JP2022078069A - 二本鎖ＲＮＡによるα－１アンチトリプシンの特異的阻害のための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】ｄｓＲＮＡ、例えばダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）剤の使用を通してα１アンチトリプシン標的ＲＮＡ及びタンパク質のレベルを低下させるのに有用な化合物、組成物、及び方法を提供する。【解決手段】第１および第２の核酸鎖を含む二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）であって、（ｉ）アンチセンス鎖は、１９～３５ヌクレオチド長であり、かつ特定の配列を有する長さ１９ヌクレオチドのα１アンチトリプシン標的ｍＲＮＡの連続した標的配列に相補的であり、（ｉｉ）前記ｄｓＮＡは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、（ｉｉｉ）センス鎖の３’－末端は、ヌクレオチドの一本鎖テトラループによって前記アンチセンス鎖の５’－末端に連結されており、その結果、前記ｄｓＮＡは、哺乳類細胞内に導入されたときに、α１アンチトリプシンｍＲＮＡの発現を低下させることができる、二本鎖ＲＮＡである。【選択図】図１
Description
関連出願
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、以下の出願の優先権及び利益を主張する：２０１３年７月３日に出願された表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｐｈａ－１ Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｂｙ Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ」の米国特許仮出願第６１／８４２，５５１号、及び２０１３年１０月１６日に出願された表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｐｈａ－１ Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｂｙ Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ」の米国特許仮出願第６１／８９１，５４８号。前述の特許出願の全内容は、参照により本明細書に取り込まれる。
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、以下の出願の優先権及び利益を主張する：２０１３年７月３日に出願された表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｐｈａ－１ Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｂｙ Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ」の米国特許仮出願第６１／８４２，５５１号、及び２０１３年１０月１６日に出願された表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｐｈａ－１ Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｂｙ Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ」の米国特許仮出願第６１／８９１，５４８号。前述の特許出願の全内容は、参照により本明細書に取り込まれる。
発明の分野
本発明は、α１アンチトリプシンの遺伝子発現及び／または活性の調整に応答する形質、疾患及び病状の試験、診断、及び処置のための化合物、組成物、及び方法に関する。
本発明は、α１アンチトリプシンの遺伝子発現及び／または活性の調整に応答する形質、疾患及び病状の試験、診断、及び処置のための化合物、組成物、及び方法に関する。
配列の登録
本出願は、電子形式で配列表と共に出願されている。配列表は、「３０１９３７＿９４００７＿ｓｅｑ＿ｌｉｓｔｉｎｇ＿１ＪＵＬ２０１４」という表題で、２０１４年７月１日に作成されており、６９２ｋｂのサイズである。配列表の電子形式の情報は、本出願の一部であり、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本出願は、電子形式で配列表と共に出願されている。配列表は、「３０１９３７＿９４００７＿ｓｅｑ＿ｌｉｓｔｉｎｇ＿１ＪＵＬ２０１４」という表題で、２０１４年７月１日に作成されており、６９２ｋｂのサイズである。配列表の電子形式の情報は、本出願の一部であり、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
α１アンチトリプシン（ＡＡＴまたはＳｅｒｐｉｎａ１）は、セルピンスーパーファミリーに属するプロテアーゼ阻害剤である。それは、一般には、血清トリプシン阻害剤として知られる。α１アンチトリプシンは、非常に様々なプロテアーゼを阻害することから、α１プロテイナーゼ阻害剤（Ａ１ＰＩ）とも称される（Ｇｅｔｔｉｎｓ ＰＧ． Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ １０２： ４７５１－８０４）。それは、組織を炎症細胞の酵素、特に好中球エラスターゼから防御し、１．５～３．５グラム／リットルの血中の基準範囲を有するが、急性炎症の際に、何倍ものレベル上昇が起こり得る（Ｋｕｓｈｎｅｒ， Ｍａｃｋｉｅｗｉｃｚ． Ａｃｕｔｅ－ｐｈａｓｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）． ｐｐ． ３－１９）。ＡＡＴがなければ、好中球エラスターゼは、肺の弾性に寄与するエラスチンを無制限に破壊し、成人の気腫またはＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、及び成人または小児の硬変症などの呼吸器合併症を生じる。ＡＡＴ遺伝子の一方または両方のコピーに突然変異を有する個体は、α１アンチトリプシン欠損症に罹患する可能性があり、それは、肺及び肝臓の正常なエラスターゼ活性よりも大きいことによる、肺気腫または慢性肝臓疾患発症のリスクとして現れる。
罹患した個体においては、α１アンチトリプシンの欠損は、野生型機能性α１アンチトリプシンの欠損である。しかし、本発明に関連する幾つかの例では、そのような個体は、かなりの量のα１アンチトリプシンを産生するが、産生されたα１アンチトリプシンタンパク質の一定割合が、ミスフォールドされているか、またはタンパク質の機能を損なう突然変異を含む。幾つかの例において、該個体は、体内の合成部位から作用部位に適切に輸送され得ないミスフォールドタンパク質を産生している。
α１アンチトリプシン欠損症により生じる肝臓疾患は、そのようなミスフォールドタンパク質により誘発される可能性がある。α１アンチトリプシンの突然変異形態（例えば、３４２位（前処理された形態では３６６位）にグルタミン酸からリシンへの突然変異を抱える一般的なＰｉＺバリアント）は、肝臓細胞内で産生され（一般には肝臓内の肝細胞が多量の循環ＡＡＴを産生する）、ミスフォールド構成では、そのような形態は細胞から容易に輸送されない。これにより、肝臓細胞（肝細胞）内にミスフォールドタンパク質が蓄積され（最も多量の突然変異Ｚタンパク質を有する肝細胞は、細胞内損傷の連鎖を受けて最終的にアポトーシスを生じる可能性があり、肝細胞内アポトーシスと再生の慢性サイクルにより線維症及び臓器損傷を引き起こす可能性がある）、非限定的に慢性肝臓疾患、肝臓の炎症、肝硬変、肝線維症、及び／または肝細胞癌をはじめとする１種または複数の肝臓の疾患または障害を誘発する可能性がある。
α１アンチトリプシン欠損症に関連する肝臓疾患の患者を処置する選択肢は、現在のところほとんどなく、そのような選択肢としては、肝炎ワクチン接種、支持療法、及び損傷性物質（例えば、アルコール及びＮＳＡＩＤ）の回避が挙げられるが、それらはいずれも標的療法を提供しない。α１アンチトリプシンの交換は、これらの患者の肝臓疾患に影響を有さないが、肝臓移植が効果的になり得る。
２５～３５ヌクレオチドの鎖長を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤が、哺乳動物細胞内の標的遺伝子発現の効果的阻害物質として記載されている（Ｒｏｓｓｉ他、米国特許出願公開第２００５／０２４４８５８号及び同第２００５／０２７７６１０号）。そのような長さのｄｓＲＮＡ剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路のダイサー酵素により処理されると考えられるため、そのような薬剤は「ダイサー基質ｓｉＲＮＡ」（「ＤｓｉＲＮＡ」）」剤と称されている。ＤｓｉＲＮＡ剤の追加的修飾構造が、過去に記載されている（Ｒｏｓｓｉ他、米国特許出願公開第２００７／０２６５２２０号）。ダイサー基質の効果的な伸長形態もまた、近年になり記載されている（Ｂｒｏｗｎ、米国特許第８，３４９，８０９号及び米国特許出願公開第２０１０／０１７３９７４号）
本明細書において、α１アンチトリプシンを標的とする改善された核酸剤が提供される。特にα１アンチトリプシンを標的とするものが、具体的に例示されている。
本発明は、α１アンチトリプシンの発現を減少させる核酸組成物を対象とする。そのような組成物は、二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）などの核酸、及びそれらを調製する方法を含む。本発明の核酸は、インビトロまたは哺乳動物対象体内のいずれにおいても、細胞において、標的α１アンチトリプシン遺伝子発現を減少させることができる。
一態様において、本発明は、オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１５ヌクレオチドに沿って配列番号９９１～１１８８の標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡ配列に十分に相補性があり、核酸が哺乳動物細胞内に導入されるとα１アンチトリプシン標的ｍＲＮＡ発現を減少させる、１５～３５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド鎖を有する該核酸を提供する。
別の態様において、本発明は、オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドに沿って配列番号９９１～１１８８の標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡ配列に十分に相補性があり、核酸が哺乳動物細胞内に導入されるとα１アンチトリプシン標的ｍＲＮＡ発現を減少させる、１９～３５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド鎖を有する該核酸を提供する。
さらなる態様において、本発明は、ＲＮＡを含む第一及び第二の核酸鎖を有する二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）であって、該第一の鎖が１５～３５ヌクレオチド長で、該第二の鎖が１９～３５ヌクレオチド長であり、該第二のオリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１５ヌクレオチドに沿って配列番号９９１～１１８８の標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡ配列に十分に相補性があり、該ｄｓＮＡが哺乳動物細胞内に導入されるとα１アンチトリプシン標的ｍＲＮＡ発現を減少させる、該二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）を提供する。
追加の態様において、本発明は、第一及び第二の核酸鎖を有するｄｓＮＡであって、該ｄｓＮＡの第一の鎖が１５～３５ヌクレオチド長で、該第二の鎖が１９～３５ヌクレオチド長であり、該第二のオリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドに沿って配列番号９９１～１１８８の標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡ配列に十分に相補性があり、該ｄｓＮＡが哺乳動物細胞内に導入されるとα１アンチトリプシン標的ｍＲＮＡ発現を減少させる、該ｄｓＮＡを提供する。
別の態様において、本発明は、第一及び第二の核酸鎖を有するｄｓＮＡであって、該ｄｓＮＡの第一の鎖が１５～３５ヌクレオチド長で、該第二の鎖が１９～３５ヌクレオチド長であり、該第二のオリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドに沿って配列番号９９１～１１８８の標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡ配列に十分に相補性があり、該ｄｓＮＡが哺乳動物細胞内に導入されると、α１アンチトリプシン標的ｍＲＮＡ発現を減少させ、哺乳動物Ａｇｏ２が、配列番号９９１～１１８８のα１アンチトリプシンｍＲＮＡ配列の５’末端（１位と呼称）から出発した場合の該配列の９位～１０位の一部位でｍＲＮＡを切断する、該ｄｓＮＡを提供する。
さらなる態様において、本発明は、（ａ）センス領域とアンチセンス領域が一緒になって２５～３５塩基対からなる二重鎖領域を形成し、該アンチセンス領域が配列番号９９１～１１８８及び１９３８～１９６８の任意の１つの（またはそれを超える）配列の相補体である配列を含む、該センス領域及び該アンチセンス領域と、（ｂ）各オーバーハング領域が６ヌクレオチド長以下である０～２の３’オーバーハング領域と、からなるｄｓＮＡ分子であって、該ｄｓＲＮＡが哺乳動物細胞内に導入されると、哺乳動物Ａｇｏ２が、配列番号９９１～１１８８及び１９３８～１９６８のα１アンチトリプシンｍＲＮＡ配列の５’末端（１位）から出発した場合の該配列の９位～１０位の一部位でｍＲＮＡを切断する、該ｄｓＮＡ分子を提供する。
追加の態様において、本発明は、第一及び第二の核酸鎖と、少なくとも２５塩基対の二重鎖領域と、を有するｄｓＮＡであって、該ｄｓＮＡの第一の鎖が２５～３４ヌクレオチド長であり、該第二の鎖が２６～３５ヌクレオチド長で、その３’末端に１～５の一本鎖ヌクレオチドを含み、該第二のオリゴヌクレオチド鎖が、該第二のオリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドに沿って配列番号９９１～１１８８及び１９３８～１９６８の標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡ配列に十分に相補性があり、該ｄｓＮＡが哺乳動物細胞内に導入されるとα１アンチトリプシン標的発現を減少させる、該ｄｓＮＡを提供する。
別の態様において、本発明は、第一及び第二の核酸鎖と、少なくとも２５塩基対の二重鎖領域と、を有するｄｓＮＡであって、該ｄｓＮＡの第一の鎖が２５～３４ヌクレオチド長であり、該第二の鎖が２６～３５ヌクレオチド長で、その３’末端に１～５の一本鎖ヌクレオチドを含み、第一のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端及び第二のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端が、平滑末端を形成し、該第二のオリゴヌクレオチド鎖が、該第二のオリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドに沿って配列番号９９１～１１８８及び１９３８～１９６８の標的α１アンチトリプシン配列に十分に相補性があり、該ｄｓＮＡが哺乳動物細胞内に導入されるとα１アンチトリプシン標的ｍＲＮＡ発現を減少させる、該ｄｓＮＡを提供する。
追加の態様において、本発明は、１５～３５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを有する核酸であって、該オリゴヌクレオチド鎖が、該オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１５ヌクレオチドに沿って配列番号９９１～１１８８または１９３８～１９６８の標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡ配列にハイブリダイズすることができる、該核酸を提供する。
本発明の別の態様は、ＲＮＡを含む第一及び第二の核酸鎖を有するｄｓＮＡであって、該ｄｓＮＡの該第一の鎖が１５～３５ヌクレオチド長で、該第二の鎖が１９～３５ヌクレオチド長であり、該第二のオリゴヌクレオチド鎖が、該第二のオリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１５ヌクレオチドに沿って配列番号９９１～１１８８または１９３８～１９６８の標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡ配列にハイブリダイズすることができる、該ｄｓＮＡを提供する。
本発明のさらなる態様は、外来性核酸配列と、配列番号９９１～１１８８または１９３８～１９６８の標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡ配列と、を含む、細胞内のインビボハイブリダイゼーション複合体を提供する。
本発明の追加の態様は、外来性核酸配列と、配列番号９９１～１１８８または１９３８～１９６８の標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡ配列と、を含む、細胞内のインビトロハイブリダイゼーション複合体を提供する。
一実施形態において、該ｄｓＮＡは、１９～２１塩基対、２１～２５塩基対または少なくとも２５塩基対の長さである二重鎖領域を有する。
別の実施形態において、該第二のオリゴヌクレオチド鎖は、３’末端に１～５の一本鎖ヌクレオチドを含む。
追加の実施形態において、該第一の鎖は、２５～３５ヌクレオチド長である。任意で該第二の鎖は、２５～３５ヌクレオチド長である。
別の実施形態において、該第二のオリゴヌクレオチド鎖は、該第二のオリゴヌクレオチド鎖長の最大２７ヌクレオチドに沿って、標的α１アンチトリプシンｃＤＮＡ配列ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００２９５．４に相補性がある。
一実施形態において、該ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体は、修飾ヌクレオチドを含む。任意で該修飾ヌクレオチド残基は、２’－Ｏ－メチル、２’－メトキシエトキシ、２’－フルオロ、２’－アリル、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］、４’－チオ、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’－架橋、４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’－架橋、２’－ＬＮＡ、２’－アミノ及び２’－Ｏ－（Ｎ－メチルカルバマート）からなる群のものである。
さらなる実施形態において、該第一のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の最初のヌクレオチド（１位）から出発した場合の１位、２位または３位が、修飾ヌクレオチドで置換されている。任意で、該第一の鎖の３’末端の修飾ヌクレオチド残基は、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、または蛍光分子である。ある特定の実施形態において、該第一のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の１位は、デオキシリボヌクレオチドである。
一実施形態において、該第一の鎖は、２５ヌクレオチド長であり、該第二の鎖は、２７ヌクレオチド長である。任意で該第一の鎖の３’末端及び該第二の鎖の５’末端は、平滑末端を形成している。
別の実施形態において、ｄｓＮＡが、哺乳動物細胞に導入されると、哺乳動物Ａｇｏ２が、配列番号９９１～１１８８及び１９３８～１９６８のα１アンチトリプシンｍＲＮＡ配列の５’末端（１位）から出発した場合の該配列の９位～１０位の一部位でｍＲＮＡを切断し、それによりα１アンチトリプシン標的ｍＲＮＡの発現を減少させる。任意で該第二の鎖は、配列番号１９９～３９６または３４９３～３４９９の配列を含む。ある特定の実施形態において、第一の鎖は、配列番号１～１９８の配列を含む。
一実施形態において、該ｄｓＮＡは、表２の第一の鎖配列／第二の鎖配列の対を含む。
さらなる実施形態において、該第一の鎖及び該第二の鎖のそれぞれは、少なくとも２６ヌクレオチドの長さを有する。
一実施形態において、該第二の鎖の３’末端の１～５の一本鎖ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む。任意で該修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドである。関連する実施形態において、該第二の鎖の３’末端の１～５の一本鎖ヌクレオチドの全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、該第二の鎖の３’末端の１～５の一本鎖ヌクレオチドは、１～４ヌクレオチド長であるか、１～３ヌクレオチド長であるか、または１～２ヌクレオチド長である。関連する実施形態において、該第二の鎖の３’末端の１～５の一本鎖ヌクレオチドは、２ヌクレオチド長であり、２’－Ｏ－メチルで修飾されたリボヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態において、該第二のオリゴヌクレオチド鎖は、ＡＳ－Ｍ１～ＡＳ－Ｍ８４、ＡＳ－Ｍ８８～ＡＳ－Ｍ９６、ＡＳ－Ｍ２１０、ＡＳ－Ｍ１＊～ＡＳ－Ｍ８４＊、ＡＳ－Ｍ８８＊～ＡＳ－Ｍ９６＊またはＡＳ－Ｍ２１０＊の修飾パターンを含む。
任意で、該第一のオリゴヌクレオチド鎖は、ＳＭ１～ＳＭ１１９またはＳＭ２５０～ＳＭ２５２の修飾パターンを含む。
さらなる実施形態において、第一の鎖及び第二の鎖のそれぞれは、少なくとも２６ヌクレオチドで最大３０ヌクレオチドの長さを有する。
任意で該ｄｓＮＡは、ダイサーにより細胞内で内因的に切断される。
ある特定の実施形態において、本発明のｄｓＮＡは、少なくとも１つのアンロックヌクレオ塩基類似体（ＵＮＡ）を含む。任意で少なくとも１つのＵＮＡは、ｄｓＮＡの３’－オーバーハング領域、５’－オーバーハング領域、またはそれらの領域の両方に、任意でｄｓＮＡのガイド鎖上に位置する。
幾つかの実施形態において、本発明のｄｓＮＡは、ダイナミックポリコンジュゲート（ＤＰＣ）に結合されている。追加の実施形態において、本発明のｄｓＮＡは、ＤＰＣと共に投与され、任意でｄｓＮＡとＤＰＣは、結合されていない。
幾つかの実施形態において、本発明のｄｓＮＡは、ＧａｌＮＡｃ部分（任意で、トリアンテナ型ＧａｌＮＡｃ部分）及び／またはコレステロールもしくはコレステロール標的リガンドに結合されている。
ある特定の実施形態において、標的遺伝子の発現を減少させるのに十分な核酸の量は、細胞環境で１ナノモル以下、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、または１ピコモル以下存在する。
一実施形態において、該ｄｓＮＡは、１ナノモル以下の細胞環境の有効濃度で、哺乳動物細胞でインビトロアッセイすると、標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡ発現を減少させることにおいて、標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡの同一の少なくとも１９ヌクレオチドを対象とする２１量体ｓｉＲＮＡよりも大きな能力を有する。ある特定の実施形態において、ノックダウン効力及び／または能力は、細胞環境で１ナノモル、２００ピコモル、１００ピコモル、５０ピコモル、２０ピコモル、１０ピコモル、５ピコモル、２ピコモル、または１ピコモルの濃度で測定される。
別の実施形態において、該ｄｓＮＡは、標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡ配列に十分に相補性があり、該ｄｓＮＡが哺乳動物細胞に導入されると、α１アンチトリプシン標的ｍＲＮＡ発現を少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０～９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の量（％で表す）減少させる。
ある特定の実施形態において、該第一及び第二の鎖は、化学的リンカーによりつながれている。任意で、第一の鎖の３’末端と第二の鎖の５’末端は、化学的リンカーによりつながれている。
一実施形態において、該第二または第一の鎖のヌクレオチドは、ダイサー切断の方向を指示する修飾ヌクレオチドで置換されている。
任意で、該ｄｓＮＡとしては、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’－デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’－アジド－３’－デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’－ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’－ジデオキシ－３’－チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’－ジデヒドロ－２’，３’－ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、３’－アジド－３’－デオキシチミジン（ＡＺＴ）の一リン酸塩ヌクレオチド、２’，３’－ジデオキシ－３’－チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’－ジデヒドロ－２’，３’－ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸塩ヌクレオチド、４－チオウラシル、５－ブロモウラシル、５－ヨードウラシル、５－（３－アミノアリル）－ウラシル、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－アミノリボヌクレオチド、２’－フルオロリボヌクレオチド、またはロックされた核酸が挙げられる。
ある特定の実施形態において、該ｄｓＮＡとしては、ホスホン酸塩、ホスホロチオアート、またはホスホトリエステルであるリン酸塩バックボーン修飾が挙げられる。
一実施形態において、該ｄｓＮＡとしては、モルホリノ核酸またはペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
一態様において、本発明は、細胞内の標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡの発現を減少させるのに十分な量で、インビトロの哺乳動物細胞を本発明のｄｓＮＡと接触させることを含む、哺乳動物細胞内での標的α１アンチトリプシン遺伝子の発現を減少させる方法を提供する。
一実施形態において、標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡ発現は、少なくとも１０％、少なくとも５０％、または少なくとも８０～９０％減少する。任意でα１アンチトリプシンｍＲＮＡレベルは、該細胞をｄｓＮＡと接触させた後少なくとも８日間、少なくとも９０％低下する。ある特定の実施形態において、α１アンチトリプシンｍＲＮＡレベルは、該細胞をｄｓＮＡと接触させた後少なくとも１０日間、少なくとも７０％低下する。
一態様において、本発明は、哺乳動物の標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡの発現を減少させる方法であって、哺乳動物の標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡの発現を減少させるのに十分な量で、本発明の核酸を哺乳動物に投与することを含む、該方法を提供する。
ある特定の実施形態において、該核酸は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に配合される。一実施形態において、該核酸は、１日に哺乳動物１キログラムあたり１マイクログラム～５ミリグラム、１キログラムあたり１００マイクログラム～０．５ミリグラム、１キログラムあたり０．００１～０．２５ミリグラム、１キログラムあたり０．０１～２０マイクログラム、１キログラムあたり０．０１～１０マイクログラム、１キログラムあたり０．１０～５マイクログラム、または１キログラムあたり０．１～２．５マイクログラムの投与量で投与される。
ある特定の実施形態において、該核酸は、１ナノモル以下の細胞環境での有効濃度で、哺乳動物細胞でインビトロアッセイすると、標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡ発現を減少させることにおいて標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡの同一の少なくとも１９ヌクレオチドを対象とする２１量体ｓｉＲＮＡよりも大きな能力を有する。ある特定の実施形態において、ノックダウン効力及び／または能力は、細胞環境で１ナノモル、２００ピコモル、１００ピコモル、５０ピコモル、２０ピコモル、１０ピコモル、５ピコモル、２ピコモル、または１ピコモルの濃度で測定される。
別の実施形態において、α１アンチトリプシンｍＲＮＡレベルは、ｄｓＮＡを哺乳動物に投与した後少なくとも３日間、哺乳動物の組織内で少なくとも７０％減少する。任意で該組織は、肝臓組織である。
ある特定の実施形態において、投与としては、静脈注射、筋肉注射、腹腔注射、輸液、皮下注射、経皮、エアロゾル、経直腸、経膣、外用、経口または吸入送達が挙げられる。
別の態様において、本発明は、対象の肝臓疾患または障害を治療または予防する方法であって、該対象の該肝臓疾患または障害を治療または予防するのに十分な量で、本発明のｄｓＮＡを該対象に投与することを含む、該方法を提供する。
一実施形態において、該肝臓疾患または障害は、慢性肝臓疾患、肝臓の炎症、肝硬変、肝線維症、または肝細胞癌である。任意で該対象は、ヒトである。
さらなる対象において、本発明は、核酸がインビトロで哺乳動物細胞に導入された場合に標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡレベルを少なくとも１０％、少なくとも５０％、または少なくとも８０～９０％低下させるのに有効な的な量で存在する本発明の核酸を含む配合剤を提供する。
一実施形態において、該有効な量は、細胞環境で１ナノモル以下、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、または１ピコモル以下である。ある特定の実施形態において、ノックダウン効力は、細胞環境で１ナノモル、２００ピコモル、１００ピコモル、５０ピコモル、２０ピコモル、１０ピコモル、５ピコモル、２ピコモル、または１ピコモルの濃度で測定される。
別の態様において、本発明は、ｄｓＮＡが哺乳動物対象に導入された場合の標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡレベルを少なくとも１０％、少なくとも５０％、または少なくとも８０～９０％低下させるのに有効な量で存在する本発明のｄｓＮＡを含む配合剤を提供する。任意で該有効な量は、１日に対象１キログラムあたり１マイクログラム～５ミリグラム、１キログラムあたり１００マイクログラム～０．５ミリグラム、１キログラムあたり０．００１～０．２５ミリグラム、１キログラムあたり０．０１～２０マイクログラム、１キログラムあたり０．０１～１０マイクログラム、１キログラムあたり０．１０～５マイクログラム、または１キログラムあたり０．１～２．５マイクログラムの投与量である。
追加の態様において、本発明は、本発明の核酸を含む哺乳動物細胞を提供する。
さらなる態様において、本発明は、本発明の核酸及び医薬的に許容し得る担体を含有する医薬組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明の核酸及びその使用説明書を含むキットを提供する。
追加の態様において、本発明は、本質的に本発明の核酸からなるα１アンチトリプシン阻害活性を有する組成物を提供する。
本発明の別の態様は、外来性核酸を細胞内のｍＲＮＡにハイブリダイズする方法であって、該細胞に外来性核酸配列を導入すること、及び配列番号９９１～１１８８または１９３８～１９６８の配列の標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡ配列に該外来性核酸をハイブリダイズすること、を含む該方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、肝臓または肺疾患または障害を有する個体を治療する方法であって、該個体の細胞に外来性核酸配列を導入すること、及び配列番号９９１～１１８８または１９３８～１９６８の標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡ配列に該外来性核酸をハイブリダイズすること、を含む該方法を提供する。
本発明の追加の態様は、細胞内でインビボハイブリダイゼーション複合体を形成する方法であって、該細胞に外来性核酸配列を導入すること、及び配列番号９９１～１１８８または１９３８～１９６８の標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡ配列に該外来性核酸をハイブリダイズすること、を含む該方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、細胞内のタンパク質への標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害する方法であって、該細胞に外来性核酸配列を導入すること、配列番号９９１～１１８８または１９３８～１９６８の標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡ配列に該外来性核酸をハイブリダイズすること、該外来性核酸をＲＩＳＣと複合体化すること、及び該ｍＲＮＡを切断すること、を含む該方法を提供する。
一実施形態において、該外来性核酸は、ＲＩＳＣと複合体化される。関連する実施形態において、該ＲＩＳＣは、該ｍＲＮＡを切断する。
本発明の別の態様は、「一本鎖伸長」（本明細書では５’末端のガイド鎖伸長）ｄｓＮＡを提供する。具体的には本発明のこの態様は、ＲＮＡを含む第一及び第二の核酸鎖を有するｄｓＮＡであって、該第一の鎖が１５～３５ヌクレオチド長であり、該第二の鎖が少なくとも３５ヌクレオチド長であり、任意で配列番号３４９３～３４９９の配列の少なくとも２５ヌクレオチドを有する第二の鎖の配列を含み、第二のオリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１５ヌクレオチドに沿って配列番号９９１～１１８８の標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡ配列に十分に相補性があるため、ｄｓＮＡが哺乳動物細胞に導入されるとα１アンチトリプシン標的ｍＲＮＡ発現を減少させる、該ｄｓＮＡを提供する。
本発明は、インビボまたはインビトロでのα１アンチトリプシン遺伝子のレベル及び／または発現を減少させることができる核酸、例えば二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を含有する組成物、及びそれらを調製する方法を対象とする。ｄｓＲＮＡの鎖の１つは、標的とするα１アンチトリプシン転写産物の破壊及び／または翻訳阻害を指示し得る１９～３５ヌクレオチドの範囲の長さを有するヌクレオチド配列の領域を含む。
定義
他に別様に定義がなければ、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に共通して理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で用いられる用語の多くの一般的定義を当業者に示している：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２ｎｄ ｅｄ． １９９４）； Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．， １９８８）； Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ５ｔｈ Ｅｄ．， Ｒ． Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ （１９９１）；及びＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ， Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９１）。本明細書で用いられる次の用語は、他に断りがなければ、以下にそれらに与えられた意味を有する。
他に別様に定義がなければ、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に共通して理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で用いられる用語の多くの一般的定義を当業者に示している：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２ｎｄ ｅｄ． １９９４）； Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．， １９８８）； Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ５ｔｈ Ｅｄ．， Ｒ． Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ （１９９１）；及びＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ， Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９１）。本明細書で用いられる次の用語は、他に断りがなければ、以下にそれらに与えられた意味を有する。
本発明は、α１アンチトリプシン発現を調整（例えば、阻害）し得る１種または複数のＤｓｉＲＮＡ分子を特色とする。本発明のＤｓｉＲＮＡは、任意で、α１アンチトリプシン誤制御（例えば、腫瘍の形成及び／または成長など）に関連する疾患または障害の維持または発達に関連する他の遺伝子及び／または遺伝子産物のモジュレータと併せて用いることができる。本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、本明細書では概して「α１アンチトリプシン」と称されるＧｅｎＢａｎｋ 登録番号ＮＭ＿０００２９５．４（ヒトα１アンチトリプシン）及びＮＭ＿００９２４６．３（マウスセルピナ１ｄ）により参照されるｃＤＮＡ配列に対応するものなどのα１アンチトリプシンＲＮＡを調整する。
本発明の様々な態様及び実施形態の以下の記述は、本明細書では概してα１アンチトリプシンと称される、例示的α１アンチトリプシンＲＮＡに関連して提供されている。しかしそのような参照は、例示に過ぎないことを意図しており、本発明の様々な態様及び実施形態は、変異体α１アンチトリプシンＲＮＡまたは追加のα１アンチトリプシンスプライスバリアントなど、代替のα１アンチトリプシンＲＮＡも対象とする。ある特定の態様及び実施形態は、誤制御がα１アンチトリプシンのものと関連して作用して（または、α１アンチトリプシン制御の影響を受け、もしくはα１アンチトリプシン制御に影響を及ぼして）、処置のためのターゲットとなり得る表現型への影響（例えば、腫瘍の形成及び／または成長など）を生じる遺伝子など、α１アンチトリプシン経路に関与する他の遺伝子も対象とする。ＢＡＫ１、Ｎｏｘａ、ＢＣＬ２Ｌ１１、Ｂｃｌ－２関連デスプロモータ、ＰＣＮＡ、ＤＡＤ１、ＴＮＫＳ及びＢＨ３共役ドメインデスアゴニストが、α１アンチトリプシンと相互作用する遺伝子の例である。α１アンチトリプシンと連携して作用する経路の遺伝子をはじめとするそのような追加の遺伝子は、ｄｓＲＮＡ、及びα１アンチトリプシン標的化ｄｓＲＮＡの使用に関して本明細書に記載された方法を利用して、標的とされ得る。つまり他の遺伝子の阻害及びそのような阻害の効果を、本明細書に記載された通り実施することができる。
「α１アンチトリプシン」という用語は、α１アンチトリプシンタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、α１アンチトリプシンＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００２９５．４及びＮＭ＿００９２４６．３の配列などのα１アンチトリプシン転写産物）を指す。ある特定の実施形態において、「α１アンチトリプシン」という用語は、他のα１アンチトリプシンアイソフォーム、突然変異体α１アンチトリプシン遺伝子、α１アンチトリプシン遺伝子のスプライスバリアント、及びα１アンチトリプシン遺伝子多型などの他のα１アンチトリプシンコード配列も含むことを意味する。「α１アンチトリプシン」という用語は、α１アンチトリプシンＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００２８６．３及びＮＰ＿０３３２７２．１によりコードされるものなど、α１アンチトリプシン遺伝子／転写産物のポリペプチド遺伝子産物、例えばα１アンチトリプシンタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指すのにも用いられる。
本明細書で用いられる「α１アンチトリプシン関連疾患または障害」は、改変されたα１アンチトリプシン発現、レベル及び／または活性に関連することが当該技術分野で知られている疾患または障害を指す。特に「α１アンチトリプシン関連疾患または障害」は、非限定的に慢性肝臓疾患、肝臓の炎症、肝硬変、肝線維症、及び／または肝細胞癌をはじめとする肝臓の疾患または障害を包含する。
本発明の抗α１アンチトリプシンｄｓＲＮＡが系（例えば、無細胞のインビトロ系）、細胞、組織または臓器に投与された場合に、選択された対照と比較してα１アンチトリプシンＲＮＡの（またはα１アンチトリプシンタンパク質が評価される場合にはα１アンチトリプシンタンパク質レベルの）統計学的に有意な減少が認められれば、本発明の抗α１アンチトリプシンｄｓＲＮＡは、「α１アンチトリプシン阻害活性」を有すると見なされる。実験値の分布及び行われる反復アッセイの数が、α１アンチトリプシンＲＮＡの減少レベル（％として、または絶対的用語のいずれかで）を統計学的に有意（当該技術分野で知られる統計学的有意差を決定する標準的方法による評価で）と見なされるパラメータを決定する傾向があろう。しかしある特定の実施形態において、「α１アンチトリプシン阻害活性」は、系、細胞、組織または臓器内のα１アンチトリプシンレベル低下の％または絶対値に基づいて定義される。例えばある特定の実施形態において、α１アンチトリプシンＲＮＡの少なくとも５％の減少または少なくとも１０％の減少が、適切な対照で認められたα１アンチトリプシンレベルに比較して本発明のｄｓＲＮＡの存在下で観察されれば、本発明のｄｓＲＮＡは、α１アンチトリプシン阻害活性を有すると見なされる。（例えば、ある特定の実施形態において、例えばα１アンチトリプシンレベルの５％または１０％低下が対照に比較して観察されれば、組織及び／または対象のインビボα１アンチトリプシンレベルは、本発明のｄｓＲＮＡ剤により阻害されると見なされる。）ある特定の他の実施形態において、α１アンチトリプシンＲＮＡレベルが選択された対照に比較して少なくとも１５％、選択された対照に比較して少なくとも２０％、選択された対照に比較して少なくとも２５％、選択された対照に比較して少なくとも３０％、選択された対照に比較して少なくとも３５％、選択された対照に比較して少なくとも４０％、選択された対照に比較して少なくとも４５％、選択された対照に比較して少なくとも５０％、選択された対照に比較して少なくとも５５％、選択された対照に比較して少なくとも６０％、選択された対照に比較して少なくとも６５％、選択された対照に比較して少なくとも７０％、選択された対照に比較して少なくとも７５％、選択された対照に比較して少なくとも８０％、選択された対照に比較して少なくとも８５％、選択された対照に比較して少なくとも９０％、選択された対照に比較して少なくとも９５％、選択された対照に比較して少なくとも９６％、選択された対照に比較して少なくとも９７％、選択された対照に比較して少なくとも９８％、または選択された対照に比較して少なくとも９９％低下することが観察されれば、本発明のｄｓＲＮＡは、α１アンチトリプシン阻害活性を有すると見なされる。幾つかの実施形態において、α１アンチトリプシンの完全な阻害が、ｄｓＲＮＡがα１アンチトリプシン阻害活性を有すると見なされるのに必要となる。ある特定のモデル（例えば、細胞培養）において、適切な対照に比較してα１アンチトリプシンレベルの少なくとも５０％の低下が観察された場合には、ｄｓＲＮＡは、α１アンチトリプシン阻害活性を有すると見なされる。特定の他の実施形態において、適切な対照に比較してα１アンチトリプシンレベルの少なくとも８０％の低下が観察された場合には、ｄｓＲＮＡは、α１アンチトリプシン阻害活性を有すると見なされる。
具体的な例として、以下の実施例２において、α１アンチトリプシンを標的とする一連のＤｓｉＲＮＡが、インビトロでのヒトＨｕｈ７またはマウスＡＭＬ１２細胞内のα１アンチトリプシンｍＲＮＡレベルを、そのような細胞環境及びトランスフェクション剤（リポフェクタミン（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ、インビトロジェン）の存在下の１ｎＭ濃度で低下させる能力について試験された。以下の実施例２では、α１アンチトリプシン阻害活性は、アッセイ条件下、α１アンチトリプシンｍＲＮＡレベルの少なくとも７０％の低下をもたらすことが観察されたＤｓｉＲＮＡに起因する。同一または類似のアッセイ及び条件が用いられた場合であっても、α１アンチトリプシン阻害活性が以下の実施例２で用いられるものよりも高または低ストリンジェント条件のいずれかでｄｓＲＮＡに起因し得ることも、企図される。例えばある特定の実施形態において、α１アンチトリプシンｍＲＮＡレベルの少なくとも１０％の低下、少なくとも２０％の低下、少なくとも３０％の低下、少なくとも４０％の低下、少なくとも５０％の低下、少なくとも６０％の低下、少なくとも７５％の低下、少なくとも８０％の低下、少なくとも８５％の低下、少なくとも９０％の低下、または少なくとも９５％の低下が、適切な対照に比較して、細胞環境での１ｎＭ ｄｓＲＮＡ濃度以下で、インビトロの哺乳動物細胞株で観察された場合には、試験された本発明のｄｓＲＮＡは、α１アンチトリプシン阻害活性を有すると見なされる。
本発明の二本鎖ＲＮＡがα１アンチトリプシン阻害活性を有するかどうかを決定するための他のエンドポイントの利用も、企図される。具体的には一実施形態において、α１アンチトリプシンｍＲＮＡレベルの評価に加えて、またはその代わりに、試験されるｄｓＲＮＡがα１アンチトリプシンタンパク質レベルを低下させる能力を評価し（例えば、インビトロまたはインビボで哺乳動物細胞と接触した後４８時間目に）、適切な対照に比較してα１アンチトリプシンタンパク質レベルの少なくとも１０％の低下、少なくとも２０％の低下、少なくとも３０％の低下、少なくとも４０％の低下、少なくとも５０％の低下、少なくとも６０％の低下、少なくとも７０％の低下、少なくとも７５％の低下、少なくとも８０％の低下、少なくとも８５％の低下、少なくとも９０％の低下、または少なくとも９５％の低下が、インビトロまたはインビボでアッセイされた二本鎖ＲＮＡと接触された哺乳動物細胞で観察されれば、試験されたｄｓＲＮＡは、α１アンチトリプシン阻害活性を有すると見なされる。企図される追加のエンドポイントには、例えばα１アンチトリプシンレベルに関連する表現型の評価、例えば慢性肝臓疾患、肝臓の炎症、肝硬変、肝線維症、及び／または肝細胞癌の、直接の評価、またはそのような肝臓疾患もしくは障害の適当なマーカ及び／もしくは指示薬の評価による退縮がある。
α１アンチトリプシン阻害活性は、投与される濃度及び投与後の期間に従って適合されたα１アンチトリプシン阻害活性を有するｄｓＲＮＡを構成するものの評価で、時間（期間）及び濃度範囲（能力）に応じて評価することもできる。つまり、ある特定の実施形態において、α１アンチトリプシン活性の少なくとも５０％の低下が、細胞または臓器へのｄｓＲＮＡの投与後２時間、５時間、１０時間、１日間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、またはそれを超える期間、観察／持続されれば、本発明のｄｓＲＮＡは、α１アンチトリプシン阻害活性を有すると見なされる。追加の実施形態において、α１アンチトリプシン阻害活性（例えば、ある特定の実施形態において、α１アンチトリプシンの少なくとも５０％の阻害）が、細胞環境において、例えば本明細書に記載されたα１アンチトリプシン阻害活性のためのインビトロアッセイで、１ｎＭ以下、５００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、１０ｐＭ以下、５ｐＭ以下、２ｐＭ以下、またはさらには１ｐＭ以下の濃度で観察されれば、本発明のｄｓＲＮＡは、強力なα１アンチトリプシン阻害活性剤であると見なされる。ある特定の実施形態において、本発明の強力なα１アンチトリプシン阻害性ｄｓＲＮＡは、効果的送達ビヒクル（例えば、効果的な脂質ナノ粒子配合剤）中で対象に投与される場合に、１０ｍｇ／ｋｇ以下の配合濃度で、α１アンチトリプシン阻害活性（例えば、ある特定の実施形態において、α１アンチトリプシンレベルの少なくとも２０％の低下）が可能なものと定義される。好ましくは本発明の強力なα１アンチトリプシン阻害性ｄｓＲＮＡは、効果的送達ビヒクル中で対象に投与される場合に、５ｍｇ／ｋｇ以下の配合濃度で、α１アンチトリプシン阻害活性（例えば、ある特定の実施形態において、α１アンチトリプシンレベルの少なくとも５０％の低下）が可能なものと定義される。より好ましくは本発明の強力なα１アンチトリプシン阻害性ｄｓＲＮＡは、効果的送達ビヒクル中で対象に投与される場合に、５ｍｇ／ｋｇ以下の配合濃度で、α１アンチトリプシン阻害活性（例えば、ある特定の実施形態において、α１アンチトリプシンレベルの少なくとも５０％の低下）が可能なものと定義される。任意で本発明の強力なα１アンチトリプシン阻害性ｄｓＲＮＡは、効果的送達ビヒクル中で対象に投与される場合に、２ｍｇ／ｋｇ以下または１ｍｇ／ｋｇ以下の配合濃度で、α１アンチトリプシン阻害活性（例えば、ある特定の実施形態において、α１アンチトリプシンレベルの少なくとも５０％の低下）が可能なものと定義される。本発明のα１アンチトリプシン標的化ＲＮＡｉ剤の例示的な不連続の配合濃度としては、約５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約２５０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約２５μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約５μｇ／ｋｇ、約２．５μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ、約５００ｎｇ／ｋｇ、約２５０ｎｇ／ｋｇ、約１００ｎｇ／ｋｇ、約５０ｎｇ／ｋｇ、約２５ｎｇ／ｋｇ、約１０ｎｇ／ｋｇ、約５ｎｇ／ｋｇ、約２．５ｎｇ／ｋｇ、約１ｎｇ／ｋｇ、及び約５００ｐｇ／ｋｇが挙げられる。
約：本明細書で用いられる「約」という用語は、引用された値の±１０％を意味する。「約」の使用は、本明細書で引用された全ての範囲及び値に関して企図される。
ある特定の実施形態において、「本質的に～からなる」という表現は、本発明の抗α１アンチトリプシンｄｓＲＮＡに関連して用いられる。幾つかのそのような実施形態において、「本質的に～からなる」は、少なくとも特定レベルのα１アンチトリプシン阻害活性（例えば、少なくとも５０％のα１アンチトリプシン阻害活性）を有する本発明のｄｓＲＮＡを含み、ｄｓＲＮＡのα１アンチトリプシン阻害活性に有意な影響を及ぼさない１種または複数の追加の成分及び／または修飾も含む組成物を指す。例えばある特定の実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡ及び／または該組成物のｄｓＲＮＡ関連成分の修飾が単離された本発明のｄｓＲＮＡに比較して３％より大きく、５％より大きく、１０％より大きく、１５％より大きく、２０％より大きく、２５％より大きく、３０％より大きく、３５％より大きく、４０％より大きく、４５％より大きく、または５０％より大きく、α１アンチトリプシン阻害活性（任意で、α１アンチトリプシン阻害活性の能力または期間など）を改変しなければ、該組成物は、「本質的に本発明のｄｓＲＮＡからなる」。ある特定の実施形態において、α１アンチトリプシン阻害活性のより劇的な低下（例えば、効力、期間及び／または能力の８０％の低下、９０％の低下など）が追加の成分または修飾の存在下で起こる場合でも、α１アンチトリプシン阻害活性が追加の成分及び／または修飾の存在下で有意に上昇していなければ（例えば、α１アンチトリプシン阻害活性の観察レベルが本発明のｄｓＲＮＡで観察されたレベルの１０％以内であれば）、該組成物は本質的に本発明のｄｓＲＮＡからなると見なされる。
