JP2015504650A - 脊髄性筋萎縮症における誘発されたエクソン包含 - Google Patents

Abstract

本発明は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の処置としてエクソン包含を誘発するためのアンチセンス化合物の使用に関する。より具体的には、本発明は、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）遺伝子によってコードされた生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質のレベルを回復するためのエクソン７包含の誘発に関する。患者の脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の処置方法もまた、本発明の範囲内である。このような方法は、ＳＭＮ２遺伝子内の一領域に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さ及び相補性のヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与して、細胞内のエクソン７含有ＳＭＮ２ｍＲＮＡのエクソン欠失ＳＭＮ２ｍＲＮＡに対するレベルを増強する工程を含む。【選択図】なし

Description

本発明は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の処置としてエクソン包含を誘発するためのアンチセンス化合物の使用に関する。より具体的には、本発明は、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）遺伝子によってコードされた生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質のレベルを回復するためのエクソン７包含の誘発に関する。

選択的スプライシングは、１つの遺伝子から複数のタンパク質を産生することによってヒトゲノムのコーディングポテンシャルを増大する。更に、ヒト疾患の数の増大にも関連する。

ＳＭＡは、生存運動ニューロンＳＭＮ遺伝子によってコードされたＳＭＮタンパク質の損失の結果生じる、しばしば致命的となる遺伝性疾患である。ＳＭＮ遺伝子、ＳＭＮ１及びＳＭＮ２は染色体５上に位置し、ＳＭＡは両方の染色体からＳＭＮ１が失われることによって引き起こされる。ＳＭＮ２はＳＭＮ１とほぼ同一であるが、ＳＭＮタンパク質の生成における有効性がより低い。ＳＭＡの重症度は、ＳＭＮ２（数個のコピーが存在する）がＳＭＮタンパク質を産生する効率によって影響される。

ＳＭＮ１は、細胞生存に不可欠なプロセスであるｓｎＲＮＰアセンブリに必要な、遍在的に発現する３８ｋＤａのＳＭＮタンパク質をコードする。この遺伝子のほぼ同一のコピーであるＳＭＮ２は、エクソン７スキッピングにより、不安定なトランケート型タンパク質であるＳＭＮΔ７を産生することから、ＳＭＮ１の損失を補正できない。ＳＭＮ１とＳＭＮ２は、エクソン７の６位（ＳＭＮ２転写物のＣ６Ｕ）における重要なＣ→Ｔ置換によって異なる。Ｃ６Ｕはコード配列を変更しないが、ＳＭＮ２においてエクソン７スキッピングを引き起こすには十分である。

現在のＳＭＡの処置は、長期的な運動単位損失の二次的影響の防止及び管理からなる。現在、ＳＭＡの処置又は予防に使用できる薬物療法は存在しない。

アンチセンス技術は、ほとんどがＲＮＡ下方制御に使用されるが、最近はスプライシングプロセスの変更に適応されている。ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのスプライシングを変更できる有効な作用剤は、治療的に有用である可能性が高い。

本出願は、細胞内のエクソン７含有ＳＭＮ２ｍＲＮＡのエクソン欠失ＳＭＮ２ｍＲＮＡに対するレベルを増強する方法であって、ＳＭＮ２遺伝子内の一領域に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さ及び相補性のアンチセンスオリゴヌクレオチドに細胞を接触させて、細胞内のエクソン７含有ＳＭＮ２ｍＲＮＡのエクソン欠失ＳＭＮ２ｍＲＮＡに対するレベルを増強する工程を含み、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理学的ｐＨにおいて正に荷電したヌクレオシドを少なくとも１つ有する、方法に関する。

一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約４．５〜約１２のｐＫａを示す少なくとも１つのヌクレオシド間結合を有する。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、塩基性窒素とアルキル、アリール、又はアラルキル基との両方を含有するヌクレオシド間結合を有する。他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはモルホリノを含む。

他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、次式：

を有するヌクレオチドを少なくとも１つ包含し、式中、Ｎｕは核酸塩基であり；
Ｒ_１は次式

の部分であり、ｑは０、１、２、３又は４であり；
Ｒ_２は、水素、Ｃ_１〜Ｃ_５アルキル、ホルムアミジニル部分からなる群から選択され、かつ
Ｒ_３は、水素及びＣ_１〜Ｃ_５アルキルからなる群から選択されるか、又は
Ｒ_２及びＲ_３は、結合して、任意追加的に酸素ヘテロ原子を含有する５〜７員の複素環を形成し、この環は任意追加的にＣ_１〜Ｃ_５アルキル、フェニル、ハロゲン、及びアラルキルからなる群から選択される置換基で置換されていてもよく；
Ｒ_４は、不在、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル及びアラルキルからなる群から選択され；
Ｒ_ｘは、ＨＯ−、ヌクレオチド、膜透過性ペプチド部分、及びピペラジニルからなる群から選択され；
Ｒ_ｙは、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、ヌクレオチド、ペプチド部分、アミノ酸、ホルムアミジニル部分、及びアシルからなる群から選択され；
Ｒ_ｚは、不在、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、及びアシル；並びにこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される。

好ましくは、Ｎｕは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、及びヒポキサンチンからなる群から選択される。

細胞内のエクソン７含有ＳＭＮ２ｍＲＮＡのエクソン欠失ＳＭＮ２ｍＲＮＡに対するレベルを増強する別の方法は、ＳＭＮ２遺伝子内の一領域に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さ及び相補性のアンチセンスオリゴヌクレオチドに細胞を接触させて、細胞内のエクソン７含有ＳＭＮ２ｍＲＮＡのエクソン欠失ＳＭＮ２ｍＲＮＡに対するレベルを増強する工程を含み、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、次式：

を有するヌクレオシドを少なくとも１つ有し、式中、Ｒｘ、Ｒｙ、Ｒｚ、及びＮｕは上述の通りである。

別の実施形態において、細胞内のエクソン７含有ＳＭＮ２ｍＲＮＡのエクソン欠失ＳＭＮ２ｍＲＮＡに対するレベルを増強する方法は、ＳＭＮ２遺伝子内の一領域、例えばＳＭＮ２遺伝子のエクソン７、イントロン７、又はエクソン８内の一領域（又はスプライスジャンクションに広がる領域）に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さ及び相補性のアンチセンスオリゴヌクレオチドに細胞を接触させて、細胞内のエクソン７含有ＳＭＮ２ｍＲＮＡのエクソン欠失ＳＭＮ２ｍＲＮＡに対するレベルを増強する工程を含む。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＭＮ２遺伝子のイントロン７に相補的又はＳＭＮ２遺伝子のエクソン８に相補的な配列を含む。別の実施形態は、細胞取り込みを増強するペプチド部分を更に含むアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは無電荷である。更なる実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは帯電している。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド内の１つ以上のヌクレオチド間結合がＡＰＮ修飾を有してもよい。修飾されたオリゴヌクレオチドは、核酸塩基Ｔ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ又はそれらの類似体を含有する。好ましくは、修飾されたヌクレオチド間結合は、Ｔ、Ｃ又はＡサブユニットから誘導される。

本発明はまた、ＡＰＮ修飾を有する表１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び本発明の方法におけるその使用にも関する。

患者の脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の処置方法もまた、本発明の範囲内である。このような方法は、ＳＭＮ２遺伝子内の一領域に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さ及び相補性のヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与して、細胞内のエクソン７含有ＳＭＮ２ｍＲＮＡのエクソン欠失ＳＭＮ２ｍＲＮＡに対するレベルを増強する工程を含み、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理学的ｐＨにおいて正に荷電したヌクレオシドを少なくとも１つ有し、それによって患者を処置する。

モルホリノオリゴマーを合成するための固体担体の調製。 モルホリノオリゴマーを合成するための固体担体の調製。 モルホリノオリゴマーの固相合成。 モルホリノオリゴマーの固相合成。 試験した脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）配列。上記の配列を含有し、図６で試験したオリゴヌクレオチドは、赤色太字で下線を引いたＴ塩基にＡＰＮ修飾を有するＰＭＯ骨格を含有する（各ＡＰＮ含有オリゴについて合計４つの修飾）。 オリゴヌクレオチド処理した脊髄性筋萎縮症患者線維芽細胞から得られた用量反応曲線。ＧＭ０３８１３線維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ）中のＳＭＮ２エクソン７の包含又は除外を表すゲルバンドの強度を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥ）で定量化した。エクソン７包含は、エクソン７包含バンド強度をエクソン７包含バンドと除外バンドからの強度の合計で除算した比から計算されたパーセンテージとして報告される。各ドットは、各濃度における２つのレプリケートの平均＋／−１標準偏差を表す。３種類の独立した実験を組み合わせて上記のデータセットを得た。包含パーセンテージの分析は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで実施した。データポイント及び曲線は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍでプロットした。データは、オリゴヌクレオチドに対するＡＰＮ修飾が、化合物の効力を、同じ配列を含有する非修飾ＰＭＯと比較して増強することを示す。 ＳＭＮ２のＲＴ−ＰＣＲ。示されている濃度においてＥ８／４ｂ ＡＰＮ修飾オリゴヌクレオチドでヌクレオフェクトしたＧＭ０３８１３線維芽細胞からのＲＮＡを、「方法」に記載するように、ＲＴ−ＰＣＲ増幅した。その結果生じる反応を含有するゲルを、「方法」及び図６に記載のように分析した。 図７に示すように、本発明は、細胞内のエクソン７含有ＳＭＮ２ｍＲＮＡのエクソン欠失ＳＭＮ２ｍＲＮＡに対するレベルを増強するための方法を提供する。これをこの図に模式的に示す。図７のゲルで最大のバンドは、エクソン６、７、イントロン７及びエクソン８を含有するｃＤＮＡに相当する。中間のバンドは、エクソン６、７、及びエクソン８を含有する逆転写産物を含有する。最小のバンドは、エクソン６及び８に相当する。このように、細胞をＡＰＮオリゴヌクレオチドで処理すると、ｃＤＮＡ内のエクソン７包含に相当する高分子量のバンドが増大する。エクソン７は終止コドンを包含することから、いずれの高分子量ｃＤＮＡのタンパク質産物も同じになるであろう。 ＡＰＮ及びｐｌｕｓ関連のカチオン修飾の代表的構造。ＡＰＮ関連及びｐｌｕｓ関連のカチオン修飾の代表的な種を示している。ＡＰＮ関連修飾はＡＰＮ及びｍａｐＴを包含し、ｐｕｌｓ関連修飾はｐｌｕｓＴ、ｍｅｄａＴ、及びｅｔｐｉｐＴを包含する。例示された修飾はチミンに関するが、いかなる塩基（例えば、チミン、シトシン、グアニン、アデニン）も、ＡＰＮ関連及びｐｌｕｓ関連のカチオン修飾で修飾できる。

本明細書で使用するとき、「核酸塩基」（Ｎｕ）、「塩基対合部分」又は「塩基」は、互換可能に使用されて、改良された特性、例えばオリゴヌクレオチドに対する結合親和性を付与する未変性ＤＮＡ又はＲＮＡ（ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、及びグアニン）に見出されるプリン又はピリミジン塩基、並びに天然のプリン及びピリミジンの類似体を指す。代表的な類似体としては、ヒポキサンチン（ヌクレオシドイノシンの塩基成分）；５−メチルシトシン；Ｃ５−プロピニル修飾ピリミジン、９−（アミノエトキシ）フェノキサジン（Ｇ−クランプ）等が挙げられる。

塩基対合部分の更なる例としては、限定するものではないが、ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、及びグアニン（それぞれのアミノ基がアシル保護基によって保護されたもの）、２−フルオロウラシル、２−フルオロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、２，６−ジアミノプリン、アザシトシン、ピリミジン類似体（プソイドイソシトシン及びプソイドウラシル等）並びにその他の修飾核酸塩基、例えば８−置換プリン、キサンチン、又はヒポキサンチン（後者２つは天然分解産物である）が挙げられる。Ｃｈｉｕ ａｎｄ Ｒａｎａ，ＲＮＡ，２００３，９，１０３４−１０４８、Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２２，２１８３−２１９６及びＲｅｖａｎｋａｒ ａｎｄ Ｒａｏ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．７，３１３に開示されている修飾核酸塩基もまた想到される。

塩基対合部分の更なる例としては、限定するものではないが、１つ以上のベンゼン環が付加された拡大核酸塩基が挙げられる。Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ（ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）；Ｋｒｕｅｇｅｒ ＡＴ ｅｔ ａｌ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００７，４０，１４１−１５０；Ｋｏｏｌ，ＥＴ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００２，３５，９３６−９４３；Ｂｅｎｎｅｒ Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２００５，６，５５３−５４３；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００３，７，７２３−７３３；Ｈｉｒａｏ，Ｉ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００６，１０，６２２−６２７に記載されている核酸塩基置換は、本明細書に記載のオリゴマーの合成に有用であると想到される。これらの拡大核酸塩基のいくつかの例を以下に示す：

リボース、糖類似体又はモルホリノに共有結合した核酸塩基はヌクレオシドを含む。「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドを１個のリン酸基と共に含む。リン酸基は、隣接するヌクレオチドと互いに共有結合して、オリゴヌクレオチドを形成する。本明細書で使用するとき、「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド、又はヌクレオチド類似体の線形配列であって、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合によって核酸塩基をＲＮＡの標的配列にハイブリダイズさせて標的配列内にオリゴヌクレオチド：ＲＮＡヘテロ二本鎖を形成することができる。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「アンチセンスオリゴマー」、「オリゴマー」及び「化合物」という用語は、オリゴヌクレオチドを指すために互換可能に使用され得る。

