JP2014511685A - 組織因子経路インヒビター（ｔｆｐｉ）に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

ヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）の特定のエピトープに結合する単離されたモノクローナル抗体およびそれをコードする単離された核酸分子が提供される。抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体を含む医薬組成物および該抗体の投与による凝固における欠乏または欠損を処置する方法もまた提供される。

Description

組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に対するモノクローナル抗体
ワン・ジュオジ、ジョン・マーフィー、トビアス・マルクヴァルト、ディーター・モースマイヤー。

配列表提出
本出願と関連する配列表をＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子形式において出願し、その全体を出典明示により本明細書に包含させる。

態様の分野
ヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に結合する単離されたモノクローナル抗体およびそれらのフラグメントを提供する。

背景
血液凝固は、血液が安定な血餅を形成し、出血を停止させるプロセスである。該プロセスは、血液中に循環している多くのプロ酵素およびプロ補因子（または「凝固因子」）と関連する。これらのプロ酵素およびプロ補因子は、いくつかの経路を介して相互作用し、それらを介して、連続して、または同時にのいずれかで、活性化形態に変換される。最後に、該プロセスは、第Ｖａ因子、イオン化カルシウムおよび血小板の存在下で活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）によるプロトロンビンのトロンビンへの活性化をもたらす。活性化トロンビンは、次に、血小板凝集を誘導し、フィブリノーゲンをフィブリンに変換し、次に、活性化第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩａ）により架橋され、血餅を形成する。

第Ｘ因子の活性化を引き起こすプロセスは、２つの別個の経路：接触活性化経路（以前は内因性経路として知られていた）および組織因子経路（以前は外因性経路として知られていた）により行われ得る。凝固カスケードが共通の経路に接続した等しく重要な２つの経路からなると以前に考えられていた。現在、血液凝固の開始のための主要な経路は組織因子経路であることが知られている。

第Ｘ因子は、活性化第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）と一緒に組織因子（ＴＦ）により活性化され得る。ＦＶＩＩａおよびその必須の補因子であるＴＦの複合体は、凝固カスケードの強力な開始剤である。

凝固の組織因子経路は、組織因子経路インヒビター（「ＴＦＰＩ」）によりネガティブコントロールされる。ＴＦＰＩは、ＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体の天然のＦＸａ−依存性フィードバックインヒビターである。それは、多価Ｋｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼインヒビターのメンバーである。生理学的に、ＴＦＰＩは、活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）に結合し、ヘテロダイマー複合体を形成し、次にＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体と相互作用し、その活性を阻害し、したがって凝固の組織因子経路を停止させる。原則として、ＴＦＰＩ活性のブロックは、ＦＸａおよびＦＶＩＩａ／ＴＦ活性を回復させ、したがって組織因子経路の作用期間を延長し、血友病ＡおよびＢにおける共通の欠陥であるＦＸａの産生を増幅させることができる。

実際に、いくつかの予備的実験証拠は、ＴＦＰＩに対する抗体によるＴＦＰＩ活性のブロックが長期凝固時間を正常化するか、または出血時間を短縮することが示されている。例えば、Ｎｏｒｄｆａｎｇらは、血友病血漿の長期希釈プロトロンビン時間が、ＴＦＰＩに対する抗体での血漿処置後、正常化されることを示した（Thromb. Haemost., 1991, 66(4): 464-467）。同様に、Ｅｒｈａｒｄｔｓｅｎらは、血友病Ａウサギモデルにおける出血時間が抗ＴＦＰＩ抗体により有意に短縮されることを示した（Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1995, 6: 388-394）。これらの試験は、抗ＴＦＰＩ抗体によるＴＦＰＩの阻害が血友病ＡまたはＢの処置のために有用であり得ることを示す。ポリクローナル抗ＴＦＰＩ抗体のみが、これらの試験において使用された。

ハイブリドーマ技術を使用して、組換えヒトＴＦＰＩ（ｒｈＴＦＰＩ）に対するモノクローナル抗体を製造し、同定した。（Yangら Chin. Med. J., 1998, 111(8): 718-721参照）。希釈プロトロンビン時間（ＰＴ）および活性化部分トロンボプラスチン（ＡＰＴＴ）におけるモノクローナル抗体の効果を試験した。実験は、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体が、第ＩＸ因子欠乏血漿の希釈トロンボプラスチン凝固時間を短縮することを示した。組織因子経路が生理学的凝固だけでなく血友病の出血においてもまた重要な役割を果たすことを示唆する（Yangら Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao, 1997, 22(4): 297-300）。

したがって、ＴＦＰＩに対して特異的な抗体は、血液疾患および癌を処置するために必要である。

一般的に、ヒト疾患のための治療抗体は、マウス、キメラ、ヒト化または完全ヒト抗体を創造するために、遺伝子操作を使用して産生されている。マウスモノクローナル抗体は、短い血清半減期、ヒトエフェクター機能を引き起こすことができないこと、およびヒト抗マウス−抗体の生産のため、治療剤として限定された使用であることが示された（Brekke and Sandlie, “Therapeutic Antibodies for Human Diseases at the Dawn of the Twenty-first Century,” Nature 2, 53, 52-62, Jan. 2003）。キメラ抗体は、ヒト抗−キメラ抗体応答を引き起こすことが示されている。ヒト化抗体はさらに、抗体のマウス成分を最小限にする。しかしながら、完全ヒト抗体は、マウス成分と関連する免疫原性を完全に回避する。したがって、遺伝的に操作されたモノクローナル抗体の他の形態と関連する免疫原性を回避するような完全ヒト抗体を開発する必要性が存在する。特に、慢性予防処置、例えば、血友病処置は、ヒト化または好ましくは、完全ヒト抗体を必要とする。マウス成分またはマウス起源を有する抗体が使用される場合、必要とされる非常に多くの投与および長期の治療によって、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体が治療に対する免疫応答の発生の高い危険性を有する。例えば、血友病Ａに対する抗体治療は、患者の生存のために毎週の投与を必要とし得る。これは、免疫系に対する継続的な抗原投与である。したがって、血友病ならびに関連した凝固における遺伝的および後天的欠乏または欠損に対する抗体治療のための完全ヒト抗体の必要性が存在する。

治療抗体は、“Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity,” Nature 256, 495-497 (1975)においてＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより記載されているハイブリドーマ技術を介して作製されている。完全ヒト抗体はまた、組換え的に原核生物および真核生物において作製され得る。ハイブリドーマ生産よりむしろ宿主細胞における抗体の組換え生産が治療抗体のために好ましい。組換え生産は、より良い生産物の一貫性、期待できるより高い生産レベル、および動物由来のタンパク質の存在を最小限にするか、または除去するコントロールされた製造という利点を有する。これらの理由のため、組換え的に生産されたモノクローナル抗ＴＦＰＩ抗体を有することが望ましい。

加えて、ＴＦＰＩが高親和性で活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）に結合するため、有効な抗ＴＦＰＩ抗体は同程度の親和性を有するべきである。したがって、ＴＦＰＩ／ＦＸａ結合と競合することができる結合親和性を有する抗ＴＦＰＩ抗体を有することが望ましい。

概要
ヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）の特定のエピトープに対する特異的結合を有するモノクローナル抗体を提供する。抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドも提供する。抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体を含む医薬組成物ならびに凝固における遺伝的および後天的欠乏または欠損、例えば、血友病ＡおよびＢの処置方法もまた提供する。

図１は、サイズ排除分析によるＦａｂ ＡおよびＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の複合体形成を示す。

図２は、ヒト組織因子経路インヒビターとその抗体（Ｆａｂ Ａ）間の相互作用のアニメーション(cartoon)描写を示す。示されている可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）および重鎖（Ｖ_Ｈ）ドメインを有するＦａｂ Ａは、下部の構造として示される。ＴＦＰＩのＫｕｎｉｔｚドメイン２（ＫＤ２）は、上部の構造として示される。

図３は、重要なエピトープ残基Ａｓｐ１０２（Ｄ１０２）、Ｉｌｅ１０５（Ｉ１０５）、Ａｒｇ１０７（Ｒ１０７）、Ｃｙｓ１０６−Ｃｙｓ１３０ジスルフィド架橋、およびＡ表面でのＴＦＰＩの結合を示す。

図４は、ＴＦＰＩ−Ｆａｂ Ａ複合体およびトリプシン結合Ｋｕｎｉｔｚドメイン２（ＫＤ２）の重ね合わせを示し、第Ｘａ因子およびＦａｂ ＡへのＴＦＰＩの同時結合の排除を示す。ＫＤ２およびＦａｂ Ａは、アニメーション描写において示され、トリプシンは、透明な表面として示される。Ｆａｂ Ａおよびトリプシンの立体障害も示す。

図５は、サイズ排除分析によるＦａｂ ＢおよびＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン１＋２の複合体形成を示す。

図６は、第１の角度および第１の角度と比較して９０度回転された別の角度での、ヒト組織因子経路インヒビターとその抗体（Ｆａｂ Ｂ）間の相互作用を示す２つのアニメーション描写を示す。示されている可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）および重鎖（Ｖ_Ｈ）ドメインを有するＦａｂ Ｂは、図の下部の構造において示される（グレー色の影付き）。ＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）は白色で示され、ＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン２（ＫＤ２）は黒色で示される。

図７は、重要なエピトープ残基Ａｓｐ３１（Ｄ３１）、Ａｓｐ３２（Ｄ３２）、Ｐｒｏ３４（Ｐ３４）、Ｌｙｓ３６（Ｋ３６）、Ｇｌｕ６０（Ｅ６０）、Ｃｙｓ３５−Ｃｙｓ５９ジスルフィド架橋、Ｆａｂ Ｂ表面でのＫｕｎｉｔｚドメイン１ ＴＦＰＩの結合を示す。列挙されていないが、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の結合も示される。

図８は、Ｆａｂ ＢとＫｕｎｉｔｚドメイン２のエピトープ残基Ｇｌｕ１００（Ｅ１００）、Ｇｌｕ１０１（Ｅ１０１）、Ｐｒｏ１０３（Ｐ１０３）、Ｉｌｅ１０５（Ｉ１０５）、Ａｒｇ１０７（Ｒ１０７）、Ｔｙｒ１０９（Ｙ１０９）の結合および相互作用の２つの角度の光景を示す。Ａｒｇ１０７は、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１のＧｌｙ３３（Ｇ３３）およびＣｙｓ３５（Ｃ３５）と相互作用する。

図９は、ＴＦＰＩ−Ｆａｂ Ｂ複合体ならびにＢＰＴＩ、第ＶＩＩａ因子および組織因子の複合体の重ね合わせを示し、第ＶＩＩａ因子／組織因子およびＦａｂ ＢへのＴＦＰＩの同時結合の排除を示す。Ｆａｂ Ｂおよび第ＶＩＩａ因子ならびにＦａｂ Ｂおよび組織因子の立体障害は、矢印により示される。

図１０は、ＴＦＰＩ−Ｆａｂ Ｂ複合体およびトリプシン結合Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の重ね合わせを示し、第Ｘａ因子およびＦａｂ ＢへのＴＦＰＩの同時結合の排除を示す。Ｆａｂ ＢおよびトリプシンならびにＦａｂ Ｂ結合Ｋｕｎｉｔｚドメイン１およびトリプシンの立体障害を示す。

図１１は、（Ａ）Ｆａｂ Ａの軽鎖および重鎖（配列番号：２および３）およびＦａｂ Ｃの軽鎖および重鎖（配列番号：６および７）の配列アラインメント、ならびに（Ｂ）Ｆａｂ Ｃの相同性モデルとＴＦＰＩ−Ｆａｂ Ａ Ｘ線構造の重ね合わせを示す。（Ａ）パラトープ残基は、太字であり、強調されている。Ｆａｂ ＡおよびＦａｂ Ｃにおいて異なるパラトープ残基ｈｃ＿Ａｓｎ３２は、アステリスクで印を付けられている。（Ｂ）Ｋｕｎｉｔｚドメイン２（ＫＤ２）は、黒色においてアニメーションとして示される。Ｆａｂ構造は、グレー色のリボンとして示される。パラトープ残基ｈｃ＿Ａｓｎ３２は、棒により示される。

図１２は、（Ａ）Ｆａｂ Ｂの軽鎖および重鎖（配列番号：４および５）およびＦａｂ Ｄの軽鎖および重鎖（配列番号：８および９）の配列アラインメント、ならびに（Ｂ）Ｆａｂ Ｄの相同性モデルとＴＦＰＩ−Ｆａｂ Ｂ Ｘ線構造の重ね合わせを示す。（Ａ）パラトープ残基は、太字であり、強調されている。Ｆａｂ ＢおよびＦａｂ Ｄにおいて異なるパラトープ残基は、アステリスクで印を付けられている。（Ｂ）Ｋｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）およびＫｕｎｉｔｚドメイン２（ＫＤ２）は、それぞれ明るいグレー色および黒色のアニメーションとして示される。Ｆａｂ構造は、グレー色のリボンとして示される。Ｆａｂ ＢおよびＦａｂ Ｄにおいて異なるパラトープ残基は、棒により示される。

図１３は、（Ａ）ＴＦＰＩ上のＦＸａ結合をブロックするＦａｂ ＣおよびＦａｂ Ｄの表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）データ、ならびに、（Ｂ）ＴＦＰＩ上のＦＶＩＩａ／ＴＦ結合をブロックするＦａｂ ＣおよびＦａｂ Ｄの表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）データを示す。

詳細な説明
定義
本明細書において使用される「組織因子経路インヒビター」または「ＴＦＰＩ」なる用語は、細胞により天然に発現されるヒトＴＦＰＩのあらゆる変異体、アイソフォームおよび種ホモログを示す。本発明の好ましい態様において、ＴＦＰＩへの本発明の抗体の結合は血液凝固時間を減少させる。

