JP2014534178A - 癌の処置方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、癌の処置が必要な対象、例えば癌の処置が必要なヒトにおいて癌を処置する方法であって、前記ヒトに由来するサンプル中において以下の少なくとも一つを決定する工程:(a)前記ヒトに由来するサンプル中におけるEZH2のアラニン677(A677)残基における変異の有無、(b)EZH2中のチロシン641(Y641)残基における変異の有無、または(c)対照と比較したH3K27me3レベルの増加の有無、および前記サンプル中に前記A677変異、Y641変異、またはH3K27me3レベルの増加の少なくとも一つがある場合に、有効量のEZH2阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩を前記ヒトに投与する工程を含んでなる方法に関する。
Description
技術分野
本発明は、癌の処置が必要な対象における癌の処置方法に関する。
本発明は、癌の処置が必要な対象における癌の処置方法に関する。
背景技術
癌を処置するための標的化された治療法の開発および利用の拡大は、主要な発癌経路およびどのようにこれらの経路の標的化された撹乱が臨床反応に対応するかの理解が進んできていることを反映している。標的化療法の有効性の予測における難点は、経路の調節解除の原因となる機構(例えば、活性化型の変異、増幅)の全体的な知識が限定的であることによるものと考えられる。腫瘍治療のための前臨床トランスレーショナル研究調査は、どの腫瘍型および遺伝子型が処置の恩恵を最も受け易いかを決定することに焦点を合わせている。選択された患者集団の処理は、治療の可能性を最大にするのに役立ち得る。腫瘍モデルの前臨床細胞反応プロファイリングが新規癌治療開発の土台となっている。インビトロ腫瘍モデルのコホートを用いて臨床的有効性を予測しようとする努力が成功を収めている(例えば、EGFR阻害剤はEGFR変異を有する腫瘍で選択的に有用である)。したがって、多様な腫瘍に由来する細胞株の拡張的パネルで「来る人全員(all comers)」の有効性試験を要約することができ、これにより、どの組織構造および特異的腫瘍遺伝子型が最も処置の恩恵を受け易いかが特定される。臨床状況で恩恵を最も受け易い患者を特定するために多くの特異的分子マーカーが現在用いられている。
癌を処置するための標的化された治療法の開発および利用の拡大は、主要な発癌経路およびどのようにこれらの経路の標的化された撹乱が臨床反応に対応するかの理解が進んできていることを反映している。標的化療法の有効性の予測における難点は、経路の調節解除の原因となる機構(例えば、活性化型の変異、増幅)の全体的な知識が限定的であることによるものと考えられる。腫瘍治療のための前臨床トランスレーショナル研究調査は、どの腫瘍型および遺伝子型が処置の恩恵を最も受け易いかを決定することに焦点を合わせている。選択された患者集団の処理は、治療の可能性を最大にするのに役立ち得る。腫瘍モデルの前臨床細胞反応プロファイリングが新規癌治療開発の土台となっている。インビトロ腫瘍モデルのコホートを用いて臨床的有効性を予測しようとする努力が成功を収めている(例えば、EGFR阻害剤はEGFR変異を有する腫瘍で選択的に有用である)。したがって、多様な腫瘍に由来する細胞株の拡張的パネルで「来る人全員(all comers)」の有効性試験を要約することができ、これにより、どの組織構造および特異的腫瘍遺伝子型が最も処置の恩恵を受け易いかが特定される。臨床状況で恩恵を最も受け易い患者を特定するために多くの特異的分子マーカーが現在用いられている。
EZH2(enhancer of zeste homolog 2、ヒトEZH2遺伝子:Cardoso, C, et al、 European J of Human Genetics, Vol. 8, No. 3 Pages 174-180, 2000)は、ヒストンH3のリジン27をトリメチル化する(H3K27me3)ことにより標的遺伝子の発現を抑制するように機能するポリコーム抑制複合体2(PRC2)の触媒サブユニットである。ヒストンH3は、真核生物細胞中のクロマチン構造に関わる5個の主要なヒストンタンパク質の一つである。ヒストンは主要な球状ドメインおよび長いN末端テールを特徴とし、ヌクレオソームの構造、すなわち「数珠玉(beads-on-a-string)」構造に関与する。ヒストンタンパク質は高度に翻訳後修飾を受けるが、ヒストンH3が5個のヒストンの中で最も広く修飾される。単独の「ヒストンH3」という用語は、配列バリアント間または修飾状態を区別しない点で意図的に曖昧にしている。ヒストンH3は新興のエピジェネティクス分野で重要なタンパク質であり、その配列バリアントおよび可変な修飾状態は遺伝子の動的なおよび長期間の制御に関与していると考えられている。
癌の処置に有用なEZH2阻害剤が、引用することにより本明細書の開示の範囲とされる国際出願第PCT/US2011/035336号、同第PCT/US2011/035340号、および同第PCT/US2011/035344号に報告されている。これらの化合物に対してより応答し易い遺伝子型を同定することが望ましい。
本発明は、癌の処置(治療)が必要なヒトにおける癌の処置(治療)方法であって、
前記ヒトのサンプル中の以下の少なくとも一つを決定する工程:
a.前記ヒトのサンプル中のEZH2のアラニン677(A677)残基における変異の有無、または
b.EZH2のチロシン641(Y641)残基における変異の有無、または
c.対照と比較したH3K27me3レベルの増加の有無、および
前記A677変異、Y641変異、またはH3K27me3レベルの増加の少なくとも一つが前記サンプル中に存在する場合、有効量のEZH2阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩を前記ヒトに投与する工程
を含んでなる方法を提供する。
前記ヒトのサンプル中の以下の少なくとも一つを決定する工程:
a.前記ヒトのサンプル中のEZH2のアラニン677(A677)残基における変異の有無、または
b.EZH2のチロシン641(Y641)残基における変異の有無、または
c.対照と比較したH3K27me3レベルの増加の有無、および
前記A677変異、Y641変異、またはH3K27me3レベルの増加の少なくとも一つが前記サンプル中に存在する場合、有効量のEZH2阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩を前記ヒトに投与する工程
を含んでなる方法を提供する。
近年のゲノムワイドなシークエンシング研究により、非ホジキンリンパ腫においてしばしば変化している、とりわけEZH2、MLL2、MEF2B、CREBBP、およびTP53を含む複数の遺伝子が明らかとなった(1〜3)。これらの遺伝子の多くは、直接的または補助因子のリクルートを介して間接的に、ヒストンのアミノ末端テール上で観察される一連の翻訳後修飾を仲介している。更に、同様な実験により、これらおよび他のエピジェネティックな因子が膀胱の移行上皮癌(例えば、UTX、ARID1A、MLL、MLL3)、頭頸部扁平上皮癌(例えば、EZH2、MLL2)、および骨髄性悪性腫瘍(例えば、IDH1/2、TET2、DNMT3A、EZH2)(4〜6)にも関連付けられている(4〜6)。転写因子およびヒストン修飾遺伝子に影響を与える遺伝的変化の多いことは、腫瘍形成において適切な転写調節を維持することの重要性を示している。
EZH2遺伝子は、EED、SUZ12、RbAp48、およびAEBP2と共にポリコーム抑制複合体2(PRC2)を形成するSETドメイン含有リジンメチルトランスフェラーゼをコードする(7、8)。EZH2は、ジまたはトリメチル化状態で存在する時に一般的に転写抑制に関連するヒストンH3リジン27(H3K27)残基のメチル化を担う(7〜9)。EZH2は、プロB細胞で高度に発現しており、細胞がプレB細胞、未熟B細胞、再循環B細胞へと進行するにつれて発現が連続的に低下する(10)。EZH2の遺伝的不活性化はプロB細胞段階の細胞を蓄積させることから、EZH2発現は骨髄中におけるプロB細胞からプレB細胞および未熟B細胞への進行に必要である(10)。しかし、プロB細胞段階の後にEZH2を不活性化した場合、その後の成熟工程が妨げられないことから、EZH2はB細胞分化の初期に機能することが示唆される(10)。実際、複数のグループが、造血幹細胞および前駆細胞の維持にEZH2が重要な役割を果たすことを示している(11、12)。特に、造血幹細胞(HSC)中でのEZH2過剰発現は累代移植モデルにおいて連続的自己複製能を生じさせることから、EZH2が再増殖能に寄与し、複製ストレスへの細胞の抵抗を助けることが示唆される(11)。
EZH2はほとんどの固形腫瘍型でしばしば増幅および/または過剰発現される(13)が、これはリンパ腫の場合には当てはまらないようであり、これはおそらく、正常な増殖性B細胞におけるEZH2の高い基礎発現によると考えられる。その代わり、EZH2は胚中心B細胞(GCB)びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)の22%および濾胞性リンパ腫(FL)の7%でチロシン641(Y641)残基に再発性変異を有することが報告されている(3)。最初は機能喪失型変異であるとして報告された(3)が、その後の生化学的研究により、このY641変異EZH2について新規な機能獲得活性が示された(14、15)。野生型EZH2は非メチル化およびモノメチル化H3K27基質に強力な選好性を示すが、リンパ腫で観察されたY641 EZH2変異体(Y641F/N/S/H)は、ジメチル化基質に対する顕著な活性の増大および非メチル化およびモノメチル化H3K27に対する活性の欠如を示す(14、15)。野生型および変異型EZH2タンパク質の協調的活性を介して、Y641変異リンパ腫においてH3K27のトリメチル化(H3K27me3)がグローバルに増加し、それに付随してモノおよびジメチル化H3K27が減少する(14)。
これらのEZH2 Y641変異は、多くの腫瘍におけるEZH2過剰発現と共に、H3K27me3レベルの調節解除がヒト腫瘍形成に重要であることを示唆している。実際、H3K27me3レベルは、腎細胞癌における無増悪生存期間(16)ならびに食道扁平上皮癌(17)における疾患の重症度および腫瘍分化不良と相関する。EZH2 Y641の変異に加えて、H3K27me3の調節解除の更なる機構として、miR−101レベルの低減(20、21)、異常なE2F活性(22)、および染色体増幅(23)等の複数の機構によるEZH2の過剰発現およびH3K27デメチラーゼUTXの不活性化変異(4、18、19)が含まれる。
100個を超える細胞株におけるグローバルなH3K27me3レベルの調査により、本発明者らは、いくつかのリンパ腫細胞においてH3K27me3の増加に関わるA677残基に新規なEZH2変異を同定した。この変異タンパク質の特徴解析により、Y641 EZH2変異同様、677位のアラニンがグリシンに交換される(A677G)とジメチル化H3K27基質との活性が増大することが明らかになった。しかし、重要なことに、この置換は野生型EZH2中に存在する重要な相互作用を維持しており、非、モノ、ジメチル化を含む全てのH3K27メチル化状態を効率的に利用する。この変異は、Y641 EZH2変異体の場合に必要な野生型EZH2との協調を必要とせずに細胞にH3K27メチル化を調節解除させるユニークなアプローチをもたらす。
本発明は、癌の処置が必要なヒトにおいて癌を処置する方法であって、
前記ヒトに由来するサンプル中で以下の少なくとも一つを決定する工程:
a.前記ヒトに由来するサンプル中のEZH2中のアラニン677(A677)残基における変異の有無、または
b.EZH2中のチロシン641(Y641)残基における変異の有無、または
c.対照と比較したH3K27me3レベルの増加の有無、および
前記サンプル中に前記A677変異、Y641変異、またはH3K27me3レベル増加の少なくとも一つが存在する場合に、有効量のEZH2阻害剤、例えば本明細書に記載の本発明の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を前記ヒトに投与する工程
を含んでなる方法を提供する。
前記ヒトに由来するサンプル中で以下の少なくとも一つを決定する工程:
a.前記ヒトに由来するサンプル中のEZH2中のアラニン677(A677)残基における変異の有無、または
b.EZH2中のチロシン641(Y641)残基における変異の有無、または
c.対照と比較したH3K27me3レベルの増加の有無、および
前記サンプル中に前記A677変異、Y641変異、またはH3K27me3レベル増加の少なくとも一つが存在する場合に、有効量のEZH2阻害剤、例えば本明細書に記載の本発明の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を前記ヒトに投与する工程
を含んでなる方法を提供する。
本明細書中の方法の特定の実施形態では、a、b、およびcの少なくとも二つ、例えばaおよびb、aおよびc、またはbおよびcが任意の順番で決定される。更なる実施形態では、a、b、およびcのそれぞれが決定され、A677変異、Y641変異、または対照と比較したH3K27me3レベル増加のいずれかが存在することが決定された場合に、本明細書に記載の本発明の化合物等のEZH2阻害剤が投与される。
更なる実施形態では、Y641変異の有無が決定され、Y641変異はY641F、Y641S、Y641H、Y641N、またはY641Cである。別の更なる実施形態では、A677変異の有無が決定され、A677変異はA677Gである。
更なる実施形態では、癌細胞または腫瘍細胞のグローバルなメチル化レベルの増加が決定される。別の実施形態では、H3K27メチル化レベルが決定される。別の実施形態では、H3K27me0、H3K27me1、H3K27me2、およびH3K27me3のレベルが決定され、H3K27me3レベルの増加によりEZH2阻害剤を用いた処置が示唆される。本パラグラフ中の本発明の更なる実施形態では、メチル化レベルを対照と比較し、対照と比較したメチル化の相対的増加により、EZH2阻害剤を用いた処置が示唆される。
EZH2中のY641またはA677に変異を検出する方法は当業者に周知であり、本明細書中の発明を実施するための形態および実施例に記載されている。対照と比較したメチル化レベルの増加(例えば、H3K27me3)を決定する方法は当該技術分野で周知であり、実施例に示されており、例えばヒストン3のトリメチル化リジン27に特異的な抗体の使用が挙げられる。対照は、当業者が選択するであろう任意のもの、例えば、ヒトに由来する対応する細胞、ヒトに由来する対応する組織、腫瘍と同じ起源であるが野生型EZH2を有することが知られている細胞、または同じ起源の非癌性細胞もしくは野生型EZH2を有する細胞で見られるものと相関する開発された対照であり得る。
本発明の別の実施形態では、サンプルは少なくとも一つの癌細胞を含んでなる。特定のそのような実施形態では、サンプルは生物学的サンプルである。
本明細書中の発明の実施形態のいずれかにおいて、癌はリンパ腫である。本発明の方法の更なる実施形態では、リンパ腫は、胚中心B細胞(GCB)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、脾臓辺縁帯リンパ腫(SMZL)、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症リンパ形質細胞性リンパ腫(WM)、濾胞性リンパ腫(FL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、および粘膜関連リンパ組織(MALT)の節外辺縁帯B細胞リンパ腫(Extra nodal marginal zone B-cell lymphoma of mucosa associated lymphoid tissue)からなる群から選択される。
本明細書の発明の方法の方法の実施形態では、A677変異および/またはY641変異は体細胞変異である。
癌を処置する方法の別の実施形態では、処置は、非処置のヒトと比較した奏効率の上昇および/または無増悪生存期間の延長を含んでなる。
本発明は、以下の工程を含んでなるヒトにおいて癌を処置する方法を提供する:(a)前記ヒトに由来する少なくとも一つの腫瘍細胞のH3K27me3レベルを検出する工程、および(b)前記少なくとも一つの腫瘍細胞のH3K27me3レベルが高い場合に、有効量のEZH2阻害剤またはまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物の形態で前記ヒトに投与する工程。
本発明は更に、以下の工程を含んでなるヒトにおいて癌を処置する方法に関する:(a)対象腫瘍に由来する生物学的サンプルに遺伝子タイピング技術を行って前記腫瘍がEZH2のチロシン641(Y641)残基に体細胞変異を有するか否かを決定する工程、および(b)前記変異の検出を、EZH2阻害剤が投与された時の奏効率の上昇および/または無増悪生存期間の延長の可能性増大と相関させる工程。
本発明は更に、以下の工程を含んでなるヒトにおいて癌を処置する方法に関する:(a)対象腫瘍に由来する生物学的サンプルに遺伝子タイピング技術を行って前記腫瘍がEZH2のチロシン641(Y641)残基に体細胞変異を有するか否かを決定する工程、および(b)前記腫瘍がEZH2のチロシン641残基に変異を有していた場合に、有効量のEZH2阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩を前記ヒトに投与する工程。
本発明は更に、ヒトにおいて癌を処置する方法であって、(a)対象腫瘍に由来する生物学的サンプルに遺伝子タイピング技術を行って前記腫瘍がEZH2のチロシン641(Y641)残基に体細胞変異を有するか否かを決定する工程、および(b)前記腫瘍がEZH2のチロシン641残基に変異を有していた場合に、有効量のEZH2阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩を前記ヒトに投与する工程を含んでなり、そのようなEZH2変異がY641N、Y641F、Y641S、Y641H、またはY641Cである、方法に関する。
本発明は更に、以下の工程を含んでなるヒトにおいて癌を処置する方法に関する:(a)対象腫瘍に由来する生物学的サンプルに遺伝子タイピング技術を行って前記腫瘍がEZH2のA677残基に体細胞変異を有するか否かを決定する工程、および(b)前記変異の検出を、EZH2阻害剤が投与された時の奏効率の上昇および/または無増悪生存期間の延長の可能性増大と相関させる工程。
本発明は更に、以下の工程を含んでなるヒトにおいて癌を処置する方法に関する:(a)対象腫瘍に由来する生物学的サンプルに遺伝子タイピング技術を行って前記腫瘍がEZH2のA677残基に体細胞変異を有するか否かを決定する工程、および(b)前記腫瘍がEZH2のA677残基に変異を有していた場合に、有効量のEZH2阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩を前記ヒトに投与する工程。
本発明は更に、ヒトにおいて癌を処置する方法にであって、(a)対象腫瘍に由来する生物学的サンプルに遺伝子タイピング技術を行って前記腫瘍がEZH2のA677残基に体細胞変異を有するか否かを決定する工程、および(b)前記腫瘍がEZH2のA677残基に変異を有していた場合に、有効量のEZH2阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩を前記ヒトに投与する工程を含んでなり、そのようなEZH2変異がA677Gである、方法に関する。
定義
「野生型」という用語は、当該技術分野で理解されるように、遺伝的改変のない天然集団で生じるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を指す。また、当該技術分野で理解されるように、「バリアント」には、野生型のポリペプチドまたはポリヌクレオチド中に見られる対応するアミノ酸または核酸と比較してそれぞれアミノ酸または核酸に少なくとも一つの改変を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列が含まれる。バリアントという用語には、最も多く見られる(野生型)核酸鎖と比較して核酸鎖の配列中に一塩基対の違いがある一塩基多型(SNP)が含まれる。
「野生型」という用語は、当該技術分野で理解されるように、遺伝的改変のない天然集団で生じるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を指す。また、当該技術分野で理解されるように、「バリアント」には、野生型のポリペプチドまたはポリヌクレオチド中に見られる対応するアミノ酸または核酸と比較してそれぞれアミノ酸または核酸に少なくとも一つの改変を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列が含まれる。バリアントという用語には、最も多く見られる(野生型)核酸鎖と比較して核酸鎖の配列中に一塩基対の違いがある一塩基多型(SNP)が含まれる。
本発明において、「遺伝的改変」または「遺伝的に改変された」またはその文法的バリエーションは、限定されるものではないが、DNA配列中への1または複数の塩基のあらゆる抑制、置換、増幅、欠失、および/または挿入を指す。また、本発明において、「遺伝的に改変された」とは、それぞれ核酸またはアミノ酸の少なくとも一つの欠失、置換、または抑制を有するポリペプチドをコードする遺伝子またはポリペプチドを指すこともある。遺伝的バリアントおよび/またはSNPは公知の方法により確認することができる。例えば、野生型またはSNPはDNAの増幅およびシークエンシング技術、DNAおよびRNAの検出技術、例えば、限定されるものではないが、それぞれノーザンおよびサザンブロット、ならびに/または種々のバイオチップおよびアレイ技術により同定することができる。WTおよび変異ポリペプチドは種々の技術により検出することができ、そのような技術としては、限定されるものではないが、ELISAおよびウェスタンブロット等の免疫診断技術が含まれる。本発明において、対立遺伝子または多型の検出プロセスは、限定されるものではないが、血清学的および遺伝学的方法を含む。検出される対立遺伝子または多型は、個体の表現型への影響に機能的に関与し得、あるいは機能的多型/対立遺伝子と連鎖不平衡な対立遺伝子または多型であり得る。当業者に明らかであるように、多型/対立遺伝子は、対象のゲノムDNA中に見出されるが、この領域から転写または翻訳されたRNA、cDNA、またはタンパク質の配列からも検出可能であり得る。
遺伝学において周知なように、同じ遺伝子について異なる供給源から得られたヌクレオチドおよび関連アミノ酸配列はナンバリングスキームおよび正確な配列の両方において異なり得る。そのような差異は、ナンバリングスキーム、遺伝子内の固有の配列のばらつき、および/またはシークエンシングエラーによるものであり得る。したがって、本明細書中における数字による特定の多型部位への言及は、それらの記述に異なるナンバリング/命名法スキームが用いられたとしても、遺伝子内の配列および位置の対応する多型部位を含むことが当業者には理解されよう。
本発明において、少なくとも一つのポリペプチドまたは少なくとも一つのポリペプチドをコードする遺伝子中における変異または遺伝子の多型対立遺伝子についての対象(またはDNA等のサンプル)の「遺伝子タイピング」とは、どの変異した対立遺伝子型または多型の形態の遺伝子または遺伝子発現産物(例えば、hnRNA、mRNA、またはタンパク質)が対象(またはサンプル)中に存在するか、または存在しないことを検出することを意味する。そのような遺伝子から発現された関連RNAまたはタンパク質も変異体または多型体バリエーションの検出に用いることができる。当該技術分野で周知のように、個体は特定の対立遺伝子についてヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。3種類以上の対立遺伝子形態が存在し得るので、4種類以上の可能な遺伝子タイプがあり得る。本発明において、対立遺伝子は、他の可能な対立遺伝子バリアントが除外された時に「検出」され得、例えば、特定の核酸位置がアデニン(A)、チミン(O)、またはシトシン(C)のいずれでもないことが判明した場合、その位置にグアニン(G)が存在すると結論付けることができる(すなわち、対象中でGが「検出」または「診断」される)。配列のバリエーションは直接的(例えばシークエンシングにより)または間接的(例えば、制限断片長の多型分析、または既知配列のプローブのハイブリダイゼーションの検出、または参照鎖のコンホメーション多型)にまたは他の公知の方法により検出することができる。
本発明において、集団の「遺伝的サブセット」は、少なくとも一つの体細胞変異を有する特定の遺伝子型または腫瘍を有する集団のメンバーからなる。二対立遺伝子多型の場合、集団は潜在的に三つのサブセット、すなわち対立遺伝子1のホモ接合型(1,1)、ヘテロ接合型(1,2)、および対立遺伝子2のホモ接合型(2,2)に分けることができる。対象の「集団」は種々の基準を用いて定義され得る。
本発明において、癌の処置が必要なヒトは、遺伝子タイピングに基づいて特定の表現型応答の「素因を有する」または「リスクが高い」ヒトであり得、標的多型座の遺伝子型が異なる個体よりその表現型を示し易い。表現型応答が複数の対立多型に基づくか、2以上の遺伝子の遺伝子タイピングに基づく場合、複数の可能な遺伝子型間で相対的リスクが異なり得る。
あるいは、癌の処置が必要なヒトは体細胞変異のある腫瘍または癌細胞を有し得、遺伝子タイピングまたは他の変異検出法が行われ得る。
本発明において、処置に対する「応答(反応)」およびその文法的バリエーションは、限定されるものではないが、患者が薬物療法を受けた後の患者の臨床状態の改善を含む。応答は、処置の開始後に患者の状態が悪化しないことを意味することもある。応答は、疾患または障害の特定の徴候の測定によって定義することもできる。癌に関して、応答とは、限定されるものではないが、患者における腫瘍および/または腫瘍細胞のサイズおよびまたは数の減少を意味し得る。また、応答は、他のエンドポイント、例えば患者における前腫瘍細胞(pre-tumorous cell)の数の減少または低下によって定義することもできる。
「遺伝子検査」(遺伝子スクリーニングとも呼ばれる)は、本明細書中で使用されるように、対象の遺伝子型を決定するための、対象に由来する生物学的サンプルの検査を指し、対象の遺伝子が特定の表現型を生じさせるまたはその表現型へのなり易さを増大させる(またはその表現型を生じさせる、もしくはその表現型へのなり易さを増大させる対立遺伝子と連鎖不平衡である)対立遺伝子を含んでなるか否かを判定するために用いられ得る。
1または複数の変異を検査または判定するためのサンプル、例えば生物学的サンプルは、タンパク質、ヌクレオチド、細胞のブレブ(bleb)または構成要素、血清、細胞、血液、血液成分、尿、および唾液の群から選択され得る。変異の検査は当該技術分野で公知のおよび/または本明細書に記載の複数の技術により行うことができる。
遺伝子、PCR産物、またはその断片もしくは一部を含む任意の核酸の配列は、当該技術分野で公知の任意の方法(例えば、化学的シークエンシングまたは酵素的シークエンシング)によりシークエンシングされ得る。DNAの「化学的シークエンシング」とは、個々の塩基特異的反応を用いてDNAをランダムに切断するMaxam and Gilbert (1977) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560)に記載の方法などの方法を意味し得る。DNAの「酵素的シークエンシング」とは、Sanger (Sanger, et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463)に記載の方法などの方法を意味し得る。
シークエンシング技術を含む従来の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術は当業者に周知である。そのような技術は文献中で十分に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (本明細書中では"Sambrook, et al., 1989")、 DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985)、 Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984)、 Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985))、 Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984))、 Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1986))、 Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986))、 B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)、 F. M. Ausubel, et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994参照。
ペプチド核酸(PNA)アフィニティーアッセイは従来のハイブリダイゼーションアッセイに由来する(Nielsen et al., Science 254:1497-1500 (1991)、 Egholm et al., J. Am. Chem. Soc. 114:1895-1897 (1992)、 James et al., Protein Science 3:1347-1350 (1994))。PNAは、ワトソン・クリック塩基対形成規則に従う構造的DNA模倣物であり、標準的DNAハイブリダイゼーションアッセイで用いられる。PNA/DNAミスマッチはDNA/DNAミスマッチより不安定であり、相補的PNA/DNA鎖は相補的DNA/DNA鎖より強力な結合を形成するので、PNAはハイブリダイゼーションアッセイでより大きな特異性を示す。
DNAマイクロアレイは、遺伝的変動(variation)および多型を検出するために開発された(Taton et al., Science 289:1757-60, 2000、 Lockhart et al., Nature 405:827-836 (2000)、 Gerhold et al., Trends in Biochemical Sciences 24:168-73 (1999)、 Wallace, R. W., Molecular Medicine Today 3:384-89 (1997)、 Blanchard and Hood, Nature Biotechnology 149:1649 (1996))。DNAマイクロアレイは、高速ロボット工学によりガラスまたはナイロン基体上に作製され、既知のアイデンティティーのDNA断片(「プローブ」)を含む。マイクロアレイは、従来の塩基対形成規則に基づく既知および未知のDNA断片(「標的」)のマッチングに用いられる。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、交換可能に用いられており、本明細書中では、天然タンパク質、断片、ペプチド、またはポリペプチド配列のアナログを指す一般的な用語として用いられる。したがって、天然タンパク質、断片、およびアナログはポリペプチド属の種である。
