JP2018530309A - タンパク質−タンパク質相互作用の超分解能イメージング - Google Patents

Abstract

本開示は、分子内および分子間の相互作用、たとえば、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための方法および組成物を提供する。こうした方法は、かかる相互作用をサブ回折距離で検出するので、超分解能の検出法およびイメージング法と呼ばれる。

Description

関連出願
本出願は、合衆国法典第３５巻第１１９条第（ｅ）の規定により２０１５年８月７日出願の米国仮出願第６２／２０２，３２７号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に基づく利益を主張する。

連邦政府委託研究
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）により付与されたＵ０１−ＭＨ１０６０１１−０１および５Ｒ０１ＥＢ０１８６５９−０２に基づいて、ならびに米国科学財団（National Science Foundation）により付与されたＣＣＦ−１３１７２９１に基づいて、ならびに米国国防総省海軍研究事務所（U.S. Department of Defense, Office of Naval Research）により付与されたＮ０００１４−１３−１−０５９３に基づいて、政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に関する一定の権利を有する。

背景
ゲノムシーケンシングデータは、膨大な量の予測タンパク質セットを生成してきた。しかしながら、バイオメディカル研究に有用な包括的インタラクトームマップを確立するには、相互作用タンパク質の局在化および共局在化の精密かつ正確な研究方法が必要となる。現在利用可能な方法の多くは、単一細胞内の一過性相互作用を検出できず、その代わりに、細胞集団内の比較的安定なタンパク質相互作用のみを検出できるにすぎない（たとえば、共免疫沈降を用いて）。

概要
本開示は、タンパク質や他のバイオ分子などの相互作用部分の超分解能イメージングのための組成物、キット、および方法を提供する。ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴ（ナノスケールトポグラフィーによるイメージングのためのデオキシリボ核酸の点蓄積）技術に基づくこうした感度の良い特定の方法は、本明細書では「近接ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴ」法として参照される。近接ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴは、いくつかの実施形態では、個々の細胞内の２つの異なる分子間、たとえば、細胞内タンパク質（または核酸）間の相互作用を検出／可視化するために使用される。近接ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴでは、一対のオリゴヌクレオチド（たとえば、２００ヌクレオチド未満の長さまたは１００ヌクレオチド未満の長さを有する一本鎖核酸）が使用され、各オリゴヌクレオチドは、「ドッキング部位」の半体を形成するドメインを含み、２つの半体が一体化されてフルドッキング部位を形成した場合のみ標識「イメージャー鎖」に結合する。各オリゴヌクレオチドはまた、安定性ドメインも含む。一対のオリゴヌクレオチドの安定性ドメインは互いに相補的であるので、オリゴヌクレオチドに結合された結合パートナー（たとえばタンパク質）間の相互作用により一対のオリゴヌクレオチドが近接一体化されると、オリゴヌクレオチドは互いに結合する（安定性／ステムドメインを介して）。図１Ａ〜１Ｂに示されるように、それぞれドッキング部位の半体を含有する一対（相補対）の２つのオリゴヌクレオチドが互いに結合した場合（対象の２つの結合パートナーが互いに相互作用した場合または非常に近接した場合）のみ、フルドッキング部位が形成される。したがって、一対の両方のオリゴヌクレオチドが互いに十分に近接して互いに結合した場合のみ、ドッキング部位へのイメージャー鎖の結合が起こるであろう。各対のオリゴヌクレオチドを標的特異的抗体などの一対の標的特異的結合パートナーにコンジュゲートすることにより、かかる標的の相互作用をサブ回折限界分解能で直接観測可能である。したがって、本組成物および方法は、本明細書に提供されるように、たとえば、個々の細胞内の内因性タンパク質間の相互作用を可視化するために使用可能である。ＤＮＡドッキング鎖の直交性により多重化を達成することも可能である。

したがって、本開示は、（ａ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、（ｂ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、（ａ）および（ｂ）の安定性ドメインが互いに相補的であり、かつ（ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインが線状に組み合わされてフルドッキングドメインを形成する、第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、（ｃ）５’ドメインと、３’ドメインと、５’ドメインと３’ドメインとの間に位置するリンカードメインと、を含むイメージャー鎖であって、５’ドメインが（ａ）のハーフドッキングドメインに相補的であり、かつ３’ドメインが（ｂ）のハーフドッキングドメインに相補的である、イメージャー鎖と、を含む、システム、組成物、およびキットを提供する。

いくつかの実施形態では、（ａ）および（ｂ）の結合パートナーのそれぞれは、抗体または抗原結合抗体フラグメントである。抗体（および抗原結合抗体フラグメント）は、たとえば、モノクローナルまたはポリクローナルでありうる。キメラ抗体（および抗原結合抗体フラグメントならびにヒト化抗体（および抗原結合抗体フラグメント）もまた、本明細書に包含される。

いくつかの実施形態では、（ａ）および（ｂ）の結合パートナーのそれぞれは、異なるタンパク質に結合する。たとえば、一対の結合パートナーは、タンパク質Ａに特異的に結合する一方の抗体と、タンパク質Ｂに特異的に結合する他方の抗体と、を含みうる。したがって、各結合パートナー（たとえば抗体）は、異なるタンパク質に（たとえば、１つはタンパク質Ａに、１つはタンパク質Ｂに）結合する。いくつかの実施形態では、（ａ）および（ｂ）の結合パートナーのそれぞれは、同一のタンパク質の異なる結合部位（たとえばエピトープ）に結合する。たとえば、一対の結合パートナーは、タンパク質ＡのエピトープＡに特異的に結合する一方の抗体と、タンパク質ＡのエピトープＢに特異的に結合する他方の抗体と、を含みうる。したがって、各結合パートナー（たとえば抗体）は、同一のタンパク質の異なるエピトープに（たとえば、１つはエピトープＡに、１つはエピトープＢに）結合する。

いくつかの実施形態では、（ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインのそれぞれは、５〜１５ヌクレオチドの長さを有する。たとえば、（ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインのそれぞれは、５〜１０ヌクレオチドの長さを有しうる。いくつかの実施形態では、（ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインのそれぞれは、３〜２０、３〜１５、３〜１０、４〜２０、４〜１５、４〜１０、５〜２０、５〜１５、または５〜１０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、（ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインのそれぞれは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、（ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインのそれぞれは、５±２ヌクレオチド、６±２ヌクレオチド、７±２ヌクレオチド、または８±２ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、（ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインのそれぞれは、の長さ５〜７ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、（ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインのそれぞれは、６ヌクレオチドの長さを有する。

いくつかの実施形態では、（ａ）および（ｂ）の安定性ドメインのそれぞれは、５〜５０ヌクレオチドの長さを有する。たとえば、（ａ）および（ｂ）の安定性ドメインのそれぞれは、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、または１０〜２０ヌクレオチドの長さを有しうる。いくつかの実施形態では、（ａ）および（ｂ）の安定性ドメインのそれぞれは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、（ａ）および（ｂ）の安定性ドメインのそれぞれは、８±２ヌクレオチド、９±２ヌクレオチド、１０±２ヌクレオチド、１１±２ヌクレオチド、または１２±２ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、（ａ）および（ｂ）の安定性ドメインのそれぞれは、９〜１１ヌクレオチドの長さを有する。

いくつかの実施形態では、イメージャー鎖は、１０〜３０ヌクレオチドの長さを有する。たとえば、イメージャー鎖は、１０〜１５または１０〜２０ヌクレオチドの長さを有しうる。いくつかの実施形態では、イメージャー鎖は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、イメージャー鎖は、８±２ヌクレオチド、９±２ヌクレオチド、１０±２ヌクレオチド、１１±２ヌクレオチド、１２±２ヌクレオチド、１３±２ヌクレオチド、１４±２ヌクレオチド、１５±２ヌクレオチド、または１６±２ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、イメージャー鎖は、１０〜１２ヌクレオチドまたは１２〜１４ヌクレオチドの長さを有する。

いくつかの実施形態では、イメージャー鎖の５’ドメインおよび３’ドメインのそれぞれは、５〜１０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、イメージャー鎖の５’ドメインおよび３’ドメインのそれぞれは、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、イメージャー鎖の５’ドメインおよび３’ドメインのそれぞれは、６ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、イメージャー鎖の５’ドメインおよび３’ドメインのそれぞれは、６±２ヌクレオチドの長さを有する。

いくつかの実施形態では、リンカードメインは、１〜５ヌクレオチドの長さを有する。たとえば、リンカードメインは、１、２、３、４、または５ヌクレオチドの長さを有しうる。いくつかの実施形態では、リンカードメインは、チミン（Ｔ）ヌクレオチド（Ｔ残基）を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＴＴ配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカードメインは、アデニン（Ａ）ヌクレオチド（Ａ残基）を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＡＡ配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカードメインは、シトシン（Ｃ）ヌクレオチド（Ｃ残基）を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＣＣ配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカードメインは、グアニン（Ｇ）ヌクレオチド（Ｇ残基）を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧ配列を含むかまたはそれからなる。

いくつかの実施形態では、イメージャー鎖は、検出可能に標識される（検出可能な分子を含む）。いくつかの実施形態では、イメージャー鎖は、蛍光標識される（フルオロフォアなどの蛍光標識／分子を含む）。

いくつかの実施形態では、（ａ）および（ｂ）の結合パートナーのそれぞれは、ストレプトアビジン−ビオチン結合対によりそれぞれ（ａ）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる。たとえば、結合パートナーはストレプトアビジンに結合しうるとともに、オリゴヌクレオチドはビオチンに結合しうる。代替的に、結合パートナーはビオチンに結合しうるとともに、オリゴヌクレオチドはストレプトアビジンに結合しうる。

いくつかの実施形態では、組成物は、２つの標的（たとえば、互いに結合するかさもなければ相互作用するタンパク質）を含む複合体をさらに含み、（ａ）の結合パートナーは、２つの標的の一方に結合するかまたは結合され、かつ（ｂ）の結合パートナーは、２つの標的の他方に結合するかまたは結合される。

いくつかの実施形態では、２つの標的のそれぞれはタンパク質である。

いくつかの実施形態では、複数あるうちの異なる組成物のイメージャー鎖は、スペクトル識別可能な標識（たとえば、いくつかは赤色チャンネルの蛍光、他のものは青色チャンネルの蛍光）を含む。

また、本明細書には、（ａ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、（ｂ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、（ａ）および（ｂ）の安定性ドメインが互いに相補的であり、かつ（ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインが線状に組み合わされてフルドッキングドメインを形成する、第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、（ｃ）５’ドメインと、３’ドメインと、５’ドメインと３’ドメインとの間に位置するリンカードメインと、を含むイメージャー鎖であって、５’ドメインが（ａ）のハーフドッキングドメインに相補的であり、かつ３’ドメインが（ｂ）のハーフドッキングドメインに相補的である、イメージャー鎖と、を含み、複数あるうちの異なる組成物のイメージャー鎖がスペクトル識別不能な標識を含む、複数（たとえば、１０、１００、１０００、１００００など）の組成物も提供される。

また、本明細書には、（ａ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、（ｂ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、（ａ）および（ｂ）の安定性ドメインが互いに相補的であり、かつ（ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインが線状に組み合わされてフルドッキングドメインを形成する、第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、（ｃ）５’ドメインと、３’ドメインと、５’ドメインと３’ドメインとの間に位置するリンカードメインと、を含むイメージャー鎖であって、５’ドメインが（ａ）のハーフドッキングドメインに相補的であり、かつ３’ドメインが（ｂ）のハーフドッキングドメインに相補的である、イメージャー鎖と、を含み、複数の組成物の少なくとも１つが、複数あるうちの他の組成物とは異なる明滅頻度（たとえば、Ｋ_ＯＮ／Ｋ_ＯＦＦ）を有する、複数の組成物も提供される。