「モルホリノオリゴマー」又は「ＰＭＯ」は、代表的なポリヌクレオチドと水素結合することができる核酸塩基を担持する骨格を有するオリゴヌクレオチドを指し、このポリマーはペントース糖骨格部分を欠くが、代わりにモルホリノ環を含有する。したがって、ＰＭＯにおいてモルホリノ環構造は塩基対合部分を担持し、細胞内又は処置中の被験体内で選択されたアンチセンス標的とハイブリダイズするように一般的に設計された塩基対合部分の配列を形成する。代表的な「モルホリノ」オリゴマーは、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの４’環外炭素に結合するホスホロアミデート又はホスホロジアミデート結合によって一緒に結合されたモルホリノサブユニット構造を含み、このサブユニットの各々は、塩基特異的な水素結合によってポリヌクレオチド内の塩基と結合するのに有効なプリン又はピリミジン核酸塩基を含む。モルホリノオリゴマー（アンチセンスオリゴマーを包含する）は、例えば、米国特許第５，６９８，６８５号；同第５，２１７，８６６号；同第５，１４２，０４７号；同第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，５２１，０６３号；同第５，５０６，３３７号及び係属中の米国特許出願公開第１２／２７１，０３６号；同第１２／２７１，０４０号並びにＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００９／０６４４７１号に詳述されており、これらは全て、参照によりその全体を本明細書に組み込む。

オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は一般にオリゴヌクレオチドの「ヌクレオシド間結合」を形成すると言われる。ＲＮＡ及びＤＮＡの天然のヌクレオシド間結合は、３’〜５’ホスホジエステル結合である。「ホスホロアミデート」基は３個の結合酸素原子と１個の結合窒素原子とを有するリンを含み、一方「ホスホロジアミデート」基は２個の結合酸素原子と２個の結合窒素原子とを有するリンを含む。本明細書中に記載のＰＭＯ及び／又はＰＭＯＸオリゴマーの無電荷又はカチオン性のサブユニット間結合において、１個の窒素は常に骨格鎖にペンダントしている。ホスホロジアミデート結合において、第２の窒素は、一般的にモルホリノ環構造内の環窒素である。

「ＰＭＯＸ」は、（ｉ）モルホリノ環の窒素原子への共有結合及び（ｉｉ）４−アミノピペリジンン−１−イル（すなわち、ＡＰＮ）又は４−アミノピペリジン−１−イルの誘導体の環窒素への第２の共有結合によってリン原子を有するホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーを指す。ＰＭＯＸオリゴマーは、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／３８４５９号（ＷＯ／２０１１／１５０４０８号として公開）に開示されており、参照によりその全体を本明細書に組み込む。「ＰＭＯａｐｎ」又は「ＡＰＮ」は、リン原子がモルホリノ基及び４−アミノピペリジン−１−イル（すなわち、ＡＰＮ）の環窒素に結合したＰＭＯＸオリゴマーを指す。

本明細書で使用するとき、ＬＮＡはロックド核酸オリゴヌクレオチドを指す。「ＬＮＡ」は、架橋核酸（ＢＮＡ）と呼ばれる修飾の分類の１つである。ＢＮＡは、Ｃ３０エンド（ノーザン）糖パッカーのリボース環のコンフォーメーションをロックする共有結合を特徴とする。ＬＮＡでは、架橋が２’−Ｏ位と４’−Ｃ位との間のメチレンで構成される。ＬＮＡは骨格のプレオーガナイゼーション及び塩基スタッキングを増強し、ハイブリダイゼーション及び熱安定性を増大させる。

オリゴヌクレオチドは、Ｔｍが実質的に４５℃を超え、好ましくは少なくとも５０℃であり、典型的には６０℃〜８０℃又はそれ以上である生理学的条件下でオリゴマーが標的にハイブリダイズした場合に、標的ポリヌクレオチドに「特異的にハイブリダイズ」する。このようなハイブリダイゼーションは、好ましくは厳しいハイブリダイゼーション条件に相当する。所与のイオン強度及びｐＨにおいて、Ｔｍは標的配列の５０％が相補的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。そのようなハイブリダイゼーションは、アンチセンスオリゴマーの標的配列に対する「近い」又は「実質的な」相補性、並びに完全な相補性で生じ得る。

標的化配列は、標的配列に「近い」又は「実質的な」相補性を有してもよく、なおも本発明の目的で機能する、すなわち、なおも「相補性」であってもよい。好ましくは、本発明で用いられるオリゴヌクレオチド類似化合物は、標的配列に対して、１０ヌクレオチドのうち多くても１つのミスマッチ、好ましくは、２０のうち多くても１つのミスマッチを有する。あるいは、用いられるアンチセンスオリゴマーは、本明細書中で指定される例示的な標的化配列に対し、少なくとも９０％の配列相同性、好ましくは、少なくとも９５％の配列相同性を有する。

「電子対」は、他の原子と結合又は共有していない一価の電子の対を指す。

「膜透過性ペプチド」（ＣＰＰ）又は「細胞取り込みを増強するペプチド部分」は、互換可能に使用されてカチオン性膜透過性ペプチドを指し、「輸送ペプチド」、「キャリアペプチド」、又は「ペプチド導入ドメイン」とも呼ばれる。このペプチドは、本明細書中に示されるように、所与の細胞培養集団の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％（これらの間のすべての整数を包含する）以内の細胞の膜透過を誘導する能力を有し、全身投与された際に、インビボにおいて複数の組織内での高分子転座を可能にする。一実施形態において、膜透過性ペプチドは、アルギニンリッチペプチドトランスポータである。別の実施形態において、膜透過性ペプチドは、ペネトラチン又はＴａｔペプチドであってもよい。これらのペプチドは、当該技術分野において周知であり、例えば、参照によりその全体を組み込む米国特許出願公開第２０１０−００１６２１５Ａ１号に開示されている。ペプチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートするための特に好ましいアプローチは、参照によりその全体が組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／１５０９６０号に見出すことができる。オリゴにコンジュゲートされたペプチドの好ましい実施形態は、グリシンをＣＰＰとアンチセンスオリゴヌクレオチドとの間のリンカーとして使用する。例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、（Ａｒｇ）_６Ｇｌｙ（６つのアルギニンと１つのグリシンがオリゴヌクレオチドに結合）のようにアルギニンリッチペプチドと連結することができ；例えば、好ましいペプチドコンジュゲートＰＭＯはＲ６−Ｇ−ＰＭＯからなる。

「単離された」とは、自然の状態で通常それを伴う成分を実質的又は本質的に含まない材料のことを意味する。例えば、本明細書で使用するとき、「単離されたポリヌクレオチド」又は「単離されたオリゴヌクレオチド」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されたか又は取り出されたポリヌクレオチド、例えば、ゲノム内でそのフラグメントに隣接する配列から取り出されたＤＮＡフラグメントのことを指し得る。「単離する」という用語は、細胞に関する場合、供給被験体（例えば、ポリヌクレオチド反復疾患を有する被験体）から細胞（例えば、線維芽細胞、リンパ芽球）を精製することを指す。ｍＲＮＡ又はタンパク質に関する場合、「単離する」は、供給源、例えば細胞から、ｍＲＮＡ又はタンパク質を回収することを指す。

本明細書で使用するとき、「十分な長さ」は、ＲＮＡ中の少なくとも８、より一般的には８〜４０の隣接核酸塩基に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。十分な長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも、ＲＮＡに特異的にハイブリダイズできる最小限の数のヌクレオチドを有する。好ましくは、十分な長さのオリゴヌクレオチドは、１０〜４０ヌクレオチドの長さであり、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９及び４０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを包含する。一実施形態において、十分な長さのオリゴヌクレオチドは、１０〜約３０ヌクレオチドの長さである。別の実施形態において、十分な長さのオリゴヌクレオチドは、１５〜約２５ヌクレオチドの長さである。更に別の実施形態において、十分な長さのオリゴヌクレオチドは、２０〜約３０ヌクレオチドの長さである。

本明細書で使用するとき、「細胞に接触する」、「導入する」又は「送達する」という用語は、本発明のオリゴヌクレオチドを当該技術分野において常用の方法、例えば、トランスフェクション（例えば、リポソーム、リン酸カルシウム、ポリエチレンイミン）、電気穿孔法（例えば、ヌクレオフェクション）、顕微注入法によって細胞内に送達することを指す。

本明細書で使用するとき、「定量化する」、「定量化」又はその他の関連する語は、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の単位体積中の量、質量、又は濃度を決定することを指す。

本明細書で使用するとき、被験体（例えば、ヒトのような哺乳類）又は細胞の「処置」は、その個人又は細胞の自然経過を変える試みに使用される任意の種類の介入である。処置は、限定するものではないが、医薬組成物の投与を包含し、予防的に又は病的事象の開始若しくは病原体との接触の後のいずれかに実施されてもよい。

オリゴヌクレオチドの構造的特徴
上記のように、実質的に無電荷のオリゴヌクレオチドは、本発明の一態様に従って、荷電した結合を、例えば、２〜５個の無電荷結合につき約１個まで、例えば１０個の無電荷結合につき約４〜５個を、包含するように修飾されてもよい。特定の実施形態において、アンチセンス活性の最適な改良は、骨格結合の約２５％がカチオン性である場合に見られることがある。特定の実施形態において、増強は、少数、例えば、１０〜２０％のカチオン性結合、又はカチオン性結合の数が５０〜８０％の範囲、例えば約６０％の場合に見られる場合がある。

特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、上記で引用した参考文献、及び混合物若しくは無電荷及びカチオン性の骨格結合を有するオリゴヌクレオチドの合成に関しては下記に詳述されている方法を用いて、段階的固相合成によって調製できる。場合によっては、アンチセンス化合物に追加の化学的部分を、例えば薬物動態を増強するため又は化合物の捕獲若しくは検出を容易にするために、付加することが望ましい場合がある。そのような部分は、標準的な合成方法に従って共有結合で結合することができる。例えば、ポリエチレングリコール部分又はその他の親水性ポリマー、例えば、１〜１００のモノマーサブユニットを有するものの付加は、溶解度の増強に有用となる場合がある。

フルオレセイン又は放射線標識基のようなレポーター部分を、検出の目的で結合させてもよい。あるいは、オリゴマーに結合するレポーター標識は、標識した抗体又はストレプトアビジンに結合することができる、抗原又はビオチンのようなリガンドであってもよい。アンチセンス化合物の結合又は修飾のための部分の選択において、当然、生体適合性であり、望ましくない副作用を生じることなく被験体が耐容できる可能性の高い群の化合物を選択することが一般的に望ましい。

上記のように、特定のアンチセンス化合物を、上記の種類の無電荷結合が点在した状態で選択した数のカチオン性結合を含有するように構築することができる。サブユニット間結合は、無電荷及びカチオン性のいずれも、好ましくは下記の構造：

を有するリン含有結合である。式中、
ＷはＳ又はＯであり、好ましくはＯであり、
Ｘ＝Ｒ_１、ＮＲ^１１Ｒ^１２又はＯＲ^１６であり、
Ｙ＝Ｏ又はＮＲ^１７であり、
オリゴマー中の結合はそれぞれ以下から選択される：
（ａ）無電荷結合（ａ）、ここでＲ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１６及びＲ^１７のそれぞれは水素及びＣ_１〜Ｃ_６アルキルから独立して選択される；又は
（ｂ１）カチオン性結合（ｂ１）、ここでＲ_１は次式

の部分であり、ｑは０、１、２、３又は４であり；
Ｒ_２は、水素、Ｃ_１〜Ｃ_５アルキル、及びホルムアミジニル部分からなる群から選択され、かつ
Ｒ_３は、水素及びＣ_１〜Ｃ_５アルキルからなる群から選択されるか、又は、
Ｒ_２及びＲ_３は、結合して、任意追加的に酸素ヘテロ原子を含有する５〜７員の複素環を形成し、この環は任意追加的にＣ_１〜Ｃ_５アルキル、フェニル、ハロゲン、及びアラルキルからなる群から選択される置換基で置換されていてもよく；
Ｒ_４は、不在、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル及びアラルキルからなる群から選択される；
（ｂ２）カチオン性結合（ｂ２）、ここでＸ＝ＮＲ^１１Ｒ^１２及びＹ＝Ｏであり、ＮＲ^１１Ｒ^１２は次式

の任意追加的に置換されたピペラジノ基を表し、式中、
各Ｒは独立してＨ又はＣＨ_３であり、
Ｒ^１４はＨ、ＣＨ_３、又は不在であり、
Ｒ^１３はＨ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、５〜７員の置換又は非置換アリール、Ｎ及びＯからなる群から選択される２個までのヘテロ原子を含有するヘテロアリール又は複素環、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、Ｚ−Ｌ−ＮＲＲ、Ｚ−Ｌ−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、Ｚ−Ｌ−ＣＯＯＨ、Ｚ−Ｌ−ＳＨ、Ｚ−Ｌ−ＰＰｈ_３、Ｚ−Ｌ−Ｒ^２１−Ｒ^２２、コラート、及び［Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ’ＮＨ］_ｍＨから選択され、ここで：ＺはＣ（Ｏ）又は直接結合であり、Ｌは１８原子までの長さ、好ましくは１２原子まで、より好ましくは８原子までの長さで、アルキル、アルコキシ、及びアルキルアミノから選択される結合を有する任意追加的なリンカーであり、Ｒ’は天然アミノ酸又はその１炭素又は２炭素相同体の側鎖であり、ｍは１〜６、好ましくは１〜４であり；Ｒ^２１は５〜７員のアリール環であり、Ｒ^２２はＮ及びＯからなる群から選択される４個までのヘテロ原子を含有する５〜７員のヘテロアリール環である；
（ｂ３）カチオン性結合（ｂ３）、ここでＸ＝ＮＲ^１１Ｒ^１２及びＹ＝Ｏ、Ｒ^１１＝Ｈ又はＣＨ_３、及びＲ^１２＝ＬＮＲ^１３Ｒ^１４Ｒ^１５であり、ここでＬ、Ｒ^１３、及びＲ^１４は上記で定義された通りであり、Ｒ^１５はＨ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、又はＣ_１〜Ｃ_６（アルコキシ）アルキルである；並びに
（ｂ４）カチオン性結合（ｂ４）、ここでＹ＝ＮＲ^１７及びＸ＝ＯＲ^１６であり、Ｒ^１７＝ＬＮＲ^１３Ｒ^１４Ｒ^１５であり、ここでＬ、Ｒ^１３、Ｒ^１４及びＲ^１５は上記で定義された通りであり、Ｒ^１６はＨ又はＣ_１〜Ｃ_６アルキルである；
そして、少なくとも１つの結合が、カチオン性結合（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）及び（ｂ４）から選択される。

