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JP2014042531A - ゼアラレノンアナログ化合物ががんを処置する能力を予測する方法 - Google Patents

ゼアラレノンアナログ化合物ががんを処置する能力を予測する方法 Download PDF

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JP2014042531A JP2013246099A JP2013246099A JP2014042531A JP 2014042531 A JP2014042531 A JP 2014042531A JP 2013246099 A JP2013246099 A JP 2013246099A JP 2013246099 A JP2013246099 A JP 2013246099A JP 2014042531 A JP2014042531 A JP 2014042531A
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アゴールニク セルゲイ
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Abstract

【課題】がんを処置する能力を予測する方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者におけるがんを処置する能力を予測する方法、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者におけるがんの増殖を阻害する能力を予測する方法、およびゼアラレノンアナログ化合物が被験者におけるがんのアポトーシスの活性化を促進する能力を予測する方法を提供する。被験者におけるがんを処置する方法もまた提供される。本発明は、被験者におけるがんがゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に対し感受性であるか否かをを決定する方法にもまた関連する。
【選択図】なし

Description

（関連出願）
この出願は２００７年１０月２９日に出願された米国仮出願第６１／０００，７９６号（名称は「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｇｎｏｓｉｎｇ ｔｈｅ Ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａ Ｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ Ａｎａｌｏｇ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｔｏ ｔｒｅａｔ Ｃａｎｃｅｒ」）に対し優先権を主張する。この出願の全容が本明細書において援用される。
（背景技術）
米国内、さらに実際は世界中で報告されたがんの症例の増加した件数は、重大な関心事である。現在、特定の型のがんに対し利用可能な処置はわずかに一握りであり、さらにこれらは成功の完全な保証を提供してはいない。最も有効にするために、これらの処置はがんの初期での検出だけでなく、そのがんが公知の化合物を用いて効果的に処置され得るか否かの信頼できる評価、およびある被験者のあるがんが処置に対して感受性であるか否かの信頼できる決定を必要とする。
ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ ＭＡＰＫシグナル伝達経路における変異は、形質転換された細胞株中でしばしば観察され、かつ、ヒトのがんと頻繁に関連付けられる。例えば、非特許文献１は、悪性メラノーマの６７％、および結腸直腸がんの１２％においてＢＲＡＦ（ＲＡＦのアイソフォームであるＢＲＡＦタンパク質をコードしている）体細胞ミスセンス変異を同定した。この経路における変異は、甲状腺がん（例えば、乳頭甲状腺癌）、膵臓がん、脳腫瘍（例えば、原発性脳腫瘍）、卵巣がん、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病および／または急性リンパ球芽性白血病（ＡＬＬ））、乳がん、神経がん（例えば、神経膠腫、神経芽細胞腫または網膜芽細胞腫）、多発性骨髄腫、メラノーマ（例えば、転移性メラノーマ）、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、およびＢ細胞リンパ腫とも関連付けられ得る。
最近、ゼアラレノンアナログ（ｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ）化合物は、特有の複数キナーゼ阻害プロフィールを有することが発見された。これは、ＭＡＰＫシグナル伝達経路における変異に関連した特異的ながんに対し有用であり得る（例として、２００７年７月２５日に出願された米国出願第６０／９５１，９０６号、および２００８年７月２５日に出願された米国出願第１２／１８０，４０８号を参照のこと。これらはそれぞれその全容が、本明細書において明示的に援用される）。しかしながら、しばしば、特定のがん細胞は化学療法の薬物を用いた処置に対し耐性である。ゼアラレノンアナログ化合物を含む公知の化学療法の薬物は、公知のがんの全てを処置することに対しては有効であり得ない。そこで、ゼアラレノンアナログ化合物などの化学療法の化合物がある被験者のあるがんを処置する能力を予測する方法の必要性が、当該分野において存在する。さらに、特定のがん細胞は時間と共に化学療法の化合物を用いた処置に対して耐性となり得る。それゆえ、ある被験者のあるがんが化学療法の化合物（例えば、ゼアラレノンアナログ化合物）を用いた処置に対し感受性か否かを決定する方法の必要性もまた、当該分野において存在する。
Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２００２、４１７、９４９−９５４
（発明の概要）
本発明はゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する（例えば、増殖を阻害する）能力を予測する方法を提供する。本発明は、活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達、または活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達および野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を有するがん細胞株が、ゼアラレノンアナログ化合物を用いた処置に対し感受性であるという発見を、少なくとも一部基礎としている。本発明は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−８）のレベルまたは特定の他の応答マーカー（例えば、フォスフォＥＲＫ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ、フォスフォｐＲＢ、およびｐ２７）のレベルが、被験者のがんがゼアラレノンアナログ化合物を用いた処置に対し感受性であるか否かを決定するために用いられ得るという発見もまた、少なくとも一部基礎としている。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ゼアラレノンアナログ化合物が被験者におけるがんを処置する能力を予測する方法であって、該方法は：
ａ）該被験者に由来するサンプルが、コントロールサンプルと比較して、活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定する工程；および
ｂ）該サンプルが、コントロールサンプルと比較して、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定する工程、を含み、
ここで、工程ａ）およびｂ）において決定される該サンプルにおける活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達および野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達は、ゼアラレノンアナログ化合物が該被験者の該がんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が該被験者の該がんを処置する能力を予測する、方法。
（項目２）
項目１の方法であって、ここで前記サンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定する工程は、該サンプルにおいてＢＲＡＦ遺伝子内の変異を同定する工程を含み、そしてここで該サンプルにおけるＢＲＡＦ遺伝子内の変異の存在は活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達の指標である、方法。
（項目３）
項目２の方法であって、ここでＢＲＡＦ遺伝子内の前記変異が、Ｖ６００Ｅ、Ｇ４６４Ｅ、Ｇ４６４Ｖ、Ｇ４６６Ａ、Ｇ４６６Ｅ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６９Ａ、Ｇ４６９Ｅ、Ｅ５８６Ｋ、Ｆ５９５Ｌ、Ｇ５９６Ｒ、Ｌ５９７Ｖ、Ｌ５９７Ｒ、Ｌ５９７ＳおよびＶ６００Ｄからなる群から選択される、方法。
（項目４）
項目１の方法であって、ここで前記サンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定する工程は、該サンプルにおいてＢＲＡＦ活性を測定する工程を含み、そしてここでコントロールサンプルと比較して、該サンプルにおけるＢＲＡＦ活性の上昇は活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達の指標である、方法。
（項目５）
項目１の方法であって、ここで前記サンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定する工程は、該サンプルにおいてＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２からなる群から選択される一つまたはそれより多いタンパク質の活性を測定する工程を含み、そしてここでコントロールサンプルと比較して、該サンプル中の一つまたはそれより多い該タンパク質の活性における上昇は活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達の指標である、方法。
（項目６）
項目１の方法であって、ここで前記サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定する工程は、該サンプルにおけるＰＴＥＮ遺伝子の変異の状態を決定する工程を含み、そしてここで該サンプルにおいてＰＴＥＮ遺伝子の変異が無いことは野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達の指標である、方法。
（項目７）
項目１の方法であって、ここで前記サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定する工程は、該サンプルにおける全ＡＫＴタンパク質のレベルと比較してまたはコントロールサンプルと比較して、該サンプルにおけるリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルを決定する工程を含み、そしてここで該サンプルにおけるリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルは野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達の指標である、方法。
（項目８）
項目７の方法であって、ここでＡＫＴリン酸化のレベルがウェスタンブロッティング、免疫組織化学（ＩＨＣ）または蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって決定される、方法。
（項目９）
項目１の方法であって、ここで前記サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定する工程は、該サンプルにおけるＡＫＴタンパク質の活性を測定する工程を含み、そしてここでコントロールサンプルと比較して、該サンプルにおけるＡＫＴタンパク質の活性の低から中程度のレベルは野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達の指標である、方法。
（項目１０）
ゼアラレノンアナログ化合物が被験者におけるがんを処置する能力を予測する方法であって、該方法は：
ａ）該被験者に由来するサンプルが、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異を提示するか否かを決定する工程；および
ｂ）該サンプルにおける全ＡＫＴタンパク質のレベルと比較してまたはコントロールサンプルと比較して、該サンプルにおけるリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルを決定する工程、を含み、
ここで、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異の存在および工程ｂ）において決定される該サンプルにおけるリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルは、ゼアラレノンアナログ化合物が該被験者の該がんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が該被験者の該がんを処置する能力を予測する、方法。
（項目１１）
ゼアラレノンアナログ化合物が被験者におけるがんを処置する能力を予測する方法であって、該方法は：
ａ）該被験者に由来するサンプルが、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異を提示するか否かを決定する工程；および
ｂ）該サンプルが野生型ＰＴＥＮ配列を提示するか否かを決定する工程、を含み、
ここで、該サンプルにおけるＢＲＡＦ遺伝子内の変異の存在および野生型ＰＴＥＮ配列は、ゼアラレノンアナログ化合物が該被験者の該がんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が該被験者の該がんを処置する能力を予測する、方法。
（項目１２）
前記被験者からのサンプルにおいてＡＫＴタンパク質の活性を測定する工程をさらに含む項目１１の方法であって、ここでコントロールサンプルと比較して、該サンプルにおけるＡＫＴタンパク質の活性の低から中程度のレベルは、ゼアラレノンアナログ化合物が該被験者の前記がんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が該被験者の該がんを処置する能力を予測する、方法。
（項目１３）
前記被験者からのサンプルにおける全ＡＫＴタンパク質のレベルと比較してまたはコントロールサンプルと比較して、該サンプルにおけるリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルを決定する工程をさらに含む項目１１の方法であって、ここで該サンプルにおける全ＡＫＴタンパク質のレベルと比較してまたはコントロールサンプルと比較して、該サンプルにおけるリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルは、ゼアラレノンアナログ化合物が該被験者の前記がんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が該被験者の該がんを処置する能力を予測する、方法。
（項目１４）
ゼアラレノンアナログ化合物が被験者におけるがんを処置する能力を予測する方法であって、該方法は：
ａ）該被験者に由来するサンプルが、ＢＲＡＦ遺伝子内にＶ６００Ｅ変異を提示するか否かを決定する工程；および
ｂ）該サンプルにおける全ＡＫＴタンパク質のレベルと比較してまたはコントロールサンプルと比較して、該サンプルにおけるリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルを決定する工程、を含み、
ここで、ＢＲＡＦ遺伝子内のＶ６００Ｅ変異の存在および工程ｂ）において決定される該サンプルにおけるリン酸化されたＡＫＴの低から中程度のレベルは、ゼアラレノンアナログ化合物が該被験者の該がんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が該被験者の該がんを処置する能力を予測する、方法。
（項目１５）
項目１、１０、１１および１４の何れか一つの方法であって、ここで前記被験者由来の前記サンプルが腫瘍生検である、方法。
（項目１６）
項目１０または１１の何れか一つの方法であって、ここでＢＲＡＦ遺伝子内の前記変異がＶ６００Ｅである、方法。
（項目１７）
項目１０または１１の何れか一つの方法であって、ここでＢＲＡＦ遺伝子内の前記変異がＢＲＡＦのキナーゼドメイン内の変異である、方法。
（項目１８）
項目１０または１１の何れか一つの方法であって、ここでＢＲＡＦ遺伝子内の前記変異が、Ｖ６００Ｅ、Ｇ４６４Ｅ、Ｇ４６４Ｖ、Ｇ４６６Ａ、Ｇ４６６Ｅ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６９Ａ、Ｇ４６９Ｅ、Ｅ５８６Ｋ、Ｆ５９５Ｌ、Ｇ５９６Ｒ、Ｌ５９７Ｖ、Ｌ５９７Ｒ、Ｌ５９７ＳおよびＶ６００Ｄからなる群から選択される、方法。
（項目１９）
項目１０または１１の何れか一つの方法であって、ここで前記サンプルがＢＲＡＦ遺伝子内に変異を提示するか否かを決定する工程が、該サンプルの、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応、逆転写酵素ＰＣＲ分析、一本鎖高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二本鎖分析、サザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、およびデオキシリボ核酸配列決定からなる群から選択される技術を用いて成し遂げられる、方法。
（項目２０）
項目１０または１４の何れか一つの方法であって、ここで前記サンプルにおけるリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルが、ウェスタンブロット、免疫組織化学（ＩＨＣ）または蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって決定される、方法。（項目２１）
項目１０または１４の何れか一つの方法であって、ここで前記サンプルにおける全ＡＫＴタンパク質のレベルと比較して、該サンプルにおけるリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルが決定され、そしてここで該サンプルにおけるリン酸化されたＡＫＴタンパク質の前記低から中程度のレベルが、該サンプルにおける全ＡＫＴタンパク質のレベルと比較して約レベル１から約レベル４である、方法。
（項目２２）
項目１、１０、１１および１４の何れか一つの方法であって、ここで前記ゼアラレノンアナログ化合物が：
Figure 2014042531
である化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩もしくはエステルである、方法。
（項目２３）
項目１、１０、１１および１４の何れか一つの方法であって、ここで前記ゼアラレノンアナログ化合物が：
Figure 2014042531
である化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩もしくはエステルである、方法。
（項目２４）
被験者におけるがんがゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に対し感受性であるか否かを決定する方法であって、該方法は：
ａ）該ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に、該被験者から得られるサンプルにおけるサイトカインの発現レベルを測定する工程；
ｂ）該ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に、該被験者から得られるサンプルにおける該サイトカインの発現レベルを測定する工程；
ｃ）該ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に得られるサンプルにおける該サイトカインの発現レベルを、該ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に得られるサンプルにおける該サイトカインの発現レベルと比較する工程
を含み、ここで、該ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に得られる該サンプルにおける発現レベルと比較して、該ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に得られる該サンプルにおける発現レベルの低下は、該被験者の該がんが、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に感受性であることの指標である、方法。
（項目２５）
項目２４の方法であって、ここで工程ａ）およびｂ）においてサイトカインの発現レベルが、該サイトカインのｍＲＮＡのレベルを測定することによって測定される、方法。
（項目２６）
項目２４の方法であって、ここで工程ａ）およびｂ）においてサイトカインの発現レベルが、サイトカインタンパク質のレベルを測定することによって測定される、方法。
（項目２７）
項目２４の方法であって、ここで前記サイトカインがＩＬ−８である、方法。
（項目２８）
項目２４の方法であって、ここで前記サイトカインがＩＬ−６である、方法。
（項目２９）
被験者におけるがんがゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に対し感受性であるか否かを決定する方法であって、該方法は：
ａ）該ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に、該被験者から得られるサンプルにおける応答マーカーのレベルを測定する工程、ここで応答マーカーはフォスフォＥＲＫ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、フォスフォｐＲＢ、および（ｐ２７）からなる群から選択されるマーカーである；
ｂ）該ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に、該被験者から得られるサンプルにおける該応答マーカーのレベルを測定する工程；
ｃ）該ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に得られる該サンプルにおける該応答マーカーのレベルを、該ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に得られる該サンプルにおける該応答マーカーのレベルと比較する工程、
を含み、ここで該ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に得られる該サンプルにおける該応答マーカーのレベルと比較して、該ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に得られる該サンプルにおけるフォスフォＥＲＫ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、およびフォスフォｐＲＢからなる群から選択される該応答マーカーのレベルの低下、または応答マーカー（ｐ２７）のレベルの上昇は、該被験者の該がんがゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に対し感受性であることの指標である、方法。
（項目３０）
被験者におけるがんを処置する方法であって：
ａ）活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達について、コントロールサンプルと比較して該被験者由来のサンプルの評価の結果を見きわめる工程および野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達について、コントロールサンプルと比較して該被験者由来のサンプルの評価の結果を見きわめる工程；ならびに
ｂ）該評価の結果、該サンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達および野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を示す場合、該被験者へ治療上有効な量のゼアラレノンアナログ化合物を含む組成物を投与する工程
を含む、方法。
（項目３１）
項目１、１０、１１、１４および３０の何れか一つの方法であって、ここで前記がんがＢＲＡＦが変異したがんである、方法。
（項目３２）
項目３０の方法であって、ここで前記ＢＲＡＦが変異したがんが、転移性メラノーマ、乳頭甲状腺癌、結腸直腸癌、および原発性脳腫瘍からなる群から選択される、方法。
（項目３３）
項目１、１０、１１、１４および３０の何れか一つの方法であって、ここで前記がんがメラノーマ、甲状腺がん、結腸直腸がん、膵臓がん、脳腫瘍、卵巣がん、白血病、神経がん、神経膠腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫からなる群から選択される、方法。
（項目３４）
ゼアラレノンアナログ化合物が被験者におけるがんを処置する能力を予測するためのキットであって、該キットは：
ａ）サンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定する工程のための試薬；および
ｂ）該サンプルが、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定する工程のための試薬、
を含む、キット。
（項目３５）
項目３４のキットであって、ここで前記サンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定するための前記試薬が、ＢＲＡＦ変異を同定するためのプローブである、キット。
（項目３６）
項目３４のキットであって、ここで前記サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定するための前記試薬が、野生型ＰＴＥＮ配列を同定するためのプローブである、キット。
（項目３７）
項目３４のキットであって、ここで前記サンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定するための前記試薬が抗体である、キット。
（項目３８）
項目３４のキットであって、ここで前記サンプルが野生型のシグナル伝達を提示するか否かを決定するための前記試薬がＰＴＥＮ抗体である、キット。
（項目３９）
ゼアラレノンアナログ化合物が被験者におけるがんを処置する能力を予測する方法であって、該方法は、該被験者由来のサンプルがＢＲＡＦ遺伝子内の変異を提示するか否かを提示する工程を含み、ここでコントロールサンプルと比較して、該サンプルにおけるＢＲＡＦ遺伝子内の変異の存在は、ゼアラレノンアナログ化合物が該被験者の該がんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が該被験者の該がんを処置する能力を予測する、方法。
（項目４０）
項目３９の方法であって、ここでＢＲＡＦ遺伝子内の前記変異がＶ６００Ｅである、方法。
（項目４１）
項目３９の方法であって、ここでＢＲＡＦ遺伝子内の前記変異がＢＲＡＦのキナーゼドメイン内の変異である、方法。
（項目４２）
項目３９の方法であって、ここでＢＲＡＦ遺伝子内の前記変異がＶ６００Ｅ、Ｇ４６４Ｅ、Ｇ４６４Ｖ、Ｇ４６６Ａ、Ｇ４６６Ｅ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６９Ａ、Ｇ４６９Ｅ、Ｅ５８６Ｋ、Ｆ５９５Ｌ、Ｇ５９６Ｒ、Ｌ５９７Ｖ、Ｌ５９７Ｒ、Ｌ５９７ＳおよびＶ６００Ｄからなる群から選択される、方法。
（項目４３）
項目３９の方法であって、ここで前記サンプルがＢＲＡＦ遺伝子内に変異を提示するか否かを決定する工程が、該サンプルの、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応、逆転写酵素ＰＣＲ分析、一本鎖高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二本鎖分析、サザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、およびデオキシリボ核酸配列決定からなる群から選択される技術を用いて成し遂げられる、方法。
（項目４４）
項目３９の方法であって、ここで前記サンプルがＢＲＡＦ遺伝子内に変異を提示するか否かを決定する工程が該サンプルにおけるＢＲＡＦ活性を測定する工程を含み、そしてここでコントロールサンプルと比較して、該サンプルにおけるＢＲＡＦ活性の上昇はＢＲＡＦ遺伝子内の変異の指標である、方法。
（項目４５）
ゼアラレノンアナログ化合物が被験者におけるがんを処置する能力を予測する方法であって、該方法は、該サンプルにおける全ＡＫＴタンパク質のレベルと比較してまたはコントロールサンプルと比較して、該サンプルにおけるリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルを決定する工程を含み、ここで該サンプルにおける全ＡＫＴタンパク質のレベルと比較してまたはコントロールサンプルと比較して、該サンプルにおけるリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルは、ゼアラレノンアナログ化合物が該被験者の該がんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が該被験者の該がんを処置する能力を予測する、方法。
（項目４６）
項目４５の方法であって、ここでＡＫＴリン酸化のレベルがウェスタンブロッティング、免疫組織化学（ＩＨＣ）または蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって決定される、方法。
（項目４７）