本明細書には、サンプル中の２つの標的の複合体を検出する方法であって、サンプルと、（ａ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、（ｂ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、（ａ）および（ｂ）の安定性ドメインが互いに相補的であり、かつ（ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインが線状に組み合わされてフルドッキングドメインを形成する、第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、（ｃ）５’ドメインと、３’ドメインと、５’ドメインと３’ドメインとの間に位置するリンカードメインと、を含むイメージャー鎖であって、５’ドメインが（ａ）のハーフドッキングドメインに相補的であり、かつ３’ドメインが（ｂ）のハーフドッキングドメインに相補的である、イメージャー鎖と、を接触させることであって、（ａ）の結合パートナーが２つの標的の一方に対して特異性を有し、かつ（ｂ）の結合パートナーが２つの標的の他方に対して特異性を有する、ことと、サンプル中の複合体の存在または不在を検出することと、を含む方法がさらに提供される。

いくつかの実施形態では、サンプルは、細胞（たとえば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞）または細胞ライセートである。

いくつかの実施形態では、２つの標的のそれぞれはタンパク質である。

いくつかの実施形態では、２つの標的のそれぞれは、細胞または細胞ライセートから得られる（たとえば、それらから単離されるかまたはそれらから精製される）。

いくつかの実施形態では、本方法は、サンプル中の２つの標的の複数の複合体を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、複数の複合体は複数の異なる複合体である。いくつかの実施形態では、複数あるうちの複合体のサブセットは、互いにサブ回折距離内に位置する。

本開示はまた、サンプル中の分子内相互作用を検出する方法であって、標的分子を含むサンプルと、（ａ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、（ａ）の結合パートナーが標的分子上のある位置に対して特異性を有する、第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、（ｂ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、（ｂ）の結合パートナーが標的分子上の他の位置に対して特異性を有し、（ａ）および（ｂ）の安定性ドメインが互いに相補的であり、かつ（ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインが線状に組み合わされてフルドッキングドメインを形成する、第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、（ｃ）検出可能な標識と、５’ドメインと、３’ドメインと、５’ドメインと３’ドメインとの間に位置するリンカードメインと、を含むイメージャー鎖であって、５’ドメインが（ａ）のハーフドッキングドメインに相補的であり、かつ３’ドメインが（ｂ）のハーフドッキングドメインに相補的である、イメージャー鎖と、を接触させることと、サンプル中の（ｃ）のイメージャー鎖の検出可能な標識の存在または不在を検出することと、を含む方法を提供する。

いくつかの実施形態では、サンプルは細胞または細胞ライセートである。

いくつかの実施形態では、標的分子はタンパク質である。

いくつかの実施形態では、（ａ）および（ｂ）の位置のそれぞれは、タンパク質上の異なるエピトープである。したがって、本方法は、対象のタンパク質上の２つの異なる結合部位（たとえばエピトープ）の存在を検出するために使用しうる。

また、本明細書には、（ａ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、（ｂ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、（ａ）および（ｂ）の安定性ドメインが互いに相補的であり、かつ（ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインが線状に組み合わされて第１のフルドッキングドメインを形成する、第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、（ｃ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第３の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、（ａ）および（ｃ）の安定性ドメインが互いに相補的であり、かつ（ａ）および（ｃ）のハーフドッキングドメインが線状に組み合わされて第２のフルドッキングドメインを形成する、第３の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、（ｄ）５’ドメインと、３’ドメインと、５’ドメインと３’ドメインとの間に位置するリンカードメインと、を含む第１のイメージャー鎖であって、第１のイメージャー鎖の５’ドメインが（ａ）のハーフドッキングドメインに相補的であり、かつ第１のイメージャー鎖の３’ドメインが（ｂ）のハーフドッキングドメインに相補的である、第１のイメージャー鎖と、（ｅ）５’ドメインと、３’ドメインと、５’ドメインと３’ドメインとの間に位置するリンカードメインと、を含む第２のイメージャー鎖であって、第２のイメージャー鎖の５’ドメインが（ａ）のハーフドッキングドメインに相補的であり、かつ第２のイメージャー鎖の３’ドメインが（ｃ）のハーフドッキングドメインに相補的である、第２のイメージャー鎖と、を含む、システム、キット、および組成物も提供される。

本開示は、いくつかの実施形態では、（ａ）５〜７ヌクレオチドの長さを有するハーフドッキングドメインと、９〜１１ヌクレオチドの長さを有する安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された抗体を含む第１の抗体−オリゴヌクレオチド（たとえば、抗体−ＤＮＡ）コンジュゲートと、（ｂ）５〜７ヌクレオチドの長さを有するハーフドッキングドメインと、９〜１１ヌクレオチドの長さを有する安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第２の抗体−オリゴヌクレオチド（たとえば、抗体−ＤＮＡ）コンジュゲートであって、（ａ）および（ｂ）の安定性ドメインが相補的であり、かつ（ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインが（たとえば線状に）アライメントしてフルドッキングドメインを形成する、第２の抗体−オリゴヌクレオチド（たとえば、抗体−ＤＮＡ）コンジュゲートと、（ｃ）５〜７ヌクレオチドの長さを有する５’ドメインと、５〜７ヌクレオチドの長さを有する３’ドメインと、５’ドメインと３’ドメインとの間に位置する１〜５ヌクレオチドの長さを有するリンカードメインと、を含むイメージャー鎖であって、５’ドメインが（ａ）のハーフドッキングドメインに相補的であり、かつ３’ドメインが（ｂ）のハーフドッキングドメインに相補的である、イメージャー鎖と、を含む、システム、組成物、およびキットを提供する。