特定の実施形態において、オリゴマーは少なくとも２つの連続する（ａ）型結合（すなわち、無電荷結合）を包含してもよい。更なる実施形態において、オリゴマー中の結合の少なくとも５％はカチオン性結合（すなわち、（ｂ１）型、（ｂ２）型、（ｂ３）型又は（ｂ４）型）である；例えば、１０％〜６０％、好ましくは２０％〜５０％の結合がカチオン性結合であってもよい。

一実施形態において、少なくとも１つの結合が（ｂ１）型であり、ここでｑは１であり、Ｒ_２及びＲ_３は水素であり、Ｒ_４は不在である。

一実施形態において、少なくとも１つの結合が（ｂ２）型の結合であり、ここで、好ましくは、各ＲはＨであり、Ｒ^１４はＨ、ＣＨ_３、又は不在であり、Ｒ^１３はＨ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、及びＣ（Ｏ）−Ｌ−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２から選択される。Ｒ^１３の後者２つの実施形態は、それぞれ、ピペラジン環に直接結合するか、又はリンカー基Ｌにペンダントするかのいずれかのグアニジニル部分を提供する。合成を容易にするために、Ｒ^１３内の変数Ｚは、好ましくは、示されているように、Ｃ（Ｏ）（カルボニル）である。

リンカー基Ｌは、上述のように、その骨格に、アルキル（例えば、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）、アルコキシ（−Ｃ−Ｏ−）、及びアルキルアミノ（例えば、−ＣＨ_２−ＮＨ−）から選択される結合を含むが、ただし、Ｌ中の末端原子（例えば、カルボニル又は窒素に隣接する原子）は炭素原子である。分枝した結合（例えば、−ＣＨ_２−ＣＨＣＨ_３−）も可能であるが、リンカーは好ましくは未分枝状である。一実施形態において、リンカーは、炭化水素リンカーである。このようなリンカーは、構造−（ＣＨ_２）_ｎ−を有してもよく、ここでｎは１〜１２、好ましくは２〜８、より好ましくは２〜６である。

モルホリノサブユニット（ヌクレオチド）は次の構造：

を有し、式中、Ｐｉは塩基対合部分であり、上記結合は（ｉ）の窒素原子を隣接するサブユニットの５’炭素に連結する。塩基対合部分Ｐｉは、同じであっても異なっていても良く、一般的には、標的核酸に結合する配列を提供するように設計される。

モルホリノサブユニットを連結するための上記の結合型（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）及び（ｂ４）の実施形態の使用は、図式的に次のように例示される：

必ずしも必要ではないが好ましくは、オリゴマー中の全てのカチオン性結合は、同じ型のものである；すなわち、全て（ｂ１）型、全て（ｂ２）型、全て（ｂ３）型又は全て（ｂ４）型である。

更なる実施形態において、カチオン性結合は、以下に示すように結合（ｂ２’）及び（ｂ２’’）から選択され、ここで（ｂ２’）は、本明細書において「Ｐｉｐ」結合と称され、（ｂ２’’）は本明細書において「ＧｕＸ」結合と称される：

上記の構造において、ＷはＳ又はＯであり、好ましくはＯであり；Ｒ^１１及びＲ^１２のそれぞれは水素及びＣ_１〜Ｃ_６アルキルから独立して選択され、好ましくはメチル又はエチルであり；Ａは（ｂ２’）及び（ｂ２’’）中の１つ以上の炭素原子上の水素又はＣ_１〜Ｃ_６アルキルを表す。好ましくは、ピペラジン環中の環炭素は非置換であり；ただし、メチルのような非干渉性の置換基を含んでもよい。好ましくは、多くても１個又は２個の炭素原子がこのように置換される。更なる実施形態において、結合の少なくとも１０％が（ｂ２’）型又は（ｂ２’’）型の結合である；例えば、結合の１０％〜６０％、好ましくは２０％〜５０％が（ｂ２’）型又は（ｂ２’’）型であってもよい。

特定の実施形態において、オリゴマーは上記の（ｂ２’）型の結合を含有しない。あるいは、オリゴマーは各ＲがＨであり、Ｒ^１３がＨ又はＣＨ_３であり、Ｒ^１４がＨ、ＣＨ_３、又は不在である（ｂ２）型の結合を含有しない。

モルホリノサブユニットはまた、以下に更に記載されるような、非リン系サブユニット間結合によって結合されてもよく、この場合、少なくとも１つの結合が、上記のように、カチオン性のペンダント基で修飾される。

非修飾状態では無電荷であるがペンダントのアミン置換基もまた有することができるその他のオリゴヌクレオチド類似体結合を使用することができる。例えば、モルホリノ環上の５’窒素原子は、スルファミド結合又は尿素結合（この場合、リンがそれぞれ、炭素又は硫黄で置換される）に用いることができ、上記構造（ｂ４）の５’窒素原子に類似した様式で修飾されることができる。

任意の数のカチオン性結合を有するオリゴマーが提供され、これには、完全にカチオン性結合されたオリゴマーが包含される。ただし、好ましくは、オリゴマーは部分的に、例えば１０％〜８０％が荷電している。好ましい実施形態において、結合の約１０％〜６０％、好ましくは２０％〜５０％がカチオン性である。

実施形態では、カチオン性結合は、骨格に沿って点在する。部分的に荷電したオリゴマーは、好ましくは、少なくとも２つの連続した無電荷結合を含有する；すなわち、オリゴマーは、好ましくは、その全長に沿って厳密に交互になるパターンは有さない。

カチオン性結合のブロックと無電荷結合のブロックとを有するオリゴマーも考えられる；例えば、無電荷結合の中央ブロックがカチオン性結合のブロックで挟まれてもよく、又はその逆であってもよい。一実施形態において、オリゴマーは、およそ等しい長さの５’、３’及び中央領域を有し、中央領域におけるカチオン性結合の割合は約５０％を超え、好ましくは約７０％を超える。

アンチセンス用途で使用するためのオリゴマーは、一般に、長さが約１０〜約４０サブユニット、より好ましくは約１０〜３０サブユニット、及び典型的には１５〜２５塩基の範囲である。例えば、アンチセンス化合物にとって有用な長さである１９〜２０サブユニットを有する本発明のオリゴマーは、理想的には、２〜１０個、例えば、４〜８個のカチオン性結合を有し、残りが無電荷結合であってもよい。１４〜１５サブユニットを有するオリゴマーは、理想的には２〜７個、例えば、３、４、又は５個のカチオン性結合を有し、残りが無電荷結合であってもよい。

各モルホリノ環構造は塩基対合部分を担持し、細胞内又は処置中の被験体内で選択されたアンチセンス標的とハイブリダイズするように一般的に設計された塩基対合部分の配列を形成する。塩基対合部分は、未変性ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵ）に見られるプリン若しくはピリミジン又は類似体、例えばヒポキサンチン（ヌクレオシドイノシンの塩基成分）又は５−メチルシトシンであってもよい。

上記のように、特定の実施形態は、新規サブユニット間結合を含むオリゴマーに関し、これはＰＭＯ−Ｘオリゴマー及び修飾末端基を有するオリゴマーを包含する。いくつかの実施形態において、これらのオリゴマーはＤＮＡ及びＲＮＡに対する親和性が対応する未修飾オリゴマーよりも高く、他のサブユニット間結合を有するオリゴマーと比較して、改良された細胞送達、効力、及び／又は組織分布特性を示す。一実施形態において、オリゴマーは、本明細書に定義される（Ｂ）型のサブユニット間結合を少なくとも１つ含む。オリゴマーは、本明細書に定義される（Ａ）型のサブユニット間結合も１つ以上含んでもよい。種々の結合型及びオリゴマーの構造的特徴及び特性を、以下の考察で更に詳細に記載する。これらのオリゴマー及び関連オリゴマーの合成は、共同出願の米国特許出願公開第１３／１１８，２９８号に記載されており、その全体を参照により組み込む。

好ましい実施形態において、本発明は、ヒト疾患に関連する標的配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを提供し、このオリゴヌクレオチドは次式：

を有するヌクレオチドの配列を含み、式中、Ｎｕは核酸塩基であり；
Ｒ_１は、Ｒ_１’及びＲ_１’’からなる群から選択され、式中Ｒ_１’はジメチルアミノであり、Ｒ_１’’は次式

の部分であり、式中、少なくとも１つのＲ_１がＲ_１’’であり；
ｑは０、１、２、３又は４であり；
Ｒ_２は、水素、Ｃ_１〜Ｃ_５アルキル、ホルムアミジニル部分からなる群から選択され、かつ
Ｒ_３は、水素及びＣ_１〜Ｃ_５アルキルからなる群から選択されるか、又は
Ｒ_２及びＲ_３は、結合して、任意追加的に酸素ヘテロ原子を含有する５〜７員の複素環を形成し、この環は任意追加的にＣ_１〜Ｃ_５アルキル、フェニル、ハロゲン、及びアラルキルからなる群から選択される置換基で置換されていてもよく；
Ｒ_４は、不在、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル及びアラルキルからなる群から選択され；
Ｒｘは、ＨＯ−、ヌクレオチド、膜透過性ペプチド部分、及びピペラジニルからなる群から選択され；
Ｒｙは、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、ヌクレオチド、ペプチド部分、アミノ酸、ホルムアミジニル部分、及びアシルからなる群から選択され；
Ｒｚは、不在、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、及びアシル；並びにこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される。

Ｎｕは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、及びヒポキサンチンからなる群から選択されてもよい。より好ましくは、Ｎｕはチミン又はウラシルである。

Ｒ_１基の約５０〜９０％は、ジメチルアミノ（すなわち、Ｒ_１’）である。最も好ましくは、Ｒ_１基の約６６％（３分の２）はジメチルアミノである。

Ｒ_１は以下

からなる群から選択されてもよい。

好ましくは、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは次式：

を有し、式中、Ｒｘ、Ｒｙ、Ｒｚ、及びＮｕは上述の通りである。最も好ましくは、Ｎｕはチミン又はウラシルである。

チミン（Ｔ）は、上記の化学修飾を含有する好ましい塩基対合部分（Ｎｕ又はＰｉ）であるが、当業者に既知のいかなる塩基サブユニットも塩基対合部分として使用することができる。

アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明は、表１に記載の群から選択される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１４−ｍｅｒ−ＡＰＮ、Ｅ−８／４ａ−ＡＰＮ及びＥ８／４ｂ−ＡＰＮからなる群から選択される配列を含む。本発明に従って使用できる追加的なアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、以下の特許及び特許出願公開に記載されているものが挙げられ、その内容を参照により本明細書に組み込む：ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００７／００２３９０号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１０／１２０８２０号、ＷＯ２０１０／１４８２４９号、米国特許第７，８３８，６５７号、米国特許出願公開第２０１１／０２６９８２０号。

本発明は更に、ＡＰＮ修飾又はＡＰＮ誘導体を有する表１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。本明細書に記載の方法に有用な特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、１４−ｍｅｒ−ＡＰＮ、Ｅ−８／４ａ−ＡＰＮ及びＥ８／４ｂ−ＡＰＮが挙げられる。

本明細書で使用するとき、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的ＲＮＡ（例えば、プレｍＲＮＡ）の一領域を有効にブロックするための、標的ＲＮＡ（すなわち、スプライス部位選択が調節されたＲＮＡ）に相補的な十分な配列を有する核酸（好ましい実施形態において、ＲＮＡ）（又はその類似体）を指す。本発明の代表的実施形態において、このようなＳＭＮ２プレｍＲＮＡのブロックは、そうしなければスプライシングを調節すると予想される未変性タンパク質の結合部位をマスキングすることによって、及び／又は標的ＲＮＡの構造を変えることによって、スプライシングを調節する作用がある。本発明の好ましい実施形態において、標的ＲＮＡは標的プレｍＲＮＡ（例えば、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡ）である。標的ＲＮＡのスプライシングを調節するための標的ＲＮＡ配列に対する十分な配列相補性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドとは、アンチセンス剤が、そうしなければスプライシングを調節する及び／又は標的ＲＮＡの３次元構造を変えると予想される未変性タンパク質の結合部位のマスキングを引き起こすのに十分な配列を有することを意味する。同様に、標的ＲＮＡのスプライシングを調節するための標的ＲＮＡ配列に対する十分な配列相補性を有するオリゴヌクレオチド試薬とは、オリゴヌクレオチド試薬が、そうしなければスプライシングを調節する及び／又は標的ＲＮＡの３次元構造を変えると予想される未変性タンパク質の結合部位のマスキングを引き起こすのに十分な配列を有することを意味する。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは無電荷である。更なる実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは荷電している。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、「モルホリノオリゴマー」、「ＰＭＯ」、「ＰＭＯＸ」、「ＰＰＭＯ」、又は「ＰＭＯ＋」であってもよい。更に、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばＰＭＯは、当該技術分野において既知のいかなる方法で修飾されてもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチド内の１つ以上のヌクレオチド間結合が修飾されてもよい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオチド間結合が、カチオン性修飾を有してもよい。カチオン性修飾は、ＡＰＮ修飾であってもよい。好ましくは、修飾されたヌクレオチド間結合は、Ｔ、Ｃ又はＡサブユニットから誘導される。例えば、一実施形態において、ＰＭＯはカチオン性修飾を含んでもよい。ＰＭＯはＡＰＮ修飾ＰＭＯであってもよく、これは「ＰＭＯａｐｎ」又は「ＡＰＮ」と称される場合がある。

