JP2002520448A

JP2002520448A - 加水分解酵素の新規蛍光原基質

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Publication number: JP2002520448A
Application number: JP2000559254A
Authority: JP
Inventors: マイケルジェイ．コンラド; リヤンヘ
Original assignee: クロマジェンインコーポレーティッド
Priority date: 1998-07-10
Filing date: 1999-07-09
Publication date: 2002-07-09
Also published as: AU4976699A; WO2000003034A3; WO2000003034A2; US6949632B2; US20030049714A1; CA2335564A1; US6635435B1; EP1095161A2

Abstract

(57)【要約】本発明は加水分解酵素の蛍光原基質として有用な化合物を提供する。加水分解可能な基の加水分解によって、蛍光が強く、水溶性で、大きいストークスシフトを含むいくつかの望ましい特徴を示すハロ-ピレン置換分子が生成される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願の相互参照本出願は1998年7月10日に出願された米国仮出願第60/092,245号に対する優先
権を主張する。

【０００２】発明の分野本発明は、加水分解酵素の蛍光基質の分野に関し、また生物学的アッセイ法の
分野にも関する。

【０００３】発明の背景生体分子分析の分野において、放射性同位体または比色色素のいずれかによる
標識が歴史的に最良の検出方法であった。しかし、放射性同位体を用いての作業
が困難であることや、着色色素の感度には限界があることから、標識および検出
のための発光分子の使用に対する興味が増大しつつある。特に、放射性同位体ま
たは比色検出に比べて感度がより高いだけでなく、同じ試料で複数の分析物の同
時検出も可能な発光検出システムの開発にますます興味が持たれている。

【０００４】生物学的アッセイ法では2種類の発光、すなわち化学発光および蛍光が一般に
興味が持たれている。化学発光は化学反応中にエネルギーが光として一時的に放
出されるもので、生物学的に興味が持たれるほとんどの場合、特異的酵素により
触媒される反応を含む。蛍光は、異なる波長の光による分子の励起によって誘導
される光の放出である。化学発光とは異なり、蛍光分子は（i）標識としてすで
に蛍光を発する分子を共有結合するために、または（ii）特定の酵素の作用によ
って出発基質に比べて大きく増強された蛍光を示す蛍光生成物に変換することの
できる「蛍光原」酵素基質としてのいずれかで用いることができるように誘導体
化することができる。いずれの場合にも、検出は、その酵素の基質が検出可能な
化学発光性または蛍光性の最終生成物に変換された率または程度を評価すること
による、特異的酵素の間接的検出に頼っている。

【０００５】生物学的アッセイ法において、相補的な生物学的「標的」の量を間接的に検出
または測定するために酵素の活性を用いる。このために最も一般的に用いられる
酵素はアルカリ性ホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ
、β-グルコシダーゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼである。HRPを除き、最
初の4つの酵素は関連性のある組を形成しており、すべて、ヒドロキシル部分で
誘導体化されて、それぞれリン酸、ガラクトシド、グルコシドおよびグルクロニ
ド基質となった基質分子に作用する加水分解酵素である。加水分解酵素は比色お
よび化学発光基質と共に広く用いられており、また、現在の蛍光原基質も、感度
に限界があるにも関わらず広く用いられ、最も一般的なものは4-メチルウンベリ
フェロン（4MU）およびアットホス（Attophos）基質である。比較してみると、H
RPは比色および化学発光基質を用いる組織化学およびELISAの両方にとって重要
な非加水分解酵素ではあるが、ペルオキシダーゼの蛍光原基質は水溶液中での安
定性が不十分であるため、検出のために広く用いられてはいない。

【０００６】この10年間で加水分解酵素に対する多くの新しい化学発光酵素基質が開発され
ており、その結果、今や化学発光システムの利点および限界がよく知られている
。利点には非酵素的加水分解の結果生じる非特異的化学発光が低いことと、1,2-
ジオキセタン「グロー」試薬の場合、比色検出に比べて検出感度が著しく高いこ
ととが含まれる。化学発光検出の欠点には、使用に際し面倒な作業が要求される
こと、化学発光自体が一時的であるため感度に限界があること、および化学発光
の分光放射輝度が広く、単一試料中の複数の分析物を同時に検出できないことが
含まれる。

