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JP2008517627A - Ｔｏｒｃポリヌクレオチドおよびポリペプチドならびに使用法 - Google Patents

Ｔｏｒｃポリヌクレオチドおよびポリペプチドならびに使用法 Download PDF

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Abstract

本発明は、広く制御CREB(TORC)関連ポリヌクレオチドのトランスデューサー、ポリペプチドまたはTORC特異的抗体を利用する方法に関する。さらに本発明は、TORC野生型配列の変異型を含むTORC関連ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはTORC特異的抗体組成物に関する。方法の例は、細胞のTORC関連過程を刺激する方法および細胞のTORC関連過程を阻害する方法ならびに細胞のTORC関連過程を阻害する方法を含む。本発明は、さらに対象における細胞のTORC活性化過程の異常なレベルに関連する疾患または病理的状態の発症を実質的に阻害する、処置する、または改善する方法であり、対象に細胞でのTORCポリペプチドの蓄積を調節するかまたは細胞でのTORCポリペプチドの発現を阻害する物質のいずれかの１個またはそれ以上の治療上有効量を投与することを含む方法を開示する。さらなる態様において、細胞のTORC関連過程の活性を調節する薬剤を同定する方法を開示する。さらに別の態様において、本発明は、試料中のTORCポリペプチドの存在を検出するまたは定量する方法に関する。さらなる態様において、試料中のTORCポリペプチドの量が対照におけるTORCポリペプチドの量と異なるか否かを決定する方法を開示する。さらなる態様は、第一の対象の疾患または病理の診断または予後診断にまたは治療戦略の開発に貢献する方法を開示する(ここで該病理のTORCポリペプチドの細胞内局在は非病理的状態のTORCポリペプチドの細胞内局在とは異なっていることが既知である)。

Description

本発明は、概してあるポリヌクレオチドおよびポリペプチド、それらを包含する細胞、ならびにそれらを使用する方法に関する。特に、TORCポリヌクレオチドおよびTORCポリペプチド、それらの変異体、TORC特異的抗体、ならびにTORC包含細胞を開示する。TORCを使用した薬学的研究法、分析法、診断法および治療法も開示する。
転写因子の環状AMP応答エレメント(CRE)結合たんぱく質(CREB)ファミリーは、CREB１および密接に関連したCREMおよびATF-1たんぱく質を含む小集団を表す。CREB１たんぱく質は、多くの生物学的過程に影響する多くの遺伝子のプロモーターに存在する環状AMP応答エレメント(CRE)に結合することによって遺伝子発現を制御する。CREBは細胞成長制御および分化、代謝、発生、神経活動ならびに免疫制御に関与する一連の標的遺伝子を制御する(Mayr and Montminy, 2001; Shaywitz and Greenberg, 1999にレビュー)。特にCREBは、適応行動のために重要な様々な情報伝達経路の終点であると考えられている(レビューのためにWest et al., 2001 and Lonze et al., 2002を参照)。
長期記憶の基礎であると考えられている、長期にわたる遺伝子発現の変化は部分的にまたは概してCREBによって仲介され得る(レビューのためにBourtchuladze et al., 1994, Yin et al., 1994, Tully et al., 2003参照)。CREBによって仲介される遺伝子発現の活性化は、神経変性および精神疾患を含む様々な臨床設定で記憶を高める実行可能な方法であることが示されている(Tully et al., 2003; Jackson et al., 2003)。環状AMP応答の活性化またはCREB活性の混乱は常習行為(レビューのためにChao and Nestler 2004参照)およびエタノールに対する感受性(Moore et al., 1998)に影響することが示されている。マウスでCREB活性の混乱は概日時計を混乱させ(Gau et al., 2002)、不安神経症を増加させ(Valverde et al.,2004)、モルヒネの使用中止後の行動に影響を与え、このことは、CREB活性の修飾が睡眠障害、不安神経症または耽溺の処置に利用できることも示している。
CREBはcfos、サイクリンA、サイクリンD1、PCNA、Bcl2を含む様々な成長促進および抗アポトーシス遺伝子、ならびにBDNFのような神経栄養因子を制御する。様々な研究によりCREB活性が神経生存に必要であることも示されている。マウスでのCREBおよびCREMの遮断は神経細胞死および進行性神経疾患を起こす(Mantamadiotis 2002; レビューのためにLonze et al 2002参照)。故にCREBの活性は神経保護的であり、神経変性疾患または卒中において臨床上の利点があり得る。中枢神経系での役割に加えて、多くの代謝制御遺伝子はプロモーターにCREサイトを含み、糖新生における律速酵素であるPEPCKの遺伝子は環状AMPによって制御されることが示されている。マウスでのCREB１の機能遮断は低血糖を起こす。CREB１欠損マウスが欠陥のあるＴ細胞発達を示し、CREB１のアイソフォームでありCREB１による転写活性化を妨害するICERがIL-2発現を妨害するので、CREB１は免疫応答でも役割を果たし得る(Bodor et al., 2000)。CREBの活性化は神経変性および精神疾患を含む様々な臨床設定で記憶を高める実行可能な方法であり神経保護的であることが示されており(Tully et al., 2003)、そしてCREBシグナル伝達はまた、アテローム斑の形成に関与し得るTNFα誘導血管平滑筋細胞移動に関与している(Ono et al., 2004)。
出願人は以前、TORC１がホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)、アンフィレグリン(amphiregulin)ならびにIL-8およびExodus-1/MIPalphaのようなケモカインを含むたんぱく質の有力な誘導因子であり、TORC活性を通じて作用すると考えらることを開示した(PCT特許公報WO 2004/085646およびIourgenko, et al. 2003)。TORC１および他のTORCたんぱく質は、CREBとTFIIDの TAFII130構成要素との相互作用を高めることに関与している(Conkright, et al. 2003)。本発明のTORCたんぱく質は、それ自体、プロモーター領域にCREサイトを含む遺伝子の異常な活性に関連する病理的状態の処置のためのおよびPEPCK、アンフィレグリン(amphiregulin)およびケモカイン、特にIL-8およびExodus-1/MIPalphaの異常な活性と関係がある状態の処置のための新規薬剤標的として役立つと考えられる。これらの状態は、これに限定されるものではないが、骨関節症、乾癬、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、リウマチ性関節炎、癌、病的血管形成、糖尿病、高血圧、慢性疼痛、炎症性疾患および自己免疫性疾患ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病のような神経変性疾患を含む。
故にTORC活性を調節する必要がある。さらにTORC活性の候補調節剤を同定する必要がある。その上さらに疾患細胞または組織における異常なTORC活性と関連がある疾患または病理的状態を処置する必要がある。本発明の開示はこれらおよび関連する必要性に取り組む。
発明の要約
本発明は広く、制御CREBのトランスデューサー(TORC)ファミリー物質に関連するポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体組成物ならびに研究、診断適用および治療適用でこれらの組成物を使用する方法に関する。
第１の局面では、TORCポリペプチドの生物学的活性が試料細胞で異常であるか否かを決定する方法であって、
(a)試料細胞内の多くの細胞内画分におけるTORCポリペプチドの第１の分布を決定し；そして
(b)(a)の結果をTORCの正常な分布を有するように設計された１個またはそれ以上の対照細胞内の多くの細胞内画分におけるTORCポリペプチドの第２の分布と比較すること
を含み、ここで、試料細胞のTORCポリペプチドの分布が対照細胞のTORCポリペプチドの分布と異なっているとき、試料細胞のTORCポリペプチドの生物学的活性は異常である、方法を開示する。この解析法の重要な態様では、第１の細胞内画分が細胞質であり、他の態様では第２の細胞内画分が核である。さらなる態様では細胞が内皮細胞であるか、または脳で天然に存在する細胞である。
さらなる局面では、本発明は、細胞を細胞内コンパートメントのTORCポリペプチドの蓄積を調節する物質と接触させることを含む、細胞におけるCREB促進過程の調節剤を同定する方法を含む。この方法の重要な態様では調節剤がイオノフォア、細胞内環状AMP濃縮の刺激剤、細胞内カルシウム濃縮の刺激剤またはプロテインキナーゼA活性の刺激剤であり得る。さらなる重要な態様では、細胞内画分が核であるか、またはイムノフィリン結合剤のような阻害剤であり得る。さらなる重要な態様では、細胞がほ乳類細胞または内皮細胞もしくは脳で天然に存在する細胞であり得る。さらにこの方法では、細胞がインビトロで培養されていてよく、または対象からのエキソビボもしくは対象内のインビボであってよい。
またさらなる局面では、本発明は、細胞をTORCポリペプチドの発現を調節する物質と接触させることを含む、細胞におけるCREB促進過程を調節する方法を開示する。この方法の重要な態様では、物質がアンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉オリゴヌクレオチド、マイクロオリゴヌクレオチド、三重らせん核酸、リボザイム、RNAアプタマー、２本鎖または１本鎖RNA、ペプチド模倣薬、ペプチド模倣薬をコードする配列を含むポリヌクレオチド、またはそれらの任意の２個もしくはそれ以上の混合物を含む。さらに重要な態様では、細胞がほ乳類細胞または内皮細胞もしくは脳で天然に存在する細胞であり得る。さらにこの方法の重要な態様では、細胞がインビトロで培養されまたは対象からのエキソビボもしくは対象のインビボであり得る。
本発明のさらなる態様では、対象における細胞のCREB促進過程の異常なレベルに関連する疾患または病理的状態の発症を実質的に阻害する、処置する、または改善する方法を提供する。この方法は、対象にある細胞内領域にTORCポリペプチドの蓄積を調節する物質の１個またはそれ以上の治療上有効量を投与することを含む。この治療法の有利な態様では、細胞内領域が細胞質または核であり得る。さらなる有利な態様では、病理的状態が神経変性疾患、自己免疫疾患、または炎症性疾患であり得るか、もしくはアルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病、骨関節症、乾癬、喘息、COPD、リウマチ性関節炎、癌、糖尿病、高血圧および慢性疼痛から選択され得る。さらなる有利な態様では、CRE調節剤がTORC１、TORC２、およびTORC３から選択される１個またはそれ以上のTORCたんぱく質の活性または蓄積を、例えば阻害したり高めたりすることによって変える。さらに有利な態様では、TORC調節剤がTORCに対する１個またはそれ以上の抗体またはその断片を含み、ここで抗体またはその断片はTORCたんぱく質の活性または蓄積を変える。さらなる有利な態様では、TORC調節剤がTORCたんぱく質に対する１個またはそれ以上のペプチド模倣薬を含み、ペプチド模倣薬はTORCたんぱく質の活性または蓄積を変える。