ゼアラレノンアナログ化合物が被験者におけるがんを処置する能力を予測する方法であって、該方法は、該被験者からのサンプルにおけるＡＫＴタンパク質の活性を測定する工程を含み、ここでコントロールサンプルと比較して、該サンプルにおけるＡＫＴタンパク質の低から中程度の活性レベルは、ゼアラレノンアナログ化合物が該被験者の該がんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が該被験者の該がんを処置する能力を予測する、方法。
（項目４８）
ゼアラレノンアナログ化合物が被験者におけるがんを処置する能力を予測する方法であって、該方法は、該被験者からのサンプルにおけるＰＴＥＮの変異の状態を決定する工程を含み、ここでコントロールサンプルと比較して、該サンプルにおけるＰＴＥＮ内に変異が存在しないことは、ゼアラレノンアナログ化合物が該被験者の該がんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が該被験者の該がんを処置する能力を予測する、方法。
（項目４９）
項目４８の方法であって、ここで前記サンプルはＰＴＥＮ内に変異が存在しないことを提示するか否かを決定する工程が、該サンプルの、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応、逆転写酵素ＰＣＲ分析、一本鎖高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二本鎖分析、サザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、およびデオキシリボ核酸配列決定からなる群から選択される技術を用いて成し遂げられる、方法。
（項目５０）
ゼアラレノンアナログ化合物が被験者におけるがんを処置する能力を予測する方法であって、該方法はａ）該被験者に由来するサンプルが、ＢＲＡＦ遺伝子内に変異を提示するか否かを決定する工程；およびｂ）コントロールサンプルと比較して、該サンプルにおけるＡＫＴタンパク質の発現レベルを決定する工程、を含み、ここでＢＲＡＦ遺伝子内の変異の存在および工程ｂ）において決定されるＡＫＴタンパク質の低から中程度の発現レベルは、ゼアラレノンアナログ化合物が該被験者の該がんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が該被験者の該がんを処置する能力を予測する、方法。
ＢＲＡＦの変異状態（例えばＶ６００Ｅ）およびＰＴＥＮの変異状態（フォスフォＡＫＴレベルまたはＡＫＴ発現を通して、必要に応じ読み取り可能である）は、患者の選別に対して有用なマーカーとして同定された。変異ＢＲＡＦ、低から中程度のフォスフォＡＫＴレベル、または変異ＢＲＡＦおよび低から中程度のフォスフォＡＫＴレベルを有する患者は、化合物１０６などのゼアラレノンアナログ化合物に対し反応することが予測される。一旦処置されたら、薬物処置への応答の初期の薬力学的兆候は、サイトカインのレベルの低下（血漿ＩＬ−６またはＩＬ−８レベルの低下など）を測定することによって決定され得る。
フォスフォＥＲＫ、サイクリンＤ１および／もしくはフォスフォｐＲＢなどの薬力学的マーカーの低下、またはＣＤＫインヒビターであるｐ２７の上昇は、ゼアラレノンアナログ化合物を用いた処置への応答に対する、更なる代替マーカーを提供する。総合して、これらの知見は、ゼアラレノンアナログ化合物のためのバイオマーカープログラムを作成すること（これは患者の価値を高める戦略を提供する）と同様に、処置に対する追跡調査のための様式（薬力学的モニタリングによる薬物応答の初期の評価を有する）を作成することも可能にする。
一つの局面において、本発明はゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する方法を提供する。この方法はａ）被験者由来のサンプルが、コントロールサンプルと比較して活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定すること；およびｂ）このサンプルがコントロールサンプルと比較して野生型のＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することを含む。ここで、ａ）およびｂ）の工程において決定される活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達および野生型のＰＩ３Ｋシグナル伝達は、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する。
別の局面において、本発明はゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する方法を提供する。この方法はａ）被験者由来のサンプルが、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異を提示するか否かを決定すること；およびｂ）このサンプル中の全ＡＫＴタンパク質レベルまたはコントロールサンプルと比較して、このサンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルを決定することを含む。ここで、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異の存在およびｂ）の工程において決定される、リン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルは、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する。
別の局面において、本発明はゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する方法を提供する。この方法はａ）被験者由来のサンプルが、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異を提示するか否かを決定すること；およびｂ）コントロールサンプルと比較して、このサンプル中のＡＫＴタンパク質の発現レベルを決定することを含む。ここで、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異の存在およびｂ）の工程において決定される、ＡＫＴタンパク質の低から中程度の発現レベルは、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する。
さらに別の局面において、本発明はゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する方法を提供する。この方法はａ）被験者由来のサンプルが、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異を提示するか否かを決定すること；およびｂ）このサンプルが野生型ＰＴＥＮ配列を提示するか否かを決定することを含む。ここで、サンプル中のＢＲＡＦ遺伝子内の変異の存在および野生型ＰＴＥＮ配列は、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する。
一つの実施形態において、この方法は、被験者由来のサンプルにおけるＡＫＴタンパク質の活性を測定することをさらに含む。ここで、コントロールサンプルと比較して、このサンプルにおけるＡＫＴタンパク質の低から中程度の活性レベルは、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する。
別の実施形態において、この方法は、被験者由来のサンプルにおけるリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルを、このサンプルにおける全ＡＫＴタンパク質のレベルまたはコントロールサンプルと比較して決定することをさらに含む。ここで、このサンプルにおける全ＡＫＴタンパク質のレベルまたはコントロールサンプルと比較して、このサンプルにおけるリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルは、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する。
別の局面において、本発明はゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する方法を提供する。この方法はａ）被験者由来のサンプルが、ＢＲＡＦ遺伝子内にＶ６００Ｅ変異を提示するか否かを決定すること；およびｂ）このサンプル中の全ＡＫＴタンパク質のレベルまたはコントロールサンプルと比較して、このサンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルを決定することを含む。ここで、ＢＲＡＦ遺伝子内のＶ６００Ｅ変異の存在およびｂ）の工程において決定される、リン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルは、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する。
別の局面において、本発明はゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する方法を提供する。この方法はａ）被験者由来のサンプルが、ＢＲＡＦ遺伝子内にＶ６００Ｅ変異を提示するか否かを決定すること；およびｂ）コントロールサンプルと比較して、このサンプル中のＡＫＴタンパク質の発現レベルを決定することを含む。ここで、ＢＲＡＦ遺伝子内のＶ６００Ｅ変異の存在およびｂ）の工程において決定される、ＡＫＴタンパク質の低から中程度の発現レベルは、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する。
別の局面において、本発明はゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する方法を提供する。この方法は、被験者由来のサンプルがＢＲＡＦ遺伝子内に変異を提示するか否かを決定することを含む。ここで、コントロールサンプルと比較して、このサンプル中のＢＲＡＦ遺伝子内の変異の存在は、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する。
さらに別の局面において、本発明はゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する方法を提供する。この方法は、被験者由来のサンプルにおけるリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルを、このサンプル中の全ＡＫＴタンパク質のレベルまたはコントロールサンプルと比較して決定することを含む。ここで、このサンプル中の全ＡＫＴタンパク質のレベルまたはコントロールサンプルと比較して、このサンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルは、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する。
さらに別の局面において、本発明はゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する方法を提供する。この方法は、被験者由来のサンプル中のＡＫＴタンパク質の発現レベルを、コントロールサンプルと比較して決定することを含む。ここで、ＡＫＴタンパク質の低から中程度の発現レベルは、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する。一つの実施形態において、発現のレベルはｍＲＮＡのレベルを測定することによって決定される。別の実施形態において、発現のレベルはタンパク質のレベルでＡＫＴのレベルを測定することによって決定される。
さらなる局面において、本発明はゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する方法を提供する。この方法は、被験者由来のサンプル中のＡＫＴタンパク質の活性を測定することを含む。ここで、コントロールサンプルと比較して、このサンプル中のＡＫＴタンパク質の低から中程度の活性レベルは、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する。
さらに別の局面において、本発明はゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する方法を提供する。この方法は、被験者由来のサンプル中のＰＴＥＮの変異の状態を決定することを含む。ここで、コントロールサンプルと比較して、このサンプル中のＰＴＥＮが変異を有しないことは、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する。
一つの実施形態において、がんはＢＲＡＦが変異したがんである。別の実施形態において、ＢＲＡＦが変異したがんは、転移性メラノーマ、乳頭甲状腺癌、結腸直腸癌、および原発性脳腫瘍からなる群から選択される。
別の実施形態において、がんは固形の腫瘍ならびに白血病、リンパ腫、および骨髄腫を含む血液学的悪性腫瘍からなる群から選択される。例えば、がんは、乳がん、メラノーマ、卵巣がん、甲状腺がん、膵臓がん、結腸直腸がん、脳腫瘍、神経がん、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫などの神経膠腫、多形神経膠芽腫もしくは他のＣＮＳ腫瘍、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、非ホジキンＢ細胞リンパ腫）、または多発性骨髄腫であり得る。
一つの実施形態において、ゼアラレノンアナログ化合物は、この化合物である：
Figure 2014042531
 別の実施形態において、ゼアラレノンアナログ化合物は、この化合物である：
Figure 2014042531
 ＢＲＡＦ遺伝子は、細胞質のセリン／スレオニンキナーゼであるＢＲＡＦをコードする。ＢＲＡＦ遺伝子内の体細胞変異は、ヒトのがんにおいて一般的である。多くのそのような変異は、コードされるタンパク質のキナーゼドメインに影響し（キナーゼドメイン変異）、そしてコードされる変異ＢＲＡＦタンパク質のキナーゼ活性の上昇を導く。これらの変異は、ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ ＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化を導き得る。
別の実施形態において、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異は、キナーゼドメイン内の変異である。例えば、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異は、ＢＲＡＦのキナーゼ活性の上昇を導くキナーゼドメイン変異であり得る。別の実施形態において、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異は、Ｖ６００Ｅであり得る。さらに別の実施形態において、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異は、Ｖ６００Ｅ、Ｇ４６４Ｅ、Ｇ４６４Ｖ、Ｇ４６６Ａ、Ｇ４６６Ｅ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６９Ａ、Ｇ４６９Ｅ、Ｅ５８６Ｋ、Ｆ５９５Ｌ、Ｇ５９６Ｒ、Ｌ５９７Ｖ、Ｌ５９７Ｒ、Ｌ５９７ＳおよびＶ６００Ｄからなる群から選択される。
一つの実施形態において、サンプルがＢＲＡＦ遺伝子内の変異を提示するか否かを決定することは、サンプルの、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応、逆転写酵素ＰＣＲ分析、一本鎖高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二本鎖分析、サザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、およびデオキシリボ核酸配列決定からなる群から選択される技術を用いて成し遂げられる。
別の実施形態において、サンプルがＢＲＡＦ遺伝子内の変異を提示するか否かを決定することは、サンプル中のＢＲＡＦ活性（例えば、ＢＲＡＦのタンパク質キナーゼ活性）を測定することを含む。ここで、コントロールサンプルと比較して、このサンプル中のＢＲＡＦ活性の上昇は、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異を示している。
別の実施形態において、ＡＫＴリン酸化のレベルは、ウェスタンブロット、免疫組織化学（ＩＨＣ）、または蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって決定される。別の実施形態において、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルは、サンプル中の全ＡＫＴタンパク質のレベルと比較して、約レベル１から約レベル４である。
一つの実施形態において、サンプルが、ＰＴＥＮ内に変異を有しないことを提示するか否かを決定することは、サンプルの、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応、逆転写酵素ＰＣＲ分析、一本鎖高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二本鎖分析、サザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、およびデオキシリボ核酸配列決定からなる群から選択される技術を用いて成し遂げられる。
一つの実施形態において、被験者由来のサンプルは腫瘍生検である。
別の実施形態において、サンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、サンプル中のＢＲＡＦ遺伝子内の変異を同定することを含む。ここで、サンプル中のＢＲＡＦ遺伝子内の変異の存在は、活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を示す。活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を示すＢＲＡＦ遺伝子内の変異は、コードされるタンパク質のキナーゼ活性を上昇させるキナーゼドメインの変異などの、機能獲得型変異を含む。さらに別の実施形態において、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異は、Ｖ６００Ｅ、Ｇ４６４Ｅ、Ｇ４６４Ｖ、Ｇ４６６Ａ、Ｇ４６６Ｅ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６９Ａ、Ｇ４６９Ｅ、Ｅ５８６Ｋ、Ｆ５９５Ｌ、Ｇ５９６Ｒ、Ｌ５９７Ｖ、Ｌ５９７Ｒ、Ｌ５９７ＳおよびＶ６００Ｄからなる群から選択される。
別の実施形態において、サンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、サンプル中のＢＲＡＦタンパク質キナーゼ活性を測定することを含む。ここで、コントロールサンプルと比較して、サンプル中のＢＲＡＦ活性の上昇は、活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を示す。
別の実施形態において、サンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、サンプル中のＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２からなる群から選択される一つまたはそれより多いタンパク質の活性を測定することを含む。ここで、コントロールサンプルと比較して、サンプル中のタンパク質の活性（例えば、タンパク質キナーゼ活性）の上昇は、活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を示している。
別の実施形態において、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、サンプル中のＰＴＥＮ遺伝子の変異の状態を決定することを含む。ここで、サンプル中のＰＴＥＮ遺伝子内に機能喪失型変異が無いことは、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を示す。ＰＴＥＮ遺伝子（第１０染色体上から欠失されるフォスファターゼおよびテンシンホモログともいわれる）は、タンパク質フォスファターゼ活性（セリン／スレオニン／チロシンフォスファターゼ）および脂質フォスファターゼ活性を有するタンパク質をコードしている。ＰＴＥＮは腫瘍抑制遺伝子であり、ＰＩ３Ｋ活性の負の調節因子である。ＰＴＥＮ遺伝子の体細胞変異は、様々なヒトのがんで発見されている。ＰＴＥＮ遺伝子内における機能喪失型変異は、同定されている。例えば、ＰＴＥＮ遺伝子のエキソン７および８は、（Ａ）６リピートを含んでおり、そのような配列は変異の標的である（例えば、フレームシフト）。エキソン７の（Ａ）６リピート内の１塩基対欠失、またはエキソン８の（Ａ）６リピート内の１塩基対欠失はヒトのがんにおいて観察されている。これらの領域内のフレームシフトもまた、ヒトのがんにおいて観察されている（Ｇｕａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．、９（２）：２８３−２８７（２０００）。ＰＴＥＮ遺伝子内の機能喪失型変異（例えば、欠失、挿入、点変異）は、ＰＴＥＮのタンパク質および／または脂質フォスファターゼ活性を低下させ得、ＰＩ３Ｋへの調節の解除およびその後のＡＫＴの活性化が生じ得る。したがって、ＰＴＥＮ遺伝子内に機能喪失型変異が無いことまたは野生型のＰＴＥＮ配列は、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定するために用いられ得る。反対に、ＰＴＥＮ内の機能喪失型変異の検出は、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を示すことにならない。
別の実施形態において、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、コントロールと比較して、サンプル中のＰＴＥＮプロモーターのＤＮＡ高度メチル化を検出することを含む。ＰＴＥＮ活性は、多くの原発性および転移性のヒトのがんにおいて、プロモーターメチル化サイレンシングによって失われ得る。これは腫瘍抑制遺伝子の不活性化に代わるメカニズムとして認識される現象である。（Ｃａｒｎｅｒｏ
ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ、８（３）：１８７−９８（２００８）；Ｍｉｒｍｏｈａｍｍａｄｓａｄｅｇｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６６（１３）：６５４６−５２（２００６）もまた参照のこと）。メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ．、１１３（９）：２４４０−７（２００８））または定量的位置メチル化分析（パイロシークエンシング）（Ｍｉｒｍｏｈａｍｍａｄｓａｄｅｇｈ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６６（１３）：６５４６−５２（２００６））などのあらゆる適した方法が、ＤＮＡ高度メチル化またはＣｐＧアイランド高度メチル化を検出するため用いられ得る。
一つの実施形態において、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、サンプル中の全ＡＫＴタンパク質レベルと比較して、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルを決定することを含む。ここで、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルは、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を示す。別の実施形態において、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、コントロールサンプルと比較して、リン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルを決定することを含む。ここで、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルは、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を示す。いくつかの実施形態において、ＡＫＴリン酸化のレベルは、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学（ＩＨＣ）または蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって決定される。
別の実施形態において、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、コントロールサンプルと比較して、被験者由来のサンプル中のＡＫＴタンパク質の発現レベルを決定することを含む。ここで、コントロールサンプルと比較して、サンプル中のＡＫＴタンパク質の低から中程度の発現レベルは、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を示す。
別の実施形態において、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、サンプル中のＡＫＴタンパク質の活性を測定することを含む。ここで、コントロールサンプルと比較して、サンプル中のＡＫＴタンパク質の低から中程度の活性レベルは、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を示す。
別の実施形態において、これらの方法の組合せが、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定するために用いられ得る。例えば、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、（ａ）サンプル中のＰＴＥＮ遺伝子の変異の状態を決定すること、および／またはＰＴＥＮプロモーターのＤＮＡ高度メチル化を検出すること；ならびに（ｂ）サンプル中の全ＡＫＴタンパク質のレベルと比較して、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルを決定すること；コントロールサンプルと比較して、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルを決定すること；コントロールサンプルと比較して、サンプル中のＡＫＴタンパク質の活性を測定すること；および／またはコントロールサンプルと比較して、被験者由来のサンプル中のＡＫＴタンパク質の発現レベルを決定することを含み得る。
別の局面において、本発明は、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんの増殖を阻害する能力を予測する方法を提供する。この方法は：ａ）コントロールサンプルと比較して、被験者由来のサンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定すること；ｂ）コントロールサンプルと比較して、被験者由来のサンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することを含む。ここで、コントロールサンプルと比較して、サンプル中の活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達および野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達は、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんの増殖を阻害する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんの増殖を阻害する能力を予測する。
別の実施形態において、本発明は、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんのアポトーシスの活性化を促進する能力を予測する方法を提供する。この方法は：ａ）コントロールサンプルと比較して、被験者由来のサンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定すること；ｂ）コントロールサンプルと比較して、被験者由来のサンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することを含む。ここで、コントロールサンプルと比較して、サンプル中の活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達および野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達は、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんのアポトーシスの活性化を促進する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんのアポトーシスの活性化を促進する能力を予測する。
本発明は、被験者のがんを処置する種々の方法もまた提供する。いくつかの実施形態において、被験者のがんを処置する方法は、ａ）本明細書に記載されているように、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する方法のステップを実行すること、および工程ａ）の結果がゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有することを示す場合、ｂ）被験者へ治療上有効な量のゼアラレノンアナログ化合物を含む組成物を投与することを含む。他の実施形態において、被験者のがんを処置する方法は、ａ）本明細書に記載されているように、被験者由来のサンプルの評価の結果を見きわめること、および工程ａ）の結果がゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有することを示す場合、ｂ）被験者へ治療上有効な量のゼアラレノンアナログ化合物を含む組成物を投与することを含む。