【０００７】蛍光検出は理論的には化学発光検出の欠点を回避することが可能であるが、前
者は長い間、次の理由により化学発光よりも感度が低いと見なされてきた：（i
）励起を誘導するために用いる光源が原因ですべての蛍光検出器に背景光（「迷
」光）が存在すること、（ii）高い蛍光強度を有する分子の水溶性が低いこと、
（iii）水溶液中では著しい消光が起こり、光安定性が低いこと、および（iv）
利用可能な蛍光原基質の特異的酵素による処理（ターンオーバー）率が低いこと
。主にこのような制約により、加水分解酵素の蛍光原基質が生物学的研究および
臨床応用に利用できるようにされてきた。本発明は、これまでの化合物の制約を
克服する物理的性質を持つ新規な分子構造を特定することにより、このような要
求に応えるものである。

【０００８】 Satoら（［1992］Chem. Pharm. Bull. 40(3)：786〜788）は、酸性およびアル
カリ性ホスファターゼの定量のために新しい種類の蛍光原基質を開示した。彼ら
は酸性とアルカリ性両方の環境において高い蛍光を示す化合物として、8-ヒドロ
キシピレン-1,3,6-トリスルホン酸（HPTS、「ピラニン」）を開示した。彼らは
また、ピラニンの蛍光強度がリン酸化によって著しく消失するため、酸性および
アルカリ性ホスファターゼやヒト血清ホスファターゼのアッセイ法のための基質
として用いることができることも開示した。しかし、Satoらによって開示された
分子はC₁₆H₆K₅O₁₃PS₃ 4H₂Oである分子に一致する化学組成を有しており、したが
ってハロ-ヒドロキシピレンジスルホン酸（HHPDS）ではなかった。

【０００９】 WolfbeisおよびKoller（［1983］Anal. Chem. 129：365〜370）はエステラー
ゼの蛍光原基質としてのHPTSエステルの使用について報告したが、彼らはHPDSの
ハロゲン化変異体については開示も示唆もしなかった。Wolfbeisら（［1983］An
al. Chem. 314：119〜124）はHPTSの蛍光特性ならびにいくつかの他の蛍光指示
薬の蛍光特性を特徴付けた。彼らはヒドロキシピレン化合物のハロゲン化変異体
については開示も示唆もしなかった。

【００１０】 Koller（［1994］Amer. Biotech. Laboratory 13 (Nov)：13〜15）は、1-ヒド
ロキシピレン-3,6,8-トリス(ジメチルスルホンアミド)、ならびにその酢酸エス
テル、酪酸エステル、および他の長鎖脂肪酸エステル、リン酸エステル、硫酸エ
ステル、ガラクトシド、グルコシド、グルクロニドや、そのN-アセチルグルコサ
ミニド誘導体の特徴について報告した。しかし、ヒドロキシピレン化合物のハロ
誘導体に関する開示や示唆はなかった。

【００１１】 TietzeおよびBayer（Germany-Druckで印刷されたWissenschaftl Hauptlaborat
orium of I.G. Garbenindustrie-Werk Leverkunsenの［1937］：Metzger & Witt
ig、Leipzig、189〜210ページ）は、ピレンスルホ酸およびその誘導体の化学お
よび蛍光分析特性の早期分析を提供した。3-アミノピレン-5,8,10-トリスルホ酸
の製造を記載する過程において、3-クロロピレンの調製およびその3-クロロピレ
ン-5,8,10-トロスルホ酸へのスルホン化が述べられている。しかし、この化合物
に蛍光がある、または蛍光がないとの言及も示唆もなく、また、蛍光原基質とし
てのクロロジスルホ酸のリン酸エステルまたは他の誘導体についていかなる言及
もなかった。

【００１２】米国特許第4585598号および4614713号において、ホスファターゼの蛍光分析定
量のためのヒドロキシ-ピレン-トリスルホン酸の蛍光原リン酸エステルが開示さ
れた。開示された水溶性リン酸エステルは、ヒドロキシピレン-トリスルホン酸
を5ハロゲン化リンと反応させ、続いてジハロゲノホスホニルオキシ化合物を加
水分解することによって調製された。この特許は、モノハロ-ヒドロキシピレン-
ジスルホン酸の蛍光原基質としての使用について開示も示唆もしていない。

【００１３】米国特許第5132432号において、ピレニルオキシトリスルホン酸類の一つが開
示され、いくつかの生物学的および生化学的方法におけるそれらの有用性が記載
された。この特許の開示は参照として本明細書に組み入れられる。この特許はフ
ェニルオキトリスルホン酸エステルの置換基となりうる様々な基について言及し
ているが、リン酸エステル、-O-ガラクトシド、-O-グルコシド、-O-グルクロニ
ド部分で置換されたハロ-ピレニルオキシジスルホン酸誘導体、またはそのよう
な化合物の蛍光原基質としての使用について開示も示唆もされていない。

