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JP2010525826A - 癌を治療するためのｍｉｒ３４治療剤を含む組成物 - Google Patents

癌を治療するためのｍｉｒ３４治療剤を含む組成物 Download PDF

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Abstract

ある態様において、本発明は、全般的に、癌の治療のための、ｍｉＲ−３４及びｍｉＲ−３４と機能的及び構造的に関連するｓｉＲＮＡを含む組成物に関する。

Description

本発明は、全般的に、癌の治療のための、ｍｉＲ３４及び、ｍｉＲ３４に機能的及び構造的に関連するｓｉＲＮＡを含む組成物に関する。
以下は、ＴＰ５３及びＲＮＡｉに関連する従来技術の考察である。この考察は、続く本発明の様々な実施形態の理解のためにのみ提供される。本明細書中の詳説を通して引用される要約及び参考文献は、以下の内容の何れも、主張される発明に対する先行技術であることを承認するものではない。
ＴＰ５３腫瘍サプレッサーは、遺伝毒性ストレス後のタンパク質安定化により活性化される。この活性化は、紫外線又は電離放射線ならびに多くのＤＮＡ障害性化学療法剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン及びブレオマイシンなど）により誘導され得る。ＴＰ５３の活性化により、Ｓ期に入る前の細胞周期停止及び／又はアポトーシスが起こる。ＴＰ５３活性化によってまた、多くのＤＮＡ修復経路が開始される（Ｆｅｉ及びＥｌ’Ｄｅｉｒｙ、２００３、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：５７７４−８３）。ＴＰ５３における突然変異（ヒト癌の約５０％に存在する。（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：４９−５３））の結果、チェックポイント異常が起こるが、これは無制限の細胞増殖、ゲノム不安定性及び発癌性突然変異の蓄積の一因となり得る（Ｐｒｉｖｅｓ及びＨａｌｌ、１９９９、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１８６：１１２−２６）。臨床において、ＴＰ５３陽性腫瘍細胞及びＴＰ５３欠損腫瘍細胞の両方に効果的である化学療法剤を同定することに重点が置かれてきた（Ｌｏｗｅら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：８０７−８１０；Ｌａｃｒｏｉｘら、２００６、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ １３：２９３−３２５；Ｌｅｖｅｓｑｕｅ及びＥａｓｔｍａｎ、２００７、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２８：１３−２０）。従って、ヒト腫瘍におけるＴＰ５３経路の状態を予測することは、ある種の癌タイプに対する有効な癌療法を選択するための重要な要素となろう。
ＴＰ５３のＤＮＡ配列決定から不活性化する突然変異が明らかになり得るが、別の機構によりＴＰ５３経路を不活性化することができる。例えば、ｐ１９（ＡＲＦ）（ＩＮＫ４ａ−ＡＲＦ遺伝子座によりコードされる。）は、ＴＰ５３を活性化することにより細胞増殖を阻害する（Ｓｈｅｒｒら、２００５、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．７０：１２９−３７）。意義深いことに、多くのヒト癌は、ＩＮＫ４ａ−ＡＲＦ遺伝子座の欠失、抑制（サイレンシング）又は突然変異を示す。その他の腫瘍は、ＴＰ５３安定性及び転写活性の重要な調節因子であるＭＤＭ２の異常なスプライス型を過剰発現又は発現する（Ｌｅｖａｎ−Ｃｏｈｅｎら、２００５、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ２３：１８３−９２）。ＴＰ５３経路の不活性化は、ヒトパピローマウイルスＥ６タンパク質などのウイルス因子によっても引き起こされ得るが、これは、分解のために、ＴＰ５３に結合し、ＴＰ５３を標的化する。従って、ＴＰ５３経路の完全性を予測することは、多くの患者の腫瘍において直接的ではない可能性がある。Ｍｉｌｌｅｒら（２００５、ＰＮＡＳ ３８：１３５５０−５５）は、癌患者のＴＰ５３経路の状態を予測するための遺伝子発現特性を発展させたが、提示されるデータは、臨床での乳癌の挙動を予測することにおけるＴＰ５３経路状態の重要性を示す。
発生の調節因子として機能することに加えて、ｍｉＲＮＡが癌遺伝子及び腫瘍サプレッサーとして働き得（Ａｋａｏら、２００６、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ １６：８４５−５０；Ｅｓｑｕｅｌａ−Ｋｅｒｓｃｈｅｒ及びＳｌａｃｋ、２００６、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．、６：２５９−２６９；Ｈｅら、２００５、Ｎａｔｕｒｅ ４３５：８２８−３３）、ある状況下で、ヒト癌を診断し、分類するために、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを使用することができる（Ｌｕら、２００５、Ｎａｔｕｒｅ ４３５：８３４−３８；Ｖｏｌｉｎｉａら、２００６、ＰＮＡＳ １０３：２２５１−６１；Ｙａｎａｉｈａｒａら、２００６、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ９：１８９−１９８）という認識が高まっている。癌におけるＴＰ５３の意義及びＴＰ５３の状態に対する臨床的バイオマーカーの発見の重要性を考えると、ＴＰ５３経路の制御に関与する、ｍｉＲＮＡを含むＲＮＡ転写産物を同定する必要性がある。
Ｆｅｉ及びＥｌ’Ｄｅｉｒｙ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２、２００３年、ｐ．５７７４−８３ Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３、１９９１年、ｐ．４９−５３ Ｐｒｉｖｅｓ及びＨａｌｌ、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１８６、１９９９年、ｐ．１１２−２６ Ｌｏｗｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６、１９９４年、ｐ．８０７−８１０ Ｌａｃｒｏｉｘ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ １３、２００６年、ｐ．２９３−３２５ Ｌｅｖｅｓｑｕｅ及びＥａｓｔｍａｎ、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２８、２００７年、ｐ．１３−２０ Ｓｈｅｒｒ他、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．７０、２００５年、ｐ．１２９−３７ Ｌｅｖａｎ−Ｃｏｈｅｎ他、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ２３、２００５年、ｐ．１８３−９２ Ｍｉｌｌｅｒ他、ＰＮＡＳ ３８、２００５年、ｐ．１３５５０−５５ Ａｋａｏ他、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ １６、２００６年、ｐ．８４５−５０ Ｅｓｑｕｅｌａ−Ｋｅｒｓｃｈｅｒ及びＳｌａｃｋ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．、６、２００６年、ｐ．２５９−２６９ Ｈｅ他、Ｎａｔｕｒｅ ４３５、２００５年、ｐ．８２８−３３ Ｌｕ他、Ｎａｔｕｒｅ ４３５、２００５年、ｐ．８３４−３８ Ｖｏｌｉｎｉａ他、ＰＮＡＳ １０３、２００６年、ｐ．２２５１−６１ Ｙａｎａｉｈａｒａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ９、２００６年、ｐ．１８９−１９８
要約
ある態様において、単離合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物が提供されるが、この合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物は、（ｉ）１８から２５個のヌクレオチドのヌクレオチド配列からなるガイド鎖核酸分子（前記ガイド鎖ヌクレオチド配列は、シード領域ヌクレオチド配列及び非シード領域ヌクレオチド配列を含み、前記シード領域は前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１から１２からなり、前記非シード領域は、前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１３から３’末端からなり、前記ガイド鎖の位置１は前記ガイド鎖の５’末端に相当し、前記シード領域は、天然のマイクロＲＮＡのシード領域配列と同一である少なくとも６個のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列をさらに含む。）と、（ｉｉ）１８から２５個のヌクレオチドのヌクレオチド配列からなるパッセンジャー鎖核酸分子（前記パッセンジャー鎖は、ガイド鎖と基本的に相同であるヌクレオチド配列を含み、前記パッセンジャー鎖核酸分子は、ガイド鎖のシード領域の正確な逆相補体配列と比較して、１個のヌクレオチド配列の相違を有し、この１個のヌクレオチドの相違はパッセンジャー鎖のヌクレオチド位置１３から３’末端内に位置する。）と、を含む。
別の態様において、単離核酸分子が提供され、この核酸分子は、１８から２５個のヌクレオチドのガイド鎖ヌクレオチド配列を含み、前記ガイド鎖ヌクレオチド配列はシード領域ヌクレオチド配列及び非シード領域ヌクレオチド配列を含み、前記シード領域は、基本的に前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１から１２からなり、前記非シード領域が基本的に前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１３から３’末端からなり、前記ガイド鎖の位置１は前記ガイド鎖の５’末端に相当し、前記シード領域は、配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号３１からなる群から選択されるヌクレオチド配列と配列が同一である少なくとも６個のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列をさらに含み、前記単離核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号２９からなる群から選択されるヌクレオチド配列と比較して、少なくとも１個のヌクレオチド配列の相違を有する。
別の態様において、少なくとも１つの低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）（前記ｓｉＮＡは、１８から２５個のヌクレオチドのガイド鎖ヌクレオチド配列を含み、前記ガイド鎖ヌクレオチド配列はシード領域ヌクレオチド配列及び非シード領域ヌクレオチド配列を含み、前記シード領域は、基本的に前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１から１２からなり、前記非シード領域は基本的に前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１３から３’末端からなり、前記ガイド鎖の位置１は前記ガイド鎖の５’末端に相当し、前記シード領域は、配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号３１からなる群から選択される配列内の６個の連続ヌクレオチドと同一である少なくとも６個のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列をさらに含む。）と、送達物質と、を含む組成物が提供される。
別の態様において、本発明は、少なくとも１つの合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物及び送達物質を含む組成物を提供し、この合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物は、
（ｉ）１８から２５個のヌクレオチドのヌクレオチド配列からなるガイド鎖核酸分子（前記ガイド鎖ヌクレオチド配列は、シード領域ヌクレオチド配列及び非シード領域ヌクレオチド配列を含み、前記シード領域は、前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１から１２からなり、前記非シード領域は、前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１３から３’末端からなり、前記ガイド鎖の位置１は前記ガイド鎖の５’末端に相当し、前記シード領域は、天然のマイクロＲＮＡのシード領域と配列が同一である少なくとも６個のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列をさらに含む。）と、
（ｉｉ）１８から２５個のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むパッセンジャー鎖核酸分子（前記パッセンジャー鎖は、ガイド鎖と基本的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、前記パッセンジャー鎖核酸分子は、ガイド鎖のシード領域の正確な逆相補体配列と比較して、１個のヌクレオチド配列の相違を有し、この１個のヌクレオチドの相違は、前記パッセンジャー鎖のヌクレオチド位置１３から３’末端内に位置する。）、
を含む。
本発明の単離核酸分子及び組成物は、哺乳動物対象における癌の治療のためなど、哺乳動物細胞の細胞分裂を阻害するために使用され得る。
本発明の先述の態様及び多くの付随する長所は、付随の図面と組み合わせられた場合に、次の詳細な説明を参照することによってより詳細に理解されるようになるように、より容易に認識されよう。
図１は、対応する「シード領域」を含む、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ及びｍｉＲ−４４９のＲＮＡ配列を示す。 図２Ａは、所定のＤＮＡ含量（蛍光強度により測定、Ｘ軸）とともに細胞数（Ｙ軸）を示す、野生型ｐ５３を有する細胞のヒストグラムである。 図２Ｂは、所定のＤＮＡ含量（蛍光強度により測定、Ｘ軸）とともに細胞数（Ｙ軸）を示す、ドキソルビシンで処理した野生型ｐ５３を有する細胞のヒストグラムである。 図２Ｃは、所定のＤＮＡ含量（蛍光強度により測定、Ｘ軸）とともに細胞数（Ｙ軸）を示す、ＴＰ５３ ｓｈＲＮＡを遺伝子移入した野生型ｐ５３を有する細胞のヒストグラムである。 図２Ｄは、所定のＤＮＡ含量（蛍光強度により測定、Ｘ軸）とともに細胞数（Ｙ軸）を示す、ＴＰ５３ ｓｈＲＮＡを遺伝子移入し、ドキソルビシンで処理した野生型ｐ５３を有する細胞のヒストグラムであり、ＴＰ５３の分解により、ＤＮＡ損傷後、Ｇ０／Ｇ１チェックポイントが損なわれることを示す。
詳細な説明
このセクションは、本明細書中で開示される本発明を代表する多くの様々な態様及び実施形態の詳細な説明を与える。この説明は、、様々な詳細及び特異性の、いくつかの典型的説明のためのものである。これらの実施形態のその他の特性及び長所は、様々な実施例を含む、本明細書中で与えられるさらなる説明から明らかである。与えられる実施例は、本発明の様々な実施形態を実施することにおいて有用な様々な成分及び方法を説明する。この実施例は、主張される本発明を限定するものではない。本開示に基づき、当業者は、本発明を実施するために有用なその他の成分及び方法を識別し、使用することができる。
本願は、参照により本明細書によって組み込まれる、米国仮出願第６０／９２７，６２１号（２００７年５月３日提出）からの優先権を主張する。
Ｉ．定義
別段の定義がない限り、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術者により一般に理解される意味を有する。実施者は、当技術分野の定義及び用語については、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）及びＡｕｓｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４７）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照する。
本発明との関連で「約」という用語の使用は、具体的な要素、特徴又はその他の特質の正確な測定に固有の問題を含蓄することであると考えられる。従って、「約」という用語は、主張される発明に関連して本明細書中で使用される場合、単純に、単一もしくは集団的な検定を考慮に入れる量又は大きさ及びその量又は大きさを決定することに一般に関連するその他の標準誤差を指す。例えば、Ｔｒｉｓの「約」１００ｍＭの濃度は、５ｍＭが、その濃度への到達における集合的エラーバーに相当する場合、１００ｍＭ±０．５ｍＭの量を包含し得る。このようにして、この出願において指定される何らかの大きさ又は量は、その大きさ又は量に、秤、ピペットマン、ピペット、メスシリンダーなどの検定又は測定機器に付随する誤差が出やすい場合、「約」という用語とともに使用され得る。
「ａ」又は「ａｎ」という用語の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書において「含む」という用語と組み合わせて使用される場合、「１」を意味し得るが、これは、「１以上、「少なくとも１」及び「１又は複数」の意味とも合致する。特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、代替物のみを指すことが明確に指示されない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるか又は代替物は相互排他的であるが、開示は、代替物のみ及び「及び／又は」を指す定義を支持する。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語（及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」などの「含む」の何らかの形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（及び「ｈａｖｅ」及び「ｈａｓ」などの「有する」の何らかの形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（及び「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」及び「ｉｎｃｌｕｄｅ」などの「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の何らかの形態）又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（及び「ｃｏｎｔａｉｎｓ」及び「ｃｏｎｔａｉｎ」などの「含有する」の何らかの形態）は、包括的であるか又はオープンエンドであり、さらなる、列挙されない要素又は方法段階を除外しない。
本明細書中で使用される場合、数に関して「およそ」又は「約」という用語は、一般に、別段の断りがない限り、又は内容から明らかとならない限り、その数の何れかの方向（それを超えるか又はそれ未満）での５％の範囲内に入る数を含むものと解釈される（このような数が可能な値の１００％を超える場合を除く。）。範囲が指定される場合、エンドポイントは、別段の断りがないか又は内容から明らかとならない限り、範囲内に含まれる。
本願で考察されるあらゆる実施形態が、本発明の何らかの方法、キット、試薬又は組成物に関して実行され得ると考えられる（又はその逆も成り立つ。）。さらに、本発明の方法を達成するために本発明の組成物を使用することができる。
本明細書中で使用される場合、「遺伝子」という用語は、当技術分野で理解されるとおりのその意味を有する。しかし、当業者にとって当然のことながら、「遺伝子」という用語は、遺伝子調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）及び／又はイントロン配列を含み得る。さらに当然のことながら、遺伝子の定義は、タンパク質をコードしないがｔＲＮＡなどの機能的ＲＮＡ分子をコードする核酸への言及を含む。明確にするために、「遺伝子」という用語は、一般に、タンパク質をコードする核酸の一部を指し；この用語は、場合によっては、調節配列を包含し得る。この定義は、非タンパク質コード発現単位に対する「遺伝子」という用語の使用を排除するが、殆どの場合、本明細書で使用される場合、この用語はタンパク質コード核酸を指すことを明確にしておく。場合によっては、遺伝子は、転写又はメッセージ産生又は組成に関与する調節配列を含む。その他の実施形態において、遺伝子は、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードする転写される配列を含む。本明細書中に記載の専門用語と一致して、「単離遺伝子」は、その他のこのような配列（その他の天然の遺伝子、調節配列、ポリペプチド又はペプチドコード配列など）から実質的に単離された、転写される核酸、調節配列、コード配列などを含み得る。この点において、「遺伝子」という用語は、転写されるヌクレオチド配列及びその相補体を含む核酸を指すために、簡素化の目的で使用される。
特定の実施形態において、転写されるヌクレオチド配列は、少なくとも１つの機能的タンパク質、ポリペプチド及び／又はペプチドコード単位を含む。当業者により理解されるように、この機能的用語「遺伝子」は、ゲノム配列、ＲＮＡもしくはｃＤＮＡ配列の両方又はより小さい改変核酸セグメント（以下に限定されないが、遺伝子の非転写プロモーター又はエンハンサー領域を含む、遺伝子の非転写部分の核酸セグメントを含む。）を含む。より小さい改変遺伝子核酸セグメントは、核酸操作技術を用いて、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、機能タンパク質、突然変異体及び／又はこのようなものを発現し得るか又は発現するように改造され得る。
本明細書中で使用される場合、「マイクロＲＮＡ種」、「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」又は「ｍｉ−Ｒ」という用語は、哺乳動物を含む多彩な真核生物において発現される低分子の非タンパク質コードＲＮＡ分子を指す。マイクロＲＮＡ分子は、通常、１５から１２０個のヌクレオチドの範囲の長さを有し、大きさは、特異的マイクロＲＮＡ種及び細胞内プロセシングの程度に依存する。成熟した完全にプロセシングされたｍｉＲＮＡは、約１５から３０、１５から２５又は２０から３０個のヌクレオチド長であり、約１６から２４、１７から２３、１８から２２、１９から２１又は２１から２４個の間のヌクレオチド長であることが多い。マイクロＲＮＡは、プロセシングされた配列ならびに対応する長い一次転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）及びプロセシングされた前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を含む。いくつかのマイクロＲＮＡ分子は、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現を制御するために生細胞において機能する。代表的な一連のマイクロＲＮＡ種は、一般に公開されている、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂでアクセス可能な、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：Ｄ１０９−Ｄ１１１（２００４）及びＧｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４：Ｄ１４０−Ｄ１４４（２００６）、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅウェブサイトにおいて記載のような、ｍｉＲ Ｂａｓｅ配列データベースに記載されている。
本明細書中で使用される場合、「マイクロＲＮＡファミリー」という用語は、Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ、Ｊ．ら、ＰｌｏＳ ｂｉｏｌ ３（３）：ｐｅ８５（２００５）で記載のように、「シード領域」とも呼ばれる、マイクロＲＮＡ分子の５’末端のヌクレオチド位置１から１２内の少なくとも６個の連続ヌクレオチドにわたり同一である一群のマイクロＲＮＡ種を指す。
本明細書中で使用される場合、「マイクロＲＮＡファミリーメンバー」という用語は、マイクロＲＮＡファミリーのメンバーであるマイクロＲＮＡ種を指す。
本明細書中で使用される場合、「ＲＮＡ干渉」又は「ＲＮＡｉ」という用語は、抑制される遺伝子の配列と相補的であるｉＲＮＡガイド鎖においてシード領域配列を有するｉＲＮＡ物質により開始される、動物及び植物における、配列特異的な、転写後遺伝子抑制のプロセスを介した、ｉＲＮＡ物質（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）による遺伝子発現の抑制又は低下を指す。
本明細書中で使用される場合、「ｉＮＡ物質」という用語（「干渉核酸物質」に対する略語）は、核酸物質、例えばＲＮＡ又は化学修飾されたＲＮＡを指し、これは、標的遺伝子の発現を下方制御し得る。理論に縛られることを望まないが、ｉＮＡ物質は、標的ｍＲＮＡの転写後切断を含む多くの機構又は転写前もしくは翻訳前機構の１以上により作用し得る。ｉＮＡ物質は、１本鎖（ｓｓ）を含み得るか又は複数鎖を含み得、例えばこれは２本鎖（ｄｓ）ｉＮＡ物質であり得る。
本明細書中で使用される場合、「１本鎖ｉＲＮＡ物質」又は「ｓｓＲＮＡ」という用語は、１つの分子からなるｉＲＮＡ物質である。これは、鎖内対形成により形成される２本鎖形成領域を含み得、例えば、これは、ヘアピン又はパンハンドル構造であり得るか又はヘアピン又はパンハンドル構造を含み得る。本発明のｓｓＲＮＡ物質は、２本鎖ｓｉＲＮＡにプロセシングされる、ｓｈＲＮＡなどのステムループ構造を導入する転写産物を含む。
本明細書中で使用される場合、「ｄｓ ｉＮＡ物質」という用語は、共有結合しない２本の鎖を含むｄｓＮＡ（２本鎖核酸（ＮＡ））物質であり、鎖間ハイブリッド形成により、２本鎖構造の領域が形成され得る。本発明のｄｓＮＡ物質は、それらが哺乳動物細胞においてインターフェロン反応を誘引しないように十分に短いサイレンシングｄｓＮＡ分子を含む。
本明細書中で使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、低分子干渉ＲＮＡを指す。ｓｉＲＮＡは、約１５−６０、１５−５０、１５−５０又は１５−４０（二本鎖）ヌクレオチド長、より一般的には約１５−３０、１５−２５又は１９−２５（二本鎖）ヌクレオチド長及び好ましくは約２０−２４又は約２１−２２又は２１−２３（二本鎖）ヌクレオチド長の低分子干渉ＲＮＡを含む（例えば、２本鎖ｓｉＲＮＡの各相補的配列は、１５−６０、１５−５０、１５−５０、１５−４０、１５−３０、１５−２５又は１９−２５ヌクレオチド長、好ましくは約２０−２４又は約２１−２２又は２１−２３ヌクレオチド長、好ましくは１９−２１ヌクレオチド長であり、２本鎖ｓｉＲＮＡは、約１５−６０、１５−５０、１５−５０、１５−４０、１５−３０、１５−２５又は１９−２５塩基対長、好ましくは約２０−２４又は約２１−２２又は１９−２１又は２１−２３塩基対長である。）。ｓｉＲＮＡ２本鎖は、約１から約４ヌクレオチド、好ましくは約２から約３ヌクレオチドの３’突出部及び５’リン酸末端を含み得る。ある実施形態において、ｓｉＲＮＡは、末端リン酸を欠く。
