CN108367075A - 4-1bb结合蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

公开了特异性结合4‑1BB(CD137)的结合蛋白。更具体地，公开了特异性结合人4‑1BB的抗体。这些结合蛋白可以通过改变4‑1BB的水平或活性而用于治疗或预防诸如癌症的疾病。

Description

4-1BB结合蛋白及其用途

相关申请

本申请要求于2016年11月23日提交的美国专利申请62/426,074的优先权，在此通过引用将其全部内容并入本申请。

公开领域

本公开涉及4-1BB(CD137)结合蛋白以及它们的用途，尤其涉及多种疾病的治疗。

背景

癌症免疫疗法通过克服T细胞的调控机制(检查点)增强了抗肿瘤应答。4-1BB(CD137)蛋白受体存在于多种免疫细胞上，如T细胞、自然杀伤细胞和树突细胞。4-1BB显示增强细胞毒性T细胞应答。对于综述，参见Yonezawa等人，Clinical Cancer Research,21:3113-20(2015)。

概述

本公开涉及4-1BB(CD137)结合蛋白。本公开的结合蛋白包括但不限于抗体、抗原结合部分以及能够结合人4-1BB的其它抗原结合蛋白。此外，本公开提供了制备4-1BB结合蛋白的方法以及利用4-1BB结合蛋白治疗诸如癌症等疾病的方法。

本文公开了多种结合人4-1BB、刺激并增加免疫细胞的数目的人4-1BB抗体。这些抗体可以通过自身提供增强的抗肿瘤免疫功能。这些抗体还可以与一些用于阻抑T细胞功能的免疫检查点的抑制剂(即PD-1和PD-L1mAb)协同作用。

在一个实施方案中，本公开涉及能够结合4-1BB的结合蛋白。在另一实施方案中，结合蛋白结合人4-1BB。在另一实施方案中，结合蛋白能够调节4-1BB的一种或多种生物学功能。在另一实施方案中，结合蛋白能够中和4-1BB。在另一实施方案中，结合蛋白不中和4-1BB。在另一实施方案中，结合蛋白能够结合4-1BB并阻止4-1BB与它的其它结合靶标的结合。在另一实施方案中，结合蛋白能够用作4-1BB的激动剂。

本公开的一个实施方案提供分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合人4-1BB并抑制细胞中4-1BB与其结合伴侣的结合。在另一实施方案中，在50nM 4-1BB的浓度下，公开的抗体的EC50是10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M。

在另一实施方案中，结合蛋白是分离的抗体。在另一实施方案中，本公开提供分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合人4-1BB，并调节4-1BB的水平和/或活性。在一个方面，在向对象施用治疗有效量的所述抗体或其抗原结合片段之后，所述抗体或其抗原结合片段使表达4-1BB的细胞中4-1BB的活性抑制约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在另一方面，在向对象施用治疗有效量的所述抗体或其抗原结合片段之后，所述抗体或其抗原结合片段使表达4-1BB的细胞中4-1BB的水平降低约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在另一方面，在向对象施用治疗有效量的所述抗体或其抗原结合片段之后，所述抗体或其抗原结合片段使表达4-1BB的细胞中4-1BB的活性增强约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

在一个实施方案中，如通过表面等离子体共振所测量的，本公开的结合蛋白与4-1BB具有至少约10²M^-1s^-1、至少约10³M^-1s^-1、至少约10⁴M^-1s^-1、至少约10⁵M^-1s^-1、至少约10⁶M^-1s^-1、至少约10⁷M^-1s^-1或者至少约10⁸M^-1s^-1的结合速率常数(k_on)。

在另一实施方案中，如通过表面等离子体共振所测量的，本公开的结合蛋白与4-1BB具有至多约10^-3s^-1、至多约10^-4s^-1、至多约10^-5s^-1、至多约10^-6s^-1、至多约10^-7s^-1或者至多约10^-7s^-1的解离速率常数(k_off)。

在另一实施方案中，本公开的结合蛋白与4-1BB具有至多约10^-7M、至多约10^-8M、至多约10^-9M、至多约10^-10M、至多约10^-11M、至多约10^-12M或者至多约10^-13M的解离常数(K_D)。

在一个实施方案中，公开了能够特异性结合人4-1BB的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含抗原结合结构域，并且所述抗原结合结构域包含六种CDR：CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:35；其中CDR-H2选自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:36；其中CDR-H3选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:37；CDR-L1选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:38；CDR-L2选自SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:39；以及CDR-L3选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQID NO:28、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:40。

在另一实施方案中，六种CDR中的三种选自由下述CDR集组成的可变结构域CDR集：

VH ZW103 CDR集

CDR-H1:SEQ ID NO:11

CDR-H2:SEQ ID NO:12

CDR-H3:SEQ ID NO:13

VL ZW103 CDR集

CDR-L1:SEQ ID NO:14

CDR-L2:SEQ ID NO:15

CDR-L3:SEQ ID NO:16

VH ZW104 CDR集

CDR-H1:SEQ ID NO:17

CDR-H2:SEQ ID NO:18

CDR-H3:SEQ ID NO:19

VL ZW104 CDR集

CDR-L1:SEQ ID NO:20

CDR-L2:SEQ ID NO:21

CDR-L3:SEQ ID NO:22

VH ZW105 CDR集

CDR-H1:SEQ ID NO:23

CDR-H2:SEQ ID NO:24

CDR-H3:SEQ ID NO:25

VL ZW105 CDR集

CDR-L1:SEQ ID NO:26

CDR-L2:SEQ ID NO:27

CDR-L3:SEQ ID NO:28

VH ZW106 CDR集

CDR-H1:SEQ ID NO:29

CDR-H2:SEQ ID NO:30

CDR-H3:SEQ ID NO:31

VL ZW106 CDR集

CDR-L1:SEQ ID NO:32

CDR-L2:SEQ ID NO:33

CDR-L3:SEQ ID NO:34

VH ZW107 CDR集

CDR-H1:SEQ ID NO:35

CDR-H2:SEQ ID NO:36

CDR-H3:SEQ ID NO:37

VL ZW107 CDR集

CDR-L1:SEQ ID NO:38

CDR-L2:SEQ ID NO:39

CDR-L3:SEQ ID NO:40。

在另一实施方案中，结合蛋白包含选自下述的至少两种可变结构域CDR集：VHZW103 CDR集和VL ZW103 CDR集；VH ZW104 CDR集和VL ZW104 CDR集；VH ZW105 CDR集和VLZW105 CDR集；VH ZW106 CDR集和VL ZW106 CDR集；VH ZW107 CDR集和VL ZW107 CDR集。

在另一实施方案中，本文公开的结合蛋白还包含人Fc区域。在另一实施方案中，结合蛋白是能够结合4-1BB的人抗体或其抗原结合部分。

在另一实施方案中，本文公开的结合蛋白还包含人受体框架。在另一实施方案中，结合蛋白是能够结合4-1BB的CDR移植抗体或其抗原结合部分。在另一实施方案中，CDR移植抗体或其抗原结合部分包含本文公开的一种或多种CDR。在另一实施方案中，CDR移植抗体或其抗原结合部分包含人受体框架。

在另一实施方案中，公开的结合蛋白是能够结合4-1BB的人源化抗体或其抗原结合部分。在另一实施方案中，所述人源化抗体或其抗原结合部分包含以上公开的一种或多种CDR，其并入人受体框架的人抗体可变结构域中。在另一实施方案中，人抗体可变结构域是共有人可变结构域。

在另一实施方案中，人受体框架包含关键残基处的至少一个框架区氨基酸取代，其中所述关键残基选自：与CDR邻近的残基、糖基化位点残基、稀有残基、能够与人4-1BB相互作用的残基、能够与CDR相互作用的残基、典型残基、重链可变区与轻链可变区之间的接触残基、Vernier区中的残基以及Chothia定义的可变重链CDR1与Kabat定义的第一重链框架之间的重叠区域内的残基。

在实施方案中，结合蛋白是能够结合4-1BB的人源化抗体或其抗原结合部分。在另一实施方案中，所述人源化抗体或其抗原结合部分包含本文公开的一种或多种CDR。在另一实施方案中，所述人源化抗体或其抗原结合部分包含本文公开的三种或更多种CDR。在另一实施方案中，所述人源化抗体或其抗原结合部分包含本文公开的六种CDR。

在另一实施方案中，结合蛋白包含至少一种具有选自SEQ ID NO.:1-10的氨基酸序列的可变结构域。

在另一实施方案中，结合蛋白包含至少一种重链可变结构域和至少一种轻链可变结构域，所述重链可变结构域含有选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、52和56的氨基酸序列，以及所述轻链可变结构域含有选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、53和57的氨基酸序列。

在另一实施方案中，结合蛋白可以包含两种可变结构域，其中所述两种可变结构域含有选自下述可变结构域集的氨基酸序列：

SEQ ID NO:1和2；

SEQ ID NO:3和4；

SEQ ID NO:5和6；

SEQ ID NO:7和8；

SEQ ID NO:9和10；

SEQ ID NO:52和53；或

SEQ ID NO:56和57。

在一个实施方案中，本公开提供了抗体构建体，其包含以上公开的任何一种结合蛋白以及接头多肽或免疫球蛋白。在另一实施方案中，抗体构建体选自：免疫球蛋白分子、单克隆抗体、完全人抗体、嵌合抗体、CDR-移植抗体、人源化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、单域抗体、双链抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体以及双特异性抗体。在另一实施方案中，所述抗体构建体包含选自下述的重链免疫球蛋白恒定结构域：人IgM恒定结构域、人IgG1恒定结构域、人IgG2恒定结构域、人IgG3恒定结构域、人IgG4恒定结构域、人IgE恒定结构域和人IgA恒定结构域。在另一实施方案中，本公开提供了抗体缀合物，其包含本文公开的抗体构建体和试剂，其中所述试剂选自：免疫粘附分子、显像剂、治疗剂和细胞毒性剂。在另一实施方案中，所述显像剂选自：放射性标记物、酶、荧光标记物、发光标记物、生物发光标记物、磁性标记物和生物素。在另一实施方案中，所述显像剂是选自下述的放射性标记物：³H、¹⁴C、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁷⁷Lu、¹⁶⁶Ho以及¹⁵³Sm。在另一实施方案中，治疗剂或细胞毒性剂选自：抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类药物、毒素以及细胞凋亡剂。

在另一实施方案中，抗体构建体被糖基化。在另一实施方案中，所述糖基化是人糖基化模式。

在另一实施方案中，本文公开的结合蛋白、抗体构建体或抗体缀合物以晶体存在。在另一实施方案中，所述晶体是不含载体的药物控释晶体。在另一实施方案中，结晶的结合蛋白、结晶的抗体构建体或结晶的抗体缀合物在体内具有长于其可溶性对应物的半衰期。在另一实施方案中，结晶的结合蛋白、结晶的抗体构建体或结晶的抗体缀合物在结晶之后保留生物学活性。

在一个方面，结合蛋白可以是多特异性抗体、双重特异性抗体和双特异性抗体。此类抗体构建体在本领域众所周知，并且如Kontermann(ed.),Bispecific Antibodies,Springer,NY(2011)以及Spiess等人，Mol.Immunol.67(2):96-106(2015)中所述并表征。此类双特异性抗体构建体包含能够结合4-1BB和第二靶标的一个或多个结合结构域。在一个实施方案中，所述第二靶标选自：PD-1、PD-L1、CTLA-4、HER2/neu受体、CSF1、MCSF、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、FGF2、IFNα1、IFNβ1、IFNγ、组胺和组胺受体、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12α、IL-12β、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、KITLG、PDGFB、IL-2Rα、IL-4R、IL-5Rα、IL-8Rα、IL-8Rβ、IL-12Rβ1、IL-12Rβ2、GDF11Rα1、GDF11Rα2、IL-18R1、TSLP、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL13、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL22、CCL24、CX3CL1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、XCL1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CX3CR1、GPR2、XCR1、FOS、GATA3、JAK1、JAK3、STAT6、TBX21、TGFB1、TNFSF6、YY1、CYSLTR1、FCER1A、FCER2、LTB4R、TB4R2以及LTBR。

在另一实施方案中，本公开涉及编码以上所公开的结合蛋白、抗体构建体或抗体缀合物中的任何一种的分离的核酸。又一实施方案提供了包含以上所公开的分离的核酸的载体，其中所述载体选自：pcDNA；pTT(Durocher等人，Nucleic Acids Research 2002,Vol30,No.2)；pTT3(含有额外的多克隆位点的pTT；pEFBOS(Mizushima,S和Nagata,S.,(1990)Nucleic acids Research Vol 18,No.17)；pBV；pJV以及pBJ。

在一个实施方案中，用以上所公开的载体转化宿主细胞。在另一实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞。在另一实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。在另一实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞。在另一实施方案中，所述真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。在另一实施方案中，所述宿主细胞是包括但不限于CHO和COS的哺乳动物细胞；或诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的真菌细胞；或诸如Sf9的昆虫细胞。

在另一实施方案中，提供了产生结合4-1BB的结合蛋白的方法。所述方法可以包括在足以产生结合4-1BB的结合蛋白的条件下，在培养基中培养以上所公开的任何一种宿主细胞。另一实施方案提供了根据以上所公开的方法产生的结合蛋白。

在另一实施方案中，公开了用于释放结合蛋白的组合物，其中所述组合物包含制剂以及至少一种聚合物载体，所述制剂进而包含以上所公开的结晶的结合蛋白、结晶的抗体构建体或结晶的抗体缀合物以及成分。在另一实施方案中，所述聚合物载体是选自下述中的一种或多种的聚合物：聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酐类)、聚(缩酚酸肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-羟基乙酸)或PLGA、聚(b-羟基丁酸酯)、聚(己内酯)、聚(二氧环己酮)、聚(乙二醇)、聚((羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚[(有机)磷腈]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、顺丁烯二酸酐-烷基乙烯醚共聚物、普朗尼克多元醇(pluronic polyol)、白蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖(glycaminoglycan)、硫酸化多糖、以上的掺和物和共聚物。在另一实施方案中，所述成分选自：白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇以及聚乙二醇。

在另一实施方案中，公开了治疗哺乳动物的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的本文所公开的组合物的步骤。

本公开还提供了药物组合物，其包含如本文所公开的结合蛋白、抗体构建体或抗体缀合物以及药学可接受的载体。在又一实施方案中，所述药物组合物包含用于治疗4-1BB活性有害的病症的至少一种另外的治疗剂。在另一实施方案中，另外的试剂选自：治疗剂、显像剂、细胞毒性剂、血管生成抑制剂(包括但不限于抗VEGF抗体或VEGF捕获剂(VEGF-trap))；激酶抑制剂(包括但不限于KDR和TIE-2抑制剂)；共刺激分子阻断剂(包括但不限于抗B7.1、抗B7.2、CTLA4-Ig、抗CD20)；粘附分子阻断剂(包括但不限于抗LFA-1Ab、抗E/L选择素Ab、小分子抑制剂)；抗细胞因子抗体或其功能片段(包括但不限于抗IL-18、抗TNF、抗IL-6/细胞因子受体抗体)；甲氨蝶呤；环孢菌素；雷帕霉素；FK506；可检测的标记物或报告子；TNF拮抗剂；抗风湿药；肌肉松弛剂、麻醉剂(narcotic)、非类固醇类抗炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂(anesthetic)、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗菌剂、抗银屑病药、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、红细胞生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁剂、安定药、兴奋剂、哮喘药物、β激动剂、吸入式类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子以及细胞因子拮抗剂。