本明細書において使用される「抗体」は、抗体全体およびあらゆる抗原結合フラグメント（すなわち「抗原結合部分」）またはそれらの一本鎖を示す。該用語は、天然であるか、または正常免疫グロブリン遺伝子フラグメント組換え方法により形成される全長免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、または特異的結合活性を保持する免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、抗体フラグメントを含む。構造にかかわらず、抗体フラグメントは、全長抗体により認識される抗原と同じ抗原に結合する。例えば、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体フラグメントは、ＴＦＰＩのエピトープに結合する。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントにより行うことができる。抗体の「抗原結合部分」なる用語に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_ＬおよびＣ_Ｈ１ドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結される２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）_２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｖ_ＨおよびＣ_Ｈ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶ_ＬおよびＶ_ＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）Ｖ_ＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Wardら (1989) Nature 341:544-546）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；（ｖｉｉ）ミニボディ、ジアボディ、トリアボディ、テトラボディおよびカッパボディ（例えば、Illら Protein Eng 1997;10:949-57参照）；（ｖｉｉｉ）ラクダＩｇＧ；および（ｉｘ）ＩｇＮＡＲを含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶ_ＬおよびＶ_Ｈは別々の遺伝子によりコードされるが、それらは、組換え方法を使用して、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域が対になって、一価の分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Birdら (1988) Science 242:423-426;およびHustonら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照）を形成する単一のタンパク質鎖として作製されるようにすることができる合成リンカーによって結合させることができる。このような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」なる用語内に含まれることが意図される。これらの抗体フラグメントは当業者に知られている慣用の技術を使用して得られ、該フラグメントはインタクトな抗体と同じ方法で有用性について分析される。

さらに、抗原結合フラグメントは、抗体模擬物に包含され得ることが考えられる。本明細書において使用される「抗体模擬物」または「模擬物」なる用語は、抗体と同様の結合を示すが、より小さい代替抗体または非抗体タンパク質であるタンパク質を意味する。このような抗体模擬物は、スカフォールドに含まれ得る。「スカフォールド」なる用語は、適合した機能および特性を有する新規産物の操作のためのポリペプチド基本骨格(platform)を示す。

「エピトープ」なる用語は、抗体が特異的に結合または相互作用する抗原の地域または領域を示し、いくつかの態様において、抗原が抗体との物理的接触であることを示す。逆に、「パラトープ」なる用語は、抗原が特異的に結合する抗体の地域または領域を示す。競合結合により特徴付けられるエピトープは、対応する抗体の結合が相互排他的であるとき、すなわち１つの抗体の結合が別の抗体の同時結合を排除するとき、重複であると言われる。エピトープは、抗原が両方の対応する抗体の結合を同時に提供することができるとき、別（ユニーク(unique)）であると言われる。

本明細書において使用される「競合する抗体」なる用語は、本明細書に記載されているＴＦＰＩに対する抗体と、ほぼ、実質的にもしくは本質的に同じ、または同じエピトープに結合する抗体を示す。「競合する抗体」は、重複するエピトープ特異性を有する抗体を含む。したがって、競合する抗体は、ＴＦＰＩへの結合に対して、本明細書に記載されている抗体と有効に競合することができる。好ましくは、競合する抗体は、本明細書に記載されている抗体と同じエピトープに結合することができる。別の見方をすれば、競合する抗体は、本明細書に記載されている抗体と同じエピトープ特異性を有する。

本明細書において使用される「結合の阻害」および「結合のブロック」（例えば、ＴＦＰＩへのＴＦＰＩリガンドの結合の阻害／ブロック）なる用語は、互換的に使用され、部分的および完全阻害またはブロックの両方を含む。阻害およびブロックはまた、抗ＴＦＰＩ抗体と接触していないＴＦＰＩと比較して、抗ＴＦＰＩ抗体と接触しているとき、生理学的基質へのＴＦＰＩの結合親和性におけるあらゆる測定可能な減少、例えば、ＴＦＰＩと第Ｘａ因子との相互作用またはＴＦＰＩ−第Ｘａ因子複合体と組織因子、第ＶＩＩａ因子または組織因子／第ＶＩＩａ因子の複合体との相互作用を、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％ブロックすることを含むことを意図する。

本明細書において使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」なる用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を示す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」なる用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有し、単一の結合特異性を示す抗体を示す。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発またはインビボでの体細胞変異により導入される変異）を含み得る。

本明細書において使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を示すことを意図する（例えば、ＴＦＰＩに結合する単離された抗体は、ＴＦＰＩ以外の抗原に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＴＦＰＩのエピトープ、アイソフォームまたは変異体に結合する単離された抗体は、例えば、他の種由来の他の関連抗原（例えば、ＴＦＰＩ種ホモログ）に対する交差反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まないこともある。

本明細書において使用される「特異的結合」は、予め決定された抗原に対する抗体結合を示す。一般的に、抗体は、少なくとも約１０^５Ｍ^−１の親和性で結合し、予め決定された抗原または密接に関連した抗原以外の不適切な抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対する結合に対する親和性よりも、高い、例えば少なくとも２倍高い親和性で予め決定された抗原に結合する。「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」なるフレーズは、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」なる用語と互換的に使用される。

本明細書において使用されるＩｇＧ抗体に対する「高親和性」なる用語は、少なくとも約１０^７Ｍ^−１、いくつかの態様において、少なくとも約１０^８Ｍ^−１、いくつかの態様において、少なくとも約１０^９Ｍ^−１、１０^１０Ｍ^−１、１０^１１Ｍ^−１またはそれ以上、例えば、最大１０^１３Ｍ^−１またはそれ以上の結合親和性を示す。しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに対して変化し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高親和性」結合は、少なくとも約１．０×１０^７Ｍ^−１の結合親和性を示す。本明細書において使用される「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を示す。

「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、結合される抗原の三次元構造に相補的であるＮ−末端抗原結合表面を形成する抗体分子の重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域内の３つの超可変領域の１つを示す。重鎖または軽鎖のＮ−末端から始めて、これらの相補性決定領域はそれぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」と示される。ＣＤＲは抗原抗体結合に関与し、ＣＤＲ３は、抗原抗体結合に対して特異的なユニークな領域を含む。したがって、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域のそれぞれのＣＤＲ領域を含む６つのＣＤＲを含み得る。

本明細書において使用される「保存的置換」は、ポリペプチドの生物学的または生化学的機能の喪失をもたらさない同様の生化学的特性を有するアミノ酸の１つ以上のアミノ酸での置換を含むポリペプチドの修飾を示す。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族性側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。本発明の抗体は、保存的アミノ酸置換を有していてもよく、活性を保持しているものを想定する。

核酸およびポリペプチドにおいて、「実質的な相同性」なる用語は、２つの核酸または２つのポリペプチドまたはそれらの示された配列が、最適にアラインされ比較されたとき、適当なヌクレオチドまたはアミノ酸挿入または欠失を有し、少なくとも約８０％のヌクレオチドまたはアミノ酸、通常少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％、さらに好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％または９９．５％のヌクレオチドまたはアミノ酸で同一であることを示す。あるいは、核酸に対する実質的な相同性は、セグメントが選択的なハイブリダイゼーション条件下で鎖の相補体にハイブリダイズするとき存在する。本発明は、本明細書において記載されている特定の核酸配列およびアミノ酸配列と実質的な相同性を有する核酸配列およびポリペプチド配列を含む。

２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮して、配列により共有される同一の位置の数の関数（すなわち、相同性％＝同一の位置の＃／全位置の＃×１００）である。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズム、例えば、限定はしないが、ベクターＮＴＩ^ＴＭのＡｌｉｇｎＸ^ＴＭ（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）を使用して成し遂げることができる。ＡｌｉｇｎＸ^ＴＭにおいて、複数のアラインメントのデフォルトパラメーターは、：ギャップオープンペナルティ：１０；ギャップ伸長ペナルティ：０．０５；ギャップ分離ペナルティ範囲：８；アラインメントディレイに関する同一性％：４０である。（http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/LINNEA-Online-Guides/LINNEA-Communities/Vector-NTI-Community/Sequence-analysis-and-data-management-software-for-PCs/AlignX-Module-for-Vector-NTI-Advance.reg.us.htmlでさらに詳細に見られる）。

グローバル配列アラインメントとしても示されるクエリー配列（本発明の配列）および対象配列間の最も良い全体の一致を決定するための別の方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓら（Computer Applications in the Biosciences (CABIOS), 1992, 8(2): 189-191）のアルゴリズムに基づくＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータープログラム（Thompsonら Nucleic Acids Research, 1994, 2(22): 4673-4680）を使用して決定することができる。配列アラインメントにおいて、クエリーおよび対象配列は両方ともＤＮＡ配列である。該グローバル配列アラインメントの結果は同一性パーセントである。ペアワイズアラインメントを介して同一性パーセントを計算するためにＤＮＡ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントにおいて使用される好ましいパラメーターは、マトリックス＝ＩＵＢ、ｋ−タプル＝１、トップ ダイアゴナル数＝５、ギャップペナルティ＝３、ギャップオープンペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．１である。多数のアラインメントにおいて、以下のＣＬＵＳＴＡＬＷパラメーターが好ましい：ギャップオープンペナルティ＝１０、ギャップ伸長パラメーター＝０．０５；ギャップ分離ペナルティ範囲＝８；アラインメントディレイに関する同一性％＝４０。

核酸は、全細胞、細胞溶解物中に存在し得、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態において存在し得る。核酸は、天然環境と通常関連する他の細胞成分から精製されるとき、「単離」または「実質的に純粋」（に）されている。核酸を単離するために、標準技術、例えば以下のものが使用され得る：アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および他の当分野でよく知られているもの。

ＴＦＰＩの特定のエピトープに結合するモノクローナル抗体
本明細書において、配列番号：１に示されるヒトＴＦＰＩへの特異的結合を有するモノクローナル抗体を提供する。いくつかの態様において、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体は、ＴＦＰＩへのＴＦＰＩリガンドの結合を阻害する。したがって、いくつかの態様において、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体は、ＴＦＰＩの活性を阻害し得る。

ヒト組織因子経路インヒビターのエピトープ（配列番号：１）に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、該エピトープは、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の１つまたはそれ以上の残基を含む、単離されたモノクローナル抗体を提供する。いくつかの態様において、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号：２または配列番号：４に示される軽鎖を含む。いくつかの態様において、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号：３または配列番号：５に示される重鎖を含む。いくつかの態様において、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号：２に示される軽鎖および配列番号：３に示される重鎖を含む。いくつかの態様において、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号：４に示される軽鎖および配列番号：５に示される重鎖を含む。いくつかの態様において、単離されたモノクローナル抗体が、提供されるものと実質的な相同性を有する軽鎖または重鎖を含み得るとも考慮される。例えば、実質的な相同性を含む単離されたモノクローナル抗体は、１つまたはそれ以上の保存的置換を含み得る。

いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターのエピトープ（配列番号：１）に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、該エピトープは、配列番号：１のＧｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ａｓｐ１０２、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｌｙｓ１２６、Ｇｌｙ１２８、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２およびＡｓｎ１３３およびそれらの組合せから選択される１つまたはそれ以上の残基を含む、単離されたモノクローナル抗体を提供する。

いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｇｌｕ１００を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｇｌｕ１０１を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ａｓｐ１０２を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｐｒｏ１０３を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｇｌｙ１０４を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｉｌｅ１０５を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｃｙｓ１０６を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ａｒｇ１０７を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｇｌｙ１０８を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｔｙｒ１０９を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｌｙｓ１２６を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｇｌｙ１２８を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｇｌｙ１２９を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｃｙｓ１３０を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｌｅｕ１３１を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｇｌｙ１３２を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ａｓｎ１３３を含む。

いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｉｌｅ１０５およびＡｓｐ１０２を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｉｌｅ１０５およびＬｅｕ１３１を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｉｌｅ１０５、Ａｓｐ１０２およびＬｅｕ１３１を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｇｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｃｙｓ１０６、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｌｙｓ１２６、Ｇｌｙ１２８、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２またはＡｓｎ１３３をさらに含む。

いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターのエピトープ（配列番号：１）に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、該エピトープは、配列番号：１の残基Ｃｙｓ１０６およびＣｙｓ１３０間のジスルフィド架橋により連結される２つのアミノ酸ループを含む、単離されたモノクローナル抗体を提供する。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１のＧｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ａｓｐ１０２、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｌｙｓ１２６、Ｇｌｙ１２８、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２およびＡｓｎ１３３から選択される１つまたはそれ以上の残基をさらに含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｉｌｅ１０５を含む。他の態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ａｓｐ１０２を含む。他の態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｌｅｕ１３１を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１のＧｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ａｓｐ１０２、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｌｙｓ１２６、Ｇｌｙ１２８、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２およびＡｓｎ１３３から選択される１つまたはそれ以上の残基をさらに含む。

ヒト組織因子経路インヒビターのエピトープ（配列番号：１）に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、該エピトープは、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の１つまたはそれ以上の残基およびＫｕｎｉｔｚドメイン２の１つまたはそれ以上の残基を含む、単離されたモノクローナル抗体も提供する。いくつかの態様において、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号：６または配列番号：８に示される軽鎖を含む。いくつかの態様において、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号：７または配列番号：９に示される重鎖を含む。いくつかの態様において、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号：６に示される軽鎖および配列番号：７に示される重鎖を含む。いくつかの態様において、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号：８に示される軽鎖および配列番号：９に示される重鎖を含む。いくつかの態様において、単離されたモノクローナル抗体が、提供されるものと実質的な相同性を有する軽鎖または重鎖を含み得るとも考慮される。例えば、実質的な相同性を含む単離されたモノクローナル抗体は、１つまたはそれ以上の保存的置換を含み得る。

いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列番号：１のＡｓｐ３１、Ａｓｐ３２、Ｇｌｙ３３、Ｐｒｏ３４、Ｃｙｓ３５、Ｌｙｓ３６、Ｃｙｓ５９、Ｇｌｕ６０およびＡｓｎ６２およびそれらの組合せから選択される１つまたはそれ以上の残基を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列番号：１の残基Ａｓｐ３１を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列番号：１の残基Ａｓｐ３２を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列番号：１の残基Ｇｌｙ３３を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列番号：１の残基Ｐｒｏ３４を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列番号：１の残基Ｃｙｓ３５を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列番号：１の残基Ｌｙｓ３６を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列番号：１の残基Ｃｙｓ５９を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列番号：１の残基Ｇｌｕ６０を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列番号：１の残基Ａｓｎ６２を含む。

いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列番号：１の残基Ｐｒｏ３４およびＧｌｕ６０を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列番号：１の残基Ｐｒｏ３４およびＬｙｓ３６を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列番号：１の残基Ｐｒｏ３４、Ｌｙｓ３６およびＧｌｕ６０を含む。

いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１のＧｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｐｈｅ１１４、Ａｓｎ１１６、Ｇｌｕ１２３、Ａｒｇ１２４、Ｌｙｓ１２６、Ｔｙｒ１２７およびＧｌｙ１２８およびそれらの組合せから選択される１つまたはそれ以上の残基を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ｇｌｕ１００を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ｇｌｕ１０１を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ｐｒｏ１０３を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ｇｌｙ１０４を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ｉｌｅ１０５を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ｃｙｓ１０６を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ａｒｇ１０７を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ｇｌｙ１０８を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ｔｙｒ１０９を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ｐｈｅ１１４を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ａｓｎ１１６を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ｇｌｕ１２３を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ａｒｇ１２４を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ｌｙｓ１２６を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ｔｙｒ１２７を含む。

いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ａｒｇ１０７およびＧｌｕ１０１を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ａｒｇ１０７およびＴｙｒ１０９を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ａｒｇ１０７、Ｇｌｕ１０１およびＴｙｒ１０９を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ｇｌｙ１２８を含む。

いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１のＡｓｐ１０２、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２およびＡｓｎ１３３およびそれらの組合せから選択される１つまたはそれ以上の残基をさらに含み得る。

いくつかの態様において、単離されたモノクローナル抗体は、Ａｓｐ３１、Ａｓｐ３２、Ｇｌｙ３３、Ｐｒｏ３４、Ｃｙｓ３５、Ｌｙｓ３６、Ｃｙｓ５９、Ｇｌｕ６０およびＡｓｎ６２から選択される１つまたはそれ以上の残基を含むＫｕｎｉｔｚドメイン１の残基；ならびに、Ｇｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｐｈｅ１１４、Ａｓｎ１１６、Ｇｌｕ１２３、Ａｒｇ１２４、Ｌｙｓ１２６、Ｔｙｒ１２７およびＧｌｙ１２８から選択される１つまたはそれ以上の残基を含むＫｕｎｉｔｚドメイン２の残基を含む。

ヒト組織因子経路インヒビターのエピトープ（配列番号：１）に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、該エピトープは、配列番号：１の残基Ｃｙｓ３５およびＣｙｓ５９間のジスルフィド架橋により連結される２つのアミノ酸ループを含む、単離されたモノクローナル抗体も提供する。いくつかの態様において、エピトープは、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の１つまたはそれ以上の残基およびＫｕｎｉｔｚドメイン２の１つまたはそれ以上の残基をさらに含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列番号：１のＡｓｐ３１、Ａｓｐ３２、Ｇｌｙ３３、Ｐｒｏ３４、Ｃｙｓ３５、Ｌｙｓ３６、Ｃｙｓ５９、Ｇｌｕ６０およびＡｓｎ６２から選択される１つまたはそれ以上の残基を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１のＧｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｐｈｅ１１４、Ａｓｎ１１６、Ｇｌｕ１２３、Ａｒｇ１２４、Ｌｙｓ１２６、Ｔｙｒ１２７およびＧｌｙ１２８から選択される１つまたはそれ以上の残基を含む。

ＴＦＰＩへの結合に対して本明細書に記載されているいずれかの抗体と競合することができる抗体も提供する。例えば、本明細書に記載されている抗体と同じエピトープに結合する抗体は、ＴＦＰＩの結合に対して有効に競合することができる。いくつかの態様において、ＴＦＰＩに結合する単離されたモノクローナル抗体であって、本明細書に記載されているいずれかの単離されたモノクローナル抗体と競合する単離されたモノクローナル抗体を提供する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８に示される軽鎖を有する抗体と競合する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９に示される重鎖を有する抗体と競合する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号：２に示される軽鎖および配列番号：３に示される重鎖を有する抗体と競合する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号：４に示される軽鎖および配列番号：５に示される重鎖を有する抗体と競合する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号：６に示される軽鎖および配列番号：７に示される重鎖を有する抗体と競合する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号：８に示される軽鎖および配列番号：９に示される重鎖を有する抗体と競合する。

ＴＦＰＩへの結合に対して本明細書に記載されているいずれかの抗体と競合することができる二重特異性抗体も提供する。例えば、このような二重特異性抗体は、上記１つまたはそれ以上のエピトープに結合し得る。

抗体は種特異的であり得、または多数の種と交差反応し得る。いくつかの態様において、抗体は、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、サル、ブタ、イヌ、ネコまたは他の哺乳動物種のＴＦＰＩと特異的に反応するか、または交差反応し得る。

抗体は、種々のクラスの抗体のいずれか、例えば、限定はしないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体であり得る。

核酸、ベクターおよび宿主細胞
モノクローナル抗体のアミノ酸配列が提供されているが、核酸配列は、いずれかのこれらのモノクローナル抗体をコードするように設計することができると考慮される。このようなポリヌクレオチドは、抗ＴＦＰＩ抗体の軽鎖または重鎖をコードし得る。いくつかの態様において、このようなポリヌクレオチドは、破壊することができる結合により分離される抗ＴＦＰＩ抗体の軽鎖および重鎖の両方をコードし得る。さらに、上記の抗体は、任意の上記のモノクローナル抗体をコードする単離された核酸分子を含む発現ベクターおよびこのようなベクターを含む宿主細胞を使用して生産することができる。

ＴＦＰＩに対する抗体を製造する方法
モノクローナル抗体は、本発明の態様のモノクローナル抗体の可変領域をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞において発現させることにより組換え的に生産され得る。発現ベクターの手助けで、該ヌクレオチド配列を含む核酸を、生産のために適当な宿主細胞にトランスフェクトし、発現させ得る。したがって、
（ａ）本発明のモノクローナル抗体をコードする核酸分子を宿主細胞にトラスフェクトすること、
（ｂ）宿主細胞を培養し、宿主細胞において該モノクローナル抗体を発現すること、および所望により
（ｃ）生産されたモノクローナル抗体を単離し、精製すること
を含む、ヒトＴＦＰＩと結合するモノクローナル抗体を生産するための方法であって、該核酸分子は本発明のモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配列を含む方法もまた提供する。

１つの例において、抗体またはその抗体フラグメントを発現させるために、標準分子生物学技術により得られる部分または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写および翻訳コントロール配列に作動可能に連結されるように、発現ベクターに挿入される。この文脈において、「作動可能に連結される」なる用語は、ベクター内の転写および翻訳コントロール配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する意図された機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターに連結されることを意味することが意図される。発現ベクターおよび発現コントロール配列は、使用される発現宿主細胞に適合するように選択される。抗体の軽鎖遺伝子および抗体の重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入されるか、またはより一般的には、両方の遺伝子は同じ発現ベクターに挿入され得る。抗体遺伝子は、標準方法（例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクターにおける相補的制限酵素認識部位のライゲーション、または制限酵素認識部位が存在しないとき、平滑末端ライゲーション）により発現ベクターに挿入される。本明細書に記載されている抗体の軽鎖および重鎖可変領域は、Ｖ_Ｈセグメントがベクター内でＣ_Ｈセグメントに作動可能に連結され、Ｖ_Ｌセグメントがベクター内でＣ_Ｌセグメントに作動可能に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をすでにコードする発現ベクターに挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を創造するために使用することができる。さらに、またはあるいは、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫タンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。

抗体鎖コード遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現をコントロールする調節配列を有する。「調節配列」なる用語は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳をコントロールするプロモーター、エンハンサーおよび他の発現コントロールエレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存し得ることは当業者に理解されよう。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列の例は、哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を指向するウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。あるいは、非ウイルス調節配列、例えば、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターが使用され得る。

抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択可能なマーカー遺伝子を有し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、全てＡｘｅｌらによる米国特許第４，３９９，２１６、４，６３４，６６５および５，１７９，０１７号、参照）。例えば、一般的に、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞において薬物、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートに対する耐性を与える。選択可能なマーカー遺伝子の例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅でのｄｈｆｒ−宿主細胞における使用のための）およびネオ遺伝子（Ｇ４１８選択のための）を含む。

軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターは、標準技術により宿主細胞にトランスフェクトされる。種々の形態の「トランスフェクション」なる用語は、原核生物または真核生物宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入のために一般的に使用される多種多様の技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを含むことを意図する。原核生物または真核宿主細胞のいずれかにおいて本発明の抗体を発現させることが理論的に可能であるが、真核細胞、特に哺乳動物細胞は、原核細胞よりも、適切に折り畳まれ、免疫学的に活性な抗体を集合させ分泌しやすいため、真核細胞、より好ましくは哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が最も好ましい。

組換え抗体を発現させるための哺乳動物宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621に記載されているＤＨＦＲ選択可能なマーカーを使用するUrlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＫＢ１１細胞およびＳＰ２細胞を含む。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入されたとき、抗体は、宿主細胞における抗体の発現または宿主細胞が培養される培養培地への抗体の分泌を可能にする十分な期間、宿主細胞を培養することにより生産される。抗体は、標準タンパク質精製方法、例えば、限外ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび遠心分離を使用して、培養培地から回収することができる。

インタクトな抗体を発現させるための部分的抗体配列の使用
抗体は、６つの重鎖および軽鎖ＣＤＲに位置するアミノ酸残基を介して主に標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも個々の抗体間でより異なっている。ＣＤＲ配列が非常に抗体抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列上にグラフトされた特定の天然抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることができる（例えば、Riechmann, L.ら 1998, Nature 332:323-327; Jones, P.ら 1986, Nature 321:522-525;およびQueen, C.ら 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033参照）。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公のＤＮＡデータベースから得ることができる。これらの生殖細胞系列配列は、Ｂ細胞成熟中のＶ（Ｄ）Ｊ連結により形成される完全に集合された可変遺伝子を含まないため、成熟抗体遺伝子配列と異なる。起源の抗体と同様の結合特性を有するインタクトな組換え抗体を再創造するために、特定の抗体の全ＤＮＡ配列を得る必要はない（ＷＯ９９／４５９６２参照）。ＣＤＲ領域にわたる部分的な重鎖および軽鎖配列が、一般的に、この目的のために十分である。部分的な配列は、生殖細胞系列可変および連結遺伝子セグメントが組換え抗体可変遺伝子に寄与することを決定するために使用される。次に、生殖細胞系列配列は、可変領域の欠損部分を満たすために使用される。重鎖および軽鎖リーダー配列は、タンパク質成熟中に開裂され、最終抗体の特性に起因しない。この理由のため、発現構築物のために対応する生殖細胞系列リーダー配列を使用することが必要である。欠損配列を加えるため、クローンｃＤＮＡ配列は、ライゲーションまたはＰＣＲ増幅により合成オリゴヌクレオチドと組み合わせることができる。あるいは、全可変領域は、短い重複オリゴヌクレオチドのセットとして合成され、ＰＣＲ増幅により組み合わせられ、完全に合成可変領域クローンを創造することができる。このプロセスは、特定の制限酵素認識部位の除去または包含、または特定のコドンの最適化のようなある利点を有する。

重鎖および軽鎖転写産物のヌクレオチド配列は、天然配列と同一のアミノ酸コード能力を有する合成Ｖ配列を創造するために、合成オリゴヌクレオチドの重複セットを設計するために使用される。合成重鎖および軽鎖配列は、３つの点において天然配列と異なり得る：繰り返されたヌクレオチド塩基の連続が、オリゴヌクレオチド合成およびＰＣＲ増幅を容易にするため中断され；最適な翻訳開始部位が、Ｋｏｚａｋのルール（Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870）にしたがって組み込まれ；制限エンドヌクレアーゼ部位が、翻訳開始部位の上流に操作される。

重鎖および軽鎖可変領域両方において、最適化されたコードおよび対応する非コード鎖配列は、対応する非コードオリゴヌクレオチドのほぼ中間点で３０−５０ヌクレオチド断片に分解される。したがって、それぞれの鎖において、オリゴヌクレオチドは、１５０−４００ヌクレオチドのセグメントにわたる重複二本鎖セットに集合され得る。次に、プールは、１５０−４００ヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物を生産するために鋳型として使用される。一般的に、単一の可変領域オリゴヌクレオチドセットは、別々に増幅され、２つの重複ＰＣＲ産物を産生する２つのプールに分解される。次に、これらの重複産物をＰＣＲ増幅により組み合わせて、完全可変領域を形成する。また、発現ベクター構築物中に容易にクローニングすることができるフラグメントを産生するために、ＰＣＲ増幅において重鎖または軽鎖定常領域の重複フラグメントを含むことが望ましいことがある。

次に、再構築された重鎖および軽鎖可変領域をクローン化されたプロモーター、翻訳開始、定常領域、３’非翻訳、ポリアデニル化および転写終止配列と組み合わせ、発現ベクター構築物を形成する。重鎖および軽鎖発現構築物は、単一のベクター中に組み合わせられ、次に両方の鎖を発現する宿主細胞を形成するように融合される宿主細胞に共トランスフェクトされるか、連続トランスフェクトされるか、または別々にトランスフェクトされ得る。