本明細書で使用するとき、「ＳＭＡ」という用語は、しばしば罹患者のＳＭＮタンパク質の過少発現を特徴とするヒト常染色体劣性疾患である脊髄性筋萎縮症を指す。

本明細書で使用するとき、「標的」という用語は、ＲＮＡ領域を指し、具体的には、ＳＭＮ２遺伝子によって識別される領域を指す。特定の実施形態において、標的領域は、エクソン７欠失の原因となりＳＭＮと関連するＳＭＮ２イントロン７領域のｍＲＮＡの領域である。別の実施形態において、標的領域は、ＳＭＮ２エクソン８のｍＲＮＡの領域である。

「標的配列」という用語は、オリゴヌクレオチド類似体が配向される標的ＲＮＡの部分、すなわち、オリゴヌクレオチド類似体が相補的配列のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合によってハイブリダイズする配列を指す。

「標的化配列」という用語は、ＲＮＡゲノム中の標的配列に対して相補的な（加えて、実質的に相補的であることを意味する）オリゴヌクレオチド類似体内の配列である。アンチセンスオリゴヌクレオチドの全配列又は一部のみが、標的配列に対して相補的であってもよい。例えば、２０塩基を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、１２〜１４のみが標的化配列であってもよい。典型的には、標的化配列は、オリゴヌクレオチド内の連続塩基の形態をとるが、別の方法として、共に配置した場合に（例えば、オリゴヌクレオチドの反対側の末端から）標的配列にわたる配列を構成する、不連続配列の形態をとってもよい。

一般的に、標的ＲＮＡの部分に完全に相補的であるヌクレオチド配列を含有するオリゴヌクレオチド試薬が、標的ＲＮＡのブロッキングに好ましい。ただし、オリゴヌクレオチド試薬と標的ＲＮＡとの間の１００％配列相補性は、本発明を実施する上で必要ではない。したがって、本発明は、遺伝的突然変異、系統多型、又は進化的分岐から予想される配列変動を許容し得る。例えば、標的配列に対して挿入、欠失、及び一点変異を有するオリゴヌクレオチド試薬配列もまた阻害に有効となる場合がある。あるいは、ヌクレオチド類似体置換又は挿入を有するオリゴヌクレオチド試薬配列は、ブロッキングに有効となり得る。

７０％を超える配列同一性（又は相補性）、例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は更には１００％の配列同一性が、オリゴヌクレオチド試薬と標的ＲＮＡ、例えば、標的プレｍＲＮＡとの間にあることが好ましい。

加えて、同じ機能を保持する表１のオリゴヌクレオチド配列の変異体を、本発明の方法に使用できる。例えば、一連の突然変異体を、その選択的スプライシング阻害能力について試験してもよい。一実施形態において、そのような変異体配列は、その配列の全長にわたって表１に記載の配列と少なくとも約９５％同一の配列である。別の実施形態において、そのような変異体配列は、その配列の全長にわたって少なくとも約９０％同一の配列である。

調査したＲＮＡ及びタンパク質のスプライシング型及び発現レベルは、転写された核酸又はタンパク質のスプライシング型及び／又は発現を検出するための多種多様な周知の方法のいずれかで評価されてもよい。このような方法の非限定例としては、ＲＮＡのスプライシング型のＲＴ−ＰＣＲ後のＰＣＲ産物のサイズ分離、核酸ハイブリダイゼーション法、例えば、ノーザンブロット及び／又は核酸アレイの使用；核酸増幅法；タンパク質検出のための免疫学的方法；タンパク質精製法；及びタンパク質機能又は活性アッセイが挙げられる。

ＲＮＡ発現レベルは、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ（すなわち、転写されたポリヌクレオチド）を細胞、組織又は生体から調製することによって、及びｍＲＮＡ／ｃＤＮＡをアッセイされた核酸の相補体である参照ポリヌクレオチド又はそのフラグメントとハイブリダイズすることによって、評価することができる。ｃＤＮＡは、任意追加的に、相補的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの前に種々のポリメラーゼ鎖反応又はインビトロ転写方法のいずれかを用いて増幅することができ；好ましくは、増幅されない。１つ以上の転写体の発現を定量的ＰＣＲを用いて検出して、転写体の発現のレベルを評価することもできる。

本発明の方法
一態様において、本発明は、細胞内のエクソン７含有ＳＭＮ２ｍＲＮＡのエクソン７欠失ＳＭＮ２ｍＲＮＡに対するレベルを増強する方法であって、ＳＭＮ２遺伝子内の一領域に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さ及び相補性のアンチセンスオリゴヌクレオチドに細胞を接触させて、細胞内のエクソン７含有ＳＭＮ２ｍＲＮＡのエクソン７欠失ＳＭＮ２ｍＲＮＡに対するレベルを増強する工程を含み、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理学的ｐＨにおいて正に荷電したヌクレオシド間結合を少なくとも１つ有する、方法を提供する。

任意追加的に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、塩基性窒素とアルキル、アリール、又はアラルキル基の両方とのヌクレオシド間結合を有してもよい。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドはモルホリノを含む。

更に、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが生理学的ｐＨにおいて正に荷電したヌクレオシド間結合を少なくとも１つ有することを定める。本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、５．５〜１２のｐＫａを示すヌクレオシド間結合を少なくとも１つを有することも定める。

理論に束縛されるものではないが、正に荷電したＡＰＮ基又はＡＰＮ誘導体は、ＰＭＯＸオリゴマーにおいて、標的ヌクレオチド内の負に荷電したリン酸塩への結合を促進すると考えられる。したがって、突然変異体ＲＮＡとＰＭＯＸオリゴマーとの間のヘテロ二本鎖の形成は、イオン引力によって、並びにＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合によって一緒に保持されてもよい。

標的核酸へのアンチセンスオリゴマーの有効な送達は、処置の重要な観点である。アンチセンスオリゴマー送達の経路としては、限定するものではないが、種々の全身経路、例えば、経口経路及び非経口経路（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、及び筋肉内）、並びに吸入、経皮送達及び局所送達が挙げられる。適切な経路は、処置されている被験体の状態に適切であるように、当業者によって決定されてもよい。血管又は血管外循環、血液又はリンパ系、及び脳脊髄液は、ＲＮＡを導入してもよい非限定的部位の一部である。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で認められた任意の方法によって被験体の神経系に送達することができる。例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの末梢血注入を用いて、拡散的及び／又は能動的手段により試薬を末梢神経に送達することができる。一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは被験体の脳に送達されてもよい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、脳室内（ＩＣＶ）注入によって送達されてもよい。あるいは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、血液脳関門（ＢＢＢ）の通過を促進するように修飾し、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞への試薬の送達を達成することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチド技術及び送達戦略における特異な最近の進歩は、神経疾患のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド使用の範囲を広げた（Ｆｏｒｔｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．２００５．Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ６：２１−２９；Ｊａｅｇｅｒ，Ｌ．Ｂ．，ａｎｄ Ｗ．Ａ．Ｂａｎｋｓ．２００５．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０６：２３７−２５１；Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ，Ｓ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．２００４．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５：５０−６０；これらの全体を参照により本明細書に組み込む）。例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ペプチド核酸（ＰＮＡ）化合物として生成することができる。ＰＮＡ試薬はそれぞれ、ＢＢＢを通過することが確認されている（Ｊａｅｇｅｒ，Ｌ．Ｂ．，ａｎｄ Ｗ．Ａ．Ｂａｎｋｓ．２００５．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０６：２３７−２５１）。被験体を、例えば、血管作用剤で処置することも、ＢＢＢを通過する輸送を促進すると記載されている（同上）。ＢＢＢを通過して能動的に輸送される作用剤に本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドをテザーすることも、送達機構として有用な場合がある。

特定の実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、経皮的方法によって送達することができる（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば、乳濁液に組み込み、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドが任意追加的にリポソーム内にパッケージ化された状態で）。このような経皮的な及び乳濁液／リポソーム媒介性の送達方法は、当該技術分野におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達に関して、例えば、米国特許第６，９６５，０２５号に記載されており、その内容の全体を参照により本明細書に組み込む。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、移植可能なデバイスを介して送達されてもよい。このようなデバイスの設計は、例えば、その内容の全体を参照により本明細書に組み込む米国特許第６，９６９，４００号に記載されている合成インプラント設計を用いた、当該技術分野で認められたプロセスである。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは当該技術分野で認められた技法（例えば、遺伝子移入、電気穿孔法、癒合、リポソーム、コロイドポリマー粒子並びにウイルス性及び非ウイルス性ベクター並びにその他の当該技術分野において既知の手段）を用いて細胞に導入できる。選択される送達方法は、少なくとも処置される細胞及びその細胞の位置に依存すると思われ、熟練者には明らかであろう。例えば、局在化は、リポソームを指向するための特異的マーカーを表面に有するリポソーム、標識細胞を含有する組織への直接注入、特定の受容体媒介性の取り込み、ウイルス性ベクター等によって達成できる。

核酸を導入する物理的方法としては、ＲＮＡを含有する溶液の注入、ＲＮＡで被覆された粒子による衝突、ＲＮＡの溶液への細胞又は生体の浸漬、又はＲＮＡ存在下での細胞膜の電気穿孔が挙げられる。ウイルス粒子内にパッケージ化されたウイルスコンストラクトは、細胞への発現コンストラクトの効率的導入と、その発現コンストラクトによってコードされるＲＮＡの転写との両方を達成するであろう。脂質媒介性キャリア輸送、リン酸カルシウムなどの化学品媒介性輸送等の、核酸を細胞へ導入するための当該分野において既知のその他の方法を用いてもよい。したがって、ＲＮＡを以下の活動の１つ以上を行う成分と共に導入してもよい：細胞によるＲＮＡの取り込みを増強する、一本鎖のアニーリングを阻害する、一本鎖を安定化する、又は標的遺伝子の発現を増大させる。

当該技術分野で既知のように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、リポソーム媒介性の取り込み、脂質コンジュゲート、ポリリシン媒介性の取り込み、ナノ粒子媒介性の取り込み、及び受容体媒介性のエンドサイトーシスを伴う方法、並びに追加的な非エンドサイトーシスの送達様式、例えば顕微注入法、膜透過処理（例えば、ストレプトリジン−Ｏ膜透過処理、アニオン性ペプチド膜透過処理）、電気穿孔法、及び当該技術分野において既知の種々の非侵襲性の非エンドサイトーシス送達方法を用いて送達されてもよい（参照によりその全体を本明細書に組み込むＤｏｋｋａ ａｎｄ Ｒｏｊａｎａｓａｋｕｌ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４４，３５−４９参照）。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理学的及び／又は薬学的に許容可能な任意の都合の良いビヒクル又はキャリア中で投与することができる。このような組成物としては、当業者によって使用される任意の種々の標準的な薬学的に許容可能なキャリアが挙げられる。例としては、限定するものではないが、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、水、エタノール水溶液、乳濁液（例えば、油／水乳濁液又はトリグリセリド乳濁液）、錠剤及びカプセルが挙げられる。適切な生理学的に許容可能なキャリアの選択は、選択した投与様式に依存して変わるであろう。「薬学的に許容可能なキャリア」は、医薬品投与に適合可能な任意及び全ての溶剤、分散媒体、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤等を包含することを意図する。薬学的に活性な物質へのこのような媒体及び作用剤の使用は、当該技術分野において周知である。いかなる従来の媒体又は作用剤もまた、活性化合物に不適合である場合を除き、組成物への使用が想到される。補助的活性化合物も組成物中に組み込むことができる。

本発明の化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、一般に、遊離酸又は遊離塩基として利用されてもよい。あるいは、本発明の化合物を、酸付加塩又は塩基付加塩の形態で使用してもよい。本発明の遊離アミノ化合物の酸付加塩は、当該技術分野で周知の方法によって調製してもよく、有機酸及び無機酸から形成してもよい。好適な有機酸としては、マレイン酸、フマル酸、安息香酸、アスコルビン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、プロピオン酸、酒石酸、サリチル酸、クエン酸、グルコン酸、乳酸、マンデル酸、桂皮酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、グリコール酸、グルタミン酸、及びベンゼンスルホン酸が挙げられる。

好適な無機酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、及び硝酸が挙げられる。塩基付加塩は、カルボキシレートアニオンと共に形成される塩を包含し、アルカリ金属及びアルカリ土類金属（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、バリウム及びカルシウム）、並びにアンモニウムイオン及びその置換誘導体（例えば、ジベンジルアンモニウム、ベンジルアンモニウム、２−ヒドロキシエチルアンモニウム等）から選択されるもののような、有機及び無機カチオンと共に形成される塩を包含する。したがって、「薬学的に許容可能な塩」という用語は、任意及び全ての許容可能な塩形態を含むことが意図される。

更に、プロドラッグもまた本発明の文脈内に含まれる。プロドラッグは、かかるプロドラッグを患者に投与した場合にインビボで化合物を放出する任意の共有結合したキャリアである。プロドラッグは、一般に、日常的な操作又はインビボのいずれかによって修飾が切断されて親化合物が得られるような方法で官能基を修飾することによって調製される。プロドラッグとしては、例えば、患者に投与された場合に切断されてヒドロキシ基、アミン基又はスルフヒドリル基を形成する任意の基にヒドロキシ基、アミン基又はスルフヒドリル基が結合した本発明の化合物が挙げられる。したがって、プロドラッグの代表例としては（限定するものではないが）、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのアルコール及びアミン官能基の酢酸、ギ酸、及び安息香酸誘導体が挙げられる。更に、カルボン酸（―ＣＯＯＨ）の場合、メチルエステル、エチルエステル等のエステルを使用してもよい。

場合によっては、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内への取り込みを促進するためにリポソームを用いてもよい。（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ａ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ １０（１２）：１９８０−１９８９，１９９６；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ２３：１１９，１９９４；Ｕｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ａ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ９０，Ｎｏ．４，２５ ｐａｇｅｓ５４４−５８４，１９９０；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｐ．２８７−３４１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９７９参照）。例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／０１２８６号に記載されるように、ヒドロゲルもまた、アンチセンスオリゴマー投与のためのビヒクルとして使用できる。あるいは、オリゴヌクレオチドは、ミクロスフェア又は微粒子中で投与されてもよい（例えば、Ｗｕ，Ｇ．Ｙ．ａｎｄ Ｗｕ，Ｃ．Ｈ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２，３０ １９８７参照）。別の方法としては、米国特許第６，２４５，７４７号に記載されるように、アンチセンスオリゴマーと複合体を形成するガス充填マイクロバブルの使用により、標的組織への送達を増強できる。持続放出組成物もまた使用できる。これは、フィルム又はマイクロカプセルのような成形物品の形態の半透性ポリマーマトリクスを包含してもよい。