本発明のさらなる局面では、対象における細胞のTORC関連過程の異常なレベルに関連する疾患または病理的状態の発症を実質的に阻害する、処置する、または改善する方法を提供する。この方法は、対象に細胞内領域のTORCポリペプチドの蓄積を調節する物質の１個またはそれ以上の治療上有効量を投与することを含む方法が提供される。この治療法の有利な態様では、細胞内領域が細胞質または核であり得る。さらなる有利な態様では、病理的状態が神経変性疾患、自己免疫疾患、または炎症性疾患であり得るか、もしくはアルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病、骨関節症、乾癬、喘息、COPD、リウマチ性関節炎、癌、糖尿病、高血圧および慢性疼痛から選択され得る。さらなる有利な態様では、CRE調節剤がTORC１、TORC２、およびTORC３から選択される１個またはそれ以上のTORCたんぱく質の活性または蓄積を、例えば阻害したり高めたりすることによって変える。さらに有利な態様では、TORC調節剤がTORCに対する１個またはそれ以上の抗体またはその断片を含み、ここで抗体またはその断片はTORCたんぱく質の活性または蓄積を変える。さらなる有利な態様では、TORC調節剤がTORCたんぱく質に対する１個またはそれ以上のペプチド模倣薬を含み、ペプチド模倣薬はTORCたんぱく質の活性または蓄積を変える。
本発明のさらなる局面では、対象における細胞のTORC活性またはCREB促進過程の異常なレベルに関連する疾患または病理的状態の発症を実質的に阻害する、処置する、または改善する方法を提供する。この方法は、対象にある細胞内領域にTORCポリペプチドの発現を調節する物質の１個またはそれ以上の治療上有効量を投与することを含む。この治療法の重要な態様では、阻害物質がアンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉オリゴヌクレオチド、マイクロオリゴヌクレオチド、三重らせん核酸、リボザイム、RNAアプタマー、２本鎖または１本鎖RNA、ペプチド模倣薬、ペプチド模倣薬をコードする配列を含むポリヌクレオチド、またはそれらの任意の２個もしくはそれ以上の混合物を含む。他の重要な態様では、物質がTORC１、TORC２、またはTORC３からなる群から選択される１個またはそれ以上のTORCたんぱく質の発現を調節する。さらなる重要な態様では、病理的状態が神経変性疾患、自己免疫疾患、または炎症性疾患である得るか、もしくはアルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病、骨関節症、乾癬、喘息、COPD、リウマチ性関節炎、癌、糖尿病、高血圧および慢性疼痛から選択され得る。
さらなる局面では、本発明は
(a)TORCポリペプチドを第一の細胞および対照細胞中に導入し、
(b)第一の細胞を薬剤と接触させ；そして
(c)第一の細胞でTORCポリペプチドの生物学的機能が薬剤と接触していない対照細胞のTORCポリペプチド生物学的機能と比較して調節されるかを決定すること、
を含み、ここで機能的な差異があれば調節剤が同定される、細胞のTORC関連過程の活性を調節する薬剤を同定する方法を提供する。この方法の重要な態様では、生物学的機能が多くの細胞内コンパートメントへのTORCポリペプチドの分布を調節することを含む。さらなる重要な態様では、第一の細胞内画分が細胞質であり得、第二の細胞内画分が核であり得る。他の重要な態様では、方法がさらに段階(b)で第一の細胞および対照細胞の両方を、核画分へのTORCポリペプチドの蓄積を調節する物質と接触させることを含む。さらなる重要な態様では、方法がさらに段階(b)で第一の細胞および対照細胞の両方を、細胞質画分へのTORCポリペプチドの蓄積を調節する物質と接触させることを含む。さらに重要な態様では、TORCポリペプチドがTORC１、TORC２、またはTORC３からなる群から選択される。さらに重要な態様では、第一の細胞および対照細胞がインビトロおよびエキソビボで観察されるか、もしくはインビボモデルから得られる。
さらなる局面では、本発明は免疫特異的にTORCポリペプチドに結合する抗体を提供する。有利な態様では、抗体が免疫特異的にアミノ酸配列が配列番号2、配列番号4、または配列番号6によって示されるポリペプチド、その断片に結合する。
さらなる局面では、本発明は本発明のTORC関連組成物を診断使用および研究目的のために分析するためのキットであって、１個またはそれ以上の容器中に
(a)TORCポリヌクレオチド
(b)TORC融合ポリヌクレオチド
(c)本明細書記載のTORCポリペプチド
(d)TORC融合ポリペプチド；および、
(e)TORC抗体
から選択される１個またはそれ以上の成分を含む、キットを開示する。
ポリヌクレオチドを含むキットの重要な態様では、ポリヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉オリゴヌクレオチド、マイクロオリゴヌクレオチド、三重らせん核酸、リボザイム、RNAアプタマー、２本鎖または１本鎖RNA、ペプチド模倣薬、ペプチド模倣薬をコードする配列を含むポリヌクレオチド、またはそれらの任意の２個もしくはそれ以上の混合物を含む。
本発明は広く様々な分析法および診断法に関する。１つの局面では、本発明は
(a)試料核酸を含む試料を提供し；そして
(b)試料核酸中のTORCポリヌクレオチドの存在を検出するかまたは量を定量する、
段階を含む試料中のTORCポリヌクレオチドの存在を検出するかまたは定量する方法を開示する。
この方法の重要な態様では、試料が細胞の細胞内画分由来である。さらに重要な態様では、試料核酸中のTORC配列の少なくとも一部を含む標的ヌクレオチド配列が伸張され、さらに段階(b)での検出または定量は伸張された標的TORC配列で行われる。他の重要な態様では、伸張が逆転写またはポリメラーゼ連鎖反応もしくはその両方を含む。他の重要な態様では、段階(b)での検出または定量が(i)細胞または細胞画分の蛍光インサイチュハイブリダイゼーションまたは(ii)リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を含む。まださらなる重要な態様では、段階(b)での検出または定量が試料核酸をTORCポリヌクレオチドのプローブへのハイブリダイゼーションが確実な条件下でTORCポリヌクレオチドにハイブリダイズするTORCポリヌクレオチドを含むプローブ核酸と接触させ、そしてプローブ核酸にハイブリダイズするTORCポリヌクレオチドの存在を検出するかまたは定量することを含む。さらに重要な態様では、TORCポリヌクレオチドが標識を含み、検出または定量が標識の検出または定量を含む。この方法の他の重要な態様では、プローブ核酸が固体表面に結合する。
さらなる局面では、本発明は第一の対象の病理の診断または予後診断もしくは治療戦略を開発するのに役立つ調節剤を同定する方法であって、ここで病理はCREB依存的遺伝子発現に関連するものであり、そして
(a)試料核酸を含む第一の対象から試料を提供し(ここで、試料はTORCヌクレオチド配列を含む)、
(b)第一の対象からの試料中のTORC配列の量が、対照試料中のTORC配列の量と異なっているか否かを決定する段階を含み(ここで、対照試料は病理を有しないことが知られている第二の対象からの対照核酸を含む)、
故に、病理の診断、予後診断または治療戦略を開発するのに貢献する、方法を開示する。この方法の重要な態様では、試料が細胞の細胞内画分由来である。他の局面では、病理的状態は神経変性疾患、自己免疫疾患、または炎症性疾患であり得るか、もしくはアルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病、骨関節症、乾癬、喘息、COPD、リウマチ性関節炎、癌、糖尿病、高血圧および慢性疼痛から選択され得る。さらなる局面では、方法は第一の試料と対照試料間で発現した遺伝子発現プロファイルを比較することを含む。
さらなる局面では、本発明は試料中にのTORCポリペプチドの存在を検出するかまたは定量する方法であって、
(a)TORCポリペプチドを含むことが疑われる試料を供給し、
(b)ポリペプチドをTORCポリペプチドが特異的結合剤に結合することが確実な条件下でTORCポリペプチドに結合する特異的結合剤と接触させ；そして
(c)TORCポリペプチドに結合する特異的結合剤の存在を検出するかまたは定量する、
工程を含む、方法を開示する。
有利な態様では、試料が細胞の細胞内画分由来である。この方法のさらに有利な態様では特異的結合剤が標識を含むか、または特異的結合剤が標識を含む二次的結合剤に結合し、検出または定量が標識の検出または定量を含む。さらに有利な態様では、特異的結合剤が抗体である。
さらなる局面では、本発明は試料中のTORCポリペプチドの量が対照試料中のTORCポリペプチドの量と異なるか否かを決定する方法であって、
(a)TORCポリペプチドを含むことが疑われる試料を供給し、
(b)試料をTORCポリペプチドが特異的結合剤に結合することが確実な条件下でTORCポリペプチドに結合する特異的結合剤と接触させ；そして
(c)段階(b)で使用されたのと同じ条件下で試料に結合する特異的結合剤の量が対照に結合する特異的結合剤の量と異なるか否かを決定する(ここで対照はTORCポリペプチドの標準的または対照量を含む)、
工程を含む、方法を開示する。
この方法の重要な態様では、試料が細胞の細胞内画分由来である。さらなる重要な態様では、試料がヒトから提供され、かつ対照試料がヒトから提供されるか、または試料がほ乳類から提供され、かつ対照も同じ種のほ乳類から提供される。この方法のさらに重要な態様では、特異的結合剤が標識を含むか、または特異的結合剤が標識を含む二次的結合剤に結合し、検出または定量が標識の検出または定量を含む。さらに重要な態様では、特異的結合剤が抗体である。
さらなる局面では、本発明は第一の対象の疾患または病理の診断または予後診断、もしくは病理の治療戦略の開発に貢献する方法であって、ここで病理のTORCポリペプチドの細胞内局在は非病理的状態でのTORCポリペプチドの細胞内局在とは異なることが知られており、そして
(a)TORCポリペプチドを含むことが疑われる第一の対象から試料を供給し、
(b)試料をTORCポリペプチドが特異的結合剤に結合することが確実な条件下で、本明細書に記載されたTORCポリペプチドに結合する特異的結合剤と接触させ；そして
(c)段階(b)で使用されたのと同じ条件下で試料に結合する特異的結合剤の量が対照に結合する特異的結合剤の量と異なるか否かを決定する(ここで、対照は病理を有しないことが知られている第二の対象から供給される)；
工程を含み、故に、病理の診断または予後診断、もしくは病理の治療戦略の開発に貢献する方法を開示する。この方法の重要な態様では、試料が細胞の細胞内画分由来である。さらに重要な態様では、病理的状態が神経変性疾患、自己免疫疾患または炎症性疾患であり得るか、もしくはアルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病、骨関節症、乾癬、喘息、COPD、リウマチ性関節炎、癌、糖尿病、高血圧および慢性疼痛から選択され得る。さらに重要な態様では、試料がヒトから提供され、かつ対照試料がヒトから提供されるか、または試料がほ乳類から提供され、かつ対照が同じ種のほ乳類から提供される。この方法のさらに重要な態様では、特異的結合剤が標識を含むか、または特異的結合剤が標識を含む二次的結合剤に結合し、検出または定量が標識の検出または定量を含む。さらに重要な態様では、特異的結合剤が抗体である。
