JP2016208934A - 抗イヌインターロイキン−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメント及びその利用 - Google Patents

Abstract

【課題】イヌＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントを提供する。また、イヌの関節症又は関節炎の診断剤、イヌの関節症又は関節炎の診断方法、イヌの関節症又は関節炎の治療剤、イヌの関節症又は関節炎の治療方法、核酸及びベクターを提供する。【解決手段】ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列又は配列番号１〜３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６のアミノ酸配列又は配列番号４〜６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、イヌインターロイキン−６受容体に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメント。【選択図】なし

Description

本発明は、抗イヌインターロイキン（ＩＬ）−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメント及びその利用に関する。より具体的には、抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメント、イヌの関節症又は関節炎の診断剤、イヌの関節症又は関節炎の診断方法、イヌの関節症又は関節炎の治療剤、イヌの関節症又は関節炎の治療方法、核酸及びベクターに関する。

ＩＬ−６は、ＩＬ−１やＴＮＦαと並んで炎症性サイトカインと呼ばれている。関節症又は関節炎（例えば、関節リウマチ）の多くの症状はＩＬ−６の作用による。すなわち、ＩＬ−６は抗体産生を誘導し、リウマチ因子や抗γグロブリン血症の原因となる。また、ＩＬ−６は、肝細胞刺激因子として、急性期炎症タンパク質のＣ反応性タンパク質や血清アミロイドを誘導する。さらに、ＩＬ−６は、関節破壊においても破骨細胞を活性化する。

ヒトＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体（トリシズマブ）は、日本で開発された初の抗体医薬であり、ＩＬ−６受容体に結合し、ＩＬ−６の働きを特異的に阻害する（例えば、特許文献１を参照。）。トリシズマブは、日本を含む世界各国において、関節リウマチ、若年性突発性関節炎、キャッスルマン病の治療薬として承認され、その優れた治療効果が認められている。

特許第３３７０３２４号公報

近年、イヌにおいても関節リウマチに代表される関節症又は関節炎等の自己免疫疾患が増加している。しかしながら、抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体は市販されておらず、抗体を用いた治療が困難な状況にある。

そこで、本発明は、イヌＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントを提供することを目的とする。本発明はまた、イヌの関節症又は関節炎の診断剤、イヌの関節症又は関節炎の診断方法、イヌの関節症又は関節炎の治療剤、イヌの関節症又は関節炎の治療方法、核酸及びベクターを提供することを目的とする。

本発明は以下の通りである。
（１）ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列又は配列番号１〜３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６のアミノ酸配列又は配列番号４〜６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、イヌＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメント。
（２）ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、（１）に記載の抗体又は抗体フラグメント。
（３）配列番号７のアミノ酸配列又は配列番号７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、 配列番号８のアミノ酸配列又は配列番号８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、（１）又は（２）に記載の抗体又は抗体フラグメント。
（４）配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、（３）に記載の抗体又は抗体フラグメント。
（５）キメラ抗体又はイヌ化抗体である、（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメント。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメントを含む、イヌの関節症又は関節炎の診断剤。
（７）イヌ由来の生体試料に、（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメントを反応させる工程を含む、イヌの関節症又は関節炎の診断方法。
（８）（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメントを有効成分とする、イヌの関節症又は関節炎の治療剤。
（９）（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメントを、イヌに投与する工程を含む、イヌの関節症又は関節炎の治療方法。
（１０）（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸。
（１１）（１０）に記載の核酸を発現可能に保持するベクター。

本発明によれば、イヌＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントを提供することができる。また、イヌの関節症又は関節炎の診断剤、イヌの関節症又は関節炎の診断方法、イヌの関節症又は関節炎の治療剤、イヌの関節症又は関節炎の治療方法、核酸及びベクターを提供することができる。