在一个方面，本公开提供了激活人4-1BB的活性的方法，其包括使人4-1BB与本文所公开的结合蛋白接触，以激活人4-1BB。

在另一方面，本公开提供了治疗(例如治愈、阻抑、减轻、延迟或预防发作或者预防复发或再发)或预防对象中的4-1BB相关病症的方法。所述方法包括：向所述对象施用足以治疗或预防所述4-1BB相关病症的量的4-1BB结合剂，例如如本文所述的抗4-1BB抗体或其片段。可以向对象单独施用或者与如本文所述的其它治疗方式组合施用4-1BB结合蛋白，例如抗4-1BB抗体或其片段。

在一个实施方案中，对象是哺乳动物，例如罹患一种或多种4-1BB相关病症的人，所述病症包括例如如本文所述的呼吸系统病症(例如哮喘(例如过敏性哮喘和非过敏性哮喘)，慢性阻塞性肺病(COPD)和涉及气道炎症、嗜酸粒细胞增多、纤维化和过多粘液产生的其它病况；特应性病症(例如特应性皮炎和过敏性鼻炎)；皮肤的炎性病况和/或自身免疫病况、胃肠器官的炎性病况和/或自身免疫病况(例如炎症性肠病(IBD)，如溃疡性结肠炎和/或克罗恩氏病)和肝脏的炎性病况和/或自身免疫病况(例如肝硬化、纤维化)；硬皮病；肿瘤或癌症，例如霍奇金氏淋巴瘤。因此，本公开包括4-1BB结合剂(如本文所述的抗4-1BB抗体或其片段)在本文所述的治疗中的用途以及4-1BB复合剂(如本文所述的抗4-1BB抗体或其片段)在制备用于本文所述的治疗的药物中的用途。4-1BB相关病症的实例包括但不限于本文所述的癌症。

在另一方面，本申请提供了体外检测样品(例如生物样品，如血清、血浆、组织和活组织切片)中4-1BB的存在的方法。主题方法可以用于诊断病症。所述方法包括：(i)使样品或对照样品与如本文所述的抗4-1BB抗体或其片段接触；和(ii)检测抗4-1BB抗体或其片段与样品或对照样品的复合物的形成，其中相对于对照样品，所述样品中复合物形成的统计学显著的改变指示所述样品中存在4-1BB。

在另一方面，本申请提供了体内(例如，在对象中体内成像)检测4-1BB的存在的方法。主题方法可以用于诊断病症，例如4-1BB相关病症。所述方法包括：(i)在允许如本文所述的抗4-1BB抗体或其片段与4-1BB结合的条件下，向对象或对照对象施用所述抗体或片段；和(ii)检测抗所述抗体或片段与4-1BB的复合物的形成，其中相对于对照对象，所述对象中复合物形成的统计学显著的改变指示存在4-1BB。

在另一方面，本公开的结合蛋白可以用于治疗选自下述的病症：地中海贫血，β地中海贫血，贫血，缺铁性贫血，Plummer-Vinson综合征，恶性贫血，巨幼细胞贫血，蛋白质缺乏性贫血，坏血病，棘红细胞增多症，α-地中海贫血，再生障碍性贫血，先天性红细胞生成异常性贫血，溶血性贫血范可尼贫血，遗传性球形红细胞增多症，遗传性椭圆形红细胞增多症，遗传性热变性异形红细胞增多症(hereditary pyropoilikocytosis)，冷凝集素病，溶血性尿毒症综合征，充血(hyperanemia)，无效性红细胞生成(ineffectiveerythropesis)，cacrocytic anemia，骨髓病性贫血，神经棘红细胞增多症，舞蹈病，棘红细胞增多症，丙酮酸激酶缺乏症，镰状细胞病，磷酸丙糖异构酶缺乏症，关节炎，骨关节炎，幼年型慢性关节炎，脓毒性关节炎，莱姆关节炎，银屑病关节炎，反应性关节炎，脊椎关节病，全身性红斑狼疮，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，炎症性肠病，胰岛素依赖型糖尿病，甲状腺炎，哮喘，过敏性疾病，银屑病，皮炎硬皮病，移植物抗宿主病，器官移植排斥，与器官移植相关的急性或慢性免疫病，结节病，动脉粥样硬化，弥散性血管内凝血，川崎病，格雷夫斯病，肾病综合征，慢性疲劳综合征，韦格纳肉芽肿病，过敏性紫癜，肾脏显微镜下血管炎，慢性活动性肝炎，葡萄膜炎，感染性休克，中毒性休克综合征，脓毒病综合征，恶病质，感染性疾病，寄生虫病，获得性免疫缺陷综合征，急性横贯性脊髓炎，亨廷顿氏舞蹈症，帕金森氏病，阿尔兹海默病，中风，原发性胆汁性肝硬化，溶血性贫血，恶性肿瘤，心力衰竭，心肌梗塞，爱迪生氏病，散发性(sporadic)的多腺体缺陷I型和多腺体缺陷II型，施密特氏综合征，成人(急性)呼吸窘迫综合征，秃头症，斑秃(alopecia greata)，血清阴性关节病，关节病，赖特尔病，银屑病性关节病，溃疡性结肠炎性关节病，肠病性滑膜炎，衣原体、耶尔森菌属和沙门氏菌属相关的关节病，脊椎关节病，动脉粥样硬化性疾病/动脉硬化，特应性变态反应，自身免疫性大疱病，寻常天疱疮，落叶型天疱疮，类天疱疮，线性IgA疾病，自身免疫性溶血性贫血，Coombs阳性溶血性贫血，获得性恶性贫血，青少年恶性贫血，肌痛性脑脊髓炎/慢性疲劳综合征，慢性皮肤粘膜念珠菌病，巨细胞动脉炎，原发性硬化性肝炎，隐源性自身免疫性肝炎，获得性免疫缺陷综合征，获得性免疫缺陷相关疾病，乙型肝炎，丙型肝炎，常见的多种免疫缺陷(常见的多种血丙种球蛋白过少)，扩张型心肌病，女性不孕，卵巢功能衰竭，卵巢功能早衰，纤维化肺疾病，隐源性纤维化肺泡炎，炎症后间质性肺病，间质性肺炎，结缔组织病相关的间质性肺病，混合性结缔组织病相关的肺病，系统性硬化病相关的间质性肺病，风湿性关节炎相关的间质性肺病，系统性红斑狼疮相关的肺病，皮肌炎/多肌炎相关的肺病，斯耶格伦病相关的肺病，强直性脊柱炎相关的肺病，血管炎性弥漫性肺病，含铁血黄素沉着症相关的肺病，药物引起的间质性肺病，纤维化，辐射纤维化，闭塞性细支气管炎，慢性嗜酸性粒细胞性肺炎，淋巴细胞浸润性肺病，感染后间质性肺病，痛风性关节炎，自身免疫性肝炎，1型自身免疫性肝炎(经典的自身免疫性肝炎或狼疮状肝炎)，2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)，自身免疫介导的低血糖，伴有黑色棘皮症的B型胰岛素抵抗，甲状旁腺功能减退，与器官移植相关的急性免疫病，与器官移植相关的慢性免疫病，骨关节病，原发性硬化性胆管炎，1型银屑病，2型银屑病，特发性白血球减少症(idiopathic leucopaenia)，自身免疫性中性粒细胞减少症，肾脏疾病NOS，肾小球肾炎，肾脏的显微镜下血管炎，莱姆病，盘状红斑狼疮，特发性男性不育或NOS，精子自身免疫，多发性硬化(所有亚型)，交感性眼炎，结缔组织病继发的肺动脉高压，肺出血肾炎综合征，结节性多动脉炎的肺部表现，急性风湿热，类风湿性脊柱炎，斯提尔氏病，系统性硬化病，斯耶格伦综合征，高安氏病/动脉炎，自身免疫性血小板减少症(autoimmune thrombocytopaenia)，特发性血小板减少症，自身免疫性甲状腺疾病，甲状腺功能亢进，甲状腺肿自身免疫性甲状腺功能减退(桥本氏病)，萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退，原发性粘液水肿，晶状体源性葡萄膜炎(phacogenic uveitis)，原发性血管炎，白癜风急性肝病，慢性肝病，酒精性肝硬化，酒精引起的肝损伤，胆汁郁积(choleosatatis)，特应性肝病，药物引起的肝炎，非酒精性脂肪性肝炎，过敏和哮喘，B族链球菌(GBS)感染，精神障碍(例如抑郁症和精神分裂症)，Th2型介导的疾病和Th1型介导的疾病，急性疼痛和慢性疼痛(不同形式的疼痛)，以及癌症如肺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和直肠癌以及血液系统恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)，无β脂蛋白血症(Abetalipoprotemia)，手足发绀，急性和慢性寄生或感染过程，急性白血病，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，急性髓性白血病(AML)，急性或慢性细菌感染，急性胰腺炎，急性肾衰竭，腺癌，心房异位搏动(aerial ectopic beats)，AIDS痴呆综合征，酒精引起的肝炎，变应性结膜炎，变应性接触性皮炎，过敏性鼻炎，同种异体移植物排斥，α-1-抗胰蛋白酶缺乏症，肌萎缩性脊髓侧索硬化症，贫血，心绞痛，前角细胞退化，抗cd3疗法，抗磷脂综合征，抗受体过敏反应，主动脉和外周动脉瘤(aordic and peripheral aneuryisms)，主动脉夹层，动脉高血压，动脉硬化，动静脉瘘，共济失调，心房颤动(持久性的或突发性的)，心房扑动，房室传导阻滞，B细胞淋巴瘤，骨移植物排斥，骨髓移植物(BMT)排斥，束支传导阻滞，伯基特氏淋巴瘤，烧伤，心律不齐，心脏晕眩综合征(cardiac stun syndrome)，心脏肿瘤，心肌病，心肺转流炎性应答，软骨移植物排斥，小脑皮质退化，小脑病症，混乱性或多源性房性心动过速，化疗相关的病症，慢性粒细胞性白血病(CML)，慢性酒精中毒，慢性炎性疾病，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，慢性阻塞性肺病(COPD)，慢性水杨酸中毒，结肠直肠癌，充血性心力衰竭，结膜炎，接触性皮炎，肺心病，冠状动脉疾病，克雅二氏病，培养阴性脓毒症，囊肿性纤维化，细胞因子疗法相关的病症，拳击员痴呆，脱髓鞘疾病，登革出血热，皮炎，皮肤病况，糖尿病(diabetes)，糖尿病(diabetes mellitus)，糖尿病性动脉硬化病，弥漫性路易体病，扩张性充血性心肌病，基底神经节病症，中年唐氏综合征，药物引起的运动障碍(其由阻断CNS多巴胺受体的药物引起)，药物敏感性，湿疹，脑脊髓炎，心内膜炎，内分泌病，会厌炎，爱泼斯坦-巴尔病毒感染，红斑性肢痛症，锥体束外病症和小脑病症，家族性嗜血细胞性淋巴组织细胞增生症，胎儿胸腺移植物排斥，弗里德希氏共济失调，功能性外周动脉病，真菌脓毒症，气性坏疽，胃溃疡，肾小球肾炎，任何器官或组织的移植物排斥，革兰氏阴性脓毒症，革兰式阳性脓毒症，由细胞内的有机体导致的肉芽肿，毛细胞白血病，哈勒沃登-施帕茨病(Hallerrorden-Spatz disease)，桥本氏甲状腺炎，花粉热，心脏移植物排斥，血色素沉着，血液透析，溶血性尿毒综合征/溶血性血小板减少性紫癜，出血，肝炎(A)，希氏束心律不齐(His bundle arrhythmias)，HIV感染/HIV神经病，霍奇金氏病，运动机能亢进性运动障碍，过敏反应，过敏性肺炎，高血压，运动机能减退性运动障碍，下丘脑-垂体-肾上腺轴评估，特发性爱迪生氏病，特发性肺部纤维化，抗体介导的细胞毒性，衰弱，婴儿脊髓性肌萎缩，主动脉炎症，流感，电离辐射暴露，虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎，缺血再灌注损伤，缺血性发作，幼年型类风湿性关节炎，幼年型脊髓性肌萎缩，卡波西肉瘤，肾移植物排斥，军团菌属，利什曼病，麻疯病，皮质脊髓系统损伤，脂肪水肿，肝脏移植物排斥，淋巴水肿，疟疾，恶性淋巴瘤，恶性组织细胞增生症，恶性黑色素瘤，脑膜炎，脑膜炎球菌血症，代谢性/特发性病症，偏头痛，线粒体多系统紊乱，混合性结缔组织病，单克隆丙种球蛋白病，多发性骨髓瘤，多系统退化(Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager和Machado-Joseph)，重症肌无力，鸟胞内分枝杆菌，结核分枝杆菌，骨髓增生异常综合征，心肌梗塞，心肌缺血性病症，鼻咽癌，新生儿慢性肺病，肾炎，肾病，神经退行性疾病，神经源性I肌肉萎缩，中性白细胞减少性发热，非霍奇金氏淋巴瘤，腹主动脉及其分支阻塞，阻塞性动脉病症，okt3疗法，睾丸炎/附睾炎，睾丸炎/输精管复通程序，器官巨大症，骨质疏松症，胰腺移植物排斥，胰腺癌，副肿瘤综合征/恶性高血钙症，甲状旁腺移植物排斥，盆腔炎，常年性鼻炎，心包疾病，外周动脉硬化病，外周血管病，腹膜炎，恶性贫血，肺孢子虫病，肺炎，POEMS综合征(多神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤改变综合征)，灌注后综合征，泵后综合征，MI心切开术后综合征，子痫前期，进行性核上性麻痹，原发性肺动脉高压，放射疗法，雷诺现象和疾病，雷诺氏病，植烷酸贮积症，常规窄QRS心动过速，肾血管性高血压，再灌注损伤，限制性心肌病，肉瘤，硬皮病，老年性舞蹈病，路易体型老年痴呆，血清阴性关节病，休克，镰状细胞性贫血，皮肤同种异体移植物排斥，皮肤改变综合征，小肠移植物排斥，实体瘤，特异性心律失常，脊髓性共济失调，脊髓小脑变性，链球菌肌炎，小脑结构损伤，亚急性硬化性全脑炎，晕厥，心血管系统梅毒，全身性过敏反应，全身炎症反应综合征，全身发作性幼年型类风湿性关节炎，T细胞或FAB ALL，毛细管扩张，血栓闭塞性脉管炎，血小板减少症，毒性，移植物，创伤/出血，III型过敏反应，IV型过敏症，不稳定型心绞痛，尿毒症，尿脓毒病，荨麻疹，心瓣膜病，静脉曲张，血管炎，静脉疾病，静脉血栓形成，心室纤维性颤动，病毒和真菌感染，病毒性脑炎/无菌性脑膜炎，病毒相关的嗜血综合征，韦尼克-科尔萨科夫综合征，威尔逊氏病，任何器官或组织的异种移植物排斥，急性冠状动脉综合征，急性特发性多神经炎，急性炎性脱髓鞘多发性神经根神经病，急性缺血，成人斯提尔氏病，斑秃，过敏性反应，抗磷脂抗体综合征，再生障碍性贫血，动脉硬化，特应性湿疹，特应性皮炎，自身免疫性皮炎，与链球菌属感染相关的自身免疫病症，自身免疫性肠病，自身免疫性听力损失，自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)，自身免疫性心肌炎，自身免疫性卵巢功能早衰，眼睑炎，支气管扩张，大疱性类天疱疮，心血管病，灾难性抗磷脂综合征，乳糜泻，颈椎病，慢性缺血，瘢痕性类天疱疮，具有多发性硬化风险的临床孤立综合征(CIS)，结膜炎，童年期发作性精神障碍，慢性阻塞性肺病(COPD)，泪囊炎，皮肌炎，糖尿病视网膜病变，糖尿病，椎间盘突出，盘脱垂，药物引起的免疫性溶血性贫血，心内膜炎，子宫内膜异位，眼内炎，巩膜外层炎，多形性红斑，重症多形红斑，妊娠期类天疱疮，格林-巴利综合征(GBS)，花粉热，休斯综合征(HughesSyndrome)，特发性帕金森氏病，特发性间质性肺炎，IgE介导的过敏，免疫性溶血性贫血，包涵体肌炎，感染性眼部炎性疾病，炎性脱髓鞘病，炎性心脏病，炎性肾病，IPF/UIP，虹膜炎，角膜炎，干燥性角膜结膜炎(Keratojuntivitis sicca)，Kussmaul病或Kussmaul-Meier病，兰德里氏麻痹(Landry's Paralysis)，朗格汉斯细胞组织细胞增多症，网状青斑，黄斑变性，显微镜下多血管炎，白赫铁列夫症(Morbus Bechterev)，运动神经元病症，粘膜类天疱疮，多器官功能衰竭，重症肌无力，骨髓增生异常综合征，心肌炎，神经根病症，神经病，非A非B型肝炎，视神经炎，骨质溶解，少关节型JRA，外周动脉闭塞性疾病(PAOD)，外周血管病(PVD)，外周动脉病(PAD)，静脉炎，结节性多动脉炎(或结节性动脉周围炎)，多软骨炎，风湿性多肌痛，灰发症，多关节性JRA，多内分泌腺缺陷综合征，多肌炎，风湿性多肌痛(PMR)，泵后综合征，原发性帕金森病，前列腺炎，纯红细胞再生障碍，原发性肾上腺机能不全，复发性视神经脊髓炎，再狭窄，风湿性心脏病，SAPHO(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥大和骨炎)，硬皮病，继发性淀粉样变性，休克肺，巩膜炎，坐骨神经痛，继发性肾上腺机能不全，硅酮相关的结缔组织病，Sneddon-Wilkinson皮肤病，强直性脊柱炎，史蒂文斯-约翰逊综合征(SJS)，全身性炎性应答综合征，颞动脉炎，弓形体视网膜炎，中毒性表皮坏死松解症，横贯性脊髓炎，TRAPS(肿瘤坏死因子受体、I型过敏反应，II型糖尿病，荨麻疹，普通型间质性肺炎(UIP)，血管炎，春季结膜炎，病毒性视网膜炎，伏格特-小柳-原田三氏综合征(VKH综合征)，湿型黄斑变性以及伤口愈合。