【００１４】米国特許第4844841号において、蛍光脂質プローブとして有用なピレントリス
ルホン酸類の一つが記載された。本発明のハロ-ピレン-ジスルホン酸誘導体につ
いては、開示も示唆もされていない。

【００１５】米国特許第5424440号において、ベンゾチアゾール化合物類の一つが水溶性蛍
光原基質として開示された。本発明とは化学的に関連はないが、この特許は最先
端技術を概説しているため、これを引用し、本明細書に組み入れる。

【００１６】国際公開公報第93/15097号において、ピレン-(1,3,6-トリスルホン酸)-8- -D-
グルクロニドおよび類似の化合物が-D-グルクロニダーゼなどの糖加水分解酵素
を定量するための有用な蛍光原基質であるとして開示された。この公開公報はハ
ロ置換ピレンジスルホン酸蛍光原基質について開示も示唆もしていない。

【００１７】発明の簡単な概要本発明は新しい種類の蛍光原基質を提供する。特定の態様において、これらの
基質はハロ-ピレン-ジスルホン酸およびその誘導体である。過去に報告されたピ
レントリスルホン酸誘導体とは対照的に、これらの新しい基質は、適当な酵素の
存在下であれば生成物への非常に高い変換率を示す。有益なことに、酵素加水分
解によってこれらの化合物は、生物学的および生化学的システムにおける蛍光標
識として有用な蛍光の強いハロピレン誘導体を生成する。同じく重要なことに、
これらの化合物は非酵素的加水分解に対して非常に安定で、それにより高感度で
広いダイナミック範囲を呈するアッセイ法への適用が可能である。

【００１８】有益なことに、本発明の化合物は、蛍光分析アッセイ法で用いることができる
、水性媒質中での高い溶解性、長い励起波長、および高度にストークスシフトし
た放出波長を有している。

【００１９】特定の態様において、本発明の基質は下記の構造（I）で表すことができるか
またはその塩である：

【化２１】式中、 R₁はO、OH、リン酸エステル、スルホニル、硫酸エステル、アミン、スルホン
アミド、ケトン、エステル、または加水分解酵素の基質（例えば、-O-ガラクト
シド、-O-グルコシド、-O-グルクロニド、およびN-アセチルグルコサミニドを含
む）であり；かつ R₂、R₃、およびR₄はその少なくとも一つがハロゲン化物であるとの条件で、個
別に-SO₃、NR₅R₆、-SO₂NR₅R₆、またはハロゲン化物であり；ただしR₅およびR₆は
個別にH、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロ、C_1〜6アルキル、アリール
アルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、または検出分子に
任意に連結された単官能性リンカーである。

【００２０】好ましい態様において、R₂、R₃、またはR₄の一つはハロゲン化物であり、該ハ
ロゲン化物は塩素である。

【００２１】別の好ましい態様において、本発明の基質は下記の構造（II）、（III）、（I
V）、もしくは（V）で表される式を有するかまたはその塩であることができる：

【化２２】

【化２３】

【化２４】

【化２５】式中、 R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、およびR₈はその少なくとも一つがO、OH、リン酸エステ
ル、スルホニル、硫酸エステル、アミン、スルホンアミド、ケトン、エステル、
または加水分解酵素の基質（例えば、-O-ガラクトシド、-O-グルコシド、-O-グ
ルクロニド、およびN-アセチルグルコサミニドを含む）であるとの条件で、個別
にO、OH、リン酸エステル、スルホニル、硫酸エステル、アミン、スルホンアミ
ド、ケトン、エステル、または加水分解酵素の基質（例えば、-O-ガラクトシド
、-O-グルコシド、-O-グルクロニド、およびN-アセチルグルコサミニドを含む）
、-SO₃、NR₅R₆、-SO₂NR₅R₆、ハロゲン化物、またはアリール基であり；ただしR₅ およびR₆は個別にH、H、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロ、C_1〜6アル
キル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、検
出分子に任意に連結された単官能性リンカーである。

【００２２】発明の詳細な説明本発明は、適当な処理によって蛍光性の強い生成物を生じさせる加水分解酵素
の蛍光原基質を提供する。本発明の蛍光生成物または蛍光原基質は、放射性同位
体または既知の蛍光原分子が現在用いられているいかなるアッセイ法においても
用いることができる。したがって、例えば、ELISAアッセイ法、核酸検出アッセ
イ法、および他の当技術分野で公知の診断アッセイ法において、本明細書におい
て開示される化合物を使用することは有益である。