図１Ａ〜１Ｃは、近接ＰＡＩＮＴの例を示している。図２Ａは、それぞれ２つのｐ−ＰＡＩＮＴ ＤＮＡオリゴの１つで標識された２つの標的タンパク質を示す。タンパク質が相互作用すれば、相互作用はＤＮＡ−ＰＡＩＮＴにより可視化可能であろう。図１Ｂは、ｐＰＡＩＮＴオリゴの詳細模式図を示し、ドッキング部位として機能する２つのオリゴは、一過的に結合する短い相補的ドメイン（ステム）を有する。このドメインは、イメージャー鎖の平均結合時間よりも長い平均結合時間を有するように設計される。したがって、ドッキング部位を形成するのに十分な程度に近くに２つのオリゴがある場合、イメージャー鎖は、ドッキング部位を形成するのに十分な程度に近くに２つのオリゴがなかった場合よりも高い確率でドッキング部位に結合するであろう。ドッキング部位が形成されなければ、ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴの痕跡は観測されない。この例に示されるｐＰＡＩＮＴに使用されるイメージャー鎖（プローブ）は、３つのドメイン、すなわち、一方のドッキング鎖配列の一末端「ａ１」（たとえば５’末端）に結合する末端ドメイン「ａ１＊」と、ＴＴリンカーを含む中央ドメインと、それは他方のドッキング鎖配列の一末端「２ａ」（たとえば３’末端）に結合する他の末端ドメイン「ａ２＊」と、を有する。本明細書で用いられる場合、リンカーおよびスペーサーという用語は同義的に用いられる。図１Ｃは、４つのコーナーがｐＰＡＩＮＴオリゴで「標識」されたＤＮＡオリガミ構造を示し、ｐＰＡＩＮＴオリゴ対が存在する場合、Ｃｙ３ｂ標識イメージャー鎖を用いてＤＮＡ−ＰＡＩＮＴ超分解能蛍光画像が得られた。ｐＰＡＩＮＴオリゴの一方のみが存在する場合、可視化可能な痕跡は得られなかった。図１Ｄは、ｐＰＡＩＮＴプローブを有する伸長部を含有するＤＮＡオリガミナノ構造を示し、対照ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴドッキング部位（Ｐ１６およびＰ３８）ならびにｐＰＡＩＮＴドッキング部位（ｐＰ１））を用いて所望のジオメトリーを可視化できることを実証する。図１Ｅは、ｐＰＡＩＮＴプローブ対（ｉ）、モチーフ２（ｉｉ）、およびモチーフ１（ｉｉｉ）がとる二次構造を示す。各モチーフは、２つのプローブがごく近接した場合は（ｉ）で表される二次構造をとることを保証するのに十分な程度に弱いが多価相互作用の形成を防止するのに十分な程度に強い二次構造をとるように設計した。この最後の特徴が有用である理由は、たとえば、通常は抗体が２つ以上のＤＮＡプローブで標識されるので、標的の１つのみが存在する場合でさえも、多価相互作用によりｐＰＡＩＮＴドッキング部位（ｉ）の形成を引き起こす可能性であるからである。 図１Ａ〜１Ｃは、近接ＰＡＩＮＴの例を示している。図２Ａは、それぞれ２つのｐ−ＰＡＩＮＴ ＤＮＡオリゴの１つで標識された２つの標的タンパク質を示す。タンパク質が相互作用すれば、相互作用はＤＮＡ−ＰＡＩＮＴにより可視化可能であろう。図１Ｂは、ｐＰＡＩＮＴオリゴの詳細模式図を示し、ドッキング部位として機能する２つのオリゴは、一過的に結合する短い相補的ドメイン（ステム）を有する。このドメインは、イメージャー鎖の平均結合時間よりも長い平均結合時間を有するように設計される。したがって、ドッキング部位を形成するのに十分な程度に近くに２つのオリゴがある場合、イメージャー鎖は、ドッキング部位を形成するのに十分な程度に近くに２つのオリゴがなかった場合よりも高い確率でドッキング部位に結合するであろう。ドッキング部位が形成されなければ、ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴの痕跡は観測されない。この例に示されるｐＰＡＩＮＴに使用されるイメージャー鎖（プローブ）は、３つのドメイン、すなわち、一方のドッキング鎖配列の一末端「ａ１」（たとえば５’末端）に結合する末端ドメイン「ａ１＊」と、ＴＴリンカーを含む中央ドメインと、それは他方のドッキング鎖配列の一末端「２ａ」（たとえば３’末端）に結合する他の末端ドメイン「ａ２＊」と、を有する。本明細書で用いられる場合、リンカーおよびスペーサーという用語は同義的に用いられる。図１Ｃは、４つのコーナーがｐＰＡＩＮＴオリゴで「標識」されたＤＮＡオリガミ構造を示し、ｐＰＡＩＮＴオリゴ対が存在する場合、Ｃｙ３ｂ標識イメージャー鎖を用いてＤＮＡ−ＰＡＩＮＴ超分解能蛍光画像が得られた。ｐＰＡＩＮＴオリゴの一方のみが存在する場合、可視化可能な痕跡は得られなかった。図１Ｄは、ｐＰＡＩＮＴプローブを有する伸長部を含有するＤＮＡオリガミナノ構造を示し、対照ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴドッキング部位（Ｐ１６およびＰ３８）ならびにｐＰＡＩＮＴドッキング部位（ｐＰ１））を用いて所望のジオメトリーを可視化できることを実証する。図１Ｅは、ｐＰＡＩＮＴプローブ対（ｉ）、モチーフ２（ｉｉ）、およびモチーフ１（ｉｉｉ）がとる二次構造を示す。各モチーフは、２つのプローブがごく近接した場合は（ｉ）で表される二次構造をとることを保証するのに十分な程度に弱いが多価相互作用の形成を防止するのに十分な程度に強い二次構造をとるように設計した。この最後の特徴が有用である理由は、たとえば、通常は抗体が２つ以上のＤＮＡプローブで標識されるので、標的の１つのみが存在する場合でさえも、多価相互作用によりｐＰＡＩＮＴドッキング部位（ｉ）の形成を引き起こす可能性であるからである。 図１Ａ〜１Ｃは、近接ＰＡＩＮＴの例を示している。図２Ａは、それぞれ２つのｐ−ＰＡＩＮＴ ＤＮＡオリゴの１つで標識された２つの標的タンパク質を示す。タンパク質が相互作用すれば、相互作用はＤＮＡ−ＰＡＩＮＴにより可視化可能であろう。図１Ｂは、ｐＰＡＩＮＴオリゴの詳細模式図を示し、ドッキング部位として機能する２つのオリゴは、一過的に結合する短い相補的ドメイン（ステム）を有する。このドメインは、イメージャー鎖の平均結合時間よりも長い平均結合時間を有するように設計される。したがって、ドッキング部位を形成するのに十分な程度に近くに２つのオリゴがある場合、イメージャー鎖は、ドッキング部位を形成するのに十分な程度に近くに２つのオリゴがなかった場合よりも高い確率でドッキング部位に結合するであろう。ドッキング部位が形成されなければ、ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴの痕跡は観測されない。この例に示されるｐＰＡＩＮＴに使用されるイメージャー鎖（プローブ）は、３つのドメイン、すなわち、一方のドッキング鎖配列の一末端「ａ１」（たとえば５’末端）に結合する末端ドメイン「ａ１＊」と、ＴＴリンカーを含む中央ドメインと、それは他方のドッキング鎖配列の一末端「２ａ」（たとえば３’末端）に結合する他の末端ドメイン「ａ２＊」と、を有する。本明細書で用いられる場合、リンカーおよびスペーサーという用語は同義的に用いられる。図１Ｃは、４つのコーナーがｐＰＡＩＮＴオリゴで「標識」されたＤＮＡオリガミ構造を示し、ｐＰＡＩＮＴオリゴ対が存在する場合、Ｃｙ３ｂ標識イメージャー鎖を用いてＤＮＡ−ＰＡＩＮＴ超分解能蛍光画像が得られた。ｐＰＡＩＮＴオリゴの一方のみが存在する場合、可視化可能な痕跡は得られなかった。図１Ｄは、ｐＰＡＩＮＴプローブを有する伸長部を含有するＤＮＡオリガミナノ構造を示し、対照ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴドッキング部位（Ｐ１６およびＰ３８）ならびにｐＰＡＩＮＴドッキング部位（ｐＰ１））を用いて所望のジオメトリーを可視化できることを実証する。図１Ｅは、ｐＰＡＩＮＴプローブ対（ｉ）、モチーフ２（ｉｉ）、およびモチーフ１（ｉｉｉ）がとる二次構造を示す。各モチーフは、２つのプローブがごく近接した場合は（ｉ）で表される二次構造をとることを保証するのに十分な程度に弱いが多価相互作用の形成を防止するのに十分な程度に強い二次構造をとるように設計した。この最後の特徴が有用である理由は、たとえば、通常は抗体が２つ以上のＤＮＡプローブで標識されるので、標的の１つのみが存在する場合でさえも、多価相互作用によりｐＰＡＩＮＴドッキング部位（ｉ）の形成を引き起こす可能性であるからである。 図１Ａ〜１Ｃは、近接ＰＡＩＮＴの例を示している。図２Ａは、それぞれ２つのｐ−ＰＡＩＮＴ ＤＮＡオリゴの１つで標識された２つの標的タンパク質を示す。タンパク質が相互作用すれば、相互作用はＤＮＡ−ＰＡＩＮＴにより可視化可能であろう。図１Ｂは、ｐＰＡＩＮＴオリゴの詳細模式図を示し、ドッキング部位として機能する２つのオリゴは、一過的に結合する短い相補的ドメイン（ステム）を有する。このドメインは、イメージャー鎖の平均結合時間よりも長い平均結合時間を有するように設計される。したがって、ドッキング部位を形成するのに十分な程度に近くに２つのオリゴがある場合、イメージャー鎖は、ドッキング部位を形成するのに十分な程度に近くに２つのオリゴがなかった場合よりも高い確率でドッキング部位に結合するであろう。ドッキング部位が形成されなければ、ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴの痕跡は観測されない。この例に示されるｐＰＡＩＮＴに使用されるイメージャー鎖（プローブ）は、３つのドメイン、すなわち、一方のドッキング鎖配列の一末端「ａ１」（たとえば５’末端）に結合する末端ドメイン「ａ１＊」と、ＴＴリンカーを含む中央ドメインと、それは他方のドッキング鎖配列の一末端「２ａ」（たとえば３’末端）に結合する他の末端ドメイン「ａ２＊」と、を有する。本明細書で用いられる場合、リンカーおよびスペーサーという用語は同義的に用いられる。図１Ｃは、４つのコーナーがｐＰＡＩＮＴオリゴで「標識」されたＤＮＡオリガミ構造を示し、ｐＰＡＩＮＴオリゴ対が存在する場合、Ｃｙ３ｂ標識イメージャー鎖を用いてＤＮＡ−ＰＡＩＮＴ超分解能蛍光画像が得られた。ｐＰＡＩＮＴオリゴの一方のみが存在する場合、可視化可能な痕跡は得られなかった。図１Ｄは、ｐＰＡＩＮＴプローブを有する伸長部を含有するＤＮＡオリガミナノ構造を示し、対照ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴドッキング部位（Ｐ１６およびＰ３８）ならびにｐＰＡＩＮＴドッキング部位（ｐＰ１））を用いて所望のジオメトリーを可視化できることを実証する。図１Ｅは、ｐＰＡＩＮＴプローブ対（ｉ）、モチーフ２（ｉｉ）、およびモチーフ１（ｉｉｉ）がとる二次構造を示す。各モチーフは、２つのプローブがごく近接した場合は（ｉ）で表される二次構造をとることを保証するのに十分な程度に弱いが多価相互作用の形成を防止するのに十分な程度に強い二次構造をとるように設計した。この最後の特徴が有用である理由は、たとえば、通常は抗体が２つ以上のＤＮＡプローブで標識されるので、標的の１つのみが存在する場合でさえも、多価相互作用によりｐＰＡＩＮＴドッキング部位（ｉ）の形成を引き起こす可能性であるからである。 図１Ａ〜１Ｃは、近接ＰＡＩＮＴの例を示している。図２Ａは、それぞれ２つのｐ−ＰＡＩＮＴ ＤＮＡオリゴの１つで標識された２つの標的タンパク質を示す。タンパク質が相互作用すれば、相互作用はＤＮＡ−ＰＡＩＮＴにより可視化可能であろう。図１Ｂは、ｐＰＡＩＮＴオリゴの詳細模式図を示し、ドッキング部位として機能する２つのオリゴは、一過的に結合する短い相補的ドメイン（ステム）を有する。このドメインは、イメージャー鎖の平均結合時間よりも長い平均結合時間を有するように設計される。したがって、ドッキング部位を形成するのに十分な程度に近くに２つのオリゴがある場合、イメージャー鎖は、ドッキング部位を形成するのに十分な程度に近くに２つのオリゴがなかった場合よりも高い確率でドッキング部位に結合するであろう。ドッキング部位が形成されなければ、ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴの痕跡は観測されない。この例に示されるｐＰＡＩＮＴに使用されるイメージャー鎖（プローブ）は、３つのドメイン、すなわち、一方のドッキング鎖配列の一末端「ａ１」（たとえば５’末端）に結合する末端ドメイン「ａ１＊」と、ＴＴリンカーを含む中央ドメインと、それは他方のドッキング鎖配列の一末端「２ａ」（たとえば３’末端）に結合する他の末端ドメイン「ａ２＊」と、を有する。本明細書で用いられる場合、リンカーおよびスペーサーという用語は同義的に用いられる。図１Ｃは、４つのコーナーがｐＰＡＩＮＴオリゴで「標識」されたＤＮＡオリガミ構造を示し、ｐＰＡＩＮＴオリゴ対が存在する場合、Ｃｙ３ｂ標識イメージャー鎖を用いてＤＮＡ−ＰＡＩＮＴ超分解能蛍光画像が得られた。ｐＰＡＩＮＴオリゴの一方のみが存在する場合、可視化可能な痕跡は得られなかった。図１Ｄは、ｐＰＡＩＮＴプローブを有する伸長部を含有するＤＮＡオリガミナノ構造を示し、対照ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴドッキング部位（Ｐ１６およびＰ３８）ならびにｐＰＡＩＮＴドッキング部位（ｐＰ１））を用いて所望のジオメトリーを可視化できることを実証する。図１Ｅは、ｐＰＡＩＮＴプローブ対（ｉ）、モチーフ２（ｉｉ）、およびモチーフ１（ｉｉｉ）がとる二次構造を示す。各モチーフは、２つのプローブがごく近接した場合は（ｉ）で表される二次構造をとることを保証するのに十分な程度に弱いが多価相互作用の形成を防止するのに十分な程度に強い二次構造をとるように設計した。この最後の特徴が有用である理由は、たとえば、通常は抗体が２つ以上のＤＮＡプローブで標識されるので、標的の１つのみが存在する場合でさえも、多価相互作用によりｐＰＡＩＮＴドッキング部位（ｉ）の形成を引き起こす可能性であるからである。 ｐＰＡＩＮＴの第１段階。（左側パネル）ステムとドッキング部位の１つとの間のエッジのスペーサーがＴＴ、Ｔ、および不在である３つのタイプのドッキング部位を、中間のリンカーがＴＴＴＴ、ＴＴＴ、およびＴＴである３つのタイプのイメージャーで評価した。（中間パネル）速度論的分析に基づいてドッキング部位の最良性能イメージャーを選択した。（右側パネル）この対を用いて、例として、長さが９〜１１ｂｐの範囲内にある一群のステム設計の中から最適ステム長さを決定した。 ステムとドッキング部位配列の１つとの間がＴＴスペーサー（四角）、Ｔスペーサー（三角）、および無スペーサー（丸）である３つのタイプのドッキング部位、ならびに中間がＴＴＴＴ（ミディアムグレイ）、ＴＴＴ（ライトグレー）、およびＴＴ（ダークグレー）リンカーである３つのタイプのイメージャーに対する平均結合時間。いくつかの場合には、ｐＰＡＩＮＴ設計は、ステムの末端のスペーサーが欠如したものおよびイメージャー鎖中のＴＴリンカーに対応する。 ステムとドッキング部位配列の１つとの間がＴＴスペーサー（四角）、Ｔスペーサー（三角）、および無スペーサー（丸）である３つのタイプのドッキング部位、ならびに中間がＴＴＴＴ（ミディアムグレイ）、ＴＴＴ（ライトグレー）ＴＴ（ダークグレー）リンカーである３つのタイプのイメージャーに対するＫ_ｏｎ。 Ｓ９Ｖ２（四角）、Ｓ１０Ｖ２（三角）、Ｓ１１Ｖ１（丸）のステム長さで最良設計の平均結合時間を評価した。 Ｓ９Ｖ２（四角）、Ｓ１０Ｖ２（三角）、Ｓ１１Ｖ１（丸）のステム長さで設計例のＫ_ｏｎを評価した。 ｐＰＡＩＮＴの検出範囲。（左側パネル）ＤＮＡオリガミポリマーを３つの異なる距離でｐＰＡＩＮＴオリゴにより「標識」した。（中間パネル）距離の増加に伴ってよりぼやけたシグナルが見られると予想される。（右上パネル）こうした特徴付けにより、ｐ−ＰＡＩＮＴの動作範囲を決定可能であろう。（右下パネル）より長い距離で２つのドッキング部位を用いて行った試験の暫定的結果。２つのｐＰＡＩＮＴオリゴヌクレオチドをそれらの間の距離が５ｎｍ（上側パネル）および２０ｎｍ（下側パネル）になるように配置した。各パネルの左側で、六角ステープル表現（各六角形は３’末端伸長（ダークグレー）および５’末端（ブラック）の修飾に対して色コード付けしたステープルを表す）は、２つのハーフドッキング部位をＤＮＡオリガミ中に配置した位置を表す。こうした特徴付けにより、ｐＰＡＩＮＴの動作範囲は少なくとも２０ｎｍであると結論付けることができる。 ｐＰＡＩＮＴのｉｎ ｓｉｔｕベンチマーキング。

