JP2010014648A - プローブアレイおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】蛍光観察をする際に、励起光の強度を変えて調整することなく、広いダイナミックレンジの検出結果が得られるプローブアレイを提供する。
【解決手段】互いに平行に延びる第１および第２の主面４，５を有し、その複数のプローブ保持部６にプローブ分子７を保持している、プローブ保持基板２と、蛍光受光面に対して平行に配置される基準面８を有するとともに、プローブ保持基板２を支持するための台座面１０を有し、台座面１０は基準面８に対して平行とはならない方向に延びている、台座部材３との組み合わせからなる。各プローブ保持部６は、受光面に対する角度が互いに異なる複数の面、すなわち、底面と、底面から立ち上がる複数の立ち上がり壁面とを有しているため、これら複数の面の感度を互いに異ならせることができ、その結果、広いダイナミックレンジを実現できる。
【選択図】図１

Description

この発明は、化学または生物化学の分野で用いるプローブアレイおよびその製造方法に関するもので、特に、蛍光観察法による検出の確実性を向上させるための改良に関するものである。

遺伝子診断を同時に多項目に関して行なう場合、あるいは多種類のｍＲＮＡに関してその発現量を同時に調査する場合、またあるいは多項目のＳＮＰｓ（single nucleotide polymorphisms：一塩基多型）の調査を同時に行なう場合等のツールとして、ＤＮＡチップが注目されている。ＤＮＡチップは、ＤＮＡマイクロアレイとも呼ばれるもので、標的とするＤＮＡ分子やＲＮＡ分子とハイブリダイゼーションを起こす既知のＤＮＡをプローブとし、周期的に配列された複数のプローブ保持部に複数種類のプローブを保持したプローブアレイである。

また、多種類の抗体や抗原に関してその有無を同時に調査する場合に用いられるツールとして、抗原チップや抗体チップが注目を集めている。抗原チップは、標的とする抗体分子と結合する既知の抗原をプローブとし、周期的に配列された複数のプローブ保持部に複数種類のプローブを保持したプローブアレイである。抗体チップは、標的とする抗原と結合する既知の抗体分子をプローブとし、周期的に配列された複数のプローブ保持部に複数種類のプローブを保持したプローブアレイである。

このようなプローブアレイを用いて標的分子を検出する一般的な方法として、蛍光観察法がある（たとえば、非特許文献１参照）。蛍光観察法においては、まず、試料溶液に化学的な処理を施して標的分子を蛍光修飾し、その試料溶液をプローブアレイのプローブ保持部に付着させる。そして、プローブアレイのうちのどのプローブに標的分子が結合したかを、蛍光観察（励起光を照射した上で、発する蛍光を観察する。）によって検出することで検査を行なう。

蛍光観察法が適用されるプローブアレイにあっては、試料溶液に含まれる標的分子の濃度が高い場合においても低い場合においても、標的分子の濃度に対して定量性が維持されることが望ましい。すなわち、標的分子の濃度に対して、広いダイナミックレンジを有することが望ましい。

しかしながら、従来は、感度の低いプローブアレイでは、標的分子の濃度が薄すぎる場合、プローブアレイの発する蛍光が微弱になりすぎて標的分子の存在を検出することができず、逆に感度の高いプローブアレイでは、標的分子の濃度が高すぎる場合、プローブアレイの発する蛍光強度が飽和してしまって定量性が失われてしまう。よって、標的分子の濃度が低いときでも高いときでも定量性を失わない、広いダイナミックレンジを有するプローブアレイが望まれている。

そこで、従来からあるプローブアレイを使用しながら、広いダイナミックレンジを得たい場合には、蛍光観察をする際に、励起光の強度を適当に調整しながら、複数回の蛍光観察をする方法が用いられるのが一般的であるが、複数回の観察が必要であるため、検出作業が煩雑である。また、複数回の励起光照射を受けるうちに、蛍光修飾された標的分子が蛍光退色して、感度が失われたり、感度が不安定になったりするという問題をも招く。

したがって、１回の蛍光観察で、広いダイナミックレンジの検出結果が得られるプローブアレイが望まれている。
関根光雄編，「新しいＤＮＡチップの科学と応用」，株式会社講談社発行，株式会社講談社サイエンティフィク編集，２００７年７月３０日，ｐ．００８−００９

そこで、この発明の目的は、上記のような要望を満たし得る、広いダイナミックレンジを有するプローブアレイおよびその製造方法を提供しようとすることである。

この発明は、蛍光観察法によってプローブ分子を検出する際に用いられる、プローブアレイの構造にまず向けられるものであって、上述した技術的課題を解決するため、次のような構成を備えることを特徴としている。

この発明に係るプローブアレイは、第１の局面では、相対向しかつ互いに平行に延びる第１および第２の主面を有し、かつ第１の主面に沿って複数のプローブ保持部が配列され、各プローブ保持部にプローブ分子を保持している、プローブ保持基板と、蛍光観察法においてプローブ保持部から発せられた蛍光を受光する受光面に対して平行に配置される基準面を有するとともに、プローブ保持基板を支持するためにプローブ保持基板の第２の主面に接する台座面を有する、台座部材との組み合わせからなる。

そして、プローブ保持基板において、各プローブ保持部は、主面に対して平行な底面と、底面から立ち上がる立ち上がり壁面とを有していることを特徴とし、また、台座部材において、上記台座面は、基準面に対して平行とはならない方向に延びていることを特徴としている。

この発明に係るプローブアレイは、第２の局面では、基準面を有し、かつ基準面に沿って複数のプローブ保持部が配列され、各プローブ保持部にプローブ分子が保持されている、プローブ保持基板を備える。

そして、プローブ保持基板は、基準面が、蛍光観察法においてプローブ保持部から発せられた蛍光を受光する受光面に対して平行に延びるように配置される。また、各プローブ保持部は、底面と、底面から立ち上がる立ち上がり壁面とを有し、立ち上がり壁面は、基準面に対して垂直とはならない方向に延びていることを特徴としている。

なお、この発明では、蛍光観察法においてプローブ保持部から発せられた蛍光を受光する受光面に対して平行に配置される面を基準面としたが、第１の局面における発明では、台座部材に基準面を有し、他方、第２の局面における発明では、プローブ保持基板に基準面を有している。

