生じている。例えば、Ｋｉｍら（１９９６年）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９３巻（３号）：１１５６〜１１６０頁を参照されたい。より最近、ＺＦＮは、種々の生物においてゲノム改変に使用されている。例えば、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６０１８８９８７号；同第２００６００６３２３１号；ならびに国際公開第０７／０１４２７５号を参照されたい。同様に、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼドメインに融合されて、ＴＡＬＥＮを生じている。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。

上述のように、開裂ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対して異種であり得る、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン、またはＴＡＬＥＮＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン。異種開裂ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られ得る。開裂ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるがこれらに限定されない。例えば、２００２〜２００３年カタログ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ；およびＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５巻：３３７９〜３３８８頁を参照されたい。ＤＮＡを開裂するさらなる酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；リョクトウヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅＩ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎら（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９９３年もまた参照）。これらの酵素（またはその機能的断片）のうちの１または複数は、開裂ドメインおよび開裂ハーフドメインの供給源として使用され得る。

同様に、開裂ハーフドメインは、開裂活性のために二量体形成を必要とする、上記のような任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。一般に、融合タンパク質が開裂ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が、開裂に必要とされる。あるいは、２つの開裂ハーフドメインを含む単一のタンパク質が使用され得る。これら２つの開裂ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得、または各開裂ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得る。さらに、２つの融合タンパク質についての標的部位は、好ましくは、互いに関して配置され、その結果、そのそれぞれの標的部位への２つの融合タンパク質の結合は、例えば二量体形成によって開裂ハーフドメインに機能的開裂ドメインを形成させる互いに対する空間的配向に、これらの開裂ハーフドメインを置く。したがって、ある特定の実施形態では、標的部位の近くの端は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチド離れている。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位間に介在し得る（例えば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれ超）。一般に、開裂の部位は、標的部位間に存在する。

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在しており、（認識部位における）ＤＮＡへの配列特異的結合が可能であり、結合の部位またはその近傍でＤＮＡを開裂させることが可能である。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から取り出された部位においてＤＮＡを開裂させ、分離可能な結合ドメインおよび開裂ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチドおよび他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドの場所において、ＤＮＡの二本鎖開裂を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；同第５，４３６，１５０号および同第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉら（１９９２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９巻：４２７５〜４２７９頁；Ｌｉら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０巻：２７６４〜２７６８頁；Ｋｉｍら（１９９４年ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１巻：８８３〜８８７頁；Ｋｉｍら（１９９４年ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻：３１，９７８〜３１，９８２頁を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、遺伝子操作されてもされなくてもよい、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素および１または複数のジンクフィンガー結合ドメイン由来の開裂ドメイン（または開裂ハーフドメイン）を含む。

その開裂ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら（１９９８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５巻：１０，５７０〜１０，５７５頁。したがって、本開示の目的のため、開示された融合タンパク質において使用されるＦｏｋＩ酵素の一部は、開裂ハーフドメインとみなされる。したがって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した細胞配列の標的化された二本鎖開裂および／または標的化された置き換えのために、各々がＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質が、触媒的に活性な開裂ドメインを再構成するために使用され得る。あるいは、１つのジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む単一のポリペプチド分子もまた、使用され得る。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した標的化された開裂および標的された配列変更のためのパラメーターは、本開示の別の場所に提供される。

開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインは、機能的開裂ドメインを形成するために、開裂活性を保持するまたは多量体形成する（例えば、二量体形成する）能力を保持する、タンパク質の任意の部分であり得る。

例示的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号に記載されている。さらなる制限酵素もまた、分離可能な結合および開裂ドメインを含み、これらは、本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３１巻：４１８〜４２０頁を参照されたい。

ある特定の実施形態では、開裂ドメインは、例えば、その全ての開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，７７２，４５３号；同第８，６２３，６１８号；同第８，４０９，８６１号；同第８，０３４，５９８号；同第７，９１４，７９６号；および同第７，８８８，１２１号に記載されるように、ホモ二量体形成を最小化または防止する１種または複数種の遺伝子操作された開裂ハーフドメイン（二量体形成ドメイン変異体とも呼ばれる）を含む。ＦｏｋＩの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位および５３８位におけるアミノ酸残基は、全て、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインの二量体形成に影響を与えるための標的である。

偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な遺伝子操作された開裂ハーフドメインには、第１の開裂ハーフドメインが、ＦｏｋＩの４９０位および５３８位のアミノ酸残基において変異を含み、第２の開裂ハーフドメインが、アミノ酸残基４８６および４９９において変異を含む、対が含まれる。

したがって、一実施形態では、４９０位における変異によりＧｌｕ（Ｅ）がＬｙｓ（Ｋ）で置き換えられ、５３８位における変異によりＩｓｏ（Ｉ）がＬｙｓ（Ｋ）で置き換えられ、４８６位における変異によりＧｌｎ（Ｑ）がＧｌｕ（Ｅ）で置き換えられ、４９９位における変異によりＩｓｏ（Ｉ）がＬｙｓ（Ｋ）で置き換えられる。特に、本明細書に記載される遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、一方の開裂ハーフドメインにおいて４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と称される遺伝子操作された開裂ハーフドメインを産生し、および別の開裂ハーフドメインにおいて４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と称される遺伝子操作された開裂ハーフドメインを産生することにより調製された。本明細書に記載される遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、異常な開裂が最小化または消失される、偏性ヘテロ二量体変異体である。例えば、あらゆる目的でそれらの開示が参照によりそれらの全体が組み込まれる、米国特許第７，９１４，７９６号および同第８，０３４，５９８号を参照されたい。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、４８６位、４９９位および４９６位における変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える変異、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で置き換える変異、および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＥＬＤ」ドメインおよび「ＥＬＥ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、４９０位、５３８位および５３７位における変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える変異、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える変異、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＫＫＫ」ドメインおよび「ＫＫＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、４９０位および５３７位における変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える変異、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＫＩＫ」ドメインおよび「ＫＩＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む（例えば、米国特許第８，７７２，４５３号を参照されたい）。他の実施形態では、遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、「シャーキー」および／または「シャーキー」変異を含む（Ｇｕｏら（２０１０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４００巻（１号）：９６〜１０７頁を参照されたい）。

本明細書に記載される遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、例えば、米国特許第８，７７２，４５３号；同第８，６２３，６１８号；同第８，４０９，８６１号；同第８，０３４，５９８号；同第７，９１４，７９６号；および同第７，８８８，１２１号に記載されるように、野生型開裂ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的変異誘発によって、任意の適切な方法を使用して調製できる。

あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「開裂酵素」技術を使用して、核酸標的部位においてｉｎｖｉｖｏでアセンブルされ得る（例えば、米国特許出願公開第２００９００６８１６４号を参照されたい）。かかる開裂酵素の構成成分は、別々の発現構築物のいずれか上に発現され得るか、または、例えば、自己開裂性２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって個々の構成成分が分離されて、１つのオープンリーディングフレームで連結され得る。構成成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。

ヌクレアーゼは、例えば、米国特許第８，５６３，３１４号に記載される酵母ベースの染色体系における使用の前に、活性についてスクリーニングされ得る。

ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化（抑制解除）され、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にあり得る。

Ｃａｓ９関連のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、同一のダイレクトリピート（ＤＲ）によって空間が置かれたヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）を含有する２種のＲＮＡ非コード構成成分：ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイを含む。ゲノム遺伝子操作を達成するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用するために、これらのＲＮＡの両方の機能が存在しなければならない（Ｃｏｎｇら（２０１３年）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ１／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ１２３１１４３を参照されたい）。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｐｒｅ−ｃｒＲＮＡは、別々の発現構築物を介して、または別々のＲＮＡとして、供給される。他の実施形態では、遺伝子操作された成熟ｃｒＲＮＡ（標的特異性を付与する）がｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ９との相互作用を供給する）に融合されてキメラｃｒ−ＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（単一ガイドＲＮＡとも呼ぶ）を生じる、キメラＲＮＡが構築される（Ｊｉｎｅｋ同書およびＣｏｎｇ、同書を参照されたい）。

標的部位
上に詳細に記載したように、ＤＮＡドメインは、選択された任意の配列に結合するように遺伝子操作され得る。遺伝子操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然起源のＤＮＡ結合ドメインと比較して、新規結合特異性を有し得る。遺伝子操作方法には、合理的設計および種々の型の選択が含まれるがこれらに限定されない。合理的設計には、例えば、トリプレット（またはクアドルプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各トリプレットまたはクアドルプレットのヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの１種または複数種のアミノ酸配列と関連する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、共有に係る米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。ＴＡＬエフェクタードメインの合理的設計もまた実施され得る。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。

ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む、ＤＮＡ結合ドメインに適用可能な例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；および同第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共有に係るＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。

標的部位の選択；融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのヌクレアーゼおよび方法は、当業者に公知であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および同第２００６０１８８９８７号に詳細に記載されている。

さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、マルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質）は、例えば、５またはそれ超のアミノ酸のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を使用して一緒に連結され得る。６またはそれ超のアミノ酸長の例示的なリンカー配列について、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のＤＮＡ結合ドメイン間に適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。米国特許第８，５８６，５２６号もまた参照されたい。

適切な標的遺伝子の非限定的な例としては、ベータ（β）グロビン遺伝子（ＨＢＢ）、ガンマ（γ）グロビン遺伝子（ＨＢＧ１）、Ｂ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子、クルッペル様因子１（ＫＬＦ１）遺伝子、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、アルブミン遺伝子、第ＶＩＩＩ因子遺伝子、第ＩＸ因子遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、ハンチンチン（Hungtingin）（Ｈｔｔ）遺伝子、ロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子、サーファクタントタンパク質Ｂ遺伝子（ＳＦＴＰＢ）、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＲＡＣ）遺伝子、Ｔ細胞受容体ベータ（ＴＲＢＣ）遺伝子、プログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）遺伝子、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）Ａ遺伝子、ＨＬＡＢ遺伝子、ＨＬＡＣ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＰＡ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子、ＬＭＰ７遺伝子、抗原ペプチド輸送体（ＴＡＰ）１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、タパシン遺伝子（ＴＡＰＢＰ）、クラスＩＩ主要組織適合性遺伝子複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子、ジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ）、グルココルチコイド受容体遺伝子（ＧＲ）、ＩＬ２ＲＧ遺伝子、Ｒａｇ−１遺伝子、ＲＦＸ５遺伝子、ＦＡＤ２遺伝子、ＦＡＤ３遺伝子、ＺＰ１５遺伝子、ＫＡＳＩＩ遺伝子、ＭＤＨ遺伝子、および／またはＥＰＳＰＳ遺伝子が挙げられる。

ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ヒト細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子、ＨＰＲＴ遺伝子、アルブミン遺伝子およびＣＣＲ５遺伝子、ならびにマウス細胞におけるＲｏｓａ２６などの「セーフハーバー」遺伝子座（例えば、米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；同第８，５８６，５２６号；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号および同第２０１３０１７７９６０号を参照されたい）、ならびに植物におけるＺｐ１５遺伝子座（米国特許第８，３２９，９８６号を参照されたい）を標的とする。

ドナー
本願の開示は、ＨＳＣ／ＰＣのゲノムへの外因性配列のヌクレアーゼ媒介性の標的化された組込みに関する。上述した通り、例えば、変異遺伝子を補正するための、または野生型遺伝子の発現を増加させるための、または導入遺伝子の発現のための、外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも言う）の挿入。ドナー配列は、典型的には、それが配置されるゲノム配列と同一ではないことが容易に明らかとなる。ドナー配列は、２つの相同な領域に隣接する非相同配列を含有し、目的の位置での効率的なＨＤＲを可能とする。さらに、ドナー配列は、細胞クロマチン内の目的の領域に相同でない配列を含有するベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞クロマチンに相同ないくつかの不連続な領域を含有することができる。例えば、常態では目的の領域に存在しない標的化された配列を挿入するために、前記配列を、ドナー核酸分子中に存在させることができ、目的の領域中の配列に相同な領域を隣接させることができる。

本明細書に記載されているのは、選択された位置内へ挿入するための、任意のポリヌクレオチドの標的化された挿入の方法である。挿入に用いるポリヌクレオチドは、「外因性」ポリヌクレオチド、「ドナー」ポリヌクレオチドもしくは分子、または「導入遺伝子」とも呼ばれ得る。ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってよく、一本鎖および／または二本鎖であってもよく、直鎖状または環状の形態で細胞内に導入することができる。米国特許出願公開第２０１０００４７８０５号および同第２０１１０２０７２２１号を参照されたい。ドナー配列（複数可）は、ＤＮＡＭＣの形態で導入され得、これは、培養中の細胞内へ環状または直鎖状の形態で導入され得る。直鎖状の形態で導入される場合、当業者に公知の方法によって、ドナー配列の末端を保護する（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）ことができる。例えば、１つまたは複数のジデオキシヌクレオチド残基を直鎖状分子の３’末端に付加する、および／または自己相補的なオリゴヌクレオチドを一端または両端にライゲーションする。例えば、Ｃｈａｎｇら、１９８７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：４９５９〜４９６３頁、Ｎｅｈｌｓら、１９９６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２巻：８８６〜８８９頁を参照されたい。分解から外因性ポリヌクレオチドを保護するための追加的な方法としては、末端アミノ基（複数可）の付加、および例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミダートやＯ−メチルリボースもしくはデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間の結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。二本鎖形態で導入する場合、ドナーは、１つまたは複数のヌクレアーゼ標的部位、例えば、細胞のゲノム中に組み込まれる導入遺伝子に隣接するヌクレアーゼ標的部位を含み得る。例えば、米国特許出願公開第２０１３０３２６６４５号を参照されたい。

ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーターや抗生物質耐性をコードしている遺伝子などの追加的な配列を有するベクター分子の部分として、細胞内に導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドを、ネイキッド核酸として、リポソーム、ナノ粒子またはポロキサマーなどの剤と複合体を形成した核酸として、導入することができ、また、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達することができる。

ある特定の実施形態では、二本鎖のドナーは、１ｋｂ超の長さの配列（例えば、コード配列であり、導入遺伝子とも呼ばれる）、例えば、２から２００ｋｂの間、２から１０ｋｂの間（またはこれらの間にある任意の値）を含む。例えば、二本鎖ドナーもまた、少なくとも１つのヌクレアーゼ標的部位を含む。ある特定の実施形態では、ドナーは少なくとも２つの標的部位を含み、例えば、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮの対のためのものであり得る。典型的には、ヌクレアーゼ標的部位は、導入遺伝子の開裂に用いるために、導入遺伝子配列の外側、例えば、導入遺伝子に対して５’および／または３’にある。ヌクレアーゼの開裂部位（複数可）は、任意のヌクレアーゼ（複数可）のためのものである。ある特定の実施形態では、二本鎖ドナーに含有されているヌクレアーゼ標的部位（複数可）は、内因性の標的を開裂するために使用されるのと同じヌクレアーゼ（複数可）のためのものであり、その内因性の標的に、開裂されたドナーが相同性非依存的な方法を介して組み込まれる。

ドナーは、一般に、組込み部位の内因性プロモーター、即ちドナーが挿入されている内因性遺伝子（例えば、グロビン、ＡＡＶＳ１など）の発現を駆動するプロモーターによって、発現が駆動されるように挿入される。しかし、ドナーが、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成性のプロモーターまたは誘導可能なもしくは組織特異的なプロモーターを含み得ることは明らが明らかである。

ドナー分子は、内因性遺伝子の全てもしくはいくつかが発現するか、または発現しないように、内因性遺伝子内に挿入されていてもよい。他の実施形態では、導入遺伝子（ペプチドをコードする遺伝子があるものまたはないもの）は、任意の内因性遺伝子座、例えば、セーフハーバー遺伝子座に組み込まれている。例えば、米国特許出願公開第２００８０２９９５８０号；同第２００８０１５９９９６号および同第２０１０００２１８２６４号を参照されたい。

さらに、発現を必要としていなくとも、外因性配列は、転写調節配列または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルをも含み得る。さらに、スプライスアクセプター配列を含めることができる。例示的なスプライスアクセプター部位配列は、当業者に公知であり、単に例として、ＣＴＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＡＧ、（配列番号２９）（ヒトＨＢＢ遺伝子由来）およびＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧ（配列番号３０）（ヒト免疫グロブリン−ガンマ遺伝子由来）が挙げられる。

本明細書に記載されているドナー配列に保有されている導入遺伝子は、プラスミド、細胞または他の供給源から、ＰＣＲなど当技術分野で公知の標準的な技法を使用して単離され得る。使用するドナーとしては、環状スーパーコイル型、環状リラックス型、線型などを含めて様々な種類のトポロジーを挙げることができる。あるいは、それらを、標準的なオリゴヌクレオチド合成技法を使用して、化学的に合成してもよい。さらに、ドナーをメチル化してもよいし、メチル化を欠いてもよい。ドナーは、細菌または酵母の人工染色体の形態であってもよい（ＢＡＣまたはＹＡＣ）。