図面の簡単な説明
図1 蛍光顕微鏡を用いた一過的にトランスフェクションされた蛍光TORCたんぱく質の細胞内局在の表示。パネルA-DはHeLa細胞。パネルE-HはHEK293細胞。
図2 蛍光顕微鏡で視覚化した、トランスフェクションされたHeLa細胞中のTORC2-eGFP(パネルA)およびTORC3-eGFP(パネルB)の細胞内局在の表示。
図3 HeLa細胞中のTORC１トランスロケーションスクリーンの結果の表示。核−細胞質蛍光差異をMCG全長cDNAコレクションの各クローンについてプロットする(菱形)。レプトマイシンBを、TORCトランスロケーションのポジティブコントロールとして、それぞれのプレートに包含した(×印)。TRPV6およびPKAを担持するポジティブクローンを同定する。
図4 空発現ベクターpCMV-SPORT6(パネルA)またはTRPV6を含んだ発現ベクター(パネルB)もしくはPKAを含んだ発現ベクター(パネルC)でトランスフェクションした細胞中の、顕微鏡により撮像したTORC1-eGFPの局在の表示。出願当初のパネルA〜Cの上のセットは、カラーである。パネルA〜Cの下のセットは、コンピューターによってカラーのパネルをグレースケールイメージに変換することによって調製した。
図5 蛍光顕微鏡によって取得した、HeLa細胞のcAMPシグナルに応答した蛍光TORC融合たんぱく質のトランスロケーションの表示。
図6 蛍光免疫染色(IHC)によって取得したHEK293細胞中の内在性TORC2トランスロケーションおよび顕微鏡写真法によって取得した核染色(ヘキスト)の表示。
図7 蛍光顕微鏡を用いた、HEK293細胞での、GPCRアゴニストイソプロテレノールに応答した、蛍光TORC融合たんぱく質のトランスロケーションの表示。
図8 蛍光顕微鏡を用いた、TORC1-eGFPを安定的に発現しているHeLa細胞での、カルシニューリン活性化によるカルシウムシグナルに応答した、TORC1-eGFP融合たんぱく質のトランスロケーションの表示。
図9 蛍光顕微鏡および顕微鏡撮影を用いた、TORC1-eGFPを安定的に発現しているHeLa細胞での、活性化カルシニューリンによって誘導されるTORC1-eGFPのトランスロケーションの表示。出願当初のパネルAおよびBの上のセットは、カラーである。パネルAおよびBの下のセットは、コンピューターによってカラーのパネルをグレースケールイメージに変換することによって調製した。
図10 TRPV6によるNF-AT依存性ルシフェラーゼレポーターの活性化の表示。
図11 蛍光顕微鏡を用いて取得した、HEK293細胞中の、いくつかの外来性の因子を用いた処理に応答した、TORC融合たんぱく質の局在の表示。
図12 蛍光顕微鏡を用いて取得した、HeLa細胞中の、UV照射およびPMA投与に応答した、TORC1-eGFPのトランスロケーションの表示。
図13 HeLa細胞中の、刺激依存性CRE誘導転写に対するTORC1過剰発現の効果の表示。
図14 HeLa細胞中の、カルシウム誘導CRE-駆動転写またはNFκB駆動転写のための、TORCたんぱく質の必要性の表示。
図15 様々な薬剤で誘導する前に、HeLa細胞に、抗GFP特異的siRNAか、またはTORC1およびTORC2特異的siRNAの両方でトランスフェクションし、処理後取得したウエスタンブロットの表示。
図16 プロモーター駆動遺伝子発現に対するTORC1(1-44)-eGFP融合たんぱく質の効果の表示。
図17 蛍光顕微鏡によって撮像した、ショウジョウバエ唾液腺細胞中のcAMPおよびカルシウムに応答した蛍光ショウジョウバエTORC融合たんぱく質のトランスロケーションの表示。出願当初のパネルAからEの上のセットは、カラーである。パネルAおよびEの下のセットは、コンピューターによってカラーのパネルをグレースケールイメージに変換することによって調製した。
図18 TORC1は、CREBを介してPGC-1αの転写を活性化する。HeLa細胞に、pGL3-basic-2kb-PGC1α-Luc、phRL-SV40(トランスフェクション効率のコントロールとして)を、示された様々なcDNA構築体と共にトランスフェクションした。細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクション後、48時間で決定した。ウミシイタケ(Renilla)発光(RL)を超えるホタル発光(ff)の比率を計算し(平均 ± SEM)、標準化ルシフェラーゼ活性として示し、PGC-1α遺伝子転写の指標として使用した。
図19 TORC1の異所性の発現は、PGC-1αおよびシトクロームcの発現を増やし、このことは、TORC1がミトコンドリア生合成を誘導することを示している。HeLa細胞に、コントロールレンチウイルス(停止またはGFP)か、またはTORC1レンチウイルスを導入した。A.総たんぱく質を、導入の72時間後に細胞から抽出し、ウエスタンブロット解析にかけ、PGC-1αたんぱく質の発現を決定した。B.総RNAを、導入の24、48、および72時間後に細胞から抽出し、qPCR解析にかけ、内在性のPGC-1α(B)およびシトクロームc(C)のmRNAの発現レベルを決定した。
図20 TORC1の異所性の発現は、HeLa細胞で細胞呼吸を増やす。HeLa細胞に、コントロール(停止)か、またはTORC1レンチウイルスを導入した。細胞呼吸は、クラーク電極(Clark electrode)を用いて、導入後72時間で決定した。オリゴマイシンおよびCCCPの濃度は、それぞれ、2 μg/mlおよび2 μMである。
図21 TORC1、2および3は、PGC1-αの転写を活性化する。HeLa細胞に、pGL3-basic-2kb-PGC1α-Luc、phRL-SV40(トランスフェクション効率のコントロールとして)を、示された様々なcDNA構築体と共にトランスフェクションした。細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクション後、48時間で決定した。ウミシイタケ発光を超えるホタル発光の比率を計算し、標準化ルシフェラーゼ活性として示し、PGC-1α遺伝子転写の指標として使用した。N=6、* P<0.05(TORC1、2、3対ベクターに関して)。
図22 TORC2またはTORC3の異所性の発現は、PGC1-αおよびミトコンドリアマーカーの発現を増やす。初代筋肉細胞に、TORC2、TORC3またはGFPアデノウイルスを導入した。A、総たんぱく質を、導入後48時間の細胞から抽出し、異所性のTORC2およびTORC3たんぱく質の発現を決定するために、ウエスタンブロット解析を行った。異所性のTORC2およびTORC3たんぱく質を検出する一次および二次抗体は、それぞれ、V5およびヤギ-抗-ウサギIgGであった。B-C、全RNAを、導入後24および48時間の細胞から抽出し、内在性のPGC1-α(B)およびPGC1-α標的遺伝子(C)(ERRαおよびミトコンドリアマーカー、シトクロームC (CytC)、シトクロームオキシダーゼサブユニットII(CoxII)、イソクエン酸脱水素酵素(IDH)を含む)の発現レベルを決定するために、qPCR解析を行った。N=3, *P<0.05 (TO-RC2またはTORC3対GFP)
図23 TORC2またはTORC3の異所性の発現は、マウス初代筋肉細胞の脂肪酸酸化を増やす。初代筋肉細胞に、TORC2、TORC3またはGFPアデノウイルスを導入した。14C-パルミテート酸化は、導入後48時間で行われた。N=3、*P<0.05。
図24 TORC2またはTORC3の異所性の発現は、マウス初代筋肉細胞の細胞呼吸を増やす。初代筋肉細胞に、48時間、TORC、TORC3またはGFPアデノウイルスを導入した。細胞呼吸は、処理なし(基底)、またはオリゴマイシンもしくはCCCP処理で測定した。N=3、*p< 0.05 TORC対GFP。
発明の詳細な記載
本明細書に記載された本発明は、記載された特定の方法論、プロトコールおよび試薬に、それらが変わり得るため、限定されないことを意図する。また本明細書で使用される専門用語は特定の態様を記載する目的のためだけであり、いかなる方法によっても本発明の範囲を制限するものではないことを理解すべきである。
別に定義がなければ、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語はこの発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載したものと類似または同等の任意の方法および材料が本発明の実施または試験のために使用され得るが、好ましい方法、装置および材料を現在記載している。本明細書に記載されたすべての出版物は、本発明との関連で使用され得る出版物に報告された材料および方法論を記載ならびに開示する目的で出典明示により本明細書の一部とする。
本発明を実施するとき、分子生物学での多くの古典的な技術が使用される。これらの技術は既知であり、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, 1997 (F. M. Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.); Animal Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney ed.); Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory);およびMethods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (各々Wu and GrossmanおよびWu編)で説明される。

略語
ATF:活性転写因子
cAMP:環状AMP
CBP:CREB結合たんぱく質
CCE:容量性カルシウム流入
CNS:中枢神経系
COPD:慢性閉塞性肺疾患
CPA:シクロピアゾン酸
CRE:cAMP応答エレメント
CREB:cAMP応答エレメント結合たんぱく質
CREM:cAMP応答エレメントモジュレーター
CsA:シクロスポリンA
dTORC:ショウジョウバエの制御されたCREBのトランスデューサー
HTS:ハイスループットスクリーニング
ICER:誘導性cAMP早期抑制
LMB:レプトマイシンB
NF-AT:活性型T細胞の核因子
PKA:環状AMP依存性たんぱく質キナーゼA
SOCC:貯蔵量制御型カルシウムチャネル
TORC:制御されたCREBのトランスデューサー
TRPV6:一過性受容体潜在的陽イオンチャンネル、サブファミリーV、メンバー6
TORCたんぱく質がCREB依存性遺伝子発現の重要な共調節因子であることを実施例で示している。TORCたんぱく質は優勢的に細胞質に存在しているが、CREB１リン酸化を協調的に制御することが知られている様々な誘導経路により迅速に核へ移行することが分かっている。これらは細胞内cAMPレベルを増加させる薬剤、一過的にカルシウム増加を誘導する薬剤、UVライト、プロテインキナーゼA(PKA)活性およびGPCRリガンドを含む。さらにTORC活性は必要であり、TORC核トランスロケーションがCRE仲介遺伝子発現の誘導のために十分である。さらにTORC１はカルシニューリンに依存した方法で核へ移行し、故にNF-ATに加えてこの方法で制御される第２のほ乳類転写因子を表す。カルシウムシグナリングに対する応答でTORC１およびより少ない程度のTORC２の移行はシクロスポリンA(CsA)に感受性であり、これはイムノフィリン結合剤の有効性および毒性が起こり得る新規メカニズムを示している。単一のショウジョウバエTORCたんぱく質、dTORCはまたカルシニューリン依存性核トランスロケーションによって制御されることが証明されており、さらにTORC機能の重要な保存された役割を例証する。最終的にTORCトランスロケーションはcAMPおよびカルシウム依存性シグナル経路の活性化のための単純な生物学的センサーを提供する。