この発明に係るプローブアレイにおいて、９０度以下の角度側で測定したとき、すなわち角度を９０度以下側で示した場合に、底面および立ち上がり壁面のいずれかは、基準面に対して、角度θ１をなす第１の面と、角度θ１より大きい角度θ２をなす第２の面とを少なくとも有し、cos θ１／cos θ２の値が５以上かつ５０以下であることが好ましく、cos θ１／cos θ２の値が５以上かつ２０以下であることがより好ましい。

また、この発明に係るプローブアレイにおいて、９０度以下の角度側で測定したとき、底面および立ち上がり壁面のいずれかは、基準面に対して、角度の小さい順に、角度θ１、θ２、…、θｎをそれぞれなす第１、第２、…、第ｎの面を少なくとも有し、ｋを２以上かつｎ以下の任意の自然数としたとき、第（ｋ−１）および第ｋの面の、基準面に対してそれぞれなす角度θ（ｋ−１）およびθｋについて、cos θ（ｋ−１）／cos θｋの値が５０以下であり、かつ、cos θ１／cos θｎの値が５以上であることが好ましく、cos θ（ｋ−１）／cos θｋの値が２０以下であることがより好ましく、また、cos θ１／cos θｎの値が５０以上であることがより好ましい。

さらに、角度θ１、θ２、…、θｎにおいて、cos θ（ｋ−１）／cos θｋの値がほぼ一定であることが好ましい。

なお、上述したような特定的な関係に選ばれる角度θ１、θ２、…、θｎをそれぞれなす第１、第２、…、第ｎの面については、これらの面が少なくとも存在していればよいということであり、これら以外の角度をなす面がさらに存在することを妨げるものではない。

この発明は、また、プローブアレイの製造方法にも向けられる。

前述の第１の局面に係るプローブアレイを製造する方法は、プローブ保持基板および台座部材をそれぞれ用意する工程と、プローブ保持基板の各プローブ保持部にプローブ分子を保持させる工程と、プローブ保持基板の第２の主面を台座部材の台座面に向けた状態で、プローブ保持基板を台座面に貼り付ける工程とを備えることを特徴としている。

上述のプローブ保持部にプローブ分子を保持させる工程は、プローブ保持基板を台座面に貼り付ける工程の前に実施されても、後に実施されてもよい。

また、上述の台座部材を用意する工程において、台座面には窪みが形成され、プローブ保持基板を台座面に貼り付ける工程は、接着剤を用いてプローブ保持基板を台座面に貼り付ける工程を含み、プローブ保持基板を台座面に貼り付ける工程において、窪みは接着剤の余分なものを受け入れるように機能するようにされることが好ましい。

他方、前述の第２の局面に係るプローブアレイを製造する方法は、プローブ保持基板を作製する工程と、プローブ保持基板の各プローブ保持部にプローブ分子を保持させる工程とを備え、プローブ保持基板を作製する工程は、ドライエッチングを用いて底面および立ち上がり壁面を形成する工程を含み、ドライエッチングにおいて、プラズマ中の陽イオンが、プローブ保持基板の基準面に対して垂直とはならない方向に入射するようにされることを特徴としている。

上述のプローブ保持基板を作製する工程は、プローブ保持基板となるべき板状の材料基板を用意する工程と、表側の面と裏側の面とが互いに平行でない補助基板を用意する工程と、材料基板を補助基板上に載置した状態で、ドライエッチングを実施する工程とを含むことが好ましい。

また、第２の局面に係るプローブアレイを製造する方法は、別の実施態様では、プローブ保持基板を作製する工程と、プローブ保持基板の各プローブ保持部にプローブ分子を保持させる工程とを備え、プローブ保持基板を作製する工程は、プローブ保持基板となるべき単結晶シリコン基板を用意する工程と、単結晶シリコン基板の主面の結晶方位が（１１０）方向から傾いている状態で、アルカリ性の液体を用いた異方性ウェットエッチングを実施することによって、底面および立ち上がり壁面を形成する工程を含むことを特徴としている。

この発明に係るプローブアレイによれば、蛍光観察法における受光面に対する角度が互いに異なる複数の面が１つのプローブ保持部に形成されることになるので、これら複数の面の感度を互いに異ならせることができる。したがって、標的分子の濃度が薄い場合には、感度の比較的高い面からの蛍光を検出に用い、他方、標的分子の濃度が高く、感度の高い面からの蛍光強度が飽和してしまう場合には、それよりも感度が低い面からの蛍光を検出に用いることにより、定量性を維持しながら、蛍光を検出することができる。このことから、広いダイナミックレンジを有するプローブアレイを実現することができる。

この発明に係るプローブアレイにおいて、底面および立ち上がり壁面のいずれかが、基準面に対して、角度θ１をなす第１の面と、角度θ１より大きい角度θ２をなす第２の面とを少なくとも有するとき、cos θ１／cos θ２の値が５以上かつ５０以下であると、現在市販されている蛍光読取り機のダイナミックレンジとほぼ一致させることができ、第１の面の感度と第２の面の感度との間に有意差を確実に設けることができるとともに、ダイナミックレンジの中で定量性を確実に維持することができる。また、より限定的に、cos θ１／cos θ２の値が２０以下であると、定量性の維持をより確実なものとすることができる。

この発明に係るプローブアレイにおいて、底面および立ち上がり壁面のいずれかが、基準面に対して、角度の小さい順に、角度θ１、θ２、…、θｎをそれぞれなす第１、第２、…、第ｎの面を少なくとも有し、ｋを２以上かつｎ以下の任意の自然数としたとき、第（ｋ−１）および第ｋの面の、基準面に対してそれぞれなす角度θ（ｋ−１）およびθｋについて、cos θ（ｋ−１）／cos θｋの値が５０以下であり、かつ、cos θ１／cos θｎの値が５以上であると、現在市販されている蛍光読取り機のダイナミックレンジとほぼ一致させることができ、第１の面と第２の面との各感度間に有意差を確実に設けることができるとともに、ダイナミックレンジの中で定量性を確実に維持することができる。