詳細な説明
本開示は、伝統的ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴ法の修正を提供する。単一のタンパク質や単一の核酸などの単一の標的のイメージングではなく、本開示の方法は、互い相互作用する標的（たとえば２つの標的）を検出する。本方法は、一対の標的が互いに十分に近接して２つ標的が互いに結合したまたは互いに複合体化したと見なせる場合にのみシグナルを生成する。標的が互いに十分に近くない場合、シグナルは検出されない。したがって、本開示は、ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴ法の予想外の使用、さらにはかかる使用に関連する組成物を提供する。

ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴは、回折限界距離未満の距離だけ互いに分離された標的への標識オリゴヌクレオチドの確率的短寿命結合を含む超分解能イメージング法である。本方法は、任意の所与の時間での標的のサブセットのみへのオリゴヌクレオチドの結合に基づく。標的のサブセットは、１つ以上（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）でありうるとともに、いくつかの場合には、標的は結合されないこともある。検出可能なオリゴヌクレオチドに全部に満たない標的が結合した場合、個々の標的からのシグナルは互いにより容易に識別される。これは、検出可能な標識にすべての標的が結合される状況とは対照的であり、その場合は、複数の標的からのシグナルを識別できない。したがって、互いに近すぎる標的は、それぞれ時差をつけてシグナルを検出することにより、空間的に分割することが可能である。

ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴ法では、標的は、標的に特異的に結合する結合パートナーを用いて検出される。結合パートナーは、次に、「ドッキング鎖」として本明細書で参照されるオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる。検出には、ドッキング鎖に相補的な「イメージャー鎖」（プローブ）として参照される他のオリゴヌクレオチドの使用がさらに必要である。ドッキング鎖は、イメージャー鎖が結合するドッキング部位を提供する。イメージャー鎖は、たとえば蛍光標識などで検出可能に標識される。ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴは、ドッキング鎖とイメージャー鎖との間の相互作用が短寿命であることを必要とする。これは、いくつかの方法により、たとえば、ドッキング鎖およびイメージャー鎖の長さにより、ドッキング鎖およびイメージャー鎖のヌクレオチド配列により、イメージャー鎖の濃度により、標的１つ当たりのドッキング鎖の数により、結合相互作用が起こる条件により、その他により、達成される。

二分子蛍光相補性（Hu, Chinenov, & Kerppola, 2002）などの他の技術は、細胞内のこうした相互作用の局在化を可能にするが、融合タンパク質の高い発現レベルを必要とする。近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）（Soederberg, et al., 2006）と称される異なる手段は、高い感度および特異性を提供するが、タンパク質間相互作用の指標となる視覚シグナルは、依然として回折限界の制約を受け、かかるシグナルの増幅および検出のためにいくつかの酵素工程が必要である。

単一分子局在化（ＳＭＬ）技術は、回折限界未満の可視化を可能にし、きわめて多くの価値ある生物学的情報を明らかにする。これを実現するには、多くの場合、蛍光のオン状態およびオフ状態を用いて回折限界領域内でタンパク質の局在化を時間的に切り離す。標的化（たとえば、誘導放出抑制顕微鏡法またはＳＴＥＤ）（Hell, 1994）ならびに確率的（光活性化局在顕微鏡法またはＰＡＬＭ、および確率的光学再構築顕微鏡法またはＳＴＯＲＭ）（Rust, Bates, & Zhuang, 2006）（Betzig, et al., 2006）スイッチング方法は両方とも、これまでにない空間分解能を達成したが、コストのかかる装置および／または専用の実験条件のいずれかを必要とする。

これとは対照的に、ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴは、相補的「ドッキング」鎖に一過的に結合する検出可能に標識された短いオリゴヌクレオチド（「イメージャー」鎖）のプログラマブル機能を利用して単一分子局在化に必要な確率的オン状態・オフ状態を達成することにより、超分解能顕微鏡法を容易にする（Jungmann et al. Nano Lett. 2010 Nov 10;10(11):4756-61（参照により本明細書に組み込まれる））。ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴは、ＤＮＡナノ構造で＜１０ｎｍの空間分解能を有する高多重化サブ回折画像を達成可能である。このほかに、抗体にＤＮＡオリゴヌクレオチドを結合することにより、ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴをｉｎ ｓｉｔｕ多重化二・三次元超分解能イメージングに拡張可能である。

また、ＳＭＬ法の分解能を他のアッセイと組み合わせる技術も利用可能である。こうした技術としては、タンパク質−タンパク質相互作用の超分解能イメージングのための二分子蛍光相補性（ＢｉＦＣ）とＰＡＬＭとの組合せ（Liu, et al., 2014）およびフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）とユニバーサルＰＡＩＮＴ（ｕＰＡＩＮＴ）との組合せ（Winckler, et al., 2013）が挙げられる。これらの方法は、サブ回折限界分解能を用いて相互作用タンパク質の役割に関する価値ある知見を提供してきた。それにもかかわらず、これらの方法は、非常に高レベルで融合タンパク質を発現する必要性に依存するので、そうした必要性の制約を受ける。そのほかに、これらの方法は、膜中の標的タンパク質の分析に制限される。さらに、これらの利用可能な技術を用いて多数のタンパク質対の多重化を行うのは非常に困難である。

近接ＰＡＩＮＴ
ＤＮＡ ＰＡＩＮＴと同様に、近接ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴは、ヌクレオチド配列の公知の速度論に基づく。オリゴヌクレオチド対の長さおよび配列を調節することにより、回折限界領域内で複合体などの標的分子の局在化を可能にする一過性の結合および非結合を達成することが可能である。２０１４年７月３０日出願の国際公開第２０１５／０１７５８６号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

いくつかの実施形態では、互いにごく近接した場合のみドッキング部位として機能する一対のヌクレオチド配列を含むシステムが提供される。対がごく近接しない場合、イメージャー鎖と各配列単独との間のいかなる相互作用も、検出に十分な程度に安定ではない（図１Ａ〜Ｂ）。

図１Ａ〜Ｃは、２つの相互作用タンパク質に関連する近接ＰＡＩＮＴ（ｐＰＡＩＮＴ）法を例示する。図１Ａでは、２つの標的タンパク質は、それぞれ、一対のｐ−ＰＡＩＮＴオリゴヌクレオチドの１つで標識される。タンパク質が相互作用している場合、相互作用はＤＮＡ−ＰＡＩＮＴにより可視化可能である。

図１Ｂは、ｐＰＡＩＮＴオリゴヌクレオチドの設計を例示する。２つのｐＰＡＩＮＴオリゴヌクレオチドは、組み合わされてドッキング部位を形成する。そのほかに、それらは、オリゴヌクレオチドを互いに一過的に結合する短い相補的ドメイン（安定性ドメインまたはステムドメインとして本明細書で参照される）を有する。このドメインは、ドッキング部位に結合するイメージャー鎖よりも長い平均結合時間を有する。したがって、２つのオリゴヌクレオチドが互いに十分に近い場合、イメージャー鎖は、オリゴヌクレオチドが互いに十分に近くでなかった場合よりも高い確率でドッキング部位に結合するであろう。オリゴヌクレオチドが互いに十分に近くない場合、有意なＤＮＡ−ＰＡＩＮＴ痕跡（たとえば蛍光シグナル）は得られない。

ｐＰＡＩＮＴイメージャー鎖の一実施形態は、図１Ｂに例示される。例示されたイメージャー鎖は３つのドメインを有し、第１のドメインは、ドッキング部位の５’末端ヌクレオチド配列（すなわち、５’ハーフドッキング部位）に結合し、第２のドメインは、ドッキング部位の３’末端ヌクレオチド配列（すなわち、３’ハーフドッキング部位）に結合し、および（任意選択的な）リンカードメインは、５’ドメインと３’ドメインの間に位置する。存在する場合、リンカーは、核酸であっても非核酸であってもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは１〜５ヌクレオチドを含む。ヌクレオチドは、Ａ、Ｔ、Ｃ、もしくはＧ残基またはそれらのいくつかの組合せ、変異体、もしくは修飾体でありうる。リンカーは、脱塩基部位で構成しうる。存在する場合、リンカー配列は、ハーフドッキング部位のいずれの配列にも結合しないことが重要である。より正確には、リンカーは、５’ドメインおよび３’ドメインがハーフドッキング部位上のそれらの相補的配列に結合するようにそれらを互いに十分に分離するように機能する。いくつかの実施形態では、リンカードメインは、Ｔ、ＴＴ、ＴＴＴ、ＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＴなどのＴ残基のみからなりうる。いくつかの実施形態では、リンカードメインは、Ａ、ＡＡ、ＡＡＡ、ＡＡＡＡ、ＡＡＡＡＡなどのＡ残基のみからなりうる。いくつかの実施形態では、リンカードメインは、Ｃ、ＣＣ、ＣＣＣ、ＣＣＣＣ、ＣＣＣＣＣなどのＣ残基のみからなりうる。いくつかの実施形態では、リンカードメインは、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧなどのＧ残基のみからなりうる。したがって、リンカーは、たとえば、Ａ（ポリＡ）、Ｔ（ポリＴ）、Ｃ（ポリＣ）、またはＧ（ポリＣ）のみからなるホモポリマーでありうる。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析では、図１Ｃに模式的に示されるように、ＤＮＡオリガミ構造（ナノ構造）の４つのコーナーをｐＰＡＩＮＴオリゴヌクレオチドで「標識」した。ｐＰＡＩＮＴオリゴヌクレオチド対が存在する場合、Ｃｙ３ｂ標識イメージャー鎖を用いてＤＮＡ−ＰＡＩＮＴ超分解能蛍光画像が得られた。ｐＰＡＩＮＴオリゴヌクレオチドの一方のみが存在する場合、可視化可能な痕跡は得られなかった。

標的特異的結合パートナーにコンジュゲートされるｐＰＡＩＮＴオリゴヌクレオチドは、一過的に結合する（互いにハイブリダイズする）短い相補的（ステムまたは安定性）ドメインを有して設計される。ステムドメインの平均結合時間は、イメージャー−ドッキング部位結合の平均結合時間よりも長い。したがって、ステムドメインは、イメージャー鎖結合の確率を増加させるようにドッキング部位複合体にある程度の安定性を付与する。イメージャー鎖は、ドッキング部位の５’末端（一方のオリゴヌクレオチドにより与えられる）およびドッキング部位の３’末端（他方のオリゴヌクレオチドにより与えられる）を結合する。

図１Ｂに例示されるイメージャー鎖は、それぞれハーフドッキング部位に結合する５’ドメインおよび３’ドメインを中間のリンカードメインと共に含む。イメージャーは、これまでに使用されたイメージャー鎖よりも長くしうる。増加した長さは、中間に小さいループを有する熱力学的ペナルティーを補償する（図１Ｂ）。

本開示は、とくに、各種標的間の相互作用、たとえば、少なくとも２つ（たとえば、２、３、４、または５つ）のタンパク質間の相互作用またはタンパク質と他の部分との間の相互作用を検出するための方法を提供する。

本開示の方法は、細胞内または細胞ライセート内の相互作用を研究するために使用可能である。そのほかに、たとえばスクリーニングアッセイまたはプラットフォームの一部としてｉｎ ｖｉｔｒｏ標的間の相互作用を研究するために使用しうる。

ドッキング部位、ハーフドッキング部位、およびハーフドッキング鎖
本明細書に提供される方法では、「ドッキング部位」は２つの「ハーフドッキング部位」を含み、各半体部位に標的特異的結合パートナーが寄与する。したがって、２つの標的が互いに複合体化された場合、２つの標的に結合された結合パートナーは互いにごく近接し、結合パートナーにコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドも同様に近接するであろう。オリゴヌクレオチドが互いにごく近接した場合、一緒になってイメージャー鎖がハイブリダイズ可能なフルドッキング部位を形成する。標的が複合体化されない場合、結合パートナーは互いに十分近接した範囲内に位置する可能性がなく、結合されたオリゴヌクレオチドは互いに相互作用しないであろう。また、したがって、ドッキング部位は形成されていないであろう。