本明細書に記載されている二本鎖のドナーポリヌクレオチドは、１つまたは複数の非天然の塩基および／または骨格を含んでいてもよい。具体的には、本明細書に記載されている方法を使用して、メチル化シトシンを伴うドナー分子の挿入を行い、目的の領域での転写的に静止した状態を達成することができる。

外因性の（ドナー）ポリヌクレオチドは、任意の目的の配列（外因性配列）を含んでいてもよい。例示的な外因性配列としては、任意のポリペプチドをコードする配列（例えば、ｃＤＮＡまたはその断片）、プロモーター配列、エンハンサー配列、エピトープタグ、マーカー遺伝子、開裂酵素認識部位、および様々な種類の発現構築物が挙げられるが、これらに限定されない。マーカー遺伝子としては、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、発色性または蛍光性または発光性のタンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、増強型緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、ならびに細胞増殖の増強および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、デヒドロ葉酸レダクターゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。エピトープタグとしては、例えば、１コピーまたは複数のコピーのＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列が挙げられる。

好適な実施形態では、外因性配列（導入遺伝子）は、細胞での発現が望ましい任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、そのようなポリペプチドとしては、抗体、抗原、酵素、受容体（細胞表面のまたは核の）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターポリペプチド、増殖因子および前出のいずれかの機能性断片が挙げられるが、これらに限定されない。コード配列は、例えば、ｃＤＮＡであってもよい。外因性配列は、目的の内因性遺伝子配列と連結するための導入遺伝子の断片であってもよい。例えば、目的の遺伝子の３’末端の配列を含む導入遺伝子の断片を利用して、挿入または置き換えを介して、内因性遺伝子配列の３’末端における変異をコードする配列を補正することができる。同様に、断片は、そのような内因性配列を補正または改変するための内因性配列の挿入／置き換えのための、内因性遺伝子の５’末端と同様の配列を含んでいてもよい。さらに、断片は、ｉｎｓｉｔｕにおいて内因性遺伝子配列と連結して融合タンパク質を産生するための目的の機能的ドメイン（触媒、分泌など）をコードしてよい。

例えば、外因性配列は、遺伝性疾患に罹っている被験体内で欠失しているか機能しないポリペプチドをコードする配列を含んでいてもよく、そのような遺伝性疾患としては、軟骨形成不全、赤緑色覚異常、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＯＭＩＭＮｏ．１０２７００）、副腎白質萎縮症、エカルディ症候群、アルファ−１アンチトリプシン欠損症、アルファ地中海貧血、アンドロゲン不応症候群、アペール症候群、不整脈性右心室異形成、毛細管拡張性運動失調、バルト症候群、ベータ地中海貧血、青色ゴムまり様母斑症候群、キャナヴァン病、慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）、ネコ泣き症候群、嚢胞性線維症、ダーカム病、外胚葉性異形成、ファンコーニ貧血、進行性骨化性線維形成異常症、脆弱Ｘ染色体症候群、ガラクトース血症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス（例えば、ＧＭ１）、血色素症、ベータグロビンの第６コドンのヘモグロビンＣ変異（ＨｂＣ）、血友病、ハンチントン病、フルラー症候群、低ホスファターゼ血症、クラインフェルター症候群、クラッベ病、ランガー・ギーディオン症候群、白血球粘着不全症（ＬＡＤ、ＯＭＩＭＮｏ．１１６９２０）、白質ジストロフィー、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、メービウス症候群、ムコ多糖沈着症（ＭＰＳ）、爪膝蓋骨症候群、腎原発性尿崩症、神経線維腫症、ニーマン・ピック病、骨形成不全、ポルフィリン症、プラダー・ウィリー症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、サンフィリッポ症候群、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シュバッハマン症候群、鎌状赤血球病（鎌状赤血球貧血症）、スミス・マジェニス症候群、スティックラー症候群、テイ・ザックス病、血小板減少性橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トリーチャー・コリンズ症候群、トリソミー、結節硬化症、ターナー症候群、尿素回路障害、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ワーデンブルグ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット・アルドリッヒ症候群、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ、ＯＭＩＭＮｏ．３０８２４０）が挙げられるが、これらに限定されない。

標的組込みによって治療され得る追加的な疾患の例としては、後天性免疫不全症、リソソーム蓄積病（例えば、ゴーシェ病、ＧＭ１、ファブリー病およびテイ・ザックス病）、ムコ多糖沈着症（例えば、ハンター病、フルラー病）、異常ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球病、ＨｂＣ、α−地中海貧血、β−地中海貧血）ならびに血友病が挙げられる。

ある特定の実施形態では、外因性配列は、標的組込みを受けた細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子（上述）と、追加的な機能をコードする連結された配列とを含むことができる。マーカー遺伝子の非限定的な例としては、ＧＦＰ、薬物選択マーカー（複数可）などが挙げられる。

挿入することのできる追加的な遺伝子配列としては、例えば、変異配列を置き換える野生型遺伝子が挙げられ得る。例えば、野生型の第ＩＸ因子の遺伝子配列を、内因性の遺伝子コピーが変異している幹細胞のゲノム内へ挿入してもよい。野生型コピーは、内因性遺伝子座へ挿入してもよいし、代替的にセーフハーバー遺伝子座へ標的化してもよい。

本願の明細書の教示に従うそのような発現カセットの構築は、分子生物学の分野で周知の方法論を利用する（例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉｓを参照されたい）。発現カセットを使用してトランスジェニック動物を生成する前に、選択された制御要素に関連があるストレス誘導物質に対する発現カセットの応答性を、該発現カセットを適切な細胞株（例えば、初代細胞、形質転換細胞または不死化細胞株）内へ導入することによって、試験することができる。

さらに、発現を必要としていなくとも、外因性配列は、転写調節配列または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルをも含み得る。また、目的の遺伝子の制御要素を、レポーター遺伝子へ作動可能に連結して、キメラ遺伝子（例えば、レポーター発現カセット）を作り出すことができる。

非コード核酸配列の標的挿入も達成され得る。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする配列もまた、標的挿入のために使用され得る。

追加的な実施形態では、ドナー核酸は、追加的なヌクレアーゼの設計のために、特異的な標的部位である非コード配列を含んでいてもよい。その後、元のドナー分子が開裂されて、別の目的のドナー分子を挿入されることによって改変されるように、追加的なヌクレアーゼを細胞で発現してもよい。このようにして、ドナー分子の反復的な組込みを生じ、目的の特定の遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座で、形質を積み重ねることを可能とし得る。

ドナー（複数可）は、ヌクレアーゼ（複数可）を細胞中に導入する前に、それと同時に、またはその後に送達することができる。ある特定の実施形態では、ドナー（複数可）をヌクレアーゼ（複数可）と同時に送達する。他の実施形態では、ドナーをヌクレアーゼ（複数可）の前に、例えば、これらに限定されないが、ヌクレアーゼ（複数可）の１〜６０分（またはそれらの間の任意の時間）前、ヌクレアーゼ（複数可）の１〜２４時間（またはそれらの間の任意の時間）前、またはヌクレアーゼ（複数可）の２４時間超前を含めた、ドナーの数秒前〜数時間前〜数日前に送達する。ある特定の実施形態では、ドナーをヌクレアーゼの後、好ましくは４時間以内に送達する。

ドナーは、ヌクレアーゼ（複数可）と同じ送達系を使用して送達することができる。同時に送達する場合、ドナーおよびヌクレアーゼは、同じベクター、例えば、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ６）上にあってよい。ある特定の実施形態では、ドナーはＡＡＶベクターを使用して送達し、ヌクレアーゼ（複数可）はｍＲＮＡ形態で送達する。

細胞
したがって、遺伝子改変された細胞、例えば、細胞において機能的なタンパク質を発現する導入遺伝子を含めた導入遺伝子を含む初代ＨＳＣ／ＰＣまたはＴ細胞が本明細書で提供される。本明細書に記載の方法によって産生される細胞も提供される。導入遺伝子を、１種または複数種のヌクレアーゼを使用して、標的化された様式で細胞のゲノム中に組み込む。ある特定の実施形態では、導入遺伝子をセーフハーバー遺伝子中に組み込む。