本明細書で用いられる「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または修飾ヌクレオチド、及びそれらのポリマーを指す。その用語は、合成、天然由来及び非天然由来であり、参照核酸と類似の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと類似の手法で代謝される、公知のヌクレオチドアナログまたは修飾バックボーン残基もしくは結合を含む核酸を包含する。そのようなアナログの例としては、ホスホロチオアート、ホスホルアミダート、ホスホン酸メチル、キラルホスホン酸メチル、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及びアンロック核酸（ＵＮＡまたはアンロックヌクレオ塩基類似体；例えばＪｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５２： １３３－４参照）、ならびにそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる「ヌクレオチド」は、当該技術分野で認識される通り、天然塩基（標準）、及び当該技術分野で周知の修飾塩基を有するものを含んで用いられる。そのような塩基は、一般に、ヌクレオチド糖部分の１’位に配置する。ヌクレオチドは、一般に、塩基、糖及びリン酸基を含む。ヌクレオチドは、糖、リン酸及び／または塩基部分が非修飾であるか、または修飾され得る（互換的にヌクレオチドアナログ、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドなどとも称される；例えばＵｓｍａｎ及びＭｃＳｗｉｇｇｅｎ、上記参照； Ｅｃｋｓｔｅｉｎ他、国際特許ＰＣＴ公告ＷＯ９２／０７０６５号；Ｕｓｍａｎ他、国際特許ＰＣＴ公告ＷＯ９３／１５１８７号；Ｕｈｌｍａｎ ＆ Ｐｅｙｍａｎ、上記参照。全てが参照により本明細書に取り込まれる）。Ｌｉｍｂａｃｈ， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：２１８３， １９９４に概説される通り、当該技術分野で知られる修飾核酸塩基には複数の例が存在する。核酸分子に導入され得る塩基修飾の非限定的例の幾つかには、ヒポキサンチン、プリン、ピリジン－４－オン、ピリジン－２－オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６－トリメトキシベンゼン、３－メチルウラシル、ジヒドロウラシル、ナフチル、アミノフェニル、５－アルキルシチジン（例えば、５－メチルシチジン）、５－アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５－ハロウリジン（例えば、５－ブロモウリジン）または６－アザピリミジンまたは６－アルキルピリミジン（例えば、６－メチルウリジン）、プロピンなどが挙げられる（Ｂｕｒｇｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：１４０９０， １９９６； Ｕｈｌｍａｎ ＆ Ｐｅｙｍａｎ、上記参照）。この態様における「修飾塩基」は、１’位のアデニン、グアニン、シトシン及びウラシル以外、またはそれらの均等物以外のヌクレオチド塩基を意味する。
本明細書で用いられる「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、ヌクレオ塩基、ペントース環、またはリン酸基への１つまたは複数の修飾を有するヌクレオチドを指す。例えば修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸及びシチジン一リン酸を含むリボヌクレオチド、ならびにデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸及びデオキシシチジン一リン酸を含むデオキシリボヌクレオチドを排除する。修飾は、メチルトランスフェラーゼなど、ヌクレオチドを修飾する酵素による修飾から生じる天然由来のものを包含する。修飾ヌクレオチドとしては、合成または非天然由来ヌクレオチドも挙げられる。ヌクレオチドにおける合成または天然由来の修飾には、２’ 修飾を有するもの、例えば２’－メトキシエトキシ、２’－フルオロ、２’－アリル、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキシエチル］、４’－チオ、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’－架橋、４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’－架橋、２’－ＬＮＡ、または他の二環式もしくは「架橋」ヌクレオシドアナログ、及び２’－Ｏ－（Ｎ－メチルカルバマート）、または塩基類似体を含むものがある。本開示に関して記載された２’修飾ヌクレオチドに関連して、「アミノ」は、２’－ＮＨ２または２’－Ｏ－ＮＨ２を意味し、それらは修飾であっても、または非修飾でもあり得る。そのような修飾基は、例えばＥｃｋｓｔｅｉｎらの米国特許第５，６７２，６９５号、及びＭａｔｕｌｉｃ－Ａｄａｍｉｃらの米国特許第６，２４８，８７８号に記載される。本発明の「修飾ヌクレオチド」は、先に記載されたヌクレオチドアナログも包含し得る。
本開示の核酸分子に関して、修飾は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の一方または両方の鎖上でこれらの薬剤にパターンとして存在していてもよい。本明細書で用いられる「交互の位置」は、１つおきのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであるパターン、またはｄｓＲＮＡの鎖の決まった長さでそれぞれの修飾ヌクレオチドの間に非修飾ヌクレオチド（例えば、非修飾リボヌクレオチド）が存在するパターン（例えば、５’－ＭＮＭＮＭＮ－３’；３’－ＭＮＭＮＭＮ－５’；（ここでＭは、修飾ヌクレオチドであり、Ｎは、非修飾ヌクレオチドである））を指す。修飾パターンは、例えば本明細書に記載された通り、位置付番の慣例に従って５’または３’末端のいずれかの最初のヌクレオチド位置から出発する（ある特定の実施形態において、１位は、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の予測されたダイサー切断事象に続く鎖の末端残基に関連して割り当てられ、つまり１位は、いつも本発明の前処理剤の３’末端または５’末端残基を構成するとは限らない）。交互位置にある修飾ヌクレオチドのパターンは、鎖の全長に存在し得るが、ある特定の実施形態においては、それぞれ少なくとも２、３、４、５、６または７の修飾ヌクレオチドを含む少なくとも４、６、８、１０、１２、１４のヌクレオチドを含む。本明細書で用いられる「位置の交互の対」は、２つの連続する修飾ヌクレオチドが、ｄｓＲＮＡの鎖の決まった長さで２つの連続する非修飾ヌクレオチドにより分離されたパターン（例えば、５’－ＭＭＮＮＭＭＮＮＭＭＮＮ－３’；３’－ＭＭＮＮＭＭＮＮＭＭＮＮ－５’；（ここでＭは、修飾ヌクレオチドであり、Ｎは、非修飾ヌクレオチドである））を指す。修飾パターンは、本明細書に記載されたものなど、位置付番の慣例に従って５’または３’末端のいずれかの最初のヌクレオチド位置から出発する。交互位置にある修飾ヌクレオチドのパターンは、鎖の全長に存在し得るが、好ましくは、それぞれ少なくとも４、６、８、１０、１２、または１４の修飾ヌクレオチドを含む少なくとも８、１２、１６、２０、２４、２８のヌクレオチドを含む。先の修飾パターンは例示であり、本発明の範囲の限定を意図しないことを強調する。
本明細書で用いられる「塩基類似体」は、核酸二重鎖に組み込まれ得る修飾ヌクレオチド内のヌクレオチド糖部分の１’位（または核酸二重鎖に組み込まれ得るヌクレオチド糖部分置換の同等位置）に位置する複素環部分を指す。本発明のｄｓＲＮＡにおいて、塩基類似体は、概して、一般的な塩基のグアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）を除くプリンまたはピリミジン塩基のいずれかである。塩基類似体は、ｄｓＲＮＡにおいて他の塩基または塩基類似体と二重鎖を形成し得る。塩基類似体としては、本発明の化合物及び方法において有用なもの、例えば参照により本明細書に取り込まれる、Ｂｅｎｎｅｒへの米国特許第５，４３２，２７２号及び同第６，００１，９８３号、ならびにＭａｎｏｈａｒａｎへの米国特許出願公開第２００８０２１３８９１号に開示されたものが挙げられる。塩基の非限定的な例としては、ヒポキサンチン（Ｉ）、キサンチン（Ｘ）、３β－Ｄ－リボフラノシル－（２，６－ジアミノピリミジン）（Ｋ）、３－β－Ｄ－リボフラノシル－（１－メチル－ピラゾロ［４，３－ｄ］ピリミジン－５，７（４Ｈ，６Ｈ）－ジオン）（Ｐ）、イソ－シトシン（イソ－Ｃ）、イソグアニン（イソ－Ｇ）、１－β－Ｄ－リボフラノシル－（５－ニトロインドール）、１－β－Ｄ－リボフラノシル－（３－ニトロピロール）、５－ブロモウラシル、２－アミノプリジン、４－チオ－ｄＴ、７－（２－チエニル）－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン（Ｄｓ）及びピロール－２－カルバルデヒド（Ｐａ）、２－アミノ－６－（２－チエニル）プリン（Ｓ）、２－オキソピリジン（Ｙ）、ジフルオロトリル、４－フルオロ－６－メチルベンゾイミダゾール、４－メチルベンゾイミダゾール、３－メチルイソカルボスチリル（３－ｍｅｔｈｙｌ ｉｓｏｃａｒｂｏｓｔｙｒｉｌｙl）、５－メチルイソカルボスチリル（５－ｍｅｔｈｙｌ ｉｓｏｃａｒｂｏｓｔｙｒｉｌｙｌ）、及び３－メチル－７－プロピニルイソカルボスチリル（３－ｍｅｔｈｙｌ－７－ｉｓｏｃａｒｂｏｓｔｙｒｉｌｙｌ）、７－アザインドリル、６－メチル－７－アザインドリル、イミジゾピリジニル、９－メチル－イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリル（ｉｓｏｃａｒｂｏｓｔｙｒｉｌｙｌ）、７－プロピニルイソカルボスチリル（ｐｒｏｐｙｎｙｌ ｉｓｏｃａｒｂｏｓｔｙｒｉｌｙｌ）、ピロピニル－７－アザインドリル、２，４，５－トリメチルフェニル、４－メチルインドリル、４，６－ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラセニル、ペンタセニル、及びそれらの構造誘導体が挙げられる（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ５９：７２３８－７２４２ （１９９４）； Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２８（１５）：２９１１－２９１４ （２０００）； Ｍｏｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１９：２０５６－２０５７ （１９９７）； Ｍｏｒａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２１：２３２３－２３２４ （１９９９）； Ｇｕｃｋｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１８：８１８２－８１８３ （１９９６）； Ｍｏｒａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２２（６）：１００１－１００７ （２０００）； ＭｃＭｉｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２１：１１５８５－１１５８６ （１９９９）； Ｇｕｃｋｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ６３：９６５２－９６５６ （１９９８）； Ｍｏｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９４：１０５０６－１０５１１ （１９９７）； Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．， １：１９７－２０６ （２００２）； Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．， １： １６０５－１６１１ （２００１）； Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２２（３２）：７６２１－７６３２ （２０００）； Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ６７：５８６９－５８７５ （２００２）； Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１７：１０４３４－１０４４２ （１９９５）；及び米国特許第６，２１８，１０８号）。塩基類似体は、ユニバーサル塩基であってもよい。
本明細書で用いられる「ユニバーサル塩基」は、核酸二重鎖内に存在する場合には二重らせん構造（例えば、リン酸バックボーンの構造）を改変せずに１タイプを超える塩基と向き合って配置され得る、修飾ヌクレオチド内のヌクレオチド糖部分の１’位、またはヌクレオチド糖部分置換内の同等の位置にある複素環部分を指す。加えて、ユニバーサル塩基は、標的核酸に対して二重鎖を形成するように存在する一本鎖核酸の能力を破壊しない。標的核酸と二重鎖を形成するユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸の能力は、当業者に明白な方法（例えば、ＵＶ吸収、円偏光二色性、ゲルシフト、一本鎖ヌクレアーゼ感受性など）によりアッセイすることができる。加えて、二重鎖形成が観察される条件、例えば温度は、融解温度（Ｔｍ）が核酸二重鎖の安定性と相関するために、二重鎖安定性または形成を計測するために変動され得る。標的核酸に厳密に相補性がある参照一本鎖核酸と比較すると、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補性核酸を用いて形成された二重鎖よりも低いＴｍを有する標的核酸と二重鎖を形成する。しかしユニバーサル塩基が塩基と置換されて単一のミスマッチを生成する参照一本鎖核酸と比較すると、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチ塩基を有する核酸を用いて形成された二重鎖よりも高いＴｍを有する標的核酸と二重鎖を形成する。
幾つかのユニバーサル塩基は、塩基対形成条件下で、ユニバーサル塩基と、塩基のグアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）の全てとの間に水素結合を形成することにより塩基対合ができる。ユニバーサル塩基は、１つだけの単一相補性塩基で塩基対を形成する塩基ではない。二重鎖では、ユニバーサル塩基は、二重鎖の逆鎖上の塩基と向き合うＧ、Ｃ、Ａ、Ｔ、及びＵそれぞれと水素結合を全く形成しないか、１つの水素結合を形成するか、または１つを超える水素結合を形成することができる。好ましくは、ユニバーサル塩基は、二重鎖の逆鎖上の塩基と向き合う塩基と相互作用しない。二重鎖では、ユニバーサル塩基間の塩基対合は、リン酸バックボーンの二重らせん構造を改変せずに生じる。ユニバーサル塩基は、スタッキング相互作用により同じ核酸鎖上の隣接するヌクレオチド内の塩基とも相互作用し得る。特にユニバーサル塩基が二重鎖の逆鎖上の塩基に向き合って配置された塩基と任意の水素結合を形成しない状況では、そのようなスタッキング相互作用は、二重鎖を安定化させる。ユニバーサル結合するヌクレオチドの非限定的例としては、イノシン、１－β－Ｄ－リボフラノシル－５－ニトロインドール、及び／または１－β－Ｄ－リボフラノシル－３－ニトロピロールが挙げられる（Ｑｕａｎｙらへの米国特許出願公開第２００７０２５４３６２号；Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｎ ａｃｙｃｌｉｃ ５－ｎｉｔｒｏｉｎｄａｚｏｌｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅ ａｓ ａｍｂｉｇｕｏｕｓ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９５ Ｎｏｖ １１；２３（２１）：４３６３－７０； Ｌｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．， ３－Ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｌｅ ａｎｄ ５－ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ ａｓ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅｓ ｉｎ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ＰＣＲ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９５ Ｊｕｌ １１；２３（１３）：２３６１－６； Ｌｏａｋｅｓ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ， ５－Ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ ａｓ ａｎ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ ａｎａｌｏｇｕｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９４ Ｏｃｔ １１；２２（２０）：４０３９－４３）。
本明細書で用いられる「ループ」は、特定の一本鎖ヌクレオチド領域に隣接する相補性領域が、相補性領域の間の一本鎖ヌクレオチド領域が二重鎖形成またはワトソン・クリック型塩基対合から除外されるようにハイブリダイズする、一本鎖の核酸により形成された構造を指す。ループは、任意の長さの一本鎖ヌクレオチド領域である。ループの例としては、ヘアピン、ステムループ、または伸長ループのような構造の中に存在する不対ヌクレオチドが挙げられる
本明細書で用いられる、ｄｓＲＮＡに関連する「伸長ループ」は、一本鎖ループと、それに加えてループに隣接する１、２、３、４、５、６または最大２０の塩基対または二重鎖を指す。伸長されたループでは、５’側のループに隣接するヌクレオチドは、３’側のループに隣接するヌクレオチドと二重鎖を形成する。伸長ループは、ヘアピンまたはステムループを形成し得る。
本明細書で用いられる、ｄｓＲＮＡに関連する「テトラループ」は、隣接のワトソン・クリック型ハイブリダイズドヌクレオチドの安定性に寄与する安定した二次構造を形成する４つのヌクレオチドからなるループ（一本鎖領域）を指す。理論に限定されるわけではなく、テトラループは、スタッキング相互作用により隣接のワトソン・クリック型塩基対を安定化させることができる。加えて、テトラループ内の４つのヌクレオチド間の相互作用には、非ワトソン・クリック型塩基対合、スタッキング相互作用、水素結合、及び接触相互作用があるが、これらに限定されない（Ｃｈｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ １９９０ Ａｕｇ １６；３４６（６２８５）：６８０－２； Ｈｅｕｓ ａｎｄ Ｐａｒｄｉ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１ Ｊｕｌ １２；２５３（５０１６）：１９１－４）。テトラループは、４つのランダム塩基からなる簡単なモデルループ配列から予測されるよりも高い隣接二重鎖の融解温度（Ｔｍ）の上昇を付与する。例えばテトラループは、少なくとも２塩基の長さの二重鎖を含むヘアピンに、１０ｍＭ ＮａＨＰＯ４中での少なくとも５５℃の融解温度を付与し得る。テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びそれらの組み合わせを含み得る。ＲＮＡテトラループの例としては、テトラループのＵＮＣＧファミリー（例えば、ＵＵＣＧ）、テトラループのＧＮＲＡファミリー（例えば、ＧＡＡＡ）、及びＣＵＵＧテトラループが挙げられる。（Ｗｏｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９０ Ｎｏｖ；８７（２１）：８４６７－７１； Ａｎｔａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９１ Ｎｏｖ １１；１９（２１）：５９０１－５）。ＤＮＡテトラループの例としては、テトラループのｄ（ＧＮＮＡ）ファミリー（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ）、テトラループのｄ（ＧＮＲＡ））ファミリー、テトラループのｄ（ＧＮＡＢ）ファミリー、テトラループのｄ（ＣＮＮＧ）ファミリー、テトラループのｄ（ＴＮＣＧ）ファミリー（例えば、ｄ（ＴＴＣＧ））が挙げられる。（Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４１ （４８）， １４２８１ －１４２９２， ２００２．； ＳＨＩＮＪＩ ｅｔ ａｌ． 日本化学会講演予稿集第７８ ＮＯ．２；ｐ７３１ （２０００）．）
本明細書で用いられる「ｓｉＲＮＡ」という用語は、それぞれの鎖がＲＮＡ、ＲＮＡ類似体（複数可）またはＲＮＡとＤＮＡを含む、二本鎖核酸を指す。ｓｉＲＮＡは、１９～２３のヌクレオチドを含むか、または２１のヌクレオチドを含む。ｓｉＲＮＡは、典型的にはｓｉＲＮＡ内の二重鎖領域が１７～２１のヌクレオチド、または１９のヌクレオチドを含むように、各鎖の３’末端に２ｂｐのオーバーハングを有する。典型的にはｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、α１アンチトリプシン遺伝子／ＲＮＡの標的配列に十分に相補性がある。
第一の配列が、本明細書の第二の配列に関して「実質的に相補性がある」と呼ばれる場合、その２つの配列は、最終使用に最も関連する条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、完全に相補性であり得るか、またはそれらは、ハイブリダイゼーションの際に１つまたは複数、しかし一般には４、３、または２以下のミスマッチ塩基対を形成し得ない。しかし、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションの際に１つまたは複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されていれば、そのようなオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチと見なされないであろう。例えば２１ヌクレオチド長の一方のオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の他方のオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡは、長いほうのオリゴヌクレオチドが短い方のオリゴヌクレオチドに完全に相補性がある２１ヌクレオチドの配列を含む場合でも、本発明の目的では「完全に相補性」と呼ぶことができる。
本明細書で用いられる用語「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、２つのアンチパラレルで先に定義された通り実質的に相補性がある核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。二重鎖構造を形成する２つの鎖は、１つのより大きなＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、またはそれらは、別個のＲＮＡ分子であってもよい。別個のＲＮＡ分子であれば、そのようなｄｓＲＮＡは、多くの場合、ｓｉＲＮＡ（「低分子干渉ＲＮＡ」）またはＤｓｉＲＮＡ（「ダイサー基質ｓｉＲＮＡ」）と称される。２つの鎖がひとつのより大きな分子の一部であり、それゆえ、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端と各他方の鎖の５’末端の間の連続したヌクレオチド鎖により連結されている場合には、連結するＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」、「小ヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」と称される。２つの鎖が、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端と各他方の鎖の５’末端の間の連続したヌクレオチド鎖以外の手段により共有結合で連結される場合、連結する構造は、「リンカー」と称される。ＲＮＡ鎖は、同一または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最短鎖のヌクレオチド数から二重鎖内に存在する任意のオーバーハング数を引いた数である。二重鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは、１つまたは複数のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。加えて、本明細書で用いられる「ｄｓＲＮＡ」は、複数のヌクレオチドに実質的な修飾を含み、本明細書に開示された、または当該技術分野で知られる全てのタイプの修飾を含む、リボヌクレオチド、インターヌクレオシド結合、末端基、キャップ、及びコンジュゲート部分への化学修飾を含み得る。ｓｉＲＮＡ型またはＤｓｉＲＮＡ型分子中で用いられる任意のそのような修飾は、本明細書及び特許請求の範囲の目的では「ｄｓＲＮＡ」に包含される。
「二重鎖領域」という表現は、相補性または実質的に相補性があるオリゴヌクレオチド鎖間の二重鎖を可能にするワトソン・クリック型塩基対合または他の様式のいずれかにより互いに塩基対を形成する、２つの相補性または実質的に相補性があるオリゴヌクレオチド内の領域を指す。例えば２１のヌクレオチド単位を有するオリゴヌクレオチド鎖は、２１のヌクレオチド単位の別のオリゴヌクレオチドと塩基対合し得るが、各鎖の１９塩基だけが相補性または実質的に相補性があれば、「二重鎖領域」は１９の塩基対からなる。残りの塩基対は、例えば５’及び３’オーバーハングとして存在し得る。さらに二重鎖領域内では、１００％の相補性は必要とならず、実質的相補性が、二重鎖領域内で許容され得る。実質的相補性は、生物学的条件下でアニーリングが可能であるような鎖間の相補性を指す。２つの鎖が生物学的条件下でアニーリングが可能であるかどうかを経験的に決定する技法は、当該技術分野で周知である。あるいは２つの鎖を合成して、生物学的条件下で共に付加して、それらが互いにアニーリングするかどうかを決定することができる。
定義上、「十分に相補性がある」（例えば、「１００％相補性」と対比させて）は、ｄｓＲＮＡがＲＮＡｉ機構（例えば、ＲＩＳＣ複合体）またはプロセスにより標的ＲＮＡの破壊を惹起するのに十分な相補性を有することを条件に、本発明のｄｓＲＮＡと標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列（例えば、α１アンチトリプシンｍＲＮＡ）の間に存在する１つまたは複数のミスマッチを可能にする。ある特定の実施形態において、本発明の「十分に相補性がある」ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ配列と標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列の間に１、２、３または４またはそれを超えるミスマッチを抱えること可能である（例えば、特定のそのような実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列とアライメントされた場合に１、２、３、４、５または６またはそれを超えるミスマッチを抱える）。本発明の特定のｄｓＲＮＡ内のそのようなミスマッチの好ましい位置のさらなる検討は、以下により詳細に検討される。
本明細書で用いられる「ＤｓｉＲＮＡｍｍ」は、ＤｓｉＲＮＡのセンス及びアンチセンス鎖により形成された二重鎖の１、２、３または４のミスマッチ塩基対を含む「ミスマッチ耐性領域」を有するＤｓｉＲＮＡを指し、そのようなミスマッチがＤｓｉＲＮＡのどちらかの末端の２つの末端塩基対の間に存在する（つまり、それを含まない）位置（複数可）のＤｓｉＲＮＡ内に配置されている。ＤｓｉＲＮＡｍｍ組成物の例示的形態の構造及びミスマッチ配置を、以下により詳細に記載する。
多数の塩基で塩基対合する一本鎖核酸は、「ハイブリダイズする」と言われる。ハイブリダイゼーションは、典型的には生理学的または生物学的に適切な条件下（例えば、細胞内ではｐＨ７．２、１４０ｍＭカリウムイオン；細胞外ではｐＨ７．４、１４５ｍＭナトリウムイオン）で計測される。ハイブリダイゼーション条件は、一般に、一価カチオン及び生物学的に許容し得る緩衝剤を含み、二価カチオン、複合体アニオン、例えばグルコン酸カリウムのグルコン酸イオン、スクロースなどの非電荷種、及び試料中の水の活性を低下させる不活性ポリマー、例えばＰＥＧを含んでいても、または含んでいなくてもよい。そのような条件は、塩基対が形成し得る条件を包含する。
ハイブリダイゼーションは、二重鎖を形成している一本鎖核酸を解離するのに必要とされる温度、即ち、（融解温度：Ｔｍ）により測定される。ハイブリダイゼーション条件は、塩基対が形成し得る条件でもある、様々なストリンジェンシーの条件を用いて、ハイブリダイゼーションを計測することができる（例えば、Ｗａｈｌ， Ｇ． Ｍ． ａｎｄ Ｓ． Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３９９； Ｋｉｍｍｅｌ， Ａ． Ｒ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：５０７参照）。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含むであろう。５０塩基対長未満であると予期されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５～１０℃低くなければならず、ここでＴｍは、以下の式に従って計測される。１８塩基対長未満のハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ塩基＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ塩基＋Ｃ塩基の数）。１８～４９塩基対長のハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）－（６００／Ｎ）であり、ここでＮは、ハイブリッド内の塩基の数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣでの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。例えばハイブリダイゼーション計測緩衝液を、表１に示す。
ハイブリダイゼーション条件の有用な変形は、当業者に容易に明白となろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知であり、例えばＢｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ （Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０， １９７７）； Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｈｏｇｎｅｓｓ （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ７２：３９６１， １９７５）； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００１）； Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ （Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １９８７， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載される。
本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド鎖」は、一本鎖核酸分子である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド（例えば、２’ 修飾を有するヌクレオチド、合成塩基類似体など）またはそれらの組み合わせを含み得る。そのような修飾オリゴヌクレオチドは、例えば細胞内取込みの増加及びヌクレアーゼ存在下での安定性上昇などの特性により自然形態よりも好ましくあり得る。
本明細書で用いられる「リボヌクレオチド」という用語は、天然及び合成の非修飾及び修飾リボヌクレオチドを包含する。修飾には、オリゴヌクレオチド内の糖部分への変化、塩基部分への変化及び／またはリボヌクレオチド間の結合への変化がある。本明細書で用いられる「リボヌクレオチド」という用語は専ら、２’リボース環位置に単一プロトン基を有するヌクレオチドであるデオキシリボヌクレオチドを排除する。
本明細書で用いられる「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、天然及び合成の非修飾及び修飾デオキシリボヌクレオチドを包含する。修飾には、オリゴヌクレオチド内の糖部分への変化、塩基部分への変化及び／またはデオキシリボヌクレオチド間の結合への変化がある。本明細書で用いられる「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、ｄｓＲＮＡ剤のダイサー切断が可能でない修飾リボヌクレオチド、例えばダイサー切断により残基の結合を生じることが可能でない２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオアート修飾リボヌクレオチド残基なども包含する。
本明細書で用いられる「ＰＳ－ＮＡ」という用語は、ホスホロチオアート修飾ヌクレオチド残基を指す。それゆえ「ＰＳ－ＮＡ」という用語は、ホスホロチオアート修飾リボヌクレオチド（「ＰＳ－ＲＮＡ」）とホスホロチオアート修飾デオキシリボヌクレオチド（「ＰＳ－ＤＮＡ」）の両方を包含する。
本明細書で用いられる「ダイサー」は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ含有分子、例えば二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはプレマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を、通常は３’末端に二塩基オーバーハングを有する、１９～２５ヌクレオチド長の二本鎖核酸フラグメントに切断するＲＮａｓｅＩＩＩファミリー内のエンドリボヌクレアーゼを指す。本発明の特定のｄｓＲＮＡ（例えば、「ＤｓｉＲＮＡ」）に関して、本発明の薬剤のｄｓＲＮＡ領域により形成される二重鎖は、ダイサーにより認識され、該二重鎖の少なくとも１つの鎖上のダイサー基質である。ダイサーは、ＲＮＡ干渉経路の最初のステップを触媒し、その結果、標的ＲＮＡの分解をもたらす。ヒトダイサーのタンパク質配列は、参照により本明細書に取り込まれる登録番号ＮＰ＿０８５１２４号の下、ＮＣＢＩデータベースで提供される。
ダイサー「切断」は、以下の通り計測することができる（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８：１８７－２００ （２００８）参照）。ダイサー切断アッセイにおいて、ＲＮＡ二重鎖（１００ｐｍｏｌ）を、２０ｍＭトリスｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２の２０μＬを、１単位の組換えヒトダイサー（ストラタジーン、カリフォルニア州ラホヤ所在）と共に、またはそれを含まずに、３７℃で１８～２４時間インキュベートする。パフォーマＳＲ（Ｐｅｒｆｏｒｍａ ＳＲ）９６ウェルプレート（エッジ・バイオシステムズ、メリーランド州ゲイザースバーグ所在）を用いて、試料を脱塩する。ダイサー処理前及び処理後に二重鎖ＲＮＡのエレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ＥＳＩ－ＬＣＭＳ）を、サーモフィニガンＴＳＱ７０００、エクスキャリバー（Ｘｃａｌｉｂｕｒ）データシステム、プロマス（ＰｒｏＭａｓｓ）データ処理ソフトウエア及びパラダイムＭＳ４ ＨＰＬＣ(ミクロム・バイオリソーシズ、カリフォルニア州オーバーン所在）からなるオリゴＨＴＣＳシステム（ノバティア（Ｎｏｖａｔｉａ）、ニュージャージー州プリンストン所在；Ｈａｉｌ ｅｔ ａｌ．， ２００４）を用いて実施する。このアッセイにおいて、ダイサー切断が起こり、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ（即ち、２５～３０ｂｐ ｄｓＲＮＡ、好ましくは２６～３０ｂｐ ｄｓＲＮＡ）の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％が、より短いｄｓＲＮＡ（即ち、１９～２３ｂｐ ｄｓＲＮＡ、好ましくは２１～２３ｂｐ ｄｓＲＮＡ）に切断される。
本明細書で用いられる「ダイサー切断部位」は、ダイサーがｄｓＲＮＡを切断する部位（例えば、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤のｄｓＲＮＡ領域）を指す。ダイサーは、典型的にはｄｓＲＮＡのセンス及びアンチセンス鎖の両方を切断する２つのＲＮａｓｅＩＩＩドメインを含む。ＲＮａｓｅＩＩＩドメインとＰＡＺドメインとの平均距離が、生成する短い二本鎖核酸フラグメントの長さを決定し、この距離は変動し得る（Ｍａｃｒａｅ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１１： １９５－８）。図１に示される通り、ダイサーは、アンチセンス鎖の３’末端から除去される２１番目のヌクレオチドと２２番目のヌクレオチドの間の一部位と、センス鎖の５’末端から除去される２１番目のヌクレオチドと２２番目のヌクレオチドの間の対応する部位と、にある２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有するアンチセンス鎖を有する本発明の特定の二本鎖リボ核酸を切断すると予測される。図１に示されたものとは異なるｄｓＲＮＡ分子の予測された、そして／または優先的なダイサー切断部位（複数可）は、Ｍａｃｒａｅらに記載されたものなど、技術的に認識された方法により同様に特定され得る。図１に示されたダイサー切断事象は、２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡを生成するが、ｄｓＲＮＡ（例えば、ＤｓｉＲＮＡ）のダイサー切断が、１９～２３ヌクレオチド長のダイサー処理されたｓｉＲＮＡ長を生成し得ることが注目される。実際に、ある特定の実施形態において、二本鎖ＤＮＡ領域は、２１量体よりもむしろ典型的には非好適な１９量体または２０量体ｓｉＲＮＡの優先的ダイサー切除を指示する目的で、ｄｓＲＮＡ内に含まれ得る。
ある特定の実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、ダイサー基質ｓｉＲＮＡ（「ＤｓｉＲＮＡ」）である。ＤｓｉＲＮＡは、ダイサー基質でない阻害性核酸（「非ＤｓｉＲＮＡ」）に比較して特定の利点を有し得る。そのような利点としては、各阻害核酸が同じ濃度の哺乳動物細胞の阻害活性に向けて適切に配合及び評価された場合に、非ＤｓｉＲＮＡに比較した場合のＤｓｉＲＮＡによる効果期間の増加、及び非ＤｓｉＲＮＡ（例えば、１９～２３量体 ｓｉＲＮＡ）に比較した場合のＤｓｉＲＮＡによる阻害活性の上昇が挙げられるが、これらに限定されない（後者のシナリオでは、ＤｓｉＲＮＡは、非ＤｓｉＲＮＡよりも効力があると特定されるであろう）。非ＤｓｉＲＮＡに比較したＤｓｉＲＮＡの能力増強の検出は、多くの場合、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）へおよそ３０～７０％のノックダウン活性を誘発するＤｓｉＲＮＡをもたらす配合濃度（例えば、ｄｓＲＮＡのトランスフェクション濃度）で最も容易に実現される。活性ＤｓｉＲＮＡでは、そのようなレベルのノックダウン活性は、最も多くの場合、適切に配合された１ｎＭ以下のインビトロ哺乳動物細胞ＤｓｉＲＮＡトランスフェクション濃度で実現され、ある特定の例において、２００ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、１０ｐＭ以下、５ｐＭ以下、または１ｐＭ以下のＤｓｉＲＮＡトランスフェクション濃度で観察される。実際に、標的ＲＮＡの３０～７０％ノックダウンが観察される正確な濃度のＤｓｉＲＮＡ間の変動性により、有効濃度範囲でＤｓｉＲＮＡ及び非ＤｓｉＲＮＡの阻害活性を評価することによるＩＣ５０曲線の構成が、非ＤｓｉＲＮＡ阻害剤に比較したＤｓｉＲＮＡの能力増強を検出する好ましい方法である。
本明細書で用いられる「オーバーハング」は、ｄｓＲＮＡの５’末端または３’末端に１または複数の自由末端を有する二重鎖の状況での不対合ヌクレオチドを指す。ある特定の実施形態において、オーバーハングは、アンチセンス鎖またはセンス鎖上の３’または５’オーバーハングである。幾つかの実施形態において、オーバーハングは、１～６ヌクレオチド、任意で１～５、１～４、１～３、１～２、２～６、２～５、２～４、２～３、３～６、３～５、３～４、４～６、４～５、５～６ヌクレオチド、または１、２、３、４、５もしくは６ヌクレオチドの長さを有する３’オーバーハングである。「平滑」または「平滑末端」は、ｄｓＲＮＡのそのような末端に不対合ヌクレオチドを有さないこと、即ちヌクレオチドオーバーハングを有さないことを意味する。明瞭にするために、ｓｉＲＮＡの３’末端または５’末端にコンジュゲートされた化学的キャップまたは非ヌクレオチド化学部分は、ｓｉＲＮＡがオーバーハングを有するか、または平滑末端であるかを決定する上では考慮されない。ある特定の実施形態において、本発明は、細胞内または哺乳動物体内のα１アンチトリプシン標的遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子であって、該ｄｓＲＮＡが、α１アンチトリプシン標的遺伝子の発現において形成されたｍＲＮＡの少なくとも一部に相補性がある相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含み、該相補性の領域が、３５ヌクレオチド長未満、任意で１９～２４ヌクレオチド長、または２５～３０ヌクレオチド長であり、該ｄｓＲＮＡが、α１アンチトリプシン標的遺伝子を発現する細胞と接触すると、α１アンチトリプシン標的遺伝子の発現を少なくとも１０％、２５％、または４０％阻害する、該ｄｓＲＮ分子を提供する。
本明細書で用いられる用語「ＲＮＡプロセシング」は、以下により詳細に記載される、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＲＮａｓｅ Ｈ経路の成分（例えば、ドローシャ、ダイサー、アルゴノート２または他のＲＩＳＣエンドリボヌクレアーゼ、及びＲＮａｓｅ Ｈ）により実施されるプロセシング活性を指す（以下の「ＲＮＡプロセシング」の節を参照）。この用語は、非ＲＩＳＣまたは非ＲＮａｓｅ Ｈ媒介プロセスを通したＲＮＡの５’キャッピング及びＲＮＡ分解の転写後プロセスと明白に識別される。そのようなＲＮＡの「分解」は、いくつかの形態、例えば複数のエンド－またはエキソ－ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｐ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ（１、２、３、４／５）、オリゴヌクレオチダーゼなど）の１つまたは複数によるＲＮＡ本体の一部または全ての脱アデニル化（３’ポリ（Ａ）テールの除去）及び／またはヌクレアーゼ消化で実施することができる。
「相同配列」は、遺伝子、遺伝子転写産物及び／または非コーディングポリヌクレオチドなどの１種または複数のポリヌクレオチド配列により共有されるヌクレオチド配列を意味する。例えば相同配列は、関連するが異なるタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子、例えば遺伝子ファミリーの異なるメンバー、異なるタンパク質エピトープ、異なるタンパク質アイソフォーム、または完全に異なる遺伝子、例えばサイトカイン及びその対応するレセプターなどにより共有されるヌクレオチド配列であり得る。相同配列は、非コーディングＤＮＡまたはＲＮＡ、調節配列、イントロン、及び転写制御または調節の部位などの２つ以上の非コーディングポリヌクレオチドにより共有されたヌクレオチド配列であり得る。相同配列は、１を超えるポリヌクレオチド配列により共有された保存配列領域も含み得る。部分的に相同性の配列もまた本発明により企図されるので（例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０など）、相同性が完全な相同性（例えば、１００％）である必要はない。実際に、本発明のｄｓＲＮＡ剤の設計及び使用は、本明細書に記載されたｄｓＲＮＡと完全な相補性を有するα１アンチトリプシンの標的ＲＮＡに対してのみならず、例えば９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％などでも前記ｄｓＲＮＡに対して相補性がある配列を有する標的α１アンチトリプシンＲＮＡに対しても、そのようなｄｓＲＮＡ剤を用いることの可能性を企図する。同様に、本明細書に記載された本発明のｄｓＲＮＡ剤が、当業者により容易に改変されて、例えばα１アンチトリプシンの特定の対立遺伝子バリアント（例えば、治療的関心の高い対立遺伝子）の、前記ｄｓＲＮＡ剤と標的α１アンチトリプシンＲＮＡとの相補性の程度を上昇させ得ることが企図される。実際に、標的α１アンチトリプシン配列に対して挿入、欠失、及び単一点突然変異を含むｄｓＲＮＡ剤配列もまた、阻害に効果的になり得る。あるいはヌクレオチドアナログの置換または挿入を含むｄｓＲＮＡ剤配列が、阻害に効果的になり得る。
配列同一性は、当該技術分野で知られる配列比較及びアライメントアルゴリズムにより計測することができる。２つの核酸配列（または２つのアミノ酸配列）の同一性％を計測するために、配列を比較目的でアライメントする（例えば、最適なアライメントのために第一の配列または第二の配列にギャップを導入することができる）。対応するヌクレオチド（またはアミノ酸）位置のヌクレオチド（またはアミノ酸残基）を、その後、比較する。第一の配列のある位置が、第二の配列の対応する位置と同じ残基で占有されていれば、その分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性％は、それらの配列が共有する同一位置の数の関数であり（即ち、相同性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）、任意で、導入されたギャップの数及び／または導入されたギャップの長さに合わせてそのスコアを減数する。
２つの配列間の配列比較及び同一性％計測は、数学的アルゴリズムを利用して完遂することができる。一実施形態において、アライメントが、十分な同一性を有するようにアライメントされた配列の特定部分で生成したが、低い同一性を有する部分では生成されなかった（即ち、ローカルアライメント）。配列比較のために用いられるローカルアライメントアルゴリズムの好ましい非限定的例は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３－７７にあるように改良されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：２２６４－６８のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－１０のＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。
別の実施形態、すなわちギャップアライメントにおいて、アライメントは、適当なギャップを導入することにより最適化され、同一性％は、アライメントされた配列（すなあわち、ギャップアライメント）の長さについて計測される。比較目的でギャップアライメントを得るために、ギャップのあるＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１７）：３３８９－３４０２に記載された通り利用することができる。別の実施形態、すなわちグローバルアライメントにおいて、アライメントは、適当なギャップを導入することにより最適化され、同一性％は、アライメントされた配列の全長について計測される（即ち、グローバルアライメント）。配列の全体的比較に用いられる数学的アルゴリズムの好ましい非限定的例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ， ＣＡＢＩＯＳ （１９８９）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウエアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するのにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表（ＰＡＭ１２０ ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを用いることができる。
ｄｓＲＮＡアンチセンス鎖とα１アンチトリプシンＲＮＡ配列の部分の間には、８０％を超える配列同一性、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらには１００％の配列同一性が好ましい。あるいはｄｓＲＮＡは、α１アンチトリプシンＲＮＡの一部とハイブリダイズすること（例えば、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２～１６時間ハイブリダイゼーションした後、洗浄）が可能なヌクレオチド配列（またはオリゴヌクレオチド配列）として機能的に定義され得る。追加の好ましいハイブリダイゼーション条件は、１×ＳＳＣ中で７０℃、もしくは１×ＳＳＣ、５０％ホルムアルデヒド中で５０℃でハイブリダイゼーションした後、０．３×ＳＳＣ中で７０℃で洗浄するか、または４×ＳＳＣ中で７０℃、もしくは４×ＳＳＣ、５０％ホルムアルデヒド中で５０℃でハイブリダイゼーションした後、１×ＳＳＣ中で６７℃で洗浄することを含む。５０塩基対長未満であることが予期されるハイブリッドの場合のハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５～１０℃低くなければならず、Ｔｍは、以下の式により決定される。１８塩基対長未満のハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。１８～４９塩基対長のハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）－（６００／Ｎ）であり、ここでＮは、ハイブリッド内の塩基の数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣでの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのストリンジェンシーな条件の追加の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ， ａｎｄ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， ｃｈａｐｔｅｒｓ ９ ａｎｄ １１、ならびにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９５， Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．１０及び６．３－６．４に示されている。同一ヌクレオチド配列の長さは、少なくとも１０、１２、１５、１７、２０、２２、２５、２７または３０塩基であり得る。
「保存された配列領域」は、ポリヌクレオチド内の１つまたは複数の領域のヌクレオチド配列が作製の間で、または１つの生体系、対象もしくは生物体と別の生体系、対象もしくは生物体の間で有意に変動しないことを意味する。ポリヌクレオチドは、コーディングＤＮＡ及びＲＮＡと非コーディングＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含み得る。
「センス領域」は、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス領域への相補性を有するｄｓＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。加えて、ｄｓＲＮＡ分子のセンス領域は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含み得る。
「アンチセンス領域」は、標的核酸配列への相補性を有するｄｓＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。加えて、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス領域は、ｄｓＲＮＡ分子のセンス領域への相補性を有する核酸配列を含む。
本明細書で用いられる「アンチセンス鎖」は、標的ＲＮＡの配列に相補性がある配列を有する一本鎖核酸分子を指す。アンチセンス鎖が、塩基類似体を有する修飾ヌクレオチドを含む場合、それは、必ずしも全長で相補性があるわけでないが、少なくとも標的ＲＮＡとハイブリダイズしなければならない。
本明細書で用いられる「センス鎖」は、アンチセンス鎖の配列に相補性がある配列を有する一本鎖核酸分子を指す。アンチセンス鎖が、塩基類似体を有する修飾ヌクレオチドを含む場合、センス鎖は、アンチセンス鎖の全長で相補性がある必要はないが、少なくともアンチセンス鎖と二重鎖を形成しなければならない。
本明細書で用いられる「ガイド鎖」は、標的ＲＮＡの配列に対して十分に相補性がある配列を有し、ＲＮＡ干渉をもたらすｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ含有分子の一本鎖核酸分子を指す。ダイサーによるｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ含有分子の切断後に、ガイド鎖のフラグメントが、ＲＩＳＣと会合されたままで、ＲＩＳＣ複合体の成分として標的ＲＮＡに結合し、ＲＩＳＣによる標的ＲＮＡの切断を促進する。本明細書で用いられるガイド鎖は、必ずしも連続する一本鎖核酸を指すわけでなく、好ましくはダイサーにより切断された部位に、不連続性を含み得る。ガイド鎖は、アンチセンス鎖である。