【００２３】蛍光原基質が検出および標識の要求を満たす際に最も有用となり、また放射性
同位体に取って代わるためには、基質から遊離される分子が強い蛍光を示すこと
が必要である。好ましくは、この分子は少なくとも下記の特性を示す：１．蛍光原基質は量子収量が大きくなくてはならない。すなわち、この分子はエ
ネルギーのかなりの比率を再放出しなければならない。好ましい態様において、
この分子は分子を励起するために用いられる入射放射のエネルギーの少なくとも
約70％を放出する。より好ましい態様において、再放出光は約80%以上であり、
最も好ましい態様において、再放出光は90%以上である。２．蛍光原基質は大きなストークスシフトを示さなければならない。すなわち、
この分子は第一の励起波長で任意に励起される一方、少なくとも約25nm離れた第
二の放出波長で放射を放出しなければならない。好ましくは、この波長の差は約
35nmである。励起光子ではなく、この様式でのみ、蛍光からの光子の明確な検出
が可能となる。３．蛍光原基質は水性媒質への溶解性が高くなくてはならない。ほとんどの生物
学的および生化学的反応が水性溶液中で起こるか、または行われるため、これは
重要な条件である。４．蛍光原基質は非常に安定でなければならない。すなわち、この分子の非特異
的加水分解は非常に低くなければならない。分子が十分な蛍光を有していれば、
たとえ低いレベルの非特異的加水分解でも許容できないレベルの背景光を生じる
ことになるため、このことも重要な条件である。５．蛍光原基質をその蛍光状態に変換する速度は非常に速くなければならない。
生成物の蛍光が強いとしても、十分な量の蛍光種がかなり短い時間で生成されな
ければ役に立たないため、この条件は重要である。６．蛍光原基質の励起および放出スペクトルは狭くなくてはならない。これによ
り蛍光生成物を同じ試料中の他の蛍光体から区別することが可能となるため、こ
の条件は重要である。これは、他の原料からの蛍光による背景光を低減する際や
、同じ試料中の複数の分析物の検出を可能にするために有用である。

【００２４】一つの態様において、本発明の蛍光原基質は下記の構造（I）で表される一般
式を有するかまたはその塩である：

【化２６】式中、 R₁はO、OH、リン酸エステル、スルホニル、硫酸エステル、アミン、スルホン
アミド、ケトン、エステル、または加水分解酵素の基質（例えば、-O-ガラクト
シド、-O-グルコシド、-O-グルクロニド、およびN-アセチルグルコサミニドを含
む）であり；かつ R₂、R₃、およびR₄はその一つがハロゲン化物であるとの条件で、個別に-SO₃、
NR₅R₆、-SO₂NR₅R₆、またはハロゲン化物であり；ただしR₅およびR₆は個別にH、
アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロ、C_1〜6アルキル、アリールアルキル
、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、または検出分子に任意に連
結された単官能性リンカーである。

【００２５】好ましい態様において、ハロゲン化物は塩素である。

【００２６】他の好ましい態様において、本発明の基質は下記の構造（II）、（III）、（I
V）、または（V）で表される式を有するものかまたはその塩でありうる：

【化２７】

【化２８】

【化２９】

【化３０】式中、 R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、およびR₈はその少なくとも一つがO、OH、リン酸エステ
ル、スルホニル、硫酸エステル、アミン、スルホンアミド、ケトン、エステル、
または加水分解酵素の基質（例えば、-O-ガラクトシド、-O-グルコシド、-O-グ
ルクロニド、およびN-アセチルグルコサミニドを含む）であるとの条件で、個別
にO、OH、リン酸エステル、スルホニル、硫酸エステル、アミン、スルホンアミ
ド、ケトン、エステル、または加水分解酵素の基質（例えば、-O-ガラクトシド
、-O-グルコシド、-O-グルクロニド、およびN-アセチルグルコサミニドを含む）
、-SO₃、NR₅R₆、-SO₂NR₅R₆、ハロゲン化物、またはアリール基であり；ただしR₅ およびR₆は個別にH、H、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロ、C_1〜6アル
キル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、検
出分子に任意に連結された単官能性リンカーである。