在另一方面，本公开的结合蛋白可以用于治疗选自下述的病症：急性成淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、脑干胶质瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚瘤、视通路和下丘脑胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、类癌瘤、类癌瘤、未知原发性胃肠癌、中枢神经系统淋巴瘤、原发性小脑星形细胞瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病慢性骨髓增殖性疾病、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因家族肿瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼内黑色素瘤视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃(Gastric)(Stomach)癌、胃肠类癌瘤、胃肠间质瘤(GIST)、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞瘤、胶质瘤、脑干胶质瘤、脑星形细胞瘤胶质瘤、儿童期视通路和下丘脑胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞(肝脏)癌、霍奇金氏淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾(肾细胞)癌、喉癌、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、毛细胞白血病、唇和口腔癌、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、AIDS相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、眼内(眼)黑色素瘤、梅克尔细胞癌、恶性间皮瘤、隐匿原发性转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌腺肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/脊髓增生性疾病、髓性白血病、慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生性病症、鼻腔癌和鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口癌、口腔癌、唇和口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度恶性潜在肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原发性神经外胚瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞(肾脏)癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、成视网膜细胞瘤、涎腺癌、肉瘤、尤因家族肿瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、塞扎里综合征、皮肤癌(非黑色素瘤)、皮肤癌(黑色素瘤)、梅克尔细胞皮肤癌、小肠癌、鳞状细胞癌、隐匿原发性转移性鳞状颈癌、胃(Stomach)(Gastric)癌、幕上原发性神经外胚瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、妊娠滋养细胞肿瘤、输尿管和肾盂移行细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫内膜子宫肉瘤、阴道癌、视通路和小丘脑胶质瘤、外阴癌、华氏巨球蛋白血症以及威尔姆氏肿瘤。

在另一方面，本公开提供了治疗罹患涉及人4-1BB活性的病症的患者的方法，其包括在施用如本文所论述的第二试剂之前、同时或之后施用任一结合蛋白这一步骤。在实施方案中，可以与一种或多种4-1BB结合蛋白共同施用和/或共同配制的另外的治疗剂包括但不限于下述中的一种或多种：吸入式类固醇；口服类固醇；β激动剂，例如短效或长效β激动剂；白三烯或白三烯受体的拮抗剂；复方药物，如ADVAIR；IgE抑制剂，例如抗IgE抗体(例如XOLAIR)；磷酸二酯酶抑制剂(例如PDE4抑制剂)；黄嘌呤；抗胆碱药物；肥大细胞稳定剂，如色甘酸；IL-4抑制剂；IL-5抑制剂；嗜酸细胞活化趋化因子/CCR3抑制剂；组胺或其受体(包括H1、H2、H3和H4)的拮抗剂以及前列腺素D或其受体(DP1和CRTH2)的拮抗剂。此类组合可以用于治疗哮喘和其它呼吸系统病症。可以与一种或多种抗4-1BB抗体或其片段共同施用和/或共同配制的治疗剂的另外的实例包括下述中的一种或多种：TNF拮抗剂(例如TNF受体(例如p55或p75人TNF受体)的可溶性片段或其衍生物，例如75kD TNFR-IgG(75kD TNF受体IgG融合蛋白，ENBREL))；TNF酶拮抗剂，例如TNF转化酶(TACE)抑制剂；毒蕈碱性受体拮抗剂；TGFβ拮抗剂；干扰素γ；吡非尼酮；化疗剂，例如甲氨蝶呤、来氟米特或西罗莫司(雷帕霉素)或以上的类似物，例如CCI-779；COX2和cPLA2抑制剂；NSAID；免疫调节剂；p38抑制剂、TPL-2抑制剂、MK-2抑制剂和NFkB抑制剂等。另外的第二试剂选自：布地奈德，表皮生长因子，皮质类固醇，环孢菌素，柳氮磺胺吡啶，氨基水杨酸盐，6-巯嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝唑，脂氧合酶抑制剂，美沙拉嗪，奥沙拉秦，巴柳氮，抗氧化剂，血栓素抑制剂；IL-1受体拮抗剂，抗IL-1β单克隆抗体，抗IL-6单克隆抗体，生长因子，弹性蛋白酶抑制剂，吡啶基-咪唑化合物，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF的抗体或激动剂，CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配体的抗体，甲氨蝶呤，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸酯，来氟米特，NSAID，布洛芬，皮质类固醇，泼尼松龙，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗血栓剂，补体抑制剂，肾上腺素能剂，IRAK、NIK、IKK、p38、MAP激酶抑制剂，IL-1β，转化酶抑制剂，TNF转化酶抑制剂，T细胞信号传导抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺胺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯嘌呤，血管紧张素转化酶抑制剂，可溶性细胞因子受体，可溶性p55TNF受体，可溶性p75TNF受体，sIL-1RI，sIL-1RII，sIL-6R，抗炎性细胞因子，IL-4，IL-10，IL-11以及TGF-β。

在另一实施方案中，通过选自下述的至少一种方式向对象施用本文公开的药物组合物：肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内(intraosteal)、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、颊部、舌下、鼻内以及经皮。

在另一实施方案中，本公开提供了本文公开的至少一种结合蛋白的至少一种4-1BB抗独特型抗体。抗4-1BB独特型抗体包括含有这样的分子的任何蛋白或肽，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少一部分，例如但不限于：重链或轻链或其配体结合部分的至少一种互补决定区(CDR)，重链或轻链可变区，重链或轻链恒定区，框架区，或者；可以并入本公开的结合蛋白的以上的任何部分。

附图简述

图1显示ZW103(其它克隆显示类似的作用(数据未显示))能够连同一种或多种共刺激分子扩增CD4+T细胞或CD8+T细胞。

图2显示ZW103和ZW104(其它克隆显示类似的作用(数据未显示))能够结合人4-1BB和猴4-1BB。

图3显示ZW103和ZW104(其它克隆显示类似的作用(数据未显示))能够刺激T细胞增殖。

图4显示ZW103和ZW104(其它克隆显示类似的作用(数据未显示))能够激活人CD8+和CD4+T细胞并刺激人T细胞产生IFN-γ。

图5A显示了移植物抗宿主(GVH)疾病模型的程序。

图5B显示在异种-GVHD小鼠模型中，4-1BB mAb治疗促进T细胞增殖。

图6A显示公开的人源化的4-1BB Ab促进移植有人PBMC的NSG小鼠的GVHD(图6A)。

图6B显示在异种-GVHD模型中，公开的人源化的4-1BB Ab增加血清IFN-γ。

图6C显示在异种-GVHD模型中，公开的人源化的4-1BB Ab增加脾脏大小。

图6D显示公开的人源化的4-1BB Ab增加外周血中的人T细胞，并且该作用是剂量依赖性的。

图6E显示公开的人源化的4-1BB Ab增加肝脏中人T细胞的浸润。

图7A显示了4-1BB mAb的体内抗肿瘤作用。

图7B显示了不同剂量的完全人源化的4-1BB mAb的体内作用。

详细描述

本公开涉及4-1BB结合蛋白，并且更具体地涉及结合4-1BB的抗4-1BB抗体或其抗原结合部分。本公开各方面涉及抗体和抗体片段及其药物组合物以及制备此类抗体和片段的核酸、重组表达载体和宿主细胞。还公开了利用本公开的抗体检测人4-1BB，以在体外或体内调节人4-1BB活性和/或水平的方法。

除非本文另外限定，否则与本公开相关使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。术语的含义和范围是清楚的，但是如果有任何潜在的歧义，本文提供的定义优先于任何字典或外在定义。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语应当包含复数，并且复数术语应当包含单数。在本公开中，除非另外指明，否则“或”的使用意为“和/或”。此外，术语“包含(including)”以及其它形式如“包含(includes)”和“包含(included)”的使用不是限制性的。此外，诸如“元素”或“组分”的术语涵盖包含一个/一种单元的元素和组分以及包含多个/多种亚单元的元素和组分这两种，除非另外明确指明。

一般而言，本文所述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学以及杂交相关使用的术语以及细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学以及杂交的技术是本领域众所周知且常用的那些。通常根据本领域众所周知的常规方法以及如贯穿本公开所引用和论述的各种一般和更具体的参考文献所述，实施本公开的方法和技术，除非另外指明。根据制造商的说明书、如本领域通常完成的或者如本文所述，实施酶促反应和纯化技术。本文所述的与分析化学、合成有机化学和医药化学相关使用的术语以及分析化学、合成有机化学和医药化学的实验室程序和技术是本领域众所周知且常用的那些。将标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。

为了更容易地理解本公开，以下定义了所选术语。

本文使用的术语“多肽”指氨基酸的任何多聚链。术语“肽”和“蛋白”以及术语多肽可互换使用，并且也指氨基酸的多聚链。术语“多肽”涵盖蛋白序列的天然或人工蛋白、蛋白片段和多肽类似物。多肽可以是单体或多聚体。

术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”是这样的蛋白或多肽：其凭借其来源或推断的来源没有结合在其天然状态下与其相伴的天然结合组分；基本不含来自相同物种的其它蛋白；由来自不同物种的细胞表达；或者自然界中不存在。因此，化学合成或在不同于多肽天然来源的细胞的细胞系统中合成的多肽将是与其天然结合组分“分离”的。利用本领域众所周知的蛋白纯化技术，通过分离，蛋白还可以变得基本不含天然结合组分。

本文使用的蛋白的“生物活性”或“活性”指蛋白的所有固有生物学特性。

关于抗体、蛋白或肽与第二化学物质的相互作用，本文使用的术语“特异性结合(specific binding)”或“特异性结合(specifically binding)”意为相互作用依赖化学物质上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特定蛋白结构而非广泛的蛋白。如果抗体对于表位“A”是特异的，则在包含标记的“A”和抗体的反应中，包含表位A(或者游离的、未标记的A)的分子的存在将降低与抗体结合的标记的A的量。

本文使用的术语“抗体”广泛指由四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)组成的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或者保留Ig分子的必要表位结合特征的其任何功能片段、突变体、变体或衍生物。此类突变体、变体或衍生抗体形式在本领域是已知的。以下论述了其非限制性实施方案。

在全长抗体中，各重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。各轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的高变区、被称为框架区(FR)的散布的更加保守的区域。各VH和VL由三个CDR和四个FR组成，其从氨基端至羧基端以下述顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG 3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。

本文使用的术语抗体的“抗原结合部分”(或者简称为“抗体部分”)指保留特异性结合抗原(例如4-1BB)的能力的抗体的一种或多种片段。已经显示，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。此类抗体的实施方案也可以是双特异性、双重特异性或多特异性形式；其特异性结合两种或更多种不同的抗原。多特异性、双重特异性和双特异性抗体构建体在本领域众所周知，并且描述并表征于Kontermann(ed.),BispecificAntibodies,Springer,NY(2011)和Spiess等人，Mol.Immunol.67(2):96-106(2015)中。

术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')₂片段，其是包含通过铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341:544-546,Winter等人，PCT公开WO 90/05144A1，在此将其通过引用并入)，其包含单可变结构域；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是可以利用重组方法，通过合成的接头将它们进行连接，所述接头使得它们被制备成单蛋白链，其中VL区和VH区配对以形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见，例如Bird等人(1988)Science 242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体还意图涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”内。还涵盖单链抗体的其它形式，如双链抗体。双链抗体是二价、双特异性抗体，其中VH结构域和VL结构域在单多肽链上表达，但是利用太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点(参见，例如Holliger,P.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak,R.J.等人(1994)Structure 2:1121-1123)。此类抗体结合部分在本领域是已知的(Kontermann和Dubel eds.,AntibodyEngineering(2001)Springer-Verlag.New York.790pp.(ISBN 3-540-41354-5)。

本文使用的术语“抗体构建体”指包含与接头多肽或免疫球蛋白恒定结构域连接的本公开的一个或多个抗原结合部分的多肽。接头多肽包含通过肽键连接的两个或更多个氨基酸残基，并且用于连接一个或多个抗原结合部分。此类接头多肽在本领域众所周知(参见，例如Holliger,P.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak,R.J.等人(1994)Structure 2:1121-1123)。免疫球蛋白恒定结构域指重链或轻链恒定结构域。人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列及其功能变体在本领域是已知的。