本明細書における「パッセンジャー鎖」は、ガイド鎖の配列に相補性がある配列を有するｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ含有分子のオリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書で用いられるパッセンジャー鎖は、必ずしも連続する一本鎖核酸を指すわけでなく、好ましくはダイサーにより切断された部位に、不連続性を含み得る。パッセンジャー鎖は、センス鎖である。
「標的核酸」は、発現、レベルまたは活性が調節される核酸配列を意味する。標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。α１アンチトリプシンを標的とする薬剤では、ある特定の実施形態において、該標的核酸は、α１アンチトリプシンＲＮＡであり、例えばある特定の実施形態において、α１アンチトリプシンｍＲＮＡである。α１アンチトリプシンＲＮＡの標的部位は、互換的に対応するｃＤＮＡ配列によっても参照され得る。α１アンチトリプシンのレベルは、α１アンチトリプシンの上流エフェクターを標的とすることを通して、標的とすることができ、または調節もしくは誤制御されたα１アンチトリプシンの影響は、α１アンチトリプシンシグナル伝達経路におけるα１アンチトリプシンの下流分子の標的化により調節することもできる。
「相補性」は、ある核酸が伝統的なワトソン・クリック型または他の非従来タイプのいずれかにより別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成し得ることを意味する。本発明の核酸分子に関連して、核酸分子とその相補性配列との結合自由エネルギーは、核酸の関連機能、例えばＲＮＡｉ活性を進行させるのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの計測は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， ＣＳＨ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ＬＩＩ ｐｐ． １２３－１３３； Ｆｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：９３７３－９３７７； Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０９：３７８３－３７８５参照）。相補性％は、第二の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン・クリック型塩基対合）を形成し得る核酸分子内の隣接残基の％率を示す（例えば、１０ヌクレオチドを有する第二の核酸配列に塩基対合している第一のオリゴヌクレオチド内の合計１０ヌクレオチドのうち５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドは、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％の相補性を表す）。「完全に相補性がある」は、核酸配列の隣接残基の全てが、第二の核酸配列内の隣接残基の同数と水素結合することを意味する。一実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、１つまたは複数の標的核酸分子またはその一部に相補性がある１９～３０（例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０またはそれを超える）ヌクレオチドを含む。
本明細書で用いられる、標的ＲＮＡまたはcＤＮＡ配列（例えば、α１アンチトリプシンｍＲＮＡ）に対して「十分に相補性がある」配列を有するｄｓＲＮＡ、例えばＤｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、そのｄｓＲＮＡがＲＮＡｉ機構（例えば、ＲＩＳＣ複合体）またはプロセスによる標的ＲＮＡ（ｃＤＮＡが引用される場合には、引用されたｃＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列）の破壊を惹起するのに十分な配列を有することを意味する。例えばＲＮＡｉ機構もしくはプロセスによる標的ＲＮＡの破壊を惹起する標的ＲＮＡもしくはｃＤＮＡ配列に対して「十分に相補性がある」ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ活性の適当なアッセイ（例えば、以下の実施例２に記載されたインビトロアッセイ）において標的ＲＮＡレベルの検出可能な低下を誘発するｄｓＲＮＡとして特定され得、またはさらなる例において、ＲＮＡｉ機構もしくはプロセスによる標的ＲＮＡの破壊を惹起する標的ＲＮＡもしくはｃＤＮＡ配列に十分に相補性があるｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ活性の適当なアッセイにおいて標的ＲＮＡレベルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の低下を生じるｄｓＲＮＡとして特定され得る。追加の例において、ＲＮＡｉ機構またはプロセスによる標的ＲＮＡの破壊を惹起する標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列に十分に相補性があるｄｓＲＮＡは、細胞または生物体における標的ＲＮＡまたはタンパク質レベルに関連して特定レベルの阻害活性の期間の評価に基づいて特定され得る。例えばＲＮＡｉ機構またはプロセスによる標的ＲＮＡの破壊を惹起する標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列に十分に相補性があるｄｓＲＮＡは、標的ｍＲＮＡレベルを、細胞または生物体への前記ｄｓＲＮＡの投与後少なくとも４８時間少なくとも２０％低下させることができるｄｓＲＮＡとして特定され得る。好ましくはＲＮＡｉ機構またはプロセスによる標的ＲＮＡの破壊を惹起する標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列に十分に相補性があるｄｓＲＮＡは、標的ｍＲＮＡレベルを、細胞もしくは生物体への前記ｄｓＲＮＡの投与後少なくとも７２時間少なくとも４０％、細胞もしくは生物体への前記ｄｓＲＮＡの投与後少なくとも４日、５日もしくは７日間少なくとも４０％、細胞もしくは生物体への前記ｄｓＲＮＡの投与後少なくとも４８時間少なくとも５０％、細胞もしくは生物体への前記ｄｓＲＮＡの投与後少なくとも７２時間少なくとも５０％、細胞もしくは生物体への前記ｄｓＲＮＡの投与後少なくとも４日、５日もしくは７日間少なくとも５０％、細胞もしくは生物体への前記ｄｓＲＮＡの投与後少なくとも４８時間少なくとも８０％、細胞もしくは生物体への前記ｄｓＲＮＡの投与後少なくとも７２時間少なくとも８０％、または細胞もしくは生物体への前記ｄｓＲＮＡの投与後少なくとも４日、５日もしくは７日間少なくとも８０％低下させることが可能なｄｓＲＮＡとして特定される。
ある特定の実施形態において、本発明の核酸（例えば、ＤｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）は、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列に「ハイブリダイズするのに十分に相補性がある」配列を有し、それにより標的ＲＮＡへの阻害作用を実現する。ハイブリダイゼーション、及び１つの核酸が別の核酸に対して十分に相補性があることでそれら２つの配列をハイブリダイズさせることが可能であるかを決定するために利用可能な条件を、以下により詳細に記載する。
本明細書で用いられる「細胞」は、通常の生物学的意味で用いられ、多細胞生物全体を指さず、例えば具体的にヒトは指さない。細胞は、生物体、例えば鳥類、植物、ならびに哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ、及びネコの体内に存在し得る。該細胞は、原核生物（例えば、細菌細胞）または真核生物（例えば、哺乳動物または植物の細胞）のものであり得る。該細胞は、全能性または多能性で分裂または非分裂の体細胞または生殖細胞株のものであり得る。該細胞は、配偶子もしくは胎芽、幹細胞、または完全に分化した細胞に由来することもでき、あるいはそれを含むことができる。ある特定の態様において、「細胞」という用語は、具体的には本開示の１つまたは複数のｄｓＲＮＡ分子を含む哺乳動物細胞、例えばヒト細胞を指す。特定の態様において、細胞は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ含有分子を処理して標的核酸のＲＮＡ干渉をもたらし、ＲＮＡｉに必要なタンパク質及びタンパク質複合体、例えばダイサー及びＲＩＳＣを含む。
「ＲＮＡ」は、少なくとも１、好ましくは少なくとも４、８及び１２のリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。少なくとも４、８または１２のＲＮＡ残基は、隣接し得る。「リボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡ，本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え技術で生成されたＲＮＡ、ならびに１つまたは複数のヌクレオチドの付加、置換及び／または改変により天然由来ＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡなどのＲＮＡを包含する。そのような改変は、例えばＲＮＡの１つまたは複数のヌクレオチドの、ｄｓＲＮＡの末端（複数可）または内部などへの非ヌクレオチド物質の付加を包含し得る。本発明のＲＮＡ分子内のヌクレオチドは、非天然由来ヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドなどの非標準的なヌクレオチドも含み得る。これらの改変されたＲＮＡは、類似体、または天然由来ＲＮＡの類似体と呼ぶことができる。
ある特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤（例えば、ｄｓＲＮＡ）は、「単離された」ＲＮＡｉ剤であり得、該ＲＮＡｉ剤が自然環境から単離（除去及び／または精製）されることを意味する。
幾つかの実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤（例えば、ｄｓＲＮＡ）は、「合成」ＲＮＡｉ剤であり得る。「合成」または「非天然」という用語は、（ｉ）機械を用いて合成されるか、または（ｉｉ）通常通りＲＮＡｉ剤を産生する細胞もしくは生物体に由来しない、ＲＮＡｉ剤（例えば、本開示のｄｓＲＮＡ）を指す。
「対象」は、移植細胞のドナーもしくはレシピエントである生物体、またはそれらの細胞自体を意味する。「対象」は、本発明のｄｓＲＮＡ剤が投与され得る生物体も指す。対象は、ヒトまたはヒト細胞をはじめとする哺乳動物または哺乳動物細胞であり得る。
「医薬的に許容し得る担体」という表現は、治療剤の投与のための担体を指す。例示的担体としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組み合わせが挙げられる。経口投与される薬物では、医薬的に許容し得る担体としては、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、着色剤及び防腐剤などの医薬的に許容し得る賦形剤が挙げられるが、これらに限定されない。適切な不活性希釈剤としては、炭酸ナトリウム及び炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カルシウム、ならびにラクトースが挙げられ、コーンスターチ及びアルギン酸が、適切な崩壊剤である。結合剤としては、デンプン及びゼラチンを挙げることができ、滑沢剤は、存在するならば、一般にはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであろう。所望なら錠剤は、胃腸管での吸収を遅延させるために、モノステアリン酸グリセリルまたは除ステアリン酸グリセリルなどの材料でコーティングされていてもよい。開示されたｄｓＲＮＡ組成物の医薬的に許容し得る担体は、リポソーム、カプシド、カプソイド、ポリマーナノカプセル、またはポリマーマイクロカプセルなどのミセル構造であり得る。
ポリマーナノカプセルまたはマイクロカプセルは、細胞内へのカプセル化または結合されたｄｓＲＮＡの輸送及び放出を容易にする。それらは、特にポリブチルシアノアクリラートをはじめとする、ポリマー及びモノマー材料を包含する。材料及び作製方法の概要は、公表されている（Ｋｒｅｕｔｅｒ， １９９１参照）。重合／ナノ粒子生成ステップにおいてモノマー及び／またはオリゴマー前駆体から形成されるポリマー材料は、それ自体が先行技術から公知であり、ナノ粒子製造の分野の当業者が通常の技能により適切に選択し得るポリマー材料の分子量及び分子量分布も同様に公知である。
「インビトロ」という用語は、当該技術分野で認識された意味を有し、例えば精製された試薬または抽出物、例えば細胞抽出物などが関与する。「インビボ」という用語もまた、当該技術分野で認識された意味を有し、例えば生存している細胞、例えば不死化細胞、初代細胞、細胞株、及び／または生物体内の細胞などが関与する。
本明細書で用いられる「処置」または「処置すること」は、疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の症状を治癒、療養、軽減、緩和、改変、矯正、寛解、改善する、またはそれらに影響を与えることを目的として、障害を有する患者への治療剤（例えば、ｄｓＲＮＡ剤、またはそれをコードするベクターもしくはトランスジーン）の適用もしくは投与、または患者から単離された組織または細胞株への治療剤の適用もしくは投与として定義される。「処置」または「処置すること」という用語は、薬剤を予防的に投与することに関連しても本明細書で用いられる。「有効用量」または「有効投与量」という用語は、所望の効果を実行する、または少なくとも部分的に実行するのに十分な量として定義される。「治療有効用量」という用語は、該疾患に既に罹患している患者の該疾患及びその合併症を治癒または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量として定義される。「患者」という用語は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒト及び他の哺乳動物対象を包含する。
本発明の様々な手法は、値、レベル、特色、特徴、特性などを、本明細書で互換的に「適当な対照」と称される「適切な対照」と比較することを含む少なくとも１つのステップを含む。「適切な対照」または「適当な対照」は、比較目的で有用である、当業者に熟知された対照または標準である。一実施形態において、「適切な対照」または「適当な対照」は、本明細書に記載されたＲＮＡｉ方法論を実施する前に計測される値、レベル、特色、特徴、特性などである。例えば、細胞または生物体への本発明のＲＮＡサイレンシング剤（例えば、ＤｓｉＲＮＡ）を導入する前に、転写速度、ｍＲＮＡレベル、翻訳速度、タンパク質レベル、生物学的活性、細胞の特徴または特性、遺伝子型、表現型などを計測することができる。別の実施形態において、「適切な対照」または「適当な対照」は、例えば正常な形質を示す、細胞または生物体、例えば対照または正常細胞もしくは生物体において決定される値、レベル、特色、特徴、特性などである。さらに別の実施形態において、「適切な対照」または「適当な対照」は、予め定義された値、レベル、特色、特徴、特性などである。
ＲＮＡｉの標的としてのα１アンチトリプシン
α１アンチトリプシン（ＡＡＴまたはＳｅｒｐｉｎａ１）は、セルピンスーパーファミリーに属するプロテアーゼ阻害剤である。それは、一般に、血清トリプシン阻害剤として知られる。α１アンチトリプシンは、非常に様々なプロテアーゼを阻害することから、α１プロテアーゼ阻害剤（Ａ１ＰＩ）とも称される（Ｇｅｔｔｉｎｓ ＰＧ． Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ １０２： ４７５１－８０４）。それは、組織を炎症細胞の酵素、特に好中球エラスターゼから防御し、１．５～３．５グラム／リットルの血中の基準範囲を有するが、急性炎症の際に、何倍ものレベル上昇が起こり得る（Ｋｕｓｈｎｅｒ， Ｍａｃｋｉｅｗｉｃｚ． Ａｃｕｔｅ－ｐｈａｓｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）． ｐｐ． ３－１９）。ＡＴＴがなければ、好中球エラスターゼは、肺の弾性に寄与するエラスチンを無制限に破壊し、成人の気腫またはＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、及び成人または小児の肝硬変などの呼吸器合併症を生じる。ＡＡＴ遺伝子の一方または両方のコピーに突然変異を有する個体は、α１アンチトリプシン欠損症に罹患する可能性があり、それは、肺及び肝臓の正常なエラスターゼ活性よりも大きいことによる、肺気腫または慢性肝臓疾患発症のリスクとして現れる。
α１アンチトリプシン（ＡＡＴまたはＳｅｒｐｉｎａ１）は、セルピンスーパーファミリーに属するプロテアーゼ阻害剤である。それは、一般に、血清トリプシン阻害剤として知られる。α１アンチトリプシンは、非常に様々なプロテアーゼを阻害することから、α１プロテアーゼ阻害剤（Ａ１ＰＩ）とも称される（Ｇｅｔｔｉｎｓ ＰＧ． Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ １０２： ４７５１－８０４）。それは、組織を炎症細胞の酵素、特に好中球エラスターゼから防御し、１．５～３．５グラム／リットルの血中の基準範囲を有するが、急性炎症の際に、何倍ものレベル上昇が起こり得る（Ｋｕｓｈｎｅｒ， Ｍａｃｋｉｅｗｉｃｚ． Ａｃｕｔｅ－ｐｈａｓｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）． ｐｐ． ３－１９）。ＡＴＴがなければ、好中球エラスターゼは、肺の弾性に寄与するエラスチンを無制限に破壊し、成人の気腫またはＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、及び成人または小児の肝硬変などの呼吸器合併症を生じる。ＡＡＴ遺伝子の一方または両方のコピーに突然変異を有する個体は、α１アンチトリプシン欠損症に罹患する可能性があり、それは、肺及び肝臓の正常なエラスターゼ活性よりも大きいことによる、肺気腫または慢性肝臓疾患発症のリスクとして現れる。
上述の通り、α１アンチトリプシン発現に関連する特定の疾患状態において、個体は、かなりの量のα１アンチトリプシンを産生するが、産生されたα１アンチトリプシンタンパク質のかなりの割合が、ミスフォールドされているか、またはタンパク質の機能を損なう突然変異を含む。ある特定のそのような例において、該個体は、体内の合成部位から作用部位に適宜、輸送され得ないミスフォールドタンパク質を産生している。
α１アンチトリプシン欠損症により生じる肝疾患は、そのようなミスフォールドタンパク質により誘発される可能性がある。α１アンチトリプシンの突然変異形態（例えば、３４２位（前処理された形態では３６６位）にグルタミン酸からリシンへの突然変異を抱える一般的なＰｉＺバリアント）が、肝臓細胞内で産生され（一般には肝臓内の肝細胞が多量の循環ＡＡＴを産生する）、ミスフォールド構成では、そのような形態は細胞から容易に輸送されない。これにより、肝臓細胞内にミスフォールドタンパク質が蓄積され、非限定的に慢性肝臓疾患、肝臓の炎症、肝硬変、肝線維症、及び／または肝細胞癌をはじめとする１種または複数の肝臓の疾患または障害を誘発する可能性がある。
ＲＮＡｉ治療薬は、α１アンチトリプシンの突然変異形態の影響を分子レベルで処置する魅力的な標的化手段を提供することが、新たに確認された。特に、本明細書で具体的に例示されるｄｓＲＮＡなどのＲＮＡｉ治療薬は、インビボで（例えば、脂質ナノ粒子及び／またはダイナミックポリコンジュゲート（ｄｙｎａｍｉｃ ｐｏｌｙｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）もしくはＧａｌＮＡｃコンジュゲートなどのコンジュゲートを通して）肝臓の細胞に送達される、特に良好な能力を示している。このように、本明細書に記載されたものなどの配合ＲＮＡｉ治療薬は、α１アンチトリプシンの突然変異形態に関連する疾患または障害（特に肝臓特有の疾患または障害、例えば慢性肝臓疾患、肝臓の炎症、肝硬変、肝線維症、及び／または肝細胞癌）を処置または予防するための魅力的な様式である。
他の組織における分子レベルのα１アンチトリプシンを標的とするＲＮＡｉ治療薬の使用も、企図される。最も注目すべきこととして、肺では、血清中のα１アンチトリプシンの突然変異した不活性形態の存在が、活性α１アンチトリプシンの血清レベルの欠損を引き起こして、好中球プロテアーゼによる障害を受けやすい宿主組織をもたらす可能性がある。その結果、そのような肺組織は、特に喫煙による損傷のリスクに見舞われ、本明細書に記載されたような肺に向けたＲＮＡｉ治療薬が、魅力的で正確な治療を提供する。
α１アンチトリプシンｃＤＮＡ及びポリペプチドの配列
公知のヒト及びマウスα１アンチトリプシンｃＤＮＡ及びポリペプチドの配列は、以下のものを含む：ヒトα１アンチトリプシンＮＭ＿０００２９５．４及び対応するヒトα１アンチトリプシンポリペプチド配列ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００２８６．３；ならびにマウス野生型α１アンチトリプシン配列ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００９２４６．３（ハツカネズミＣ５７ＢＬ／６セルピナ１ｄ）及び対応するマウスセルピナ１ｄ配列ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０３３２７２．１。
公知のヒト及びマウスα１アンチトリプシンｃＤＮＡ及びポリペプチドの配列は、以下のものを含む：ヒトα１アンチトリプシンＮＭ＿０００２９５．４及び対応するヒトα１アンチトリプシンポリペプチド配列ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００２８６．３；ならびにマウス野生型α１アンチトリプシン配列ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００９２４６．３（ハツカネズミＣ５７ＢＬ／６セルピナ１ｄ）及び対応するマウスセルピナ１ｄ配列ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０３３２７２．１。
α１アンチトリプシンレベルの評価
ある特定の実施形態において、α１アンチトリプシン標的配列のｄｓＲＮＡを介した阻害が評価される。そのような実施形態において、α１アンチトリプシンＲＮＡレベルは、当該技術分野で認識された方法（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロット、発現アレイなど）により、任意で本発明の抗α１アンチトリプシンｄｓＲＮＡの非存在への、そのような抗α１アンチトリプシンｄｓＲＮＡの存在下でのα１アンチトリプシンレベルの比較を通して、評価することができる。ある特定の実施形態において、抗α１アンチトリプシンｄｓＲＮＡの存在下でのα１アンチトリプシンレベルは、ビヒクル単独の存在下、無関係の標的ＲＮＡに向けられるｄｓＲＮＡの存在下、または任意の処置の非存在下で、観察されるレベルと比較される。
ある特定の実施形態において、α１アンチトリプシン標的配列のｄｓＲＮＡを介した阻害が評価される。そのような実施形態において、α１アンチトリプシンＲＮＡレベルは、当該技術分野で認識された方法（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロット、発現アレイなど）により、任意で本発明の抗α１アンチトリプシンｄｓＲＮＡの非存在への、そのような抗α１アンチトリプシンｄｓＲＮＡの存在下でのα１アンチトリプシンレベルの比較を通して、評価することができる。ある特定の実施形態において、抗α１アンチトリプシンｄｓＲＮＡの存在下でのα１アンチトリプシンレベルは、ビヒクル単独の存在下、無関係の標的ＲＮＡに向けられるｄｓＲＮＡの存在下、または任意の処置の非存在下で、観察されるレベルと比較される。
α１アンチトリプシンタンパク質のレベルが評価され得ること、ならびにα１アンチトリプシンタンパク質レベルが、異なる条件下で、α１アンチトリプシンＲＮＡレベル及び／またはｄｓＲＮＡがα１アンチトリプシン発現レベルを阻害する程度に直接的または間接的に関係し、このためα１アンチトリプシンタンパク質レベルを評価する当該技術分野で認識された方法（例えば、ウェスタンブロット、免疫沈降法、他の抗体に基づく方法など）もまた本発明のｄｓＲＮＡの阻害作用を検査するのに用いられ得ることも、認識される。
ある特定の実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡの効力は、特定レベルの標的遺伝子ノックダウンを実現するのに必要な標的細胞の細胞質内に存在するｄｓＲＮＡのコピー数を参照して決定される。例えばある特定の実施形態において、強力なｄｓＲＮＡは、細胞あたりのＲＩＳＣ負荷アンチセンス鎖１０００以下のコピー数で標的細胞の細胞質内に存在する場合に、標的ｍＲＮＡの５０％以上のノックダウンを誘発し得るものである。より好ましくは強力なｄｓＲＮＡは、細胞あたりのＲＩＳＣ負荷アンチセンス鎖５００以下のコピー数で標的細胞の細胞質内に存在する場合に、標的ｍＲＮＡの５０％以上のノックダウンを誘発し得るものである。任意で、強力なｄｓＲＮＡは、細胞あたりのＲＩＳＣ負荷アンチセンス鎖３００以下のコピー数で標的細胞の細胞質内に存在する場合に、標的ｍＲＮＡの５０％以上のノックダウンを誘発し得るものである。
さらなる実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡの効力は、同じ標的遺伝子内の同じ標的配列に向けた１９～２３量体ｄｓＲＮＡに関連して定義することができる。例えば、対応する１９～２３量体ｄｓＲＮＡに関して高い効力を有する本発明のＤｓｉＲＮＡは、能力差の検出が可能なほど十分に低濃度（例えば、本明細書に記載されたインビトロアッセイにおいて、細胞環境で１ｎＭ以下、細胞環境で１００ｐＭ以下、細胞環境で１０ｐＭ以下、細胞環境で１ｎＭ以下のトランスフェクション濃度；特に、用量反応曲線を作成すること、及びＤｓｉＲＮＡ／ｄｓＲＮＡに関連するＩＣ５０値を特定することが目的であれば、一定濃度範囲、例えば０．１ｐＭ～１０ｎＭでのそのようなアッセイの性能により能力差が最良に検出され得ることが認識されている）で本明細書に記載されたインビトロアッセイでアッセイされた場合に、対応する１９～２３量体ｄｓＲＮＡに比較して、標的遺伝子をさらに５％以上、さらに１０％以上、さらに２０％以上、さらに３０％以上、さらに４０％以上、またはさらに５０％以上減少させるＤｓｉＲＮＡであり得る。
ある特定の実施形態において、本発明の核酸は、該核酸が哺乳動物細胞に導入される場合に、α１アンチトリプシン標的ｍＲＮＡ発現を減少させるのに十分な量で投与される。例示的実施形態において、本発明のα１アンチトリプシン標的核酸を含まない適当な対照を投与された対応する哺乳動物細胞に比較して、α１アンチトリプシン標的ｍＲＮＡレベルが少なくとも５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上低下した場合に、α１アンチトリプシン標的ｍＲＮＡ発現の低下が生じたことが評価される。例示的実施形態において、α１アンチトリプシン標的ｍＲＮＡ発現の減少が適当な対照に比較して生じたかどうかを決定するのに用いられる哺乳動物細胞は、Ｈｕｈ７細胞であり、本発明のα１アンチトリプシン標的化核酸は、任意で本明細書に記載されたインビトロアッセイにおいて、細胞環境で１ｎＭ以下、細胞環境で１００ｐＭ以下、細胞環境で１０ｐＭ以下、細胞環境で１ｎＭ以下の濃度でのトランスフェクション（例えば、リポフェクタミン（商標）を用いる）を通して投与される。
α１アンチトリプシン阻害レベル及び／またはα１アンチトリプシンレベルが、間接的に評価されてもよく、例えば対象におけるポリープまたは腫瘍のサイズ、数及び／または成長もしくは拡大速度の低下の測定を利用して、本発明の二本鎖核酸のα１アンチトリプシンレベル及び／またはα１アンチトリプシン阻害効力を評価してもよい。
α１アンチトリプシンｍＲＮＡレベル及び発現の下方制御を評価するのに有用なモデル
治療剤を、選択された動物モデル（複数可）において試験することができる。例えば本明細書に記載されたｄｓＲＮＡ剤（または発現ベクターもしくはそれをコードするトランスジーン）を動物モデルに用いて、前記薬剤での処置の効力、毒性、または副作用を決定することができる。あるいは薬剤（例えば、治療剤）を動物モデルに用いて、そのような薬剤の作用機序を決定することができる。
治療剤を、選択された動物モデル（複数可）において試験することができる。例えば本明細書に記載されたｄｓＲＮＡ剤（または発現ベクターもしくはそれをコードするトランスジーン）を動物モデルに用いて、前記薬剤での処置の効力、毒性、または副作用を決定することができる。あるいは薬剤（例えば、治療剤）を動物モデルに用いて、そのような薬剤の作用機序を決定することができる。
細胞培養
本発明のｄｓＲＮＡ剤は、例えば以下の手順を利用して、インビボでの切断活性について試験することができる。本発明のｄｓＲＮＡ剤の標的となるα１アンチトリプシンｃＤＮＡ内のヌクレオチド配列は、先のα１アンチトリプシン配列内に示される。
本発明のｄｓＲＮＡ剤は、例えば以下の手順を利用して、インビボでの切断活性について試験することができる。本発明のｄｓＲＮＡ剤の標的となるα１アンチトリプシンｃＤＮＡ内のヌクレオチド配列は、先のα１アンチトリプシン配列内に示される。
本発明のｄｓＲＮＡ試薬を、Ｈｕｈ７または他の哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞株Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、ＤＵ１４５、Ｃａｌｕ３、ＳＷ４８０、Ｔ８４、ＰＬ４５、ＨｅＬａなど、及びマウス細胞株ＡＬＭ１２、Ｎｅｕｒｏ２ａなど）を用いた細胞培養で試験して、α１アンチトリプシンＲＮＡ及びα１アンチトリプシンタンパク質の阻害の程度を計測することができる。ある特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬（例えば、図１、及び本明細書の他の箇所で引用された例示的構造を参照）は、本明細書に記載されるように、α１アンチトリプシンターゲットに向けて選択される。例えば培養されたＨｕｈ７細胞または培養での他の形質転換もしくは非形質転換哺乳動物細胞への、適切なトランスフェクション剤によるこれらの試薬の送達後に、α１アンチトリプシンＲＮＡ阻害が測定される。標的α１アンチトリプシンＲＮＡの相対量が、リアルタイムＰＣＲによる増幅のモニタリング（例えば、ＡＢＩ７７００ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））を利用したＨＰＲＴ１、アクチンまたは他の適切な対照に対比させて測定される。同じ全長及び化学的性質を有する無関係の標的もしくは無作為化されたＤｓｉＲＮＡ対照に対して、または単に適当なビヒクル処置もしくは未処置対照に対して作製されたオリゴヌクレオチド配列の活性に対して、比較が行われる。一次または二次リード試薬が、ターゲット及び実施された最適化のために選択される。
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（リアルタイムＰＣＲによる増幅のモニタリング）及びｍＲＮＡのライトサイクラー定量
例えば大規模抽出用のアンビオンＲＮＡクエアス（Ｒｎａｑｕｅｏｕｓ）４－ＰＣＲ精製キット、または９６ウェルアッセイ用のプロメガＳＶ９６を用いて、全ＲＮＡをＤｓｉＲＮＡ送達後の細胞から調製する。タックマン分析では、例えば５’末端に共有結合されたレポーター色素ＦＡＭまたはＶＩＣ、及び３’末端にコンジュゲートされたクエンチャー色素ＴＡＭＲＡを用いて、二重標識プローブを合成する。例えば１０μＬの全ＲＮＡ、１００ｎＭの順プライマー、１００ｍＭの逆プライマー、１００ｎＭのプローブ、１×タックマンＰＣＲ反応緩衝液（ＰＥ－アプライド・バイオシステムズ）、５．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、０．２Ｕ ＲＮａｓｅ阻害剤（プロメガ）、０．０２５Ｕ アンプリタックゴールド（ＰＥ－アプライド・バイオシステムズ）のそれぞれならびに０．２Ｕ Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素（プロメガ）からなる５０μＬ反応物を用いて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００ シークエンスディテクターで、ＰＣＲ増幅を実施する。熱サイクル条件は、４８℃で３０分、９５℃で１０分、その後、９５℃で１５秒と６０℃で１分を４０サイクルからなり得る。標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡレベルの定量は、系列希釈された細胞トータルＲＮＡから生成された標準（３００、１００、３０、１０ｎｇ／ｒｘｎ）に比較し、そして例えば並行して実施された反応、または同じ試験管のタックマン反応のいずれかのＨＰＲＴ１ ｍＲＮＡに対して正規化することにより計測される。
例えば大規模抽出用のアンビオンＲＮＡクエアス（Ｒｎａｑｕｅｏｕｓ）４－ＰＣＲ精製キット、または９６ウェルアッセイ用のプロメガＳＶ９６を用いて、全ＲＮＡをＤｓｉＲＮＡ送達後の細胞から調製する。タックマン分析では、例えば５’末端に共有結合されたレポーター色素ＦＡＭまたはＶＩＣ、及び３’末端にコンジュゲートされたクエンチャー色素ＴＡＭＲＡを用いて、二重標識プローブを合成する。例えば１０μＬの全ＲＮＡ、１００ｎＭの順プライマー、１００ｍＭの逆プライマー、１００ｎＭのプローブ、１×タックマンＰＣＲ反応緩衝液（ＰＥ－アプライド・バイオシステムズ）、５．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、０．２Ｕ ＲＮａｓｅ阻害剤（プロメガ）、０．０２５Ｕ アンプリタックゴールド（ＰＥ－アプライド・バイオシステムズ）のそれぞれならびに０．２Ｕ Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素（プロメガ）からなる５０μＬ反応物を用いて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００ シークエンスディテクターで、ＰＣＲ増幅を実施する。熱サイクル条件は、４８℃で３０分、９５℃で１０分、その後、９５℃で１５秒と６０℃で１分を４０サイクルからなり得る。標的α１アンチトリプシンｍＲＮＡレベルの定量は、系列希釈された細胞トータルＲＮＡから生成された標準（３００、１００、３０、１０ｎｇ／ｒｘｎ）に比較し、そして例えば並行して実施された反応、または同じ試験管のタックマン反応のいずれかのＨＰＲＴ１ ｍＲＮＡに対して正規化することにより計測される。
ウェスタンブロット
細胞タンパク質抽出物は、標準のマイクロ調製技術を用いて（例えば、ＲＩＰＡ緩衝液を使用する）、または好ましくはＮＥ－ＰＥＲ核及び細胞質抽出キット（ＮＥ－ＰＥＲ Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）キット（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）などの方法により核タンパク質を抽出することにより、調製することができる。細胞タンパク質抽出物をトリス－グリシンポリアクリルアミドゲルに添加し、膜上で移動させる。例えば５％脱脂乳と共に１時間、その後一次抗体と共に４℃で１６時間インキュベーションすることにより、非特異的結合を遮断することができる。洗浄後に二次抗体を、例えば室温で１時間適用し（１：１０，０００希釈）、バーサドック（ＶｅｒｓａＤｏｃ）画像システムでシグナルを検出する。
細胞タンパク質抽出物は、標準のマイクロ調製技術を用いて（例えば、ＲＩＰＡ緩衝液を使用する）、または好ましくはＮＥ－ＰＥＲ核及び細胞質抽出キット（ＮＥ－ＰＥＲ Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）キット（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）などの方法により核タンパク質を抽出することにより、調製することができる。細胞タンパク質抽出物をトリス－グリシンポリアクリルアミドゲルに添加し、膜上で移動させる。例えば５％脱脂乳と共に１時間、その後一次抗体と共に４℃で１６時間インキュベーションすることにより、非特異的結合を遮断することができる。洗浄後に二次抗体を、例えば室温で１時間適用し（１：１０，０００希釈）、バーサドック（ＶｅｒｓａＤｏｃ）画像システムでシグナルを検出する。
いくつかの細胞培養システムにおいて、カチオン性脂質が培養細胞へのオリゴヌクレオチドの生物学的利用度を向上させることが示されている（Ｂｅｎｎｅｔ， ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ４１， １０２３－１０３３）。一実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、細胞培養実験のためにカチオン性脂質と複合体化される。ｄｓＲＮＡとカチオン性脂質との混合物を、細胞に添加する直前に無血清ＯｐｔｉＭＥＭ（インビトロジェン）で調製する。ＯｐｔｉＭＥＭを室温（約２０～２５℃）まで加温し、カチオン性脂質を最終的な所望の濃度まで添加する。ｄｓＲＮＡ分子をＯｐｔｉＭＥＭに所望の濃度まで添加して、該溶液を希釈されたｄｓＲＮＡに添加し、室温で１５分間インキュベートする。用量反応実験では、ＲＮＡ複合体を、カチオン性脂質の添加前にＯｐｔｉＭＥＭに系列希釈する。
動物モデル
抗α１アンチトリプシンｄｓＲＮＡ剤の効力を、動物モデルで評価することができる。当該技術分野で知られる肝臓の疾患、病状、または障害の動物モデルを、抗α１アンチトリプシンｄｓＲＮＡの効力、能力、毒性などの評価に用いることができる。α１アンチトリプシンによる肝臓疾患の例示的動物モデルは、ヒトα１アンチトリプシン突然変異体Ｚタンパク質ＰｉＺを発現するトランスジェニックマウスであり、それは、ヒト肝臓疾患を再現し、炎症、高レベルのアポトーシス及びオートファジー、増殖促進、ならびに肝臓前駆細胞の発達促進を示す（そのようなモデルの挙動は、肝臓疾患の処置において抗α１アンチトリプシンｄｓＲＮＡと併用した抗酸化剤の使用も示唆する；Ｍａｒｃｕｓ ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｅｒ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ２３７： １１６３－１１７２； Ｔｅｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８６： Ｇ８５１－６２； Ｒｕｄｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３９： １０４８－５５； Ｂｒｕｎｔ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｎｕｔｒ ５１： ６２６－３０）。そのようなマウスは、例えばセントルイス大学から入手可能である。これらの動物モデルは、本発明の組成物のアッセイのための供給源細胞または組織として用いることができる。そのようなモデルは、α１アンチトリプシン遺伝子発現を治療使用に向けて調整する上で、本発明のｄｓＲＮＡ組成物の効力の前臨床評価に使用すること、またはその使用に向けて適合させることもできる。
抗α１アンチトリプシンｄｓＲＮＡ剤の効力を、動物モデルで評価することができる。当該技術分野で知られる肝臓の疾患、病状、または障害の動物モデルを、抗α１アンチトリプシンｄｓＲＮＡの効力、能力、毒性などの評価に用いることができる。α１アンチトリプシンによる肝臓疾患の例示的動物モデルは、ヒトα１アンチトリプシン突然変異体Ｚタンパク質ＰｉＺを発現するトランスジェニックマウスであり、それは、ヒト肝臓疾患を再現し、炎症、高レベルのアポトーシス及びオートファジー、増殖促進、ならびに肝臓前駆細胞の発達促進を示す（そのようなモデルの挙動は、肝臓疾患の処置において抗α１アンチトリプシンｄｓＲＮＡと併用した抗酸化剤の使用も示唆する；Ｍａｒｃｕｓ ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｅｒ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ２３７： １１６３－１１７２； Ｔｅｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８６： Ｇ８５１－６２； Ｒｕｄｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３９： １０４８－５５； Ｂｒｕｎｔ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｎｕｔｒ ５１： ６２６－３０）。そのようなマウスは、例えばセントルイス大学から入手可能である。これらの動物モデルは、本発明の組成物のアッセイのための供給源細胞または組織として用いることができる。そのようなモデルは、α１アンチトリプシン遺伝子発現を治療使用に向けて調整する上で、本発明のｄｓＲＮＡ組成物の効力の前臨床評価に使用すること、またはその使用に向けて適合させることもできる。
そのようなモデル及び／または野生型マウスを、α１アンチトリプシンレベル、発現、α１アンチトリプシン関連の表現型、疾患または障害などの発生を阻害する本発明のｄｓＲＮＡ分子の効力を評価する際に用いることができる。これらのモデル、野生型マウス及び／または他のモデルを、前臨床試験で本発明のｄｓＲＮＡ分子の安全性／毒性及び効力を評価するのに同様に用いることができる。
本発明のα１アンチトリプシン標的化ｄｓＲＮＡの評価に有用な動物モデル系の具体的例としては、野生型マウス及びトランスジェニックＰｉＺ突然変異体モデルマウスが挙げられる。例示的インビボ実験では、本発明のｄｓＲＮＡが、１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲内の用量でそのようなマウスモデルに尾静脈注射され、あるいは反復用量が単一用量のＩＣ５０レベルで投与され、臓器試料（例えば、肝臓であるが、前立腺、腎臓、肺、膵臓、結腸、皮膚、脾臓、骨髄、リンパ節、乳房脂肪体などを挙げることもできる）が最終用量の投与後２４時間目に採取される。そのような臓器は、その後、用いられたモデルに応じて、マウス及び／またはヒトα１アンチトリプシンレベルについて評価される。作用期間もまた、例えば最後のｄｓＲＮＡ投与の１、４、７、１４、２１日目、またはそれ以降に検査することもできる。
α１アンチトリプシンを標的とするｄｓＲＮＡ
ある特定の実施形態において、本発明の抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡは、少なくとも２５ヌクレオチドの鎖長を有する。したがってある特定の実施形態において、抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡは、少なくとも２５ヌクレオチド長で３５ヌクレオチド以下、または最大５０ヌクレオチドまたはそれを超える長さの１オリゴヌクレオチド配列である第一の配列を含む。このＲＮＡ配列は、２６～３５、２６～３４、２６～３３、２６～３２、２６～３１、２６～３０、及び２６～２９ヌクレオチド長であり得る。この配列は、２７もしくは２８ヌクレオチド長、または２７ヌクレオチド長であり得る。ＤｓｉＲＮＡ剤の第二の配列は、生物学的条件下、例えば真核細胞の細胞質内で、第一の配列にアニーリングする配列であり得る。一般に第二のオリゴヌクレオチド配列は、第一のオリゴヌクレオチド配列と少なくとも１９の相補性塩基対を有し、より典型的には第二のオリゴヌクレオチド配列は、第一のオリゴヌクレオチド配列と２１以上の相補性塩基対、または２５以上の相補性塩基対を有する。一実施形態において、第二の配列は、第一の配列と同一の長さであり、ＤｓｉＲＮＡ剤は、平滑末端である。別の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ剤の末端は、１つまたは複数のオーバーハングを有する。
ある特定の実施形態において、本発明の抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡは、少なくとも２５ヌクレオチドの鎖長を有する。したがってある特定の実施形態において、抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡは、少なくとも２５ヌクレオチド長で３５ヌクレオチド以下、または最大５０ヌクレオチドまたはそれを超える長さの１オリゴヌクレオチド配列である第一の配列を含む。このＲＮＡ配列は、２６～３５、２６～３４、２６～３３、２６～３２、２６～３１、２６～３０、及び２６～２９ヌクレオチド長であり得る。この配列は、２７もしくは２８ヌクレオチド長、または２７ヌクレオチド長であり得る。ＤｓｉＲＮＡ剤の第二の配列は、生物学的条件下、例えば真核細胞の細胞質内で、第一の配列にアニーリングする配列であり得る。一般に第二のオリゴヌクレオチド配列は、第一のオリゴヌクレオチド配列と少なくとも１９の相補性塩基対を有し、より典型的には第二のオリゴヌクレオチド配列は、第一のオリゴヌクレオチド配列と２１以上の相補性塩基対、または２５以上の相補性塩基対を有する。一実施形態において、第二の配列は、第一の配列と同一の長さであり、ＤｓｉＲＮＡ剤は、平滑末端である。別の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ剤の末端は、１つまたは複数のオーバーハングを有する。
ある特定の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡ剤の第一及び第二のオリゴヌクレオチド配列は、別個のオリゴヌクレオチド鎖上に存在し、それらの鎖は化学合成することができ、典型的には化学合成される。幾つかの実施形態において、両方の鎖は、２６～３５ヌクレオチド長である。別の実施形態において、両方の鎖は、２５～３０または２６～３０ヌクレオチド長である。一実施形態において、両方の鎖は、２７ヌクレオチド長で、完全に相補性であり、平滑末端を有する。本発明のある特定の実施形態において、抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡの第一及び第二の配列は、別個のＲＮＡオリゴヌクレオチド（鎖）上に存在する。一実施形態において、一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖は、ダイサーの基質として働くことができる。別の実施形態において、遺伝子発現を阻害する際に二本鎖ＲＮＡ構造の効果を最大限にする方向に二本鎖ＲＮＡ構造に結合するようにダイサーを促す、少なくとも１つの修飾が存在する。本発明のある特定の実施形態において、抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ剤は、異なる長さの２つのオリゴヌクレオチド鎖で構成され、該抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡは、第一の鎖（センス鎖）の３’末端に平滑末端を、そして第二の鎖（アンチセンス鎖）の３’末端に３’オーバーハングを有する。ＤｓｉＲＮＡは、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）塩基置換を含み得る。
２つの別個のオリゴヌクレオチドを含む適切なＤｓｉＲＮＡ組成物は、化学結合基によりそれらのアニーリング領域の外側で化学結合され得る。多くの適切な化学結合基が、当該技術分野で知られており、使用することができる。適切な基は、ＤｓｉＲＮＡ上でのダイサー活性を遮断せず、標的遺伝子から転写されたＲＮＡの指示された破壊を妨害しないであろう。あるいは、ＤｓｉＲＮＡ組成物を構成する２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングする際にヘアピン構造が生成されるように、該２つの別個のオリゴヌクレオチドを第三のオリゴヌクレオチドによって結合させることができる。該ヘアピン構造は、ＤｓｉＲＮＡ上でのダイサー活性を遮断せず、標的遺伝子から転写されたＲＮＡの支持された破壊を妨害しないであろう。
アンチセンス鎖の各残基が標的分子内の残基と相補性になるように、ｄｓＲＮＡ分子を設計することができる。あるいは置換を分子内に生成して、前記分子の安定性を上昇させ、そして／または処理活性を増強することができる。置換は、鎖内に生成することができ、または鎖の末端の残基に生成することができる。ある特定の実施形態において、置換及び／または修飾は、ＤｓｉＲＮＡ剤中の特異的残基に生成される。そのような置換及び／または修飾としては、例えばＤｓｉＲＮＡ剤のセンス鎖の３’末端位置から数えて１、２及び３位の１つまたは複数の残基でのデオキシ修飾；ならびにＤｓｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の３’末端残基での２’－Ｏ－アルキル（例えば、２’－Ｏ－メチル）修飾の導入を挙げることができるが、そのような修飾は、活性ｓｉＲＮＡ剤を形成するために処理されるＤｓｉＲＮＡ剤の領域内に含まれるＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’部分のオーバーハング位置、及び該アンチセンス鎖の別の残基でも実施される。前述の修飾は、例示として示されており、いかなる様式でも限定を意図するものではない。本発明の抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ剤で実施され得る修飾及び置換のさらなる記述をはじめとする、好ましいＤｓｉＲＮＡ剤の構造のさらなる考察は、以下に見出され得る。
本発明のｄｓＲＮＡは、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分な相補性がある２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に実質的に相補性があって概ね完全に相補性がある相補性の領域を含み、その領域はα１アンチトリプシン標的遺伝子の発現の際に形成されるｍＲＮＡの配列から得られ、他方の鎖（センス鎖）は、適切な条件下で混和された時に２つの鎖がハイブリダイズして二重鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖に相補性がある領域を含む。一般にこの二重鎖構造は、１５～３５、任意で２５～３０、２６～３０、１８～２５、１９～２４、または１９～２１の塩基対長である。同様に、標的配列に相補性がある領域は、１５～３５、任意で１８～３０、２５～３０、１９～２４、または１９～２１のヌクレオチド長である。本発明のｄｓＲＮＡは、１つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハング（複数可）をさらに含み得る。ＤｓｉＲＮＡ（一般に少なくとも２５塩基対長）及びｓｉＲＮＡ（ある特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡの二重鎖構造は２０～２３塩基対長、任意で、具体的には２１塩基対である（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ ２０： ６８７７－６８８８））をはじめとする１５～３５塩基対長の二重鎖構造を含むｄｓＲＮＡがＲＮＡ干渉を誘導するのに効果的であり得ることが、確認されている。２０塩基対よりも短い二重鎖（例えば、１５、１６、１７、１８または１９塩基対の二重鎖）を有するｄｓＲＮＡが同様に効果的になる得ることも、確認されている。ある特定の実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、１９ヌクレオチド以上の長さの鎖を少なくとも１つ含み得る。ある特定の実施形態において、一方または両方の末端に表５、１０、１５または２０の配列の１つに相補性がある配列から数ヌクレオチドだけ引いた配列を含むより短いｄｓＲＮＡが、前記及び表２～３、７～８、１２～１３及び１７～１８に記載されたｄｓＲＮＡに比較して同じく効果的になり得ることも、合理的に予期され得る。このため、表５、１０、１５または２０の配列の１つに十分に相補性がある少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれを超える隣接するヌクレオチドの部分配列を含み、本明細書に記載されたアッセイにおいて完全な配列を含むｄｓＲＮＡからの５、１０、２０、２５、または３０％以下の阻害でα１アンチトリプシン標的遺伝子の発現を阻害する能力が異なる、ｄｓＲＮＡが本発明により企図される。一実施形態において、ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の末端は、１～５、任意で１～４、ある特定の実施形態において１または２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するある特定のｄｓＲＮＡ構造は、ｄｓＲＮＡ分子の両端に塩基対合した平滑末端を有する相当物に比較して優れた阻害特性を有する。
一実施形態において、α１アンチトリプシン遺伝子発現をダウンレギュレートまたは低減する本発明のｄｓＲＮＡ分子は、対象または生物体のα１アンチトリプシン関連疾患または障害（例えば、肝臓疾患）治療、予防または減少させるのに用いられる。