ポリペプチド配列中の変異の文脈における「X番号(#)Y」という用語法は当該技術分野で認識されており、「番号(#)」は、ポリペプチドのアミノ酸番号でで表した変異の位置を示し、「X」は、野生型アミノ酸配列においてその位置に見られるアミノ酸を示し、「Y」は、その位置の変異アミノ酸を示す。例えば、K−rasポリペプチドに関して「G12S」という表記は、野生型K−rasのアミノ酸番号12にグリシンがあり、変異K−ras配列中ではグリシンがセリンで置換されていることを示している。
ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする遺伝子中の「変異」およびその文法的バリエーションは、1または複数の対立遺伝子バリアント、スプライスバリアント、誘導バリアント、置換バリアント、欠失バリアント、および/または挿入バリアント、融合ポリペプチド、オルソログ、および/または種間ホモログを有するポリペプチドまたはポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。例えば、EZH2の少なくとも一つの変異には、細胞中で生産されるEZH2タンパク質の少なくとも一つについて、ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする遺伝子の配列の一部または全部が細胞中で発現されないまたは存在しないEZH2が含まれる。例えば、EZH2タンパク質は切断型で細胞により生産され得、切断型の配列は、その切断体の配列全体にわたって野生型であってよい。欠失とは、遺伝子または遺伝子にコードされるタンパク質の全部または一部が存在しないことを意味し得る。EZH2変異は更に、ポリヌクレオチド中の一塩基における変異または1アミノ酸置換を意味し得る。更に、細胞中で発現されるまたは細胞にコードされるタンパク質のいくつかが、例えば1アミノ酸で、変異しており、一方、同じ細胞中で生産される同じタンパク質の他のコピーが野生型であってもよい。
変異は、当該技術分野で周知の複数の方法によりポリヌクレオチドまたは翻訳されたタンパク質中に検出され得る。これらの方法としては、限定されるものではないが、シークエンシング、RT−PCR、およびin situハイブリダイゼーション、例えば蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)、抗体検出、タンパク質分解シークエンシング等が含まれる。メチル化状態等のエピジェネティックな変化によっても、変異および/またはタンパク質をコードする対応するポリヌクレオチドからのタンパク質の一部または全部の発現の欠如が生じ得る。
本発明において、「遺伝的異常」とは、対象の細胞の正常な天然核酸内容物との比較による欠失、置換、付加、転位、増幅等を意味する。本発明において、「EZH2タンパク質をコードする遺伝子」とは、任意のEZH2タンパク質をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドの任意の部分を意味する。この用語の意味には、EZH2をコードするエキソンが含まれる。EZH2タンパク質をコードする遺伝子としては、限定されるものではないが、EZH2の一部または全部をコードする遺伝子が含まれる。
本明細書中で言及される「ポリヌクレオチド」という用語は、長さが少なくとも10塩基のヌクレオチドの重合体形態を意味し、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾された形態のいずれであってもよい。この用語は一本鎖および二本鎖の形態のDNAを含む。
本明細書中で言及される「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然および非天然のオリゴヌクレオチド結合により連結された、天然および修飾ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般的に長さが200塩基以下のポリヌクレオチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、10〜60塩基長、最も好ましくは12、13、14、15、16、17、18、19、または20〜40塩基長である。オリゴヌクレオチドは例えば遺伝子変異体の構築に使用するためには二本鎖であり得るが、オリゴヌクレオチドは通常(例えばプローブ用に)一本鎖である。オリゴヌクレオチドはセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれでもあり得る。
オリゴヌクレオチドプローブまたはプローブとは、サイズが典型的には約8ヌクレオチドから数百ヌクレオチド長の核酸分子である。そのような分子は、典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的核酸配列にハイブリダイズさせることによりサンプル中の標的核酸配列を同定するために用いられる。ハイブリダイゼーション条件は上記で詳細に説明した。
PCRプライマーも核酸配列であるが、PCRプライマーは通常、ポリメラーゼ連鎖反応に用いられるかなり長さの短いオリゴヌクレオチドである。当業者は、標的配列からの配列情報を用いて、PCRプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを容易に設計および作製することができる(例えば、Sambrook et al.,(前述)またはGlick et al.(前述)参照)。
本発明において、「過剰発現された」、「過剰発現」、およびこれらの文法的バリエーションは、所与の細胞が正常細胞よりも特定のタンパク質を多く産生することを意味する。例えば、一部の腫瘍細胞は、正常胸部組織の細胞と比較して細胞表面にHer2またはErb2を過剰発現することが知られている。遺伝子導入実験により、HER2の過剰発現がNIH 3T3細胞を癌化させ、また、毒性マクロファージサイトカイン腫瘍壊死因子に対する抵抗性を上昇させることが示されている(Hudziak et al., "Amplified Expression of the HER2/ERBB2 Oncogene Induces Resistance to Tumor Necrosis Factor Alpha in NIH 3T3 Cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5102-5106 (1988))。特定の細胞におけるポリペプチドの発現レベルは、限定されるものではないが、細胞ゲノム中の種々の調節エレメントおよび/または非コード配列の変異、欠失、および/または置換に影響され得る。
本発明において、「処置(処理)」とは、障害に付随する1または複数の症状が有益に変化する任意の方法を意味する。したがって、この用語は、障害の症状もしくは副作用の治癒もしくは回復または障害の進行速度の低下を含む。
本発明において、「癌」、「新生物」、および「腫瘍」という用語は、交換可能に、単数形または複数形のいずれでも使用され、宿主生物にとって病的な細胞にする悪性形質転換を受けた細胞を指す。初代癌細胞(すなわち、悪性形質転換部位の近くから得られた細胞)は、よく確立された技術、特に組織検査により、非癌性細胞から容易に識別することができる。本明細書で用いられる癌細胞の定義は、初代癌細胞だけでなく、癌細胞祖先に由来するあらゆる細胞を含む。これには、転移した癌細胞、ならびに癌細胞に由来するインビトロ培養物および細胞株が含まれる。固形腫瘍として通常現れる癌の種類に言及する場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍とは、腫瘍塊に基づいて、例えばCATスキャン、磁気共鳴画像法、X線、超音波、もしくは触診等の方法により検出可能な腫瘍であり、且つ/または患者から得ることができるサンプル中における1もしくは複数の癌特異的抗原の発現により検出可能な腫瘍である。腫瘍は、造血器腫瘍、例えば血液細胞等の腫瘍であり得る。そのような腫瘍が原因の臨床状態の具体例としては、慢性骨髄性白血病または急性骨髄性白血病等の白血病、多発性骨髄腫等の骨髄腫、リンパ腫等が含まれる。
癌は、異常な数の芽細胞が存在するか、白血病、骨髄性悪性腫瘍、または骨髄異形成等の血液系の癌または異形成、例えば、限定されるものではないが、未分化急性骨髄性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、および巨核芽球性白血病として診断される任意の癌であり得る。一態様では、癌は骨髄性悪性腫瘍癌である。別の態様では、癌は白血病である。白血病は、急性リンパ球性白血病、急性非リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性(または骨髄球性)白血病(CML)、および慢性骨髄単球性白血病(CMML)であり得る。一実施形態では、ヒトは原因不明性骨髄様化生および/またはプアリスク脊髄形成異常(MDS)を有する。いくつかの態様では、癌は再発性または難治性である。
造血癌としては更に、リンパ節、脾臓、骨髄、末梢血液、および/または結節外部位に影響を与え得るリンパ性腫瘍が含まれる。リンパ癌としてはB細胞悪性腫瘍が含まれ、B細胞悪性腫瘍には、限定されるものではないが、B細胞非ホジキンリンパ腫(B−NHL)が含まれる。B−NHLは、無痛性(または低悪性度)、中悪性度(または侵襲性)、または高悪性度(非常に高い侵襲性)であり得る。無痛性B細胞リンパ腫は、濾胞性リンパ腫(FL)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、辺縁帯リンパ腫(MZL)、例えば結節性MZL、節外MZL、脾臓MZL、および有毛リンパ球を伴う脾臓MZL、リンパ形質細胞性リンパ腫(LPL)、および粘膜関連リンパ組織(MALTまたは節外辺縁帯)リンパ腫を含む。中悪性度のB−NHLには、白血病を伴うまたは伴わないマントル細胞リンパ腫(MCL)、びまん性大細胞リンパ腫(DLBCL)、濾胞性大細胞(またはグレード3もしくはグレード3B)リンパ腫、および縦隔原発リンパ腫(PML)が含まれる。高悪性度B−NHLには、バーキットリンパ腫(BL)、バーキット様リンパ腫、小型非切れ込み核細胞性リンパ腫(SNCCL)、およびリンパ芽球性リンパ腫が含まれる。その他のB−NHLとしては、免疫芽球性リンパ腫(または免疫細胞腫)、原発性滲出性リンパ腫、HIV関連(またはAIDS関連)リンパ腫、および移植後リンパ増殖性障害(PTLD)またはリンパ腫が含まれる。B細胞悪性腫瘍は更に、限定されるものではないが、慢性リンパ球性白血病(CLL)、前リンパ球性白血病(PLL)、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症(WM)、ヘアリーセル白血病(HCL)、大顆粒リンパ球性(LGL)白血病、急性リンパ性(またはリンパ球性もしくはリンパ芽球性)白血病、およびキャッスルマン病を含む。NHLは更に、T細胞非ホジキンリンパ腫(T−NHL)を含み得、T−NHLとしては、限定されるものではないが、T細胞非ホジキンリンパ腫−非特定型(NOS)、末梢性T細胞リンパ腫(PTCL)、未分化大細胞リンパ腫(ALCL)、血管免疫芽球性リンパ節症(angioimmunoblastic lymphoid disorder:AILD)、鼻腔ナチュラルキラー(nasal natural killer)(NK)細胞/T細胞リンパ腫、ガンマ/デルタリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、菌状息肉症、およびセザリー症候群が含まれる。
造血癌はまた、古典的ホジキンリンパ腫、結節硬化型ホジキンリンパ腫、混合細胞型ホジキンリンパ腫、リンパ球優位型(LP)ホジキンリンパ腫、結節性LPホジキンリンパ腫、およびリンパ球減少型ホジキンリンパ腫を含むホジキンリンパ腫(またはホジキン病)を含む。造血癌は更に、形質細胞の疾患または癌、例えば多発性骨髄腫(MM)、例えばくすぶり型MM、意義不明(未知、不明瞭)の単クローン性高ガンマグロブリン血症(MGUS)、形質細胞腫(骨、髄外)、リンパ形質細胞性リンパ腫(LPL)、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、形質細胞性白血病、および原発性アミロイドーシス(AL)を含む。造血癌としては更に、多型核の白血球(または好中球)、好塩基球、好酸球、樹状細胞、血小板、赤血球、およびナチュラルキラー細胞等の更なる造血細胞のその他の癌が含まれ得る。本明細書中で「造血細胞組織」として言及される造血細胞を含む組織は、骨髄、末梢血液、胸腺、および末梢リンパ組織、例えば脾臓、リンパ節、粘膜関連リンパ組織(例えば、消化管関連リンパ組織)、扁桃腺、パイエル板、および虫垂、ならびに他の粘膜、例えば気管支内層(bronchial lining)に関連するリンパ組織を含む。
いくつかの実施形態では、サンプルは、癌細胞、腫瘍細胞、細胞、血液、血液成分、尿、および唾液からなる群から選択される。
本発明の化合物
癌の処置を必要とするヒトにおける癌の処置方法の特定の実施形態では、EZH2阻害剤は、下記式IのEZH2阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩である:
癌の処置を必要とするヒトにおける癌の処置方法の特定の実施形態では、EZH2阻害剤は、下記式IのEZH2阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩である:
Wは、NまたはCR2であり、
XおよびZは、水素、(C1−C8)アルキル、(C2−C8)アルケニル、(C2−C8)アルキニル、非置換または置換の(C3−C8)シクロアルキル、非置換または置換の(C3−C8)シクロアルキル−(C1−C8)アルキルまたは−(C2−C8)アルケニル、非置換または置換の(C5−C8)シクロアルケニル、非置換または置換の(C5−C8)シクロアルケニル−(C1−C8)アルキルまたは−(C2−C8)アルケニル、(C6−C10)ビシクロアルキル、非置換または置換のヘテロシクロアルキル、非置換または置換のヘテロシクロアルキル−(C1−C8)アルキルまたは−(C2−C8)アルケニル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリール−(C1−C8)アルキルまたは−(C2−C8)アルケニル、非置換または置換のヘテロアリール、非置換または置換のヘテロアリール−(C1−C8)アルキルまたは−(C2−C8)アルケニル、ハロゲン、シアノ、−CORa、−CO2Ra、−CONRaRb、−CONRaNRaRb、−SRa、−SORa、−SO2Ra、−SO2NRaRb、ニトロ、−NRaRb、−NRaC(O)Rb、−NRaC(O)NRaRb、−NRaC(O)ORa、−NRaSO2Rb、−NRaSO2NRaRb、−NRaNRaRb、−NRaNRaC(O)Rb、−NRaNRaC(O)NRaRb、−NRaNRaC(O)ORa、−ORa、−OC(O)Ra、および−OC(O)NRaRbからなる群からそれぞれ独立して選択され、
Yは、水素またはハロゲンであり、
R1は、(C1−C8)アルキル、(C2−C8)アルケニル、(C2−C8)アルキニル、非置換もしくは置換の(C3−C8)シクロアルキル、非置換もしくは置換の(C3−C8)シクロアルキル−(C1−C8)アルキルもしくは−(C2−C8)アルケニル、非置換もしくは置換の(C5−C8)シクロアルケニル、非置換もしくは置換の(C5−C8)シクロアルケニル−(C1−C8)アルキルもしくは−(C2−C8)アルケニル、非置換もしくは置換の(C6−C10)ビシクロアルキル、非置換もしくは置換のヘテロシクロアルキルもしくは−(C2−C8)アルケニル、非置換もしくは置換のヘテロシクロアルキル−(C1−C8)アルキル、非置換もしくは置換のアリール、非置換もしくは置換のアリール−(C1−C8)アルキルもしくは−(C2−C8)アルケニル、非置換もしくは置換のヘテロアリール、非置換もしくは置換のヘテロアリール−(C1−C8)アルキルもしくは−(C2−C8)アルケニル、−CORa、−CO2Ra、−CONRaRb、または−CONRaNRaRbであり、
R2は、存在する場合、水素、(C1−C8)アルキル、トリフルオロメチル、アルコキシ、またはハロゲンであり、前記(C1−C8)アルキルは、アミノおよび(C1−C3)アルキルアミノから選択される1〜2個の基で置換されていてよく、
R7は、水素、(C1−C3)アルキル、またはアルコキシであり、R3は、水素、(C1−C8)アルキル、シアノ、トリフルオロメチル、−NRaRb、またはハロゲンであり、
R6は、水素、ハロ、(C1−C8)アルキル、(C2−C8)アルケニル、−B(OH)2、置換または非置換の(C2−C8)アルキニル、非置換または置換の(C3−C8)シクロアルキル、非置換または置換の(C3−C8)シクロアルキル−(C1−C8)アルキル、非置換または置換の(C5−C8)シクロアルケニル、非置換または置換の(C5−C8)シクロアルケニル−(C1−C8)アルキル、(C6−C10)ビシクロアルキル、非置換または置換のヘテロシクロアルキル、非置換または置換のヘテロシクロアルキル−(C1−C8)アルキル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリール−(C1−C8)アルキル、非置換または置換のヘテロアリール、非置換または置換のヘテロアリール−(C1−C8)アルキル、シアノ、−CORa、−CO2Ra、−CONRaRb、−CONRaNRaRb、−SRa、−SORa、−SO2Ra、−SO2NRaRb、ニトロ、−NRaRb、−NRaC(O)Rb、−NRaC(O)NRaRb、−NRaC(O)ORa、−NRaSO2Rb、−NRaSO2NRaRb、−NRaNRaRb、−NRaNRaC(O)Rb、−NRaNRaC(O)NRaRb、−NRaNRaC(O)ORa、−ORa、−OC(O)Ra、および−OC(O)NRaRbからなる群から選択され、
ここで、(C1−C8)アルキル、(C2−C8)アルケニル、(C2−C8)アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ビシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール基はいずれも、−O(C1−C6)アルキル(Rc)1−2、−S(C1−C6)アルキル(Rc)1−2、−(C1−C6)アルキル(Rc)1−2、(C1−C8)アルキル−ヘテロシクロアルキル、(C3−C8)シクロアルキル−ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、(C1−C6)アルキル、(C3−C8)シクロアルキル、(C5−C8)シクロアルケニル、(C1−C6)ハロアルキル、シアノ、−CORa、−CO2Ra、−CONRaRb、−SRa、−SORa、−SO2Ra、−SO2NRaRb、ニトロ、−NRaRb、−NRaC(O)Rb、−NRaC(O)NRaRb、−NRaC(O)ORa、−NRaSO2Rb、−NRaSO2NRaRb、−ORa、−OC(O)Ra、−OC(O)NRaRb、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール(C1−C4)アルキル、およびヘテロアリール(C1−C4)アルキルからなる群から独立して選択される1、2、または3個の基で置換されていてよく、
ここで、前記アリール、ヘテロアリール、アリール(C1−C4)アルキル、またはヘテロアリール(C1−C4)アルキルのアリールまたはヘテロアリール部分は、ハロゲン、(C1−C6)アルキル、(C3−C8)シクロアルキル、(C5−C8)シクロアルケニル、(C1−C6)ハロアルキル、シアノ、−CORa、−CO2Ra、−CONRaRb、−SRa、−SORa、−SO2Ra、−SO2NRaRb、ニトロ、−NRaRb、−NRaC(O)Rb、−NRaC(O)NRaRb、−NRaC(O)ORa、−NRaSO2Rb、−NRaSO2NRaRb、−ORa、−OC(O)Ra、および−OC(O)NRaRbからなる群から独立して選択される1、2、または3個の基で置換されていてよく、
各Rcは、独立して(C1−C4)アルキルアミノ、−NRaSO2Rb、−SORa、−SO2Ra、−NRaC(O)ORa、−NRaRb、または−CO2Raであり、
RaおよびRbは、それぞれ独立して、水素、(C1−C8)アルキル、(C2−C8)アルケニル、(C2−C8)アルキニル、(C3−C8)シクロアルキル、(C5−C8)シクロアルケニル、(C6−C10)ビシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールであり、前記(C1−C8)アルキル、(C2−C8)アルケニル、(C2−C8)アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ビシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール基は、ハロゲン、ヒドロキシル、(C1−C4)アルコキシ、アミノ、(C1−C4)アルキルアミノ、((C1−C4)アルキル)((C1−C4)アルキル)アミノ、−CO2H、−CO2(C1−C4)アルキル、−CONH2、−CONH(C1−C4)アルキル、−CON((C1−C4)アルキル)((C1−C4)アルキル)、−SO2(C1−C4)アルキル、−SO2NH2、−SO2NH(C1−C4)アルキル、または−SO2N((C1−C4)アルキル)((C1−C4)アルキル)から独立して選択される1、2、または3個の基で置換されていてよく
あるいは、RaおよびRbは、それらが結合している窒素と一緒に、酸素、窒素、および硫黄から選択される更なるヘテロ原子を含んでいてよい5〜8員飽和または不飽和環を表し、前記環は、(C1−C4)アルキル、(C1−C4)ハロアルキル、アミノ、(C1−C4)アルキルアミノ、((C1−C4)アルキル)((C1−C4)アルキル)アミノ、ヒドロキシル、オキソ、(C1−C4)アルコキシ、および(C1−C4)アルコキシ(C1−C4)アルキルから独立して選択される1、2、または3個の基で置換されていてよく、前記環は、(C3−C8)シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール環と縮合していてよく、
あるいは、RaおよびRbは、それらが結合している窒素と一緒に、(C3−C8)シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール環と縮合していてよい6〜10員架橋二環系を表す]。
式Iの化合物およびその製造方法は、その全体を引用することにより本明細書の開示の範囲とされる国際公開第2011/140324号に開示されている。
更なる実施形態では、EZH2阻害剤は、WがCR2である式(I)の化合物またはその薬学的に許容可能な塩である。
更に別の実施形態では、EZH2阻害剤は式Bで表される式Iの化合物またはその薬学的に許容可能な塩である:
式Bで表される化合物およびその製造方法が国際公開第2011/140324号(例えば、実施例270)に開示されている。
別の実施形態では、EZH2阻害剤は、式、1−(1−メチルエチル)−N−[(6−メチル−2−オキソ−4−プロピル−1,2−ジヒドロ−3−ピリジニル)メチル]−6−[6−(4−メチル−1−ピペラジニル)−3−ピリジニル]−1H−インダゾール−4−カルボキサミドで表される化合物Aである。
更なるEZH2阻害剤が当該技術分野で周知である。例えば、EZH2阻害剤は、それぞれの全体を引用することにより本明細書の開示の範囲とされる国際公開第2011/140324号、国際公開第2011/140325号、および国際公開第2012/075080号に開示されている。本明細書中の実施形態のいずれかで、EZH2阻害剤は、国際公開第2011/140324号、国際公開第2011/140325号、または国際公開第2012/075080号に開示されている化合物であり得る。
誤解のないように、特に断りのない限り、「置換」という用語は、1または複数の定義された基による置換を意味する。基が複数の代替的な基から選択され得る場合、選択される基は同じであっても異なってもよい。
「独立して」という用語は、複数の可能な置換基から二つ以上の基が選択される場合、それらの置換基が同じであっても異なってもよいことを意味する。
「有効量」とは、例えば研究者または臨床医が求める組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的反応を惹起する薬物または医薬品の量を意味する。更に、「治療有効量」という用語は、そのような量を投与されていない対応する対象と比較して、疾患、障害、もしくは副作用の向上された処置、治癒、防止、もしくは改善または疾患もしくは障害の進行速度の低下が達成される任意の量を意味する。この用語の範囲には、正常な生理機能を増強するのに有効な量も含まれる。
本発明において、「アルキル」という用語は、指定された数の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルを指す。したがって、例えば、本明細書中で使用されるように、「C1C8アルキル」という用語は、それぞれ少なくとも1個から8個までの炭素原子を有するアルキル基を指す。本発明に有用なそのような分岐鎖または直鎖アルキル基の例としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、イソブチル、n−ブチル、t−ブチル、n−ペンチル、イソペンチル、n−ヘキシル、n−ヘプチル、およびn−オクチル、ならびに後半の5個のノルマルアルカンの分岐アナログが含まれる。
本発明において、「アルコキシ」という用語は、上記アルキルの定義によれば−OCH3、−OCH2CH3、および−OC(CH3)3等を含む−O(C1C8アルキル)を意味する。
本発明において、「アルキルチオ」という用語は、上記アルキルの定義に則った−SCH3、−SCH2CH3等を含む−S(C1C8アルキル)を意味する。
「アシルオキシ」という用語は、上記アルキルの定義に則った−OC(O)C1C8アルキル等を意味する。
「アシルアミノ」とは、上記アルキルの定義に則ったN(H)C(O)C1C8アルキル等を意味する。
「アリールオキシ」とは、−O(アリール)、−O(置換アリール)、−O(ヘテロアリール)、または−O(置換ヘテロアリール)を意味する。
「アリールアミノ」とは、−NH(アリール)、−NH(置換アリール)、−NH(ヘテロアリール)、または−NH(置換ヘテロアリール)等を意味する。
「アルケニル」(または「アルケニレン」)という用語が用いられる場合、この用語は、指定された数の炭素原子および少なくとも1個から5個までの炭素−炭素二重結合を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。例としては、エテニル(またはエテニレン)およびプロペニル(またはプロペニレン)が含まれる。
「アルキニル」(または「アルキニレン」)という用語が用いられる場合、この用語は、指定された数の炭素原子および少なくとも1個から5個までの炭素−炭素三重結合を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。例としては、エチニル(またはエチニレン)およびプロピニル(またはプロピニレン)が含まれる。
「ハロアルキル」とは、1または複数のハロゲン置換基、好ましくは1〜6個の置換基で置換されたアルキル基基を指す。ハロアルキルはトリフルオロメチルを包含する。
「シクロアルキル」が用いられる場合、これは、指定された数の炭素原子を含む非芳香族飽和環状炭化水素環を指す。したがって、例えば、「C3−C8シクロアルキル」という用語は、3〜8個の炭素原子を有する非芳香族環状炭化水素環を指す。本発明において有用な「C3−C8シクロアルキル」基の例としては、限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが含まれる。
「C5C8シクロアルケニル」という用語は、指定された数の炭素原子および3個までの炭素−炭素二重結合を有する非芳香族単環炭素環式環を指す。「シクロアルケニル」は、例えばシクロペンテニルおよびシクロヘキセニルを包含する。
「C3C8ヘテロシクロアルキル」が用いられる場合、これは、O、S、およびNから独立して選択される1または複数のヘテロ原子置換を含み、指定された数の環原子を含む、飽和または1もしくは複数の程度の不飽和の非芳香族複素環式環を指す。そのような環は、1または複数の他の「複素環式」環またはシクロアルキル環と縮合していてもよい。例は後述する。
「アリール」とは、6〜14個の炭素原子を有し、ヒュッケル則に従う少なくとも一つの芳香族環を有し、置換されていてもよい、単環式または多炭素環式の非縮合または縮合基を指す。アリール基の例としては、以下で更に説明するように、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル等が挙げられる。
「ヘテロアリール」とは、少なくとも一つの環が、ヒュッケル則に従い、指定された数の環原子を有し、その環がN、O、およびSから独立して選択される少なくとも一つのヘテロ原子を含む、置換されていてよい多炭素環式縮合環系または芳香族単環式環を意味する。「ヘテロアリール」基の例は本明細書中で以下に記載されている。
「されてもよい(optionally)」という用語は、その後に記載されている事象が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、起こる事象および起こらない事象の両方を包含する。
本明細書において、「薬学的に許容可能な塩」という用語は、対象化合物の所望の生物学的活性を保持しており、望ましくない毒物学的影響が最小限である塩を指す。これらの薬学的に許容可能な塩は、化合物の最終的な単離および精製中にその場で(in situ)、あるいは、その遊離酸または遊離塩基の形態の精製化合物をそれぞれ好適な塩基または酸と別個に反応させることにより製造され得る。
医薬製剤
本発明の化合物ならびにその薬学的に許容可能な塩および溶媒和物は原体(raw chemical)として投与することも可能であるが、活性成分を医薬組成物として与えることも可能である。したがって、本発明の実施形態は更に、治療有効量の式(I)の化合物、化合物A、または化合物B、および1または複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または補形剤を含む医薬組成物を提供する。担体、希釈剤、または補形剤は、製剤のその他の成分と適合性であるという意味で許容可能でなければならず、そのレシピエントに有害であってはならない。本発明の別の態様によれば更に、式I、化合物A、または化合物Bの化合物を1または複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または補形剤と混合することを含む医薬製剤の製造プロセスが提供される。