ランダムな組込みとは異なり、標的化された組込みでは、導入遺伝子の指定の遺伝子または遺伝子座中への組込みが確実になる。導入遺伝子は、標的遺伝子中のどこにでも組み込むことができる。ある特定の実施形態では、導入遺伝子をヌクレアーゼ開裂部位またはその近傍、例えば、開裂部位の上流または下流の１〜３００（またはそれらの間の任意の値）塩基対の範囲内、より好ましくは開裂部位のいずれか側の１〜１００塩基対（またはそれらの間の任意の値）の範囲内、さらにより好ましくは開裂部位のいずれか側の１〜５０塩基対（またはそれらの間の任意の値）の範囲内に組み込む。ある特定の実施形態では、導入遺伝子を含む、組み込まれる配列は、いかなるベクター配列（例えば、ウイルスベクター配列）も含まない。

これらだけに限定されないが、細胞および細胞株を含めた任意の細胞型を本明細書に記載されているように遺伝子改変することができる。本明細書に記載されている細胞の他の非限定的な例としては、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋など）；樹状細胞；Ｂ細胞；自己由来（例えば、患者由来）または異種性の多能性幹細胞、全能性幹細胞または多分化能性幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞など）が挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されている細胞は、治療することが望まれる障害を有する患者に由来するＣＤ３４＋細胞である。

本明細書に記載されている細胞は、障害を、例えばｅｘｖｉｖｏ療法によって治療および／または予防することにおいて有用である。ヌクレアーゼにより改変された細胞を増大させ、次いで、標準の技法を使用して患者に再導入することができる。例えば、Tebasら、（２０１４年）New Eng J Med ３７０巻（１０号）：９０１頁を参照されたい。幹細胞の場合では、被験体に注入後、これらの前駆体の、機能的な導入遺伝子を発現する細胞へのｉｎｖｉｖｏ分化も起こる。本明細書に記載されている細胞を含む医薬組成物も提供される。さらに、細胞は、患者に投与する前に凍結保存することができる。

送達
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載されているタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物を、任意の適当な手段によって、任意の細胞型へｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏで送達してもよい。

適当な細胞としては、真核（例えば、動物）および原核の細胞および／または細胞株が挙げられる。かかる細胞またはかかる細胞から生成される細胞株の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）およびｐｅｒＣ６細胞、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）などの昆虫細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの真菌細胞が挙げられる。ある特定の実施形態において、細胞株は、ＣＨＯ、ＭＤＣＫ、またはＨＥＫ２９３細胞株である。適当な細胞としては、また、例として、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞および間葉幹細胞などの幹細胞が挙げられる。

本明細書に記載されているようなヌクレアーゼの送達方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号および同第７，１６３，８２４号に記載されており、それらの全ての開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。

また、本明細書に記載されているようなヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を、１種または複数種のＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（複数可）をコードする配列を含有するベクターを使用して送達してもよい。以下に限定されないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターなどを含めた任意のベクター系を使用してもよい。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号および同第７，１６３，８２４号も参照されたい。さらに、任意のこれらのベクターが、処置に求められる１種または複数種の配列を含んでもよいことは明らかである。そのため、１種または複数種のヌクレアーゼおよびドナー構築物を細胞内に導入する際に、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドを同じベクターまたは異なるベクターに保有させてもよい（ＤＮＡＭＣ）。複数のベクターを使用する際には、各ベクターは、１種または複数種のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物をコードする配列を含んでもよい。

従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子移入方法は、細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に、ヌクレアーゼおよびドナー構築物をコードする核酸を導入するために使用することができる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡまたはＲＮＡプラスミド、ＤＮＡＭＣ、ネイキッド核酸、およびリポソーム、ナノ粒子またはポロキサマーなどの送達ビヒクルとの複合体を形成している核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられ、これらは細胞へ送達された後に、エピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのどちらかを有する。遺伝子操作されたＤＮＡ結合タンパク質およびこれらの結合タンパク質を含む融合タンパク質のｉｎｖｉｖｏ送達の総説については、Ｒｅｂａｒ（２００４年）、ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎｉｏｎＩｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ、１３巻（７号）：８２９〜８３９頁、Ｒｏｓｓｉら（２００７年）、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．、２５巻（１２号）：１４４４〜１４５４頁、ならびにＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：８０８〜８１３頁（１９９２年）、ＮａｂｅｌおよびＦｅｌｇｎｅｒ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：２１１〜２１７頁（１９９３年）、ＭｉｔａｎｉおよびＣａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：１６２〜１６６頁（１９９３年）、Ｄｉｌｌｏｎ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：１６７〜１７５頁（１９９３年）、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３５７巻：４５５〜４６０頁（１９９２年）、ＶａｎＢｒｕｎｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻（１０号）：１１４９〜１１５４頁（１９８８年）、Ｖｉｇｎｅ、ＲｅｓｔｏｒａｔｉｖｅＮｅｕｒｏｌｏｇｙａｎｄＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、８巻：３５〜３６頁（１９９５年）、ＫｒｅｍｅｒおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、ＢｒｉｔｉｓｈＭｅｄｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ、５１巻（１号）：３１〜４４頁（１９９５年）、Ｈａｄｄａｄａら、ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中のＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢｏｅｈｍ著（１９９５年）ならびにＹｕら、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、１巻：１３〜２６頁（１９９４年）などの一般的な遺伝子送達の文献を参照されたい。

核酸の非ウイルス送達方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、他のナノ粒子、ポリカチオン、または脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤で増強されたＤＮＡ取り込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーションも、核酸の送達に使用することができる。

追加的な例示の核酸送達系としては、ＡｍａｘａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ケルン、ドイツ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（ロックビル、メリーランド州）、ＢＴＸＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ（ホリストン、マサチューセッツ州）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ、（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照されたい）によって提供されるものが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適した陽イオン性および中性脂質としては、ＦｅｌｇｎｅｒのＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４の脂質が挙げられる。

免疫脂質複合体などの標的化されたリポソームを含めた脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻：４０４〜４１０頁（１９９５年）、Ｂｌａｅｓｅら、ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．、２巻：２９１〜２９７頁（１９９５年）、Ｂｅｈｒら、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．、５巻：３８２〜３８９頁（１９９４年）；Ｒｅｍｙら、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．、５巻：６４７−６５４（１９９４年）、Ｇａｏら、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、２巻：７１０〜７２２頁（１９９５年）、Ａｈｍａｄら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、５２巻：４８１７〜４８２０頁（１９９２年）、ならびに米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号および同第４，９４６，７８７号を参照されたい）。

追加的な送達方法としては、送達される核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）内へのパッケージングを使用することが挙げられる。これらのＥＤＶは、抗体の１つのアームが標的組織に対する特異性を有し、かつ他方がＥＤＶに対する特異性を有する二重特異性抗体を使用して、標的組織に特異的に送達される。抗体は、ＥＤＶを標的細胞の表面に運び、次いでＥＤＶは、エンドサイトーシスにより細胞内に運ばれる。細胞内に取り込まれると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら、（２００９年）、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２７巻（７号）、６４３頁を参照されたい）。

遺伝子操作されたＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸を送達するためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、ウイルスに体内の特定の細胞を標的とさせ、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化した過程を利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与（ｉｎｖｉｖｏ）することができるか、またはインビトロで細胞を処置するために使用することができ、改変された細胞は患者に投与される（ｅｘｖｉｖｏ）。ＺＦＰを送達するための従来のウイルスに基づく系としては、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクチン、および単純ヘルペスウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。宿主ゲノム内の組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ関連ウイルスの遺伝子移入方法を用いて可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、高い形質導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織において観察されている。

レトロウイルスの向性は、外来のエンベロープタンパク質を組み入れることによって変更することができ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大させる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させることができるレトロウイルスベクターであり、典型的には高ウイルス力価を生じる。レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列に用いるパッケージング能力を有する、シス作用性の長い末端反復からなる。最小限のシス作用性ＬＴＲが、ベクターの複製およびパッケージングには十分であり、それらは、次いで、治療遺伝子を標的細胞内に組み込むために使用されて、導入遺伝子の永続的な発現を提供する。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組合せに基づくものが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：２７３１〜２７３９頁（１９９２年）、Ｊｏｈａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：１６３５〜１６４０頁（１９９２年）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら、Ｖｉｒｏｌ．、１７６巻：５８〜５９頁（１９９０年）、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：２３７４〜２３７８頁（１９８９年）、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５巻：２２２０〜２２２４頁（１９９１年）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。