本発明の一実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の各配列は、独立して２５～３５ヌクレオチド長、具体的な実施形態において、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５ヌクレオチド長である。別の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ二重鎖は、独立して２５～３０塩基対（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）を含む。別の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の１つまたは複数の鎖は、独立して標的（α１アンチトリプシン）核酸分子に相補性がある１９～３５ヌクレオチド（例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５）を含む。ある特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、２５～３４ヌクレオチド長（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４ヌクレオチド長；任意で、対向する鎖の同族ヌクレオチドとのそのようなヌクレオチド塩基対の全て）の二重鎖ヌクレオチドの長さを有する。（本発明の例示的ＤｓｉＲＮＡ分子を、図１及び以下に示す）。
本発明のある特定の追加的実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の各オリゴヌクレオチドは、独立して２５～５３ヌクレオチド長、具体的な実施形態において２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２または５３ヌクレオチド長である。３０ヌクレオチド長を超える鎖を有するＤｓｉＲＮＡでは、利用可能な構造としては、１つの鎖だけが３０ヌクレオチド長を超えるもの（例えば、米国特許第８，３４９，８０９号参照）、または両方の鎖が３０ヌクレオチド長を超えるもの（例えば、ＷＯ２０１０／０８０１２９号参照）が挙げられる。安定化させる修飾（例えば、２’－Ｏ－メチル、ホスホロチオアート、ｄＮＴＰ塩基対をはじめとするデオキシリボヌクレオチドなど）を、本発明の任意の二本鎖核酸内に組み込むことができ、特に３０ヌクレオチド長を超える一方または両方の鎖を有するＤｓｉＲＮＡ内で、用いることができる。本発明の二本鎖核酸のガイド鎖は、例えば標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に相補性がある１５、１６、１７、１８または１９ヌクレオチドの配列を有さなければならないが、ガイド鎖の追加的配列（複数可）は、標的ＲＮＡに相補性がある必要はない。３０ヌクレオチドを超える鎖長を少なくとも１つ有する二本鎖核酸の末端構造は、機能的ｄｓＮＡを生成し続けながら変動する可能性があり、例えばガイド鎖の５’末端及びパッセンジャー鎖の３’末端は、５’－オーバーハング、平滑末端または３’オーバーハングを形成する場合があり（特定のｄｓＮＡ、例えば「一本鎖伸長」ｄｓＮＡでは、そのような５’または３’オーバーハングの長さは、１～４、１～５、１～６、１～１０、１～１５、１～２０または１～２５またはそれを超え得る）；同様にガイド鎖の３’末端及びパッセンジャー鎖の５’末端は、５’－オーバーハング、平滑末端または３’オーバーハングを形成する場合がある（特定のｄｓＮＡ、例えば「一本鎖伸長」ｄｓＮＡでは、そのような５’または３’オーバーハングの長さは、１～４、１～５、１～６、１～１０、１～１５、１～２０または１～２５またはそれを超え得る）。ある特定の実施形態において、パッセンジャー鎖の長さは、３１～４９ヌクレオチドであり、ガイド鎖の長さは、３１～５３ヌクレオチドであり、任意でガイド鎖の５’末端は、パッセンジャー鎖の３’末端と共に平滑末端（任意で塩基対合した平滑末端）を形成し、任意でガイド鎖の３’末端及びパッセンジャー鎖の５’末端が、１～４ヌクレオチド長の３’オーバーハングを形成している。例示的な「伸長」ダイサー基質構造は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１７３９７４号及び米国特許第８，３４９，８０９号に示されており、それらは両者とも、参照により本明細書に取り込まれる。ある特定の実施形態において、本発明のｄｓＮＡ分子の１つまたは複数の鎖は、独立して、標的（α１アンチトリプシン）核酸分子に相補性がある１９～３５のヌクレオチド（例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５）を含む。ある特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、２５～４９ヌクレオチド長（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９ヌクレオチド長；任意で、逆鎖の同族ヌクレオチドとのそのようなヌクレオチド塩基対の全て）の二重鎖ヌクレオチドの長さを有する。
ある特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ（ダイサー切断の前の、最初に形成されたままの状態）は、内部に含まれる１９、２０、２１、２２または２３塩基対配列よりも哺乳動物細胞内でのα１アンチトリプシン標的遺伝子発現を減少させる点でより効力がある。ある特定のそのような実施形態において、ダイサー切断前のＤｓｉＲＮＡは、内部に含まれる１９～２１量体よりも効力がある。任意で、ダイサー切断前のＤｓｉＲＮＡは、対称なｄＴｄＴオーバーハングで合成された（それによりｄＴｄＴオーバーハングを有する２１ヌクレオチド鎖長を有するｓｉＲＮＡを形成する）、内部に含まれる１９塩基対二重鎖よりも効力がある。ある特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに関して引用された２１ヌクレオチド標的配列の少なくとも１９ヌクレオチドを標的とする１９～２３量体ｓｉＲＮＡ（例えば、ｄＴｄＴオーバーハングを有する１９塩基対二重鎖）よりも効力がある（理論に束縛されるのを望むものではないが、ＤｓｉＲＮＡに関するそのような標的部位の識別は、ＤｓｉＲＮＡに関するＡｇｏ２切断部位の特定を通して特定され、ＤｓｉＲＮＡのＡｇｏ２切断部位が、ＤｓｉＲＮＡに関して決定されたら、任意の他の阻害性ｄｓＲＮＡについてのＡｇｏ２切断部位の特定を実施することができ、これらのＡｇｏ２切断部位をアライメントし、それにより複数のｄｓＲＮＡについて予測された標的ヌクレオチド配列のアライメントを決定することができる）。ある特定の関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに関して引用された２１ヌクレオチド標的配列の少なくとも２０ヌクレオチドを標的とする１９～２３量体ｓｉＲＮＡよりも効力がある。任意で、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに関して引用された同じ２１ヌクレオチド標的配列を標的とする１９～２３量体ｓｉＲＮＡよりも効力がある。ある特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに関して引用された同じ２１ヌクレオチド標的配列を標的とする任意の２１量体ｓｉＲＮＡよりも効力がある。任意で、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに関して引用された同じ２１ヌクレオチド標的配列を標的とする任意の２１または２２量体ｓｉＲＮＡよりも効力がある。ある特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに関して引用された同じ２１ヌクレオチド標的配列を標的とする任意の２１、２２または２３量体ｓｉＲＮＡよりも効力がある。先に記載された通り、そのような効力の評価は、１ｎＭ以下の濃度で適切に配合された（例えば、適当なトランスフェクション試薬と共に配合された）ｄｓＲＮＡで最も効果的に実施される。任意で、ＩＣ５０評価が、効果的な阻害濃度の範囲で活性を評価するのに実施され、それによりそのようにアッセイされたｄｓＲＮＡの相対的能力のロバストな比較が可能になる。
本発明のｄｓＲＮＡ分子を直接添加するか、あるいは脂質（例えば、カチオン性脂質）と複合体化すること、リポソームに封入すること、または他の方法で標的細胞もしくは組織へ送達することができる。核酸または核酸複合体は、バイオポリマーに組み込んで、または組み込まずに、エクスビボ、またはインビボで直接の皮膚適用、経皮適用、または注射により、関連組織へ局所投与することができる。特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、図１に示された配列及び以下の例示的構造を含む。そのような核酸分子の例は、本質的にこれらの図及び例示的構造において定義された配列からなる。さらに、そのような薬剤がＤｓｉＲＮＡ剤の修飾様式を示す以下の記載に従って修飾される場合、図１に記載された構成及び以下の例示的構造の化学修飾形態を、図１及び以下の例示的構造のｄｓＲＮＡ剤に関して記載された全ての用途において使用することができる。
別の態様において、本発明は、本発明の１種または複数のｄｓＲＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を提供する。１種または複数のｄｓＲＮＡ分子は、独立して同一または異なる部位を標的とすることができる。
α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ剤の修飾構造
特定の実施形態において、本発明の抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ剤は、以下の構造を有し得る。
特定の実施形態において、本発明の抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ剤は、以下の構造を有し得る。
１つのそのような実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインである。関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。
本発明のＤｓｉＲＮＡは、広範囲の修飾パターン（例えば伸長ＤｓｉＲＮＡ剤の中の、例えば２’－Ｏ－メチルＲＮＡパターン）を含み得る。本発明のＤｓｉＲＮＡの第二の鎖の特定の修飾パターンを、以下に表す。
一実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
別のそのような実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
別のそのような実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ７」または「Ｍ７」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。更なる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ６」または「Ｍ６」修飾パターンとも称される。
別の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ５」または「Ｍ５」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ４」または「Ｍ４」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ８」または「Ｍ８」修飾パターンとも称される。
別の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ３」または「Ｍ３」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ２」または「Ｍ２」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ１」または「Ｍ１」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ９」または「Ｍ９」修飾パターンとも称される。
別の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ１０」または「Ｍ１０」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ１１」または「Ｍ１１」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ１２」または「Ｍ１２」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ１３」または「Ｍ１３」修飾パターンとも称される。
別の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ２１」または「Ｍ２１」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ１４」または「Ｍ１４」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ１５」または「Ｍ１５」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ１６」または「Ｍ１６」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ１７」または「Ｍ１７」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ１８」または「Ｍ１８」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ１９」または「Ｍ１９」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ２０」または「Ｍ２０」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ２２」または「Ｍ２２」修飾パターンとも称される。
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ２２」または「Ｍ２２」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ２４」または「Ｍ２４」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ２５」または「Ｍ２５」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ２６」または「Ｍ２６」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ２７」または「Ｍ２７」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5’
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ２８」または「Ｍ２８」修飾パターンとも称される。
3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5’
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ２８」または「Ｍ２８」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ２９」または「Ｍ２９」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ３０」または「Ｍ３０」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ３１」または「Ｍ３１」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ３２」または「Ｍ３２」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ３４」または「Ｍ３４」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ３５」または「Ｍ３５」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ３７」または「Ｍ３７」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ３８」または「Ｍ３８」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ４０」または「Ｍ４０」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ４１」または「Ｍ４１」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ３６」または「Ｍ３６」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ４２」または「Ｍ４２」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ４３」または「Ｍ４３」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ４４」または「Ｍ４４」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ４５」または「Ｍ４５」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ４６」または「Ｍ４６」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ４７」または「Ｍ４７」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ４８」または「Ｍ４８」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ５２」または「Ｍ５２」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ５４」または「Ｍ５４」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ５５」または「Ｍ５５」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ５６」または「Ｍ５６」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ５７」または「Ｍ５７」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ５８」または「Ｍ５８」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ５９」または「Ｍ５９」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ６０」または「Ｍ６０」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ６１」または「Ｍ６１」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ６２」または「Ｍ６２」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ６３」または「Ｍ６３」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ６４」または「Ｍ６４」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ６５」または「Ｍ６５」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡであ る。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ６６」または「Ｍ６６」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ６７」または「Ｍ６７」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ６８」または「Ｍ６８」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ６９」または「Ｍ６９」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ７０」または「Ｍ７０」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ７１」または「Ｍ７１」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ７２」または「Ｍ７２」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ７３」または「Ｍ７３」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ７＊」または「Ｍ７＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ６＊」または「Ｍ６＊」修飾パターンとも称される。
別の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ５＊」または「Ｍ５＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ４＊」または「Ｍ４＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－８＊」または「Ｍ８＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ２＊」または「Ｍ２＊」修飾パターンとも称される。
別の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ１０＊」または「Ｍ１０＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ１１＊」または「Ｍ１１＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ１３＊」または「Ｍ１３＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ１４＊」または「Ｍ１４＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ１５＊」または「Ｍ１５＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ１６＊」または「Ｍ１６＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ１７＊」または「Ｍ１７＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ１８＊」または「Ｍ１８＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ１９＊」または「Ｍ１９＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、下線の引かれた残基は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ２０＊」または「Ｍ２０＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ２２＊」または「Ｍ２２＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ２４＊」または「Ｍ２４＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ２５＊」または「Ｍ２５＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ２６＊」または「Ｍ２６＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ２７＊」または「Ｍ２７＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ２８＊」または「Ｍ２８＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ２９＊」または「Ｍ２９＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ３４＊」または「Ｍ３４＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ３５＊」または「Ｍ３５＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ３７＊」または「Ｍ３７＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ３８＊」または「Ｍ３８＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ４０＊」または「Ｍ４０＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ４１＊」または「Ｍ４１＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ３６＊」または「Ｍ３６＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5’
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ４２＊」または「Ｍ４２＊」修飾パターンとも称される。
3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5’
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ４３＊」または「Ｍ４３＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ４４＊」または「Ｍ４４＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ４６＊」または「Ｍ４６＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ４７＊」または「Ｍ４７＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ４８＊」または「Ｍ４８＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ５２＊」または「Ｍ５２＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ５４＊」または「Ｍ５４＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ５５＊」または「Ｍ５５＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ５６＊」または「Ｍ５６＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ５７＊」または「Ｍ５７＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ５８＊」または「Ｍ５８＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ５９＊」または「Ｍ５９＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ６０＊」または「Ｍ６０＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ６１＊」または「Ｍ６１＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ６２＊」または「Ｍ６２＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ６３＊」または「Ｍ６３＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ６４＊」または「Ｍ６４＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ６５＊」または「Ｍ６５＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ６６＊」または「Ｍ６６＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ６７＊」または「Ｍ６７＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ６８＊」または「Ｍ６８＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ６９＊」または「Ｍ６９＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ７０＊」または「Ｍ７０＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ７１＊」または「Ｍ７１＊」修飾パターンとも称される。
さらなる実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ７２＊」または「Ｍ７２＊」修飾パターンとも称される。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらなる関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。この修飾パターンは、本明細書では「ＡＳ－Ｍ７３＊」または「Ｍ７３＊」修飾パターンとも称される。
追加の例示的アンチセンス鎖修飾としては、以下のものが挙げられ：
ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｆ」＝２’－フルオロＮＡ、「ｐ」＝ホスホロチオアート結合である。
特定の追加の実施形態において、本発明の選択されたｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、任意で５’末端で、伸長しており、それぞれ以下の通り表される、塩基「ＡＳ－Ｍ８」、「ＡＳ－Ｍ１７」及び「ＡＳ－Ｍ４８」修飾パターンの例示的な５’伸長を有し：
ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｆ」＝２’－フルオロＮＡ、太字で斜体の「Ａ」は、２’－フルオロアデニン残基を示す。
ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｆ」＝２’－フルオロＮＡ、太字で斜体の「Ａ」は、２’－フルオロアデニン残基を示す。
特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡのセンス鎖は、修飾されており、センス鎖修飾の具体的な例示形態を以下に示し、そのような修飾センス鎖が先に示されたＤｓｉＲＮＡのいずれかのセンス鎖の代わりに用いられて、上記のアンチセンス鎖でアニーリングした下記のセンス鎖を含むＤｓｉＲＮＡを作製する可能性が企図される。例示的なセンス鎖修飾パターンとしては、
が挙げられ、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｆ」＝２’－フルオロＮＡ、「ｐ」＝ホスホロチオアート結合である。
先の修飾パターンは、例えば伸長ＤｓｉＲＮＡ構造及びミスマッチ、ならびに／または下記のほどけたＤｓｉＲＮＡ構造に、組み込むこともできる。
別の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、ダイサー切断を方向づける働きがあるミスマッチ残基を１～３個有する同じ長さの鎖を含む（具体的には、第一及び第二の鎖が互いにアニーリングされる際に、３’末端残基から数えてＤｓｉＲＮＡの第一の鎖の１、２または３位の１つまたは複数が、第二の鎖の５’末端領域の対応する残基とミスマッチする）。２つの末端ミスマッチ残基を有する例示的な２７量体ＤｓｉＲＮＡ剤を示す：
ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｍ」＝鎖がアニーリングされる際、相補性鎖の「Ｍ」残基に対応する核酸残基と塩基対合（水素結合）しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然もしくは修飾核酸））。そのような薬剤の残基のいずれも、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーになり得る、つまり上記の非対称の薬剤に関して示される通り、下の（第二の）鎖の３’末端残基から開始する２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーの交互配置が、先の「平滑／ほぐれた」ＤｓｉＲＮＡ剤の中でも用いられ得る。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。
ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｍ」＝鎖がアニーリングされる際、相補性鎖の「Ｍ」残基に対応する核酸残基と塩基対合（水素結合）しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然もしくは修飾核酸））。そのような薬剤の残基のいずれも、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーになり得る、つまり上記の非対称の薬剤に関して示される通り、下の（第二の）鎖の３’末端残基から開始する２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーの交互配置が、先の「平滑／ほぐれた」ＤｓｉＲＮＡ剤の中でも用いられ得る。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。
特定の追加の実施形態において、本発明は、予測されるセンス鎖ダイサー切断部位の３’位及び予測されるアンチセンス鎖ダイサー切断部位の対応する５’位にある二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の領域内に１つまたは複数の塩基対合したデオキシリボヌクレオチドを有するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のための組成物を提供する。本発明の組成物は、前駆分子であるｄｓＲＮＡを含み、即ち本発明のｄｓＲＮＡは、インビボで処理されて、活性の低分子干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）を生成する。該ｄｓＲＮＡは、ダイサーにより活性ｓｉＲＮＡに処理されて、ＲＩＳＣに取り込まれる。
特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、以下の例示的構造を有し得る（以下の例示的構造のいずれも、例えば上記構造の下の鎖の修飾パターンと組み合わせ得ることに留意されたい、つまり１つの具体的実施例において、上記構造のいずれかに示された下の鎖の修飾パターンが、下記構造のいずれかにある下の鎖の最も３’側の２７残基に適用され、別の具体的実施例において、下の鎖の最も３’側の２３残基にある上記構造のいずれかに示された下の鎖の修飾パターンが、下記構造のいずれかにある下の鎖の最も３’側の２３残基に適用される）。
１つのそのような実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、以下のもの（例示的な「右に伸長した」、「ＤＮＡが伸長した」ＤｓｉＲＮＡ）：
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー０～１０個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１～５０またはそれを超える数値であるが、任意で１～８または１～１０である。「Ｎ＊」＝０～１５またはそれを超える数値であるが、任意で０、１、２、３、４、５または６である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。
関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー０～１０個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１～５０またはそれを超える数値であるが、任意で１～８または１～１０である。「Ｎ＊」＝０～１５またはそれを超える数値であるが、任意で０、１、２、３、４、５または６である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー０～１０個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、「Ｎ」＝１～５０またはそれを超える数値であるが、任意で１～８または１～１０である。「Ｎ＊」＝０～１５またはそれを超える数値であるが、任意で０、１、２、３、４、５または６である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖であり、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーが、本明細書において先の図に示された下の鎖ではなくむしろ上の鎖に沿って交互の残基に配置される。
別のそのような実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー０～１０個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、「Ｎ」＝１～５０またはそれを超える数値であるが、任意で１～８または１～１０である。「Ｎ＊」＝０～１５またはそれを超える数値であるが、任意で０、１、２、３、４、５または６である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖であり、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーが、本明細書において先の図に示された下の鎖ではなくむしろ上の鎖に沿って交互の残基に配置される。
別のそのような実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー０～１０個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、「Ｎ」＝１～５０またはそれを超える数値であるが、任意で１～８または１～１０である。「Ｎ＊」＝０～１５またはそれを超える数値であるが、任意で０、１、２、３、４、５または６である）を含む。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖であり、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーが、本明細書において先の図に示された下の鎖ではなくむしろ上の鎖に沿って交互の残基に配置される。
別の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー０～１０個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、「Ｎ」＝１～５０またはそれを超える数値であるが、任意で１～８または１～１０であり、少なくとも１つのＤ１Ｎが、上の鎖に存在して下の鎖の対応するＤ２Ｎと塩基対合している。任意でＤ１Ｎ及びＤ１Ｎ＋１が、対応するＤ２Ｎ及びＤ２Ｎ＋１と塩基対合しており、Ｄ１Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１及びＤ１Ｎ＋２が、対応するＤ２Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１及びＤ１Ｎ＋２と塩基対合している、などとなっている。「Ｎ＊」＝０～１５またはそれを超える数値であるが、任意で０、１、２、３、４、５または６である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖であり、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーが、本明細書において先の図に示された下の鎖ではなくむしろ上の鎖に沿って交互の残基に配置される。
本明細書に示された構造において、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの５’末端は、任意でリン酸基を含み得る。
別の実施形態において、ＤＮＡ：ＤＮＡが伸長したＤｓｉＲＮＡは、ダイサー切断を方向づける働きがあるミスマッチ残基を１～３個有する同じ長さの鎖を含む（具体的には、第一及び第二の鎖が互いにアニーリングされる際、３’末端残基から数えてＤｓｉＲＮＡの第一の鎖の１、２または３位の１つまたは複数が、第二の鎖の５’末端領域の対応する残基とミスマッチする）。２つの末端ミスマッチ残基を有する例示的なＤＮＡ：ＤＮＡが伸長したＤｓｉＲＮＡ剤を示す：
ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｍ」＝鎖がアニーリングされる際にそれ以外では相補性鎖の「Ｍ」残基に対応する核酸残基と塩基対合（水素結合）しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然もしくは修飾核酸）、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１～５０またはそれを超える数値であるが、任意で１～１５または１～８である。「Ｎ＊」＝０～１５またはそれを超える数値であるが、任意で０、１、２、３、４、５または６である。そのような薬剤の残基のいずれも、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーになり得る、つまり上記の非対称の薬剤に関して示される通り、下の（第二の）鎖の３’末端残基から開始する２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーの交互配置が、先の「平滑／ほぐれた」ＤｓｉＲＮＡ剤の中でも用いられ得る。一実施形態において、上の鎖（第一の鎖）は、センス鎖であり、下の鎖（第二の鎖）は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。非対称／オーバーハングの薬剤に関して先に示されたものに匹敵する修飾及びＤＮＡ：ＤＮＡ伸長パターンもまた、そのような「平滑／ほぐれた」薬剤に組み込むことができる。
ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｍ」＝鎖がアニーリングされる際にそれ以外では相補性鎖の「Ｍ」残基に対応する核酸残基と塩基対合（水素結合）しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然もしくは修飾核酸）、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１～５０またはそれを超える数値であるが、任意で１～１５または１～８である。「Ｎ＊」＝０～１５またはそれを超える数値であるが、任意で０、１、２、３、４、５または６である。そのような薬剤の残基のいずれも、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーになり得る、つまり上記の非対称の薬剤に関して示される通り、下の（第二の）鎖の３’末端残基から開始する２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーの交互配置が、先の「平滑／ほぐれた」ＤｓｉＲＮＡ剤の中でも用いられ得る。一実施形態において、上の鎖（第一の鎖）は、センス鎖であり、下の鎖（第二の鎖）は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。非対称／オーバーハングの薬剤に関して先に示されたものに匹敵する修飾及びＤＮＡ：ＤＮＡ伸長パターンもまた、そのような「平滑／ほぐれた」薬剤に組み込むことができる。
一実施形態において、特定方向のダイサー切断により機能するようにモデル化された部位に位置するデオキシリボヌクレオチドを含むが、ｄｓＲＮＡ構造内の塩基対合したデオキシリボヌクレオチドの存在を必要としない、長いＤｓｉＲＮＡ剤が提供される。そのような分子の例示的構造を示す：
ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー０～１０個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ）。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。上記構造は、主な処理後形態としてダイサーに最小で２１量体の二重鎖を切断させるようにモデル化させている。上記構造の下の鎖がアンチセンス鎖である実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端の最後及び最後から二番目の残基にある２つのデオキシリボヌクレオチド残基の位置づけが、オフターゲット効果の低減を助けることになる（以前の研究で、アンチセンス鎖の５’末端の少なくとも最後から２番目の２’－Ｏ－メチル修飾が、オフターゲット効果を低減することが示されたため。例えばＵＳ２００７／０２２３４２７参照）。
ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー０～１０個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ）。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。上記構造は、主な処理後形態としてダイサーに最小で２１量体の二重鎖を切断させるようにモデル化させている。上記構造の下の鎖がアンチセンス鎖である実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端の最後及び最後から二番目の残基にある２つのデオキシリボヌクレオチド残基の位置づけが、オフターゲット効果の低減を助けることになる（以前の研究で、アンチセンス鎖の５’末端の少なくとも最後から２番目の２’－Ｏ－メチル修飾が、オフターゲット効果を低減することが示されたため。例えばＵＳ２００７／０２２３４２７参照）。
一実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、以下のもの（例示的な「左が伸長した」、「ＤＮＡが伸長した」ＤｓｉＲＮＡ）：
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー０～１０個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１～５０またはそれを超える数値であるが、任意で１～８または１～１０である。「Ｎ＊」＝０～１５またはそれを超える数値であるが、任意で０、１、２、３、４、５または６である）を含む。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー０～１０個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１～５０またはそれを超える数値であるが、任意で１～８または１～１０である。「Ｎ＊」＝０～１５またはそれを超える数値であるが、任意で０、１、２、３、４、５または６である）を含む。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。
関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１～５０またはそれを超える数値であるが、任意で１～８または１～１０である。「Ｎ＊」＝０～１５またはそれを超える数値であるが、任意で０、１、２、３、４、５または６である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。
追加の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１～５０またはそれを超える数値であるが、任意で１～８または１～１０である。「Ｎ＊」＝０～１５またはそれを超える数値であるが、任意で０、１、２、３、４、５または６である。「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡである。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖であり、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーが、本明細書において先の図に示された下の鎖ではなくむしろ上の鎖に沿って交互の残基に配置される。
別のそのような実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１～５０またはそれを超える数値であるが、任意で１～８または１～１０である。「Ｎ＊」＝０～１５またはそれを超える数値であるが、任意で０、１、２、３、４、５または６である。「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡである。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖であり、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーが、本明細書において先の図に示された下の鎖ではなくむしろ上の鎖に沿って交互の残基に配置される。
別のそのような実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、「Ｎ」＝１～５０またはそれを超える数値であるが、任意で１～８または１～１０である。「Ｎ＊」＝０～１５またはそれを超える数値であるが、任意で０、１、２、３、４、５または６である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖であり、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーが、本明細書において先の図に示された下の鎖ではなくむしろ上の鎖に沿って交互の残基に配置される。
別のそのような実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、「Ｎ」＝１～５０またはそれを超える数値であるが、任意で１～８または１～１０である。「Ｎ＊」＝０～１５またはそれを超える数値であるが、任意で０、１、２、３、４、５または６である。「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー０～１０個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインである。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖であり、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーが、本明細書において先の図に示された下の鎖ではなくむしろ上の鎖に沿って交互の残基に配置される。
別の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、「Ｎ」＝１～５０またはそれを超える数値であるが、任意で１～８または１～１０であり、少なくとも１つのＤ１Ｎが、上の鎖に存在して下の鎖の対応するＤ２Ｎと塩基対合している。任意でＤ１Ｎ及びＤ１Ｎ＋１が、対応するＤ２Ｎ及びＤ２Ｎ＋１と塩基対合しており；Ｄ１Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１及びＤ１Ｎ＋２が、対応するＤ２Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１及びＤ１Ｎ＋２と塩基対合している、などとなっている。「Ｎ＊」＝０～１５またはそれを超える数値であるが、任意で０、１、２、３、４、５または６である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖であり、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーが、本明細書において先の図に示された下の鎖ではなくむしろ上の鎖に沿って交互の残基に配置される。
関連の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡは、
を含み、ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー０～１０個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、「Ｎ」＝１～５０またはそれを超える数値であるが、任意で１～８または１～１０であり、少なくとも１つのＤ１Ｎが、上の鎖に存在して下の鎖の対応するＤ２Ｎと塩基対合している。任意でＤ１Ｎ及びＤ１Ｎ＋１が、対応するＤ２Ｎ及びＤ２Ｎ＋１と塩基対合しており；Ｄ１Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１及びＤ１Ｎ＋２が、対応するＤ２Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１及びＤ１Ｎ＋２と塩基対合している、などとなっている。「Ｎ＊」＝０～１５またはそれを超える数値であるが、任意で０、１、２、３、４、５または６である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖であり、２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーが、本明細書において先の図に示された下の鎖ではなくむしろ上の鎖に沿って交互の残基に配置される。