したがって、別の局面において、ヒト抗ＴＦＰＩ抗体の構造的特徴は、ＴＦＰＩへの結合の機能を保持する構造的に関連したヒト抗ＴＦＰＩ抗体を創造するために使用される。さらに具体的に、本発明のモノクローナル抗体の具体的に同定された重鎖および軽鎖領域の１つまたはそれ以上ＣＤＲは、本発明のさらに組換え的に操作されたヒト抗ＴＦＰＩ抗体を創造するために、既知のヒトフレームワーク領域およびＣＤＲと組換え的に組み合わされ得る。

医薬組成物
治療有効量の抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物もまた提供する。「薬学的に許容される担体」は、調製物を製剤化または安定化させるための手助けとなり、患者に有意な有害毒物学的効果を引き起こさない活性成分に加えられ得る物質である。このような担体の例は当業者によく知られており、水、糖、例えば、マルトースまたはスクロース、アルブミン、塩、例えば、塩化ナトリウムなどを含む。他の担体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martinにおいて記載されている。このような組成物は、治療有効量の少なくとも１つの抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体を含む。いくつかの態様において、このような組成物は、治療有効量の１つまたはそれ以上の抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体を含み得る。いくつかの態様において、医薬組成物は、上記Ｋｕｎｉｔｚドメイン１に特異的に結合する抗体および上記Ｋｕｎｉｔｚドメイン１および２に特異的に結合する抗体を含み得る。

薬学的に許容される担体は、滅菌の水溶液または分散媒体および滅菌の注射可能な溶液または分散媒体の即時調製物のための滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当分野で知られている。該組成物は、好ましくは非経口注射のために製剤化される。該組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは他の高薬物濃度に適当な規則構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。いくつかの場合において、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含む。

滅菌の注射可能な溶液は、必要なとき、上記成分の１つまたは組合せを有する適当な溶媒中に必要な量の活性化合物を含み、次に精密濾過で滅菌することにより調製することができる。一般的に、分散媒体は、基本的な分散媒体および上記成分からの必要な他の成分を含む滅菌のビヒクルに活性化合物を組み込むことにより調製される。滅菌の注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製のいくつかの方法は、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）であり、予め滅菌ろ過処理した溶液から、活性成分プラス任意の付加的な所望の成分の粉末が得られる。

医薬的使用
モノクローナル抗体は、凝固における遺伝的および後天的欠乏または欠損を処置するための治療目的のために使用することができる。例えば、上記態様におけるモノクローナル抗体は、ＴＦＰＩとＦＸａとの相互作用をブロックするか、またはＴＦ／ＦＶＩＩａ活性のＴＦＰＩ依存性阻害を防止するために使用され得る。さらに、モノクローナル抗体はまた、ＦＸａのＴＦ／ＦＶＩＩａ−駆動産生を回復させ、ＦＸａのＦＶＩＩＩ−もしくはＦＩＸ−依存性増幅の欠乏を迂回させるために使用され得る。

モノクローナル抗体は、止血の障害、例えば、血小板減少症、血小板障害および出血性障害（例えば、血友病Ａ、血友病Ｂおよび血友病Ｃ）の処置における治療的使用を有する。このような障害は、治療有効量の抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体を必要とする患者に投与することにより処置され得る。モノクローナル抗体はまた、適応症におけるコントロールされていない出血、例えば、外傷および出血性脳卒中の処置において治療的使用を有する。したがって、治療有効量の本発明の抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体を必要とする患者に投与することを含む出血時間を短縮するための方法もまた提供する。

抗体は、単剤療法または止血障害に対する他の治療と組み合わせて使用することができる。例えば、１つまたはそれ以上の本発明の抗体と凝固因子、例えば、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子との共投与は、血友病を処置するために有用であると考えられる。１つの態様において、（ａ）ヒト組織因子経路インヒビターに結合する第１の量のモノクローナル抗体および（ｂ）第２の量の第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を投与することを含む凝固における遺伝的および後天的欠乏または欠損を処置するための方法であって、該第１および第２の量は合わせて、該欠乏または欠損を処置するために有効である方法を提供する。別の態様において、（ａ）ヒト組織因子経路インヒビターに結合する第１の量のモノクローナル抗体および（ｂ）第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の第２の量を投与することを含む凝固における遺伝的および後天的欠乏または欠損を処置するための方法であって、該第１および第２の量は合わせて、該欠乏または欠損を処置するために有効であり、さらに、第ＶＩＩ因子は共投与されない方法を提供する。本発明はまた、治療有効量の本発明のモノクローナル抗体および第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の組合せを含む医薬組成物であって、第ＶＩＩ因子を含まない組成物を含む。「第ＶＩＩ因子」は、第ＶＩＩ因子および第ＶＩＩａ因子を含む。これらの組合せ治療は、凝固因子の必要な注入頻度を減少させる可能性がある。共投与または併用療法は、それぞれ別々に製剤化された、または１つの組成物中で共に製剤化された２つの治療薬物の投与を意味し、別々に製剤化されたとき、ほぼ同時で、または同じ治療期間にわたってであるが異なる時間で投与される。

医薬組成物は、出血症状の重症度により変化し得る、または予防治療の場合、患者の凝固欠乏の重症度により変化し得る用量および頻度で、血友病ＡまたはＢに罹患している対象に非経口的に投与され得る。

組成物は、ボーラスとして、または連続的な注入により必要とする患者に投与され得る。例えば、Ｆａｂフラグメントとして存在する本願発明の抗体のボーラス投与は、０．００２５から１００ｍｇ／ｋｇ体重、０．０２５から０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０から０．１０ｍｇ／ｋｇまたは０．１０−０．５０ｍｇ／ｋｇの量であり得る。連続的な注入のために、Ｆａｂフラグメントとして存在する本願発明の抗体は、０．００１から１００ｍｇ／ｋｇ体重／分、０．０１２５から１．２５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０から０．７５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０から１．０ｍｇ／ｋｇ／分または０．１０−０．５０ｍｇ／ｋｇ／分で１−２４時間、１−１２時間、２−１２時間、６−１２時間、２−８時間または１−２時間、投与され得る。全長抗体（完全定常領域を有する）として存在する本願発明の抗体の投与のための投与量は、約１−１０ｍｇ／ｋｇ体重、２−８ｍｇ／ｋｇまたは５−６ｍｇ／ｋｇであり得る。このような全長抗体は、一般的に３０分から３時間の期間に延長され注入により投与される。投与の頻度は状態の重症度に依存する。頻度は、週に３回から２または３週間毎に１回の範囲であり得る。

さらに、組成物は、皮下注射を介して患者に投与され得る。例えば、１０から１００ｍｇの用量の抗ＴＦＰＩ抗体を、１週間毎、２週間毎または１月毎に皮下注射を介して患者に投与することができる。

本明細書において使用される「治療有効量」は、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体、または、このような抗体およびインビボで凝固時間を有効に増加させるか、またはさもなければ必要とする患者にインビボで測定可能な利益を与えるために必要である第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の組合せの量を意味する。正確な量は、限定はしないが、治療組成物の成分および物理的特性、意図される患者集団、個々の患者の検討などを含む多数の因子に依存し、当業者により容易に決定することができる。

実施例
実施例１．大腸菌からの組換えＴＦＰＩ（Ｋｕｎｉｔｚドメイン２）の発現および精製
発現系
ｐＤ Ｅｃｏ５ Ｎと表される目的ベクター（Ｇａｔｅｗａｙ命名法にしたがって）を利用した。ｐＤ Ｅｃｏ５ Ｎは、ｐＥＴ−１６ ｂ（Novagen）に基づき、さらに、Ｈｉｓ_１０およびＮｕｓＡタグならびにＨｉｓ_１０／ＮｕｓＡおよび興味あるタンパク質からなる融合タンパク質の発現のためのＧａｔｅｗａｙクローニングカセットをコードする。

Ｋｕｎｉｔｚドメイン２のＮ−末端（Ｌｙｓ９３からＰｈｅ１５４、参照Ｕｎｉｐｒｏｔ １０６４６）およびＧａｔｅｗａｙ結合部位（ａｔｔＢ１−５＃、ａｔｔＢ２−３＃、Invitrogen）に融合したトロンビン切断部位をコードするＴＦＰＩ構築物を、ｐＤ Ｅｃｏ５ Ｎ ベクターにクローニングし、ｐＤ Ｅｃｏ５ Ｎ ＴＦＰＩ ＫＤ２と表される発現ベクターを得た。ＢＬ２１ ＤＥ３（Novagen）発現株を利用した。
ｐＤ Ｅｃｏ５ Ｎ ＴＦＰＩ ＫＤ２を使用して発現される融合タンパク質のアミノ酸配列、６００ＡＡ

配列構成要素

発現
ｐＤ Ｅｃｏ５ Ｎ ＃２０９で形質転換されたＢＬ２１ ＤＥ３株を、１４時間３７℃で１８０ｒｐｍの撹拌速度で２００μｇ／ｍＬのアンピシリンを有する２×５０ｍＬのＬＢ培地中で前培養として培養した。次に、４００ｍＬのＣｉｒｃｌｅｇｒｏｗ培地（Q-Biogene）を有する８つの震盪フラスコをそれぞれ、８ｍＬの前培養物で植菌し、１８０ｒｐｍの撹拌速度で３７℃でインキュベートした。ＯＤ６００の培養密度で、ＩＰＴＧ（１００ｍＭの最終濃度）を遺伝子誘導のために加え、１８０ｒｐｍで１７℃で２４時間さらに培養した。大腸菌を遠心分離（３０００ｇ、１０分）によりペレット化し、−８０℃で貯蔵した。

精製
３．２Ｌの培養物からのペレット化された大腸菌集団を、２００ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％（ｗ／ｗ）グリセロール、４０ｍＭのイミダゾール、プロテアーゼインヒビターカクテル Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ−フリー（Roche））に再懸濁し、高圧デバイス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｓ）でホモジェナイズし、次に、溶解物を遠心した（１００．０００ｇ、６０分、４℃）。いくつかの精製工程をＡｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ系を使用して行った。濃縮されたサンプルを、最初のＩＭＡＣ クロマトグラフィー工程において、２連結５ｍＬ単位のＨｉ−Ｔｒａｐ−セファロース ＨＰ マトリックス（ＧＥ）に付した。Ｈｉ−Ｔｒａｐ−セファロース ＨＰ マトリックスの平衡、融合タンパク質結合および洗浄を、バッファーＡ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのイミダゾール）を使用して行った。ＮｕｓＡ−ＴＦＰＩ融合タンパク質の溶離のために、バッファーＢ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中、４０から５００ｍＭのイミダゾールの直線勾配を使用した。溶離画分をプールし、（Ａｍｉｃｏｎ 限外ろ過デバイスを使用する６−７のファクターによる）濃縮し、バッファーをＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０と交換した。濃縮されたサンプル（６−７ｍＬ）を、Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０中Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ−１００（ＸＫ２６／７４）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーにさらに付した。融合タンパク質を含む主なピークの画分を貯め、限外ろ過（Amicon）により５ｍＬの容量に濃縮した。トロンビン（ＨＴＩ）をサンプル（比率 酵素：融合タンパク質、１：５０ｗ／ｗ）に加え、２１℃で５時間インキュベートし、最後に反応をＰＭＳＦ（１ｍＭの最終濃度）により停止した。次に、第２のサイズ排除クロマトグラフィー工程（Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０中Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ−１００ （ＸＫ２６／７４））を行い、ピーク画分をＰＡＧＥによりモニタリングした。単量体ＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン２なしの画分を回収し、濃縮し（Amicon）、３．２Ｌの大腸菌培養物から約４ｍｇの産物を得た。

実施例２．ＴＦＰＩに対する組換えモノクローナル抗体Ｆａｂ Ａの生産、大腸菌における発現およびその精製
発現
Ｆａｂ Ａを、発現ベクターｐＥＴ２８ａおよび大腸菌株 ＢＬ２１ Ｓｔａｒ ＤＥ３を使用して共発現した。発現ベクターにおいてコードされる軽鎖および重鎖領域をそれぞれ、Ｎ−末端にてペリプラズムのシグナル配列に融合した。重鎖領域は、Ｆａｂの精製のためにＣ−末端にＨｉｓ６タグもコードした。ＴＢ−Ｉｎｓｔａｎｔ 一晩発現培地において培養された形質転換された大腸菌株を、組換えタンパク質発現の自己誘導のために使用した（#71491, Novagen）。簡潔には、１０ｍＬの形質転換された大腸菌培養物（５０ｍＬ Ｆａｌｃｏｎチューブ中）を、３７℃で１４時間、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを有するＬＢ培地中で前培養として培養し、１８０ｒｐｍで撹拌した。次に、５００ｍＬのＴＢ−Ｉｎｓｔａｎｔ一晩発現培地を有する４つのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコをそれぞれ、２ｍＬの前培養物で植菌し、１８０ｒｐｍで３０℃で２４時間インキュベートした。培養物を１０，０００ｇで１０℃で３０分間遠心し、Ｆａｂを含む上清を、さらなる産物精製のために即座に使用されるか、または−２０または−８０℃で貯蔵した。