本発明のｓｉＲＮＡ分子の非限定例は、自己相補的センス及びアンチセンス領域（アンチセンス領域は、標的核酸分子又はその一部におけるヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列（あるいは、分子が２本の別個の鎖を含有する場合、ガイド領域又はガイド鎖と呼ばれる。）を含む。）と、標的核酸配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を有するセンス領域（分子が２本の別個の鎖を含有する場合、パッセンジャー領域又はパッセンジャー鎖とも呼ばれる。）と、を含む、２本鎖ポリヌクレオチド分子を含み得る。ｓｉＲＮＡは、２本の別個のオリゴヌクレオチドから編成され得、ここで一方の鎖はセンス鎖であり、他方の鎖はアンチセンス鎖であり、アンチセンス及びセンス鎖は自己相補的であり（即ち、各鎖は、他方の鎖のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含み；例えばアンチセンス鎖及びセンス鎖は２本鎖又は２本鎖構造を形成し、例えば２本鎖領域は、約１８から約３０、例えば約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０塩基対である。）；アンチセンス鎖（ガイド鎖）は、標的核酸分子のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列又はその一部を含み、センス鎖（パッセンジャー鎖）は、標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列又はその一部を含む（例えば、ｓｉＲＮＡ分子の約１５から約２５ヌクレオチドは、標的核酸又はその一部と相補的である。）。通常、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、約１７から約２９塩基対、好ましくは１９から２１塩基対長の２本鎖ＲＮＡ分子を指し、この一方の鎖は標的ｍＲＮＡと相補的であり、標的ｍＲＮＡを有する細胞に添加される場合、又はインビボの細胞中で産生される場合、標的ｍＲＮＡの分解を引き起こす。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡと完全に相補的である。しかし、これは、１又は２個のミスマッチ塩基対を有し得る。
あるいは、ｓｉＲＮＡは１本のオリゴヌクレオチドから編成され、ｓｉＲＮＡの自己相補的センス及びアンチセンス領域は、核酸に基づく又は核酸ではないリンカーにより連結される。ｓｉＲＮＡは、自己相補的センス及びアンチセンス領域を有する、２本鎖、非対称２本鎖、ヘアピン又は非対称ヘアピン二次構造を伴うポリヌクレオチドであり得、アンチセンス領域は、別個の標的核酸分子のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列又はその一部を含み、センス領域は、標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列又はその一部を有する。ｓｉＲＮＡは、２以上のループ構造及び、自己相補的センス及びアンチセンス領域を含むステムを有する環状１本鎖ポリヌクレオチドであり得、このアンチセンス領域は、標的核酸分子のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列又はその一部を含み、センス領域は、標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列又はその一部を有し、この環状ポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉを媒介することができる活性のあるｓｉＲＮＡ分子を生成させるために、インビボ又はインビトロの何れかでプロセシングされ得る。ｓｉＲＮＡはまた、標的核酸分子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する１本鎖ポリヌクレオチドも含み得（例えばこのようなｓｉＲＮＡ分子は、標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列又はその一部がｓｉＲＮＡ分子内に存在する必要はない。）、この１本鎖ポリヌクレオチドは、５’−リン酸などの末端リン酸基（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００２、Ｃｅｌｌ １１０：５６３−５７４及びＳｃｈｗａｒｚら、２００２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ、７０：５３７−５６８を参照）又は５’，３’−二リン酸をさらに含み得る。ある実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、別個のセンス及びアンチセンス配列又は領域を含み、このセンス及びアンチセンス領域は、当技術分野で公知のように、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー分子により共有結合されるか、又は、あるいはイオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用及び／又はスタッキング相互作用により非共有結合される。ある実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子の発現の阻害を引き起こすように標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。
本明細書中で使用される場合、ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含有する分子に限定される必要はないが、化学修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドをさらに包含し得る。ＷＯ２００５／０７８０９７；ＷＯ２００５／００２０５２１及びＷＯ２００３／０７０９１８は、ＲＮＡｉ分子に対する様々な化学修飾を詳述しており、各参考文献の内容は、その全体において参照により本明細書によって組み込まれる。ある実施形態において、例えば、低分子干渉核酸分子は、２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠き得る。ｓｉＲＮＡは、化学的に合成されるか又はプラスミドによりコードされ得る（例えば、ヘアピンループを伴う二本鎖へと自動的に折り畳まれる配列として転写される。）。ｓｉＲＮＡはまた、Ｅ．コリＲＮａｓｅＩＩＩ又はＤｉｃｅｒを用いて、より長いｄｓＲＮＡの切断によっても生成させることができる（例えば、約２５ヌクレオチド長より長いｄｓＲＮＡ）。これらの酵素は、ｄｓＲＮＡを生物学的に活性があるｓｉＲＮＡへとプロセシングする（例えば、Ｙａｎｇら、２００２ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９９：９９４２−７；Ｃａｌｅｇａｒｉら、２００２、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９９：１４２３６；Ｂｙｒｏｍら、２００３、Ａｍｂｉｏｎ ＴｅｃｈＮｏｔｅｓ １０（１）：４−６；Ｋａｗａｓａｋｉら、２００３、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：９８１−７；Ｋｎｉｇｈｔ及びＢａｓｓ、２００１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：２２６９−７１；及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎら、１９６８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３：８２参照）。長いｄｓＲＮＡは、遺伝子転写産物全体又は部分的な遺伝子転写産物をコードし得る。
本明細書中で使用される場合、「％修飾」は、修飾されている、ｓｉＲＮＡの各鎖における、又は集合的なｄｓＲＮＡにおける、ヌクレオチド数を指す。従って、アンチセンス鎖の１９％修飾は、２１ヌクレオチド配列（２１ｍｅｒ）中４ヌクレオチド／ｂｐ以下の修飾を指す。１００％は、完全修飾ｄｓＲＮＡを指す。化学修飾の程度は、当業者にとって周知の様々な要素に依存する。例えば、標的ｍＲＮＡ、誤ったサイレンシング、エンドヌクレアーゼ分解の程度などである。
本明細書中で使用される場合、「ｓｈＲＮＡ」又は「短いヘアピンＲＮＡ」という用語は、生理的条件で、約１７から約２９塩基対長の２本鎖ステムを伴うステムループ構造を形成するＲＮＡ分子を指し、塩基対ステムの一方の鎖は、標的遺伝子のｍＲＮＡと相補的である。ｓｈＲＮＡステムループ構造のループは、インビボで標的遺伝子を不活性化させる何らかの適切な長さであり得る。このループは３から３０ヌクレオチド長であり得るが、通常、これは１−１０ヌクレオチド長である。塩基対形成したステムは、完全に塩基対形成し得るか又は１もしくは２個のミスマッチ塩基対を有し得る。２本鎖部分は、通常はそうではないが、１以上の対形成しないヌクレオチドからなる１以上の突出部を含有する。ｓｈＲＮＡは、塩基対形成ステムから伸びる非塩基対形成５’及び３’配列を有し得る。しかし、通常、５’伸長はない。ＧはポリメラーゼＩＩＩにより転写される第一のヌクレオチドであるので、５’末端におけるｓｈＲＮＡの第一のヌクレオチドはＧである。Ｇが標的配列の第一の塩基として存在しない場合、Ｇは特異的な標的配列の前に付加され得る。５’Ｇは通常、塩基対形成ステムの部分を形成する。通常、ｓｈＲＮＡの３’末端は、転写終結シグナルであるポリＵセグメントであり、塩基対形成構造を形成しない。本願に記載のように、及び当技術者にとって公知のように、ｓｈＲＮＡは、保存されている細胞ＲＮＡｉ機構によりｓｉＲＮＡへとプロセシングされる。従って、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの前駆体であり、一般に、同様に標的ｍＲＮＡ転写産物の発現を阻害することができる。説明目的のために、ある実施形態において、本発明のｓｈＲＮＡコンストラクトは、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ又はｍｉＲ−４４９により標的とされる１以上のｍＲＮＡを標的とする。標的遺伝子転写産物に対するアンチセンスであるｓｈＲＮＡの鎖はまた「ガイド鎖」としても知られる。
本明細書中で使用される場合、「マイクロＲＮＡ反応性標的部位」という用語は、マイクロＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的であるか又は基本的に相補的である、約５から約２５ヌクレオチド（５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチドなど）の範囲の大きさの核酸配列を指す。ある実施形態において、マイクロＲＮＡ反応性標的部位は、マイクロＲＮＡ分子のシード領域に対して相補的である、少なくとも６個の連続ヌクレオチド、少なくとも７個の連続ヌクレオチド、少なくとも８個の連続ヌクレオチド又は少なくとも９個のヌクレオチドを含む（即ち、「シード領域」と呼ばれる、マイクロＲＮＡ分子の５’末端のヌクレオチド位置１から１２内）。
「標的遺伝子の発現を阻害する」という句は、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉ物質が、標的遺伝子の発現を抑制するか、低下させるか又は阻害する能力を指す。「阻害する」、「下方制御する」又は「低下させる」に対して、別の言い方をすると、遺伝子の発現又は１以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子もしくは同等のＲＮＡ分子のレベル又は１以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性が、ＲＮＡｉ物質の非存在下で観察されるもの以下に低下することを意味する。例えば、本発明の実施形態は、ｍｉＲ３４ａ様ｓｉＲＮＡ分子を導入することにより、ｍｉ−３４ａ様ｓｉＲＮＡ分子が導入されていない対照細胞でのＴＰ５３経路遺伝子に対して観察されるレベル以下に、１以上のＴＰ５３経路遺伝子の発現を阻害、下方制御又は低下させることを目論む。別の実施形態において、阻害、下方制御又は低下は、例えば、スクランブル配列又はミスマッチがあるｓｉＲＮＡ分子の存在下で観察されるレベル以下の標的ｍＲＮＡの阻害を目論む。さらに別の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ（例えば１以上のＴＰ５３経路遺伝子ｍＲＮＡレベルを下方制御するｓｉＲＮＡ）の存在下での本発明のｓｉＲＮＡ分子による遺伝子発現の阻害、下方制御又は低下は、それが存在しない場合よりも大きい。ある実施形態において、遺伝子発現の阻害、下方制御又は低下は、ＲＮＡｉが介在する標的核酸分子（例えばＲＮＡ）の切断又は翻訳の阻害などの転写後抑制と関連する。
遺伝子抑制の程度を調べるために、標的遺伝子の発現を、抑制する、低下させる又は阻害するｓｉＲＮＡと、試験試料（例えば、標的遺伝子を発現する関心のある生物由来の生体試料又は標的遺伝子を発現する培養物中の細胞試料）を接触させる。試験試料中の標的遺伝子の発現を、ｓｉＲＮＡと接触させない対照試料（例えば、標的遺伝子を発現する関心のある生物由来の生体試料又は標的遺伝子を発現する培養物中の細胞試料）中の標的遺伝子の発現と比較する。対照試料（即ち標的遺伝子を発現する試料）を１００％の値とする。対照試料に対する試験試料の値が約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％又は１０％である場合、標的遺伝子の発現の、抑制、阻害又は低下が達成される。適切なアッセイには、例えば、ドットブロット、ノザンブロット、インシトゥハイブリッド形成、ＥＬＩＳＡ、マイクロアレイハイブリッド形成、免疫沈降、酵素機能などの当業者にとって公知の技術を用いたタンパク質又はｍＲＮＡレベルの試験ならびに当業者にとって公知の表現型アッセイが含まれる。
ｓｉＲＮＡ又はＲＮＡｉ物質の「有効量」又は「治療的有効量」は、所望の効果、例えばｓｉＲＮＡ又はＲＮＡｉ物質の非存在下で検出される正常発現レベルに対して、標的配列の発現阻害を生じさせるのに十分な量である。ｓｉＲＮＡ又はＲＮＡｉ物質による標的遺伝子又は標的配列の発現阻害は、標的遺伝子ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルが、対照試料の標的遺伝子ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルに対して、約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％又は０％である場合に達成される。
本明細書中で使用される場合、単離核酸分子に関して「単離される」という用語は、人間の介在を通じて、天然の状態から改変又は除去されるものである。例えば、生きている動物において天然に存在するＲＮＡは「単離され」ていない。部分的又は完全にその天然状態の共存物質から分離されている合成ＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ又はマイクロＲＮＡ分子は、「単離され」ている。このようにして、細胞に意図的に送達させられるか又は細胞において発現させられるｍｉＲＮＡ分子は、「単離」核酸分子とみなされる。
「調節する」は、遺伝子の発現又は１以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子又は同等のＲＮＡ分子のレベル又は１以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性が調節物質の非存在下で観察されるものより大きいか又は小さいように、遺伝子の発現又は１以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子又は同等のＲＮＡ分子のレベル又は１以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性が、上方制御されるか又は下方制御されることを意味する。例えば、「調節する」という用語は、「阻害する」を意味し得るが、「調節する」という用語の使用はこの定義に限定されない。
本明細書中で使用される場合、「ＲＮＡ」は、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を指す。「リボヌクレオチド」という用語は、β−Ｄ−リボフラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、部分的に精製されたＲＮＡ、基本的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換え産生ＲＮＡならびに、１以上のヌクレオチドの、付加、欠失、置換及び／又は改変により天然のＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡなどの、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、単離ＲＮＡを含む。このような改変には、ＲＮＡｉ物質の末端又は内部などへの、例えばＲＮＡの１以上のヌクレオチドにおける、非ヌクレオチド物質の付加が含まれ得る。本発明のＲＮＡ分子におけるヌクレオチドはまた、非天然ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドなどの、標準的ではないヌクレオチドも含み得る。これらの改変ＲＮＡは、天然ＲＮＡの類似体と呼ばれ得る。
本明細書中で使用される場合、「相補的」という用語は、標準的ワトソンクリック相補体形成規則に従い塩基対形成することができる核酸配列を指す。即ち、より大きいプリンは、より小さいピリミジンと塩基対形成し、シトシンと対形成されるグアニン（Ｇ：Ｃ）及びチミンの何れかと対形成されるアデニン（Ａ：Ｔ）（ＤＮＡの場合）又はウラシルと対形成されるアデニン（Ａ：Ｕ）（ＲＮＡの場合）の組み合わせを形成する。
本明細書中で使用される場合、マイクロＲＮＡ標的配列に関して「基本的に相補的」という用語は、ヌクレオチド位置１から１２のマイクロＲＮＡ分子の５’部分（「シード領域」とも呼ばれる。）の少なくとも８個の連続ヌクレオチドに対して相補的である（完全に一致する）８ヌクレオチドより長いマイクロＲＮＡ標的核酸配列を指し、天然のｍｉＲ−３４ファミリーメンバーと比較した場合、マイクロＲＮＡ標的核酸配列の残りの部分にわたり、少なくとも６５％相補的（少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９６％同一など）である。Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３、ＰＮＡＳ ９０：５８７３−５８７７）におけるもののように改変された、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０、ＰＮＡＳ ８７：２２６４−２２６８）の数学的アルゴリズムを用いて、２種類の配列間の配列比較及び％同一性及び類似性の決定を行うことができる。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７５：４０３−４１０）のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。
本明細書中で使用される場合、「遺伝子」という用語は、当業者にとって公知の意味、即ち、ＲＮＡ及び／又はポリペプチド又はその前駆体の産生に必要なコード配列ならびにコード配列の５’及び３’末端の周囲の非コード配列（非翻訳領域）を含む核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）配列を包含する。「遺伝子」という用語は、遺伝子のｃＤＮＡ及びゲノム形態の両方を包含する。「遺伝子」という用語はまた、例えば、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡなどを含む、マイクロＲＮＡ及びその他の非タンパク質コード配列を含む核酸配列も包含する。機能的ポリペプチドは、ポリペプチドの所望の活性又は機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、抗原提示）が保持される限り、全長コード配列により又はコード配列の何れかの部分によりコードされ得る。コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡに存在する配列は、５’非翻訳配列（「５’ＵＴＲ」）と呼ばれる。コード領域の３’又は下流に位置し、ｍＲＮＡに存在する配列は、３’非翻訳配列又は（「３’ＵＴＲ」）と呼ばれる。
「遺伝子発現」という用語は、本明細書中で使用される場合、ＲＮＡ又はタンパク質のどちらであっても、遺伝子産物を生成させるための遺伝子の転写及び翻訳のプロセスを指す。従って、遺伝子発現の調節は、転写、転写後プロセシング、翻訳、翻訳後修飾などを含め、多くのレベルの何らか１以上で起こり得る。
本明細書中で使用される場合、「発現カセット」という用語は、その転写及び翻訳制御配列とともに発現されるべき少なくとも１つの核酸配列を含む核酸分子を指す。発現カセットは、通常、遺伝子送達ベクターにおいてカセットが容易に挿入、除去又は置換され得るように、５’及び３’末端に存在するように改変された制限部位を含む。カセットを変化させることにより、様々な配列の発現を支配するためにカセットが組み込まれる遺伝子送達ベクターが得られる。
本明細書中で使用される場合、「表現型」という用語は、遺伝子発現分析又はタンパク質発現分析により測定される場合の１以上の遺伝子の発現の調節を含む、当業者にとって公知の意味を包含する。
本明細書中で使用される場合、「増殖性疾患」又は「癌」という用語は、本明細書中で使用される場合、白血病、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）及び慢性リンパ性白血病；カポジ肉腫などのＡＩＤＳ関連癌；乳癌；骨癌、例えば、骨肉種、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、巨細胞腫、アダマンチノーマ及び脊索腫など；脳腫瘍、例えば、髄膜腫、膠芽細胞腫、軽度星状細胞腫、乏突起膠細胞腫、下垂体部腫瘍、神経鞘腫及び転移性脳腫瘍など；マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫などの様々なリンパ腫を含む頭頸部の癌、腺腫、扁平上皮癌、喉頭癌、胆嚢及び胆管癌、網膜芽細胞腫などの網膜の癌、食道癌、胃癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌、睾丸癌、子宮内膜癌、メラノーマ、結腸直腸癌、肺癌、膀胱癌、前立腺癌、肺癌（非小細胞肺癌を含む。）、膵臓癌、肉腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、頭部及び頸部癌、皮膚癌、鼻咽腔癌、脂肪肉腫、上皮癌、腎細胞癌、胆嚢腺癌、耳下腺癌、子宮内膜肉腫、多剤耐性癌；及び増殖性疾患及び状態、例えば腫瘍血管形成に関連する血管新生、黄斑変性（例えば浸潤性／萎縮性ＡＭＤ）、角膜血管新生、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、近視性変性及びその他の増殖性疾患及び状態など、例えば、再狭窄及び多発性嚢胞腎及び、単独でその他の治療薬と組み合わせて、細胞又は組織における疾患関連遺伝子発現の調節に反応し得る、何らかのその他の癌又は増殖性疾患、状態、形質、遺伝子型又は表現型を含む、当技術分野で公知のような、無秩序な細胞増殖又は複製を特徴とする、何らかの疾患、状態、形質、遺伝子型又は表現型を指す。
本明細書中で使用される場合、「生物学的知識のソース」という用語は、非常に多数の遺伝子の、（例えば、分子、細胞及び全身レベルでの）機能、構造、病理学的役割、毒性学的意義などを記載する情報を指す。データベース及び、Ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ、Ｕｎｉｇｅｎｅ、ＳｗｉｓｓＴｒＥＭＢＬなどの公開ソースから集められた情報を含め、本発明の方法に対して、生物学的知識の様々なソースが使用され、分子生物学のセントラルドグマの概念に従い関係データベースに整理することができる。ある実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ又は同様のシステムにより使用されるアノテーションシステムが使用される。ＧＯは、全ての生物に適用され得る分子生物学に対する動的な統制語（ｄｙｎａｍｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｖｏｃａｂｕｌａｒｙ）である。遺伝子機能の知識が蓄積し変化しているので、これは、Ｇｅｎｅ ＯｎｔｏｌｏｇｙＴＭ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ：ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｕｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅ Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２５：２５−２９））により発展させられ、維持されている。
本明細書中で使用される場合、「哺乳動物細胞の増殖を阻害する」という句は、細胞を死滅させるか又は永久的もしくは一時的に細胞の成長を停止させることを意味する。インビトロ培養容器で又は対象においての何れかでこのような細胞の数が本発明の組成物の投与後に一定のままであるか又は減少する場合、哺乳動物細胞の阻害を推測することができる。このような細胞の絶対数が増加するが腫瘍増殖の割合が低下する場合も、腫瘍細胞増殖の阻害を推測することができる。
本明細書中で使用される場合、「発現レベルを測定する」、「発現レベルを獲得する」などの句は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は遺伝子によりコードされるタンパク質を含め、例えば遺伝子の転写産物の遺伝子発現レベルを定量する方法ならびに関心のある遺伝子がとにかく発現されるか否かを調べる方法を含む。このようにして、発現量の定量を必ずしも与えることなく、「Ｙｅｓ」又は「Ｎｏ」の結果を提供するアッセイは、この用語が本明細書中で使用される場合、「発現を測定する」アッセイである。あるいは、測定されるか又は得られる発現レベルは、何らかの定量的値、例えば、発現の倍率変化、増加又は減少（対照遺伝子に対して、又は別の試料中の同じ遺伝子に対して）、又は発現のｌｏｇ比又はその何らかの視覚的表現、例えば、色強度が、検出される遺伝子発現の量の代表である「ヒートマップ」など、として表現され得る。遺伝子の発現のレベルを検出するための代表的な方法には、以下に限定されないが、ノーザンブロッティング、ドット又はスロットブロット、レポーター遺伝子マトリクス（例えばＵＳ５，５６９，５８８参照）ヌクレアーゼ保護、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイプロファイリング、ディファレンシャルディスプレイ、２Ｄゲル電気泳動、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ、ＩＣＡＴ、酵素アッセイ、抗体アッセイなどが含まれる。
本明細書中で使用される場合、「ｍｉＲ−３４ファミリー」は、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ及びｍｉＲ−４４９を指す。
本明細書中で使用される場合、「ｍｉＲ−３４」は、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ及びｍｉＲ−３４ｃの１以上を指す。
本明細書中で使用される場合、「ｍｉＲ−３４ａ」は、配列番号１及びその前駆ＲＮＡ配列（その例は配列番号２である。）を指す。
本明細書中で使用される場合、「ｍｉＲ−３４ａシード領域」は、配列番号３を指す。
本明細書中で使用される場合、「ｍｉＲ−３４ｂ」は配列番号４及びその前駆ＲＮＡ配列（その例は配列番号５である。）を指す。
本明細書中で使用される場合、「ｍｉＲ−３４ｂシード領域」は、配列番号６を指す。
本明細書中で使用される場合、「ｍｉＲ−３４ｃ」は配列番号７及びその前駆ＲＮＡ配列（その例は配列番号８である。）を指す。
本明細書中で使用される場合、「ｍｉＲ−３４ｃシード領域」は、配列番号９を指す。
本明細書中で使用される場合、「ｍｉＲ−４４９」は配列番号２９及びその前駆ＲＮＡ配列（その例は配列番号３０である。）を指す。
本明細書中で使用される場合、「ｍｉＲ−４４９シード領域」は、配列番号３１を指す。