実施例で報告している実験はTORCトランスロケーションアッセイが、ハイスループットスクリーニング法でTORC機能および最終的にはCRE依存性遺伝子発現のモジュレーターを同定するのに役立つことを示している。既知の修飾因子を用いて入手した結果に基づき、さらにTORC機能およびトランスロケーションのモジュレーターならびにTORCポリペプチドの発現を妨害する薬剤がCREB１仲介応答を調節するのに利用できると考えられている。さらにTORC機能およびトランスロケーションのモジュレーターならびにTORCポリペプチドの発現を妨害する薬剤が実質的に細胞のTORC関連またはCREB促進過程の異常なレベルに関する対象の疾患または病理的状態の発症を阻害する、処置する、または改善するのに有効であると考えられている。
本明細書中で使用する“試料”という用語および類似の言葉は、無傷細胞の核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドもしくはたんぱく質またはポリペプチドと同一もしくは最小限変更された形の、核酸、ポリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドもしくはたんぱく質またはポリペプチドを含む任意の物質、組成物または対象に関する。広義には試料は、無傷細胞からなる生物試料であり得る。この広義の意味では試料中のDNAはゲノムDNAであり、試料中のRNAはmRNA、tRNA、rRNAおよび類似RNAを含む。試料はまた、試料の細胞から核を単離するまたは試料細胞に含まれた核を破壊するような段階を考慮して、ゲノムDNAから最小限変更されたDNAを含み得る。別の意味では、試料は細胞内画分、細胞内成分またはオルガネラであるか、もしくは無傷細胞を考えるとき、細胞自身または細胞の細胞内領域であってもよい。本明細書中で検討したいくつかの態様では、細胞、核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドもしくはたんぱく質またはポリペプチドを含む試料は特定の病理を有することが疑われるかあるいは有すると診断された対象から入手できる。
本明細書中で使用する“対照”という用語および類似の言葉は、試料を特定の病理を有することが疑われるかあるいは有すると診断された対象から入手し、同じ方法の同じ段階で使用する対照を病理を有さないことが知られている対象から入手する方法の態様であるという以外、“試料”に関して上記で定義された任意の物質、組成物または対象に関する。より広義には、対照はコントロールとしてまたは非実験状態もしくは非病理的状態を特徴づけるものとして役立つと信頼できる起源から入手する。
本明細書中で使用する“アゴニスト”という用語は直接的または間接的にポリペプチド(例えばTORCポリペプチド)を調節し得る分子および該ポリペプチドの生物活性を増加させる分子(すなわちモジュレーター)を言う。アゴニストはたんぱく質、核酸、炭水化物または他の分子を含んでよい。遺伝子転写またはたんぱく質の生化学的機能を増加するモジュレーターは、それぞれ転写を増加させるか、または該たんぱく質の生化学的特性もしくは活性を刺激するものである。
本明細書中で使用する“アンタゴニスト”または“阻害剤”という用語は直接的または間接的にポリペプチド(例えばTORCポリペプチド)を調節し得る分子および該ポリペプチドの生物活性を妨害または阻害する分子(すなわちモジュレーター)を言う。アンタゴニストおよび阻害剤はたんぱく質、核酸、炭水化物または他の分子を含んでよい。たんぱく質の発現または生化学的機能を阻害するモジュレーターはそれぞれ該たんぱく質の遺伝子発現または生物活性を減少させるものである。
検出および標識。TORCポリヌクレオチドまたはTORCポリペプチドは多くの方法で検出し得る。検出は、TORCポリヌクレオチドまたはTORCポリペプチドの存在を検出するまたは定量することができる任意の１つまたはそれ以上の過程を含んでいてよい。１つの態様では、TORCポリヌクレオチドを含んだ試料核酸を伸張前に検出し得る。他の態様では、試料中のTORCポリヌクレオチドを伸張TORCポリヌクレオチドの提供のために伸張し、伸張TORCポリヌクレオチドを検出または定量し得る。物理的、化学的または生物学的方法を、TORCポリヌクレオチドの検出および定量に使用できる。物理的方法は、この例に限るものではないが、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、インサイチュハイブリダイゼーションの微視的視角化、プローブを表面に結合させ、そしてTORCポリヌクレオチドまたはTORCポリペプチドの固定プローブへの結合を検出するのに表面プラズモン共鳴(SPR)を使用する、またはクロマトグラフィー媒体中にプローブを保持し、そしてクロマトグラフィー媒体中のTORCポリヌクレオチドの結合を検出するようなSPR検出などの様々な顕微鏡技術を含む光学的視覚化を含む。物理的方法はさらに、TORCポリヌクレオチドまたはTORCポリペプチドを他のポリヌクレオチドまたはポリペプチドから分離し、分離したTORCポリヌクレオチドまたはTORCポリペプチドを検出するゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動法を含む。物理的方法はさらに、物質を検出または定量する任意の分光学的方法を広く含む。化学的方法は一般に、TORCポリヌクレオチドがプローブにハイブリダイズするハイブリダイゼーション法を含む。生物学的方法はTORCポリヌクレオチドまたはTORCポリペプチドが細胞に生物学的効果を及ぼし、その効果を検出することを含む。本発明は生物学的解析として利用され得る生物学的効果の例を開示する。多くの態様では、ポリヌクレオチドは下記で記載したように検出および定量を助けるために標識し得る。例えば、試料核酸は標識ヌクレオチドまたは標識オリゴヌクレオチドリンカーのような標識部分の化学的または酵素学的付加により標識され得る。TORCポリヌクレオチドまたはTORCポリペプチドを検出する多くの同等の方法は本発明の技術分野に属する当業者に既知であり、本発明の範囲内に含まれる。
本発明の核酸は、任意の幅広いPCR増幅技術に従い、cDNA、mRNAまたはその他ゲノムDNAを適当なオリゴヌクレオチドプライマーと共に鋳型として用いて伸張できる。このように増幅した核酸は適当なベクターにクローン化し、DNA配列解析により特徴づけられ得る。さらにTORCヌクレオチド配列に相当するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成法、例えば自動DNAシンセサイザーを用いて調製され得る。
伸張ポリヌクレオチドは直接、検出および/または定量され得る。例えば伸張ポリヌクレオチドは、大きさによって分離するゲルでの電気泳動を行い、その存在および量を明示する染料で染色する。あるいは、伸張TORCポリヌクレオチドはハイブリダイズする条件下(下記参照)でプローブ核酸に暴露することで検出し、ハイブリダイゼーションによる結合を検出および/または定量し得る。検出はTORCポリヌクレオチドがプローブに結合していることを決定できる任意の方法で遂行される。これは、断片にハイブリダイズすることによって生じるプローブの物理的特性の変化を検出することによって達成できる。そのような物理的検出の非限定的例はSPRである。
検出を達成する別の方法は、TORCポリヌクレオチドまたはTORCポリペプチドの標識型を使用し、結合標識を検出することである。ポリヌクレオチドは核酸を伸張する過程でまたは他の方法で、付加的な特性として標識され得る。標識は、断片集団を伸張するのに使用される組成物中に含まれる修飾ヌクレオチドの使用により、断片中に組み込まれ得る。標識は、放射能によって検出できる例えば125I、35S、32P、14C、または3Hのような放射性同位体標識であってもよい。あるいは、標識は、例えば分光法を使って検出できるようなものから選択され得る。１つの例では、標識は入射光線を吸収する発色団であり得る。好ましい標識は発光によって検出できるものである。発光は蛍光、リン光および化学発光を含む。故に、蛍光であるまたはリン光である、もしくは化学発光反応を誘導する標識が使用され得る。適当な蛍光標識または蛍光色素の例は、152Eu標識、フルオルセイン標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、Cy-3、Cy-5、アロフィコシアニン標識、o-フタルアルデヒド標識、およびフルオルセアミン標識を含む。発光標識は高感度での検出を可能にする。標識はさらに、電子常磁性共鳴により検出できる安定型フリーラジカル標識、または核磁気共鳴によって検出できる核標識のような磁気共鳴標識であってもよい。標識はまたさらに特異的リガンド-受容体対のリガンドであってよい；ここでリガンドの存在は、通常それ自体が検出のために標識されている特異的受容体の二次結合によって検出される。そのようなリガンド-受容体対の非限定的例は、ビオチンとストレプトアビジンまたはアビジン、ジゴキシゲニンまたは抗原のようなハプテンとその特異的抗体などを含む。標識はまたさらに、TORCポリヌクレオチドまたはTORCポリペプチドに付加した融合配列であってもよい。そのような融合は、TORCポリヌクレオチドまたはTORCポリペプチドの単離および/または検出ならびに定量を許容する。非限定的例として、融合配列はFLAG配列、ポリヒスチジン配列、緑色蛍光たんぱく質および黄色蛍光たんぱく質のような蛍光たんぱく質配列、アルカリホスファターゼ、グルタチオン転移酵素などであってよい。要約すると、標識は本発明の開示に関する分野における当業者に既知の様々な手段で達成することができる。TORCポリヌクレオチドまたはTORCポリペプチドの検出および/または定量を許容するいかなる同等な標識も、本発明の範囲内に属するものと理解する。
標識を含む検出、定量法は、概して、非限定的例として分光学、核酸化学、生化学、分子生物学および細胞生物学の分野を含む本発明に関する分野における当業者に既知である。定量により、プローブに結合した核酸またはポリヌクレオチドもしくはその断片の量、質量、または濃度を決定することができる。定量は、本および前パラグラフで記載したような物理学的、化学的、生物学的特性の変化量を決定することを含む。例えば標識から発生したシグナルの強度は、プローブに結合した核酸の量を評価するのに使用され得る。プローブ核酸にハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはその断片の、存在および/または量、質量、もしくは濃度を検出する方法を生み出すいかなる同等な過程も、本発明の範囲内に属するものとみなす。