一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチド関連疾患の症状を示す哺乳類の被験体、例えば、ヒト又は家畜に、好適な薬学的キャリア中で投与される。本方法の一態様では、被験体はヒト被験体、例えばＳＭＡを有すると診断された患者である。患者の症状から、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの予防的投与が指示されてもよい。例えば、患者が（１）免疫不全患者；（２）火傷被害者；（３）留置カテーテルを有する；又は（４）手術直前か若しくは手術を最近受けた場合である。１つの好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容可能なキャリアに含有され、経口送達される。別の好ましい実施形態では、オリゴマーは、薬学的に許容可能なキャリアに含有され、静脈内（ｉ．ｖ．）送達される。

一実施形態では、アンチセンス化合物を、少なくとも２００〜４００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドのピーク血中濃度を得るのに有効な量及び様式で投与する。典型的には、１用量以上のアンチセンスオリゴマーを、一般に、一定間隔を置いて約１〜２週間にわたって投与する。経口投与に好ましい用量は、約１〜１０００ｍｇオリゴマー／７０ｋｇである。場合によっては、１０００ｍｇオリゴマー／患者を超える用量が必要である。ｉ．ｖ．投与の場合、好ましい用量は、約０．５ｍｇ〜１０００ｍｇオリゴマー／７０ｋｇである。アンチセンスオリゴマーを、一定間隔をおいて短期間、例えば、２週間以下にわたって毎日；２日毎に１回：３日毎に１回：３〜７日毎に１回；３〜１０日毎に１回；７〜１０日毎に１回；２週間毎に１回；毎月１回、投与してもよい。ただし、場合によっては、オリゴマーを、より長期間にわたって、例えば、数週間、数ケ月又は数年間にわたって断続的に投与する。例えば、アンチセンスオリゴマーを、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２ケ月毎に１回投与してもよい。更に、アンチセンスオリゴマーを、１、２、３、４又は５年毎に１回投与してもよい。投与後又は投与と同時に、抗生物質の投与又は他の治療上の処置を行ってもよい。処置レジメンを、処置下の被験体の免疫アッセイ、他の生化学試験、及び生理学検査の結果に基づく指示に従って調節してもよい（用量、頻度、経路等）。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した有効なインビボでの処置レジメンは、投与の持続時間、用量、頻度及び経路、並びに処置下の被験体の状態に応じて様々であり得る（すなわち、予防的投与に対して局所若しくは全身性感染に対応した投与）。したがって、かかるインビボでの治療は、しばしば、処置下の特定の疾患の種類に適した試験によるモニタリング、及びモニタリングに従って最適な治療結果を達成するための用量又は処置レジメンの調節が必要であろう。

処置を、例えば、当該技術分野において既知の一般的な疾患の指標によってモニタリングしてもよい。インビボで投与した本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与前、投与中及び投与後に被験体から採取した生体試料（組織、血液、尿等）から決定してもよい。かかる試料のアッセイとしては、（１）当業者に既知の手順（例えば、電気泳動ゲル移動アッセイ）を使用した標的配列及び非標的配列とのヘテロ二重鎖形成の有無のモニタリング；（２）ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロッティングのような標準的技法によって測定された参照正常ｍＲＮＡ又はタンパク質と比較した突然変異ｍＲＮＡの量のモニタリングが挙げられる。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、哺乳動物細胞によって能動的に取り込まれる。更なる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、かかる取り込みを容易にするために本明細書中に記載の通り輸送部分（例えば、輸送ペプチド）にコンジュゲートさせることができる。

処置方法
本発明はまた、治療目的で（例えば、ＳＭＡの被験体の処置のため）、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、エクソン７含有ＳＭＮ２ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を増大させる方法にも関する。したがって、一実施形態において、本発明はＳＭＡを患う個人を処置する方法を提供する。

一実施形態では、ＳＭＡを有する被験体からの細胞を本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させて、エクソン７含有ＳＭＮ２ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を増大させる。１４−ｍｅｒ−ＡＰＮ、Ｅ−８／４ａ−ＡＰＮ及びＥ８／４ｂ−ＡＰＮのような代表的なアンチセンス配列及び組成物を表１に開示する。

一実施形態では、脊髄性筋萎縮症を有する被験体からの細胞を本発明のオリゴヌクレオチド試薬と接触させて、ＳＭＮ２エクソン７のスプライシングを阻害する。代表的なオリゴヌクレオチド試薬としては、イントロン７標的配列又はエクソン８標的配列及びその変異体（例えば、本明細書に示すもの）に相補的な配列が挙げられる。別の実施形態において、選択的スプライシングの阻害から利益を得ると考えられる別の疾患を有する被験体からの細胞を、本発明のオリゴヌクレオチド試薬と接触させる。本明細書に開示される標的配列に関係する標的配列が、ヒトイントロン配列に存在する。例えば、ヒトＣＦＴＲのイントロン１０に位置するイントロン７配列に部分的に相同な配列が存在する。

このような作用剤はまた、パラコートへの曝露のような酸化的ストレスに対する高い感受性に関連する疾患及び誘発されたパーキンソン病、並びに筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、低レベルのＳＭＮタンパク質を特徴とするその他の神経疾患の処置にも使用できる（Ｖｅｌｄｉｎｋ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．２００５ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ６５（６）：８２０−５）。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＭＡの処置（予防的又は治療的）のために被験体に投与することができる。このような処置と共に、薬理ゲノミクス（すなわち個人の遺伝子型とその個人の異物又は薬物に対する反応との関係の研究）を考慮してもよい。治療の代謝の違いは、薬学的に活性な薬物の用量と血中濃度との関係を変えることによって、重度の毒性又は治療障害を招き得る。したがって、医師又は臨床医は、治療薬を投与するか否かの決定並びに治療薬の用量及び／又は処置レジメンの調節において、関連する薬理ゲノミクス研究で得られた知識の適用を考慮してもよい。

ＡＰＮ修飾オリゴヌクレオチドと非修飾オリゴヌクレオチドとの比較
ＡＰＮ修飾オリゴヌクレオチドが非修飾オリゴヌクレオチドと比較してＳＭＮ２エクソン７包含を増強するか否かを判断するため、本発明のいくつかの実施形態のオリゴヌクレオチドを試験した。１４−ｍｅｒ−ＡＰＮ（Ｔ ＴＴＣ ＡＴＡ ＡＴＧ ＣＴＧ Ｇ）と称されるＡＰＮ修飾オリゴマーは、太字で示したＴ塩基にＡＰＮ修飾を含有する（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）。Ｎ１（Ａ ＴＴＣ ＡＣＴ ＴＴＣ ＡＴＡ ＡＴＧ ＣＴＧ Ｇ）及び１４ｍｅｒオリゴマー（Ｔ ＴＴＣ ＡＴＡ ＡＴＧ ＣＴＧ Ｇ）はＡＰＮ修飾を含有しない（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及び１９）。同様に、Ｅ８／４ａ−ＡＰＮ（Ｃ ＴＡＧ ＴＡＴ ＴＴＣ ＣＴＧ ＣＡＡ ＡＴＧ ＡＧ）及びＥ８／４ｂ−ＡＰＮ（Ｃ ＣＡＧ ＣＡＴ ＴＴＣ ＣＴＧ ＣＡＡ ＡＴＧ ＡＧ）と称されるオリゴマーは、太字で示したＴ塩基にＡＰＮ修飾を含有する（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３及び５４）；Ｅ８／４ａ（Ｃ ＴＡＧ ＴＡＴ ＴＴＣ ＣＴＧ ＣＡＡ ＡＴＧ ＡＧ）及びＥ８／４ｂ（Ｃ ＣＡＧ ＣＡＴ ＴＴＣ ＣＴＧ ＣＡＡ ＡＴＧ ＡＧ）と称される対応するオリゴマーは、ＡＰＮ修飾を含有しない（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２及び５３）。図５及び表１参照。

オリゴヌクレオチドに対するＡＰＮ修飾の追加は、化合物の効力を、同じ配列を含有する非修飾ＰＭＯと比較して増強することが明らかになった（図６参照）。具体的には、１４ｍｅｒ（１１／１５）ＡＰＮは、ＡＰＮ結合のない１４ｍｅｒ（１１／１５）よりも効力が約１桁高かった。同様に、Ｅ８／４ａ−ＡＰＮ（１１／１５）及びＥ８／４ｂ−ＡＰＮ（１１／１５）は、それぞれＥ８／４ａ（１１／１５）及びＥ８／４ｂ（１１／１５）よりも効力が高かった（実施例２４及び実施例２５並びに図６及び図７参照）。

塩基性窒素ヌクレオシド間リンカーを有するＰＭＯ−Ｘの調製
モルホリノサブユニット、修飾されたサブユニット間結合及びこれを含むオリゴマーを、実施例並びに米国特許第５，１８５，４４４号及び同第７，９４３，７６２号（参照によりその全体を本明細書中に組み込む）に記載のように調製することができる。モルホリノサブユニットを、以下の一般的な反応スキームＩに従って調製することができる。

反応スキーム１．モルホリノサブユニットの調製

反応スキーム１を参照すると、Ｂは塩基対合部分を示し、ＰＧは保護基を示し、モルホリノサブユニットは、図示のように、対応するリボヌクレオシド（１）から調製することができる。モルホリノサブユニット（２）を、任意追加的に、適切な保護基前駆体（例えば、トリチルクロリド）との反応によって保護することができる。以下により詳細に記載するように、３’保護基は、一般的に、固相オリゴマー合成中に除去される。塩基対合部分を、固相オリゴマー合成のために適切に保護してもよい。好適な保護基としては、アデニン及びシトシンについてはベンゾイル、グアニンについてはフェニルアセチル、ヒポキサンチン（Ｉ）についてはピバロイルオキシメチルが挙げられる。ピバロイルオキシメチル基を、ヒポキサンチン複素環塩基のＮ１位上に導入することができる。非保護ヒポキサンチンサブユニットを用いてもよいが、活性化反応の収率は、塩基が保護されている場合の方がはるかに優れている。他の好適な保護基としては、同時係属米国特許出願第１２／２７１，０４０号（参照によりその全体を本明細書に組み込む）に開示されている保護基が挙げられる。

３の活性化リン化合物４との反応により、所望の結合部分５を有するモルホリノサブユニットが得られる。構造４の化合物を、当業者に既知の任意数の方法を使用して調製することができる。例えば、かかる化合物を、対応するアミン及びオキシ塩化リンの反応によって調製してもよい。これに関して、アミン出発物質を、当該分野で既知の任意の方法、例えば、実施例及び米国特許第７，９４３，７６２号に記載の方法を使用して調製することができる。

構造５の化合物を、サブユニット間結合を含むオリゴマーの調製のための固相自動化オリゴマー合成に使用することができる。かかる方法は、当該分野で周知である。簡潔に述べれば、構造５の化合物を、固体担体に対するリンカーを含有するように５’末端において修飾してもよい。例えば、化合物５を、Ｌ^１１及びＬ^１５を含むリンカーによって固体担体に結合してもよい。例示的な方法を、図１及び図２に示す。担持された後、保護基（例えば、トリチル）を除去し、遊離アミンを構造５の第２の化合物の活性化リン部分と反応させる。所望の長さのオリゴが得られるまで、この手順を繰り返す。５’末端中の保護基は除去してもよく、５’修飾が望ましい場合は残してもよい。オリゴは、任意数の方法を用いて固体担体から除去することができ、例えば図３及び４に示すように、ＤＴＴで処理した後水酸化アンモニウムで処理することによって除去することができる。

修飾されたモルホリノサブユニット及びモルホリノオリゴマーの調製は、実施例に更に詳細に記載されている。任意数の修飾結合を含有するモルホリノオリゴマーを、本明細書中に記載の方法、当該分野で既知の方法及び／又は本明細書中の参考文献に記載の方法を使用して調製することができる。以前に記載されているように（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２００８０３６１２７号参照）調製したモルホリノオリゴマーの包括的修飾もまた実施例に記載されている。

用語「保護基」は、化合物の一部又は全ての反応性部分をブロックし、保護基が除去されるまで、そのような部分が化学反応に参加するのを防ぐ化学的部分を指し、例えば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９９）に列挙及び記載されている部分である。異なる保護基を用いる場合、それぞれの（異なる）保護基を異なる手段によって除去できることが有利となり得る。完全に異なる反応条件下にて開裂される保護基は、そのような保護基の特異的な除去を可能とする。例えば、保護基を酸、塩基、及び水素化分解によって除去することができる。トリチル、ジメトキシトリチル、アセタール及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルのような基は、酸不安定性であり、水素化分解によって除去可能なＣｂｚ基、及び塩基不安定性のＦｍｏｃ基で保護されたアミノ基の存在下でカルボキシ及びヒドロキシ反応性部分を保護するために使用できる。カルボン酸部分は、メチル、又はエチル等であるがこれらに限定されない塩基不安定性基でブロックすることができ、ヒドロキシ反応性部分は、ｔｅｒｔ−ブチルカルバメートのような酸不安定性基又は酸及び塩基のいずれにも安定であるが加水分解除去できるカルバメートでブロックされたアミンの存在下で、アセチルのような塩基不安定性基でブロックできる。

カルボン酸及びヒドロキシル反応性部分はまたベンジル基のような加水分解除去可能な保護基でもブロックでき、一方でアミン基はＦｍｏｃのような塩基不安定性基でブロックすることができる。式（Ｉ）の化合物の合成に特に有用なアミン保護基は、トリフルオロアセトアミドである。カルボン酸反応性部分は、２，４−ジメトキシベンジルなどの酸化的に除去可能な保護基でブロックすることができ、一方で共存するアミノ基はフッ化物不安定性のシリルカーバメートでブロックすることができる。