本発明の化合物ならびにその薬学的に許容可能な塩および溶媒和物は原体(raw chemical)として投与することも可能であるが、活性成分を医薬組成物として与えることも可能である。したがって、本発明の実施形態は更に、治療有効量の式(I)の化合物、化合物A、または化合物B、および1または複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または補形剤を含む医薬組成物を提供する。担体、希釈剤、または補形剤は、製剤のその他の成分と適合性であるという意味で許容可能でなければならず、そのレシピエントに有害であってはならない。本発明の別の態様によれば更に、式I、化合物A、または化合物Bの化合物を1または複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または補形剤と混合することを含む医薬製剤の製造プロセスが提供される。
医薬製剤は、単位用量当たり所定の量の活性成分を含む単位用量形態(unit dose form)で与えられ得る。そのような単位は、処置される状態、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、および状態に応じて、例えば0.5mg〜1g、好ましくは1mg〜800mgの式(I)の化合物を含み得る。好ましい単位投与量製剤(unit dosage formulation)は、前述したような一日用量またはサブ用量、またはその適切な分割量(fraction)の活性成分を含むものである。更に、そのような医薬製剤は、当該技術分野、例えば薬学分野の熟練者に周知の方法のいずれかによって製造され得る。
医薬製剤は、任意の適切な経路による、例えば経口(頬側または舌下を含む)、直腸、経鼻、局所、(頬側、舌下、または経皮を含む)、腟内、または非経口(皮下、筋肉内、静脈内、または皮内を含む)経路による投与に適応し得る。そのような製剤は、薬学分野で公知の任意の方法で、例えば活性成分を担体または補形剤と会合させることにより製造され得る。
経口投与に適応する医薬製剤は、個別の単位、例えばカプセル剤または錠剤、散剤または顆粒剤、水性または非水性液体中の、液剤または懸濁剤、食用の泡(edible foam)またはホイップ、水中油滴型液体エマルションまたは油中水滴型液体エマルションであり得る。
例えば、錠剤またはカプセル剤の形態で経口投与するために、活性薬物成分をエタノール、グリセロール、水等の薬学的に許容可能な経口非毒性不活性担体と組み合わせることができる。散剤は、化合物を好適な微細サイズに粉砕し、同様に粉砕した、例えばデンプンまたはマンニトール等の食用炭水化物等の薬学的担体と混合することにより製造される。香味剤、保存剤、分散剤、および着色剤も存在してよい。
カプセル剤は、上記のように粉末混合物を調製し、形成されたゼラチン被覆に充填することにより製造される。滑剤および滑沢剤、例えばコロイダルシリカ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、または固体ポリエチレングリコールを充填作業の前に粉末混合物に添加することができる。崩壊剤または可溶化剤、例えば寒天−寒天、炭酸カルシウムまたは炭酸ナトリウムを添加して、カプセル剤が摂取された時の医薬の利用能を改善することもできる。
更に、所望であれば、または必要であれば、混合物中に好適な結合剤、滑沢剤、崩壊剤、および着色剤を組み込むこともできる。好適な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、天然糖、例えばグルコースまたはベータ−ラクトース、コーン甘味料、天然および合成のゴム、例えばアカシア、トラガント、またはアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス等が含まれる。これらの剤形で使用される滑沢剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が含まれる。崩壊剤としては、限定されるものではないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等が含まれる。錠剤は、例えば粉末混合物を調製し、造粒またはスラッギング(slugging)し、滑沢剤および崩壊剤を加え、錠剤へとプレスすることにより製剤化される。粉末混合物は、好適に粉砕された化合物を前述の希釈剤または基剤ならびに任意で結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩(aliginate)、ゼラチン、またはポリビニルピロリドン、溶解遅延剤、例えばパラフィン、吸収促進剤、例えば第四級塩および/または吸収剤、例えばベントナイト、カオリン、またはリン酸二カルシウムと混合することにより調製される。粉末混合物は、結合剤、例えばシロップ、デンプン糊、アカディア粘液、またはセルロース系もしくは高分子系の材料の溶液で湿らせて篩に押し通すことで造粒することができる。造粒する代わりに、粉末混合物を打錠機に通し、不完全形成スラグを得て顆粒に砕いてもよい。打錠用ダイへの付着を防ぐために、ステアリン酸、ステアリン酸塩、タルク、またはミネラル油を加えることにより顆粒を滑らかにしてもよい。次いで、滑らかにした混合物を打錠する。本発明の化合物はまた、自由に流動することができる不活性担体と組み合わせ、造粒またはスラグ化工程を介さずに直接打錠してもよい。セラックのシーリングコート、糖または高分子材料のコーティング、およびワックスの光沢コーティング(polish coating)からなる透明または不透明な保護コーティングを設けてもよい。異なる単位投与量を識別するために、これらのコーティングに色素を添加してもよい。
内服用の流体、例えば液剤、シロップ剤、およびエリキシル剤は、所与の量が所定の量の化合物を含むように投与単位形態(dosage unit form)で調製することができる。シロップ剤は、好適に香味付けした水溶液に化合物を溶解することで調製することができ、エリキシル剤は、非毒性アルコール溶媒を用いて調製される。懸濁剤は、化合物を非毒性溶媒中に分散させることで製剤化することができる。可溶化剤および乳化剤、例えばエトキシ化イソステアリルアルコールおよびポリオキシエチレンソルビトールエーテル、保存剤、香味添加剤、例えばペパーミントオイル、天然甘味剤、サッカリン、またはその他の人工甘味剤等も添加することができる。
適切な場合、経口投与用の投与単位製剤(dosage unit formulation)をマイクロカプセル化することができる。製剤はまた、例えば微粒子材料をポリマー、ワックス等の中にコーティングするか埋め込むことにより、放出が延長または持続されるように調製することができる。
投与単位製剤は、当業者が提供することができるi.v.送達用の形態であってもよい。
投与単位形態(例えばi.v.送達用)は、リポソーム送達システムの形態、例えば小さな単層リポソーム(small unilamellar vesicle)、大きな単層リポソーム(large unilamellar vesicle)、および多重層リポソーム(multilamellar vesicle)であってもよい。リポソームは、種々のリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリン、または当業者に公知のその他の形態から形成され得る。
上記で具体的に述べた成分に加えて、製剤は、問題の製剤の種類に関連してこの分野で通常用いられるその他の薬剤を含み得る(例えば経口投与に適したものは着香料を含み得る)と理解するべきである。
式(I)の化合物またはその薬学的に許容可能な塩の治療有効量は複数の要因、例えば、動物の年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およびその重症度、製剤の性質、ならびに投与経路に依存し、最終的には主治医または獣医の裁量による。しかし、本明細書に記載したような癌状態を処置するための式(I)の化合物またはその塩の有効量は通常、レシピエント(哺乳動物)の体重1kg当たり1日0.1〜100mgであり、より一般的には体重1kg当たり1日1〜12mgである。したがって、70kgの成体の哺乳動物では、1日当たりの実際の量は通常、70〜840mgであり、この量は1日1回用量で与えられてもよく、より一般的には1日の総用量が同じになるように1日複数回(例えば2、3、4、5、または6回)のサブ用量で与えられてもよい。その塩または溶媒和物の有効量は、式(I)の化合物自体の有効量に対する割合として決定され得る。同様な投与量が上記で言及したその他の状態の処置にも適切であると考えられる。
本発明のこれらの態様に係る投与または処方される化合物の量は、複数の要因、例えば、患者の年齢および体重、処置が必要な正確な状態、状態の重症度、製剤の性質、投与経路等に依存する。最終的に、この量は主治医の裁量による。
組合せおよび更なる抗新生物剤
特定の実施形態では、本発明の方法は1または複数の更なる抗新生物剤を投与することを更に含んでなる。
特定の実施形態では、本発明の方法は1または複数の更なる抗新生物剤を投与することを更に含んでなる。
EZH2阻害剤、限定されるものではないが例えば式I、化合物A、または化合物Bが癌の処置のために投与される場合、「共投与する」という用語およびその派生形は、本明細書中で使用されるように、本明細書に記載のEZH2阻害化合物と、化学療法および放射線照射処置等の癌の処置において有用であることが知られている更なる活性成分との同時投与または任意の様式による別個の逐次投与を意味する。更なる活性成分という用語は、本明細書中で使用されるように、癌の処置を必要とする患者に投与された時の有益な特性が知られているまたは実証されているあらゆる化合物または治療薬剤を含む。投与が同時でない場合、化合物は互いに近い時間で投与される。更に、化合物が同じ製剤で投与されるか否かは問題ではなく、例えば、一つの化合物が局所または静脈内(i.v.)投与され、別の化合物が経口投与であってもよい。
典型的には、処置されている感受性の腫瘍または癌(例えばリンパ腫)に対する活性を有する任意の抗新生物剤が本発明における癌の処置において共投与され得る。そのような薬剤の例はCancer Principles and Practice f Oncology by V.T. Devita and S. Hellman (editors), 6th edition (February 15, 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishersに見つけることができる。当業者であれば、関係する薬物および癌の具体的性質に基づいて、どの薬剤の組合せが有用であるかを知ることができる。本発明において有用な典型的な抗新生物剤としては、限定されるものではないが、リンパ腫の任意の処置、例えば、リツキシマブと、DNAアルキル化架橋剤であるシクロホスファミドと、DNA挿入剤であるヒドロキシダウノルビシン(すなわち、ドキソルビシンまたはアドリアマイシン)と、チューブリンタンパク質に結合して細胞分裂を阻害するオンコビン(ビンクリスチン)と、コルチコステロイドであるプレドニゾンまたはプレドニゾロンとを含んでなる、非ホジキンリンパ腫に対する5つの成分による処置であるR−CHOP、CHOP、R−CVP(R−CHOPに類似しており、リツキシマブ、シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾロン/プレドニゾンを含んでなる)、CVP、ボルテゾミブ、ベンダムスチン、アレムツズマブ、および放射免疫療法(例えば、イブリツモマブ(ゼヴァリン)、トシツモマブ(ベキサール))が含まれる。
本発明において有用なその他の典型的な抗新生物剤としては、限定されるものではないが、クラスIおよびクラスIIヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤(例えば、ボリノスタット)、DNAメチラーゼ阻害剤(例えば、デシタビンまたはアザシチジン)、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)阻害剤(例えば、p300およびPCAF阻害剤)、微小管阻害剤、例えばジテルペノイドおよびビンカアルカロイド、白金配位化合物、アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード、オキサザホスホリン、アルキルスルホナート、ニトロソウレア、およびトリアゼン、抗生剤、例えばアントラサイクリン、アクチノマイシン、およびブレオマイシン、トポイソメラーゼII阻害剤、例えばエピポドフィロトキシン、代謝拮抗薬、例えばプリンおよびピリミジンアナログならびに葉酸代謝拮抗化合物、トポイソメラーゼI阻害剤、例えばカンプトテシン、ホルモンおよびホルモンアナログ、シグナル伝達経路阻害剤、非受容体型チロシンキナーゼ血管新生抑制薬、免疫療法剤、アポトーシス促進剤、および細胞周期シグナル伝達阻害剤が含まれる。
本発明のEZH2阻害化合物と組み合せて使用するためのまたは共投与される更なる活性成分の例としては化学療法剤が挙げられる。
微小管阻害剤または有糸分裂阻害剤は、細胞周期のM期、すなわち分裂期の腫瘍細胞の微小管に対して活性な周期特異的薬剤(phase specific agent)である。微小管阻害剤の例としては、限定されるものではないが、ジテルペノイドおよびビンカアルカロイドが含まれる。
天然供給源に由来するジテルペノイドは、細胞周期のG2/M期に作用する周期特異的抗癌剤である。ジテルペノイドは、微小管のβチューブリンサブユニットとの結合によりこのタンパク質を安定化すると考えられている。次いで、タンパク質の解体が阻害されて、有糸分裂が停止し、細胞死が起こるようである。ジテルペノイドの例としては、限定されるものではないが、パクリタキセルおよびそのアナログであるドセタキセルが含まれる。
パクリタキセル、すなわち(2R,3S)−N−ベンゾイル−3−フェニルイソセリンとの5β,20−エポキシ−1,2α,4,7β,10β,13α−ヘキサ−ヒドロキシタキサ−11−エン−9−オン4,10−ジアセタート2−ベンゾアート13−エステルは、北大西洋のイチイ属の木であるタイヘイヨウイチイ(Taxus brevifolia)から単離された天然ジテルペン製品であり、注射用液剤TAXOL(商標)として市販されている。これはテルペンのタキサンファミリーのメンバーである。これは、化学的およびX線結晶学的方法でその構造を解析したWani et al. J. Am. Chem, Soc., 93:2325. 1971)によって1971年に最初に単離された。その活性機構の一つは、パクリタキセルがチューブリンに結合することで癌細胞の成長を阻害する能力に関連する(Schiff et al., Proc. Natl, Acad, Sci. USA, 77:1561-1565 (1980)、Schiff et al., Nature, 277:665-667 (1979)、Kumar, J. Biol, Chem, 256: 10435-10441 (1981))。いくつかのパクリタキセル誘導体の合成および抗癌活性の概括については、D. G. I. Kingston et al., Studies in Organic Chemistry vol. 26, “New trends in Natural Products Chemistry 1986”, Attaur-Rahman, P.W. Le Quesne, Eds. (Elsevier, Amsterdam, 1986) pp 219-235を参照されたい。
パクリタキセルは米国において難治性卵巣癌の処置(Markman et al., Yale Journal of Biology and Medicine, 64:583, 1991、McGuire et al., Ann. lntem, Med., 111:273,1989)および乳癌の処置(Holmes et al., J. Nat. Cancer Inst., 83:1797,1991)における臨床使用が承認されている。パクリタキセルは、皮膚癌(Einzig et. al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 20:46)および頭頸部癌(Forastire et. al., Sem. Oncol., 20:56, 1990)における新生物の処置に有望な候補である。この化合物はまた、多発性嚢胞腎疾患(Woo et. al., Nature, 368:750. 1994)、肺癌、およびマラリアの処置にも可能性を示している。パクリタキセルで患者を処置すると、閾値濃度(50nM)(Kearns, C.M. et. al., Seminars in Oncology, 3(6) p.16-23, 1995)を超える投薬期間に関連して、骨髄抑制が起こる(複数の細胞系統、Ignoff, R.J. et. al, Cancer Chemotherapy Pocket Guide, 1998)。
ドセタキセル、すなわち5β−20−エポキシ−1,2α,4,7β,10β,13α−ヘキサヒドロキシタキサ−11−エン−9−オン4−アセタート2−ベンゾアート,三水和物との(2R,3S)−N−カルボキシ−3−フェニルイソセリン,N−tert−ブチルエステル,13−エステルは、注射用液剤としてTAXOTERE(商標)として市販されている。ドセタキセルは乳癌の処置に適応される。ドセタキセルは、ヨーロッパイチイの木の針葉から抽出される天然の前駆物質10−デアセチル−バッカチンIIIを用いて製造されるパクリタキセル(q.v.)の半合成誘導体である。ドセタキセルの用量制限毒性は好中球減少症である。
ビンカアルカロイドは、ニチニチソウに由来する周期特異的な抗新生物剤である。ビンカアルカロイドは、チューブリンに特異的に結合することにより細胞周期のM期(有糸分裂)に作用する。その結果、結合チューブリン分子は重合して微小管を形成することができなくなる。有糸分裂が中期に停止した後、細胞死が起こると考えられている。ビンカアルカロイドの例としては、限定されるものではないが、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンが含まれる。
ビンブラスチン、すなわちビンカロイコブラスチン硫酸塩は、VELBAN(商標)として注射用液剤として市販されている。これは様々な固形腫瘍の第二選択治療として可能な適応を有するが、精巣癌および種々のリンパ腫、例えばホジキン病、ならびにリンパ球性リンパ腫および組織球性リンパ腫の処置に主に適応される。ビンブラスチンの用量制限副作用は骨髄抑制である。
ビンクリスチン、すなわちビンカロイコブラスチン,22−オキソ−,硫酸塩は、ONCOVIN(商標)として注射用液剤として市販されている。ビンクリスチンは、急性白血病の処置に適応され、ホジキンおよび非ホジキン悪性リンパ腫の治療レジメンにも使用される。脱毛症および神経学的効果がビンクリスチンの最も一般的な副作用であり、それより軽い程度で、骨髄抑制および胃腸粘膜炎効果が生じる。
ビノレルビン、すなわち3’,4’−ジデヒドロ−4’−デオキシ−C’−ノルビンカロイコブラスチン[R−(R*,R*)−2,3−ジヒドロキシブタンジオアート(1:2)(塩)]は、酒石酸ビノレルビンの注射用液剤として市販されており(NAVELBINE(商標))、半合成ビンカアルカロイドである。ビノレルビンは、種々の固形腫瘍、特に非小細胞肺癌、進行性乳癌、およびホルモン不応性前立腺癌の処置において、単一の薬剤または他の化学療法剤、例えばシスプラチンとの併用で適応される。ビノレルビンの最も一般的な用量制限副作用は骨髄抑制である。
白金配位錯体は、DNAと相互作用する周期特異的でない抗癌剤である。白金錯体は、腫瘍細胞に入り、アクア化し、DNAと鎖内および鎖間架橋を形成して、腫瘍に有害な生物学的効果を生じる。白金配位錯体の例としては、限定されるものではないが、シスプラチンおよびカルボプラチンが含まれる。
シスプラチン、すなわちシス−ジアミンジクロロ白金は、PLATINOL(商標)として注射用液剤として市販されている。シスプラチンは、転移性の精巣癌および卵巣癌ならびに進行膀胱癌の処置に主に適応される。シスプラチンの主な用量制限副作用は、水分摂取および利尿により制御され得る腎毒性、ならびに中毒性難聴である。
カルボプラチン、すなわち白金,ジアミン[1,1−シクロブタン−ジカルボキシラート(2−)−O,O’]は、PARAPLATIN(商標)として注射用液剤として市販されている。カルボプラチンは、進行卵巣癌の第一および第二選択処置で主に適応される。カルボプラチンの用量制限毒性は骨髄抑制である。
アルキル化剤は、周期非特異的な抗癌剤であり、強力な求電子剤である。典型的には、アルキル化剤は、アルキル化により、リン酸基、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、イミダゾール基等のDNA分子の求核部分を介してDNAに共有結合を形成する。このようなアルキル化は、核酸機能を乱し、細胞死を招く。アルキル化剤の例としては、限定されるものではないが、ナイトロジェンマスタード、例えばシクロホスファミド、メルファラン、およびクロラムブシル、アルキルスルホナート、例えばブスルファン、ニトロソウレア、例えばカルムスチン、ならびにトリアゼン、例えばダカルバジンが含まれる。
シクロホスファミド、すなわち2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]テトラヒドロ−2H−1,3,2−オキサザホスホリン2−オキシド一水和物は、注射用液剤または錠剤としてCYTOXAN(商標)として市販されている。シクロホスファミドは、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、および白血病の処置において単一薬剤としてまたは他の化学療法剤との併用で適応される。シクロホスファミドの最も一般的な用量制限副作用は脱毛症、悪心、嘔吐、および白血球減少症である。
メルファラン、すなわち4−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]−L−フェニルアラニンは、注射用液剤または錠剤としてALKERAN(商標)として市販されている。メルファランは、多発性骨髄腫および切除不能な卵巣の上皮癌の緩和処置に適応される。メルファランの最も一般的な用量制限副作用は骨髄抑制である。
クロラムブシル、すなわち4−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]ベンゼンブタン酸は、LEUKERAN(商標)錠として市販されている。クロラムブシルは、慢性リンパ性白血病ならびに悪性リンパ腫、例えばリンパ肉腫、巨大濾胞性リンパ腫、およびホジキン病の緩和処置に適応される。クロラムブシルの最も一般的な用量制限副作用は骨髄抑制である。
ブスルファン、すなわち1,4−ブタンジオールジメタンスルホナートは、MYLERAN(商標)錠として市販されている。ブスルファンは、慢性骨髄性白血病の緩和処置に適応される。ブスルファンの最も一般的な用量制限副作用は骨髄抑制である。
カルムスチン、すなわち1,3−[ビス(2−クロロエチル)−1−ニトロソウレアは、凍結乾燥材料の単一バイアルとしてBiCNU(商標)として市販されている。カルムスチンは、脳腫瘍、多発性骨髄腫、ホジキン病、および非ホジキンリンパ腫に対して単一薬剤としてまたは他の薬剤と併用して緩和処置に適応される。カルムスチンの最も一般的な用量制限副作用は遅発性の骨髄抑制である。
ダカルバジン、すなわち5−(3,3−ジメチル−1−トリアゼノ)−イミダゾール−4−カルボキサミドは、単一バイアルの材料としてDTIC−Dome(商標)として市販されている。ダカルバジンは、転移性悪性メラノーマの処置に適応され、また、ホジキン病の第二選択処置に他の薬剤と併用して適応される。ダカルバジンの最も一般的な用量制限副作用は悪心、嘔吐、および食欲不振である。
抗生物質抗新生物剤は、DNAに結合またはインターカレートする、周期非特異的な薬剤である。典型的には、このような作用は、DNA複合体を安定化するか鎖を破壊して核酸の通常の機能を乱し、細胞死を招く。抗生物質抗新生物剤の例としては、限定されるものではないが、アクチノマイシン、例えばダクチノマイシン、アンスロサイクリン、例えばダウノルビシンおよびドキソルビシン、ならびにブレオマイシンが含まれる。
ダクチノマイシンは、アクチノマイシンDとしても知られ、COSMEGEN(商標)として注射用の形態で市販されている。ダクチノマイシンは、ウィルムス腫瘍および横紋筋肉腫の処置に適応される。ダクチノマイシンの最も一般的な用量制限副作用は悪心、嘔吐、および食欲不振である。
ダウノルビシン、すなわち(8S−シス−)−8−アセチル−10−[(3−アミノ−2,3,6−トリデオキシ−α−L−リキソ−ヘキソピラノシル)オキシ]−7,8,9,10−テトラヒドロ−6,8,11−トリヒドロキシ−1−メトキシ−5,12ナフタセンジオン塩酸塩は、注射可能なリポソーム形態としてDAUNOXOME(商標)としてまたは注射剤としてCERUBIDINE(商標)として市販されている。ダウノルビシンは、急性非リンパ球性白血病および進行HIV関連カポジ肉腫の処置における寛解導入に適応される。ダウノルビシンの最も一般的な用量制限副作用は骨髄抑制である。
ドキソルビシン、すなわち(8S、10S)−10−[(3−アミノ−2,3,6−トリデオキシ−α−L−リキソ−ヘキソピラノシル)オキシ]−8−グリコロイル、7,8,9,10−テトラヒドロ−6,8,11−トリヒドロキシ−1−メトキシ−5,12ナフタセンジオン塩酸塩は、RUBEX(商標)またはADRIAMYCIN RDF(商標)として注射可能な形態で市販されている。ドキソルビシンは、急性リンパ芽球性白血病および急性骨髄芽球性白血病の処置に主に適応されるが、一部の固形腫瘍およびリンパ腫の処置においても有用な成分である。ドキソルビシンの最も一般的な用量制限副作用は骨髄抑制である。
ブレオマイシンは、Streptomyces verticillusの株から単離された細胞毒性グリコペプチド抗生物質の混合物であり、BLENOXANE(商標)として市販されている。ブレオマイシンは、単一薬剤としてまたは他の薬剤と併用して、扁平細胞癌、リンパ腫、および精巣癌の緩和療法に適応される。ブレオマイシンの最も一般的な用量制限副作用は肺毒性および皮膚毒性である。
トポイソメラーゼII阻害剤としてはエピポドフィロトキシンが含まれるが、これに限定されるものではない。
エピポドフィロトキシンは、マンドレークに由来する周期特異的抗新生物剤である。エピポドフィロトキシンは通常、トポイソメラーゼIIおよびDNAと三元複合体を形成してDNA鎖を破壊することにより細胞周期のS期およびG2期の細胞に影響を与える。鎖の破壊が蓄積し、細胞死が起こる。エピポドフィロトキシンの例としては、限定されるものではないが、エトポシドおよびテニポシドが含まれる。
エトポシド、すなわち4’−デメチル−エピポドフィロトキシン9[4,6−0−(R)−エチリデン−β−D−グルコピラノシド]は、注射用液剤もしくはカプセル剤としてVePESID(商標)として市販されており、VP−16として一般的に知られる。エトポシドは、精巣癌および非小細胞肺癌の処置において単一薬剤としてまたは他の化学療法剤と併用して適応される。エトポシドの最も一般的な副作用は骨髄抑制である。白血球減少症の発生が血小板減少症より重度な傾向がある。
テニポシド、すなわち4’−デメチル−エピポドフィロトキシン9[4,6−0−(R)−テニリデン−β−D−グルコピラノシド]は、注射用液剤としてVUMON(商標)として市販されており、VM−26として一般的に知られる。テニポシドは、小児の急性白血病の処置において単一薬剤としてまたは他の化学療法剤と併用して適応される。テニポシドの最も一般的な用量制限副作用は骨髄抑制である。テニポシドは白血球減少症および血小板減少症の両方を誘発し得る。
代謝拮抗新生物剤は、DNA合成を阻害するかプリンまたはピリミジンの塩基合成を阻害することによりDNA合成を制限することで細胞周期のS期(DNA合成)に作用する周期特異的な抗新生物剤である。これにより、S期が進行せず、細胞死が起こる。代謝拮抗抗新生物剤の例としては、限定されるものではないが、フルオロウラシル、メトトレキサート、シタラビン、メカプトプリン、チオグアニン、およびゲムシタビンが含まれる。
5−フルオロウラシル、すなわち5−フルオロ−2,4−(1H,3H)ピリミジンジオンはフルオロウラシルとして市販されている。5−フルオロウラシルは投与されるとチミジル酸合成を阻害し、更にRNAおよびDNAの両方に取り込まれる。その結果、通常、細胞死が起こる。5−フルオロウラシルは乳癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、および膵臓癌の処置において単一薬剤としてまたは他の化学療法剤と併用して適応される。5−フルオロウラシルの用量制限副作用は骨髄抑制および粘膜炎である。他のフルオロピリミジンアナログとしては、5−フルオロデオキシウリジン(フロクスウリジン)および5−フルオロデオキシウリジン一リン酸が含まれる。
シタラビン、すなわち4−アミノ−1−β−D−アラビノフラノシル−2(1H)−ピリミジノンは、CYTOSAR−U(商標)として市販されており、Ara−Cとして一般的に知られる。シタラビンは、成長しているDNA鎖中へのシタラビンの末端取り込みによりDNA鎖伸張を阻害することによりS期に細胞周期特異性を示すと考えられている。シタラビンは、急性白血病の処置において単一薬剤としてまたは他の化学療法剤と併用して適応される。他のシチジンアナログとしては、5−アザシチジンおよび2’,2’−ジフルオロデオキシシチジン(ゲムシタビン)が含まれる。シタラビンは白血球減少症、血小板減少症、および粘膜炎を誘発する。
メルカプトプリン、すなわち1,7−ジヒドロ−6H−プリン−6−チオン一水和物は、PURINETHOL(商標)として市販されている。メルカプトプリンはまだ特定されていない機構によりDNA合成を阻害することによりS期に細胞周期特異性を示す。メルカプトプリンは急性白血病の処置において単一薬剤としてまたは他の化学療法剤と併用して適応される。高用量のメルカプトプリンの予想される副作用は骨髄抑制および胃腸粘膜炎である。有用なメルカプトプリンアナログはアザチオプリンである。
チオグアニン、すなわち2−アミノ−1,7−ジヒドロ−6H−プリン−6−チオンは、TABLOID(商標)として市販されている。チオグアニンはまだ特定されていない機構によりDNA合成を阻害することでS期に細胞周期特異性を示す。チオグアニンは、急性白血病の処置において単一薬剤としてまたは他の化学療法剤と併用して適応される。チオグアニン投与の最も一般的な用量制限副作用は骨髄抑制、例えば白血球減少症、血小板減少症、および貧血であるが、胃腸の副作用が生じることもあり、これが用量制限となることもある。他のプリンアナログとしては、ペントスタチン、エリスロヒドロキシノニルアデニン、リン酸フルダラビン、およびクラドリビンが含まれる。
ゲムシタビン、すなわち2’−デオキシ−2’、2’−ジフルオロシチジン一塩酸塩(β異性体)は、GEMZAR(商標)として市販されている。ゲムシタビンはG1/S境界で細胞進行をブロックすることによりS期に細胞周期特異性を示す。ゲムシタビンは局所進行性非小細胞肺癌の処置においてシスプラチンと併用しておよび局所進行性膵臓癌の処置において単独で適応される。ゲムシタビン投与の最も一般的な用量制限副作用は骨髄抑制、例えば白血球減少症、血小板減少症、および貧血である。