本明細書中で使用される場合、「単離核酸」は、天然で見出されるものと同一配列の何らかの核酸分子と非同一である物理的形状で存在する核酸分子であり；「単離される」とは、そのように記載される核酸そのものがそのネイティブ環境から物理的に除去されていることを必要としないが、それを禁じない。例えば、核酸は、それが天然で見出されないヌクレオチド及び／又はヌクレオシド間結合を含む場合、「単離されている」と言われ得る。代わりにホスホジエステル結合における天然のヌクレオシドからなる場合、核酸は、それが天然で見出されない純度で存在するとき、「単離されている」と言われ得、この場合、純度は、その他の配列の核酸の存在に関して、タンパク質の存在に関して、脂質の存在に関して又は生物細胞の何らかのその他の成分の存在に関して、又は核酸が生物のゲノムにおいて他の同一である配列に隣接する配列を欠く場合、又は核酸が天然で完全に同じようには存在しない配列を保持する場合、判断される。そのように定義される場合、「単離核酸」には、非相同部位で宿主細胞染色体に組み込まれる核酸、非相同配列に対するネイティブ断片の組み換え融合物、エピソームとして存在するか又は宿主細胞染色体に組み込まれるように存在する組み換えベクターが含まれる。
「過剰発現」、「過剰発現する」、「過剰発現すること」などの句は、１以上の統計学的検定を用いて調べられる場合、同じ非改変対象又は類似の非改変対象でのその遺伝子の発現のレベルよりも、対象における１以上の遺伝子の発現が有意に高くなるように、対象を改変する状態を指す。
本明細書中で使用される場合、「精製（される）核酸」とは、試料又は検体に存在する総核酸の少なくとも１０％に相当する。好ましい実施形態において、精製（される）核酸は、単離核酸試料又は検体中の総核酸の、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％又は少なくとも約９５％に相当する。「精製（される）核酸」への言及は、その核酸が何らかの精製を受けている必要はなく、例えば精製されていない化学合成核酸を含み得る。
本明細書中で使用される場合、「特異的結合」は、異種の（同種でない）試料中に同時に存在する２種類の分子種が、その試料中のその他の分子種に結合するよりも優先して互いに結合する能力を指す。通常、特異的結合相互作用は、少なくとも２倍、より一般的には少なくとも１０倍、多くは少なくとも１００倍、反応における偶然的な結合相互作用を上回り；検体を検出するために使用されるとき、異種の（同種でない）試料中の検体の存在が決定される場合、特異的結合は十分に差別的である。通常、特異的結合反応の親和性又は親和力は、少なくとも約１μＭである。
本明細書中で使用される場合、「対象」とは、生物又は細胞試料、それら由来の組織試料又は臓器検体（例えば培養細胞株、生検、細胞を含有する体液試料の血液試料を含む。）を指す。例えば、生物は、以下に限定されないが、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ニワトリ、ネコ、犬などの動物を含む動物であり得、通常哺乳動物、例えばヒトなどである。
本明細書中で使用される場合、「ＴＰ５３経路」は、例えばＤＮＡ損傷の認知、ＴＰ５３活性の調節、細胞周期停止及びアポトーシスに関与するか又は必要であるタンパク質を含む、Ｐ５３の上流及び下流の両方で機能するタンパク質及びそれらの対応する遺伝子を指す。ＴＰ５３経路には、以下に限定されないが、表１で列挙される、遺伝子及びそれによりコードされるタンパク質が含まれる（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ ４０８：３０７−３１０；Ｗｏｏｄｓ及びＶｏｕｓｄｅｎ、２００１、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２６４：５６−６６；Ｅｌ−Ｄｅｉｒｙ、１９９８、Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８：３４５−３５７；及びＰｒｉｖｅｓ及びＨａｌｌ、１９９９、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９９ ７８７：１１２−１２６も参照のこと。）。
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ＩＩ．本発明の態様及び実施形態
ある態様において、機能的ＴＰ５３活性を有する哺乳動物細胞の細胞分裂を阻害するために使用され得る、治療用ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ又はｍｉＲ−４４９、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ組成物が提供される。本明細書と同時に提出された同時係属出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／６２６８１に記載のように、ｍｉＲ−３４の１以上のメンバーのベースラインレベルは、ｍｉＲ−３４の得られるレベルがＴＰ５３の機能的活性又はＴＰ５３経路の機能的活性と統計学的に有意に関連する場合、ＴＰ５３経路活性状態と相互関連がある。
具体的な細胞株（この細胞株は機能的ＴＰ５３活性又は欠陥ＴＰ５３活性を有することが知られている。）を参照することにより、ｍｉＲ−３４のベースラインレベルを確立することができる。機能的ＴＰ５３を有する細胞株の例には、以下に限定されないが、ＨＣＴ１１６（Ｖａｓｓｉｌｅｖら、２００４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０３：８４４−８）、ＬＯＶＯ（Ｃｏｔｔｕら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、１３：２７２７−３０）、ＬＳ１２３（Ｌｉｕ及びＢｏｄｍｅｒ、２００６、ＰＮＡＳ、１０３：９７６−８１）、ＲＫＯ（Ｖａｓｓｉｌｅｖら、２００４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０３：８４４−８）及びＲＫＯ−ＡＳ４５−１（Ｂａｍｆｏｒｄら、２００４、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９７：３５５−５８）が含まれる。欠陥ＴＰ５３を有する細胞株の例には、以下に限定されないが、ＨＴ２９（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、１９９０、ＰＮＡＳ、８７：７５５５−９）、ＬＳ１０３４（Ｌｉｕ及びＢｏｄｍｅｒ、２００６、ＰＮＡＳ、１０３：９７６−８１）、ＳＷ１４１７（Ｌｉｕ及びＢｏｄｍｅｒ、２００６、ＰＮＡＳ、１０３：９７６−８１）、ＳＷ１１１６（Ｌｉｕ及びＢｏｄｍｅｒ、２００６、ＰＮＡＳ、１０３：９７６−８１）及びＳＷ６２０（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、１９９０、ＰＮＡＳ、８７：７５５５−９）が含まれる。あるいは、本明細書中の実施例１に記載のものなど、機能的ＴＰ５３を有するか又は持たない、適合する細胞株対に、遺伝子抑制のためにＴＰ５３を標的とするｓｈＲＮＡヘアピン分子をコードする核酸ベクターを遺伝子移入することができる。
その他の実施形態において、複数の異なる細胞試料を一緒にプールし、ｍｉＲ−３４のベースラインレベルを設定するために、得られたプールを使用することができるか、又はあるいは、当技術分野で公知の様々な異なる統計検定の何れかを用い、複数の異なる細胞試料からの個々のｍｉＲ−３４測定を用いてベースラインレベルを得ることができる。さらにその他の実施形態において、対象の１以上の細胞又は組織試料又は対象の種において測定される１以上のｍｉＲ−３４メンバーのレベルに基づき、ｍｉＲ−３４のベースラインレベルを確立する。
その他の実施形態において、癌に罹患している患者のための一連の治療を決定するために、腫瘍試料から得られる細胞試料のｐ５３経路状態を使用する。例えば、１以上のＤＮＡ損傷剤を含む組成物の治療的有効量で、実質的に活性のあるＴＰ５３経路状態を有するとして分類される腫瘍を有する患者を治療する。１以上のＤＮＡ損傷剤には、トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えばカンプトテシン；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン；ＤＮＡ結合剤、例えばシスプラチン；代謝拮抗剤；又は電離放射線が含まれ得る。
別の実施形態において、１以上のＤＮＡ損傷剤による細胞殺滅を促進することができるタンパク質又は遺伝子の阻害剤と組み合わせた１以上のＤＮＡ損傷剤を含む組成物の治療的に十分な量で、実質的に不活性であるＴＰ５３経路状態を有するとして分類される腫瘍を有する患者を治療する。その活性がＤＮＡ損傷剤に対するＴＰ５３経路不活性細胞の感受性に対して正又は負の何れかの影響を与える遺伝子及びタンパク質は、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０３１００２に記載されている。
治療処置のある実施形態は、機能的ＴＰ５３を含有するとして分類される腫瘍を処置するために、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ又はｍｉＲ−４４９ ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡから選択されるｍｉＲ−３４ファミリーメンバーを含む組成物の治療的に十分な量の使用を含む。このような治療は、１以上のＤＮＡ損傷剤と組み合わせられ得る。
治療用ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ又はｍｉＲ−４４９、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ組成物は少なくとも１８ヌクレオチドのガイド鎖連続ヌクレオチド配列を含み、この場合、前記ガイド鎖はヌクレオチド位置１から１２からなるシード領域を含み、位置１は、前記ガイド鎖の５’末端に相当し、前記シード領域は、配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号３１からなる群から選択される配列内の６個の連続ヌクレオチドと同一である少なくとも６個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。
ある実施形態において、治療用ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ又はｍｉＲ−４４９、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ組成物は、１８から２５個のヌクレオチドのガイド鎖ヌクレオチド配列を含み、前記ガイド鎖ヌクレオチド配列はシード領域ヌクレオチド配列及び非シード領域ヌクレオチド配列を含み、前記シード領域は基本的にガイド鎖のヌクレオチド位置１から１２からなり、前記非シード領域は基本的にガイド鎖のヌクレオチド位置１３から３’末端からなり、前記ガイド鎖の位置１は前記ガイド鎖の５’末端に相当し、前記シード領域は、配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号３１からなる群から選択されるヌクレオチド配列と配列が同一である少なくとも６個のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列をさらに含み、前記単離核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号２９からなる群から選択されるヌクレオチド配列と比較して、少なくとも１個のヌクレオチド配列の相違を有する。
ある実施形態において、治療用ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ又はｍｉＲ−４４９、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ組成物は、（ｉ）１８から２５個のヌクレオチドのヌクレオチド配列からなるガイド鎖核酸分子（前記ガイド鎖ヌクレオチド配列はシード領域ヌクレオチド配列及び非シード領域ヌクレオチド配列を含み、前記シード領域は前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１から１２からなり、前記非シード領域は前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１３から３’末端からなり、前記ガイド鎖の位置１は前記ガイド鎖の５’末端に相当し、前記シード領域は、天然のマイクロＲＮＡのシード領域配列と同一である少なくとも６個のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列をさらに含む。）と、（ｉｉ）１８から２５個のヌクレオチドのヌクレオチド配列からなるパッセンジャー鎖核酸分子（前記パッセンジャー鎖はガイド鎖と基本的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、前記パッセンジャー鎖核酸分子は、ガイド鎖のシード領域の正確な逆相補体配列と比較して、１個のヌクレオチド配列の相違を有し、１個のヌクレオチドの相違は、パッセンジャー鎖のヌクレオチド位置１３から３’末端内に位置する。）と、を含む、合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物を含む。
ある実施形態において、２本鎖の少なくとも一方は、１−４、好ましくは２ヌクレオチド、３’突出部をさらに含む。ヌクレオチド突出部は、チミン、ウラシル、アデニン、グアニンもしくはシトシン又はそれらの誘導体もしくは類似体の何らかの組み合わせを含み得る。ある一定の態様におけるヌクレオチド突出部は、２ヌクレオチド突出部であり、この場合両方のヌクレオチドがチミンである。重要なこととして、センス及びアンチセンス鎖を含むｄｓＲＮＡが投与される場合、これは、標的特異的干渉を支配し、インターフェロン反応経路を迂回する。
低分子干渉核酸の安定性を促進するために、３’突出部を分解に対して安定化することもできる。ある実施形態において、アデノシン又はグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含むことにより、３’突出部が安定化される。あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば３’突出部における２’−デオキシチミジンでのウリジンヌクレオチドの置換は、耐容され、ＲＮＡｉ分解の効率には影響を与えない。特に、２’−デオキシチミジンにおいて２’ヒドロキシルがないと、組織培養液中での３’突出部のヌクレアーゼ耐性が顕著に促進される。
本明細書中で使用される場合、「３’突出部」は、ｓｉＲＮＡ配列の３’末端から伸びる少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。３’突出部は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチド又は修飾デオキシリボヌクレオチドを含み得る。３’突出部は、好ましくは１から約５ヌクレオチド長、より好ましくは１から約４ヌクレオチド長及び最も好ましくは約２から約４ヌクレオチド長である。３’突出部は、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス又はアンチセンス配列で又は両方の配列で生じ得る。突出部の長さは、２本鎖の各鎖に対して同じであっても異なっても良い。最も好ましくは、３’突出部は、２本鎖の両方の鎖に存在し、各鎖に対する突出部は２ヌクレオチド長である。例えば、２本鎖の各鎖は、ジチミジル酸（「ｔｔ」）又はジウリジル酸（「ｕｕ」）の３’突出部を含み得る。
本発明の別の態様は、化学修飾されたｓｉＲＮＡコンストラクトを提供する。例えば、ｓｉＲＮＡ物質は、非ヌクレオチド部分を含み得る。化学修飾又はその他の非ヌクレオチド部分は、核酸分解に対してセンス（ガイド鎖）及びアンチセンス（パッセンジャー鎖）配列を安定化させ得る。さらに、特定の細胞型に対してｓｉＲＮＡ物質の取り込みを増加させ標的化するために、結合物を使用することができる。このようにして、ある実施形態において、ｓｉＲＮＡ物質は、２本鎖分子の１以上の配列が化学的に修飾されている２本鎖分子を含む。このような化学修飾の非限定例には、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、「非環式」ヌクレオチド、５’−Ｃ−メチルヌクレオチド及び末端グリセリル及び／又は逆デオキシ脱塩基残基組み込みが含まれる。これらの化学修飾は、ｓｉＲＮＡ物質において使用される場合、細胞におけるその物質のＲＮＡｉ活性を保存することを促進することができ、ｓｉＲＮＡ物質の血清安定性を向上させることができる。
ある実施形態において、アンチセンス及び／又はセンス配列の５’末端の、第一の及び場合によっては又は好ましくは第一の２つの、ヌクレオチド間結合は、好ましくはホスホロチオアートにより修飾される。別の実施形態において、センス及び／又はアンチセンス配列の３’末端の、第一の及びおそらくは第一の２つ、３つ又は４つのヌクレオチド間結合が、例えばホスホロチオアートにより修飾される。別の実施形態において、センス及びアンチセンス配列両方の５’末端及びセンス及びアンチセンス配列両方の３’末端は記載のように修飾される。
本発明のある実施形態において、ＴＰ５３経路状態は、細胞又は細胞の集団内でのＴＰ５３経路の活性又は不活性の程度を決定することに関連する。例えば、細胞が活性のあるＴＰ５３経路を有するか否かの１つの目安は、紫外線又は電離放射線又はその他のＤＮＡ損傷剤（化学療法剤など）によるＴＰ５３の活性化の結果、ある程度の細胞周期停止及び／又はアポトーシスが起こることである。機能不全又は不活性のＴＰ５３経路状態を有する細胞は、機能的又は活性のあるＴＰ５３経路を有する細胞と比較して、細胞ストレス後、細胞分裂を停止させるか又はアポトーシスを開始させることができない。ＴＰ５３経路状態はまた、上記表１で示されるものなどのＴＰ５３経路のメンバーである１以上の遺伝子又はタンパク質の発現の障害又は変化を測定することによっても特徴付けられ得る。本発明のある実施形態において、ＴＰ５３経路状態は、細胞試料中の１以上のｍｉＲ−３４レベルの測定に基づき、例えば実質的に機能的（即ち、遺伝毒性ストレスの存在下でＴＰ５３介在性の細胞周期停止を誘発することができるか又はＴＰ５３反応性レポーター系を活性化することができる（例えばｐ５３ＲＥ−ｂｌａ；カタログ番号Ｋ１１９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。）及び実質的に非機能的（例えば、遺伝毒性ストレスの存在下でＴＰ５３介在性の細胞周期停止を誘発することができないか又はＴＰ５３反応性レポーター系を活性化することができない。）など、２つの状態のカテゴリーに分類され得る。
あるいは、ＴＰ５３機能状態は、細胞で測定されるｍｉＲ−３４のレベルに基づき、例えば高ＴＰ５３経路活性、中程度のＴＰ５３経路活性又は低ＴＰ５３経路活性など、３以上の機能カテゴリーに分類され得る。このような各ＴＰ５３経路状態カテゴリーの閾値レベルは、ＴＰ５３経路機能の機能的な生物測定に基づき、ＴＰ５３経路機能が決定されているか又は評価されている複数の様々な細胞型又は細胞から、試料ｍｉＲ−３４レベルの範囲を測定するか又は得ることにより設定することができる。
本発明のこの態様のある実施形態において、測定されるか又は得られるｍｉＲ−３４分子レベルは、ｍｉＲ−３４ａ（配列番号１）、ｍｉＲ−３４ｂ（配列番号４）、ｍｉＲ−３４ｃ（配列番号７）及びその前駆ＲＮＡ（それぞれ、配列番号２；配列番号５及び配列番号８）からなる群から選択される。
本発明の別の態様は、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）の有効量を細胞に導入することを含む、哺乳動物細胞の細胞分裂を阻害する方法を提供するが、ここで、前記ｓｉＮＡは、少なくとも１８ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列のガイド鎖を含み、このガイド鎖は、ヌクレオチド位置１から１２からなるシード領域を含み、位置１はこのガイド鎖の５’末端に相当し、前記シード領域は、配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号３１からなる群から選択される配列内の６個の連続ヌクレオチドと同一である少なくとも６個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。
ある実施形態において、ｓｉＮＡは、遺伝子移入により前記細胞に導入される２本鎖ＲＮＡ分子である。ある実施形態において、導入されるｓｉＮＡは、１以上の化学修飾されたヌクレオチドを含む。ｓｉＮＡの有効量は、ｍｉＲ−３４ファミリーの１以上のメンバーにより制御される１以上の遺伝子転写産物の検出レベルの測定可能な変化を引き起こすのに十分な量である。ある実施形態において、ｍｉＲ−３４ファミリーの１以上のメンバーにより制御される遺伝子転写産物は、表５から選択される。
別の実施形態において、ｓｈＲＮＡ遺伝子を発現する核酸ベクター分子の導入により細胞分裂が阻害され、この場合、ｓｈＲＮＡ転写産物はＲＮＡｉ物質として作用する。ｓｈＲＮＡ遺伝子は、例えば、配列番号２、配列番号５、配列番号８又は配列番号３０などのマイクロＲＮＡ前駆ＲＮＡをコードし得る。あるいは、ｓｈＲＮＡ遺伝子は、内在性の細胞性ＲＮＡプロセシング酵素により活性ｓｉＲＮＡ配列へとプロセシングされやすい何らかのその他のＲＮＡ配列をコードし得、ここで、活性ｓｉＲＮＡ配列のシード領域は、配列番号３、配列番号６、配列番号９又は配列番号３１内の６個の連続ヌクレオチド配列と同一である、少なくとも６個の連続ヌクレオチド配列を含有する。ｓｈＲＮＡ遺伝子の発現に有用なベクター及び転写プロモーター配列の例は当技術分野で周知である（Ｐａｄｄｉｓｏｎら、２００４、Ｎａｔｕｒｅ ４：２８−３１；Ｓｉｌｖａら、２００５、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３７：１２８１−８８；Ｂｅｒｎａｒｄｓら、２００６、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：７０１−０６）。ｓｈＲＮＡの有効量は、ｍｉＲ−３４ファミリーの１以上のメンバーにより制御される１以上の遺伝子転写産物の検出レベルの測定可能な変化を引き起こすのに十分な量である。ある実施形態において、ｍｉＲ−３４ファミリーの１以上のメンバーにより制御される遺伝子転写産物は、表５から選択される。
別の態様において、本発明は、１８から２５個のヌクレオチドのガイド鎖ヌクレオチド配列を含むか又は基本的にそれらからなる単離核酸分子を提供し、このガイド鎖ヌクレオチド配列は、シード領域ヌクレオチド配列及び非シード領域ヌクレオチド配列を含み、前記シード領域は、基本的に前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１から１２からなり、前記非シード領域は、基本的に前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１３から３’末端からなり、前記ガイド鎖の位置１は前記ガイド鎖の５’末端に相当し、前記シード領域は、配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号３１からなる群から選択されるヌクレオチド配列と配列が同一である少なくとも６個のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列をさらに含み、前記単離核酸分子は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるヌクレオチド配列と比較して、少なくとも１個のヌクレオチド配列の相違を有する。
ある実施形態において、単離核酸分子は、基本的に１９から２３個のヌクレオチドのガイド鎖ヌクレオチド配列からなり、前記ガイド鎖はヌクレオチド配列は、シード領域ヌクレオチド配列及び非シード領域ヌクレオチド配列を含み、前記シード領域は基本的に前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１から１０からなり、前記非シード領域は、基本的に前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１１から３’末端からなり、前記ガイド鎖の位置１は前記ガイド鎖の５’末端に相当し、前記シード領域は、配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号３１からなる群から選択されるヌクレオチド配列と配列が同一である少なくとも６個のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列をさらに含み、前記単離核酸分子は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるヌクレオチド配列と比較して、少なくとも１個のヌクレオチド配列の相違を有する。
別の態様において、本発明は、単離合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物及び合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物を作製する方法を提供する。本明細書中で記載されるうように、実施例５で示されるように、天然成熟ｍｉＲ−３４ａ（配列番号１）に対応する配列を伴うガイド鎖と、配列の３’末端に位置する１個の塩基ミスマッチを除き、ｍｉＲ−３４ａ天然成熟ガイド鎖と基本的に相補的である合成パッセンジャー鎖（配列番号１２）（非対称パッセンジャー鎖）と、を含む合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物は、天然のｍｉＲ−３４ａガイド鎖（配列番号１）及び天然のｍｉＲ−３４ａパッセンジャー鎖（配列番号３５）からなる２本鎖よりも、細胞に遺伝子移入された場合に細胞周期表現型を誘導することにおいて有効であることが明らかにされた。理論に縛られることを望まないが、パッセンジャー鎖でのミスマッチの存在により、ＲＩＣＳへの移入が促進され得ると考えられる。
前述の説明によると、ある実施形態において、本発明は、（ｉ）１８から２５個のヌクレオチドのヌクレオチド配列からなるガイド鎖核酸分子（前記ガイド鎖ヌクレオチド配列は、シード領域ヌクレオチド配列及び非シード領域ヌクレオチド配列を含み、前記シード領域は、前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１から１２からなり、前記非シード領域は、前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１３から３’末端からなり、前記ガイド鎖の位置１は前記ガイド鎖の５’末端に相当し、前記シード領域は、天然のマイクロＲＮＡのシード領域配列と同一である少なくとも６個のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列をさらに含む。）と、
（ｉｉ）１８から２５個のヌクレオチドのヌクレオチド配列からなるパッセンジャー鎖核酸分子（前記パッセンジャー鎖は、ガイド鎖と基本的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、前記パッセンジャー鎖核酸分子は、ガイド鎖のシード領域の正確な逆相補体配列と比較して、１個のヌクレオチド配列の相違を有し、この１個のヌクレオチドの相違は、パッセンジャー鎖のヌクレオチド位置１３から３’末端内に位置する。）と、を含む、単離合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物を提供する。