また、より限定的に、cos θ（ｋ−１）／cos θｋの値が２０以下であると、定量性の維持がより確実なものとすることができる。

また、より限定的に、最も傾斜の大きな面の傾斜角の余弦と最も傾斜の小さい面の傾斜角の余弦との比、すなわち、cos θ１／cos θｎの値が５０以上であると、各面の感度間に有意差をより確実に設けることができる。

さらに、角度θ１、θ２、…、θｎにおいて、cos θ（ｋ−１）／cos θｋの値がほぼ一定であると、ダイナミックレンジの中での定量性を一様に保つことができる。

第１の局面に係るプローブアレイを製造する方法において、プローブ保持部にプローブ分子を保持させる工程が、プローブ保持基板を台座面に貼り付ける工程の前に実施されると、複数のプローブ保持基板を集合状態で作製して、集合状態にある段階で、プローブ分子溶液を供給することができ、この段階では、複数のプローブ保持基板の相対位置関係が厳密に決まっているため、複数のプローブ保持基板に対するプローブ分子溶液の連続的な供給が容易であるという利点が奏される。

他方、プローブ保持部にプローブ分子を保持させる工程が、プローブ保持基板を台座面に貼り付ける工程の後に実施されると、プローブアレイを製造するための最終工程に近い段階で、プローブ分子を保持させるため、保持されたプローブ分子が、その後の工程でダメージを受ける危険が少なくなるという利点が奏される。

また、台座面に、余分な接着剤を受け入れるための窪みが形成されていると、接着剤の付与量についての厳密な管理を不要とすることができる。

次に、第２の局面に係るプローブアレイを製造する方法であって、ドライエッチングを用いる方法によれば、複数のプローブ保持部の各々に形成される底面の、蛍光受光面からの各距離を互いに同じにすることができるので、蛍光観察の際、複数のプローブ保持部に対して互いに同じ焦点距離での蛍光観察ができるため、検出操作が容易になる。

また、第２の局面に係るプローブアレイを製造する方法であって、異方性ウェットエッチングを用いる方法によれば、エッチングされにくい（１１１）結晶面を立ち上がり壁面とした高アスペクトの掘り込みを容易に形成することができる。

図１は、この発明の第１の実施形態によるプローブアレイ１を分解して示す斜視図である。プローブアレイ１は、プローブ保持基板２と台座部材３との組み合わせからなる。

プローブ保持基板２は、相対向しかつ互いに平行に延びる第１および第２の主面４および５を有している。プローブ保持基板２には、第１の主面４に沿って複数のプローブ保持部６が行および列をなすように配列されている。各プローブ保持部６には、概略的に図示するように、プローブ分子７が保持されている。

台座部材３は、蛍光観察法においてプローブアレイ１に備えるプローブ保持部６から発せられた蛍光を受光する受光面（図示せず。）に対して平行に延びるように配置される基準面８を有する。基準面８の中央部には凹部９が設けられ、この凹部９を規定する底面は、プローブ保持基板２を支持するためにプローブ保持基板２の第２の主面５に接する台座面１０とされる。

台座面１０は、基準面８に対して平行とはならないように傾いている。台座面１０における図１による右方向をＸ軸、同じく奥行方向をＹ軸、そしてＸ軸およびＹ軸の両方に対して垂直かつ上に向かう方向をＺ軸としたとき、台座面１０の法線ベクトルは（０，０，１）である。また、基準面８の法線ベクトルは、台座面１０の法線ベクトルに対して傾いており、たとえば、（０．０１９，０．１０５，０．９９４）となるように設定されている。

なお、通常は、基準面８を基準として座標軸をとるのが自然であるが、以下の説明を簡明にするために、台座面１０を基準とした座標軸をとることにする。

前述したプローブ保持基板２は、第２の主面５を台座面１０に向けた状態で、接着剤を用いて、台座面１０に貼り付けられる。このとき、プローブ保持基板２は、凹部９にはまり込んだ状態となって位置決めされる。

台座面１０には、上述した接着剤の余分なものを受け入れるための窪み１１が形成されている。この実施形態では、窪み１１は、台座面１０の端縁部にまで届くように形成されていて、窪み１１によって受入れ切れなかった余分な接着剤については、台座面１０の外側にまで逃がすことができるようにされている。このように、台座面１０に窪み１１が形成されていると、接着剤の付与量についての厳密な管理を不要とすることができる。

プローブ保持基板２の一部について、その第１の主面４側から見た構成が、図２に斜視図で示され、かつ、図３に平面図で示されている。

プローブ保持基板２の第１の主面４に沿って複数のプローブ保持部６が配列されていることについては前述したとおりであるが、図２および図３に示すように、プローブ保持基板２の第１の主面４側には、プローブ保持部６となるべき一辺がたとえば７０μｍの正方形の平面形状を有する複数の掘り込みパターン１２が、互いの間にたとえば１０μｍの間隔を隔てて配列されている。掘り込みパターン１２の底面１３は、プローブ保持基板２の第１および第２の主面４および５に対して平行になっている。

また、掘り込みパターン１２の内部には、一辺がたとえば１０μｍの正方形の断面形状を有する突起パターン１４が底面１３から突出するように形成されている。掘り込みパターン１２を規定する正方形の辺と突起パターン１４を規定する正方形の辺とは、平行に向いておらず、たとえば４５度回転した関係となっている。これは、後の説明から明らかになるように、プローブ分子保持面の角度のより多様化を図るためのものである。

１つの掘り込みパターン１２が拡大されて図４に示されている。掘り込みパターン１２は、その底面１３からたとえば垂直に立ち上がる立ち上がり壁面として４つの内側面１５〜１８を有している。他方、突起パターン１４は、底面１３からたとえば垂直に立ち上がる立ち上がり壁面としての４つの突起外側面１９〜２２を有している。これら内側面１５〜１８および突起外側面１９〜２２は、プローブ保持基板２の第１および第２の主面４および５に対して垂直方向に延びている。