メトトレキサート、すなわちN−[4[[(2,4−ジアミノ−6−プテリジニル)メチル]メチルアミノ]ベンゾイル]−L−グルタミン酸はメトトレキサートナトリウムとして市販されている。メトトレキサートは、プリンヌクレオチドおよびチミジル酸の合成に必要なジヒドロ葉酸還元酵素の阻害を介してDNAの合成、修復、および/または複製を阻害することにより、S期で特異的に細胞周期に影響を与える。メトトレキサートは、絨毛癌、髄膜白血病、非ホジキンリンパ腫、ならびに乳癌、頭部癌、頸部癌、卵巣癌、および膀胱癌の処置において単一薬剤としてまたは他の化学療法剤と併用して適応される。メトトレキサート投与の予想される副作用は骨髄抑制(白血球減少症、血小板減少症、および貧血)および粘膜炎である。
カンプトテシン、例えば、カンプトテシンおよびカンプトテシン誘導体は、トポイソメラーゼI阻害剤として入手可能であるか開発中である。カンプトテシンの細胞毒性活性は、そのトポイソメラーゼI阻害活性に関連すると考えられている。カンプトテシンの例としては、限定されるものではないが、イリノテカン、トポテカン、および後述する種々の光学的形態の7−(4−メチルピペラジノ−メチレン)−10,11−エチレンジオキシ−20−カンプトテシンが含まれる。
イリノテカンHCl、すなわち(4S)−4,11−ジエチル−4−ヒドロキシ−9−[(4−ピペリジノピペリジノ)カルボニルオキシ]−1H−ピラノ[3’,4’,6,7]インドリジノ[1,2−b]キノリン−3,14(4H,12H)−ジオン塩酸塩は、注射用液剤CAMPTOSAR(商標)として市販されている。
イリノテカンは、その活性代謝物質SN−38と共にトポイソメラーゼI−DNA複合体に結合するカンプトテシンの誘導体である。トポイソメラーゼI:DNA:イリンテカンまたはSN−38三元複合体と複製酵素の相互作用によって生じる修復不能な二本鎖破壊により細胞毒性が生じると考えられている。イリノテカンは結腸または直腸の転移性癌の処置に適応される。イリノテカンHClの用量制限副作用は好中球減少症等の骨髄抑制および下痢等の胃腸への影響である。
トポテカンHCl、すなわち(S)−10−[(ジメチルアミノ)メチル]−4−エチル−4,9−ジヒドロキシ−1H−ピラノ[3’,4’,6,7]インドリジノ[1,2−b]キノリン−3,14−(4H,12H)−ジオン一塩酸は、注射用液剤HYCAMTIN(商標)として市販されている。トポテカンは、トポイソメラーゼI−DNA複合体に結合するカンプトテシンの誘導体であり、DNA分子の鎖のねじれに応答してトポイソメラーゼIにより生じる一本鎖破損部分の再ライゲーションを防ぐ。トポテカンは転移性卵巣癌および小細胞肺癌の第二選択処置に適応される。トポテカンHClの用量制限副作用は骨髄抑制、主に好中球減少症である。
また、ラセミ混合物(R,S)形態ならびにRおよびSエナンチオマーを含む、化学名「7−(4−メチルピペラジノ−メチレン)−10,11−エチレンジオキシ−20(R,S)−カンプトテシン(ラセミ混合物)または「7−(4−メチルピペラジノ−メチレン)−10,11−エチレンジオキシ−20(R)−カンプトテシン(Rエナンチオマー)または「7−(4−メチルピペラジノ−メチレン)−10,11−エチレンジオキシ−20(S)−カンプトテシン(Sエナンチオマー)で知られる、現在開発中の下記式F
ホルモンおよびホルモンアナログは、ホルモンと癌の成長および/または成長の欠如との間に関係がある癌の処置に有用な化合物である。癌の処置に有用なホルモンおよびホルモンアナログの例としては、限定されるものではないが、小児の悪性リンパ腫および急性白血病の処置に有用な副腎皮質ステロイド、例えばプレドニゾンおよびプレドニゾロン、副腎皮質癌およびエストロゲン受容体を含むホルモン依存性乳癌の処置に有用な、アミノグルテチミドおよびその他のアロマターゼ阻害剤、例えばアナストロゾール、レトラゾール、ボラゾール、およびエキセメスタン、ホルモン依存性乳癌および子宮内膜癌の処置に有用なプロゲストリン、例えば酢酸メゲストロール、前立腺癌および良性前立腺肥大症の処置に有用な、エストロゲン、アンドロゲン、抗アンドロゲン剤(例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸シプロテロン)、および5α還元酵素、例えばフィナステリドおよびデュタステリド、ホルモン依存性乳癌およびその他の感受性癌の処置に有用な、抗エストロゲン薬、例えばタモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、ならびに米国特許第5,681,835号、同第5,877,219号、および同第6,207,716号に記載されているような選択的エストロゲン受容体調節因子(SERMS)、ならびに前立腺癌を処置するための、黄体ホルモン(LH)および/または卵胞刺激ホルモン(FSH)の放出を刺激する生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)およびそのアナログ、例えばLHRHアゴニストおよびアンタガゴニスト、例えば酢酸ゴセレリンおよびルプロリドが含まれる。
レトロゾール(商標フェマーラ)は、手術後のホルモン応答性乳癌を処置するための経口非ステロイド性アロマターゼ阻害剤である。アロマターゼ酵素の活性を介したアンドロゲンの変換によりエストロゲンが産生される。その後、エストロゲンはエストロゲン受容体に結合し、細胞を分裂させる。レトロゾールは、アロマターゼのチトクロームP450ユニットのヘムに競合的且つ可逆的に結合して、アロマターゼによるエストロゲンの産生を妨げる。この作用は特異的であり、レトロゾールはミネラルコルチコイドまたはコルチコステロイドの産生を減少させない。
シグナル伝達経路阻害剤とは、細胞内変化を引き起こす化学的プロセスをブロックまたは阻害する阻害剤である。本明細書において、この変化は細胞増殖または分化である。本発明において有用なシグナル伝達阻害剤としては、受容体型チロシンキナーゼ、非受容体型チロシンキナーゼ、SH2/SH3ドメインブロッカー、セリン/スレオニンキナーゼ、ホスフォチジルイノシトール−3キナーゼ、ミオイノシトールシグナル伝達、およびRas癌遺伝子の阻害剤が含まれる。
複数のタンパク質チロシンキナーゼが、細胞成長の制御に関与する種々のタンパク質の特異的チロシル残基のリン酸化を触媒する。そのようなタンパク質チロシンキナーゼは、受容体型または非受容体型キナーゼとしておおまかに分類することができる。
受容体型チロシンキナーゼは、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびチロシンキナーゼドメインを有する膜貫通タンパク質である。受容体型チロシンキナーゼは、細胞成長の制御に関わり、一般に成長因子受容体と呼ばれる。これらのキナーゼの多くの不適切なまたは制御されていない活性化、すなわち異常なキナーゼ成長因子受容体活性(例えば過剰発現または変異による)は、制御されない細胞成長を招くことが示されている。したがって、そのようなキナーゼの活性異常が悪性腫瘍の成長に関連付けられている。したがって、そのようなキナーゼの阻害剤は癌の処置方法を提供し得る。成長因子受容体としては、例えば、上皮成長因子受容体(EGFr)、血小板由来成長因子受容体(PDGFr)、erbB2、erbB4、血管内皮成長因子受容体(VEGFr)、免疫グロブリン様および上皮成長因子相同性領域(TIE−2)を有するチロシンキナーゼ、インスリン成長因子I(IGFI)受容体、マクロファージコロニー刺激因子(cfms)、BTK、ckit、cmet、線維芽細胞成長因子(FGF)受容体、Trk受容体(TrkA、TrkB、およびTrkC)、エフリン(eph)受容体、ならびにRET癌原遺伝子が含まれる。成長受容体の阻害剤が複数開発中であり、これにはリガンドアンタゴニスト、抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。成長因子受容体および成長因子受容体機能を阻害する薬剤は、例えば、Kath, John C., Exp. Opin. Ther. Patents (2000) 10(6):803-818、Shawver et al DDT Vol 2, No. 2 February 1997、およびLofts, F. J. et al, “Growth factor receptors as targets”, New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy, ed. Workman, Paul and Kerr, David, CRC press 1994, Londonに記載されている。
成長因子受容体キナーゼでないチロシンキナーゼは非受容体型チロシンキナーゼと呼ばれる。抗癌薬の標的または標的候補である本発明に有用な非受容体型チロシンキナーゼとしては、cSrc、Lck、Fyn、Yes、Jak、cAbl、FAK(接着斑キナーゼ)、ブルトン型チロシンキナーゼ、およびBcr−Ablが含まれる。このような非受容体型キナーゼおよび非受容体型チロシンキナーゼ機能を阻害する薬剤はSinh, S. and Corey, S.J., (1999) Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research 8 (5): 465-80、 and Bolen, J.B., Brugge, J.S., (1997) Annual review of Immunology. 15: 371-404に記載されている。
SH2/SH3ドメインブロッカーとは、PI3−K p85サブユニット、Srcファミリーキナーゼ、アダプター分子(Shc、Crk、Nck、Grb2)、およびRas−GAPを含む種々の酵素またはアダプタータンパク質中のSH2またはSH3ドメイン結合を乱す薬剤である。抗癌薬の標的としてのSH2/SH3ドメインがSmithgall, T.E. (1995), Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 34(3) 125-32に考察されている。
Rafキナーゼ(rafk)、マイトジェンまたは細胞外制御キナーゼ(MEK)、および細胞外制御キナーゼ(ERK)のブロッカーを含むMAPキナーゼカスケードブロッカーを含むセリン/スレオニンキナーゼの阻害剤、およびPKC(アルファ、ベータ、ガンマ、イプシロン、ミュー、ラムダ、イオタ、ゼータ)のブロッカーを含むタンパク質キナーゼCファミリーメンバーブロッカー、IkBキナーゼファミリー(IKKa、IKKb)、PKBファミリーキナーゼ、AKTキナーゼファミリーメンバー、およびTGFベータ受容体キナーゼ。そのようなセリン/スレオニンキナーゼおよびその阻害剤はYamamoto, T., Taya, S., Kaibuchi, K., (1999), Journal of Biochemistry. 126 (5) 799-803、Brodt, P, Samani, A., and Navab, R. (2000), Biochemical Pharmacology, 60. 1101-1107、Massague, J., Weis-Garcia, F. (1996) Cancer Surveys. 27:41-64、Philip, P.A., and Harris, A.L. (1995), Cancer Treatment and Research. 78: 3-27, Lackey, K. et al Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, (10), 2000, 223-226、米国特許第6,268,391号、および Martinez-Iacaci, L., et al, Int. J. Cancer (2000), 88(1), 44-52に記載されている。
PI3−キナーゼ、ATM、DNA−PK、およびKuのブロッカーを含むホスフォチジルイノシトール−3キナーゼファミリーメンバーの阻害剤も本発明に有用である。このようなキナーゼはAbraham, R.T. (1996), Current Opinion in Immunology. 8 (3) 412-8、Canman, C.E., Lim, D.S. (1998), Oncogene 17 (25) 3301-3308、Jackson, S.P. (1997), International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 29 (7):935-8、およびZhong, H. et al, Cancer res, (2000) 60(6), 1541-1545に考察されている。
ホスホリパーゼCブロッカーおよびミオイノシトールアナログ等のミオイノシトールシグナル伝達阻害剤も本発明に有用である。このようなシグナル阻害剤はPowis, G., and Kozikowski A., (1994) New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy ed., Paul Workman and David Kerr, CRC press 1994, Londonに記載されている。
もう一つのグループのシグナル伝達経路阻害剤はRas癌遺伝子の阻害剤である。そのような阻害剤としては、ファルネシルトランスフェラーゼ、ゲラニル−ゲラニルトランスフェラーゼ、およびCAAXプロテアーゼの阻害剤ならびにアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、および免疫療法が含まれる。このような阻害剤は、野生型変異体rasを含む細胞中でras活性化をブロックすることにより抗増殖剤として作用することが示されている。Ras癌遺伝子阻害についてはScharovsky, O.G., Rozados, V.R., Gervasoni, S.I. Matar, P. (2000), Journal of Biomedical Science. 7(4) 292-8、Ashby, M.N. (1998), Current Opinion in Lipidology. 9 (2) 99-102、およびBennett, C.F. and Cowsert, L.M. BioChim. Biophys. Acta, (1999) 1489(1):19-30に記載されている。
前述したように、受容体型キナーゼリガンド結合に対する抗体アンタゴニストもシグナル伝達阻害剤となり得る。このグループのシグナル伝達経路阻害剤としては、受容体型チロシンキナーゼの細胞外リガンド結合ドメインに対するヒト化抗体の使用が含まれる。例として、Imclone C225 EGFR特異的抗体(Green, M.C. et al, Monoclonal Antibody Therapy for Solid Tumors, Cancer Treat. Rev., (2000), 26(4), 269-286参照)、ハーセプチン(商標)erbB2抗体(Tyrosine Kinase Signalling in Breast cancer:erbB Family Receptor Tyrosine Kniases, Breast cancer Res., 2000, 2(3), 176-183参照)、および2CB VEGFR2特異的抗体(Brekken, R.A. et al, Selective Inhibition of VEGFR2 Activity by a monoclonal Anti-VEGF antibody blocks tumor growth in mice, Cancer Res. (2000) 60, 5117-5124参照)が挙げられる。
非受容体型キナーゼ血管新生阻害剤も本発明に有用であり得る。血管新生関連VEGFRおよびTIE2の阻害剤はシグナル伝達阻害剤に関連して上記で説明されている(どちらの受容体も受容体型チロシンキナーゼである)。erbB2およびEGFRの阻害剤が血管新生、主にVEGFの発現を阻害することが示されているので、血管新生は一般的にerbB/EGFRシグナル伝達と関連付けられる。したがって、erbB2/EGFR阻害剤と血管新生阻害剤の組合せは理に適っている。したがって、非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤は本発明のEGFR/erbB2阻害剤と併用され得る。例えば、VEGFR(受容体型チロシンキナーゼ)を認識しないがリガンドに結合する抗VEGF抗体、血管新生を阻害するインテグリン(αv、β3)の小分子阻害剤、エンドスタチンおよびアンジオスタチン(非RTK)も、開示されているerbファミリー阻害剤との併用に有用であることが示され得る(Bruns CJ et al (2000), Cancer Res., 60: 2926-2935、Schreiber AB, Winkler ME, and Derynck R. (1986), Science, 232: 1250-1253、Yen L et al. (2000), Oncogene 19: 3460-3469参照)。
ヴォトリエント(商標)として市販されているパゾパニブはチロシンキナーゼ阻害剤(TKI)である。パゾパニブは、化学名5−[[4−[(2,3−ジメチル−2H−インダゾール−6−イル)メチルアミノ]−2−ピリミジニル]アミノ]−2−メチルベンゼンスルホンアミド一塩酸塩で塩酸塩として提供される。パゾポニブは進行腎細胞癌の患者の処置に承認されている。
アバスチン(商標)として市販されているベバシスマブは、VEGF−Aをブロックするヒト化モノクローナル抗体である。アバスチン(商標)は、結腸直腸、肺、胸、腎臓、および膠芽腫等の種々の癌の処置に承認されている。
mTOR阻害剤としては、限定されるものではないが、ラパマイシン(FK506)およびラパログ(rapalog)、RAD001すなわちエベロリムス(アフィニトール)、CCI−779すなわちテムシロリムス、AP23573、AZD8055、WYE−354、WYE−600、WYE−687、およびPp121が含まれる。
エベロリムスは、ノバルティス社からアフィニトール(商標)として販売されており、シロリムスの40−O−(2−ヒドロキシエチル)誘導体であり、mTOR(ラパマイシンの哺乳類標的)阻害剤としてシロリムスと同様に作用する。これは現在、臓器移植片の拒絶を防止するための免疫抑制薬および腎細胞癌の処置として使用されている。複数の癌における使用について、エベロリムスおよび他のmTOR阻害剤について多くの研究がなされてきた。これは以下の化学構造(式V)および化学名を有する。
ベキサロテンはターグレチン(商標)として販売されており、レチノイドX受容体(RXR)を選択的に活性化するレチノイドのサブクラスのメンバーである。これらのレチノイド受容体は、レチノイン酸受容体(RAR)とは異なる生物学的活性を有する。化学名は4−[1−(5,6,7,8−テトラヒドロ−3,5,5,8,8−ペンタメチル−2−ナフタレニル)エテニル]安息香酸である。ベキサロテンは、少なくとも一つの他の薬物療法による処置が疾患に奏功しなかった人々の皮膚T細胞リンパ腫(CTCL、皮膚癌の一種)の処置に用いられる。
ソラフェニブはネクサバール(商標)として販売されており、マルチキナーゼ阻害剤と呼ばれる薬物のクラスに属し、化学名は4−[4−[[4−クロロ−3−(トリフルオロメチル)フェニル]カルバモイルアミノ]フェノキシ]−N−メチル−ピリジン−2−カルボキサミドである。ソラフェニブは進行腎細胞癌(腎臓中で始まる癌の一種)の処置に用いられる。ソラフェニブは切除不能な肝細胞癌(手術により処置することができない肝癌の一種)の処置にも用いられる。
免疫療法のレジメンに使用される薬剤も式(I)の化合物との併用に有用であり得る。erbB2またはEGFRに対する免疫応答を生じさせる免疫学的戦略は複数ある。これらの戦略は、通常、腫瘍ワクチン接種の領域に含まれる。免疫学的アプローチの有効性は、小分子阻害剤を用いたerbB2/EGFRシグナル伝達経路の組合せ阻害によって大きく上昇し得る。erbB2/EGFRに対する免疫学的/腫瘍ワクチンアプローチについての考察がReilly RT et al. (2000), Cancer Res. 60: 3569-3576およびChen Y, Hu D, Eling DJ, Robbins J, and Kipps TJ. (1998), Cancer Res. 58: 1965-1971に記載されている。
erbB阻害剤の例としては、ラパチニブ、エルロチニブ、およびゲフィチニブが含まれる。ラパチニブ、すなわちN−(3−クロロ−4−{[(3−フルオロフェニル)メチル]オキシ}フェニル)−6−[5−({[2−(メチルスルホニル)エチル]アミノ}メチル)−2−フラニル]−4−キナゾリンアミン(図示されているように、式VIで表される)は、HER2陽性転移乳癌の処置にカペシタビンとの併用で承認されているerbB−1およびerbB−2(EGFRおよびHER2)チロシンキナーゼの強力な経口小分子二重阻害剤である。
式(VI)の化合物の遊離塩基、HCl塩、およびジトシラート塩は、1999年7月15日付で公開された国際公開第99/35146号および2002年1月10日付で公開された国際公開第02/02552号に開示されている方法に従って製造することができる。
タルセバ)の商標名で市販されているエルロチニブ、すなわちN−(3−エチニルフェニル)−6,7−ビス{[2−(メチルオキシ)エチル]オキシ}−4−キナゾリンアミンは、図示されているように式VIIで表される。
エルロチニブの遊離塩基およびHCl塩は例えば米国特許第5,747,498号の実施例20に従って製造することができる。
ゲフィチニブ、すなわち4−キナゾリンアミン,N−(3−クロロ−4−フルオロフェニル)−7−メトキシ−6−[3−4−モルホリン)プロポキシ]は、図示されているように式VIIIで表される。
イレッサ(商標)(アストラゼネカ社)の商標名で市販されているゲフィチニブは、白金系およびドセタキセルによる化学療法の両方が失敗した後の、局所的進行性または転移性の非小細胞肺癌の患者の処置に単剤治療として指定されているerbB−1阻害剤である。ゲフィチニブの遊離塩基、HCl塩、および二塩酸塩は、1996年4月23日付で提出されて1996年10月31日付で国際公開第96/33980号として公開された国際出願PCT/GB96/00961号の方法に従って製造することができる。
トラスツズマブ(HEREPTIN(商標))はHER2受容体に結合するヒト化モノクローナル抗体である。この最初の適応はHER2陽性乳癌である
セツキシマブ(アービタックス(商標))は上皮成長因子受容体(EGFR)を阻害するキメラマウスヒト抗体である。
ペルツズマブ(2C4とも呼ばれる、商標オムニターグ)はモノクローナル抗体である。「HER2量体化阻害剤」と呼ばれる薬剤ラインのクラスの最初のものである。ペルツズマブは、HER2に結合することにより、HER2と他のHER受容体の2量体化を阻害し、これは腫瘍の成長を遅らせるという仮説が立てられている。ペルツズマブは2001年1月4日付で公開された国際公開第01/00245号に記載されている。
リツキシマブは、リツキサン(商標)およびマブセラ(商標)として販売されているキメラモノクローナル抗体である。リツキシマブは、B細胞上のCD20に結合し、細胞のアポトーシスを引き起こす。リツキシマブは関節リウマチおよびB細胞非ホジキンリンパ腫の処置に承認されており、静脈内投与される。
オファツムマブは、アルゼラ(商標)として販売されている完全ヒトモノクローナル抗体である。オファツムマブはB細胞上のCD20に結合し、フルダラビン(フルダラ)およびアレムツズマブ(キャンパス)による処置に抵抗性の成人の慢性リンパ球性白血病(CLL、白血球の癌の一種)の処置に用いられる。
アポトーシス促進療法に使用される薬剤(例えば、bcl−2アンチセンスオリゴヌクレオチド)も本発明の組合せに用いられ得る。Bcl−2ファミリーのメンバーのタンパク質はアポトーシスをブロックする。そのため、bcl−2のアップレギュレーションが化学療法抵抗性に関連付けられている。研究により、上皮成長因子(EGF)がbcl−2ファミリーの抗アポトーシスメンバー(すなわちmcl−1)を刺激することが示されている。したがって、腫瘍中のbcl−2の発現をダウンレギュレートするように設計された戦略は臨床的有益性が実証されており、現在、Genta’s G3139 bcl−2アンチセンスオリゴヌクレオチドとして第II/III相治験が行われている。bcl−2に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド戦略を用いたこのようなアポトーシス促進戦略はWater JS et al. (2000), J. Clin. Oncol. 18: 1812-1823および Kitada S et al. (1994), Antisense Res. Dev. 4: 71-79に記載されている。
細胞周期シグナル伝達阻害剤は細胞周期の制御に関わる分子を阻害する。サイクリン依存性キナーゼ(CDK)と呼ばれるタンパク質キナーゼのファミリーおよびサイクリンと名付けられたタンパク質ファミリーとのそれらの相互作用が、真核生物の細胞周期の進行を制御する。細胞周期の正常な進行には種々のサイクリン/CDK複合体の協調的な活性化および不活性化が必要である。細胞周期シグナル伝達の複数の阻害剤が開発中である。例えば、CDK2、CDK4、およびCDK6を含むサイクリン依存性キナーゼならびにその阻害剤の例が例えばRosania et al, Exp. Opin. Ther. Patents (2000) 10(2):215-230に記載されている。
EZH2のY641もしくはA677における変異のいずれかまたはH3K27me3レベルの増加が検出された場合、特許請求される発明の癌処置方法はいずれも、微小管阻害剤、白金配位化合物、アルキル化剤、抗生剤、トポイソメラーゼII阻害剤、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼI阻害剤、ホルモンおよびホルモンアナログ、シグナル伝達経路阻害剤、非受容体型チロシンキナーゼ血管新生抑制薬、免疫療法剤、アポトーシス促進剤、ならびに細胞周期シグナル伝達阻害剤からなる群から選択される抗新生物剤等の少なくとも一つの更なる抗新生物剤を用いた処置を更に含んでなってよい。
実施例1
細胞培養および原発性腫瘍検体
パイフェルDLBCL細胞株(ATCC)を、10%ウシ胎児血清(FBS)(シグマ アルドリッチ社製)を補充したRPMI−1640培地(メディアテック社(MediaTech)製)中に維持した。他の細胞株は全てATCCまたはDSMZのずれかから入手し、推奨される細胞培養培地中に維持した。41名のリンパ腫患者のゲノムDNAの提供をオリジーン社(OriGene、メリーランド州ロックヴィル)から受けた。高腫瘍含有率(>40%)の病理検証された腫瘍組織の凍結ブロックからDNAを抽出した。IRBの承認および患者のインフォームド・コンセントに準じ、分子的分析のために組織を採取した。腫瘍検体の詳細な臨床的特徴を表2に示す。
細胞培養および原発性腫瘍検体
パイフェルDLBCL細胞株(ATCC)を、10%ウシ胎児血清(FBS)(シグマ アルドリッチ社製)を補充したRPMI−1640培地(メディアテック社(MediaTech)製)中に維持した。他の細胞株は全てATCCまたはDSMZのずれかから入手し、推奨される細胞培養培地中に維持した。41名のリンパ腫患者のゲノムDNAの提供をオリジーン社(OriGene、メリーランド州ロックヴィル)から受けた。高腫瘍含有率(>40%)の病理検証された腫瘍組織の凍結ブロックからDNAを抽出した。IRBの承認および患者のインフォームド・コンセントに準じ、分子的分析のために組織を採取した。腫瘍検体の詳細な臨床的特徴を表2に示す。
実施例2
ELISAを用いたヒストンH3およびH3K27me3レベルの定量化
細胞株を回収し、1×PBSですすぎ、遠心した。細胞ペレットを0.2N HClで30分間溶解してヒストンを抽出した。酸不溶性部分を遠心によりペレット化し、上清をプロテアーゼ阻害剤(ロシュ社製)を含む中和バッファー(1M Na2HPO4、pH12.5、アクティブ・モティフ社(ActiveMotif)製)で中和した。タンパク質ライセートおよび組換え体H3K27me3(アクティブ・モティフ社製)を、中和した溶解バッファー中で滴定し、Maxisorp ELISAプレート(ヌンク社製)に、二つのプレートのそれぞれに2連(in duplicate)で添加した。ブロッキングバッファー(1%BSA)を加え、プレートを1時間インキュベートした後、Tween−20(KPL)を含むイミダゾール緩衝食塩水で4回洗浄した。プレートを、H3K27me3に対する一次抗体(セル・シグナリング・テクノロジー社(Cell Signaling Technology)製)または全H3に対する一次抗体(アクティブ・モティフ社製)とインキュベートし、洗浄し、抗ウサギIgG HRP連結二次抗体(セル・シグナリング・テクノロジー社製)とインキュベートした。Luminata Forte基質(ミリポア社製)を加え、5分後に、EnVisionマルチラベルプレートリーダー(パーキンエルマー社製)を用いて化学発光を定量した。組換え体H3K27me3シグナルを標準対照として細胞株のH3K27me3および全H3のレベルを計算し、H3K27me3を全H3値に基づいて標準化した。
ELISAを用いたヒストンH3およびH3K27me3レベルの定量化
細胞株を回収し、1×PBSですすぎ、遠心した。細胞ペレットを0.2N HClで30分間溶解してヒストンを抽出した。酸不溶性部分を遠心によりペレット化し、上清をプロテアーゼ阻害剤(ロシュ社製)を含む中和バッファー(1M Na2HPO4、pH12.5、アクティブ・モティフ社(ActiveMotif)製)で中和した。タンパク質ライセートおよび組換え体H3K27me3(アクティブ・モティフ社製)を、中和した溶解バッファー中で滴定し、Maxisorp ELISAプレート(ヌンク社製)に、二つのプレートのそれぞれに2連(in duplicate)で添加した。ブロッキングバッファー(1%BSA)を加え、プレートを1時間インキュベートした後、Tween−20(KPL)を含むイミダゾール緩衝食塩水で4回洗浄した。プレートを、H3K27me3に対する一次抗体(セル・シグナリング・テクノロジー社(Cell Signaling Technology)製)または全H3に対する一次抗体(アクティブ・モティフ社製)とインキュベートし、洗浄し、抗ウサギIgG HRP連結二次抗体(セル・シグナリング・テクノロジー社製)とインキュベートした。Luminata Forte基質(ミリポア社製)を加え、5分後に、EnVisionマルチラベルプレートリーダー(パーキンエルマー社製)を用いて化学発光を定量した。組換え体H3K27me3シグナルを標準対照として細胞株のH3K27me3および全H3のレベルを計算し、H3K27me3を全H3値に基づいて標準化した。
実施例3
H3K27メチル化状態のウェスタンブロット分析
細胞株をPBSですすぎ、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤(ロシュ社製)を含むRIPAバッファー(サーモサイエンティフィック社製)を用いて氷上で溶解した。その後、Branson Sonifier 150(設定=2)でライセートを15秒間超音波処理し、BCAタンパク質アッセイ(サーモサイエンティフィック社)によりタンパク質濃度を測定した。その後、タンパク質ライセート(1〜5□g)を変性させ、Bis−Tris SDS−ポリアクリルアミドゲル(インビトロジェン社製)を用いて電気泳動した後、PVDFメンブレン(インビトロジェン社製)に転写した。Odysseyブロッキングバッファー(ライコア社(Li−Cor)製)でメンブレンをブロッキングし、EZH2認識抗体(BDトランスダクションラボラトリーズ社(BD Transduction Labs)製)ヒストンH3認識抗体(アブカム社(Abcam)製)、H3K27me1、H3K27me3認識抗体(セル・シグナリング・テクノロジー社製)、またはアクチン認識抗体(シグマ社製)で探索した。0.1%Tween−20を含むPBS(PBST)で洗浄した後、蛍光二次抗体(ライコア社製)でメンブレンをハイブリダイズし、PBSTで洗浄し、Odyssey赤外イメージングシステム(ライコア社)を用いてイメージングした。