本発明のこの態様によると、合成２本鎖模倣物は、何らかの天然のマイクロＲＮＡに対して生成され得る。コンピュータ及び分子クローニングを用いたアプローチにより、様々な生物において様々なレベルで発現される何百ものマイクロＲＮＡが明らかになった。ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／のＷｅｌｌｃｏｍ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅウェブサイトのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂにおいて一般公開され利用可能な「ｍｉＲＢａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅ（配列データベース）」に記載のように、２００を超える様々な哺乳動物マイクロＲＮＡが同定されてきた。代表的なマイクロＲＮＡ種の一覧もまた次の参考文献に記載されている：Ａｍｂｒｏｓら、ＲＮＡ ９：２７７−２７９（２００３）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３２：Ｄ１０９−Ｄ１１１（２００４）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４：Ｄ１４０−Ｄ１４４（２００６）；Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａら、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．１２（９）：７３５−９（２００２）；Ｌｉｍ、Ｌ．Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９（５６１２）：１５４０（２００３）。何らかのある一定のマイクロＲＮＡに対して、マイクロＲＮＡ反応性標的部位のレベルを調節するために、本発明のこの態様の合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物を使用し得る。本発明のこの態様の合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物は、本明細書中に記載のように、脂質ナノ粒子など送達物質とともに組成物に含まれ得る。
本発明のこの態様のある実施形態において、ガイド鎖は、配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号３１からなる群から選択されるヌクレオチド配列と配列が同一である少なくとも６個のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むシード領域を含む。ある実施形態において、ガイド鎖配列は、配列番号１、配列番号４、配列番号７及び配列番号２９からなる群から選択される。
本発明の態様に従い、パッセンジャー鎖は、１８から２５個のヌクレオチドのヌクレオチド配列からなる核酸分子である。パッセンジャー鎖のヌクレオチド配列は、ガイド鎖と基本的に相補的であり、パッセンジャー鎖は、ガイド鎖のシード領域の正確な逆相補体配列と比較した場合、１個のヌクレオチド配列の相違を有する。本明細書中で使用される場合、ガイド鎖に関して「基本的に相補的」という用語は、ガイド鎖シード配列（ガイド鎖の位置１から１２）の正確な逆相補体との１個の塩基ミスマッチ（１個のヌクレオチド配列の相違）（これは、パッセンジャー鎖の３’末端に位置する（位置１３から３’末端）。）がある、ガイド鎖の逆相補体であるパッセンジャー鎖を指す。ある実施形態において、１個のヌクレオチド配列の相違は、パッセンジャー鎖の３’末端の６個のヌクレオチド内に位置する。ある実施形態において、１個のヌクレオチド配列の相違は、パッセンジャー鎖の３’末端からの６個のヌクレオチドに位置する。ある実施形態において、１個のヌクレオチド配列の相違は、パッセンジャー鎖の３’末端からの５ヌクレオチドに位置する。ある実施形態において、１個のヌクレオチド配列の相違は、パッセンジャー鎖の３’末端からの４ヌクレオチドに位置する。ある実施形態において、１個のヌクレオチド配列の相違は、パッセンジャー鎖の３’末端からの３ヌクレオチドに位置する。ある実施形態において、１個のヌクレオチド配列の相違は、パッセンジャー鎖の３’末端からの２ヌクレオチドに位置する。
ある実施形態において、パッセンジャー鎖のヌクレオチド配列は、ガイド鎖の配列の逆相補体と基本的に相補的であり、パッセンジャー鎖の５’末端は、ガイド鎖の３’末端からの位置１から４の塩基に相補的であり、それにより、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖が一緒にアニーリングされる場合、２本鎖の片端に３’突出部が形成される。
ある実施形態において、ヌクレオチド配列は、ガイド鎖の配列の逆相補体と基本的に相補的であり、パッセンジャー鎖の３’末端は、ガイド鎖の５’末端を越えて１から４塩基伸び、それにより、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖が一緒にアニーリングされる場合、２本鎖の片端に３’突出部が形成される。
ある実施形態において、単離合成２本鎖は、ガイド鎖配列番号１及びパッセンジャー鎖配列番号１２を含む。ある実施形態において、単離合成２本鎖は、ガイド鎖配列番号４及びパッセンジャー鎖配列番号１７を含む。ある実施形態において、単離合成２本鎖は、ガイド鎖配列番号７及びパッセンジャー鎖配列番号２２を含む。ある実施形態において、単離合成２本鎖は、ガイド鎖配列番号２９及びパッセンジャー鎖配列番号３２を含む。
別の態様において、本発明は、合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物を作製する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物を形成するために単離パッセンジャー鎖核酸分子と単離ガイド鎖核酸分子をアニーリングすることを含み、ここで、（ｉ）単離ガイド鎖核酸分子は、１８から２５個のヌクレオチドのヌクレオチド配列からなり、このガイド鎖ヌクレオチド配列は、シード領域ヌクレオチド配列及び非シード領域ヌクレオチド配列を含み、前記シード領域は前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１から１２からなり、前記非シード領域は前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１３から３’末端からなり、前記ガイド鎖の位置１は前記ガイド鎖の５’末端に相当し、このシード領域は、天然のマイクロＲＮＡのシード領域配列と同一である少なくとも６個のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列をさらに含み；（ｉｉ）単離パッセンジャー鎖核酸分子は、１８から２５個のヌクレオチドのヌクレオチド配列からなり、前記パッセンジャー鎖はガイド鎖と基本的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、前記パッセンジャー鎖核酸分子は、ガイド鎖のシード領域の正確な逆相補体配列と比較して、１個のヌクレオチド配列の相違を有し、この１個のヌクレオチドの相違は、パッセンジャー鎖のヌクレオチド位置１３から３’末端内に位置する。
ＩＩＩ．核酸分子
本明細書中で使用される場合、「核酸塩基」は、例えば、少なくとも１つの天然核酸（即ちＤＮＡ及びＲＮＡ）で見出される天然の核酸塩基（即ち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵ）及びこのような核酸塩基の天然又は非天然の誘導体及び類似体などの複素環塩基を指す。核酸塩基は、通常、天然の核酸塩基対形成に対して置換し得るように、少なくとも１つの天然核酸塩基と１以上の水素結合を形成する（「アニーリング」又は「ハイブリッド形成」）（例えば、ＡとＴ、ＧとＣ及びＡとＵとの間の水素結合）。
「プリン」及び／又は「ピリミジン」核酸塩基は、天然のプリン及び／又はピリミジン核酸塩基及びまた、以下に限定されないが、アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、ヒドロキシル、ハロゲン（即ち、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード）、チオール又はアルキルチオール部分の１以上により置換されるプリン又はピリミジンを含む、それらの誘導体及び類似体を包含する。好ましいアルキル（例えば、アルキル、カルボキシアルキルなど）部分は、約１、約２、約３、約４、約５から約６個の炭素原子からなる。プリン又はピリミジンのその他の非限定例は、デアザプリン、２，６−ジアミノプリン、５−フルオロウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、ブロモチミン、８−アミノグアニン、８−ヒドロキシグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、アザグアニン、２−アミノプリン、５−エチルシトシン、５−メチルシトシン、５−ブロモウラシル、５−エチルウラシル、５−ヨードウラシル、５−クロロウラシル、５−プロピルウラシル、チオウラシル、２−メチルアデニン、メチルチオアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、アザアデニン、８−ブロモアデニン、８−ヒドロキシアデニン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリン、４−（６−アミノヘキシル／シトシン）などを含む。核酸塩基は、本明細書中で記載されるか又は当業者にとって公知の何らかの化学合成又は天然合成法を用いて、ヌクレオシド又はヌクレオチドに含まれ得る。このような核酸塩基は、標識され得るか又は標識される分子の一部であり得、核酸塩基を含有する。
本明細書中で使用される場合、「ヌクレオシド」は、核酸塩基リンカー部分に共有結合される核酸塩基を含む個々の化学単位を指す。「核酸塩基リンカー部分」の非限定例は、以下に限定されないが、デオキシリボース、リボース、アラビノース又は５−炭糖の誘導体もしくは類似体を含む、５−炭素原子を含む糖（即ち「５−炭糖」）である。５−炭糖の誘導体又は類似体の非限定例は、２’−フルオロ−２’−デオキシリボース又は炭素環式の糖（糖環において炭素で酸素原子が置換されている。）を含む。
核酸塩基リンカー部分に対する核酸塩基の共有結合の様々なタイプは当技術分野で公知である。非限定例として、プリン（即ちＡ又はＧ）又は７−デアザプリン核酸塩基を含むヌクレオシドは、通常、プリン又は７−デアザプリンの９位を５−炭糖の１’位に共有結合する。別の非限定例において、ピリミジン核酸塩基（即ち、Ｃ、Ｔ又はＵ）を含むヌクレオシドは、通常、ピリミジンの１位を５−炭糖の１’−位に共有結合する（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ及びＢａｋｅｒ、１９９２、「ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）。
本明細書中で使用される場合、「ヌクレオチド」は、「骨格部分」をさらに含むヌクレオシドを指す。骨格部分は通常、ヌクレオチドを含む別の分子に、又は別のヌクレオチドに、ヌクレオチドを共有結合し、核酸を形成する。天然のヌクレオチドの「骨格部分」は通常、リン部分を含み、これは、５−炭糖に共有結合される。骨格部分の結合は、通常、５−炭糖の３’−又は５’−位の何れかで生じる。結合のその他のタイプは、特にヌクレオチドが天然の５−炭糖の誘導体又は類似体又はリン部分を含む場合、当技術分野で公知である。
核酸は、天然の核酸中に存在し得る、核酸塩基の誘導体又は類似体、核酸塩基リンカー部分及び／又は骨格部分を含み得るか又はこれらから完全に構成され得る。本明細書中で使用される場合、「誘導体」は、天然分子の化学修飾又は改変型を指し、一方、「模倣物」又は「類似体」という用語は、天然分子又は部分に構造的に類似していても類似しなくてもよいが、同様の機能を保持する分子を指す。本明細書中で使用される場合、「部分」は、通常、より大きい化学又は分子構造のより小さい化学又は分子成分を指す。核酸塩基、ヌクレオシド及びヌクレオチド類似体又は誘導体は、当技術分野で周知であり、記載されている（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ、１９８０、「Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｗｉｌｅｙ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと。）。
５−炭糖及び／又は骨格部分誘導体又は類似体を含む、ヌクレオシド、ヌクレオチド又は核酸のさらなる非限定例には、米国特許第５，６８１，９４７号（これは、ｄｓＤＮＡと三重へリックスを形成し及び／又はｄｓＤＮＡの発現を阻止するプリン誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載する。）；米国特許第５，６５２，０９９号及び同第５，７６３，１６７号（特に蛍光核酸プローブとしての使用のための、ＤＮＡ又はＲＮＡで見出されるヌクレオシドの蛍光類似体を組み込む核酸を記載する。）；米国特許第５，６１４，６１７号（これは、高いヌクレアーゼ安定性を保持するピリミジン環において置換を有するオリゴヌクレオチド類似体を記載する。）；米国特許第５，６７０，６６３号、同第５，８７２，２３２号及び同第５，８５９，２２１号（これは、核酸検出で使用される、修飾５−炭糖を有するオリゴヌクレオチド類似体を記載する（即ち、修飾２’−デオキシフラノシル部分）。）；米国特許第５，４４６，１３７号（これは、ハイブリッド形成アッセイにおいて使用され得る水素以外の置換基により４’位で置換される少なくとも１個の５−炭糖部分を含むオリゴヌクレオチドを記載する。）；米国特許第５，８８６，１６５号（これは、３’−５’ヌクレオチド間結合を有するデオキシリボヌクレオチド及び２’−５’ヌクレオチド間結合を有するリボヌクレオチドの両方を有するオリゴヌクレオチドを記載する。）；米国特許第５，７１４，６０６号（これは、ヌクレオチド間結合の３’−位の酸素が炭素により置換され、核酸のヌクレアーゼ耐性が促進されている、修飾ヌクレオチド間結合を記載する。）；米国特許第５，６７２，６９７号（これは、ヌクレアーゼ耐性を促進する１以上の５’メチレンホスホン酸ヌクレオチド間結合を含有するオリゴヌクレオチドを記載する。）；米国特許第５，４６６，７８６号及び同第５，７９２，８４７号（これは、置換基部分の結合を記載し、これは、ヌクレアーゼ安定性を促進し、薬物又は検出部分の送達能を与えるために、オリゴヌクレオチドの２’炭素に対して薬物又は標識を含有し得る。）；米国特許第５，２２３，６１８号（これは、細胞取り込み向上、ヌクレアーゼに対する耐性及びＲＮＡを標的化するためのハイブリッド形成に対して、隣接５−炭糖部分の４’位及び３’位を結合させる２又は３炭素骨格結合を伴うオリゴヌクレオチド類似体を記載する。）；米国特許第５，４７０，９６７号（これは、核酸ハイブリッド形成プローブとして有用である少なくとも１つのスルファミン酸塩又はスルファミドヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドを記載する。）；米国特許第５，３７８，８２５号、同第５，７７７，０９２号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６１０，２８９号及び同第５，６０２，２４０号（これらは、ヌクレアーゼ耐性向上、細胞取り込み及びＲＮＡ発現の制御のために使用されるホスホジエステル骨格部分を置換する３又は４個の原子リンカー部分を有するオリゴヌクレオチドを記載する。）；米国特許第５，８５８，９８８号（これは、それらの膜透過性及び安定性を促進するためにオリゴヌクレオチドの２’−Ｏ位に連結される疎水性担体物質を記載する。）；米国特許第５，２１４，１３６号（これは、ＤＮＡ又はＲＮＡへのハイブリッド形成が促進されヌクレアーゼに対する、安定性が向上した、５’末端でアントラキノンに結合されるオリゴヌクレオチドを記載する。）；米国特許第５，７００，９２２号（これは、ＤＮＡが、ヌクレアーゼ耐性、結合親和性及びＲＮａｓｅＨを活性化する能力を向上させるための２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシルヌクレオチドを含むＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡキメラを記載する。）；及び米国特許第５，７０８，１５４号（これは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成するためにＤＮＡに連結されるＲＮＡを記載する。）；及び米国特許第５，７２８，５２５号（これは、ユニバーサル蛍光標識によるヌクレオシド類似体の標識を記載する。）におけるものが含まれる。
ヌクレオシド類似体及び核酸類似体に対するさらなる教示は、米国特許第５，７２８，５２５号（これは、末端標識されるヌクレオシド類似体を記載する。）；及び米国特許第５，６３７，６８３号、同第６，２５１，６６６号（Ｌ−ヌクレオチド置換）及び同第５，４８０，９８０号（７−デアザ−２’デオキシグアノシンヌクレオチド及びその核酸類似体）である。
ｓｈＲＮＡ介在性抑制
あるいは、本発明のある一定の核酸分子は、真核プロモーターから細胞内で発現され得る（例えばＩｚａｎｔ及びＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：３４５；ＭｃＧａｒｒｙ及びＬｉｎｄｑｕｉｓｔ、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ ８３：３９９；Ｓｃａｎｌｏｎら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ ８８：１０５９１−９５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら、１９９２、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．、２：３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃら、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、６６：１４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅら、１９９１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５：５５３１−４；Ｏｊｗａｎｇら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ ８９：１０８０２−０６；Ｃｈｅｎら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０：４５８１ ８９；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１２２２−２５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２３：２２５９；Ｇｏｏｄら、１９９７、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、４：４５）。当業者は、適切なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから真核細胞において何らかの核酸が発現され得ることを認める。このような核酸の活性は、酵素的核酸による一次転写産物からのそれらの放出により増強され得る（Ｄｒａｐｅｒら、ＰＣＴ ＷＯ９３／２３５６９及びＳｕｌｌｉｖａｎら、ＰＣＴ ＷＯ９４／０２５９５；Ｏｈｋａｗａら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．、２７：１５−６；Ｔａｉｒａら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、７９：５１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａら、１９９３、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１：３２４９−５５；Ｃｈｏｗｒｉｒａら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：２５８５６）。ＣＮＳに特異的な遺伝子治療アプローチは、Ｂｌｅｓｃｈら、２０００、Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．、１３：２６９−２８０；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、２０００、Ｃｅｎｔ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓｔ．Ｄｉｓ．、４８５：５０８；Ｐｅｅｌ及びＫｌｅｉｎ、２０００、Ｊ．Ｎｅｕｒｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、９８：９５−１０４；Ｈａｇｉｈａｒａら、２０００、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７：７５９−７６３；及びＨｅｒｒｌｉｎｇｅｒら、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、３５：２８７−３１２に記載されている。神経系の細胞への核酸のＡＡＶ−介在送達は、Ｋａｐｌｉｔｔら、米国特許第６，１８０，６１３号にさらに記載されている。
本発明の別の態様において、本発明のＲＮＡ分子は、好ましくは、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターに挿入される転写単位から発現される（例えばＣｏｕｔｕｒｅら、１９９６、ＴＩＧ．、１２：５１０）。組み換えベクターは、好ましくはＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターである。以下に限定されないが、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス又はアルファウイルスに基づき、リボザイム発現ウイルスベクターを構築することができる。好ましくは、核酸分子を発現することができる組み換えベクターは、上述のように送達され、標的細胞において持続する。あるいは、核酸分子の一時的発現をもたらすウイルスベクターを使用することができる。このようなベクターを必要に応じて繰り返し投与することができる。発現されると、核酸分子は標的ｍＲＮＡに結合する。ベクターを発現する核酸分子の送達は、静脈内又は筋肉内投与によって、患者又は対象から外移植された標的細胞への投与とそれに続く患者又は対象への再導入によって、又は所望の標的細胞への導入を可能にする何らかのその他の手順によってなど、全身的であり得る（概説については、Ｃｏｕｔｕｒｅら、１９９６、ＴＩＧ．、７２：５１０参照）。
ある態様において、本発明は、本発明の核酸分子の少なくとも１つをコードする核酸配列を含む発現ベクターを考慮する。本発明の核酸分子をコードする核酸配列は、その核酸分子の発現が可能になるように、操作可能に連結される。
別の態様において、本発明は、ａ）転写開始領域（例えば、真核ｐｏｌ Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ開始領域）と；ｂ）転写終結領域（例えば、真核ｐｏｌ Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ終結領域）と；ｃ）本発明の核酸分子の少なくとも１つをコードする核酸配列と、を含み、前記配列が、前記核酸分子の発現及び／又は送達が可能になるように、前記開始領域及び前記終結領域に操作可能に連結される、発現ベクターを特色とする。ベクターは、本発明の核酸分子をコードする配列の５’側又は３’側で操作可能に連結されるタンパク質に対するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び／又はイントロン（介在配列）を場合によっては含み得る。
核酸分子配列の転写は、真核ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）に対するプロモーターから支配される。ｐｏｌ ＩＩ又はｐｏｌ ＩＩＩプロモーターからの転写は全ての細胞において高レベルで発現され；ある種の細胞型におけるある種のｐｏｌ ＩＩプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子制御配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。適切な細胞において原核ＲＮＡポリメラーゼ酵素が発現されるならば、原核ＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた使用される（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ及びＭｏｓｓ、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６７４３−７；Ｇａｏ及びＨｕａｎｇ、１９９３、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１：２８６７−７２；Ｌｉｅｂｅｒら、１９９３、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、２１７：４７−６６；Ｚｈｏｕら、１９９０、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、７０：４５２９−３７）。
一部の研究者は、このようなプロモーターから発現されるｓｈＲＮＡ又はマイクロＲＮＡをコードする核酸分子が哺乳動物細胞において機能し得ることを示した（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０−５５３；Ｐａｄｄｉｓｏｎら、２００４、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １：１６３−６７；ＭｃＩｎｔｙｒｅ及びＦａｎｎｉｎｇ ２００６ ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１月５日）６：１；Ｔａｘｍａｎら、２００６ ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１月２４日）６：７）。上記ｓｈＲＮＡ又はマイクロＲＮＡ転写単位は、以下に限定されないが、プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（アデノウイルス又はアデノ関連ウイルスベクターなど）又はウイルスＲＮＡベクター（レトロウイルス又はアルファウイルスベクターなど）（概説として、Ｃｏｕｔｕｒｅ及びＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ、１９９６前出を参照のこと。）を含む、哺乳動物細胞への導入のための様々なベクターに組み込むことができる。
別の態様において、本発明は、その核酸分子の発現を可能にするように本発明の核酸分子の少なくとも１つをコードする核酸配列を含む発現ベクターを特色とする。発現ベクターは、ある実施形態において、ａ）転写開始領域；ｂ）転写終結領域；ｃ）少なくとも１つの前記核酸分子をコードする核酸配列を含み；前記配列は、前記核酸分子の発現及び／又は送達を可能にするように前記開始領域及び前記終結領域に操作可能に連結される。
別の実施形態において、発現ベクターは、ａ）転写開始領域；ｂ）転写終結領域；ｃ）オープンリーディングフレーム；ｄ）少なくとも１つの前記核酸分子をコードする核酸配列を含み、前記配列は、前記オープンリーディングフレームの３’−末端に操作可能に連結され；前記配列は、前記核酸分子の発現及び／又は送達が可能になるように、前記開始領域、前記オープンリーディングフレーム及び前記終結領域に操作可能に連結される。さらに別の実施形態において、発現ベクターは、ａ）転写開始領域；ｂ）転写終結領域；ｃ）イントロン；ｄ）少なくとも１つの前記核酸分子をコードする核酸配列を含み、前記配列は、前記核酸分子の発現及び／又は送達が可能になるように前記開始領域、前記イントロン及び前記終結領域に操作可能に連結される。
別の実施形態において、発現ベクターは、ａ）転写開始領域；ｂ）転写終結領域；ｃ）イントロン；ｄ）オープンリーディングフレーム；ｅ）少なくとも１つの前記核酸分子をコードする核酸配列を含み、前記配列は、前記オープンリーディングフレームの３’−末端に操作可能に連結され；前記配列は、前記核酸分子の発現及び／又は送達が可能になるように、前記開始領域、前記イントロン、前記オープンリーディングフレーム及び前記終結領域に操作可能に連結される。