図２ないし図３では図示しないが、少なくとも底面１３ならびに内側面１５〜１８および突起外側面１９〜２２には、プローブ分子が保持されている。そして、プローブ保持部６となる掘り込みパターン１２ごとに、それぞれ相異なるプローブ分子が保持されていて、プローブアレイ１が構成されている。ここで、プローブ分子がＤＮＡであれば、プローブアレイ１はＤＮＡチップとなり、プローブ分子が抗原であればプローブアレイ１は抗原アレイとなり、プローブ分子が抗体であれば、プローブアレイ１は抗体アレイとなる。

次に、プローブアレイ１の製造方法について説明する。まず、図５を参照して、プローブ保持基板２の製造方法について説明する。

図５（１）に示すように、プローブ保持基板２となるべき材料基板としてのシリコン基板を用意し、このシリコン基板に、レジストパターン３１をフォトリソグラフィーによって形成して、レジストパターン３１をマスクとして、ＩＣＰ−ＲＩＥ（Inductive Coupling Plasma Reactive Ion Etching）によって、深さ１５０μｍのエッチングを行なう。これにより、掘り込みパターン１２と突起パターン１４とが形成され、プローブ保持基板２が有する形状が付与される。

次いで、上述のプローブ保持基板２の形状が付与されたシリコン基板を、硫酸と過酸化水素水との混合溶液によって洗浄し、それによって、図５（２）に示すように、レジストパターン３１を除去する。続いて、プローブ保持基板２となるシリコン基板を、アンモニア水と過酸化水素との混合溶液によって洗浄することで、表面の汚染を除去すると同時に、シリコン基板の表面にシリコン酸化膜の層を形成する。引き続いて、シリコン基板を、アミノシランの水溶液に浸漬して、シリコン基板最表面のＯＨ基（シラノール基）をアミノ基に置き換える。引き続いて、Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシイミド［Ｎ−（６−Maleimidocaproyloxy）succinimide］を含む試薬を作用させて、シリコン基板の最表面のアミノ基をマレイミド基に置き換える。

その後、図５（３）に示すように、プローブ保持部６としての掘り込みパターン１２に、プローブ分子溶液３２を供給する。このとき、掘り込みパターン１２ごとに、異なったプローブ分子が含まれるプローブ分子溶液３２を供給する。掘り込みパターン１２にプローブ分子溶液３２を供給する方法としては、インクジェットによる供給、マイクロピペットによる供給、複数のプローブ分子溶液３２の配列した供給用容器に接触させることによる供給などが考えられる。

また、ここで、プローブ分子溶液３２中のプローブ分子にはチオール基を導入しておく。プローブ分子としてＤＮＡ分子を使用する場合は、ＤＮＡ分子のたとえば５’末端にチオール基を導入しておく。プローブ分子としてポリペプチドやタンパク質を使用する場合には、たとえば、そのアミノ酸配列の中に、まだジスルフィド結合を形成していないシステイン残基を導入しておく。掘り込みパターン１２に、チオール基の導入されたプローブ分子を含んだプローブ分子溶液３２を供給した状態で、一定時間放置すれば、プローブ保持基板２となるシリコン基板の最表面のマレイミド基とプローブ分子のチオール基とが結合する。その結果、プローブ保持部６となる掘り込みパターン１２における底面１３ならびに内側面１５〜１８ならびに突起外側面１９〜２２にプローブ分子が結合し、保持されることになる。この後、掘り込みパターン１２に残った余分な液体を除去すれば、プローブ分子を保持したプローブ保持基板２が完成される。

なお、プローブ保持基板２とプローブ分子とを結合させる手段として、上述したマレイミド基とチオール基との結合に代えて、アビジンとビオチンとの結合などを用いてもよい。

一方、台座部材３は、樹脂板をエンボス加工するか、研削加工することによって得られる。そして、台座部材３の台座面１０に、適量の接着剤を塗布した上で、先に示した方法によって作製したプローブ保持基板２を貼り付けることで、プローブアレイ１が完成される。

上述した製造方法では、プローブ保持基板２にプローブ分子を保持させた後に、プローブ保持基板２と台座部材３との貼り合せを行なったが、プローブ保持基板２と台座部材３との貼り合せを行なった後に、プローブ分子溶液３２を供給して、プローブ保持基板２にプローブ分子を保持させるようにしてもよい。

プローブ保持基板２を集合状態で作製して、最後に切り分けることによって、個々のプローブ保持基板２とする場合では、プローブ保持基板２が集合状態にある段階で、プローブ分子溶液３２を供給した方が、複数のプローブ保持基板２の相対位置関係が厳密に決まっているため、複数のプローブ保持基板２に対するプローブ分子溶液３２の連続的な供給が容易であるという利点がある。

一方、プローブ保持基板２と台座部材３とを貼り合せた後で、プローブ分子溶液３２を供給する方法では、プローブアレイ１を製造するための最終工程に近い段階で、プローブ分子を保持させるため、保持したプローブ分子が、その後の工程でダメージを受ける危険が少なくなるという利点がある。

プローブアレイ１の各プローブ保持部６には、プローブ分子を保持した複数の面が存在する。すなわち、複数の面とは、底面１３ならびに内側面１５〜１８および突起外側面１９〜２２のことである。これらは、プローブアレイ１の主面となる台座部材３の基準面８に対して平行とはならず、種々に異なる傾斜角を持っている。

図３に示すように、プローブ保持基板２の第１の主面４内の図による右方向をＸ軸、第１の主面４内の図による上方向をＹ軸、そしてＸ軸とＹ軸との両方に対して垂直かつ紙面上方に向かう方向をＺ軸とする。プローブアレイ１においては、台座部材３の台座面１０と、プローブ保持基板２の第１の主面４とは互いに平行になっているから、ここで定義したＸ軸、Ｙ軸およびＺ軸は、それぞれ、前述したように、台座面１０を基準として図１を参照して定義したＸ軸、Ｙ軸およびＺ軸と、その方向がそれぞれ完全に一致する。

この座標系を用いて、内側面１７および１８の法線ベクトルを示すと、それぞれ、（０，１，０）および（１，０，０）となる。また、この座標系を用いて、突起外側面１９および２０の法線ベクトルを計算すると、それぞれ、（−１／√２，１／√２，０）および（１／√２，１／√２，０）となる。また、底面１３の法線ベクトルは、（０，０，１）となる。