H3K27メチル化状態のウェスタンブロット分析
細胞株をPBSですすぎ、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤(ロシュ社製)を含むRIPAバッファー(サーモサイエンティフィック社製)を用いて氷上で溶解した。その後、Branson Sonifier 150(設定=2)でライセートを15秒間超音波処理し、BCAタンパク質アッセイ(サーモサイエンティフィック社)によりタンパク質濃度を測定した。その後、タンパク質ライセート(1〜5□g)を変性させ、Bis−Tris SDS−ポリアクリルアミドゲル(インビトロジェン社製)を用いて電気泳動した後、PVDFメンブレン(インビトロジェン社製)に転写した。Odysseyブロッキングバッファー(ライコア社(Li−Cor)製)でメンブレンをブロッキングし、EZH2認識抗体(BDトランスダクションラボラトリーズ社(BD Transduction Labs)製)ヒストンH3認識抗体(アブカム社(Abcam)製)、H3K27me1、H3K27me3認識抗体(セル・シグナリング・テクノロジー社製)、またはアクチン認識抗体(シグマ社製)で探索した。0.1%Tween−20を含むPBS(PBST)で洗浄した後、蛍光二次抗体(ライコア社製)でメンブレンをハイブリダイズし、PBSTで洗浄し、Odyssey赤外イメージングシステム(ライコア社)を用いてイメージングした。
実施例4
EZH2の全長サンガーシークエンシング
Maxwell 16 Cell DNA Purification Kit(プロメガ社製)を用いて細胞ペレットからゲノムDNA(gDNA)を単離した。改変したRNeasyキットの方法(キアゲン社製)を用いて全RNAを調製し、HiFi First Strand cDNA Synthesis Kitのプロトコール(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を用いてcDNAに変換した。M13ユニバーサルシークエンシングプライマー配列を末端付加したプライマー(表3)(インテグレイテッドDNAテクノロジーズ社製)およびHotstarTaq DNAポリメラーゼ(キアゲン社製)を用いてPCR反応を行った。DNA(50ng)を増幅し、AmPure(アジェンコート・バイオサイエンス社(Agencourt Bioscience)製)を用いてPCR産物を精製した。v3.1 Big Dye−ターミネーターサイクルシークエンシングキット(アプライドバイオシステムズ社製)を用いた3730XL Genetic Analyzer(アプライドバイオシステムズ社製)により、M13プライマーを用いた精製PCR産物の直接シークエンシングを行った。シークエンシング反応を分析し、Codon Code Aligner(コドンコードコーポレーション(CodonCode Corporation)製)を用いて全ての配列を構築および分析した。
EZH2の全長サンガーシークエンシング
Maxwell 16 Cell DNA Purification Kit(プロメガ社製)を用いて細胞ペレットからゲノムDNA(gDNA)を単離した。改変したRNeasyキットの方法(キアゲン社製)を用いて全RNAを調製し、HiFi First Strand cDNA Synthesis Kitのプロトコール(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を用いてcDNAに変換した。M13ユニバーサルシークエンシングプライマー配列を末端付加したプライマー(表3)(インテグレイテッドDNAテクノロジーズ社製)およびHotstarTaq DNAポリメラーゼ(キアゲン社製)を用いてPCR反応を行った。DNA(50ng)を増幅し、AmPure(アジェンコート・バイオサイエンス社(Agencourt Bioscience)製)を用いてPCR産物を精製した。v3.1 Big Dye−ターミネーターサイクルシークエンシングキット(アプライドバイオシステムズ社製)を用いた3730XL Genetic Analyzer(アプライドバイオシステムズ社製)により、M13プライマーを用いた精製PCR産物の直接シークエンシングを行った。シークエンシング反応を分析し、Codon Code Aligner(コドンコードコーポレーション(CodonCode Corporation)製)を用いて全ての配列を構築および分析した。
実施例5
細胞中での野生型および変異型EZH2タンパク質の一過的発現
トランスフェクションの前日に、6ウェル組織培養プレートの10%FBS補充RPMI−1640培地にMCF−7乳癌細胞(3×105、ATCC)を播種した。メーカーの推奨に従い、500μlのOpti−MEM(インビトロジェン製)中で2μgのプラスミドDNAおよび6μlのLipofectamine 2000(インビトロジェン社製)を混合し、室温で20分間インキュベートした後、細胞に添加した。次いで、前述したタンパク質ライセートおよびウェスタンブロット分析のために回収するまで、細胞を5%CO2、37℃でインキュベートした。
細胞中での野生型および変異型EZH2タンパク質の一過的発現
トランスフェクションの前日に、6ウェル組織培養プレートの10%FBS補充RPMI−1640培地にMCF−7乳癌細胞(3×105、ATCC)を播種した。メーカーの推奨に従い、500μlのOpti−MEM(インビトロジェン製)中で2μgのプラスミドDNAおよび6μlのLipofectamine 2000(インビトロジェン社製)を混合し、室温で20分間インキュベートした後、細胞に添加した。次いで、前述したタンパク質ライセートおよびウェスタンブロット分析のために回収するまで、細胞を5%CO2、37℃でインキュベートした。
実施例6
EZH2が野生型および変異体である5個のメンバーで構成されるPRC2のクローニング、発現、および精製
ヒトEED1(NM_003797)、SUZ12(NP_056170)、RbAp48(RBBP4、NP_005601)、およびAEBP2(NP_694939)をpENTR/TEV/D−TOPO(インビトロジェン社製)にクローニングし、pDEST8(インビトロジェン社製)中にサブクローニングした。ヒトEZH2(NP_001190176)をpENTR/TEV/D−TOPOにクローニングし、N末端FLAGエピトープタグを含むpDEST8にサブクローニングした。pENTR/TEV/D−TOPO中のヒトEZH2を、部位特異的突然変異誘発(QuikChange II XL、アジレント・テクノロジーズ社(Agilent Technologies)製)により変異させてA677G、Y641N、Y641F、Y641C、Y641H、またはY641Sの単一アミノ酸変化を導入し(表4)、N末端FLAGエピトープタグを含むpDEST8にサブクローニングした。全ての変異体の全コード領域を二本鎖シークエンシングにより確認した。哺乳動物の発現実験では、野生型ヒトEZH2をpIRES2−ZsGreen1(クロンテック社製)にサブクローニングした。その後、上記のように部位特異的突然変異誘発を用いてA677およびY641変異体を得た。
EZH2が野生型および変異体である5個のメンバーで構成されるPRC2のクローニング、発現、および精製
ヒトEED1(NM_003797)、SUZ12(NP_056170)、RbAp48(RBBP4、NP_005601)、およびAEBP2(NP_694939)をpENTR/TEV/D−TOPO(インビトロジェン社製)にクローニングし、pDEST8(インビトロジェン社製)中にサブクローニングした。ヒトEZH2(NP_001190176)をpENTR/TEV/D−TOPOにクローニングし、N末端FLAGエピトープタグを含むpDEST8にサブクローニングした。pENTR/TEV/D−TOPO中のヒトEZH2を、部位特異的突然変異誘発(QuikChange II XL、アジレント・テクノロジーズ社(Agilent Technologies)製)により変異させてA677G、Y641N、Y641F、Y641C、Y641H、またはY641Sの単一アミノ酸変化を導入し(表4)、N末端FLAGエピトープタグを含むpDEST8にサブクローニングした。全ての変異体の全コード領域を二本鎖シークエンシングにより確認した。哺乳動物の発現実験では、野生型ヒトEZH2をpIRES2−ZsGreen1(クロンテック社製)にサブクローニングした。その後、上記のように部位特異的突然変異誘発を用いてA677およびY641変異体を得た。
Bac−to−Bac(商標)システム(インビトロジェン社製)を用いて、EED1、SUZ12、RbAp48、AEBP2、およびFLAG−tev−EZH2の発現用に個々のバキュロウイルスストックを作製した。PRC2の5つの構成要素全てを、各構成要素について10Lの振盪バッグ(wave bag)当たり2×107バキュロウイルス感染昆虫細胞を加えることによりSf9昆虫細胞中で共発現させた。細胞を27℃でインキュベートし、感染後66〜70時間の間に細胞ペーストを回収した。
flagタグ化野生型EZH2または変異EZH2(A677G、Y641F、Y641N、Y641S、Y641H、またはY641C)を含むPRC2複合体(EZH2、EED、SUZ12、AEBP2、RbAp48)を、10mlの抗FLAG M2樹脂(シグマ社製)を用いて4℃で、1LのSf9細胞ペーストライセートから精製した。樹脂をXK26カラムに充填し、Buffer A(50mM Tris HCl(pH7.5)、250mM NaCl、2mM DTT)で洗浄した。その後、100μg/mLのFLAGペプチド(カリフォルニアペプチドリサーチ社(California Peptide Research)製)を含むBuffer AでPRC2複合体を溶出した。その後、EZH2を含む画分をプールし、Buffer Aで平衡化したSuperdex 200カラム(16/60)(GEファルマシア社製)にアプライした。単量体PRC2複合体を回収し、SDS−PAGEで純度を評価し、ペプチドマッピング分析により全ての構成要素およびEZH2変異を確認した。
実施例7
メチルトランスフェラーゼ活性の生化学的評価
特に断りのない限り、全ての試薬はシグマ社から入手しており、最低でも試薬グレードである。リジン27が未修飾であるか、モノメチル化またはジメチル化された、ヒストンH3ペプチド(AA21〜44、ATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGG[K−Ahx−ビオチン]−アミド)のカスタム合成品を21stセンチュリー・バイオケミカルズ社(21st Century Biochemicals、マサチューセッツ州マールバロ)から購入した。ライブラリーに含まれるペプチドは、21stセンチュリー・バイオケミカルズ社、アナスペック社(AnaSpec、カリフォルニア州フリーモント)、またはアルタバイオサイエンス社(Alta Bioscience、英国バーミンガム)から入手した。MicroScint20、ストレプトアビジンSPAビーズ(RPNQ0261)、および[3H−]S−アデノシル−メチオニン(SAM)はパーキンエルマー社から購入した。
メチルトランスフェラーゼ活性の生化学的評価
特に断りのない限り、全ての試薬はシグマ社から入手しており、最低でも試薬グレードである。リジン27が未修飾であるか、モノメチル化またはジメチル化された、ヒストンH3ペプチド(AA21〜44、ATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGG[K−Ahx−ビオチン]−アミド)のカスタム合成品を21stセンチュリー・バイオケミカルズ社(21st Century Biochemicals、マサチューセッツ州マールバロ)から購入した。ライブラリーに含まれるペプチドは、21stセンチュリー・バイオケミカルズ社、アナスペック社(AnaSpec、カリフォルニア州フリーモント)、またはアルタバイオサイエンス社(Alta Bioscience、英国バーミンガム)から入手した。MicroScint20、ストレプトアビジンSPAビーズ(RPNQ0261)、および[3H−]S−アデノシル−メチオニン(SAM)はパーキンエルマー社から購入した。
全ての反応は、50mM Tris−HCl、(pH8.0)、2mM MgCl2、4mM DTT、およびTween−20(EZH2ペプチド活性アッセイでは0.001%、ヌクレオソーム活性アッセイでは0.002%)を含むアッセイバッファー中、周囲温度で評価した。
ペプチドアッセイでは、種々の濃度のH3K27ペプチドおよび[3H−]SAMを含む96ウェル反応プレート(コーニング社(Corning)製)にEZH2(20nM)を加えた。プログレス曲線の直線部分中に0.1mM非標識SAMを加えて反応をクエンチした。クエンチした反応混合物を、0.2M NH4HCO3(pH8.0)(ウォッシュバッファー1)で予め洗浄した96ウェルマルチスクリーンHTSフィルタープレート(ミリポア社製、MSPHNXB50)に移し、30分間インキュベートして捕捉させた。その後、フィルタープレートを更なる150μLずつのウォッシュバッファー1で4回洗浄し、乾燥させた。MicroScint20(60μL/ウェル)を加え、密封したプレートを30分間インキュベートし、捕捉された[3H−]Me−ペプチドまたは[3H−]Me−ヌクレオソームの定量化をTopCount液体シンチレーションカウンターでモニタリングした。ろ過後に個々のプレート上に置いた反応標準を基準にアウトプットDPMを標準化した。
ヌクレオソームアッセイでは、フィルタープレート(ミリポア社製、MSDEN6B50)およびウォッシュバッファー(50mMリン酸カリウム(pH7.6)、ウォッシュバッファー2)以外は同様な手法を用いた。以前に報告されているように(35)、モノおよびジヌクレオソームをHeLa細胞から精製した。ヘテロ天然ヌクレオソーム調製物内の個々のモノヌクレオソームユニットの分子量を、個々のヒストンの累積重量[2×H2A(2×14.0kDa)+2×H2B(2×13.8kDa)+2×H3(2×15.2kDa)+2×H4(2×11.2kDa)+200塩基対dsDNA(200×0.66kDa)]に基づいて評価した。
基質共滴定から得られた速度データを、逐次的反応速度機構に適合する等式(1)に当てはめた。等式(1)中、Vは最大速度であり、kcatは酸素濃度に対して標準化されたVを表し、AおよびBは基質濃度を表し、KiaはAの解離定数であり、KaおよびKbはそれぞれ基質AおよびBのミカエリス定数である。
v=VAB/(KiaKb+KaB+KbA+AB) (1)
v=VAB/(KiaKb+KaB+KbA+AB) (1)
実施例8
EZH2の構造的モデリング
H3K9me2ペプチド基質(PDB ID=2RFI)に結合したGLP/EHMT1を一次テンプレートとして用いて、野生型EZH2の相同性モデルを構築し、結晶構造が決定されているヒストンリジンメチルトランスフェラーゼを含む他の関連SETドメインと構造比較した。相同性モデルはケミカルコンピューティンググループ(Chemical Computing Group:CCG)のMolecular Operating Environment(MOE)の2009バージョンを用いて構築した。残基をMOE中で変異させ、回転異性体(rotamer)の形状の探索から最適な配向(orientation)を選択した。A677G変異体のモデルでは(図5C)、トリメチル化に最適な配向でジメチル化リジンを手動で回転させた後に、Y641の低エネルギー回転異性体が選択された。
EZH2の構造的モデリング
H3K9me2ペプチド基質(PDB ID=2RFI)に結合したGLP/EHMT1を一次テンプレートとして用いて、野生型EZH2の相同性モデルを構築し、結晶構造が決定されているヒストンリジンメチルトランスフェラーゼを含む他の関連SETドメインと構造比較した。相同性モデルはケミカルコンピューティンググループ(Chemical Computing Group:CCG)のMolecular Operating Environment(MOE)の2009バージョンを用いて構築した。残基をMOE中で変異させ、回転異性体(rotamer)の形状の探索から最適な配向(orientation)を選択した。A677G変異体のモデルでは(図5C)、トリメチル化に最適な配向でジメチル化リジンを手動で回転させた後に、Y641の低エネルギー回転異性体が選択された。
実施例9
増殖への影響を評価するためおよび成長IC 50 (gIC50)を計算するためのアッセイプロトコール
フラスコに入った適切な培地中で細胞を細胞密度が80〜100%になるまで培養した。細胞を回収、計数し、384ウェル組織培養プレート(グライナー社(Greiner)製、#781090)中に個々の細胞株の成長特性に応じて50〜4000細胞/ウェルの所定の最適な播種密度でプレーティングした。その後、プレートを37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。終濃度0.15%DMSOとなる20ポイントの2倍希釈スキームを用いて化合物で細胞を処理した。プレートの一つの列は0.15%DMSOのみで処理された細胞を含み、一つの列は細胞を含んでおらず、バックグランドとしての役割を果たす。プレートを37℃、5%CO2で6日間インキュベートした。化合物を添加した日に時間ゼロ(t0)の読取り値を取った。プレートを現像するために、25μLのCell Titer Glo(プロメガ社製、#G7572)を各ウェルに加え、室温で12分インキュベートした。Tecan Safire2を用いて発光を測定した。
増殖への影響を評価するためおよび成長IC 50 (gIC50)を計算するためのアッセイプロトコール
フラスコに入った適切な培地中で細胞を細胞密度が80〜100%になるまで培養した。細胞を回収、計数し、384ウェル組織培養プレート(グライナー社(Greiner)製、#781090)中に個々の細胞株の成長特性に応じて50〜4000細胞/ウェルの所定の最適な播種密度でプレーティングした。その後、プレートを37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。終濃度0.15%DMSOとなる20ポイントの2倍希釈スキームを用いて化合物で細胞を処理した。プレートの一つの列は0.15%DMSOのみで処理された細胞を含み、一つの列は細胞を含んでおらず、バックグランドとしての役割を果たす。プレートを37℃、5%CO2で6日間インキュベートした。化合物を添加した日に時間ゼロ(t0)の読取り値を取った。プレートを現像するために、25μLのCell Titer Glo(プロメガ社製、#G7572)を各ウェルに加え、室温で12分インキュベートした。Tecan Safire2を用いて発光を測定した。
Assay Client softwareを用いてデータを分析した。t0と比較した成長率に基づいて用量反応曲線を生成した。4パラメーターのロジスティックモデルを用いて成長IC50値を計算した。
化合物AはEZH2阻害剤である。
実施例10
Y641野生型リンパ腫細胞株におけるH3K27me3レベルの異常な上昇
GCB DLBCL、FL、および骨髄異形成症候群(MDS)に由来する原発性腫瘍においてEZH2の種々の活性化および不活性化変異が報告されている(1〜3、24〜26)。これらの変異の最終的な結果は、H3K27のメチル化の増加または減少である(14、15、24、26)。ヒト癌細胞株におけるH3K27me3の変化を特徴解析するために、本発明者らは、ユニークな7つの腫瘍型に由来する111個の細胞株におけるELISAにより、グローバルなH3K27me3および全ヒストンH3のレベルを定量化した(図1A)。調べた各腫瘍型は、様々なH3K27me3レベルを示し、複数のリンパ腫細胞株は、最も高い非リンパ腫細胞株よりH3K27me3レベルが2〜3倍高かった。これらの細胞株の複数に由来するタンパク質ライセートの更なる分析により、H3K27のメチル化状態間に明白な不均衡があることが明らかとなった(図1B)。全体として、グローバルなH3K27me3レベルがより低いリンパ腫細胞株と比較して、H3K27me3レベルが増加し、その代わりにH3K27me1が減少していた。
Y641野生型リンパ腫細胞株におけるH3K27me3レベルの異常な上昇
GCB DLBCL、FL、および骨髄異形成症候群(MDS)に由来する原発性腫瘍においてEZH2の種々の活性化および不活性化変異が報告されている(1〜3、24〜26)。これらの変異の最終的な結果は、H3K27のメチル化の増加または減少である(14、15、24、26)。ヒト癌細胞株におけるH3K27me3の変化を特徴解析するために、本発明者らは、ユニークな7つの腫瘍型に由来する111個の細胞株におけるELISAにより、グローバルなH3K27me3および全ヒストンH3のレベルを定量化した(図1A)。調べた各腫瘍型は、様々なH3K27me3レベルを示し、複数のリンパ腫細胞株は、最も高い非リンパ腫細胞株よりH3K27me3レベルが2〜3倍高かった。これらの細胞株の複数に由来するタンパク質ライセートの更なる分析により、H3K27のメチル化状態間に明白な不均衡があることが明らかとなった(図1B)。全体として、グローバルなH3K27me3レベルがより低いリンパ腫細胞株と比較して、H3K27me3レベルが増加し、その代わりにH3K27me1が減少していた。
実施例11
リンパ腫細胞株におけるEZH2のA677残基のグリシンへの変異はH3K27me3を異常に増加させた
EHZ2のY641残基がフェニルアラニン(F)、アスパラギン(N)、セリン(S)、またはヒスチジン(H)のいずれかに変異したリンパ腫細胞におけるH3K27のハイパートリメチル化表現型を示す最近の知見に基づき、本発明者らは、H3K27me3レベルが最高のリンパ腫細胞株がY641に活性化変異を有するという仮説と立てた。Y641コドンについての全細胞株のサンガーシークエンシングにより、グローバルなH3K27me3レベルで順位付けした時に上位7つのリンパ腫のうちの6つで活性化変異が明らかになった。
リンパ腫細胞株におけるEZH2のA677残基のグリシンへの変異はH3K27me3を異常に増加させた
EHZ2のY641残基がフェニルアラニン(F)、アスパラギン(N)、セリン(S)、またはヒスチジン(H)のいずれかに変異したリンパ腫細胞におけるH3K27のハイパートリメチル化表現型を示す最近の知見に基づき、本発明者らは、H3K27me3レベルが最高のリンパ腫細胞株がY641に活性化変異を有するという仮説と立てた。Y641コドンについての全細胞株のサンガーシークエンシングにより、グローバルなH3K27me3レベルで順位付けした時に上位7つのリンパ腫のうちの6つで活性化変異が明らかになった。
Y641に変異がなかったH3K27me3レベルが高い一つの細胞株はパイフェルであった。パイフェル細胞株はDLBCLの白血病の時期の患者の胸水から1992年に樹立された(27)。全EZH2コードエキソンのゲノムDNAのサンガーシークエンシングにより、A677残基のグリシンへの非同義変異(A677G)を生じさせるヌクレオチド2045におけるCからGへのヘテロ変異が明らかになった(図2A)。cDNAの配列分析により、野生型および変異型の対立遺伝子の両方が発現されていることが明らかになった(非掲載データ)。この残基はEZH2の触媒SETドメイン内にあり、エキソン18中のY641残基の2エキソン下流に位置している(図2B)。この残基は、複数の種および複数のヒストンメチルトランスフェラーゼで高度に保存されており(図2C)、このことは、この残基がEZH2の機能に重要な役割を果たすことを示している。
実施例12
原発性リンパ腫サンプルにおけるA677G EZH2変異の発生
パイフェル細胞株で確認された変異が原発性ヒトリンパ腫で生じているか否かを調べるために、41個のリンパ腫検体のパネルにおいてこの残基をシークエンシングした。このパネルは、30個のDLBCL、6個のFL、1個の粘膜関連リンパ組織(MALT)の節外辺縁帯B細胞リンパ腫、1個のマントル細胞リンパ腫(MCL)、1個の脾臓辺縁帯リンパ腫(SMZL)、および2個のワルデンシュトレームマクログロブリン血症またはリンパ形質細胞性リンパ腫(WM)からなる(表2)。Y641変異の発生4つに加え、非同義ミスセンス変異がP488およびA677で観察された。A677変異はヘテロ接合性であり、74歳の女性から得られたステージIIEのDLBCLで生じていた(図2A、表2)。cDNA中で両方の対立遺伝子が検出されたことから、この変異は発現されていた(非掲載データ)。これらのデータは、A677G変異が原発性ヒトリンパ腫で発生しており、単に細胞培養のアーチファクトではないことを示している。
原発性リンパ腫サンプルにおけるA677G EZH2変異の発生
パイフェル細胞株で確認された変異が原発性ヒトリンパ腫で生じているか否かを調べるために、41個のリンパ腫検体のパネルにおいてこの残基をシークエンシングした。このパネルは、30個のDLBCL、6個のFL、1個の粘膜関連リンパ組織(MALT)の節外辺縁帯B細胞リンパ腫、1個のマントル細胞リンパ腫(MCL)、1個の脾臓辺縁帯リンパ腫(SMZL)、および2個のワルデンシュトレームマクログロブリン血症またはリンパ形質細胞性リンパ腫(WM)からなる(表2)。Y641変異の発生4つに加え、非同義ミスセンス変異がP488およびA677で観察された。A677変異はヘテロ接合性であり、74歳の女性から得られたステージIIEのDLBCLで生じていた(図2A、表2)。cDNA中で両方の対立遺伝子が検出されたことから、この変異は発現されていた(非掲載データ)。これらのデータは、A677G変異が原発性ヒトリンパ腫で発生しており、単に細胞培養のアーチファクトではないことを示している。
実施例13
EZH2 A677G変異はH3K27メチル化状態に依存しない生化学的活性を付与する
EZH2 Y641変異は基質特異性に影響を与え、その結果、H3K27me2が非修飾型およびモノメチル化型よりも優先されるようになる(図2B)(3、14)。基質選択性に対するA677G変異の影響を更に調べるために、H3K27me0、H3K27me1、またはH3K27me2を含むペプチド基質を用いて、野生型および変異型EZH2複合体の定常状態キネティクスを特徴解析した。3種類のペプチド基質との代謝回転を比較すると(kcatまたはkcat/Kmのいずれかとして)、野生型EZH2は、H3K27中により多くのメチル基が導入されるにつれて活性を失う(すなわち、H3K27me0>H3K27me1>H3K27me2)(図3、表1)。対照的に、評価した全てのY641変異酵素は逆の傾向を示し、H3K27me2ペプチドが最も効率的に利用された(すなわち、H3K27me2>H3K27me1>H3K27me0)(図3、表1)。一方、A677G EZH2複合体は、野生型およびY641変異体のどちらとも異なるプロファイルを示した。A677G EZH2は3種類の基質全てをほぼ等しい効率で且つ野生型酵素の最高の代謝回転に匹敵する速度で利用した(それぞれkcat=0.64s−1対0.62s−1)(図3、表1)。HeLa細胞から精製したヌクレオソームを評価した時、A677G EZH2の活性は野生型EZH2およびY641変異体より高かった(kcat=0.17s−1対0.10s−1(野生型)および0.11s−1(Y641S))。この観察結果は、A677G EZH2複合体が、H3K27の修飾が不均一なより大きなヒストン集団に作用できるためであると考えられる。
EZH2 A677G変異はH3K27メチル化状態に依存しない生化学的活性を付与する
EZH2 Y641変異は基質特異性に影響を与え、その結果、H3K27me2が非修飾型およびモノメチル化型よりも優先されるようになる(図2B)(3、14)。基質選択性に対するA677G変異の影響を更に調べるために、H3K27me0、H3K27me1、またはH3K27me2を含むペプチド基質を用いて、野生型および変異型EZH2複合体の定常状態キネティクスを特徴解析した。3種類のペプチド基質との代謝回転を比較すると(kcatまたはkcat/Kmのいずれかとして)、野生型EZH2は、H3K27中により多くのメチル基が導入されるにつれて活性を失う(すなわち、H3K27me0>H3K27me1>H3K27me2)(図3、表1)。対照的に、評価した全てのY641変異酵素は逆の傾向を示し、H3K27me2ペプチドが最も効率的に利用された(すなわち、H3K27me2>H3K27me1>H3K27me0)(図3、表1)。一方、A677G EZH2複合体は、野生型およびY641変異体のどちらとも異なるプロファイルを示した。A677G EZH2は3種類の基質全てをほぼ等しい効率で且つ野生型酵素の最高の代謝回転に匹敵する速度で利用した(それぞれkcat=0.64s−1対0.62s−1)(図3、表1)。HeLa細胞から精製したヌクレオソームを評価した時、A677G EZH2の活性は野生型EZH2およびY641変異体より高かった(kcat=0.17s−1対0.10s−1(野生型)および0.11s−1(Y641S))。この観察結果は、A677G EZH2複合体が、H3K27の修飾が不均一なより大きなヒストン集団に作用できるためであると考えられる。
実施例14
A677G EZH2の発現はH3K27のハイパートリメチル化を起こすのに十分である
A677GおよびY641 EZH2変異体がヒストンメチル化レベルに与える影響を調べるために、野生型および変異体バージョンのEZH2を細胞中で一過的に発現させた後、H3K27me1およびH3K27me3のレベルを評価した。MCF−7細胞が比較的低レベルのH3K27me3を示し(パイフェルH3K27me3レベルの26%、図1A)、トランスフェクションが容易であるため、この分析にMCF−7細胞を選択した。実際、A677GまたはY641変異EZH2の外因的発現は、H3K27me3の2〜3倍の増加を誘導することができ、このマークのグローバルなレベルをパイフェル細胞で観察されたのと同様なレベルにした(図4)。これらのデータは、H3K27残基のグローバルなハイパートリメチル化を誘導するのにA677Gの発現が十分であることを示している。
A677G EZH2の発現はH3K27のハイパートリメチル化を起こすのに十分である
A677GおよびY641 EZH2変異体がヒストンメチル化レベルに与える影響を調べるために、野生型および変異体バージョンのEZH2を細胞中で一過的に発現させた後、H3K27me1およびH3K27me3のレベルを評価した。MCF−7細胞が比較的低レベルのH3K27me3を示し(パイフェルH3K27me3レベルの26%、図1A)、トランスフェクションが容易であるため、この分析にMCF−7細胞を選択した。実際、A677GまたはY641変異EZH2の外因的発現は、H3K27me3の2〜3倍の増加を誘導することができ、このマークのグローバルなレベルをパイフェル細胞で観察されたのと同様なレベルにした(図4)。これらのデータは、H3K27残基のグローバルなハイパートリメチル化を誘導するのにA677Gの発現が十分であることを示している。