本発明は、被験者のがんがゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に対し感受性であるか否かを決定する方法もまた、提供する。一つの実施形態において、この方法は、ａ）ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に、被験者から得られるサンプル中のサイトカインの発現レベルを測定すること：ｂ）ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に、被験者から得られるサンプル中のサイトカインの発現レベルを測定すること；ｃ）ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に得られるサンプル中のサイトカインの発現レベルを、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に得られるサンプル中のサイトカインの発現レベルと比較することを含む。ここで、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に得られるサンプル中の発現レベルと比較して、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に得られるサンプル中の発現レベルの低下は、被験者のがんが、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に感受性であることを示す。好ましい実施形態において、サイトカインはＩＬ−６およびＩＬ−８からなる群から選択される。
別の局面において、本発明は、被験者のがんがゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に対し感受性であるか否かを決定する方法を提供する。この方法は：ａ）ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に、被験者から得られるサンプル中の応答マーカーのレベルを測定すること、ここで応答マーカーはフォスフォＥＲＫ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、フォスフォｐＲＢ、およびｐ２７からなる群から選択されるマーカーである；ｂ）ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に、被験者から得られるサンプル中の応答マーカーのレベルを測定すること；ｃ）ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に得られるサンプル中の応答マーカーのレベルを、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に得られるサンプル中の応答マーカーのレベルと比較することを含む。ここで、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に得られるサンプル中の応答マーカーのレベルと比較して、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に得られるサンプル中のフォスフォＥＲＫ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、およびフォスフォｐＲＢからなる群から選択される応答マーカーのレベルの低下、または応答マーカーｐ２７のレベルの上昇は、被験者のがんがゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に対し感受性であることを示す。
別の局面において、本発明は、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を評価するための試薬の使用に対し、向けられる。この使用は：ａ）コントロールサンプルと比較して、被験者由来のサンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定すること；およびｂ）コントロールサンプルと比較して、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することを含む。ここで、工程ａ）およびｂ）において決定される、サンプル中の活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達および野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達は、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有することを示す。
別の局面において、本発明は、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を評価するための試薬の使用に対し、向けられる。この使用は：ａ）被験者由来のサンプルがＢＲＡＦ遺伝子内の変異を提示するか否かを決定すること；およびｂ）サンプル中の全ＡＫＴタンパク質のレベルまたはコントロールサンプルと比較して、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルを決定することを含む。ここで、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異の存在および工程ｂ）において決定されるサンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルは、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有することを示す。
別の局面において、本発明は、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を評価するための試薬の使用に対し、向けられる。この使用は：ａ）被験者由来のサンプルがＢＲＡＦ遺伝子における変異を提示するか否かを決定すること；およびｂ）このサンプルが野生型のＰＴＥＮ配列を提示するか否かを決定することを含む。ここで、サンプル中のＢＲＡＦ遺伝子における変異の存在および野生型のＰＴＥＮ配列は、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有することを示す。
別の局面において、本発明は、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を評価するための試薬の使用に対し、向けられる。この使用は：ａ）被験者由来のサンプルがＢＲＡＦ遺伝子におけるＶ６００Ｅ変異を提示するか否かを決定すること；およびｂ）サンプル中の全ＡＫＴタンパク質のレベルまたはコントロールサンプルと比較して、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルを決定することを含む。ここで、ＢＲＡＦ遺伝子におけるＶ６００Ｅ変異の存在および工程ｂ）において決定されるリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルは、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有することを示す。
別の実施形態において、被験者のがんを処置する方法は、ａ）ＢＲＡＦ遺伝子における変異の存在に関し、被験者由来のサンプルの評価の結果を見きわめること、および評価の結果、サンプルがＢＲＡＦ遺伝子における変異（例えば、ＢＲＡＦ遺伝子におけるＶ６００Ｅ変異）を提示する場合；ｂ）被験者へ治療上有効な量のゼアラレノンアナログ化合物を含む組成物を投与することを含む。
さらに別の実施形態において、被験者のがんを処置する方法は、ａ）サンプル中の全ＡＫＴタンパク質のレベルまたはコントロールサンプルと比較して、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルに関して被験者由来のサンプルの評価の結果を見きわめること、および評価の結果、サンプルがリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルを提示することを示す場合、ｂ）被験者へ治療上有効な量のゼアラレノンアナログ化合物を含む組成物を投与することを含む。
さらなる実施形態において、被験者のがんを処置する方法は、ａ）サンプル中の全ＡＫＴタンパク質のレベルまたはコントロールサンプルと比較して、サンプル中のＡＫＴタンパク質の活性に関して被験者由来のサンプルの評価の結果を見きわめること、および評価の結果、サンプルがＡＫＴタンパク質の低から中程度の活性レベルを提示することを示す場合；ｂ）被験者へ治療上有効な量のゼアラレノンアナログ化合物を含む組成物を投与することを含む。
さらに別の実施形態において、被験者のがんを処置する方法は、ａ）ＰＴＥＮ遺伝子の変異の状態に関して被験者由来のサンプルの評価の結果を見きわめること、および評価の結果、サンプルが野生型ＰＴＥＮ配列を提示することを示す場合；ｂ）被験者へ治療上有効な量のゼアラレノンアナログ化合物を含む組成物を投与することを含む。
一つの実施形態において、がんはＢＲＡＦが変異したがんである。別の実施形態において、ＢＲＡＦが変異したがんは、転移性メラノーマ、乳頭甲状腺癌、結腸直腸癌、および原発性脳腫瘍からなる群から選択される。
別の実施形態において、がんは固形の腫瘍ならびに白血病、リンパ腫、および骨髄腫を含む血液学的悪性腫瘍からなる群から選択される。例えば、がんは、乳がん、メラノーマ、卵巣がん、甲状腺がん、膵臓がん、結腸直腸がん、脳腫瘍、神経がん、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫などの神経膠腫、多形神経膠芽腫もしくは他のＣＮＳ腫瘍、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、非ホジキンＢ細胞リンパ腫）、または多発性骨髄腫であり得る。
一つの実施形態において、ゼアラレノンアナログ化合物はこの化合物である：
Figure 2014042531
 別の実施形態において、ゼアラレノンアナログ化合物はこの化合物である：
Figure 2014042531
 別の実施形態において、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異はキナーゼドメイン内の変異である。別の実施形態において、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異はＶ６００Ｅである。さらに別の実施形態において、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異はＶ６００Ｅ、Ｇ４６４Ｅ、Ｇ４６４Ｖ、Ｇ４６６Ａ、Ｇ４６６Ｅ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６９Ａ、Ｇ４６９Ｅ、Ｅ５８６Ｋ、Ｆ５９５Ｌ、Ｇ５９６Ｒ、Ｌ５９７Ｖ、Ｌ５９７Ｒ、Ｌ５９７ＳおよびＶ６００Ｄからなる群から選択される。
一つの実施形態において、サンプルがＢＲＡＦ遺伝子内の変異を提示するか否かを決定することは、サンプルの、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応、逆転写酵素ＰＣＲ分析、一本鎖高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二本鎖分析、サザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、およびデオキシリボ核酸配列決定からなる群から選択される技術を用いて成し遂げられる。
別の実施形態において、サンプルがＢＲＡＦ遺伝子内の変異を提示するか否かを決定することは、サンプル中のＢＲＡＦ活性を測定することを含む。ここで、コントロールサンプルと比較して、このサンプル中のＢＲＡＦ活性の上昇は、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異を示している。
別の実施形態において、ＡＫＴリン酸化のレベルは、ウェスタンブロット、免疫組織化学（ＩＨＣ）、または蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって決定される。別の実施形態において、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルは、サンプル中の全ＡＫＴタンパク質のレベルと比較して、約レベル１から約レベル４である。
一つの実施形態において、サンプルが、ＰＴＥＮ内に変異を有しないことを提示するか否かを決定することは、サンプルの、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応、逆転写酵素ＰＣＲ分析、一本鎖高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二本鎖分析、サザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、およびデオキシリボ核酸配列決定からなる群から選択される技術を用いて成し遂げられる。
一つの実施形態において、被験者由来のサンプルは腫瘍生検である。
別の実施形態において、サンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、サンプル中のＢＲＡＦ遺伝子内の変異を同定することを含む。ここで、サンプル中のＢＲＡＦ遺伝子内の変異の存在は、活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を示す。活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を示すＢＲＡＦ遺伝子内の変異は、コードされるタンパク質のキナーゼ活性を上昇させるキナーゼドメインの変異などの、機能獲得型変異を含む。さらに別の実施形態において、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異は、Ｖ６００Ｅ、Ｇ４６４Ｅ、Ｇ４６４Ｖ、Ｇ４６６Ａ、Ｇ４６６Ｅ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６９Ａ、Ｇ４６９Ｅ、Ｅ５８６Ｋ、Ｆ５９５Ｌ、Ｇ５９６Ｒ、Ｌ５９７Ｖ、Ｌ５９７Ｒ、Ｌ５９７ＳおよびＶ６００Ｄからなる群から選択される。
別の実施形態において、サンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、サンプル中のＢＲＡＦタンパク質キナーゼ活性を測定することを含む。ここで、コントロールサンプルと比較して、サンプル中のＢＲＡＦ活性の上昇は、活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を示す。別の実施形態において、サンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、サンプル中のＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２からなる群から選択される一つまたはそれより多いタンパク質の活性を測定することを含む。ここで、コントロールサンプルと比較して、サンプル中のタンパク質の活性（例えば、タンパク質キナーゼ活性）の上昇は、活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を示している。
別の実施形態において、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、サンプル中のＰＴＥＮ遺伝子の変異の状態を決定することを含む。ここで、サンプル中のＰＴＥＮ遺伝子内に機能喪失型変異が無いことは、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を示す。
一つの実施形態において、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、サンプル中の全ＡＫＴタンパク質レベルと比較して、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルを決定することを含む。ここで、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルは、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を示す。別の実施形態において、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、コントロールサンプルと比較して、リン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルを決定することを含む。ここで、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルは、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を示す。いくつかの実施形態において、ＡＫＴリン酸化のレベルは、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学（ＩＨＣ）または蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって決定される。
別の実施形態において、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、サンプル中のＡＫＴタンパク質の活性を測定することを含む。ここで、コントロールサンプルと比較して、サンプル中のＡＫＴタンパク質の低から中程度の活性レベルは、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を示す。
また別の局面において、本発明は、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を評価するための試薬の使用に対し、向けられる。この使用は：ａ）ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に、被験者から得られるサンプル中のサイトカインの発現レベルを測定すること；ｂ）ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に、被験者から得られるサンプル中のサイトカインの発現レベルを測定すること；ｃ）ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に得られるサンプル中の発現レベルを、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に得られるサンプル中の発現レベルと比較することを含む。ここで、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に得られるサンプル中のサイトカインの発現レベルと比較して、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に得られるサンプル中のサイトカインの発現レベルの低下は、被験者のがんが、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に感受性であることを示す。好ましい実施形態において、サイトカインはＩＬ−６およびＩＬ−８からなる群から選択される。
また別の局面において、本発明は、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を評価するための試薬の使用に対し、向けられる。この使用は：ａ）ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に、被験者から得られるサンプル中の応答マーカーのレベルを測定すること、ここで応答マーカーはフォスフォＥＲＫ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、フォスフォｐＲＢ、およびｐ２７からなる群から選択されるマーカーである；ｂ）ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に、被験者から得られるサンプル中の応答マーカーのレベルを測定すること；ｃ）ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に得られるサンプル中の応答マーカーのレベルを、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に得られるサンプル中の応答マーカーのレベルと比較することを含む。ここで、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に得られるサンプル中の応答マーカーのレベルと比較して、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に得られるサンプル中のフォスフォＥＲＫ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、およびフォスフォｐＲＢからなる群から選択される応答マーカーのレベルの低下、または応答マーカーｐ２７のレベルの上昇は、被験者のがんがゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に対し感受性であることを示す。
別の局面において、本発明は、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測するためのキットを提供する。このキットは、サンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定することのための試薬（例えばプローブまたは抗体）、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することのための試薬（例えばプローブまたは抗体）を含む。一つの実施形態において、サンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定することのための試薬は、ＢＲＡＦ変異を同定するためのプローブである。別の実施形態において、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することのための試薬は、野生型ＰＴＥＮ配列を同定するためのプローブである。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記述および特許請求の範囲から明白になる。
図１は、ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋシグナル伝達経路を要約している概略図である。 図２は、ＡＫＴのリン酸化状態が、様々ながん細胞株の化合物１０６に対する感受性に影響することを実証しているグラフである。 図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄは、本明細書に記載されている実験で用いられているがん細胞株を要約しているグラフおよび表である。これらの表は、いくつかの種類のがん細胞株における化合物１０６および化合物０９１に対するＩＣ５０値もまた要約している。 図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄは、本明細書に記載されている実験で用いられているがん細胞株を要約しているグラフおよび表である。これらの表は、いくつかの種類のがん細胞株における化合物１０６および化合物０９１に対するＩＣ５０値もまた要約している。 図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄは、本明細書に記載されている実験で用いられているがん細胞株を要約しているグラフおよび表である。これらの表は、いくつかの種類のがん細胞株における化合物１０６および化合物０９１に対するＩＣ５０値もまた要約している。 図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄは、本明細書に記載されている実験で用いられているがん細胞株を要約しているグラフおよび表である。これらの表は、いくつかの種類のがん細胞株における化合物１０６および化合物０９１に対するＩＣ５０値もまた要約している。 図４は、化合物１０６に対して感受性である患者のエンリッチメント（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）のための予測バイオマーカーの使用および化合物１０６を用いる処置後の患者の応答を決定するための代替応答マーカーの使用を実証している概略図である。 図５は、ＢＲＡＦ変異がん細胞がプロ炎症性サイトカインインターロイキン８（ＩＬ−８）を産生することを実証しているグラフである。 図６は、ＬＯＸメラノーマ細胞において、ＩＬ−６およびＩＬ−８産出は、化合物１０６によってインビトロで阻害されることを実証しているグラフである。 図７は、化合物１０６に感受性である担腫瘍マウスは、化合物１０６を用いる処置後の血漿ＩＬ−８レベルにおいて有意な低下を示すことを実証している。ここで、化合物１０６に耐性である担腫瘍マウスは、化合物１０６を用いる処置後の血漿ＩＬ−８レベルにおいて有意な変化を示さない。 図８は、化合物１０６を用いる処置後の、いくつかの種類の応答マーカー（例えばフォスフォＥＲＫ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、ｐ２７およびフォスフォｐＲＢ）のタンパク質レベルを実証しているウェスタンブロットのセットである。 図９Ａおよび９Ｂは、ＬＯＸメラノーマ異種移植片における、フォスフォｐＲＢおよびフォスフォＥＲＫの染色を実証している免疫組織化学（ＩＨＣ）染色である。 図９Ａおよび９Ｂは、ＬＯＸメラノーマ異種移植片における、フォスフォｐＲＢおよびフォスフォＥＲＫの染色を実証している免疫組織化学（ＩＨＣ）染色である。 図１０は、化合物１０６を用いる処置に対するｓ．ｃ．ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ神経膠芽腫腫瘍の応答を実証しているグラフである。 図１１は、化合物１０６を用いる処置に対するｓ．ｃ．ＬＯＸメラノーマ腫瘍の応答を実証しているグラフである。
（発明の詳細な記述）
ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ ＭＡＰＫシグナル伝達経路は、多様な型の細胞における細胞増殖を調節している。この経路における変異は、形質転換された細胞株においてしばしば観察され、かつ、ヒトのがんと頻繁に関連付けられる（例えば、Ｗａｌｌａｃｅ
ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５：２１５−２１９）。本発明の局面は、活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達、または活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達および野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を有するがん細胞株が、ゼアラレノンアナログ化合物（例えば、化合物１０６）を用いる処置に対し感受性であるという発見を、少なくとも一部基礎としている。本発明は、とりわけ、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する方法を提供する。
本発明の他の局面は、特定のタンパク質のレベルは、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置への応答に対する代替マーカーとして用いられ得るという発見を少なくとも一部基礎としている。ならびに、本発明は被験者のがんがゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に対し感受性であるか否かを決定することにおいて有用な方法を提供する。
特許請求の範囲の主題についてより明らかにかつ簡潔に記載するため、以下の定義は、本明細書で用いられる特異的な用語の意味としての手引きを提供することが意図される。
（定義）
本明細書で用いられる場合、単数形「ある、一つの（ａ、ａｎ）」および「この、その（ｔｈｅ）」は、異なる明記がなされない限り、「少なくとも一つの（ａｔ ｌｅａｓｔ
ｏｎｅ）」および「一つまたはそれより多い（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」を含む。したがって、例えば、参考として「ある薬理学的に許容可能な担体」は、二つまたはそれより多い担体の混合物および一つの担体を含み得る。
本明細書で用いられる場合、用語「予測」、「予測する」、もしくは「予測すること」は、経過または結果の見込みの予想をいう。具体的には、「ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測すること」は、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置するために有用であろうという予想をいう。例えば、この発明の予測方法は、サンプルが、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有するか否かを予想することに用いられ得る特異的な特性（例えば、活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異、ＡＫＴリン酸化の状態、および／または野生型ＰＴＥＮ配列）を提示するか否かを決定することを提供する。
本明細書で用いられる場合、「処置する」、「処置」、「処置すること」もしくは「処置される」は、がんが治療される、治癒される、緩和される、軽減される、治される、改善される、または好転されることをいう。例えば、この発明の予測方法は、ゼアラレノンアナログ化合物が、特異的ながんもしくはがんの特異的なクラスの進行を、遅らせ得るまたは止め得るか否かを決定することにおいて有用である。
本明細書で用いられる場合、「被験者」は、哺乳類（ヒト、霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のウシの、ヒツジの、ウマの、イヌの、ネコの、げっ歯動物のもしくはマウスの種を含むが、これらに制限されない）などの動物をいう。いくつかの実施形態において、被験者はヒトである。