（ａ）は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によりイヌＩＬ−６受容体の発現を解析した結果を示すグラフである。（ｂ）は、ウエスタンブロッティングによりイヌＩＬ−６受容体の発現を解析した結果を示す写真である。 ハイブリドーマのスクリーニングにおける代表的なＦＡＣＳの結果を示すグラフである。 モノクローナル抗体Ｇ１０をイヌ末梢リンパ球と反応させた結果を示すグラフである。 （ａ）は、イヌ末梢リンパ球を抗ＣＤ２１抗体及びモノクローナル抗体Ｇ１０で染色した結果を示すグラフである。（ｂ）は、イヌ末梢リンパ球を抗ＣＤ３ε抗体及びモノクローナル抗体Ｇ１０で染色した結果を示すグラフである。 （ａ）は、イヌ末梢リンパ球を抗ＣＤ２１抗体で染色した結果を示すグラフである。（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）は、イヌＩＬ−６受容体遺伝子のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真である。（ｃ）は、イヌ末梢リンパ球を抗ＣＤ３ε抗体で染色した結果を示すグラフである。（ｅ）は、イヌ末梢リンパ球をモノクローナル抗体Ｇ１０で染色した結果を示すグラフである。 パラホルムアルデヒドで固定したイヌ末梢リンパ球をモノクローナル抗体Ｇ１０で染色した結果を示すグラフである。 （ａ）は、サイトスピンにより回収した、変形性関節症罹患犬の関節液中に含まれる細胞の顕微鏡写真である。（ｂ）は、変形性関節症罹患犬の関節液中に含まれる細胞をモノクローナル抗体Ｇ１０で染色した結果を示すグラフである。

［抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメント］
１実施形態において、本発明は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３が、それぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列又は配列番号１〜３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６のアミノ酸配列又は配列番号４〜６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、イヌＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントを提供する。ここで、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３における数個とは、５個、４個、３個又は２個を意味する。

抗体フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを適切なリンカーで連結したｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ（ｓｃＦｖ）等が挙げられる。ｓｃＦｖのリンカーとしては、例えば、（ＧＧＧＧＳ）_３（配列番号２１）等のペプチドが挙げられる。

本実施形態の抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、イヌＩＬ−６受容体に良好に結合することができることから、イヌの生きた細胞や組織を用いた、ＦＡＣＳ解析、蛍光顕微鏡観察等による、イヌＩＬ−６受容体陽性細胞の動態や形態の解析に用いることができる。

更に、実施例において後述するように、本実施形態の抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、パラホルムアルデヒド固定した細胞におけるＩＬ−６受容体にも反応することができる。したがって、本実施形態の抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、固定された病理標本の染色にも利用することができる。

抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するものであってもよい。

また、抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するものであってもよい。

また、抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、抗イヌＩＬ−６受容体に対する反応性を有している限り、配列番号７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するものであってもよい。ここで、重鎖可変領域又は軽可変領域における数個とは、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個又は２個を意味する。

また、抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、キメラ抗体又はイヌ化抗体であってもよい。ここで、キメラ抗体とは、抗体の定常領域部分が、他の動物由来の抗体の定常領域部分に置き換えられた抗体をいう。ここで、他の動物由来の抗体としては、イヌ抗体が好ましい。また、イヌ化抗体とは、可変領域中の相補性決定領域（ＣＤＲ）のみがラット等の非イヌ動物抗体由来であり、ＣＤＲ以外の可変領域中のフレームワーク領域（ＦＲ）及び定常領域がイヌ抗体由来であるものをいう。キメラ抗体又はイヌ化抗体のクラスは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのいずれであってもよいが、例えばＩｇＧであることが好ましい。

イヌに非イヌ抗体を投与すると、異種抗原に対する免疫応答が惹起され、アナフィラキシーショック等の重篤な副作用が生じる場合がある。これに対し、抗体の定常領域部分がイヌ抗体に置き換えられたキメラ抗体又はイヌ化抗体であれば、このような副作用が低減されるため、イヌに投与することができる。

抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、標識物質で標識されていてもよい。標識物質としては、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アミラーゼ等の酵素；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｒ−フィコエリトリン、Ｂ−フィコエリトリン、アレクサフルオロ４８８、アレクサフルオロ６４７等の蛍光物質；トリチウム、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１等の放射性核種；ビオチン；ストレプトアビジン等が挙げられる。

［イヌの関節症又は関節炎の診断剤］
１実施形態において、本発明は、上述した抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントを含む、イヌの関節症又は関節炎の診断剤を提供する。

関節症としては、変形性膝関節症、変形性股関節症等の変形性関節症；半月板損傷、膝蓋腱損傷等の外傷による外傷性関節症；顎関節症；関節リウマチによる関節破壊（骨破壊）等が挙げられる。関節炎としては、関節リウマチ；関節周囲炎等が挙げられる。