一過性発現が好適な用途では、アデノウイルスに基づく系を使用することができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型で非常に高い効率で形質移入が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高力価および高レベルの発現を得ている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。また、アデノ関連ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して、例えば、核酸およびペプチドのｉｎｖｉｔｒｏ産生において、ならびにｉｎｖｉｖｏおよびｅｘｖｉｖｏの遺伝子治療の手順（例えば、Ｗｅｓｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６０巻：３８〜４７頁（１９８７年）、米国特許第４，７９７，３６８号、ＷＯ９３／２４６４１、Ｋｏｔｉｎ、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、５巻：７９３〜８０１頁（１９９４年）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４巻：１３５１頁（１９９４年）を参照されたい）に用いるために、細胞に標的核酸を形質導入することもできる。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５巻：３２５１〜３２６０頁（１９８５年）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、４巻：２０７２〜２０８１頁（１９８４年）、ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、ＰＮＡＳ、８１巻：６４６６〜６４７０頁（１９８４年）、およびＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：０３８２２〜３８２８頁（１９８９年）を含めた多数の刊行物に記載されている。

少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが、現在、臨床試験の遺伝子移入に利用可能であり、それらは、形質導入薬剤を生成するために、ヘルパー細胞株内に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補性を含むアプローチを利用する。

ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験で使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら、Ｂｌｏｏｄ、８５巻：３０４８〜３０５頁（１９９５年）、Ｋｏｈｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１巻：１０１７〜１０２頁（１９９５年）、Ｍａｌｅｃｈら、ＰＮＡＳ、９４巻：２２号、１２１３３〜１２１３８頁（１９９７年））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験で使用された最初の治療ベクターであった。（Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻：４７５〜４８０頁（１９９５年））。ＭＦＧ−Ｓでパッケージされたベクターについて、５０％またはそれ超の形質導入効率が観察されている。（Ｅｌｌｅｍら、ＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、４４巻（１号）：１０〜２０頁（１９９７年）、Ｄｒａｎｏｆｆら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、１巻：１１１〜２頁（１９９７年）。）

組換えアデノ関連ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損型および非病原性のパルボウイルスアデノ関連２型ウイルスに基づく有望な代替の遺伝子送達システムである。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ１４５ｂｐの逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノム内への組込みに起因する効率的な遺伝子移入および安定な導入遺伝子送達は、このベクター系の鍵となる特長である（Ｗａｇｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ３５１巻：９１１７号１７０２〜３頁（１９９８年）、Ｋｅａｒｎｓら、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．９巻：７４８〜５５頁（１９９６年））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ．１０、ならびに任意の新規ＡＡＶ血清型を含めた他のＡＡＶ血清型も、本発明に従って使用することができる。一部の実施形態では、ウイルス核酸のＬＴＲ配列の起源ウイルスとカプシド配列の起源ウイルスが異種性であるキメラＡＡＶを使用する。例として、ＡＡＶ２に由来するＬＴＲと、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に由来するカプシドを有するキメラウイルス（即ち、それぞれＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／９）が挙げられる。

複製欠損性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生することができ、多数の異なる細胞型を容易に感染させる。アデノウイルスベクターのほとんどは、導入遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えて、その後、複製欠損性ベクターが、欠失した遺伝子機能をトランスに供給するヒト２９３細胞で増殖するように、遺伝子操作される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉で見出されるものなど非分裂性の分化細胞を含む、複数の種類の組織をｉｎｖｉｖｏで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな保有能力を有する。臨床試験でＡｄベクターを使用する例では、筋肉内注入を用いた抗腫瘍免疫化のポリヌクレオチド治療が含められた（Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、７巻：１０８３〜９頁（１９９８年））。臨床試験における遺伝子移入に用いるアデノウイルスベクターの使用の追加的な例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、２４巻：１号、５〜１０頁（１９９６年）、Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、９巻：７号、１０８３〜１０８９頁（１９９８年）、Ｗｅｌｓｈら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、２巻：２０５〜１８頁（１９９５年）、Ａｌｖａｒｅｚら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、５巻：５９７〜６１３頁（１９９７年）、Ｔｏｐｆら、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、５巻：５０７〜５１３頁（１９９８年）、Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、７巻：１０８３〜１０８９頁（１９９８年）が挙げられる。

パッケージング細胞を使用して、宿主細胞を感染させることが可能なウイルス粒子を形成する。そのような細胞としては、ＡＡＶおよびアデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７が含まれる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、通常、ウイルス粒子内に核酸ベクターをパッケージングする生産細胞株によって生成される。これらのベクターは、典型的に、パッケージングおよびその後の宿主への組込みに必要とされる最小限のウイルス配列（適用可能な場合）、発現させるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられている他のウイルス配列を含有する。欠けているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスに供給される。例えば、遺伝子治療に使用するＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノム内へのパッケージングおよび組込みに必要とされるＡＡＶゲノム由来の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを具える。ウイルスＤＮＡは、細胞株中にパッケージングされ、他のＡＡＶ遺伝子即ち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするもののＩＴＲ配列を欠失したヘルパープラスミドを含有する。細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製、およびヘルパープラスミド由来のＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠失しているため、有意な量にはパッケージングされない。アデノウイルスによる夾雑は、例えば、ＡＡＶよりも感受性があるアデノウイルスに対する熱処理によって低減することができる。一部の実施形態では、バキュロウイルスの発現系を使用してＡＡＶを産生する。

多くの遺伝子治療用途では、遺伝子治療ベクターが、高度な特異性で特定の細胞型に送達されることが望ましい。したがって、ウイルスの外表面上でウイルス外被タンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、ウイルスベクターを所与の細胞型に対する特異性を有するように改変することができる。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが公知の受容体に対する親和性を有するように選ばれる。例えば、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２巻：９７４７〜９７５１頁（１９９５年）は、モロニーマウス白血病ウイルスを改変して、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現することができ、その組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現しているある特定のヒト乳がん細胞を感染させることを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質をウイルスが発現する、他のウイルス−標的細胞の対にまで及び得るものである。例えば、線状ファージを遺伝子操作して、事実上いかなる選ばれた細胞受容体にも特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示することができる。上記の記載は、主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターを遺伝子操作して、特異的な標的細胞による取り込みに好都合な特異的な取り込み配列を含有させることができる。

遺伝子治療ベクターは、下記に説明するように、個々の患者への投与によって、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下もしくは頭蓋内注入）または局所適用によって、ｉｎｖｉｖｏで送達することができる。あるいは、個々の患者から移植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）や万能ドナーの造血幹細胞などの細胞に、ベクターをｅｘｖｉｖｏで送達し、続いて、通常はベクターを組み入れた細胞を選択した後に、患者への細胞の再移植を行うことができる。

また、ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）を、ｉｎｖｉｖｏでの細胞の形質導入のために、生物に直接投与することもできる。あるいは、ネイキッドＤＮＡを投与することができる。投与は、血液または組織の細胞との最終的な接触の内に分子を導入するために通常使用される経路のいずれかに依り、そのような経路としては、注射、注入、局所適用、およびエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない。そのような核酸を投与する適当な方法は、利用可能であり、当業者に周知であり、そして、１つよりも多い経路を使用して特定の組成物を投与することができるが、多くの場合、特定の経路は、別の経路よりも速やかかつ有効な反応を提供することができる。

本明細書に記載されているポリヌクレオチド（例えば、ヌクレアーゼをコードするおよび／または二本鎖のドナー）の導入に適したベクターとしては、非組込み型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）が挙げられる。例えば、Ｏｒｙら（１９９６年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻：１１３８２〜１１３８８頁、Ｄｕｌｌら（１９９８年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：８４６３〜８４７１頁、Ｚｕｆｆｅｒｙら（１９９８年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：９８７３〜９８８０頁、Ｆｏｌｌｅｎｚｉら（２０００年）、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ、２５巻：２１７〜２２２頁、米国特許出願公開第２００９／０５４９８５号を参照されたい。

薬学的に許容される担体は、投与されている特定の組成物によって、および組成物を投与するために使用される特定の方法によって、ある程度は決定される。したがって、下記に記載するように、利用可能な医薬組成物の実に様々な適当な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８９年を参照されたい）。

ヌクレアーゼをコードする配列とドナー構築物とを、同じまたは異なる系を使用して送達することができることは明らかである。例えば、ヌクレアーゼおよびドナーを同じＤＮＡＭＣによって保有することができる。あるいは、ドナーポリヌクレオチドをＭＣによって保有することができ、一方、１種または複数種のヌクレアーゼを標準的なプラスミドまたはＡＡＶベクターによって保有することができる。さらに、これらの異なるベクターを、同じまたは異なる経路（筋肉内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、腹腔内投与および／または筋肉内注射）によって投与することができる。これらのベクターを、同時にまたは任意の順番で、送達することができる。