本明細書で用いられる場合、用語「活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達」は、ＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性もしくは機能の上昇に関連付けられるまたは影響されるシグナル伝達をいう（図１を参照のこと）。ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ ＭＡＰＫシグナル伝達経路は、幅広い範囲のヒトの腫瘍からの細胞の、増殖および生存の調節におけるその中心的な役割に基づいて、抗がん治療に対する重要な経路としてみなされている。本発明の一つの実施形態において、サンプルが「活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達」を提示するか否かを決定することは、サンプル中のＢＲＡＦ遺伝子内の変異を同定することを含む。ここで、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異（例えば、Ｖ６００Ｅ）の存在は、活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を示す。別の実施形態において、サンプルが「活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達」を提示するか否かを決定することは、サンプル中のＢＲＡＦタンパク質キナーゼ活性を測定することを含む。ここで、コントロールサンプルと比較して、サンプル中のＢＲＡＦタンパク質キナーゼ活性の上昇は、活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を示す。別の実施形態において、サンプルが「活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達」を提示するか否かを決定することは、サンプル中のＭＡＰＫシグナル伝達経路に含まれるタンパク質（ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＥＲＫ１、および／もしくはＥＲＫ２、またはこの経路に含まれているとして当該分野で周知のあらゆるタンパク質など、例えば図１において明らかにされているタンパク質）の活性を測定することを含む。ここで、コントロールサンプルと比較して、サンプル中のタンパク質の活性の上昇は、活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を示す。
本明細書で用いられる場合、用語「野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達」は、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の通常の活性または機能に、関連付けられるシグナル伝達ををいう（図１を参照のこと）。ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路は、細胞におけるアポートシスの調節におけるその中心的な役割に基づき、抗がん治療に対する重要な経路である。本発明の一つの実施形態において、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、このサンプルが野生型ＰＴＥＮ配列を提示するか否かを決定することを含む。ここで、サンプル中のＰＴＥＮ遺伝子内に変異を有しないことは、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を示す。別の実施形態において、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、サンプル中のＰＴＥＮの活性（例えば、フォスファターゼ活性）を測定することを含む。ここで、コントロールサンプルと比較して、サンプル中のＰＴＥＮ活性の低から中程度のレベルは、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を示す。別の実施形態において、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルを決定することを含む。ここで、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルは、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を示す。別の実施形態において、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、サンプル中のＡＫＴタンパク質キナーゼの活性を測定することを含む。ここで、コントロールサンプルと比較して、サンプル中のＡＫＴタンパク質のタンパク質キナーゼ活性の低から中程度のレベルは、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を示す。さらに別の実施形態において、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達は、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路（ＡＫＴ、ＢＡＤ、ＢＣＬ−ＸＬ、Ｃａｓｐａｓｅ ９、ＰＤＫ、ＡＦＸもしくは図１において明らかにされているあらゆるタンパク質を含む）に含まれるあらゆるタンパク質の活性または変異の状態を測定することによって決定され得る。
「サンプルが変異を提示するか否かを決定する方法」は、当該分野で利用可能な技術（例えば、サンプルのデオキシリボ核酸配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、逆転写酵素ＰＣＲ分析、一本鎖高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二本鎖分析、サザンブロット分析、またはウェスタンブロット分析）などのあらゆる適切な方法を用いて達成され得る。これらの技術は当業者に周知であり、かつ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、（この全容が本明細書において援用される）に一般的に記述されている。サンプルが変異を提示するか否かを決定することは、変異の存在（例えば、キナーゼドメイン内）に関しての、遺伝子の全体または一部の検査を伴ない得る。
本明細書で用いられる場合、用語「ＢＲＡＦ遺伝子内の変異」は、ＢＲＡＦ機能の活性化もしくは獲得を導く一つまたはそれより多い変異を含むＢＲＡＦ遺伝子配列をいう。ＢＲＡＦ変異は当該分野で周知である。ＢＲＡＦ変異の概説については、Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ４１７：９４９−９５４およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｖｉｃｉａｎａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ３１１：１２８７−１２９０を参照のこと。ＢＲＡＦ遺伝子内の最も一般的な変異は、Ｖ６００Ｅ変異（Ｖ５９９Ｅ変異としてもともとは記載された）であると言及されており、かつ、ＢＲＡＦ変異の９０％を超える割合を占めている。上で引用されているＤａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｖｉｃｉａｎａ ｅｔ ａｌ．の文献中（各文献の全容が本明細書において援用される）に記載されているような、さらなる変異部位が当該分野において公知である。例えば、ＢＲＡＦ変異としてはＧ４６４Ｅ、Ｇ４６４Ｖ、Ｇ４６６Ａ、Ｇ４６６Ｅ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６９Ａ、Ｇ４６９Ｅ、Ｅ５８６Ｋ、Ｆ５９５Ｌ、Ｇ５９６Ｒ、Ｌ５９７Ｖ、Ｌ５９７Ｒ、Ｌ５９７ＳおよびＶ６００Ｄが挙げられる。
本明細書で用いられる場合、「ＲＡＦ」は、ＲＡＦタンパク質アイソフォームのＲＡＦ−１（Ｃ−ＲＡＦ）、ＢＲＡＦおよび／またはＡ−ＲＡＦを含む。
本明細書で用いられる場合、「ＥＲＫ」あるいは「ＥＲＫ１／２」は、リン酸化状態にかかわらず、細胞外シグナルに調節されるキナーゼＥＲＫ１および／またはＥＲＫ２をいう。「フォスフォＥＲＫ１」あるいは「ｐ−ＥＲＫ」は、フォスフォＥＲＫ１および／またはフォスフォＥＲＫ２をいう。
本明細書で用いられる場合、「ＡＫＴ」あるいは「ＡＫＴタンパク質」は、（リン酸化状態にかかわらず）ＡＫＴ１、ＡＫＴ２および／またはＡＫＴ３をいう。これらはタンパク質キナーゼのＡＫＴファミリーの一員である。「フォスフォＡＫＴ」あるいは「ｐ−ＡＫＴ」は、フォスフォＡＫＴ１、フォスフォＡＫＴ２および／またはフォスフォＡＫＴ３をいう。
いくつかの実施形態において、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルは、サンプル中の全ＡＫＴタンパク質のレベルと比較して決定される。他の実施形態において、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルは、コントロールサンプルと比較して決定される。
野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を有する細胞は、「リン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベル」を提示し得る。一方、活性化されたＰＩ３Ｋシグナル伝達は、ＡＫＴのリン酸化を高める。いくつかの実施形態において、リン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルは、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を有する正常な組織中のリン酸化されたＡＫＴのレベル（例えば、正常な組織サンプル中で観察されるフォスフォＡＫＴのレベルから決定される範囲）などのコントロールサンプルと比較して決定される。これらの実施形態において、「リン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベル」は、正常な組織中に観察されるレベル（例えば、正常な組織サンプル中に観察される正常な範囲内で減少した値）と類似する。いくつかの実施形態において、リン酸化されたＡＫＴのレベルは、他の被験者由来の腫瘍サンプル中のリン酸化されたＡＫＴのレベルなどのコントロールサンプルと比較して決定される。例えば、種々の被験者由来の腫瘍サンプル中のリン酸化されたＡＫＴのレベルは、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に対し感受性となる低から中程度のレベルを明確に定めるために決定され得、そして目的の被験者のサンプルがこれらと比較される。
サンプル中の全ＡＫＴタンパク質のレベルと比較して決定されるとき、「リン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベル」は、例えば、約７５％もしくはそれより少ない、約６０％もしくはそれより少ない、約５５％もしくはそれより少ない、約５０％もしくはそれより少ない、約４５％もしくはそれより少ない、約４０％もしくはそれより少ない、約３５％もしくはそれより少ない、約３０％もしくはそれより少ない、約２５％もしくはそれより少ない、約２０％もしくはそれより少ない、約１５％もしくはそれより少ない、約１０％もしくはそれより少ない、約９％もしくはそれより少ない、約８％もしくはそれより少ない、約７％もしくはそれより少ない、約６％もしくはそれより少ない、約５％もしくはそれより少ない、約４％もしくはそれより少ない、約３％もしくはそれより少ない、約２％もしくはそれより少ない、または約１％もしくはそれより少ないＡＫＴタンパク質がサンプル中でリン酸化されていることを示す。
一つの実施形態において、上記サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルは、このサンプル中の全ＡＫＴタンパク質のレベルの約１％から約７５％である。別の実施形態において、上記サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルは、このサンプル中の全ＡＫＴタンパク質のレベルの約１％から約４０％である。一つの実施形態において、上記サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルは、このサンプル中の全ＡＫＴタンパク質のレベルの約３０％から約４０％である。別の実施形態において、上記サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルは、このサンプル中の全ＡＫＴタンパク質のレベルの約１％から約１０％；約１％から約２０％；約１０％から約５０％；または約２０％から約５０％である。
リン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルは、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学（ＩＨＣ）、またはＦＩＳＨなどのあらゆる適切な方法を用いて決定され得る。好ましい実施形態において、ウェスタンブロッティングが、リン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルを決定するために用いられる。ウェスタンブロットを行った後、１から１０に格付けをするシステムが、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルの特徴づけをするために、用いられ得る。各例において、サンプル中の全ＡＫＴタンパク質のレベルはレベル１０が指定される。そして、この全ＡＫＴタンパク質のレベルは、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルと比較される。一つの実施形態において、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルは、サンプル中の全ＡＫＴタンパク質の７５％であり、そしてレベル７．５が指定される。別の実施形態において、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴのレベルは、サンプル中の全ＡＫＴタンパク質の５０％であり、そしてレベル５が指定される。別の実施形態において、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴのレベルは、サンプル中の全ＡＫＴタンパク質の４０％であり、そしてレベル４が指定される。別の実施形態において、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴのレベルは、サンプル中の全ＡＫＴタンパク質の３０％であり、そしてレベル３が指定される。別の実施形態において、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴのレベルは、サンプル中の全ＡＫＴタンパク質の２０％であり、そしてレベル２が指定される。別の実施形態において、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴのレベルは、サンプル中の全ＡＫＴタンパク質の１０％であり、そしてレベル１が指定される。別の実施形態において、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴのレベルは、サンプル中の全ＡＫＴタンパク質の５％であり、そしてレベル０．５が指定される。
この格付けをするシステムが用いられるとき、「リン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベル」は、７．５またはそれより低いレベル（例えば、７、６．５、６、５．５、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２，１．５、１、０．５または０．１）に相当する。いくつかの実施形態において、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルは、約レベル１から約レベル７．５、約レベル１から約レベル７、約レベル１から約レベル６、約レベル１から約レベル５、約レベル１から約レベル４、約レベル１から約レベル３、約レベル１から約レベル２、約レベル０．５から約レベル１、約レベル２から約レベル５、約レベル３から約レベル６、約レベル４から約レベル７または約レベル２から約レベル６である。
野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を有する細胞は、「ＡＫＴタンパク質の低から中程度の発現レベル」を提示し得る。一方、活性化したＰＩ３Ｋシグナル伝達は、ＡＫＴ発現を高める。いくつかの実施形態において、ＡＫＴタンパク質の発現レベルは、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を有する正常な組織中のＡＫＴの発現レベル（例えば、正常な組織サンプル中で観察されるＡＫＴの発現レベルから決定される範囲）などのコントロールサンプルと比較して決定される。これらの実施形態において、「ＡＫＴタンパク質の低から中程度の発現レベル」は、正常な組織中に観察されるレベル（例えば、正常な組織サンプル中に観察される正常な範囲内で減少した値）と類似する。いくつかの実施形態において、ＡＫＴの発現レベルは、他の被験者由来の腫瘍サンプル中のＡＫＴの発現レベルなどのコントロールサンプルと比較して決定される。例えば、種々の被験者由来の腫瘍サンプル中のＡＫＴの発現レベルは、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に対し感受性となる低から中程度のレベルを明確に定めるために決定され得、そして目的の被験者のサンプルがこれらと比較される。
本明細書で用いられる場合、用語「野生型ＰＴＥＮ配列」は、ＰＴＥＮ機能における喪失を導くあらゆる変異を含まないＰＴＥＮ配列または一つあるいはそれより多い変異のホットスポットについて調査されかつ調査が変異を明らかにしないＰＴＥＮ配列をいう。１００を超えるＰＴＥＮ変異が同定されており、かつ当該分野で周知である。ＰＴＥＮ変異の概説については、Ｇｕａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ９（２）：２８３−２８７（この全容が本明細書において援用される）を参照のこと。例えば、ＰＴＥＮ遺伝子配列のエキソン７および８は、（Ａ）６リピートならびにモノヌクレオチドリピート配列を含む。これらのサイトは、がんにおける変異の頻繁なターゲットである。最も頻繁には、エキソン７またはエキソン８の（Ａ）６リピート内の１塩基欠失が、未成熟での停止を引き起こし、このことが遺伝子機能の喪失を結果として導く。例えば、エキソン７および／またはエキソン８は、変異のホットスポットの例である。例えば、エキソン７および／またはエキソン８は配列決定され、もし変異が検出されないときは、その配列はこの試験の目的において「野生型ＰＴＥＮ配列」であると考えられ得る。
本明細書で用いられる場合、用語「ＢＲＡＦが変異したがん」は、ＢＲＡＦ機能の活性化または獲得を導くＢＲＡＦ遺伝子内の一つまたはそれより多い変異と関連付けられるがんをいう。ヒトのがんは、ＢＲＡＦ遺伝子内の体細胞ミスセンス変異をしばしば含む。（例えば、Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ４１７：９４９を参照のこと）。ＢＲＡＦ変異は、しばしばＢＲＡＦのキナーゼドメイン内に、優性変異であるＶ６００Ｅ（ＢＲＡＦ変異の９０％を占めている）を伴なって存在する。他のＢＲＡＦ変異としてはＧ４６４Ｅ、Ｇ４６４Ｖ、Ｇ４６６Ａ、Ｇ４６６Ｅ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６９Ａ、Ｇ４６９Ｅ、Ｅ５８６Ｋ、Ｆ５９５Ｌ、Ｇ５９６Ｒ、Ｌ５９７Ｖ、Ｌ５９７Ｒ、Ｌ５９７ＳおよびＶ６００Ｄが挙げられる。ＢＲＡＦ遺伝子内の変異の結果、ＢＲＡＦが変異したがんは、上昇したキナーゼ活性を実証し、ＭＥＫ（マイトジェンに活性化されるタンパク質キナーゼ／細胞外シグナルに調節されるキナーゼ）の活性化を導き、これがＥＲＫのリン酸化を引き起こし、そして下流の経路を活性化する。例示的なＢＲＡＦが変異したがんは、本明細書中でより詳細に論じられ、かつ、例えば、メラノーマ（例えば、転移性メラノーマ）、甲状腺がん（例えば、乳頭甲状腺癌）、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）脳腫瘍（例えば、原発性脳腫瘍、例えば、神経膠芽腫）、卵巣がん、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病および／または急性リンパ球芽性白血病（ＡＬＬ））、乳がん、神経がん（例えば、神経膠腫、神経芽細胞腫または網膜芽細胞腫）、多発性骨髄腫、ならびにＢ細胞リンパ腫を含み得る。上に記載されているように、「ＢＲＡＦに関連する」と指定されるがんは、これらの、ＢＲＡＦ内の特異的なタンパク質の変異との見かけ上の関連のため選び出されているがんである。
本明細書で用いられる場合、用語「耐性」は、被験者が時間とともにゼアラレノンアナログ化合物（例えば、化合物１０６）に対し反応が弱くなることをいう。それゆえ、いくつかの実施形態において、ゼアラレノンアナログ化合物への耐性は、この化合物に対して被験者の反応性が完全に無いことをいう（例えば、ここでの腫瘍の増殖の割合は阻害されない）。いくつかの実施形態において、ゼアラレノンアナログ化合物への耐性は、この化合物に対して被験者の反応性が部分的に無いことをいう（例えば、ここでの腫瘍の増殖の割合は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％または２５％の腫瘍の増殖の阻害というように、とても低い程度でのみ阻害される）。ゼアラレノンアナログ化合物へ耐性であることの性質は非常に変化するものであり、種々の腫瘍が、種々の条件下で、与えられたゼアラレノンアナログ化合物に対して種々のレベルでの「耐性」を提示する。他の実施形態において、ゼアラレノンアナログ化合物に対する耐性は、化合物の以前の投与と比較して、化合物に対する被験者の完全なまたは部分的な反応性の無さをいう。
本明細書で用いられる場合、用語「処置に対し感受性」は、被験者のがんが、ゼアラレノンアナログ化合物（例えば、化合物１０６）を用いる処置に対し反応性があることをいう。いくつかの実施形態において、ゼアラレノンアナログ化合物へのがんの完全な反応性が観察される（例えば、ここでの腫瘍の増殖は阻害される）。いくつかの実施形態において、ゼアラレノンアナログ化合物へのがんの部分的な反応性が観察される（例えば、ここでの腫瘍の増殖の割合は、約９５％、９０％、８５、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％または４０％の腫瘍の増殖の阻害というように、いくらかの程度まで阻害される）。ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に対し感受性であることの性質は様々であり得、種々の腫瘍が、種々の条件下で、与えられたゼアラレノンアナログ化合物に対して種々のレベルでの「感受性」を提示する。一つの実施形態において、用語、処置に対し感受性は、ゼアラレノンアナログ化合物を用いるがんの有効な処置をいう。
本明細書で用いられる場合、用語「応答マーカー」は、がんがゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に対し感受性であることの指標として、客観的に測定されるおよび評価される遺伝子のまたはタンパク質のマーカーをいう。本発明の応答マーカーは、サイトカイン（例えば、ＩＬ−８、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６またはＴＮＦα）であり得る。本発明の応答マーカーは、フォスフォＥＲＫ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、ｐ２７、フォスフォｐＲＢまたはフォスフォＡＫＴでもまたあり得る。応答マーカーのレベルは、定量ＰＣＲ、ウェスタンブロッティングもしくはＥＬＩＳＡの技術などのあらゆる適切な方法を用いて、ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルでマーカーの発現を決定することによって測定され得る。
多数の値および範囲が、本発明の種々の実施形態との関連の中で列挙される（例えば、組成物中に存在する本発明の化合物の量）。ここで、範囲が与えられるとき（例えば、ＸからＹ）、この範囲は、異なる記述が明示的になされない限り、Ｘ、ＹおよびＸとＹの間で低下する全ての値を含むことが理解される。用語「約」が、本明細書でパラメーター、範囲および量とともに用いられる場合、そのパラメーターまたは量は、定められているパラメーターまたは量の±１％以内であることを意味する。
（予測の方法）
本発明は、ゼアラレノンアナログ化合物が、ＢＲＡＦが変異したがん（例えば、メラノーマ（例えば、転移性メラノーマ）、甲状腺がん（例えば、乳頭甲状腺癌）、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、脳腫瘍（例えば、原発性脳腫瘍、神経膠芽腫）、卵巣がん、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病および／または急性リンパ球芽性白血病（ＡＬＬ））、乳がん、神経がん（例えば、神経膠腫、神経芽細胞腫または網膜芽細胞腫）、多発性骨髄腫、ならびにＢ細胞リンパ腫などのがんを処置する能力を予測するための方法を提供する。
一つの局面において、本発明の方法は、コントロールサンプルと比較して、がんを患っている被験者由来のサンプルが活性化したＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定することおよび／またはコントロールサンプルと比較して、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することを一般に含む。ここで、コントロールサンプルと比較して、サンプル中の活性化したＭＡＰＫシグナル伝達および／または野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達は、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有することを示し、これによってゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する。
ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ ＭＡＰＫシグナル伝達経路（図１を参照のこと）は、種々の型の細胞における細胞増殖を調節していると考えられる。この経路における変異は、形質転換された細胞株中でしばしば観察され、かつ、ヒトのがんと頻繁に関連付けられる。Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ４１７、９４９−９５４、２００２）は、ＢＲＡＦ（ＲＡＦのアイソフォームをコードしている）体細胞ミスセンス変異が、全ての悪性メラノーマの６７％、および全ての結腸直腸がんの１２％に生じていることを以前に発見した。ＢＲＡＦ変異は、ＢＲＡＦのキナーゼドメイン内の変異（ＢＲＡＦ変異の９０％を占める優性変異のＶ６００Ｅを有する）を一般的にコードする。他のＢＲＡＦ変異としてはＧ４６４Ｅ、Ｇ４６４Ｖ、Ｇ４６６Ａ、Ｇ４６６Ｅ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６９Ａ、Ｇ４６９Ｅ、Ｅ５８６Ｋ、Ｆ５９５Ｌ、Ｇ５９６Ｒ、Ｌ５９７Ｖ、Ｌ５９７Ｒ、Ｌ５９７ＳおよびＶ６００Ｄが挙げられる。ＢＲＡＦ遺伝子内の変異の結果、ＢＲＡＦが変異したがんは、上昇したキナーゼ活性を実証し、ＭＥＫ（マイトジェンに活性化されるタンパク質キナーゼ／細胞外シグナルに調節されるキナーゼキナーゼ）の活性化を導き、これがＥＲＫのリン酸化を引き起こし、そして下流の経路を活性化する。それゆえ、本発明は、がんを有する被験者由来のサンプル中のＭＡＰＫシグナル伝達のレベルを決定することによって、ゼアラレノンアナログ化合物ががんを処置する能力を予測するための新たな戦略を提供する。本発明は、がんを有する被験者由来のサンプルがＢＲＡＦ変異を提示するか否かを決定することによって、ゼアラレノンアナログ化合物ががんを処置する能力を予測するための新たな戦略もまた提供する。
特定の実施形態において、本発明の方法は、ゼアラレノンアナログ化合物が活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を有する腫瘍（ＢＲＡＦ変異を有する腫瘍を含むが、これに限定されない）を処置する能力を予測するために有用である。３種のタンパク質が、活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達（下の表１を参照のこと、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ：４、２００４中の表１から改変）に対する標的として、最も注目を受けている。これらの３種のタンパク質における変異は、ＭＥＫ−ＥＲＫ経路の活性化を導き得る。具体的には、卵巣がん、甲状腺がん、結腸直腸がんおよびメラノーマは、高頻度でＢＲＡＦ変異を示す。
（表１）
Figure 2014042531
 それゆえ、いくつかの実施形態において、サンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、コントロールサンプル（例えば、同じ被験者由来の正常な組織）と比較して、サンプル中のＢＲＡＦ遺伝子内の変異を同定することを含む。例えば、ＢＲＡＦ遺伝子内の変異は、Ｖ６００Ｅ（Ｖ５９９Ｅとしてもともとは記載された）、Ｇ４６４Ｅ（Ｇ４６３Ｅとしてもともとは記載された）、Ｇ４６４Ｖ（Ｇ４６５Ｖとしてもともとは記載された）、Ｇ４６６Ａ（Ｇ４６５Ａとしてもともとは記載された）、Ｇ４６６Ｅ（Ｇ４６５Ｅとしてもともとは記載された）、Ｇ４６６Ｖ（Ｇ４６５Ｖとしてもともとは記載された）、Ｇ４６９Ａ（Ｇ４６８Ａとしてもともとは記載された）、Ｇ４６９Ｅ（Ｇ４６８Ｅとしてもともとは記載された）、Ｅ５８６Ｋ（Ｅ５８５Ｋとしてもともとは記載された）、Ｆ５９５Ｌ（Ｆ５９４Ｌとしてもともとは記載された）、Ｇ５９６Ｒ（Ｇ５９５Ｒとしてもともとは記載された）、Ｌ５９７Ｖ（Ｌ５９６Ｖとしてもともとは記載された）、Ｌ５９７Ｒ（Ｌ５９６Ｒとしてもともとは記載された）、Ｌ５９７Ｓ（Ｌ５９６Ｓとしてもともとは記載された）またはＶ６００Ｄ（Ｖ５９９Ｄとしてもともとは記載された）であり得る。多くのこのような変異が公知であるので、このような変異を検出するときは、他の被験者の正常な組織由来の公知の野生型配列がコントロールとしてみなされ得る。