【００２７】本発明の蛍光原基質は前述の条件のすべてを満たす。すなわち、水溶性が高い
。光安定性であり、同様に非酵素的加水分解に対しても安定である。ストークス
シフト値が大きく（図1参照）、励起および放出帯域が狭い。励起および放出帯
は好ましくは約15nm未満で、最も好ましくは約5nm未満である。加えて、蛍光体
のハロゲン化によってその量子収量は10〜100分の1（ナフタレンを様々なハロナ
フタレンと比べられたい（Turro, N.J.［1978］Modern Molecular Photochemist
ry、The Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc.、110〜111ページ参照）に低
下しうるとすれば、本発明のハロゲン化蛍光生成物は驚くことに、また都合のよ
いことに、非常に高い量子収量を有する。最後に、本発明の蛍光原基質は蛍光生
成物に非常に速やかに変換される（高い処理すなわちターンオーバー率）。一つ
の態様において、リン酸化化合物（R₁がリン酸エステル）は、例えばアルカリ性
または酸性ホスファターゼによって、速やかに加水分解されてヒドロキシルとな
る。本発明の化合物のこれらの特徴が組合わされて、本発明の分子は、モルまた
は生成速度を基準として、4-MUなどの既知の化合物によって達成しうるものの何
桁も大きいシグナルを提供することになる。関連する態様において、-O-ガラク
トシド、-O-グルコシド、-O-グルクロニドまたはN-アセチルグルコサミニド誘導
体も、それぞれの特異的酵素によって速やかに加水分解されてヒドロキシルとな
る。

【００２８】本発明の一つの態様において、化合物はクロロホスフェートピレン-ジスルホ
ン酸（CPPD）である。そのいくつかの塩のいずれも、例えば5アンモニウム塩で
も、検出可能な蛍光生成物の生成に関する様々なアッセイ法で用いることができ
る。CPPDは、例えば、ヒドロキシピレン-3,6,8-トリスルホン酸塩をPOCl₃などの
強力な塩素供与体を用いてリン酸化および塩素化することによって調製し、逆相
クロマトグラフィを含むいくつかの手段のいずれかによって精製する。

【００２９】本発明の一つの態様において、蛍光原基質の元素分析結果は次のとおりである
：C、30.34；H、4.55；S、7.64；Cl、4.36；P、4.05。この同じ分子の質量スペ
クトルは図2に示すとおりで、アンモニウム塩の質量スペクトルは図3、プロトン
NMRは図4、³¹P NMRは図5に示すとおりである。

【００３０】当業者であれば本発明の蛍光原基質（I）はいくつかの分子のいずれとでも連
結しうることを理解すると思われる。したがって、核酸プローブ、抗原、抗体ま
たはいかなる他の生物学的または化学的な分子種も、本開示から利益を受ける当
業者によって容易に実施することができる化学的方法を用いて、この基質で標識
することができる。基質（I）のR₁を加水分解することができる特異的酵素、例
えばホスファターゼ、糖加水分解酵素または同様の試薬に曝露することにより、
（VI）などの分子が生成される：

【化３１】式中、 R₁は-OHまたは-O^-であり； R₂、R₃、およびR₄はその一つがハロゲン化物であるとの条件で、個別に-SO₃、-S
O₂NH₂、-SON(CH₃)₂、-Clである。

【００３１】分子（VI）は蛍光が強く、当技術分野において周知の方法に従って容易に検出
される。

【００３２】特に好ましい態様において、本発明の化合物は下記の構造を有する：

【化３２】式中、R₁＝OまたはOHである。

【００３３】本発明の蛍光原基質は、好ましい態様において下記の特性を有するため、特に
有益である：１．低分子量、好ましくは約1,500ダルトン未満、最も好ましくは約500〜1,000
ダルトンの範囲；２．高い値の量子収量およびモル吸光係数；３．高い光安定性（無視できる光退色または光酸化）；４．消光が無視できる大きなストークスシフト；５．蛍光体を同じ試料中の他の物質から区別可能にする狭い励起および放出帯域
；６．高い水溶性、ならびに７．高速の特異的酵素による処理と低速の非酵素的加水分解の組み合わせ。

【００３４】本発明の化合物は、検査キットで供給することもでき、または生化学試薬とし
て用いるための純粋な化合物として提供することもできる。

【００３５】以下は、本発明を実施するための方法を示す例である。これらの実施例は制限
的なものと解釈されるべきではない。別に記載される場合を除き、パーセンテー
ジはすべて重量によるもので、溶媒混合比はすべて体積によるものである。