実施例15
A677G変異EZH2の基質選択性および生成物特異性の構造的根拠
EZH2の結晶構造なしで、野生型EZH2のタンパク質配列およびH3K9me2を含むヒストンH3ペプチド基質に結合したGLP/EHMT1の結晶構造に基づいて相同性モデルを構築した(図5A)。このモデルは、野生型EZH2がH3K27のモノおよびジメチル化を主に触媒するがトリメチル化は触媒しないことを示す生化学的データと一致する。Set7/9等のその他のメチルトランスフェラーゼ同様、高度に保存されたEZH2 Y641残基は、リジンε−アミン基との水素結合を介したメチル基転移に最適なように非メチル化およびモノメチル化型のH3K27を配向させると考えられる(28、29)。更に、Phe/Tyrスイッチ位置にチロシンの代わりに保存されたフェニルアラニン残基(F724)が存在することで、非メチル化リジンを更に配向させることが示されている(28)構造的に保存された水分子への水素結合が失われている(図5中には示されていない)。保存された水は、更なる水素結合を有さないので、おそらくより弱く結合しており、そのためモノメチル化リジンが第2のメチル基転移のための位置へと回転する時により容易に置換される。したがって、このモデルは、モノおよびジメチルトランスフェラーゼとしてEZH2が効率的に機能することを裏付けている。しかし、Y641のヒドロキシル酸素とH3K27me2のε−アミン基との間は3.3Åしかなく、ジメチル化リジンが第3のメチル基を受け入れる位置に回転する余地はほとんどない。したがって、EZH2のY641残基は非メチル化およびモノメチル化リジンの配向に関与しつつ、同時にトリメチル化を立体的に制限するという二重の目的を有している。
A677G変異EZH2の基質選択性および生成物特異性の構造的根拠
EZH2の結晶構造なしで、野生型EZH2のタンパク質配列およびH3K9me2を含むヒストンH3ペプチド基質に結合したGLP/EHMT1の結晶構造に基づいて相同性モデルを構築した(図5A)。このモデルは、野生型EZH2がH3K27のモノおよびジメチル化を主に触媒するがトリメチル化は触媒しないことを示す生化学的データと一致する。Set7/9等のその他のメチルトランスフェラーゼ同様、高度に保存されたEZH2 Y641残基は、リジンε−アミン基との水素結合を介したメチル基転移に最適なように非メチル化およびモノメチル化型のH3K27を配向させると考えられる(28、29)。更に、Phe/Tyrスイッチ位置にチロシンの代わりに保存されたフェニルアラニン残基(F724)が存在することで、非メチル化リジンを更に配向させることが示されている(28)構造的に保存された水分子への水素結合が失われている(図5中には示されていない)。保存された水は、更なる水素結合を有さないので、おそらくより弱く結合しており、そのためモノメチル化リジンが第2のメチル基転移のための位置へと回転する時により容易に置換される。したがって、このモデルは、モノおよびジメチルトランスフェラーゼとしてEZH2が効率的に機能することを裏付けている。しかし、Y641のヒドロキシル酸素とH3K27me2のε−アミン基との間は3.3Åしかなく、ジメチル化リジンが第3のメチル基を受け入れる位置に回転する余地はほとんどない。したがって、EZH2のY641残基は非メチル化およびモノメチル化リジンの配向に関与しつつ、同時にトリメチル化を立体的に制限するという二重の目的を有している。
このモデルから、Y641からアスパラギン等のより小さな残基への変異(Y641N)は重要な水素結合の消失およびより大きなリジントンネルの生成の両方が生じると予測される(図5B)。より大きなリジントンネルおよび適切な水素結合の消失はおそらく、柔軟性の大きい非修飾またはモノメチル化リジンの安定化を妨げる。一方、Y641をアスパラギン等のより小さな残基で置換すると、ジメチル化リジンが回転して第3のメチル基転移の位置になることを可能にする、より大きなトンネル(H3K27me2メチル炭素からN641側鎖への距離=3.8Å)が生じる。おそらく、H3Kme2の2個のメチル基もジメチル化リジンの配向を更に助ける有利な疎水性相互作用をリジントンネル中で作る。この解釈は、Y641変異体が非メチル化リジンを効率的に利用しないがジメチル化基質との強力な活性を獲得していることを示す本発明者らおよび他の人々により提示されているデータと一致する。
興味深いことに、野生型EZH2の構造的モデルは、高度に保存されたA677残基がSAMまたはH3K27のいずれとも直接相互作用しないことを示唆しているが、この残基はY641のヒドロキシル酸素に近接している(3.3Å)(図5A)。したがって、A677をより小さなグリシン残基に変異させることで、Y641がリジントンネル内に更なるスペースを生じさせる別のコンホメーションを取ることができ、メチル基転移に適した配向にジメチル化基質が回転できるようになると予測される(図5C)。この別のY641コンホメーションでは、リジンテールが回転して第3のメチル基転移の位置にある時でも、Y641のヒドロキシル酸素とH3K27me2の最も近いメチル炭素との間に十分な空間(3.1Å)がある。したがって、このモデルは、別のY641配向と組み合わされたY641残基の保持が、非修飾、モノ、およびジメチル化基質の効率的なメチル化に寄与していることを示唆している。
実施例16
増殖アッセイ(アッセイ1)におけるEZH2阻害剤への細胞株の感受性
EZH2阻害に対する感受性へのEZH2変異およびH3K27me3レベルの影響を評価するために、化合物Aとして表されるEZH2阻害剤を用いて6日間の増殖アッセイ(増殖アッセイ1)で38個のリンパ腫細胞株を評価した。表5および図6に示されているように、EZH2中に変異を有し、H3K27me3が高い(パイフェルの100%以上)細胞株はEZH2阻害に感受性である。EZH2阻害に抵抗性または弱い感受性であるEZH2変異を有する細胞株がいくつかある(例えば、SUDL−4、DB、OC1−LY−19、およびSKM1)ことから、EZH2変異状態だけからは、これらの条件下におけるEZH2阻害への感受性を予測することはできない。更に、EZH2阻害アッセイの更なる最適化。
増殖アッセイ(アッセイ1)におけるEZH2阻害剤への細胞株の感受性
EZH2阻害に対する感受性へのEZH2変異およびH3K27me3レベルの影響を評価するために、化合物Aとして表されるEZH2阻害剤を用いて6日間の増殖アッセイ(増殖アッセイ1)で38個のリンパ腫細胞株を評価した。表5および図6に示されているように、EZH2中に変異を有し、H3K27me3が高い(パイフェルの100%以上)細胞株はEZH2阻害に感受性である。EZH2阻害に抵抗性または弱い感受性であるEZH2変異を有する細胞株がいくつかある(例えば、SUDL−4、DB、OC1−LY−19、およびSKM1)ことから、EZH2変異状態だけからは、これらの条件下におけるEZH2阻害への感受性を予測することはできない。更に、EZH2阻害アッセイの更なる最適化。
実施例17
EZH2変異、癌、およびEZH2阻害剤を用いた処置についての考察
EZH2レベルの増加は、多くの癌の特徴であり、SU−DHL−4 DLBCL細胞株におけるEZH2のノックダウンはG1/S遷移で成長を停止させることから、一部のリンパ腫細胞の増殖に必要であると考えられている(30)。最近の研究で、H3K27ハイパートリメチル化を生じさせる、リンパ腫におけるEZH2のY641の変異が同定された(1、3、14、15)。本明細書において、本発明者らは、ヒトリンパ腫細胞におけるグローバルなH3K27me3を増加させることができる新規なEZH2変異の同定および特徴解析を報告しており、H3K27me3レベルが増加しており且つEZH2中のY641またはA677変異のいずれかを有するリンパ腫細胞株がEZH2の阻害に感受性であることを実証している。
EZH2変異、癌、およびEZH2阻害剤を用いた処置についての考察
EZH2レベルの増加は、多くの癌の特徴であり、SU−DHL−4 DLBCL細胞株におけるEZH2のノックダウンはG1/S遷移で成長を停止させることから、一部のリンパ腫細胞の増殖に必要であると考えられている(30)。最近の研究で、H3K27ハイパートリメチル化を生じさせる、リンパ腫におけるEZH2のY641の変異が同定された(1、3、14、15)。本明細書において、本発明者らは、ヒトリンパ腫細胞におけるグローバルなH3K27me3を増加させることができる新規なEZH2変異の同定および特徴解析を報告しており、H3K27me3レベルが増加しており且つEZH2中のY641またはA677変異のいずれかを有するリンパ腫細胞株がEZH2の阻害に感受性であることを実証している。
EZH2 Y641変異はGCB DLBCLの22%およびFLの7%で生じている(3)が、本発明者らの研究は、EZH2 A677のグリシンへの変異がかなり珍しい事象であることを示している。本発明者らは、この変異を50個のリンパ腫細胞株中の1個および41個の原発性リンパ腫サンプル中の1個で観察した。更に、Morin et alが最近、RNA−seq、exome−seq、および/またはgenome−seqにより評価した127サンプル中、A677G変異を有するDLBCLを1例(63歳、女性、ステージ1AE)観察している(1)。したがって、この変化の真の発生率を確立するためにはA677コドンの焦点を合わせた遺伝子タイピングを含む更に詳細な研究が必要であるが、これらの初期のデータは、この変異の頻度が2〜3%未満であろうことを示唆している。
これら二つの変異の最終的な結果(すなわち、H3K27me3の増加)が非常に似たものであり得ることを考慮すると、最初、これらの変異がそのような異なる割合で起こることは幾分驚きである。しかし、この矛盾は各部位における可能な活性化変異の幅により大部分が説明され得る。これまで、5つの異なる残基(F、N、S、C、またはH)のいずれかへのY641の変異がH3K27me2基質との活性を増大させることが報告されている((1、3、14、15)および本研究)。この活性増大は、より大きなH3K27me2基質がメチル基転移のための位置へと回転できるようにする、より小さな残基とY641の交換によるものであった。A677G変異は、アラニンとより小さなアミノ酸の交換を介してリジントンネルのサイズを同様に大きくするようであるが、アラニンは既に2番目に小さいアミノ酸であるので、グリシンとしか交換され得ない。ヌクレオチドレベルでは、A677コドン内の9個の単一ヌクレオチド変異の1個だけがグリシン残基を生じさせ、一方、9個のうち5個がY641で活性化変異を生じさせる。したがって、一見低いEZH2 A677G変異の発生率は単に、この特定の部位に可能な変化の数が非常に限定されていることによると考えられる。
オルソロガスなおよび相同なメチルトランスフェラーゼ間でSETドメインが高度に保存されていることから、一つのメチルトランスフェラーゼからの知見を別のメチルトランスフェラーゼへと容易に翻訳することができる。例えば、EZH2のY641残基における変化の影響を、生化学的性質がより詳細に研究されている他のSETドメインメチルトランスフェラーゼの変異分析に基づいて予測することができる。ヒトSET7/9メチルトランスフェラーゼは通常H3K4をモノメチル化するが、SET7/9のY245残基(EZH2のY641に相当)がアラニンに変異している場合、この変異体はもはやH3K4me0基質を修飾することができず、その代わり、H3K4me1ペプチド基質をジおよびトリメチル化する能力を獲得している(31)。H3K9メチルトランスフェラーゼG9aの更なる研究から、Y1067のフェニルアラニンへの変異により酵素がモノおよびジメチルトランスフェラーゼからトリメチルトランスフェラーゼへと変換されることが示されている(32)。
実施例18
EZH2 A677変異体、例えばEZH2 A677Gは治療に有用な新規なバイオマーカーである
本発明者らの知る限り、この研究は、複数のPKMTアーゼ間で保存されているEZH2のA677残基の生化学的および細胞的活性を調べた最初の報告である。しかし、興味深いことに、アカパンカビ(N. crassa)のDIM−5を含む構造的に関連するSETドメインは相当する位置にグリシンを有し(図2C)、そのH3K9基質に3つのメチル化事象全てを行うことが報告されている(33、34)。したがって、EZH2の残基677のアラニンおよび他のSETドメインメチルトランスフェラーゼ中の相当すると考えられる残基は、基質と直接接触することなく基質特異性の調節に重要な役割を果たしているようである。このEZH2のY641とA677の間の相互関係は、リジンメチルトランスフェラーゼの基質および生成物の特異性を調節するために進化してきたであろう多くの重要な機構の一つだけを強調している。
EZH2 A677変異体、例えばEZH2 A677Gは治療に有用な新規なバイオマーカーである
本発明者らの知る限り、この研究は、複数のPKMTアーゼ間で保存されているEZH2のA677残基の生化学的および細胞的活性を調べた最初の報告である。しかし、興味深いことに、アカパンカビ(N. crassa)のDIM−5を含む構造的に関連するSETドメインは相当する位置にグリシンを有し(図2C)、そのH3K9基質に3つのメチル化事象全てを行うことが報告されている(33、34)。したがって、EZH2の残基677のアラニンおよび他のSETドメインメチルトランスフェラーゼ中の相当すると考えられる残基は、基質と直接接触することなく基質特異性の調節に重要な役割を果たしているようである。このEZH2のY641とA677の間の相互関係は、リジンメチルトランスフェラーゼの基質および生成物の特異性を調節するために進化してきたであろう多くの重要な機構の一つだけを強調している。
実施例19
インビトロおよびインビボでのEZH2変異体におけるEZH2阻害剤化合物B処置の概要
真核生物では、ヒストンのエピジェネティックな翻訳後修飾がクロマチン構造および遺伝子発現の調節に重要である。EZH2はポリコーム抑制複合体2(PRC2)の触媒サブユニットであり、ヒストンH3のリジン27(H3K27)のメチル化を介した遺伝子発現の抑制を担う。EZH2過剰発現は腫瘍形成に関係し、複数の腫瘍型における予後不良に関連する(21、36〜39)。更に、EZH2の触媒SETドメイン内のY641およびA677残基の体細胞ヘテロ変異がびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)および濾胞性リンパ腫(FL)中で生じる(1、3、40〜42)。Y641残基は最も頻度の高い変異残基であり、GCB(胚芽細胞B細胞) DLBCLおよびFLの最大22%がこの部位に変異を有する。これらのリンパ腫は、変異酵素の基質選択性の変化によるH3K27トリメチル化(H3K27me3)の増加を示す(14、15、41、43)。しかし、EZH2メチルトランスフェラーゼ活性の特異的な直接的阻害がEZH2変異リンパ腫の処置に有効であるか否かは知られていない。本明細書において、本発明者らは、強力で選択性の高い、S−アデノシル−メチオニン(SAM)競合的な、EZH2メチルトランスフェラーゼ活性の小分子阻害剤であるGSK126が、グローバルなH3K27me3レベルを低減し、サイレンシングされたPRC2標的遺伝子を再活性化することを示した。GSK126はEZH2変異DLBCL細胞株の増殖を効果的に阻害し、マウス中でEZH2変異DLBCL異種移植片の成長を劇的に阻害する。総合すると、これらのデータは、EZH2活性の薬理学的阻害がEZH2変異リンパ腫に対する有望な処置を提供し得ることを示している。
インビトロおよびインビボでのEZH2変異体におけるEZH2阻害剤化合物B処置の概要
真核生物では、ヒストンのエピジェネティックな翻訳後修飾がクロマチン構造および遺伝子発現の調節に重要である。EZH2はポリコーム抑制複合体2(PRC2)の触媒サブユニットであり、ヒストンH3のリジン27(H3K27)のメチル化を介した遺伝子発現の抑制を担う。EZH2過剰発現は腫瘍形成に関係し、複数の腫瘍型における予後不良に関連する(21、36〜39)。更に、EZH2の触媒SETドメイン内のY641およびA677残基の体細胞ヘテロ変異がびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)および濾胞性リンパ腫(FL)中で生じる(1、3、40〜42)。Y641残基は最も頻度の高い変異残基であり、GCB(胚芽細胞B細胞) DLBCLおよびFLの最大22%がこの部位に変異を有する。これらのリンパ腫は、変異酵素の基質選択性の変化によるH3K27トリメチル化(H3K27me3)の増加を示す(14、15、41、43)。しかし、EZH2メチルトランスフェラーゼ活性の特異的な直接的阻害がEZH2変異リンパ腫の処置に有効であるか否かは知られていない。本明細書において、本発明者らは、強力で選択性の高い、S−アデノシル−メチオニン(SAM)競合的な、EZH2メチルトランスフェラーゼ活性の小分子阻害剤であるGSK126が、グローバルなH3K27me3レベルを低減し、サイレンシングされたPRC2標的遺伝子を再活性化することを示した。GSK126はEZH2変異DLBCL細胞株の増殖を効果的に阻害し、マウス中でEZH2変異DLBCL異種移植片の成長を劇的に阻害する。総合すると、これらのデータは、EZH2活性の薬理学的阻害がEZH2変異リンパ腫に対する有望な処置を提供し得ることを示している。
化合物B(GSK126)はEZH2阻害剤である。化合物Bは以下の式で表される。
実施例20
EZH2メチルトランスフェラーゼ活性の強力な阻害剤としての化合物B(GSK126)を同定するためのハイスループットスクリーニング
EZH2メチルトランスフェラーゼ活性の阻害剤を同定するために、5個のメンバーで構成されるPRC2タンパク質複合体を用いたハイスループットな生化学的スクリーニングを行った(44)。この研究により、Ki app=700nMの小分子EZH2阻害剤が同定された。医薬品化学によるこの化合物の徹底的な最適化によりGSK126が作製された(図7A)。GSK126は、利用される基質とは関係なく同様な強さでWTおよび変異EZH2メチルトランスフェラーゼ活性の両方を強力に阻害し(Ki app=0.5〜3nM)、SAMと競合し、ペプチド基質とは競合しない(図7B、非掲載データ)。GSK126は他のメチルトランスフェラーゼおよびタンパク質クラスに対して高い選択性を有する(非掲載データ)。特に、GSK126は、SETドメインを含むメチルトランスフェラーゼおよびSETドメインを含まないメチルトランスフェラーゼの両方を含む他の20種類のヒトメチルトランスフェラーゼと比較してEZH2に対して1,000倍超の選択性を有する(45)。EZH2とSETドメイン内で96%同一、全体で76%同一のEZH1でさえ、150分の1未満の強さでしか阻害されない(Ki app=89nM)。酵素作用機序および阻害剤の構造と活性との関連性データと組み合せてEZH2相同性モデル(41)を用い、イン・シリコドッキングにより、SAM結合ポケットがGSK126の最もそれらしいドッキング部位として示された。ここで、これはSAM結合ポケットの片側を形成するポストSETドメインと広く接触することが予測される(図8a〜d)。興味深いことに、予測されたGSK126結合部位の10Å内に、EZH2とEZH1の間で異なる6個の残基のうち、4個がポストSETドメイン内にあり、これらがEZH1に対する効力の消失に寄与していると考えられる。
EZH2メチルトランスフェラーゼ活性の強力な阻害剤としての化合物B(GSK126)を同定するためのハイスループットスクリーニング
EZH2メチルトランスフェラーゼ活性の阻害剤を同定するために、5個のメンバーで構成されるPRC2タンパク質複合体を用いたハイスループットな生化学的スクリーニングを行った(44)。この研究により、Ki app=700nMの小分子EZH2阻害剤が同定された。医薬品化学によるこの化合物の徹底的な最適化によりGSK126が作製された(図7A)。GSK126は、利用される基質とは関係なく同様な強さでWTおよび変異EZH2メチルトランスフェラーゼ活性の両方を強力に阻害し(Ki app=0.5〜3nM)、SAMと競合し、ペプチド基質とは競合しない(図7B、非掲載データ)。GSK126は他のメチルトランスフェラーゼおよびタンパク質クラスに対して高い選択性を有する(非掲載データ)。特に、GSK126は、SETドメインを含むメチルトランスフェラーゼおよびSETドメインを含まないメチルトランスフェラーゼの両方を含む他の20種類のヒトメチルトランスフェラーゼと比較してEZH2に対して1,000倍超の選択性を有する(45)。EZH2とSETドメイン内で96%同一、全体で76%同一のEZH1でさえ、150分の1未満の強さでしか阻害されない(Ki app=89nM)。酵素作用機序および阻害剤の構造と活性との関連性データと組み合せてEZH2相同性モデル(41)を用い、イン・シリコドッキングにより、SAM結合ポケットがGSK126の最もそれらしいドッキング部位として示された。ここで、これはSAM結合ポケットの片側を形成するポストSETドメインと広く接触することが予測される(図8a〜d)。興味深いことに、予測されたGSK126結合部位の10Å内に、EZH2とEZH1の間で異なる6個の残基のうち、4個がポストSETドメイン内にあり、これらがEZH1に対する効力の消失に寄与していると考えられる。
実施例21
化合物B(GSK126)はH3K27me3の消失を誘導する
EZH2変異体の基質選択性の変化は細胞H3K27メチル化状態の不均衡を引き起こす(図9a)(14、41)。それにもかかわらず、GSK126は、EZH2の変異状態に関係なく10〜252nMのIC50値で、EZH2がWTであるDLBCL細胞株およびEZH2が変異体であるDLBCL細胞株の両方でH3K27me3の消失を誘導した(T検定、p=0.27)(図7c)。更なる分析により、H3K27me3の阻害が24時間より前に始まり、効力は2日後に最大であることが示された(図9b)。GSK126はH3K27me3を最も強力に阻害し、次いでH3K27me2を阻害し、H3K27me1は最高阻害剤濃度で弱く減少しただけであった(図7、および図9c)。全ヒストンH3およびPRC2構成要素はGSK126の影響を受けなかった(図9cおよび10)ので、H3K27メチル化の減少はEZH2メチルトランスフェラーゼ活性の直接阻害によるものであり、ヒストンH3またはPRC2の分解によるものではない。これは、PRC2複合体の分解を促進し且つ細胞内S−アデノシル−L−ホモシステイン(SAH)濃度への影響を介してEZH2を間接的に阻害する、SAHヒドロラーゼの阻害剤である3−デアザネプラノシンA(DZNep)(46)とは対照的である。
化合物B(GSK126)はH3K27me3の消失を誘導する
EZH2変異体の基質選択性の変化は細胞H3K27メチル化状態の不均衡を引き起こす(図9a)(14、41)。それにもかかわらず、GSK126は、EZH2の変異状態に関係なく10〜252nMのIC50値で、EZH2がWTであるDLBCL細胞株およびEZH2が変異体であるDLBCL細胞株の両方でH3K27me3の消失を誘導した(T検定、p=0.27)(図7c)。更なる分析により、H3K27me3の阻害が24時間より前に始まり、効力は2日後に最大であることが示された(図9b)。GSK126はH3K27me3を最も強力に阻害し、次いでH3K27me2を阻害し、H3K27me1は最高阻害剤濃度で弱く減少しただけであった(図7、および図9c)。全ヒストンH3およびPRC2構成要素はGSK126の影響を受けなかった(図9cおよび10)ので、H3K27メチル化の減少はEZH2メチルトランスフェラーゼ活性の直接阻害によるものであり、ヒストンH3またはPRC2の分解によるものではない。これは、PRC2複合体の分解を促進し且つ細胞内S−アデノシル−L−ホモシステイン(SAH)濃度への影響を介してEZH2を間接的に阻害する、SAHヒドロラーゼの阻害剤である3−デアザネプラノシンA(DZNep)(46)とは対照的である。
実施例22
化合物BはB細胞リンパ腫細胞の成長を阻害する
本発明者らは、化合物Aで用いたhatと比較して(前述の化合物A処理ではアッセイ1を用いた)改良された増殖アッセイを用いてB細胞リンパ腫細胞株のパネルにおいて細胞増殖への化合物B(GSK126)の影響を評価した。したがって、実施例22および表6は、細胞株、例えばリンパ腫細胞株へのHZH2阻害剤の阻害をよりよく反映している。DLBCL細胞株がEZH2阻害に最も感受性が高かった(図11a)。最も感受性の高いDLBCL細胞株7個の内の6個がY641N、Y641F、またはA677GのEZH2変異を有していた(成長IC50=28〜861nM)(図11a、表6、および図12)。例外はHTであり、これはEZH2が野生型である(成長IC50=516nM)。興味深いことに、HTは、複数の腫瘍型でしばしば不活性化されているH3K27デメチラーゼであるUTXに変異を有する(R1111C)(19)。残りの11個のDLBCL細胞株のうち、2個だけがEZH2変異を有しており、このことは、ほとんどの場合において、変異EZH2を有するDLBCL細胞株が細胞成長に関してEZH2活性に依存しているが、場合によっては、一緒に起こっている変化がEZH2活性への細胞の依存を克服させてEZH2阻害への感受性を下げ得ることを示唆している。EZH2変異細胞株中、GSK126への感受性は、DLBCLで見られる共通する変化であるBCL2の転位またはp53の変異とは無関係である(表6)。H3K27me3の阻害と細胞成長との間には中程度の相関があった(ピアソン、r=0.62)が、GSK126への感受性とEZH2タンパク質レベルとの間には相関はなかった(図13a〜c)。興味深いことに、最も感受性の高いDLBCL細胞株の二つ、WSU−DLCL2およびKARPAS−422は難治性疾患の患者に由来する(47、48)。このことは、治療標準に抵抗性のDLBCL細胞がEZH2阻害に感受性であり得ることを示唆している。バーキット(BL)およびホジキン(HL)リンパ腫細胞株は、WT EZH2を有するBL細胞株であるJiyoye(成長IC50=0.23μM)を除いて、一般的にEZH2阻害にさほど感受性ではなかった(成長IC50>1.3μM)。リンパ腫亜型間の感受性の決定要因を完全に解明するには、更なるリンパ腫細胞株におけるGSK126の評価ならびに大規模なゲノムおよびエピゲノムの特徴解析が必要である。最も感受性の高い細胞株中で細胞分裂停止反応および細胞毒性反応の両方が観察された(表6)。そこで、最も感受性の高い細胞株の二つにおいてGSK126により誘導される増殖および細胞死への影響のタイミングを詳細に調べた。パイフェルでは、2日後に細胞増殖の強力な阻害が観察され(図11b)、3日後に細胞数の純減が明白であった(図11c)。この細胞死は、サブG1集団の増加(図11d)および用量依存的なカスパーぜ活性の誘導(図11e)に示されるように、カスパーゼを介したアポトーシスにより起こっているようである。KARPAS−422における応答はそれより遅く、効力が最大になるまで6〜7日必要であった(図11b)。更に、0日目のレベルより高く維持されているCTG値、サブG1量がほとんどないG1停止(DMSOおよび500nM GSK126でそれぞれ細胞の43%および77%がG1)、および1μM未満のGSK126でカスパーぜ活性が最小限であることから示されるように、KARPAS−422では主に細胞分裂停止効果が観察された(図11f〜h)。これらの観察結果と一致し、shRNAを介したEZH2のノックダウンにおいては、パイフェルでは重度の細胞毒性応答およびアポトーシス応答が生じ、KARPAS−422では、細胞増殖が低減し、カスパーぜの活性化が起こらなかった。このことは、GSK126で観察された表現型への影響がEZH2の阻害によるものであることを示している(図14a〜c)。
化合物BはB細胞リンパ腫細胞の成長を阻害する
本発明者らは、化合物Aで用いたhatと比較して(前述の化合物A処理ではアッセイ1を用いた)改良された増殖アッセイを用いてB細胞リンパ腫細胞株のパネルにおいて細胞増殖への化合物B(GSK126)の影響を評価した。したがって、実施例22および表6は、細胞株、例えばリンパ腫細胞株へのHZH2阻害剤の阻害をよりよく反映している。DLBCL細胞株がEZH2阻害に最も感受性が高かった(図11a)。最も感受性の高いDLBCL細胞株7個の内の6個がY641N、Y641F、またはA677GのEZH2変異を有していた(成長IC50=28〜861nM)(図11a、表6、および図12)。例外はHTであり、これはEZH2が野生型である(成長IC50=516nM)。興味深いことに、HTは、複数の腫瘍型でしばしば不活性化されているH3K27デメチラーゼであるUTXに変異を有する(R1111C)(19)。残りの11個のDLBCL細胞株のうち、2個だけがEZH2変異を有しており、このことは、ほとんどの場合において、変異EZH2を有するDLBCL細胞株が細胞成長に関してEZH2活性に依存しているが、場合によっては、一緒に起こっている変化がEZH2活性への細胞の依存を克服させてEZH2阻害への感受性を下げ得ることを示唆している。EZH2変異細胞株中、GSK126への感受性は、DLBCLで見られる共通する変化であるBCL2の転位またはp53の変異とは無関係である(表6)。H3K27me3の阻害と細胞成長との間には中程度の相関があった(ピアソン、r=0.62)が、GSK126への感受性とEZH2タンパク質レベルとの間には相関はなかった(図13a〜c)。興味深いことに、最も感受性の高いDLBCL細胞株の二つ、WSU−DLCL2およびKARPAS−422は難治性疾患の患者に由来する(47、48)。このことは、治療標準に抵抗性のDLBCL細胞がEZH2阻害に感受性であり得ることを示唆している。バーキット(BL)およびホジキン(HL)リンパ腫細胞株は、WT EZH2を有するBL細胞株であるJiyoye(成長IC50=0.23μM)を除いて、一般的にEZH2阻害にさほど感受性ではなかった(成長IC50>1.3μM)。リンパ腫亜型間の感受性の決定要因を完全に解明するには、更なるリンパ腫細胞株におけるGSK126の評価ならびに大規模なゲノムおよびエピゲノムの特徴解析が必要である。最も感受性の高い細胞株中で細胞分裂停止反応および細胞毒性反応の両方が観察された(表6)。そこで、最も感受性の高い細胞株の二つにおいてGSK126により誘導される増殖および細胞死への影響のタイミングを詳細に調べた。パイフェルでは、2日後に細胞増殖の強力な阻害が観察され(図11b)、3日後に細胞数の純減が明白であった(図11c)。この細胞死は、サブG1集団の増加(図11d)および用量依存的なカスパーぜ活性の誘導(図11e)に示されるように、カスパーゼを介したアポトーシスにより起こっているようである。KARPAS−422における応答はそれより遅く、効力が最大になるまで6〜7日必要であった(図11b)。更に、0日目のレベルより高く維持されているCTG値、サブG1量がほとんどないG1停止(DMSOおよび500nM GSK126でそれぞれ細胞の43%および77%がG1)、および1μM未満のGSK126でカスパーぜ活性が最小限であることから示されるように、KARPAS−422では主に細胞分裂停止効果が観察された(図11f〜h)。これらの観察結果と一致し、shRNAを介したEZH2のノックダウンにおいては、パイフェルでは重度の細胞毒性応答およびアポトーシス応答が生じ、KARPAS−422では、細胞増殖が低減し、カスパーぜの活性化が起こらなかった。このことは、GSK126で観察された表現型への影響がEZH2の阻害によるものであることを示している(図14a〜c)。