変異は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、逆転写酵素ＰＣＲ分析、一本鎖高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二本鎖分析、サザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、および遺伝子のデオキシリボ核酸配列決定などの、当該分野で公知の技術を含むあらゆる適切な方法によって決定され得る。これらの技術は当業者に周知であり、かつ、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（この全容が本明細書において援用される）に記述されている。
サンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、サンプル中のＲＡＦタンパク質キナーゼ（例えば、ＲＡＦ−１、Ａ−ＲＡＦ、ＢＲＡＦ）活性を測定することによってもまた達成され得る。ここでコントロールサンプルと比較して、サンプル中のＲＡＦタンパク質キナーゼ活性の上昇は、活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を示す。他の実施形態において、上記サンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、サンプル中のＭＡＰＫシグナル伝達経路に関与するタンパク質（ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２など、またはこの経路に含まれているとして当該分野で周知のあらゆるタンパク質、例えば図１において明らかにされているタンパク質）の活性を測定することを含む。ここで、コントロールサンプルと比較して、サンプル中のタンパク質の活性の上昇は、活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を示す。
タンパク質の活性は当該分野で公知のあらゆる種々の方法を含む、あらゆる適切な方法によって測定され得る。例えば、キナーゼ活性は、酵素が連結された免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、放射性の手段（例えば、３２Ｐもしくは３３Ｐのγリン酸基への取込み）を用いて下流のタンパク質のリン酸化状態を決定することによって、免疫沈降、ブロッティング、およびゲル電気泳動を含む標識された抗体を使用するアッセイによって、免疫組織化学によって、または蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって測定され得る。キナーゼ活性を測定するための他の方法は、ＷＯ９５／０４１３６、ＥＰ０７３０７４０Ｂ１、米国特許第５，５９９，６８１号、および米国特許第６，９４２，９８７号（これらはキナーゼ活性を測定するための方法に関連するため、これらのそれぞれの全容は、本明細書において援用される）に記載されている。例えば、ＲＡＦ−１またはＢＲＡＦキナーゼ活性はＲＡＦ−１免疫沈降キナーゼカスケードキットまたはＢＲＡＦキナーゼカスケードキット（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を用いて決定され得る。ならびに、ＭＥＫ／ＥＲＫ活性は一対のＭＥＫ／ＥＲＫ活性化アッセイ（例えば、Ｓｔｏｋｏｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６４：１４６３−１４６７を参照のこと）を用いて測定され得る。ＥＲＫ活性は、免疫沈降されたタンパク質を用いてまたはｐ４２／ｐ４４ＭＡＰキナーゼ酵素アッセイキット（例えば、Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８６：Ｆ４１７−Ｆ４２４を参照のこと）を使用して決定され得る。
いくつかの実施形態において、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、このサンプル中のＰＴＥＮ遺伝子の変異の状態を決定することを含む。ここで、サンプル中のＰＴＥＮ遺伝子内に機能喪失型変異が無いことは、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を示す。例えば、未成熟での停止を引き起こすエキソン７またはエキソン８の（Ａ）６リピート内の１塩基欠失が検出されるならば、この変異の存在は、ＰＩ３Ｋシグナル伝達は野生型と比較して変化していることを示す。ＰＴＥＮ変異の存在または存在しないことは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、逆転写酵素ＰＣＲ分析、一本鎖高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二本鎖分析、サザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、および遺伝子のデオキシリボ核酸配列決定を含む当該分野で公知の技術などの何れかの適切な方法によって決定され得る。
別の実施形態において、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルを測定することを含む。ここで、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴの低から中程度のレベルは、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を示す。いくつの実施形態において、ＡＫＴリン酸化のレベルの測定は、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学または蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって決定される。
上で示されているように、いくつの実施形態において、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルは、このサンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルとサンプル中の全ＡＫＴタンパク質のレベルとを比較して決定される。他の実施形態において、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルは、このサンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルとコントロールサンプルとを比較して決定される。
リン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルは、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学（ＩＨＣ）、またはＦＩＳＨなどのあらゆる適切な方法を用いて決定され得る。好ましい実施形態において、ウェスタンブロッティングが、リン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルを決定するために用いられる。本明細書で説明されているように、ウェスタンブロットを行った後、１から１０に格付けをするシステムが、サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルの特徴づけをするために用いられ得る。
他の実施形態において、サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定することは、サンプル中のＡＫＴタンパク質の活性を測定することを含む。ここで、コントロールサンプルと比較して、サンプル中のＡＫＴタンパク質の活性の上昇または低下が無いことは、野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を示す。タンパク質の活性は種々の方法よって測定され得る。例えば、キナーゼ活性は、酵素が連結された免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、放射性の手段（例えば、３２Ｐもしくは３３Ｐのγリン酸基への取込み）を用いて下流のタンパク質のリン酸化状態を決定することによって、免疫沈降、ブロッティング、およびゲル電気泳動を含む標識された抗体を使用するアッセイによって、免疫組織化学によって、または蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって測定され得る。キナーゼ活性を測定するための他の方法は、ＷＯ９５／０４１３６、ＥＰ０７３０７４０Ｂ１、米国特許第５，５９９，６８１号、および米国特許第６，９４２，９８７号に記載されている。
本発明の方法において有用なサンプルとしては、あらゆる組織、細胞、生検、体液サンプル、抽出物、画分またはそれらの成分（例えば、タンパク質もしくは核酸を含むサンプル）が挙げられる。例えば、サンプルは、組織、細胞、全血、血清、血漿、頬側を擦り取ったもの、唾液、脳脊髄液、尿、便、または気管支肺胞洗浄であり得る。一つの実施形態において、組織サンプルは、胃の組織サンプル、小腸の組織サンプル、大腸の組織サンプル、または皮膚のサンプルである。好ましい実施形態において、サンプルは腫瘍の生検サンプルであり、これは、腫瘍の生検由来の腫瘍の組織を含む。
サンプルはあらゆる適切な方法（例えば、生検を用いて、またはある領域を擦り取ることもしくはふき取ること、または体液を吸引するために針を用いることを含む）によって被験者から取得され得る。種々のサンプルを収集するための方法は、当該分野で周知である。被験者由来のサンプルは、そのような方法によって取得され得、かつ、必要に応じてさらなる処理の段階（例えば、凍結、分画、固定など）を受け得る。
ＭＡＰＫシグナル伝達またはＰＩ３Ｋシグナル伝達を検出することおよび定量化することに適した組織サンプルは、新鮮であり得、凍結され得、または当業者に公知の方法に従って固定され得る。適切な組織サンプルはさらなる分析のため、好ましくは切片にされ、そして顕微鏡のスライドの上に置かれる。また、固形のサンプル（すなわち組織サンプル）は、可溶化され得および／または均質化され得、そしてその後、可溶性抽出物として分析され得る。
一つの実施形態において、新たに取得された生検サンプルは、例えば、液体窒素またはジフルオロジクロロメタンを用いて凍結される。凍結されたサンプルは、切片にするために例えばＯＣＴを用いてマウントされ、そしてクリオスタット内で連続的に切片にされる。連続的な切片は、ガラス顕微鏡スライド上に収集される。免疫組織化学染色のため、切片がスライド上に固定されることを確実にするため、スライドは例えばクロムミョウバン、ゼラチンまたはポリＬリジンを用いて覆われ得る。別の実施形態において、サンプルは切片にする前に固定されそして包理される。例えば、組織サンプルは例えばホルマリン中で固定され得、段階的に脱水され得、そして例えばパラフィン中で包理され得る。フォスフォタンパク質が検出されるような実施形態においては、脱リン酸化のインヒビターがこの処理において用いられ得る。例えば、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＧｕａｒｄＴＭなどの試薬が、免疫組織化学のための標本またはサンプルを保存するために用いられ得る（例えば、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＧｕａｒｄＴＭ ＩＨＣ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））。
当業者は、問題のアッセイに対する適切なコントロールサンプルを選択し得る。例えば、正常な組織のサンプルは、（例えば、同じ被験者由来の）腫瘍組織のコントロールとして機能し得る。いくつかの実施形態において、被験者由来のサンプルは、正常な被験者から得られたサンプルと比較される。いくつかの場合において、正常な被験者もしくは正常な組織から得られたサンプル由来の野生型の配列情報または応答マーカーの発現のレベルは、コントロールとして機能し得、被験者から別個のコントロールサンプルを取得する必要を回避する。例えば、被験者がＢＲＡＦ遺伝子内に変異を提示するか否かを決定するとき、同じ被験者由来の正常な組織サンプルは、望む場合、コントロールとして用いられ得る。必要に応じて、Ｖ６００Ｅ、Ｇ４６４Ｅ、Ｇ４６４Ｖ、Ｇ４６６Ａ、Ｇ４６６Ｅ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６９Ａ、Ｇ４６９Ｅ、Ｅ５８６Ｋ、Ｆ５９５Ｌ、Ｇ５９６Ｒ、Ｌ５９７Ｖ、Ｌ５９７Ｒ、Ｌ５９７ＳおよびＶ６００ＤなどのＢＲＡＦを活性化する公知の変異の検出のため、他の被験者の正常な組織由来の公知の野生型配列は、コントロールとしてみなされ得る。本発明の方法において、各段階におけるコントロールサンプルは、適切なコントロールサンプルである。したがって、これらは、同じもしくは種々の組織および／または被験者由来であり得、かつ、問題の変異の状態、活性または応答マーカーを評価するために適切な様式で処理され得る。
一旦サンプルが取得されたら、ＭＡＰＫまたはＰＩ３Ｋシグナル伝達を（核酸のレベルもしくはタンパク質のレベルで）検出することおよび定量化することに適切であるあらゆる方法が用いられ得る。そのような方法は当該分野で周知であり、かつ、そのような方法としては、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、サザンブロット、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ（例えば、増幅されるＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、免疫蛍光、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）、核酸ハイブリダイゼーション技術、核酸逆転写法、ならびに核酸増幅法が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ＡＫＴ、フォスフォＡＫＴ、ＢＲＡＦ、ＰＴＥＮ、ＲＡＦ、ＢＲＡＦ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＥＲＫ、フォスフォＥＲＫ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、フォスフォｐＲＢ、およびｐ２７タンパク質の発現または活性のレベルが、タンパク質のレベルで、例えば米国特許第６，９８２，３１８号、米国特許出願公開第２００２／０１５０９５４号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００７／００２０２３２号明細書（これらのそれぞれの全容が本明細書において援用される）に記載されているような、これらのタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて検出される。
本発明は、被験者のがん（例えば、ＢＲＡＦが変異したがん）を処置する種々の方法もまた提供する。いくつかの実施形態において、被験者のがんを処置する方法は、ａ）本明細書に記載されているように、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する方法のステップを実行する工程、および工程ａ）の結果がゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有することを示す場合、ｂ）被験者へ治療上有効な量のゼアラレノンアナログ化合物を含む組成物を投与することを含む。
他の実施形態において、被験者のがんを処置する方法は、ａ）本明細書に記載されているように、被験者由来のサンプルの評価の結果を見きわめること、および工程ａ）の結果がゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を有することを示す場合、ｂ）被験者へ治療上有効な量のゼアラレノンアナログ化合物を含む組成物を投与することを含む。例えば、一つの実施形態において、被験者のがんを処置する方法は、ａ）活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達および野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達に関して、コントロールサンプルと比較して被験者由来のサンプルの評価の結果を見きめわること；および評価の結果が、サンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達および野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示することを示す場合、ｂ）被験者へ治療上有効な量のゼアラレノンアナログ化合物を含む組成物を投与することを含む。別の実施形態において、被験者のがんを処置する方法は、ａ）サンプル中のＢＲＡＦ遺伝子内の変異の存在およびリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルに関して、サンプル中の全ＡＫＴタンパク質のレベルまたはコントロールサンプルと比較して被験者由来のサンプルの評価の結果を見きめわること；および評価の結果が、サンプルがＢＲＡＦ遺伝子内の変異（例えば、ＢＲＡＦ遺伝子内のＶ６００Ｅ変異）およびリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルを提示することを示す場合、ｂ）被験者へ治療上有効な量のゼアラレノンアナログ化合物を含む組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態において、被験者のがんを処置する方法は、ａ）ＢＲＡＦ遺伝子内の変異の存在およびＰＴＥＮ遺伝子の変異の状態に関して、被験者由来のサンプルの評価の結果を見きめわること；および評価の結果が、サンプルがＢＲＡＦ遺伝子内の変異（例えば、ＢＲＡＦ遺伝子内のＶ６００Ｅ変異）および野生型ＰＴＥＮ配列を提示することを示す場合、ｂ）被験者へ治療上有効な量のゼアラレノンアナログ化合物を含む組成物を投与することを含む。別の実施形態において、被験者のがんを処置する方法は、ａ）ＢＲＡＦ遺伝子内の変異の存在に関して、被験者由来のサンプルの評価の結果を見きめわること；および評価の結果が、サンプルがＢＲＡＦ遺伝子内の変異（例えば、ＢＲＡＦ遺伝子内のＶ６００Ｅ変異）を提示することを示す場合、ｂ）被験者へ治療上有効な量のゼアラレノンアナログ化合物を含む組成物を投与することを含む。別の実施形態において、被験者のがんを処置する方法は、ａ）サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルに関して、サンプル中の全ＡＫＴタンパク質のレベルまたはコントロールサンプルと比較して被験者由来のサンプルの評価の結果を見きめわること；および評価の結果が、サンプルがリン酸化されたＡＫＴタンパク質の低から中程度のレベルを提示することを示す場合、ｂ）被験者へ治療上有効な量のゼアラレノンアナログ化合物を含む組成物を投与することを含む。別の実施形態において、被験者のがんを処置する方法は、ａ）サンプル中のＡＫＴタンパク質の発現レベルに関して、コントロールサンプルと比較して被験者由来のサンプルの評価の結果を見きめわること；および評価の結果が、サンプルがＡＫＴタンパク質の低から中程度の発現レベルを提示することを示す場合、ｂ）被験者へ治療上有効な量のゼアラレノンアナログ化合物を含む組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態において、被験者のがんを処置する方法は、ａ）サンプル中のＡＫＴタンパク質の活性に関して、サンプル中のＡＫＴタンパク質の活性またはコントロールサンプルと比較して被験者由来のサンプルの評価の結果を見きめわること；および評価の結果が、サンプルがＡＫＴタンパク質の低から中程度の活性レベルを提示することを示す場合、ｂ）被験者へ治療上有効な量のゼアラレノンアナログ化合物を含む組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態において、被験者のがんを処置する方法は、ａ）ＰＴＥＮ遺伝子の変異の状態に関して、被験者由来のサンプルの評価の結果を見きめわること；および評価の結果が、サンプルが野生型ＰＴＥＮ配列を提示することを示す場合、ｂ）被験者へ治療上有効な量のゼアラレノンアナログ化合物を含む組成物を投与することを含む。評価の結果を見きわめることは、被験者が処置から利益を得ることが可能か否かを決定することに関連した、サンプルの評価の結果の再検討を伴なう。
（がんがゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に対し感受性であるか否かを決定する方法）
本発明は、被験者のがんが、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる方法に対し感受性であるか否か決定する方法もまた提供する。一つの実施形態において、この方法は、ａ）処置前の被験者から得られるサンプル中の応答マーカーのレベルを測定すること、ここで応答マーカーは、サイトカイン、フォスフォＥＲＫ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、フォスフォｐＲＢ、またはｐ２７である；ｂ）処置後の被験者から得られるサンプル中の応答マーカーのレベルを測定すること；およびｃ）ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に得られるサンプル中の応答マーカーのレベルを、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に得られるサンプル中の応答マーカーのレベルと比較することを含む。ここで、処置前に得られるサンプル中の応答マーカーのレベルと比較して、処置後に得られるサンプル中のサイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−８）、フォスフォＥＲＫ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、もしくはフォスフォｐＲＢ応答マーカーのレベルの低下、または応答マーカーｐ２７のレベルの上昇は、被験者のがんが、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に対し感受性であることを示す。一つの実施形態において、この方法は、処置に対する感受性を決定するため、一つまたはそれより多いこれらのマーカーのいずれかの使用を含む。応答マーカーのレベルは、発現レベルを測定することによって測定され得る。一つの実施形態において、応答マーカーのレベルは、タンパク質のレベルを測定することによって測定される。別の実施形態において、応答マーカーのレベルは、ｍＲＮＡに対応するレベルを測定することによって測定される。いくつかの実施形態において、Ｋｉ−６７または細胞増殖核抗原（ＰＣＮＡ）などの増殖マーカーの発現レベルがモニターされ、これによって、応答マーカーの発現の低下が、処置の結果としての細胞の増殖の低下と関連付けされ得る（例えば、Ｋｉ−６７レベルは増殖が低下すると、低下する）。
一つの実施形態において、応答マーカーはサイトカインである。それゆえ、本発明は被験者のがんが、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる方法に対し感受性であるか否か決定する方法を提供する。この方法は、ａ）ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に上記被験者から得られるサンプル中のサイトカインの発現レベルを測定すること；ｂ）ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に上記被験者から得られるサンプル中の上記サイトカインの発現レベルを測定すること；ｃ）ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に得られるサンプル中のサイトカインのレベルを、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に得られるサンプル中のサイトカインのレベルと比較することを含む。ここで、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に得られるサンプル中の発現レベルと比較して、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に得られるサンプル中の発現レベルの低下は、被験者のがんが、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に対し感受性であることを示す。一つの実施形態において、発現のレベルは、ｍＲＮＡのレベルを測定することによって決定される。別の実施形態において、発現のレベルは、サイトカインのレベルを（タンパク質のレベルで）測定することによって決定される。
それゆえ、一つの局面において、本発明は、ａ）処置前の被験者から得られるサンプル中のサイトカイン（例えば、ＩＬ−８、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６またはＴＮＦα）のレベルを測定すること；ｂ）処置後の被験者から得られるサンプル中のサイトカインのレベルを測定すること；およびｃ）ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に得られるサンプル中のサイトカインのレベルを、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に得られるサンプル中のサイトカインのレベルと比較することを含む。ここで、処置前に得られるサンプル中のサイトカインのレベルと比較して、処置後に得られるサンプル中のサイトカインのレベルの低下は、被験者のがんが、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に対し感受性であることを示す。
好ましい実施形態において、サイトカインはＩＬ−８である。別の実施形態において、サイトカインはＩＬ−６である。別の実施形態において、サイトカインはＴＮＦαである。別の実施形態において、サイトカインはＩＬ−１である。さらに別の実施形態において、サイトカインはＩＬ−２である。別の実施形態において、サイトカインはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＧＦ−β、ＴＮＦα、またはＴＮＦβである。
一つの実施形態において、サンプル中のサイトカイン（例えば、ＩＬ−８、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６もしくはＴＮＦα）の発現レベルは、ＰＣＲ、標準のＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティングを用いて測定され得る。一つの実施形態において、サンプルは患者から採取された血漿または血液を含む。別の実施形態において、サンプルは腫瘍組織または生検サンプルを含む。
処置前に得られるサイトカインの発現レベルと比較して、処置後に得られるサンプル中のサイトカインの発現レベルの低下は、被験者のがんが、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に対し感受性であることを示す。一つの実施形態において、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後の被験者から得られるサンプル中のサイトカインの発現レベルは、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前の被験者から得られるサンプル中のサイトカインの発現レベルと比較して、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％下げられる。
別の実施形態において、本発明は、被験者のがんが、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる方法に対し感受性であるか否か決定する方法を提供する。この方法は、ａ）処置前の被験者から得られるサンプル中の応答マーカーのレベルを測定すること、ここで応答マーカーは、フォスフォＥＲＫ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、フォスフォｐＲＢ、またはｐ２７である；ｂ）処置後の被験者から得られるサンプル中の応答マーカーのレベルを測定すること；およびｃ）ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前に得られるサンプル中の応答マーカーのレベルを、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に得られるサンプル中の応答マーカーのレベルと比較することを含む。ここで、処置前に得られるサンプル中の応答マーカーのレベルと比較して、処置後に得られる同じサンプル中のフォスフォＥＲＫ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、もしくはフォスフォｐＲＢ応答マーカーのレベルの低下、または応答マーカーｐ２７のレベルの上昇は、被験者のがんが、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に対し感受性であることを示す。
一つの実施形態において、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に被験者から得られるサンプル中の応答マーカー（例えば、フォスフォＥＲＫ、ＣｙｃｌｉｎＤ１、もしくはフォスフォｐＲＢ）のレベルは、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前の被験者から得られるサンプルと比較して、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％下げられる。いくつかの実施形態において、フォスフォｐＲＢまたはｐ−ＥＲＫのレベルは、それぞれ全フォスフォｐＲＢまたは全ｐ−ＥＲＫと比較して決定される。