上述した抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、イヌの細胞の表面に発現したＩＬ−６受容体に対して良好な反応性を示し、生きた細胞及び固定した細胞のいずれに対しても使用することができる。したがって、本実施形態の診断剤は、イヌの関節症又は関節炎の診断に好適に用いられる。

本実施形態の診断剤の抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、非標識であってもよいし、標識されていてもよい。また、溶液状態で提供されてもよいし、凍結乾燥された粉末状態で提供されてもよい。抗体又は抗体フラグメントが非標識である場合には、例えば、標識された２次抗体を使用して、細胞の表面に発現したＩＬ−６受容体、又は血液中の可溶性ＩＬ−６受容体を検出することができる。

本実施形態の診断剤は、抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントの他に、抗体が酵素標識されていた場合の当該酵素の発色基質、抗体や発色基質を希釈するための緩衝液等を含むキットとして提供されてもよい。

［イヌの関節症又は関節炎の診断方法］
１実施形態において、本発明は、イヌ由来の生体試料に、上述した抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントを反応させる工程を含む、イヌの関節症又は関節炎の診断方法を提供する。

本実施形態の診断方法について以下に説明する。まず、対象のイヌから少量の生体組織を採取する。生体組織としては、例えば、血液、関節液等が挙げられる。続いて、これらの生体試料から、例えば、市販のリンパ球分離液を用いた比重遠心法による分離によりリンパ球等の細胞を回収する。続いて、回収した細胞に、上述した抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントを混合し、反応させる。

続いて、未反応の抗体を洗浄除去し、必要であれば標識された２次抗体を反応させて、更に未反応の２次抗体を洗浄除去する。その後、ＦＡＣＳ解析、蛍光顕微鏡観察等を行い、ＩＬ−６受容体陽性細胞の動態や形態を観察し、イヌの関節症又は関節炎の診断を行う。

あるいは、イヌの血液又は血清、血漿を生体試料として、血液中の可溶性ＩＬ−６受容体を定量することにより、イヌの関節症又は関節炎の診断を行うこともできる。

本実施形態の診断方法では、イヌの生きた細胞及び固定した細胞のいずれも使用することができるため、より正確かつ簡便にイヌの関節症又は関節炎の診断を行うことができる。

［イヌの関節症又は関節炎の治療剤］
１実施形態において、本発明は、上述した抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントを有効成分とする、イヌの関節症又は関節炎の治療剤を提供する。

本実施形態の治療剤をイヌに投与すると、ＩＬ−６受容体に結合して、ＩＬ−６のシグナル伝達を遮断することが期待される。

あるいは、抗体依存性細胞傷害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ−Ｃｅｌｌｕｌａｒ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞障害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）活性、アポトーシス誘導等の機構により、ＩＬ−６受容体発現細胞を殺傷することもできる。

したがって、上述した抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントを有効成分とする治療剤は、イヌの関節症又は関節炎の治療剤として有用である。

本実施形態の治療剤は、薬学的に許容可能な添加剤を含有する医薬組成物として製剤化されていてもよい。医薬組成物の剤型としては、注射剤等が挙げられる。また、薬学的に許容可能な添加剤としては、水等の溶媒、界面活性剤、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、無水クエン酸、ｐＨ調整剤、防腐剤等が挙げられる。医薬組成物は、注射剤であってもよい。医薬組成物は、液体で供給されてもよく、粉末で供給され、使用前に水や緩衝液等で溶解するように構成されていてもよい。

イヌへの投与は、例えば、皮下注射、関節内注射、筋肉内注射等が挙げられる。投与量は、患畜の体重や年齢、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。例えば、１回１０〜２００ｍｇを２週間間隔で皮下注射することが挙げられる。

［イヌの関節症又は関節炎の治療方法］
１実施形態において、本発明は、上述した抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントを、イヌに投与する工程を含む、イヌの関節症又は関節炎の治療方法を提供する。

本実施形態の治療方法により、イヌの関節症又は関節炎を治療することができる。ここで、抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、上述した医薬組成物として製剤化されていてもよい。抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントの投与方法、投与量は、上述したものと同様である。

１実施形態において、本発明は、イヌの関節症又は関節炎の治療のための、上述した抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントを提供する。

１実施形態において、本発明は、イヌの関節症又は関節炎の治療剤の製造のための、上述した抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントの使用を提供する。

［抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸］
１実施形態において、本発明は、上述した抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸を提供する。