ＩＶ．修飾ＳＩＮＡ分子
本明細書中に記載のｓｉＮＡコンストラクトの何れも下記のように評価及び修飾することができる。
ｓｉＮＡコンストラクトは、例えばｓｉＮＡコンストラクトが対象の身体に導入される場合など、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼにより切断されやすいものであり得る。切断の部位（例えば、ＲＮＡｉコンストラクトにおけるエンド及びエキソヌクレアーゼ核酸分解切断）を決定するために、及び切断機構を調べるために、方法を使用することができる。このような切断を阻害するために、ｓｉＮＡコンストラクトを修飾することができる。
代表的な修飾には、本明細書中に記載の修飾を含む、エンドヌクレアーゼ核酸分解を阻害する修飾が含まれる。特に好ましい修飾には、２’修飾、例えば、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド又は２’−デオキシヌクレオチド（例えば、２’デオキシ−シトジン）又は２’−フルオロ、ジフルオロトルイル、５−Ｍｅ−２’−ピリミジン、５−アリアミノ−ピリミジン、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−ヒドロキシ又は２’−アラ−フルオロヌクレオチド又はロックド核酸（ＬＮＡ）、伸長核酸（ＥＮＡ）、ヘキソース核酸（ＨＮＡ）又はシクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）が含まれる。ある実施形態において、２’修飾は、少なくとも１つの５’−ウリジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチド、少なくとも１つの５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチド、少なくとも１つの５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチド又は少なくとも１つの５’−ウリジン−シチジン−３’（５’−ＵＣ−３’）ジヌクレオチドのウリジンにおけるものであるか又は少なくとも１つの５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチド、少なくとも１つの５’−シチジン−シチジン−３’（５’−ＣＣ−３’）ジヌクレオチド又は少なくとも１つの５’−シチジン−ウリジン−３’（５’−ＣＵ−３’）ジヌクレオチドのシチジンにおけるものである。２’修飾はまた、ｓｉＮＡコンストラクトにおいて全てのピリミジンにも適用され得る。ある好ましい実施形態において、２’修飾は、ｓｉＮＡコンストラクトのセンス鎖上の２’ＯＭｅ修飾である。より好ましい実施形態において、２’修飾は、２’フルオロ修飾であり、２’フルオロは、センス（パッセンジャー）又はアンチセンス（ガイド）鎖又は両方の鎖上にある。
例えば、リン酸骨格における、ＳでのＯの置換による、骨格の修飾（例えばホスホロチオアート修飾の提供）は、エンドヌクレアーゼ活性を阻害するために使用することができる。ある実施形態において、ｓｉＮＡコンストラクトは、１以上のリボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドで置換することによって修飾されている。好ましくは、隣接デオキシリボヌクレオチドはホスホロチオアート結合により連結され、ｓｉＮＡコンストラクトは、センス又はアンチセンス鎖上で４個を超える連続デオキシリボヌクレオチドを含まない。Ｃ５アミノリンカーでのＵの置換；ＧでのＡの置換（配列変化は、センス鎖上にあり、アンチセンス鎖上にはないことが好ましい。）；又は２’、６’、７’又は８’位の糖の修飾もまた、ｓｉＮＡコンストラクトのエンドヌクレアーゼ切断を阻害し得る。好ましい実施形態は、これらの修飾の１以上がセンス鎖上に存在するが、アンチセンス鎖上に存在しないもの又はアンチセンス鎖がこのような修飾が少ない実施形態である。
代表的な修飾にはまた、エキソヌクレアーゼにより分解を阻害するものも含まれる。ある実施形態において、ｓｉＮＡコンストラクトには、ｓｉＮＡコンストラクトの末端ヌクレオチドの１以上の間の、ホスホロチオアート結合又はその結合におけるＰ−アルキル修飾が含まれる。別の実施形態において、ｓｉＮＡコンストラクトの１以上の末端ヌクレオチドには、糖修飾、例えば、２’又は３’糖修飾が含まれる。代表的な糖修飾には、例えば、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド（例えば、デオキシ−シトジン）、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’−Ｆ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２−Ｏ−−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−−ＮＭＡ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−ヒドロキシヌクレオチド又は２’−アラ−フルオロヌクレオチド又はロックド核酸（ＬＮＡ）、伸長核酸（ＥＮＡ）、ヘキソース核酸（ＨＮＡ）又はシクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）が含まれる。２’修飾は、好ましくは２’ＯＭｅ、より好ましくは２’フルオロである。
エキソヌクレアーゼによる切断を阻害するために記載される修飾は、単一のｓｉＮＡコンストラクト上に組み合わせることができる。例えば、ある実施形態において、ｓｉＮＡコンストラクトの少なくとも１個の末端ヌクレオチドは、ホスホロチオアート結合及び２’糖修飾、例えば、２’Ｆ又は２’ＯＭｅ修飾を有する。別の実施形態において、ｓｉＮＡコンストラクトの少なくとも１個の末端ヌクレオチドは、５’Ｍｅ−ピリミジン及び２’糖修飾、例えば２’Ｆ又は２’ＯＭｅ修飾を有する。
エキソヌクレアーゼ切断を阻害するために、ｓｉＮＡコンストラクトは、陽イオン性修飾など（例えば３’−脱塩基陽イオン性修飾など）、核酸塩基修飾を含み得る。陽イオン性修飾は、例えば、ｓｉＮＡコンストラクトの末端ヌクレオチドの１以上における、アルキルアミノ−ｄＴ（例えば、Ｃ６アミノ−ｄＴ）、アリルアミノ結合物、ピロリジン結合物、フタルアミド又はヒドロキシプロリノール結合物であり得る。ある実施形態において、アルキルアミノ−ｄＴ結合物は、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス又はアンチセンス鎖の３’末端に連結される。別の実施形態において、ピロリジンリンカーは、センス鎖の３’もしくは５’末端又はアンチセンス鎖の３’末端に連結される。ある実施形態において、アリルアミンウリジンは、センス鎖の３’又は５’末端上にあり、アンチセンス鎖の５’末端上にない。
ある実施形態において、ｓｉＮＡコンストラクトは、ｓｉＮＡコンストラクトの末端ヌクレオチドの１以上において結合物を含む。結合物は、例えば、脂溶性物質、テルペン、タンパク質結合物質、ビタミン、炭水化物、レチノイド又はペプチドであり得る。例えば、結合物は、ナプロキセン、ニトロインドール（又はスタッキング相互作用に関与する別の結合物）、葉酸、イブプロフェン、コレステロール、レチノイド、ＰＥＧ又はＣ５ピリミジンリンカーであり得る。その他の実施形態において、結合物は、グリセリド脂質結合物（例えばジアルキルグリセリド誘導体）、ビタミンＥ結合物又はチオコレステロールである。ある実施形態において、結合物は、アンチセンス鎖の３’末端上又はセンス鎖の５’又は３’末端上にあり、結合物は、アンチセンス鎖の３’末端及びセンス鎖の３’末端上にない。
ある実施形態において、結合物はナプロキセンであり、結合物は、センス又はアンチセンス鎖の５’又は３’末端上にある。ある実施形態において、結合物はコレステロールであり、結合物は、センス鎖の５’又は３’末端上にあり、アンチセンス鎖には存在しない。ある実施形態において、コレステロールは、ピロリジンリンカー又はセリノールリンカー、アミノオキシ又はヒドロキシプロリノールリンカーによりｓｉＮＡコンストラクトに結合されている。その他の実施形態において、結合物は、ｄＵ−コレステロールであるか又はコレステロールがジスルフィド結合によりｓｉＮＡコンストラクトに結合されている。別の実施形態において、結合物は、コラン酸であり、コラン酸は、センス鎖の５’もしくは３’末端又はアンチセンス鎖の３’末端に結合されている。ある実施形態において、コラン酸は、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端に連結される。別の実施形態において、結合物は、ＰＥＧ５、ＰＥＧ２０、ナプロキセン又はレチノールである。
別の実施形態において、１以上の末端ヌクレオチドは、２’−５’結合を有する。ある実施形態において、２’−５’結合は、センス鎖、例えばセンス鎖の５’末端に存在する。
ある実施形態において、ｓｉＮＡコンストラクトは、Ｌ−糖を好ましくはセンス鎖の５’又は３’末端に含む。
ある実施形態において、ｓｉＮＡコンストラクトは、１以上の末端ヌクレオチドで、エキソヌクレアーゼ耐性を促進するために、例えばコンストラクトのセンス又はアンチセンス鎖の３’末端で、メチルホスホン酸塩を含む。
ある実施形態において、ｓｉＲＮＡコンストラクトは、デオキシリボヌクレオチドで１以上のリボヌクレオチドを置換することにより、修飾されている。別の実施形態において、隣接デオキシリボヌクレオチドは、ホスホロチオアート結合により連結される。ある実施形態において、ｓｉＮＡコンストラクトは、センス又はアンチセンス鎖において４個を超える連続デオキシリボヌクレオチドを含まない。別の実施形態において、リボヌクレオチドは全て、リボヌクレオチドではない修飾ヌクレオチドで置換されている。
ある実施形態において、細胞及び生体試料中での安定性が向上しているｓｉＮＡコンストラクトは、ジフルオロトルイル（ＤＦＴ）修飾、例えば、イノシン置換に対する２，４−ジフルオロトルイルウラシル又はグアニジンを含む。
本方法は、候補ｓｉＮＡ、例えば候補ｓｉＲＮＡコンストラクト（これは、修飾されていないか又は修飾、例えば分解を阻害するか、ｄｓＲＮＡ分子を標的化するか又はハイブリッド形成を調節する修飾を含む。）を評価するために使用することができる。このような修飾は本明細書中に記載されている。切断アッセイは、標的転写産物を抑制する修飾又は非修飾候補の能力を調べるためのアッセイと組み合わせることができる。例えば、標的（又は間違った標的配列）を抑制するその能力を評価するために、候補を（場合によっては）試験し、その切断されやすさを評価し、修飾された候補物質を産生させるためにそれを修飾し（例えば、分解を阻害するためになど、本明細書中に記載のように）、抑制能及び分解耐性能の一方又は両方について修飾された候補物質を試験し得る。この手順を反復し得る。１回につき１つ又はまとめて修飾を導入することができる。標的ＲＮＡを抑制する能力を監視するために細胞を用いた方法を使用することが好都合であることが多い。この後、活性を確認するために、異なる方法、例えば、動物全体を用いる方法を行い得る。
修飾（塩基、糖及び／又はリン酸）を有する化学合成核酸分子は、血清リボヌクレアーゼによるそれらの分解を阻止し、それらの有効性を向上させることができる（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、国際公開番号ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ ３４４：５６５；Ｐｉｅｋｅｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３１４；Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ、１９９２、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３３４；Ｂｕｒｇｉｎら、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５：１４０９０；Ｕｓｍａｎら、国際公開番号ＷＯ９３／１５１８７；及びＲｏｓｓｉら、国際公開番号ＷＯ９１／０３１６２；Ｓｐｒｏａｔ、米国特許第５，３３４，７１１号；Ｇｏｌｄら、米国特許第６，３００，０７４号；及びＶａｒｇｅｅｓｅら、ＵＳ２００６／０２１７３３を参照。）。上記参考文献の全ては、本明細書中に記載の核酸分子の、塩基、リン酸及び／又は糖部分に対してなされ得る様々な化学修飾を記載する。細胞におけるそれらの有効性及びオリゴヌクレオチド合成時間を短縮するための核酸分子からの塩基の除去を促進し、化学的必要条件を減少させる修飾が所望される。
１以上のｍｉＲ−３４ファミリーメンバーにより下方制御される２以上の遺伝子の発現を調節又は減弱させることにおける使用のための化学修飾ｓｉＮＡ分子もまた、本発明の範囲内である。本明細書中に記載されているのは、単離ｓｉＮＡ物質、例えば、ＲＮＡｉが、１以上のｍｉＲ−３４ファミリーメンバーにより下方制御される２以上の遺伝子の発現を阻害するのに介在するＲＮＡ分子（化学修飾されているか又はされていない２本鎖又は１本鎖）である。
本明細書中で考察されるｓｉＮＡ物質には、他に、非修飾ＲＮＡならびに、例えば有効性を向上させるために化学修飾されているＲＮＡ、及びヌクレオシド代用物のポリマーが含まれる。非修飾ＲＮＡは、核酸の成分、即ち糖、塩基及びリン酸部分が、天然で生じるものと同じであるか又は基本的に同じである、好ましくはヒト身体で天然に生じるものと同じである分子を指す。この技術は、稀であるか又は通常のものではないが天然の、修飾ＲＮＡとしてのＲＮＡを指している（例えば、Ｌｉｍｂａｃｈら、１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２１８３−２１９６参照）。修飾ＲＮＡと呼ばれることが多い、このような稀であるか又は通常とは異なるＲＮＡは、（明らかに、これらは通常、翻訳後修飾の結果であるので）、本明細書中で使用される場合、非修飾ＲＮＡという用語の範囲内である。
修飾ＲＮＡは、本明細書中で使用される場合、核酸の成分（即ち、ＲＮＡｉ２本鎖の成分である、糖、塩基及びリン酸部分）の１以上が天然で生じるものとは異なる、好ましくはヒト身体で生じるものとは異なる分子を指す。これらが「修飾ＲＮＡ」と呼ばれる一方、これらは、当然のことながら、修飾ゆえに、ＲＮＡではない分子を含む。ヌクレオシド代用物は、リボホスフェート骨格により見られるものとハイブリッド形成が実質的に同様であるように正しい空間的関係で塩基が与えられることを可能にする非リボホスフェートコンストラクトでリボホスフェート骨格が置換される分子である（例えば、リボホスフェート骨格の非荷電模倣物）。上記の全てのものの例は、本明細書中で考察される。
本明細書中に記載の修飾は、本明細書中に記載の何らかの２本鎖ＲＮＡ及びＲＮＡ様分子（例えばｓｉＮＡコンストラクト）に組み込むことができる。これは、ｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス及びセンス鎖の一方又は両方を修飾するために望ましいものであり得る。核酸がサブユニットのポリマー又はモノマーである場合、下記の修飾の多くは、核酸内で反復される位置、例えば塩基の修飾、又はリン酸部分又はリン酸部分の非連結Ｏで起こる。場合によっては、核酸中の対象位置全てで修飾が生じるが、多くの場合、実際は殆どの場合、そのようにならない。
例として、修飾は３’又は５’末端位置で起こり得、末端領域で、例えば末端ヌクレオチドの位置で又は鎖の最後の２、３、４、５又は１０ヌクレオチドにおいて、起こり得る。２本鎖領域、１本鎖領域又は両方で修飾が起こり得る。例えば、非連結Ｏ位置のホスホロチオアート修飾は、一方又は両末端でのみで起こり得、末端領域（例えば末端ヌクレオチドの位置で又は鎖の最後の２、３、４、５又は１０ヌクレオチドにおいて）でのみ起こり得るか、又は２本鎖及び１本鎖領域で、特に末端で起こり得る。同様に、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方において修飾が起こり得る。場合によっては、隣接残基を除く内部残基で修飾が起こり得る。ある場合では、センス及びアンチセンス鎖は、同じ修飾又は同じクラスの修飾を有するが、その他の場合では、センス及びアンチセンス鎖は異なる修飾を有し、例えば、ある場合には、一方の鎖のみ、例えばセンス鎖を修飾することが望ましいものであり得る。ある場合には、ＲＩＳＣ複合体への抗センス鎖の挿入を促進するために、センス鎖が修飾、例えばキャップ付加され得る。
ｓｉＮＡコンストラクトの、糖、塩基又は骨格に対してなされ得るその他の適切な修飾は、ＵＳ２００６／０２１７３３１、ＵＳ２００５／００２０５２１、ＷＯ２００３／７０９１８、ＷＯ２００５／０１９４５３、ＰＣＲ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１９３に記載されている。ｓｉＮＡコンストラクトは、上述の参考文献の何れか１つに記載の塩基など、非天然の塩基を含み得る。ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１８２２も参照のこと。ｓｉＮＡコンストラクトはまた、非炭化水素環状担体分子など、非天然の糖も含み得る。ｓｉＮＡ物質での使用のための非天然の糖の代表的な特性は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１１８２９に記載されている。
本発明のｓｉＮＡコンストラクトへの修飾の導入に対する２つの主要な目的は、生体環境における分解に対するそれらの安定化及び薬理学的特性、例えば薬物動態特性の向上である。当技術分野において、それらのヌクレアーゼ安定性及び有効性を顕著に促進しながら核酸分子に導入することができる、糖、塩基及びリン酸修飾を記載するいくつかの例がある。例えば、オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性基（例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｈ、ヌクレオチド塩基修飾）での修飾により、安定性を促進するため及び／又は生物学的活性を促進するために修飾される（概説としては、Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ、１９９２、ＴＩＢＳ １７：３４；Ｕｓｍａｎら、１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１：１６３；Ｂｕｒｇｉｎら、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５：１４０９０を参照のこと。）。核酸分子の糖修飾は、当技術分野で詳細に記載されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４４：５６５−５６８；Ｐｉｅｋｅｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３１４−３１７；Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ、１９９２、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３３４−３３９；Ｕｓｍａｎら、国際公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｓｐｒｏａｔ、米国特許第５，３３４，７１１号及びＢｅｉｇｅｌｍａｎら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０：２５７０２；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、国際ＰＣＴ公開ＷＯ９７／２６２７０；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、米国特許第５，７１６，８２４号；Ｕｓｍａｎら、米国特許第５，６２７，０５３号；Ｗｏｏｌｆら、国際ＰＣＴ公開ＷＯ９８／１３５２６；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、米国特許出願シリアル番号６０／０８２，４０４（１９９８年４月２０日出願）；Ｋａｒｐｅｉｓｋｙら、１９９８、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、３９：１１３１；Ｅａｒｎｓｈａｗ及びＧａｉｔ、１９９８、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、４８：３９−５５；Ｖｅｒｍａ及びＥｃｋｓｔｅｉｎ、１９９８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６７：９９−１３４；及びＢｕｒｌｉｎａら、１９９７、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、５：１９９９−２０１０参照）。このような刊行物は、触媒作用を変化させることなく、糖、塩基及び／又はリン酸修飾などの核酸分子への組み込みの位置を決定するための一般的な方法及びストラテジーを記載する。このような教示を考慮して、細胞でのＲＮＡｉを促進するｓｉＮＡの能力が顕著に阻害されない限り、本発明のｓｉＮＡ分子を変化させるために、同様の修飾を本明細書中に記載のように使用することができる。
修飾は、糖−リン酸骨格の修飾であり得る。修飾はまた、ヌクレオシド部分が修飾され得る。場合によっては、センス鎖は、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％修飾ヌクレオチドを含むＲＮＡ又はＲＮＡ鎖である。ある実施形態において、センスポリヌクレオチドは、複数の修飾リボヌクレオチドを含むＲＮＡ鎖である。同様に、その他の実施形態において、ＲＮＡアンチセンス鎖は１以上の修飾を含む。例えば、ＲＮＡアンチセンス鎖は、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又は７５％以下の修飾ヌクレオチドを含み得る。１以上の修飾は、生理的条件において、同じ指定配列を有する非修飾２本鎖核酸に対して、２本鎖核酸の疎水性を向上させるように選択され得る。
ある実施形態において、１以上の修飾を含むｓｉＮＡコンストラクトは、その他の同一の非修飾ｓｉＲＮＡコンストラクトのｌｏｇＰ値未満の少なくとも０．５ ｌｏｇＰ単位のｌｏｇＰ値を有する。別の実施形態において、１以上の修飾を含むｓｉＮＡコンストラクトは、その他の同一の非修飾ｓｉＲＮＡコンストラクトのｌｏｇＰ値未満の、少なくとも１、２、３又はさらに４のｌｏｇＰ単位を有する。１以上の修飾は、生理的条件において、同じ指定配列を有する非修飾２本鎖核酸に対して、２本鎖核酸の正電荷を増加させる（又は負電荷を増加させる）ように選択され得る。ある実施形態において、１以上の修飾を含むｓｉＮＡコンストラクトは、他の同一の非修飾ｓｉＲＮＡコンストラクトよりも少なくとも０．２５単位高い等電点ｐＨ（ｐＩ）を有する。別の実施形態において、センスポリヌクレオチドは、ホスホロチオアート部分、ホスホロアミダート部分、ホスホジチオアート部分、ＰＮＡ部分、ＬＮＡ部分、２’−Ｏ−メチル部分及び２’−デオキシ−２’フッ化物部分からなる群から選択されるリン酸−糖骨格に対する修飾を含む。
ある実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、細胞内部でｓｉＲＮＡにプロセシングされるヘアピン核酸である。場合によっては、２本鎖核酸の各鎖は、１９−１００塩基対長及び好ましくは１９−５０又は１９−３０塩基対長であり得る。
ｓｉＮＡｉコンストラクトは、ヌクレアーゼ耐性を向上させるのに有用であるヌクレオチド間結合（例えばキラルホスホロチオアート結合）を含み得る。さらに、又はあるいは、ｓｉＮＡコンストラクトは、ヌクレアーゼ耐性を向上させるためにリボース模倣物を含み得る。ヌクレアーゼ耐性を向上させるための代表的なヌクレオチド間結合及びリボース模倣物は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０に記載されている。
ｓｉＲＮＡｉコンストラクトはまた、オリゴヌクレオチド合成のための、リガンド結合モノマーサブユニット及びモノマーも含み得る。代表的なモノマーは、例えば米国出願第１０／９１６，１８５号に記載されている。
ｓｉＮＡコンストラクトは、共有ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０に記載のような、ＺＸＹ構造を有し得る。同様に、ｓｉＮＡコンストラクトは、両親媒性部分と複合体形成され得る。ｓｉＮＡ物質との使用のための代表的な両親媒性部分は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０に記載されている。
ｓｉＮＡｉコンストラクトのセンス及びアンチセンス配列は、パリンドロームであり得る。パリンドロームｓｉＮＡ物質の代表的な特性は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０に記載されている。
別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡコンストラクトは、モジュラー複合体を特色とする送達物質と複合体形成され得る。この複合体は、次のものの１以上（好ましくは２以上、より好ましくは３つ全て）と連結される担体物質を含み得る：（ａ）縮合剤（例えばイオン性又は静電相互作用を通じて、例えば、核酸を求引、例えば核酸に結合することができる物質）；（ｂ）融合誘導因子（例えば、細胞膜を通じて融合することができる及び／又は輸送され得る。）；及び（ｃ）標的基、例えば、細胞又は組織標的物質、例えば、特異的な細胞型に結合する、レクチン、糖タンパク質、脂質又はタンパク質（例えば抗体）。送達物質と複合体化されたｉＲＮＡ物質は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０に記載されている。
本発明のｓｉＮＡコンストラクトは、ｉＲＮＡ２本鎖のセンスとアンチセンス配列との間などの、非標準的な対形成を有し得る。非標準的ｉＲＮＡ物質の代表的な特性は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０に記載されている。
ある実施形態において、本発明の核酸分子は、１以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）Ｇ−クランプヌクレオチドを含む。Ｇ−クランプヌクレオチドは、修飾シトシン類似体（この修飾は、２本鎖内で相補的グアニンのワトソン−クリック及びフーグスティーンフェイスの両方を水素結合する能力をもたらす。）である。例えば、Ｌｉｎ及びＭａｔｔｅｕｃｃｉ、１９９８、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２０：８５３１−８５３２参照。オリゴヌクレオチド内の１個のＧ−クランプ類似体置換の結果、相補的オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させられる場合、ヘリックスの熱安定性及びミスマッチ識別が実質的に促進され得る。本発明の核酸分子にこのようなヌクレオチドが含まれる結果、核酸標的、相補的配列又は鋳型鎖に対する親和性及び特異性の両方が向上する。別の実施形態において、本発明の核酸分子は、２’，４’−Ｃメチレンビシクロヌクレオチドなどの、１以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＬＮＡ「ロックド核酸」ヌクレオチドを含む（例えば、Ｗｅｎｇｅｌら、国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／６６６０４及びＷＯ９９／１４２２６参照）。
本発明のｓｉＮＡ物質は、ヌクレアーゼに対する耐性を向上させるために修飾され得る。代表的な方法は、切断部位を同定し、切断を阻害するためにこのような部位を修飾することを目論む。ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１８９３１で開示されるような代表的ジヌクレオチド５’−ＵＡ−３’、５’−ＵＧ−３’、５’−ＣＡ−３’、５’−ＵＵ−３’又は５’−ＣＣ−３’は、切断部位となり得る。