システムおよびその成分は、結合を観測するのに必要な時間にわたりイメージャー鎖がハーフドッキング部位のいずれにも結合しないように設計される。したがって、イメージャー鎖の結合には、２つのハーフドッキング部位の組合せが必要とされる。イメージャー鎖が結合された場合のみ、焦点面に由来する検出可能なシグナルが得られるであろう。未結合イメージャー鎖は、典型的には焦点面外にあるので検出されないが、ノイズに寄与する可能性がある。

結合パートナーにコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドは、ハーフドッキング部位ドメインと、安定性（またはステム）ドメインと、任意選択的に、ハーフドッキング部位ドメインと安定性ドメインとの間のスペーサードメインと、任意選択的に、結合パートナーにコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの末端と安定性ドメインと間のスペーサードメインと、を含む。ハーフドッキング部位ドメインは、他方の結合パートナーにコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドにより付与される他方のハーフドッキング部位ドメインと組み合わされて相補的イメージャー鎖が結合するフルドッキング部位を形成するヌクレオチド配列である。安定性ドメインは、他方の結合パートナーにコンジュゲートされた他方のオリゴヌクレオチド中の安定性ドメインに相補的なヌクレオチド配列である。２つの標的が相互作用してこれらのオリゴヌクレオチドが十分にごく近接した場合、それらは安定性ドメインを介して互いにハイブリダイズして二本鎖ステムドメインを形成する。かかるハイブリダイゼーションは、２つのハーフドッキング部位ドメインの組合せにより形成されたフルドッキング部位の安定化に役立つ。オリゴヌクレオチドは、任意選択的に１または２つのスペーサードメインを含みうる。スペーサードメインは、互いのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび／またはドッキング部位へのイメージャー鎖のハイブリダイゼーションを促進しうる。

オリゴヌクレオチドは、典型的には一本鎖であるが、他方の結合パートナーにコンジュゲートされた他方のオリゴヌクレオチドに結合する前に二本鎖領域を含みうる。

本開示は、安定性ドメインを介する２つのオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションがドッキング部位へのイメージャー鎖の結合よりも安定であることを企図する。本開示はさらに、２つの複合体同士の結合が２つのオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションよりも安定であることを企図する。言い換えれば、各種相互作用の自由エネルギーは、次の通り、すなわち、標的−標的相互作用＞オリゴ−オリゴハイブリダイゼーション＞イメージャー鎖−ドッキング部位である。

フルドッキング部位は、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４ヌクレオチドの長さを含めて、約８ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約８〜約５０ヌクレオチド、約８〜約４０ヌクレオチド、約８〜約３０ヌクレオチド、約８〜約２０ヌクレオチド、約８〜約１５ヌクレオチド、または約１０〜約１４ヌクレオチドの長さを有しうる。いくつかの実施形態では、フルドッキング部位は、８〜１４ヌクレオチド長、または９〜１３ヌクレオチド長、または１０〜１２ヌクレオチド長である。イメージャー鎖の長さは、典型的には、少なくともフルドッキング部位の長さである。

ハーフドッキング部位は、長さが約４ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの範囲内である。いくつかの実施形態では、ドッキング鎖は、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長を含めて、約４〜約２０ヌクレオチド、約４〜約１０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ドッキング鎖は、４〜５０または４〜１００ヌクレオチドの長さを有する。たとえば、ドッキング鎖は、４〜１０、４〜１５、４〜２０、４〜２５、４〜３０、４〜３５、４〜４０、４〜４５、４〜５０、４〜５５、４〜６０、４〜６０、４〜７０、または４〜７５ヌクレオチドの長さを有しうる。

ハーフドッキング部位は、等しい数のヌクレオチドをフルドッキング部位に与えうるか、または等しくない数のヌクレオチドをドッキング部位に与えうる。たとえば、ハーフドッキング部位は、それぞれ、４、５、６、７、またはそれ以上のヌクレオチドを与えうる。いくつかの実施形態では、ハーフドッキング部位は、それぞれ、４または５ヌクレオチドを与える。ハーフドッキング部位は、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、または７ヌクレオチドを与える。

安定性ドメインまたはステムドメインは、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４ヌクレオチド長を含めて、約８〜約２０ヌクレオチド長、または約８〜約１５ヌクレオチド長でありうる。

オリゴヌクレオチドは、安定性ドメインとハーフドッキング部位ドメインとの間にスペーサードメインを含みうる。かかるスペーサードメインは、たとえば、１〜５ヌクレオチド長でありうる。ヌクレオチドは、Ｔ残基でありうるかまたは脱塩基残基でありうる。かかるスペーサードメインは、イメージャー鎖にハイブリダイズすべきでない。いくつかの実施形態では、安定性ドメインとハーフドッキング部位との間にスペーサードメインはない。

オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのコンジュゲート末端と安定性ドメインとの間にスペーサードメインを含みうる。このスペーサードメインは、たとえば５〜１００ヌクレオチド長を含めて、１〜１００ヌクレオチド長以上でありうる。スペーサードメインは、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、および１００ヌクレオチドまででありうる。いくつかの実施形態では、スペーサードメインは、約２．５ｎｍ、５ｎｍ、１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、またはそれ以上を含めて、約４０ｎｍ以下の長さである。

イメージャー鎖
「イメージャー鎖」は、ドッキング部位に一過的に結合する一本鎖核酸（たとえばＤＮＡ）である。イメージャー鎖は、ドッキング部位とほぼ同一の長さでありうる。したがって、リンカードメインを用いない場合、イメージャー鎖は、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４ヌクレオチド長を含めて、約８ヌクレオチド長〜約５０ヌクレオチド長、約８〜約４０ヌクレオチド、約８〜約３０ヌクレオチド、約８〜約２０ヌクレオチド、約８〜約１５ヌクレオチド、または約１０〜約１４のヌクレオチドでありうる。いくつかの実施形態では、イメージャー鎖は、リンカードメインまたは配列の不在下で、８〜１４ヌクレオチド長、または９〜１３ヌクレオチド長、または１０〜１２ヌクレオチド長である。

いくつかの実施形態では、イメージャー鎖は、それぞれ６ヌクレオチド長の５’および３’ドメインと２ヌクレオチドリンカーとを含めて、１４ヌクレオチド長である。

いくつかの実施形態では、イメージャー鎖は、それぞれ４〜８ヌクレオチド長の５’および３’ドメインと１〜４ヌクレオチドリンカーとを含めて、８〜２０ヌクレオチド長である。

イメージャー鎖は、フルドッキング部位に相補的でありかつ一過的に結合する。２つの核酸または核酸ドメインは、それらが互いに塩基対合または結合してワトソン・クリック相互作用により二本鎖核酸分子を形成する場合、互いに「相補的」である。本明細書で用いられる場合、「結合」とは、たとえば、生理学的条件下での静電的、疎水性、イオン性、および／または水素結合性の相互作用に基づく、少なくとも２つの分子間の会合を意味する。イメージャー鎖は、ドッキング部位の相補的領域に結合してから短時間内でドッキング部位から解離（脱結合）する場合、ドッキング部位に「一過的に結合する」と考えられる。こうした相互作用は、いくつかの実施形態では室温で起こりうる。いくつかの実施形態では、イメージャー鎖は、約０．１〜約１０または約０．１〜約５秒間にわたりドッキング鎖との結合を維持する。たとえば、イメージャー鎖は、約０．１、約１、約５、または約１０秒間にわたりドッキング鎖との結合を維持する。

リンカードメインの存在下では、イメージャー鎖は、上述した長さよりも少なくとも１〜５ヌクレオチド長くしうる。

本開示のイメージャー鎖は、検出可能な標識（たとえば、蛍光標識、その場合、「蛍光標識される」と考えられる）で標識しうる。たとえば、いくつかの実施形態では、イメージャー鎖は、少なくとも１つ（すなわち１つ以上）のフルオロフォアを含みうる。本開示に係る使用に供されるフルオロフォアの例としては、キサンテン誘導体（たとえば、フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシン、およびテキサスレッド）、シアニン誘導体（たとえば、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、およびメロシアニン）、ナフタレン誘導体（たとえば、ダンシルおよびプロダン誘導体）、クマリン誘導体、オキサジアゾール誘導体（たとえば、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール、およびベンゾオキサジアゾール）、ピレン誘導体（たとえば、カスケードブルー）、オキサジン誘導体（たとえば、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、およびオキサジン１７０）、アクリジン誘導体（たとえば、プロフラビン、アクリジンオレンジ、およびアクリジンイエロー）、アリールメチン誘導体（たとえば、オーラミン、クリスタルバイオレット、およびマラカイトグリーン）、ならびにテトラピロール誘導体（たとえば、ポルフィン、フタロシアニン、およびビリルビン）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の検出可能な標識、たとえば、金ナノ粒子または他の検出可能な粒子などは、本開示に従って使用しうる。

いくつかの実施形態では、イメージャー鎖は標的特異的に標識される。これは、複合体Ａに特異的なイメージャー鎖がスペクトル識別可能な標識で標識されることを意図する。本明細書で用いられる場合、「スペクトル識別可能な」標識とは、異なるスペクトルシグナルまたは波長の標識（たとえばフルオロフォア）を意味する。たとえば、Ｃｙ２フルオロフォアで標識されたイメージャー鎖は、約５１０ｎｍの光の波長でシグナルを発し、一方、Ｃｙ５フルオロフォアで標識されたイメージャー鎖は、約６７０ｎｍの光の波長でシグナルを発する。したがって、Ｃｙ２標識イメージャー鎖は、Ｃｙ５標識イメージャー鎖とスペクトル識別可能である。

それとは逆に、「スペクトル識別不能な」標識は、同一のスペクトルシグナルまたは波長を有する標識である。すなわち、波長が同一であるかまたは近接しているので、２つの蛍光スペクトル識別不能な標識間の識別に標識の発光波長を使用できない。いくつかの実施形態では、イメージャー鎖は非標的特異的に標識される。イメージャー鎖は、同一の標識またはスペクトル識別不能な標識で標識しうる。

本明細書に提供される方法は、複数の相互作用の検出に使用しうる。このため、本方法は、多重化方法またはアッセイとして参照しうる。異なる相互作用は、時間的に、またはスペクトル識別可能なシグナルを用いて、またはイメージャー鎖−ドッキング部位相互作用の明滅頻度の差により、互いに識別しうる。異なるイメージャー鎖を同時ではなく逐次的に使用して、異なる標的を時間的に識別可能である。たとえば、第１の相互作用に特異的な第１のイメージャー鎖を用いて第１の相互作用の存在を検出し、次いで、第２の相互作用に特異的な第２のイメージャー鎖を用いて第２の相互作用存在を検出するなど。異なるイメージャー鎖とは、異なるドッキング部位を検出する異なるヌクレオチド配列を有するイメージャー鎖を意味する。異なる標的は、スペクトル識別可能な標識で標識された異なるイメージャー鎖を用いてスペクトル識別可能である。たとえば、Ｃｙ２標識を有する第１のイメージャー鎖を用いて第１の相互作用を検出し、Ｃｙ５標識を有する第２のイメージャー鎖を用いて第２の相互作用を検出する。これらのスペクトル識別可能なイメージャー鎖は、同時に使用可能である。異なる標的は、異なる明滅頻度を有するイメージャー鎖−ドッキング部位の組合せにより識別可能である。本明細書に記載されるように、イメージャー鎖−ドッキング部位相互作用の明滅頻度は、規定された識別可能なオン速度および／またはオフ速度を有するように調節可能である。こうして、いくつかのイメージャー鎖−ドッキング部位の対は、高頻度で結合・脱結合することにより他の対よりも頻繁に「明滅する」ようになる。こうして、イメージャー鎖は、同一の標識を用いることを含めて、スペクトル識別不能な標識で標識しうるとともに、明滅頻度が異なるので依然として同時に使用しうる。明滅頻度は、イメージャー鎖の長さおよびそれに対応してドッキング部位を変化させることにより、配列組成を変化させることにより（たとえば、よりＡＴリッチまたはよりＧＣリッチにする）、他の方法を用いて融解温度を変化させることにより、たとえば、ハイブリダイゼーション条件を変化させることにより、標的１つ当たりのドッキング部位の数を変化させることにより、イメージャー鎖の濃度を増加させることにより、その他により、調節可能である。