このような核酸としては、例えば、上述した抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体の重鎖可変領域遺伝子、上述した抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体の軽鎖可変領域遺伝子、上述した抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体の重鎖可変領域及び定常領域の一部をコードする遺伝子、上述した抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体の軽鎖可変領域及び定常領域の一部をコードする遺伝子、上述した抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体の重鎖全長をコードする遺伝子、上述した抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体の軽鎖全長をコードする遺伝子、上述した抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体の重鎖可変領域遺伝子に非ラット抗体重鎖定常領域の一部又は全長が連結された遺伝子、上述した抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体の軽鎖可変領域遺伝子に非ラット抗体軽鎖定常領域の一部又は全長が連結された遺伝子、上述した抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを適切なリンカーで連結したｓｃＦｖをコードする遺伝子等が挙げられる。

上記の重鎖可変領域遺伝子は、配列番号９に記載の塩基配列の１１７〜４７９番目の残基からなる重鎖可変領域遺伝子であってもよい。また、上記の軽鎖可変領域遺伝子は、配列番号１０に記載の塩基配列の９８〜４１５番目の残基からなる軽鎖可変領域遺伝子であってもよい。

また、上記の重鎖可変領域遺伝子は、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１〜３に記載のアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ以外のフレームワーク領域が非ラット抗体由来である重鎖可変領域をコードする遺伝子であってもよい。また、上記の軽鎖可変領域遺伝子は、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６に記載のアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ以外のフレームワーク領域が、非ラット抗体由来である軽鎖可変領域をコードする遺伝子であってもよい。ここで、非ラット抗体としては、マウス、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ロバ、ウシ、ウマ、ブタ、サル、ヒト等の抗体が挙げられ、特にイヌ抗体であることが好ましい。

本実施形態の核酸は、上述した抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体の重鎖可変領域遺伝子又はこれに由来する遺伝子と、抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体の軽鎖可変領域遺伝子又はこれに由来する遺伝子との組み合わせであることが好ましい。ここで、重鎖可変領域遺伝子に由来する遺伝子としては、例えば、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１〜３に記載のアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ以外のフレームワーク領域が非ラット抗体由来である重鎖可変領域をコードする遺伝子が挙げられる。また、同様に、軽鎖可変領域遺伝子に由来する遺伝子としては、例えば、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６に記載のアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ以外のフレームワーク領域が非ラット抗体由来である軽鎖可変領域をコードする遺伝子が挙げられる。

［抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントの発現ベクター］
１実施形態において、本発明は、上述した抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸を発現可能に保持するベクターを提供する。本実施形態のベクターにより、上述した核酸を発現させ、上述した抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体又は抗体断片を作製することができる。ベクターとしては、各発現系に応じたものを用いることができ、例えば、大腸菌発現用のｐＥＴ、酵母発現用のｐＡＵＲ、昆虫細胞発現用のｐＩＥｘ、動物細胞発現用のｐＣＭＶ、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられる。

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

〔実験例１〕
［抗イヌＩＬ−６受容体モノクローナル抗体の作製］
（イヌＩＬ−６受容体安定発現ＮＲＫ細胞株の樹立）
すでに報告されているＩＬ−６受容体のｃＤＮＡの塩基配列をもとに、健常イヌ浅頸リンパ節由来ｃＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、イヌＩＬ−６受容体のｃＤＮＡをクローニングした。クローニングしたイヌＩＬ−６受容体のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２２に示す。

続いて、イヌＩＬ−６受容体のｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み、ラット腎臓由来細胞株であるＮＲＫ細胞株に遺伝子導入後、ネオマイシン存在下で培養し、イヌＩＬ−６受容体安定発現ＮＲＫ細胞株を樹立した。

上述したイヌＩＬ−６受容体安定発現ＮＲＫ細胞株に導入されたイヌＩＬ−６受容体遺伝子には、ＨＡタグが連結されている。したがって、イヌＩＬ−６受容体安定発現ＮＲＫ細胞株が発現するイヌＩＬ−６受容体タンパク質は、抗ＨＡ抗体を用いて検出することができる。