【００３６】実施例１−クロロ-ホスフェートピレン-ジスルホン酸5アンモニウム塩（CPPD）
の調製 1g（1.9mmol）の1-ヒドロキシピレン-3,6,8-トリスルホン酸3ナトリウム塩（H
PTS）および1.59g（6mmol）の18-クラウン-6を20mlの無水ピリジンに懸濁した。
室温で0.5時間撹拌後、澄明な黄色溶液が得られた。氷水浴中で撹拌しながら冷
却中のHPTS溶液に、800μlのPOCl₃（8.8mmol）を滴下した。この溶液を氷水浴中
で2時間撹拌を続けた。2時間後、反応をTLCでチェックし、完了していることが
判明した。反応混合物を5mlの氷に注ぎ、溶媒を減圧下で除去した。次いで残渣
を30mlのH₂Oに溶解した。氷水浴中で冷却しながら、濃NH₄OH溶液を加えて溶液を
pH8とした。次いで溶媒を減圧下で除去した。この工程を3回繰り返した。次いで
残渣を50mlの水に溶解し、酢酸エチルで5回抽出した。水層を減圧下で5mlまで濃
縮した。遠心分離によって黄色の溶液を白色沈殿から分離し、固体を少量のMeOH
で洗浄した。溶液を合わせて乾燥し、1.3gの黄色固体を得た。生成物をC18逆相
フラッシュクロマトグラフィでさらに精製し、0.96gの淡黄色粉末を得た（収率
：84％）。蛍光：最大吸収＝400nm、最大放出＝430nm。 ¹H NMR/D₂O：＝8.21（s、1H）；8.59（d、1H）；8.70（d、1H）；8.91（dd、2
H）；9.15（s、1H）。 ³¹P NMR/D₂O：＝-1.99（s）。質量スペクトル（分解能2000の陰イオンエレクトロスプレー）：m/z＝491(M-H
)⁺、C₁₆H₉ClO₁₀PS₂、m/z計算値＝491。元素分析C₁₆H₆ClO₁₀PS₂・4(NH₄)・5H₂O・1.5CH₃COOHの予測値：Ｃ、30.06；Ｈ
、5.31；Cl、4.67；S、8.45；P、4.08。実測値：Ｃ、30.34；Ｈ、4.55；Cl、4.3
6；S、7.64；P、4.05。

【００３７】実施例２−ストークスシフトが大きいアルカリ性ホスファターゼの蛍光原基質と
してのCPPD 1mlの0.01mM CPPD溶液をキュベットに入れた。放出スペクトルを450nmで励起
して記録した。次いで1単位のアルカリ性ホスファターゼを加え、溶液を室温で0
.5時間放置した。励起および放出スペクトルを測定した（図1参照）。

【００３８】実施例３−動力学的パラメーター測定と4MUPおよび4NPPとの比較動力学的パラメーター（K_m、K_cat）を、次の緩衝液中で測定した：50mM TAPS
pH9.0（CPPD）；1M DEA pH9.8（4MUPおよび4NPP）。CPPDおよび4MUPについては
、パラメーターは蛍光分析によって測定した。蛍光の励起および放出最大値はそ
れぞれ、440nmおよび505nm（CPPD）と368nmおよび448nm（4MUP）で得られた。4N
PPのパラメーターは比色分析によって測定し、405nmの吸光度の変化を測定した
。すべてのパラメーターは37℃で測定した。

【００３９】各基質について、既知濃度の溶液を調製し、1単位のアルカリ性ホスファター
ゼを加えた。溶液を37℃で終夜インキュベートした。次いで消化した溶液を異な
る濃度に希釈し、505nm（CPPD）、410nm（4MUP）の相対蛍光強度（RFU）、およ
び500nmの吸光度（4NPP）を各溶液について測定した。データを用いて、基質濃
度の関数としての505nm（CPPD）、410nm（4MUP）のRFU、および500nmの吸光度（
4NPP）のプロットを作製した。これらのプロットを標準曲線として用い、酵素ア
ッセイ法中に消化された基質の濃度を計算した。

【００４０】酵素アッセイ法のために、様々な濃度のCPPDおよび4MUP溶液に0.001単位のア
ルカリ性ホスファターゼを加えた。4NPPについては、0.01単位のアルカリ性ホス
ファターゼを用いた。酵素添加後、基質の加水分解による蛍光または吸光度の変
化を時間、通常は10分間に対して自動的に記録した。このプロットの直線部分の
傾きから酵素の活性を計算し、完全に消化された基質で作製した標準曲線と比較
した。K_mおよびK_catをラインウィーバー−バークプロットから計算した。