別の実施形態において、ＤＮＡ：ＤＮＡが伸長したＤｓｉＲＮＡは、ダイサー切断を方向づける働きがあるミスマッチ残基を１～３個有する同じ長さの鎖を含む（具体的には、第一及び第二の鎖が互いにアニーリングされる際、３’末端残基から数えてＤｓｉＲＮＡの第一の鎖の１、２または３位の１つまたは複数が、第二の鎖の５’末端領域の対応する残基とミスマッチする）。２つの末端ミスマッチ残基を有する例示的なＤＮＡ：ＤＮＡが伸長したＤｓｉＲＮＡ剤を示す：
ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｍ」＝鎖がアニーリングされる際にそれ以外では相補性鎖の「Ｍ」残基に対応する核酸残基と塩基対合（水素結合）しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然もしくは修飾核酸）、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１～５０またはそれを超える数値であるが、任意で１～８または１～１０である。「Ｎ＊」＝０～１５またはそれを超える数値であるが、任意で０、１、２、３、４、５または６である。そのような薬剤の残基のいずれも、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーになり得る、つまり上記の非対称の薬剤に関して示される通り、下の（第二の）鎖の３’末端残基から開始する２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーの交互配置が、先の「平滑／ほぐれた」ＤｓｉＲＮＡ剤の中でも用いられ得る。一実施形態において、上の鎖（第一の鎖）は、センス鎖であり、下の鎖（第二の鎖）は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。非対称／オーバーハングの薬剤に関して先に示されたものに匹敵する修飾及びＤＮＡ：ＤＮＡ伸長パターンもまた、そのような「平滑／ほぐれた」薬剤に組み込むことができる。
別の実施形態において、特定方向のダイサー切断により機能するようにモデル化された部位に位置するデオキシリボヌクレオチドを含むが、ｄｓＲＮＡ構造内の塩基対合したデオキシリボヌクレオチドの存在を必要としない、長いＤｓｉＲＮＡ剤が提供される。そのような分子の例示的構造を示す：
ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー０～１０個で構成された任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーであるＲＮＡモノマー１～４個で構成されたオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。「Ｎ＊」＝０～１５またはそれを超える数値であるが、任意で０、１、２、３、４、５または６である）。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。
上記構造の下の鎖がアンチセンス鎖である上記実施形態のいずれかにおいも、アンチセンス鎖の５’末端の最後及び最後から二番目の残基にある２つのデオキシリボヌクレオチド残基の位置づけが、オフターゲット効果の低減を助けることになる（以前の研究で、アンチセンス鎖の５’末端の少なくとも最後から２番目の位置の２’－Ｏ－メチル修飾がオフターゲット効果を低減することが示されたため。例えばＵＳ２００７／０２２３４２７参照）。
ある特定の実施形態において、上記構造の「Ｄ」残基は、少なくとも１つのＰＳ－ＤＮＡまたはＰＳ－ＲＮＡを含む。任意で、上記構造の「Ｄ」残基は、ダイサー切断を阻害する少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
上記の「ＤＮＡが伸長した」ＤｓｉＲＮＡ剤は、「左伸長」または「右伸長」のいずれかに分類することができるが、１つの薬剤中に左伸長及び右伸長の両方のＤＮＡを含有する配列（例えば、コアｄｓＲＮＡ構造を取り囲む両方の隣接部分がｄｓＤＮＡ伸長である）を含むＤｓｉＲＮＡ剤を、「右伸長」剤及び「左伸長」剤に関して本明細書に記載されたものと類似の手法で作製及び使用することもできる。
幾つかの実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、ＤＮＡ：ＤＮＡが伸長したＤｓｉＲＮＡ剤のセンス鎖とアンチセンス鎖をつなぐ連結部分またはドメインをさらに含む。任意で、そのような連結部分のドメインは、センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端をつなぐ。該連結部分は、オリゴメチレンジオールリンカー、オリゴエチレングリコールリンカー、または他の当該技術分野で認識されたリンカー部分など、化学的（非ヌクレオチド）リンカーであってもよい。あるいは該リンカーは、任意で伸長ループ及び／またはテトラループをはじめとする、ヌクレオチドリンカーであり得る。
一実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡ剤は、非対称構造を有し、センス鎖が２５塩基対長、そしてアンチセンス鎖が２７塩基対長で１～４塩基の３’－オーバーハング（例えば、１塩基の３’－オーバーハング、２塩基の３’－オーバーハング、３塩基の３’－オーバーハング、または４塩基の３’－オーバーハング）を有する。別の実施形態において、このＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖の３’末端に２つのデオキシヌクレオチド（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）をさらに含む非対称構造を有する。
別の実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡ剤は、非対称構造を有し、アンチセンス鎖が２５塩基対長、そしてセンス鎖が２７塩基対長で１～４塩基の３’－オーバーハング（例えば、１塩基の３’－オーバーハング、２塩基の３’－オーバーハング、３塩基の３’－オーバーハング、または４塩基の３’－オーバーハング）を有する。別の実施形態において、このＤｓｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのデオキシリボヌクレオチドをさらに含む非対称構造を有する。
本発明の例示的なα１アンチトリプシンを標的とするＤｓｉＲＮＡ剤、及びそれらに関連するα１アンチトリプシン標的配列は、下の一連の表に表された以下のものを含む：
表番号：
（２） 選択されたヒト抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ剤（非対称）；
（３） 選択されたヒト抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ － 非修飾二重鎖（非対称）；
（４） α１アンチトリプシンｍＲＮＡ内のＤｓｉＲＮＡ標的配列（２１量体）；
（５） 選択されたヒト抗α１アンチトリプシン「平滑／平滑」ＤｓｉＲＮＡ；及び
（６） α１アンチトリプシンｍＲＮＡ内のＤｓｉＲＮＡ成分の１９ヌクレオチド標的配列；
（７） 追加のヒト抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ剤（非対称）；
（８） 追加のヒト抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ － 非修飾二重鎖（非対称）；
（９） α１アンチトリプシンｍＲＮＡ内の追加のＤｓｉＲＮＡ標的配列（２１量体）；
（１０） 追加のヒト抗α１アンチトリプシン「平滑／平滑」ＤｓｉＲＮＡ；及び
（１１） α１アンチトリプシンｍＲＮＡ内の追加のＤｓｉＲＮＡ成分の１９ヌクレオチド標的配列；
（１２） さらなるヒト抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ剤（非対称）；
（１３） さらなるヒト抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ － 非修飾二重鎖（非対称）；
（１４） α１アンチトリプシンｍＲＮＡ内のさらなるＤｓｉＲＮＡ標的配列（２１量体）；
（１５） さらなるヒト抗α１アンチトリプシン「平滑／平滑」ＤｓｉＲＮＡ；及び
（１６） α１アンチトリプシンｍＲＮＡ内のさらなるＤｓｉＲＮＡ成分の１９ヌクレオチド標的配列；
（１７） 他のヒト抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ剤（非対称）；
（１８） 他のヒト抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ － 非修飾二重鎖（非対称）；
（１９） α１アンチトリプシンｍＲＮＡ内の他のＤｓｉＲＮＡ標的配列（２１量体）；
（２０） 他のヒト抗α１アンチトリプシン「平滑／平滑」ＤｓｉＲＮＡ；及び
（２１） α１アンチトリプシンｍＲＮＡ内の他のＤｓｉＲＮＡ成分の１９ヌクレオチド標的配列。
表番号：
（２） 選択されたヒト抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ剤（非対称）；
（３） 選択されたヒト抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ － 非修飾二重鎖（非対称）；
（４） α１アンチトリプシンｍＲＮＡ内のＤｓｉＲＮＡ標的配列（２１量体）；
（５） 選択されたヒト抗α１アンチトリプシン「平滑／平滑」ＤｓｉＲＮＡ；及び
（６） α１アンチトリプシンｍＲＮＡ内のＤｓｉＲＮＡ成分の１９ヌクレオチド標的配列；
（７） 追加のヒト抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ剤（非対称）；
（８） 追加のヒト抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ － 非修飾二重鎖（非対称）；
（９） α１アンチトリプシンｍＲＮＡ内の追加のＤｓｉＲＮＡ標的配列（２１量体）；
（１０） 追加のヒト抗α１アンチトリプシン「平滑／平滑」ＤｓｉＲＮＡ；及び
（１１） α１アンチトリプシンｍＲＮＡ内の追加のＤｓｉＲＮＡ成分の１９ヌクレオチド標的配列；
（１２） さらなるヒト抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ剤（非対称）；
（１３） さらなるヒト抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ － 非修飾二重鎖（非対称）；
（１４） α１アンチトリプシンｍＲＮＡ内のさらなるＤｓｉＲＮＡ標的配列（２１量体）；
（１５） さらなるヒト抗α１アンチトリプシン「平滑／平滑」ＤｓｉＲＮＡ；及び
（１６） α１アンチトリプシンｍＲＮＡ内のさらなるＤｓｉＲＮＡ成分の１９ヌクレオチド標的配列；
（１７） 他のヒト抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ剤（非対称）；
（１８） 他のヒト抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ － 非修飾二重鎖（非対称）；
（１９） α１アンチトリプシンｍＲＮＡ内の他のＤｓｉＲＮＡ標的配列（２１量体）；
（２０） 他のヒト抗α１アンチトリプシン「平滑／平滑」ＤｓｉＲＮＡ；及び
（２１） α１アンチトリプシンｍＲＮＡ内の他のＤｓｉＲＮＡ成分の１９ヌクレオチド標的配列。
先の表２、３、５、７、８、１０、１２、１３、１５、１７、１８及び２０において、下線が引かれた残基は、２’－Ｏ－メチル残基を示し、大文字は、リボヌクレオチドを、そして小文字は、デオキシリボヌクレオチドを示す。先の表２～３、７～８、１２～１３及び１７～１８のＤｓｉＲＮＡ剤は、平滑末端を有する２５／２７量体の薬剤である。先の表２～３、７～８、１２～１３及び１７～１８の該薬剤の構造及び／または修飾パターンを、先の一般的な配列構造に容易に適合させることができ、例えば第二の鎖の３’オーバーハングを拡張または短縮させることができ、第二の鎖の２’－Ｏ－メチル化を、任意で交互の部位などで、第二の鎖の５’末端に向かって拡張させることができる。そのようなさらなる修飾を有する２５／２７量体ＤｓｉＲＮＡは、先のＤｓｉＲＮＡ剤からも容易に設計することができ、α１アンチトリプシン発現の機能的阻害剤にもなると予測されるため、そのようなさらなる修飾は、選択肢になる。同様に先の表５、１０、１５及び２０の薬剤の２７量体「平滑／平滑」ＤｓｉＲＮＡ構造及び／または修飾パターンもまた、例えばそのような構造にアンチセンス鎖の修飾パターンを適用するため、そして／または先の一般的構造にそのような配列を適合させるために、先の一般的な配列構造に容易に適合させることができる。
ある特定の実施形態において、それぞれが２７ヌクレオチドの独立した鎖長を有する２７量体ＤｓｉＲＮＡが、本明細書の表２～３、７～８、１２～１３及び１７～１８に示された非対称「２５／２７」構造と同じ、α１アンチトリプシン転写産物内の部位を標的化するように設計及び合成される。例示的な「２７／２７」ＤｓｉＲＮＡが、任意で先の表５、１０、１５及び２０のＤｓｉＲＮＡに関して示された「平滑／平滑」構造を含んで設計される。
ある特定の実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、例えば第二の鎖の対応する残基に相補性がある第一の鎖の少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５または少なくとも２６の残基を必要とする。ある特定の関連の実施形態において、第二の鎖の対応する残基に相補性があるこれらの第一の鎖の残基は、任意で連続した残基である。
本発明のある特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ（「ＤｓｉＲＮＡミスマッチ」）の実施形態において、ミスマッチ塩基対は、対応する標的核酸の予測されるＡｇｏ２切断部位の場所に関して、本明細書で定義された「ミスマッチ耐性領域」内に配置される。ミスマッチ耐性領域は、標的鎖の予測されるＡｇｏ２切断部位の「上流」に配置される。この文脈の「上流」は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ二重鎖の最も５’側の部分と理解され、ここでの５’は、ＤｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖の方向を指す。それゆえミスマッチ耐性領域は、標的核酸の予測されるＡｇｏ２切断部位に対応するセンス（パッセンジャー）鎖の塩基の上流であり（図１参照）、あるいはＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス（ガイド）鎖を参照する場合には、ミスマッチ耐性領域は、標的核酸の予測されるＡｇｏ２切断部位に相補性がある塩基の下流、即ちＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖の最も３’側の部分に位置すると記載することもできる（ここでのアンチセンス鎖の１位は、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドである。図１参照）。
一実施形態において、例えば図１に示された通り付番すると、ミスマッチ耐性領域は、二重鎖のセンス鎖の５’末端から開始するヌクレオチドのナンバリングでは塩基対３～９の間に（これらの数を含む）位置する。それゆえ本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍは、右伸長ＤｓｉＲＮＡのセンス鎖の３、４、５、６、７、８または９位のいずれか一箇所に１つのミスマッチ塩基対を有する（ここでの１位は、センス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、９位は、センス鎖配列に対応する標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列の予測されるＡｇｏ２切断部位の直ぐ５’側にあるセンス鎖のヌクレオチド残基である）。ある特定の実施形態において、センス鎖の３、４、５、６、７、８または９位のいずれかにミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍの場合、アンチセンス鎖の対応するミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、ＤｓｉＲＮＡｍｍ標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列ともミスマッチ塩基対を形成する（したがってアンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との相補性が、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対で破壊され、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列の間でも、同様に相同性が破壊される）。代わりの実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドのみとミスマッチ塩基対を形成するが、対応する標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列ヌクレオチドとは塩基対を形成する（したがってアンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対で破壊されるが、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列の間は、相補性が維持される）。
上に記載されたミスマッチ耐性領域（ミスマッチ領域）内に１つのミスマッチ塩基対を有する本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍ（例えば、センス鎖の３、４、５、６、７、８または９位のいずれか一箇所に１つのミスマッチヌクレオチド残基を抱えるＤｓｉＲＮＡｍｍ）は、１、２またはさらに３個の追加のミスマッチ塩基対をさらに含み得る。好ましい実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのこれらの１、２または３個の追加のミスマッチ塩基対は、センス鎖の３、４、５、６、７、８及び／または９位（複数可）（及びアンチセンス鎖の対応する残基）に生じる。１つの追加のミスマッチ塩基対がＤｓｉＲＮＡｍｍ内に存在する一実施形態において、センス鎖の２つのミスマッチ塩基対が、例えばセンス鎖の４及び６位の両方のヌクレオチドに生じ得る（ミスマッチがアンチセンス鎖の対応するヌクレオチド残基にも生じる）。
２つのミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ剤において、ミスマッチは、連続して（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って連続した位置に）生じ得る。あるいは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖ヌクレオチドに、アンチセンス鎖配列と塩基対合するヌクレオチドが散在し得る（例えば、３及び６位にミスマッチヌクレオチドを有すが４及び５位に有さないＤｓｉＲＮＡｍｍの場合、３及び６位のセンス鎖のミスマッチ残基に、アンチセンス鎖の対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する２つのヌクレオチドが散在する）。例えば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖の２つの残基（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に配置される）は、これらのミスマッチ塩基対の間に配置された０、１、２、３、４または５個のミスマッチ塩基対と共に生じ得る。
３つのミスマッチ塩基対を有するある特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤の場合、ミスマッチは、連続して（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って三連で）生じ得る。あるいはアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖ヌクレオチドに、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するヌクレオチドが散在し得る（例えば、３、４及び８位にミスマッチヌクレオチドを有し５、６及び７位に有さないＤｓｉＲＮＡｍｍの場合、３及び４位のセンス鎖のミスマッチ残基が、互いに隣接し、一方でセンス鎖の４及び８位のミスマッチ残基に、アンチセンス鎖の対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する３つのヌクレオチドが散在する）。例えば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖の３つの残基（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に配置される）は、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に配置された０、１、２、３、または４個のミスマッチ塩基対と共に生じ得る。
４つのミスマッチ塩基対を有するある特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤の場合、ミスマッチは、連続して（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って四連で）生じ得る。あるいはアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドに、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するヌクレオチドが散在し得る（例えば、３、５、７及び８位にミスマッチヌクレオチドを有するが４及び６位に有さないＤｓｉＲＮＡｍｍの場合、７及び８位のセンス鎖のミスマッチ残基が、互いに隣接し、一方でセンス鎖の３及び５位のミスマッチ残基に、アンチセンス鎖の対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する１つのヌクレオチドが散在し、同様に５及び７位のセンス鎖のミスマッチ残基にはまた、アンチセンス鎖の対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する１つのヌクレオチドが散在する）。例えば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖の４つの残基（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に配置される）は、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に配置された０、１、２または３個のミスマッチ塩基対と共に生じ得る。
別の実施形態において、例えば図１に示された通り付番すると、本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍは、ＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３位のいずれか一箇所に１つのミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するミスマッチ耐性領域を含む（ここでは１位は、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、１７位は、アンチセンス鎖配列に十分に相補性がある標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列の予測されるＡｇｏ２切断部位のアンチセンス鎖の直ぐ３’側（下流）にあるアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である）。ある特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖に関して、アンチセンス鎖の１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３位のいずれかにミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍの場合、アンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、ＤｓｉＲＮＡｍｍ標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列ともミスマッチ塩基対を形成する（したがってアンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との相補性が、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対で破壊され、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列の間でも同様に相同性が破壊される）。代わりの実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドだけとミスマッチ塩基対を形成し、対応する標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列ヌクレオチドとは塩基対を形成する（したがってアンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対で破壊されるが、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列の間には、相補性が維持される）。
うえに記載されたミスマッチ耐性領域内に１つのミスマッチ塩基対を有する本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍ（例えば、アンチセンス鎖の１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３位に１つのミスマッチヌクレオチド残基を抱えるＤｓｉＲＮＡｍｍ）は、１、２または３個の追加のミスマッチ塩基対をさらに含み得る。好ましい実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのこれらの１、２または３個の追加のミスマッチ塩基対は、アンチセンス鎖の１７、１８、１９、２０、２１、２２及び／または２３位（複数可）（ならびにセンス鎖の対応する残基）に生じる。１つの追加のミスマッチ塩基対がＤｓｉＲＮＡｍｍ内に存在する一実施形態において、アンチセンス鎖の２つのミスマッチ塩基対が、例えばアンチセンス鎖の１８及び２０位の両方のヌクレオチドに生じ得る（ミスマッチはセンス鎖の対応するヌクレオチド残基にも生じる）。
２つのミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ剤において、ミスマッチは、連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って連続した位置に）生じ得る。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドに、センス鎖配列と塩基対合するヌクレオチドが散在し得る（例えば、１７及び２０位にミスマッチヌクレオチドを有するが１８及び１９位に有さないＤｓｉＲＮＡｍｍの場合、１７及び２０位のアンチセンス鎖のミスマッチ残基に、センス鎖の対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する２つのヌクレオチドが散在する）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の２つの残基（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に配置される）は、これらのミスマッチ塩基対の間に配置された０、１、２、３、４、５、６または７個のミスマッチ塩基対と共に生じ得る。
３つのミスマッチ塩基対を有するある特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤の場合、ミスマッチは、連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って三連で）生じ得る。あるいはセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドに、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するヌクレオチドが散在し得る（例えば、１７、１８及び２２位にミスマッチヌクレオチドを有するが１９、２０及び２１位に有さないＤｓｉＲＮＡｍｍでは、１７及び１８位のアンチセンス鎖のミスマッチ残基が、互いに隣接し、一方でアンチセンス鎖の１８及び１２２位のミスマッチ残基に、センス鎖の対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する３つのヌクレオチドが散在する）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の３つの残基（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に配置される）は、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に配置された０、１、２、３、４、５または６個のミスマッチ塩基対と共に生じ得る。
４つのミスマッチ塩基対を有するある特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤の場合、ミスマッチは、連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って四連で）生じ得る。あるいはセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドに、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するヌクレオチドが散在し得る（例えば、１８、２０、２２及び２３位にミスマッチヌクレオチドを有するが１９及び２１位に有さないＤｓｉＲＮＡｍｍの場合、２２及び２３位のアンチセンス鎖のミスマッチ残基が、互いに隣接し、一方でアンチセンス鎖の１８及び２０位のミスマッチ残基に、センス鎖の対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する１つのヌクレオチドが散在し、同様に２０及び２２位のアンチセンス鎖のミスマッチ残基にはまた、センス鎖の対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する１つのヌクレオチドが散在する）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の４つの残基（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に配置される）は、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に配置された０、１、２、３、４または５個のミスマッチ塩基対と共に生じ得る。
明瞭にするために、上記ＤｓｉＲＮＡｍｍ剤の中のミスマッチヌクレオチド残基の場所（複数可）を、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの５’末端残基に関して付番する。アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域（ミスマッチ領域）内に配置された位置の付番を、センス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端付近で変動させながら予測されるＡｇｏ２切断部位にシフトさせることができる。したがってアンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれかの中の好ましいミスマッチ部位の場所（複数可）を、予測されるＡｇｏ２切断部位へのそのようなミスマッチの許容し得る近接として特定することもできる。したがって１つの好ましい実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖のミスマッチヌクレオチドの位置は、対応する標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列の予測されるＡｇｏ２切断部位の直ぐ５’側（上流）に配置されたセンス鎖のヌクレオチド残基である。別の好ましい実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖のミスマッチヌクレオチドは、予測されるＡｇｏ２切断部位の２ヌクレオチド５’側（上流）、予測されるＡｇｏ２切断部位の３ヌクレオチド５’側（上流）、予測されるＡｇｏ２切断部位の４ヌクレオチドの５’側（上流）、予測されるＡｇｏ２切断部位の５ヌクレオチド５’側（上流）、予測されるＡｇｏ２切断部位の６ヌクレオチドの５’側（上流）、予測されるＡｇｏ２切断部位の７ヌクレオチドの５’側（上流）、予測されるＡｇｏ２切断部位の８ヌクレオチドの５’側（上流）、または予測されるＡｇｏ２切断部位の９ヌクレオチドの５’側（上流）に配置されたセンス鎖のヌクレオチド残基に位置する。
例示的な１つのミスマッチを含有する２５／２７量体ＤｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡｍｍ）として、以下の構造が挙げられる（そのようなミスマッチ含有構造を、本明細書に示された他の例示的ＤｓｉＲＮＡ構造に組み込んでもよい）。
ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｍ」＝鎖がアニーリングされる際にそれ以外では相補性鎖の「Ｍ」残基に対応する核酸残基と塩基対合（水素結合）しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然もしくは修飾核酸）である。そのような薬剤の残基のいずれも、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーになり得る、つまり先に示される通り、下の（第二の）鎖の３’末端残基から開始する２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーの交互配置が、先のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤の中でも用いられ得る。先のミスマッチ構造の場合、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
ある特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列に関して存在するミスマッチを含み得るが、ＤｓｉＲＮＡの２つの鎖の中に必ずしもミスマッチ塩基対として存在するわけではなく、したがってＤｓｉＲＮＡは、ＤｓｉＲＮＡの第一の鎖と第二の鎖の間に完全な相補性を有し得るが、それでも標的α１アンチトリプシンＲＮＡに関してミスマッチ残基を有する（それは、ある特定の実施形態において、有効性及び／または効力及び／または作用期間を増進する上で有利になり得る）。ミスマッチがアンチセンス鎖と標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列の間に生じるある特定の実施形態において、ミスマッチの位置は、標的領域の予測されるＡｇｏ２切断部位の５’側にあるセンス鎖の配列に対応する位置（複数可）のアンチセンス鎖、例えば標的配列の予測されるＡｇｏ２切断部位に相補性があるアンチセンス残基の３’のアンチセンス鎖内に位置するアンチセンス鎖残基（複数可）、の中に配置される。
標的配列に関して１つのミスマッチ残基を抱える例示的な２５／２７量体ＤｓｉＲＮＡは、以下の構造を含む。
ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｅ」＝鎖がアニーリングされる際にそれ以外では相補性（標的）鎖の対応する「Ａ」ＲＮＡ残基と塩基対合しないが、任意で対応する「Ｂ」残基とは塩基対合する核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然もしくは修飾核酸）である（「Ｂ」残基もまた、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然もしくは修飾核酸である）。そのような薬剤の残基のいずれも、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーになり得る、つまり先に示される通り、下の（第二の）鎖の３’末端残基から開始する２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーの交互配置が、先のＤｓｉＲＮＡ剤の中でも用いられ得る。
ある特定の実施形態において、標的遺伝子発現を低減するために標的遺伝子配列の少なくとも１９ヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に対して十分に相補性がある本発明のｄｓＲＮＡのガイド鎖は、少なくとも１９ヌクレオチド長の標的遺伝子配列に対して完全に相補性があるわけではない。むしろ、標的遺伝子発現を低減するために標的ＲＮＡ配列の少なくとも１９ヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡに対して十分に相補性がある本発明のｄｓＲＮＡのガイド鎖が、１９ヌクレオチド長以上の標的鎖配列とミスマッチする１、２、３、または４個またはそれを超えるヌクレオチドを有し得ると認識される。したがって１９ヌクレオチドの標的ＲＮＡ配列の場合、本発明のｄｓＲＮＡのガイド鎖は、ガイド鎖と標的ＲＮＡ配列の間に例えば１５／１９、１６／１９、１７／１９または１８／１９のみのミスマッチヌクレオチド残基を有するが、標的遺伝子レベルを低減するために標的ＲＮＡ配列に対して十分相補性があり得る。
本発明のｄｓＲＮＡは、上の例示的構造に加えて、標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列とさらなるミスマッチを形成する１、２または３個の追加の残基も有し得る。そのようなミスマッチは、連続し得るが、または標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するヌクレオチドが内部に散在し得る。ミスマッチ残基は、ミスマッチ塩基対を形成するヌクレオチドが散在する場合、１つの鎖の中で、そのようなミスマッチ形成残基間に１、２、３、４、５、６、７または８個の塩基対ヌクレオチドの間隔で、互いに分離され得る。
上に記載されたＤｓｉＲＮＡ剤に関して、標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成する（しかし対応するセンス鎖ヌクレオチドとはミスマッチを形成しても、または形成しなくてもよい）アンチセンス鎖ヌクレオチドについてのｄｓＲＮＡ（例えば、ＤｓｉＲＮＡ）内の好ましい場所は、ＤｓｉＲＮＡの予測されるＡｇｏ２切断部位に相補性があるアンチセンス鎖配列の３’（下流）に配置されたアンチセンス鎖領域内である（例えば、図１において、予測されるＡｇｏ２切断部位の３’にあるアンチセンス鎖の領域が、ミスマッチ形成残基に好ましく、図１に示される２５／２７量体の薬剤ではアンチセンス鎖の１７～２３位に配置されるように生じる）。したがって一実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖の（標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列に関する）ミスマッチヌクレオチドの位置は、対応する標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列の予測されるＡｇｏ２切断部位のアンチセンス鎖配列内の直ぐ３’側（下流）に配置されたアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である。別の好ましい実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチヌクレオチドは（標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列に関して）、対応する予測されるＡｇｏ２切断部位の２ヌクレオチド３’側（下流）、対応する予測されるＡｇｏ２切断部位の３ヌクレオチド３’側（下流）、対応する予測されるＡｇｏ２切断部位の４ヌクレオチド３’側（下流）、対応する予測されるＡｇｏ２切断部位の５ヌクレオチド３’側（下流）、対応する予測されるＡｇｏ２切断部位の６ヌクレオチド３’側（下流）、対応する予測されるＡｇｏ２切断部位の７ヌクレオチド３’側（下流）、対応する予測されるＡｇｏ２切断部位の８ヌクレオチド３’側（下流）、または対応する予測されるＡｇｏ２切断部位の９ヌクレオチド３’側（下流）に配置されたアンチセンス鎖のヌクレオチド残基に位置する。
アンチセンス鎖の２つのミスマッチ形成ヌクレオチドを有するｄｓＲＮＡ剤において（ミスマッチ形成ヌクレオチドが標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列に関してミスマッチを形成する場合）、ミスマッチは、連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って連続した位置に）生じ得る。あるいは標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドに、標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列と塩基対合するヌクレオチドが散在し得る（例えば、（図１に示された２５／２７量体の薬剤のアンチセンス鎖の５’末端（１位）から出発して）１７及び２０位にはミスマッチ形成ヌクレオチドを有するが１８及び１９位には有さないＤｓｉＲＮＡの場合、１７及び２０位のセンス鎖のミスマッチ残基に、標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列の対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する２つのヌクレオチドが散在する）。例えば、対応する標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の２つの残基（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に配置される）は、これらのミスマッチ形成塩基対の間に配置された（標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列に関して）０、１、２、３、４または５個のミスマッチ塩基対と共に生じ得る。
３つのミスマッチ形成塩基対（標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列に関するミスマッチ形成）を有するある特定のｄｓＲＮＡ剤の場合、ミスマッチ形成ヌクレオチドは、連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って三連で）生じ得る。あるいは標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖ヌクレオチドに、標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するヌクレオチドが散在し得る（例えば、１７、１８及び２２位にミスマッチヌクレオチドを有し１９、２０及び２１位に有さないＤｓｉＲＮＡの場合、アンチセンス鎖の１７及び１８位のミスマッチ形成残基が、互いに隣接し、一方でアンチセンス鎖の１８及び２２位のミスマッチ形成残基に、標的α１アンチトリプシンＲＮＡの対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する３つのヌクレオチドが散在する）。例えば、対応する標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の３つの残基（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に配置される）は、これらのミスマッチ形成塩基対の任意の２つの間に配置された０、１、２、３、または４個のミスマッチ塩基対と共に生じ得る。
４つのミスマッチ形成塩基対（標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列に関するミスマッチ形成）を有するある特定のＤｓｉＲＮＡの場合、ミスマッチ形成ヌクレオチドは、連続して（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って四連で）生じ得る。あるいは標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドに、標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するヌクレオチドが散在し得る（例えば、１７、１９、２１及び２２位にミスマッチ形成ヌクレオチドを有するが１８及び２０位に有さないＤｓｉＲＮＡでは、アンチセンス鎖の２１及び２２位のミスマッチ形成残基が、互いに隣接し、一方でアンチセンス鎖の１７及び１９位のミスマッチ形成残基に、標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列の対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する１つのヌクレオチドが散在し、同様にアンチセンス鎖の１９及び２０位のミスマッチ形成残基にはまた、標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列の対応する残基とミスマッチ塩基対を形成する１つのヌクレオチドが散在する）。例えば、対応する標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の４つの残基（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に配置される）は、これらのミスマッチ形成塩基対の任意の２つの間に配置された０、１、２または３個のミスマッチ塩基対と共に生じ得る。
ＤｓｉＲＮＡｍｍ及びｄｓＲＮＡ剤のある特定の構造を例示するために、上のＤｓｉＲＮＡｍｍ及び他のｄｓＲＮＡ構造を記載する。上のＤｓｉＲＮＡｍｍ及びｄｓＲＮＡ構造の設計は、例えば下に示される他のＤｓｉＲＮＡ構造のＤｓｉＲＮＡｍｍ形態を作製するために、適合させることができる。上に例示された通り、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列の間に１つのミスマッチ（または２、３もしくは４個のミスマッチ）を有するが、任意でｄｓＲＮＡのセンス鎖配列とアンチセンス鎖配列の間に完全な相補性を保持し得る、ｄｓＲＮＡを設計することもできる。
下に例示されるｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖及び／または標的α１アンチトリプシンＲＮＡにアレイメントされた構造の中に挿入／欠失（ｉｎ／ｄｅｌ）構造も有し得ることが、さらに注目される。したがって本発明のｄｓＲＮＡは、例えば標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列に比較したアンチセンス鎖配列及び／またはセンス鎖配列に比較して、アンチセンス鎖配列において、ｉｎ／ｄｅｌ変動を有するよう設計することができ、そのようなｉｎ／ｄｅｌヌクレオチドの配置に好ましい場所（複数可）は、ミスマッチ塩基対及び／またはミスマッチ形成塩基対の位置づけに関して先に記載されたそれらの場所に対応する。
センス鎖の３’末端領域／アンチセンス鎖の５’末端領域は、ダイサーにより処理されて、ＲＩＳＣに導入されるガイド鎖配列から解離するようにモデル化されるため、本発明のＤｓｉＲＮＡが、この領域内のミスマッチに耐え得ることにも注目される。そのようなミスマッチを抱える本発明の例示的ＤｓｉＲＮＡ構造として、以下のものが挙げられる：
ここで、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｉ」及び「Ｊ」＝互いに塩基対合（水素結合）しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然もしくは修飾核酸）であるが、任意で「Ｊ」は、標的ＲＮＡ配列ヌクレオチド「Ｈ」に相補性がある。そのような薬剤の残基のいずれも、任意で２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーになり得る、つまり上に示される通り、下の（第二の）鎖の３’末端残基から開始する２’－Ｏ－メチルＲＮＡモノマーの交互配置（または上記のメチル化パターンのいずれか）が、先のＤｓｉＲＮＡ剤の中でも用いられ得る。上記ミスマッチも、本発明のＤｓｉＲＮＡ内に組み込まれ得る。
以下の例示的構造において、そのようなミスマッチは、非対称ＡＡＴ－５０６ ＤｓｉＲＮＡ内に導入される（新たに導入されたミスマッチ残基を斜体で示す）：
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の１９位（５’末端から）
任意で、センス鎖の１９位のミスマッチ「Ａ」残基は、代替として「Ｕ」または「Ｃ」である。
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２０位（５’末端から）
任意で、センス鎖の２０位のミスマッチ「Ｕ」残基は、代替として「Ａ」または「Ｇ」である。
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２１位（５’末端から）
任意で、センス鎖の２１位のミスマッチ「Ｕ」残基は、代替として「Ｇ」または「Ｃ」である。
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２２位（５’末端から）
任意で、センス鎖の２２位のミスマッチ「Ｇ」残基は、代替として「Ａ」または「Ｃ」である。
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２３位（５’末端から）
任意で、センス鎖の２３位のミスマッチ「Ａ」残基は、代替として「Ｕ」または「Ｃ」である。
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２４位（５’末端から）
任意で、センス鎖の２４位のミスマッチ「ｔ」残基は、代替として「ａ」または「ｃ」である。
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２５位（５’末端から）
任意で、センス鎖の２５位のミスマッチ「ａ」残基は、代替として「ｔ」または「ｇ」である。
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の１位（５’末端から）
任意で、アンチセンス鎖の１位のミスマッチ「Ｕ」残基は、代替として「Ａ」または「Ｃ」である。
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の２位（５’末端から）
任意で、アンチセンス鎖の２位のミスマッチ「Ａ」残基は、代替として「Ｕ」または「Ｇ」である。
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の３位（５’末端から）
任意で、アンチセンス鎖の３位のミスマッチ「Ｕ」残基は、代替として「Ａ」または「Ｃ」である
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の４位（５’末端から）
任意で、アンチセンス鎖の４位のミスマッチ「Ｃ」残基は、代替として「Ｕ」または「Ｇ」である。
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の５位（５’末端から）
任意で、アンチセンス鎖の５位のミスマッチ「Ａ」残基は、代替として「Ｃ」または「Ｇ」である。
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の６位（５’末端から）
任意で、アンチセンス鎖の６位のミスマッチ「Ａ」残基は、代替として「Ｕ」または「Ｃ」である。
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の７位（５’末端から）
任意で、アンチセンス鎖の７位のミスマッチ「Ｕ」残基は、代替として「Ａ」または「Ｇ」である。
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の１９位（５’末端から）
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２０位（５’末端から）
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２１位（５’末端から）
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２２位（５’末端から）
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２３位（５’末端から）