図１（ａ）は、ＮＲＫ細胞株及び樹立したイヌＩＬ−６受容体安定発現ＮＲＫ細胞株を抗ＨＡ抗体で染色し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によりイヌＩＬ−６受容体の発現を解析した結果を示すグラフである。図中、「ＮＲＫ」はＮＲＫ細胞株の結果を示し、「ＮＲＫ／ＩＬ６Ｒ」はイヌＩＬ−６受容体安定発現ＮＲＫ細胞株の結果を示す。その結果、樹立したイヌＩＬ−６受容体安定発現ＮＲＫ細胞株がイヌＩＬ−６受容体を発現していることが確認された。

また、図１（ｂ）は、ＮＲＫ細胞株及びイヌＩＬ−６受容体安定発現ＮＲＫ細胞株より調製した全タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロッティングに供し、抗ＨＡ抗体で染色した結果を示す写真である。図中、「ｍｏｃｋ」はＮＲＫ細胞株の結果を示し、「ＮＲＫ／ＩＬ６Ｒ」はイヌＩＬ−６受容体安定発現ＮＲＫ細胞株の結果を示す。その結果、その結果、樹立したイヌＩＬ−６受容体安定発現ＮＲＫ細胞株がイヌＩＬ−６受容体を発現していることが確認された。

（ラットの免疫及びハイブリドーマの作製）
従来、遺伝子情報を基に作製した抗原については、大腸菌等を用いて作成した組み換えタンパク質を免疫抗原として主に用いられてきた。しかし、組み換えタンパク質を免疫して得られたほとんどの抗体は、目的の分子の１次構造を認識することができても、細胞表面に発現した場合の３次元構造を認識することができない。

そこで、本発明者らはラット腸骨リンパ節法によるラットの免疫を行った。より具体的には、上述したイヌＩＬ−６受容体安定発現ＮＲＫ細胞株を、ＮＲＫ細胞株と同系のラットに免疫した。これにより、ＮＲＫ細胞株の細胞表面に発現した非自己のイヌＩＬ−６受容体のみを認識する抗体が得られると考えられた。

イヌＩＬ−６受容体安定発現ＮＲＫ細胞株を、アジュバントであるＴｉｔｅｒ Ｍａｘ Ｇｏｌｄ（ＣｙｔＲｘ社）と混合し、Ｗｉｓｔａｒラット（日本エスエルシー株式会社）の臀部筋肉に投与し、初回免疫７日後及び１４日後にブーストを行った。続いて、最終免疫から３日後に、膝下リンパ節及び鼡径リンパ節を採取し、リンパ球を回収した。続いて、回収したリンパ球及びマウスミエローマ細胞株であるＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞を細胞融合した。得られた細胞を、ＨＡＴ培養液で培養して、リンパ球とマウスミエローマ細胞とが融合したハイブリドーマを選択した。

（ハイブリドーマのスクリーニング）
得られたハイブリドーマの培養上清中の抗体を、イヌＩＬ−６受容体安定発現ＮＲＫ細胞株と反応させ、ＦＡＣＳにより、反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングした。２次抗体としては、蛍光標識された抗ラットＩｇＧ抗体を使用した。図２は、代表的なＦＡＣＳの結果を示すグラフである。図中、「ＮＲＫ」はＮＲＫ細胞株の結果を示し、「ＮＲＫ／ＩＬ６Ｒ」はイヌＩＬ−６受容体安定発現ＮＲＫ細胞株の結果を示す。その結果、イヌＩＬ−６受容体安定発現ＮＲＫ細胞株に反応し、ＮＲＫ細胞株に反応しない抗体を産生するハイブリドーマを選択することができた。

続いて、候補のハイブリドーマの培養上清中の抗体を、イヌ末梢リンパ球と反応させ、ＦＡＣＳにより、反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングした。有望なハイブリドーマについて、限界希釈法によりクローニングを行い、ハイブリドーマ細胞株Ｃｌｏｎｅ Ｇ１０を得た。以下、ハイブリドーマ細胞株Ｃｌｏｎｅ Ｇ１０が産生するモノクローナル抗体を「モノクローナル抗体Ｇ１０」という。

図３は、モノクローナル抗体Ｇ１０をイヌ末梢リンパ球と反応させた結果を示すグラフである。その結果、モノクローナル抗体Ｇ１０はイヌ末梢リンパ球の３４．８％と反応することが明らかとなった。

〔実験例２〕
［ＦＡＣＳによるモノクローナル抗体Ｇ１０の解析］
イヌ末梢リンパ球を、Ｂ細胞マーカーであるＣＤ２１に対する抗体、Ｔ細胞マーカーであるＣＤ３εに対する抗体、及びモノクローナル抗体Ｇ１０で染色してＦＡＣＳで解析した。