アリルブロック基は、酸保護基が安定で、後に金属又はπ酸触媒によって除去することができるため、酸保護基及び塩基保護基の存在下で有用である。例えば、アリルブロックされたカルボン酸は、酸不安定性ｔ−ブチルカーバメート又は塩基不安定性酢酸アミン保護基の存在下でパラジウム（０）触媒反応で脱保護することができる。保護基の更に別の形態は、化合物又は中間体が結合できる樹脂である。残基が樹脂に結合する限り、その官能基はブロックされ、反応することができない。樹脂から放出されるとすぐに、官能基は反応に利用可能となる。

典型的なブロック／保護基は当該技術分野において既知であり、限定するものではないが、下記の部分を包含する：

他に記載のない限り、全ての化学物質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｆｌｕｋａから入手した。ベンゾイルアデノシン、ベンゾイルシチジン、及びフェニルアセチルグアノシンは、Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ，ＵＫから入手した。

本明細書に記載の更なる結合修飾を含有するＰＭＯ、ＰＭＯ＋、ＰＰＭＯ、及びＰＭＯ−Ｘの合成は、当該技術分野において既知の方法並びに係属中の米国特許出願公開第１２／２７１，０３６号及び同第１２／２７１，０４０号並びにＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００９／０６４４７１号（これらの全体を参照により本明細書に組み込む）に記載の方法を用いて実施した。

３’トリチル修飾を有するＰＭＯは、脱トリチル化工程が削除されていることを除き、本質的にＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００９／０６４４７１号の記載の通りに合成した。

活性化サブユニットの調製手順Ａ：

撹拌した６（１当量）のジクロロメタン溶液に、０℃にてＰＯＣｌ_３（１．１当量）、続いてジイソプロピルエチルアミン（３当量）を添加し、氷浴により冷却した。１５分後、氷浴を除去し、溶液を１時間かけて室温まで自然昇温させた。反応が完了すると、反応溶液をジクロロメタンで希釈し、１０％クエン酸水溶液で３回洗浄した。ＭｇＳＯ_４上で乾燥した後、有機層をシリカゲルのプラグに通し、減圧濃縮した。得られたホスホロアミドジクロリド（４）を、更に精製することなく次の工程に直接使用した。

ホスホロアミドジクロリド（４）（１当量）、２，６−ルチジン（１当量）のジクロロメタン溶液に、Ｍｏ（Ｔｒ）Ｔ（７）（０．５当量）／ジクロロメタン溶液、続いてＮ−メチルイミダゾール（０．２当量）を添加した。反応を室温で一晩撹拌した。反応が完了すると、反応溶液をジクロロメタンで希釈し、１０％クエン酸水溶液で３回洗浄した。ＭｇＳＯ_４上で乾燥した後、有機層を濾過し、続いて濃縮した。生成物（８）をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサンの勾配で溶離）で精製した後、−２０℃で保管した。構造を、ＬＣＭＳ分析によって確認した。

活性化サブユニットの調製手順Ｂ：

ＰＯＣｌ_３（１．１当量）のジクロロメタン溶液に、２，６−ルチジン（２当量）を添加し、続いてＭｏ（Ｔｒ）Ｔ（７）（１当量）／ジクロロメタン溶液を０℃で滴下により添加した。１時間後、反応溶液をジクロロメタンで希釈し、素早く１０％クエン酸水溶液で３回洗浄した。所望のホスホロジクロリデート（９）は、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、溶媒を蒸発させた後に得られた。

ホスホロジクロリデート（１当量）のジクロロメタン溶液に、アミン（１当量）／ジクロロメタンを０℃で滴下により添加した。１５分後、反応混合物を約１時間かけて室温まで自然昇温させた。反応が完了すると、生成物（８）を、ヘキサン添加による沈殿、その後濾過によって白色固体として回収した。生成物は、真空乾燥後、−２０℃で保管した。構造を、ＬＣＭＳ分析によって確認した。

実施例１：（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチルホスホロジクロリデート

冷却（氷／水浴）したオキシ塩化リン（２．１２ｍＬ、２２．７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（２０ｍＬ）に２，６−ルチジン（４．８２ｍＬ、４１．４ｍｍｏｌ）を滴下により添加し、続いてＭｏ（Ｔｒ）Ｔ（２）（１０．０ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（２０ｍＬ）を１５分かけて滴下により添加し（内部温度０〜１０℃）、続いて浴を除去し、周囲温度で撹拌を２０分間継続した。反応をクエン酸溶液で洗浄（４０ｍＬ×３、１０％ｗ／ｖ ａｑ）、乾燥（ＭｇＳＯ_４）、濾過及び濃縮して得た白色発泡体（９．７９ｇ）を、以後の手順に直接使用した。

実施例２：（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（ジメチルアミノ）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート

冷却（氷／水浴）した実施例１からのジクロロホスフェート（５．００ｇ、５．００ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（５ｍＬ）に、ピペリジン（０．６１ｇ、４．７６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（５ｍＬ）を滴下により添加し、続いて浴を除去し、周囲温度で撹拌を３０分間継続した。反応を、直接カラムにロードした。［ＳｉＯ_２カラム（４０ｇ）、ＤＣＭ／ＥｔＯＨ溶離液（勾配１：０〜１：１）］を用いたクロマトグラフィーで、表題化合物（２．５ｇ）を白色発泡体として得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ_４６Ｈ_５５Ｎ_８Ｏ_７ＰのＥＳＩ／ＭＳ計算値８６２．４、実測値ｍ／ｚ＝８６３．６（Ｍ＋１）。

実施例３：１−（１−（クロロ（（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メトキシ）ホスホリル）ピペリジン−４−イル）−１−メチルピロリジン−１−イウムクロリド

表題化合物を実施例２に記載の方法と類似の方法で合成し、表題化合物（０．６ｇ）を白色固体として得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ_４９Ｈ_６０Ｎ_８Ｏ_７ＰのＥＳＩ／ＭＳ計算値９０３．４、実測値ｍ／ｚ＝９０３．７（Ｍ＋）。

実施例４：（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−メチルピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート

冷却（氷／水浴）したオキシ塩化リン（１．０２ｍＬ、１１．０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）に、２，６−ルチジン（３．４９ｍＬ、２９．９ｍｍｏｌ）続いてメチルピペラジン（１．００ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）を滴下により添加し、撹拌を１時間継続した。Ｍｏ（Ｔｒ）Ｔ（２）（４．８２、１０．０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）及びＮＭＩ（７９μＬ、１．０ｍｍｏｌ）を添加し、４時間撹拌した後、直接カラムにロードした。［ＳｉＯ_２カラム（８０ｇ）、ＤＣＭ／アセトン（２％ＴＥＡ含有）溶離液（勾配１：０〜０：１）］を用いたクロマトグラフィーで、表題化合物（０．８ｇ）を白色発泡体として得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ_４３Ｈ_４８Ｎ_７Ｏ_８ＰのＥＳＩ／ＭＳ計算値８３４．４、実測値ｍ／ｚ＝８３５．５（Ｍ＋１）。

実施例５：（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−エチルピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート

表題化合物を実施例４に記載の方法と類似の方法で合成し、表題化合物（１１．５ｇ）を白色発泡体として得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ_４５Ｈ_５３Ｎ_８Ｏ_７ＰのＥＳＩ／ＭＳ計算値８４８．４、実測値ｍ／ｚ＝８４９．７（Ｍ＋１）。

実施例６：（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（６−ベンジルアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−エチルピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート

表題化合物を実施例４に記載の方法と類似の方法で合成し、表題化合物（４．５ｇ）を白色発泡体として得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ_５２Ｈ_５６Ｎ_１１Ｏ_６ＰのＥＳＩ／ＭＳ計算値９６１．４、実測値ｍ／ｚ＝９６２．８（Ｍ＋１）。

実施例７：（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−イソプロピルピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート

表題化合物を実施例４に記載の方法と類似の方法で合成し、表題化合物（３．５ｇ）を白色発泡体として得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ_４６Ｈ_５５Ｎ_８Ｏ_７ＰのＥＳＩ／ＭＳ計算値８６２．４、実測値ｍ／ｚ＝８６３．７（Ｍ＋１）。

実施例８：（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチルメチル（２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチル）ホスホロアミドクロリデート

表題化合物を実施例４に記載の方法と類似の方法で合成し、表題化合物（１．０ｇ）を白色発泡体として得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ_４４Ｈ_４８Ｆ_３Ｎ_８Ｏ_８ＰのＥＳＩ／ＭＳ計算値９０４．３、実測値ｍ／ｚ＝９０３．７（Ｍ−１）。

実施例９：（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチルメチル（２−（２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−メチルアセトアミド）エチル）ホスホロアミドクロリデート

表題化合物を実施例４に記載の方法と類似の方法で合成し、表題化合物（１．８ｇ）を白色発泡体として得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ_４５Ｈ_５０Ｆ_３Ｎ_８Ｏ_８ＰのＥＳＩ／ＭＳ計算値９１８．３、実測値ｍ／ｚ＝１８３６．６（２Ｍ＋）。

実施例１０：（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート

冷却（氷／水浴）したオキシ塩化リン（１７．７ｍＬ、１９０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１９０ｍＬ）に２，６−ルチジン（１０１ｍＬ、８６４ｍｍｏｌ）を滴下により添加し、続いてＭｏ（Ｔｒ）Ｔ（２）（８３．５ｇ、１７３ｍｍｏｌ）を１５分かけて少しずつ添加し（内部温度０〜１０℃）、撹拌した。３０分後、４−アミノピペリジンモノトリフルオロアセトアミド（４８．９ｇ、約１９０ｍｍｏｌ）を１５分かけて滴下により添加し（内部温度０〜８℃）、撹拌した。１時間後、ＤＩＰＥＡ（５０ｍＬ）を滴下により添加し（内部温度０〜１０℃）、１時間撹拌した。反応をクエン酸溶液で洗浄（５００ｍＬ×３、１０％ｗ／ｖ ａｑ）、乾燥（ＭｇＳＯ_４）、濾過及び濃縮して粘稠油を得、これを直接カラムにロードした。［ＳｉＯ_２カラム（３００ｇ）、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ溶離液（勾配１：０〜０：１）］を用いたクロマトグラフィーで、表題化合物（９１．３ｇ、収率７０％）を白色発泡体として得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ_４３Ｈ_４８Ｎ_７Ｏ_８ＰのＥＳＩ／ＭＳ計算値９３０．９、実測値ｍ／ｚ＝９５４．４（Ｍ＋Ｎａ）。

実施例１３〜３７は、上記の手順Ａにより調製した。

実施例１１：（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（１−（２，２，２−トリフルオロアセチル）ピペリジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート

実施例１２：（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−モルホリノピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート

実施例１３：（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチルビス（３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）プロピル）ホスホロアミドクロリデート

実施例１４：（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル［１，４’−ビピペリジン］−１’−イルホスホノクロリデート

以下の実施例１５〜２０は、上記の手順Ｂにより調製した。

実施例１５：（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート

実施例１６：（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（２−（ジメチルアミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート

実施例１７：（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−フェニルピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート

実施例１８：（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−メチルアセトアミド）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート

実施例１９：（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチルメチル（３−（２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−メチルアセトアミド）プロピル）ホスホロアミドクロリデート

実施例２０：（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート

実施例２１：（４−（ピロリジン−１−イル）ピペリジン−１−イル）ホスホン酸ジクロリド塩酸塩

冷却（氷／水浴）したオキシ塩化リン（５．７０ｍＬ、５５．６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（３０ｍＬ）に、２，６−ルチジン（１９．４ｍＬ、１６７ｍｍｏｌ）及び４−（１−ピロリジニル）−ピペリジン（８．５８ｇ、５５．６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（３０ｍＬ）を添加し、１時間撹拌した。懸濁液を濾過し、固体を過剰のジエチルエーテルで洗浄して、表題ピロリジン（１７．７ｇ、収率９１％）を白色固体として得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ_１９Ｈ_３０Ｎ_５Ｏ_４ＰのＥＳＩ／ＭＳ計算値４２３．２、実測値ｍ／ｚ＝４２２．２（Ｍ−１）。

実施例２２：（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（ピロリジン−１−イル）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート塩酸塩

撹拌、冷却（氷／水浴）した実施例２１からのジクロロホスホロアミデート（１７．７ｇ、５０．６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１００ｍＬ）に、Ｍｏ（Ｔｒ）Ｔ（２）（２４．５ｇ、５０．６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１００ｍＬ）、２，６−ルチジン（１７．７ｍＬ、１５２ｍｍｏｌ）、及び１−メチルイミダゾール（０．４０１ｍＬ、５．０６ｍｍｏｌ）を１０分かけて滴下により添加した。懸濁液を撹拌しながら、浴を周囲温度まで自然昇温させた。６時間後、懸濁液をジエチルエーテル（１Ｌ）に注ぎ、１５分撹拌、濾過し、固体を追加のエーテルで洗浄して白色固体（４５．４ｇ）を得た。粗生成物をクロマトグラフィー［ＳｉＯ_２カラム（１２０グラム）、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ溶離液（勾配１：０〜６：４）］で精製し、合わせた画分をジエチルエーテル（２．５Ｌ）に注ぎ、１５分間撹拌、濾過し、得られた固体を追加のエーテルで洗浄して、表題化合物（２３．１ｇ、収率６０％）を白色固体として得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ_４８Ｈ_５７Ｎ_８Ｏ_７ＰのＥＳＩ／ＭＳ計算値８８８．４、実測値ｍ／ｚ＝８８７．６（Ｍ−１）。