あるいは、Ｆａｂを、１０Ｌのバイオリアクター（Sartorius）中で、発現ベクターｐＥＴ２８ａおよび大腸菌株 ＢＬ２１ Ｓｔａｒ ＤＥ３を使用して発現させた。５００ｍＬの形質転換された大腸菌培養物を、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを有するＬＢ培地中で３７℃で１７時間培養し、１６５ｒｐｍで撹拌し、次に、１０Ｌの自己誘導培地を有する撹拌されるバイオリアクターを植菌するために使用した。自己誘導培地は１リットルあたり以下の成分を含んだ：１２ｇのトリプトン、２４ｇの酵母抽出物、９．９ｇのグリセロール（８７％）、１２．５４ｇのＫ２ＨＰＯ４、２．３１ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．２５ｇのＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１ｇのグルコース、２．５ｇのラクトース、３０ｍｇのカナマイシン。バイオリアクターでの培養を２４時間（３０℃で３５０−最大８００ｒｐｍで）行い、次に、培養上清物を、遠心機（Heraeus）における遠心分離によりバイオマスを除去することにより回収した。

精製
Ｆａｂを、Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０ｓデバイスで２工程クロマトグラフィー方法を使用して精製した。中空繊維モジュール（１０ｋＤａカットオフ閾値）を、１Ｌの透明な培養上清を１００ｍＬの最終容量に濃縮し、バッファーＡ（５０ｍＭのリン酸Ｎａ ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール）を有するバッファー組成物で平衡にするために適用した。Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ系を有する最初の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）工程において、濃縮されたサンプルを、５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡスーパーフローマトリックス（Qiagen）に付した。Ｎｉ−ＮＴＡマトリックスの平衡、サンプル結合および洗浄を、バッファーＡ（結合は２１℃で行い、全ての他のクロマトグラフィー工程は４℃で行った）を使用して行った。Ｆａｂの溶離のために、バッファーＡ中、１０から２５０ｍＭのイミダゾールの直線勾配を使用した。単一の溶離ピークからの画分をプールし（６０ｍＬ全容量）、限外ろ過により１０ｍＬに濃縮し、Ｈｉ−Ｐｒｅｐ２６／１０ 脱塩カラムを使用してバッファーをＰＢＳ ｐＨ７．４に調整した。次に、ＰＢＳで平衡化された２ｍＬの抗カッパ軽鎖抗体マトリックス（ＢＡＣからのＫａｐｐａ Ｓｅｌｅｃｔ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍｅｄｉａ、０８３３．１０）を、撹拌下で室温で１時間、濃縮されたＩＭＡＣ溶出液とインキュベートした。結合したサンプルを有するマトリックスを、クロマトグラフィーカラムに移し、ＰＢＳで洗浄した。Ｆａｂサンプルを２ｍＬのグリシンｐＨ２．０で溶離し、１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５で中和し、バッファーをＰＤ１０脱塩カラム（ＧＥ、１７−０８５１−０１）でＰＢＳに調整した。

Ｆａｂを１０Ｌのバイオリアクター（Sartorius）を使用して大腸菌において発現させるとき、以下の精製方法を使用した。遠心された培養上清物を、５および０．２μｍの細孔径を有する２つの使い捨てフィルターモジュール（ＧＥ、ＫＭＰ−ＨＣ−９２０４ＴＴ；ＫＧＦ−Ａ−０５０４ＴＴ）を介して連続して濾過した。中空繊維モジュール（１０ｋＤａカットオフ閾値）を、透明な培養上清を１５００ｍＬの最終容量に濃縮し、バッファー組成物をバッファーＡに調整するために適用した。２５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡスーパーフローマトリックス（Qiagen、バッファーＡにおいて平衡化された）を、濃縮されたサンプルに加え、２１℃で１．５時間インキュベートした。結合したサンプルを有するマトリックスを、空のクロマトグラフィーカラム（２５×１２５ｍｍ）に移し、Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ クロマトグラフィーデバイスに接続し、バッファーＡ（約２５０ｍＬ）で洗浄した。Ｆａｂの溶離のために、５％（３０ｍＬ）および１０％（３５ｍＬ）のバッファーＢでの２つの後の段階勾配、次に、１００％までのバッファーＢの直線溶離勾配を適用した。次に、プールした溶離画分（７２ｍＬ）を以下のとおり処理した：遠心分離限外ろ過デバイス（カットオフ１０ｋＤａ、Amicon）で２０ｍＬの最終容量に濃縮、バッファーをＰＢＳ ｐＨ７．４に調整した脱塩カラム（ＧＥ ＨｉＰｒｅｐ、２６／１０）に３回に分けて加える、および遠心分離限外ろ過デバイス（Amicon）において４０ｍＬの最終容量へのさらなる濃縮。濃縮されたサンプルを、撹拌下で室温で１時間、５ｍＬの抗カッパ軽鎖抗体マトリックス（Kappa Select Affinity Media、ＢＡＣ、ＰＢＳで平衡化された）とインキュベートした。結合したサンプルを有するセファロースマトリックスを、クロマトグラフィーカラムに移し、以下の洗浄工程の順序で処理した、１５ｍＬのＰＢＳで４回；５ｍＬの洗浄バッファー（１００ｍＭのリン酸Ｎａ ｐＨ６．０、１００ｍＬのＮａＣｌ、５００ｍＭのアルギニン）で２回。溶離工程は、バッファー１００ｍＭのグリシン ＨＣｌｐＨ３．０の５ｍＬの適用の３回からなる。溶出液を、１ＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０で即座に中和し、形成された沈殿物を遠心分離（１０分、３．２００ｇ）により取り出した。サンプルを限外ろ過（Amicon）により濃縮し、ＴＢＳバッファーを有するＡｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ クロマトグラフィー系におけるＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５ 分取グレード １６／６０ カラムに付した。ピーク画分をＰＡＧＥにより分析し、１．１モル比におけるＦａｂの重鎖および軽鎖を示す画分をプールし、限外ろ過（Amicon）により１ｍＬの最終容量に再び濃縮した。約４ｍｇのＦａｂ Ａを１０Ｌの大腸菌培養物上清物から単離した。

分析サイズ排除クロマトグラフィー（Akta Micro system、Ｓ７５ ５／１５０ カラム、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ＨＣｌ、ｐｈ７．５）を使用し、Ｆａｂ Ａ／ＴＦＰＩ ＫＤ２複合体形成を証明した。したがって、Ｆａｂ Ａ、ＴＦＰＩ ＫＤ２およびＦａｂ ＡプラスＴＦＰＩ ＫＤ２の混合物を別々に分析した（図１）。

実施例３．ＴＦＰＩ−Ｆａｂ Ａ複合体の結晶化およびＸ線構造決定
結晶化
ＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン２およびモノクローナル抗体Ｆａｂ Ａの共結晶を、シッティング・ドロップ(sitting-drop)方法を使用して２０℃で成長させた。タンパク質複合体を９ｍｇ／ｍＬに濃縮し、等容量のタンパク質溶液およびウェル溶液（１５％ ＰＥＧ８０００、Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５）を沈殿剤として混合することにより結晶化した。結晶は次の日に現れた。

データ回収および処理
結晶を、低温保護のために結晶化バッファー中３０％のグリセロールにおいて液体窒素にて急速冷凍した。データを、ＭＡＲ ＣＣＤ検出器におけるビームラインＢＬ１４．１、ＢＥＳＳＹシンクロトロン（Berlin）で回収した。データを、ＸＤＳ（W. Kabsch (2010) Acta Cryst. D66, 125-132）またはＩＭＯＳＦＬＭ（The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography (1994) Acta Cryst. D50, 760-763; A.G.W. Leslie, (1992), Joint CCP4 + ESF-EAMCB Newsletter on Protein Crystallography, No. 26）で指数化し、組み込み、ＰＯＩＮＴＬＥＳＳ（P.R. Evans, (2005) Acta Cryst. D62, 72-82）でスケーリングのために調製し、ＳＣＡＬＡ（P.R. Evans, (2005) Acta Cryst. D62, 72-82）でスケーリングした。結晶は、最大２．６Åで回折し、セル定数ａ＝６５．７、ｂ＝１１４．７、ｃ＝１５１．９；α＝β＝γ＝９０°で空間群Ｐ２_１２_１２_１、および非対称ユニットにおける２つのＴＦＰＩ−Ｆａｂ複合体を有した。

構造決定および精密化
ＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン２およびモノクローナル抗体Ｆａｂ共構造を、ＰＨＡＳＥＲ（A.J. McCoyら (2007) J. Appl. Cryst. 40, 658-674）ならびに公開されたサーチモデルとしてＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン２（ｐｄｂコード１ｔｆｘ）およびＦａｂフラグメント（ｐｄｂコード３ｍｘｗ）のＸ線構造を使用して分子置換により解析した。分子置換の前に、Ｆａｂモデル配列を、ＣＨＡＩＮＳＡＷ（N. Stein, (2008) J. Appl. Cryst. 41, 641 - 643）で修飾した。ＣＯＯＴ（P. Emsleyら (2010) Acta Cryst. D66:486-501）でのモデル構築およびＲＥＦＭＡＣ５．５（G.N. Murshudovら (1997) Acta Cryst. D53, 240-255）を使用する最尤精密化の反復繰り返しによって、モデルを完成した。ＫＤ２の領域Ｐｈｅ Ａ ３１−Ａｓｎ Ａ ３５、Ｐｒｏ Ｂ ９、Ｌｙｓ Ｍ １３９−Ｓｅｒ Ｍ １４２、およびＡｓｐ１４０−Ｐｈｅ１５４は、弱い電子密度を示し、モデルに含まれなかった。データセットおよび精密化統計値は、表１に要約される。

表１．ＴＦＰＩ−Ｆａｂ Ａ複合体に対するデータセットおよび精密化統計値

実施例４．Ｆａｂ ＡのＸ線構造ベースのエピトープマッピング
ＴＦＰＩ−Ｆａｂ Ａの複合体（図２）は、非対称ユニットあたり２つのコピーの複合体として結晶化した。複合体の主鎖は、関連ＴＦＰＩエピトープに結合されるそれぞれのＦａｂと０．７Åの総標準偏差（ＲＭＳＤ）で重なる。Ｆａｂ Ａ（エピトープ）と接触するＴＦＰＩの残基およびそれぞれの埋め込まれる表面を、ＣＣＰ４プログラムＡＲＥＡＩＭＯＬ（P.J. Briggs (2000) CCP4 Newsletter No. 38）で分析した。最小５Å^２埋め込まれる表面または５０％以上埋め込まれる表面での残基は、接触と考える（表２）。ＴＦＰＩ（パラトープ）と接触するＦａｂ Ａの残基およびそれぞれの埋め込まれる表面を、ＡＲＥＡＩＭＯＬで分析した。最小５Å^２埋め込まれる表面または５０％以上埋め込まれる表面での残基は、接触と考える（表３）。

表２：Ｆａｂ Ａと接触するＴＦＰＩの残基。Ｃ鎖およびＮ鎖は、非対称ユニットにおけるそれぞれの複合体のＴＦＰＩに対応する。

表３：ＴＦＰＩと接触するＦａｂ Ａの残基。Ａ鎖、Ｂ鎖およびＬ鎖、Ｍ鎖は、非対称ユニットにおけるそれぞれの複合体のＦａｂ Ａの軽鎖および重鎖を示す。

Ｆａｂ Ａにより認識される非直線エピトープは、領域Ｇｌｕ１００−Ａｒｇ１０９およびＬｙｓ１２６、Ｇｌｙ１２８−Ａｓｎ１３３により定義される。Ｆａｂ Ａにおけるパラトープは、軽鎖（ｌｃ）残基ｌｃ＿Ｔｙｒ３７、ｌｃ＿Ｔｙｒ９６、ｌｃ＿Ａｓｐ９７、ｌｃ＿Ｓｅｒ９８、ｌｃ＿Ｔｙｒ９９およびｌｃ＿Ｌｅｕ１０１ならびに重鎖（ｈｃ）残基ｈｃ＿Ａｓｎ３２、ｈｃ＿Ｓｅｒ３３、ｈｃ＿Ａｌａ３５、ｈｃ＿Ｉｌｅ５２、ｈｃ＿Ｔｙｒ５４、ｈｃ＿Ａｒｇ５６、ｈｃ＿Ｌｙｓ５８、ｈｃ＿Ｔｙｒ６０、ｈｃ＿Ａｒｇ６２、ｈｃ＿Ｔｒｐ１０２、ｈｃ＿Ｓｅｒ１０４、ｈｃ＿Ａｓｐ１０５およびｈｃ＿Ｔｒｐ１０８を含む。ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３は、接触の数に基づいて主な相互作用部位であることを示す。

エピトープは、Ｃｙｓ１０６およびＣｙｓ１３０間のジスルフィド架橋により連結される２つのループからなる（図３）。ジスルフィド架橋は、ＣＤＲ−Ｈ３のｈｃ＿Ｔｒｐ１０８に対して積み重なっているが、隣接Ｉｌｅ１０５およびＬｅｕ１３１は、ｈｃ＿Ａｌａ３５、ｈｃ＿Ｉｌｅ５２、ｈｃ＿Ｔｙｒ５４（ＣＤＲ−Ｈ２）、ｈｃ＿Ｔｒｐ１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）、およびｌｃ＿Ｔｙｒ９６、ｌｃ＿Ｓｅｒ９８、ｌｃ＿Ｔｙｒ９９、ｌｃ＿Ｌｅｕ１０１（ＣＤＲ−Ｌ３）により作られる疎水性裂隙において埋め込まれる。接触の数に基づいて、Ｉｌｅ１０５およびＬｅｕ１３１は、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３との疎水性接触における重要なエピトープ残基である。

ＴＦＰＩ領域Ｇｌｕ１０１−Ｉｌｅ１０５は、ＣＤＲ−Ｈ２と相互作用する。接合面は、ｈｃ＿Ｔｙｒ５４、ｈｃ＿Ｔｙｒ６０およびｈｃ＿Ａｒｇ６２により強く特徴付けられる。Ｈｃ＿Ｔｙｒ５４は、Ａｓｐ１０２の側鎖との極性相互作用を示す。Ｈｃ＿Ｔｙｒ６０は、Ｇｌｕ１０１の主鎖カルボニル酸素との極性相互作用を示し、ｈｃ＿Ａｒｇ６２は、Ａｓｐ１０２の側鎖およびＧｌｙ１３２の主鎖カルボニル酸素との極性相互作用を示す。