図４（ａ）は抗ＣＤ２１抗体及びモノクローナル抗体Ｇ１０による染色結果を示すグラフである。その結果、イヌＢ細胞のうち、９１％がモノクローナル抗体Ｇ１０と反応することが明らかとなった。

図４（ｂ）は抗ＣＤ３ε抗体及びモノクローナル抗体Ｇ１０による染色結果を示すグラフである。その結果、イヌＴ細胞のうち、４１％がモノクローナル抗体Ｇ１０と反応することが明らかとなった。

〔実験例３〕
［ＦＡＣＳ及びＲＴ−ＰＣＲによるＩＬ−６受容体の発現の解析］
イヌ末梢リンパ球を抗ＣＤ２１抗体で染色し、ＣＤ２１陽性細胞及びＣＤ２１陰性細胞をＦＡＣＳのソーティング機能により分取した。図５（ａ）はＦＡＣＳの結果を示すグラフである。図中、「ＣＤ２１^＋」はＣＤ２１陽性細胞を示し、「ＣＤ２１⁻」はＣＤ２１陰性細胞を示す。

ソーティングにより回収したＣＤ２１陽性細胞及びＣＤ２１陰性細胞のそれぞれについて、ＲＴ−ＰＣＲによりイヌＩＬ−６受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現を検討した。陽性対照として、アクチンのｍＲＮＡの発現を検討した。イヌＩＬ−６受容体遺伝子の増幅用プライマーには、Ｐ−ＩＬ６ＲＦ（配列番号１１）及びＰ−ＩＬ６ＲＲ（配列番号１２）を使用した。また、アクチン遺伝子の増幅用プライマーには、Ｐ−ａｃｔｉｎＦ（配列番号１３）及びＰ−ａｃｔｉｎＲ（配列番号１４）を使用した。

図５（ｂ）は、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真である。図中、「ＩＬ６Ｒ」はイヌＩＬ−６受容体遺伝子を意味する。ＣＤ２１陰性細胞では、イヌＩＬ−６受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現が認められなかったのに対し、ＣＤ２１陽性細胞では、イヌＩＬ−６受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現が認められた。

続いて、イヌ末梢リンパ球を抗ＣＤ３ε抗体で染色し、ＣＤ３ε陽性細胞及びＣＤ３ε陰性細胞をＦＡＣＳのソーティング機能により分取した。図５（ｃ）はＦＡＣＳの結果を示すグラフである。図中、「ＣＤ３ε^＋」はＣＤ３ε陽性細胞を示し、「ＣＤ３ε⁻」はＣＤ３ε陰性細胞を示す。

ソーティングにより回収したＣＤ３ε陽性細胞及びＣＤ３ε陰性細胞のそれぞれについて、ＲＴ−ＰＣＲにより上記と同様にしてイヌＩＬ−６受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現を検討した。

図５（ｄ）は、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真である。ＣＤ３ε陰性細胞では、イヌＩＬ−６受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現が認められなかったのに対し、ＣＤ３ε陽性細胞では、イヌＩＬ−６受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現が認められた。

続いて、イヌ末梢リンパ球をモノクローナル抗体Ｇ１０で染色し、染色される細胞及び染色されない細胞をＦＡＣＳのソーティング機能により分取した。図５（ｅ）はＦＡＣＳの結果を示すグラフである。図中、「Ｇ１０^＋」はモノクローナル抗体Ｇ１０で染色される細胞を示し、「Ｇ１０⁻」はモノクローナル抗体Ｇ１０で染色されない細胞を示す。

ソーティングにより回収した細胞のそれぞれについて、ＲＴ−ＰＣＲにより上記と同様にしてイヌＩＬ−６受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現を検討した。

図５（ｆ）は、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真である。モノクローナル抗体Ｇ１０で染色される細胞では、イヌＩＬ−６受容体のｍＲＮＡの強い発現が認められた。

以上の結果は、モノクローナル抗体Ｇ１０がイヌＩＬ−６受容体に特異的に反応することを示す。

〔実験例４〕
［固定した細胞に対するモノクローナル抗体Ｇ１０の反応性の解析］
イヌ末梢リンパ球をパラホルムアルデヒドで固定し、固定したイヌ末梢リンパ球に対するモノクローナル抗体Ｇ１０の反応性をＦＡＣＳにより解析した。