ヌクレアーゼ耐性及び／又は標的に対する結合親和性の向上のために、ｓｉＲＮＡ物質（例えばｉＲＮＡ物質のセンス及び／又はアンチセンス鎖）は、例えば、２’−修飾リボース単位及び／又はホスホロチオアート結合を含み得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、多くの異なる「オキシ」又は「デオキシ」置換基で修飾又は置換され得る。
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例には、アルコキシ又はアリールオキシ（ＯＲ、例えば、Ｒ．ｄｂｄ．Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；例えばメチレン架橋により、同じリボース糖の４’炭素に、２’ヒドロキシルが連結される、「ロックド」核酸（ＬＮＡ）；Ｏ−アミン（アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）及びアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎアミン、（例えば、アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）が含まれる。メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＰＥＧ誘導体）のみを含有するオリゴヌクレオチドが強固なホスホロチオアート修飾で修飾されたものに匹敵するヌクレアーゼ安定性を示すことは注目に値する。
「デオキシ」修飾には、水素（即ち、デオキシリボース糖、これは、部分的ｄｓＲＮＡの突出部分に特に関連がある。）；ハロ（例えばフルオロ）；アミノ（例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ又はアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミン（アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ又はジヘテロアリールアミノ）、−−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；及びアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルが含まれ、これらは、例えば、アミノ官能基で場合によっては置換され得る。ある実施形態において、置換基は、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル及び２’−フルオロである。
別の実施形態において、ヌクレアーゼ耐性を最大化するために、２’修飾は、１以上のリン酸リンカー修飾（例えばホスホロチオアート）と組み合わせて使用され得る。いわゆる「キメラ」オリゴヌクレオチドは、２以上の異なる修飾を含有するものである。
ある実施形態において、ｓｉＮＡ物質の全てのピリミジンは２’−修飾を担い、従って、この分子は、エンドヌクレアーゼに対する耐性が向上している。高ヌクレアーゼ耐性はまた、５’−ヌクレオチドを修飾することによっても達成され得、その結果、例えば少なくとも１つの５’−ウリジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチド（ここで、ウリジンは２’−修飾ヌクレオチドである。）、少なくとも１つの５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチド（ここで、５’−ウリジンは２’−修飾ヌクレオチドである。）；少なくとも１つの５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチド（ここで、５’−シチジンは２’−修飾ヌクレオチドである。）；少なくとも１つの５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチド（ここで、５’−ウリジンは２’−修飾ヌクレオチドである。）；又は少なくとも１つの５’−シチジン−シチジン−３’（５’−ＣＣ−３’）ジヌクレオチド（ここで、５’−シチジンは２’−修飾ヌクレオチドである。）が得られる。ｓｉＮＡ物質は、このようなジヌクレオチドの少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４又は少なくとも５個を含み得る。ある実施形態において、配列モチーフ５’−ＵＡ−３’、５’−ＣＡ−３’、５’−ＵＵ−３’及び５’−ＵＧ−３’の全ての出現における５’−末端（ｍｏｓｔ）ピリミジンは２’−修飾ヌクレオチドである。その他の実施形態において、センス鎖における全てのピリミジンは、配列モチーフ５’−ＵＡ−３’及び５’−ＣＡ−３’の全出現において、２’−修飾ヌクレオチド及び５’−末端（ｍｏｓｔ）ピリミジンである。ある実施形態において、センス鎖中の全ピリミジンが、２’−修飾ヌクレオチドであり、配列モチーフ５’−ＵＡ−３’、５’−ＣＡ−３’、５’−ＵＵ−３’及び５’−ＵＧ−３’の全出現における５’−末端（ｍｏｓｔ）ピリミジンが、アンチセンス鎖において２’−修飾ヌクレオチドである。修飾の後者のパターンは、ヌクレアーゼ分解に対する分子全体の安定化に対するヌクレオチド修飾の関与を最大化し、一方で所望の安定性を達成することが必要とされる修飾の総数を最小化することが示されている。ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１８９３１参照。ヌクレアーゼに対する耐性を向上させるためのさらなる修飾は、ＵＳ２００５／００２０５２１、ＷＯ２００３／７０９１８及びＷＯ２００５／０１９４５３で見出され得る。
オリゴヌクレオチド骨格においてフラノース糖を含むことによっても、エンドヌクレアーゼ性切断を減少させることができる。このようにして、ある実施形態において、本発明のｓｉＮＡは、３’陽イオン基を含むことにより、又は３’−３’連結により３’−末端でヌクレオシドを逆転することにより、修飾することができる。別の代替法において、３’−末端は、アミノアルキル基で、例えば、３’Ｃ５−アミノアルキルｄＴで遮断することができる。その他の３’結合物は、３’−５’エキソヌクレアーゼ性切断を阻害することができる。理論に縛られないが、ナプロキセン又はイブプロフェンなどの３’結合物は、オリゴヌクレオチドの３’−末端への結合からエキソクレアーゼを立体的に遮断することにより、エキソヌクレアーゼ性切断を阻害し得る。低分子の、アルキル鎖、アリール基、複素環結合物又は修飾糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコースなど）でさえも、３’−５’−エキソヌクレアーゼを遮断することができる。
同様に、５’結合物は、５’−３’エキソヌクレアーゼ性切断を阻害し得る。理論に縛られないが、ナプロキセン又はイブプロフェンなどの５’結合物は、オリゴヌクレオチドの５’−末端への結合からエキソヌクレアーゼを立体的に遮断することによって、エキソヌクレアーゼ性切断を阻害し得る。低分子の、アルキル鎖、アリール基、複素環結合物又は修飾糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコースなど）でさえも、３’−５’−エキソヌクレアーゼを遮断することができる。
ｓｉＮＡ分子によるヌクレアーゼへの耐性を向上させることに対する代替的アプローチは、２本鎖ｓｉＮＡの少なくとも一方又は両鎖に対して突出部を含むことを目論む。ある実施形態において、ヌクレオチド突出部は、１から４、好ましくは２から３の不対ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、末端ヌクレオチド対に直接隣接する１本鎖突出部の不対ヌクレオチドは、プリン塩基を含有し、末端ヌクレオチド対はＧ−Ｃ対であるか、又は最後の４つの相補的ヌクレオチド対のうち少なくとも２つがＧ−Ｃ対である。その他の実施形態において、ヌクレオチド突出部は、１又は２つの不対ヌクレオチドを有し得、代表的な実施形態において、ヌクレオチド突出部は、５’−ＧＣ−３’であり得る。別の実施形態において、ヌクレオチド突出部は、アンチセンス鎖の３’−末端にある。
このようにして、ｓｉＮＡ分子は、本文の主要部で見出される、例えばヌクレアーゼ、例えばエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼによる分解を阻害するように修飾されているモノマーを含み得る。これらのモノマーは、本明細書中でＮＲＭ又はヌクレアーゼ耐性促進モノマー又は修飾と呼ばれる。場合によっては、これらの修飾は、同様にｓｉＮＡ物質のその他の特性、例えばタンパク質（例えば輸送タンパク質、例えば血清アルブミン）又はＲＩＳＣのメンバーと相互作用する能力、又は第一及び第二の配列が互いに２本鎖を形成するか又は別の配列（例えば標的分子）と２本鎖を形成する能力を調節する。
理論に縛られることを望まないが、ｓｉＮＡ物質中の糖、塩基及び／又はリン酸骨格の修飾は、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ耐性を促進し、輸送体タンパク質及びＲＩＳＣ複合体の機能的成分の１以上との相互作用を促進することができると考えられる。ある実施形態において、修飾は、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼ耐性を向上させ得、従って、ＲＩＳＣ複合体との相互作用前のｓｉＮＡ物質の半減期を延長させるが、同時に標的ｍＲＮＡ切断を支配する物質としてのその意図される活性に対してｓｉＮＡ物質を不活性化しない。再び、理論に縛られることを望まないが、アンチセンス鎖の３’及び／又は５’末端において又はその近くに修飾を配置する結果、ｓｉＮＡ物質は上記で説明される好ましいヌクレアーゼ耐性基準に合致するようになり得ると考えられる。
上記で説明されるヌクレアーゼ耐性基準を示すｓｉＮＡ物質を産生させるために有用であり得る修飾は、糖、塩基、及び／又はリン酸骨格の次の化学及び／又は立体化学的修飾の１以上を含み得、この技術は、同様に同じ結果を達成し得るその他の方法も開示すると理解されたい：
（ｉ）キラル（Ｓｐ）チオアート。ＮＲＭは、非架橋位置にヘテロ原子（例えば位置Ｘ（これは、一般には酸素が占める位置である。）にＳｐ又はＲｐ）を含有する修飾リン酸基の特定のキラル型が豊富であるか純粋な特定のキラル型であるヌクレオチド二量体を含み得る。Ｘでの原子はまたＳ、Ｓｅ、Ｎｒ２又はＢｒ３でもあり得る。ＸがＳである場合、Ｓｐ連結が豊富であるかキラル的に純粋であるＳｐ連結が好ましい。豊富である、とは、好ましい型が少なくとも７０、８０、９０、９５又は９９％であることを意味する。
（ｉｉ）リン酸又は修飾リン酸骨格部分の、糖、塩基及び／又はリン原子への１以上の陽イオン基の連結。ある実施形態において、これらは、陽イオン基において誘導体化された末端位置にモノマーを含み得る。アンチセンス配列の５’−末端は、末端−−ＯＨ又はリン酸基を有するはずであるので、このＮＲＭは好ましくはアンチセンス配列の５’−末端で使用されない。この基は、好ましくは、例えば、他方の鎖の相補的塩基と相互作用する面から離れた（例えば、ピリミジンの５’位又はプリンの７位で）、Ｈ結合形成及びハイブリッド形成への干渉を最小限にする塩基の位置に連結されるはずである。
（ｉｉｉ）末端での非リン酸結合。ある実施形態において、ＮＲＭは、非リン酸結合、例えば、リン酸結合よりも切断に対する耐性を大きくする４原子の連結、を含む。例としては、３’ＣＨ２−ＮＣＨ３−−Ｏ−−ＣＨ２−５’及び３’ＣＨ２−−ＮＨ−−（Ｏ．ｄｂｄ．）−−ＣＨ２−５’が挙げられる。
（ｉｖ）３’−架橋チオホスフェート及び５’−架橋チオホスフェート。ある実施形態において、ＮＲＭはこれらの構造の間に含まれ得る。
（ｖ）Ｌ−ＲＮＡ、２’−５’結合、逆位結合（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｌｉｎｋａｇｅ）及びａ−ヌクレオシド。ある実施形態において、ＮＲＭは、Ｌヌクレオシド及びＬ−ヌクレオシド由来の二量体ヌクレオチド；２’−５’リン酸、非リン酸及び修飾リン酸結合（例えば、チオホスフェート、ホスホールアミダート及びボロノホスフェート）；逆位結合（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｌｉｎｋａｇｅ）（例えば３’−３’又は５’−５’連結）を有する二量体；糖の１’部位にα結合があるモノマー、例えば、α結合を有する本明細書中に記載の構造を含む。
（ｖｉ）結合基。ある実施形態において、ＮＲＭは、例えば、糖、塩基又は骨格を通じて、例えば、モノマーと結合される本明細書中に記載の標的部分又は結合リガンドを含み得る；
（ｖｉ）脱塩基結合。ある実施形態において、ＮＲＭは、脱塩基モノマー、例えば本明細書中に記載のような脱塩基モノマー（例えば、核酸塩基のないモノマー）；本明細書中に記載のような芳香族又は複素環又はポリ複素環芳香族モノマーを含み得る；
（ｖｉｉ）５’−ホスホネート及び５’−リン酸プロドラッグ。ある実施形態において、ＮＲＭは、好ましくは末端位置、例えば５’位に、モノマーを含み、ここで、リン酸基の１以上の原子が保護基で誘導体化され、この保護基は、対象の身体中の成分（例えばカルボキシエステラーゼ又は対象の身体中に存在する酵素）の作用の結果として除去される。例えば、カルボキシエステラーゼが保護される分子を切断し、その結果、リン酸塩のＯに隣接する炭素を攻撃するチオアート陰イオンが生成され、その結果非保護リン酸塩が生成されるリン酸プロドラッグである。
「リガンド」とは、本明細書中で使用される場合、抗原−抗体相互作用以外の機構を通じて、第二の分子（通常は、ポリペプチド又はその一部、例えば炭水化物部分など）に特異的に結合する分子を意味する。この用語は、例えば、その構造が人間により発明された分子を含む、天然又は合成の何れかの、ポリペプチド、ペプチド及び小分子を包含する。この用語は、それらが相互作用し、通常はそれらの活性を調節する受容体及び分子（例えばアゴニスト又はアンタゴニスト）に関して頻繁に使用されるが、この用語は、本明細書中で使用される場合、より全般的に適用される。
１以上の様々なＮＲＭ修飾は、ｓｉＮＡ物質に又はｓｉＲＮＡ物質の配列に導入され得る。ＮＲＭ修飾は、配列において又はｓｉＲＮＡ物質において複数回使用され得る。ある一部のＮＲＭはハイブリッド形成を妨害するので、組み込まれる総数は、ｓｉＮＡ物質２本鎖形成の受容可能なレベルが維持されるようなものであるべきである。
ある実施形態において、ＮＲＭ修飾は、末端切断部位に又は、対象において所望の配列もしくは遺伝子を標的としない配列（センス鎖又は配列）の切断領域に、導入される。
殆どの場合、ヌクレアーゼ耐性促進修飾は、その配列が対象における配列を標的とするか（アンチセンス配列と呼ばれる。）、又は対象において配列を標的としないか（センス配列と呼ばれることが多い。）に依存して様々に分布する。配列が対象における配列を標的とするべき場合、ＲＩＳＣ介在切断に曝される領域、例えば切断部位又は切断領域において、エンドヌクレアーゼ切断を妨害するか又は阻害する修飾を挿入すべきではない（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．１５：１８８に記載のとおり）。
標的の切断は、２０又は２１ｎｔガイドＲＮＡのおよそ中ほど又はガイド配列に相補的である第一のヌクレオチドの約１０もしくは１１ヌクレオチド上流で起こる。本明細書中で使用される場合、「切断部位」は、切断部位の何れかの側における、標的における、又はそれに対してハイブリッド形成するｉＲＮＡ物質鎖における、ヌクレオチドを指す。切断領域は、何れかの方向の、切断部位の１、２又は３ヌクレオチド内のヌクレオチドを意味する。
このような修飾は、末端領域に、例えば、標的する配列又は対象において配列を標的しない配列の、末端部位又は末端の位置２、３、４又は５内に導入することができる。
Ｖ．治療での使用
不全ＴＰ５３経路状態を有する腫瘍は、成長過程においていくつかの腫瘍学化合物に対してより反応性があると仮定される（ＰＬＫ１、ＡＵＲＡ、ＷＥＥ１、ＣＨＥＫ１）（ＷＯ２００５０３１００２）。従って、ＴＰ５３機能状態を予測する転写の同定は、これらの化合物の臨床試験のための適切な患者集団の選択に有用であり得る。先行研究は、ＴＰ５３機能に対する転写マーカーを同定するために、ゲノムスケールのアプローチを使用してきた。ＴＰ５３転写因子結合部位のゲノムスケール分析に対してクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）が使用された（Ｗｉｅら、（２００６）Ｃｅｌｌ １２４：２０１−２１９）。Ｍｉｌｌｅｒらは、配列決定されたＴＰ５３を用いて乳癌を分析し、ＴＰ５３−突然変異及び野生型腫瘍を区別する発現痕跡を同定し、治療反応を予測した（Ｍｉｌｌｅｒら、（２００５）ＰＮＡＳ １０２：１３５５０−１３５５５）。
ある実施形態において、癌に罹患している哺乳動物対象を治療するための方法が提供されるが、この方法は、（ａ）活性ＴＰ５３経路又は不活性ＴＰ５３経路を有するものとして対象からの癌細胞試料を分類し；（ｂ）低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を含む組成物を用いて活性ＴＰ５３経路を有する哺乳動物対象を治療することを含み、ここで、前記ｓｉＮＡは、少なくとも１８ヌクレオチドのガイド鎖連続ヌクレオチド配列を含み、前記ガイド鎖は、ヌクレオチド位置１から１２からなるシード領域を含み、位置１はこのガイド鎖の５’末端に相当し、前記シード領域は、配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号３１からなる群から選択される配列内の６個の連続ヌクレオチドと同一である少なくとも６個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。
本発明の組成物を用いて治療することができる癌の例には、以下に限定されないが、胆道癌；膀胱癌；膠芽細胞腫及び髄芽腫を含む脳腫瘍；乳癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；急性リンパ性及び骨髄性白血病を含む血液学的腫瘍；多発性骨髄腫；ＡＩＤＳ関連白血病及び成人Ｔ細胞白血病リンパ腫；ボーエン病及びパジェット病を含む上皮内新生物；肝臓癌；肺癌；ホジキン病及びリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫；神経芽細胞腫；扁平上皮癌を含む口腔癌；上皮細胞、間質細胞、生殖細胞及び間葉細胞から生じるものを含む卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫及び骨肉腫を含む肉腫；メラノーマ、カポジ肉腫、基底細胞癌及び扁平上皮癌を含む皮膚癌；セミノーマ、非セミノーマ、奇形腫、絨毛癌などの胚細胞腫瘍を含む睾丸癌；間質性腫瘍及び生殖細胞腫瘍；甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）及び髄様癌を含む甲状腺癌；及び腺癌及びウィルムス腫瘍を含む腎臓癌が含まれる。
ある実施形態において、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を含む本発明の組成物は、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、直腸結腸癌及び脳腫瘍などの一般的に遭遇する癌に罹患した哺乳動物対象を治療するために使用される。ある実施形態において、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を含む本発明の組成物は、ｃ−ＭＥＴ依存性である癌細胞の増殖を阻害するために使用される。ある実施形態において、本発明の組成物は、ｃ−ＭＥＴ依存性である非小細胞肺癌に罹患した哺乳動物対象を治療するために使用される。
一般に、癌に罹患する哺乳動物対象を治療するための本発明の１以上の組成物の有効量は、インシトゥで哺乳動物癌細胞増殖を阻害するために必要な量である。当業者は、抗癌剤の有効量を評価する技術に対して熟練している。
場合によっては、上述の治療法は、既知の癌治療法と組み合わせ得る。「癌治療」という用語には、本明細書中で使用される場合、以下に限定されないが、化学療法、放射線療法、アジュバント療法、外科手術又はこれらの何らかの組み合わせ及び／又はその他の方法を含み得る。癌治療の特定の形態は、例えば、治療される対象によって変化し得る。例としては、以下に限定されないが、投与量、投与のタイミング、治療期間などが挙げられる。医学分野の通常の技術者は、対象に対する適切な癌治療を決定することができる。
本発明の分子は、医薬品として使用することができる。医薬品は、対象における病態の発症を予防するか、阻害するか又は対象における病態を治療（ある程度まで、好ましくは全ての症状を緩和）する。
医薬組成物を形成するために安定化剤、緩衝剤などとともに又はこれらなしで、何らかの標準的手段により、本発明の負に荷電したポリヌクレオチドを投与し（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はそれらのタンパク質複合体）、対象に導入することができる。リポソーム送達機構を使用することが所望される場合、リポソームの形成のための標準的プロトコールに従い得る。本発明の組成物はまた、経口投与用の、錠剤、カプセル又はエリキシル；直腸投与用の座薬；滅菌溶液；注射物質投与のための懸濁液；及び当技術分野で公知のその他の組成物として処方され使用され得る。
ある実施形態において、本発明の組成物は、局所注射を介して、腫瘍など、対象の局所領域に局所投与される。
本発明はまた、記載される化合物の医薬的に許容可能な製剤も含む。これらの製剤は、上記化合物の塩、例えば酸付加塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩及びベンゼンスルホン酸塩を含む。
医薬組成物又は製剤とは、細胞又は対象（好ましくはヒト）への投与（例えば全身投与）に適切な形態の組成物又は製剤を指す。適切な形態は、一部分、使用又は移入経路（例えば経口、経皮又は注射による）に依存する。このような形態は、組成物又は製剤が標的細胞（即ち、負に荷電したポリマーが送達されることが所望される細胞）に到達するのを妨げてはならない。例えば、血流に注入される医薬組成物は可溶性であるべきである。その他の因子は当技術分野で公知であり、これには、組成物又は製剤がその効果を発揮するのを妨げる毒性及び形態などが考慮に含まれる。
「全身投与」とは、血流における薬物のインビボの全身吸収又は蓄積と続く身体中への分布を意味する。全身的吸収を導く投与経路には、以下に限定されないが、静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内及び筋肉内が含まれる。これらの投与経路のそれぞれは、所望の負荷電ポリマー、例えば核酸を、接近可能な疾患組織に曝露させる。循環への薬物移入率は、分子量又は大きさの関数であることが示されている。本発明の化合物を含むリポソーム又はその他の薬物担体の使用は、例えば、細網内皮系（ＲＥＳ）の組織など、ある種の組織型において薬物を局在化させることができる可能性がある。リンパ球及びマクロファージなどの細胞の表面と薬物の会合を促進することができるリポソーム製剤もまた有用である。このアプローチは、癌細胞などの異常細胞のマクロファージ及びリンパ球免疫認識の特異性の長所を利用することにより、標的細胞への薬物の送達を促進することができる。
「医薬的に許容可能な製剤」とは、それらの所望の活性に最も適切な物理的位置において本発明の核酸分子の有効な分布を可能にする組成物又は製剤を意味する。本発明の核酸分子を伴う製剤に適切な物質の非限定例には、ＰＥＧ結合核酸、リン脂質結合核酸、脂溶性部分を含有する核酸、ホスホロチオアート、様々な組織への薬物の移入を促進することができるＰ−糖タンパク質阻害剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ８５など）、例えばＣＮＳ（Ｊｏｌｌｉｅｔ−Ｒｉａｎｔ及びＴｉｌｌｅｍｅｎｔ、１９９９、Ｆｕｎｄａｍ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１３：１６−２６）；生体分解性のポリマー、例えば移植後の持続放出送達のためのポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）ミクロスフェア（Ｅｍｅｒｉｃｈ、Ｄ．Ｆ．ら、１９９９、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、８：４７−５８）Ａｌｋｅｒｍｅｓ、Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．；及び充填ナノ粒子、例えばポリブチルシアノアクリレート製のものなど（これは、血液脳関門を横断して薬物を送達することができ、神経取り込み機構を変化させることができる（Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、２３：９４１−９４９、１９９９）。）が含まれる。脂質鎖で修飾された表面官能基を有するリジン含有ナノ粒子などの脂質（脂質ナノ粒子）で官能化されるナノ粒子も、本発明の核酸分子の送達のために使用され得る。このような脂質ナノ粒子は、参照により本明細書中に組み込まれる、Ｂａｉｇｕｄｅ Ｈ．ら、ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２（４）：２３７−２４１（２００７）に記載のように作製され得る。本発明の核酸分子のＣＮＳ送達を含む、送達ストラテジーのその他の非限定例には、Ｂｏａｄｏら、１９９８、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、８７：１３０８−１３１５；Ｔｙｌｅｒら、１９９９、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、４２１：２８０−２８４；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、１９９５、ＰＮＡＳ ＵＳＡ．、９２：５５９２−５５９６；Ｂｏａｄｏ、１９９５、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．、１５：７３−１０７；Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａら、１９９８、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２６：４９１０−４９１６；及びＴｙｌｅｒら、１９９９、ＰＮＡＳ ＵＳＡ．、９６：７０５３−７０５８に記載の物質が含まれる。全てのこれらの参考文献は、参照により本明細書よって本明細書中に組み込まれる。
本発明はまた、ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ−修飾又は長期循環リポソーム又はステルスリポソーム）を含有する表面−修飾リポソームを含む組成物の使用を特徴とする。本発明の核酸分子はまた、様々な分子量の共有結合ＰＥＧ分子も含み得る。これらの製剤は、標的組織での薬物の蓄積を増加させるための方法を与える。薬物担体のこのクラスは、オプソニン化及び単核食細胞系（ＭＰＳ又はＲＥＳ）による除去に耐性があり、それにより血流循環時間を延長させ、カプセル化薬物に対する組織曝露を促進することができる（Ｌａｓｉｃら、１９９５、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９５：２６０１−２６２７；Ｉｓｈｉｗａｔａら、１９９５、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４３：１００５−１０１１）。このようなリポソームは、おそらく、血管新生が起こった標的組織における溢血及び補捉により、腫瘍において選択的に蓄積することが示されている（Ｌａｓｉｃら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１２７５−１２７６；Ｏｋｕら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１２３８：８６−９０）。長期循環リポソームは、特に、ＭＰＳの組織で蓄積することが知られる従来の陽イオン性リポソームと比較して、ＤＮＡ及びＲＮＡの薬物動態及び薬力学を促進する（Ｌｉｕら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４２：２４８６４−２４８７０；Ｃｈｏｉら、国際ＰＣＴ公開ＷＯ９６／１０３９１；Ａｎｓｅｌｌら、国際ＰＣＴ公開ＷＯ９６／１０３９０；Ｈｏｌｌａｎｄら、国際ＰＣＴ公開ＷＯ９６／１０３９２；これらは全て、本明細書中で参照により組み込まれる。）。長期循環リポソームはまた、肝臓及び脾臓などの代謝的に活動的なＭＰＳ組織での蓄積を回避するその能力に基づき、陽イオン性リポソームと比較して、ヌクレアーゼ分解から薬物をよく保護すると思われる。これらの参考文献は全て、本明細書中で参照により組み込まれる。本発明はまた、医薬的に許容可能な担体又は希釈剤中に所望の化合物の医薬的有効量を含む保管又は投与のために調製される組成物も含む。治療での使用のための許容可能な担体又は希釈剤は、医薬分野で周知であり、例えば、本明細書中で参照により本明細書によって組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載されている。例えば、保存料、安定化剤、染料及び香味剤が提供され得る。これらは、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを含む。さらに、抗酸化剤及び懸濁剤を使用することができる。