実施例23
遺伝子発現への化合物Bの影響
EZH2は転写抑制に関わるので、本発明者らは、GSK126への感受性が様々なDLBCL細胞株において遺伝子発現へのGSK126の影響を評価した。最も感受性の高い細胞株で強力な転写活性化が確認された(図15a、図16a、および非掲載データ)。H3K27me2/3が抑制性であることを考慮すれば驚くべきことではないが、転写変化の大部分はアップレギュレーションを伴った。GSK126処理とKARPAS−422およびパイフェル細胞におけるEZH2ノックダウンとで観察された遺伝子発現変化間の高度な類似性は、これらの転写変化がEZH2活性の消失によるものであり、非特異的(off−target)影響によるものではないことを示唆している(非掲載データ)。更に、最も反応性の3個の細胞株についてのChIP−seqデータの分析から、処理前、アップレギュレートされた遺伝子はH3K27me3の広範な濃縮を示すことが明らかになり、このことは、これらの遺伝子がH3K27me3でマーキングされたEZH2標的であることを示唆ている(図15bおよび図17a〜c)。
遺伝子発現への化合物Bの影響
EZH2は転写抑制に関わるので、本発明者らは、GSK126への感受性が様々なDLBCL細胞株において遺伝子発現へのGSK126の影響を評価した。最も感受性の高い細胞株で強力な転写活性化が確認された(図15a、図16a、および非掲載データ)。H3K27me2/3が抑制性であることを考慮すれば驚くべきことではないが、転写変化の大部分はアップレギュレーションを伴った。GSK126処理とKARPAS−422およびパイフェル細胞におけるEZH2ノックダウンとで観察された遺伝子発現変化間の高度な類似性は、これらの転写変化がEZH2活性の消失によるものであり、非特異的(off−target)影響によるものではないことを示唆している(非掲載データ)。更に、最も反応性の3個の細胞株についてのChIP−seqデータの分析から、処理前、アップレギュレートされた遺伝子はH3K27me3の広範な濃縮を示すことが明らかになり、このことは、これらの遺伝子がH3K27me3でマーキングされたEZH2標的であることを示唆ている(図15bおよび図17a〜c)。
感受性細胞株で観察された反応とは対照的に、成長がEZH2阻害の影響を受けないWT EZH2を有する細胞株のToledoではGSK126による転写変化は最小限であった(図15a、図16b)。2μMのGSK126でさえ、この用量および時間ではH3K27me3がほぼ完全に消失するにも関わらず、Toledoでは非常にわずかな転写変化しか観察されなかった(23個のアップレギュレートおよび10個のダウンレギュレートされたプローブセット)(図9cおよび非掲載データ)。同様に、二つのH3K27me3濃縮遺伝子について行ったqRT−PCRでは、パイフェルおよびKARPAS−422ではたった25nMのGSK126で遺伝子発現が用量反応的に増加していたが、Toledoでは1μMまでのGSK126で転写変化がなかった(図15cおよび非掲載データ)。興味深いことに、最も感受性の高いWT EZH2細胞株であるHTでさえ、同様な感受性のEZH2変異DLBCL細胞株と比較した時、転写応答はそれほど顕著でなかった(図15a)。転写の変化倍率の基準を2.0から1.5に緩和したところ、HT細胞において中程度の更なる転写変化が明らかになった(図16b)。EZH2 WTおよびより感受性の低い変異体細胞株におけるこの弱い転写応答は、これらの細胞株に転写応答を弱める別の補償的な機構(H3K9、H4K20、またはDNAのメチル化等)が存在し得ることを示唆している。
EZH2変異細胞株中、グローバルなH3K27me3レベルは転写応答性の細胞株で統計的により高く(T検定、p=0.019)、このことは、グローバルなH3K27me3レベルと組み合せたEZH2変異状態が変異状態単独よりも良好な予測バイオマーカーであり得ることを示唆している(図16c)。最も感受性の高い5個のEZH2変異体細胞株はアップレギュレートされた遺伝子発現変化が優勢であった(69〜95%)が、2倍または1.5倍の有意性基準を用いた場合、発現量に差のあるプローブセット間でほとんど重複が見られなかった(図15dおよび16d)。35個のアップレギュレートされたプローブセットだけが、これら5個の変異細胞株の少なくとも4個で共通していた(表7)。これら共通のアップレギュレートされたプローブセットの検査により、多くでH3K27me3の濃縮が明らかになった(32/35)(表7および非掲載データ)。更に、これらのプローブセットの多くは、弱くではあるが、他の細胞株でも誘導されており、これらの設定下での完全な遺伝子活性化には更なる時間またはクロマチン因子が必要であることが示唆される(図15eおよび表7)。最後に、共通してアップレギュレートされた限定された遺伝子セット中、どの単一の経路またはプロセスも有意に濃縮されていなかったが、個々の各細胞株における制御された遺伝子セットのジーンオントロジーエンリッチメント解析により、細胞周期制御、細胞死、および生物学的/細胞プロセスの制御を含む複数の共通するプロセスが明らかになった(図18および非掲載データ)。これらのデータは、GSK126を用いたEZH2の阻害に続くH3K27me3のグローバルな消失が、感受性とよく相関するEZH2標的遺伝子の転写活性化に関連すること、および変異EHZ2が、標的化された様式ではなくグローバルな様式でH3K27me3の制御を解除することを示している。感受性細胞株のアップレギュレートされた遺伝子セット間の有意なばらつきは、各細胞株におけるエピゲノムの複雑さおよび独自性、ならびに個々のリンパ腫の発達中の選択圧の多様性を強調していると考えられる驚くべき観察結果である。
実施例24
化合物Bはインビボで腫瘍の成長を阻害する
細胞培養における強力な作用に基づき、本発明者らは、KARPAS−422およびパイフェルの皮下異種移植片を用いてマウスにおいてGSK126を評価した。GSK126の1日1回(QD)投与を10日間行った後、細胞培養で得られた観察結果と一致して、用量依存的にグローバルなH3K27me3が減少し、遺伝子発現が増加した(図19a、b)。GSK126は初期に血中から急速に除去(clear)されたが、血液および腫瘍からの薬物消去がより遅い、延長された最終期があった(図20a、b)。50mg/kgの連日投薬で、KARPAS−422およびパイフェルモデルの両方において完全な腫瘍成長阻害が観察された(図19cおよび図21a)。KARPAS−422異種移植片でより多い投与計画を調べたところ、顕著な腫瘍退縮が観察された(図19c)。投薬休止後、50mg/kg、QD群の腫瘍は腫瘍停滞を示したが、150mg/kg、QDおよび300mg/kg、週2回の群では完全な腫瘍の根絶が観察された。腫瘍成長阻害は更に、より侵襲性の強いKARPAS−422腫瘍を有するマウスの統計的に有意な生存率増加と相関しており、ビヒクル処置動物では自然死(spontaneous death)が起こった(図19d)。これらの驚くべき観察結果に基づき、より低量のGSK126を週1回または1週間の休薬期間を設けて与える断続的な投与計画を、大きな腫瘍を有するKARPAS−422腫瘍異種移植片中で調べた(図21b)。全てのスケジュールで腫瘍成長阻害が示された(91〜100%、T検定、p値=0.0008〜0.0024)。これらの結果は、GSK126に対する応答が長時間続き、断続的な投薬スケジュールが、進行した腫瘍においてでさえ臨床状況で有効であり得ることを示している。
化合物Bはインビボで腫瘍の成長を阻害する
細胞培養における強力な作用に基づき、本発明者らは、KARPAS−422およびパイフェルの皮下異種移植片を用いてマウスにおいてGSK126を評価した。GSK126の1日1回(QD)投与を10日間行った後、細胞培養で得られた観察結果と一致して、用量依存的にグローバルなH3K27me3が減少し、遺伝子発現が増加した(図19a、b)。GSK126は初期に血中から急速に除去(clear)されたが、血液および腫瘍からの薬物消去がより遅い、延長された最終期があった(図20a、b)。50mg/kgの連日投薬で、KARPAS−422およびパイフェルモデルの両方において完全な腫瘍成長阻害が観察された(図19cおよび図21a)。KARPAS−422異種移植片でより多い投与計画を調べたところ、顕著な腫瘍退縮が観察された(図19c)。投薬休止後、50mg/kg、QD群の腫瘍は腫瘍停滞を示したが、150mg/kg、QDおよび300mg/kg、週2回の群では完全な腫瘍の根絶が観察された。腫瘍成長阻害は更に、より侵襲性の強いKARPAS−422腫瘍を有するマウスの統計的に有意な生存率増加と相関しており、ビヒクル処置動物では自然死(spontaneous death)が起こった(図19d)。これらの驚くべき観察結果に基づき、より低量のGSK126を週1回または1週間の休薬期間を設けて与える断続的な投与計画を、大きな腫瘍を有するKARPAS−422腫瘍異種移植片中で調べた(図21b)。全てのスケジュールで腫瘍成長阻害が示された(91〜100%、T検定、p値=0.0008〜0.0024)。これらの結果は、GSK126に対する応答が長時間続き、断続的な投薬スケジュールが、進行した腫瘍においてでさえ臨床状況で有効であり得ることを示している。
KARPAS−422異種移植片を有するマウスにおいて体重がほとんどまたは全く減少せず、毛づくろいおよび行動が正常であり、生存率が大幅に改善されたことから示されるように、GSK126は調べた用量およびスケジュールで忍容性が良好であった(図22a〜cおよび図19d)。正常な造血におけるEZH2の役割および骨髄悪性腫瘍におけるEZH2の機能喪失型変異の同定を考慮して(49〜52)、本発明者らは、免疫適格性マウスの末梢血液へのGSK126処置の影響を調べた。全血球計算分析の結果、腫瘍異種移植片で有効性が観察された用量および時間で、いずれの血液細胞タイプでも有意な変化は見られなかった(図22d)。
過去10年間で、活性化体細胞変異を有する腫瘍性タンパク質を特異的に阻害する標的化試薬の開発により、癌患者にとって大きな臨床的利益がもたらされた(53、54)。本明細書のデータは、EZH2メチルトランスフェラーゼ活性の阻害が、EZH2に活性化変異を有するDLBCLおよび無痛性FLの処置に実行可能な戦略であり得ることの有力な証拠を提供する。GSK126はまた、EZH2過剰発現が予後不良と関連付けられている腫瘍(36〜39)およびUTXに機能喪失型変異を有する腫瘍(19、50、55)の生存にEZH2活性が必要であるか否かを評価する手段を提供する。本発明者らは、EZH2中に機能喪失型変異を有する骨髄性悪性腫瘍(50〜52)の処置にGSK126が有効であるとは予想していないが、GSK126は正常な骨髄の発達におけるEZH2の役割を評価するためおよび骨髄増殖性新生物におけるEZH2の発癌的役割を理解するための重要なツールとなるであろう。最後に、PRC2複合体の分解を引き起こさない選択的EZH2阻害剤の同定は、従来の遺伝子操作実験では解明できなかった発生、腫瘍形成、および腫瘍進行におけるその足場的役割に対してEZH2のメチルトランスフェラーゼ活性の役割を理解するのに有用なツールを提供する。
実施例25
GSK126(化合物B)を開示する実施例の方法の要約
生化学的アッセイには、WTまたは変異EZH2を含む5個のメンバーで構成されるPRC2複合体(ヒトFlag−EZH2、EED、SUZ12、AEBP2、RbAp48)、[3H−]SAM、および記載のペプチド基質を用い、反応液は30分間インキュベートした。グローバルなヒストン修飾レベルは、全ヒストンH3、H3K27me1、H3K27me2、またはH3K27me3に特異的な抗体を用いたELISAまたはウェスタンブロット法により決定した。細胞増殖およびカスパーゼ−3/7活性はそれぞれCellTiter−GloおよびCaspase−Glo3/7(プロメガ社製)を用いて評価した。遺伝子発現プロファイリングは、Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0マイクロアレイを用いて行った。limma統計パッケージ(http://www.bioconductor.org)を用いて線形モデルにデータを当てはめ、処理と対照の対で対比を行うことにより、発現量に差のあるプローブセットを決定した。有意なプローブセットを検出用のフィルターにかけた(log2シグナル域値8)、平均変化倍率>2もしくは<−2または>1.5もしくは<−1.5(記載されている通り)、FDR(Benjamini Hochberg)により多重検定に対して補正したp値<0.1。H3K27me3 ChIPのリードをBowtie(56)を用いて整列させた。パラメーターを最適化したSICER(57)を用いてH3K27me3濃縮ピークを同定した。カスタムのPERLスクリプトを用いて、遺伝子セット間の平均基礎H3K27me3 ChIP−seqタグ密度を定量化した。全てのインビボ実験は、GSKの動物実験委員会による審査後、実験動物の取り扱いに関するGSKの方針(GSK Policy on the Care, Welfare and Treatment of Laboratory Animals)に準じて行われた。GSK126およびビヒクルはマウス腹腔内に投与した。二つのサンプルの分散が等しいと仮定して両側t検定を行った。
GSK126(化合物B)を開示する実施例の方法の要約
生化学的アッセイには、WTまたは変異EZH2を含む5個のメンバーで構成されるPRC2複合体(ヒトFlag−EZH2、EED、SUZ12、AEBP2、RbAp48)、[3H−]SAM、および記載のペプチド基質を用い、反応液は30分間インキュベートした。グローバルなヒストン修飾レベルは、全ヒストンH3、H3K27me1、H3K27me2、またはH3K27me3に特異的な抗体を用いたELISAまたはウェスタンブロット法により決定した。細胞増殖およびカスパーゼ−3/7活性はそれぞれCellTiter−GloおよびCaspase−Glo3/7(プロメガ社製)を用いて評価した。遺伝子発現プロファイリングは、Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0マイクロアレイを用いて行った。limma統計パッケージ(http://www.bioconductor.org)を用いて線形モデルにデータを当てはめ、処理と対照の対で対比を行うことにより、発現量に差のあるプローブセットを決定した。有意なプローブセットを検出用のフィルターにかけた(log2シグナル域値8)、平均変化倍率>2もしくは<−2または>1.5もしくは<−1.5(記載されている通り)、FDR(Benjamini Hochberg)により多重検定に対して補正したp値<0.1。H3K27me3 ChIPのリードをBowtie(56)を用いて整列させた。パラメーターを最適化したSICER(57)を用いてH3K27me3濃縮ピークを同定した。カスタムのPERLスクリプトを用いて、遺伝子セット間の平均基礎H3K27me3 ChIP−seqタグ密度を定量化した。全てのインビボ実験は、GSKの動物実験委員会による審査後、実験動物の取り扱いに関するGSKの方針(GSK Policy on the Care, Welfare and Treatment of Laboratory Animals)に準じて行われた。GSK126およびビヒクルはマウス腹腔内に投与した。二つのサンプルの分散が等しいと仮定して両側t検定を行った。
WTおよび変異EZH2のGSK126阻害のK i app 値の決定
WTまたは変異(A677G、Y641N、Y641C、Y641H、Y641S、またはY641F)EZH2のいずれかを含む5個のメンバーで構成されるPRC2複合体(Flag−EZH2、EED、SUZ12、AEBP2、RbAp48)は以前に報告されているように調製した(41)。GSK126をDMSOに溶解し、最終DMSO濃度を2.5%として0.6〜300nMの濃度で試験した。インビトロで基質にH3K27me0を好む野生型EZH2とは対照的に、EZH2 Y641変異体はH3K27me2を好み、H3K27me0またはH3K27me1にはほとんど活性を有さない。A677G変異体はH3K27me0、H3K27me1、およびH3K27me2を効率的にメチル化する点でEZH2の野生型およびY641変異体型のどちらとも異なるので、K27me0(WT、A677G EZH2)、K27me1(A677G EZH2)、またはK27me2(A677G、Y641N、Y641C、Y641H、Y641S、およびY641F EZH2)のいずれかを有するヒストンH3ペプチド(残基21〜44、最終10μM)をメチルトランスフェラーゼ基質として用いた。GSK126をプレートに加えた後、6nM EZH2複合体およびペプチドを加えた。GSK126の効力は[SAM]=Kmのアッセイランの密着結合限界(tight binding limit)であるかそれに近いので、本発明者らは、そのKmと比較して高濃度の競合基質SAM(SAMのKmを0.3μMとして、7.5μM SAM)でIC50値を測定する方法を用いた。これらの条件下では、酵素濃度の寄与が比較的小さくなり(等式1参照)、Kiの正確な推定値を計算することができる(58)。[3H−]SAMで反応を開始させ、30分間インキュベートし、500倍過剰の非標識SAMを加えてクエンチし、MSPH Multiscreenプレート(EMDミリポア社製、米国マサチューセッツ州ビルリカ)用のメーカーが提供しているプロトコールに従い、メチル化された生成ペプチドをホスホセルロースフィルター上に捕捉した。20μLのMicroscint−20カクテルを添加した後にTopCount(どちらもパーキンエルマー社製、米国マサチューセッツ州ウォルサム)を用いてプレートを読み取った。競合阻害剤のチェン−プルソフ(Cheng−Prusoff)の関係(59)を用いて見かけのKi値±s.d.を計算した(n=2)。
等式1:IC50=Ki *(1+[S]/Km)+[E]/2
WTまたは変異(A677G、Y641N、Y641C、Y641H、Y641S、またはY641F)EZH2のいずれかを含む5個のメンバーで構成されるPRC2複合体(Flag−EZH2、EED、SUZ12、AEBP2、RbAp48)は以前に報告されているように調製した(41)。GSK126をDMSOに溶解し、最終DMSO濃度を2.5%として0.6〜300nMの濃度で試験した。インビトロで基質にH3K27me0を好む野生型EZH2とは対照的に、EZH2 Y641変異体はH3K27me2を好み、H3K27me0またはH3K27me1にはほとんど活性を有さない。A677G変異体はH3K27me0、H3K27me1、およびH3K27me2を効率的にメチル化する点でEZH2の野生型およびY641変異体型のどちらとも異なるので、K27me0(WT、A677G EZH2)、K27me1(A677G EZH2)、またはK27me2(A677G、Y641N、Y641C、Y641H、Y641S、およびY641F EZH2)のいずれかを有するヒストンH3ペプチド(残基21〜44、最終10μM)をメチルトランスフェラーゼ基質として用いた。GSK126をプレートに加えた後、6nM EZH2複合体およびペプチドを加えた。GSK126の効力は[SAM]=Kmのアッセイランの密着結合限界(tight binding limit)であるかそれに近いので、本発明者らは、そのKmと比較して高濃度の競合基質SAM(SAMのKmを0.3μMとして、7.5μM SAM)でIC50値を測定する方法を用いた。これらの条件下では、酵素濃度の寄与が比較的小さくなり(等式1参照)、Kiの正確な推定値を計算することができる(58)。[3H−]SAMで反応を開始させ、30分間インキュベートし、500倍過剰の非標識SAMを加えてクエンチし、MSPH Multiscreenプレート(EMDミリポア社製、米国マサチューセッツ州ビルリカ)用のメーカーが提供しているプロトコールに従い、メチル化された生成ペプチドをホスホセルロースフィルター上に捕捉した。20μLのMicroscint−20カクテルを添加した後にTopCount(どちらもパーキンエルマー社製、米国マサチューセッツ州ウォルサム)を用いてプレートを読み取った。競合阻害剤のチェン−プルソフ(Cheng−Prusoff)の関係(59)を用いて見かけのKi値±s.d.を計算した(n=2)。
等式1:IC50=Ki *(1+[S]/Km)+[E]/2
GSK126のEZH2阻害機構
前述のアッセイ条件を用いて、0.1〜15μMの複数のSAM濃度、次いで別個に16〜60μMの複数のペプチド濃度で、GSK126によるEZH2阻害のIC50値を決定した。得られたIC50値をそれぞれ[SAM]/Km比または[ペプチド]/Km比に対してプロットした。
前述のアッセイ条件を用いて、0.1〜15μMの複数のSAM濃度、次いで別個に16〜60μMの複数のペプチド濃度で、GSK126によるEZH2阻害のIC50値を決定した。得られたIC50値をそれぞれ[SAM]/Km比または[ペプチド]/Km比に対してプロットした。
細胞培養およびイムノブロッティング
細胞株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)またはDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellbulturenから入手し、推奨される細胞培養培地中に37℃、5%CO2で維持した。細胞を放射性免疫沈降法(RIPA)バッファー(サーモサイエンティフィック社製)で溶解し、以前に報告(41)されているようにウェスタンブロット分析を行った。抗体は以前に報告(41)されているように得たか、セル・シグナリング・テクノロジー社から得た(SUZ12、3737)か、サンタクルーズバイオテクノロジー社(Santa Cruz Biotechnology)から得た(EED、sc−28701)。
細胞株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)またはDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellbulturenから入手し、推奨される細胞培養培地中に37℃、5%CO2で維持した。細胞を放射性免疫沈降法(RIPA)バッファー(サーモサイエンティフィック社製)で溶解し、以前に報告(41)されているようにウェスタンブロット分析を行った。抗体は以前に報告(41)されているように得たか、セル・シグナリング・テクノロジー社から得た(SUZ12、3737)か、サンタクルーズバイオテクノロジー社(Santa Cruz Biotechnology)から得た(EED、sc−28701)。
GSK126処理後のH3K27メチル化状態およびPRC2構成要素
処理の24時間前に細胞(2×105/ウェル)を6ウェル組織培養プレート中の適切な細胞培養培地に播種した。次いで、細胞を0.1%DMSOまたは種々の濃度のGSK126(範囲=25nM〜2μM)に24、72、または144時間晒した。
処理の24時間前に細胞(2×105/ウェル)を6ウェル組織培養プレート中の適切な細胞培養培地に播種した。次いで、細胞を0.1%DMSOまたは種々の濃度のGSK126(範囲=25nM〜2μM)に24、72、または144時間晒した。
全ヒストンH3およびH3K27me3レベルのELISAに基づく定量化
組織をホモジナイズした後、Epigentek Histone Extractionキット(OP−0006)を用いて腫瘍組織ライセートを調製した。あるいは、細胞を96ウェルプレートに2,000細胞/ウェルで播種し、GSK126の10ポイントの3倍希釈系列(用量範囲=2nM〜38μM)で48時間処理した。細胞を0.2N HClで30分間溶解してヒストンを抽出し、酸不溶性部分を遠心でペレットにし、上清を、プロテアーゼ阻害剤(ロシュ社製)を含む中和バッファー(1M Na2HPO4、pH12.5、アクティブ・モティフ社製)で中和した。ライセートをMaxisorp ELISAプレート(ヌンク社製)に、2枚のプレートのそれぞれにつき2連(in duplicate)で、ブロッキングバッファー(1%BSA)と共に加えた。プレートを1時間インキュベートし、Tween−20を含むイミダゾール緩衝食塩水(Kirkegaard & Perry Laboratories社製)で4回洗浄し、H3K27me3または全H3に対する一次抗体とインキュベートし、洗浄し、HRP連結二次抗ウサギIgG抗体とインキュベートし、再度洗浄した。Luminata Forte基質(ミリポア社製)を加えた5分後に、EnVisionマルチラベルプレートリーダー(パーキンエルマー社製)を用いて化学発光を定量化した。H3K27me3レベルを全H3値を基準に標準化し、4パラメーターの曲線に当てはめてIC50値を決定した。
組織をホモジナイズした後、Epigentek Histone Extractionキット(OP−0006)を用いて腫瘍組織ライセートを調製した。あるいは、細胞を96ウェルプレートに2,000細胞/ウェルで播種し、GSK126の10ポイントの3倍希釈系列(用量範囲=2nM〜38μM)で48時間処理した。細胞を0.2N HClで30分間溶解してヒストンを抽出し、酸不溶性部分を遠心でペレットにし、上清を、プロテアーゼ阻害剤(ロシュ社製)を含む中和バッファー(1M Na2HPO4、pH12.5、アクティブ・モティフ社製)で中和した。ライセートをMaxisorp ELISAプレート(ヌンク社製)に、2枚のプレートのそれぞれにつき2連(in duplicate)で、ブロッキングバッファー(1%BSA)と共に加えた。プレートを1時間インキュベートし、Tween−20を含むイミダゾール緩衝食塩水(Kirkegaard & Perry Laboratories社製)で4回洗浄し、H3K27me3または全H3に対する一次抗体とインキュベートし、洗浄し、HRP連結二次抗ウサギIgG抗体とインキュベートし、再度洗浄した。Luminata Forte基質(ミリポア社製)を加えた5分後に、EnVisionマルチラベルプレートリーダー(パーキンエルマー社製)を用いて化学発光を定量化した。H3K27me3レベルを全H3値を基準に標準化し、4パラメーターの曲線に当てはめてIC50値を決定した。
細胞増殖アッセイ
6日間の増殖が可能な条件を特定するために、384ウェルフォーマットで幅広い播種密度の成長を調べることにより、全細胞株についての最適な細胞播種を実験的に決定した。次いで、細胞を最適な播種密度でプレーティングし、24時間後、GSK126の20ポイントの2倍希釈系列または0.15%DMSOで処理した(2連)。プレートを37℃、5%CO2で6日間インキュベートした。その後、細胞をCellTiter−Glo(プロメガ社製)で溶解し、TECAN Safire2マイクロプレートリーダーで化学発光シグナルを検出した。更に、化合物添加時(T0)に細胞の非処理プレートを回収して、開始時の細胞数を定量化した。6日間の処理後に得られたCTG値をT0値に対するパーセントとして表し、化合物濃度に対してプロットした。データを4パラメーターの等式に当てはめて、濃度反応曲線を作製し、成長を50%阻害するのに必要なGSK126濃度(gIC50)を決定した。
6日間の増殖が可能な条件を特定するために、384ウェルフォーマットで幅広い播種密度の成長を調べることにより、全細胞株についての最適な細胞播種を実験的に決定した。次いで、細胞を最適な播種密度でプレーティングし、24時間後、GSK126の20ポイントの2倍希釈系列または0.15%DMSOで処理した(2連)。プレートを37℃、5%CO2で6日間インキュベートした。その後、細胞をCellTiter−Glo(プロメガ社製)で溶解し、TECAN Safire2マイクロプレートリーダーで化学発光シグナルを検出した。更に、化合物添加時(T0)に細胞の非処理プレートを回収して、開始時の細胞数を定量化した。6日間の処理後に得られたCTG値をT0値に対するパーセントとして表し、化合物濃度に対してプロットした。データを4パラメーターの等式に当てはめて、濃度反応曲線を作製し、成長を50%阻害するのに必要なGSK126濃度(gIC50)を決定した。
カスパーゼ3/7アッセイ
カスパーゼ−3/7活性を検出するために、細胞を96ウェルプレートで培養し、GSK126の10ポイントの3倍希釈系列(0.03nM〜5μM)で処理し、Caspase−Glo 3/7(プロメガ社製)をメーカーの指示書に従って用いて評価した。各時点でCellTiter Glo(プロメガ社製)レベルに対して値を標準化し、ビヒクル処理対照に対するパーセンテージとして表した。データはn=4の平均値を表す。
カスパーゼ−3/7活性を検出するために、細胞を96ウェルプレートで培養し、GSK126の10ポイントの3倍希釈系列(0.03nM〜5μM)で処理し、Caspase−Glo 3/7(プロメガ社製)をメーカーの指示書に従って用いて評価した。各時点でCellTiter Glo(プロメガ社製)レベルに対して値を標準化し、ビヒクル処理対照に対するパーセンテージとして表した。データはn=4の平均値を表す。
細胞周期分析
細胞周期分布はフローサイトメトリーにより調べた。6ウェル培養プレートに細胞を播種した24時間後に、細胞をGSK126または0.1%DMSO(ビヒクル)で3日間処理した。細胞をPBSで洗浄し、BDバッファー溶液中でペレット化し、急速冷凍し、−80℃で保存した。CycleTest(商標) PLUS DNA試薬キット(ベクトン・ディッキンソン社製、340242)をメーカーの指示書に従って用いて核を調製してヨウ化プロピジウムで染色した。FACSCaliburフローサイトメーター(ベクトン・ディッキンソン社製)を用いてサンプルを評価し、FlowJoソフトウェア(ツリー・スター社(Tree Star)製)を用いてデータを分析した。
細胞周期分布はフローサイトメトリーにより調べた。6ウェル培養プレートに細胞を播種した24時間後に、細胞をGSK126または0.1%DMSO(ビヒクル)で3日間処理した。細胞をPBSで洗浄し、BDバッファー溶液中でペレット化し、急速冷凍し、−80℃で保存した。CycleTest(商標) PLUS DNA試薬キット(ベクトン・ディッキンソン社製、340242)をメーカーの指示書に従って用いて核を調製してヨウ化プロピジウムで染色した。FACSCaliburフローサイトメーター(ベクトン・ディッキンソン社製)を用いてサンプルを評価し、FlowJoソフトウェア(ツリー・スター社(Tree Star)製)を用いてデータを分析した。
遺伝子発現プロファイリング
処理の24時間前に細胞(2×105/ウェル)を6ウェル組織培養プレート中の適切な細胞培養培地に播種した。次いで、2連のウェル(duplicate well)を0.1%DMSO、500nM、または2μM GSK126に72時間晒した。細胞をTrizol試薬(インビトロジェン社製)中に回収し、フェノール:クロロホルム抽出し、ーカーの指示書に従って用いたRNeasyキット(キアゲン社製)により全RNAを単離した。全RNAを標識し、メーカーの指示書に従い(アフィメトリクス社、米国カリフォルニア州サンタクララ)、エクスプレッション・アナリシス社(Expression Analysis、ノースカロライナ州ダーラム)でAffymetrix Human Genome U133 Plus 2.0オリゴヌクレオチドマイクロアレイのアレイにハイブリダイズさせた。これらのデータはアクセッション番号GSE40972でGEOからアクセスできる。主成分分析および相関分析を用いてデータの再現性を確認した(図16)。