【００４１】実施例４−蛍光強度と酵素濃度の間の直線関係および4MUPと比較してCDDPを用い
た場合のアルカリ性ホスファターゼの検出限界 50mM TAPS pH9.0中0.01mM CPPDおよび1M DEA pH9.8中0.01mM 4MUPを100μlマ
イクロタイタープレートに入れた。時間0で、一連の各ウェルに異なる濃度の酵
素10μlを各酵素濃度につき3つずつ加えた。プレートを37℃で60分間インキュベ
ートし、基質の酵素加水分解による蛍光の増大を測定した（図6参照）。

【００４２】実施例５−CPPDの非酵素的加水分解 50mM TAPS中0.1mM CPPDを室温、37℃および50℃でインキュベートした。535nm
の蛍光を図7に明記されている時点で測定した。

【００４３】本明細書において記載されている実施例および態様は例示のために示している
にすぎず、当業者にはそれに照らして様々な修正や変更が示唆され、本出願の精
神および範囲内ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解されるべ
きである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図1は本発明の蛍光原基質が蛍光生成物に変換された後の、該蛍
光原基質の励起および放出スペクトルを示す図である。

【図２】図2は本発明の一つの化合物の質量スペクトルを示す図である。

【図３】図3は本発明の一つの化合物のアンモニウム塩の質量スペクトル
を示す図である。

【図４】図4は本発明の一つの化合物のプロトンNMRである。

【図５】図5は本発明の一つの化合物の³¹P NMRである。

【図６】図6は本発明の蛍光原基質を用いて達成しうる検出感度（アルカ
リ性ホスファターゼ検出）の程度を4-MUPと比べて示す図である。

【図７】図7は複数の時点で測定したCPPDの535nmにおける蛍光を示す図で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡＦターム(参考） 2G045 AA28 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 FA29 FB01 FB02 FB03 FB07 FB12 GC15 4B063 QA01 QQ30 QQ33 QQ42 QR41 QR58 QR63 QR66 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の特徴を有する蛍光原基質分子であって、（a）分子を励起するために用いられる入射放射のエネルギーの少なくとも約70
％を再放出し；（ｂ）分子を励起するために用いられる放射の波長から少なくとも約25nm離れて
いる波長で放射を放出し；かつ（c）水中で可溶性かつ安定である分子。
【請求項２】下記の構造を有する請求項１記載の蛍光原基質分子またはそ
の塩：【化１】式中、 R₁はO、OH、リン酸エステル、スルホニル、硫酸エステル、アミン、スルホン
アミド、ケトン、エステル、および加水分解酵素の基質からなる群より選択され
；かつ R₂、R₃、およびR₄はその少なくとも一つがハロゲン化物であるとの条件で、SO ₃ 、NR₅R₆、SO₂NR₅R₆、およびハロゲン化物からなる群より個別に選択され；ただ
しR₅およびR₆はH、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロ、C_1〜6アルキル、
アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、および検
出分子に任意に連結された単官能性リンカーからなる群より個別に選択される。
【請求項３】下記の構造を有する、請求項２記載の蛍光原基質分子：【化２】式中、R₁＝OまたはOHである。
【請求項４】下記の構造式からなる群より選択される構造を有する請求項
１記載の蛍光原基質分子またはその塩：【化３】【化４】【化５】および【化６】式中、 R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、およびR₈はその少なくとも一つがO、OH、リン酸エステ
ル、スルホニル、硫酸エステル、アミン、スルホンアミド、ケトン、エステル、
または加水分解酵素の基質であるとの条件で、O、OH、リン酸エステル、スルホ
ニル、硫酸エステル、アミン、スルホンアミド、ケトン、エステル、加水分解酵
素の基質、-SO₃、NR₅R₆、-SO₂NR₅R₆、ハロゲン化物、およびアリール基からなる
群より個別に選択され；ただしR₅およびR₆はH、OH、アリール、ヘテロアリール
、ヘテロシクロ、C_1〜6アルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル
、ヘテロシクロアルキル、検出分子に任意に連結された単官能性リンカーからな
る群より個別に選択される。