実施例２３：モルホリノオリゴマーの調製
トリチルピペラジンフェニルカルバメート１ｂの調製（図１参照）：冷却した化合物１ａのジクロロメタン（６ｍＬ／ｇ１１）懸濁液に、炭酸カリウム（３．２当量）の水溶液（４ｍＬ／ｇ炭酸カリウム）を添加した。この２相混合物に、クロロギ酸フェニル（１．０３当量）のジクロロメタン溶液（２ｇ／ｇクロロギ酸フェニル）をゆっくりと添加した。反応混合物を２０℃に加温した。反応が完了すると（１〜２時間）、層を分離した。有機層を水で洗浄し、無水炭酸カリウム上で乾燥した。生成物１ｂを、アセトニトリルからの結晶化により単離した。収率＝８０％。

カルバメートアルコール１ｃの調製：水素化ナトリウム（１．２当量）を１−メチル−２−ピロリジノン（３２ｍＬ／ｇ水素化ナトリウム）に懸濁した。この懸濁液にトリエチレングリコール（１０．０当量）及び化合物１ｂ（１．０当量）を添加した。得られるスラリーを９５℃に加熱した。反応が完了すると（１〜２時間）、混合物を２０℃に冷却した。この混合物に、３０％ジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ｖ：ｖ）及び水を添加した。生成物を含有する有機層を、ＮａＯＨ水溶液、コハク酸水溶液、及び飽和塩化ナトリウム水溶液で連続して洗浄した。生成物１ｃをジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／ヘプタンから結晶化により単離した。収率＝９０％。

Ｔａｉｌ酸１ｄの調製：化合物１ｃのテトラヒドロフラン（７ｍＬ／ｇ３６）溶液に無水コハク酸（２．０当量）及びＤＭＡＰ（０．５当量）を添加した。混合物を５０℃に加熱した。反応が完了すると（５時間）、この混合物を２０℃に冷却し、ＮａＨＣＯ３水溶液でｐＨ８．５に調節した。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを添加し、生成物を水層に抽出した。ジクロロメタンを添加し、混合物をクエン酸水溶液でｐＨ３に調節した。生成物を含有する有機層をｐＨ＝３クエン酸塩緩衝液と飽和塩化ナトリウム水溶液との混合物で洗浄した。この１ｄのジクロロメタン溶液を、単離せずに化合物１ｅの調製に使用した。

１ｅの調製：化合物１ｄの溶液にＮ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）（１．０２当量）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．３４当量）、続いて１−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１．１当量）を添加した。混合物を５５℃に加熱した。反応が完了すると（４〜５時間）、混合物を２０℃に冷却し、１：１の０．２Ｍクエン酸／ブライン及びブラインで連続的に洗浄した。ジクロロメタン溶液を、アセトン、続いてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドと溶媒交換し、生成物をアセトン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドから飽和塩化ナトリウム水溶液への沈殿によって単離した。粗生成物を、水に数回再スラリー化し、残留するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及び塩を除去した。化合物１ｃからの１ｅの収率＝７０％活性化した「Ｔａｉｌ」のジスルフィドアンカー樹脂上への導入を、固相合成中のサブユニット組み込みに使用した手順によって、ＮＭＰ中で実施した。

モルホリノオリゴマーの合成用の固体担体の調製（図２参照）：この手順は、粗大空隙（４０〜６０μｍ）ガラスフリット、オーバーヘッド撹拌子、及びＴｅｆｌｏｎ三方コックを備え、フリットを通したＮ２のバブリング又は減圧抽出が可能な、シラン処理されたジャケット付きペプチド容器（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ，ＮＪ，ＵＳＡによる注文生産）で実施した。反応容器における温度の制御は、循環水浴によって達成した。

以下の手順における樹脂の処理／洗浄の工程は、樹脂流動化と溶媒／溶液抽出との２つの基本操作からなる。樹脂流動化では、Ｎ２がフリットを通って上方に流れるようにコック位置を設定し、特定の樹脂処理／洗浄剤を反応器に添加して、樹脂に浸透させ、樹脂を完全に湿潤させた。続いて、混合を開始し、樹脂のスラリーを、特定の時間にわたって混合した。溶媒／溶液抽出では、混合及びＮ２の流れを停止し、減圧ポンプを始動し、続いて、樹脂処理／洗浄剤が廃棄物に排出されるようにコック位置を設定した。樹脂処理／洗浄剤の全体積は、別途記載のない限り、１５ｍＬ／ｇ樹脂であった。

シラン処理されたジャケット付きペプチド容器中のアミノメチルポリスチレン樹脂（１００〜２００メッシュ、約１．０ｍｍｏｌ／ｇ Ｎ２置換；７５ｇ、１当量、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓ，ＵＫ、部品＃１４６４−Ｘ７９９）に、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ；２０ｍｌ／ｇ樹脂）を添加し、１〜２時間混合しながら樹脂を膨潤させた。膨潤溶媒排出後、樹脂をジクロロメタン（２×１〜２分間）、２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中の５％ジイソプロピルエチルアミン（２×３〜４分間）及びジクロロメタン（２×１〜２分間）で洗浄した。最終洗浄液を排出した後、樹脂を、ジスルフィドアンカー２ａの１−メチル−２−ピロリジノン（０．１７Ｍ；１５ｍＬ／ｇ樹脂、約２．５当量）溶液で流動化し、この樹脂／試薬混合物を４５℃で６０時間加熱した。反応が完了すると、加熱を停止し、アンカー溶液を排出し、樹脂を１−メチル−２−ピロリジノン（４×３〜４分）及びジクロロメタン（６×１〜２分）で洗浄した。樹脂を１０％（ｖ／ｖ）ジエチルジカルボナートのジクロロメタン溶液（１６ｍＬ／ｇ；２×５〜６分）で処理し、次いでジクロロメタン（６×１〜２分）で洗浄した。樹脂２ｂをＮ２流下で１〜３時間乾燥し、続いて減圧下で一定重量（±２％）まで乾燥した。収率：樹脂の原重量の１１０〜１５０％。

アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂の負荷の決定：樹脂の負荷（潜在的に利用可能な反応性部位の数）は、樹脂１ｇあたりのトリフェニルメチル（トリチル）基の数の分光アッセイにより決定される。

既知重量の乾燥樹脂（２５±３ｍｇ）を、シラン処理した２５ｍＬメスフラスコに移し、約５ｍＬの２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸ジクロロメタン溶液を添加する。内容物を静かに旋回させて混合し、次いで３０分間静置する。追加の２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸ジクロロメタン溶液で２５ｍＬに増量し、内容物を十分に混合する。容積式ピペットを使用して、一定分量のトリチル含有溶液（５００μＬ）を１０ｍＬメスフラスコに移し、メタンスルホン酸で１０ｍＬに増量する。

最終溶液におけるトリチルカチオン含量を、４３１．７ｎｍにおけるＵＶ吸光度により測定し、適切な容量、希釈、消光係数（ε：４１μｍｏｌ−１ｃｍ−１）及び樹脂重量を用いて、樹脂の負荷を、樹脂１ｇ当たりのトリチル基（μｍｏｌ／ｇ）として算出する。このアッセイをトリプリケートで行い、平均の負荷を算出する。

この実施例における樹脂の負荷手順は、約５００μｍｏｌ／ｇの負荷を有する樹脂を提供する。ジスルフィドアンカー組み込み工程を、室温で２４時間行った場合、３００〜４００μｍｏｌ／ｇの負荷が得られた。

Ｔａｉｌの負荷：アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂の調製と同じ設定及び容量を用いて、Ｔａｉｌを分子に導入することができる。カップリング工程では、ジスルフィドアンカー溶液の代わりに、１ｅ（０．２Ｍ）の４−エチルモルホリン（ＮＥＭ、０．４Ｍ）含有ＮＭＰ溶液を用いた。４５℃で２時間の後、樹脂２ｂを５％ジイソプロピルエチルアミンの２５％イソプロパノール／ジクロロメタン溶液で２回、及びＤＣＭで１回洗浄した。この樹脂に、無水安息香酸（０．４Ｍ）及びＮＥＭ（０．４Ｍ）の溶液を添加した。２５分後、反応器のジャケットを室温まで冷却し、樹脂を、５％ジイソプロピルエチルアミンの２５％イソプロパノール／ジクロロメタン溶液で２回及びＤＣＭで８回洗浄した。樹脂２ｃを濾過し、高真空下で乾燥した。樹脂２ｃの負荷は、Ｔａｉｌの負荷において使用した、最初のアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂２ｂの負荷であると定義される。

固相合成：モルホリノオリゴマーを、２ｍＬのＧｉｌｓｏｎポリプロピレン反応カラム（部品＃３９８０２７０）中、Ｇｉｌｓｏｎ ＡＭＳ−４２２自動ペプチド合成装置にて調製した。水を流すためのチャネルを備えるアルミニウムブロックを、合成装置に据えたカラムの周りに配置した。ＡＭＳ−４２２は、あるいは試薬／洗浄溶液を加え、特定の時間にわたり保持し、真空を用いてカラムから排出させる。

約２５サブユニットまでの範囲の長さのオリゴマーには、約５００μｍｏｌ／ｇ樹脂の負荷のアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂が好ましい。より長いオリゴマーには、３００〜４００μｍｏｌ／ｇ樹脂の負荷のアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂が好ましい。５’−Ｔａｉｌを持つ分子が望ましい場合、Ｔａｉｌ負荷された樹脂を、同じ負荷ガイドラインを用いて選択する。

以下の試薬溶液を調製した：
脱トリチル化溶液：１０％シアノ酢酸（ｗ／ｖ）の４：１ジクロロメタン／アセトニトリル溶液；中和溶液：５％ジイソプロピルエチルアミンの３：１ジクロロメタン／イソプロパノール溶液；カップリング溶液：０．１８Ｍ（又は、２０サブユニットより長く成長したオリゴマーについては０．２４Ｍ）の所望の塩基及び結合型の活性化されたルモホリノサブユニット及び０．４ＭのＮ−エチルモルホリンの１，３−ジメチルイミダゾリジノン溶液。異なる試薬溶液洗浄液を分離する移行用洗浄として、ジクロロメタン（ＤＣＭ）を用いた。

ブロックを４２℃に設定した合成装置において、３０ｍｇのアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂（又はＴａｉｌ樹脂）を含有する各カラムに、２ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノンを加え、室温で３０分間静置した。２ｍＬのジクロロメタンで２回洗浄した後、以下の合成サイクルを用いた：

各カラムが、適切なカップリング溶液（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｉ）を適切な順序で受け取るように、個々のオリゴマーの順序を合成装置にプログラムした。カラム内のオリゴマーがその最後のサブユニットの組み込みを完了すると、カラムをブロックから外し、０．８９Ｍの４−エチルモルホリンを含有する４−メトキシトリフェニルメチルクロリド（ＤＭＩ中０．３２Ｍ）を含むカップリング溶液を用いて、手動で最後のサイクルを実施した。

樹脂からの切断並びに塩基及び骨格保護基の除去：メトキシトリチル化の後、樹脂を、２ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノンで８回洗浄した。０．１Ｍ１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び０．７３Ｍトリエチルアミンの１−メチル−２−ピロリジノン溶液からなる切断溶液を１ｍＬ添加し、カラムに蓋をして、室温で３０分間静置した。その後、この溶液を、１２ｍＬのＷｈｅａｔｏｎバイアル中に排液した。大幅に縮んだ樹脂を、３００μＬの切断溶液で２回洗浄した。この溶液に、４．０ｍＬの濃アンモニア水溶液（−２０℃で保管）を添加し、（Ｔｅｆｌｏｎライニング付スクリューキャップで）バイアルにしっかりと蓋をし、混合物を旋回させて溶液を混合した。バイアルを、４５℃のオーブン内に１６〜２４時間置いて、塩基及び骨格保護基を切断した。

初期オリゴマーの単離：バイアル中のアンモノリシス溶液をオーブンから取り出し、室温まで放置冷却した。この溶液を、２０ｍＬの０．２８％アンモニア水溶液で希釈し、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ ＨＱ樹脂（ＢｉｏＲａｄ）を含有する２．５×１０ｃｍのカラムに通した。塩勾配（Ａ：０．２８％アンモニア＋Ｂ：０．２８％アンモニア中の１Ｍ塩化ナトリウム；６０分で０〜１００％のＢ）を用いて、メトキシトリチルを含有するピークを溶離した。合わせた画分をプールし、所望される生成物に応じて更に処理した。

モルホリノオリゴマーの脱メトキシトリチル化：Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ精製からのプールした画分を、１ＭのＨ３ＰＯ４で処理して、ｐＨを２．５まで下げた。最初の混合の後、試料を、室温で４分間静置し、この時点で２．８％アンモニア／水を用いてｐＨ１０〜１１に中和する。生成物を、固相抽出（ＳＰＥ）により精製した。

Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ ＣＧ−３００Ｍ（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）（３ｍＬ）を２０ｍＬのフリット状カラム（ＢｉｏＲａｄ Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃクロマトグラフィーカラム（７３２−１０１１））に充填し、樹脂を以下の溶液３ｍＬですすいだ：０．２８％ＮＨ４ＯＨ／８０％アセトニトリル；０．５Ｍ ＮａＯＨ／２０％エタノール；水；５０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４／８０％アセトニトリル；水；０．５ＮａＯＨ／２０％エタノール；水；０．２８％ＮＨ４ＯＨ。

脱メトキシトリチル化からの溶液をカラム上にロードし、樹脂を、３〜６ｍＬの０．２８％アンモニア水溶液で３回すすいだ。Ｗｈｅａｔｏｎバイアル（１２ｍＬ）をカラムの下に置き、４５％アセトニトリル０．２８％アンモニア水溶液２ｍＬで２回洗浄することによって、生成物を溶離した。この溶液をドライアイス中で凍結し、バイアルを、凍結乾燥装置中に置いて、綿毛状の白色粉末を生じた。この試料を水に溶解し、シリンジを用いて０．２２マイクロメートルフィルター（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｃｒｏｄｉｓｃ ２５ｍｍシリンジフィルター＋０．２マイクロメートルのＨＴ Ｔｕｆｆｒｙｎメンブラン）を通して濾過し、ＵＶ分光光度計にて光学密度（ＯＤ）を測定して、存在するオリゴマーのＯＤ単位を決定し、分析用の試料を分与した。続いて、この溶液を、凍結乾燥のためＷｈｅａｔｏｎバイアルに戻した。