なお、ここで、各プローブ保持部６に存在する複数の面としての底面１３ならびに内側面１５〜１８および突起外側面１９〜２２のうち、底面１３、内側面１７および１８ならびに突起外側面１９および２０のみを採り上げたのは、これら底面１３、内側面１７および１８ならびに突起外側面１９および２０が蛍光受光面に向く姿勢にあるとき、残りの内側面１５および１６ならびに突起外側面２１および２２は、蛍光受光面に向く姿勢にはならず、陰になって隠れてしまうからである。

台座部材３の主面すなわちプローブアレイ１の基準面８と底面１３とがなす角度の余弦（cosine）を求める。求める余弦は、前述のように設定された基準面８の法線ベクトル（０．０１９，０．１０５，０．９９４）と底面１３の法線ベクトル（０，０，１）との内積を、基準面８の法線ベクトル（０．０１９，０．１０５，０．９９４）の大きさと底面１３の法線ベクトル（０，０，１）の大きさとの積で割ったものになるから、その値は０．９９４となる。

同様の計算によって、内側面１７、内側面１８、突起外側面１９および突起外側面２０が、それぞれ、基準面８となす角度の余弦を求めることができる。角度の余弦が大きい順に、その計算結果を示せば、次のようになる。

基準面８と底面１３とのなす角度の余弦は、０．９９４である。基準面８と内側面１７とのなす角度の余弦は０．１０５である。基準面８と突起外側面２０とのなす角度の余弦は０．０８７７である。基準面８と突起外側面１９とのなす角度の余弦は０．０６０８である。基準面８と内側面１８とのなす角度の余弦は０．０１９０である。

上述のように、プローブアレイ１の各プローブ保持部６には、プローブ分子を保持した複数の面が存在し、これら複数の面は、基準面８に対して平行とはならず、互いに異なる傾斜角を持っている。このような異なる傾斜角を持つプローブ分子保持面は、異なる蛍光強度を示すことになる。このことについて、一般化した図６を参照して以下に説明する。

図６には、互いに同じ分布密度をもってプローブ分子４０を保持した第１ないし第３のプローブ分子保持面４１〜４３が図示されている。第１ないし第３のプローブ分子保持面４１〜４３は、互いに同じ面積を有している。また、プローブ分子保持面４１〜４３に対向するように配置される蛍光受光面４４が図示されている。蛍光受光面４４と平行に延びる基準面４５に対して、第１のプローブ分子保持面４１は角度θ１をなし、第２のプローブ分子保持面４２は角度θ２をなし、第３のプローブ分子保持面４３は角度θ３をなしている。ここで、角度θ１〜θ３は、９０度以下の角度側で測定するものとする。すなわち、鈍角ではなく鋭角となる側の角度を測定するものとする。

プローブ分子保持面４１〜４３に励起光が照射された状況下では、プローブ分子４０に結合した蛍光修飾済の標的分子が蛍光を発する点光源と見なせるから、プローブ分子保持面４１〜４３は、点光源が一定密度で配列された蛍光パネルであると見なすことができる。

したがって、第１のプローブ分子保持面４１の蛍光を蛍光受光面４４で観察したとすると、受光部４６が有する面積部分で蛍光を受光することになる。同様に、第２のプローブ分子保持面４２の蛍光を蛍光受光面４４で観察したとすると、受光部４７が有する面積部分で蛍光を受光することになり、第３のプローブ分子保持面４３の蛍光を蛍光受光面４４で観察したとすると、受光部４８が有する面積部分で蛍光を受光することになる。

ここで、受光部４６は受光部４７より面積が大きく、受光部４７は受光部４８より面積が大きい。よって、第１のプローブ分子保持面４１の蛍光を受光部４６で受光した場合に比べて、第２のプローブ分子保持面４２の蛍光を受光部４７で受光した場合の方が、より小さな受光面積で受光することになるため、面積あたりの蛍光強度は強くなる。また、第２のプローブ分子保持面４２の蛍光を受光部４７で受光した場合に比べて、第３のプローブ分子保持面４３の蛍光を受光部４８で受光した場合の方が、より小さな受光面積で受光することになるため、面積あたりの蛍光強度は強くなる。

このように、面積あたりの蛍光強度は受光面積に反比例すると言えるから、受光部４６〜４８の各々間での面積の比から、蛍光強度が何倍になるかを見積もることができる。受光部４７は、受光部４６と比較すると、面積が（cos θ２／cos θ１）倍であるから、（cos θ１／cos θ２）倍の蛍光強度を示すようになると見積もることができる。同様に、受光部４８は、受光部４７と比較すると、面積が（cos θ３／cos θ２）倍であるから、（cos θ２／cos θ３）倍の蛍光強度を示すようになると見積もることができる。

再びプローブアレイ１に着目する。なお、ここでは、底面１３ならびに内側面１５〜１８および突起外側面１９〜２２のうち、励起光の照射により発した蛍光が受光面にまで届く底面１３、内側面１７および１８ならびに突起外側面１９および２０についてのみ議論する。

プローブ保持部６において、底面１３、内側面１７、突起外側面２０、突起外側面１９および内側面１８は、この順序で基準面８に対する傾斜角がより小さいが、プローブアレイ１の基準面８に対して、互いに異なる傾斜角をもっているため、それぞれ異なる蛍光強度を有する。先に計算したとおり、それぞれの基準面８に対する傾斜角の余弦は、０．９９４、０．１０５、０．０８７７、０．０６０８および０．０１９０である。蛍光強度はこの余弦の逆数に比例するから、蛍光強度の比は、１．０１、９．５２、１１．４、１６．４および５２．６となる。

蛍光強度の比は、感度の比ととらえることができるから、プローブアレイ１の各プローブ保持部６の中には、感度の互いに異なるプローブ分子保持面が形成されていることになる。これにより、プローブアレイ１は、広いダイナミックレンジを実現することができる。すなわち、標的分子の濃度が薄い場合には、たとえば、感度の比較的高い内側面１８が感度を有し、他方、標的分子の濃度が高く、感度の高い内側面１８の蛍光強度が飽和してしまう場合には、それよりも感度が低い、たとえば底面１３が定量性を維持した蛍光を発することができる。