一つの実施形態において、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置後に被験者から得られるサンプル中の応答マーカー（例えば、ｐ２７）のレベルは、ゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置前の被験者から得られるサンプルと比較して、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１２５％、１５０、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、または５００％上げられる。
用語「処置後」は、ゼアラレノンアナログ化合物のあらゆる投与の後のあらゆる時間を含む。例えば、サンプルは投与前ならびに投与中および／もしくは投与後の一つまたはそれより多い時間点において得られ得る。例えば、薬物が、注入によって投与される場合、血漿中のサイトカインのレベルの決定のための血液サンプルは、注入前、注入終了の付近、注入の終了後８時間の付近、注入の終了後２４時間の付近、注入の終了後４８時間の付近、および／または注入の終了後７２時間の付近で取得され得る。別の実施例において、腫瘍生検組織は処置前および処置後に取得され得、かつ、サイトカインレベルが（例えば、定量ＰＣＲなどのＰＣＲによって）分析され得る。さらに別の実施例において、腫瘍生検組織は、処置前および処置後に取得され得、かつ、フォスフォＥＲＫ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、フォスフォｐＲＢ、および／またはｐ２７などの応答マーカーのレベルが、（例えば、準定量ＩＨＣなどの免疫組織化学によって）決定され得る。例えば、薬物が注入によって投与される場合、生検は、注入前および注入後（例えば、注入後２４から７２時間）に取得され得る。処置のサイクルが用いられるとき、試料採取は、一回またはそれより多いサイクルにおいて行われ得る。
一つの実施形態において、サンプル中のサイトカインまたは応答マーカーのレベルは、ＥＬＩＳＡによってサイトカインまたは応答マーカーのレベルを検査することによって測定され得る。別の実施形態において、サンプル中のサイトカインまたは応答マーカーのレベルは、ウェスタンブロッティングによって測定され得る。別の実施形態において、サンプル中のサイトカインまたは応答マーカーのレベルは、免疫組織化学によって測定され得る。
適切なサンプルおよび適切なサンプルを取得するための方法は、上に記載される。皮膚生検は代替組織として用いられ得、これらの応答マーカーのレベルにおける変化は、ゼアラレノンアナログ化合物を用いて処置される被験者の正常な皮膚サンプルにおいて、検出され得る。例えば、皮下組織のレベルまでの正常な皮膚の領域から得られる皮膚生検は、処置前および処置後に被験者から取得され得る。好ましくは、処置前および処置後の皮膚生検は、同じ解剖学的領域、しかし被験者の体の反対側（例えば、反対側の上部胸郭、鎖骨上の領域、上肢）から取得される。例えば、薬物が注入によって投与される場合、皮膚生検は、注入前および注入後（例えば、注入後２４から７２時間）に取得され得る。処置のサイクルが用いられるとき、試料採取は、一回またはそれより多いサイクル（例えば、一回目および／またはその後のサイクルにおける注入後）において行われ得る。一つの実施形態において、サンプルは正常な皮膚であり、かつ、応答マーカーはフォスフォＥＲＫおよびフォスフォｐＲＢからなる群から選択される。
本発明の予測の方法の一般的原理は、適切な条件下で、かつ、サイトカインまたは応答マーカーおよびプローブが相互作用ならびに結合すること（つまり、反応混合物中で取除かれならびに／または検出され得る複合体を形成すること）を充分に許容する時間、サイトカインもしくは応答マーカーおよびプローブを含み得るサンプルまたは反応混合物を調製することを含む。これらのアッセイは、種々の方法で行われ得る。
例えば、そのようなアッセイを行うための方法は、プローブを固相支持体（基質ともいわれる）の上に固定させること、および反応終了時に固相上に固定されている標的のマーカー／プローブ複合体を検出することを含む。そのような方法の一つの実施形態において、被験者由来のサンプル（サイトカインまたは応答マーカーの存在および／または濃度について検査される）は、担体または固相支持体上に固定され得る。別の実施形態において、逆の状態が可能であり、そのような状態では、プローブが固相上に固定され得、かつ、被験者由来のサンプルが、固定されていないアッセイの成分として反応することが許容され得る。
アッセイの成分を固相に固定するための多くの確立された方法がある。これらは、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合によって動かないようにされているマーカーまたはプローブ分子を含むが、これらに限定されない。そのようなビオチニル化されたアッセイ成分は、当該分野で公知の技術（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて、ビオチンＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）から調製され得、かつ、ストレプトアビジンで覆われた９６穴プレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）の穴の中に動かないようにされ得る。特定の実施形態において、動かないようにされたアッセイ成分を有する表面は事前に準備され得、そして保存され得る。このようなアッセイに適した他の担体または固相支持体は、マーカーもしくはプローブが属する分子のクラスと結合することが可能なあらゆる物質を含む。周知の支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ナイロン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエチレン、デキストラン、アミラーゼ、天然のおよび変えられたセルロース、ポリアクリルアミド、ハンレイ岩、ならびにマグネタイトが挙げられるが、これらに限定されない。
上で述べられている手法を用いるアッセイを行うために、動かないようにされていない成分が、第二の成分が固定されている固相に添加される。反応が完了した後、複合体にされていない成分は、形成されたいずれの複合体も固相上で動かないように残るような条件下で、（例えば、洗浄によって）除去され得る。固相に固定されたサイトカインまたは応答マーカー／プローブ複合体の検出は、本明細書で概説されている多数の方法において成し遂げられ得る。
好ましい実施形態において、プローブは、固定されていないアッセイ成分である場合、本明細書で議論される検出可能な標識を用いて、直接または間接的に、アッセイの検出および読み取りの目的のため標識され得る。かつ、それらは当業者で周知である。
マーカーもしくはプローブいずれかの成分のさらなる操作または標識無しに、例えば蛍光エネルギー移動の技術（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，６３１，１６９；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ、ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，８６８，１０３号を参照のこと）を利用することによって、サイトカインまたは応答マーカー／プローブ複合体形成を直接検出することもまた可能である。第一の「ドナー」分子上にフルオロフォア標識が選択され、それが適切な波長の入射光を用いて励起するとき、そこで放出される蛍光エネルギーは、第二の「アクセプター」分子上の蛍光標識によって吸収され得る。そして、吸収されたエネルギーのため、蛍光を発することが可能となる。この代わりに、「ドナー」タンパク質分子は、トリプトファン残基の天然の蛍光エネルギーを単純に利用し得る。標識は、光の種々の波長を放出する標識が選択される。そのような「アクセプター」分子標識は、「ドナー」の標識とは見分けられ得る。標識間でのエネルギー移動の効率は、離れている分子の距離に関連されるので、分子間の空間的関係は検査され得る。分子間での結合が起こる状況においては、アッセイにおける「ドナー」分子標識の蛍光の放出は、最大値であるはずである。ＦＥＴ結合事象は、当該分野で周知である標準の蛍光の検出手法で（例えば、蛍光光度計を用いて）、利便良く測定され得る。
別の実施形態において、プローブがサイトカインまたは応答マーカーを認識する能力の決定は、いすれかのアッセイ成分を標識することなく、リアルタイムＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ、Ｓ．およびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ、Ｃ．、１９９１、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５およびＳｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．、１９９５、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５を参照のこと）などの技術を利用して達成され得る。本明細書で用いられる場合、「ＢＩＡ」または「表面プラズモン共鳴」は、いずれの相互作用するものへの標識無しに、リアルタイムで生体分子特異的な相互作用を研究するための技術である（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）。結合の表面での質量の変化（結合の事象を示している）は、表面付近の光の屈折率の変化（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象）となり、生物学的分子間でのリアルタイムの反応を示すものとして用いられ得る検出可能なシグナルを生じる。
また、別の実施形態において、類似している予測アッセイは、液相中の溶質として、サイトカインまたは応答マーカーおよびプローブを用いて行われ得る。そのようなアッセイにおいて、複合体にされているサイトカインまたは応答マーカーおよびプローブは、多数のあらゆる標準の技術（分画遠心分離（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、クロマトグラフィー、電気泳動ならびに免疫沈降が挙げられるが、これらに限定されない）によって複合体にされていない成分から分離される。分画遠心分離において、サイトカインまたは応答マーカー／プローブ複合体は、それらの異なる大きさおよび密度に基づいた複合体の異なる沈降平衡のため、一連の遠心の段階を通して、複合体にされていないアッセイ成分から分離され得る（例えば、Ｒｉｖａｓ、Ｇ．、およびＭｉｎｔｏｎ、Ａ．Ｐ．、１９９３、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．１８（８）：２８４−７を参照のこと）。標準のクロマトグラフィーの技術もまた、複合体にされていない分子から複合体にされている分子を分離するために利用され得る。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーは大きさに基づき、かつカラムの型における適切なゲルろ過樹脂の利用を通して分子を分離する（例えば、相対的に大きな複合体は、相対的に小さな複合体にされていない分子から分離され得る）。同様に、複合体にされていない成分と比較して、サイトカインまたは応答マーカー／プローブ複合体の相対的に異なった電荷の性質は、例えばイオン交換クロマトグラフィー樹脂を通して、複合体にされていない成分から複合体を分けるために活用され得る。そのような樹脂およびクロマトグラフィー技術は、当業者に周知である（例えば、Ｈｅｅｇａａｒｄ、Ｎ．Ｈ．、１９９８、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．Ｗｉｎｔｅｒ １１（１−６）：１４１−８；Ｈａｇｅ、Ｄ．Ｓ．、およびＴｗｅｅｄ、Ｓ．Ａ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ Ａｐｐｌ １９９７ Ｏｃｔ１０；６９９（１−２）：４９９−５２５を参照のこと）。ゲル電気泳動もまた、結合されていない成分から結合されたアッセイ成分を分離するために使用され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、ｅｄ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７−１９９９を参照のこと）。この技術において、タンパク質もしくは核酸の複合体は、例えば、大きさまたは電荷に基づいて分離される。電気泳動工程の間に相互作用の結合を維持するために、非変性ゲルマトリックス物質、および還元剤がない条件が通常好まれる。特定のアッセイおよびその成分に対する適切な条件は、当業者に周知である。
特定の実施形態において、サイトカインまたは応答マーカーのｍＲＮＡのレベルは、当該分野で公知の方法を用いて、被験者由来のサンプルにおいて、インサイチューおよびインビトロ両方の型によって決定され得る。多くの発現検出方法が単離されたＲＮＡを使用する。インビトロの方法のために、ｍＲＮＡの単離に対して選別しないあらゆるＲＮＡ単離技術が被験者由来の組織からのＲＮＡの精製のために用いられ得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、ｅｄ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８７−１９９９を参照のこと）。さらに、組織サンプル中の大きな分子は、例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉの一段階のＲＮＡ分離処理（１９８９，米国特許第４，８４３，１５５号）などの当業者に周知の技術を用いて容易に処理され得る。
単離されたｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンもしくはノーザン分析が挙げられるが、これらに限定されない）または増幅アッセイ（ポリメラーゼ連鎖反応分析（例えば、定量ＰＣＲ）およびプローブアッセイが挙げられるが、これらに限定されない）において用いられ得る。ｍＲＮＡレベルを検出するための一つの好ましい診断上の方法は、単離されたｍＲＮＡと、検出される遺伝子によってコードされているｍＲＮＡとハイブリダイズし得る核酸分子（プローブ）とを接触させることを含む。核酸プローブは、例えば、少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチドの長さであり、かつ本発明のマーカーをコードするｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡに対し、ストリンジェント条件下で特異的にハイブリダイズするために充分であるオリゴヌクレオチド、全長ｃＤＮＡ、またはそれらの一部であり得る。本発明の診断アッセイにおいて用いるための他の適したプローブは、本明細書で記載される。ｍＲＮＡとプローブのハイブリダイゼーションは、問題になっているサイトカインまたは応答マーカーが発現されていることを示す。
一つの型において、ｍＲＮＡは固相上に動かないようにされ、かつ、例えば単離されたＲＮＡをアガロースゲル上で移動させることおよびニトロセルロースなどの膜にゲルからｍＲＮＡを移動させることによって、プローブと接触させられる。他の型において、プローブは固相上に動かないようにされ、かつｍＲＮＡはプローブと、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイ中で接触させられる。当業者は、公知のｍＲＮＡ検出方法を、本発明のマーカーによってコードされているｍＲＮＡのレベルを検出することにおける使用に、容易に適合させ得る。
サンプル中のサイトカインもしくは応答マーカーのｍＲＮＡレベルを決定するための他の方法は、例えばｒｔＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ、１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号に記載の実験の実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：１８９−１９３）、自家持続性配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７８）、Ｑβレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．、１９８８、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，８５４，０３３号）またはあらゆる他の核酸増幅方法による、核酸増幅の処理（その後、当業者において周知である技術を用いて増幅された分子が検出される）を含む。これらの検出の案は、核酸分子が非常に少ない数で存在している場合、核酸分子の検出に特に有益である。本明細書で用いられるように、増幅プライマーは、遺伝子の５’または３’領域（それぞれプラスおよびマイナス鎖、また逆も真）にアニールし得、かつその間の短い領域を含み得る一対の核酸分子として定義される。一般に、増幅プライマーは、長さ約１０から３０ヌクレオチドに由来し、かつ長さ約５０から２００ヌクレオチド由来の領域を脇に配置している。適切な条件下でかつ適切な試薬を有するとき、そのようなプライマーは、プライマーの脇のヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。
インサイチューの方法のために、ｍＲＮＡは、検出前にサンプル（例えば、腫瘍細胞）から単離されることを必要としない。そのような方法において、細胞または組織サンプルは、公知の組織学的方法を用いて調製／処理される。そして、サンプルは支持体上（典型的にはガラススライド）に動かないようにされ、そしてマーカーをコードするｍＲＮＡとハイブリダイズし得るプローブと接触させられる。
サイトカインまたは応答マーカーの絶対的な発現レベルに基づいて決定を行うことの代替として、決定はサイトカインまたは応答マーカーの標準化された発現レベルに基づき得る。発現レベルは、サイトカインまたは応答マーカーではない遺伝子（例えば、恒常的に発現されているハウスキーピング遺伝子）の発現と比較することによるマーカーの絶対的な発現レベルの補正によって標準化され得る。標準化に適した遺伝子としては、アクチン遺伝子などのハウスキーピング遺伝子、または上皮細胞特異的遺伝子が挙げられる。この標準化は、一つのサンプル（例えば、がんを有する被験者由来のサンプル）における発現レベルを他のサンプル（例えば、がんを有しない被験者由来のサンプル）と比較すること、または種々の供給源由来のサンプル間で比較することを可能にする。
あるいは、発現レベルは相対的発現レベルとして提供され得る。例えば、マーカーの相対的発現レベルを決定するために、サイトカインもしくは応答マーカーの発現のレベルは、問題になっているサンプルの発現レベルの決定の前に、一つまたはそれより多いサンプル（例えば、１０個またはそれより多い正常な単離物対がん細胞単離物、好ましくは５０個またはそれより多いサンプル）について決定され得る。多数のサンプルにおいて検査される各遺伝子の平均発現レベルは決定され、そしてこれは、正常細胞対がん細胞におけるサイトカインまたは応答マーカーのための基線の発現レベルとして用いられる。試験サンプルについて決定されるサイトカインまたは応答マーカーの発現レベル（発現の絶対的レベル）は、その後、そのサイトカインまたは応答マーカーについて得られる平均発現値によって割られる。これは、相対的発現レベルを提供する。
本発明の別の実施形態において、サイトカインまたは応答マーカーは検出される。本発明のサイトカインもしくは応答マーカータンパク質を検出するための好ましい物質は、そのようなタンパク質またはそれらの断片と結合することが可能な抗体、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体は多クローン性、またはより好ましくは単一クローン性であり得る。完全な抗体、またはその断片（例えば、Ｆａｂ）もしくはその誘導体（例えばＦ（ａｂ’）２）が用いられ得る。用語「標識される」は、プローブまたは抗体に関して、検出可能な物質とプローブまたは抗体を連結すること（すなわち物理的につなぐこと）によってプローブまたは抗体を直接標識すること、および直接標識されている他の試薬との反応性によってプローブまたは抗体を間接に標識することを含むことが意図される。間接標識することの実施例は、蛍光で標識された二次抗体を用いる一次抗体の検出、および末端がビオチンで標識されているＤＮＡプローブ（蛍光で標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得る）を含む。
がん細胞由来のタンパク質は、当業者に周知の技術を用いて単離され得る。タンパク質の使われている単離方法は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されているような方法であり得る。
種々の型が、サンプルが与えられた抗体に結合するタンパク質を含むか否かを決定するために使用され得る。そのような型の実施例としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット分析および酵素が連結された免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、公知のタンパク質／抗体検出方法を、がん細胞が本発明のマーカーを発現しているか否かを決定することにおける使用に、容易に適合させ得る。
一つの型において、抗体、または抗体の断片もしくは誘導体は、発現されたタンパク質を検出するため、ウェスタンブロット、免疫組織化学または免疫蛍光技術などの方法において用いられ得る。そのような使用において、抗体またはタンパク質のいずれかを固体支持体上に動かないようにすることが一般的に好ましい。適切な固相支持体または担体は、抗原もしくは抗体と結合することが可能なあらゆる支持体を含む。周知の支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然のおよび変えられたセルロース、ポリアクリルアミド、ハンレイ岩、ならびにマグネタイトが挙げられる。
当業者は、抗体または抗原と結合するための多くの他の適切なの担体を知っており、そのような支持体を、本発明を用いる使用に適合させることが可能である。例えば、腫瘍生検組織から単離されるタンパク質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動上において移動させ得、かつニトロセルロースなどの固相支持体上に動かないようにさせ得る。その後支持体は適切な緩衝液を用いて洗浄され得、検出し得る標識された抗体を用いる処置がされ得る。固相支持体は、その後、結合されていない抗体を除去するために緩衝液を用いて２回洗浄され得る。固体支持体上に結合された標識の量は、その後、通常の手法によって検出され得る。
（ゼアラレノンアナログ化合物）
本発明は、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測するための方法に対し、向けられる。ゼアラレノンアナログ化合物は当該分野で周知であり、かつ、２００７年７月２５日に出願された米国出願番号第６０／９５１，９０１号、２００７年７月２５日に出願された６０／９５１，９０６号、２００８年７月２５日に出願された米国出願番号第１２／１８０，４０８号、２００７年７月２５日に出願された米国出願番号第６０／９５１，８９２号、２００８年７月２５日に出願された米国出願番号第１２／１８０，４２３号、米国特許出願第１０／５０７，０６７号、米国出願公開第２００４／０２２４９３６号、ＧＢ３２３８４５、ＥＰ６０６０４４、ＷＯ００／３８６７４、ＪＰ８４０８９３、ＷＯ９６／１３２５９、米国特許第５，７２８，７２６号、米国特許第５，６７４，８９２号および米国特許第５，７９６，９１０号にて開示されているものを含む。上記出願のそれぞれの全容が本明細書において援用される。最近、ゼアラレノンアナログ化合物が特有の複数キナーゼ阻害プロフィールを有すること、および血液脳関門を通り抜け得ることが発見された。このことは、特異的ながんに対して有益であり得る。例えば、ゼアラレノンアナログ化合物は、ＭＥＫ１およびＭＥＫＫ１、増殖因子受容体チロシンキナーゼ（例えば、ＦＬＴ−３、ＴＲＫＢ、ＥＰＨＡ２）、ＡＢＬチロシンキナーゼ、ならびにＰＡＮ−ＳＲＣチロシンキナーゼファミリーの一員（例えば、Ｃ−ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｙｅｓ）を含むＭＡＰＫＫを阻害し得る。
いくつかの実施形態において、ゼアラレノンアナログ化合物は化学式（Ｉ）：
Figure 2014042531
 の化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩もしくはエステルであり、ここで
Ｒ３は、−ＮＨＲ１であり、かつＲ１は、０、１、もしくは２個のヒドロキシ部分によって置換されたＣ１−Ｃ３アルキルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ３は非置換型Ｃ１−３アルキルアミノである。いくつかの実施形態において、Ｒ３はメチルアミノである。他の実施形態において、Ｒ３はエチルアミノである。いくつかの実施形態において、Ｒ３は１個のヒドロキシ部分によって置換されたＣ１−３アルキルアミノである。いくつかの実施形態において、Ｒ３は２個のヒドロキシ部分によって置換されたＣ１−３アルキルアミノである。ヒドロキシ部分は、Ｃ１−３アルキル鎖におけるあらゆる数の炭素上であり得る。さらに、１より多い数のヒドロキシ部分は、Ｃ１−３アルキル鎖の一つの炭素上であり得る。いくつかの実施形態において、アルキル鎖の２−炭素上にヒドロキシル部分がある。いくつかの実施形態において、Ｒ３はヒドロキシエチルアミノ（例えば、２−ヒドロキシエチルアミノ）である。他の実施形態において、Ｒ３はジヒドロキシプロピルアミノ（例えば、２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ）である。いくつかの実施形態において、Ｃ１−３アルキルは、非環式のＣ１−３アルキル鎖である。
本明細書で用いられる場合、「アルキル」基は、直鎖アルキル基、環式アルキル基（または「シクロアルキル」もしくは「脂環式」もしくは「炭素環式」基）（例えば、シクロプロピル）、および分岐鎖アルキル基（例えば、イソプロピル）を含む、１個またはそれより多い数の炭素原子を有する飽和炭化水素を包含する。
いくつかの実施形態において、ゼアラレノンアナログ化合物は：
Figure 2014042531
 およびそれらの薬学的に許容可能な塩またはプロドラッグからなる群から選択される少なくとも一つの化合物である。
ゼアラレノンアナログ化合物は一つまたはそれより多い不斉中心を含み得、かつ、そのため、例えば、立体異性体および／またはジアステレオマーなどの種々の異性体において存在し得る。そのため、ゼアラレノンアナログ化合物およびゼアラレノンアナログ化合物を含む薬学的組成物は、個々の鏡像異性体、ジアステレオマーまたは幾何異性体の型であり得、または立体異性体の混合物の型であり得る。特定の実施形態において、ゼアラレノンアナログ化合物はエナンチオピュア（ｅｎａｎｔｉｏｐｕｒｅ）な化合物であり得る。特定の他の実施形態において、立体異性体またはジアステレオマーの混合物が、本発明の方法において用いられ得る。
異なる明記がなされない限り、本発明の方法において用いるためのゼアラレノンアナログ化合物は、ＺもしくはＥアイソマーいずれかとして存在し得る一つまたはそれより多い二重結合もまた有し得る。本発明は、他のアイソマーを実質的に含まない個々のアイソマーとして存在する化合物、および、あるいは例えば立体異性体のラセミ混合物などの種々のアイソマーの混合物として存在する化合物の使用もさらに含む。
本発明の方法において用いるための化合物はさらに、例えば、化学式（Ｉ）の化合物の多形体、溶媒和物あるいは水和物などの結晶の型の一つまたは組合せとして存在し得る。種々の結晶の型は、再結晶化（様々な温度で結晶化を行うことによって；多様な冷却の方法を用いて（結晶化の間の、非常に速いから非常に緩やかの範囲での冷却））のための様々な溶媒和物を用いて、あるいは溶媒和物の様々な混合物を用いることによって同定および／または調製され得る。種々の結晶の型は、化合物を加熱または融解させ、その後徐々にあるいは速く冷却することによって取得され得る。多形体の存在は、固体のプローブのＮＭＲ分光法、ＩＲ分光法、示差走査熱量測定、粉末Ｘ線回折図形、および／または他の技術によって決定され得る。
（合成の方法論）
本発明の方法を実施するために有益であるゼアラレノンアナログ化合物は、例えば２００７年７月２５日に出願された米国出願番号第６０／９５１，９０１号、２００７年７月２５日に出願された米国出願番号第６０／９５１，９０６号、２００８年７月２５日に出願された米国出願番号第１２／１８０，４０８号、２００７年７月２５日に出願された米国出願番号第６０／９５１，８９２号、２００８年７月２５日に出願された米国出願番号第１２／１８０，４２３号、ＷＯ０５／０２３７９２（例えば、ページ３２−３８）、およびＷＯ０３／０７６４２４（例えば、ページ２８−３６）に記載されている合成方法を用いて調製され得る。上記出願のそれぞれの全容が本明細書において援用される。本明細書に含まれる情報に組合わせたこれらの参考文献ならびにマクロライド化学に関する知識の更なる集合体は、当業者に合成の戦略、保護基、ならびに本発明の方法において用いられ得るゼアラレノンアナログ化合物の合成に有益な他の物質および方法についての案内を提供する。例えば、上記の特許文書は、本明細書に記載されているゼアラレノンアナログ化合物に類似の化合物または関連する中間体の調製における背景情報、ならびにそのような化合物の製造、使用、および投与についての情報を提供する。
（薬学的組成物）
ゼアラレノンアナログ化合物は、薬学的組成物を用いて被験者に投与され得る。適切な薬学的組成物は、本明細書に記載されているあらゆる化合物の一つ（またはそれらの薬学的に許容可能な塩もしくはエステル）を含み、かつ薬学的に許容可能な担体を必要に応じて含む。特定の実施形態において、これらの組成物は、一つまたはそれより多い更なる治療の薬剤を必要に応じてさらに含む。