此外，抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体部分与一种或多种其它蛋白或肽的共价或非共价结合形成的较大的免疫粘附分子的一部分。此类免疫粘附分子的实例包括利用链霉亲和素核心区制备四聚体scFv分子(Kipriyanov,S.M.等人(1995)HumanAntibodies and Hybridomas 6:93-101)以及利用半胱氨酸残基、标志物肽和C-端多组氨酸标签制备二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov,S.M.等人(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)。可以利用常规技术，如分别利用全抗体的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化，由全抗体制备抗体部分，如Fab和F(ab')₂片段。此外，如本文所述，可以利用标准重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。

本文使用的“分离的抗体”意图指基本不含具有不同的抗原特异性的其它抗体的抗体(例如特异性结合人4-1BB的分离的抗体基本不含特异性结合除h4-1BB之外的抗原的抗体)。但是，特异性结合h4-1BB的分离的抗体可以具有与其它抗原(如来自其它物种的4-1BB分子)的交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本不含其它细胞物质和/或化学物质。

本文使用的术语“人抗体”意图包括含有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本公开的人抗体可以包含并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR以及特别是CDR3中。但是，本文使用的术语“人抗体”不意图包括这样的抗体：其中来源于另一哺乳动物物种种系(如小鼠)的CDR序列被移植到人框架序列上。

本文使用的术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如利用转染进宿主细胞的重组表达载体表达的抗体(本公开更加详细地进行了描述)，分离自重组组合人抗体文库的抗体(Hoogenboom H.R.,(1997)TIB Tech.15:62-70；Azzazy H.和Highsmith W.E.,(2002)Clin.Biochem.35:425-445；Gavilondo J.V.和Larrick J.W.(2002)BioTechniques 29:128-145；Hoogenboom H.和Chames P.(2000)Immunology Today 21:371-378)，分离自针对人免疫球蛋白基因而转基因的动物(例如小鼠)的抗体(参见，例如Taylor,L.D.等人(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295；Kellermann S-A.和Green L.L.(2002)Current Opinion in Biotechnology 13:593-597；Little M.等人(2000)Immunology Today 21:364-370)或者通过包括人免疫球蛋白基因序列至其它DNA序列的剪接的任何其它手段制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。但是，在某些实施方案中，将此类重组人抗体进行体外诱变(或者当利用针对人Ig序列而转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，从而使重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列：其尽管来源于人种系VH和VL序列，并与人种系VH和VL序列相关，但是可能并不天然存在于体内人抗体种系库内。本公开的一个实施方案提供了能够结合人4-1BB的完全人抗体，其可以利用本领域众所周知的技术产生，例如但不限于，利用诸如Jermutus等人，PCT公开号WO 2005/007699A2中所公开的那些的人Ig噬菌体文库。

术语“嵌合抗体”指包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列和来自另一物种的恒定区序列的抗体，如具有连接至人恒定区的鼠重链和轻链可变区的抗体。

术语“CDR-移植抗体”指这样的抗体，其包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列，但是其中VH和/或VL的一个或多个CDR区的序列被另一物种的CDR序列替代，如具有鼠重链和轻链可变区，其中鼠CDR(例如CDR3)中的一个或多个已被人CDR序列替代的抗体。

术语“人源化抗体”指这样的抗体，其包含来自非人物种(例如小鼠)的重链和轻链可变区序列，但是其中至少一部分VH和/或VL序列被改变以更加“类似于人的”，即与人种系可变序列更加相似。一种类型的人源化抗体是CDR-移植抗体，其中将人CDR序列引入非人VH和VL序列，以替代相应的非人CDR序列。在一个实施方案中，提供了人源化的抗人4-1BB抗体和抗原结合部分。通过利用传统的杂交瘤技术获得鼠抗h4-1BB单克隆抗体，随后利用体外基因工程(如Kasaian等人PCT公开号WO 2005/123126A2中所公开的那些)进行人源化，从而产生此类抗体。

术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文可互换使用。这些术语在本领域公认指比抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中的其它氨基酸残基更可变(即高变)的氨基酸残基的编号系统(Kabat等人(1971)Ann.NY Acad,Sci.190:382-391，和Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国卫生及公共服务部，NIH公开号91-3242)。

本文使用的术语“受体”和“受体抗体(acceptor antibody)”指提供或编码一个或多个框架区的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列的抗体或核酸序列。在一些实施方案中，术语“受体”指提供或编码恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在另一实施方案中，术语“受体”指提供或编码一个或多个框架区和恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在具体实施方案中，术语“受体”指提供或编码一个或多个框架区的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列的人抗体氨基酸或核酸序列。根据该实施方案，受体可以包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或者至少10个在人抗体的一个或多个特定位点不存在的氨基酸残基。受体框架区和/或受体恒定区可以，例如来源于或者获自种系抗体基因、成熟的抗体基因、功能性抗体(例如，本领域众所周知的抗体、正在开发的抗体或者市售的抗体)。

本文使用的术语“CDR”指抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链各可变区中存在三个CDR，对于各可变区，其被指定为CDR1、CDR2和CDR3。本文使用的术语“CDR集”指存在于能够结合抗原的单可变区中的一组三个CDR。已经根据不同的系统区别定义了这些CDR的准确界限。Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(国立卫生研究院,Bethesda,Md.(1987)和(1991))所述的系统不仅提供了可应用于抗体的任何可变区的明确的残基编号系统，还提供了限定这三个CDR的精确的残基界限。这些CDR可被称为Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)以及Chothia等人，Nature 342:877-883(1989))发现，Kabat CDR内的某些子部分采取几乎相同的肽骨架构象，尽管它们的氨基酸序列水平具有很大的多样性。这些子部分被指定为L1、L2和L3或者H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指定轻链和重链区域。这些区域可被称为ChothiaCDR，其具有与Kabat CDR重叠的界限。Padlan(FASEB J.9:133-139(1995))和MacCallum(JMol Biol 262(5):732-45(1996))描述了与Kabat CDR重叠的限定CDR的其它界限。其它CDR界限限定可能不严格遵循以上系统中的一种，但是其仍将与Kabat CDR重叠，尽管根据特定残基或残基组或者甚至是整个CDR不显著影响抗原结合这一预测或实验发现，它们可能被缩短或延长。本文使用的方法可以利用根据这些系统中的任何系统所限定的CDR，尽管优选的实施方案使用Kabat或Chothia限定的CDR。

本文使用的术语“典型”残基指如Chothia等人(J.Mol.Biol.196:901-907(1987)；Chothia等人，J.Mol.Biol.227:799(1992)，将这两者通过引用并入本文)所限定的，限定特定典型CDR结构的CDR或框架中的残基。根据Chothia等人，许多抗体的CDR的关键部分具有几乎相同的肽骨架构象，尽管它们的氨基酸序列水平具有很大的多样性。各典型结构主要针对形成环的氨基酸残基连续区段指定了一组肽骨架扭转角。

本文使用的术语“供体”和“供体抗体”指提供一种或多种CDR的抗体。在实施方案中，供体抗体是来自与获得或得到框架区的抗体不同的物种的抗体。在人源化抗体的背景下，术语“供体抗体”指提供一种或多种CDR的非人抗体。

本文使用的术语“框架”或“框架序列”指可变区中除CDR之外剩余的序列。因为可以通过不同的系统确定CDR序列的精确定义，所以对框架序列的含义进行相应不同的解释。六个CDR(轻链的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，以及重链的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)也将轻链和重链上的框架区分为各链上的四个子区域(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1与FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，以及CDR3位于FR3和FR4之间。在不指定特定子区域是FR1、FR2、FR3或FR4的情况下，其它提及的框架区，表示单个天然存在的免疫球蛋白链的可变区内合并的FR。如本文所使用的，一个FR表示四个子区域中的一个，以及两个或更多个FR表示构成框架区的四个子区域中的两个或更多个。

人重链和轻链受体序列在本领域是已知的。在一个实施方案中，在本领域已知的受体序列可以用于本文公开的抗体中。

本文使用的术语“种系抗体基因”或“基因片段”指由未经历导致表达特定免疫球蛋白的基因重排和突变的成熟过程的非淋巴样细胞编码的免疫球蛋白序列。(参见，例如Shapiro等人，Crit.Rev.Immunol.22(3):183-200(2002)；Marchalonis等人，Adv ExpMed.Biol.484:13-30(2001))。本公开各实施方案提供的优势之一源于下述认知：种系抗体基因比成熟的抗体基因更有可能保留物种个体的必需氨基酸序列结构特征，因此当在在该物种中用于治疗使用时，不太可能被认为是来自外源。

本文使用的术语“关键”残基指对抗体，特别是人源化抗体的结合特异性和/或亲和力具有更多影响的可变区内的某些残基。关键残基包括但不限于下述中的一种或多种：与CDR相邻的残基、潜在的糖基化位点(可以是N-或O-糖基化位点)、稀有残基、能够与抗原相互作用的残基、能够与CDR相互作用的残基、典型残基、重链可变区与轻链可变区之间的接触残基、Vernier区中的残基以及Chothia定义的可变重链CDR1与Kabat定义的第一重链框架之间的重叠区域内的残基。

本文使用的术语“人源化抗体”是以下抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，其免疫特异性结合目标抗原，并且包含基本含有人抗体的氨基酸序列的框架(FR)区和基本含有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。在CDR的背景下，本文使用的术语“基本上”指与非人抗体CDR的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列的CDR。人源化抗体基本包含至少一种并且通常两种可变结构域(Fab、Fab'、F(ab')₂、FabC、Fv)的全部，其中全部或基本全部CDR区对应于非人免疫球蛋白(即供体抗体)的CDR区，以及全部或基本全部框架区是人免疫球蛋白共有序列的框架区。在一个实施方案中，人源化抗体还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体既包含轻链又至少包含重链的可变结构域。抗体还可以包含重链的CH1区、铰链区、CH2区、CH3区和CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体仅包含人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体仅包含人源化重链。在另一实施方案中，人源化抗体仅包含轻链的人源化可变结构域和/或人源化重链。

人源化抗体可以选自任何类别的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE以及任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可以包含来自多种类别或同种型的序列，并且可以利用本领域众所周知的技术选择特定的恒定结构域以优化期望的效应子功能。

在一个实施方案中，人源化抗体的框架区和CDR区不需要与亲本序列严格对应，例如可以通过至少一个氨基酸残基的取代、插入和/或缺失对供体抗体的CDR或共有框架进行诱变，以使该位点处的CDR或框架残基不与供体抗体或共有框架相对应。但是，在另一实施方案中，此类突变不广泛。通常，至少80％、85％、90％和或95％的人源化抗体残基将与亲本FR和CDR序列的那些残基相对应。本文使用的术语“共有框架”指共有免疫球蛋白序列内的框架区。本文使用的术语“共有免疫球蛋白序列”指由相关免疫球蛋白序列家族中最频繁存在的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见，例如Winnaker,From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany 1987)。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的各位点由所述家族中该位点处最频繁存在的氨基酸占据。在另一实施方案中，如果两种氨基酸同样频繁地出现，则可将两者之中的任一种包括在共有序列中。

本文使用的“Vernier”区指如Foote和Winter(1992,J.Mol.Biol.224:487-499，将其通过引用并入本文)所述，可以调节CDR结构并微调与抗原的配合的框架残基的子集。Vernier区残基在CDR之下形成层，并且可能影响CDR的结构和抗体的亲和力。

在本说明书中使用术语“多价结合蛋白”来表示包含两个或更多个抗原结合位点的结合蛋白。在另一实施方案中，可将多价结合蛋白工程化以包含三个或更多个抗原结合位点，并且其通常不是天然存在的抗体。

术语“多特异性结合蛋白”指能够结合两种或更多种相关或非相关靶标的结合蛋白。如早前引用的，此类抗体构建体在本领域众所周知，并且如Kontermann(ed.),Bispecific Antibodies,Springer,NY(2011)和Spiess等人，Mol.Immunol.67(2):96-106(2015)中所述以及表征的。此类双特异性抗体构建体包括但不限于通常被称为微型抗体(Minibody)、纳米抗体、双链抗体(Diabody)、Bite、Duobody、Tandemab、Knobs-into-holesIg、DAF、CT-Ig、DutamAb、DVD-Ig、CoDVD-Ig、CoDV-Ig、FIT-Ig、CrossmAb、CrossfAb、SEEDbody、TriomAb、LUZ-Ys、Zybody的那些。本文使用的多特异性结合蛋白是这样的结合蛋白：其包含两种或更多种抗原结合位点，并且是四价或多价结合蛋白。此类DVD可以是单特异性的，即能够结合一种抗原，或者是多特异性的，即能够结合两种或更多种抗原。

本文使用的术语“中和”指当结合蛋白特异性结合靶蛋白时，中和靶蛋白的生物学活性。例如，中和4-1BB结合蛋白可以是与4-1BB的结合导致抑制4-1BB的生物学活性的中和抗体。在一个实施方案中，中和结合蛋白结合4-1BB，并使4-1BB的生物学活性降低至少约20％、40％、60％、80％、85％或者更多。可以通过测量本领域众所周知的4-1BB的生物学活性的一个或多个指标来评估中和结合蛋白对4-1BB生物学活性的抑制。在另一实施方案中，本公开的4-1BB结合蛋白不是中和抗体。

术语“活性”包括诸如抗体对抗原的结合特异性/亲和力的活性。

术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的化学活性表面分子群，并且在某些实施方案中，其可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位是抗原的被抗体结合的区域。在某些实施方案中，当抗体优先识别其在蛋白和/或大分子的复合混合物中的靶标抗原时，所述抗体被认为特异性结合抗原。

本文使用的术语“表面等离子体共振”指允许通过检测生物传感器基质内蛋白浓度的改变，例如利用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden andPiscataway,N.J.)分析实时生物特异性相互作用的光学现象。对于进一步的描述，参见Jonsson,U.等人(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；Jonsson,U.等人(1991)Biotechniques11:620-627；Johnsson,B.等人(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131；以及Johnnson,B.等人(1991)Anal.Biochem.198:268-277。

如本领域已知的，本文使用的术语“k_on”意图指抗体与抗原结合以形成抗体/抗原复合物的结合速率常数。

如本领域已知的，本文使用的术语“k_off”意图指抗体从抗体/抗原复合物中解离的解离速率常数。

如本领域已知的，本文使用的术语“K_D”意图指具体抗体-抗原相互作用的解离常数。

本文使用的术语“标记的结合蛋白”指具有提供结合蛋白的鉴定的掺入的标记的蛋白。在一个实施方案中，标记是可检测的标志物，例如掺入放射性标记的氨基酸或者连接至可以通过标记的亲和素(例如，包含荧光标志物或者可以通过光学方法或比色法进行检测的酶活性的链霉亲和素)进行检测的生物素基部分的多肽。用于多肽的标记物的实例包括但不限于下述：放射性同位素或放射性核素(例如³H、¹⁴C、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁷⁷Lu、¹⁶⁶Ho和¹⁵³Sm)；荧光标记物(例如FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶标记物(例如辣根过氧化物酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光标志物；生物素基团；由第二报告子识别的预定的多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)；以及磁性物质，如钆螯合物。

术语“抗体缀合物”指化学连接至第二化学部分(如治疗剂或细胞毒性剂)的结合蛋白，如抗体。术语“试剂”在本文用于表示化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或者由生物材料制备的提取物。在另一实施方案中，治疗剂或细胞毒性剂包括但不限于：百日咳毒素、紫杉酚、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、道诺霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素以及以上的类似物或同系物。