Ａｓｐ１０２は、ＣＤＲ−Ｈ２のｈｃ＿Ｔｙｒ５４およびｈｃ＿Ａｒｇ６２との極性相互作用における重要なエピトープ残基である。Ｆａｂ Ａにおけるアルギニンへの野生型ｈｃ＿Ａｓｐ６２の置換は、１２０倍の親和性の増加をもたらす。Ｘ線構造に基づいて、これは、ｈｃ＿Ａｓｐ６２およびＡｓｐ１０２間の反発からｈｃ＿Ａｒｇ６２およびＡｓｐ１０２、および主鎖カルボニル酸素の極性相互作用への切り替えにより説明することができる。

Ａｒｇ１０７のグアニジン基は、ＣＤＲ−Ｈ１およびＣＤＲ−Ｈ３のｈｃ＿Ａｓｎ３２およびｈｃ＿Ａｓｐ１０５の側鎖のそれぞれと直接相互作用する。Ａｒｇ１０７は、第Ｘａ因子の阻害のために重要であると示されている（M.S. Bajajら (2001) Thromb Haemost 86(4):959-72.）。Ｆａｂ Ａは、該重要な残基を占有し、第Ｘａ因子を阻害するＡｒｇ１０７機能と競合する。

実施例５．Ｆａｂ Ａおよびその最適化された変異体Ｆａｂ Ｃのパラトープ比較
Ｆａｂ Ａの最適化された変異体であるＦａｂ ＣによるＴＦＰＩエピトープ結合の一貫性を評価するために、Ｆａｂ Ｃの軽鎖および重鎖の配列アラインメント（図１１Ａ）および相同性モデル（図１１Ｂ）を、Ｆａｂ ＣにおけるＦａｂ Ａパラトープ残基の保存について分析した。相同性モデルを、インプット鋳型構造として本発明者らのＴＦＰＩ−Ｆａｂ Ａ Ｘ線構造を使用して、ＤＳ ＭＯＤＥＬＥＲ（ACCELRYS, Inc; Fiser, A. and Sali A. (2003) Methods in Enzymology, 374:463-493）で計算した。相同性モデルは、ＲＭＳＤ＜０．５ÅでＦａｂ Ａと比較してほぼ同一の骨格構造を示す。ＴＦＰＩ−Ｆａｂ Ａ複合体において観察される２０個のパラトープ残基のうち、ｈｃ＿Ａｓｎ３２は、Ｆａｂ Ｃにおいて、異なる唯一のパラトープ残基であり、そこでは、アスパラギン酸残基がその位置にある（図１１）。Ｈｃ＿Ａｓｎ３２は、ＴＦＰＩ Ａｒｇ１０７と相互作用する。そのカルボキシレート基およびＡｒｇ１０７のグアニジン基との有望な相互作用を考慮すると、Ｆａｂ ＣのＡｓｐ３２は、ＴＦＰＩとよりしっかりと相互作用するはずである。Ｆａｂ ＡおよびＦａｂ Ｃパラトープ残基および予期される同一の骨格構造間の高い配列保存に基づいて、Ｆａｂ Ｃは、Ｆａｂ Ａと同じＴＦＰＩエピトープを恐らく認識する。

実施例６．ＴＦＰＩ−第Ｘａ因子相互作用の阻害に関するＸ線構造ベースの理論的根拠
Ｆａｂ Ａは、ＴＦＰＩ−第Ｘａ因子相互作用および阻害を予測する。ＴＦＰＩ−Ｆａｂ Ａ複合体とＴＦＰＩ−トリプシンの構造との重ね合わせ（M.J. Burgeringら (1997) J Mol Biol. 269(3):395-407）は、Ｆａｂ Ａのエピトープを含むＴＦＰＩ領域が第Ｘａ因子に対する代替物であるトリプシンとの相互作用のために重要であることを示す。Ｘ線構造に基づいて、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２上の観察されるエピトープへのＦａｂ Ａの結合は、立体障害により第Ｘａ因子の結合を排除するはずである（図４）。

実施例７．組換えＴＦＰＩ（Ｋｕｎｉｔｚドメイン１＋２）の生産、大腸菌における発現およびその精製
発現系
ｐＤ Ｅｃｏ５ Ｎと表される目的ベクター（Ｇａｔｅｗａｙ命名法にしたがって）は、ＥＴ−１６ ｂ（Novagen）に基づく。該ベクターはまた、Ｈｉｓ_１０およびＮｕｓＡタグならびにＨｉｓ_１０／ＮｕｓＡおよび興味あるタンパク質からなる融合タンパク質の発現のためのＧａｔｅｗａｙクローニングカセットをコードする。

Ｋｕｎｉｔｚドメイン１＋２のＮ−末端（Ａｓｐ１からＰｈｅ１５４、参照Ｕｎｉｐｒｏｔ １０６４６、成熟ＴＦＰＩアルファ）およびＧａｔｅｗａｙ結合部位（ａｔｔＢ１−５＃、ａｔｔＢ２−３＃、Invitrogen）に融合したＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードするＤＮＡ構築物を、ｐＤ Ｅｃｏ５ Ｎ ベクターにクローニングし、ｐＤ Ｅｃｏ５ Ｎ ＴＦＰＩ ＫＤ１＋２と表される発現ベクターを得た。使用される発現株はＢＬ２１ ＤＥ３（Novagen）であった。
ｐＤ Ｅｃｏ５ Ｎ ＴＦＰＩ ＫＤ１＋２を使用して発現される融合タンパク質のアミノ酸配列、６００ＡＡ

配列構成要素

発現
ｐＤ Ｅｃｏ５ Ｎ ＴＦＰＩ ＫＤ１＋２で形質転換されたＢＬ２１ ＤＥ３株を、１８０ｒｐｍの撹拌をしながら、３７℃で１４時間、２００μｇ／ｍＬのアンピシリンを有する２×１００ｍＬのＬＢ培地中で前培養として培養した。１０Ｌ培養容量（ＬＢ培地、２００μｇ／ｍＬのアンピシリン）を有するバイオリアクター（Sartorius Stedim Biotech）を２００ｍＬの前培養物で植菌し、１５０ｒｐｍの撹拌をしながら３７℃でインキュベートした。ＯＤ６００の培養密度で、ＩＰＴＧ（イソプロピル β−Ｄ−チオガラクトシド）を、遺伝子誘導のために１００ｍＭの最終濃度に加え、５０％のｐＯ２最小レベルおよび１８０−８００ｒｐｍの撹拌速度で１７℃で２４時間さらに培養した。大腸菌を遠心分離（３０００ｇ、１０分）によりペレット化し、−８０℃で貯蔵した。

精製
１０Ｌの培養物からのペレット化された大腸菌集団を、５００ｍＬの溶解バッファー［５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％（ｗ／ｗ）グリセロール、４０ｍＭのイミダゾール、プロテアーゼインヒビターカクテル Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ−フリー（Roche）］に再懸濁し、高圧デバイス（Microfluids）でホモジェナイズし、次に、溶解物を遠心した（１００．０００ｇ、６０分、４℃）。いくつかの精製工程をＡｋｔａ精製系を使用して行った。遠心された可溶性溶解物画分を、最初のＩＭＡＣクロマトグラフィー工程において、５０ｍＬのＮｉ−セファロース ＨＰ マトリックス（ＧＥ）を含むカラムに付した。Ｈｉ−Ｔｒａｐ−セファロース ＨＰ マトリックスの平衡、融合タンパク質結合および洗浄を、バッファーＡ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのイミダゾール）を使用して行った。ＮｕｓＡ−ＴＦＰＩ融合タンパク質の溶離のために、バッファーＢ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中、４０から５００ｍＭのイミダゾールの直線勾配を使用した。溶離画分をプールし（全容量１４０ｍＬ）、５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２を有するバッファーへの交換のために、脱塩カラム Ｈｉ Ｐｒｅｐ ２６／１０（ＧＥ）（２つの連結カラムユニット）に画分において付した。Ｎｕｓ Ａタグの除去のために、Ｈｉｓ_６−タグ化ＴＥＶでのタンパク質分解消化を、１：６６ｗ／ｗの酵素 対 融合タンパク質比率で、４℃で１６時間行った。サンプルを、５０ｍＬのＮｉ−セファロース ＨＰ マトリックス（ＧＥ）を含むカラムに再び付し、未開裂融合タンパク質およびＨｉｓ−ＴＥＶから遊離ＴＦＰＩを分離した。次に、ＩＭＡＣ工程の溶出液を、サイズ排除クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ、カラム Ｓ１００、ＧＥ）に付し、単量体ＴＦＰＩ画分を単離し、限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ、３ｋＤａ−カットオフ範囲でのユニット）により約１．５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。精製された最終ＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン１＋２サンプルは、約１８ｋＤａの見かけの分子量で、ＰＡＧＥにおいて二重バンドで現れた。さらなる分析（ＳＥＣ、ウェスタンブロット）は、上部のバンドに対応するタンパク質のみが、Ｆａｂ Ｂと免疫反応性であったことを示した。

実施例８．ヒト ＩｇＧ１由来のＦａｂ Ｂのタンパク質分解処理および精製
発現
Ｆａｂ Ｂを、そのヒトＩｇＧ１形態からタンパク質分解処理した。Ｆａｂ Ｂ＿ＩｇＧ１は、哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３）において分泌タンパク質として発現した。ＩｇＧ１単離のために、１．６Ｌの培養上清を、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲＥの２つの連結カラム（ＧＥから、５ｍＬベッド容量、流速１．５ｍＬ／分、４℃、１６時間）に付した。カラム洗浄および平衡のために、ＰＢＳおよび５００ｍＭのＮａＣｌからなるバッファーを使用した。結合したＩｇＧ１を溶離し（５０ｍＭの酢酸Ｎａ、５００ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ３．５、次に、ｐＨ３．０で同じバッファー）、中和し（２．５ＭのＴｒｉｓ＞１１）、約１３ｍｇ／ｍＬに限外ろ過により濃縮した。

固定されたパパイン（Ｐｉｅｒｃｅ、２０ｍＬのスラリー）を、１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ反応チューブ中、２２画分を使用して、約２７０ｍｇ（１２．５ｍＬ中）のＩｇＧ１の消化のために使用した（インキュベーション１６時間、３７℃、撹拌１４００ｒｐｍ）。処理後、サンプルを遠心し、上清を回収し、ペレットをＰＢＳで洗浄し、上清および除去される洗浄物の両方をプールした。

消化されたサンプルを、ＦｃおよびＦａｂ物質の分離を可能にする２つの連結ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅカラム（２×５ｍｌ）に再び付した。プールされた単離されたＦａｂ Ｂ画分を、限外濾過により約８ｍｇ／ｍＬ（全収量１２０ｍｇ）に濃縮した。さらに、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５（カラム２６／６０、ＰＢＳでの流速２．５ｍＬ／分）でのサイズ排除クロマトグラフィーを、さらなる精製のために使用した。さらなる濃度および滅菌濾過後、Ｆａｂ Ｂの最終収量は、８．５ｍｇ／ｍＬの濃度で１１５ｍｇであった。

分析サイズ排除クロマトグラフィー（Ａｋｔａ Ｍｉｃｒｏ ｓｙｓｔｅｍ、Ｓ７５ ５／１５０ カラム、１００ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を使用し、Ｆａｂ Ｂ／ＴＦＰＩ ＫＤ１＋２複合体形成を証明した（図５）。Ｆａｂ Ｂにおいて、ＳＥＣカラムにおいて予想外に長期の保持時間が、ＴＦＰＩ ＫＤ１＋２に対して検出される分子量と非常に類似である２０ｋＤａの見かけの分子量に対応して、観察された。

実施例９．Ｆａｂ Ｂとの複合体ＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン１＋２の生産
免疫複合体を形成するために、ＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン１＋２およびＦａｂ Ｂを、約１：１．５（ｗ／ｗ）の比率で混合した。したがって、３．８５ｍｇの濃縮された単量体ＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン１＋２タンパク質（Ｓ１００ プールされた画分から）を７．４ｍｇのＦａｂ Ｂ（ＳＥＣ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５から）と混合し、２１℃で１６時間インキュベートした。複合体形成は、分析ＳＥＣ（Ｓ２００／１５０）およびウェスタンブロットを介して証明された。複合体を、１５０ｍＭのＮａＣｌを有する１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４中でＳＥＣ（Ｓ２００ ２６／２６）によりさらに精製し、限外ろ過（Amicon、５ｋＤａ−カットオフ範囲でのユニット）により１０．３ｍｇ／ｍＬに濃縮し、これを結晶化のために使用した。

実施例１０．ＴＦＰＩ−Ｆａｂ Ｂ複合体の結晶化およびＸ線構造決定
結晶化
ＴＦＰＩ−Ｋｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）およびＫｕｎｉｔｚドメイン２（ＫＤ２）を含むタンパク質構築物ならびにモノクローナルＴＦＰＩ抗体Ｆａｂ Ｂの共結晶を、シッティング・ドロップ方法を使用して４℃で成長させた。タンパク質複合体を１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、等容量のタンパク質溶液およびウェル溶液（２０％ ＰＥＧ８０００）を沈殿剤として混合することにより結晶化した。結晶は３日後に現れた。