図６は、ＦＡＣＳの結果を示すグラフである。図中、「ＮＣ」は陰性対照として、アイソタイプコントロール抗体を用いた染色結果を示し、「Ｇ１０」はモノクローナル抗体Ｇ１０で染色した結果を示す。

その結果、モノクローナル抗体Ｇ１０は、パラホルムアルデヒド固定した細胞においても反応性を有することが明らかとなった。

〔実験例５〕
［変形性関節症罹患犬の関節液中に含まれる細胞に対するモノクローナル抗体Ｇ１０の反応性の解析］
変形性関節症罹患犬の関節液中には細胞が含まれている。図７（ａ）は、サイトスピン標本における、変形性関節症罹患犬の関節液中に含まれる細胞の顕微鏡写真である。変形性関節症罹患犬の関節液中に含まれる細胞をモノクローナル抗体Ｇ１０で染色し、ＦＡＣＳにより解析した。

図７（ｂ）は、ＦＡＣＳの結果を示すグラフである。図中、「ＮＣ」は陰性対照として、アイソタイプコントロール抗体を用いた染色結果を示し、「Ｇ１０」はモノクローナル抗体Ｇ１０で染色した結果を示す。その結果、変形性関節症罹患犬の関節液中に含まれる細胞はＩＬ−６受容体を発現していることが明らかとなった。

以上の結果は、モノクローナル抗体Ｇ１０がイヌ関節症又は関節炎の診断に利用可能であることを示す。

〔実験例６〕
［モノクローナル抗体Ｇ１０をコードする遺伝子の塩基配列解析］
ハイブリドーマ細胞株Ｃｌｏｎｅ Ｇ１０から調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより抗体重鎖可変領域遺伝子を増幅し、シークエンス用ベクターｐＧＥＭ−ｅａｓｙ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社）にクローン化し、塩基配列を解析した。抗体重鎖可変領域遺伝子増幅用プライマーには、Ｐ−Ｈ_ＶＦ１（配列番号１５）、Ｐ−Ｈ_ＶＦ２（配列番号１６）及びＰ−Ｈ_ＶＲ（配列番号１７）を使用した。モノクローナル抗体Ｇ１０の重鎖可変領域遺伝子の塩基配列を配列番号９に示す。また、重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号７に示す。また、重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１〜３に示す。

同様に、ハイブリドーマ細胞株Ｃｌｏｎｅ Ｇ１０から調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより抗体軽鎖可変領域遺伝子を増幅し、シークエンス用ベクターｐＧＥＭ−ｅａｓｙ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社）にクローン化し、塩基配列を解析した。抗体軽鎖可変領域遺伝子増幅用プライマーには、Ｐ−Ｌ_ＶＦ１（配列番号１８）、Ｐ−Ｌ_ＶＦ２（配列番号１９）及びＰ−Ｌ_ＶＲ（配列番号２０）を使用した。モノクローナル抗体Ｇ１０の軽鎖可変領域遺伝子の塩基配列を配列番号１０に示す。また、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号８に示す。また、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４〜６に示す。

本発明によれば、イヌＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントを提供することができる。また、イヌの関節症又は関節炎の診断剤、イヌの関節症又は関節炎の診断方法、イヌの関節症又は関節炎の治療剤、イヌの関節症又は関節炎の治療方法、核酸及びベクターを提供することができる。

Claims (11)

1. ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列又は配列番号１〜３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、
   ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６のアミノ酸配列又は配列番号４〜６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、イヌインターロイキン−６受容体に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメント。
2. ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメント。
3. 配列番号７のアミノ酸配列又は配列番号７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、
   配列番号８のアミノ酸配列又は配列番号８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、請求項１又は２に記載の抗体又は抗体フラグメント。
4. 配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、請求項３に記載の抗体又は抗体フラグメント。
5. キメラ抗体又はイヌ化抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントを含む、イヌの関節症又は関節炎の診断剤。
7. イヌ由来の生体試料に、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントを反応させる工程を含む、イヌの関節症又は関節炎の診断方法。
8. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントを有効成分とする、イヌの関節症又は関節炎の治療剤。
9. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントを、イヌに投与する工程を含む、イヌの関節症又は関節炎の治療方法。
10. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸。
11. 請求項１０に記載の核酸を発現可能に保持するベクター。