本文使用的术语“晶体”或“结晶”指以晶体形式存在的抗体或其抗原结合部分。晶体是固态物质的一种形式，其不同于诸如无定形固态或液晶态的其它形式。晶体由原子、离子、分子(例如诸如抗体的蛋白)或分子组装物(例如抗原/抗体复合物)的有规则的重复三维阵列组成。这些三维阵列根据本领域众所周知的特定数学关系排列。晶体中重复的基本单位或构块被称为不对称单位。以符合给定的定义明确的晶体学对称性排列的不对称单位的重复提供了晶体的“晶胞”。晶胞通过所有三个维度中规则翻译的重复提供了晶体。参见Giege,R.和Ducruix,A.Barrett,Crystallization of Nucleic Acids and Proteins,aPractical Approach,2nd ea.,pp.20 1-16,Oxford University Press,New York,N.Y.,(1999)。

本文提及的术语“多核苷酸”意为两个或更多个核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或者两种类型的核苷酸之一的修饰形式)的聚合形式。该术语包括单链和双链形式的DNA。

本文使用的术语“分离的多核苷酸”应当意为这样的多核苷酸(例如基因组、cDNA或合成来源或者以上的一些组合的多核苷酸)：由于其来源，其不与天然存在的“分离的多核苷酸”所结合的多核苷酸的全部或一部分结合；其可操作地连接至自然界中不与之连接的多核苷酸；或者其在自然界中不作为较大序列的一部分存在。

本文使用的术语“载体”意图指能够转运核酸分子所连接的另一核酸的所述核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指另外的DNA区段可以连接至其内的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接至所述病毒的基因组中。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞内自主复制(例如含有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。可在引入宿主细胞时，将其它载体(例如非游离型哺乳动物载体)整合至宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文被称为“重组表达载体”(或者简称为“表达载体”)。一般而言，重组DNA技术中利用的表达载体通常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。但是，本公开意图包括发挥等同功能的其它形式的表达载体，如病毒载体(例如复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

术语“可操作地连接的”指这样的并置，其中所述组件处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系。“可操作地连接”至编码序列的控制序列以这样的方式连接，以在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。“可操作地连接的”序列既包括与目标基因相邻的表达控制序列，又包括反式或者在一定距离处发挥作用以控制目标基因的表达控制序列。本文使用的术语“表达控制序列”指对于实现与其连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始序列、终止序列、启动子序列和增强子序列；有效的RNA加工信号，如剪接信号和聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及需要时，增强蛋白分泌的序列。此类控制序列的性质根据宿主有机体而不同；在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，此类控制序列通常包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”意图包括其存在对于表达和加工而言是必要的的组件，并且还可以包括其存在是有利的的另外的组件，如前导序列和融合伴侣序列。可以利用本领域已知的表达载体和宿主细胞(包括表达盒、载体、重组宿主细胞)以及用于重组表达和蛋白水解加工来自单一开放阅读框的重组多聚蛋白和前体蛋白的方法来表达和纯化本公开的蛋白构建体(例如通过引用并入本文的WO 2007/014162)。

本文定义的“转化”指外源DNA进入宿主细胞的任何过程。可以利用本领域众所周知的多种方法，在天然条件下或人工条件下发生转化。转化可以依赖用于将外源核酸序列插入原核或真核宿主细胞的任何已知的方法。基于转化的宿主细胞选择方法，并且所述方法可以包括但不限于病毒感染、电穿孔、脂质转染和粒子轰击。此类“转化的”细胞包括其内插入的DNA能够作为自主复制质粒或者作为宿主染色体的一部分进行复制的稳定转化的细胞。它们还包括在有限时间内瞬时表达插入的DNA或RNA的细胞。

本文使用的术语“重组宿主细胞”(或者简称“宿主细胞”)意图指其内已引入外源DNA的细胞。应当理解，此类术语不仅意图指具体的主体细胞，还指此类细胞的后代。因为由于突变或环境影响，在后代中可以存在某些修饰，所以事实上此类后代可能与亲本细胞不同，但是其仍然包含在本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。在另一实施方案中，宿主细胞包括选自任何生物界的原核细胞和真核细胞。在另一实施方案中，真核细胞包括原生生物细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞。在另一实施方案中，宿主细胞包括但不限于原核细胞系大肠杆菌；哺乳动物细胞系CHO、HEK 293和COS；昆虫细胞系Sf9；和真菌细胞酿酒酵母。

可将标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养以及转化(例如电穿孔、脂质转染)。可以根据制造商的说明书或者如本领域通常完成的或者如本文所述，实施酶促反应和纯化技术。通常可以根据本领域众所周知的常规方法以及如贯穿本说明书所引用和论述的各种一般和更具体的参考文献中所述，实施前述技术和程序。参见，例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))，出于任何目的，将其通过引用并入本文。

如本领域所已知的和如本文所使用的，“转基因有机体”指含有包含转基因的细胞的有机体，其中引入所述有机体(或有机体的祖先)的转基因表达所述有机体内天然状态下不表达的多肽。“转基因”是DNA构建体，其稳定且可操作地整合至发育成转基因有机体的细胞的基因组中，指导转基因有机体的一种或多种细胞类型或组织内编码的基因产物的表达。

术语“调控”和“调节”可互换使用，并且如本文所使用的，其指目标分子活性(例如4-1BB的生物学活性)的改变或更改。调节可以是目标分子的某些活性或功能量级的增加或降低。分子的示例性活性和功能包括但不限于：结合特征、酶活性、细胞受体激活和信号转导。

相应地，本文使用的术语“调节剂”是能够改变或更改目标分子的活性或功能(例如4-1BB的生物学活性)的化合物。例如，与在调节剂不存在的情况下观察到的分子的某些活性或功能的量级相比，调节剂可以引起所述活性或功能的量级的增加或降低。在某些实施方案中，调节剂是抑制剂，其降低分子的至少一种活性或功能的量级。示例性的抑制剂包括但不限于蛋白、肽、抗体、肽体(peptibody)、碳水化合物或小的有机分子。肽体描述于例如WO0183525中。

本文使用的术语“激动剂”指这样的调节剂，当其与目标分子接触时，与在所述激动剂不存在的情况下观察到的分子的某些活性或功能的量级相比，其引起所述活性或功能的量级的增加。4-1BB的激动剂可以包括但不限于结合4-1BB的蛋白(例如Ab)、核酸、碳水化合物或者任何其它分子。在一个实施方案中，本公开的4-1BB结合蛋白是4-1BB激动剂。

本文使用的术语“拮抗剂”或“抑制剂”指这样的调节剂，当其与目标分子接触时，与在所述拮抗剂不存在的情况下观察到的分子的某些活性或功能的量级相比，其引起所述活性或功能的量级的降低。具体的目标拮抗剂包括阻断或调节4-1BB的生物学活性或免疫性活性的那些拮抗剂。4-1BB的拮抗剂和抑制剂可以包括但不限于与4-1BB结合的蛋白(例如Ab)、核酸、碳水化合物或者任何其它分子。在另一实施方案中，本公开的4-1BB结合蛋白不是4-1BB拮抗剂。

本文使用的术语“有效量”指足以降低或减轻病症或其一种或多种症状的严重性和/或持续时间，阻止病症的进展，引起病症的消退，阻止与病症相关的一种或多种症状的复发、发展、发作或进程，检测病症，或者增强或改善另一疗法(例如预防剂或治疗剂)的预防效果或治疗效果的疗法的量。

本文使用的术语“样品”以其最广泛的含义使用。本文使用的“生物样品”包括但不限于来自有生命的东西或之前有生命的东西的任何量的物质。此类有生命的东西包括但不限于：人、小鼠、大鼠、猴子、狗、兔子和其它动物。此类物质包括但不限于：血液、血清、尿、滑液、细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾脏。

I.结合人4-1BB的结合蛋白

本公开一方面提供了抗体或其部分，其是分离的抗体。本公开一方面提供了以高亲和力、缓慢的解离速率和高中和能力结合4-1BB的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。本公开另一方面提供了特异性结合人4-1BB(h4-1BB)的抗体。本公开另一方面提供了结合4-1BB的完全人抗体。本公开另一方面提供了结合4-1BB的鼠抗体。本公开另一方面提供了结合4-1BB的嵌合抗体。本公开另一方面提供了结合4-1BB的人源化抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，抗体或其部分特异性结合h4-1BB。

A.制备抗4-1BB抗体的方法

如实施例中所阐明的，可以通过多种本领域已知的技术中的任何技术制备本公开的抗体。

1. 4-1BB结合蛋白

表1是候选抗4-1BB抗体克隆的缩写序列列表。

表1针对人4-1BB的小鼠单克隆抗体的VH区和VL区的氨基酸序列列表

以下表2-6列出了各克隆的CDR序列。

表2克隆ZW103的CDR序列

克隆	氨基酸序列	SEQ ID No.
			CDRH1	DYAMH	11
CDRH2	GISTYNGDASYNQKFKG	12
			CDRH3	SNYGYAMDY	13
CDRL1	KSSQSLLYSSNQKNYLA	14
			CDRL2	WASTRES	15
CDRL3	QQYLSYPWT	16

表3克隆ZW104的CDR序列

克隆	氨基酸序列	SEQ ID No.
			CDRH1	TYAMH	17
CDRH2	YINPTTVYTIYNQKFKD	18
			CDRH3	LGGHWYFDV	19
CDRL1	RASESVDNYGISFMN	20
			CDRL2	SASNQGS	21
CDRL3	QQSKEVPWT	22

表4克隆ZW105的CDR序列

表5克隆ZW106的CDR序列

克隆	氨基酸序列	SEQ ID No.
			CDRH1	SYWMD	29
CDRH2	NIYPDSGGTNYAEKFKS	30
			CDRH3	EEALGGYYELTY	31
CDRL1	RASQSVSTSSYSYMH	32
			CDRL2	YASNLES	33
CDRL3	QHSWEIPYT	34

表6克隆ZW107的CDR序列

克隆	氨基酸序列	SEQ ID No.
			CDRH1	NYWLG	35
CDRH2	DIYPGNGNNYYSEKFKD	36
			CDRH3	HGSFRSAMDY	37
CDRL1	RASENIYSYLA	38
			CDRL2	NAKTLAD	39
CDRL3	QHHYGTPPT	40

表7显示了包含ZW103-107克隆的前导序列的重链序列。

表7候选抗体克隆的HC和LC的氨基酸序列列表

前述分离的抗4-1BB抗体CDR序列建立了根据本公开进行分离，并且包含含有表1-7中所列序列的多肽的4-1BB结合蛋白的新家族和基序。

也已经产生了人源化的抗4-1BB抗体。例如，表8显示了人源化的ZW105和ZW106的序列。

表8人源化的ZW105-8和ZW106-2的VH和VL的氨基酸序列列表

2.抗4-1BB嵌合抗体

嵌合抗体是抗体的不同部分来源于不同来源或动物物种的分子。产生嵌合抗体的方法在本领域是已知的。参见，例如Morrison,Science229:1202(1985)；Oi等人，BioTechniques 4:214(1986)；Gillies等人，(1989)J.Immunol.Methods 125:191-202；美国专利第5,807,715号，第4,816,567号和第4,816,397号，将其通过引用整体并入本文。此外，可以使用为产生“嵌合抗体”而开发的通过剪接具有合适的抗原特异性的来自小鼠抗体分子的基因以及具有合适的生物学活性的来自人抗体分子的基因的技术(Morrison等人，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.81:851-855；Neuberger等人，1984,Nature 312:604-608；Takeda等人，1985,Nature 314:452-454，将其通过引用整体并入本文)。

在一个实施方案中，通过插入本文所述的抗4-1BB结合蛋白的CDR以及人IgG1恒定区而产生本公开的嵌合抗体。

3.抗4-1BB人源化抗体

人源化抗体是来自非人物种抗体的抗体分子，其结合含有来自非人物种的一种或多种互补决定区(CDR)以及来自人免疫球蛋白分子的框架区的期望的抗原。已知的人Ig序列公开于，例如：

www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi；www.atcc.org/phage/hdb.html；

www.sciquest.com/；www.abcam.com/；

www.antibodyresource.com/onlinecomp.html；

www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html；

www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html；

www.whfreeman.com/immunology/CH-05/kuby05.htm；

www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html；

www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/；

www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m-ikeimages.html；

www.antibodyresource.com/；

mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html.www.immunologylink.com/；

pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.-html；

www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/；www.pebio.com/pa/340913/340913.html-；

www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/；

www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito-/Elisa.html；

www.biodesign.con/table.asp；www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html；

www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html；

www.isac-net.org/sites_geo.html；

aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP-Start.html；

baserv.uci.kun.nl/.aboutjraats/linksl.html；

www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/；

www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html；

www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html；imgt.cnusc.fr:8104/；

www.biochem.uct.ac.uk/.about.martin/abs/index.html；antibody.bath.ac.uk/；

abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html；

www.unizh.ch/.about.honegger/AHOseminar/Slide01.html；

www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/；

www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm；

www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html；

www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html；

www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html；

www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo-ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html；

www.jerini.de/fr roducts.htm；www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat等人，

Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Dept.Health(1983)，将以上各自通过引用整体并入本文。如本领域所知，此类引入的序列可以用于降低免疫原性，或者降低、增强或改变结合、亲和力、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期或者任何其它合适的特征。

人框架区内的框架残基可以被来自CDR供体抗体的相应残基取代，以更改或改善抗原结合。这些框架取代通过本领域众所周知的方法来鉴定，例如通过模拟CDR与框架残基的相互作用以鉴定对于抗原结合而言重要的框架残基，以及通过序列比较来鉴定特定位点处罕见的框架残基(参见，例如Queen等人，美国专利第5,585,089号；Riechmann等人，Nature 332:323(1988)，将其通过引用整体并入本文)。通常可以获得三维免疫球蛋白模型，并且其是本领域技术人员所熟知的。可以获得阐明和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。对这些显示的观察允许分析残基在候选免疫球蛋序列的功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以此种方式，可以从共有序列和输入序列选择并组合FR残基，以实现期望的抗体特征，如对靶标抗原的增加的亲和力。一般而言，CDR残基直接并且最大程度参与影响抗原结合。可以利用本领域已知的多种技术将抗体人源化，所述技术例如但不限于下述中所述的那些技术：Jones等人，Nature 321:522(1986)；Verhoeyen等人，Science 239:1534(1988))，Sims等人，J.Immunol.151:2296(1993)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901(1987)，Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.151:2623(1993),Padlan,Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991)；Studnicka等人，ProteinEngineering 7(6):805-814(1994),Roguska.等人，PNAS 91:969-973(1994)；PCT公开WO91/09967、PCT/:US98/16280、US96/18978、US91/09630、US91/05939、US94/01234、GB89/01334、GB91/01134、GB92/01755；WO90/14443、WO90/14424、WO90/14430、EP 229246、EP592,106；EP 519,596、EP 239,400，美国专利第5,565,332号、第5,723,323号、第5,976,862号、第5,824,514号、第5,817,483号、第5,814,476号、第5,763,192号、第5,723,323号、第5,766886号、第5,714,352号、第6,204,023号、第6,180,370号、第5,693,762号、第5,530,101号、第5,585,089号、第5,225,539；第4,816,567号，将以上各自通过引用整体并入本文，包括其内引用的参考文献。