当然、図示したプローブアレイ１は、この発明に係るプローブアレイの一例にすぎず、幾何形状を工夫することによって、プローブ保持部における複数のプローブ分子保持面の傾斜角度は任意に設計することができる。プローブ保持基板の掘り込みの形状を正方形ではなく、多角形にしたりすれば、プローブ分子保持面の傾斜のバリエーションをさらに増やすことができる。

プローブアレイの基準面に対して、最も傾斜の大きなプローブ分子保持面の傾斜角と最も傾斜の小さなプローブ分子保持面の傾斜角との差が小さすぎると、ダイナミックレンジの拡大が小幅なものに留まってしまうため、両者の傾斜角の余弦の比を５以上にしないと、実質的な効果は得られない。より望ましくは、最も傾斜の大きなプローブ分子保持面の傾斜角の余弦と最も傾斜の小さなプローブ分子保持面の傾斜角の余弦との比は５０以上である。

また、蛍光強度の弱い順に、プローブ分子保持面のプローブアレイ基準面に対する傾斜角の余弦を並べていったとき、隣接する数字の比が大きくなりすぎると、すなわち、両者の蛍光強度の比が大きすぎ、かつ蛍光強度が両者の間に位置するプローブ分子保持面が存在しないと、蛍光強度の強いプローブ分子保持面の蛍光強度が飽和しているのにも関わらず、蛍光強度の弱いプローブ分子保持面の蛍光は検出できないという、標的分子の濃度が存在することになってしまう。

このような、定量性を失うような標的分子の濃度をダイナミックレンジの中に作らないためには、蛍光強度の弱い順に、プローブ分子保持面のプローブアレイ基準面に対する傾斜角の余弦を並べていったとき、隣接する数字の比が常に一定値以下である必要がある。この数値は蛍光測定を行なう装置にも依存するが、現時点において、一般的な市販の蛍光観察装置を用いると仮定するのであれば、たとえばその値は５０以下であり、より望ましくは２０以下である。

また、蛍光強度の弱い順に、プローブ分子保持面のプローブアレイ主面に対する傾斜角の余弦を並べていったとき、隣接する数字の比がほぼ一定であるように設計を行なえば、ダイナミックレンジの中での定量性を一様に保つことができるので、より好ましい。

図７は、この発明の第２の実施形態によるプローブアレイに備えるプローブ保持基板２ａを示す、図２に対応する図である。図７において、図２に示す要素に相当する要素には同様の参照符号を付し、重複する説明は省略する。

プローブ保持基板２ａの第１の主面４に沿って配列された複数のプローブ保持部６の各々には、プローブ分子溶液に対して濡れ性の高い突起パターン１４が形成されるが、掘り込みパターンが形成されていない。したがって、プローブ保持部６は、突起パターン１４およびその周囲に延びる高濡れ性領域５１によって与えられる。また、プローブ保持基板２ａの第１の主面４上には、低濡れ性領域５２が各プローブ保持部６の周囲を取り囲むように形成されている。

さらに、プローブ保持基板２ａの第１の主面４上には、複数のプローブ保持部６間でのプローブ分子溶液の混じり合い（クロスコンタミネーション）の有無を検査するため、プローブ分子溶液に対して高い濡れ性を示す検査用領域５３が設けられている。検査用領域５３は、複数のプローブ保持部６の隣り合うものの間において、各プローブ保持部６に対して低濡れ性領域５２を隔てて位置するように、たとえば格子状に形成されている。このように検査用領域５３が形成されていると、プローブ保持部６にプローブ分子溶液を導入した後、検査用領域５３が濡れていないか、あるいは濡れた後に乾いた形跡がないかなどを検査することにより、隣り合うプローブ分子溶液の液滴同士の混じり合いによる不良の発生を確実に検出することができる。

前述した突起パターン１４は、２本の正四角柱を、各々の１つの稜線が接するように配置しながら、対角線方向に並べた形状を有している。このような形状を有する突起パターン１４には、８つの突起外側面が形成されることになる。

図７に示したプローブ保持基板２ａを、図２に示したプローブ保持基板２と比較したとき、高濡れ性領域５１が底面１３に対応し、突起パターン１４の８つの突起外側面が立ち上がり壁面となる突起外側面１９〜２２に対応する。

図８は、この発明の第３の実施形態によるプローブアレイ６０の一部を示す平面図である。図９は、図８の線Ａ１−Ａ２に沿う切断部端面図であり、図１０は、図８の線Ｂ１−Ｂ２に沿う切断部端面図である。

プローブアレイ６０は、プローブ保持基板６１を備えている。プローブ保持基板６１は、それ自身の主面によって与えられる基準面６２を有し、かつこの基準面６２に沿って複数のプローブ保持部６３が行および列をなすように配列されている。各プローブ保持部６３には、図示しないが、プローブ分子が保持されている。基準面６２は、蛍光観察法においてプローブ保持部６３から発せられた蛍光を受光する受光面に対して平行に延びるように配置される。

プローブ保持基板６１の基準面６２に沿って配列されるプローブ保持部６３には、正方形の平面形状を有する掘り込みパターン６４が形成され、掘り込みパターン６４の底面６５は、プローブ保持基板６１の基準面６２に対して平行になっている。

また、掘り込みパターン６４の内部には、正方形の断面形状を有する突起パターン６６が底面６５から突出するように形成されている。この実施形態においても、掘り込みパターン６４を規定する正方形の辺と突起パターン６６を規定する正方形の辺とは、平行に向いておらず、たとえば４５度回転した関係となっている。

掘り込みパターン６４は、その底面６５から立ち上がる立ち上がり壁面として４つの内側面６７〜７０を有している。他方、突起パターン６６は、底面６５から立ち上がる立ち上がり壁面としての４つの突起外側面７１〜７４を有している。これら内側面６７〜７０および突起外側面７１〜７４は、プローブ保持基板６１の基準面６２に対して垂直とはならない方向に延びている。