本明細書で用いられる場合、用語「薬学的に許容可能な塩」は、信頼できる医学の判断の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応など無くヒトおよび下等動物の組織と接触することにおける使用に適していおり、かつ妥当な利益／危険の割合に相当する塩をいう。アミン、カルボン酸、および化合物の他の型の薬学的に許容可能な塩は当該分野で周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ、ｅｔ ａｌ．は薬学的に許容可能な塩についてＪ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、６６：１−１９（１９７７）（本明細書において援用される）の中で詳細に記載している。塩は、本発明の化合物の最終の分離および精製の間にインサイチューで調製され得る、または、これとは別に、以下に一般に記載されているように遊離塩基あるいは遊離酸の機能を適切な試薬と反応させることによって調製され得る。例えば、遊離塩基の機能は、適切な酸と反応させられ得る。さらに、本発明の化合物が酸性部分を有するとき、それらの適切な薬学的に許容可能な塩は、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウムまたはカリウム塩）；およびアルカリ土類金属塩（例えば、カルシウムまたはマグネシウム塩）などの金属塩を含み得る。薬学的に許容可能な非毒性酸付加塩の実施例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および過塩素酸などの無機酸によって形成されるアミノ基の塩または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸あるいはマロン酸などの有機酸によって形成されるアミノ基の塩またはイオン交換などの当該分野で用いられる他の方法を用いて形成されるアミノ基の塩である。他の薬学的に許容可能な塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘルニ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。薬学的に許容可能な塩としては、適切である場合、毒性の無いアンモニウム、四級アンモニウム、ならびにハロゲン化合物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルスルホン酸塩およびアリールスルホン酸塩などの対イオンを用いて形成されるアミン陽イオンがさらに挙げられる。
本明細書で用いられる場合、用語「薬学的に許容可能なエステル」は、インビボで加水分解するエステルおよびヒトの体において容易に分解され親化合物またはそれらの塩を残すエステルを含む。適切なエステル基は、例えば、薬学的に許容可能な脂肪族カルボン酸、特にアルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸、アルカンジオール酸（各アルキル部分またはアルケニル部分は、好都合であることに６個より多い炭素原子を有しない）に由来するエステル基を含む。特定のエステルの実施例としては、ギ酸エステル、酢酸エステル、プロピオン酸エステル、酪酸エステル、アクリル酸エステル、およびエチルコハク酸エステルが挙げられる。
上に記載されているように、薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含み得る。そのような担体は、所望の特定の用量に適合される、溶媒、希釈剤、もしくは他の液体のビヒクル、分散もしくは懸濁を補助するもの、表面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、保存剤、固体の結合剤、潤滑剤などのいずれかまたは全てを含む。ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８０）は薬学的組成物を作製することにおいて用いられる種々の担体およびそれらの調製のための公知の技術を開示している。いずれかの通常の担体媒介物がゼアラレノンアナログ化合物との相性が悪い場合（好ましくない生物学的効果を生じる、そうでなければ、薬学的組成物の何らかの他の成分と有害な様式で相互作用するなど）を除いて、この使用は、本発明の範囲内であると考えられる。薬学的に許容可能な担体として機能し得る物質のいくつかの実施例としては、乳糖、ブドウ糖およびスクロースなどの糖；トウモロコシのデンプンおよびポテト（ｐｏｔａｔｏ）のデンプンなどのデンプン；セルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースの誘導体；トラガカント末；麦芽；ゼラチン；滑石；ココアバターおよび座剤のワックスなどの賦形剤；ピーナッツオイル、綿実油などの油；ベニバナ油、ゴマ油；オリーブ油；トウモロコシ油および大豆油；プロピレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール、リン酸緩衝液、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の毒性が無く適合性のある潤滑剤など挙げられるがこれらに限定されない。着色剤、解除剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、香料剤、保存剤、および酸化防止剤もまた、作製者の判断に従い、組成物中に存在し得る。
本発明における使用のための組成物は、あらゆる所望の濃度のゼアラレノンアナログ化合物を有するように作製され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも治療上有効な量のゼアラレノンアナログ化合物を含むように組成物は作製される。治療上有効な量は、投与の条件において、がんを処置するために十分な量というような、所望の治療上の効果を達成するために十分な量である。いくつかの実施形態において、組成物は、一つまたはそれより多い望まれない副作用を引き起こし得ない量を含むように作製される。特定の実施形態において、ゼアラレノンアナログ化合物が、約１ｍｇ／ｍＬと約２０ｍｇ／ｍＬとの間；約１ｍｇ／ｍＬと約１５ｍｇ／ｍＬとの間；約１ｍｇ／ｍＬと約１０ｍｇ／ｍＬとの間；約２ｍｇ／ｍＬと約９ｍｇ／ｍＬとの間；約３ｍｇ／ｍＬと約８ｍｇ／ｍＬとの間；約４ｍｇ／ｍＬと約７ｍｇ／ｍＬとの間；約４ｍｇ／ｍＬと約６ｍｇ／ｍＬとの間の濃度で存在するように組成物は調製される。特定の実施形態において、化合物が約５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在するように組成物は調製される。
（キット）
本発明は、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する、または被験者のがんがゼアラレノンアナログ化合物を用いる処置に感受性であるか否かを決定するのための組成物およびキットもまた提供する。これらのキットは以下のものの一つまたはそれより多くのものを含む：例えば腫瘍生検もしくは血液サンプルなどのサンプルを取得するおよび／または調製するのための試薬；サンプルが活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達を提示するか否かを決定するための試薬；サンプルが野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を提示するか否かを決定するための試薬；サンプルが例えばＲＡＦ遺伝子、例えばＢＲＡＦ遺伝子内の変異を提示するか否かを決定するためのプローブおよび試薬；サンプルが例えばＰＴＥＮ遺伝子の野生型配列を提示するか否かを決定するためのプローブおよび試薬；サンプル中のＤＮＡ高度メチル化を決定するための試薬；サンプル中のリン酸化されたＡＫＴタンパク質のレベルを決定するための試薬；サンプル中のＡＫＴタンパク質の発現レベルを決定するための試薬；例えば、ＲＡＦ活性（例えば、ＢＲＡＦ活性）、ＭＥＫ１活性、ＥＲＫ１活性、ＭＥＫ２活性、ＥＲＫ２活性、またはＡＫＴ活性などのタンパク質活性を決定するための試薬；サンプル中の例えばＩＬ−８、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、またはＴＮＦαなどのサイトカインのレベルを測定するための試薬；サンプル中の例えばフォスフォＥＲＫ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、フォスフォｐＲＢ、またはｐ２７などの他の応答マーカーのレベルを測定するための試薬；および使用のための指示書。
本発明のキットは、本発明の方法を実行するために有益なさらなる成分を必要に応じて含み得る。例として、キットは、相補的な核酸にアニールするまたは抗体が特異的に結合するようなタンパク質と結合するために適切である流体（例えば、ＳＳＣ緩衝液）、一つまたはそれより多いサンプル区画、本発明の方法の実行について記載している指示のための資料、正常な細胞のサンプル、がん細胞のサンプルなどを含み得る。
本発明は、以下の実施例によってさらに例証されるが、制限するように解釈されるべきではない。この出願を通して、引用される全ての参考文献、特許、および公開された特許出願の全容は、本明細書において援用される。
（実施例）
（実施例１：ＢＲＡＦ変異細胞は、化合物１０６を用いた処置に対し感受性である）
ＢＲＡＦおよび／またはＲＡＳ中に変異を有する種々の組織型由来のがん性細胞株のパネルにおいて、ゼアラレノンアナログ化合物である化合物１０６を用いた処置後の細胞増殖阻害を評価した。２１種の細胞株のパネルを、化合物１０６の濃度を変化させて検査した。全てのアッセイは、９６ウェルフォーマット内で行った。細胞生存率は、処置後４日後に、評価した。細胞生存率を、変異を有しないまたはＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）および／もしくはＲＡＳ変異を有する細胞株のパネルにおいて、ＭＴＳ Ａｓｓａｙ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡｑｕｅｏｕｓＯｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価し、薬物感受性に対するＢＲＡＦおよびＲＡＳ遺伝子型の効果を決定した。
これらの結果を、図３Ａに示す。図３Ａは、いくつかの種類の細胞株の細胞増殖阻害のＩＣ５０値を示しているグラフであり、ＢＲＡＦが変異した結腸直腸がん細胞株、乳がん細胞株およびメラノーマがん細胞株は、化合物１０６を用いた処置に対し全て感受性であったことを実証している。結腸直腸がん細胞株ＨＴ−２９およびＣｏｌｏ−２０５、乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＤＵ４４７５、ならびにメラノーマがん細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−３、ＳＫ−ＭＥＬ−２４、およびＳＫ−ＭＥＬ−２８などのＢＲＡＦが変異した細胞株は、ゼアラレノンアナログ化合物１０６を用いた処置に対し高い感受性をもち、１００ｎＭ未満のＩＣ５０値であった。これらの結果は、ＢＲＡＦ変異を有する細胞株は、ゼアラレノンアナログ化合物（例えば化合物１０６）を用いた処置に対し、より感受性であることを実証している。
別の実験において、化合物０９１および１０６を、種々の組織型由来の固形癌細胞株を用いて検査した（化合物０９１に対する２１種の細胞株および化合物１０６に対する１９種の細胞株を、図３Ｂに示す）。全ての細胞株を９６ウェルプレートに導入し、化合物０９１または化合物１０６非存在下あるいは化合物０９１または化合物１０６が０．３−１００００ｎＭで継続的に存在する状況下で、９６時間増殖させた。細胞増殖は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはメチレンブルーアッセイを用いて評価した。ＩＣ５０値は、処置していない細胞集団と比較して、５０％細胞増殖を阻害する基質の濃度として決定した。図３Ｂ中に示されるように、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異を有する細胞株は、低ｎＭまたはμＭ未満濃度範囲の化合物０９１および１０６に対し、高い感受性であった。
ＢＲＡＦに種々の変異を有する３１種のメラノーマ細胞株のパネルにおいても、ゼアラレノンアナログ化合物の化合物１０６を用いた処置後の細胞生存率を評価した。すべのアッセイは、９６ウェルフォーマット中で行った。細胞生存率を、処置後４日後に、評価した。様々なＢＲＡＦ変異を有する細胞株のパネルにおいて、ＭＴＳ Ａｓｓａｙ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡｑｕｅｏｕｓＯｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞生存率を評価し、薬物感受性に対するＢＲＡＦ遺伝子型の効果を決定した。これらの細胞株の変異状況およびｎｍｏｌ／ＬでのＩＣ５０を、図３Ｃに示す。
これらの結果の分析を、表２に要約する。表２は、ＢＲＡＦ中に変異を有する細胞株は、化合物１０６への感受性と、統計的に関連があったことを例証している。感受性は、ＩＣ５０が１００ｎｍｏｌ／Ｌ未満と定義した。具体的には、ＢＲＡＦに変異を有する２０種の細胞株において（２０種細胞株）、これらの細胞株の７５％が化合物１０６に対し感受性であった。反対に、野生型のＢＲＡＦを有する１１種の細胞株においては、これらの細胞株の２７％のみが、化合物１０６に対し感受性であった（フィッシャーの正確検定、両側＝Ｐ＜０．０１）。
表２：３１種のメラノーマ細胞株のパネルにおける、化合物１０６感受性に対するＢＲＡＦ変異の効果
Figure 2014042531
 （実施例２：メラノーマ細胞株のパネルにおける化合物１０６感受性への、ＢＲＡＦおよびＰＴＥＮ変異の効果ならびにＢＲＡＦおよびリン酸化ＡＫＴのレベルの効果）
ＭＥＫインヒビターである化合物１０６を用いた処置後の、ＢＲＡＦおよびＰＴＥＮ内に種々の変異を有するメラノーマ細胞株のパネルにおいて、細胞生存率を評価した。８種の濃度の化合物１０６（濃度は１０μｍｏｌ／Ｌから０．０００３μｍｏｌ／Ｌの範囲である）を用いて、３１種のメラノーマ細胞株のパネルを検査した。（細胞株のパネルは、がんに関連する一つまたはそれより多い遺伝子の変異もまた有する）。
全てのアッセイは、９６ウェルフォーマット中で行った。細胞生存率を、処置後４日後に、評価した。細胞生存率を、ＭＴＳ Ａｓｓａｙ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡｑｕｅｏｕｓＯｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価し、薬物感受性に対する遺伝子型の効果を決定した。個々のＩＣ５０値を図３に示す。
結果のさらなる分析を行った。ここでは、感受性をＩＣ５０＜５００ｎｍｏｌ／Ｌと定義した。この分析の結果を、表３に要約する。この分析の結果は、化合物１０６の感受性は、野生型ＰＴＥＮの状態と、統計的に関連があったことを明示している。具体的には、野生型ＰＴＥＮを有する２３種の細胞株において、１２種の細胞株が化合物１０６に対し感受性であった。反対に、変異型ＰＴＥＮを有するまたはＰＴＥＮを欠失している８種の細胞株においては、３種の細胞株のみが、感受性であった（フィッシャーの正確検定、両側＝Ｐ＜０．０１）。
フォスフォＡＫＴ発現レベルもまた評価した。表３は、フォスフォＡＫＴ発現は化合物１０６への感受性に影響することを例証している。
表３：ＰＴＥＮ変異／欠失またはｐ−ＡＫＴのレベルは、ＢＲＡＦ変異を有する２０種のメラノーマ細胞株の化合物１０６への感受性を調節する
Figure 2014042531
 別の実験において、化合物１０６を、ＢＲＡＦ変異（Ｖ６００Ｅ）メラノーマ細胞株のパネルにおいて検査した。図３Ｄに示しているように、この細胞株のいくつかは、ＰＴＥＮ遺伝子内に変異を含んでいた。（細胞株のこのセットは、図３Ｃと比較して、１７種のさらなる細胞株を示している。）メラノーマ細胞株を９６ウェルプレートに導入し、化合物１０６非存在下または継続的に存在する条件下で増殖させた。ＩＣ５０値は、処置していない細胞集団と比較して５０％細胞増殖を阻害する基質の濃度として決定した。図３Ｄに示されるように、ＢＲＡＦ変異および野生型ＰＴＥＮを有する細胞株は、化合物１０６に対し高い感受性であった。
これらの結果は、活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達および野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を有する細胞株は、ゼアラレノンアナログ化合物（例えば、化合物１０６）に対してより感受性が高いことを実証している。
（実施例３：ＡＫＴリン酸化状態は、メラノーマ細胞株のパネルにおいて化合物１０６感受性に影響する）
化合物１０６耐性が、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路活性化の結果による恒常的ＡＫＴリン酸化と関連があるか否かを決定するため、１０種のＢＲＡＦ変異メラノーマ細胞株およびＢＲＡＦ野生型神経膠芽腫がん細胞株ＳＦ−２９５のパネルを、種々の濃度の化合物１０６（１０μｍｏｌ／Ｌから０．０００３μｍｏｌ／Ｌの範囲である）を用いて、検査した。
全てのアッセイは、９６ウェルフォーマット内で行った。これらの細胞株に対しては、タンパク質溶解物を別の実験で収集した。このことは、ＡＫＴリン酸化の恒常的レベルの評価、およびリン酸化されたＡＫＴ（ｐＡＫＴ）レベルと化合物１０６への感受性の間の関連性の評価を可能にした。細胞増殖は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価した。リン酸化されたＡＫＴタンパク質は、ウェスタンブロッティングによって分析した。ローディングコントロールとして全ＡＫＴを用いた。
ｐＡＫＴ発現の上昇（これはＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の活性化を反映し得る）を、ＲＰＭＩ−７９５１およびＳＦ−２９５を含む、化合物１０６に対して耐性を有する細胞株（例としては、図２を参照のこと）において観察した。ｐＡＫＴ発現の上昇は、化合物１０６に感受性を有する細胞株では観察されなかった。これらのデータは、ゼアラレノンアナログ化合物（例えば、化合物１０６）は、活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達および野生型ＰＩ３Ｋシグナル伝達を有する細胞株（例としては、図４を参照のこと）でのがんを、処置できる能力を有していることを実証している。これらのデータはさらに、ゼアラレノンアナログ化合物（例えば、化合物１０６）は、変異ＢＲＡＦおよび野生型ＰＴＥＮを含むがん細胞株でのがんを、処置できる能力も有していることを実証している。総合すると、これらの技術は、ゼアラレノンアナログ化合物が被験者のがんを処置する能力を予測する方法を提供している。
（実施例４：ＢＲＡＦ変異がん細胞は、プロ炎症性（Ｐｒｏ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインインターロイキン８（ＩＬ−８）を産生する）
ＩＬ−８がメラノーマ細胞によって産生されるか否かを決定するため、Ｖ６００Ｅ ＢＲＡＦ変異を有する１４種のメラノーマ細胞株について、ＩＬ−８サイトカイン発現レベルをＥＬＩＳＡによってインビトロで評価した。図５に実証されているように、ＬＯＸ、ＳＫ−ＭＥＬ−２４、ＵＡＣＣ−６２、およびＣＯＬＯ−８２９細胞株（これらはＢＲＡＦ変異を有する）は全て、タンパク質レベルでの高いＩＬ−８発現を示した。
（実施例５：化合物１０６で処置した担腫瘍マウスの血漿ＩＬ−８における変化）
血漿ＩＬ−８レベルは腫瘍異種移植片を有するマウスにおいて測定可能か否か、および血漿ＩＬ−８レベルは化合物１０６を用いた処置後変化するか否かを決定するため、雌性のヌードマウスにおいて、ＣＯＬＯ−８２９およびＵＡＣＣ−６２メラノーマ異種移植片を化合物１０６感受性異種移植片として樹立した。雌性のヌードマウスにおいて、ＳＦ−２９５ヒト神経膠芽腫（ＢＲＡＦ野生型）異種移植片を化合物１０６耐性腫瘍モデルとして樹立した。雌性の無胸腺ＮＵ／ＮＵマウスに、ＣＯＬＯ−８２９、ＵＡＣＣ−６２ヒトメラノーマがん細胞、またはＳＦ−２９５ヒト神経膠芽腫細胞を、皮下接種した。これらの動物から約２５０ｍｍ３の腫瘍を発生した動物を選び出し、無作為に２群に分けた。実験は、処置の１日目において、各群あたり、ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）処置をした８匹のマウスおよび４０ｍｇ／ｋｇの化合物１０６で処置をした８匹のマウスからなった。化合物１０６を、ＱＤ×４（合計４回の注射を毎日行う）の投与計画で、静脈内に（ｉ．ｖ．）投与した。皮下腫瘍の体積を、処置の１日目および４回目の処置後２４時間後に測定した。へパリン添加血液を、化合物１０６を用いた４回目の処置後２４時間後のマウスから、心穿刺によって収集し、また血漿を分離した。血漿中のヒトＩＬ−８のレベルは、ＥＬＩＳＡによって決定した。
図７に実証されているように、化合物１０６に感受性である異種移植片（すなわちＵＡＣＣ−６２およびＣＯＬＯ−８２９）において、４０ｍｇ／ｋｇの化合物１０６は、４回目の投与後２４時間後の血漿ＩＬ−８レベルを、ほぼ完全にブロック（ｂｌｏｃｋ）した。対照的に、化合物１０６を用いた処置は、ＳＦ−２９５腫瘍を有するマウス（化合物１０６を用いた処置に耐性である）における血漿ＩＬ−８レベルを、変化させなかった。上記の結果に基づき、血漿ＩＬ−８の減少は、ゼアラレノンアナログ化合物（例えば、化合物１０６）に対する腫瘍の反応を測定するための代替マーカーとして働き得ることが明白である。
（実施例６：血漿ＩＬ−８レベルは化合物１０６への反応を検出するために用いられ得る）
血漿ＩＬ−８を、ヒトがん患者由来の血漿または血液中で検出できるか否かを決定するため、メラノーマ患者由来の６種の血漿サンプルを、腫瘍組織バンク（Ａｓｔｅｒａｎｄ）から取得した。転移部位由来の６種のメラノーマ組織もまた、同じ患者から取得した。コントロールとして、６種の血漿サンプルもまた、健康なボランティアから取得した。ＩＬ−８血漿レベルを、ＥＬＩＳＡによって決定した。ＢＲＡＦ変異を、ＰＣＲ分析によって検出した。
表４に示されているように、検査した６種全ての臨床サンプルにおいて、ＩＬ−８を検出した。６人全てのがん患者は、ＰＣＲ分析によって示されたように、ＢＲＡＦ変異を有していた。
表４：進行メラノーマ患者における血漿ＩＬ−８レベル
Figure 2014042531
 これらの結果は、ＩＬ−８を、進行した段階のメラノーマを有する患者由来の血漿中にて、検出し得ることを実証している。
（実施例７：ゼアラレノンアナログ化合物は、がん細胞株におけるＩＬ−８およびＩＬ−６のタンパク質レベルを低下させ、かつ、ＢＲＡＦ変異細胞によるＩＬ−８およびＩＬ−６の分泌に影響する）
本研究の目的は、ＢＲＡＦ変異ＬＯＸメラノーマ細胞によるＩＬ−８およびＩＬ−６の分泌に対する、インビトロでのゼアラレノンアナログ化合物（化合物１０６など）の効果を調査することであった。（Ｄａｖｉｅｓ Ｈ．ｅｔ ａｌ．、「Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ＢＲＡＦ ｇｅｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ」、Ｎａｔｕｒｅ、４１７：９４９−９５４（２００２））。
化合物１０６（５．０ｍｇ）を量り取り、１００％無水ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中に溶解し、３．８９ｍｇ／ｍＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌストック溶液を作製した。１０ｍｍｏｌ／Ｌストック溶液の一定分割量を、−８０℃に保存した。そして、実験の各日において、ストック溶液の一定分割量を解凍し、ＲＰＭＩ−１６４０培地を添加することによって１：１０に希釈し、１ｍｍｏｌ／Ｌの溶液を取得した。４種の段階的１：１０希釈液を、１０％ＤＭＳＯ（ＲＰＭＩ−１６４０培地中）の添加によって１ｍｍｏｌ／Ｌの作業溶液から作製し、４種のさらなる作業溶液を取得した。これらの各作業溶液を、培地を用いてさらに希釈し、１ｎｍｏｌ／Ｌから１０，０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲に希釈された作業溶液を取得した。これらの希釈された作業溶液の各５ｍｌを、各ディッシュに添加した。
ＬＯＸヒトメラノーマ細胞は、もともとはＤＣＴＤ腫瘍リポジトリ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）から取得した。この細胞を、３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）において、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４０増殖培地中に単層培養で増殖させた。
ＬＯＸヒトメラノーマ細胞を、１００ｍｍディッシュに１×１０６細胞になるようにまいた。４８時間後、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて３回洗い、０．１％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて、さらに２４時間培養した。細胞の培地を除去した後、化合物１０６を含むフレッシュなＲＰＭＩ−１６４０培地（１、１０、１００、１０００、または１０，０００ｎｍｏｌ／Ｌ）を各培養ディッシュに添加し、２４時間培養した（表５を参照のこと）。コントロールには、ＲＰＭＩ−１６４０培地中の０．１％ＤＭＳＯのみを与え、ＩＬ−６およびＩＬ−８の自然分泌（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）を測定した。３回の別々の実験を、２連（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で行い、平均±ＳＥＭを計算した。
表５：ＩＬ−６およびＩＬ−８の分泌を決定するためのサンプルの組合せ
Figure 2014042531
 化合物１０６または０．１％ＤＭＳＯ存在下での２４時間の培養後、５ｍＬの細胞の培地上清を収集した。遠心分離によってあらゆる粒子状物質を除去した。全てのサンプルは分析まで−８０℃フリーザーに保存した。ＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ ＩＬ−８ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ、カタログ番号５５５２４４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、ＣＡおよびＨｕｍａｎ ＩＬ−６ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ、カタログ番号５５５２２０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）をキットから提供されているアッセイ手順書を用いて使用し、ヒトＩＬ−６またはＩＬ−８の存在を決定した。吸光度は、ＶＥＲＳＡＭＡＸＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、合併したため現在はＭＤＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの一部門である、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）上で読んだ。
細胞の培地上清の除去後、１．０ｍＬのトリプシンを細胞に添加し、３分間の後、細胞数を数えるために４ｍＬの１０％ＦＢＳ含有培地を添加した。０．１ｍｍの深さの血球計数器（Ｂｒｉｇｈｔ Ｌｉｎｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒ、Ｈａｕｓｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｏｒｓｈａｍ、ＰＡ）を用いて細胞を数えた。細胞の総数は、以下のように計算した：
５ｍＬ中の細胞の総数＝Ｃ×１０４／ｍＬ×５ｍＬ（Ｃ：１ｍｍ２内での実際の細胞数）ＩＬ−６またはＩＬ−８のレベルを、ｎｇ／１×１０６細胞として決定した。化合物１０６によるＩＬ−６またはＩＬ−８分泌の阻害を、以下の式を用いたコントロールのパーセントとして表した：
コントロールのパーセント＝（処置したサンプルの値−ブランクの平均値）／（コントロールの値−ブランクの平均値）×１００
ソフトウェアであるＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（バージョン４、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、平均ＩＣ５０値の計算のために用いた。
ＢＲＡＦ変異を有するＬＯＸヒトメラノーマ細胞は、２４時間以内にＩＬ−６（１５．５±５．１ｎｇ／１００万個の細胞）およびＩＬ−８（１０４．７±３８．９ｎｇ／１００万個の細胞）をそれぞれ自然に分泌した（表６および表７）。ＩＬ−６およびＩＬ−８のタンパク質レベルは、ＬＯＸメラノーマ細胞株において、化合物１０６により濃度依存的な様式で低下した（計算したＩＣ５０値の平均は、ＩＬ−６が２１．８ｎｍｏｌ／ＬでありＩＬ−８が１０．５ｎｍｏｌ／Ｌである）（図６ならびに表８および９）。これらの結果は、ＩＬ−６およびＩＬ−８タンパク質のレベルの変化が、化合物１０６などのゼアラレノンアナログ化合物に対する生物学的反応を測定するための薬力学的マーカーとして働き得ることを実証している。
表６：３回の別々の実験における、ＩＬ−６の自然分泌に対する化合物１０６の阻害効果
Figure 2014042531
 表７：３回の別々の実験における、ＩＬ−８の自然分泌に対する化合物１０６の阻害効果
Figure 2014042531
 表８：３回の別々の実験における、ＩＬ−６のタンパク質レベルに対する化合物１０６の抑制効果
Figure 2014042531
 表９：３回の別々の実験における、ＩＬ−８のタンパク質レベルに対する化合物１０６の抑制効果