そのため、本開示は、治療タンパク質をコードする導入遺伝子の挿入に適応し易い疾患および状態のｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏでの処置を含み、例えば、第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８）などの凝固因子のヌクレアーゼ媒介性組込みを介した血友病の処置などを含む。組成物は、血清または標的器官もしくは標的細胞で所望の濃度の治療ポリペプチドを得るために、有効量でヒト患者へ投与される。投与は、ポリヌクレオチドが所望の標的細胞に送達される任意の手段に依ることができる。例えば、ｉｎｖｉｖｏおよびｅｘｖｉｖｏの両方の方法が意図される。門脈への静脈内注射は、好ましい投与方法である。他のｉｎｖｉｖｏ投与の様式としては、例えば、肝動脈を通じることを含めて肝臓葉もしくは胆管への直接注射および肝臓遠位への静脈内注射、肝実質への直接注射、肝動脈を介した注射ならびに／または胆管を通じた逆行注射が挙げられる。ｅｘｖｉｖｏ投与の様式としては、切除した肝細胞または肝臓の他の細胞をｉｎｖｉｔｒｏで形質導入し、続いて形質導入された切除肝細胞をヒト患者の門脈脈管、肝実質または胆管へ戻して注入することが挙げられる。例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎら、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ、６巻：３３５〜３４１頁（１９９４年）を参照されたい。

投与する有効量のヌクレアーゼ（複数可）およびドナーは、患者に応じておよび目的の治療ポリペプチドによって変化することになる。したがって、有効量は、その組成物を投与する医師によって最適に決定され、適切な投薬量は、当業者によって容易に決定され得る。十分な時間で組込みおよび発現させた後（例えば、典型的には４〜１５日間）、治療ポリペプチドの血清または他の組織のレベルの分析、および投与前の初期レベルとの比較によって、投与されている量が少なすぎるのか、適正な範囲内であるか、または多すぎるのかを決定する。また、初期投与およびそれに引き続いての投与に適したレジメンも変化し得るが、初期投与と、必要であればそれに引き続いての投与とを行うのが典型的である。引き続いての投与は、種々の間隔で投与されてもよく、毎日から毎年まで数年に１回までの範囲に及ぶ。当業者は、適切な免疫抑制技法が、送達ベクターの免疫抑制による形質導入の阻害または遮断を回避するために推奨され得ることを理解する。例えば、Ｖｉｌｑｕｉｎら、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒ．、６巻：１３９１〜１４０１頁（１９９５年）を参照されたい。

ｅｘｖｉｖｏとｉｎｖｉｖｏとの両方の投与に用いる製剤としては、液体中懸濁液物または乳濁液が挙げられる。多くの場合、活性成分は、薬学的に許容され、かつ活性成分に適合する賦形剤と混合される。適当な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組合せが挙げられる。さらに、組成物は、湿潤剤もしくは乳濁剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤または医薬組成物の効果を高める他の試薬などの微量の補助的な物質を含有していてもよい。

以下の実施例は、ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系を含む、本開示の例示的な実施形態に関する。このことが、実例のみの目的にあること、ならびに他のヌクレアーゼが使用され得ること、例えば、Ｔｔａｇｏ系、遺伝子操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）が使用され得ること、および／または天然起源のもしくは遺伝子操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）のＤＮＡ結合ドメインと異種由来開裂ドメインとの融合物、および／またはメガヌクレアーゼとＴＡＬＥタンパク質との融合物が使われ得ることであることは理解されよう。

（実施例１）：ジンクフィンガーヌクレアーゼのアセンブリー
Millerら（２００７年）Nat. Biotechnol. ２５巻：７７８〜７８５頁に記載されているように、ＺＦＮをヒトＣＣＲ５およびＡＡＶＳ１遺伝子に対してアセンブルし、ＥＬＩＳＡおよびＣＥＬ１アッセイによって試験した。ＣＣＲ５特異的ＺＦＮについては、米国特許第７，９５１，９２５号を参照されたく、ＡＡＶＳ１特異的ＺＦＮについては、米国特許第８，１１０，３７９号を参照されたい。どちらも参照により本明細書に組み込まれる。

（実施例２）：ＡＡＶ−ＧＦＰドナーのＣＤ３４＋細胞への送達
ＡＡＶを、ドナー分子をＣＤ３４＋細胞に送達するためのビヒクルとして試験するために、４種の異なるＡＡＶ血清型を評価した。ＣＭＶにより駆動されるｅＧＦＰ導入遺伝子が血清型特異的ＬＴＲの間に挿入されたＡＡＶベクターを構築した。試験したＡＡＶ血清型には、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２が含まれた。これらのＡＡＶベクターでは、ＺＦＮをコードする核酸配列の全てはＡＡＶ２ＩＴＲが隣接し、そして、それぞれＡＡＶ５、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ８に由来するカプシドタンパク質を使用して被包する（GrimmおよびKay（２００３年）Current Gene Therapy ３巻：２８１〜３０４頁を参照されたい）。

ウイルス粒子を含有するドナーの産生を、当技術分野における標準の方法を使用したＨＥＫ２９３系を使用して調製することによって行った（Liら、同書を参照されたい、例えば、ＵＳ６７２３５５１を参照されたい）。Ｇ−ＣＳＦにより動員される白血球除去に由来し、ＭｉｌｅｎｙｉＣｌｉｎｉＭＡＣＳｓｙｓｔｅｍ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した正の選択によって精製された、動員された末梢血ＣＤ３４＋細胞（ｍＰＢＣＤ３４＋）に、ＣＭＶにより駆動されるｅＧＦＰ導入遺伝子を含有する、示されているＡＡＶベクターを用いて、ＡＡＶベクターの存在下で細胞を培養することによって形質導入した。次いで、感染の２日後および５日後（ｄｐｉ）に細胞を収集し、ＧＦＰ発現についてフローサイトメーター（Ｇｕａｖａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を製造者のプロトコールに従って使用して分析した。

図１に示されている結果は、これらの条件で、ＡＡＶ２／６−ＧＦＰドナー粒子が他のＡＡＶ血清型を用いて形質導入した細胞の６倍超のＧＦＰ発現ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＰＣを生成できることを実証している。

（実施例３）：ＡＡＶ２／６を使用したＲＦＬＰ保有導入遺伝子の送達
ＣＤ３４＋細胞における標的化された組込みを試験するために、ＡＡＶ６−Ｒ５−１６０−ＸｈｏＩドナーを生成した。このウイルスベクターへの導入遺伝子挿入では、２つのＣＣＲ５特異的ＺＦＮ結合部位（図２Ａ）、ＺＦＮ対８２６７：２０５０５（８１９６ｚとも呼ばれる）の間にＸｈｏＩ制限酵素部位を導入した。ＸｈｏＩ部位には、配列がゲノム中のＺＦＮ開裂部位に隣接するゲノム中の領域に相同である相同性アームが隣接する。具体的には、右の相同性アームはおよそ１３５１塩基対であり、左の相同性アームはおよそ５０９塩基対である。ＡＡＶ６−Ｒ５−１６０−ＸｈｏＩドナーを３００〜１×１０^５ｖｇ／細胞の間の用量で上記の通りＣＤ３４＋細胞に形質導入した。１日後、ＣＣＲ５特異的ＺＦＮをコードするｍＲＮＡ（１２０μｇ／ｍｌ）を、形質導入された細胞中に、ＢＴＸＥＣＭ８３０（ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ）を使用したエレクトロポレーションによって導入した。ｍＲＮＡはＡｓｕｒａｇｅｎ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）により２Ａ構築物（８２６７−２Ａ−２０５０）として製造されたものであり、１２０μｇ／ｍｌで使用した。

感染の５日後（ｄｐｉ）に、細胞をゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）精製のために収集し、その後のＲＦＬＰアッセイ（図２Ｂ）およびＩｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシング（図２Ｃ）のために処理した。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＴｉｓｓｕｅＸＳキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）を使用してゲノムＤＮＡを単離した。ネステッドＰＣＲ手法を使用してＲＦＬＰアッセイを実施し、そこで、まず、以下のプライマー：５’−ＣＴＧＴＧＣＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＧＣ−３’（配列番号１）および５’−ＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＣＴＡＣＡＧＣＣＡＡＧＣ−３’（配列番号２）を使用してＺＦＮ開裂部位の周囲の領域を増幅した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、以下のプライマー対：５’−ＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＡＴＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＧＴＣＣ−３’（配列番号３）および５’−ＣＡＡＡＧＴＣＣＣＡＣＴＧＧＧＣＧ−３’（配列番号４）を用いて再度ＰＣＲ増幅した。