処理の24時間前に細胞(2×105/ウェル)を6ウェル組織培養プレート中の適切な細胞培養培地に播種した。次いで、2連のウェル(duplicate well)を0.1%DMSO、500nM、または2μM GSK126に72時間晒した。細胞をTrizol試薬(インビトロジェン社製)中に回収し、フェノール:クロロホルム抽出し、ーカーの指示書に従って用いたRNeasyキット(キアゲン社製)により全RNAを単離した。全RNAを標識し、メーカーの指示書に従い(アフィメトリクス社、米国カリフォルニア州サンタクララ)、エクスプレッション・アナリシス社(Expression Analysis、ノースカロライナ州ダーラム)でAffymetrix Human Genome U133 Plus 2.0オリゴヌクレオチドマイクロアレイのアレイにハイブリダイズさせた。これらのデータはアクセッション番号GSE40972でGEOからアクセスできる。主成分分析および相関分析を用いてデータの再現性を確認した(図16)。
アフィメトリクス遺伝子チップデータ分析
個々のサンプルに対応するCELファイルを、シグナル値を標的強度500に倍率変更してlog2変換するMicro Array Suite 5.0(MAS5)アルゴリズム(http://www.affymetrix.com /support/index.affx)で処理した。発現量に差のあるプローブセットは、データを線形モデルに当てはめ、処理と対照を対比することにより決定した。有意なプローブセットを検出のためのフィルターにかけた(log2シグナル閾値8)、平均変化倍率>2もしくは<−2または>1.5もしくは<−1.5(記載されている通り)、FDR(Benjamini Hochberg)により多重検定に対して補正したp値<0.1。バイオコンダクター社(Bioconductor、http://www.bioconductor.org)のlimmaパッケージを用いて統計分析を行った。発現量に差のあるプローブセットの機能的分析をDAVIDを用いて行った(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)。有意に大きな比率を占めるGOの生物学的プロセス(BP)および分子機能(MF)用語(レベル3〜5)をEASEp値<0.01でフィルタリングした。
個々のサンプルに対応するCELファイルを、シグナル値を標的強度500に倍率変更してlog2変換するMicro Array Suite 5.0(MAS5)アルゴリズム(http://www.affymetrix.com /support/index.affx)で処理した。発現量に差のあるプローブセットは、データを線形モデルに当てはめ、処理と対照を対比することにより決定した。有意なプローブセットを検出のためのフィルターにかけた(log2シグナル閾値8)、平均変化倍率>2もしくは<−2または>1.5もしくは<−1.5(記載されている通り)、FDR(Benjamini Hochberg)により多重検定に対して補正したp値<0.1。バイオコンダクター社(Bioconductor、http://www.bioconductor.org)のlimmaパッケージを用いて統計分析を行った。発現量に差のあるプローブセットの機能的分析をDAVIDを用いて行った(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)。有意に大きな比率を占めるGOの生物学的プロセス(BP)および分子機能(MF)用語(レベル3〜5)をEASEp値<0.01でフィルタリングした。
qRT−PCR
細胞を0.1%DMSOまたは種々の濃度のGSK126(範囲=25nM〜1μM)で72時間処理し、全RNAを前述したように単離した。RNA(2.8μg)を、MultiScribe Reverse Transcriptase(アプライドバイオシステムズ社製)をメーカーの指示書に従って用いて逆転写した。得られたcDNAを希釈し、TaqMan遺伝子発現アッセイ(アプライドバイオシステムズ社製、GAPDH、Hs03929097_g1、TNFRSF21、Hs00205419_m1、TXNIP、Hs00197750_m1)と共に用いた。TaqMan Gene Expression Master Mix(アプライドバイオシステムズ社製)およびViiA 7 Real-Time PCR System(アプライドバイオシステムズ社製)をメーカーの指示書に従って用いて遺伝子発現を定量化した。
細胞を0.1%DMSOまたは種々の濃度のGSK126(範囲=25nM〜1μM)で72時間処理し、全RNAを前述したように単離した。RNA(2.8μg)を、MultiScribe Reverse Transcriptase(アプライドバイオシステムズ社製)をメーカーの指示書に従って用いて逆転写した。得られたcDNAを希釈し、TaqMan遺伝子発現アッセイ(アプライドバイオシステムズ社製、GAPDH、Hs03929097_g1、TNFRSF21、Hs00205419_m1、TXNIP、Hs00197750_m1)と共に用いた。TaqMan Gene Expression Master Mix(アプライドバイオシステムズ社製)およびViiA 7 Real-Time PCR System(アプライドバイオシステムズ社製)をメーカーの指示書に従って用いて遺伝子発現を定量化した。
ChIP−Seq
固定する24時間前に細胞(5×107)を適切な細胞培養培地中に24時間維持した。新たに調製したホルムアルデヒド溶液(終濃度1%ホルムアルデヒド、10mM NaCl、0.1mM EDTA(pH8.0)、5mM HEPES(pH7.9))で細胞を室温で15分間固定した後、グリシンを125mMになるように加えた。固定した細胞を、0.5%Igepal CA−630(シグマ社製)を含むPBSで2回すすぎ、細胞ペレットを急速凍結した。ChIPアッセイは、アクティブ・モティフ社(カリフォルニア州サンディエゴ)でカスタムのアッセイプロトコールを用いて行われた。H3K27me3 ChIPおよびインプットライブラリーを、イルミナ社製GAIIxシーケンサーをメーカーの指示書に従って用いた35ヌクレオチドのシングルエンドシークエンシングのために調製した。これらのデータはアクセッション番号GSE40970でGEOからアクセス可能である。リードの質を評価し(ベースの質<20は除外)、Bowtie27アルゴリズムを用いて最大2個のミスマッチを許容してヒト参照配列(hg19 build)と整列させた。ユニークにマッピングされたリードだけをその後の分析に用いた。
固定する24時間前に細胞(5×107)を適切な細胞培養培地中に24時間維持した。新たに調製したホルムアルデヒド溶液(終濃度1%ホルムアルデヒド、10mM NaCl、0.1mM EDTA(pH8.0)、5mM HEPES(pH7.9))で細胞を室温で15分間固定した後、グリシンを125mMになるように加えた。固定した細胞を、0.5%Igepal CA−630(シグマ社製)を含むPBSで2回すすぎ、細胞ペレットを急速凍結した。ChIPアッセイは、アクティブ・モティフ社(カリフォルニア州サンディエゴ)でカスタムのアッセイプロトコールを用いて行われた。H3K27me3 ChIPおよびインプットライブラリーを、イルミナ社製GAIIxシーケンサーをメーカーの指示書に従って用いた35ヌクレオチドのシングルエンドシークエンシングのために調製した。これらのデータはアクセッション番号GSE40970でGEOからアクセス可能である。リードの質を評価し(ベースの質<20は除外)、Bowtie27アルゴリズムを用いて最大2個のミスマッチを許容してヒト参照配列(hg19 build)と整列させた。ユニークにマッピングされたリードだけをその後の分析に用いた。
ChIP−seq分析
GSK126処理後にアップレギュレートされた、ダウンレギュレートされた、または変化しなかった遺伝子について、カスタムPERLスクリプトを用いて平均基礎H3K27me3 ChIP−seqタグ数を定量化した。遺伝子本体に加え、転写開始部位の10kb上流および転写終結部位の10kb下流を含む領域を評価した。全遺伝子を鎖に基づいて方向を定め、遺伝子本体の可変長を10,000binに標準化した。各塩基対の配列タグの数を平均化した後、この値を、ChIP毎のマッピングされた配列タグの総数を基準に標準化した。次いで、500塩基対の中心化移動平均を適用して、より大きな傾向を強調し、小さな変動を除去した。MultiExperiment Viewer(http://www.tm4.org/mev/)を用いて個々の遺伝子の濃縮を評価した。ピーク同定ソフトウェアのSICER28を以下のパラメーターで用いてH3K27me3濃縮のピークを同定した:断片サイズ:250bp、有効なゲノムサイズフラクション:0.86、ウィンドウサイズ:750bp、ギャップサイズ:3、重複性域値:1、FDR:0.001。対応するインプットサンプルと比較してChIPサンプルにおいて濃縮された統計的に有意なピーク(FDR<0.001)にゲノム位置についてアノテーションを付加し、転写開始部位(TSS)から±10kb内で遺伝子に割り当てて、標的遺伝子:上流(TSSから−10〜2.5kb)、プロモーター(−2.5kb〜+2.5kb)、5’UTR、コード領域、3’UTRを特定した。全ての遺伝子は5’→3’方向で考察した。データの操作および分析にBedtoolsを用い、可視化にIGV http://www.broadinstitute.org/igvを用いた。アノテーションファイルはUCSCからダウンロードした。発現量に差のあるプローブセットの機能的分析はDAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov)を用いて行った。
GSK126処理後にアップレギュレートされた、ダウンレギュレートされた、または変化しなかった遺伝子について、カスタムPERLスクリプトを用いて平均基礎H3K27me3 ChIP−seqタグ数を定量化した。遺伝子本体に加え、転写開始部位の10kb上流および転写終結部位の10kb下流を含む領域を評価した。全遺伝子を鎖に基づいて方向を定め、遺伝子本体の可変長を10,000binに標準化した。各塩基対の配列タグの数を平均化した後、この値を、ChIP毎のマッピングされた配列タグの総数を基準に標準化した。次いで、500塩基対の中心化移動平均を適用して、より大きな傾向を強調し、小さな変動を除去した。MultiExperiment Viewer(http://www.tm4.org/mev/)を用いて個々の遺伝子の濃縮を評価した。ピーク同定ソフトウェアのSICER28を以下のパラメーターで用いてH3K27me3濃縮のピークを同定した:断片サイズ:250bp、有効なゲノムサイズフラクション:0.86、ウィンドウサイズ:750bp、ギャップサイズ:3、重複性域値:1、FDR:0.001。対応するインプットサンプルと比較してChIPサンプルにおいて濃縮された統計的に有意なピーク(FDR<0.001)にゲノム位置についてアノテーションを付加し、転写開始部位(TSS)から±10kb内で遺伝子に割り当てて、標的遺伝子:上流(TSSから−10〜2.5kb)、プロモーター(−2.5kb〜+2.5kb)、5’UTR、コード領域、3’UTRを特定した。全ての遺伝子は5’→3’方向で考察した。データの操作および分析にBedtoolsを用い、可視化にIGV http://www.broadinstitute.org/igvを用いた。アノテーションファイルはUCSCからダウンロードした。発現量に差のあるプローブセットの機能的分析はDAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov)を用いて行った。
腫瘍異種移植片からのRNA単離
Qiazol(300μl/mg腫瘍)(キアゲン社製)を腫瘍異種移植片組織に加えた。キアゲン社製TissueLyzerおよびステンレス鋼ビーズを用いて、腫瘍を溶解し、ホモジナイズした。Qiazolライセートにクロロホルムを加えた。次いで、Qiazol/クロロホルムホモジネートをQuiagen MaXtract High Densityチューブ(キアゲン社製)に加えた。水相を新しいチューブに移し、等体積の70%EtOHと混合し、Quiagen RNeasyカラム(キアゲン社製)にアプライした。残りのRNA単離はメーカーのプロトコールに従って行った。
Qiazol(300μl/mg腫瘍)(キアゲン社製)を腫瘍異種移植片組織に加えた。キアゲン社製TissueLyzerおよびステンレス鋼ビーズを用いて、腫瘍を溶解し、ホモジナイズした。Qiazolライセートにクロロホルムを加えた。次いで、Qiazol/クロロホルムホモジネートをQuiagen MaXtract High Densityチューブ(キアゲン社製)に加えた。水相を新しいチューブに移し、等体積の70%EtOHと混合し、Quiagen RNeasyカラム(キアゲン社製)にアプライした。残りのRNA単離はメーカーのプロトコールに従って行った。
インビボ実験
全ての実験はGSKの動物実験委員会の審査を受けた後、実験動物の取り扱いに関するGSKの方針に則って行われた。全てのインビボ実験について、GSK126またはビヒクルは、1N酢酸でpH4〜4.5に調整した20%captisol中、体重20g当たり0.2mLの用量体積で腹腔内投与した。100%マトリゲル(BDバイオサイエンス社製)中のパイフェルまたはKARPAS−422細胞(1×107)は、雌のベージュSCIDマウスに皮下移植した。腫瘍はノギスで測定し、腫瘍サイズに従って処理群にブロックランダム化した。有効性の実験では、投薬開始前に10頭のマウスを各処理群にランダム化し、腫瘍体積がパイフェルおよびKARPAS−422の実験(図10cおよび図21a)では約200mm3になった時、KARPAS−422断続投薬実験(図21b)では500mm3になった時にGSK126処理を開始した。週2回、マウスを計量し、腫瘍をノギスで測定した。マウス薬物動態実験では、記載されている時間に安楽死させたマウスから腫瘍および血液サンプルを回収した。血液および腫瘍ホモジネートは急速凍結し、その後、HPLC/MS/MSで分析してGSK126濃度を評価した。薬力学的実験では、各腫瘍の一部を、H3K27me3/H3 ELISA用に凍結するか、RNA単離用にRNAlater(アンビオン社(Ambion)製)中に入れた。末梢血液分析では、18日目に、安楽死させた免疫適格性CD−1マウス(3マウス/群)から心臓穿刺により血液を回収した。血液はすぐにMicrotainer EDTAチューブ(BD社製)に入れ、反転させることで穏やかに混合した。全血球計算分析は、メーカーの指示書に従ってmulti−speciesソフトウェアを用いるアドヴィア2120血液学検査装置(シーメンスメディカルソリューションズ社製)を用いて行った。
全ての実験はGSKの動物実験委員会の審査を受けた後、実験動物の取り扱いに関するGSKの方針に則って行われた。全てのインビボ実験について、GSK126またはビヒクルは、1N酢酸でpH4〜4.5に調整した20%captisol中、体重20g当たり0.2mLの用量体積で腹腔内投与した。100%マトリゲル(BDバイオサイエンス社製)中のパイフェルまたはKARPAS−422細胞(1×107)は、雌のベージュSCIDマウスに皮下移植した。腫瘍はノギスで測定し、腫瘍サイズに従って処理群にブロックランダム化した。有効性の実験では、投薬開始前に10頭のマウスを各処理群にランダム化し、腫瘍体積がパイフェルおよびKARPAS−422の実験(図10cおよび図21a)では約200mm3になった時、KARPAS−422断続投薬実験(図21b)では500mm3になった時にGSK126処理を開始した。週2回、マウスを計量し、腫瘍をノギスで測定した。マウス薬物動態実験では、記載されている時間に安楽死させたマウスから腫瘍および血液サンプルを回収した。血液および腫瘍ホモジネートは急速凍結し、その後、HPLC/MS/MSで分析してGSK126濃度を評価した。薬力学的実験では、各腫瘍の一部を、H3K27me3/H3 ELISA用に凍結するか、RNA単離用にRNAlater(アンビオン社(Ambion)製)中に入れた。末梢血液分析では、18日目に、安楽死させた免疫適格性CD−1マウス(3マウス/群)から心臓穿刺により血液を回収した。血液はすぐにMicrotainer EDTAチューブ(BD社製)に入れ、反転させることで穏やかに混合した。全血球計算分析は、メーカーの指示書に従ってmulti−speciesソフトウェアを用いるアドヴィア2120血液学検査装置(シーメンスメディカルソリューションズ社製)を用いて行った。
参考文献
本文の全体にわたって参考文献リストが引用されている。例えば更なる実験の詳細を提供するために、参考文献のそれぞれの全体は引用することにより本明細書の開示の範囲とされる。参考文献が請求項、実施形態、または本明細書中の定義と矛盾する場合、本明細書が優先される。
本文の全体にわたって参考文献リストが引用されている。例えば更なる実験の詳細を提供するために、参考文献のそれぞれの全体は引用することにより本明細書の開示の範囲とされる。参考文献が請求項、実施形態、または本明細書中の定義と矛盾する場合、本明細書が優先される。
Claims (19)
- 下記工程を含んでなる、癌の処置が必要なヒトにおいて癌を処置する方法:
前記ヒトに由来するサンプル中の以下の少なくとも一つを決定する工程:
a.前記ヒトに由来するサンプル中のEZH2中のアラニン677(A677)残基における変異の有無、
b.EZH2中のチロシン641(Y641)残基における変異の有無、または
c.対照と比較したH3K27me3レベルの増加の有無、および
前記サンプル中に前記A677変異、Y641変異、またはH3K27me3レベル増加の少なくとも一つが存在する場合、有効量のEZH2阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩を前記ヒトに投与する工程。 - 前記EZH2阻害剤が、下記式(I)の化合物またはその薬学的に許容可能な塩である、請求項1に記載の方法:
Wは、NまたはCR2であり、
XおよびZは、水素、(C1−C8)アルキル、(C2−C8)アルケニル、(C2−C8)アルキニル、非置換または置換の(C3−C8)シクロアルキル、非置換または置換の(C3−C8)シクロアルキル−(C1−C8)アルキルまたは−(C2−C8)アルケニル、非置換または置換の(C5−C8)シクロアルケニル、非置換または置換の(C5−C8)シクロアルケニル−(C1−C8)アルキルまたは−(C2−C8)アルケニル、(C6−C10)ビシクロアルキル、非置換または置換のヘテロシクロアルキル、非置換または置換のヘテロシクロアルキル−(C1−C8)アルキルまたは−(C2−C8)アルケニル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリール−(C1−C8)アルキルまたは−(C2−C8)アルケニル、非置換または置換のヘテロアリール、非置換または置換のヘテロアリール−(C1−C8)アルキルまたは−(C2−C8)アルケニル、ハロゲン、シアノ、−CORa、−CO2Ra、−CONRaRb、−CONRaNRaRb、−SRa、−SORa、−SO2Ra、−SO2NRaRb、ニトロ、−NRaRb、−NRaC(O)Rb、−NRaC(O)NRaRb、−NRaC(O)ORa、−NRaSO2Rb、−NRaSO2NRaRb、−NRaNRaRb、−NRaNRaC(O)Rb、−NRaNRaC(O)NRaRb、−NRaNRaC(O)ORa、−ORa、−OC(O)Ra、および−OC(O)NRaRbからなる群からそれぞれ独立して選択され、
Yは、水素またはハロゲンであり、
R1は、(C1−C8)アルキル、(C2−C8)アルケニル、(C2−C8)アルキニル、非置換もしくは置換の(C3−C8)シクロアルキル、非置換もしくは置換の(C3−C8)シクロアルキル−(C1−C8)アルキルもしくは−(C2−C8)アルケニル、非置換もしくは置換の(C5−C8)シクロアルケニル、非置換もしくは置換の(C5−C8)シクロアルケニル−(C1−C8)アルキルもしくは−(C2−C8)アルケニル、非置換もしくは置換の(C6−C10)ビシクロアルキル、非置換もしくは置換のヘテロシクロアルキルもしくは−(C2−C8)アルケニル、非置換もしくは置換のヘテロシクロアルキル−(C1−C8)アルキル、非置換もしくは置換のアリール、非置換もしくは置換のアリール−(C1−C8)アルキルもしくは−(C2−C8)アルケニル、非置換もしくは置換のヘテロアリール、非置換もしくは置換のヘテロアリール−(C1−C8)アルキルもしくは−(C2−C8)アルケニル、−CORa、−CO2Ra、−CONRaRb、または−CONRaNRaRbであり、
R2は、存在する場合、水素、(C1−C8)アルキル、トリフルオロメチル、アルコキシ、またはハロゲンであり、ここで、前記(C1−C8)アルキルは、アミノおよび(C1−C3)アルキルアミノから選択される1〜2個の基で置換されていてよく、
R7は、水素、(C1−C3)アルキル、またはアルコキシであり、R3は、水素、(C1−C8)アルキル、シアノ、トリフルオロメチル、−NRaRb、またはハロゲンであり、
R6は、水素、ハロ、(C1−C8)アルキル、(C2−C8)アルケニル、−B(OH)2、置換または非置換の(C2−C8)アルキニル、非置換または置換の(C3−C8)シクロアルキル、非置換または置換の(C3−C8)シクロアルキル−(C1−C8)アルキル、非置換または置換の(C5−C8)シクロアルケニル、非置換または置換の(C5−C8)シクロアルケニル−(C1−C8)アルキル、(C6−C10)ビシクロアルキル、非置換または置換のヘテロシクロアルキル、非置換または置換のヘテロシクロアルキル−(C1−C8)アルキル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリール−(C1−C8)アルキル、非置換または置換のヘテロアリール、非置換または置換のヘテロアリール−(C1−C8)アルキル、シアノ、−CORa、−CO2Ra、−CONRaRb、−CONRaNRaRb、−SRa、−SORa、−SO2Ra、−SO2NRaRb、ニトロ、−NRaRb、−NRaC(O)Rb、−NRaC(O)NRaRb、−NRaC(O)ORa、−NRaSO2Rb、−NRaSO2NRaRb、−NRaNRaRb、−NRaNRaC(O)Rb、−NRaNRaC(O)NRaRb、−NRaNRaC(O)ORa、−ORa、−OC(O)Ra、および−OC(O)NRaRbからなる群から選択され、
ここで、(C1−C8)アルキル、(C2−C8)アルケニル、(C2−C8)アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ビシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール基はいずれも、−O(C1−C6)アルキル(Rc)1−2、−S(C1−C6)アルキル(Rc)1−2、−(C1−C6)アルキル(Rc)1−2、(C1−C8)アルキル−ヘテロシクロアルキル、(C3−C8)シクロアルキル−ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、(C1−C6)アルキル、(C3−C8)シクロアルキル、(C5−C8)シクロアルケニル、(C1−C6)ハロアルキル、シアノ、−CORa、−CO2Ra、−CONRaRb、−SRa、−SORa、−SO2Ra、−SO2NRaRb、ニトロ、−NRaRb、−NRaC(O)Rb、−NRaC(O)NRaRb、−NRaC(O)ORa、−NRaSO2Rb、−NRaSO2NRaRb、−ORa、−OC(O)Ra、−OC(O)NRaRb、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール(C1−C4)アルキル、およびヘテロアリール(C1−C4)アルキルからなる群から独立して選択される1、2、または3個の基で置換されていてよく、
ここで、前記アリール、ヘテロアリール、アリール(C1−C4)アルキル、またはヘテロアリール(C1−C4)アルキルの、アリールまたはヘテロアリール部分はいずれも、ハロゲン、(C1−C6)アルキル、(C3−C8)シクロアルキル、(C5−C8)シクロアルケニル、(C1−C6)ハロアルキル、シアノ、−CORa、−CO2Ra、−CONRaRb、−SRa、−SORa、−SO2Ra、−SO2NRaRb、ニトロ、−NRaRb、−NRaC(O)Rb、−NRaC(O)NRaRb、−NRaC(O)ORa、−NRaSO2Rb、−NRaSO2NRaRb、−ORa、−OC(O)Ra、および−OC(O)NRaRbからなる群から独立して選択される1、2、または3個の基で置換されていてよく、
各Rcは、独立して(C1−C4)アルキルアミノ、−NRaSO2Rb、−SORa、−SO2Ra、−NRaC(O)ORa、−NRaRb、または−CO2Raであり、
RaおよびRbは、それぞれ独立して、水素、(C1−C8)アルキル、(C2−C8)アルケニル、(C2−C8)アルキニル、(C3−C8)シクロアルキル、(C5−C8)シクロアルケニル、(C6−C10)ビシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールであり、前記(C1−C8)アルキル、(C2−C8)アルケニル、(C2−C8)アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ビシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール基は、ハロゲン、ヒドロキシル、(C1−C4)アルコキシ、アミノ、(C1−C4)アルキルアミノ、((C1−C4)アルキル)((C1−C4)アルキル)アミノ、−CO2H、−CO2(C1−C4)アルキル、−CONH2、−CONH(C1−C4)アルキル、−CON((C1−C4)アルキル)((C1−C4)アルキル)、−SO2(C1−C4)アルキル、−SO2NH2、−SO2NH(C1−C4)アルキル、または−SO2N((C1−C4)アルキル)((C1−C4)アルキル)から独立して選択される1、2、または3個の基で置換されていてよく、
あるいは、RaおよびRbはそれらが結合している窒素と一緒に、酸素、窒素、および硫黄から選択される更なるヘテロ原子を含んでいてよい5〜8員の飽和または不飽和環を表し、前記環は、(C1−C4)アルキル、(C1−C4)ハロアルキル、アミノ、(C1−C4)アルキルアミノ、((C1−C4)アルキル)((C1−C4)アルキル)アミノ、ヒドロキシル、オキソ、(C1−C4)アルコキシ、および(C1−C4)アルコキシ(C1−C4)アルキルから独立して選択される1、2、または3個の基で置換されていてよく、前記環は、(C3−C8)シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール環と縮合していてよく、
あるいは、RaおよびRbは、それらが結合している窒素と一緒に、(C3−C8)シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール環と縮合していてよい6〜10員の架橋された二環式の環系を表す]。 - 前記EZH2阻害剤が、WがCR2である式(I)の化合物である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記EZH2阻害剤が下記化合物Bまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法:
- a、b、およびcの少なくとも二つが決定される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- a、b、およびcが決定される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- Y641変異の有無が決定され、該Y641変異がY641F、Y641S、Y641H、Y641N、またはY641Cである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- A677変異の有無が決定され、該A677変異がA677Gである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルが、少なくとも一つの癌細胞を含んでなる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌がリンパ腫である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リンパ腫が、胚中心B細胞(GCB)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、脾臓辺縁帯リンパ腫(SMZL)、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症リンパ形質細胞性リンパ腫(WM)、濾胞性リンパ腫(FL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、および粘膜関連リンパ組織(MALT)の節外辺縁帯B細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記A677変異および/またはY641変異が体細胞変異である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- (a)EZH2中のA766変異の存在、(b)EZH2中のY641変異の存在、および/または対照と比較したH3K27me3レベルの増加の少なくとも一つを有するヒトが、a、b、またはcを有さないヒトと比較して、EHZ2阻害剤で処置された時に奏効率の上昇および/または無増悪生存期間の延長を示す、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 1または複数の更なる抗新生物剤を投与することを更に含んでなる、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1に記載のa、b、またはcの1または複数を決定するためのキットおよび請求項1に記載のa、b、またはcの1または複数を決定する手段を含んでなる、癌を処置するためのキット。
- 前記手段が、プライマー、プローブ、および抗体からなる群から選択される、請求項15に記載のキット。
- 治療に有用なバイオマーカーとしての、A677変異をコードするEZH2核酸またはポリペプチド配列。
- A677変異がA677Gである、請求項17に記載のEZH2配列。
- 癌の処置が必要なヒトにおいて癌を処置する方法であって、前記ヒトに由来するサンプル中における請求項1に記載のa、b、またはcの1または複数を決定する工程ならびに該サンプル中における前記変異および/または対照と比較したH3K27me3レベルの増加の1または複数の存在を、前記変異を有さず、かつ対照と比較してH3K27me3レベルの増加がないヒトと比較して前記癌の処置が必要なヒトにおける奏効率の上昇および/または無増悪生存期間の延長とを相関させる工程を含んでなる、方法。
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