Figure 2014042531
 さらに、図６に実証されているように、化合物１０６を用いた処置は、ＬＯＸメラノーマ細胞株（Ｖ６００Ｅ ＢＲＡＦ変異を有し、かつＰＴＥＮに関しては野生型）におけるＩＬ−６（２１．８ｎｍｏｌ／ＬのＩＣ５０）およびＩＬ−８（１０．５ｎｍｏｌ／ＬのＩＣ５０）タンパク質の発現をほぼ完全に抑えた。上記の結果に基づき、血漿ＩＬ−８および／またはＩＬ−６レベルの低下が、化合物１０６などのゼアラレノンアナログ化合物に対する腫瘍の反応を測定するための代替マーカーとして働くことが明白である。
（実施例８：ＩＬ−８およびＩＬ−６のレベルは、あるがんがゼアラレノンアナログ化合物を用いた処置に対し感受性であるか否かを示す）
あるがんがゼアラレノンアナログ化合物を用いた処置に対し感受性であるか否かを決定するために、様々な時点の血漿中ＩＬ−６またはＩＬ−８のレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて評価した。採血は処置前、処置中および処置後に行った。例えば、採血は注入前、注入終了の直前、注入終了後８、２４、４８および７２時間経過後に行った。これは、処置サイクルの一回またはそれより多い回数の注入において、行われ得る。
加えて、定量ＰＣＲを処置前および注入後に得た腫瘍生検組織に対して行い、ＩＬ−６および／またはＩＬ−８のｍＲＮＡレベルを決定した。
上述の各ケースにおいて、ＩＬ−６のレベルまたはＩＬ−８のレベルを、ゼアラレノンアナログ化合物の効果を評価するための薬力学的マーカーとして（薬効の代替マーカーとして）用いた。処置中または処置後のＩＬ−６またはＩＬ−８レベルの低下は、そのがんがゼアラレノンアナログ化合物を用いた処置に対し、感受性であることを示す。
（実施例９：化合物１０６を用いた処置後の、応答マーカーのタンパク質レベル）
ある被験者のあるがんがゼアラレノンアナログ化合物を用いた処置に対して感受性であるか否かを決定するための応答マーカーとして働き得るマーカーを同定するために、化合物１０６に感受性である細胞株（例えば、ＳＫ−ＭＥＬ−２８）および化合物１０６に耐性である細胞株（例えば、ＡＵ−５６５）でのフォスフォＥＲＫ、全ＥＲＫタンパク質、フォスフォｐＲＢ、全ｐＲＢ、およびＣｙｃｌｉｎ Ｄ１のタンパク質レベルを、ウェスタンブロッティングによって調べた。２×１０６のがん細胞（ＳＫ−ＭＥＬ−２８およびＡＵ−５６５）を１００ｍｍディッシュ中にまき、２日間培養した。その後、テスト化合物（例えば、化合物１０６）を１０ｎｍｏｌ／Ｌから３μｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度で各ディッシュに添加し、２４時間培養した。コントロールとして、培地を細胞に添加した。ＳＫ−ＭＥＬ−２８およびＡＵ−５６５の細胞溶解タンパク質を、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そしてフォスフォＥＲＫ１／２（カタログ番号９１０１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、フォスフォｐＲＢ（カタログ番号９３０７、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、またはＣｙｃｌｉｎ Ｄ１（カタログ番号ｓｃ−８３９６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）に対する抗体を用いてイムノブロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）した。ＥＲＫ１（カタログ番号ｓｃ−９３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）またはｐＲｂ（カタログ番号ｓｃ−１０２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）抗体は、タンパク質の全量の検出に用いた。
感受性細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２８）および耐性細胞株（ＡＵ−５６５）において、ＥＲＫおよびＧ１／Ｓ移行に重要なタンパク質（Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、ｐ２７、フォスフォｐＲＢ）の発現レベルをウェスタンブロッティングによって調べた。図８に示されているように、化合物１０６は、感受性細胞株および耐性細胞株いずれにおいても濃度依存的様式でフォスフォＥＲＫのタンパク質レベルを抑制した。重要なことに、感受性細胞株において、網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲＢ）をリン酸化するＣｙｃｌｉｎ Ｄ１のタンパク質レベルが、フォスフォｐＲＢタンパク質の減少と並行して低下していた。ＣＤＫのインヒビターであるｐ２７のタンパク質レベルは、感受性細胞株において、化合物１０６存在下で上昇した。これらの結果は、ゼアラレノンアナログ化合物が、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１発現を転写段階で阻害していることを実証している。Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１発現の転写段階での阻害は、ｐＲＢタンパク質のリン酸化を阻害し、細胞周期停止を導く。よって、これらのマーカーは、ゼアラレノンアナログ化合物（例えば、化合物１０６）を用いた処置への反応に対する薬力学的マーカーとして働き得る。
（実施例１０：ヒトメラノーマ組織の免疫組織化学）
ホルマリン固定し、パラフィン包理したヒトメラノーマ腫瘍サンプルを取得し、表１０に記載されている抗体を用いて免疫組織化学（ＩＨＣ）のための処理を行った。表１０に示されているように、一次抗体とのインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）が１時間であった場合は、以下に記載されているＩＨＣ手順（１）を用いた。表１０に示されているように、一次抗体とのインキュベーションが一晩であった場合は、以下に記載されているＩＨＣ手順（２）を用いた。
表１０：免疫組織化学のための抗体、リトリーバル（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）およびインキュベーション条件
Figure 2014042531
 １ウサギｍＡｂ １３７Ｆ５は、全ｐ４４／４２ ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１／ＥＲＫ２）タンパク質の内因性レベルを検出する。
２単一クローン性抗ＭＡＰキナーゼ抗体は、ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２）の二重にリン酸化された形態と特異的に反応する。
３ＡＫＴ（ｐａｎ）（Ｃ６７Ｅ７）ウサギｍＡｂは、全ＡＫＴタンパク質の内因性レベルを検出する。
４このウサギｍＡｂは、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１のＣ末端のエピトープを検出する。
５ウサギｍＡｂ ７３６Ｅ１１は、セリン４７３でリン酸化されているＡＫＴ１を検出する。ならびに、対応する部位でリン酸化されているＡＫＴ２およびＡＫＴ３も検出する。６抗フォスフォ網膜芽細胞腫（ｐＳｅｒ７８０）抗体は、Ｓｅｒ７８０でリン酸化されているＲＢを認識する。しかしリン酸化されていないＲＢとは反応しない。
７マウス抗ＲＢ ｍＡｂ ４Ｈ１は、全ＲＢタンパク質の内因性レベルを検出する。
（ａ．ＩＨＣ手順（１））
ＩＨＣ手順（１）は、室温で一時間のインキュベーションを必要とする全ての一次抗体に対して用いた。ＩＨＣ法は、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ ３６０およびＬａｂ Ｖｉｓｉｏｎ ＬＰ−ＡＰ検出キット（ＵｌｔｒａＶｉｓｉｏｎ ＬＰ Ｌａｒｇｅ Ｖｏｌｕｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＡＰ Ｐｏｌｙｍｅｒ（Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｕｓｅ）、カタログ番号ＴＬ−１２５−ＡＬ）を用いて実施した。ヒトメラノーマ切片（厚さ５μ）を脱パラフィン化（ｄｅｐａｒａｆｉｎｉｚｅ）し、さらに再水和させた。エピトープのリトリーバルはＬａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｍｏｄｕｌｅ（９６℃（沸騰しないサイクル）２０分の後、２０分間の冷却期間（７５℃まで））にて行った。リトリーバル緩衝液は表１０に示してあるようにＥＤＴＡ緩衝液またはクエン酸緩衝液であった：（ａ）ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ８．０（Ｌａｂ
Ｖｉｓｉｏｎ、カタログ番号ＴＡ−２５０−ＰＭ２Ｘ）；または（ｂ）クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０（Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ、カタログ番号ＴＡ−２５０−ＰＭ１Ｘ）。
切片をＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒに移した。そして以下のプログラムを用いた：プレリンス（ｐｒｅ−ｒｉｎｓｅ）（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ、カタログ番号ＴＡ−９９９−ＴＴ）；非特異的タンパク質のブロック、１０分（ＵＶブロック、ＬＰ−ＡＰキットの一部分）；一次抗体：６０分；ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液中で３回リンス；抗体のエンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）（ＬＰ−ＡＰキットの一部分）、１０分；ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液で３回リンス；ラベルされたポリマー−ＡＰ結合型（ＬＰ−ＡＰキットの一部分）、１５分；ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液で３回リンス；基質：Ｆａｓｔ Ｒｅｄ（Ｆａｓｔ Ｒｅｄ基質システムから調製した（Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ、カタログ番号ＴＡ−１２５−ＡＦ））；水で１回リンス；および蒸留水で２回リンス。
切片を、ヘマトキシリンＧｉｌｌ ＩＩＩ（ＶＷＲ（登録商標）、カタログ番号１５２０４−２６８）を用いて対比染色した。（この色素原は耐溶媒性ではない、そしてキシレン／アルコールと共に用いることができない）。ヘマトキシリン対比染色手順は、以下の通りであった：ヘマトキシリン、３０秒；ｄＨ２Ｏ；水道水でリンス、５分；Ｂｌｕｉｎｇ試薬、３０秒；水道水でリンス、５分；ｄＨ２Ｏ。
Ｖｉｓｉｏｎ Ｍｏｕｎｔ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉａ（Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ、カタログ番号ＴＡ−１２５−ＵＧ）を用いて、手作業で、切片をカバースリップで覆った。この封入剤は、Ｌａｂ ＶｉｓｉｏｎのＦａｓｔ Ｒｅｄに対し適合性がある。番号１．５カバースリップガラスを、最善の顕微鏡分析（番号１．５カバースリップに最適化された対物レンズを用いる）を行うために用いた。Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ｆａｓｔ Ｒｅｄはいつまでも状態を保つことができないので、分析はＩＨＣ染色から１週間以内に行った。
（ｂ．ＩＨＣ手順（２））
ＩＨＣ手順（２）は、４℃で一晩（１８時間）のインキュベーションを必要とする全ての一次抗体に対して用いた。
ＩＨＣ法は、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ ３６０およびＬａｂ Ｖｉｓｉｏｎ ＬＰ−ＡＰ検出キット（ＵｌｔｒａＶｉｓｉｏｎ ＬＰ Ｌａｒｇｅ Ｖｏｌｕｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＡＰ Ｐｏｌｙｍｅｒ（Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｕｓｅ）、カタログ番号ＴＬ−１２５−ＡＬ）を用いて実施した。ヒトメラノーマ切片（厚さ５μ）を脱パラフィン化し、さらに再水和させた。エピトープのリトリーバルはＬａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｍｏｄｕｌｅ（９６°Ｃ（沸騰しないサイクル）２０分の後、２０分間の冷却期間（７５°Ｃまで））にて行った。リトリーバル緩衝液は表１０に示してあるようにＥＤＴＡ緩衝液またはクエン酸緩衝液であった：（ａ）ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ８．０（Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ、カタログ番号ＴＡ−２５０−ＰＭ２Ｘ）；または（ｂ）クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０（Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ、カタログ番号ＴＡ−２５０−ＰＭ１Ｘ）。
一次抗体までの工程および一次抗体を含む工程は、手作業で行った：プレリンス（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ、カタログ番号ＴＡ−９９９−ＴＴ）；非特異的タンパク質のブロック、１０分（ＵＶブロック、ＬＰ−ＡＰキットの一部分）；一次抗体：加湿チャンバー（ｃｈａｍｂｅｒ）（切片から水分が抜けきることを防ぐため）内で４℃で一晩（１８時間）。一晩のインキュベーション時に、抗体が長いインキュベーション期間中に切片から剥がれ落ちるのを防ぐため、疎水性バリアペンを用いて組織の周りに楕円を描いた。
その後、切片をＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒに移した。そして以下のプログラムを用いた：ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ Ｂｕｆｆｅｒで３回リンス；抗体のエンハンサー（ＬＰ−ＡＰキットの一部分）、１０分；ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液で３回リンス；ラベルされたポリマー−ＡＰ結合型（ＬＰ−ＡＰキットの一部分）、１５分；ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液で３回リンス；基質：Ｆａｓｔ Ｒｅｄ（Ｆａｓｔ Ｒｅｄ基質システムから調製した、Ｌａｂ
Ｖｉｓｉｏｎ、カタログ番号ＴＡ−１２５−ＡＦ）；水中で１回リンス；および蒸留水中で２回リンス。
切片を、ヘマトキシリンＧｉｌｌ ＩＩＩ（ＶＷＲ（登録商標）、カタログ番号１５２０４−２６８）を用いて対比染色した。（この色素原は耐溶媒性ではない、そしてキシレン／アルコールと共に用いることができない）。ヘマトキシリン対比染色手順は、以下の通りであった：ヘマトキシリン、３０秒；ｄＨ２Ｏ；水道水でリンス、５分；ブルーイング試薬、３０秒；水道水でリンス、５分；ｄＨ２Ｏ。
Ｖｉｓｉｏｎ Ｍｏｕｎｔ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉａ（Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ、カタログ番号ＴＡ−１２５−ＵＧ）を用いて、手作業で、切片をカバースリップで覆った。番号１．５カバースリップガラスは、最善の顕微鏡分析（番号１．５カバースリップに最適化された対物レンズを用いる）を行うために用いた。Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ｆａｓｔ Ｒｅｄはいつまでも状態を保つことができないので、分析はＩＨＣ染色から１週間以内に行った。
上記の手順および条件は、ヒトメラノーマ腫瘍サンプル（市販の臨床サンプル）においてＥＲＫ １／２、フォスフォＥＲＫ、ＡＫＴ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、ｐ−ＡＫＴ、ｐ−ＲＢ、ＲＢおよびＫｉ６７を検出する上で、効果的である。
（実施例１１：ＬＯＸ異種移植片におけるＥＲＫリン酸化およびフォスフォｐＲｂリン酸化の時間依存的阻害）
ＬＯＸヒトメラノーマ細胞（Ｖ６００Ｅ ＢＲＡＦ変異を有している）は、ＤＣＴＤ腫瘍リポジトリ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）からもともとは取得した。この細胞を３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーターにおいて、ＤＣＴＤが推奨する増殖培地中に単層培養で増殖させた。細胞を皮下注射（ｓ．ｃ．）する日に、増殖培地を除去し、フラスコをＰＢＳで洗い、そして細胞をトリプシン処理を用いて収集した。これらの細胞を洗い、遠心分離によって収集した。その後、氷冷ＰＢＳ中に１×１０７細胞／ｍＬの密度で、再懸濁した。細胞（１×１０６細胞）を、２７ゲージ針を用いて０．１ｍＬ量を雌性の無胸腺ＮＵ／ＮＵマウスの右腋窩領域付近に接種し、接種後のマウスを生育した。化合物１０６を静脈内（ｉ．ｖ．）に、単一用量で（投与レベルは４０ｍｇ／ｋｇであり、体重１０ｇあたり０．１ｍＬの注入量であった）投与した。その後、投与後０、１、２、４、８、１２、２４、４８、７２時間を含む種々の時点でマウスを安楽死させた。腫瘍組織を解剖し、免疫組織化学のために１０％ホルマリンで固定した。
フォスフォＥＲＫ １／２の免疫組織化学的な検出のために、ウサギｍＡｂ ２０Ｇ１１を０．３６μｇ／ｍｌの終濃度で用いた（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号４３７６）。このｍＡｂは、ＥＲＫ１のＴｈｒ２０２およびＴｙｒ２０４（ＥＲＫ２のＴｈｒ１８５およびＴｙｒ１８７）が二重にリン酸化されているときならびにＴｈｒ２０２のみがリン酸化されているとき、ｐ４４およびｐ４２ ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１およびＥＲＫ２）の内因性レベルを検出する。条件は、本質的にはＩＨＣ手順（２）に記載されている条件であった（インキュベーションが４℃で一晩（１８時間）、ＥＤＴＡリトリーバル緩衝液を使用）。二次試薬は、アルカリフォスファターゼが結合しているヤギの抗ウサギ抗体であった。
結果を図９Ａに示す。フォスフォＥＲＫ染色を、０時間の時点で観察した。８時間の時点までに、フォスフォＥＲＫ染色は、観察できる染色が基本的に無いことが明白である状態まで確実に減少した。１２時間までにフォスフォＥＲＫ染色は再び観察されるようになり、そして約２４時間までに基線レベルまで本質的に回復した。細胞増殖のマーカーを検出するＫｉ６７染色は、最初の１２時間後から大幅に減少し、そして２４時間から４８時間の間に検出下限より下に抑えられ、７２時間まで抑えられた。
これらの結果は、フォスフォＥＲＫが、ゼアラレノンアナログ化合物を用いた処置の有効性をモニターするための薬力学的マーカーとして用いられ得ること、およびフォスフォＥＲＫレベルの低下はがんが処置に対して感受性であることを示していることを、実証している。
フォスフォＲＢの免疫組織化学的な検出のために、抗フォスフォ網膜芽細胞腫（ｐＳｅｒ７８０）抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｒ６２７５）を用いた（表１０）。条件はＩＨＣ手順（１）に記載されている条件であった（インキュベーションは室温で１時間、およびＥＤＴＡリトリーバル緩衝液を用いた）。二次試薬は、ホースラディシュペルオキシダーゼが結合している抗ウサギ抗体であった。
結果を、図９Ｂに示す。顕著なフォスフォｐＲＢ染色を初めは観察した；しかしながら、フォスフォｐＲＢレベルは４８時間から７２時間の間に検出下限より下に抑えられた。これらの結果は、フォスフォｐＲＢは、ゼアラレノンアナログ化合物を用いた処置の有効性をモニターするための薬力学的マーカーとして用いられ得ること、およびフォスフォｐＲＢレベルの低下はがんがゼアラレノンアナログ化合物を用いた処置に対して感受性であることを示していることを、実証している。
（実施例１２：皮下ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧヒト神経膠芽腫異種移植片の増殖に対するインビボでの化合物１０６処置の効果）
本研究の目的は、ヒトＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ神経膠芽腫異種移植片モデルにおける化合物１０６の抗がん活性を調査することであった。ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧヒト神経膠芽腫がん細胞（ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）変異を有する）を３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーターにおいて、ＡＴＣＣが推奨する増殖培地中に単層培養で増殖させた。インビボでの研究のため、細胞をＴ２２５フラスコ中で拡大させた。注射する日に、増殖培地を除去し、フラスコをＰＢＳで洗い、そして細胞をトリプシン処理を用いて収集した。これらの細胞を洗い、遠心分離によって収集し、そして氷冷ＰＢＳ中に再懸濁した。
雌性の無胸腺ＮＵ／ＮＵマウス（６週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ））に、５×１０６のＤＢＴＲＧ−０５ＭＧヒト神経膠芽腫がん細胞を皮下接種（ｓ．ｃ．）した。約１５０ｍｍ３の腫瘍を発生した動物を選び出し、無作為に５群に分けた。
この研究は、処置の１日目において、ビヒクル処置をされた群および４匹の薬物処置をされた群からなる８匹のマウスが一群である合計４０匹のマウスからなった。全ての処置は２１日目に開始した。化合物１０６を、Ｑ４Ｄ×３（２１、２５および２９日目）の投与計画で、静脈内に（ｉ．ｖ．）投与した（Ｑ４Ｄ×３＝合計３回の注射を４日ごとに行う）。投与は、５、１０、２０および４０ｍｇ／ｋｇの用量を、体重１０ｇあたり０．１ｍＬの注射量で行った。コントロールの群は、ビヒクルのみ（水中２０％Ｃａｐｔｉｓｏｌ；Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）（スルホブチルエーテルβシクロデキストリン（Ｓｕｌｆｏｂｕｔｙｌ Ｅｔｈｅｒ Ｂｅｔａ Ｃｙｃｏｌｏｄｅｘｔｒｉｎ））、ナトリウム塩；Ｃｙｄｅｘ、Ｉｎｃ．、ＫＳ））を用いて処置した。
毎日、マウスの全身の健康状態をモニターし、ならびに死亡数を記録した。処置の一日目から開始して、腫瘍の寸法および動物の体重を週に２回記録した。処置の一日目から開始して週に２回、ｓ．ｃ．腫瘍体積を測定し、動物の体重を量った。腫瘍体積をカリパス測定（ｍｍ）および以下の式を用いて決定した：
（ｌ×ｗ２）／２＝ｍｍ３
ここで、ｌおよびｗは各測定から得られた、大きい方の寸法、および小さい方の寸法をいう。
相対体重（ＲＢＷ）を以下のように計算した：
ＲＢＷ＝測定日の体重／処置の一日目の体重
各実験群における腫瘍体積および相対体重の平均ならびに平均の標準誤差（ＳＥＭ）を計算した。
本研究を、がん細胞移植後６０日目に終了した。化合物１０６処置の各群において、平均の腫瘍体積が処置の一日目から二回倍加した体積（４倍の腫瘍体積）に達したときにもまた、測定を終了した。
コントロール群対化合物１０６処置群の統計分析を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）後にダネットの多重比較検定を用いて、腫瘍体積に対する実験の試験化合物の各用量について行った。Ｐ＜０．０５の値を両側仮説下で統計的に有意であるとみなした。全ての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア（バージョン４、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて行った。この結果を図１０に示す。データは平均＋ＳＥＭで示している。２１、２５、および２９日目（Ｑ４Ｄ×３；図中に、矢印で示している）に動物の静脈内に処置した。アステリスク（＊）は対コントロール群でＰ＜０．０１であることを示している。
検査された全４用量（５、１０、２０、および４０ｍｇ／ｋｇ）での化合物１０６の投与は、統計上有意な抗がん活性を引き起こした。５ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの用量の化合物１０６を用いて処置された各群における８匹の動物の中の１匹は、６０日目においても腫瘍が無かった。これらの結果は、ｓ．ｃ．移植されたＤＢＴＲＧ−０５ＭＧヒト神経膠芽腫異種移植片（ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）変異を有する）の増殖は、試験された全ての用量（５、１０、２０、および４０ｍｇ／ｋｇ）での化合物１０６の断続的投与に対し高感受性であったことを示している。
（実施例１３．皮下ＬＯＸヒトメラノーマ異種移植片の増殖に対する化合物１０６処置のインビボでの効果）
本研究の目的は、ＬＯＸヒトメラノーマ異種移植片モデルにおける化合物１０６の抗がん活性を調査することであった。ＬＯＸヒトメラノーマ細胞（ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）変異を有する）を、ＤＣＴＤ腫瘍リポジトリ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）から取得した。細胞を３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーターにおいて、ＲＰＭＩ−１６４０増殖培地を用いてＴ２２５フラスコ中に単層培養で増殖させた。インビボ研究のため、細胞をＴ２２５フラスコ内でさらに培養した。これらの細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注射する日に、増殖培地を除去し、フラスコをＰＢＳで洗い、そして細胞をトリプシン処理を用いて収集した。細胞を洗い、３分間遠心分離にかけ、そしてその後氷冷ＰＢＳ中に再懸濁した。
雌性の無胸腺ＮＵ／ＮＵマウスに１×１０６ＬＯＸヒトメラノーマ細胞をｓ．ｃ．接種した。約１５０ｍｍ３の腫瘍を発生した動物を選び出し、無作為に５群に分けた。この研究は、処置の１日目において、ビヒクル処置をされた群および４匹の薬物処置をされた群からなる８匹のマウスが一群である合計４０匹のマウスからなった。全ての処置は６日目に開始した。化合物１０６を、Ｑ４Ｄ×３（６、１０および１４日目）の投与計画で、静脈内に（ｉ．ｖ．）投与した。投与は、５、１０、２０および４０ｍｇ／ｋｇの用量を、体重１０ｇあたり０．１ｍＬの注射量で行った。コントロールの群は、ビヒクル（水中２０％Ｃａｐｔｉｓｏｌ）のみを用いて処置した。
処置の一日目から開始して週に２回、ｓ．ｃ．腫瘍体積を測定し、動物の体重を量った。腫瘍体積および相対体重は（ＲＢＷ）を実施例１２に記載されているように決定した。
本研究を、がん細胞移植後５９日後に終了した。化合物１０６処置の各群において、平均の腫瘍体積が処置の一日目から二回倍加した体積（４倍の腫瘍体積）に達したときにもまた、測定を終了した。
ＡＮＯＶＡを用いて実施例１２に記載されているように統計分析を行った。そしてその結果を図１１に示す。データは平均＋ＳＥＭで示している。６、１０、および１４日目（Ｑ４Ｄ×３；図１１中に、矢印で示されている）に、動物に対し、静脈内に処置を行った。全ての生き残っている群における担腫瘍マウスの腫瘍の測定を、３７日目に停止した。そして、腫瘍測定を１０ｍｇ／ｋｇ（１／８）、２０ｍｇ／ｋｇ（５／８）、および４０ｍｇ／ｋｇ（７／８）の化合物１０６で処置した群における腫瘍のないマウスについて、継続した。本研究を５９日目で終わらせた。アステリスク（＊）はコントロール群に対しＰ＜０．０５であることを示している。
検査した３種類の用量（１０、２０、および４０ｍｇ／ｋｇ）での化合物１０６の投与は、統計的に有意な抗がん活性を引き起こした。加えて、１０、２０、または４０ｍｇ／ｋｇそれぞれの用量の化合物１０６を用いて処置された群の８匹の動物中、１、５、および７匹の動物は、研究の最後（５９日目）まで腫瘍が無かった。これらの結果は、ｓ．ｃ．移植されたＬＯＸヒトメラノーマ異種移植片（ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）変異を有し、ＰＴＥＮに関しては野生型である）の増殖は、１０、２０、および４０ｍｇ／ｋｇの用量の化合物１０６の断続的投与に対し高感受性であったことを示している。
化合物１０６を他の異種移植片モデル（胸部、結腸、およびメラノーマ細胞株が含まれるＢＲＡＦ変異細胞、または膵細胞株が含まれる野生型細胞が雌性ヌードマウスに皮下に移植された）においても検査した。化合物１０６またはビヒクルコントロールを静脈に投与した。ＢＲＡＦ変異異種移植片モデルにおいて、化合物１０６が４０ｍｇ／ｋｇであって２週間ＱＤ×５の投与レジメンのとき、化合物１０６はその処置中において腫瘍の静止（しかし退縮ではない）（＞８０％の腫瘍の増殖阻害）から約７３％の腫瘍の退縮までの範囲の阻害効果を示した。野生型異種移植片モデルにおいては、化合物１０６が４０ｍｇ／ｋｇであって２週間ＱＤ×５の投与レジメンのとき、化合物１０６は３０％から４０％の範囲で腫瘍退縮という阻害効果を示した。
（等価）
当業者は、本明細書に記載された特定の実施形態および方法に対する多くの等価なものを認識し、すなわち、慣用された実験法のみを用いて確かめることが可能である。そのような等価なものが、以下の特許請求の範囲に含まれることを意図する。

Claims (1)

  1. 明細書中に記載の発明。
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