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２４位（５’末端から）
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２５位（５’末端から）
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の１位（５’末端から）
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の２位（５’末端から）
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の３位（５’末端から）
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の４位（５’末端から）
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の５位（５’末端から）
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の６位（５’末端から）
ＡＡＴ－５０６ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の７位（５’末端から）
別の実施例として、以下の構造において、そのようなミスマッチは、非対称ＡＡＴ－１０５９ ＤｓｉＲＮＡに導入される（新たに導入されたミスマッチ残基を斜体で示す）：
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の１９位（５’末端から）
任意で、センス鎖の１９位のミスマッチ「Ａ」残基は、代替として「Ｕ」または「Ｃ」である。
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２０位（５’末端から）
任意で、センス鎖の２０位のミスマッチ「Ｕ」残基は、代替として「Ａ」または「Ｇ」である。
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２１位（５’末端から）
任意で、センス鎖の２１位のミスマッチ「Ａ」残基は、代替として「Ｃ」または「Ｇ」である。
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２２位（５’末端から）
任意で、センス鎖の２２位のミスマッチ「Ｕ」残基は、代替として「Ａ」または「Ｃ」である。
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２３位（５’末端から）
任意で、センス鎖の２３位のミスマッチ「Ｕ」残基は、代替として「Ｃ」または「Ｇ」である。
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２４位（５’末端から）
任意で、センス鎖の２４位のミスマッチ「ｇ」残基は、代替として「ａ」または「ｃ」である。
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２５位（５’末端から）
任意で、センス鎖の２５位のミスマッチ「ａ」残基は、代替として「ｔ」または「ｃ」である。
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の１位（５’末端から）
任意で、アンチセンス鎖の１位のミスマッチ「Ｕ」残基は、代替として「Ａ」または「Ｇ」である。
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の２位（５’末端から）
任意で、アンチセンス鎖の２位のミスマッチ「Ｃ」残基は、代替として「Ｕ」または「Ｇ」である。
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の３位（５’末端から）
任意で、アンチセンス鎖の３位のミスマッチ「Ａ」残基は、代替として「Ｃ」または「Ｇ」である。
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の４位（５’末端から）
任意で、アンチセンス鎖の４位のミスマッチ「Ａ」残基は、代替として「Ｕ」または「Ｇ」である。
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の５位（５’末端から）
任意で、アンチセンス鎖の５位のミスマッチ「Ｕ」残基は、代替として「Ｃ」または「Ｇ」である。
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の６位（５’末端から）
任意で、アンチセンス鎖の６位のミスマッチ「Ａ」残基は、代替として「Ｕ」または「Ｃ」である。
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の７位（５’末端から）
任意で、アンチセンス鎖の７位のミスマッチ「Ｕ」残基は、代替として「Ａ」または「Ｇ」である。
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の１９位（５’末端から）
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２０位（５’末端から）
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２１位（５’末端から）
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２２位（５’末端から）
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２３位（５’末端から）
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２４位（５’末端から）
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２５位（５’末端から）
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の１位（５’末端から）
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の２位（５’末端から）
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の３位（５’末端から）
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の４位（５’末端から）
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の５位（５’末端から）
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の６位（５’末端から）
ＡＡＴ－１０５９ ２５／２７量体 ＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の７位（５’末端から）
上のオリゴヌクレオチド鎖配列の場合、一方の描写された二重鎖のセンス鎖配列が他方の描写された二重鎖のアンチセンス鎖と組み合わされ、それにより異なる二重鎖を形成し得ることが企図され、ある特定の例において、そのような二重鎖は、α１アンチトリプシン標的転写産物配列に関してミスマッチ残基を含むが、そのようなセンス及びアンチセンス鎖配列は、互いに関してこの残基のミスマッチを表さない（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３２６及び３３３９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３２７及び３３３８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３２８及び３３３７などを含む二重鎖が、そのような二重鎖の例示として企図される）。
上に記述された通り、ミスマッチの導入は、本明細書に記載されたＤｓｉＲＮＡのいずれかで実施され得る。
そのようなＤｓｉＲＮＡ構造のミスマッチを組み合わせて、例えば、センス鎖の３’末端４～７ヌクレオチド／アンチセンス鎖の５’末端４～７ヌクレオチドの中に２、３または４個のミスマッチを有する、ＤｓｉＲＮＡを作製することができる。
実際に、センス鎖の３’末端残基／アンチセンス鎖の５’末端残基のＤｓｉＲＮＡに組み込まれ得る配列の柔軟性を考慮すると、ある特定の実施形態において、本発明の非対称ＤｓｉＲＮＡの配列要件は、以下の（最小）構造（例示的なα１アンチトリプシン－５０６ＤｓｉＲＮＡ配列について示される）として表すことができる：
ここで、ｎ＝１～５、１～１０、１～２０、１～３０、１～５０、または１～８０またはそれを超える。
該α１アンチトリプシン標的部位は、相補性標的部位が所定の標的部位とオーバーラップする複数のオリゴヌクレオチドのうちの１つまたは複数により標的とされる部位でもあり得る。例えば例示的α１アンチトリプシン－５０６ ＤｓｉＲＮＡの場合、ある特定のＤｓｉＲＮＡ標的化オーバーラッピング及びほんのわずかなオフセットα１アンチトリプシン配列が、α１アンチトリプシン－５０６（例えば、上の図２のα１アンチトリプシン－５００～５１３）と類似の活性レベルを呈し得ることが注目される。したがってある特定の実施形態において、指定された標的配列領域は、大きくオーバーラップする配列を有する一連のＤｓｉＲＮＡにより効果的に標的とされ得る（例えば、α１アンチトリプシン－５００～α１アンチトリプシン－５１３の標的部位（複数可）のＤｓｉＲＮＡを考慮すれば、より多く含むα１アンチトリプシン転写産物標的配列を、例えば５’－ＣＡＣＣＡＡＵＡＵＣＵＵＣＵＵＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＡＧＣＡＵＣＧＣＵ－３’（配列番号３３５７）として挙げることができ、その場合、任意の所与のＤｓｉＲＮＡ（例えば、α１アンチトリプシン－５００～α１アンチトリプシン－５１３から選択されるＤｓｉＲＮＡ）だけが、そのような配列領域内の部分配列を標的とするが、配列全体が、そのような一連のＤｓｉＲＮＡの実行可能な標的として考慮され得る。
追加及び／または代わりとして、センス鎖の３’末端７ヌクレオチド／アンチセンス鎖の５’末端 ７ヌクレオチド内のミスマッチを、先に記載された通り、他のミスマッチ耐性位置にあるミスマッチと組み合わせることができる。
特定のα１アンチトリプシン配列を標的とすることを通してα１アンチトリプシンレベルの阻害剤としての、上に記載されたダイサー基質剤（ＤｓｉＲＮＡ）の本発明の識別を考慮すれば、ＮＭ＿０００２９５．４のα１アンチトリプシン配列中、またはその変形例の中の他の配列を標的とする（例えば、ＮＭ＿０００２９５．４の配列と８０％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性、９６％の同一性、９７％の同一性、９８％の同一性、９９％またはそれを超える同一性を有する配列を標的とする）、本明細書に記載されたものと類似の構造を有するｄｓＲＮＡも合成され得ることも認識される。
抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡの設計／合成
２５～３５ヌクレオチド（ＤｓｉＲＮＡ）及び特に２５～３０ヌクレオチドの長いｄｓＲＮＡ種が、１９～２３量体ｓｉＲＮＡ剤に比較して、効力及び作用期間に関して予想外に効果的な結果を与えることが、経験的に見出された。ｄｓＲＮＡ処理メカニズムの基本理論に束縛されるのを望むものではないが、より長いｄｓＲＮＡ種が、細胞質中でダイサー酵素の基質として働くことが考えられる。ダイサーは、本発明のｄｓＲＮＡをより短いセグメントに切断することに加え、切断されたｄｓＲＮＡに由来する一本鎖切断産物の、α１アンチトリプシンの標的遺伝子（またはα１アンチトリプシン関連疾患もしくは障害に関連する他の遺伝子）の細胞質ＲＮＡ（例えば、α１アンチトリプシンＲＮＡ）、またはそれに由来する細胞質ＲＮＡの破壊を担うＲＩＳＣ複合体への取り込みを促進することが考えられる。以前の研究（Ｒｏｓｓｉら、米国特許出願公開第２００７／０２６５２２０号）で、ダイサーによるｄｓＲＮＡ種（特に、ＤｓｉＲＮＡ剤）の切断可能性が、ｄｓＲＮＡ種の効力及び作用期間の増大と一致することが示されている。
２５～３５ヌクレオチド（ＤｓｉＲＮＡ）及び特に２５～３０ヌクレオチドの長いｄｓＲＮＡ種が、１９～２３量体ｓｉＲＮＡ剤に比較して、効力及び作用期間に関して予想外に効果的な結果を与えることが、経験的に見出された。ｄｓＲＮＡ処理メカニズムの基本理論に束縛されるのを望むものではないが、より長いｄｓＲＮＡ種が、細胞質中でダイサー酵素の基質として働くことが考えられる。ダイサーは、本発明のｄｓＲＮＡをより短いセグメントに切断することに加え、切断されたｄｓＲＮＡに由来する一本鎖切断産物の、α１アンチトリプシンの標的遺伝子（またはα１アンチトリプシン関連疾患もしくは障害に関連する他の遺伝子）の細胞質ＲＮＡ（例えば、α１アンチトリプシンＲＮＡ）、またはそれに由来する細胞質ＲＮＡの破壊を担うＲＩＳＣ複合体への取り込みを促進することが考えられる。以前の研究（Ｒｏｓｓｉら、米国特許出願公開第２００７／０２６５２２０号）で、ダイサーによるｄｓＲＮＡ種（特に、ＤｓｉＲＮＡ剤）の切断可能性が、ｄｓＲＮＡ種の効力及び作用期間の増大と一致することが示されている。
ある特定の好ましい抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ剤を、予備スクリーニングの集団から選択した。ＤｓｉＲＮＡの設計は、任意で、配列領域にかかる複数の可能なＤｓｉＲＮＡ剤の予測される活性／有効性のインシリコ評価を実施する予測スコアリングアルゴリズムの使用を含み得る。そのようなスコアリングアルゴリズムの設計に関する情報は、例えばＧｏｎｇらの文献（ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００６， ７：５１６）に見出され得るが、より近年の「ｖ４．３」アルゴリズムは、当該技術分野でこれまで入手可能であったｓｉＲＮＡスコアリングアルゴリズムよりも理論的に改善されたアルゴリズムを表す（例えば、「ｖ３」及び「ｖ４」スコアリングアルゴリズムは、ヒトの配列にある任意のバイアスに頼らない機械学習アルゴリズムである。加えて「ｖ３」及び「ｖ４」アルゴリズムは、Ｇｏｎｇらの文献に記載されたような古い「ｖ２」アルゴリズムよりも数倍大きなデータセットに由来する）。
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の第一及び第二のオリゴヌクレオチドは、完全に相補性がある必要はない。事実、一実施形態において、センス鎖の３’末端は、１つまたは複数のミスマッチを含む。一態様において、２つのミスマッチが、センス鎖の３’末端に組み込まれている。別の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを２つ含む二本鎖ＲＮＡ分子であり、該ＲＮＡオリゴヌクレオチドのそれぞれは、２７ヌクレオチド長であり、互いにアニーリングされると、センス鎖の３’末端（アンチセンス鎖の５’末端）に平滑末端及び２つのヌクレオチドミスマッチを有する。おそらくＲＩＳＣへのｓｉＲＮＡ導入と共に生じる幾つかの律速的な巻戻しステップに影響を及ぼすことにより、ＲＩＳＣへのアンチセンス導入を促進する、または好適にするために、ミスマッチまたは熱力学的安定性低減の利用（特に３’－センス／５’－アンチセンス位置で）が提案されている（Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｃｅｌｌ １１５： １９９－２０８； Ｋｈｖｏｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｃｅｌｌ １１５： ２０９－２１６）。したがって末端塩基構成が、活性のある２１量体ｓｉＲＮＡ二重鎖を選択するための設計アルゴリズムに含まれている（Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３２： ９３６－９４８； Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２： ３２６－３３０）。この実施形態のｄｓＲＮＡのダイサー切断により、ミスマッチを含む小さな末端配列は、アンチセンス鎖と対合しないままである（３’－オーバーハングの一部になる）か、または最終的な２１量体ｓｉＲＮＡに完全に切断されるかのどちらかになろう。それゆえこれらの「ミスマッチ」は、ＲＩＳＣの最終的なＲＮＡ成分の中のミスマッチとして存続しない。おそらくダイサーによる処理を促進することにより、ダイサー基質のセンス鎖３’末端セグメントの塩基ミスマッチまたは不安定化が、ＲＮＡｉにおける合成二重鎖の効力を改善したという発見は、２５～３０量体ｄｓＲＮＡ（本明細書では「ＤｓｉＲＮＡ」とも称する）の設計及び使用を記載する過去の研究の驚くべき発見であった（Ｒｏｓｓｉら、米国特許出願公開第２００５／０２７７６１０号、同第２００５／０２４４８５８号及び同第２００７／０２６５２２０号）
α１アンチトリプシンｄｓＲＮＡの修飾
二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）の効果を阻害する１つの重要な因子は、ヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ及びＤｓｉＲＮＡ）の分解である。３’－エキソヌクレアーゼは、血清中に存在する主要なヌクレアーゼ活性であり、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端の修飾は、分解を予防するのに不可欠である（Ｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ Ｄｅｖ， １： １４１－１５１）。ｓｉＲＮＡの調節及び分解に関与する３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＥＲＩ－１と呼ばれるＲＮａｓｅ－Ｔファミリーヌクレアーゼが、同定されている（Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｎａｔｕｒｅ ４２７： ６４５－６４９； Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ， ３９０： ６７５－６７９）。この遺伝子は、マウスにおいてＴｈｅｘ１（ＮＭ＿０２０６７）、またはヒトにおいてＴＨＥＸ１（ＮＭ＿１５３３３２）としても公知であり、ヒストンｍＲＮＡの分解に関与し、ｓｉＲＮＡ内の３’－オーバーハングの分解も仲介するが、二重鎖ＲＮＡは分解しない（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２８１： ３０４４７－３０４５４）。それゆえ、本発明のＤｓｉＲＮＡをはじめとするｄｓＲＮＡの３’末端安定化が安定性を改善するであろうという予測は、合理的である。
二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）の効果を阻害する１つの重要な因子は、ヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ及びＤｓｉＲＮＡ）の分解である。３’－エキソヌクレアーゼは、血清中に存在する主要なヌクレアーゼ活性であり、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端の修飾は、分解を予防するのに不可欠である（Ｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ Ｄｅｖ， １： １４１－１５１）。ｓｉＲＮＡの調節及び分解に関与する３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＥＲＩ－１と呼ばれるＲＮａｓｅ－Ｔファミリーヌクレアーゼが、同定されている（Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｎａｔｕｒｅ ４２７： ６４５－６４９； Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ， ３９０： ６７５－６７９）。この遺伝子は、マウスにおいてＴｈｅｘ１（ＮＭ＿０２０６７）、またはヒトにおいてＴＨＥＸ１（ＮＭ＿１５３３３２）としても公知であり、ヒストンｍＲＮＡの分解に関与し、ｓｉＲＮＡ内の３’－オーバーハングの分解も仲介するが、二重鎖ＲＮＡは分解しない（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２８１： ３０４４７－３０４５４）。それゆえ、本発明のＤｓｉＲＮＡをはじめとするｄｓＲＮＡの３’末端安定化が安定性を改善するであろうという予測は、合理的である。
ＸＲＮ１（ＮＭ＿０１９００１）は、Ｐボディ中に存在する５’－３’エキソヌクレアーゼであり、ｍｉＲＮＡにより標的とされるｍＲＮＡの分解に関連づけられており（Ｒｅｈｗｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， ２００５， ＲＮＡ １１： １６４０－１６４７）、ｓｉＲＮＡに誘導される内部切断により開始された分解の完了も担う可能性がある。ＸＲＮ２（ＮＭ ＿０１２２５５）は、核ＲＮＡ処理に関与する別の５’－３’エキソヌクレアーゼである。
ＲＮａｓｅ Ａは、ＲＮＡを分解する哺乳動物体内の主要なエンドヌクレアーゼ活性である。それは、ｓｓＲＮＡに特異性があり、ピリミジン塩基の３’末端を切断する。ＲＮａｓｅ Ａ切断と一致するｓｉＲＮＡ分解産物が、血清中でのインキュベーション後の質量分析により検出され得る（Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ ３： ４３－５０）。３’－オーバーハングは、ＲＮａｓｅ分解へのｓｉＲＮＡの感受性を増強する。血清からのＲＮａｓｅ Ａ枯渇により、ｓｉＲＮＡ分解が減少する（この分解は、幾つかの配列好適性を示し、末端にポリＡ／Ｕ配列を有する配列にとっては好ましくない（Ｈａｕｐｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．， ２００６ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７１： ７０２－７１０）。このことから、この二重鎖の低安定性領域が「よみがえり（ｂｒｅａｔｈｅ）」、ＲＮａｓｅ Ａによる分解に利用可能な一過性の一本鎖種を提供する可能性が示唆される。ＲＮａｓｅ Ａ阻害剤を血清に添加して、ｓｉＲＮＡの寿命及び効力を改善することができる（Ｈａｕｐｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｉｎｔ Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ １２１： ２０６－２１０）。
２１量体において、ホスホロチオアートまたはボラノホスファート修飾は、ヌクレオシドリン酸間結合を直接安定化させる。ボラノホスファート修飾ＲＮＡは、高いヌクレアーゼ耐性があり、サイレンシング剤として効力があり、比較的非毒性である。ボラノホスファート修飾ＲＮＡは、標準的な化学合成法を用いて製造することができず、代わりにインビトロ転写（ＩＶＴ）により作製される（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３２： ５９９１－６０００； Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４： ２７７３－２７８１）。ホスホロチオアート（ＰＳ）修飾は、任意の所望の位置のＲＮＡ二重鎖に容易に配置することができ、標準的な化学合成法を利用して作製することができる。ＰＳ修飾は、用量依存的毒性を示し、そのためほとんどの研究者がｓｉＲＮＡへの限定的組み込みを推奨しており、それはヌクレアーゼからの防御が最も重要となる３’末端が好適である（Ｈａｒｂｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ １３： ８３－１０５； Ｃｈｉｕ ａｎｄ Ｒａｎａ， ２００３， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０： ５４９－５６１； Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２： ７９６７－７９７５； Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１： ５８９－５９５）。より広範囲のＰＳ修飾が、強力なＲＮＡｉ活性と適合し得るが、糖修飾（２’－Ｏ－メチルＲＮＡなど）の利用がより優れている可能性がある（Ｃｈｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３４２： ９１９－９２７）。
様々な置換を、一般に二重鎖安定性（Ｔｍ）を上昇させるリボースの２’位に配置させることができ、それはヌクレアーゼ耐性を大きく改善する可能性がある。２’－Ｏ－メチルＲＮＡは、哺乳動物リボソームＲＮＡ及びトランスファーＲＮＡ内に見出される天然由来の修飾である。ｓｉＲＮＡ内での２’－Ｏ－メチル修飾は、公知であるが、二重鎖内の修飾塩基の精密な位置が、効力を保持するのに重要であり、２’－Ｏ－メチルＲＮＡによるＲＮＡの完全な置換が、ｓｉＲＮＡを不活性化するであろう。例えば交互配置の２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基を利用するパターンは、非修飾ＲＮＡと同等の効力を有し得、血清中で極めて安定している（Ｃｈｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３４２： ９１９－９２７； Ｃｚａｕｄｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１： ２７０５－２７１６）。
２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾もまた、ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ及びＤｓｉＲＮＡ）の機能と適合性があり；それは、ピリミジン部位に最も一般的に配置され（試薬のコスト及び入手可能性による）、プリン位置の２’－Ｏ－メチル修飾を組み合わせることができ；２’－Ｆプリンが入手可能で、使用することもできる。この種の大きく修飾された二重鎖は、インビトロでＲＮＡｉの強力な惹起物質となり得て（Ａｌｌｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４８： ９０１－９０４； Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４８： ４２４７－４２５３； Ｋｒａｙｎａｃｋ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ， ２００６， ＲＮＡ １２： １６３－１７６）、インビボで用いられた場合には性能の改善及び作用期間の延長を可能にする（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４１： １３４９－１３５６； Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３： １００２－１００７）。非常に効力があり、ヌクレアーゼ安定性があり、平滑な１９量体二重鎖含有の代替的２’－Ｆ及び２’－Ｏ－Ｍｅ塩基が、Ａｌｌｅｒｓｏｎにより教示されている。この設計において、交互配置の２’－Ｏ－Ｍｅ残基が、Ｃｚａｕｄｅｒｎａにより用いられたものと同一パターンで位置しているが、残りのＲＮＡ残基は、２’－Ｆ修飾塩基に変換される。Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙにより用いられた非常に強力でヌクレアーゼ耐性があるｓｉＲＮＡは、インビボで非常に強力でヌクレアーゼ耐性のあるｓｉＲＮＡを使用した。この二重鎖は、２’－Ｏ－Ｍｅ ＲＮＡ及び２’－Ｆ ＲＮＡに加えて、ＤＮＡ、ＲＮＡ、反転した脱塩基残基、及び３’末端のＰＳヌクレオシド間結合を含む。広範囲の修飾は、ある特定の利点を有するが、より限定的な二重鎖修飾もまた、インビボ性能を改善することができ、製造がより簡単で低コストである。Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら（２００４， Ｎａｔｕｒｅ ４３２： １７３－１７８）は、インビボで二重鎖を使用し、ほとんどが２つの２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基及び限定された３’末端ＰＳヌクレオシド間結合を有するＲＮＡであった。
ロックされた核酸（ＬＮＡ）は、ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ及びＤｓｉＲＮＡ）を安定化するために用いられ得る２’修飾の異なる分類である。効力を維持するＬＮＡ組み込みのパターンは、２’－Ｏ－メチルまたは２’－Ｆ塩基よりも制限されており、そのため限定的修飾が好ましい（Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２： ７９６７－７９７５； Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１： ３１８５－３１９３； Ｅｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３： ４３９－４４７）。限定された組み込みであっても、ＬＮＡ修飾の利用は、ｄｓＲＮＡ性能をインビボで改善することができ、オフターゲット効果のプロファイルを変更または改善する場合もある（Ｍｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ６： ８３３－８４３）。
細胞または生きた動物中に導入される合成核酸は、「外来物質」として認識され、免疫応答を惹起する可能性がある。免疫刺激は、オフターゲット効果の主要な分類を構成し、実験結果を大幅に変化させて、細胞死を導く可能性さえある。生来の免疫系には、これらの応答を仲介するＤＮＡ及びＲＮＡと特異的に相互作用する受容体分子の集合体が含まれ、それらの一部は細胞質中に配置され、一部はエンドソーム中に存在する（Ｍａｒｑｕｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ２００５， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３： １３９９－１４０５； Ｓｃｈｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １４： ４６３－４７０）。カチオン性脂質またはリポソームによるｓｉＲＮＡの送達は、ｓｉＲＮＡを細胞質及びエンドソームコンパートメントの両方に暴露し、１型インターフェロン（ＩＦＮ）応答をインビトロ及びインビボの両方で惹起するリスクを最大にする（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３： １００２－１００７； Ｓｉｏｕｄ ａｎｄ Ｓｏｒｅｎｓｅｎ， ２００３， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３１２： １２２０－１２２５； Ｓｉｏｕｄ， ２００５， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３４８： １０７９－１０９０； Ｍａ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３３０： ７５５－７５９）。細胞内で転写されたＲＮＡは、免疫原性がより低く（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２４： ５６６－５７１）、脂質に基づく方法を利用して送達される場合に免疫原性となる合成ＲＮＡは、インビボであっても、機械的手法によって細胞に導入されれば、免疫刺激を回避することができる（Ｈｅｉｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２： １５７９－１５８２）。しかし、脂質に基づく送達方法は、簡便で効果的であり、広く使用されている。特に全ての細胞型が存在し、免疫応答を発生するリスクが最も高いインビボ適用では、免疫応答を防御する幾つかの一般的方策が必要とされる。化学修飾ＲＮＡの使用は、これらの問題のほとんど、または全てまでを解決し得る。
ある特定の実施形態において、修飾によってｄｓＲＮＡ剤がα１アンチトリプシン阻害活性を有するのを妨害しない限りは、修飾を抗α１アンチトリプシンｄｓＲＮＡ剤に含めることができる。一実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ剤のダイサー処理を増強する、１つまたは複数の修飾が行われる（ＤｓｉＲＮＡのダイサー処理を測定するアッセイが本明細書の他の箇所に記載される）。第二の実施形態において、より効果的なα１アンチトリプシン阻害をもたらす、１つまたは複数の修飾が行われる（本明細書に記載された通り、ｄｓＲＮＡのα１アンチトリプシン阻害／α１アンチトリプシン阻害活性は、ＲＮＡレベルを測定するため、またはα１アンチトリプシンポリペプチドレベルを測定するための当該技術分野で認識された方法によりアッセイすることができ、そのようなレベルを、例えばα１アンチトリプシンｍＲＮＡレベルの評価の代わり、またはそれに加えて、アッセイしなければならない）。第三の実施形態において、より大きなα１アンチトリプシン阻害活性を支援する１つまたは複数の修飾が行われる（α１アンチトリプシン阻害活性を測定する手段は、先に記載された）。第四の実施形態において、細胞に送達される各ｄｓＲＮＡ剤分子あたりのα１アンチトリプシン阻害活性をより強力にする、１つまたは複数の修飾が行われる（α１アンチトリプシン阻害活性の効力は、先に記載された）。修飾は、３’末端領域、５’末端領域、３’末端と５’末端領域の両方、または幾つかの例においては配列内の様々な位置に組み込まれ得る。上述の制限を考慮した上で、複数の修飾及び修飾の組み合わせを、ｄｓＲＮＡ剤に組み込むことができる。複数の修飾が存在する場合、それらは同一であっても、または異なっていてもよい。塩基、糖部分、リン酸バックボーン、及びそれらの組み合わせへの修飾が、企図される。５’末端のどちらかを、リン酸化することができる。
リン酸バックボーンに企図される修飾の例として、メチルホスホナートをはじめとするホスホナート、ホスホロチオアート、及びアルキルホスホトリエステルなどのホスホトリエステル修飾などが挙げられる。糖部分に企図される修飾の例としては、２’－Ｏ－メチルなどの２’－アルキルピリミジン、２’－フルオロ、アミノ、及びデオキシ修飾などが挙げられる（例えば、Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１： ５８９－５９５参照）。塩基の基に企図される修飾の例としては、脱塩基糖、２－Ｏ－アルキル修飾ピリミジン、４－チオウラシル、５－ブロモウラシル、５－ヨードウラシル、及び５－（３－アミノアリル）－ウラシルなどが挙げられる。ロックされた核酸またはＬＮＡもまた、組み込まれ得る。多くの他の修飾が公知であり、上記の基準が満たされる限り、利用することができる。修飾の例は、米国特許第５，６８４，１４３号、同第５，８５８，９８８号、及び同第６，２９１，４３８号、ならびに米国特許出願公開第２００４／０２０３１４５ Ａ１号にも開示される。他の修飾は、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ（２０００， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ １０： ２９７－３１０）、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（２０００， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ １０： １１７－２１）、Ｒｕｓｃｋｏｗｓｋｉら（２０００， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ １０： ３３３－３４５）、Ｓｔｅｉｎら（２００１， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ １１： ３１７－２５）、Ｖｏｒｏｂｊｅｖら（２００１， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ １１： ７７－８５）の文献に開示される。
企図される１つまたは複数の修飾を、どちらの鎖にも組み込むことができる。ｄｓＲＮＡ剤における修飾の配置は、より大きな効力及び安定性を付与すること、毒性を減少させること、ダイサー処理を増進すること、ならびに免疫応答を最小限にすることをはじめとし、ｄｓＲＮＡ剤の特徴に大きく影響を及ぼし得る。一実施形態において、アンチセンス鎖もしくはセンス鎖、またはそれらの両方は、１つまたは複数の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを有する。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドで構成された３’オーバーハングを含む。アンチセンス鎖は、追加の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含むこともできる。
ある特定の実施形態において、本発明の抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ剤は、ダイサーによる処理を増進する幾つかの特性を有する。そのような実施形態によれば、該ＤｓｉＲＮＡ剤は、ダイサーによって処理されてｓｉＲＮＡを生成するのに十分な長さ、及び以下の特性の少なくとも１つを有する：（ｉ）ＤｓｉＲＮＡ剤が非対称であり、例えばセンス鎖に３’オーバーハングを有すること、及び（ｉｉ）ＤｓｉＲＮＡ剤がダイサーによる結合およびｄｓＲＮＡから活性ｓｉＲＮＡへの処理の方向を指示するためにアンチセンス鎖の修飾３’末端を有すること。これらの実施形態によれば、ＤｓｉＲＮＡ剤の最長の鎖は、２５～３０ヌクレオチドを含む。一実施形態において、センス鎖は、２５～３０ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、２５～２８ヌクレオチドを含む。したがって、得られたｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’末端にオーバーハングを有する。このオーバーハングは、２ヌクレオチドなどの１～４ヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、５’リン酸も有し得る。
ある特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、センス鎖の３’末端に配置された適切な修飾因子により、ダイサー処理に向けて修飾される、即ち、ＤｓｉＲＮＡ剤は、ダイサー結合及び処理の方向を指示するように設計される。適切な修飾因子としては、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなどのヌクレオチド、及び蛍光分子などの立体障害分子が挙げられる。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰ内に通常存在する２’－デオキシリボフラノシル糖が２－ヒドロキシエトキシメチル基で置換されている。他のヌクレオチド修飾因子としては、３’－デオキアデノシン（コルジセピン）、３’－アジド－３’－デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’－ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’－ジデオキシ－３’－チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’－ジデヒドロ－２’，３’－ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、ならびに３’－アジド－３’－デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’－ジデオキシ－３’－チアシチジン（３ＴＣ）及び２’，３’－ジデヒドロ－２’，３’－ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドを挙げることができる。一実施形態において、デオキシヌクレオチドが、修飾因子として使用される。ヌクレオチド修飾因子が使用される場合、１～３ヌクレオチド修飾因子または２ヌクレオチド修飾因子が、センス鎖の３’末端上のリボヌクレオチドと置換される。立体障害分子が使用される場合、それらをアンチセンス鎖の３’末端のリボヌクレオチドに結合させる。したがって鎖の長さは、修飾因子の組み込みによって変化しない。別の実施形態において、本発明は、ダイサー処理の方向を指示するためにｄｓＲＮＡ内で２つのＤＮＡ塩基を置換することを企図する。さらなる発明において、２つの末端ＤＮＡ塩基が、２つのリボヌクレオチドの代わりにセンス鎖の３’末端に配置されて、アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端の二重鎖に平滑末端を形成させ、２ヌクレオチドのＲＮＡオーバーハングがアンチセンス鎖の３’末端に配置される。これは、平滑末端にＤＮＡ、そしてオーバーハング末端にＲＮＡ塩基を有する非対称構成となる。
ある特定の別の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端に配置された適切な修飾因子により、ダイサー処理に向けて修飾される、即ち、ＤｓｉＲＮＡ剤は、ダイサー結合及び処理の方向性を指示するように設計される。適切な修飾因子としては、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなどのヌクレオチド、及び蛍光分子などの立体障害分子が挙げられる。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰ中に通常存在する２’－デオキシリボフラノシル糖が２－ヒドロキシエトキシメチル基で置換されている。他のヌクレオチド修飾因子として、３’－デオキアデノシン（コルジセピン）、３’－アジド－３’－デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’,３’－ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’,３’－ジデオキシ－３’－チアシチジン（３ＴＣ）、２’,３’－ジデヒドロ－２’,３’－ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、ならびに３’－アジド－３’－デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’,３’－ジデオキシ－３’－チアシチジン（３ＴＣ）、及び２’,３’－ジデヒドロ－２’,３’－ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドを挙げることができる。一実施形態において、デオキシヌクレオチドが、修飾因子として使用される。ヌクレオチド修飾因子が使用される場合、１～３ヌクレオチド修飾因子または２ヌクレオチド修飾因子が、アンチセンス鎖の３’末端上のリボヌクレオチドと置換される。立体的障害分子が使用される場合、それらをアンチセンス鎖の３’末端のリボヌクレオチドに結合させる。したがって鎖の長さは、修飾因子の組み込みによって変化しない。別の実施形態において、本発明は、ダイサー処理の方向を指示するためにｄｓＲＮＡ内で２つのＤＮＡ塩基を置換することを企図する。さらなる発明において、２つの末端ＤＮＡ塩基が、２つのリボヌクレオチドの代わりにアンチセンス鎖の３’末端に配置されて、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端の二重鎖に平滑末端を形成させ、２ヌクレオチドのＲＮＡオーバーハングがセンス鎖の３’末端に配置される。これもまた、平滑末端にＤＮＡ、そしてオーバーハング末端にＲＮＡ塩基を有する非対称の構成となる。
センス及びアンチセンス鎖は、細胞質中に見出される条件などの生物学的条件下でアニーリングする。加えて、ｄｓＲＮＡの、特にアンチセンス鎖の、配列の１つの領域は、少なくとも１９ヌクレオチド長の配列を有し、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に隣接し、標的α１アンチトリプシンＲＮＡのヌクレオチド配列に十分に相補性がある。
加えて、ダイサー切断により生じたオリゴヌクレオチドセグメントが遺伝子発現を阻害する上で最も効果的であるオリゴヌクレオチドの部分になることが確実になるように、ＤｓｉＲＮＡ剤の構造が最適化され得る。例えば、本発明の一実施形態において、遺伝子発現を阻害する、予期される２１～２２ｂｐセグメントが、アンチセンス鎖の３’末端に配置された、ＤｓｉＲＮＡ剤の構造の２７ｂｐオリゴヌクレオチドが合成される。アンチセンス鎖の５’末端に配置された残りの塩基は、ダイサーにより切断され、廃棄されるであろう。この切断された部分は、相同性（即ち、標的配列の配列に基づく）または非相同性であってもよく、核酸鎖を伸長するために添加され得る。
ＵＳ２００７／０２６５２２０に、２７量体ＤｓｉＲＮＡ剤が化学修飾を含まなくとも、同等の２１量体ｓｉＲＮＡ組成物よりも改善された血清中安定性を示したことが開示されている。先に詳述されたようなパターンの、アンチセンス鎖中の２’－Ｏ－メチルＲＮＡの含有などのＤｓｉＲＮＡ剤の修飾が、５’リン酸の付加と併せると、ＤｓｉＲＮＡ剤の安定性を改善し得る。合成ＲＮＡ二重鎖中の全ての鎖に５’リン酸を付加することは、若干限定されたヌクレアーゼ安定性を付与する安価な生理学的方法になり得る。
本発明のｄｓＲＮＡ剤の化学修飾パターンは、そのような薬剤の有効性を増強するように設計される。したがってそのような修飾は、ｄｓＲＮＡ剤の効力低下を回避するように、ＤｓｉＲＮＡ剤とダイサー処理との干渉を回避するように、ｄｓＲＮＡ剤の生体液中の安定性を改善するように（ヌクレアーゼ感受性を低下させるように）、または生来の免疫系により検出を遮断もしくは回避するように設計される。そのような修飾はまた、毒性になることを回避するように、そして本発明の本ｄｓＲＮＡ剤の製造のコスト上昇を回避するように、または容易性に影響を及ぼすように設計される。
本発明のある特定の実施形態において、抗α１アンチトリプシンＤｓｉＲＮＡ剤は、以下の特性の１つまたは複数を有する：（ｉ）ＤｓｉＲＮＡ剤が非対称であり、例えばアンチセンス鎖上に３’オーバーハングを有すること、及び（ｉｉ）ＤｓｉＲＮＡ剤がダイサーによる結合及びｄｓＲＮＡから活性ｓｉＲＮＡへの処理の方向を指示するためのセンス鎖の修飾３’末端を有すること。これらの実施形態によれば、ＤｓｉＲＮＡ剤の最長の鎖は、２５～３５ヌクレオチド（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５ヌクレオチド）を含む。ある特定のそのような実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡ剤は、非対称であり、そのためセンス鎖は、２５～３４ヌクレオチドを含み、センス鎖の３’末端は、アンチセンス鎖の５’末端と共に平滑末端を形成し、一方でアンチセンス鎖は、２６～３５ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖の３’末端上にオーバーハングを形成する。一実施形態において、該ＤｓｉＲＮＡ剤は、非対称であり、センス鎖は、２５～２８ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、２５～３０ヌクレオチドを含む。したがって、得られたｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを有する。このオーバーハングは、１～４ヌクレオチド、例えば２ヌクレオチドである。センス鎖は、５’リン酸も有し得る。
ＤｓｉＲＮＡ剤は、以下の追加の特性のうちの１つまたは複数も有し得る：（ａ）アンチセンス鎖が、典型的な２１量体から右方シフトを有すること（例えば、ＤｓｉＲＮＡは、ＤｓｉＲＮＡ内の予測されるダイサー切断部位の５’末端に伸長するアンチセンス鎖ヌクレオチドの長さを含み、そのようなアンチセンス鎖ヌクレオチドは、センス鎖内の予測されるダイサー切断部位の３’に伸長するセンス鎖の対応するヌクレオチドと対合している）、（b）鎖が、完全に相補性がなくてもよいこと、即ち、鎖が、簡単なミスマッチ塩基対を含んでいてもよいこと（特定の実施形態において、ミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡのα１アンチトリプシン阻害活性が十分なレベルで保持される（例えば、ミスマッチ塩基対を有さない対応するＤｓｉＲＮＡに比較して、少なくとも５０％もしくはそれを超えるα１アンチトリプシン阻害活性、少なくとも６０％もしくはそれを超えるα１アンチトリプシン阻害活性、少なくとも７０％もしくはそれを超えるα１アンチトリプシン阻害活性、少なくとも８０％もしくはそれを超えるα１アンチトリプシン阻害活性、少なくとも９０％もしくはそれを超えるα１アンチトリプシン阻害活性、または少なくとも９５％もしくはそれを超えるα１アンチトリプシン阻害活性を保持する）ことを条件として、本発明のＤｓｉＲＮＡが、１、２、３、４または５またはそれを超えるミスマッチ塩基対を有する。ある特定の実施形態において、ミスマッチ塩基対は、ＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖とセンス鎖の間に存在する。幾つかの実施形態において、ミスマッチ塩基対は、アンチセンス鎖と標的ＲＮＡの間に存在する（または存在すると予測される）。ある特定の実施形態において、アンチセンス鎖残基と、予測されるＡｇｏ２切断部位の標的ＲＮＡ配列内の３’に配置された標的ＲＮＡ内の対応する残基と、の間にミスマッチ塩基対（複数可）の存在が保持され、それが本発明のＤｓｉＲＮＡのα１アンチトリプシン阻害活性を増強し得る）、及び、（c）ロックされた核酸（複数可）などの塩基修飾が、センス鎖の５’末端に含まれていてもよいこと。「典型的な」２１量体ｓｉＲＮＡは、従来技術を使用して設計される。１つの技術において、一般的には様々な部位を、並行してテストするか、または同じ標的に特異的な複数の異なるｓｉＲＮＡ二重鎖を含むプールにおいて、試薬のうちの１つが効果的であることを期待してテストする（Ｊｉ ｅｔ ａｌ．， ２００３， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５５２： ２４７－２５２）。他の技術では、活性ＲＮＡｉエフェクター分子を得る可能性を高めるための設計規則及びアルゴリズムが利用される（Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｃｅｌｌ １１５： １９９－２０８； Ｋｈｖｏｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｃｅｌｌ １１５： ２０９－２１６； Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３２： ９３６－９４８； Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２： ３２６－３３０； Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９： ４２２３０－４２２３９； Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３２（Ｗｅｂｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ１３０－１３４； Ｂｏｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３９２： ７３－９６）。ｓｉＲＮＡのハイスループット選択もまた、開発されている（米国特許出願公開第２００５／００４２６４１ Ａ１号）。可能性のある標的部位を、二次構造予測によって解析することもできる（Ｈｅａｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３（３）： ｅ３０）。この２１量体を使用して、その後、２１量体の５’末端の３～９の追加のヌクレオチドを含むように右方シフトを設計する。これらの追加的ヌクレオチドの配列は、制限されない。一実施形態において、追加されたリボヌクレオチドは、標的遺伝子の配列に基づく。この実施形態であっても、標的配列とアンチセンスｓｉＲＮＡの間の完全な相補性は、必要とされない。
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の第一及び第二のオリゴヌクレオチドは、完全に相補性がある必要はない。それらは、生物学的条件下でアニーリングするため、そして標的配列に十分に相補性があるｓｉＲＮＡを生成するダイサー基質を提供するために、十分に相補性があることのみを必要とする。ロックされた核酸、またはＬＮＡは、当業者に周知である（Ｅｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３： ４３９－４４７； Ｋｕｒｒｅｃｋ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０： １９１１－１９１８； Ｃｒｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０： ２４３５－２４４３； Ｂｒａａｓｃｈ ａｎｄ Ｃｏｒｅｙ， ２００１， Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ８： １－７； Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６： ２６８７－２６９５； Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７： ５６３３－５６３８）。一実施形態において、ＬＮＡが、センス鎖の５’末端に組み込まれる。別の実施形態において、ＬＮＡが、アンチセンス鎖に３’オーバーハングを含むように設計された、二重鎖のセンス鎖の５’末端に組み込まれる。