プローブ分子は、少なくとも上記底面６５ならびに内側面６７〜７０および突起外側面７１〜７４に保持されている。そして、プローブ保持部６３となる掘り込みパターン６４ごとに、それぞれ相異なるプローブ分子が保持されていて、プローブアレイ６０が構成されている。

このようなプローブアレイ６０については、これを単なる板状の台座部材上に貼り付けた状態で蛍光観察法に適用しても、そのままの状態で蛍光観察法に適用してもよい。

プローブアレイ６０の各プローブ保持部６３には、上述したように、プローブ分子を保持した複数の面、すなわち、底面６５ならびに内側面６７〜７０および突起外側面７１〜７４が存在し、これらは、プローブアレイ６０の基準面６２に対して互いに異なる傾斜角を持ち、したがって、互いに異なる蛍光強度を持っている。詳細な設計については、第１の実施形態の場合と実質的に同様であるから、その説明を省略する。

次に、プローブアレイ６０に備えるプローブ保持基板６１の製造方法について、図１１を参照して説明する。

まず、図１１（１）に示すように、プローブ保持基板６１の材料基板となるシリコン基板７５を用意し、プローブアレイ６０における基準面６２となるシリコン基板７５の一方主面７６上に、レジストパターン７７をフォトリソグラフィーによって形成する。

次に、図１１（２）に示すように、表側の面７８と裏側の面７９とが互いに平行でない、すなわち、くさび型の断面を有する補助基板８０を用意し、この補助基板８０上にシリコン基板７５を載置しかつ貼り付ける。

次いで、補助基板８０上に載置されたシリコン基板７５を、ＩＣＰ−ＲＩＥのチャンバーにセットして、図１１（３）に示すように、ドライエッチング中に陽イオン８１が基準面６２となるべきシリコン基板７５の一方主面７６に対して、斜めに入射する状態で、エッチングを行なう。これにより、主面７６すなわち基準面６２に対して、垂直ではない、斜めの壁面すなわち内側面６７〜７０および突起外側面７１〜７４を持つ掘り込みパターン６４が形成される。

次いで、図１１（４）に示すように、補助基板８０を剥離して、さらに、レジストパターン７７を除去すれば、プローブ保持基板６１が完成される。

その後、プローブ分子を保持させる工程などは、第１の実施形態の場合と実質的に同様であるので、その説明は省略する。

第３の実施形態によるプローブアレイ６０は、第１の実施形態によるプローブアレイ１と比較して、製造方法が煩雑であるという不利はある反面、プローブアレイ６０の基準面６２に対して、複数の掘り込みパターン６４の各々の底面６５が同じ深さ位置にあるため、プローブアレイ６０の基準面６２と平行に配置される蛍光受光面に対して、複数の掘り込みパターン６４の各々の底面６５が一定の距離を置いて位置している。そのため、蛍光観察の際、複数のプローブ保持部６３に対して同じ焦点距離での蛍光観察ができるため、検出操作が容易になる。

第３の実施形態によるプローブアレイ６０の上述した製造方法においては、シリコン基板７５に掘り込みパターン６４を形成するときに、ＩＣＰ―ＲＩＥというドライエッチングを用いる方法を適用した。しかしながら、このようなドライエッチングに限らず、水酸化カリウム水溶液やＴＭＡＨ水溶液などのアルカリ水溶液による、ウェットエッチングを適用することもできる。

上述したように、ウェットエッチングを適用する場合、プローブ保持基板６１のための材料基板としては、主面の結晶方位が（１１０）方向から少しずれた方位を持つシリコン単結晶を用いることが好ましい。

シリコン単結晶基板を、アルカリ水溶液によってウェットエッチングすると、エッチングされにくい（１１１）結晶面を立ち上がり壁面とした高アスペクトの掘り込みを形成することができる。なお、シリコン単結晶基板の主面の結晶方位を（１１０）方向としておくと、この主面に対して垂直な（１１１）結晶面が２方向存在することになるので、ウェットエッチングするときのマスクパターンの開口辺を、その（１１１）結晶面の方向に揃えておくことで、（１１１）結晶面に囲まれた、高アスペクトの掘り込みを形成することができる。

したがって、プローブ保持基板６１の材料基板として、主面の結晶方位が（１１０）方向から少しずれた方位を持つシリコン単結晶を用いた上で、（１１１）結晶面の方向に沿ったマスクパターンを形成した上で、アルカリ水溶液によるウェットエッチングを行なえば、主面に対して垂直でない（１１１）結晶面を立ち上がり壁面とした、掘り込みを形成することができる。

この発明の第１の実施形態によるプローブアレイ１を分解して示す斜視図である。 図１に示したプローブアレイ１に備えるプローブ保持基板２の一部を第１の主面４側から見て示す斜視図である。 図１に示したプローブアレイ１に備えるプローブ保持基板２の一部を第１の主面４側から見て示す平面図である。 図３に示した掘り込みパターン１２の１つを拡大して示す平面図である。 プローブ保持基板２を製造するために実施される工程を説明するための断面図である。 異なる傾斜角θ１〜θ３を持つプローブ分子保持面４１〜４３が異なる蛍光強度を示すことを一般化して説明するための図である。 この発明の第２の実施形態によるプローブアレイに備えるプローブ保持基板２ａを示す、図２に対応する図である。 この発明の第３の実施形態によるプローブアレイ６０の一部を示す平面図である。 図８の線Ａ１−Ａ２に沿う切断部端面図である。 図８の線Ｂ１−Ｂ２に沿う切断部端面図である。 図８に示したプローブアレイ６０に備えるプローブ保持基板６１を製造するために実施される工程を説明するための断面図である。

符号の説明

１，６０ プローブアレイ
２，２ａ，６１ プローブ保持基板
３ 台座部材
４ 第１の主面
５ 第２の主面
６，６３ プローブ保持部
７，４０ プローブ分子
８，４５，６２ 基準面
１０ 台座面
１１ 窪み
１２，６４ 掘り込みパターン
１３，６５ 底面
１４，６６ 突起パターン
１５〜１８，６７〜７０ 内側面（立ち上がり壁面）
１９〜２２，７１〜７４ 突起外側面（立ち上がり壁面）
３１，７７ レジストパターン
３２ プローブ分子溶液
４１〜４３ プローブ分子保持面
４４ 蛍光受光面
７５ シリコン基板
７８ 表側の面
７９ 裏側の面
８０ 補助基板
８１ 陽イオン