在一个实施方案中，例如如通过本领域已知的数种体外和体内分析中的任何一种所评估的，本公开的抗4-1BB结合蛋白可以显示出降低或增强4-1BB活性的高能力。

在某些实施方案中，抗体包含重链恒定区，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。在另一实施方案中，重链恒定区是IgG1重链恒定区或IgG4重链恒定区。此外，抗体可以包含轻链恒定区(κ轻链恒定区或λ轻链恒定区)。在另一实施方案中，抗体包含κ轻链恒定区。可选地，抗体部分可以是，例如Fab片段或单链Fv片段。

为更改抗体效应子功能而在Fc部分进行的氨基酸残基的置换在本领域是已知的(Winter等人，美国专利第5,648,260号，第5,624,821号)。抗体的Fc部分介导一些重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬、补体依赖的细胞毒性(CDC)以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除速率。在一些情况下，这些效应子功能对于治疗性抗体而言是可取的，但是在其它情况下，可能不是必要的或者甚至是有害的，这取决于治疗目的。某些人IgG同种型，特别是IgG1和IgG3分别通过结合Fc.γ.Rs和补体C1q来介导ADCC和CDC。新生儿Fc受体(FcRn)是决定抗体的循环半衰期的重要组分。在另一实施方案中，抗体恒定区(例如抗体的Fc区)中的至少一个氨基酸残基被置换，以更改抗体的效应子功能。

一个实施方案提供了标记的结合蛋白，其中本公开的抗体或抗体部分被衍生化或者连接至另一功能性分子(例如另一肽或蛋白)。例如，可以通过将本公开的抗体或抗体部分功能性连接(通过化学偶联、基因融合、非共价结合或者以其它方式)至一种或多种其它分子实体而获得本公开的标记的结合蛋白，所述一种或多种其它分子实体如另一抗体(例如双特异性抗体或双链抗体)、可检测试剂、细胞毒性剂、药剂和/或可以介导抗体或抗体部分与另一分子(如链霉亲和素核心区域或多组氨酸标签)的结合的蛋白或肽。

可以用于将本公开的抗体或抗体部分衍生化的有用的可检测试剂包括荧光化合物。示例性的荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。还可以用可检测的酶将抗体衍生化，所述酶如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶等。当用可检测的酶将抗体衍生化时，可以通过添加所述酶用于产生可检测的反应产物的另外的试剂对其进行检测。例如，当存在可检测的试剂辣根过氧化物酶时，添加过氧化氢和二氨基联苯胺产生可检测的有色反应产物。还可以用生物素将抗体衍生化，并且通过间接测量亲和素或链霉亲和素的结合来进行检测。

本公开的另一实施方案提供了结晶的结合蛋白。在另一实施方案中，本公开涉及本文公开的全抗4-1BB抗体及其片段的晶体，以及包含此类晶体的制剂和组合物。在另一实施方案中，结晶的结合蛋白在体内具有长于所述结合蛋白的可溶性对应物的半衰期。在另一实施方案中，结合蛋白在结晶之后保留生物学活性。

可以根据本领域已知的方法以及如WO 02072636(将其通过引用并入本文)中所公开的，产生本公开的结晶的结合蛋白。

本公开另一实施方案提供了糖基化的结合蛋白，其中抗体或其抗原结合部分包含一个或多个碳水化合物残基。新生体内蛋白的产生可以经历被称为翻译后修饰的进一步加工。具体地，可以酶促添加糖(糖基)残基，该过程被称为糖基化。产生的含有共价连接的寡糖侧链的蛋白被称为糖基化蛋白或糖蛋白。抗体是在Fc结构域以及可变结构域内含有一个或多个碳水化合物残基的糖蛋白。Fc结构域内的碳水化合物残基对Fc结构域的效应子功能有重要影响，其中对抗体的抗原结合或半衰期具有最小影响(R.Jefferis,Biotechnol.Prog.21(2005),pp.11-16)。相比之下，可变结构域的糖基化可能对抗体的抗原结合活性有影响。可变结构域内的糖基化可能对抗体结合亲和力有负面影响(这可能是因为空间位阻)(Co,M.S.,等人，Mol.Immunol.(1993)30:1361-1367)，或者其导致对抗原的增加的亲和力(Wallick,S.C.,等人，Exp.Med.(1988)168:1099-1109；Wright,A.,等人，EMBO J.(1991)10:2717 2723)。

本公开一方面涉及产生糖基化位点突变体，其中结合蛋白的O-或N-连接的糖基化位点已经被突变。本领域技术人员可以利用众所周知的标准技术产生此类突变体。保留生物学活性但是具有增加的或降低的结合活性的糖基化位点突变体是本公开的另一目标。

在另一实施方案中，对本公开的抗体或抗原结合部分的糖基化进行修饰。例如，可以制备无糖基化的(aglycoslated)抗体(即抗体缺乏糖基化)。可以更改糖基化，以例如增加抗体对抗原的亲和力。可以通过例如更改抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成此类碳水化合物修饰。例如，可以进行导致一个或多个可变区糖基化位点消除的一个或多个氨基酸取代，从而消除所述位点处的糖基化。此类无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。此类方法更加详细地描述于PCT公开WO2003016466A2以及美国专利第5,714,350号和第6,350,861号中，将其各自通过引用整体并入本文。

此外或者可选地，可以制备具有更改的糖基化类型的本公开的修饰的抗体，如具有减少量的岩藻糖基残基的岩藻糖基化不足(hypofucosylated)抗体或者具有增加的二等分GlcNAc结构的抗体。已经证明此类更改的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。可以通过，例如在具有更改的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来完成此类碳水化合物修饰。具有更改的糖基化机制的细胞在本领域已有描述，并且可将所述细胞用作表达本公开的重组抗体的宿主细胞，从而产生具有更改的糖基化的抗体。参见，例如Shields,R.L.等人，(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740；Umana等人，(1999)Nat.Biotech.17:176-1，以及欧洲专利第EP 1,176,195号；PCT公开WO 03/035835；WO 99/54342 80，将其各自通过引用整体并入本文。

蛋白的糖基化取决于目标蛋白的氨基酸序列以及表达蛋白的宿主细胞。不同的有机体可以产生不同的糖基化酶(例如糖基转移酶和糖苷酶)，并且具有不同可获得的底物(核苷酸糖)。由于此类因素，蛋白糖基化模式和糖基残基的组成可以根据表达具体蛋白的宿主细胞而不同。可用于本公开的糖基残基可以包括但不限于：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、n-乙酰葡糖胺和唾液酸。在另一实施方案中，糖基化的结合蛋白包含糖基残基，以使糖基化模式是人的糖基化模式。

本领域技术人员已知，不同的蛋白糖基化可能导致不同的蛋白特征。例如，与哺乳动物细胞如CHO细胞系中表达的治疗性蛋白的效力相比，微生物宿主如酵母中产生的并利用酵母内源性途径糖基化的治疗性蛋白的效力可能降低。此类糖蛋白在人中还可能具有免疫原性，并且在施用之后显示降低的体内半衰期。人和其它动物中的特定受体可以识别特定的糖基残基，并促进蛋白从血流中快速清除。其它不良影响可以包括下述的改变：蛋白折叠、可溶性、对蛋白酶的敏感性、运输、转运、区室化、分泌、被其它蛋白或因子识别、抗原性或者变应原性。因此，从业者可以优选具有特定糖基化组成和模式的治疗性蛋白，例如与人细胞或目标对象动物的物种特异的细胞中产生的糖基化组成和模式相同或者至少相似的糖基化组成和模式。

可以通过对宿主细胞进行遗传修饰以表达异源糖基化酶来实现表达不同于宿主细胞的糖基化蛋白的糖基化蛋白。利用本领域已知的技术，从业者可以产生显示人蛋白糖基化的抗体或其抗原结合部分。例如，将酵母菌株进行遗传修饰以表达非天然存在的糖基化酶，从而使这些酵母菌株中产生的糖基化蛋白(糖蛋白)显示出与动物细胞特别是人细胞的蛋白糖基化相同的蛋白糖基化(美国专利申请20040018590和20020137134以及PCT公开WO2005100584A2)。

除了结合蛋白之外，本公开还涉及对本公开的此类结合蛋白特异的抗独特型(抗Id)抗体。抗Id抗体是识别通常与另一抗体的抗原结合区域相关的独特决定簇的抗体。可以通过用结合蛋白或其包含CDR的区域免疫动物来制备抗Id。免疫的动物将识别并响应免疫抗体的独特型决定簇，并产生抗Id抗体。抗Id抗体还可以用作“免疫原”，以诱导另一动物中的免疫应答，产生所谓的抗抗Id抗体。

此外，本领域技术人员将会理解，可以利用基因工程化以表达多种糖基化酶的宿主细胞文库来表达目标蛋白，以使文库的成员宿主细胞产生具有变体糖基化模式的目标蛋白。然后从业者可以选择并分离具有特定新型糖基化模式的目标蛋白。在另一实施方案中，具有特别选择的新型糖基化模式的蛋白显示出改善的或更改的生物学特性。

本公开还提供包含本公开的结合蛋白、抗体或其抗原结合部分以及药学可接受的载体的药物组合物。包含本公开的抗体的药物组合物用于但不限于诊断、检测或监测病症，用于预防、治疗、管理或减轻病症或其一种或多种症状和/或用于研究中。在具体实施方案中，组合物包含本公开的一种或多种抗体。在另一实施方案中，药物组合物包含本公开的一种或多种抗体以及除本公开的抗体之外用于治疗4-1BB活性太高或太低的病症的一种或多种预防剂或治疗剂。在一个实施方案中，预防剂或治疗剂已知用于或者已经用于或者当前用于预防、治疗、管理或减轻病症或其一种或多种症状。根据这些实施方案，组合物还可以包含载体、稀释剂或赋形剂。

可将本公开的抗体和抗体部分并入适用于向对象施用的药物组合物中。通常，药物组合物包含本公开的抗体或抗体部分以及药学可接受的载体。如本文所使用的，“药学可接受的载体”包括生理学相容的任何以及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学可接受的载体的实例包括下述中的一种或多种：水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及以上的组合。在许多情况下，组合物中将优选包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。药学可接受的载体还可以包含增强抗体或抗体部分的保质期或有效性的少量辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。

多种递送系统是已知的，并且可以用于施用本公开的一种或多种抗体或者本公开的一种或多种抗体与用于预防、管理、治疗或减轻病症或其一种或多种症状的预防剂或治疗剂的组合，例如脂质体包封、微粒、微胶囊、能够表达抗体或抗体片段的重组细胞、受体介导的胞吞(参见，例如Wu和Wu,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987))、作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸的构建等。施用本公开的预防剂或治疗剂的方法包括但不限于：肠胃外施用(例如皮内施用、肌肉内施用、腹膜内施用、静脉内施用和皮下施用)、硬膜外(epidurala)施用、瘤内施用和粘膜施用(例如鼻内途径和口服途径)。此外，可以例如通过使用吸入器或喷雾器以及含有气雾化剂的制剂来使用肺部施用。参见，例如美国专利第6,019,968号、第5,985,320号、第5,985,309号、第5,934,272号、第5,874,064号、第5,855,913号、第5,290,540号和第4,880,078号；以及PCT公开第WO 92/19244号、第WO 97/32572号、第WO 97/44013号、第WO 98/31346号和第WO 99/66903号，将其各自通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，利用Alkermes AIR.RTM.肺部药物递送技术(Alkermes,Inc.,Cambridge,Mass.)施用本公开的抗体、组合疗法或本公开的组合物。在具体实施方案中，肌肉内、静脉内、瘤内、口服、鼻内、肺部或皮下施用本公开的预防剂或治疗剂。可以通过任何方便的途径施用预防剂或治疗剂，例如通过输注或弹丸注射，通过经上皮或皮肤粘膜内层(mucocutaneous lining)(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)的吸收，并且可以与其它生物活性剂共同施用。施用可以是全身的或局部的。

在具体实施方案中，向需要治疗的区域局部施用本公开的预防剂或治疗剂是可取的；这可以通过例如但不限于局部输注，通过注射或者通过植入物来实现，所述植入物是多孔材料或无孔材料，包括膜和基质，如硅橡胶膜(sialastic membrane)、聚合物、纤维基质或胶原基质。在一个实施方案中，向对象的受累区域局部施用有效量的本公开拮抗剂的一种或多种抗体，以预防、治疗、管理和/或减轻病症或其症状。在另一实施方案中，向受累区域局部施用与有效量的除本公开的主题抗体之外的一种或多种疗法(例如一种或多种预防剂或治疗剂)组合的有效量的本公开的一种或多种抗体，以预防、治疗、管理和/或减轻病症或其一种或多种症状。

在另一实施方案中，可以在控制释放系统或持续释放系统中递送本公开的预防剂或治疗剂。在一个实施方案中，可将泵用于实现控制释放或持续释放(参见以上Langer；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:20；Buchwald等人，1980,Surgery 88:507；Saudek等人，1989,N.Engl.J.Med.321:574)。在另一实施方案中，可将聚合材料用于实现本公开的疗法的控制释放或持续释放(参见，例如Medical Applications of ControlledRelease,Langer和Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974)；Controlled DrugBioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen和Ball(eds.),Wiley,New York(1984)；Ranger和Peppas,1983,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；还参见Levy等人，1985,Science 228:190；During等人，1989,Ann.Neurol.25:351；Howard等人，1989,J.Neurosurg.7 1:105)；美国专利第5,679,377号，第5,916,597号，第5,912,015号，第5,989,463号，第5,128,326号；PCT公开号WO 99/15154；以及PCT公开号WO 99/20253。用于持续释放制剂的聚合物的实例包括但不限于：聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐类、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚乳酸(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)以及聚原酸酯。在实施方案中，用于持续释放制剂的聚合物是惰性的、不含可滤取的杂质、保存稳定、无菌且生物可降解。在另一实施方案中，可以邻近预防靶标或治疗靶标放置控制释放系统或持续释放系统，从而仅需要全身剂量的一部分(参见，例如Goodson,in Medical Applications of Controlled Release,同上,vol.2,pp.115-138(1984))。

Langer(1990,Science 249:1527-1533)的综述中论述了控制释放系统。可将本领域技术人员已知的任何技术用于产生包含本公开的一种或多种治疗剂的持续释放制剂。参见，例如美国专利第4,526,938号，PCT公开WO 91/05548，PCT公开WO 96/20698,Ning等人，1996,"Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer XenograftUsing a Sustained-Release Gel,"Radiotherapy&Oncology 39:179-189,Song等人，1995,"Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions,"PDAJournal of Pharmaceutical Science&Technology 50:372-397,Cleek等人，1997,"Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for CardiovascularApplication,"Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854，以及Lam等人，1997,"Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody forLocal Delivery,"Proc.Int'l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760，将其各自通过引用整体并入本文。

在具体实施方案中，在本公开的组合物是编码预防剂或治疗剂的核酸的情况下，可以通过将所述核酸构建为合适的核酸表达载体的一部分并将其施用以使其通过例如下述变为细胞内的来体内施用核酸，从而促进其编码的预防剂或治疗剂的表达：通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利第4,980,286号)，或者通过直接注射，或者通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic,Dupont)或者用脂质或细胞表面受体或转染试剂包被，或者通过将其与已知进入核的同源框样肽连接施用(参见，例如Joliot等人，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864-1868)。可选地，可以细胞内引入核酸，以及将其并入宿主细胞DNA内，以通过同源重组进行表达。