ある特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、２５塩基対長を有するセンス鎖と、２塩基の３’オーバーハングを含む２７塩基対長を有するアンチセンス鎖と、を含む非対称構造を有する。別の実施形態において、非対称構造を有するこのＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖の３’末端に２つのリボヌクレオチドの代わりに２つのデオキシヌクレオチドをさらに含む。
２つの別個のオリゴヌクレオチドを含むある特定のＤｓｉＲＮＡ組成物を、第三の構造によって連結することができる。第三の構造は、ＤｓｉＲＮＡ剤上でのダイサー活性を遮断せず、標的遺伝子から転写されたＲＮＡの指示された破壊と干渉しないであろう。一実施形態において、第三の構造は、化学的な連結基であり得る。多くの適切な化学的連結基が、当該技術分野で公知であり、用いられ得る。あるいは、ｄｓＲＮＡ組成物を構成する２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングする際にヘアピン構造が生成されるように、第三の構造が、ＤｓｉＲＮＡ剤の２つのオリゴヌクレオチドを連結するオリゴヌクレオチドであり得る。該ヘアピン構造は、ＤｓｉＲＮＡ剤上でのダイサー活性を遮断せず、α１アンチトリプシンＲＮＡの指示された破壊と干渉しないであろう。
ｄｓＲＮＡα１アンチトリプシン阻害活性を評価するためのインビトロアッセイ
無細胞系でのＲＮＡｉを再現するインビトロアッセイを利用して、α１アンチトリプシンＲＮＡ配列（複数可）を標的とするｄｓＲＮＡ構築物を評価し、それによりｄｓＲＮＡのα１アンチトリプシンに特異的な遺伝子阻害活性（本明細書ではα１アンチトリプシン阻害活性とも称される）を評価することができる。該アッセイは、α１アンチトリプシンＲＮＡに向けたｄｓＲＮＡ（例えば、ＤｓｉＲＮＡ）剤と共に使用するように適合された、Ｔｕｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １３， ３１９１－３１９７及びＺａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｃｅｌｌ， １０１， ２５－３３に記載された系を含む。多核性胞胚に由来するショウジョウバエ抽出物を用いて、ＲＮＡｉ活性をインビトロで再構築する。標的ＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いる選択されたα１アンチトリプシン発現プラスミドからのインビトロ転写により、または化学合成により、作製される。センス及びアンチセンスｄｓＲＮＡ鎖（例えば、それぞれ２０μＭ）を、緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、２ｍＭ酢酸マグネシウムなど）中、９０℃で１分間、次に３７℃で１時間インキュベーションし、その後、溶解緩衝液（例えば、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、２ｍＭ酢酸マグネシウム）で希釈することによりアニーリングする。アニーリングを、ＴＢＥ緩衝液中のアガロースゲルでのゲル電気泳動によりモニタリングし、臭化エチジウムで染色することができる。酵母糖液入り寒天上に採取されたオレゴン－Ｒハエをコリオン除去及び溶解されて得られた、受精後０～２時間目（ｚｅｒｏ ｔｏ ｔｗｏ－ｈｏｕｒ－ｏｌｄ）の胚を用いて、ショウジョウバエ溶解物を調製する。溶解物を遠心分離し、上清を単離する。アッセイ物は、５０％（ｖ／ｖ）溶解物、ＲＮＡ（１０～５０ｐＭ最終濃度）、及び１０％（ｖ／ｖ）ｄｓＲＮＡ（１０ｎＭ最終濃度）含有溶解緩衝液を含有する反応混合物を含む。反応混合物は、１０ｍＭクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍｌクレアチニンホスホキナーゼ、１００μｍ ＧＴＰ、１００μＭ ＵＴＰ、１００μＭ ＣＴＰ、５００μＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＤＴＴ、０．１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｉｎ（プロメガ）、及び１００μＭの各アミノ酸も含有する。酢酸カリウムの最終濃度は、１００ｍＭに調整する。反応物を氷上に予め集め（ｐｏｒｅ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）、２５℃で１０分間プレインキュベートした後、ＲＮＡを添加し、その後、２５℃でさらに６０分間インキュベートする。反応物を４倍体積の１．２５×パッシブ・ライシス・バッファー（１．２５ｘＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）（プロメガ）でクエンチする。標的ＲＮＡの切断を、ＲＴ－ＰＣＲ分析または他の当該技術分野で公知の方法によりアッセイし、ｄｓＲＮＡを反応物から省いた対照反応物と比較する。
無細胞系でのＲＮＡｉを再現するインビトロアッセイを利用して、α１アンチトリプシンＲＮＡ配列（複数可）を標的とするｄｓＲＮＡ構築物を評価し、それによりｄｓＲＮＡのα１アンチトリプシンに特異的な遺伝子阻害活性（本明細書ではα１アンチトリプシン阻害活性とも称される）を評価することができる。該アッセイは、α１アンチトリプシンＲＮＡに向けたｄｓＲＮＡ（例えば、ＤｓｉＲＮＡ）剤と共に使用するように適合された、Ｔｕｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １３， ３１９１－３１９７及びＺａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｃｅｌｌ， １０１， ２５－３３に記載された系を含む。多核性胞胚に由来するショウジョウバエ抽出物を用いて、ＲＮＡｉ活性をインビトロで再構築する。標的ＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いる選択されたα１アンチトリプシン発現プラスミドからのインビトロ転写により、または化学合成により、作製される。センス及びアンチセンスｄｓＲＮＡ鎖（例えば、それぞれ２０μＭ）を、緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、２ｍＭ酢酸マグネシウムなど）中、９０℃で１分間、次に３７℃で１時間インキュベーションし、その後、溶解緩衝液（例えば、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、２ｍＭ酢酸マグネシウム）で希釈することによりアニーリングする。アニーリングを、ＴＢＥ緩衝液中のアガロースゲルでのゲル電気泳動によりモニタリングし、臭化エチジウムで染色することができる。酵母糖液入り寒天上に採取されたオレゴン－Ｒハエをコリオン除去及び溶解されて得られた、受精後０～２時間目（ｚｅｒｏ ｔｏ ｔｗｏ－ｈｏｕｒ－ｏｌｄ）の胚を用いて、ショウジョウバエ溶解物を調製する。溶解物を遠心分離し、上清を単離する。アッセイ物は、５０％（ｖ／ｖ）溶解物、ＲＮＡ（１０～５０ｐＭ最終濃度）、及び１０％（ｖ／ｖ）ｄｓＲＮＡ（１０ｎＭ最終濃度）含有溶解緩衝液を含有する反応混合物を含む。反応混合物は、１０ｍＭクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍｌクレアチニンホスホキナーゼ、１００μｍ ＧＴＰ、１００μＭ ＵＴＰ、１００μＭ ＣＴＰ、５００μＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＤＴＴ、０．１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｉｎ（プロメガ）、及び１００μＭの各アミノ酸も含有する。酢酸カリウムの最終濃度は、１００ｍＭに調整する。反応物を氷上に予め集め（ｐｏｒｅ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）、２５℃で１０分間プレインキュベートした後、ＲＮＡを添加し、その後、２５℃でさらに６０分間インキュベートする。反応物を４倍体積の１．２５×パッシブ・ライシス・バッファー（１．２５ｘＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）（プロメガ）でクエンチする。標的ＲＮＡの切断を、ＲＴ－ＰＣＲ分析または他の当該技術分野で公知の方法によりアッセイし、ｄｓＲＮＡを反応物から省いた対照反応物と比較する。
あるいはアッセイのための内部標識された標的ＲＮＡを、［α－３２Ｐ］ＣＴＰの存在下でのインビトロ転写により調製し、スピンクロマトグラフィーによりＧ５０セファデックスカラムに通し、更なる精製を行わずに標的ＲＮＡとして用いる。任意で、標的ＲＮＡを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて５’－３２Ｐで末端標識する。アッセイを上記の通り実施し、標的ＲＮＡと、ＲＮＡｉにより作製された特異的ＲＮＡ切断産物を、ゲルのオートラジオグラフで視覚化する。インタクト対照ＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含まない対照反応物からのＲＮＡと、アッセイにより作製された切断産物を表すバンドのホスホルイメージャ（ＰＨＯＳＰＨＯＲ ＩＭＡＧＥＲ）（登録商標）（オートラジオグラフィー）定量により、切断の割合％を決定する。
一実施形態において、このアッセイを用いて、ｄｓＲＮＡを介したＲＮＡｉ切断のためのα１アンチトリプシンＲＮＡターゲット内の標的部位を決定するが、この場合、例えばアッセイ反応物を標識された標的ＲＮＡの電気泳動またはノーザンブロット、及び他の当該技術分野で周知の方法論で分析することにより、複数のｄｓＲＮＡ構築物をα１アンチトリプシンＲＮＡターゲットのＲＮＡｉによる切断についてスクリーニングする。
ある特定の実施形態において、例えば適切な対照と比較して、α１アンチトリプシンＲＮＡレベルの５０％低下が系、細胞、組織または生物体において観察されれば、本発明のｄｓＲＮＡは、α１アンチトリプシンＲＮＡ阻害活性を有すると見なされる。本発明のｄｓＲＮＡのα１アンチトリプシン阻害活性の測定に関するさらなる計量及び範囲は、上に記載されている。
抗α１アンチトリプシンＲＮＡ剤のコンジュゲーション及び送達
ある特定の実施形態において、本発明は、α１アンチトリプシン関連疾患もしくは障害を有する対象、またはα１アンチトリプシン関連疾患もしくは障害を発症するリスクのある対象を処置する方法に関する。そのような実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、α１アンチトリプシン関連疾患または障害を制御するための新規な治療薬として作用し得る。該方法は、本発明の医薬組成物を患者（例えば、ヒト）に投与して、α１アンチトリプシンＲＮＡの発現、レベル及び／または活性を低減することを含む。α１アンチトリプシンＲＮＡによりコードされたポリペプチドの発現、レベル及び／または活性もまた、本発明のｄｓＲＮＡにより低減され得るが、前記ｄｓＲＮＡは、α１アンチトリプシン転写産物の非コード領域（例えば、標的とする５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ配列）を対象とする。本発明のｄｓＲＮＡは、特異性が高いため、任意で多型対立遺伝子が個体及び／または集団に存在するような対立遺伝子特異性の手法で、細胞及び組織のα１アンチトリプシン配列を特異的に標的とすることができる。
ある特定の実施形態において、本発明は、α１アンチトリプシン関連疾患もしくは障害を有する対象、またはα１アンチトリプシン関連疾患もしくは障害を発症するリスクのある対象を処置する方法に関する。そのような実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、α１アンチトリプシン関連疾患または障害を制御するための新規な治療薬として作用し得る。該方法は、本発明の医薬組成物を患者（例えば、ヒト）に投与して、α１アンチトリプシンＲＮＡの発現、レベル及び／または活性を低減することを含む。α１アンチトリプシンＲＮＡによりコードされたポリペプチドの発現、レベル及び／または活性もまた、本発明のｄｓＲＮＡにより低減され得るが、前記ｄｓＲＮＡは、α１アンチトリプシン転写産物の非コード領域（例えば、標的とする５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ配列）を対象とする。本発明のｄｓＲＮＡは、特異性が高いため、任意で多型対立遺伝子が個体及び／または集団に存在するような対立遺伝子特異性の手法で、細胞及び組織のα１アンチトリプシン配列を特異的に標的とすることができる。
α１アンチトリプシン関連疾患または障害の処置において、該ｄｓＲＮＡを、対象の細胞または組織、例えばα１アンチトリプシンの調節異常を示す対象の細胞もしくは組織及び／またはα１アンチトリプシンレベル低下のために標的とされる他のもの、と接触させることができる。例えばα１アンチトリプシンＲＮＡ配列の全てまたは一部と実質的に同一のｄｓＲＮＡを、インビボまたはインビトロで、そのような細胞と接触させるか、またはそのような細胞に導入してもよい。同様に、α１アンチトリプシンＲＮＡ配列の全てまたは一部と実質的に同一のｄｓＲＮＡを、α１アンチトリプシン関連疾患もしくは障害を有する対象、またはそれを発症するリスクのある対象に直接投与してもよい。
本発明のｄｓＲＮＡ剤の治療的使用は、複数の異なるｄｓＲＮＡ剤の配列を含むｄｓＲＮＡ剤の配合剤の使用を含み得る。例えば本明細書に記載された薬剤の２種以上、３種以上、４種以上、５種以上などを併用して、例えばα１アンチトリプシンＲＮＡの複数の異なる領域をターゲットとする配合剤、またはα１アンチトリプシンＲＮＡだけでなく例えばα１アンチトリプシン関連疾患もしくは障害に関連する細胞標的遺伝子も標的とする配合剤を生成することができる。本発明のｄｓＲＮＡ剤を、該ｄｓＲＮＡ剤のいずれかの鎖が独立してα１アンチトリプシンＲＮＡの２つ以上の領域を標的とするように、または該ｄｓＲＮＡ剤の鎖の一方が当該技術分野で公知のα１アンチトリプシンの細胞標的遺伝子を標的とするように、構築することもできる。
標的核酸分子の１つより多い領域を標的とする多機能性ｄｓＲＮＡ分子の使用もまた、α１アンチトリプシンＲＮＡレベル及び発現の強力な阻害をもたらし得る。例えば本発明の１つの多機能性ｄｓＲＮＡ構築物は、α１アンチトリプシン－５０６部位及びα１アンチトリプシン－１０５９部位の両方を同時に標的とし得、追加及び／または代わりとして、本発明の単機能または多機能性薬剤は、α１アンチトリプシンの一方のスプライスバリアントを、他よりも選択的に標的とするように設計することができる。
したがって本発明のｄｓＲＮＡ剤を、個別に、または他の薬物と併用もしくは一体化させて、α１アンチトリプシン関連疾患または障害を治療、阻害、低減または予防するために用いることができる。例えばｄｓＲＮＡ分子は、処置に適した条件下で個別に、または１種または複数の薬物と併用で、対象に投与すること、または当業者に明白な他の適当な細胞に投与することができる。
該ｄｓＲＮＡ分子は、他の公知の処置と併用して、対象または生物体のα１アンチトリプシン関連疾患または障害を治療、阻害、低減または予防することもできる。例えば記載された分子は、１種または複数の公知化合物、処置、または手順と併用して、当該技術分野で公知の通り、対象または生物体におけるα１アンチトリプシン関連疾患または障害を治療、阻害、低減または予防することができる。
本発明のｄｓＲＮＡ剤は、別の部分（例えば、ペプチドなどの非核酸部分）、有機化合物（例えば、色素、コレステロールなど）にコンジュゲートさせても（例えば、センスまたはアンチセンス鎖の５’または３’末端で）、またはコンジュゲートさせなくてもよい。この方法でｄｓＲＮＡ剤を修飾することで、対応する非コンジュゲート化ｄｓＲＮＡ剤と比較して得られたｄｓＲＮＡ剤誘導体の細胞取込みを改善するか、または細胞標的化活性を増強してもよく、それは、細胞内のｄｓＲＮＡ剤誘導体を追跡するのに有用になるか、または対応する非コンジュゲート化ｄｓＲＮＡ剤に比較してｄｓＲＮＡ剤誘導体の安定性を改善する。
核酸、ベクター、及び宿主細胞を導入する方法
本発明のｄｓＲＮＡ剤を、細胞の中に直接（即ち、細胞内）導入してもよく、あるいは生物体の体腔、間質空間、循環内に細胞外導入しても、口内に導入しても、または核酸を含有する溶液に細胞もしくは生物体を浸漬することにより導入してもよい。血管または血管外循環、血液またはリンパ系、及び脳脊髄液が、核酸が導入され得る部位である。
本発明のｄｓＲＮＡ剤を、細胞の中に直接（即ち、細胞内）導入してもよく、あるいは生物体の体腔、間質空間、循環内に細胞外導入しても、口内に導入しても、または核酸を含有する溶液に細胞もしくは生物体を浸漬することにより導入してもよい。血管または血管外循環、血液またはリンパ系、及び脳脊髄液が、核酸が導入され得る部位である。
本発明のｄｓＲＮＡ剤は、核酸を含む溶液の注射、核酸で覆われた粒子による衝撃、核酸溶液への細胞もしくは生物体の浸漬、または核酸存在下での細胞膜の電気穿孔など、当該技術分野で公知の核酸送達方法を利用して導入することができる。核酸を細胞に導入するために当該技術分野で公知の他の方法、例えば脂質による担体輸送、化学的な輸送、及びリン酸カルシウムなどのカチオン性リポソームトランスフェクションなどを用いてもよい。核酸を、以下の活性のうちの１つまたは複数を実施する他の成分と共に導入してもよい：細胞による核酸取り込みの増加、またはその他の方法による標的α１アンチトリプシンＲＮＡの阻害増強。
標的α１アンチトリプシンＲＮＡを有する細胞は、全能性または多能性の、分裂しているまたは分裂していない、柔組織または上皮の、不死化または形質転換された、生殖細胞系統または体細胞から得られてもよい。該細胞は、幹細胞または分化した細胞であってもよい。分化された細胞型としては、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮、ニューロン、グリア、血液細胞、メガカリオサイト、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、白血球、顆粒球、ケラチノサイト、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、及び内分泌腺または外分泌腺の細胞が挙げられる。
特定の標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列及び送達されるｄｓＲＮＡ剤材料の用量に応じて、このプロセスは、α１アンチトリプシンＲＮＡの部分的または完全な機能損失をもたらし得る。標的細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％またはそれを超えるＲＮＡレベルまたは発現（α１アンチトリプシンＲＮＡ発現またはコードされたポリペプチド発現のいずれか）の低下または損失が、例である。α１アンチトリプシンＲＮＡレベルまたは発現の阻害は、α１アンチトリプシンＲＮＡまたはα１アンチトリプシンＲＮＡをコードするタンパク質のレベルの非存在（または観察可能な減少）を指す。特異性は、細胞の他の遺伝子に及ぼす明確な影響を有さずにα１アンチトリプシンＲＮＡを阻害する能力を指す。阻害の結果は、細胞もしくは生物体の外向きの特性の検査により、またはＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、他の免疫測定法、及び蛍光活性化細胞分析（ＦＡＣＳ）などの生化学的技術により、確認することができる。本発明のｄｓＲＮＡ剤による標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列（複数可）の阻害は、α１アンチトリプシン関連疾患または障害、例えば慢性肝臓疾患、肝臓の炎症、肝硬変、肝線維症、及び／または肝細胞癌などの発症／進行に及ぼすそのようなｄｓＲＮＡ剤のインビボまたはインビトロのいずれかでの投与の影響に基づいて測定することもできる。これらの先行する肝臓病のいずれの処置も、肝機能に関する当該技術分野で認識されている試験、例えば適切な対照集団の平均的健常肝機能と比較して達成された肝機能の割合％（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはそれを超える）の測定により、評価することができる。ある特定の実施形態において、処置の成功は、肝臓疾患に関連する全体的な肝機能低下の減衰または停止をもたらす。幾つかの実施形態において、肝機能は、処置の成功によって改善する。肝細胞癌の腫瘍または癌細胞レベルの処置及び／または低減としては、腫瘍もしくは癌細胞レベルの成長の停止もしくは低下、または例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％またはそれを超える減少を挙げることができ、それは対数として測定することもでき、例えば癌細胞レベルの１０倍、１００倍、１０００倍、１０５倍、１０６倍、１０７倍低下が、細胞、組織または対象への本発明のｄｓＲＮＡ剤投与により実現され得る。
細胞株または全生物体におけるＲＮＡを介した阻害の場合、タンパク質生成物が容易にアッセイされる発現、レポーター、または薬物耐性遺伝子を測定することができる。そのようなレポーター遺伝子としては、アセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、βグルクロニダーゼ（β－ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）、及びその誘導体が挙げられる。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、フォスフィノスリシン、ピューロマイシ、及びテトラサイクリンに対する耐性を付与する複数の選択マーカーが利用可能である。アッセイにもよるが、遺伝子発現量の定量で、本発明により処置されていない細胞と比較して１０％、３３％、５０％、９０％、９５％または９９％を超える阻害度を測定することが可能である。
注射材料が低用量である程、そしてＲＮＡサイレンシング剤投与後の時間が長い程、より小さな割合の細胞が阻害され得る（例えば、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、５０％、７５％、９０％または９５％）。細胞内での遺伝子発現の定量は、標的α１アンチトリプシンＲＮＡの蓄積または標的タンパク質の翻訳のレベルで類似の阻害量を示し得る。例として、阻害の効率は、細胞内の遺伝子産物量を評価することにより決定することができ、ＲＮＡは、阻害性ｄｓＲＮＡに用いられた領域以外のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブで検出してもよく、または翻訳されたポリペプチドを、その領域のポリペプチド配列に対して増加した抗体により検出してもよい。
ｄｓＲＮＡ剤は、細胞あたりに少なくとも１コピーの送達を可能にする量で導入され得る。より高用量（例えば、細胞あたり少なくとも５、１０、１００、５００または１０００コピー）の材料は、より効果的な阻害を生じることができ、より低用量もまた、特異的適用に有用になり得る。
医薬組成物
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物を提供する。該ｄｓＲＮＡ剤の試料を適切に配合し、十分な部分の試料を細胞に進入させて、起こるとすれば、遺伝子サイレンシングを誘導するための任意の手段により、細胞環境に導入させることができる。ｄｓＲＮＡの多くの配合剤が、当該技術分野で公知であり、ｄｓＲＮＡが標的細胞に進入して作用し得る限り、使用することができる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０３１４５ Ａ１号及び同第２００５／００５４５９８ Ａ１号を参照されたい。例えば、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、リン酸緩衝生理食塩溶液、リポソーム、ミセル構造、及びカプシドなどの緩衝溶液に配合させることができる。ｄｓＲＮＡ剤とカチオン性ペプチドとの配合剤を使用して、細胞内へのｄｓＲＮＡ剤のトランスフェクションを容易にすることができる。例えばリポフェクチンなどのカチオン性脂質（米国特許第５，７０５，１８８号）、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリリシンなどのポリカチオン性分子（公開されたＰＣＴ国際出願ＷＯ９７／３０７３１号）を、用いることができる。適切な脂質としては、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン（ライフ・テクノロジーズ）、ＮＣ３８８（リボザイム・ファーマシューティカルズＩｎｃ．、コロラド州ボールダー所在）、またはＦｕＧｅｎｅ ６（ロッシュ）が挙げられ、それらは全て、製造業者の使用説明書に従って使用することができる。
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物を提供する。該ｄｓＲＮＡ剤の試料を適切に配合し、十分な部分の試料を細胞に進入させて、起こるとすれば、遺伝子サイレンシングを誘導するための任意の手段により、細胞環境に導入させることができる。ｄｓＲＮＡの多くの配合剤が、当該技術分野で公知であり、ｄｓＲＮＡが標的細胞に進入して作用し得る限り、使用することができる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０３１４５ Ａ１号及び同第２００５／００５４５９８ Ａ１号を参照されたい。例えば、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、リン酸緩衝生理食塩溶液、リポソーム、ミセル構造、及びカプシドなどの緩衝溶液に配合させることができる。ｄｓＲＮＡ剤とカチオン性ペプチドとの配合剤を使用して、細胞内へのｄｓＲＮＡ剤のトランスフェクションを容易にすることができる。例えばリポフェクチンなどのカチオン性脂質（米国特許第５，７０５，１８８号）、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリリシンなどのポリカチオン性分子（公開されたＰＣＴ国際出願ＷＯ９７／３０７３１号）を、用いることができる。適切な脂質としては、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン（ライフ・テクノロジーズ）、ＮＣ３８８（リボザイム・ファーマシューティカルズＩｎｃ．、コロラド州ボールダー所在）、またはＦｕＧｅｎｅ ６（ロッシュ）が挙げられ、それらは全て、製造業者の使用説明書に従って使用することができる。
そのような組成物は、典型的には核酸分子及び医薬的に許容し得る担体を含む。本明細書で用いられる「医薬的に許容し得る担体」という表現は、医薬投与に適合し得る、生理食塩水、溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延薬などを包含する。補助的活性化合物を、該組成物に組み込むこともできる。
医薬組成物は、意図する投与経路に適合するように配合させる。投与経路の例としては、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（外用）、経粘膜、及び経直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用に用いられる溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたは他のメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤、及び塩化ナトリウムまたはデキストロースなど浸透圧を調整するための薬剤。 ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口調製剤は、ガラスもしくはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは反復投与用バイアル中に封入させることができる。
注射使用に適する医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散剤、及び滅菌注射溶液または分散剤を即時調製するための滅菌粉末を含む。静脈内投与の場合、適切な担体としては、生理学的生理食塩水、制菌水、クレモホールＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州パーシッパニー所在）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての例において、該組成物は、滅菌されていなければならず、易注射性が存在する程度に流体でなければならない。該組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用が予防されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。例えばレシチンなどのコーティングの使用により、分散剤の場合には必要とされる粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により、適度な流動性を維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チオメルサールなどにより実現することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを組成物に含ませることが好ましいであろう。注射組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含ませることによりもたらされ得る。
滅菌注射溶液は、選択された溶媒中の必要量の活性化合物に、上に列挙された一成分または成分の組み合わせを組み込み、必要に応じて次に濾過滅菌することにより、調製することができる。一般的に分散剤は、活性化合物を、基剤となる分散媒体及び先に列挙されたものから得られる必要な他成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことにより調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過された溶液から有効成分＋任意の更なる所望の成分の粉末を生成する真空乾燥及び凍結乾燥である。
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療的投与の目的では、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれて、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えばゼラチンカプセルの形態で用いることができる。経口組成物は、洗口液として使用するために流動担体を用いて調製することもできる。医薬的に適合し得る結合剤及び／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含むことができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分のいずれか、または同様の性質の化合物を含有することができる：結合剤、例えば微結晶セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチン；賦形剤、例えばデンプンもしくはラクトース；崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモジェル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）もしくはコーンスターチ；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムもしくはステロート（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）；滑剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースもしくはサッカリン；または香味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香料。
吸入による投与の場合、該化合物は、適切な噴射剤、例えば二酸化炭素などの気体を含む加圧容器もしくはディスペンサーからのエアゾールスプレー、またはネブライザーの形態で送達される。そのような方法は、米国特許第６，４６８，７９８号に記載されたものを含む。
全身投与は、経粘膜または経皮手段によることもできる。経粘膜または経皮投与の場合、浸透されるバリアに適した透過剤が、配合剤中で使用される。そのような透過剤は、当該技術分野で概ね公知であり、例えば経粘膜投与では、洗浄剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは坐剤の使用により遂行することができる。経皮投与の場合、活性化合物は、当該技術分野で概ね公知の通り、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに配合される。
該化合物は、坐剤（例えば、ココアバター及び他のグリセリドなど、従来の坐剤ベースを含む）または経直腸送達用の停留浣腸の形態で調製することもできる。
該化合物はまた、非限定的にＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ． （２００２）， Ｎａｔｕｒｅ， ４１８（６８９３）， ３８－９ （流体力学的トランスフェクション）； Ｘｉａ ｅｔ ａｌ． （２００２）， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２０（１０）， １００６－１０（ウイルスによる送達） ；またはＰｕｔｎａｍ （１９９６）， Ａｍ． Ｊ． Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔ． Ｐｈａｒｍ． ５３（２）， １５１－１６０（Ａｍ． Ｊ． Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔ． Ｐｈａｒｍ． ５３（３）， ３２５ （１９９６）に訂正掲載）に記載された方法をはじめとする、当該技術分野で公知の方法を利用して、トランスフェクションまたは感染により投与することができる。
該化合物はまた、ＤＮＡワクチンなどの核酸剤の投与に適した方法により投与することができる。これらの方法としては、遺伝子銃、バイオインジェクター、及び皮膚パッチ、ならびに米国特許第６，１９４，３８９号に開示されたマイクロ粒子ＤＮＡワクチン技術及び米国特許第６，１６８，５８７号に開示された粉末型ワクチンを用いる哺乳動物の経皮的無針ワクチン接種などの無針の方法が挙げられる。加えて、とりわけＨａｍａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ． （１９９８）， Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．， ８８（２）， ２０５－１０に記載されたものなど、鼻内送達が可能である。リポソーム（例えば、米国特許第６，４７２，３７５号に記載）及びマイクロカプセル化もまた、使用することができる。生分解性の標的化可能なマイクロ粒子送達系もまた、用いることができる（例えば、米国特許第６，４７１，９９６号に記載）。
一実施形態においては、該活性化合物を、移植片及びマイクロカプセル化送達系をはじめとする制御放出配合剤などの、該化合物が体から急速に排出することを防御し得る担体と共に調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性で生体適合性のポリマーを用いることができる。そのような配合剤を、標準技術を用いて調製することができる。該材料は、アルザ・コーポレーション及びノバ・ファーマシューティカルズＩｎｃから商業的に取得することもできる。リポソーム懸濁液(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞に標的化されたリポソームなど)を、医薬的に許容し得る担体として用いることもできる。これらを、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載された通り、当業者には公知の方法に従って調製することができる。
例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的となる用量)及びＥＤ５０（集団の５０％において治療有効性のある用量）を決定するために、そのような化合物の毒性及び治療有効性を、細胞培養物または実験動物における標準的医薬手順により決定することができる。毒性作用と治療作用の間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が、好ましい。毒性副作用を示す化合物を用いる場合があるが、非感染細胞への潜在的な損傷を最小限に抑え、それにより副作用を低減するために、そのような化合物が罹患組織の部位を標的とする送達系を設計するように注意を払うべきである。
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータを、ヒトにおいて使用するための一定範囲の投与量を配合するのに用いることができる。そのような化合物の投与量は、好ましくはほとんどまたは全く毒性がないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にある。投与量は、用いられる投与剤型及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明の方法で用いられる化合物の場合、治療有効用量は、最初、細胞培養アッセイから推定され得る。細胞培養で決定されるＩＣ５０（即ち、症状の最大半量阻害を実現する被験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を実現する用量が、動物モデルにおいて配合され得る。そのような情報を利用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより、測定してもよい。
本明細書で定義された通り、核酸分子の治療有効量（即ち、有効投与量）は、選択される核酸に依存する。例えば、およそ１ｐｇ～１０００ｍｇの範囲内のｄｓＲＮＡ（または、例えばそのようなｄｓＲＮＡをコードする構築物（複数可））の単一用量を投与してもよく、幾つかの実施形態において、１０、３０、１００もしくは１０００ｐｇ、または１０、３０、１００もしくは１０００ｎｇ、または１０、３０、１００もしくは１０００μｇ、または１０、３０、１００もしくは１０００ｍｇが。投与されてもよい。幾つかの実施形態において、１～５ｇの該組成物が、投与され得る。該組成物は、１日あたり１回または複数回～１週間あたり１回または複数回（一日おきに１回など）のうちの１つで投与され得る。非限定的に疾患または障害の重症度、過去の処置、対象の一般的健康状態及び／または年齢、ならびに既存の他の疾患をはじめとするある特定の因子が、対象を効果的に処置するのに必要となる投与量及びタイミングに影響を及ぼし得ることは、当業者に認識されよう。その上、治療有効量の核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ）、タンパク質、ポリペプチド、または抗体による対象の処置は、単回の処置を含むことができ、または好ましくは一連の処置を含むことができる。
本発明の核酸分子は、例えば非限定的に上掲のＸｉａら（２００２）に記載されたものなどの当該技術分野で公知の方法を用いて、発現構築物、例えばウイルスベクター、レトロウイルスベクター、発現カセット、またはプラスミドウイルスベクターに挿入することができる。発現構築物を、例えば吸入、経口、静脈注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号参照）または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１， ３０５４－３０５７参照）により、対象に送達することができる。送達ベクターの医薬調製物は、許容し得る希釈剤中のベクターを含むことができ、または送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは完全な送達ベクター、例えばレトロウイルスベクターを、組換え細胞から無傷で製造し得る場合、該医薬調製物は、遺伝子送達系を生成する１つまたは複数の細胞を含み得る。
発現構築物は、適切な発現系内での使用に適した構築物であってもよく、当該技術分野で公知の通り、レトロウイルスベクター、線形発現カセット、プラスミド及びウイルスまたはウイルス由来ベクターが挙げられるが、それらに限定されない。そのような発現構築物は、誘導性プロモータ、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモータ系、例えばＵ６ ｓｎＲＮＡプロモータもしくはＨ１ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータ、またはその他の当該技術分野で公知のプロモータを含み得る。該構築物は、ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖を含み得る。両方の鎖を発現する発現構築物は、両方の鎖を連結するループ構造も含み得るが、または各鎖を同じ構築物内の別のプロモータから別個に転写し得る。各鎖は、別の発現構築物から転写することもできる（例えば、Ｔｕｓｃｈｌ （２００２， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０： ５００－５０５））。
ｄｓＲＮＡ剤を細胞環境に導入する方法が、細胞の型及びその環境の構造に依存するであろうことは、認識され得る。例えば細胞が液体中に見出される場合、１つの好ましい配合剤は、リポフェクタミンなどの脂質配合剤を含むもので、該ｄｓＲＮＡ剤を、細胞の液体環境に直接添加することができる。脂質配合剤を、静脈内、筋肉内、もしくは腹腔内注射、または経口、吸入もしくは他の当該技術分野で公知の方法などにより、動物に投与することもできる。該配合剤が、哺乳動物、より具体的にヒトなどの動物への投与に適する場合、該配合剤は、医薬的にも許容し得る。オリゴヌクレオチドを投与するための医薬的に許容し得る配合剤は、公知であり、使用することができる。幾つかの例において、緩衝液または生理食塩溶液中にｄｓＲＮＡ剤を配合させること、及び卵母細胞での研究の通り細胞に配合ｄｓＲＮＡ剤を直接注射することが、好ましくなり得る。ｄｓＲＮＡ剤二重鎖の直接注射も、実施することができる。ｄｓＲＮＡ（例えば、ＤｓｉＲＮＡ剤）を導入する適切な方法については、米国特許出願公開第２００４／０２０３１４５ Ａ１号を参照されたい。
ｄｓＲＮＡ剤の適切な量が、導入されなければならず、これらの量は、標準法を利用して経験的に決定することができる。典型的には、細胞環境での個々のｄｓＲＮＡ剤種の有効濃度は、５０ナノモル以下、１０ナノモル以下であり、または１ナノモル以下の濃度の組成物を用いることができる。別の実施形態において、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下の濃度、及び１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、または１ピコモル以下の濃度を利用する方法が、多くの状況で用いられ得る。
該方法は、十分量のｄｓＲＮＡ剤が細胞に進入してその効果を発揮し得るようにｄｓＲＮＡ剤組成物が配合されることを条件に、細胞が生存し得る細胞外マトリックスにｄｓＲＮＡ剤組成物を添加することにより実施され得る。例えば該方法は、液体培地もしくは細胞増殖培地などの液体中、組織外移植片、または哺乳動物、具体的にはヒトなどの動物をはじめとする全生物体の中に存在する細胞との使用に適している。
α１アンチトリプシンＲＮＡのレベルまたは活性は、当該技術分野で現在知られている、または将来開発される適切な方法により決定することができる。標的ＲＮＡ及び／または標的ＲＮＡ発現を測定するのに用いられる方法が、標的ＲＮＡの性質に依存し得ることは、認識され得る。例えば、標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列が、タンパク質をコードしている場合、「発現」という用語は、タンパク質またはα１アンチトリプシンＲＮＡ／α１アンチトリプシン遺伝子（ゲノムまたは外来起源のいずれか）由来の転写産物を指すことができる。そのような例において、標的α１アンチトリプシンＲＮＡの発現は、α１アンチトリプシンＲＮＡ／転写産物の量を直接測定することにより、またはα１アンチトリプシンタンパク質の量を測定することにより、決定することができる。タンパク質は、染色もしくは免疫ブロットなどによりタンパク質アッセイで、またはタンパク質が測定され得る反応を触媒する場合には反応速度を測定することにより、測定することができる。そのような方法の全てが、当該技術分野で公知であり、使用することができる。標的α１アンチトリプシンＲＮＡレベルが、測定される場合、ＲＮＡレベルを検出するための当該技術分野で認識された方法を用いることができる（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロットなど）。本発明のｄｓＲＮＡ剤でα１アンチトリプシンＲＮＡを標的化する場合、インビトロもしくはインビボのいずれかでの対象、組織、細胞内、または細胞抽出物中のα１アンチトリプシンＲＮＡもしくはタンパク質のレベルを低下させることにおけるｄｓＲＮＡ剤の有効性の測定が、α１アンチトリプシン関連の表現型（例えば、疾患または障害、例えば慢性肝臓疾患、肝臓の炎症、肝硬変、肝線維症、及び／または肝細胞癌など）の低減の度合いを決定するのに用いることもできる。上記測定は、細胞、細胞抽出物、組織、組織抽出物または他の適切な供給材料で行うことができる。
α１アンチトリプシンＲＮＡの発現が低減したかどうかの決定は、ＲＮＡレベルの変化を忠実に検出し得る適切な方法によりなされ得る。典型的には、該決定は、ｄｓＲＮＡ剤の少なくとも一部が細胞質に進入するように、未消化のｄｓＲＮＡを細胞環境に導入すること、及びその後、標的ＲＮＡのレベルを測定することにより行われる。同じ測定が、同一の未処理細胞で行われ、各測定から得られた結果が比較される。
該ｄｓＲＮＡ剤は、薬理学的有効量のｄｓＲＮＡ剤及び医薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物として配合され得る。薬理学的または治療的有効量は、意図する薬理学的、治療的または予防的結果を生じるのに効果的なｄｓＲＮＡ剤の量を指す。「薬理学的有効量」及び「治療的有効量」または単に「有効量」という表現は、薬理学的、治療的または予防的結果を生じるのに効果的なＲＮＡの量を指す。例えば、疾患または障害に関連する測定可能なパラメータの少なくとも２０％の低減が存在する場合に、所与の臨床的処理が効果的と見なされるならば、その疾患または障害の処置に関する薬物の治療的有効量は、そのパラメータの少なくとも２０％低減を実行するのに必要となる量である。
本発明の適切に配合された医薬組成物を、当該技術分野で公知の手段により、例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、経直腸、経膣及び外用（口腔及び舌下など）投与をはじめとする非経口投与により投与することができる。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、静脈内または非経口内部（ｉｎｔｒａｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）輸液または注射により投与される。
一般に、ｄｓＲＮＡの適切な投与単位は、１日あたりにレシピエントの体重１ｋｇあたり０．００１～０．２５ミリグラムの範囲内、または１日あたりに体重１ｋｇあたり０．０１～２０マイクログラムの範囲内、または１日あたりに体重１ｋｇあたり０．００１～５マイクログラムの範囲内、または１日あたりに体重１ｋｇあたり１～５００ナノグラムの範囲内、または１日あたりに体重１ｋｇあたり０．０１～１０マイクログラムの範囲内、または１日あたりに体重１ｋｇあたり０．１０～５マイクログラムの範囲内、または１日あたりに体重１ｋｇあたり０．１～２．５マイクログラムの範囲内である。ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物を、１日１回投与することができる。しかし該治療薬は、２、３、４、５、６またはそれを超える分割用量を含む投与単位で、投与日に適切な間隔を入れて投与することもできる。その場合、各分割用量に含まれるｄｓＲＮＡは、合計の日用量単位を実現するように、対応してより少量でなければならない。投与単位は、例えば数日間にｄｓＲＮＡの持続的で一貫した放出をもたらす従来の持続放出配合剤を用いて、数日間に１回投与されるよう調剤することもできる。持続放出配合剤は、当該技術分野で周知である。この実施形態において、該投与単位は、対応する複数の日用量を含有する。配合にかかわらず、該医薬組成物は、処置される動物またはヒトの標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量のｄｓＲＮＡを含有しなければならない。該組成物は、複数単位のｄｓＲＮＡの合計が十分な用量を含むように、調剤され得る。
データを細胞培養アッセイ及び動物試験から得て、ヒトのための適切な投与範囲を配合することができる。本発明の組成物の投与量は、ほとんどまたは全く毒性がないＥＤ５０（公知方法により決定）を含む循環濃度範囲内にある。投与量は、用いられる投与剤型及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明の方法で用いられる化合物の場合、治療有効用量は、最初、細胞培養アッセイから推定され得る。細胞培養で決定されるＩＣ５０（即ち、症状の最大半量阻害を実現する被験化合物の濃度）を含む化合物の循環血漿濃度範囲を実現するように、用量が動物モデルにおいて配合され得る。そのような情報を利用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のｄｓＲＮＡレベルは、標準法、例えば高速液体クロマトグラフィーにより、測定してもよい。
該医薬組成物は、投与用の使用説明書を伴って、キット、容器、パック、またはディスペンサー中に含まれ得る。
処置方法
本発明は、全体もしくは一部がα１アンチトリプシンにより誘発される疾患もしくは障害（例えば、α１アンチトリプシン転写産物及び／またはα１アンチトリプシンタンパク質レベルの誤制御及び／または上昇）、またはα１アンチトリプシンの選択的標的化により処置可能な疾患もしくは障害のリスクのある（またはそれに罹り易い）対象を処置する予防的及び治療的方法の両方を提供する。
本発明は、全体もしくは一部がα１アンチトリプシンにより誘発される疾患もしくは障害（例えば、α１アンチトリプシン転写産物及び／またはα１アンチトリプシンタンパク質レベルの誤制御及び／または上昇）、またはα１アンチトリプシンの選択的標的化により処置可能な疾患もしくは障害のリスクのある（またはそれに罹り易い）対象を処置する予防的及び治療的方法の両方を提供する。
ある特定の態様において、本発明は、対象に治療薬（例えば、ｄｓＲＮＡ剤、またはそれをコードするベクターもしくはトランスジーン）を投与することにより、本明細書に記載された疾患または障害を対象において予防する方法（例えば、α１アンチトリプシン発現の阻害を通した対象のトランスフォーミング事象開始の予防など）を提供する。該疾患のリスクのある対象は、例えば本明細書に記載された診断または予知アッセイの１つまたは組み合わせにより、特定され得る。疾患または障害が予防されるか、あるいは進行が遅延されるように、予防剤の投与を、例えば対象における癌の検出前、または疾患もしくは障害に特徴的な症状の発現前に行うことができる。
本発明の別の態様は、対象を治療的に処置する方法、即ち疾患または障害の兆候を変化させる方法に関係する。これらの方法は、インビトロで（例えば、細胞をｄｓＲＮＡ剤と共に培養することにより）、あるいはインビボで（例えば、対象にｄｓＲＮＡ剤を投与することにより）実施することができる。
処置の予防及び治療方法の両方に関して、そのような処置は、ゲノム薬理学の分野から得られる知識に基づいて特有に適合または修正させてもよい。本明細書で用いられる「ゲノム薬理学」は、遺伝子配列決定、統計遺伝子学、及び遺伝子発現解析などのゲノム技術を臨床開発中、及び市場の薬物に適用することを指す。より具体的には該用語は、患者の遺伝子が薬物にどれほど応答したか（例えば、患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」）を決定する研究を指す。したがって本発明の別の態様は、個体の予防的または治療的処置を、本発明の標的α１アンチトリプシンＲＮＡ分子または個体の薬物応答遺伝子型にしたがって標的α１アンチトリプシンＲＮＡモジュレータのいずれかと適合させる方法を提供する。ゲノム薬理学により、臨床医または内科医は、予防的または治療的処置を処置により最も利益を受ける患者に合わせることができ、そして有毒な薬物関連の副作用に見舞われる患者の処置を回避することができる。