結合パートナー
本方法は、結合パートナーをオリゴヌクレオチドにコンジュゲート可能である限り、結合パートナーが存在するまたは結合パートナーを作製可能である実質上任意の部分の相互作用を検出するために使用可能である。

オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされた結合パートナーは、ここでは、結合パートナー−核酸（ＢＰ−ＮＡ）コンジュゲートまたは結合パートナー−オリゴヌクレオチド（ＢＰ−オリゴ）コンジュゲートとして参照しうる。本明細書で用いられる場合、ＢＰ−ＮＡコンジュゲートまたはＢＰ−オリゴコンジュゲートとは、一本鎖核酸（たとえばＤＮＡ）に結合された（たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）リンカーを介して）分子を意味する。一本鎖核酸は、ハーフドッキング部位と、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含む。

結合パートナーは、バイオ分子（たとえば、タンパク質または核酸）などの対象の標的に対する親和性を有する（たとえば、それに結合する）任意の部分（たとえば、抗体またはアプタマー）でありうる。いくつかの実施形態では、結合パートナーはタンパク質である。本開示のコンジュゲートに使用するためのタンパク質の例としては、抗体（たとえば、モノクローナル抗体）、抗原結合抗体フラグメント（たとえば、Ｆａｂフラグメント）、レセプター、ペプチド、およびペプチドアプタマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の結合パートナーは、本開示に従って使用しうる。本明細書では、たとえば、静電的（たとえば、静電粒子）、疎水性、または磁気的（たとえば、磁気粒子）相互作用を介して標的に結合する結合パートナーが企図される。

本明細書で用いられる場合、「抗体」は、全長抗体、任意の抗原結合フラグメント（たとえば、「抗原結合部分」）、またはそれらの一本鎖を含む。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合により相互結合された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質またはその抗原結合部分を含むが、これらに限定されるものではない。抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル、異種、同種異系、もしくは同種同系、またはそれらの修飾形（たとえば、ヒト化、キメラ）でありうる。

本明細書で用いられる場合、抗体の「抗原結合部分」とは、抗原に特異的に結合する能力を維持する１つ以上の抗体フラグメントを意味する。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントにより発揮することが可能である。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＨドメインと、ＶＬドメインと、ＣＬドメインと、ＣＨ１ドメインと、からなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合された２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨドメインとＣＨ１ドメインとからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＨドメインとＶＬドメインとからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ward et al., Nature 341:544 546, 1989）、および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または（ｖｉｉ）合成リンカーにより任意選択的に連結されていてもよい２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せが挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＨおよびＶＬは個別の遺伝子によりコードされるが、ＶＨ領域とＶＬ領域とがペアになって１価分子を形成する単一のタンパク質鎖として作製できるようにする合成リンカーにより組換え法を用いて連結することが可能である（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる。たとえば、Bird et al. Science 242:423 426, 1988;およびHuston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988を参照されたい）。かかる一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を用いて得られ、フラグメントは、インタクト抗体と同様に有用性に関してスクリーニングされる。

本明細書で用いられる場合、「レセプター」とは、たとえばペプチドや低分子（たとえば、低分子量（＜９００ダルトン）の有機または無機の化合物）などのリガンドに結合する細胞由来の分子（たとえばタンパク質）を意味する。

本明細書で用いられる場合、「ペプチドアプタマー」とは、定常足場タンパク質に挿入される可変ペプチド配列を有する分子を意味する（たとえば、Baines IC, et al. Drug Discov. Today 11:334-341, 2006を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＢＰ−ＮＡコンジュゲートの分子は、たとえば核酸アプタマーなどの核酸である。本明細書で用いられる場合、「核酸アプタマー」とは、タンパク質または他の細胞標的に特異的に結合可能な二次構造および三次構造を形成可能な小さいＲＮＡまたはＤＮＡ分子を意味する（たとえば、Ni X, et al. Curr Med Chem. 18(27): 4206-4214, 2011を参照されたい）。したがって、いくつかの実施形態では、ＢＰ−ＮＡコンジュゲートはアプタマー−核酸コンジュゲートでありうる。

重要な実施形態では、結合パートナーは、対象の標的に結合する抗体または抗原結合抗体フラグメントである。

標的
標的は、対象の任意の分子または対象の分子（たとえばバイオ分子）上の任意の結合部位でありうる。標的の例としては、タンパク質および核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡたとえばｍＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。タンパク質の例としては、酵素、細胞シグナリング、リガンド結合、および／または局在化に関与するタンパク質、さらには構造タンパク質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、標的はタンパク質のエピトープである。

一対の標的は、一対の同一タイプの分子または一対の異なるタイプの分子でありうる。たとえば、一対の標的は、タンパク質Ａと核酸Ａ、タンパク質Ａとタンパク質Ｂ、または核酸Ａと核酸Ｂを含みうる。

方法
また、本明細書には、サンプル中の２つの標的の（少なくとも１つの）複合体を検出する方法であって、サンプルと、項目２９〜４４のいずれか一つに記載のイメージャー鎖と、項目２９〜４４のいずれか一つに記載の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、を接触させることであって、（ａ）の結合パートナーが２つの標的の一方に対して特異性を有し、かつ（ｂ）の結合パートナーが２つの標的の他方に対して特異性を有する、ことと、サンプル中の複合体の存在または不在を検出することと、を含む方法も提供される。

サンプルは、血液（たとえば、血清および／または血漿）サンプル、脳脊髄液サンプル、尿サンプル、または他の生物学的サンプルを含めて、組織サンプルなどの生物学的サンプルでありうる。いくつかの実施形態では、サンプルは細胞または細胞ライセートである。細胞は、たとえば、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞でありうる。他の細胞および細胞ライセートも本明細書に包含される。

標的は、いくつかの実施形態では、タンパク質や核酸などのバイオ分子である。対象のタンパク質の例としては、酵素、細胞シグナリング、リガンド結合、および／または局在化に関与するタンパク質、さらには構造タンパク質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。核酸の例としては、天然に存在するまたは工学操作（たとえば、合成もしくは組換え）が行われたＤＮＡおよびＲＮＡ（たとえばｍＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

いくつかの実施形態では、標的複合体は互いにサブ回折距離内に位置する。すなわち、光学イメージングシステムたとえば顕微鏡を使用する場合、相互作用標的の分解能は回折限界である（回折に基づくいずれの光学システムの分解能にも基本最大値が存在する）。

方法が行われる条件は、核酸ハイブリダイゼーション速度論を理解している当業者により決定可能である。かかる条件はさまざまでありうる。たとえば、標的検出の方法は、必要に応じて特定の濃度の塩と、核酸ハイブリダイゼーションおよび「明滅」速度論（以上で考察した通り）を可能にする任意の他の必要な試薬と、を有する反応緩衝液中または細胞ライセート中で行われる。

キット
そのほかに本明細書に提供されるのはキットである。キットは、本明細書に提供されるように、たとえば、個別の成分（個別に結合パートナーおよびオリゴヌクレオチド）としてまたはコンジュゲート（オリゴヌクレオチドに結合された結合パートナー）として、結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲート対と、さらには標識を含むまたは含まないイメージャー鎖と、を含みうる。キット中にはまた、本明細書に提供されるように、組成物に含まれうる任意の成分（たとえば、結合パートナー、核酸、リンカーなど）が含まれうる。たとえば、個別の成分は（たとえば個別の貯蔵容器内に）パッケージ化され、そしてより大きなパッケージ（たとえばボックス）内にまとめて提供される。

本開示は、以下の番号付き項目に包含される実施形態をさらに提供する。

１． 第１のオリゴヌクレオチドに結合された第１の結合パートナーを含む第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、第１のオリゴヌクレオチドが、第１のハーフドッキングドメインと、第１の安定性ドメインと、任意選択的に第１のスペーサードメインと、を含む、第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、
第２のオリゴヌクレオチドに結合された第２の結合パートナーを含む第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、第２のオリゴヌクレオチドが、第２のハーフドッキングドメインと、第２の安定性ドメインと、任意選択的に第２のスペーサードメインと、を含み、第１および第２の安定性ドメインが互いに相補的であり、かつ第１および第２のハーフドッキングドメインが、線状に組み合わされてフルドッキングドメインを形成する、第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、
５’ドメインと、３’ドメインと、５’ドメインと３’ドメインとの間のリンカードメインと、を含むイメージャー鎖であって、５’ドメインが第１のハーフドッキングドメインに相補的であり、かつ３’ドメインが第２のハーフドッキングドメインに相補的である、イメージャー鎖と、
を含む、キット、システム、または組成物。

２． 第１および第２の結合パートナーが抗体または抗原結合抗体フラグメントである、項目１に記載のキット、システム、または組成物。

３． 第１および第２の結合パートナーが第１および第２のタンパク質に結合し、第１および第２のタンパク質が互いに異なる、項目１または２に記載のキット、システム、または組成物。

４． 第１および第２のハーフドッキングドメインが５〜７ヌクレオチド長である、項目１〜３のいずれか一つに記載のキット、システム、または組成物。

５． 第１および第２のハーフドッキングドメインが両方とも６ヌクレオチド長である、項目１〜４のいずれか一つに記載のキット、システム、または組成物。

６． 第１および第２の安定性ドメインが９〜１１ヌクレオチド長である、項目１〜５のいずれか一つに記載のキット、システム、または組成物。

７． イメージャー鎖が１０〜１２ヌクレオチド長さまたは１２〜１４ヌクレオチド長である、項目１〜６のいずれか一つに記載のキット、システム、または組成物。

８． ５’および３’ドメインが６ヌクレオチド長である、項目１〜７のいずれか一つに記載のキット、システム、または組成物。

９． リンカードメインが１〜５ヌクレオチド長である、項目１〜８のいずれか一つに記載のキット、システム、または組成物。

１０． リンカードメインがＴ残基を含む、項目１〜９のいずれか一つに記載のキット、システム、または組成物。

１１． リンカードメインがＴＴ配列を含む、項目１〜１０のいずれか一つに記載のキット、システム、または組成物。

１２． イメージャー鎖が検出可能に標識される、項目１〜１１のいずれか一つに記載のキット、システム、または組成物。

１３． イメージャー鎖が蛍光標識される、項目１〜１２のいずれか一つに記載のキット、システム、または組成物。

１４． 結合パートナーがストレプトアビジンおよびビオチンを介してオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる、項目１〜１３のいずれか一つに記載のキット、システム、または組成物。

１５． 第１および第２の標的を含む複合体をさらに含み、第１の結合パートナーが第１の標的に結合するかまたは結合され、かつ第２の結合パートナーが第２の標的に結合するかまたは結合される、項目１〜１４のいずれか一つに記載のキット、システム、または組成物。

１６． 第１および第２の標的がタンパク質である、項目１５に記載のキット、システム、または組成物。

１７． 異なるシステムのイメージャー鎖がスペクトル識別可能な標識で標識される、項目１〜１６のいずれか一つに記載の複数のキット、システム、または組成物。

１８． 異なるシステムのイメージャー鎖がスペクトル識別不能な標識で標識される、項目１〜１６のいずれか一つに記載の複数のキット、システム、または組成物。

１９． システムの少なくとも１つが、複数あるうちの他のシステムと異なる明滅頻度を有する、項目１〜１６のいずれか一つに記載の複数のキット、システム、または組成物。

２０． サンプル中の第１および第２の標的の複合体を検出する方法であって、
サンプルと、
（ａ）項目１〜１６のいずれか一つに記載の第１および第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、第１の結合パートナーが第１の標的に対して特異性を有し、かつ第２の結合パートナーが第２の標的に対して特異性を有する、第１および第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、
（ｂ）項目１〜１６のいずれか一つに記載のイメージャー鎖と、
を接触させることと、
サンプル中の第１および第２の標的の複合体の存在を検出することと、
を含む方法。