データ回収および処理
結晶を、低温保護のために結晶化バッファー中３０％のグリセロールにおいて液体窒素にて急速冷凍した。１つの結晶のデータを、ＭＡＲ ＣＣＤ検出器におけるビームラインＢＬ１４．１、ＢＥＳＳＹシンクロトロン（Berlin）で回収した。データを、ＩＭＯＳＦＬＭ（A.G.W. Leslie, (1992), Joint CCP4 + ESF-EAMCB Newsletter on Protein Crystallography, No. 26）で指数化し、組み込み、ＰＯＩＮＴＬＥＳＳ（P.R. Evans, (2005) Acta Cryst. D62, 72-82）でスケーリングのために調製し、ＳＣＡＬＡ（P.R. Evans, (2005) Acta Cryst. D62, 72-82）でスケーリングした。結晶は、最大２．３Åで回折し、セル定数ａ＝８０．３、ｂ＝７１．９、ｃ＝１０８．８；β＝９２．５°で空間群Ｐ２_１、および非対称ユニットにおける２つのＴＦＰＩ−ＫＤ１、−ＫＤ２−Ｆａｂ複合体を有した。

構造決定および精密化
ＴＦＰＩ−ＫＤ１、−ＫＤ２およびモノクローナル抗体Ｆａｂの共構造を、ＰＨＡＳＥＲ（A.J. McCoyら (2007) J. Appl. Cryst. 40, 658-674）、ＭＯＬＲＥＰ（A.Vagin and A.Teplyakov (1997) J. Appl. Cryst. 30, 1022-10）ならびにサーチモデルとしてＴＦＰＩ−ＫＤ２（ｐｄｂコード１ｔｆｘ）およびＦａｂフラグメント（ｐｄｂコード１ｗ７２）の社内で公開されたＸ線構造を使用して分子置換により解析した。分子置換の前に、ＦａｂおよびＫＤ１モデルを、ＣＨＡＩＮＳＡＷ（N. Stein, (2008) J. Appl. Cryst. 41, 641 - 643）で処理した。ＣＯＯＴ（P. Emsleyら (2010) Acta Cryst. D66:486-501）でのモデル構築およびＲＥＦＭＡＣ５．５（G.N. Murshudovら (1997) Acta Cryst. D53, 240-255）を使用する最尤精密化の反復繰り返しによって、モデルを完成した。両方のＦａｂの領域ｈｃ＿Ｓｅｒ１３１−ｈｃ＿Ｓｅｒ１３６、ＴＦＰＩ残基Ａｓｐ１−Ｌｅｕ２１、Ａｓｐ１４９−Ｐｈｅ１５４、およびＫＤ１−ＫＤ２リンカー残基Ａｒｇ７８−Ｇｌｕ９２は、弱い電子密度を示し、モデルに含まれなかった。データセットおよび精密化統計値は、表４に要約される。

表４．ＴＦＰＩ−Ｆａｂ Ｂ複合体に対するデータセットおよび精密化統計値

実施例１１．Ｘ線構造ベースのエピトープマッピング
ＴＦＰＩ−ＫＤ１、−ＫＤ２、およびＦａｂ Ｂの複合体（図６）は、非対称ユニットあたり２つのコピーの複合体として結晶化した。複合体の主鎖は、関連ＴＦＰＩ−ＫＤ１および−ＫＤ２のエピトープに結合されるそれぞれのＦａｂ Ｂと１．０ÅのＲＭＳＤで重なる。両方のＫｕｎｉｔｚドメインは、Ｆａｂ Ｂと直接的に、または水介在相互作用を介して相互作用する。ＫＤ１およびＫＤ２はまた、互いに相互作用する。Ｆａｂ Ｂ（エピトープ）と接触するＴＦＰＩの残基およびそれぞれの埋め込まれる表面を、ＣＣＰ４プログラムＡＲＥＡＩＭＯＬ（P.J. Briggs (2000) CCP4 Newsletter No. 38）で分析した。最小５Å^２埋め込まれる表面または５０％以上埋め込まれる表面での残基は、接触と考える（表５）。ＴＦＰＩ（パラトープ）と接触するＦａｂ Ｂの残基およびそれぞれの埋め込まれる表面を、ＡＲＥＡＩＭＯＬで分析した。最小５Å^２埋め込まれる表面または５０％以上埋め込まれる表面での残基は、接触と考える（表６）。

表５：ＴＦＰＩと接触するＦａｂ Ｂの残基。Ｃ鎖、Ｄ鎖およびＮ鎖、Ｏ鎖は、非対称ユニットにおけるそれぞれの複合体のＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン１およびＫｕｎｉｔｚドメイン２を示す。

表６：ＴＦＰＩと接触するＦａｂ Ｂの残基。Ａ鎖、Ｂ鎖およびＬ鎖、Ｍ鎖は、非対称ユニットにおけるそれぞれの複合体のＦａｂ Ｂの軽鎖および重鎖を示す。

Ｆａｂ Ｂは、ＴＦＰＩ−ＫＤ１の残基Ａｓｐ３１−Ｌｙｓ３６、Ｃｙｓ５９（これは、Ｃｙｓ３５とジスルフィド架橋を形成する）、Ｇｌｕ６０およびＡｓｎ６２ならびにＴＦＰＩ−ＫＤ２のＧｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、領域Ｐｒｏ１０３−Ｃｙｓ１０６（これは、Ｃｙｓ１３０とジスルフィド架橋を形成する）、残基Ａｒｇ１０７−Ｔｙｒ１０９、Ｐｈｅ１１４、Ａｓｎ１１６、Ｇｌｕ１２３、Ａｒｇ１２４および残基Ｌｙｓ１２６−Ｇｌｙ１２８により定義されるＫＤ１およびＫＤ２の非直線エピトープを認識した。ＴＦＰＩ−ＫＤ１と相互作用するＦａｂ Ｂにおけるパラトープは、ｌｃ＿Ｌｅｕ２７−ｌｃ＿Ｔｙｒ３１、ｌｃ＿Ａｓｐ５０、ｌｃ＿Ａｓｎ６５、ｌｃ＿Ｔｒｐ９０、ｌｃ＿Ａｓｐ９２、ｌｃ＿Ｇｌｙ９３、およびｈｃ＿Ａｒｇ１０１およびｈｃ＿Ｔｙｒ１０２を含む。ＴＦＰＩ−ＫＤ２と相互作用するＦａｂ Ｂにおけるパラトープは、ｌｃ＿Ｔｙｒ３１、ｌｃ＿Ｔｙｒ４８およびｌｃ＿Ｔｙｒ４９、およびｈｃ＿Ｔｈｒ２８、ｈｃ＿Ａｒｇ３０−ｈｃ＿Ｔｙｒ３２、ｈｃ＿Ｔｙｒ１００、ｈｃ＿Ａｒｇ１０１、ｈｃ＿Ｔｒｐ１０３、およびｈｃ＿Ａｓｐ１０５を含む。軽鎖ＣＤＲは、接触の数に基づいて、ＴＦＰＩ−ＫＤ１に対して主な相互作用部位であり、重鎖ＣＤＲは、ＴＦＰＩ−ＫＤ２に対して主な相互作用部位であることを示す。

ＴＦＰＩ−ＫＤ１における非直線エピトープは、Ｃｙｓ３５およびＣｙｓ５９間のジスルフィド架橋により連結される２つのループ領域からなる。該エピトープは、Ａｓｐ３１、Ａｓｐ３２、Ｇｌｕ６０、およびＬｙｓ３６とＦａｂ Ｂとの極性相互作用の三角形により取り囲まれているＰｒｏ３４の中央疎水性相互作用により特徴付けられる（図７）。

Ｐｒｏ３４は、ＣＤＲ−Ｌ１のｌｃ＿Ｔｙｒ３０およびｌｃ＿Ｔｙｒ３１、ＣＤＲ−Ｌ３のｌｃ＿Ｔｒｐ９０およびＣＤＲ−Ｈ３のｈｃ＿Ｔｙｒ１０２により作られる疎水性裂隙にある。Ａｓｐ３１およびＡｓｐ３２は、ＣＤＲ−Ｈ３との極性相互作用およびｈｃ＿Ａｒｇ１０１、ｈｃ＿Ｔｙｒ１０２、および水分子との水素結合ネットワークを有する。Ｈｃ＿Ｔｙｒ１０２側鎖は、Ｐｒｏ３４との疎水性相互作用、Ａｓｎ３１との極性相互作用、およびＣＤＲ−Ｌ３のｌｃ＿Ｔｒｐ９０との芳香族性π−π相互作用を有する位置に置かれる。

Ａｓｐ３１およびＡｓｐ３２とＣＤＲ−Ｈ３との相互作用は、重要なエピトープ特徴であり、ｈｃ＿Ｔｙｒ１０２およびｈｃ＿Ａｒｇ１０１の方向および相互作用は極めて重要なようである。野生型残基ｈｃ＿Ｌｙｓ９９のロイシンへの突然変異は、２０倍の親和性増加をもたらした。Ｈｃ＿Ｌｅｕ９９は、軽鎖および重鎖間の疎水性接合面に位置し、ＣＤＲ−Ｈ３ループに続く。極性およびフレキシブルな(flexible)リジン側鎖は、該位置で不利な点であり、最適なＣＤＲ−Ｈ３構造および抗原相互作用を妨げる。

極性の三角形の第２コーナーを形成するＧｌｕ６０は、ｌｃ＿Ｔｙｒ３０の側鎖（ＣＤＲ−Ｌ１）、ｌｃ＿Ｔｒｐ９０およびｌｃ＿Ｇｌｙ９３の主鎖窒素（ＣＤＲ−Ｌ３）と相互作用する。

三角形の第３コーナーは、Ｌｙｓ３６により形成される。Ｌｙｓ３６は、ＴＦＰＩによる第ＶＩＩａ因子／組織因子複合体の阻害のために重要な残基である（M.S. Bajajら (2001) Thromb Haemost 86(4):959-72.）。Ｆａｂ Ｂとの複合体において、Ｌｙｓ３６は、ＣＤＲ−Ｌ１ ｌｃ＿Ｌｅｕ２７、ｌｃ＿Ａｒｇ２８、ｌｃ＿Ａｓｎ２９、ｌｃ＿Ｔｙｒ３１、ＣＤＲ−Ｌ２ ｌｃ＿Ａｓｐ５０、および水分子と有意に接触し、埋め込まれる。Ｆａｂ Ｂへの結合の間、Ｌｙｓ３６と第ＶＩＩａ因子／組織因子複合体との相互作用およびその阻害は、排除されるようである。

ＴＦＰＩ−ＫＤ２における非直線エピトープは、残基Ｇｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ｐｒｏ１０３−Ｔｙｒ１０９、Ｐｈｅ１１４；Ａｓｎ１１６およびＧｌｕ１２３；Ａｒｇ１２４、Ｌｙｓ１２６−Ｇｌｙ１２８を含む３つの区画からなる。ＫＤ２−エピトープは、Ｆａｂ Ｂ ＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２、−Ｈ１、および−Ｈ３と極性および疎水性相互作用を形成する（図８）。

Ｇｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ａｒｇ１０７およびＴｙｒ１０９は、ＣＤＲ−Ｈ１（Ｇｌｕ１００およびＧｌｕ１０１との相互作用）ＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２、−Ｈ３（Ａｒｇ１０７との相互作用）、およびＣＤＲ−Ｌ２、−Ｈ３（Ｔｙｒ１０９との相互作用）により作られるＦａｂ Ｂの３つの分離された表面領域と接触して、強い極性または疎水性固定点を提供する重要なエピトープ残基である。

Ａｒｇ１０７は、ＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２、−Ｈ３のそれぞれのｌｃ＿Ｔｙｒ３１、ｌｃ＿Ｔｙｒ４９、ｈｃ＿Ａｒｇ１０１、およびｈｃ＿Ｔｙｒ１０２により有意に接触され、ＫＤ１のＧｌｙ３３およびＣｙｓ３５とさらに相互作用する。Ａｒｇ１０７は、第Ｘａ因子の阻害のために重要であることが示されている（M.S. Bajajら (2001) Thromb Haemost 86(4):959-72.）。Ｆａｂ Ｂは、該重要な残基を占有し、第Ｘａ因子を阻害するＡｒｇ１０７機能を排除する。

Ｇｌｕ１００およびＧｌｕ１０１は、ＣＤＲ−Ｈ１残基ｈｃ＿Ａｒｇ３０、ｈｃ＿Ｓｅｒ３１、およびｈｃ＿Ｔｈｒ２８およびｈｃ＿Ｔｙｒ３２との水素結合を形成する。

Ｔｙｒ１０９は、ＣＤＲ−Ｌ２ ｌｃ＿Ｔｙｒ４８、およびＣＤＲ−Ｈ３残基ｈｃ＿Ｔｙｒ１００、およびｈｃ＿Ｔｒｐ１０３により作られる疎水性ニッチにあり、ｈｃ＿Ａｓｐ１０５との水素結合を形成する。