本発明の実践は、他に断りがなければ、当該技術分野の技能にある化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝子学、免疫学、細胞生物学、細胞培養及びトランスジェニック生物学の従来の技術を用いる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ２ｎｄ Ｅｄ． （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， ２００１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ３ｒｄ Ｅｄ． （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９２）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、定期的な改訂を含む)； Ｇｌｏｖｅｒ， １９８５， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ）； Ａｎａｎｄ， １９９２； Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎｋ， １９９１； Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， １９８８， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）； Ｊａｋｏｂｙ ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ， １９７９； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （Ｂ． Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ． １９８４）； Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ （Ｂ． Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ． １９８４）； Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ （Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， １９８７）； Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９８６）； Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８４）； ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．）； Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ （Ｊ． Ｈ． Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ． Ｐ． Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．， １９８７， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）； Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｓ． １５４ ａｎｄ １５５ （Ｗｕ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．）， Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ， ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， １９８７）； Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ （Ｄ． Ｍ． Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ． Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ， ｅｄｓ．， １９８６）； Ｒｉｏｔｔ， Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９８８； Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８６）； Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ， Ｍ．， Ｔｈｅ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｂｏｏｋ． Ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｕｓｅ ｏｆ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ （Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）， （４ｔｈ Ｅｄ．， Ｕｎｉｖ． ｏｆ Ｏｒｅｇｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ２０００）を参照されたい。
別様に定義しなければ、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同一の方法及び材料を、本発明の実践またはテストで用い得るが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書に列挙される全ての発行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。矛盾する場合、定義を含み、本明細書が優先される。加えて、材料、方法、及び実施例は、例示に過ぎず、限定を意図するものではない。
本発明を、以下の実施例を参照して記載するが、実施例は、例として提示されており、本発明の限定を意図するものではない。当該技術分野で周知の標準技術または以下に具体的に記載された技術が用いられた。
実施例１：二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドの合成及び精製
ＤｓｉＲＮＡ分子を、ＲＮＡメッセージ内の様々な部位、例えば本明細書に記載されるＲＮＡ配列内の標的配列、と相互作用するように設計することができる。本明細書に例示された薬剤において、３８４のヒト標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列を、評価のために選択した（３８４のヒト標的α１アンチトリプシン部位の選択物は、マウスα１アンチトリプシン転写産物の配列における対応する部位が保存されていると予測された）。ＤｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖の配列は、先に記載された標的α１アンチトリプシン部位の配列と相補性があった。該ＤｓｉＲＮＡ分子を、本明細書に記載された方法を利用して化学合成した。概してＤｓｉＲＮＡ構築物を、１９～２３量体ｓｉＲＮＡについて記載された固相オリゴヌクレオチド合成法を利用して合成した（例えば、Ｕｓｍａｎらの米国特許第５，８０４，６８３号、同第５，８３１，０７１号、同第５，９９８，２０３号、同第６，１１７，６５７号、同第６，３５３，０９８号、同第６，３６２，３２３号、同第６，４３７，１１７号、同第６，４６９，１５８号；Ｓｃａｒｉｎｇｅらの米国特許第６，１１１，０８６号、同第６，００８，４００号、同第６，１１１，０８６号参照）。
オリゴヌクレオチドの合成及び精製
ＤｓｉＲＮＡ分子を、ＲＮＡメッセージ内の様々な部位、例えば本明細書に記載されるＲＮＡ配列内の標的配列、と相互作用するように設計することができる。本明細書に例示された薬剤において、３８４のヒト標的α１アンチトリプシンＲＮＡ配列を、評価のために選択した（３８４のヒト標的α１アンチトリプシン部位の選択物は、マウスα１アンチトリプシン転写産物の配列における対応する部位が保存されていると予測された）。ＤｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖の配列は、先に記載された標的α１アンチトリプシン部位の配列と相補性があった。該ＤｓｉＲＮＡ分子を、本明細書に記載された方法を利用して化学合成した。概してＤｓｉＲＮＡ構築物を、１９～２３量体ｓｉＲＮＡについて記載された固相オリゴヌクレオチド合成法を利用して合成した（例えば、Ｕｓｍａｎらの米国特許第５，８０４，６８３号、同第５，８３１，０７１号、同第５，９９８，２０３号、同第６，１１７，６５７号、同第６，３５３，０９８号、同第６，３６２，３２３号、同第６，４３７，１１７号、同第６，４６９，１５８号；Ｓｃａｒｉｎｇｅらの米国特許第６，１１１，０８６号、同第６，００８，４００号、同第６，１１１，０８６号参照）。
標準法により、個々のＲＮＡ鎖を合成して、ＨＰＬＣで精製した（インテグレーティッド・ＤＮＡ・テクノロジーズ、アイオワ州コーラルビル所在）。例えば、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、固相ホスホロアミダイト化学を利用して合成し、標準的技術を利用して脱保護し、ＮＡＰ－５カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテック、ニュージャージー州ピスカタウェイ所在）で脱塩した（Ｄａｍｈａ ａｎｄ Ｏｌｇｉｖｉｅ， １９９３， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０： ８１－１１４； Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３： ２６７７－８４）。１５分の段階線形勾配を用いる、アマシャム・ソース１５Ｑカラム（１．０ｃｍ×２５ｃｍ；アマシャム・ファルマシア・バイオテック、ニュージャージー州ピスカタウェイ所在）上のイオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥ－ＨＰＬＣ）を利用して、該オリゴマーを精製した。勾配は、緩衝液Ａ：Ｂを９０：１０から５２：４８に変化させたが、ここで緩衝液Ａは、１００ｍＭのトリスｐＨ８．５、緩衝液Ｂは、１００ｍＭのトリスｐＨ８．５、１ＭのＮａＣｌであった。２６０ｎｍで試料をモニタリングし、全長オリゴヌクレオチド種に相当するピークを回収してまとめ、ＮＡＰ－５カラムで脱塩して凍結乾燥した。
各オリゴマーの純度をベックマンＰＡＣＥ５０００（ベックマン・コールターＩｎｃ．，カリフォルニア州フラトン所在）でのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）により決定した。ＣＥキャピラリーは、１００μｍの内径を有し、ｓｓＤＮＡ １００Ｒゲル（ベックマン・コールター）を含有した。典型的には、約０．６ナノモルのオリゴヌクレオチドをキャピラリー中に注入し、４４４Ｖ／ｃｍの電場中で泳動して、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度によって検出した。変性トリス－ホウ酸－７Ｍ尿素泳動緩衝液は、ベックマン・コールターから購入した。以下に記述される実験で使用するためにＣＥによる評価で、少なくとも９０％の純度のオリゴリボヌクレオチドが得られた。製造業者が推奨するプロトコルに従い、ボイジャーＤＥ（商標）バイオスペクトメトリー・ワークステーション（アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティ所在）でのマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析法により、化合物の同一性を検証した。全てのオリゴマーの相対的分子量は、多くが期待される分子量の０．２％以内で得られた。
二重鎖の調製
一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）オリゴマーを、例えば１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５からなる二重鎖緩衝液中の１００μＭの濃度で、再懸濁させた。相補的なセンス鎖及びアンチセンス鎖を、等モル量で混合して、例えば５０μＭ二重鎖の、最終溶液を得た。試料をＲＮＡ緩衝液（ＩＤＴ）中、１００℃で５分間加熱し、使用前に室温まで放冷した。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）オリゴマーを－２０℃で貯蔵した。一本鎖ＲＮＡオリゴマーを凍結乾燥して貯蔵するか、またはヌクレアーゼを含まない水中、－８０℃で貯蔵した。
一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）オリゴマーを、例えば１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５からなる二重鎖緩衝液中の１００μＭの濃度で、再懸濁させた。相補的なセンス鎖及びアンチセンス鎖を、等モル量で混合して、例えば５０μＭ二重鎖の、最終溶液を得た。試料をＲＮＡ緩衝液（ＩＤＴ）中、１００℃で５分間加熱し、使用前に室温まで放冷した。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）オリゴマーを－２０℃で貯蔵した。一本鎖ＲＮＡオリゴマーを凍結乾燥して貯蔵するか、またはヌクレアーゼを含まない水中、－８０℃で貯蔵した。
命名法
一貫性のため、以下の命名法を本明細書で使用した。二重鎖に与えられた名称は、オリゴマーの長さ及びオーバーハングの有無を示す。「２５／２７」は、２５塩基のセンス鎖及び２７塩基のアンチセンス鎖と２塩基の３’オーバーハングを有する非対称二重鎖である。「２７／２５」は、２７塩基のセンス鎖及び２５塩基のアンチセンス鎖を有する非対称二重鎖である。
一貫性のため、以下の命名法を本明細書で使用した。二重鎖に与えられた名称は、オリゴマーの長さ及びオーバーハングの有無を示す。「２５／２７」は、２５塩基のセンス鎖及び２７塩基のアンチセンス鎖と２塩基の３’オーバーハングを有する非対称二重鎖である。「２７／２５」は、２７塩基のセンス鎖及び２５塩基のアンチセンス鎖を有する非対称二重鎖である。
細胞培養及びＲＮＡトランスフェクション
Ｈｕｈ７細胞を得て、１０％ウシ胎仔血清（ハイクローン）を補充されたＤＭＥＭ（ハイクローン）中、５％ＣＯ２の下、３７℃で保持した。ＲＮＡトランスフェクションのために、リポフェクタミン（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロジェン）及び以下の製造業者の使用説明書を用いて、細胞を最終濃度１ｎＭ、０．１ｎＭまたは０．０３ｎＭのＤｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。手短に述べると、例えば下記の実施例３の、０．１ｎＭトランスフェクションでは、各ＤｓｉＲＮＡの原液のアリコットを、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ（インビトロジェン）及びリポフェクタミン（商標）ＲＮＡｉＭＡＸと混合して、１５０μＬの体積（０．３ｎＭ ＤｓｉＲＮＡ）にした。得られた１５０μＬミックスを、室温で２０分間インキュベートしてＤｓｉＲＮＡ：リポフェクタミン（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ複合体を形成させた。その間に、標的細胞をトリプシン処理して、培地に再懸濁させた。２０分間の複合体化の終了時に、ＤｓｉＲＮＡ：ＲＮＡｉＭＡＸ混合物５０μＬで、９６ウェルプレートのウェルに三箇所ずつ添加した。最後に、細胞懸濁液１００μＬを各ウェルに添加し（最終容量１５０μＬ）、プレートをインキュベータに２４時間静置した。
Ｈｕｈ７細胞を得て、１０％ウシ胎仔血清（ハイクローン）を補充されたＤＭＥＭ（ハイクローン）中、５％ＣＯ２の下、３７℃で保持した。ＲＮＡトランスフェクションのために、リポフェクタミン（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロジェン）及び以下の製造業者の使用説明書を用いて、細胞を最終濃度１ｎＭ、０．１ｎＭまたは０．０３ｎＭのＤｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。手短に述べると、例えば下記の実施例３の、０．１ｎＭトランスフェクションでは、各ＤｓｉＲＮＡの原液のアリコットを、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ（インビトロジェン）及びリポフェクタミン（商標）ＲＮＡｉＭＡＸと混合して、１５０μＬの体積（０．３ｎＭ ＤｓｉＲＮＡ）にした。得られた１５０μＬミックスを、室温で２０分間インキュベートしてＤｓｉＲＮＡ：リポフェクタミン（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ複合体を形成させた。その間に、標的細胞をトリプシン処理して、培地に再懸濁させた。２０分間の複合体化の終了時に、ＤｓｉＲＮＡ：ＲＮＡｉＭＡＸ混合物５０μＬで、９６ウェルプレートのウェルに三箇所ずつ添加した。最後に、細胞懸濁液１００μＬを各ウェルに添加し（最終容量１５０μＬ）、プレートをインキュベータに２４時間静置した。
α１アンチトリプシン阻害の評価
α１アンチトリプシン標的遺伝子ノックダウンをｑＲＴ－ＰＣＲにより計測し、値をＨＰＲＴ及びＳＦＲＳ９ハウスキーピング遺伝子と、対照ＤｓｉＲＮＡ及び／またはモックトランスフェクション対照でのトランスフェクションとに正規化した。
α１アンチトリプシン標的遺伝子ノックダウンをｑＲＴ－ＰＣＲにより計測し、値をＨＰＲＴ及びＳＦＲＳ９ハウスキーピング遺伝子と、対照ＤｓｉＲＮＡ及び／またはモックトランスフェクション対照でのトランスフェクションとに正規化した。
ＲＮＡ単離及び分析
培地を吸引し、全ＲＮＡをＳＶ９６キット（プロメガ）を用いて抽出した。全ＲＮＡを、製造業者の使用説明書に従い、スーパースクリプトＩＩ、オリゴｄＴ、及びランダムヘキサマーを用いて逆転写した。典型的には得られたｃＤＮＡを、α１アンチトリプシン遺伝子とヒト遺伝子ＨＰＲＴ－１及びＳＦＲＳ９の両方に特異的なプライマー及びプローブを用いたｑＰＣＲにより分析した。ＡＢＩ７７００を増幅反応に用いた。各試料を、三重測定でテストした。相対的なα１アンチトリプシンＲＮＡレベルを、ＨＰＲＴ１及びＳＦＲＳ９ ＲＮＡレベルに正規化して、トランスフェクション対照試料中で得られたＲＮＡレベルと比較した。
培地を吸引し、全ＲＮＡをＳＶ９６キット（プロメガ）を用いて抽出した。全ＲＮＡを、製造業者の使用説明書に従い、スーパースクリプトＩＩ、オリゴｄＴ、及びランダムヘキサマーを用いて逆転写した。典型的には得られたｃＤＮＡを、α１アンチトリプシン遺伝子とヒト遺伝子ＨＰＲＴ－１及びＳＦＲＳ９の両方に特異的なプライマー及びプローブを用いたｑＰＣＲにより分析した。ＡＢＩ７７００を増幅反応に用いた。各試料を、三重測定でテストした。相対的なα１アンチトリプシンＲＮＡレベルを、ＨＰＲＴ１及びＳＦＲＳ９ ＲＮＡレベルに正規化して、トランスフェクション対照試料中で得られたＲＮＡレベルと比較した。
実施例２：α１アンチトリプシンのＤｓｉＲＮＡ阻害
α１アンチトリプシンを標的とするＤｓｉＲＮＡ分子を、先に記載された通り設計して合成し、ヒトＨｕｈ７細胞（あるいはＨｅｐＧ２または他のヒト細胞を用いることができた）において阻害効果についてテストした。トランスフェクションについては、アニーリングされたＤｓｉＲＮＡをトランスフェクション試薬（リポフェクタミン（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ、インビトロジェン）と混合して、室温で２０分間インキュベートした。Ｈｕｈ７（ヒト）またはＡＭＬ１２（マウス）細胞（あるいはマウスＨｅｐａ１－６または他のマウス細胞を用いることができ得た）をトリプシン処理して培地に再懸濁させ、ウェルに添加して（ウェルあたり１００μＬ）、最終ＤｓｉＲＮＡ濃度１ｎＭを１５０μｌの体積で与えた。各ＤｓｉＲＮＡトランスフェクション混合物を、三重測定でのＤｓｉＲＮＡ処置のために３つのウェルに添加した。細胞を、ＤｓｉＲＮＡトランスフェクション混合物の連続での存在下、３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間目に、ＲＮＡを処置細胞の各ウェルから調製した。トランスフェクション混合物を含む上清を最初に除去して廃棄し、その後、細胞を溶解して、ＲＮＡを各ウェルから調製した。処置後の標的α１アンチトリプシンＲＮＡレベルを、α１アンチトリプシン標的遺伝子についてｑＲＴ－ＰＣＲにより評価し、値を対照で得られた値に正規化した。三重測定のデータを平均して、％誤差を各処置について決定した。正規化されたデータで表及びグラフの両方を作成し、対照と比較した、活性ＤｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの減少を決定した（以下の表２２及び図２Ａ～２Ｄ参照）。
α１アンチトリプシンを標的とするＤｓｉＲＮＡ分子を、先に記載された通り設計して合成し、ヒトＨｕｈ７細胞（あるいはＨｅｐＧ２または他のヒト細胞を用いることができた）において阻害効果についてテストした。トランスフェクションについては、アニーリングされたＤｓｉＲＮＡをトランスフェクション試薬（リポフェクタミン（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ、インビトロジェン）と混合して、室温で２０分間インキュベートした。Ｈｕｈ７（ヒト）またはＡＭＬ１２（マウス）細胞（あるいはマウスＨｅｐａ１－６または他のマウス細胞を用いることができ得た）をトリプシン処理して培地に再懸濁させ、ウェルに添加して（ウェルあたり１００μＬ）、最終ＤｓｉＲＮＡ濃度１ｎＭを１５０μｌの体積で与えた。各ＤｓｉＲＮＡトランスフェクション混合物を、三重測定でのＤｓｉＲＮＡ処置のために３つのウェルに添加した。細胞を、ＤｓｉＲＮＡトランスフェクション混合物の連続での存在下、３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間目に、ＲＮＡを処置細胞の各ウェルから調製した。トランスフェクション混合物を含む上清を最初に除去して廃棄し、その後、細胞を溶解して、ＲＮＡを各ウェルから調製した。処置後の標的α１アンチトリプシンＲＮＡレベルを、α１アンチトリプシン標的遺伝子についてｑＲＴ－ＰＣＲにより評価し、値を対照で得られた値に正規化した。三重測定のデータを平均して、％誤差を各処置について決定した。正規化されたデータで表及びグラフの両方を作成し、対照と比較した、活性ＤｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの減少を決定した（以下の表２２及び図２Ａ～２Ｄ参照）。
実施例３：α１アンチトリプシンのＤｓｉＲＮＡ阻害 － 第二のスクリーニング
その後、上記実験の９６の非対称ＤｓｉＲＮＡ（Ｈｓα１アンチトリプシンを標的とする９６であり、そのうち７つはＭｍα１アンチトリプシンも標的とした）を、第二のアッセイ（「第二相」）で検査して、そのようなアッセイの結果を図３Ａ～３Ｈにヒストグラム形式で表した。具体的には先の通り試験されたものから選択された９６の非対称ＤｓｉＲＮＡを、ヒトα１アンチトリプシン阻害について、ヒトＨｕｈ７細胞の環境で１ｎＭ、０．１ｎＭ及び０．０３ｎＭで評価した（図３Ａ～３Ｄ）。これらの９６の非対称ＤｓｉＲＮＡを、マウスα１アンチトリプシン阻害についても、マウスＡＭＬ１２細胞の環境で１ｎＭ、０．１ｎＭ及び０．０３ｎＭで評価した（図３Ｅ～３Ｈ）。図３Ａ～３Ｄに示される通り、ほとんどの非対称ＤｓｉＲＮＡは、Ｈｕｈ７細胞の環境でアッセイされた場合に、ナノモル未満の濃度で有意なヒトα１アンチトリプシン阻害効果を、再現性を持って示した。加えて図３Ｅ～３Ｈに示される通り、マウスＡＭＬ１２細胞の環境でアッセイされた場合に、ナノモル以下の濃度で有意なマウスα１アンチトリプシン阻害効果を有する限定数の非対称ＤｓｉＲＮＡが同定された。
その後、上記実験の９６の非対称ＤｓｉＲＮＡ（Ｈｓα１アンチトリプシンを標的とする９６であり、そのうち７つはＭｍα１アンチトリプシンも標的とした）を、第二のアッセイ（「第二相」）で検査して、そのようなアッセイの結果を図３Ａ～３Ｈにヒストグラム形式で表した。具体的には先の通り試験されたものから選択された９６の非対称ＤｓｉＲＮＡを、ヒトα１アンチトリプシン阻害について、ヒトＨｕｈ７細胞の環境で１ｎＭ、０．１ｎＭ及び０．０３ｎＭで評価した（図３Ａ～３Ｄ）。これらの９６の非対称ＤｓｉＲＮＡを、マウスα１アンチトリプシン阻害についても、マウスＡＭＬ１２細胞の環境で１ｎＭ、０．１ｎＭ及び０．０３ｎＭで評価した（図３Ｅ～３Ｈ）。図３Ａ～３Ｄに示される通り、ほとんどの非対称ＤｓｉＲＮＡは、Ｈｕｈ７細胞の環境でアッセイされた場合に、ナノモル未満の濃度で有意なヒトα１アンチトリプシン阻害効果を、再現性を持って示した。加えて図３Ｅ～３Ｈに示される通り、マウスＡＭＬ１２細胞の環境でアッセイされた場合に、ナノモル以下の濃度で有意なマウスα１アンチトリプシン阻害効果を有する限定数の非対称ＤｓｉＲＮＡが同定された。
実施例４：α１アンチトリプシン標的化ＤｓｉＲＮＡの修飾形態はインビトロでα１アンチトリプシンレベルを低下させた
上記の初期スクリーニングのα１アンチトリプシンと標的とする２４種のＤｓｉＲＮＡ（ＡＡＴ－４８６、－４９０、－４９６、－５０８、－８１０、－８９８、－８９９、－９１１、－１０６９、－１３６０、－１３６１、－１４４９、－１４５０、－１４５３、－１４５８、－１４５９、－１４６０、－１４６１、－１４６２、－１４６３、－１４６５、－１４７１、－１４７６及び－１４７７）を、図４Ａの図式に示された通り２’－Ｏ－メチルガイド鎖及びパッセンジャー鎖修飾パターンで調製した（個々の鎖の修飾パターンを図４Ｂにおいて分離して示した；修飾は、「Ｍ１０７」修飾パッセンジャー鎖及び上記のガイド鎖修飾パターン「Ｍ８」、「Ｍ１７」、「Ｍ３５」及び「Ｍ４８」を含む）。２４のＤｓｉＲＮＡ配列のそれぞれについて、４つのガイド鎖修飾パターンＭ８、Ｍ１７、Ｍ３５及びＭ４８のそれぞれを有するＤｓｉＲＮＡを、ヒトＨｕｈ７細胞のα１アンチトリプシン阻害について、Ｈｕｈ７細胞の環境で１ｎＭ、０．１ｎＭ及び０．０３ｎＭ濃度でアッセイした。これらの実験の結果を、図４Ｃ～４Ｆにヒストグラムとして表す。概して２４のＤｓｉＲＮＡ配列は、ガイド鎖の２’－Ｏ－メチル修飾の度合が増加するに従い、α１アンチトリプシン阻害効果が減少する傾向を示した。しかし、検査した全てのＤｓｉＲＮＡ配列について、ＤｓｉＲＮＡにインビトロで有意なα１アンチトリプシン阻害効果を保持させる修飾パターンを、特定することができた。これらＤｓｉＲＮＡのうちのいくつか（例えば、ＡＡＴ－４８６、ＡＡＴ－４９０、ＡＡＴ－８９９、ＡＡＴ－９１１、ＡＡＴ－１３６１、ＡＡＴ－１４５８、ＡＡＴ－１４５９、ＡＡＴ－１４６０、ＡＡＴ－１４６２、ＡＡＴ－１４６３、ＡＡＴ－１４６５及びＡＡＴ－１４７７）が、検査された最も高い修飾状態であっても強いα１アンチトリプシン阻害効果を示したことも、注目に値した。したがってそのような高活性の修飾ＤｓｉＲＮＡ配列は、インビボで対象に治療的に投与された場合に、そのようなＤｓｉＲＮＡの安定化及び／またはそのようなＤｓｉＲＮＡの免疫原性低下を可能にすると考えられる修飾パターンを有した。
上記の初期スクリーニングのα１アンチトリプシンと標的とする２４種のＤｓｉＲＮＡ（ＡＡＴ－４８６、－４９０、－４９６、－５０８、－８１０、－８９８、－８９９、－９１１、－１０６９、－１３６０、－１３６１、－１４４９、－１４５０、－１４５３、－１４５８、－１４５９、－１４６０、－１４６１、－１４６２、－１４６３、－１４６５、－１４７１、－１４７６及び－１４７７）を、図４Ａの図式に示された通り２’－Ｏ－メチルガイド鎖及びパッセンジャー鎖修飾パターンで調製した（個々の鎖の修飾パターンを図４Ｂにおいて分離して示した；修飾は、「Ｍ１０７」修飾パッセンジャー鎖及び上記のガイド鎖修飾パターン「Ｍ８」、「Ｍ１７」、「Ｍ３５」及び「Ｍ４８」を含む）。２４のＤｓｉＲＮＡ配列のそれぞれについて、４つのガイド鎖修飾パターンＭ８、Ｍ１７、Ｍ３５及びＭ４８のそれぞれを有するＤｓｉＲＮＡを、ヒトＨｕｈ７細胞のα１アンチトリプシン阻害について、Ｈｕｈ７細胞の環境で１ｎＭ、０．１ｎＭ及び０．０３ｎＭ濃度でアッセイした。これらの実験の結果を、図４Ｃ～４Ｆにヒストグラムとして表す。概して２４のＤｓｉＲＮＡ配列は、ガイド鎖の２’－Ｏ－メチル修飾の度合が増加するに従い、α１アンチトリプシン阻害効果が減少する傾向を示した。しかし、検査した全てのＤｓｉＲＮＡ配列について、ＤｓｉＲＮＡにインビトロで有意なα１アンチトリプシン阻害効果を保持させる修飾パターンを、特定することができた。これらＤｓｉＲＮＡのうちのいくつか（例えば、ＡＡＴ－４８６、ＡＡＴ－４９０、ＡＡＴ－８９９、ＡＡＴ－９１１、ＡＡＴ－１３６１、ＡＡＴ－１４５８、ＡＡＴ－１４５９、ＡＡＴ－１４６０、ＡＡＴ－１４６２、ＡＡＴ－１４６３、ＡＡＴ－１４６５及びＡＡＴ－１４７７）が、検査された最も高い修飾状態であっても強いα１アンチトリプシン阻害効果を示したことも、注目に値した。したがってそのような高活性の修飾ＤｓｉＲＮＡ配列は、インビボで対象に治療的に投与された場合に、そのようなＤｓｉＲＮＡの安定化及び／またはそのようなＤｓｉＲＮＡの免疫原性低下を可能にすると考えられる修飾パターンを有した。
実施例５：ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の両方の修飾を有するα１アンチトリプシン標的化ＤｓｉＲＮＡのさらなる形態はインビトロでα１アンチトリプシンレベルを低下させた
上記実験のうちの、１６種のα１アンチトリプシンを標的とするＤｓｉＲＮＡ（ＡＡＴ－４９０、ＡＡＴ－４９６、ＡＡＴ－８１０、ＡＡＴ－８９８、ＡＡＴ－８９９、ＡＡＴ－１３６０、ＡＡＴ－１３６１、ＡＡＴ－１４５０、ＡＡＴ－１４５３、ＡＡＴ－１４５８、ＡＡＴ－１４５９、ＡＡＴ－１４６１、ＡＡＴ－１４６２、ＡＡＴ－１４６３、ＡＡＴ－１４７１及びＡＡＴ－１４７７）を、上記及び図５Ａ～５Ｃに表されたような２’－Ｏ－メチルパッセンジャー鎖及びガイド鎖修飾パターンで調製した（パッセンジャー鎖修飾パターン「ＳＭ１４」、「ＳＭ２４」、「ＳＭ１０７」、「ＳＭ２５０」、「ＳＭ２５１」及び「ＳＭ２５２」と、ガイド鎖修飾パターン「Ｍ４８」、「Ｍ８」及び「Ｍ１７」を含む）。１６のＤｓｉＲＮＡ配列のそれぞれについて、６つのパッセンジャー鎖修飾パターンＭ１４、Ｍ２４、Ｍ１０７、Ｍ２５０、Ｍ２５１及びＭ２５２と、１つの好ましいガイド鎖修飾パターン（ガイド鎖修飾パターンＭ４８、Ｍ８及びＭ１７から選択）のそれぞれを有するＤｓｉＲＮＡを、ヒトＨｕｈ７細胞でのα１アンチトリプシン阻害について、Ｈｕｈ７細胞の環境で１．０ｎＭ、０．１ｎＭ及び０．０３ｎＭ（３０ピコモル）濃度でアッセイした。これらの実験の結果を、図５Ｄ～５Ｈにヒストグラムとして表す。検査した全てのＤｓｉＲＮＡ配列について、ＤｓｉＲＮＡにインビトロで有意なα１アンチトリプシン阻害効果を保持させる、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の両方の広範囲な修飾を有する少なくとも１つの二重鎖を、特定することができた。これらのＤｓｉＲＮＡの多く（例えば、ＡＡＴ－８９９、ＡＡＴ－８９９、ＡＡＴ－１４６１、ＡＡＴ－１４６２、ＡＡＴ－１４６３、ＡＡＴ－１４７１及びＡＡＴ－１４７７）が、検査された全ての修飾状態で強いα１アンチトリプシン阻害効果を示すことは、注目に値した。そのような高活性の修飾ＤｓｉＲＮＡ配列は、インビボで対象に治療的に投与された場合に、そのようなＤｓｉＲＮＡの安定化及び／またはそのようなＤｓｉＲＮＡの免疫原性低下を可能にすると考えられる修飾パターンを有する。
上記実験のうちの、１６種のα１アンチトリプシンを標的とするＤｓｉＲＮＡ（ＡＡＴ－４９０、ＡＡＴ－４９６、ＡＡＴ－８１０、ＡＡＴ－８９８、ＡＡＴ－８９９、ＡＡＴ－１３６０、ＡＡＴ－１３６１、ＡＡＴ－１４５０、ＡＡＴ－１４５３、ＡＡＴ－１４５８、ＡＡＴ－１４５９、ＡＡＴ－１４６１、ＡＡＴ－１４６２、ＡＡＴ－１４６３、ＡＡＴ－１４７１及びＡＡＴ－１４７７）を、上記及び図５Ａ～５Ｃに表されたような２’－Ｏ－メチルパッセンジャー鎖及びガイド鎖修飾パターンで調製した（パッセンジャー鎖修飾パターン「ＳＭ１４」、「ＳＭ２４」、「ＳＭ１０７」、「ＳＭ２５０」、「ＳＭ２５１」及び「ＳＭ２５２」と、ガイド鎖修飾パターン「Ｍ４８」、「Ｍ８」及び「Ｍ１７」を含む）。１６のＤｓｉＲＮＡ配列のそれぞれについて、６つのパッセンジャー鎖修飾パターンＭ１４、Ｍ２４、Ｍ１０７、Ｍ２５０、Ｍ２５１及びＭ２５２と、１つの好ましいガイド鎖修飾パターン（ガイド鎖修飾パターンＭ４８、Ｍ８及びＭ１７から選択）のそれぞれを有するＤｓｉＲＮＡを、ヒトＨｕｈ７細胞でのα１アンチトリプシン阻害について、Ｈｕｈ７細胞の環境で１．０ｎＭ、０．１ｎＭ及び０．０３ｎＭ（３０ピコモル）濃度でアッセイした。これらの実験の結果を、図５Ｄ～５Ｈにヒストグラムとして表す。検査した全てのＤｓｉＲＮＡ配列について、ＤｓｉＲＮＡにインビトロで有意なα１アンチトリプシン阻害効果を保持させる、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の両方の広範囲な修飾を有する少なくとも１つの二重鎖を、特定することができた。これらのＤｓｉＲＮＡの多く（例えば、ＡＡＴ－８９９、ＡＡＴ－８９９、ＡＡＴ－１４６１、ＡＡＴ－１４６２、ＡＡＴ－１４６３、ＡＡＴ－１４７１及びＡＡＴ－１４７７）が、検査された全ての修飾状態で強いα１アンチトリプシン阻害効果を示すことは、注目に値した。そのような高活性の修飾ＤｓｉＲＮＡ配列は、インビボで対象に治療的に投与された場合に、そのようなＤｓｉＲＮＡの安定化及び／またはそのようなＤｓｉＲＮＡの免疫原性低下を可能にすると考えられる修飾パターンを有する。
実施例６：α１アンチトリプシン標的化ｄｓＲＮＡの一本鎖伸長形態の合成及び試験
以下のα１アンチトリプシン標的化ｄｓＲＮＡも合成し、それらはガイド鎖の一本鎖５’伸長を有した（図６Ａにも示した）
ここで、下線は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡを示し、太字で斜体の「Ａ」は、２’－フルオロアデニン残基を示す。
以下のα１アンチトリプシン標的化ｄｓＲＮＡも合成し、それらはガイド鎖の一本鎖５’伸長を有した（図６Ａにも示した）
本発明のｄｓＲＮＡの上記「一本鎖伸長」（または「ｓｓ伸長」）形態を、Ｈｕｈ７細胞におけるα１アンチトリプシンノックダウン活性についても試験し、図６Ｂに示された通り、全てが強いα１アンチトリプシン阻害効果を示し、測定されたＩＣ５０値が全て０．１～２０ｐＭの範囲内であり、測定された最小のＩＣ５０値は、ＡＡＴ－１４７７－Ｍ２５１－ＥｘＭ４８伸長ｄｓＮＡ（図６Ｂでは「ＳＥＲＰＩＮＡ１ １４７７－Ｍ２５１－ＥｘＭ４８」とも称される）について得られた０．１ｐＭであった。これらのｄｓＮＡ伸長形態のそれぞれが、インビボ投与された場合、及び／またはインビボ免疫原性の予測もしくは評価のためのインビトロモデルもしくはアッセイ系において、免疫原性の欠如（例えば、ＩＦＮ及び／またはＰＫＲ効果（複数可）を効果的に誘導しないこと）も示されると予想され、それがこれらのｄｓＲＮＡ配列の一本鎖伸長内に存在する修飾により提供されるマスキングに起因する可能性がある。そのようなｄｓＲＮＡ配列は、インビボで対象に治療的に投与された場合に、（そのような長さのｄｓＲＮＡについても）そのようなｄｓＲＮＡの安定化及び／またはそのようなｄｓＲＮＡの免疫原性低下を可能にすると考えられる修飾パターンを有する。
実施例７：α１アンチトリプシンを標的とするＤｓｉＲＮＡのインビボ有効性の評価
ある特定の活性α１アンチトリプシン標的化ＤｓｉＲＮＡがマウスの、任意で肝臓疾患のマウスモデルの、α１アンチトリプシンレベルを低下させる能力を検査する。動物を無作為化し、マーカレベルに基づいて群に割り付ける。ＤｓｉＲＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）（任意で、ＥｎＣｏｒｅ－２０７２という名称のＬＰＮ配合剤が用いられる）の動物への投薬を、０日目に開始する。動物に５ｍｇ／ｋｇ ｉｖで１週間に３回ずつ２週間（合計６回）投与する。最後の投薬後４８時間目に、動物を殺処分する。肝臓を摘出して計量して、α１アンチトリプシンレベルを評価する（任意で、肝臓疾患または障害のマウスモデルでは、該疾患または障害の低減及び／または予防の度合いを評価する）。
ある特定の活性α１アンチトリプシン標的化ＤｓｉＲＮＡがマウスの、任意で肝臓疾患のマウスモデルの、α１アンチトリプシンレベルを低下させる能力を検査する。動物を無作為化し、マーカレベルに基づいて群に割り付ける。ＤｓｉＲＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）（任意で、ＥｎＣｏｒｅ－２０７２という名称のＬＰＮ配合剤が用いられる）の動物への投薬を、０日目に開始する。動物に５ｍｇ／ｋｇ ｉｖで１週間に３回ずつ２週間（合計６回）投与する。最後の投薬後４８時間目に、動物を殺処分する。肝臓を摘出して計量して、α１アンチトリプシンレベルを評価する（任意で、肝臓疾患または障害のマウスモデルでは、該疾患または障害の低減及び／または予防の度合いを評価する）。
実施例８：適応症
α１アンチトリプシン研究における現在の知識体系から、研究、診断、及び治療使用のために、α１アンチトリプシン活性をアッセイする方法と、α１アンチトリプシン発現を調節し得る化合物と、の必要性が示される。本明細書に記載される通り、本発明の核酸分子は、α１アンチトリプシンレベルに関係する疾患状態を診断するアッセイで用いられ得る。加えて、該核酸分子は、α１アンチトリプシン誤制御、レベルなどに関係する疾患状態を処置するために用いられ得る。
α１アンチトリプシン研究における現在の知識体系から、研究、診断、及び治療使用のために、α１アンチトリプシン活性をアッセイする方法と、α１アンチトリプシン発現を調節し得る化合物と、の必要性が示される。本明細書に記載される通り、本発明の核酸分子は、α１アンチトリプシンレベルに関係する疾患状態を診断するアッセイで用いられ得る。加えて、該核酸分子は、α１アンチトリプシン誤制御、レベルなどに関係する疾患状態を処置するために用いられ得る。
α１アンチトリプシン発現のモジュレーションに関連し得る具体的な障害及び疾患状態としては、慢性肝臓疾患、肝臓の炎症、肝硬変、肝線維症、及び肝細胞癌が挙げられるが、それらに限定されない。
他の治療薬を、本発明の核酸分子（例えば、ＤｓｉＲＮＡ分子）と組み合わせること、またはそれとともに使用することができる。当業者は、本明細書に記載される疾患及び病状を処置するために用いられる他の化合物及び治療を、本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ分子）と併用することができ、それゆえそれが本発明の範囲内であることを認識するであろう。例えば併用療法では、本発明の核酸は、少なくとも２つの方法のうちの１つで調製され得る。第一の方法では、該薬剤を、核酸と他の薬剤との調製物、例えばリポソーム中にカプセル化された本発明の核酸と静脈投与用の溶液中の他の薬剤とが治療有効濃度で存在する混合物（例えば、１０００～１２５０ｍｇ／ｍ２／日を送達する溶液中の他の薬剤、及び０．１～１００ｍｇ／ｋｇ／日を送達する前記溶液中の本発明のリポソーム結合核酸）に、物理的に混和する。あるいは該薬剤を、それぞれの有効用量で（例えば、１０００～１２５０ｍｇ／ｍ２／日の他の薬剤、及び０．１～１００ｍｇ／ｋｇ／日の本発明の核酸）別個であるが同時に、または順次投与する。
実施例９：ＤｓｉＲＮＡの血清安定性
５０％ウシ胎仔血清中でＤｓｉＲＮＡ剤を３７℃で様々な期間（最大２４時間）、インキュベートすることにより、ＤｓｉＲＮＡ剤の血清安定性を評価する。血清を抽出して、核酸を２０％非変性ＰＡＧＥ上に分離し、ゲルスター（Ｇｅｌｓｔａｒ）染色で視覚化することができる。ヌクレアーゼ分解からの相対的保護レベルを、ＤｓｉＲＮＡについて評価する（任意で修飾して、または修飾せずに）。
５０％ウシ胎仔血清中でＤｓｉＲＮＡ剤を３７℃で様々な期間（最大２４時間）、インキュベートすることにより、ＤｓｉＲＮＡ剤の血清安定性を評価する。血清を抽出して、核酸を２０％非変性ＰＡＧＥ上に分離し、ゲルスター（Ｇｅｌｓｔａｒ）染色で視覚化することができる。ヌクレアーゼ分解からの相対的保護レベルを、ＤｓｉＲＮＡについて評価する（任意で修飾して、または修飾せずに）。
実施例１０：診断的使用
本発明のＤｓｉＲＮＡ分子を、様々な適用、例えば臨床、工業、環境、農業及び／または研究での設定、における分子標的（例えば、ＲＮＡ）の特定などの様々な診断的適用で用いることができる。ＤｓｉＲＮＡ分子のそのような診断的使用は、例えば細胞溶解物または部分的に精製された細胞溶解物を用い、再構成されたＲＮＡｉ系を使用することを含む。本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、罹患した細胞内の遺伝的浮動及び突然変異を検査する診断ツールとして用いることができる。ＤｓｉＲＮＡ活性と標的α１アンチトリプシンＲＮＡの構造との密接な関連性により、標的α１アンチトリプシンＲＮＡの塩基対合及び三次元構造を改変するα１アンチトリプシン分子の一領域内の突然変異を検出することができる。本発明に記載された複数のＤｓｉＲＮＡ分子を使用することにより、インビトロならびに細胞及び組織内でのＲＮＡ構造及び機能に重要となるヌクレオチド変化をマッピングすることができる。ＤｓｉＲＮＡ分子による標的α１アンチトリプシンＲＮＡの切断を利用して、遺伝子発現を阻害し、α１アンチトリプシン関連疾患または障害の進行における特定の遺伝子産物の役割を定義することができる。このようにして、他の遺伝子標的を、該疾患の重要な仲介因子として定義することができる。これらの実験は、併用療法（例えば、異なる遺伝子を標的とする複数のＤｓｉＲＮＡ分子、公知の小分子阻害剤と結合させたＤｓｉＲＮＡ分子、あるいはＤｓｉＲＮＡ分子及び／または他の化学的もしくは生物学的分子と併用される間欠処置）の可能性を付与することにより、疾患進行のより良好な治療をもたらすであろう。本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の他のインビトロ使用は、当該技術分野で周知であり、疾患または関係の病状に関連するＲＮＡの存在の検出を含む。そのようなＲＮＡは、標準的な手法、例えば蛍光共鳴発光移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＦＲＥＴ）を利用して、ＤｓｉＲＮＡでの処理後の切断産物の存在を計測することにより検出される。
本発明のＤｓｉＲＮＡ分子を、様々な適用、例えば臨床、工業、環境、農業及び／または研究での設定、における分子標的（例えば、ＲＮＡ）の特定などの様々な診断的適用で用いることができる。ＤｓｉＲＮＡ分子のそのような診断的使用は、例えば細胞溶解物または部分的に精製された細胞溶解物を用い、再構成されたＲＮＡｉ系を使用することを含む。本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、罹患した細胞内の遺伝的浮動及び突然変異を検査する診断ツールとして用いることができる。ＤｓｉＲＮＡ活性と標的α１アンチトリプシンＲＮＡの構造との密接な関連性により、標的α１アンチトリプシンＲＮＡの塩基対合及び三次元構造を改変するα１アンチトリプシン分子の一領域内の突然変異を検出することができる。本発明に記載された複数のＤｓｉＲＮＡ分子を使用することにより、インビトロならびに細胞及び組織内でのＲＮＡ構造及び機能に重要となるヌクレオチド変化をマッピングすることができる。ＤｓｉＲＮＡ分子による標的α１アンチトリプシンＲＮＡの切断を利用して、遺伝子発現を阻害し、α１アンチトリプシン関連疾患または障害の進行における特定の遺伝子産物の役割を定義することができる。このようにして、他の遺伝子標的を、該疾患の重要な仲介因子として定義することができる。これらの実験は、併用療法（例えば、異なる遺伝子を標的とする複数のＤｓｉＲＮＡ分子、公知の小分子阻害剤と結合させたＤｓｉＲＮＡ分子、あるいはＤｓｉＲＮＡ分子及び／または他の化学的もしくは生物学的分子と併用される間欠処置）の可能性を付与することにより、疾患進行のより良好な治療をもたらすであろう。本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の他のインビトロ使用は、当該技術分野で周知であり、疾患または関係の病状に関連するＲＮＡの存在の検出を含む。そのようなＲＮＡは、標準的な手法、例えば蛍光共鳴発光移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＦＲＥＴ）を利用して、ＤｓｉＲＮＡでの処理後の切断産物の存在を計測することにより検出される。
具体的例において、標的α１アンチトリプシンＲＮＡの野生型または突然変異体または多型のみを切断するＤｓｉＲＮＡ分子を、アッセイに用いる。第一のＤｓｉＲＮＡ分子（即ち、標的α１アンチトリプシンＲＮＡの野生型のみを切断するもの）を用いて、試料中に存在する野生型α１アンチトリプシンＲＮＡを特定し、第二のＤｓｉＲＮＡ分子（即ち、標的ＲＮＡの突然変異体または多型のみを切断するもの）を用いて、試料中の突然変異型または多型α１アンチトリプシンＲＮＡを特定する。反応対照として、野生型と突然変異型または多型の両方のα１アンチトリプシンＲＮＡの合成基質を、両方のＤｓｉＲＮＡ分子により切断して、反応物中及び「非標的」α１アンチトリプシンＲＮＡ種の切断の非存在下で、相対的ＤｓｉＲＮＡ効率を実証する。合成基質からの切断産物は、試料集団中の野生型及び突然変異型α１アンチトリプシンＲＮＡの分析のためのサイズマーカを作製する働きもある。したがって各分析は、２種のＤｓｉＲＮＡ分子、２種の基質及び１種の未知試料を必要とし、それが６種の反応物に混和される。切断産物の存在は、ＲＮａｓｅ保護アッセイを利用して決定され、それにより各α１アンチトリプシンＲＮＡの全長及び切断フラグメントをポリアクリルアミドゲルの１レーンで分析することができる。標的細胞における突然変異型または多型α１アンチトリプシンＲＮＡの発現と、α１アンチトリプシン関連表現型変化の推定リスクについての洞察を得るのに、結果を定量することが絶対に必要というわけではない。タンパク質産物が表現型（即ち、関係／関連する疾患）の発生に関連づけられるα１アンチトリプシンｍＲＮＡの発現が、リスクを確定するのに十分である。同等の特異的活性のプローブが、両方の転写産物に用いられれば、α１アンチトリプシンＲＮＡレベルの定量的比較は十分であり、初期診断のコストを削減する。より高い突然変異型または多型形態の野生型に対する比は、α１アンチトリプシンＲＮＡレベルが定性的に比較されるか、または定量的に比較するかにかかわらず、より高いリスクと相関する。
本明細書に挙げられる全ての特許及び発行物は、本発明が属する技術分野の当業者の技能レベルを示している。本開示に引用される全ての参考文献は、各参考資料が個別に全体として参照により取り込まれたのと同程度に、参照により取り込まれる。
本発明が、目的を実践し、挙げられた目的及び利点と本明細書に内在する目的及び利点を得るように十分適合されることは、当業者に容易に認識されよう。好ましい実施形態の目下の代表として本明細書に記載される方法及び組成物は、例示であり、本発明の範囲の限定を意図するものではない。本明細書内の変更及びその他の使用は、当業者に発想されると思われ、本発明の主旨に含まれ、特許請求の範囲により定義される。
様々な置換及び修正が、本発明の範囲及び主旨を逸脱することなく、本明細書に開示された本発明になされ得ることは、当業者に容易に明白となろう。したがってそのような追加の実施形態は、本発明の範囲及び以下の特許請求の範囲に含まれる。本発明は、ＲＮＡｉ活性を仲介するために改善された活性を有する核酸構築物を作製することに向けて、本明細書に記載された化学修飾の様々な組み合わせ及び／または置換を試験することを当業者に教示している。そのような改善された活性は、改善された安定性、改善された生物学的利用度、及び／またはＲＮＡｉを仲介する細胞応答の改善された活性を含み得る。それゆえ本明細書に記載された具体的実施形態は限定ではなく、そして改善されたＲＮＡｉ活性を有するＤｓｉＲＮＡ分子を特定することに向けた実験を過度に実施することなく、本明細書に記載された修正の特定の組み合わせが試験され得ることは、当業者に容易に理解され得る。
本明細書に例示的に記載された本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素または複数の要素、限定または複数の限定がなくとも適宜、実践され得る。したがって、例えば本明細書の各例において、「含む」、「本質的に～からなる」、及び「～からなる」という用語のいずれも、他の２つの用語のいずれかと置き換えてもよい。用いられた用語及び表現は、説明の用語として用いられており、限定ではなく、そのような用語及び表現の使用において図示及び記述された特色またはその一部の任意の均等物の排除を意図するものではなく、様々な修正が請求された本発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は好ましい実施形態により具体的に開示されるが、本明細書に開示される概念の任意選択的な特色、修正及び変形が当業者によって再分類され得ること、ならびにそのような修正及び変形が本明細書及び添付の特許請求の範囲によって定義された本発明の範囲内のものと見なされることが、理解されなければならない。
加えて、本発明の特色または態様がマーカッシュ群または他の代替の群に関して記載されている場合、それにより本発明がマーカッシュ群または他の群の任意の個々の構成員または構成員の下位群に関しても記載されていることが、当業者に認識されよう。
本発明を記述する文脈において（特に、以下の特許請求の範囲の文脈において）、「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び同様の指示対象用語の使用は、本明細書中で他に断りがあるか、または文脈によって明らかに否定される場合を除き、単数形及び複数形の両方を含むと解釈されるべきである。「含む」、「有する」、「包含する」、及び「含有する」という用語は、別様に言及されない限り、制限のない用語（即ち、「非限定的に含む」を意味する）と解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の記述は、本明細書中で他に断りがなければ、単に範囲内に入るそれぞれ別の値を個別に言及する簡便な方法として機能するものであり、それぞれの別の値は、本明細書中で個別に列挙されているかのごとく、本明細書中に取り込まれる。本明細書に記述される全ての方法は、本明細書中で他に断りがあるか、または文脈によって明らかに否定される場合を除き、任意の適切な順序で行うことができる。ありとあらゆる実施例、または本明細書中で示される例示的表現（例えば「などの」）の使用は、本発明をより明解にすることのみが意図されており、他に請求されない限り、本発明の範囲の限定を述べてはいない。本明細書中のいかなる表現も、任意の請求されていない要素を本発明の実施に不可欠であるとして示すと解釈されるべきではない。
本発明を実行するための本発明者に知られる最良の様式を含む本発明の実施形態が、本明細書中に記載されている。それらの実施形態の変形は、前述の記載を読むことにより、当業者により明らかになり得る。
本発明者らは、当業者がそのような変形を適宜使用することを予期しており、本発明者らは、本明細書の具体的な記載とは異なる形で、本発明が実施されることを意図する。従って本発明は、適用可能な法律によって許可される、添付の特許請求の範囲に記述される対象の全ての修正及び均等物を含む。さらに、全ての可能性のある変形における上記要素のいかなる組み合わせも、本明細書中で他に断りがあるか、または文脈によって明らかに否定されている場合を除き、本発明に含まれる。当業者は、本明細書に記載された本発明の具体的実施形態の多くの均等物を、日常的であるものを超えない実験を用いて認識するか、または確認を可能にするであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
Claims (15)
- 第1および第2の核酸鎖を含む二本鎖核酸（dsNA）であって、
(i）アンチセンス鎖は、19～35ヌクレオチド長であり、かつ配列番号：1547に記載の長さ19ヌクレオチドのα-1アンチトリプシン標的mRNAの連続した標的配列に相補的であり、
(ii）前記dsNAは、1つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、
(iii）センス鎖の3'-末端は、ヌクレオチドの一本鎖テトラループによって前記アンチセンス鎖の5'-末端に連結されており、
その結果、前記dsNAは、哺乳類細胞内に導入されたときに、α-1アンチトリプシンmRNAの発現を低下させることができる、二本鎖RNA。 - 前記センス鎖と前記アンチセンス鎖とが二重鎖を形成し、前記第二の鎖がその3′末端に2つのヌクレオチドのオーバーハングを含む、請求項1記載のdsNA。
- 前記dsNAが、長さ20～25塩基対の二重鎖からなる、請求項1記載のdsNA。
- 前記センス鎖の長さが25～53ヌクレオチドである、請求項2記載のdsNA。
- 前記センス鎖がテトラループからなる請求項1記載のdsNA。
- 前記テトラループが、GAAAの配列を有する一本鎖ループからなる、請求項5記載のdsNA。
- 前記テトラループが、GalNAc部位、コレステロール部位およびコレステロールターゲティングリガンドからなる群から選択される部位に結合される、請求項6に記載のdsNA。
- 前記テトラループがGalNAc部位に結合される、請求項7に記載のdsNA。
- 前記dsNAが少なくとも1つのホスホロチオアート結合を含む、請求項1記載のdsNA。
- 前記dsNAが1つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項1記載のdsNA。
- 前記1つ以上の修飾ヌクレオチドが、2′修飾を含む、請求項10記載のdsNA。
- 前記1つ以上の修飾ヌクレオチドが、2′-O-メチルヌクレオチドおよび2′-フルオロヌクレオチドから選択される、請求項10に記載のdsNA。
- 前記dsNAが、少なくとも1つの2′-フルオロヌクレオチドおよび少なくとも1つの2′-O-メチルヌクレオチドを含む、請求項1に記載のdsNA。
- 請求項1～14のいずれか1項に記載のdsRNAと薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
- α-1アンチトリプシンmRNAの発現を低下させることによって治療において使用するための、請求項14に記載の医薬組成物。
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