本明細書中で使用する、細胞のTORC関連またはCREB促進過程に関連する疾患または病理的状態“の発症を実質的に阻害する”という用語および類似語ならびに語句は、疾患または状態の初期兆候を最小化する、または本質的になくすよう予防的に作用する対象への援助に関する。そのような初期兆候は、非限定的例として、試験の診断値または疾患もしくは状態の全身症状を含む。疾患または病理的状態の発症が実質的に阻害された対象は、臨床上および診断上、正常な非病理対象(nondisease-bearing subject)と区別できないように見える。
本明細書中で使用する“処置”という用語および類似語ならびに語句は、細胞のTORC関連またはCREB促進過程に関連する疾患または病理的状態に関して使用するとき、非限定的例として試験の診断値または疾患または状態の全身症状によって評価されるにより評価して、疾患または状態の進行を遅らせる、または対象が回復し始めるように作用する対象への援助に関する。
本明細書中で使用する“改善する”という用語および類似語ならびに語句は、細胞のTORC関連またはCREB促進過程に関連する疾患または病理的状態に関して使用するとき、対象の疾患または状態の兆候を減らす、または本質的になくすよう作用する対象への援助に関する。そのような兆候は、非限定的例として、試験の診断値または疾患もしくは状態の全身症状を含む。
本明細書中で使用する“Torc関連”または“Torc活性化”という用語は、Torc活性の結果またはそれを条件として(as a condition to)発現する遺伝子もしくはたんぱく質に関する。例えば、Torc関連遺伝子またはたんぱく質は、Torc活性または分布の上流もしくは下流の経路を阻害もしくは誘導する。
ポリヌクレオチド
本明細書中で使用する“核酸”および“ポリヌクレオチド”という用語および類似語ならびに語句は、互いに同義的であると考えられており、生化学、分子生物学、遺伝学、および本発明に関する類似の分野における当業者によって慣習的に理解される通りに使用される。本発明で使用されるポリヌクレオチドは一本鎖であってよく、また塩基対二重鎖構造もしくは三重鎖塩基対構造でさえあってよい。ポリヌクレオチドはDNA、RNAまたは、非限定的例として、DNA-RNA二重構造のようなDNA鎖とRNA鎖の任意の混合物もしくは組み合わせであり得る。本明細書中で使用されるポリヌクレオチドおよび“オリゴヌクレオチド”は、鎖の長さを除いて、ポリヌクレオチドに関して本明細書中に定義したものと任意のおよびすべての特性が同一である。本明細書中で使用するポリヌクレオチドは、長さが約５０ヌクレオチドまたは塩基対であるかそれより長い、もしくは長さが約６０、約７０、約８０、約１００、約１５０、約２００、約３００、約４００、約５００、約７００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、約３０００ヌクレオチドまたは塩基対であるかそれよりさらに長いものであり得る。オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも３ヌクレオチドまたは塩基対であり、約７０、約６０、約５０、約４０、約３０、約２０、約１５、約１０ヌクレオチドまたは塩基対より短いものであり得る。ポリヌクレオチドもオリゴヌクレオチドも両方、化学的に合成し得る。オリゴヌクレオチドはプローブとしても使用できる。
本明細書中で使用する“単離された”核酸分子は、少なくとも核酸が天然の起源で存在する他の核酸分子から分離されたものである。単離された核酸分子の例は、これに限定するものではないが、リコンビナントポリヌクレオチド分子、ベクターに含まれるリコンビナントポリヌクレオチド配列、異種宿主細胞で維持されるリコンビナントポリヌクレオチド分子、部分的または実質的に精製された核酸分子、および合成DNAまたはRNA分子を含む。好ましくは、“単離された”核酸は核酸が由来する生物のゲノムDNAで、核酸の側面に本来ある配列(すなわち、核酸の5'および3'末端に位置した配列)がない。例えば、様々な態様では、単離されたTORC核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムDNAで核酸の側面に本来ある核酸配列の約50kb、25kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kbまたは0.1kb以下のものを含み得る。さらにcDNA分子のような“単離された”核酸分子は、リコンビナント技術によって生成するとき、他の細胞物質または培養培地が実質的になく、また化学的に合成するとき、化学物質前駆体もしくは他の化学物質が実質的にない。
本発明の核酸分子、例えば配列番号1、配列番号3または配列番号5のヌクレオチド配列もしくはこのヌクレオチド配列のいずれかの相補体を有する核酸分子は、標準的な分子生物学の技術および本明細書中に記載した配列情報を用いて単離することができる。配列番号1、配列番号3、または配列番号5のいずれかの核酸配列の全体もしくは一部分をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、TORC核酸配列は標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術の使用により単離することができる(例えば、Sambrook et al., eds., MOLECULAR CLONING: A Laboratory Manual 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001;およびBrent et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (2003)に記載の通り)
。
本明細書中で使用する“相補的な”という用語は、核酸分子のヌクレオチドユニット間のWatson-CrickまたはHoogsteen塩基対を言う。本明細書および請求の範囲で使用する“相補的”という用語および類似語は、核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの１つの鎖における第一の核酸塩基が、核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの第２の鎖における特定の第２の核酸塩基とだけ特に相互作用する能力に関する。非限定的例として、自然に起こる塩基を考えると、AとTまたはUが互いに相互作用し、GとCが互いに相互作用する。本発明および請求の範囲で使用する“相補的な”は領域内で“完全に相補的な”、すなわち二つのポリヌクレオチド鎖を互いにアラインしたとき、少なくともその領域で第１鎖の隣接する塩基配列のそれぞれの塩基が、反対の鎖上の同じ長さの隣接する塩基配列で相互作用する塩基に相補的であることを意味することを意図する。
本明細書中で使用する“ハイブリダイズする”、“ハイブリダイゼーション”および類似語は、相補的な配列を有する鎖が互いに相互作用することによって、核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド二本鎖を形成する過程に関する。相互作用は、対を形成するために特異的に相互作用する、それぞれの鎖上の相補的な塩基によって起こる。鎖の互いにハイブリダイズする能力は、以下に示す様々な条件に依存している。それぞれの鎖で十分な数の相当する位置が、互いに相互作用するヌクレオチドによって占有されているとき、核酸鎖は互いにハイブリダイズする。二本鎖を形成する鎖の配列が特異的にハイブリダイズするのに互いに１００％相補的である必要がないことは、非限定的例として、分子生物学者、細胞生物学者を含む、本発明の分野における当業者によって理解されている。
他の態様では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号1、配列番号3、または配列番号5のいずれかで示されたヌクレオチド配列もしくはこのヌクレオチド配列の一部分に相補的である核酸分子を含む。配列番号1、配列番号3、または配列番号5のいずれかで示されたヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号1、配列番号3、または配列番号5のいずれかで示されたヌクレオチド配列に十分に相補的であるもの、すなわち、配列番号1、配列番号3、または配列番号5のいずれかで示されたヌクレオチド配列とほとんどまたは全くミスマッチなく水素結合でき、それにより安定な二本鎖を形成するものである。
核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの重要な使用は、プローブ核酸がハイブリダイズする標的配列を同定する解析である。標的に対するプローブの選択性は、ハイブリダイズ条件のストリンジェンシーにより影響を受ける。ハイブリダイゼーション反応の“ストリンジェンシー”は容易に当業者によって決定され、概してプローブ長、温度、および緩衝液組成に依存する経験的評価である。ハイブリダイゼーションは、相補鎖が融点以下の環境で存在しているとき、概して変性したDNAのリアニール能力に依存している。相対的により高い温度は、反応条件をよりストリンジェンシーにする傾向があり、一方低い温度は、そんなにストリンジェンシーではなくする。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明ならびに種々のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の同定は、Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (2003)、およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., New York: Cold Spring Harbor Press, 2001を参照のこと。さらにハイスループットまたは多重解析系で、プローブ特性およびストリンジェンシーの両方は、１セットのストリンジェンシー条件のもとで多重解析の目的を達成できるように最適化され得る。
本明細書中で定義する、“ストリンジエントな条件”および“高ストリンジェンシーな条件”の非限定的例は、(1)洗浄のために、低イオン強度および高温を用いる、例えば、0.015 M 塩化ナトリウム/0.0015 M クエン酸ナトリウム/0.1% ドデシル硫酸ナトリウムで、50℃;(2)ハイブリダイゼーション中、ホルムアミドのような変性剤を用いる、例えば、0.1% ウシ血清アルブミン/0.1% Ficoll/0.1% ポリビニルピロリドン/ 750 mM 塩化ナトリウム, 75 mM クエン酸ナトリウムを含む、pH 6.5の50 mMリン酸ナトリウム緩衝液と、50% ホルムアミドで、42℃;(3)50% ホルムアミド、5xSSC (0.75 M NaCl、0.075 M クエン酸ナトリウム)、50 mM リン酸ナトリウム (pH 6.8)、0.1% ピロリン酸ナトリウム、5x デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子DNA (50 μg/ml)、0.1% SDS、および 10% 硫酸デキストランで42℃、を用い、0.2xSSC (塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)で、42℃および 50% ホルムアミドで、55℃で洗浄し、その後、55℃ でEDTAを含む0.1xSSCからなる、高ストリンジェンシー洗浄を行うか、または(4)7% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、0.5 M NaPO4、1 mM EDTAで50℃、を用い、2X SSC、0.1% SDS で、50℃で洗浄する、ことを含む。