【請求項５】下記の構造を有する、請求項４記載の蛍光原基質分子：【化７】
【請求項６】下記の構造を有する、請求項４記載の蛍光原基質分子：【化８】
【請求項７】下記の構造を有する、請求項４記載の蛍光原基質分子：【化９】
【請求項８】下記の構造を有する、請求項４記載の蛍光原基質分子：【化１０】
【請求項９】前記ハロゲン化物が塩素である、請求項２記載の蛍光原基質
分子。
【請求項１０】 1,500ダルトン未満の分子量を有する、請求項１記載の蛍
光原基質分子。
【請求項１１】約500から約1000ダルトンの範囲の分子量を有する、請求
項１０記載の蛍光原基質分子。
【請求項１２】前記加水分解酵素が-O-ガラクトシド、-O-グルコシド、-O
-グルクロニド、およびN-アセチルグルコサミニドからなる群より選択される、
請求項２記載の蛍光原基質分子。
【請求項１３】前記加水分解酵素が-O-ガラクトシド、-O-グルコシド、-O
-グルクロニド、およびN-アセチルグルコサミニドからなる群より選択される、
請求項４記載の蛍光原基質分子。
【請求項１４】下記の特徴を有する蛍光原基質分子の、アッセイ法におけ
る使用：（a）分子を励起するために用いられる入射放射のエネルギーの少なくとも約70
％を再放出し；（ｂ）分子を励起するために用いられる放射の波長から少なくとも約25nm離れて
いる波長で放射を放出し；かつ（c）水中で可溶性かつ安定である。
【請求項１５】前記アッセイ法がELISAおよび核酸検出アッセイ法からな
る群より選択される、請求項１４記載のアッセイ法での使用。
【請求項１６】前記分子が下記の構造を有するかまたはその塩である、請
求項１４記載のアッセイ法での使用：【化１１】式中、 R₁はO、OH、リン酸エステル、スルホニル、硫酸エステル、アミン、スルホン
アミド、ケトン、エステル、および加水分解酵素の基質からなる群より選択され
；かつ R₂、R₃、およびR₄はその少なくとも一つがハロゲン化物であるとの条件で、SO ₃ 、NR₅R₆、SO₂NR₅R₆、およびハロゲン化物からなる群より個別に選択され；ただ
しR₅およびR₆はH、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロ、C_1〜6アルキル、
アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、および検
出分子に任意に連結された単官能性リンカーからなる群より個別に選択される。
【請求項１７】前記分子が下記の構造を有する、請求項１６記載のアッセ
イ法での使用：【化１２】式中、R₁＝OまたはOHである。
【請求項１８】前記分子が下記の構造式からなる群より選択される構造を
有するかまたはその塩である、請求項１５記載のアッセイ法での使用：【化１３】【化１４】【化１５】および【化１６】式中、 R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、およびR₈はその少なくとも一つがO、OH、リン酸エステ
ル、スルホニル、硫酸エステル、アミン、スルホンアミド、ケトン、エステル、
または加水分解酵素の基質であるとの条件で、O、OH、リン酸エステル、スルホ
ニル、硫酸エステル、アミン、スルホンアミド、ケトン、エステル、加水分解酵
素の基質、-SO₃、NR₅R₆、-SO₂NR₅R₆、ハロゲン化物、およびアリール基からなる
群より個別に選択され；ただしR₅およびR₆はH、OH、アリール、ヘテロアリール
、ヘテロシクロ、C_1〜6アルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル
、ヘテロシクロアルキル、検出分子に任意に連結された単官能性リンカーからな
る群より個別に選択される。
【請求項１９】前記分子が下記の構造を有する、請求項１８記載のアッセ
イ法での使用：【化１７】
【請求項２０】前記分子が下記の構造を有する、請求項１８記載のアッセ
イ法での使用：【化１８】
【請求項２１】前記分子が下記の構造を有する、請求項１８記載のアッセ
イ法での使用：【化１９】
【請求項２２】前記分子が下記の構造を有する、請求項１８記載のアッセ
イ法での使用：【化２０】
【請求項２３】前記ハロゲン化物が塩素である、請求項１６記載のアッセ
イ法での使用。
【請求項２４】前記分子が1,500ダルトン未満の分子量を有する、請求項
１５記載のアッセイ法での使用。
【請求項２５】前記分子が約500から約1000ダルトンの範囲の分子量を有
する、請求項２４記載のアッセイ法での使用。
【請求項２６】前記加水分解酵素が-O-ガラクトシド、-O-グルコシド、-O
-グルクロニド、およびN-アセチルグルコサミニドからなる群より選択される、
請求項１６記載のアッセイ法での使用。
【請求項２７】前記加水分解酵素が-O-ガラクトシド、-O-グルコシド、-O
-グルクロニド、およびN-アセチルグルコサミニドからなる群より選択される、
請求項１８記載のアッセイ法での使用。