Claims (15)

1. 蛍光観察法によってプローブ分子を検出する際に用いられる、プローブアレイであって、
   相対向しかつ互いに平行に延びる第１および第２の主面を有し、かつ前記第１の主面に沿って複数のプローブ保持部が配列され、各前記プローブ保持部にプローブ分子を保持している、プローブ保持基板と、
   蛍光観察法において前記プローブ保持部から発せられた蛍光を受光する受光面に対して平行に配置される基準面を有するとともに、前記プローブ保持基板を支持するために前記プローブ保持基板の前記第２の主面に接する台座面を有する、台座部材と
   の組み合わせからなり、
   前記プローブ保持基板において、各前記プローブ保持部は、前記主面に対して平行な底面と、前記底面から立ち上がる立ち上がり壁面とを有し、
   前記台座部材において、前記台座面は、前記基準面に対して平行とはならない方向に延びている、
   プローブアレイ。
2. 蛍光観察法によってプローブ分子を検出する際に用いられる、プローブアレイであって、
   基準面を有し、かつ前記基準面に沿って複数のプローブ保持部が配列され、各前記プローブ保持部にプローブ分子が保持されている、プローブ保持基板を備え、
   前記プローブ保持基板は、前記基準面が、蛍光観察法において前記プローブ保持部から発せられた蛍光を受光する受光面に対して平行に延びるように配置され、
   各前記プローブ保持部は、底面と、前記底面から立ち上がる立ち上がり壁面とを有し、前記立ち上がり壁面は、前記基準面に対して垂直とはならない方向に延びている、
   プローブアレイ。
3. ９０度以下の角度側で測定したとき、前記底面および前記立ち上がり壁面のいずれかは、前記基準面に対して、角度θ１をなす第１の面と、前記角度θ１より大きい角度θ２をなす第２の面とを少なくとも有し、cos θ１／cos θ２の値が５以上かつ５０以下である、請求項１または２に記載のプローブアレイ。
4. 前記cos θ１／cos θ２の値が５以上かつ２０以下である、請求項３に記載のプローブアレイ。
5. ９０度以下の角度側で測定したとき、前記底面および前記立ち上がり壁面のいずれかは、前記基準面に対して、角度の小さい順に、角度θ１、θ２、…、θｎをそれぞれなす第１、第２、…、第ｎの面を少なくとも有し、
   ｋを２以上かつｎ以下の任意の自然数としたとき、第（ｋ−１）および第ｋの面の、前記基準面に対してそれぞれなす角度θ（ｋ−１）およびθｋについて、cos θ（ｋ−１）／cos θｋの値が５０以下であり、かつ、
   cos θ１／cos θｎの値が５以上である、
   請求項１または２に記載のプローブアレイ。
6. 前記cos θ（ｋ−１）／cos θｋの値が２０以下である、請求項５に記載のプローブアレイ。
7. 前記cos θ１／cos θｎの値が５０以上である、請求項５または６に記載のプローブアレイ。
8. 角度θ１、θ２、…、θｎにおいて、前記cos θ（ｋ−１）／cos θｋの値がほぼ一定である、請求項５ないし７のいずれかに記載のプローブアレイ。
9. 請求項１に記載のプローブアレイを製造する方法であって、
   前記プローブ保持基板および前記台座部材をそれぞれ用意する工程と、
   前記プローブ保持基板の各前記プローブ保持部にプローブ分子を保持させる工程と、
   前記プローブ保持基板の前記第２の主面を前記台座部材の前記台座面に向けた状態で、前記プローブ保持基板を前記台座面に貼り付ける工程と
   を備える、プローブアレイの製造方法。
10. 前記プローブ保持部にプローブ分子を保持させる工程は、前記プローブ保持基板を台座面に貼り付ける工程の前に実施される、請求項９に記載のプローブアレイの製造方法。
11. 前記プローブ保持部にプローブ分子を保持させる工程は、前記プローブ保持基板を台座面に貼り付ける工程の後に実施される、請求項９に記載のプローブアレイの製造方法。
12. 前記台座部材を用意する工程において、前記台座面には窪みが形成され、前記プローブ保持基板を台座面に貼り付ける工程は、接着剤を用いて前記プローブ保持基板を前記台座面に貼り付ける工程を含み、前記プローブ保持基板を台座面に貼り付ける工程において、前記窪みは前記接着剤の余分なものを受け入れるように機能する、請求項９ないし１１のいずれかに記載のプローブアレイの製造方法。
13. 請求項２に記載のプローブアレイを製造する方法であって、
    前記プローブ保持基板を作製する工程と、
    前記プローブ保持基板の各前記プローブ保持部にプローブ分子を保持させる工程と
    を備え、
    前記プローブ保持基板を作製する工程は、ドライエッチングを用いて前記底面および前記立ち上がり壁面を形成する工程を含み、
    前記ドライエッチングにおいて、プラズマ中の陽イオンが、前記プローブ保持基板の前記基準面に対して垂直とはならない方向に入射するようにされる、
    プローブアレイの製造方法。
14. 前記プローブ保持基板を作製する工程は、前記プローブ保持基板となるべき板状の材料基板を用意する工程と、表側の面と裏側の面とが互いに平行でない補助基板を用意する工程と、前記材料基板を前記補助基板上に載置した状態で、前記ドライエッチングを実施する工程とを含む、請求項１３に記載のプローブアレイの製造方法。
15. 請求項２に記載のプローブアレイを製造する方法であって、
    前記プローブ保持基板を作製する工程と、
    前記プローブ保持基板の各前記プローブ保持部にプローブ分子を保持させる工程と
    を備え、
    前記プローブ保持基板を作製する工程は、前記プローブ保持基板となるべき単結晶シリコン基板を用意する工程と、前記単結晶シリコン基板の主面の結晶方位が（１１０）方向から傾いている状態で、アルカリ性の液体を用いた異方性ウェットエッチングを実施することによって、前記底面および前記立ち上がり壁面を形成する工程を含む、
    プローブアレイの製造方法。

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