２１． サンプルが細胞または細胞ライセートである、項目２０に記載の方法。

２２． 第１および／または第２の標的がタンパク質である、項目２０または２１に記載の方法。

２３． 標的が細胞または細胞ライセートから得られる、項目２０〜２２のいずれか一つに記載の方法。

２４． 方法が複数の複合体を検出する、項目２０〜２３のいずれか一つに記載の方法。

２５． 複数の複合体が複数の同一の複合体である、項目２４に記載の方法。

２６． 複数の複合体が複数の異なる複合体である、項目２４に記載の方法。

２７． 複数あるうちの複合体のサブセットが互いにサブ回折距離内に位置する、項目２４〜２６のいずれか一つに記載の方法。

２８． 第１のオリゴヌクレオチドに結合された第１の結合パートナーを含む第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、第１のオリゴヌクレオチドが、第１のハーフドッキングドメインと、第１の安定性ドメインと、任意選択的に第１のスペーサードメインと、を含む、第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、
第２のオリゴヌクレオチドに結合された第２の結合パートナーを含む第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、第２のオリゴヌクレオチドが、第２のハーフドッキングドメインと、第２の安定性ドメインと、任意選択的に第２のスペーサードメインと、を含み、第１および第２の安定性ドメインが互いに相補的であり、かつ第１および第２のハーフドッキングドメインが、線状に組み合わされて第１のフルドッキングドメインを形成する、第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、
第３のオリゴヌクレオチドに結合された第３の結合パートナーを含む第３の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、第３のオリゴヌクレオチドが、第３のハーフドッキングドメインと、第３の安定性ドメインと、任意選択的に第３のスペーサードメインと、を含み、第１および第３の安定性ドメインが互いに相補的であり、かつ第１および第３のハーフドッキングドメインが、線状に組み合わされて第２のフルドッキングドメインを形成する、第３の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、
第１の５’ドメインと、第１の３’ドメインと、第１の５’ドメインと第１の３’ドメインとの間の第１のリンカードメインと、を含む第１のイメージャー鎖であって、第１の５’ドメインが第１のハーフドッキングドメインに相補的であり、かつ３’ドメインが第２のハーフドッキングドメインに相補的である、第１のイメージャー鎖と、
第２の５’ドメインと、第２の３’ドメインと、第２の５’ドメインと第２の３’ドメインとの間の第２のリンカードメインと、を含む第２のイメージャー鎖であって、第２の５’ドメインが第１のハーフドッキングドメインに相補的であり、かつ第２の３’ドメインが第３のハーフドッキングドメインに相補的である、第２のイメージャー鎖と、
を含む、キット、システム、または組成物。

２９． （ａ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、
（ｂ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、（ａ）および（ｂ）の安定性ドメインが互いに相補的であり、かつ（ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインが線状に組み合わされてフルドッキングドメインを形成する、第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、
（ｃ）５’ドメインと、３’ドメインと、５’ドメインと３’ドメインとの間に位置するリンカードメインと、を含むイメージャー鎖であって、５’ドメインが（ａ）のハーフドッキングドメインに相補的であり、かつ３’ドメインが（ｂ）のハーフドッキングドメインに相補的である、イメージャー鎖と、
を含む組成物。

３０． （ａ）および（ｂ）の結合パートナーのそれぞれが抗体または抗原結合抗体フラグメントである、項目２９に記載の組成物。

３１． （ａ）および（ｂ）の結合パートナーのそれぞれが、異なるタンパク質に結合する、項目２９または３０に記載の組成物。

３２． （ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインのそれぞれが５〜１５ヌクレオチドの長さを有する、項目２９〜３１のいずれか一つに記載の組成物。

３３． （ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインのそれぞれが５〜１０ヌクレオチドの長さを有する、項目３２に記載の組成物。

３４． （ａ）および（ｂ）の安定性ドメインのそれぞれが５〜５０ヌクレオチドの長さを有する、項目２９〜３３のいずれか一つに記載の組成物。

３５． イメージャー鎖が１０〜３０ヌクレオチドの長さを有する、項目３４に記載の組成物。

３６． イメージャー鎖の５’ドメインおよび３’ドメインのそれぞれが５〜１０ヌクレオチドの長さを有する、項目２９〜３５のいずれか一つに記載の組成物。

３７． リンカードメインが１〜５ヌクレオチドの長さを有する、項目２９〜３６のいずれか一つに記載の組成物。

３８． リンカードメインがチミン（Ｔ）ヌクレオチドを含む、項目２９〜３７のいずれか一つに記載の組成物。

３９． リンカードメインがＴＴ配列を含む、項目２９〜３８のいずれか一つに記載の組成物。

４０． イメージャー鎖が検出可能に標識される、項目２９〜３９のいずれか一つに記載の組成物。

４１． イメージャー鎖が蛍光標識される、項目２９〜３９のいずれか一つに記載の組成物。

４２． （ａ）および（ｂ）の結合パートナーのそれぞれが、ストレプトアビジン−ビオチン結合対を介してそれぞれ（ａ）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる、項目２９〜４１のいずれか一つに記載の組成物。

４３． ２つの標的を含む複合体をさらに含み、（ａ）の結合パートナーが２つの標的の一方に結合するかまたは結合され、かつ（ｂ）の結合パートナーが２つの標的の他方に結合するかまたは結合される、項目２９〜４２のいずれか一つに記載の組成物。

４４． ２つの標的のそれぞれがタンパク質である、項目４３に記載の組成物。

４５． 複数あるうちの異なる組成物のイメージャー鎖がスペクトル識別可能な標識を含む、項目２９〜４４のいずれか一つに記載の複数の組成物。

４６． 複数あるうちの異なる組成物のイメージャー鎖がスペクトル識別不能な標識を含む、項目２９〜４４のいずれか一つに記載の複数。

４７． 複数の組成物の少なくとも１つが、複数あるうちの他の組成物と異なる明滅頻度を有する、項目２９〜４４のいずれか一つに記載の複数。

４８． サンプル中の２つの標的の複合体を検出する方法であって、
サンプルと、項目２９〜４４のいずれか一つに記載のイメージャー鎖と、項目２９〜４４のいずれか一つに記載の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、を接触させることであって、（ａ）の結合パートナーが２つの標的の一方に対して特異性を有し、かつ（ｂ）の結合パートナーが２つの標的の他方に対して特異性を有する、ことと、
サンプル中の複合体の存在または不在を検出することと、
を含む方法。

４９． サンプルが細胞または細胞ライセートである、項目４８に記載の方法。

５０． ２つの標的のそれぞれがタンパク質である、項目４８または４９に記載の方法。

５１． ２つの標的のそれぞれが細胞または細胞ライセートから得られる、項目５０に記載の方法。

５２． サンプル中の２つの標的の複数の複合体を検出することをさらに含む、４８項〜５１項のいずれか１つに記載の方法。

５３． 複数の複合体が複数の異なる複合体である、項目４８〜５２のいずれか一つに記載の方法。

５４． 複数あるうちの複合体のサブセットが互いにサブ回折距離内に位置する、項目４８〜５３のいずれか一つに記載の方法。

５５． サンプル中の分子内相互作用を検出する方法であって、
標的分子を含むサンプルと、
（ａ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、（ａ）の結合パートナーが標的分子上のある位置に対して特異性を有する、第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、
（ｂ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、（ｂ）の結合パートナーが標的分子上の他の位置に対して特異性を有し、（ａ）および（ｂ）の安定性ドメインが互いに相補的であり、かつ（ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインが線状に組み合わされてフルドッキングドメインを形成する、第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、
（ｃ）検出可能な標識と、５’ドメインと、３’ドメインと、５’ドメインと３’ドメインとの間に位置するリンカードメインと、を含むイメージャー鎖であって、５’ドメインが（ａ）のハーフドッキングドメインに相補的であり、かつ３’ドメインが（ｂ）のハーフドッキングドメインに相補的である、イメージャー鎖と、
を接触させることと、
サンプル中の（ｃ）のイメージャー鎖の検出可能な標識の存在または不在を検出することと、
を含む方法。

５６． サンプルが細胞または細胞ライセートである、項目２７に記載の方法。

５７． 標的分子がタンパク質である、項目５５または５５に記載の方法。

５８． （ａ）および（ｂ）の位置のそれぞれがタンパク質上の異なるエピトープである、項目５７に記載の方法。

５９． （ａ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、
（ｂ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、（ａ）および（ｂ）の安定性ドメインが互いに相補的であり、かつ（ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインが線状に組み合わされて第１のフルドッキングドメインを形成する、第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、
（ｃ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第３の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、（ａ）および（ｃ）の安定性ドメインが互いに相補的であり、かつ（ａ）および（ｃ）のハーフドッキングドメインが線状に組み合わされて第２のフルドッキングドメインを形成する、第３の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、
（ｄ）５’ドメインと、３’ドメインと、５’ドメインと３’ドメインとの間に位置するリンカードメインと、を含む第１のイメージャー鎖であって、第１のイメージャー鎖の５’ドメインが（ａ）のハーフドッキングドメインに相補的であり、かつ第１のイメージャー鎖の３’ドメインが（ｂ）のハーフドッキングドメインに相補的である、第１のイメージャー鎖と、
（ｅ）５’ドメインと、３’ドメインと、５’ドメインと３’ドメインとの間に位置するリンカードメインと、を含む第２のイメージャー鎖であって、第２のイメージャー鎖の５’ドメインが（ａ）のハーフドッキングドメインに相補的であり、かつ第２のイメージャー鎖の３’ドメインが（ｃ）のハーフドッキングドメインに相補的である、第２のイメージャー鎖と、
を含む組成物。

実施例
実施例１
この実施例では、リンカーの長さおよび設計を分析した。２、３、または４チミン（Ｔ）残基からなるリンカーを互いに比較した。このほかに、１または２Ｔ残基の短いスペーサーをハーフドッキング部位ドメインとステム（または安定性）ドメインとの間のｐＰＡＩＮＴオリゴヌクレオチドの１つに導入した。これらのさまざまなイメージャー鎖およびオリゴヌクレオチドを図２Ａに例示する。ステムドメインと一方のハーフドッキングドメインとの間のスペーサー（緑色）がＴＴ、Ｔ、および不在である３つのタイプのドッキング部位を、中間のリンカー（橙色）がＴＴＴＴ、ＴＴＴ、およびＴＴであ３つのタイプのイメージャーで評価した。これらの組合せでそれらの特性速度論的パラメーターに関して分析した。図２Ｂに表されるように、速度論的分析に基づいてドッキング部位の最良性能イメージャー鎖を選択した。この対を用いて、図２Ｃに例示されるように、長さが９〜１１ｂｐの範囲内にある一群のステム設計の中から最適ステム長さを決定した。

他の実験では、各実験で両方の鎖を互いに０．３５ｎｍの距離に配置して９、１０、および１１ｂｐのステムドメイン（表１には長さごとに配列例が列挙されている）を試験することにより、イメージャー鎖の結合前にｐＰＡＩＮＴオリゴヌクレオチドを一体的に保持するステムドメインの長さを最初に決定した。これらの結果から、図３および４に示されるように、５’および３’ドメイン間にＴＴリンカーを有するイメージャー鎖およびスペーサーのないドッキング部位は最長平均結合時間および最大Ｋｏｎを有して最良性能であると結論付けた。これらの結果から、図５および６に示されるように、最良のステムドメインは１１および１０ｂｐ長であると結論付けた。両方の長さをとれば、ステムドメインは一過的であるがドッキング部位へのイメージャー鎖の結合を可能にするのに十分な時間で結合するはずである。