モルホリノオリゴマーの分析：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用いて、精製物における画分の組成を決定し、オリゴマーを同定する証拠（分子量）を得た。試料を３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸（シナピン酸）、３，４，５−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）又はα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＨＣＣＡ）の溶液をマトリクスとして希釈した後、測定した。

Ｄｉｏｎｅｘ ＰｒｏＰａｃ ＳＣＸ−１０、４×２５０ｍｍカラム（Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いたカチオン交換（ＳＣＸ）ＨＰＬＣを、２５ｍＭ（ｐＨ＝５）酢酸ナトリウム２５％アセトニトリル（緩衝液Ａ）と２５ｍＭ（ｐＨ＝５）酢酸ナトリウム２５％アセトニトリル１．５Ｍ塩化カリウム（緩衝液Ｂ）（１５分で１０〜１００％Ｂの勾配）、又は２５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４ ２５％アセトニトリル（ｐＨ＝３．５）（緩衝液Ａ）と２５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４ ２５％アセトニトリル（ｐＨ＝３．５）＋１．５Ｍ塩化カリウム（緩衝液Ｂ）（１５分で０〜３５％Ｂの勾配）を用いて行った。前者の系は、ペプチドが結合していない正に荷電したオリゴマーに用い、後者はペプチドコンジュゲートに用いた。

カチオン交換クロマトグラフィーによるモルホリノオリゴマーの精製：試料を、２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ＝４．５）（緩衝液Ａ）に溶解して、Ｓｏｕｒｃｅ３０カチオン交換樹脂のカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライし、２０ｍＭ酢酸ナトリウム中０．５Ｍの塩化ナトリウム及び４０％アセトニトリル（ｐＨ＝４．５）（緩衝液Ｂ）の勾配を用いて溶離した。プールした生成物含有画分を濃アンモニア水溶液で中和し、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ ＳＰＥカラムにアプライした。生成物を、上述のようにして、溶離、凍結及び凍結乾燥した。

実施例２４：ＡＰＮオリゴヌクレオチド修飾によるＳＭＮ２エクソン７包含の増強
図５に示す配列を含有するオリゴヌクレオチドを試験して、ＡＰＮオリゴヌクレオチドがＳＭＮ２エクソン７包含を増強するか否かを判断した。表１に示すオリゴヌクレオチドの各々を、下記のヌクレオフェクションプロトコルを用いて細胞に導入した。結果を逆転写酵素プロトコルを用いて定量化し、図６及び図７に示す。ＧＭ０３８１３線維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ）中のＳＭＮ２エクソン７の包含又は除外を表すゲルバンドの強度を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥ）で定量化した。エクソン７包含は、エクソン７包含バンド強度をエクソン７包含バンドと除外バンドからの強度の合計で除算した比から計算されたパーセンテージとして報告される。各ドットは、各濃度における２つのレプリケートの平均＋／−１標準偏差を表す。３種類の独立した実験を組み合わせて上記のデータセットを得た。包含パーセンテージの分析は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで実施した。データポイント及び曲線は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍでプロットした。図６に示すように、オリゴヌクレオチドに対するＡＰＮ修飾の追加は、化合物の効力を、同じ配列を含有する非修飾ＰＭＯと比較して増強する。したがって、図６に示すように、１４ｍｅｒ（１１／１５）ＡＰＮは、ＡＰＮ結合のない１４ｍｅｒ（１１／１５）よりも効力が約１桁高かった。同様に、Ｅ８／４ａ−ＡＰＮ（１１／１５）及びＥ８／４ｂ−ＡＰＮ（１１／１５）は、それぞれＥ８／４ａ（１１／１５）及びＥ８／４ｂ（１１／１５）よりも効力が高かった。

実施例２５：ＳＭＡ細胞ヌクレオフェクションプロトコル
脊髄性筋萎縮症罹者からの患者由来線維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ細胞系ＧＭ０３８１３）を、標準的プロトコルに従って、１０％ＦＢＳ添加イーグルＭＥＭを用いて培養した。細胞は、実験までに３〜５日経過しており、ヌクレオフェクション時点で約８０％コンフルエントであった。オリゴは、ヌクレアーゼフリー水（ＤＥＰＣ未処理）中１〜２ｍＭの原液として調製し、この原液から適切な希釈液をヌクレオフェクション用に調製した。線維芽細胞をトリプシン処理し、計数し、９０ｇで１０分間遠心分離し、１〜５×１０ｅ５細胞／ウェルをヌクレオフェクション溶液Ｐ２（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁した。続いて、オリゴ溶液及び細胞をＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ１６ウェルストリップの各ウェルに加え、プログラムＥＮ−１００でパルス処理した。細胞を室温で１０分間インキュベートし、１２ウェルプレートにデュプリケートで移植した。４８時間後に、ＧＥ Ｉｌｌｕｓｔｒａ９６スピンキットを用い、製造業者が推奨するプロトコルに従って、全ＲＮＡを処理細胞から単離した。回収したＲＮＡを、分析前に−８０℃で保管した。

ＳＭＮ２対立遺伝子を増幅するため、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写酵素ＰＣＲを実施した。ヌクレオフェクトした細胞から単離した４００ｎｇの全ＲＮＡを逆転写し、以下の遺伝子特異的なプライマー及び条件で増幅した（Ｈｕａ ２００７に記載）：Ｅ６−Ｆ：５’ＡＴＡ ＡＴＴ ＣＣＣ ＣＣＡ ＣＣＡ ＣＣＴ ＣＣＣ ３’；Ｅ８−４６７−Ｒ：５’ＴＴＧ ＣＣＡ ＣＡＴ ＡＣＧ ＣＣＴ ＣＡＣ ＡＴＡ Ｃ ３’；ＰＣＲプログラム：６０℃で３０分のＲＴインキュベーション；変性９４℃、アニール５５℃、伸長７２℃、２２サイクル。Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐキットに入れた増幅液に、Ｃｙ５標識ｄＣＴＰ（ＧＥ）を加え、蛍光によるバンド可視化を可能とした。増幅後、ＰＣＲ産物をＤＤＥＩで消化して、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２対立遺伝子を差別化した（Ｈｕａ ２００７の記載による）。消化された試料を、１０％アクリルアミド／ＴＢＥプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に流し、６３３ｎｍ励起レーザー及びプラテン面に焦点面を有する６７０ｎｍ ＢＰ ３０発光フィルタを用いてＴｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ（ＧＥ）で可視化した。ゲルをＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥ）で分析し、バンドの強度を測定した。エクソン７を含有する全バンドから得た強度を加算し、包含分析における全エクソン７転写物レベルを表した。

実施例２６：ＳＭＡマウスモデル
ＳＭＮΔ７マウスを、アンチセンスオリゴヌクレオチドを修飾する疾患を特性化するためのＳＭＡモデルとして使用することができる。マウスはＳｍｎ遺伝子を１つだけ有し、この遺伝子の損失は胚致死性である。ヒトＳＭＡをモデル化するＳＭＮ欠失を有するマウスを作成するため、ヒトＳＭＮ２遺伝子をマウスに導入することができる。例えば、２コピーのヒトＳＭＮ２を、Ｓｍｎを欠くマウスに導入して、平均寿命５日の重篤なＳＭＡを有するマウスを作成することができる一方で、８コピーのＳＭＮ２を導入してこのマウスを救うことができる。更に、ＳＭＮΔ７、エクソン７を欠くＳＭＮ導入遺伝子を、重篤なＳＭＡのマウスに導入して、平均寿命を延ばすことができる。更に、ＳＭＮを生後に導入して、ＳＭＮΔ７マウスのＳＭＡを調節することができる。したがって、ＳＭＮΔ７マウスを、アンチセンスオリゴヌクレオチドを修飾する疾患を特性化するためのＳＭＡモデルとして使用することができる。

ＳＭＡのＳＭＮΔ７マウスモデルを使用して、ＳＭＮ発現を増大するための多処置戦略を実施することができる。ＳＭＮプロモータの活性化又はエクソン７スプライシングパターンの変更のいずれかを行うためにアンチセンスオリゴマー等の様々な薬理化合物を用いた標的化ＳＭＮ産生を実施して、ＳＭＮΔ７のＳＭＡマウスの表現型を改善することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソンスプライシングエンハンサー又はイントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）を包含する標的配列をブロックすることができる。更に、ＳＭＮを生後に誘発して治療効果を達成することができる。

ＰＭＯ、ＰＭＯ＋、ＰＰＭＯ、及びＰＭＯ−Ｘのようなアンチセンスオリゴマーを、高濃度でのＩＣＶ注入によってマウスに送達して、ＳＭＮ２スプライシングの変更及びＳＭＮレベルの増大を行うことができる。処置したＳＭＡマウスは、体重増加、運動活性及び寿命延長で改善を示す場合がある。アンチセンスオリゴマーは、限定するものではないが、脳室内（ＩＣＶ）注入、末梢ＦＶ送達、末梢送達とＩＣＶ送達との組み合わせ、及びデュアルＩＣＶ注入等が挙げられる数種類の機構によって送達されてもよい。

早期のＣＮＳ処置は、ロバストな作用を与える可能性が高い。ただし、遅延したＣＮＳ送達もなお生存レベルを増大する可能性がある。

ＩＣＶ注入により、脳及び脊髄において、ＳＭＮ２エクソン７取り込みとＳＭＮタンパク質レベルとの両方の増大が得られる可能性がある。したがって、ＳＭＡに衝撃を与えるためにニューロン内のＳＭＮレベルを回復することは好ましい場合がある。長期生存効果が、末梢におけるＳＭＮレベルの有意な増強なく得られる可能性がある。ただし、血液脳関門の外側での自律神経系におけるＳＭＮ発現増大が、ＳＭＡの矯正を生じる可能性もある。

表１
ＳＭＡ標的オリゴヌクレオチドのためのＰＭＯ及びＡＰＮ修飾配列
ＡＰＮ修飾位置を太赤字及び下線で示す。

Claims (18)

1. 細胞内のエクソン７含有ＳＭＮ２ｍＲＮＡのエクソン欠失ＳＭＮ２ｍＲＮＡに対するレベルを増強する方法であって、ＳＭＮ２遺伝子内の一領域に特異的にハイブリダイズする１０〜４０ヌクレオチドの長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドに細胞を接触させて、細胞内のエクソン７含有ＳＭＮ２ｍＲＮＡのエクソン７欠失ＳＭＮ２ｍＲＮＡに対するレベルを増強する工程を含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理学的ｐＨにおいて正に荷電したヌクレオシド間結合を少なくとも１つ有する、方法。
2. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、約４．５〜約１２のｐＫａを示すヌクレオシド間結合を少なくとも１つ有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、塩基性窒素とアルキル、アリール、又はアラルキル基との両方を含有するヌクレオシド間結合を有する、請求項１に記載の方法。
4. アンチセンスオリゴヌクレオチドがモルホリノを含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記オリゴヌクレオチドが次式：
   
   並びにこれらの薬学的に許容可能な塩を有するヌクレオチドを少なくとも１つ有し、式中、Ｎｕは核酸塩基であり；
   Ｒ_１は次式
   
   の部分であり、ｑは０、１、２、３又は４であり；
   Ｒ_２は、水素、Ｃ_１〜Ｃ_５アルキル、ホルムアミジニル部分からなる群から選択され、かつ
   Ｒ_３は、水素及びＣ_１〜Ｃ_５アルキルからなる群から選択されるか、又は
   Ｒ_２及びＲ_３は、結合して、任意追加的に酸素ヘテロ原子を含有する５〜７員の複素環を形成し、この環は任意追加的にＣ_１〜Ｃ_５アルキル、フェニル、ハロゲン、及びアラルキルからなる群から選択される置換基で置換されていてもよく；
   Ｒ_４は、不在、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル及びアラルキルからなる群から選択され；
   Ｒ_ｘは、ＨＯ−、ヌクレオチド、膜透過性ペプチド部分、及びピペラジニルからなる群から選択され；
   Ｒ_ｙは、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、ヌクレオチド、ペプチド部分、アミノ酸、ホルムアミジニル部分、及びアシルからなる群から選択され；
   Ｒ_ｚは、不在、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、及びアシルからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
6. Ｎｕが、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、及びヒポキサンチンからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
7. Ｎｕがチミン又はウラシルである、請求項６に記載の方法。
8. 前記ヌクレオチドが次式：
   
   を有し、式中、Ｒｘ、Ｒｙ、Ｒｚ、及びＮｕは請求項５に記載の通りである、請求項１に記載の方法。
9. Ｎｕがチミン又はウラシルである、請求項８に記載の方法。
10. 標的領域が、ＳＭＮ２遺伝子のエクソン７、イントロン７、又はエクソン８内にある、請求項１に記載の方法。
11. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＳＭＮ２遺伝子のイントロン７に相補的な配列を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＳＭＮ２遺伝子のイントロン７及びエクソン８の一部分に相補的な配列を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、約１０〜約３０ヌクレオチドの配列を含む、請求項１に記載の方法。
14. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、約１４〜約２１ヌクレオチドの配列を含む、請求項１に記載の方法。
15. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、表１に記載の配列を含む、請求項１に記載の方法。
16. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、細胞取り込みを増強するペプチド部分を更に含む、請求項１に記載の方法。
17. 前記ペプチドが、アルギニンリッチペプチドである、請求項１６に記載の方法。
18. 患者の脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の処置方法であって、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡ内の一領域に特異的にハイブリダイズする１０〜４０ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記患者に投与して、細胞内のエクソン７含有ＳＭＮ２ｍＲＮＡのエクソン欠失ＳＭＮ２ｍＲＮＡに対するレベルを増強する工程を含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理学的ｐＨにおいて正に荷電したヌクレオシドを少なくとも１つ有し、それによって前記患者を処置する、方法。