将本公开的药物组合物配制为与其意图施用途径相容。施用途径的实例包括但不限于肠胃外施用，例如静脉内施用、皮内施用、皮下施用、口服施用、鼻内(例如吸入)施用、经皮(例如局部)施用、经粘膜施用和直肠施用。在具体实施方案中，根据作为适用于向人静脉内施用、皮下施用、肌肉内施用、口服施用、鼻内或局部施用的药物组合物的常规程序配制组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗缓冲水溶液。当必要时，组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂(如lignocamne)，以缓解注射位点处的疼痛。

如果本公开的组合物意图局部施用，则可将组合物配制为软膏、乳霜、透皮贴剂、洗液、凝胶、洗发水、喷雾、气雾剂、溶液、乳液形式或者本领域技术人员众所周知的其它形式。参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction toPharmaceutical Dosage Forms，第19版，Mack Pub.Co.,Easton,Pa.(1995)。对于不可喷射的局部剂型，通常采用粘稠至半固体或固体的形式，其包含载体或者与局部应用相容并且具有高于水的动态粘滞度的一种或多种赋形剂。合适的制剂包括但不限于溶液、悬液、乳液、乳霜、软膏、粉剂、搽剂、药膏等，如果需要，其是无菌的或者与影响多种特性(如例如渗透压)的助剂(例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲剂或盐)混合。其它合适的局部剂型包括可喷射的气雾剂制剂，其中将与固体或液体惰性载体组合的活性成分包装于与压缩的挥发物(例如气体推进剂，如氟利昂)的混合物中或者挤压瓶中。如果需要，还可向药物组合物和剂型中添加保湿剂或湿润剂。此类另外的成分的实例在本领域众所周知。

如果本公开的方法包括鼻内施用组合物，则可将组合物配制为气雾剂形式、喷雾、薄雾或液滴形式。具体地，可以以气雾剂喷雾的呈现形式，使用合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或者其他合适的气体)从加压包或喷雾器方便地递送根据本发明使用的预防剂或治疗剂。在加压气雾剂的情况下，可以通过提供阀门以递送计量数量来确定剂量单位。可以配制用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(由例如明胶组成)，其包含化合物和合适的粉末基料(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

如果本公开的方法包括口服施用，则可以配制片剂、胶囊、扁囊剂、囊形片、溶液、悬液等口服形式的组合物。可以通过常规方式，用药学可接受的赋形剂来制备片剂或胶囊，所述药学可接受的赋形剂如结合剂(例如预先成胶状的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或硅土)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羧基乙酸淀粉钠)；或者润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。可以通过本领域众所周知的方法包被片剂。用于口服施用的液体制剂可以采用但不限于溶液、糖浆或悬液形式，或者它们可以呈现为干燥产品，用于在使用之前用水或其它合适的媒介物复原。可以通过常规手段，用药学可接受的添加剂来制备此类液体制剂，所述药学可接受的添加剂如悬浮剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水性媒介物(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分馏的植物油)；以及防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。视情况，制剂还可以包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于口服施用的制剂可以适当地配制为预防剂或治疗剂的缓慢释放、控制释放或持续释放。

本公开的方法可以包括肺部施用用气雾化剂配制的组合物，例如通过使用吸入器或喷雾器肺部施用。参见，例如美国专利第6,019,968号、第5,985,320号、第5,985,309号、第5,934,272号、第5,874,064号、第5,855,913号、第5,290,540号和第4,880,078号；以及PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，将其各自通过引用整体并入本文。在具体实施方案中，利用Alkermes AIR.RTM.肺部药物递送技术(Alkermes,Inc.,Cambridge,Mass.)施用本公开的抗体、组合疗法和/或本公开的组合物。

本公开的方法可以包括通过注射(例如通过弹丸注射或连续输注)施用配制的用于肠胃外施用的组合物。用于注射的制剂可以以含有添加的防腐剂的单位剂型呈现(例如在安瓿或在多剂量容器中)。组合物可以采取诸如油性或水性媒介物中的悬液、溶液或乳液的形式，并且可以包含诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的配制剂。可选地，活性成分可以是粉末形式，其用于在使用之前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)复原。

本公开的方法可以另外包括施用配制为储库制剂的组合物。可以通过植入(例如皮下或肌肉内)或者通过肌肉内注射施用此类长效制剂。因此，例如，组合物可以用合适的聚合材料或疏水材料(例如作为可接受的油中的乳液)或者离子交换树脂配制，或者作为微溶的衍生物(例如作为微溶的盐)。

本公开的方法涵盖配制为中性或盐形式的组合物的施用。药学可接受的盐包括与阴离子形成的那些药学可接受的盐和与阳离子形成的那些药学可接受的盐，所述阴离子如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些阴离子，所述阳离子如来源于钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些阳离子。

一般而言，可分开地或混合在一起以单位剂型(例如，作为在密闭容器例如指示活性剂的量的安瓿或小袋中的干燥的冻干粉末或无水浓缩物)提供组合物的成分。当施用模式是输注时，可用包含无菌医药级的水或盐水的输液瓶分散组合物。当施用模式是通过注射时，可以提供用于注射的无菌水或盐水安瓿，以在施用之前将成分混合。

具体地，本公开还提供包装于密闭容器中的本公开的预防剂或治疗剂或者药物组合物中的一种或多种，所述密闭容器如指示试剂的量的安瓿或小袋。在一个实施方案中，本公开的预防剂或治疗剂或者药物组合物中的一种或多种作为密闭容器中的干燥无菌冻干粉末或者无水浓缩物提供，并且可被复溶(例如用水或盐水)成向对象施用的合适浓度。在另一实施方案中，本公开的预防剂或治疗剂或者药物组合物中的一种或多种作为密闭容器中的干燥无菌冻干粉末提供，其单位剂量为至少5mg、至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、至少75mg或者至少100mg。应当将本公开的冻干的预防剂或治疗剂或药物组合物在2℃至8℃下保存于其原始容器中，并且本公开的预防剂或治疗剂或者药物组合物应当在复溶之后1周内、5天内、72小时内、48小时内、24小时内、12小时内、6小时内、5小时内、3小时内或者1小时内施用。在可选实施方案中，本公开的预防剂或治疗剂或者药物组合物中的一种或多种以在指示试剂的量和浓度的密闭容器中的液体形式提供。在另一实施方案中，在密闭容器中提供至少0.25mg/ml、至少0.5mg/ml、至少1mg/ml、至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/kg、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml或者至少100mg/ml的施用的液体形式的组合物。应当将液体形式在2℃至8℃下保存与其原始容器中。

可将本公开的抗体和抗体部分掺入适用于肠胃外施用的药物组合物。在另一实施方案中，抗体或抗体部分将被制备为包含0.1-250mg/ml抗体的可注射的溶液。可注射的溶液可以由透明瓶(flint vial)或琥珀色瓶、安瓿或预填充的注射器中的液体或冻干剂型组成。缓冲剂可以是pH 5.0至7.0(pH 6.0最佳)的L-组氨酸(1-50mM)，5-10mM最佳。其它合适的缓冲剂包括但不限于琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。可将氯化钠用于改变0-300mM(对于液体剂型，150mM最佳)浓度下的溶液的毒性。冻干剂型可以包含冷冻保护剂，主要是0-10％蔗糖(0.5-1.0％最佳)。其它合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。冻干剂型可以包含膨胀剂，主要是1-10％的甘露醇(24％最佳)。液体和冻干剂型均可使用稳定剂，主要是1-50mM L-甲硫氨酸(5-10mM最佳)。其它合适的膨胀剂包括甘氨酸、精氨酸，可以包含如0-0.05％聚山梨醇酯-80(0.005-0.01％最佳)。另外的表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。制备为用于肠胃外施用的可注射溶液的包含本公开的抗体或抗体部分的药物组合物还可以包含用作佐剂的试剂，如用于增加治疗性蛋白(例如抗体)的吸收或分散的那些试剂。特别有用的佐剂是透明质酸酶，如Hylenex.RTM.(重组人透明质酸酶)。在可注射溶液中添加透明质酸酶改善了肠胃外施用，特别是皮下施用之后的人生物可利用度。还允许具有更少疼痛和不适以及最低发生率的注射部位反应的更大的注射部位体积(即大于1ml)。(参见通过引用并入本文的WO2004078140、US2006104968)。

本公开的组合物可以是多种形式。这些形式包括，例如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如可注射溶液和可输注溶液(infusible solution))、分散液或悬液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选形式取决于预期施用模式和治疗应用。在另一实施方案中，典型的组合物是可注射溶液或可输注溶液的形式，如与包含其它抗体的用于人的被动免疫的那些组合物类似的组合物。在另一实施方案中，施用模式是肠胃外施用(例如静脉内施用、皮下施用、腹膜内施用、肌肉内施用)。在另一实施方案中，通过静脉内输注或注射施用抗体。在另一实施方案中，通过肌肉内或皮下注射施用抗体。

治疗性组合物在制造和保存条件下通常必须是无菌且稳定的。可将组合物配制为溶液、微乳液、分散液、脂质体或者适用于高药物浓度的其它有序结构。无菌可注射溶液可通过如下来制备：以所需量将活性化合物(即，抗体或抗体部分)掺入至具有以上所列的一种成分或成分的组合的适当溶剂中，根据需要，接着进行过滤灭菌。一般而言，分散液通过如下制备：将活性化合物掺入至含有碱性分散介质和所需的上述所列的其他成分的无菌媒介物中。在另一实施方案中，在用于制备无菌可注射溶液的无菌冻干粉末的情况下，制备方法是从其之前的无菌过滤溶液获得活性成分粉末以及任何另外期望的成分的真空干燥和喷雾干燥。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散液的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持溶液适当的流动性。可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)引起可注射组合物的延长的吸收。

可以通过本领域已知的多种方法施用本公开的抗体和抗体部分，尽管对于多种治疗应用而言，优选的施用途径/模式是皮下注射、静脉内注射或输注。技术人员将会理解，施用途径和/或模式将根据期望的结果而改变。在某些实施方案中，活性化合物可以用将保护化合物免于快速释放的载体制备，如控制释放制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法已获得专利或者通常是本领域技术人员已知的。参见，例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。

在某些实施方案中，可以例如用惰性稀释剂或可同化的食用载体口服施用本公开的抗体或抗体部分。还可将化合物(以及其它成分(如果需要))封装进硬壳和软壳明胶胶囊中，压缩为片剂或者直接掺入对象的饮食中。对于口服治疗施用，可将化合物与赋形剂合并，并以可吸收的片剂、颊含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆、薄片(wafer)等的形式使用。为了通过除肠胃外施用之外的方式施用本公开的化合物，用防止其失活的材料包被化合物或者将化合物与防止其失活的材料共同施用可能是必须的。

还可向组合物中掺入补充的活性化合物。在某些实施方案中，将本公开的抗体或抗体部分与可用于治疗4-1BB活性过低的病症的一种或多种另外的治疗剂共同配制和/或共同施用。例如，可将本公开的抗4-1BB抗体或抗体部分与结合其它靶标的一种或多种另外的抗体(例如结合其它细胞因子的抗体或者结合细胞表面分子的抗体)共同配制和/或共同施用。此外，可将本公开的一种或多种抗体与前述治疗剂中的两种或更多种组合使用。此类组合疗法可以有利地利用施用的较低剂量的治疗剂，从而避免与多种单一疗法相关的可能的毒性或并发症。

在某些实施方案中，将4-1BB的抗体或其片段连接至本领域已知的延长半衰期的媒介物。此类媒介物包括但不限于Fc结构域、聚乙二醇和葡聚糖。此类媒介物描述于，例如美国申请序列号09/428,082和公开的PCT申请第WO 99/25044号中，出于任何目的，在此将其通过引用并入。

在具体实施方案中，施用包含编码本公开的抗体或者本公开的另一预防剂或治疗剂的核苷酸序列的核酸序列，以通过基因疗法治疗、预防、管理或减轻病症或其一种或多种症状。基因疗法指通过向对象施用表达的或可表达的核酸而实施的疗法。在本公开的该实施方案中，核酸产生介导预防或治疗作用的其编码的本公开的抗体或预防剂或治疗剂。

可以根据本公开使用本领域可获得的任何基因疗法方法。对于基因疗法方法的一般综述，参见Goldspiel等人，1993,Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu和Wu,1991,Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan,Science 260:926-932(1993)；以及Morgan和Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191-217；May,1993,TIBTECH 11(5):155-215。可以使用的本领域通常已知的重组DNA技术方法描述于Ausubel等人(eds.),Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,NY(1993)；和Kriegler,Gene Transfer and Expression,ALaboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)中。多种基因疗法方法的详细描述公开于US20050042664 A1中，将其通过引用并入本文。

本公开的抗体或其抗原结合部分可以单独使用或者组合使用以治疗此类疾病。应当理解，本公开的抗体或其抗原结合部分可以单独使用或者与另外的试剂(例如治疗剂)组合使用，所述另外的试剂由技术人员出于预期的目的进行选择。例如，另外的试剂可以是本领域公认的可用于治疗由本公开的抗体治疗的疾病或病况的治疗剂。另外的试剂还可以是赋予治疗性组合物有益属性的试剂，例如影响组合物的粘度的试剂。

应当进一步理解，本公开意图包含的组合是可用于其预期目的的那些组合。以下列出的试剂是出于说明的目的，并且不意图具有限制性。作为本公开的一部分的组合可以是本公开的抗体和选自以下列表的至少一种另外的试剂。组合还可以包含多种另外的试剂，例如两种或三种另外的试剂，如果组合是这样的话，形成的化合物可以实施其预期的功能。

如本文更详细描述的，组合疗法可以包含与一种或多种另外的治疗剂共同配制和/或共同施用的一种或多种4-1BB激动剂或拮抗剂，例如抗4-1BB抗体或其片段，所述一种或多种另外的治疗剂例如一种或多种细胞因子和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂(例如全身性抗炎剂)、抗纤维变性剂、代谢抑制剂、酶抑制剂和/或细胞毒性剂或细胞抑制剂。

本公开的药物组合物可以包含“治疗有效量”或“预防有效量”的本公开的抗体或抗体部分。“治疗有效量”指在所需剂量和时间段有效实现期望的治疗结果的量。可以由本领域技术人员确定抗体或抗体部分的治疗有效量，并且其可以根据诸如下述因素而改变：个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及抗体或抗体部分引发个体中期望的应答的能力。治疗有效量也是抗体或抗体部分的治疗有益效果超出任何毒性或有害效果的量。“预防有效量”指在所需剂量和时间段有效实现期望的预防结果的量。通常，由于对象在疾病之前或者在疾病早期使用预防剂量，预防有效量将低于治疗有效量。

可以调节剂量方案，以提供最佳期望应答(例如治疗性应答或预防性应答)。例如，可以施用单次推注(single bolus)，可以随时间施用数次分份剂量，或者可以如治疗情况的紧迫性所指示的按比例降低或增加剂量。配制剂量单位形式的肠胃外组合物对于方便施用和剂量一致特别有利。本文使用的剂量单位形式指适合作为待治疗的哺乳动物对象的单一剂量的生理上分离的单元；各单元包含预定量的活性化合物，计算所述量以产生与所需的药物载体相关的期望的治疗效果。本公开剂量单位形式的规格决定于并且直接取决于以下：(a)活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗或预防效果，和(b)混合用于治疗个体中的敏感性的此类活性化合物的领域中的固有局限性。