イメージャーおよび２つのハーフドッキング部位の配列を選択した後、これらを互いに５および２０ｎｍの距離でＤＮＡオリガミ構造により再度試験した。図７に示されるように、ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴシグナルが得られたことから、ｐＰＡＩＮＴの動作範囲はこの実施例では少なくとも２０ｎｍであることが実証された。

実施例２
この実施例は、ベンチマーキングｐＰＡＩＮＴ ｉｎ ｓｉｔｕ実験を記述する。２つの標的としてαおよびβチューブリンを選択した。陽性対照（上側の３つのパネル）は、αおよびβチューブリンに対する一次抗体および一次抗体標的のそれぞれに対する二次抗体の使用を含み、それぞれｐＰＡＩＮＴモチーフの１つで標識した（図８）。微小管は、ｐＰ１、ｐ１６、およびＰ３８でイメージングした場合に可視化可能であった。陰性対照は、一次抗体の１つのみと両方の二次抗体との添加を含むものであった。第１の陰性対照では、抗αチューブリンのみを添加したので（中間の３つのパネル）、微小管はＰ１６を使用した場合のみ可視化可能であった。第２の陰性対照では、抗βチューブリンのみを添加したので、微小管はＰ３８を使用した場合のみ観測された。図１Ａ〜１Ｅに記載の実施形態では、たとえば、過剰のオリゴ標識抗体を洗浄除去するためにＰＢＳのみを必要とする伝統的な免疫標識技術を用いることにより、ｐＰＡＩＮＴを用いてタンパク質相互作用を検出することが可能である。

プローブ間距離の範囲：１０ｎｍまで
ｐＰ１．モチーフ１．１０ｎｍ：ＡＴＡＣＡＡＣＧＡＡＣＴＡＴＴＣＧＴＴＡＧＴＴＴＧＴＴＴ（配列番号４）
ｐＰ１．モチーフ２．１０ｎｍ：ＴＡＴＴＴＡＧＴＧＴＴＣＧＡＡＴＡＧＴＴＣＧＡＴＣＴＡＧ（配列番号５）

プローブ間距離の範囲：１５ｎｍまで
ｐＰ１．モチーフ１．１５ｎｍ：ＡＴＡＣＡＡＣＧＡＡＣＴＡＴＴＣＧＴＴＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号６）
ｐＰ１．モチーフ２．１５ｎｍ：ＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＧＴＴＣＧＡＡＴＡＧＴＴＣＧＡＴＣＴＡＧ（配列番号７）

参照文献
Betzig, E., Patterson, G., Sougrat, R., Lindwasser, O., Olenych, S., Bonifacino, J., et al. (2006). Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution . Science , 313, 1642-5.
Hell, S. &. (1994). Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated- emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett , 19, 780-2.
Hu, C., Chinenov, Y., & Kerppola, T. (2002). Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell , 9, 789-798.
Jungmann, R., Steinhauer, C., Scheible, M., Kuzyk, A., & Tinnefeld, P. &. (2010). Single-Molecule Kinetics and Super-Resolution Microscopy by Fluorescence Imaging of Transient Binding on DNA Origami. Nano Letters , 10, 4756-4761.
Liu, Z., Xing, D., Su, Q. P., Zhu, Y., Zhang, J., Kong, X., et al. (2014). Super-resolution imaging and tracking of protein-protein interactions in sub-diffraction cellular space . Nature Communications , 5.
Rust, M. J., Bates, M., & Zhuang, X. (2006). Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods , 3, 793-5.
Soederberg, O., Gullberg, M., Jarvius, M., Ridderstrale, K., Leuchowius, K., Jarvius, J., et al. (2006). Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature methods , 3, 995-1000.
Winckler, P., Lartigue, L., Giannone, G., De Giorgi, F., Ichas, F., Sibarita, J.-B., et al. (2013). Identification and super-resolution imaging of ligand-activated receptor dimers in live cells. Scientific Reports , 3.

本明細書に開示される参照文献、特許、および特許出願はすべて、それぞれ引用されている主題に関して参照により組み込まれ、いくつかの場合には文書の全体が包含されうる。

本明細書および特許請求の範囲で用いられる不定冠詞「a」および「an」は、明らかに相反する指定がされていない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解すべきである。

また、明らかに相反する指定がされていない限り、２つ以上の工程または行為を含む本明細書に特許請求されたいずれの方法でも、方法の工程または行為の順序は、方法の工程または行為が挙げられた順序に必ずしも限定されるとは限らないことを理解すべきである。

特許請求の範囲では、以上の明細書の場合と同様に、「comprising（〜を含む）」、「including（〜を含む）」、「carrying（〜を担持する）」、「having（〜を有する）」、「containing（〜を含有する）」、「〜を含む（involving）」、「〜を保持する（holding）」、「composed of（〜で構成される）」などの移行句はすべて、オープンエンドであることを理解すべきである。「consisting of（〜からなる）」および「consisting essentially of（〜から本質的になる）」という移行句だけは、米国特許庁特許審査手順マニュアル（United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures）のセクション２１１１．０３に示されるように、それぞれ、クローズまたはセミクローズの移行句であるものとする。

Claims (31)

1. （ａ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、
   （ｂ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと
   （ここで、（ａ）および（ｂ）の安定性ドメインは互いに相補的であり、かつ（ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインが線状に組み合わされてフルドッキングドメインを形成する）、
   （ｃ）５’ドメインと、３’ドメインと、前記５’ドメインと前記３’ドメインとの間に位置するリンカードメインと、を含むイメージャー鎖であって、前記５’ドメインが（ａ）のハーフドッキングドメインに相補的であり、かつ前記３’ドメインが（ｂ）のハーフドッキングドメインに相補的である、イメージャー鎖と、
   を含む組成物。
2. （ａ）および（ｂ）の結合パートナーのそれぞれが抗体または抗原結合抗体フラグメントである、請求項１に記載の組成物。
3. （ａ）および（ｂ）の結合パートナーのそれぞれが、異なるタンパク質に結合するかまたは同一のタンパク質の異なるエピトープに結合する、請求項１に記載の組成物。
4. （ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインのそれぞれが５〜１５ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載の組成物。
5. （ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインのそれぞれが５〜１０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載の組成物。
6. （ａ）および（ｂ）の安定性ドメインのそれぞれが５〜５０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載の組成物。
7. 前記イメージャー鎖が１０〜３０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載の組成物。
8. 前記イメージャー鎖の５’ドメインおよび３’ドメインのそれぞれが５〜１０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載の組成物。
9. 前記リンカードメインが１〜５ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載の組成物。
10. 前記リンカードメインがチミン（Ｔ）ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
11. 前記リンカードメインがＴＴ配列を含む、請求項１に記載の組成物。
12. 前記イメージャー鎖が検出可能に標識される、請求項１に記載の組成物。
13. 前記イメージャー鎖が蛍光標識される、請求項１２に記載の組成物。
14. （ａ）および（ｂ）の結合パートナーのそれぞれが、ストレプトアビジン−ビオチン結合対を介してそれぞれ（ａ）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる、請求項１に記載の組成物。
15. ２つの標的を含む複合体をさらに含み、（ａ）の結合パートナーが前記２つの標的の一方に結合するかまたは結合され、かつ（ｂ）の結合パートナーが前記２つの標的の他方に結合するかまたは結合される、請求項１に記載の組成物。
16. 前記２つの標的のそれぞれがタンパク質である、請求項１５に記載の組成物。
17. 複数あるうちの異なる組成物のイメージャー鎖がスペクトル識別可能な標識を含む、請求項１に記載の複数の組成物。
18. 複数あるうちの異なる組成物のイメージャー鎖がスペクトル識別不能な標識を含む、請求項１に記載の複数の組成物。
19. 複数の組成物の少なくともの１つが、複数あるうちの他の組成物と異なる明滅頻度を有する、請求項１に記載の複数の組成物。
20. サンプル中の２つの標的の複合体を検出する方法であって、
    サンプルと、請求項１に記載のイメージャー鎖と、請求項１に記載の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、を接触させることであって、（ａ）の結合パートナーが前記２つの標的の一方に対して特異性を有し、かつ（ｂ）の結合パートナーが前記２つの標的の他方に対して特異性を有する、ことと、
    前記サンプル中の複合体の存在または不在を検出することと、
    を含む方法。
21. 前記サンプルが細胞または細胞ライセートである、請求項２０に記載の方法。
22. 前記２つの標的のそれぞれがタンパク質である、請求項２０に記載の方法。
23. 前記２つの標的のそれぞれが細胞または細胞ライセートから得られる、請求項２０に記載の方法。
24. 前記サンプル中の２つの標的の複数の複合体を検出することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
25. 前記複数の複合体が複数の異なる複合体である、請求項２４に記載の方法。
26. 複数あるうちの複合体のサブセットが互いにサブ回折距離内に位置する、請求項２４に記載の方法。
27. サンプル中の分子内相互作用を検出する方法であって、
    標的分子を含むサンプルと、
    （ａ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、（ａ）の結合パートナーが前記標的分子上のある位置に対して特異性を有する、第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、
    （ｂ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、（ｂ）の結合パートナーが前記標的分子上の他の位置に対して特異性を有し、（ａ）および（ｂ）の安定性ドメインが互いに相補的であり、かつ（ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインが線状に組み合わされてフルドッキングドメインを形成する、第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、
    （ｃ）検出可能な標識と、５’ドメインと、３’ドメインと、前記５’ドメインと前記３’ドメインとの間に位置するリンカードメインと、を含むイメージャー鎖であって、前記５’ドメインが（ａ）のハーフドッキングドメインに相補的であり、かつ前記３’ドメインが（ｂ）のハーフドッキングドメインに相補的である、イメージャー鎖と、
    を接触させることと、
    前記サンプル中の（ｃ）のイメージャー鎖の検出可能な標識の存在または不在を検出することと、
    を含む方法。
28. 前記サンプルが細胞または細胞ライセートである、請求項２７に記載の方法。
29. 前記標的分子がタンパク質である、請求項２７に記載の方法。
30. （ａ）および（ｂ）の位置のそれぞれがタンパク質上の異なるエピトープである、請求項２９に記載の方法。
31. （ａ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、
    （ｂ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、（ａ）および（ｂ）の安定性ドメインが互いに相補的であり、かつ（ａ）および（ｂ）のハーフドッキングドメインが線状に組み合わされて第１のフルドッキングドメインを形成する、第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、
    （ｃ）ハーフドッキングドメインと、安定性ドメインと、任意選択的にスペーサードメインと、を含むオリゴヌクレオチドに結合された結合パートナーを含む第３の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、（ａ）および（ｃ）の安定性ドメインが互いに相補的であり、かつ（ａ）および（ｃ）のハーフドッキングドメインが線状に組み合わされて第２のフルドッキングドメインを形成する、第３の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、
    （ｄ）５’ドメインと、３’ドメインと、５’ドメインと３’ドメインとの間に位置するリンカードメインと、を含む第１のイメージャー鎖であって、前記第１のイメージャー鎖の５’ドメインが（ａ）のハーフドッキングドメインに相補的であり、かつ前記第１のイメージャー鎖の３’ドメインが（ｂ）のハーフドッキングドメインに相補的である、第１のイメージャー鎖と、
    （ｅ）５’ドメインと、３’ドメインと、５’ドメインと３’ドメインとの間に位置するリンカードメインと、を含む第２のイメージャー鎖であって、前記第２のイメージャー鎖の５’ドメインが（ａ）のハーフドッキングドメインに相補的であり、かつ前記第２のイメージャー鎖の３’ドメインが（ｃ）のハーフドッキングドメインに相補的である、第２のイメージャー鎖と、
    を含む組成物。