次いで、増幅したＤＮＡを、ＸｈｏＩを用いた制限分析に供し、産物をゲル電気泳動によって分析した。図２Ｂに示されているように、分析により、ＸｈｏＩを含有する導入遺伝子の存在が、存在するＤＮＡ分子のおよそ１８パーセントに至るまでのレベルで実証されたが、これはＡＡＶ６ドナーとＣＣＲ５特異的ＺＦＮをコードするｍＲＮＡの両方で処理したＣＤ３４＋試料においてのみであった。

Ｉｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングにより、ＺＦＮにより誘導されるゲノム改変をＮＨＥＪ（「インデル」として公知の一般には小さな挿入および／または欠失）経路およびＨＤＲ（ＴＩ）経路によって同時検出することが可能になった（図２Ｃ）。端的に述べると、まず、ＣＣＲ５ＺＦＮ開裂部位の周囲の領域を、５’−ＣＴＧＴＧＣＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＧＣ−３’（配列番号１）および５’−ＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＣＴＡＣＡＧＣＣＡＡＧＣ−３’（配列番号２）である、相同アームの外側に位置するプライマーを使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、次いで、標的特異的な配列とＩｌｌｕｍｉｎａ−ディープシーケンシング用のアダプターの両方を含有する融合プライマーの対：５’−ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＧＣＣＡＧＧＴＴＧＡＧＣＡＧＧＴＡＧＡＴＧ−３’（配列番号５）および５’−ＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＣＴＣＴＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＴ−３’（配列番号６）を使用してＰＣＲ増幅した。最後に、以下のプライマー対：５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴ−３’（配列番号７）および５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ−３’（配列番号８）を使用した最終的なＰＣＲ反応において試料バーコードを加えた。最終的なＰＣＲ産物をＭｉＳｅｑｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）にかけた。カスタマイズされたスクリプトを使用してデータを解析した。

ＴＩ頻度のＡＡＶ６ドナーの用量依存的な上昇が観察された。ＴＩのピークレベル（２２％）は、１０，０００ｖｇ／ｍｌのＡＡＶ６ドナーで実現された（図２Ｃ）。さらに、インデル頻度は、ＡＡＶ６ドナーの用量およびＴＩ頻度と逆相関を示した。

（実施例４）：ドナー処理とＺＦＮ処理のタイミングおよび順序の最適化
ＨＤＲによる導入遺伝子の標的化された組込みを最大にするために、ＡＡＶ６形質導入およびＺＦＮｍＲＮＡエレクトロポレーションの最適なタイミングおよび順序を調査した。ＡＡＶ６−Ｒ５−１６０−ＸｈｏＩドナーを、ＣＤ３４＋細胞に、ＣＣＲ５特異的ＺＦＮｍＲＮＡを用いたエレクトロポレーション（ＥＰ）の最大４８時間前（−４８時間）〜２０時間後（＋２０時間）に導入した。細胞を収集し、その後の時点で、ｇＤＮＡ精製およびその後のＩｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングのために処理した。

図３Ａおよび図３Ｂに示されているように、ＣＣＲ５ＺＦＮをコードするｍＲＮＡを用いたエレクトロポレーション前にＡＡＶ６−Ｒ５−１６０−ＸｈｏＩドナーを用いて短時間処理（６時間以内）することにより、２０％超の標的化された組込みが誘導された。１６時間前の処理、２０時間前の処理、または２４時間前の処理ではわずかに低い効率が観察され、４８時間前の処理を使用した場合にはＴＩ効率の有意な降下が観察された。図３Ｂに示されているように、ヌクレアーゼにより、ドナーをヌクレアーゼトランスフェクションの後（１時間以内）に提供した場合であってもＣＤ３４＋細胞における効率的な標的化された組込みが刺激された。しかし、ドナーをヌクレアーゼトランスフェクションの４時間後に提供した場合にはＴＩ効率の有意な低下が観察され、ドナーをヌクレアーゼトランスフェクションの２０時間後に提供した場合にはＴＩがほとんど見られなかった。データは、ＨＤＲによる効率的なゲノム改変のためには、ＺＦＮｍＲＮＡを用いたエレクトロポレーションの前２４時間以内またはエレクトロポレーション後１時間以内にＡＡＶ６ドナーを用いたＣＤ３４＋細胞への形質導入を行うことが最適であることを示唆している。

（実施例５）：より大きな導入遺伝子の組込み
ドナーのＡＡＶ６媒介性送達が、完全な導入遺伝子発現カセットなどのより大きな異種ＤＮＡの断片の標的化された組込みにも有効であるかどうかを試験するために、ｐｇｋプロモーターにより駆動されるｅＧＦＰ発現カセット（１．６ｋｂ）がＣＣＲ５相同アームの間に挿入されたＲ５−ｐｇｋ−ＧＦＰ−ｐＡドナーを構築した（図４Ａ）。

ＣＤ３４＋細胞を、ＡＡＶ６−Ｒ５−ｐｇｋ−ＧＦＰ−ｐＡドナーおよびＣＣＲ５ＺＦＮｍＲＮＡを用いて上記の通り処理し、次いで、フローサイトメトリー分析のために収集した。

図４Ｂに示されているように、１５ｄｐｉにおいて（図４Ｂ）またはそれより前の時点において、ドナー（１０００ｖｇ／ｍｌおよび３０００ｖｇ／ｍｌ）とＺＦＮの両方を用いて処理した試料中にはおよそ１５％のＧＦＰ＋細胞が存在していたが、ドナー単独で処理した試料中には存在していなかった。

ＧＦＰカセットのＣＣＲ５遺伝子座への標的化された組込みの存在を、半定量的Ｉｎ−ＯｕｔＰＣＲアッセイを使用してさらに確認した。標準対照のセットを、改変されていない野生型ｇＤＮＡを用いた、ＣＣＲ５遺伝子座におけるＧＦＰ導入遺伝子組込みの頻度が分かっている（サザンブロットによって決定される）ｇＤＮＡプールの段階希釈によって調製した。等量のｇＤＮＡならびにポリＡ領域（ｅＧＦＰカセット内に存在する）内に存在するプライマーおよびＺＦＮ標的部位の３’側のＣＣＲ５相同アーム領域の外側に位置するプライマーを使用してＰＣＲを実施した（図４Ｃ）。使用したプライマーを以下に示す：５’−ＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＧＣＡＧ−３’（配列番号９）および５’−ＣＣＡＧＣＡＡＴＡＧＡＴＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＡＡＡＴＴＣＣ−３’（配列番号１０）。

ＰＣＲ反応の第２のセットでは、プライマー対の両方のプライマーが標的部位の５’側に位置し、そのうちの１つがＣＣＲ５相同な領域の外側にある１つの追加的なプライマー対も同じＰＣＲ反応に含めた（２プライマー対）。第２のプライマー対をｇＤＮＡインプットの測定値として使用した。この追加的なプライマー対を下に示す：５’−ＧＡＴＴＴＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴＣＴＧＧＣ−３’（配列番号１１）および５’−ＣＣＡＴＣＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＣＴＧＴＧＣ−３’（配列番号１２）。

ＧＦＰ−ＴＩバンドの強度（図４Ｃ）および総ＣＣＲ５バンドと比較した相対的なＧＦＰ−ＴＩバンドの強度（図３Ｄ）に基づいて、１０００ｖｇ／ｍｌまたは３０００ｖｇ／ｍｌのＡＡＶ６ドナーおよびＣＣＲ５ＺＦＮｍＲＮＡを用いて処理したＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＰＣは、ＣＣＲ５遺伝子座におけるＧＦＰにおいて１０％超の標的化された組込みを有した。

総合すると、結果により、ＡＡＶ６ドナーの使用は、この方法を用いた、より大きなＤＮＡ断片の標的化された組込みに関しても効率が高いことが確認された。

（実施例６）：ゲノム中の第２の位置への標的化された組込み
そのような効率の高い標的化された組込みがＣＣＲ５遺伝子座に特異的なものである可能性を排除するために、以下の表１に示されている６つのフィンガーを伴うジンクフィンガータンパク質を含む、ＡＡＶＳ１を標的とするＺＦＮ対３００３５：３００５４の結合部位間にＨｉｎｄＩＩＩ部位が導入された、ＡＡＶＳ１に特異的なＨｉｎｄＩＩＩドナーを構築した。各フィンガーの認識へリックス領域が表１の１行にＦ１〜Ｆ６として示されており、ＺＦＰが結合した標的部位が表１の最初の列に示されている。米国特許第８，１１０，３７９号も参照されたい。標的配列では、ＺＦＮが結合したヌクレオチドが大文字で示されており、結合していないヌクレオチドが小文字で示されている。

ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを、ＡＡＶ６−ＡＡＶＳ１−ＨｉｎｄＩＩＩドナーおよびＡＡＶＳ１ＺＦＮｍＲＮＡを用いて処理した。５日後に細胞を収集し、ＡＡＶＳ１に特異的なプライマーを使用した上記のＩｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングのために処理した。

図５Ｂに示されているように、ＡＡＶＳ１ＺＦＮの存在下で、低用量のＡＡＶ６ドナー（１０００ｖｇ／ｍｌ）を使用すると対立遺伝子の３０％超が標的化された組込み（ＴＩ）を有し、高用量のＡＡＶ６ドナーを使用すると、対立遺伝子の５０％超がＴＩを有した。

（実施例７）：ＴＡＬＥＮ媒介性の標的化された組込み
ＣＤ３４＋細胞に、ＡＡＶ６−Ｒ５−１６０−ＸｈｏＩドナー（２０００ｖｇ／細胞）を用いて形質導入した。３７℃で２０時間インキュベートした後、米国特許第８，５８６，５２６号に記載されているＣＣＲ５特異的ＴＡＬＥＮｍＲＮＡ（各々８０μｇ／ｍｌ）を、形質導入された細胞中に、ＢＴＸＥＣＭ８３０（ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ）を使用したエレクトロポレーションによって導入した。５日後に、細胞をゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）精製のために収集し、その後のＩｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングのために処理した。

図６は、配列決定によって検出されたゲノム改変の量：挿入もしくは欠失（インデル）、またはドナー分子によってもたらされるＲＦＬＰの標的化された組込み（ＴＩ）のいずれかを示す。示されているように、ＴＡＬＥＮにより、初代ＣＤ３４＋細胞においてＡＡＶ６ドナーによってもたらされるＲＦＬＰの標的化された組込みが１０％超刺激された。

（実施例８）：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性の標的化された組込み
ＣＤ３４＋細胞に、ｒＡＡＶ６−ＡＡＶＳ１−ＨｉｎｄＩＩＩドナー（５００または２０００ｖｇ／細胞）を用いて形質導入した。３７℃で２０時間インキュベートした後、ＡＡＶＳ１特異的ＺＦＮ（３００５４：３００３５、４０μｇ／ｍｌ）またはＣａｓ９ｍＲＮＡ（２０μｇ／ｍｌ）およびＡＡＶＳ１特異的キメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）ＤＮＡ（１０〜４０μｇ／ｍｌ）を、形質導入された細胞中に、ＢＴＸＥＣＭ８３０（ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ）を使用したエレクトロポレーションによって導入した。ｇＲＮＡ−Ｔ１およびｇＲＮＡ−Ｔ２は、以下のＡＡＶＳ１ゲノム配列：ＧＴＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧ（配列番号２７）およびＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴＴＧＧ（配列番号２８）にそれぞれ結合するように設計されたガイドＲＮＡである。ＰＡＭ領域に下線が引かれている。５日後に、細胞をゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）精製のために収集し、その後のＩｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングのために処理した。図７は、配列決定によって検出されたゲノム改変の量：挿入もしくは欠失（インデル）、またはドナー分子によってもたらされるＲＦＬＰの標的化された組込み（ＴＩ）のいずれかを示す。示されているように、本実験において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により、初代ＣＤ３４＋細胞においてＡＡＶ６ドナーによってもたらされるＲＦＬＰの標的化された組込みが１％超刺激された。

（実施例９）：ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＡＡＶ形質導入およびＴＩ
初代ＣＤ４＋Ｔ細胞に、ＩＬ２（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＨｕｍａｎＴ−ＡｃｔｉｖａｔｏｒＣＤ３／ＣＤ２８（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の存在下で、ＣＭＶにより駆動されるｅＧＦＰ導入遺伝子を含有するＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９ベクターを用いて形質導入した。次いで、感染の５日後（ｄｐｉ）に細胞を収集し、フローサイトメーター（Ｇｕａｖａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して分析した。

ＧＦＰ陽性細胞の頻度（％）を下の表２に示す。ＡＡＶ６により、他の血清型（ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９）と比較して最も高い効率で初代ＣＤ４＋Ｔ細胞が形質導入された。

さらに、ＣＤ４＋細胞に、示されている用量のｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ６、またはＩＤＬＶＲ５−１６０−ＸｈｏＩドナーを用いて形質導入した。３７℃で２０時間インキュベートした後、ＣＣＲ５−またはＡＡＶＳ１−特異的ＺＦＮｍＲＮＡ（６０μｇ／ｍｌ）を、形質導入された細胞中に、ＢＴＸＥＣＭ８３０（ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ）を使用したエレクトロポレーションによって導入した。４日後に細胞をゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）精製のために収集し、その後のＩｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングのために処理した。

図８は、ＣＣＲ５−ヌクレアーゼ（図８Ａ）およびＡＡＶＳ１−ヌクレアーゼ（図８Ｂ）を用いて処理したＣＤ４＋Ｔ細胞における、配列決定によって検出されたゲノム改変の量：挿入もしくは欠失（インデル）、またはドナー分子によってもたらされるＲＦＬＰの標的化された組込み（ＴＩ）のいずれかを示す。示されているように、ＺＦＮにより、初代ＣＤ４＋細胞においてＡＡＶ６ドナーによってもたらされるＲＦＬＰの標的化された組込みが４０％超刺激された。

（実施例１０）：ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＡＡＶ形質導入およびＴＩ
初代ＣＤ８＋Ｔ細胞に、ＩＬ２（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＨｕｍａｎＴ−ＡｃｔｉｖａｔｏｒＣＤ３／ＣＤ２８（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の存在下で、ＣＭＶにより駆動されるｅＧＦＰ導入遺伝子を含有するＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９ベクターを用いて形質導入した。次いで、感染の５日後（ｄｐｉ）に細胞を収集し、フローサイトメーター（Ｇｕａｖａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して分析した。

ＧＦＰ陽性細胞の頻度（％）を下の表３に示す。ＡＡＶ６により、他の血清型（ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９）と比較して、比較的低い用量でＣＤ８＋Ｔ細胞が最も高い効率で形質導入された。

さらに、ＣＤ８＋細胞に、示されている用量のｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ６、またはＩＤＬＶＲ５−１６０−ＸｈｏＩドナーを用いて形質導入した。３７℃で２０時間インキュベートした後、ＣＣＲ５−またはＡＡＶＳ１−特異的ＺＦＮｍＲＮＡを、形質導入された細胞中に、ＢＴＸＥＣＭ８３０（ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ）を使用したエレクトロポレーションによって導入した。４日後に細胞をゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）精製のために収集し、その後のＩｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングのために処理した。図９は、ＣＣＲ５−ヌクレアーゼ（図９Ａ）およびＡＡＶＳ１−ヌクレアーゼ（図９Ｂ）を用いて処理したＣＤ８＋Ｔ細胞における、配列決定によって検出されたゲノム改変の量：挿入もしくは欠失（インデル）、またはドナー分子によってもたらされるＲＦＬＰの標的化された組込み（ＴＩ）のいずれかを示す。示されているように、ＺＦＮにより、初代ＣＤ８＋細胞においてＡＡＶ６ドナーによってもたらされるＲＦＬＰの標的化された組込みが３０％超刺激された。

（実施例１１）：ｅｘｖｉｖｏにおける方法
本明細書に記載されているＩＬ２ＲＧを発現する、以前に記載されている（Aiutiら（２０１３年）Science ３４１巻、１２３３１５１頁）ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（例えば、患者由来のＣＤ３４＋細胞および／または改変されたＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）を含めた、遺伝子改変された細胞を、以前に記載されているように（Aiutiら、同書）被験体に投与し、その結果、改変された細胞を用いて治療した被験体において長期間にわたる多系譜の生着がもたらされる。

本明細書にて言及されている全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

開示は、理解を明確にする目的で、説明および実施例によっていくらか詳細に提供されているが、本開示の精神または範囲を逸脱することなく様々な変形および改変が実践され得ることは、当業者にとって明らかである。したがって、前出の記載および実施例は、限定として解釈されるべきものではない。

Claims

明細書に記載の発明。