医薬的に有効な用量は、病態の出現を予防するか、阻害するか又は病態を治療（ある程度まで症状を緩和、好ましくは症状全てを緩和）するために必要とされる用量である。医薬的に有効な用量は、疾患のタイプ、使用される組成物、投与経路、治療されている哺乳動物のタイプ、考慮される具体的哺乳動物の生理特性、併用投与及び医学分野での当業者が認識するその他の因子に依存する。一般に、負荷電ポリマーの有効性に依存して、活性成分０．１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間の量が投与される。
本発明の核酸分子及びその製剤は、従来の無毒性の医薬的に許容可能な担体、アジュバント及びビヒクルを含有する投与単位製剤において、経口で、局所的に、非経口で、吸入もしくは噴霧により、又は直腸に、投与され得る。非経口という用語は、本明細書中で使用される場合、経皮、皮下、血管内（例えば静脈内）、筋肉内又は髄腔内注射又は点滴技術などを含む。さらに、本発明の核酸分子及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬製剤が提供される。１以上の無毒性の医薬的に許容可能な担体及び／又は希釈剤及び／又はアジュバント及び必要に応じてその他の活性成分と会合して、本発明の１以上の核酸分子が存在し得る。本発明の核酸分子を含有する医薬組成物は、例えば、錠剤、トローチ、薬用キャンディー、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末又は顆粒、乳剤、硬もしくは軟カプセル又はシロップもしくはエリキシルのような経口での使用に適切な形態であり得る。
医薬組成物の製造に対する技術分野で公知の何らかの方法に従い、経口使用を対象とした組成物を調製することができ、このような組成物は、医薬的に洗練され口当たりがよい調製物を提供するために、１以上のこのような甘味料、香味剤、着色料又は保存料を含有し得る。錠剤は、錠剤の製造に適切である無毒性の医薬的に許容可能な賦形剤と混合して活性成分を含有する。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウムなど；造粒剤及び崩壊剤、例えばコーンスターチ又はアルギン酸など；結合剤、例えばデンプン、ゼラチン又はアカシア及び平滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクであり得る。錠剤は被覆されていないか、又はこれらは公知の技術により被覆され得る。場合によっては、このようなコーティングは、消化管での崩壊及び吸収を遅延させ、それにより長時間にわたる持続的作用を与えるために、公知の技術により調製され得る。例えば、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延物質が使用され得る。
経口使用のための製剤はまた、活性成分が、不活性固形希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンと混合されている硬ゼラチンカプセルとして、又は活性成分が水又は油媒体（例えばピーナツ油、流動パラフィンもしくはオリーブ油）と混合されている軟ゼラチンカプセルとしても、与えられ得る。
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適切な賦形剤と混合して、活性物質を含有する。このような賦形剤には、懸濁化剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアラビアゴムなど；分散剤又は湿潤剤、例えば天然ホスファチドなど、例えばレクチン、又は脂肪酸とのアルキレンオキシドの縮合生成物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、又は長鎖脂肪アルコールとのエチレンオキシドの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、又は脂肪酸及びヘキシトール由来の部分エステルとのエチレンオキシドの縮合生成物（ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなど）又は脂肪酸及びヘキシトール無水物由来の部分エステルとのエチレンオキシドの縮合生成物（例えばポリエチレンソルビタンモノオレエート）が含まれ得る。水性懸濁液はまた、１以上の保存料、例えばエチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾアート、１以上の着色料、１以上の香味剤及び１以上の甘味料、例えばスクロース又はサッカリンなども含有する。
油性懸濁液は、植物油、例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油又はココナツ油中で、又は流動パラフィンなどの鉱物油中で、活性成分を懸濁することにより処方することができる。油性懸濁液は、濃厚剤、例えば蜜ろう、固形パラフィン又はセチルアルコールを含有し得る。口当たりが良い経口製剤を提供するために、甘味料及び香味剤を添加することができる。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤の添加により保存することができる。
水の添加による水性懸濁液の調製に適切な分散性粉末及び顆粒は、分散剤又は湿潤剤、懸濁化剤及び１以上の保存料と組み合わせて、活性成分を提供する。適切な分散剤又は湿潤剤又は懸濁化剤は、既に上述したものにより例示される。さらなる賦形剤、例えば甘味料、香味剤及び着色料も存在し得る。
本発明の医薬組成物はまた、水中油型乳剤の形態でもあり得る。油相は、植物油又は鉱物油又はこれらの混合物であり得る。適切な乳化剤は、天然ゴム、例えばアラビアゴム又はトラガカントゴム；天然のホスファチド、例えばダイズ、レシチン及び脂肪酸及びヘキシトール由来のエステル又は部分エステル；無水物、例えばソルビタンモノオレエート；及びエチレンオキシドとの前記部分エステルの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。乳剤はまた、甘味料及び香味剤も含有し得る。
シロップ及びエリキシルは、甘味料、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコース又はスクロースとともに処方され得る。このような製剤はまた、鎮痛薬、保存料及び香味剤及び着色料も含有し得る。医薬組成物は、滅菌注射水又は油性懸濁液の形態であり得る。この懸濁液は、上述の適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を用いて、既知の技術に従い処方することができる。滅菌注射製剤はまた、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液のような、無毒性の非経口で許容可能な希釈剤又は溶媒中の滅菌注射溶液又は懸濁液でもあり得る。使用することができる許容可能なビヒクル及び溶媒の中でも、水、リンガー溶液及び等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、滅菌固定油は、従来、溶媒又は懸濁化剤として使用される。この目的のために、合成モノ又はジグリセリドを含め、何らかの無刺激性の固定油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射物質の調製における使用法がある。
本発明の核酸分子はまた、例えば薬物の直腸投与のための座薬の形態で投与することもできる。これらの組成物は、通常温度で固体であるが、直腸温度で液体となり、従って直腸において溶解して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と薬物を混合することによって調製することができる。このような物質には、ココアバター及びポリエチレングリコールが含まれる。
本発明の核酸分子は、滅菌液中で非経口投与することができる。使用されるビヒクル及び濃度によって、薬物は、ビヒクル中で懸濁され得るか又は溶解され得る。好都合なことに、局部麻酔薬、保存料及び緩衝剤などのアジュバントをビヒクル中で溶解することができる。
１日あたり約０．１ｍｇから約１４０ｍｇ／ｋｇ体重のオーダーでの投与量レベルは、上述の状態の治療において有用である（１日あたり約０．５ｍｇから約７ｇ／患者又は対象）。単回投与形態を生成させるために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、治療される受容者及び投与の特定形式によって変化する。投与単位形態は、一般に、活性成分約１ｍｇから約５００ｍｇを含有する。
何らかの特定の患者又は対象に対する具体的な用量レベルが、使用される具体的化合物の活性、年齢、体重、一般的健康、性別、食餌、投与時間、投与経路、排泄率、薬物の組み合わせ及び治療が行われる特定の疾患の重症度を含む様々な因子に依存することを理解されたい。
非ヒト動物に対する投与のために、動物の餌又は飲用水にも本組成物を添加することができる。動物がその餌とともに本組成物の治療的に適切な量を摂取するように動物の餌及び飲用水組成物を処方することは好都合であり得る。餌又は飲用水への添加のための予混合物として組成物を与えることもまた好都合であり得る。
本発明の核酸分子はまた、全体的な治療効果を向上させるためにその他の治療組成物と組み合わせて対象に投与することもできる。適応症を治療するための複数の化合物の使用によって、副作用の出現度を低下させながら、有益な効果を向上させることができる。
本発明の様々な特性及び長所をさらに説明するために実施例を以下で提供する。実施例はまた、本発明を実施するための有用な方法も説明する。これらの実施例は、主張される発明を限定しない。
この実施例は、ＴＰ５３のｓｈＲＮＡ介在抑制が、ｍｉＲ−３４ａ遺伝子座を含有するＥＳＴクラスター（コンティグ６６５４）の発現を下方制御することを示す。
原理：
野生型ＴＰ５３を有する細胞は、ＤＮＡ損傷後、細胞周期が進行する前に、ＤＮＡ修復を行わせるために、Ｇ１チェックポイントを停止させる。ｓｈＲＮＡが介在するＴＰ５３の失調により、このＧ１停止がなくなる（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０−５５３）。ＴＢ５３経路の完全性を確認するために、ドキソルビシン処理後、Ｇ１停止に対して一連の腫瘍細胞株を試験した。この試験で、正常なＴＰ５３活性を有するものとして報告されている８種類の腫瘍株を使用した：Ａ５４９（肺癌、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４２８５−３００）、ＴＯＶ２１Ｇ（卵巣癌、Ｓａｍｏｕｅｌｉａｎら、２００４、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５４：４９７−５０４）、ＭＣＦ７（乳癌、Ｃｏｎｃｉｎら、２００３ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．７９：３１−４６）、ＨＥＰＧ２（肝臓癌、Ｂａｍｆｏｒｄら、２００４、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９１：３５５−５８）、ＯＡＷ４２（卵巣癌、Ｂａｍｆｏｒｄら、２００４、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９１：３５５−５８）；Ａ２７８０（卵巣癌、Ｂａｍｆｏｒｄら、２００４、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９１：３５５−５８）；Ｕ２ＯＳ（骨肉腫、Ｚｈｕら、１９９３ Ｇｅｎｅ ＆ Ｄｅｖ．７：１１１１−２５）；及びＮＣＩ−Ｈ４６０（肺癌、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１９９７ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４２８５−３００）。
方法：機能的ＴＰ５３あり又は無しの一連の対応する細胞株ペアを作製した。
何らかの単一の細胞株に特定である特有の効果を回避するために、複数の細胞株を作った。空のレンチウイルスベクター又はＴＰ５３を標的とするｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルスベクターを安定細胞株に形質導入した。使用したベクターは、ＴＰ５３を標的とするｓｈＲＮＡのヒトＨ１プロモーター上流又は５個のチミジン、ＢａｍＨＩ部位及び次に別の５個のチミジンのストレッチからなる終結配列を含有するＧａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）−適合性発現カセットが遺伝子移入されたｐＬｅｎｔｉ６／ＢＬＯＣＫ−ｉＴ−ＤＥＳＴ目標ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）であった。
これらの実験において使用されたＴＰ５３ ｓｈＲＮＡは、１９−ヌクレオチドのコア配列５’ＧＡＣＵＣＣＡＧＵＧＧＵＡＡＵＣＵＡＣ３’［配列番号１０］を有した。レンチウイルスベクターにクローニングされた全長ヘアピン配列は、５’ＧＡＣＵＣＣＡＧＵＧＧＵＡＡＵＣＵＡＣＵＵＣＡＡＧＡＧＡＧＵＡＧＡＵＵＡＣＣＡＣＵＧＧＡＧＵＣＵＵＵＵＵ３’［配列番号１１］であった。
空のベクターを形質導入した細胞と比較した場合、ＴＰ５３ｓｈＲＮＡを発現する細胞株において〜８０−９５％、ＴＰ５３ｍＲＮＡレベルが低下した（データは示さない。）。空のレンチウイルスベクター（ＬＶベクター）又はＴＰ５３を標的とするｓｈＲＮＡヘアピン（ＴＰ５３ｓｈＲＮＡ）をコードするベクターを、Ａ５４９細胞（肺癌）に形質導入し、安定細胞株を単離した。簡潔に述べると、１０％ＦＢＳ及び６μｇ／ｍＬポリブレンを含有するＤＭＥＭ中細胞１個あたり１０形質導入単位（ＴＵ／細胞）の感染多重度（ＭＯＩ）で５０％から７０％コンフルエンシーの細胞にウイルスを接種した。２４時間後、ウイルスを除去し、新鮮なＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを培養物に補充した。５μｇ／ｍＬブラストサイジンを用い、形質導入細胞を薬物選択し、形質導入から４−５日後、これを培養物に添加した。安定細胞をドキソルビシン（＋ドキソルビシン）で２４時間処理するか又はドキソルビシンで処理せずに（−ドキソルビシン）、次いでフローサイトメトリーによる細胞周期分析に供した。
図２Ａ−２Ｄで示されるように、ＴＰ５３ｓｈＲＮＡを発現する全ての細胞は、ＤＮＡ損傷を誘導するためのドキソルビシンでの処理後、Ｇ１停止が減少したことが分かった。図２Ａは、ある一定のＤＮＡ含量（蛍光強度により測定、Ｘ軸）とともに細胞数（Ｙ軸）を示す、野生型ｐ５３を有する細胞のヒストグラムである。図２Ｂは、ある一定のＤＮＡ含量（蛍光強度により測定、Ｘ軸）とともに細胞数（Ｙ軸）を示す、ドキソルビシンで処理した野生型ｐ５３を有する細胞のヒストグラムである。図２Ｃは、ある一定のＤＮＡ含量（蛍光強度により測定、Ｘ軸）とともに細胞数（Ｙ軸）を示す、ＴＰ５３ ｓｈＲＮＡを遺伝子移入した野生型ｐ５３を有する細胞のヒストグラムであり、図２Ｄは、ある一定のＤＮＡ含量（蛍光強度により測定、Ｘ軸）とともに細胞数（Ｙ軸）を示す、ＴＰ５３ ｓｈＲＮＡを遺伝子移入し、ドキソルビシンで処理した野生型ｐ５３を有する細胞のヒストグラムであり、ＤＮＡ損傷後、ＴＰ５３の障害によってＧ０／Ｇ１チェックポイントが損なわれることを示す。図２Ａ−２Ｄで示されるように、ＴＰ５３の抑制により、Ｇ０／Ｇ１チェックポイントが損なわれる。
各株からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を単離し、ＴＰ５３ ｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した細胞に対して、空のレンチウイルスベクターで形質導入した細胞を比較して、ＤＮＡマイクロアレイ分析に供した。実験ノイズを排除するために、５以上の細胞株において、＞１．５倍、Ｐ＜０．０１で遺伝子が調節される場合、ＴＰ５３により調節されるものとして、遺伝子を同定した。これらの基準に基づき、ＴＰ５３機能のＴＰ５３ ｓｈＲＮＡ障害により影響を受けた転写産物として、コンティグ６６５４を同定した。
表２は、ＴＰ５３ ｓｈＲＮＡで形質導入したＡ５４９細胞と比較した、空のベクターで形質導入した細胞中の選択遺伝子に対する、ハイブリッド形成強度のｌｏｇ１０比での倍率変化を提供する。表２で示される結果は、対照ベクターを有するＡ５４９細胞に対してｓｈＲＮＡを標的とするＴＰ５３を発現するＡ５４９細胞を比較する、競合的ハイブリッド形成マイクロアレイ実験からのものである。ＴＰ５３は、空のベクターを発現する細胞に対して、ＴＰ５３を標的とするｓｈＲＮＡを発現する細胞において約５倍下方制御された。
Figure 2010525826
各細胞株対は、重要性が低い制御を主に含む、異なるが重複する遺伝子発現特性を与えた。表２で示されるように、ＴＰ５３は、全ての場合において強く下方制御されたが、その他のレポーターの殆どは、異なる細胞株間で異なったより弱い制御を示した。
コンティグ６６５４＿ＲＣは、あまり特徴が分からないＥＳＴクラスターである。遺伝的雑種及び放射線ハイブリッドマップにおけるＳＴＳマーカーの比較を含むカリフォルニア大学サンタクルス校（ＵＣＳＣ）により公開されているゲノムブラウザーソフトウェア及びデータベースパッケージ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅウェブサイトのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂでアクセス可能な、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：Ｄ１０９−Ｄ１１１（２００４）及びＧｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４：Ｄ１４０−Ｄ１４４（２００６）に記載のような、公開されているｍｉＲＢａｓｅ配列データベースに記載のようなＵｎｉＰｒｏｔ、ＲｅｆＳｅｑ及びＧｅｎＢａｎｋ ｍＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ種に基づく既知の遺伝子を用いて、ヒトゲノムに対するこのコンティグのマッピングを行った。ＵＣＳＣゲノムブラウザーにおける上述の情報の検討から、コンティグ６６５４がマイクロＲＮＡ遺伝子座、ｍｉＲ−３４ａと重複するＥＳＴクラスターに属することが明らかとなり、ＴＰ５３機能の障害がｍｉＲ−３４ａのｍｉＲＮＡ前駆体を下方制御するという仮説が導かれた。
この実施例は、ヒト細胞への合成ｍｉＲ−３４の導入が、ＴＰ５３ Ｇ１チェックポイントの活性化により誘導されるものと同様の表現型を誘導することを示す。
原理：細胞周期のＧ１／Ｓ期移行の遅延は、ＴＰ５３活性化の結果であることが知られている。この実施例において、ｍｉＲ−３４ ｓｉＲＮＡ２本鎖は、「非対称パッセンジャー鎖」と呼ばれる、配列の３’末端から４塩基の、１個の塩基ミスマッチを除き、天然の成熟ｍｉＲＮＡと相補的であるパッセンジャー鎖を用いて設計された。代表的な非対称パッセンジャー鎖は、ｍｉＲ−３４ａ（配列番号１２）に対して；ｍｉＲ−３４ｂ（配列番号１７）に対して及びｍｉＲ−３４ｃ（配列番号２２）に対して、ミスマッチに下線を付して、表３で提供される。表３で示されるように、これらの合成設計非対称パッセンジャー鎖は、ｍｉＲ−３４ａ（配列番号３５）、ｍｉＲ−３４ｂ（配列番号３６）及びｍｉＲ−３４ｃ（配列番号３７）に対する対応する天然パッセンジャー鎖とは異なる。
実施例５に記載のように、配列番号１及び非対称パッセンジャー鎖配列番号１２のアニールされた鎖を含有するｓｉＲＮＡ２本鎖ｍｉＲ−３４模倣物配列が、アニールされた天然ｍｉＲ−３４ガイド鎖（配列番号１）及び天然ｍｉＲ−３４パッセンジャー鎖（配列番号３５）よりも細胞死表現型を誘導することにおいて効果的であることが分かった。理論に縛られることを望まないが、パッセンジャー鎖中にミスマッチが存在することにより、その領域において２本鎖が不安定化され、それにより鎖模倣成熟ｍｉＲ−３４のＲＩＳＣへの移入が促進されると考えられる。非対称パッセンジャー鎖及び天然ガイド鎖との２本鎖ｍｉＲ−３４模倣物配列がプロセシングされ、その結果、成熟野生型ｍｉＲ−３４ガイド鎖が形成される。
この実施例で与えられるデータは、ＴＰ５３の活性化と類似の方式で、細胞へのこのような２本鎖ｍｉＲ−３４模倣物の導入によって、Ｇ１チェックポイントでの細胞周期停止が導かれることを示す。
方法：
合成ｍｉＲ−３４ａ、ｂ及びｃ合成ＲＮＡ２本鎖ならびにそれぞれの突然変異対照物をＡ５４９細胞に遺伝子移入した。遺伝子移入から２４時間後、ノコダゾール（１００ｎｇ／ｍＬ）で１６−２０時間細胞を処理した。ヨウ化プロピジウム染色及びフローサイトメトリーを用いて細胞周期のＧ１期で停止した細胞のパーセンテージを測定した。Ｓｉｇｍａ−Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から全ての合成オリゴヌクレオチド（表３）を得た。
Figure 2010525826
Figure 2010525826
Figure 2010525826
表４は、１個のヌクレオチドミスマッチがあるガイド鎖［配列番号１］及びパッセンジャー鎖［配列番号１２］を含む正常な合成ｍｉＲ−３４ａＲＮＡ２本鎖（野生型成熟）を遺伝子移入した；ガイド鎖［配列番号１５］及びパッセンジャー鎖［配列番号１６］を含む非シード領域二重変異体合成ｍｉＲ−３４ａ（１８、１９）ＲＮＡ２本鎖を遺伝子移入した；又はガイド鎖［配列番号１３］及びパッセンジャー鎖［配列番号１４］を含むシード領域二重変異体合成ｍｉＲ−３４ａ（２、３）ＲＮＡ２本鎖の何れかを遺伝子移入した、ＴＰ５３機能の正常レベル（野生型ｐ５３）を有するＡ５４９細胞を示す。
表４は、１個のヌクレオチドミスマッチがあるガイド鎖［配列番号４］及びパッセンジャー鎖［配列番号１７］を含む正常な合成ｍｉＲ−３４ｂＲＮＡ２本鎖（野生型成熟）を遺伝子移入した；ガイド鎖［配列番号２０］及びパッセンジャー鎖［配列番号２１］を含む非シード領域二重変異合成ｍｉＲ−３４ｂ（１８、１９）ＲＮＡ２本鎖を遺伝子移入した；又はガイド鎖［配列番号１８］及びパッセンジャー鎖［配列番号１９］を含むシード領域二重変異合成ｍｉＲ−３４ｂ（２、３）ＲＮＡ２本鎖を遺伝子移入した、ＴＰ５３機能の正常レベル（野生型ｐ５３）を有するＡ５４９細胞をさらに示す。
表４は、１個のヌクレオチドミスマッチがあるガイド鎖［配列番号７］及びパッセンジャー鎖［配列番号２２］を含む正常な合成ｍｉＲ−３４ｃＲＮＡ２本鎖（野生型成熟）を遺伝子移入した；ガイド鎖［配列番号２５］及びパッセンジャー鎖［配列番号２６］を含む非シード領域二重変異合成ｍｉＲ−３４ｂ（１８、１９）ＲＮＡ２本鎖を遺伝子移入した；又はガイド鎖［配列番号２３］及びパッセンジャー鎖［配列番号２４］を含むシード領域二重変異合成ｍｉＲ−３４ｃ（２、３）ＲＮＡ２本鎖を遺伝子移入した、ＴＰ５３機能の正常レベル（野生型ｐ５３）を有するＡ５４９細胞をさらに示す。
表４で提供されるデータは、合成ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ及びｍｉＲ−３４ｃ ＲＮＡ２本鎖（野生型成熟）ならびに二重変異ＲＮＡ２本鎖ｍｉＲ−３４ａ（１８，１９）、ｍｉＲ−３４ｂ（１８，１９）及びｍｉＲ−３４ｃ（１８，１９）（シード領域の外側に突然変異を有する。）の導入により、ＴＰ５３機能の正常レベルを有する細胞においてＧ１細胞周期停止が誘導されることを示す。ＲＮＡ２本鎖ｍｉＲ−３４ａ（２，３）、ｍｉＲ−３４ｂ（２，３）及びｍｉＲ−３４ｃ（２，３）（シード領域中に二重変異を有する。）は、このような細胞周期停止を誘導しない。このようにして、対応するインタクトなシード領域を有する合成ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ及びｍｉＲ−３４ｃ ｓｉＲＮＡコンストラクトのそれぞれは、ＴＰ５３が介在するＤＮＡ損傷チェックポイントの反映である表現型を導くことができる。
ｍｉＲ−３４ａもしくはｍｉＲ−３４ａ（１８−１９）、ｍｉＲ−３４ｂもしくはｍｉＲ−３４ｂ（１８−１９）又はｍｉＲ−３４ｃもしくはｍｉＲ−３４ｃ（１８−１９）の導入により誘導される細胞周期停止表現型は、ＴＰ５３機能に依存することも観察された。対照Ａ５４９細胞におけるレベルの約５％にＴＰ５３を抑制するＴＰ５３ ｓｈＲＮＡコンストラクトを安定的に発現するＡ５４９細胞への、ｍｉＲ−３４ａ合成ｓｉＲＮＡコンストラクト（表３）の同じセットの送達の結果、細胞周期停止表現型は得られなかった（データは示さない。）。
この実施例は、ｍｉＲ−３４により制御される転写産物がＴＰ５３経路遺伝子と重複することを示す。
方法：
ｍｉＲ−３４ファミリーの機能をより詳細に理解するために、遺伝子発現プロファイリング実験を行った。Ａ５４９、ＨＣＴ１１６Ｄｉｃｅｒｅｘ５、ＴＯＶ２１Ｇ、ＤＬＤ−１ Ｄｉｃｅｒｅｘ５細胞に、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ又は対照標的ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）に対応するＲＮＡ２本鎖を遺伝子移入した。これらの実験で使用されるルシフェラーゼｓｉＲＮＡのガイド鎖は、５’ＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ３’［配列番号２７］であり、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖は、５’ＵＣＧＡＡＧＵＡＵＵＣＣＧＵＡＣＧｄＴｄＴ３’［配列番号２８］（Ｓｉｇｍａ−Ｐｒｏｌｉｇｏから購入）であった。これらの実験で使用されるｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ及びｍｉＲ−３４ｃ ｓｉＲＮＡ２本鎖は、実施例２の表３で示す。
リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用することにより、６−ウェルプレートでＨＣＴ１１６細胞に対して遺伝子移入を行った。ＳｉｌｅｎｔＦｅｃｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いてＤＬＤ−１、ＴＯＶ２１Ｇ及びＡ５４９細胞に対して遺伝子移入を行った。全ての細胞株に対して１００ｎＭの最終濃度で２本鎖を使用した。遺伝子移入から２４時間後、トータルＲＮＡを単離し、Ｊａｃｋｓｏｎら（２００３ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：６３５−３７）により記載されるようにマイクロアレイ発現分析に供した。ｍｉＲ−３４マイクロＲＮＡの直接の標的ならびにそれらの下流の影響を同定するために、ｍｉＲ−３４ａ、ｂ及びｃ様ｓｉＲＮＡ配列を遺伝子移入した細胞のマイクロアレイプロファイリングを使用した。
結果：マイクロアレイ遺伝子発現プロファイルの分析（データは示さない。）から、下記表５で示されるように、遺伝子移入から２４時間後に特異的に下方制御された遺伝子のクラスターが同定された。ｍｉＲ−３４により下方制御される遺伝子は、ｍｉＲ−３４シード領域六量体に相補的な３’ＵＴＲを含有する転写産物が非常に豊富であった。Ｐ−値カットオフ（Ｐ＜０．０１）を用いたマイクロアレイ遺伝子発現特性において、マイクロＲＮＡ制御転写産物を同定した。試験した株全てにおいて、下方制御された転写産物の共通部分により、ｍｉＲＮＡ下方制御された転写産物を同定した。超幾何分布を用いて、背景設定に対する濃縮について、下方制御された転写産物を試験した。アノテートされた３’ＵＴＲを有する転写産物において、ｍｉＲＮＡ６量体シード列（ｓｅｅｄ ｓｔｒｉｎｇｓ）（ｍｉＲＮＡシード領域ヌクレオチド位置１−６、２−７又は３−８に相補的な６連続塩基のストレッチ）を含有する転写産物の濃縮により、ｍｉＲＮＡ標的制御を測定した。