“中程度のストリンジエント条件”は、非限定的例として、上述したものほどストリンジエントではない、洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件(例えば、温度、イオン強度および%SDS)の使用を含む。中程度のストリンジエント条件の例は、20% ホルムアミド、5xSSC (150 mM NaCl、15 mM クエン酸トリナトリウム)、50 mM リン酸ナトリウム(pH 7.6)、5x デンハルト溶液、10%硫酸デキストラン、および20 mg/ml変性剪断サケ精子DNAを含む溶液で、37℃で一晩のインキュベーション、その後、1xSSC、約37-50℃で、フィルターを洗浄することを含む。当業者は、プローブ長などのような因子を適合させる必要があるとき、温度、イオン強度などを調節する方法を認識している。
変異体TORCポリヌクレオチド
本発明はさらに、開示されたTORCヌクレオチド配列とは異なった核酸分子を包含する。例えば、配列は遺伝暗号の縮重のため異なり得る。故にこれらの核酸は、配列番号1、配列番号3、または配列番号5で示されたヌクレオチド配列によってコードされたのと同じTORCたんぱく質をコードする。そのような態様では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号2、配列番号4、または配列番号6で示したアミノ酸配列を有するたんぱく質をコードしたヌクレオチド配列を有する。
任意の配列番号1、配列番号3、または配列番号5で示したヒトTORCヌクレオチド配列に加えて、TORCたんぱく質のアミノ酸配列の変化を導くDNAアレル配列多型が、集団(例えばヒト集団)内に存在し得ることを当業者は理解している。そのような自然のアレル変異は、典型的には、TORC遺伝子のヌクレオチド配列で1-5％不一致という結果になる。何らかのおよびすべてのヌクレオチド変異ならびに結果として生じる、自然のアレル変異の結果であり、そしてTORCたんぱく質の機能的活性を変えないTORCたんぱく質のアミノ酸多型は、本発明の範囲内に属すると意図する。
他の種のTORCオーソログをコードし、故に配列番号1、配列番号3、または配列番号5のいずれかのヒト配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内に属すると意図する。本発明のTORC cDNAの自然のアレル変異に相当する核酸分子およびオーソログは、ヒトcDNAまたはその一部分をストリンジエントなハイブリダイゼーション条件下での標準的なハイブリダイゼーション技術に従って、ハイブリダイゼーションプローブとして用いて、本明細書記載のヒトTORC核酸に対するホモロジーに基づいて単離することができる。
集団内に存在し得るTORC配列の天然に存在するアレル変異に加えて、当業者はさらに、コードされたTORCたんぱく質のアミノ酸配列は変化するが、TORCたんぱく質の機能的な能力は変わらないような、配列番号1、配列番号3、または配列番号5のいずれかで示したヌクレオチド配列の変異が、当業者によって産生できることを理解している。例えば、“非必須”アミノ酸残基におけるアミノ酸置換に至るヌクレオチド置換は、配列番号1、配列番号3、または配列番号5のいずれかで示した配列でなし得る。“非必須”アミノ酸残基とは、結果として生じる遺伝子産物の生物学的活性を変えることなく、TORCたんぱく質の野生型配列を変えることが可能な配列の位置にある残基であり、一方“必須”アミノ酸残基とは、生物学的活性のために必要な位置にある残基である。例えば、本発明のTORCたんぱく質がメンバーである、TORCたんぱく質のファミリーのメンバー間で不変のアミノ酸残基は、変化に対して特に影響を受けないと予測される。ポリペプチドのアミノ酸配列の位置が不変であるかまたは変化に対して影響を受けやすいかは、ポリペプチドのホモログ、オーソログおよびパラログの種々の配列アラインメントを調べることで容易に明らかになる。
よって本発明の重要な側面は、活性に必須ではないアミノ酸残基の変化を含むTORCたんぱく質をコードする核酸分子を含む。そのようなTORCたんぱく質は、配列番号2、配列番号4、または配列番号6のいずれかのアミノ酸配列とは異なっているが、生物学的活性を保持している。１つの態様では、単離された核酸分子は、配列番号2、配列番号4、または配列番号6のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約75%の類似性を含むたんぱく質をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、核酸によってコードされたたんぱく質は、配列番号2、配列番号4、または配列番号6のいずれかと少なくとも約80%同一であり、より好ましくは少なくとも約85%、約90%、約95%、約97%、約98%、および最も好ましくは約99%同一である。配列番号2、配列番号4、または配列番号6のいずれかに類似のたんぱく質をコードする単離された核酸分子は、相当するヌクレオチド配列に１個またはそれ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を導入することによって作り出され、その結果、１個またはそれ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失がコードされるたんぱく質に導入される。
好ましくは、保存的なアミノ酸置換は、１個またはそれ以上の予想される非必須アミノ酸残基でなされる。“保存的な”アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖をもつアミノ酸残基で置き換わるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、本技術分野で定義されている。あるアミノ酸は、極性アミノ酸と長い脂肪族側鎖のような、２個以上の分類可能な特徴を有する側鎖を有する。アミノ酸ファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非電荷極性側鎖(例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、トリプトファン、システイン)、非極性側鎖(例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、チロシン、トリプトファン、リシン)、β分枝側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)、および金属複合体側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、およびヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびPCR仲介突然変異誘発などの標準的な技術を用いて、配列番号1、配列番号3、または配列番号5中に導入可能である。別の態様では、突然変異は、例えば飽和突然変異誘発などによって、TORCコード配列の全部または一部分に無作為に導入可能であり、その結果生じる突然変異体は、活性を保持する突然変異体を単離するためにTORC生物学的活性をスクリーニングすることができる。配列番号1、配列番号3、または配列番号5の突然変異誘発に続いて、コードされたたんぱく質を、当業者にとって既知のリコンビナント技術によって発現させ、たんぱく質の活性を決定することができる。
２つのまたはそれ以上の配列間の類似性を決定すること
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の%類似性を決定するために、配列を最適な比較目的のために並べることができる(例えば、ギャップは、配列間の最適なアラインメント比較のためにどちらかの配列に導入することができる)。本明細書中で使用する、アミノ酸またはヌクレオチドの“同一性”は、アミノ酸またはヌクレオチドの“相同性”と同義である。
“配列同一性”という用語は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、特定の比較領域において残基に基づいて同一である程度を言う。“配列同一性の割合”という用語は、比較領域の２つの最適な整列配列を比較し、マッチした位置の数を導くため同一の核酸塩基(例えば核酸の場合には、A、TまたはU、C、G、またはI)が両方の配列で起こる位置の数を決定し、マッチした位置の数を比較領域における位置の全体数(すなわち、ウィンドウサイズ)で割り、配列同一性の割合を導くためにその結果に100を掛けることで計算する。本明細書中で使用する“実質的に同一”という用語は、ポリヌクレオチド配列の特徴を表し、ここでポリヌクレオチドは、比較領域の対照配列と比べて、少なくとも80%配列同一性、好ましくは、少なくとも85%同一性および、しばしば90から95%配列同一性、より通常99%配列同一性を有する配列を含む。ポリペプチドで“陽性残基の割合”は、比較領域の２つの最適な整列配列を比較し、マッチした位置の数を導くため、上記したように、同一の保存されたアミノ酸置換が両方の配列で起こる位置の数を決定し、マッチした位置の数を比較領域における位置の全体数(すなわち、ウィンドウサイズ)で割り、陽性残基の割合を導くためにその結果に100を掛けることで計算する。
当技術分野で知られているように、“同一性”は、配列を比較することによって決定される、２つまたはそれ以上のポリペプチド配列間、もしくは２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当技術分野では、“同一性”はまた、場合によってはそのような配列間のマッチによって決定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味する。“同一性”および“類似性”は、以下に示したものを含むが、これに限定するものではない既知の方法によって、容易に計算できる(Computational Molecular Biology, Lesk. A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I. Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds. Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press. New York, 1991;およびCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math. (1988) 48: 1073)。同一性を決定するより好ましい方法は、試験される配列間に最大限の一致を与えるように設計することである。相同性および類似性を決定する方法は、一般に利用できるコンピュータープログラムに組み込まれている。２つの配列間の相同性および類似性を決定する好ましいコンピュータープログラム法は、これに限定するものではないが、GCG program package (Devercux, J., et al. (1984) Nucleic Acids Research 12(1): 387)、BLASTP、BLASTN、およびFASTA (Atschul, S. F. et al. (1990) J. Molec. Biol. 215: 403-410.)を含む。BLAST X programは、一般にNCBIおよび他の源(BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410)から利用できる。既知のSmith Waterman algorithmは、また、相同性を決定するのに利用し得る。