実施例１２．Ｆａｂ Ｂおよびその最適化された変異体Ｆａｂ Ｄのパラトープ比較
Ｆａｂ Ｂの最適化された変異体であるＦａｂ ＤによるＴＦＰＩエピトープ結合の一貫性を評価するために、Ｆａｂ Ｄの軽鎖および重鎖の配列アラインメント（図１２Ａ）および相同性モデル（図１２Ｂ）によって、Ｆａｂ ＤにおけるＦａｂ Ｂパラトープ残基の保存について分析した。相同性モデルを、インプット鋳型構造として本発明者らのＴＦＰＩ−Ｆａｂ Ｂ Ｘ線構造を使用して、ＤＳ ＭＯＤＥＬＥＲ（ACCELRYS, Inc; Fiser, A. and Sali A. (2003) Methods in Enzymology, 374:463-493）で計算した。相同性モデルは、ＲＭＳＤ＜０．５ÅでＦａｂ Ｂと比較してほぼ同一の骨格構造を示す。ＴＦＰＩ−Ｆａｂ Ｂ複合体において観察される２９個のパラトープ残基のうち、７つの残基（５つの軽鎖残基、２つの重鎖残基）は、Ｆａｂ Ｄと異なる（図１２）。Ｌｃ＿Ａｒｇ２８；ｌｃ＿Ａｓｎ２９、ｌｃ＿Ａｓｐ９２、およびｌｃ＿Ｇｌｙ９３は、ＴＦＰＩエピトープ残基との主鎖相互作用を示す。Ｆａｂ Ｄにおけるこれらの残基の交換は、異なるＴＦＰＩエピトープへの結合を誘導することが予期されない。Ｆａｂ Ｄにおけるｌｃ＿Ｔｙｒ４８およびｈｃ＿Ｇｌｎ１のフェニルアラニンおよびグルタミン酸による置換は、極性側鎖相互作用がＸ線構造において観察されないため、無視できる。Ｈｃ＿Ａｒｇ３０は、ＴＦＰＩのＧｌｕ１００との極性相互作用を示し、Ｆａｂ Ｄにおけるセリンと交換される。該位置で、アルギニンは、ＴＦＰＩと相互作用するため、セリンよりも好ましいはずである。Ｆａｂ ＢおよびＦａｂ Ｄパラトープ残基間の分析される交換、全配列保存およびＦａｂ Ｄ相同性モデルの低いＲＭＳＤの予期される影響に基づいて、Ｆａｂ Ｄは、Ｆａｂ Ｂと同じＴＦＰＩエピトープを認識すると考えられる。

実施例１３ 第Ｘａ因子および第ＶＩＩａ因子／組織因子複合体とのＴＦＰＩ相互作用の阻害に関するＸ線構造ベースの理論的根拠
Ｆａｂ Ｂは、ＴＦＰＩのＫＤ１およびＫＤ２の両方に結合する。ＫＤ２は、第Ｘａ因子に結合し、阻害する。ＫＤ１は、第ＶＩＩａ因子／組織因子複合体に結合し、阻害する。トリプシンとの複合体におけるＫＤ２（M.J. Burgeringら (1997) J Mol Biol. 269(3):395-407）ならびにＴＦの細胞外部分および第ＶＩＩａ因子との複合体におけるＢＰＴＩ（E. Zhangら (1999) J Mol Biol 285(5):2089-104.）のＸ線構造は、報告されている。トリプシンは第Ｘａ因子に対する代替物であり、ＢＰＴＩはＴＦＰＩ−ＫＤ１のホモログである。ＴＦＰＩ−Ｆａｂ Ｂ複合体とＫＤ２−トリプシンまたはＢＰＴＩ−第ＶＩＩａ因子／組織因子のいずれかとの重ね合わせは、抗体結合が、ＫＤ１およびＫＤ２の、それらの天然リガンド、第ＶＩＩａ因子／組織因子および第Ｘａ因子それぞれへの結合を排除することを示す（図９、図１０）。

実施例１４．Ｆａｂ ＣおよびＦａｂ Ｄは、ＦＸａおよびＦＶＩＩ／ＴＦとのＴＦＰＩ結合をブロックした
Ｆａｂ ＣおよびＦａｂ Ｄが、ＴＦＰＩにおいてＦＶＩＩａ／ＴＦ−複合体またはＦＸａ−結合をブロックすることができることを確認するために、本発明者らは、表面プラズモン共鳴（Biacore）試験を行った。ＣＭ５チップを、アミンカップリングキット（GE Healthcare）を使用して１７０ＲＵのヒトＴＦＰＩで固定した。６０μＬのＦａｂ Ｃ、Ｆａｂ ＤまたはネガティブコントロールＦａｂの容量を注射し、６０μＬの５μｇ／ｍＬのＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体またはＦＸａをチップ上に注射した。凝固因子の注射後、ｐＨ１．５での３０から４５μＬの１０ｍＭのグリシンを注射し、チップを再生した。ネガティブコントロールＦａｂ後に産生された凝固因子の相対単位（ＲＵ）を１００％と表し、Ｆａｂ ＣまたはＦａｂ Ｄが注射された後に産生された凝固因子のＲＵを計算した。図１３Ａに示されるとおり、０．３μｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬの濃度で、ＴＦＰＩにおけるＦａｂ Ｃ結合は、ＦＸａ結合を４２．６％および５．２％にそれぞれ有意な減少を引き起こした。同様に、０．３および１μｇ／ｍＬの濃度でのＦａｂ Ｄは、ＦＸａ結合を２０．８％および７．６％にそれぞれ減少させた。ＦＶＩＩａ／ＴＦ結合の結果を、図１３Ｂに示した。０．３および１μｇ／ｍＬの濃度で、Ｆａｂ Ｃは、ＦＶＩＩａ／ＴＦ結合を２５．１％および１０．０％にそれぞれ減少させたが、Ｆａｂ Ｄは、ＦＶＩＩａ／ＴＦ結合を完全にブロックし、ＴＦＰＩのＫＤ １へのＦａｂ Ｄの直接結合による可能性が高かった。

本発明は、特定の態様および実施例に関して記載しているが、種々の修飾および変化が行われ得ること、均等物が本発明の精神および範囲から逸脱することなく置き換えられ得ることを理解すべきである。したがって、明細書および実施例は、限定的意味よりもむしろ説明的意味であると考えるべきである。さらに、本明細書において言及されている全ての文献、参考書、特許出願および特許は、出典明示によりそれらの全体を本明細書に包含させる。

Claims (37)

1. ヒト組織因子経路インヒビターのエピトープ（配列番号：１）に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、該エピトープは、配列番号：１のＧｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ａｓｐ１０２、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｌｙｓ１２６、Ｇｌｙ１２８、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２およびＡｓｎ１３３からなる群から選択される１つまたはそれ以上の残基を含む、単離されたモノクローナル抗体。
2. 該エピトープが、配列番号：１の残基Ｉｌｅ１０５を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
3. 該エピトープが、配列番号：１の残基Ｉｌｅ１０５およびＡｓｐ１０２を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
4. 該エピトープが、配列番号：１の残基Ｉｌｅ１０５、Ａｓｐ１０２およびＬｅｕ１３１を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
5. エピトープが、配列番号：１のＧｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ａｓｐ１０２、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｌｙｓ１２６、Ｇｌｙ１２８、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２およびＡｓｎ１３３からなる群から選択される１つまたはそれ以上の残基をさらに含む、請求項２−４のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体。
6. ヒト組織因子経路インヒビターのエピトープ（配列番号：１）に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、該エピトープは、配列番号：１の残基Ｃｙｓ１０６およびＣｙｓ１３０間のジスルフィド架橋により連結される２つのアミノ酸ループを含む、単離されたモノクローナル抗体。
7. 該エピトープが、配列番号：１のＧｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ａｓｐ１０２、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｌｙｓ１２６、Ｇｌｙ１２８、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２およびＡｓｎ１３３からなる群から選択される１つまたはそれ以上の残基をさらに含む、請求項６に記載の単離されたモノクローナル抗体。
8. 該エピトープが、配列番号：１の残基Ｉｌｅ１０５を含む、請求項７に記載の単離されたモノクローナル抗体。
9. エピトープが、配列番号：１の残基Ａｓｐ１０２を含む、請求項７に記載の単離されたモノクローナル抗体。
10. エピトープが、配列番号：１の残基Ｌｅｕ１３１を含む、請求項７に記載の単離されたモノクローナル抗体。
11. エピトープが、配列番号：１のＧｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ａｓｐ１０２、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｌｙｓ１２６、Ｇｌｙ１２８、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２およびＡｓｎ１３３からなる群から選択される１つまたはそれ以上の残基をさらに含む、請求項８−１０のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体。
12. ヒト組織因子経路インヒビターのエピトープ（配列番号：１）に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、該エピトープが、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の１つまたはそれ以上の残基およびＫｕｎｉｔｚドメイン２の１つまたはそれ以上の残基を含む、単離されたモノクローナル抗体。
13. Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基が、Ａｓｐ３１、Ａｓｐ３２、Ｇｌｙ３３、Ｐｒｏ３４、Ｃｙｓ３５、Ｌｙｓ３６、Ｃｙｓ５９、Ｇｌｕ６０およびＡｓｎ６２からなる群から選択される１つまたはそれ以上の残基を含む、請求項１２に記載の単離されたモノクローナル抗体。
14. Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基が残基Ｐｒｏ３４を含む、請求項１３に記載の単離されたモノクローナル抗体。
15. Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基が残基Ｐｒｏ３４およびＧｌｕ６０を含む、請求項１３に記載の単離されたモノクローナル抗体。
16. Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基が残基Ｐｒｏ３４、Ｌｙｓ３６およびＧｌｕ６０を含む、請求項１３に記載の単離されたモノクローナル抗体。
17. Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基が、Ａｓｐ３１、Ａｓｐ３２、Ｇｌｙ３３、Ｃｙｓ３５、Ｌｙｓ３６、Ｃｙｓ５９、Ｇｌｕ６０およびＡｓｎ６２からなる群から選択される１つまたはそれ以上の残基を含む、請求項１４−１６のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体。
18. Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基が、Ｇｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｐｈｅ１１４、Ａｓｎ１１６、Ｇｌｕ１２３、Ａｒｇ１２４、Ｌｙｓ１２６、Ｔｙｒ１２７およびＧｌｙ１２８からなる群から選択される１つまたはそれ以上の残基を含む、請求項１２に記載の単離されたモノクローナル抗体。
19. Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基が残基Ａｒｇ１０７を含む、請求項１８に記載の単離されたモノクローナル抗体。
20. Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基が残基Ｇｌｕ１０１を含む、請求項１８に記載の単離されたモノクローナル抗体。
21. Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基が残基Ｔｙｒ１０９を含む、請求項１８に記載の単離されたモノクローナル抗体。
22. Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基が、Ｇｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｐｈｅ１１４、Ａｓｎ１１６、Ｇｌｕ１２３、Ａｒｇ１２４、Ｌｙｓ１２６、Ｔｙｒ１２７およびＧｌｙ１２８からなる群から選択される１つまたはそれ以上の残基をさらに含む、請求項１９−２１のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体。
23. Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基が、Ａｓｐ３１、Ａｓｐ３２、Ｇｌｙ３３、Ｐｒｏ３４、Ｃｙｓ３５、Ｌｙｓ３６、Ｃｙｓ５９、Ｇｌｕ６０およびＡｓｎ６２からなる群から選択される１つまたはそれ以上の残基を含み、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基が、Ｇｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｐｈｅ１１４、Ａｓｎ１１６、Ｇｌｕ１２３、Ａｒｇ１２４、Ｌｙｓ１２６、Ｔｙｒ１２７およびＧｌｙ１２８からなる群から選択される１つまたはそれ以上の残基を含む、請求項１２に記載の単離されたモノクローナル抗体。
24. ヒト組織因子経路インヒビターのエピトープ（配列番号：１）に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、該エピトープは、配列番号：１の残基Ｃｙｓ３５およびＣｙｓ５９間のジスルフィド架橋により連結される２つのアミノ酸ループを含む、単離されたモノクローナル抗体。
25. 該エピトープが、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の１つまたはそれ以上の残基およびＫｕｎｉｔｚドメイン２の１つまたはそれ以上の残基をさらに含む、請求項２４に記載の単離されたモノクローナル抗体。
26. Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基が、Ａｓｐ３１、Ａｓｐ３２、Ｇｌｙ３３、Ｐｒｏ３４、Ｃｙｓ３５、Ｌｙｓ３６、Ｃｙｓ５９、Ｇｌｕ６０およびＡｓｎ６２からなる群から選択される１つまたはそれ以上の残基を含む、請求項２５に記載の単離されたモノクローナル抗体。
27. Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基が、Ｇｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｐｈｅ１１４、Ａｓｎ１１６、Ｇｌｕ１２３、Ａｒｇ１２４、Ｌｙｓ１２６、Ｔｙｒ１２７およびＧｌｙ１２８からなる群から選択される１つまたはそれ以上の残基を含む、請求項２５に記載の単離されたモノクローナル抗体。
28. Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基が、Ａｓｐ３１、Ａｓｐ３２、Ｇｌｙ３３、Ｐｒｏ３４、Ｃｙｓ３５、Ｌｙｓ３６、Ｃｙｓ５９、Ｇｌｕ６０およびＡｓｎ６２からなる群から選択される１つまたはそれ以上の残基を含み、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基が、Ｇｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｐｈｅ１１４、Ａｓｎ１１６、Ｇｌｕ１２３、Ａｒｇ１２４、Ｌｙｓ１２６、Ｔｙｒ１２７およびＧｌｙ１２８からなる群から選択される１つまたはそれ以上の残基を含む、請求項２２に記載の単離されたモノクローナル抗体。
29. ＴＦＰＩに結合する単離されたモノクローナル抗体であって、ＴＦＰＩへの結合に対して、請求項１から２８のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体と競合する、単離されたモノクローナル抗体。
30. ＴＦＰＩに結合する単離された二重特異性抗体であって、ＴＦＰＩへの結合に対して、請求項１から２８のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体と競合する、二重特異性抗体。
31. 治療有効量の請求項１−３０のいずれかに記載のモノクローナル抗体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
32. 治療有効量の請求項１−３０のいずれかに記載の少なくとも２つのモノクローナル抗体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
33. 第１のモノクローナル抗体が、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体を含み、第２のモノクローナル抗体が、請求項１２に記載の単離されたモノクローナル抗体を含む、請求項３２に記載の医薬組成物。
34. 治療有効量の請求項３０−３２のいずれかに記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、凝固における遺伝的および後天的欠乏または欠損を処置するための方法。
35. 血友病Ａ、ＢまたはＣを処置する、請求項３４に記載の方法。
36. 治療有効量の請求項３１−３３のいずれかに記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、出血時間を短縮するための方法。
37. 請求項１−２９のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体をコードする、ヒト組織因子経路インヒビターのエピトープ（配列番号：１）に結合する抗体をコードする、単離された核酸分子。

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