本公开的抗体或抗体部分的治疗或预防有效量的示例性非限制范围是0.1-20mg/kg、1-10mg/kg。应当注意，剂量数值可以随待缓解的病况的类型和严重性而改变。还应当理解，对于任何具体对象，应当根据个体的需求和施用或者监督组合物施用的人员的专业判断而随时间调节具体的剂量方案，并且本文示出的剂量范围仅是示例性的，且不意图限制要求保护的组合物的范围和实践。

对于本领域技术人员而言将是显而易见的是，本文所述的本公开的方法的其它合适的修改和改变很明显，并且可以在不脱离本公开的范围或本文所公开的实施方案的情况下，利用合适的等同物进行其它合适的修改和改变。现在已经详细描述了本公开，通过参考下述实施例将更清楚地理解本公开，仅出于说明的目的包含下述实施例，并且不意图限制本公开。

实施例

实施例1抗人4-1BB单克隆抗体的产生

选择并产生人抗原用于免疫动物。在C-端将编码人4-1BB(a.k.a.CD137)(NP_001552.2)胞外结构域的N-端片段(Met 1---Gln 186)的DNA序列与人IgG1的C端多组氨酸标记的Fc区融合。将构建体引入宿主细胞(例如NSO来源的小鼠骨髓瘤细胞系)，并在宿主细胞中表达为重组蛋白。如通过SDS-PAGE所测定的，将重组蛋白纯化至高于95％的纯度。

蛋白的结构域结构是：N-端{{人4-1BB(Leu24-Gln186)-DIEGRMD-人IgG1(Pro100-Lys330)-6-His标签}}C-端。预测的分子量(MW)是44.8kDa(单体)，以及在SDS-PAGE上测量的MW是50-65KD。

如在功能性ELISA中通过重组蛋白的结合能力所测量的，其显示具有4-1BB的一些功能特性。当固定10ng/mL(100μL/孔)的重组人4-1BBFc嵌合体时，发现产生50％的最佳结合应答的重组人4-1BB配体(目录#2295---4L)的浓度为大约0.5-2.5ng/mL。20μg/ml(100μl/孔)的固定化的重组小鼠4-1BB配体可以结合人4-1BB，其中线性范围为15.6-500ng/ml。

通过利用ELISA进行小鼠杂交瘤筛选，并通过蛋白质印迹确认。通过细胞表面结合分析确认所选克隆的结合亲和力。在进行4-1BB mAb上清液染色之前，用对照或人/猴4-1BB质粒过夜转染HEK293T细胞。大多数所选克隆显示出与人和猴4-1BB蛋白的交叉反应性。

实施例2抗人4-1BB单克隆抗体的表征

板包被的CD3mAb共刺激。用溶于1xPBS的不同浓度的CD3mAb(OKT3)包被96孔培养板过夜。用1xPBS洗涤三次之后，在培养开始时，将板用10ug/ml h4-1BB mAb或对照小鼠IgG1进一步包被。从人外周单核细胞(PBMC)分离人T细胞，并在添加至抗体包被的板之前用CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)标记。培养4-6天之后，经流式细胞术，通过CFSE稀释检测T细胞的分裂(或增殖)。

通过克隆刺激T细胞增殖的能力选择一些克隆。这些克隆可以用作4-1BB的共刺激激动剂。这些克隆之一是ZW103。ZW103能够与一种或多种共刺激物一起扩增CD4+T细胞或CD8+T细胞(图1)。其它克隆包括ZW104、ZW105、ZW106和ZW107等。

为了证实所选克隆能够结合人和猴4-1BB，将表达人或猴4-1BB的293T细胞用于测试ZW103和ZW104与人和猴4-1BB的结合。ZW103和ZW104均能够结合人和猴4-1BB(图2)。ZW105、ZW106和ZW107也能够结合人和猴4-1BB。表8显示了ZW105和ZW106与重组人4-1BBECD蛋白的结合亲和力。

表8抗体克隆的结合亲和力

为了证实在共刺激物CD3mAB的存在下，所选克隆能够刺激T细胞增殖，在包被的板中进行共刺激分析。ZW103和ZW104均能够刺激T细胞增殖(图3)。将纯化的人T细胞进行CFSE标记，并用OKT3以及包被的4-1BB mAb或对照蛋白进行刺激。在培养5天之后，收获细胞并针对CD4和CD8染色，以用于流式细胞术分析。将指示CFSE稀释的细胞计为分裂的T细胞(图3)。

图4是显示用OKT3以及包被的4-1BB mAb或对照蛋白刺激的纯化的人T细胞的图。在一些培养物中添加重组人白介素-2(60IU/ml)，以促进T细胞应答。在第5天收集上清液以测量细胞因子IFN-γ(图4)。这些结果证实所选克隆能够激活人CD8+和CD4+T细胞，并刺激人T细胞产生IFN-γ。

图5A显示了移植物抗宿主反应(GVH)疾病模型的程序。在第0天，将1千万个CFSE标记的人外周血单核细胞(PBMC)注射进NOD scidγ(NSG)小鼠中。在第0天和第2天，用4-1BBmAb或对照蛋白处理小鼠。在第6天收获脾细胞，以用于流式细胞术分析。如图5B中所示，在异种-GVHD小鼠模型中，4-1BB mAb处理促进T细胞的增殖。在第6天收获脾细胞，并针对hCD45、hCD3和hCD8染色。显示的数据是通过CFSE稀释测定的分裂的T细胞的平均百分比(N＝4)。如在GVHD模型中通过T细胞增殖所证实的，ZW103增强了免疫(图5B)。

为了测试公开的4-1BB Ab对移植有人PBMC的NSG小鼠的GVHD的影响，在第5、8、12、15天，用300μg公开的人源化的4-1BB Ab或PBS对照处理注射有1500万个人PBMC的NSG。在hPBMC转移时监测体重。结果显示，公开的人源化的4-1BB Ab促进了移植有人PBMC的NSG小鼠的GVHD(图6A)。

图6B显示，在异种-GVHD模型中，公开的人源化的4-1BB Ab增加血清IFN-γ。上图显示在第8天所测量的血清中的IFN-γ浓度，以及下图显示在第21天所测量的血清中的IFN-γ浓度(左侧的两个柱条分别是ZW103-2和ZW103-4，而右侧的柱条是PBS)。

图6C显示，在异种-GVHD模型中，公开的人源化的4-1BB Ab增加脾脏大小。如图4A，在第21天收获脾脏并称重。

图6D显示，公开的人源化的4-1BB Ab增加外周血中的人T细胞，并且该作用是剂量依赖性的。如图6A中，在hPBMC转移之后第28天，通过FACS分析人PBMC的移植物的人CD45染色。

图6E显示，公开的人源化的4-1BB Ab增加肝脏中人T细胞浸润。如图6A中，在hPBMC转移之后第28天，用抗人CD3抗体对肝脏组织切片进行染色。

表9显示，公开的人源化的4-1BB Ab增强由GVHD引起的组织损伤。如图6A中，在第28天，处死小鼠，并将组织浸入4％的多聚甲醛，用于苏木精和伊红(H&E)染色。由两个独立的病理学家对组织损伤进行打分。

表9公开的人源化的4-1BB Ab增强由GVHD引起的组织损伤

图7A显示了人4-1BB mAb的体内抗肿瘤效果。通过向含有嵌合的人4-1BB细胞外基因的4-1BB敲入小鼠皮下注射MC38癌细胞(0.5x10⁶)建立肿瘤模型。在第5、8、12天，用4-1BBmAb或对照蛋白静脉内处理小鼠。在第18天分离并测量肿瘤。与对照组(小鼠3和小鼠4)相比，用ZW106处理的组(小鼠1和小鼠2)中的肿瘤大小显著更小。

图7B显示了不同剂量的完全人源化的4-1BB mAb的体内作用。通过向含有嵌合的人4-1BB细胞外基因的4-1BB敲入小鼠皮下注射MC38癌细胞(0.5x10⁶)建立肿瘤模型。当肿瘤大小达到100mm³时，每三天用3mg/kg(低剂量)和15mg/kg(高剂量)的人源化的4-1BB mAbZW105-IgG4和ZW106-IgG4或者对照蛋白静脉内处理小鼠。各组中N＝6。

实施例3表位定位

为了鉴定两种纯化的抗体ZW105和ZW 106识别的4-1BB(CD137)配体表位，通过抗体进行4-1BB重组蛋白的胰蛋白酶和糜蛋白酶消化物的沉淀。利用Thermo Q-ExactiveOrbitrap质谱仪，通过纳米液相色谱串联质谱法(LC/MS/MS)分析进一步检测沉淀物。结果指示，来自4-1BB重组蛋白的肽区域T90KKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVL124(SEQ IDNO.51)是抗体ZW105和ZW106两者识别的主要表位。

Claims (27)

1.能够特异性结合人4-1BB的结合蛋白，所述结合蛋白包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含六种CDR：CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：

CDR-H1选自：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29和SEQ IDNO:35；

CDR-H2选自：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ IDNO:36；

CDR-H3选自：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:37；

CDR-L1选自：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:32和SEQ IDNO:38；

CDR-L2选自：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33和SEQ IDNO:39；以及

CDR-L3选自：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34和SEQ IDNO:40。

2.如权利要求1所述的结合蛋白，其中六种CDR中的三种选自下述可变结构域CDR集：

VH ZW103 CDR集

CDR-H1:SEQ ID NO:11

CDR-H2:SEQ ID NO:12

CDR-H3:SEQ ID NO:13

VL ZW103 CDR集

CDR-L1:SEQ ID NO:14

CDR-L2:SEQ ID NO:15

CDR-L3:SEQ ID NO:16

VH ZW104 CDR集

CDR-H1:SEQ ID NO:17

CDR-H2:SEQ ID NO:18

CDR-H3:SEQ ID NO:19

VL ZW104 CDR集

CDR-L1:SEQ ID NO:20

CDR-L2:SEQ ID NO:21

CDR-L3:SEQ ID NO:22

VH ZW105 CDR集

CDR-H1:SEQ ID NO:23

CDR-H2:SEQ ID NO:24

CDR-H3:SEQ ID NO:25

VL ZW105 CDR集

CDR-L1:SEQ ID NO:26

CDR-L2:SEQ ID NO:27

CDR-L3:SEQ ID NO:28

VH ZW106 CDR集

CDR-H1:SEQ ID NO:29

CDR-H2:SEQ ID NO:30

CDR-H3:SEQ ID NO:31

VL ZW106 CDR集

CDR-L1:SEQ ID NO:32

CDR-L2:SEQ ID NO:33

CDR-L3:SEQ ID NO:34

VH ZW107 CDR集

CDR-H1:SEQ ID NO:35

CDR-H2:SEQ ID NO:36

CDR-H3:SEQ ID NO:37

VL ZW107 CDR集

CDR-L1:SEQ ID NO:38

CDR-L2:SEQ ID NO:39

CDR-L3:SEQ ID NO:40。

3.如权利要求2所述的结合蛋白，其包含至少两种可变结构域CDR集。

4.如权利要求3所述的结合蛋白，其中所述至少两种可变结构域CDR集选自：

VH ZW103 CDR集和VL ZW103 CDR集；

VH ZW104 CDR集和VL ZW104 CDR集；

VH ZW105 CDR集和VL ZW105 CDR集；

VH ZW106 CDR集和VL ZW106 CDR集；以及

VH ZW107 CDR集和VL ZW107 CDR集。

5.如前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其还包含人受体框架。

6.如前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含至少一种可变结构域，所述可变结构域含有选自SEQ ID NO:1-10的氨基酸序列。

7.如前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含至少一种重链可变结构域和至少一种轻链可变结构域，所述重链可变结构域含有选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、52和56的氨基酸序列，以及所述轻链可变结构域含有选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、53和57的氨基酸序列。

8.如权利要求7所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含两种可变结构域，其中所述两种可变结构域含有选自下述的氨基酸序列：

SEQ ID NO:1和2；

SEQ ID NO:3和4；

SEQ ID NO:5和6；

SEQ ID NO:7和8；

SEQ ID NO:9和10；

SEQ ID NO:52和53；以及

SEQ ID NO:56和57。

9.如前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其还包含选自下述的重链免疫球蛋白恒定结构域：人IgM恒定结构域；人IgG1恒定结构域；人IgG2恒定结构域；人IgG3恒定结构域；人IgG4恒定结构域；人IgE恒定结构域和人IgA恒定结构域。

10.如前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述重链免疫球蛋白恒定结构域是人IgG1恒定结构域。

11.如前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其还包含轻链免疫球蛋白恒定结构域，其中所述轻链免疫球蛋白恒定结构域是人Igκ恒定结构域。

12.如前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其还包含轻链免疫球蛋白恒定结构域，其中所述轻链免疫球蛋白恒定结构域是人Igλ恒定结构域。

13.如前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白选自：免疫球蛋白分子、scFv、单克隆抗体、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单域抗体、Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂、Fv、二硫键连接的Fv、单域抗体、双链抗体、多特异性抗体、双特异性抗体以及双重特异性抗体。

14.如前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白是人抗体。

15.如前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够调节4-1BB的生物学功能或水平。

16.如前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述4-1BB是人4-1BB。

17.抗体构建体，其包含前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，并且还包含接头多肽或免疫球蛋白恒定结构域。

18.如权利要求17所述的抗体构建体，其选自：

免疫球蛋白分子，

单克隆抗体，

嵌合抗体，

CDR-移植抗体，

人源化抗体，

Fab，

Fab'，

F(ab')₂，

Fv，

二硫键连接的Fv，

scFv，

单域抗体，

双链抗体，

多特异性抗体，

双重特异性抗体，以及

双特异性抗体。

19.如权利要求18所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体包含选自下述的重链免疫球蛋白恒定结构域：

人IgM恒定结构域,

人IgG1恒定结构域,

人IgG2恒定结构域,

人IgG3恒定结构域,

人IgG4恒定结构域,

人IgE恒定结构域,

人IgA恒定结构域，以及

IgG恒定结构域变体，其包含改变与Fc新生儿受体、Fcγ受体或C1q的结合强度的一种或多种突变。

20.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的结合蛋白和药学可接受的载体。

21.增强人4-1BB的活性的方法，其包括使人4-1BB与有效增强人4-1BB活性的剂量的前述权利要求中任一项所述的结合蛋白接触。

22.改变罹患病症的人对象中的人4-1BB活性的方法，其包括向所述人对象施用前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，以增强所述人对象中的人4-1BB的活性。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述病症是癌症。

24.如权利要求1-16中任一项所述的结合蛋白，其中所述重链包含含有选自SEQ IDNo.54和SEQ ID No.58的序列的多肽。

25.如权利要求1-16中任一项所述的结合蛋白，其中所述轻链包含含有选自SEQ IDNo.55和SEQ ID No.59的序列的多肽。

26.能够特异性结合人4-1BB的结合蛋白，所述结合蛋白包含含有SEQ ID No.52的序列的多肽、含有SEQ ID No.53的序列的多肽、含有SEQ ID No.54的序列的多肽以及含有SEQID No.55的序列的多肽。

27.能够特异性结合人4-1BB的结合蛋白，所述结合蛋白包含含有SEQ ID No.56的序列的多肽、含有SEQ ID No.57的序列的多肽、含有SEQ ID No.58的序列的多肽以及含有SEQID No.59的序列的多肽。