さらに、BLASTアラインメントツールは、２つの配列間の類似性および相同性割合を検出するのに役立つ。BLASTは、World Wide WebのNational Center for Biotechnology Informationサイトで利用できる。BLAST解析を記載した参照文献は、Madden, T.L., Tatusov, R.L. & Zhang, J. (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaeffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; and Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) Genome Res. 7:649-656を含む。
アンチセンス核酸
本発明の他の局面は、配列番号1、配列番号3、または配列番号5もしくは変異体のヌクレオチド配列、断片、アナログまたはその誘導体にハイブリダイズ可能であるか、もしくは相補的である、単離されたアンチセンス核酸分子を含む。“アンチセンス”核酸は、たんぱく質をコードする“センス”核酸に相補的な、例えば、二重鎖cDNA分子のコード鎖に相補的な、またはmRNA配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。特別な局面では、少なくとも約10、25、50、100、250または500ヌクレオチドの一部分、もしくは完全TORCコード鎖に相補的な配列を含む、アンチセンス核酸分子が提供される。
１つの態様では、アンチセンス核酸分子は、TORCたんぱく質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の“コード領域”に対するアンチセンスである。“コード領域”という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドン(例えば、配列番号2、配列番号4、または配列番号6のいずれかに相当する、ヒトTORCたんぱく質のたんぱく質コード領域)を含む、ヌクレオチド配列の領域を言う。他の態様では、アンチセンス核酸分子は、TORCたんぱく質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の“非コード領域”に対するアンチセンスである。“非コード領域”という用語は、コード領域の側面に位置し、アミノ酸に翻訳されない(すなわち、また、5'および3'非翻訳領域とも言う)が、発現を制御する配列を含み得る、5'および3'配列を言う。
本明細書で開示したTORCたんぱく質をコードするコード鎖配列(例えば、配列番号1、配列番号3、または配列番号5)を考えるとき、本発明のアンチセンス核酸は、WatsonおよびCrickまたはHoogsteenの塩基対ルールに従って設計し得る。アンチセンス核酸分子は、TORC mRNAの全体のコード領域に相補的であることが可能であるが、より好ましくは、TORC mRNAのコードまたは非コード領域の部分にだけアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、TORCたんぱく質をコードする細胞内mRNAおよび/またはゲノムDNAとハイブリダイズもしくは結合し、例えば、転写および/または翻訳を阻害することによってたんぱく質の発現を阻害するように、対象に投与されまたはインサイチュで発生させる。安定した二本鎖を形成するための、または、例えばDNA二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝との特異的な相互作用を通して、ハイブリダイゼーションを古典的なヌクレオチド相補性により実施可能である。
干渉RNA
本発明の１つの局面では、TORC遺伝子発現をRNA干渉により減らすことが可能である。当業者に既知の方法の１つは、TORC遺伝子の発現産物が、TORC遺伝子転写産物の少なくとも19-25ヌクレオチドに相補的である(5’非翻訳(UT)領域、ORF、または3’UT領域を含む)、特異的な２本鎖TORC由来siRNAヌクレオチド配列によって標的とされる場所で、遺伝子のサイレンシングを仲介する、低分子干渉RNA(siRNA)またはマイクロRNA(本明細書中では、また、干渉ポリヌクレオチドまたはマイクロポリヌクレオチドとも呼ぶ)である。例えば、引用により本明細書の一部とした、PCT出願第WO00/44895号、第WO99/32619号、第WO01/75164号、第WO01/92513号、第WO01/29058号、第WO01/89304号、第WO02/16620号、および第WO02/29858号を参照のこと。また、Jia et al. (2003) J. Virol. 77(5):3301-3306、およびMorris et al. (2004) Science 305:1289-1292も参照のこと。標的遺伝子は、TORC遺伝子またはTORC遺伝子の上流もしくは下流のモジュレーターであり得る。TORC遺伝子の上流または下流のモジュレーターの非限定的例は、TORC遺伝子プロモーターに結合する転写因子、TORCポリペプチドと相互作用するキナーゼまたはホスファターゼ、およびTORC制御経路に関与するポリペプチドを含む。
本発明によるTORCポリヌクレオチドは、siRNAポリヌクレオチドを含む。そのようなTORC siRNAは、TORCポリヌクレオチド配列を用いて、例えば、無細胞系でTORCリボポリヌクレオチド配列をプロセッシングすることによって、リコンビナント二本鎖TORC RNAの転写によって、または、TORC配列に類似したヌクレオチド配列の化学合成によって入手できる。例えば、全体を引用により本明細書の一部とした、Tuschl, Zamore, Lehmann, Bartel and Sharp (1999), Genes & Dev. 13: 3191-3197を参照のこと。
最も効率的なサイレンシングは、一般に、3’に2ヌクレオチド突出を有する方法で対合した、21ヌクレオチドセンス鎖および21ヌクレオチドアンチセンス鎖からなるsiRNA二本鎖で観察される。3’の2ヌクレオチド突出配列は、さらに、siRNAの標的認識の特異性に対しても若干の貢献をしている。特異性への貢献は、最初の対合した塩基に隣接した対合していないヌクレオチドに局在している。１つの態様では、3’突出のヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。別の態様では、3’突出のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。
siRNAを作製するために、本発明の意図されるリコンビナント発現ベクターは、両方の鎖の発現を可能にするような方法で、TORC配列の側面に操作的結合した制御配列を含む発現ベクターの中に、クローン化したTORC DNA分子を含む。センスおよびアンチセンスRNA鎖は、RNAの切断によってTORC遺伝子をサイレンシングするsiRNA構築体を作製するために、インビボでハイブリダイズし得る。あるいは、２つの構築体を、siRNA構築体のセンスおよびアンチセンス鎖を作り出すために利用できる。最後に、クローン化DNAは、二次構造を有する構築体をコードすることができ、ここで、単一の転写物は、１個または複数の標的遺伝子からのセンスおよび相補的アンチセンス配列の両方を有する。この態様の例では、ヘアピンRNAi産物は、標的遺伝子のすべてまたは一部に類似している。他の例では、ヘアピンRNAi産物はsiRNAである。TORC配列の側面にある制御配列は、発現が独立に、または時間的もしくは空間的な方法で調節され得るように、同一か、または異なっていてもよい。
特定の態様では、TORC遺伝子鋳型を、例えば、小核RNA(snRNA)U6またはヒトRNase P RNA H1からの、RNA pol III 転写ユニットを含むベクター内にクローニングすることによって、siRNAが細胞内で転写される。ベクター系の１つの例は、GeneSuppres-sor(登録商標) RNA Interference kit (Imgenexから市販されている)である。U6およびH1プロモーターは、Pol IIIプロモーターのIII型クラスのメンバーである。
siRNAベクターは、長期にわたるmRNA阻害を提供する利点を有する。対照的に、外来合成siRNAをトランスフェクションした細胞は、典型的に、７日以内または細胞分裂が１０回以内でmRNA抑制から回復する。siRNA発現ベクターの長期にわたる遺伝子サイレンシング能力は、遺伝子治療への適用を提供し得る。
一般に、siRNAはDICERと呼ばれるATP依存性リボヌクレアーゼにより、より長いdsRNAから消化される。DICERは、二本鎖RNA特異的エンドヌクレアーゼであるRNase IIIファミリーのメンバーである。siRNAは細胞内たんぱく質と共に、エンドヌクレアーゼ複合体に集まる。ショウジョウバエでのインビトロの研究は、siRNA/たんぱく質複合体(siRNP)が、DICERとは異なったエンドリボヌクレアーゼを含む、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)と呼ばれる、第２の酵素複合体に移されることを示している。RISCは、相補的な配列のmRNAを発見し破壊するのに、アンチセンスsiRNA鎖によってコードされた配列を使用する。よって、siRNAはガイドとして働き、リボヌクレアーゼが２本のsiRNAの１本に相補的なmRNAだけを裂くように制限する。
siRNAによって標的とされるTORC mRNA領域は、一般に、出発コドンから50から100ヌクレオチド下流にある望むTORC配列から選択される。あるいは、5’または3’UTRおよびスタートコドン近くの領域が、制御たんぱく質結合部位が豊富であり得るために、一般には避けられるが、使用できる。UTP結合たんぱく質および/または翻訳開始複合体は、siRNPまたはRISCエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害し得る。Elbashir et al. 2001 EMBO J. 20(23):6877-88を参照のこと。望む遺伝子を標的とするとき、SNP、多型、アレル変異体または種特異的変異を受け入れるように考慮すべきである。
TORC siRNAを含む実験は、適当なネガティブコントロールを含む。典型的には、TORC siRNAのヌクレオチド配列をランダムに混ぜ合わせ、それが他のどの遺伝子とも相同性を欠いていることを確かめるために相同性検索を行う。
本発明の独創的な治療法は、異常なTORC発現または活性を補うために、治療としてTORC siRNA構築体を投与することを意図する。上述した通り、TORCリボポリヌクレオチドを入手し、siRNA断片に加工するか、またはTORC siRNAを合成する。上述した通り、TORC siRNAは、既知の核酸トランスフェクション技術を用いて細胞または組織に投与する。TORC遺伝子に特異的なTORC siRNAは、TORC転写産物を減少させるか、またはノックダウンすることによって、TORCポリペプチド産生を減少させ、細胞または組織内のTORCポリペプチド活性を減少させるという結果になる。