Figure 2010525826
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実施例２に記載の細胞周期表現型と一致して、表５で列挙される遺伝子は、細胞周期と関連する遺伝子が豊富であることが分かった（表６参照）。さらに、ＴＰ５３経路と関連する遺伝子がこれらのｍｉＲ−３４反応遺伝子特性の何れかにおいて豊富であるか否かを決定するために、マイクロアレイデータの下方制御又は上方制御される遺伝子特性を調べた。これを行うために、データを調べて、ｍｉＲ−３４シグネチャー遺伝子及びＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｄａｔａｂａｓｅｓ（Ｃａｍｏｎら、２００４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：Ｄ２６２−６；Ｃａｍｏｎら、２００３、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３：６６２−７２）においてそのようなものとして同定されるＴＰ５３経路遺伝子の間の重複の程度、ＴＰ５３ＤＮＡ損傷反応遺伝子セット、本明細書中で報告されるＲＮＡｉ実験で下方制御されているものとして同定される遺伝子及びＴＰ５３転写因子結合部位のゲノムスケールのクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）分析により同定される一連の直接的ＴＰ５３標的を決定した（Ｗｅｉら、２００６、Ｃｅｌｌ １２４：２０１−１９）。
表６は、ＤＮＡ損傷及び細胞周期に関与する一連の遺伝子を用いてｍｉＲ−３４遺伝子移入により上方制御又は下方制御される遺伝子の重複を提供する。Ｔｈｅ Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ：ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｕｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０００）２５：２５−２９に記載のように、Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ（機能カテゴリー）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／）からの転写産物の濃縮により、生物学的機能を分類した。同定される遺伝子セットの遺伝子の数又はそのセットの重複の数を角括弧及び斜字体で示す。超幾何分布により、Ｐ−値として表される各結果の可能性を計算し（Ｌｅｅら、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００５ ６：１８９）、表６で示す。背景設定として、マイクロアレイにおいて示される全ての遺伝子を使用した。
Figure 2010525826
ｍｉＲ−３４で制御される遺伝子とＤＮＡ損傷において発現が変化するものとの間の重要な重複（表６）を観察した。この場合において、重要な重複は、ｍｉＲ−３４遺伝子移入に対する反応において増加する（ｐ＜７ｅ−６５）遺伝子及びｍｉＲ−３４活性化において抑制される（ｐ＜１．８ｅ−７３）遺伝子の両方に対して見られた。しかし、ｍｉＲ−３４シード領域に対して相補的な配列を有する遺伝子の強力な濃縮が下方制御される重複セットで見られた一方、上方制御される遺伝子セットでは見られず、このことから、発現における遺伝子の上方制御がｍｉＲ−３４の二次的影響により引き起こされ得ることが示唆される。
表６で示されるように、重要な重複は、ｍｉＲ−３４ａにより制御される遺伝子と一般的なＴＰ５３介在事象との間で見られ、このことから、ｍｉＲ−３４遺伝子移入がＴＰ５３経路の少なくとも一部を誘導し得ることが示唆される。
この実施例は、合成ｍｉＲ４４９、ｍｉＲ−３４ファミリーのメンバーの細胞株ＨＣＴ１１６への導入により、ＴＰ５３ Ｇ１チェックポイントの活性化により誘導されるものと同様の表現型が誘導されることを示す。
原理：
細胞周期のＧ１／Ｓ期移行の遅延はＴＰ５３活性化の結果であることが知られている。この実施例において、ｍｉＲ−４４９ ｓｉＲＮＡ２本鎖は、「非対称パッセンジャー鎖」と呼ばれる、配列の３’末端からの４塩基での１個の塩基ミスマッチを除き、天然の成熟ｍｉＲＮＡと相補的であるパッセンジャー鎖を考慮して設計した。代表的な非対称パッセンジャー鎖は、ｍｉＲ−４４９（配列番号３２）に対して、ミスマッチに下線を付して表７で提供される。表７で示されるように、ｍｉＲ−４４９に対する合成的に設計された非対称パッセンジャー鎖（配列番号３２）は、ｍｉＲ−４４９に対する天然のパッセンジャー鎖（配列番号３８）とは異なる。この実施例で提供されるデータは、ＴＰ５３の活性化と類似する方式において、非対照ｍｉＲ−４４９パッセンジャー鎖（配列番号３２）にアニーリングされる天然のｍｉＲ４４９ガイド鎖（配列番号２９）を含む２本鎖ｍｉＲ−４４９模倣物の細胞への導入により、Ｇ１チェックポイントでの細胞周期停止が導かれることをを示す。
方法：
表７に記載のＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ａ−ｍｍ２，３、ｍｉＲ−４４９及びｍｉＲ−４４９−ｍｍ２，３又はルシフェラーゼ対照を、細胞株ＨＣＴ１１６＃２、ｐ５３陽性細胞株に遺伝子移入した。遺伝子移入前に、１２．５ｘ１０４の細胞を播種し、リポフェクタミンＲＮＡｉ Ｍａｘを用い、合成オリゴヌクレオチドの１０ｎＭ 最終濃度を用いて、遺伝子移入した。遺伝子移入から３０時間後、１００ｎｇ／ｍＬの最終濃度でノコダゾールを添加した。ノコダゾールを添加してから１８時間後、細胞を回収した。
Figure 2010525826
表８で示されるように、ｍｉＲ−４４９（ＷＴ成熟）及びｍｉＲ−３４ａ（ＷＴ成熟）の遺伝子移入の結果、実施例２で示されるように、ｍｉＲ−３４ａ（ＷＴ成熟）、ｍｉＲ−３４ｂ（ＷＴ成熟）及びｍｉＲ−３４ｃ（ＷＴ成熟）をＡ５４９細胞に遺伝子移入した場合に観察される結果と同様に、ＨＣＴ１１６細胞のＧ１停止が起こる。表８でさらに示されるように、ｍｉＲ−１６（ＷＴ成熟）の遺伝子移入の結果また、Ｌｉｎｓｌｅｙ Ｐ．Ｓ．ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２７：２２４０−２２５２（２００７）に記載の結果と一致して、ＨＣＴ１１６細胞のＧ１停止も起こる。
Figure 2010525826
考察：ｍｉＲ−３４は、いくつかの脊椎動物種で単一の認識できるオルソログがある、進化的に保存されたｍｉＲＮＡファミリーに属する。Ｈｅら、Ｎａｔｕｒｅ ４４７：１１３０−１１３４（２００７）参照。図１で示されるように、ｍｉＲ−４４９のシード領域（配列番号３１）は、ｍｉＲ−３４ａ（配列番号３）、ｍｉＲ−３４ｂ（配列番号６）及びｍｉＲ−３４ｃ（配列番号９）のシード領域内の６個の連続ヌクレオチドと同一である少なくとも６個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。
要約すれば、Ａ５４９細胞においてｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ及びｍｉＲ−３４ｃの過剰発現に対して実施例２において示される結果と一致して、ｐ５３野生型細胞におけるｍｉＲ−４４９の過剰発現の影響により、ＴＰ５３ Ｇ１チェックポイントの活性化により誘導されるものと同様の表現型が誘発されると思われる。
この実施例は、ＨＣＴ１１６ ＤｉｃｅｒＥｘ５及びその他の細胞株において、ｍｉＲ−３４の導入により、細胞死が起こることを示す。
方法：
アニーリングされた天然ｍｉＲ−３４ａガイド鎖（配列番号１）及び天然ｍｉＲ−３４ａパッセンジャー鎖（配列番号３５）の天然２本鎖又はアニーリングされた天然ｍｉＲ−３４ａガイド鎖（配列番号１）及び配列の３’末端から４塩基の１個の塩基ミスマッチを除き天然成熟ｍｉＲ−３４ａに相補的である合成非対称パッセンジャー鎖（配列番号１２）の合成２本鎖を、ＨＣＴ１１６ Ｄｉｃｅｒ Ｅｘ５細胞に遺伝子移入した（表３で示される。）。細胞に対してまた、模擬遺伝子移入（ｍｏｃｋ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）するか又はｓｉＲＮＡ２本鎖標的ルシフェラーゼ（配列番号２７／配列番号２８）を遺伝子移入した。遺伝子移入から４８時間後、細胞をノコダゾール（１００ｎｇ／ｍＬ）で１６時間処理した。ヨウ化プロピジウム染色及びフローサイトメトリーを用いて、サブ−Ｇ１の細胞（死細胞）のパーセンテージを調べた。
結果：
Figure 2010525826
表９で示されるように、遺伝子移入細胞のフローサイトメトリーにより測定される場合のサブ−Ｇ１の細胞のパーセンテージにより調べた場合、ｍｉＲ−３４ａ模倣２本鎖は天然ｍｉＲ−３４ａ２本鎖よりも細胞死を誘導することにおいて効果的であった。
理論に縛られることを望まないが、非対称パッセンジャー鎖中のミスマッチの存在により、その領域において２本鎖が脱安定化され、それにより鎖模倣成熟ｍｉＲ−３４のＲＩＳＣへの移入が促進されると考えられる。非対称パッセンジャー鎖及び天然ガイド鎖との２本鎖ｍｉＲ−３４模倣物配列がプロセシングされ、その結果、成熟野生型ｍｉＲ−３４ガイド鎖が形成される。
要約：この実施例はまた、その配列の３’末端から４塩基の１個の塩基ミスマッチを除いて天然成熟ｍｉＲ−３４ａと相補的な合成パッセンジャー鎖（「非対称パッセンジャー鎖」と呼ばれる。）にアニーリングされる天然ガイド鎖を含有するｍｉＲ−３４のｓｉＲＮＡ２本鎖模倣配列が、予想外に、細胞に遺伝子移入した場合、天然ｍｉＲ−３４ ２本鎖よりも、細胞死を誘導することにおいて効果的であることが分かったことも示す。
この実施例は、ｍｉＲ−３４の標的としての肝細胞増殖因子受容体ｃ−ＭＥＴの検証及びｃ−ＭＥＴ依存性細胞株ＥＢＣ−１の増殖を阻害するための合成ｍｉＲ−３４ ２本鎖の使用を述べる。
方法：
ｃ−ＭＥＴの活性化は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌及び多くの肺癌株（ＥＢＣ−１を含む。）を含む多くの癌において、成長、浸潤及び増殖に関与しており、成長及び生存のためにｃ−ＭＥＴに依存する（Ｌｕｔｔｅｒｂａｃｈら、２００７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １ ６７（５）：２０８１−８）。
表５で示されるように、ＨＣＴ１１６ Ｄｉｃｅｒ Ｅｘ５細胞への合成ｍｉＲ−３４ａ、ｂ又はｃの遺伝子移入後、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−ＭＥＴ）を含む一連の遺伝子が下方制御された。ウエスタンブロッティングによりこの観察を検証した（データは示さない。）。この観察と一致して、ヒトｃ−ＭＥＴ転写産物は、その’３ＵＴＲにおいて２箇所のｍｉＲ−３４標的部位を含有する。
生存に関してｃ−ＭＥＴに依存する肺癌細胞へ合成ｍｉＲ−３４を導入する効果を調べるために、ＥＢＣ−１細胞（非小細胞肺癌）に、天然ガイド鎖［配列番号１］及び非対称パッセンジャー鎖［配列番号１２］を含む正常な合成ｍｉＲ−３４ａＲＮＡ２本鎖（ＷＴ成熟）又はガイド鎖［配列番号１３］及びパッセンジャー鎖［配列番号１４］を含むシード領域二重変異合成ｍｉＲ−３４ａ（２、３）ＲＮＡ２本鎖を遺伝子移入した。遺伝子移入から４８時間後、フローサイトメトリー及びウエスタンブロット分析による細胞周期分析のために細胞を回収した。
結果：正常な合成ｍｉＲ−３４ａを遺伝子移入したＥＢＣ−１細胞は、シード領域突然変異合成ｍｉＲ−３４ａ又はルシフェラーゼ対照を遺伝子移入した細胞と比較した場合、サブ−Ｇ１集団の実質的な増加を示した。ｃ−ＭＥＴ及び切断ＰＡＲＰ１（アポトーシスの指標）に対する抗体を用いて、ウエスタンブロットにより、タンパク質溶解液を分析した。正常な合成ｍｉＲ−３４ａを遺伝子移入した細胞は、シード領域突然変異合成ｍｉＲ−３４ａ又はルシフェラーゼ対照を遺伝子移入した細胞と比較して、ｃ−ＭＥＴタンパク質の減少及び切断ＰＡＲＰ１の増加を示した。これらの結果は、ｍｉＲ−３４ａが、生存のためにｃ−ＭＥＴに依存するＥＢＣ−１細胞においてｃ−ＭＥＴを抑制し、アポトーシスを誘導する能力と一致する。
同時に、これらの結果は、ｃ−ＭＥＴ依存性腫瘍の、成長及び増殖を阻害する及び／又はアポトーシスを促進するために、ｍｉＲ−３４ａ治療剤が使用され得ることを示す。ｍｉＲ−ａ２本鎖の使用は、マウス腫瘍モデル及び異種移植片又はｃ−ＭＥＴ依存性である自然発生腫瘍において、容易に試験することができる。
実例となる実施形態を説明し、述べてきたが、当然のことながら、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明において様々な変更を為し得る。

Claims (41)

  1. （ｉ）１８から２５個のヌクレオチドのヌクレオチド配列からなるガイド鎖核酸分子（前記ガイド鎖ヌクレオチド配列は、シード領域ヌクレオチド配列及び非シード領域ヌクレオチド配列を含み、前記シード領域は、前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１から１２からなり、前記非シード領域は、前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１３から３’末端からなり、前記ガイド鎖の位置１は前記ガイド鎖の５’末端に相当し、前記シード領域は、天然のマイクロＲＮＡのシード領域配列と同一である少なくとも６個のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列をさらに含む。）、及び
    （ｉｉ）１８から２５個のヌクレオチドのヌクレオチド配列からなるパッセンジャー鎖核酸分子（前記パッセンジャー鎖は、ガイド鎖と基本的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、前記パッセンジャー鎖核酸分子は、ガイド鎖のシード領域の正確な逆相補体と比較して、１個のヌクレオチド配列の相違を有し、この１個のヌクレオチドの相違はパッセンジャー鎖のヌクレオチド位置１３から３’末端内に位置する。）
    を含む、単離合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物。
  2. ガイド鎖が、配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号３１からなる群から選択されるヌクレオチド配列と配列が同一である少なくとも６個のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むシード領域を含む、請求項１の単離合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物。
  3. 前記ガイド鎖配列が、ｍｉＲ３４ａ（配列番号１）、ｍｉＲ３４ｂ（配列番号４）、ｍｉＲ３４ｃ（配列番号７）及びｍｉＲ４４９（配列番号２９）からなる群から選択される、請求項１の単離合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物。
  4. パッセンジャー鎖におけるヌクレオチドの相違がその３’末端の６個のヌクレオチド内に位置する、請求項１の単離合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物。
  5. 合成２本鎖が、１つの３’突出部をさらに含み、前記３’突出部が１から４個のヌクレオチドを含む、請求項１の単離合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物。
  6. 第二の３’突出部をさらに含み、前記第二の３’突出部が１から４個のヌクレオチドを含む、請求項５の単離合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物。
  7. 非ヌクレオチド部分をさらに含む、請求項１の単離合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物。
  8. ガイド鎖及びパッセンジャー鎖が核酸分解に対して安定化されている、請求項１の単離合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物。
  9. ガイド鎖の５’末端及び／又は３’末端において及びパッセンジャー鎖の３’末端において、少なくとも１個の化学修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドをさらに含む、請求項１の単離合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物。
  10. パッセンジャー鎖及びガイド鎖の３’末端の第一のヌクレオチド間結合においてホスホロチオアートをさらに含む、請求項１の単離合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物。
  11. パッセンジャー鎖及びガイド鎖の３’末端の第一のヌクレオチド間結合においてホスホロチオアートをさらに含む、請求項１の単離合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物。
  12. ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の５’末端の第一のヌクレオチド間結合においてホスホロチオアートを、及びガイド鎖及びパッセンジャー鎖の３’末端の第一のヌクレオチド間結合においてホスホロチオアートを、さらに含む、請求項１の単離合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物。
  13. ２’−修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項１の単離合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物。
  14. ２’−修飾ヌクレオチドが、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）及び２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）からなる群から選択される修飾を含む、請求項１３の単離合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物。
  15. 合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物を形成させるために単離パッセンジャー鎖核酸分子と単離ガイド鎖核酸分子をアニーリングさせることを含む、合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物を作製する方法であって、
    （ｉ）単離ガイド鎖核酸分子は、１８から２５個のヌクレオチドのヌクレオチド配列からなり、前記ガイド鎖ヌクレオチド配列は、シード領域ヌクレオチド配列及び非シード領域ヌクレオチド配列を含み、前記シード領域は、前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１から１２からなり、前記非シード領域は前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１３から３’末端からなり、前記ガイド鎖の位置１は、前記ガイド鎖の５’末端に相当し、前記シード領域は、天然のマイクロＲＮＡのシード領域配列と同一である少なくとも６個のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列をさらに含み；ならびに
    （ｉｉ）単離パッセンジャー鎖核酸分子は、１８から２５個のヌクレオチドのヌクレオチド配列からなり、前記パッセンジャー鎖は、ガイド鎖と基本的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、前記パッセンジャー鎖核酸分子は、ガイド鎖のシード領域の正確な逆相補配列と比較して、１個のヌクレオチド配列の相違を有し、この１個のヌクレオチドの相違は、パッセンジャー鎖のヌクレオチド位置１３から３’末端内に位置する
    方法。
  16. ガイド鎖が、配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号３１からなる群から選択されるヌクレオチド配列と配列が同一である少なくとも６個のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むシード領域を含む、請求項１５の方法。
  17. 前記ガイド鎖配列が、ｍｉＲ３４ａ（配列番号１）、ｍｉＲ３４ｂ（配列番号４）、ｍｉＲ３４ｃ（配列番号７）及びｍｉＲ４４９（配列番号２９）からなる群から選択される、請求項１５の方法。
  18. パッセンジャー鎖におけるヌクレオチドの相違が、その３’末端の６個のヌクレオチド内に位置する、請求項１５の方法。
  19. ２本鎖が１つの３’突出部をさらに含み、前記３’突出部が１から４個のヌクレオチドを含む、請求項１５の方法。
  20. 第二の３’突出部をさらに含み、前記第二の３’突出部が１から４個のヌクレオチドを含む、請求項１９の方法。
  21. １８から２５個のヌクレオチドのガイド鎖ヌクレオチド配列を含み、前記ガイド鎖ヌクレオチド配列は、シード領域ヌクレオチド配列及び非シード領域ヌクレオチド配列を含み、前記シード領域は基本的に前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１から１２からなり、前記非シード領域は基本的に前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１３から３’末端からなり、前記ガイド鎖の位置１は前記ガイド鎖の５’末端に相当し、前記シード領域は配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号３１からなる群から選択されるヌクレオチド配列と配列が同一である少なくとも６個のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列をさらに含み；ならびに
    配列番号１、配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるヌクレオチド配列と比較して、少なくとも１個のヌクレオチド配列の相違を有する、単離核酸分子。
  22. 細胞株Ａ５４９の第一の試料への単離核酸分子の導入の結果、前記単離核酸分子に曝露されない細胞株Ａ５４９細胞の第二の試料中の少なくとも２つの遺伝子の測定レベルと比較して、前記少なくとも２つの遺伝子の測定レベルが検出可能に低下し、前記少なくとも２つの遺伝子は、配列番号１、配列番号４又は配列番号７を含むｓｉＮＡが前記Ａ５４９細胞に導入される場合にＡ５４９細胞において下方制御される一連の遺伝子から選択される、請求項２１の単離核酸分子。
  23. 前記２以上の遺伝子が、表５から選択される、請求項２２の単離核酸分子。
  24. 前記ガイド鎖配列が、ｍｉＲ３４ａ−ｍｍｌ８，１９（配列番号１５）、ｍｉＲ３４ｂ−ｍｍｌ８，１９（配列番号２０）及びｍｉＲ３４ｃ−ｍｍｌ８，１９（配列番号２５）からなる群から選択される、請求項２１の単離核酸分子。
  25. 前記ガイド鎖の相補体であるパッセンジャー鎖をさらに含む、請求項２１の単離核酸分子。
  26. 非ヌクレオチド部分をさらに含む、請求項２１の単離核酸分子。
  27. ガイド鎖及びパッセンジャー鎖が核酸分解に対して安定化されている、請求項２５の単離核酸分子。
  28. ガイド鎖の５’末端及び／又は３’末端及びパッセンジャー鎖の３’末端において少なくとも１個の化学修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドをさらに含む、請求項２５の単離核酸分子。
  29. １つの３’−突出部をさらに含み、前記３’−突出部が１から４個のヌクレオチドを含む、請求項２５の単離核酸分子。
  30. １つの２ヌクレオチド３’−突出部をさらに含む、請求項２５の単離核酸分子。
  31. 第二の３’−突出部をさらに含み、前記第二の３’−突出部が、１から４個のヌクレオチドを含む、請求項３０の単離核酸分子。
  32. パッセンジャー鎖及びガイド鎖の５’末端の第一のヌクレオチド間結合においてホスホロチオアートをさらに含む、請求項２６の単離核酸分子。
  33. パッセンジャー鎖及びガイド鎖の３’末端の第一のヌクレオチド間結合においてホスホロチオアートをさらに含む、請求項２５の単離核酸分子。
  34. ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の５’末端の第一のヌクレオチド間結合においてホスホロチオアートを、及び、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の３’末端の第一のヌクレオチド間結合においてホスホロチオアートを、さらに含む、請求項２５の単離核酸分子。
  35. ２’−修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項２５の単離核酸分子。
  36. ２’−修飾ヌクレオチドが、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）及び２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）からなる群から選択される修飾を含む、請求項３５の単離核酸分子。
  37. 少なくとも１つの合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物及び送達物質を含む組成物であって、
    合成２本鎖マイクロＲＮＡ模倣物は、
    （ｉ）１８から２５個のヌクレオチドのヌクレオチド配列からなるガイド鎖核酸分子（前記ガイド鎖ヌクレオチド配列は、シード領域ヌクレオチド配列及び非シード領域ヌクレオチド配列を含み、前記シード領域は、前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１から１２からなり、前記非シード領域は、前記ガイド鎖のヌクレオチド位置１３から３’末端からなり、前記ガイド鎖の位置１は前記ガイド鎖の５’末端に相当し、前記シード領域は、天然のマイクロＲＮＡのシード領域と配列が同一である少なくとも６個のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列をさらに含む。）、及び
    （ｉｉ）１８から２５個のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むパッセンジャー鎖核酸分子（前記パッセンジャー鎖は、ガイド鎖と基本的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、前記パッセンジャー鎖核酸分子は、ガイド鎖のシード領域の正確な逆相補体配列と比較して、１個のヌクレオチド配列の相違を有し、１個のヌクレオチドの相違は、前記パッセンジャー鎖のヌクレオチド位置１３から３’末端内に位置する。）
    を含む、組成物。
  38. ガイド鎖が、配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号３１からなる群から選択される配列と配列が同一である少なくとも６個のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むシード領域を含む、請求項３７の組成物。
  39. 前記ガイド鎖配列が、ｍｉＲ３４ａ（配列番号１）、ｍｉＲ３４ｂ（配列番号４）、ｍｉＲ３４ｃ（配列番号７）及びｍｉＲ４４９（配列番号２９）からなる群から選択される、請求項３７の組成物。
  40. パッセンジャー鎖におけるヌクレオチドの相違が、その３’末端の６個のヌクレオチド内に位置する、請求項３７の組成物。
  41. 送達物質が脂質ナノ粒子を含む、請求項３７の組成物。
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