本発明はまた、分解のためにたんぱく質のmRNA(たんぱく質をコードしたmRNA)を標的としたRNAi構築体を、個体に投与することを含む、対象における細胞のTORC関連またはCREB促進過程の異常なレベルに関連する疾患または病理的状態の発症を実質的に阻害する、処置する、または改善する方法を含む。特異的なRNAi構築体は、siRNAまたはsiRNAに加工される二本鎖遺伝子転写産物を含む。処置により、標的TORCたんぱく質の発現は阻害される。
リボザイム
本明細書で意図するポリヌクレオチドは、またリボザイム、すなわち、特異的なRNAの切断を触媒することによって遺伝発現を阻害するために使用し得る、酵素的なRNA分子であってよい。リボザイム反応の機構は、リボザイム分子の相補的標的RNAリボザイム分子への、配列特異的ハイブリダイゼーションと、次のエンドヌクレアーゼ的切断を含む。使用され得る例は、遺伝子配列、例えば、TORC1、TORC2、またはTORC3の遺伝子のエンドヌクレアーゼ的切断を特異的および効率的に触媒するように設計できる、改変した“ハンマーヘッド”または“ヘアピン”モチーフリボザイム分子を含む。リボザイムは、興味あるたんぱく質の特異的なヌクレオチド配列を認識し、切断するために設計することができる(Cech. J. Amer. Med Assn. 260:3030 (1988))。標的の遺伝子発現の阻害における使用のために、そのような分子を設計する技術は、本発明に関連した分野の当業者によく知られている。
リボザイム法は、細胞をリボザイムに曝すか、またはそのような小RNAリボザイム分子を細胞に発現させることを含む(Grassi and Marini, 1996, Annals of Medicine 28: 499-510; Gibson, 1996, Cancer and Metastasis Reviews 15: 287-299)。本明細書中に記載した、少なくとも１つの遺伝子に相当するmRNAを標的とするハンマーヘッドおよびヘアピンリボザイムの細胞内発現は、遺伝子によってコードされたたんぱく質を阻害するために使用できる。
リボザイムは、リボザイム配列を組み込んだRNAオリゴヌクレオチドの形態で細胞に直接送達するか、または望むリボザイムRNAをコードする発現ベクターとして細胞に導入する。リボザイムは、インビボで触媒的にmRNAを切断するのに効果的である、十分な数を日常的に発現することができ、それによって、細胞内のmRNA量を修飾できる(Cotten et al., 1989 EMBO J. 8:3861-3866)。
アプタマー
RNA存在量または活性を修飾するために、細胞にRNAアプタマーを導入し、発現させることができる。RNAアプタマーは、たんぱく質、例えばTatおよびRev RNA(Good et al., 1997, Gene Therapy 4: 45-54)に対する特異的なRNAリガンドであり、特異的にそれらの翻訳を阻害することができる。
三重らせんポリヌクレオチド
遺伝子発現の阻害は、“三重らせん”塩基対法を用いて達成することができる。三重らせん対形成は、それがポリメラーゼ、転写因子、または制御分子のために十分に開くための二重らせんの能力を阻害するために役立つ。三重鎖を使用した最近の治療上の進歩は、文献(Gee, J.E. et al. (1994) In: Huber, B.E. and B. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y.)に記載されている。これらの分子はまた、転写産物がリボソームに結合するのを妨げることによって、mRNAの翻訳を妨害するように設計してもよい。
本発明のアンチセンス分子、三重らせんDNA、RNAアプタマーおよびリボザイムを含むすべてのポリヌクレオチドは、核酸分子の合成に関して、当業者に既知の任意の方法で調製し得る。これらは、固相ホスホラミタイド(phosphoramidite)化学合成のような、化学的オリゴヌクレオチド合成技術を含む。あるいは、本明細書で記載した、ポリペプチドの遺伝子をコードしたDNA配列のインビトロおよびインビボ転写によって、RNA分子を産生し得る。そのようなDNA配列は、例えば、T7またはSP6のような適当なRNAポリメラーゼプロモーターを有する、様々なベクターに組み込み得る。あるいは、アンチセンスRNAを構成的または誘導的に合成するcDNA構築体を、細胞株、細胞または組織に組み込むことができる。
RNAの産生
TORCのセンスRNA(ssRNA)およびアンチセンスRNA(asRNA)は、RNA発現ベクターでの転写のような既知の方法を使用して生産する。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y. (2001)を参照のこと。21ヌクレオチドRNAのようなsiRNAは、Expedite RNA phosphoramidites and thymidine phosphoramidite (Proligo, Germany)を用いて化学的に合成する。合成オリゴヌクレオチドは、脱保護およびゲル精製し(Elbashir et al. (2001) Genes & Dev. 15, 188-200)、その後、Sep-Pak C18 カートリッジ(Waters, Milford, Mass., USA)精製(Tuschl et al. (1993) Biochemistry, 32:11658-11668)を行う。RNA一本鎖は、アニーリングバッファー(100 mM 酢酸カリウム、30 mM HEPES-KOH、pH 7.4、2 mM 酢酸マグネシウム)中で90℃で１分間、その後37℃で１時間インキュベートすることによってアニールさせる。
PNA部分
様々な態様では、ペプチド核酸を産生するためにTORC核酸を修飾することができる(Hyrup et al. (1996) Bioorg Med Chem 4: 5 23参照)。本明細書で使用するとき、“ペプチド核酸”または“PNA”は核酸模倣体、例えば、デオキシリボースフォスフェート骨格が擬ペプチド骨格に置換しており、４つの天然ヌクレオ塩基のみを保持している、DNA模倣体を言う。PNAの中性骨格は、低いイオン強度の条件下でDNAおよびRNAと特異的にハイブリダイズすることが示された。PNAオリゴマーの合成は、Hyrup et al. (1996) above; Perry O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670 675に記載された通りの、標準固相ペプチド合成プロトコールを用いて行うことができる。
TORCのPNAを、治療および診断適用に使用することができる。例えば、PNAを、例えば、転写または翻訳停止を誘導するかもしくは複製を阻害することによって、遺伝子発現の配列特異的調節のための、アンチセンスまたは抗遺伝子剤として使用することができる。TORCたんぱく質のPMAは、例えば、PNA指向PCRクランピングによる遺伝子の一塩基対突然変異の解析で、他の酵素、例えば、S1ヌクレアーゼ(Hyrup B. (1996)、上述)との組み合わせで使用されるときの人工的制限酵素として、またはDNA配列およびハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマー(Hyrup et al. (1996)、上述; Perry O'Keefe (1996)、上述)として、使用することができる。
ポリペプチド
本明細書で使用する“たんぱく質”、“ポリペプチド”、または“オリゴペプチド”という用語、およびこれらに基づいた類似語は、ペプチド結合でつながったαアミノ酸のポリマーに関する。αアミノ酸は、核酸、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドのトリプレットコドンによってコードされたものを含む。それらはまた、遺伝暗号によってコードされたものとは異なる側鎖を有するアミノ酸を含む。
本明細書で使用する本発明で開示したポリペプチドまたはたんぱく質の“成熟した”形態は、天然に存在するポリペプチドまたは前駆体型もしくは前たんぱく質の産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体型または前たんぱく質は、非限定的例として、相当する遺伝子によってコードされた、全長の遺伝子産物を含む。あるいは、本明細書中に記載の、オープンリーディングフレームによってコードされた、ポリペプチド、前駆体型または前たんぱく質として定義され得る。産物の“成熟した”形態は、同様に非限定的例として、遺伝子産物が生じる細胞または宿主細胞内で起こり得る通りの、１個またはそれ以上の天然に存在する加工段階の結果として生じる。ポリペプチドまたはたんぱく質を“成熟した形態”に導く、そのような加工段階の例は、オープンリーディングフレームの開始コドンにコードされている、N末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドもしくはリーダー配列のたんぱく質分解切断を含む。よって、残基１からNを有する(ここで、残基１はN末端メチオニンである)、前駆体ポリペプチドまたはたんぱく質から生じる成熟した形態は、N末端メチオニン除去後残っている残基2からNを有する。その他には、残基１からNを有する(ここで、残基１か残基らMまでのN末端シグナル配列は、切断される)、前駆体ポリペプチドまたはたんぱく質から生じる成熟した形態は、M+1から残りのN末端残基までの残基を有する。さらに、本明細書で使用するポリペプチドまたはたんぱく質の“成熟した”形態は、たんぱく質分解切断よりもむしろ、翻訳後修飾の段階から生じ得る。そのようなさらなる過程は、非限定的例として、グルコシル化、ミリストイル化またはリン酸化を含む。一般には、成熟したポリペプチドまたはたんぱく質は、これらの過程の一個のみもしくはそれらの任意の組み合わせから生じ得る。
本明細書中で使用する“アミノ酸”は、任意の、たんぱく質中で発見され天然に存在するαアミノ酸を指す。さらに、“アミノ酸”という用語は、天然に存在しないアミノ酸で、たんぱく質化学、生化学、および本発明に関する他の分野の当業者に既知のすべてのアミノ酸を指す。これらは、非限定的例として、サルコジン、ヒドロキシプロリン、ノルロイシン、アロイソロイシン、シクロヘキシルアラニン、フェニルグリシン、ホモシステイン、ジヒドロキシフェニルアラニン、オルニチン、シトルリン、天然に存在するLアミノ酸のD-アミノ酸アイソマー等を含む。さらにアミノ酸は、例えば側鎖を標識と結合することによって、修飾されまた誘導体化され得る。当業者に既知のすべてのアミノ酸は、本明細書で開示したポリペプチドの一部とする。
本明細書で使用するとき、“エピトープタグ付き”という用語は、“タグポリペプチド”に融合したTORCポリペプチドを含むキメラポリペプチドを言う。タグポリペプチドは、抗体を作ることができるエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、融合したポリペプチドの活性を妨害しないように十分短い。好ましくは、タグペプチドは、抗体が、実質的に他のエピトープと交差反応をしないように、かなり独特である。一般に、適当なタグペプチドは、少なくとも６アミノ酸残基、および通常は、約８および５０アミノ酸残基を有する(好ましくは、約１０から２０アミノ酸残基の間)。
本明細書中で使用する、“活性”または“活性化”という用語、および類似語は、未処置の、または、天然に存在するTORCの生物学的および/または免疫学的活性を保持する、ポリペプチドの形態を言い、ここで“生物学的な”活性とは、未処置の、または、天然に存在するTORCによって引き起こされる生物学的な機能のうち、未処置の、または、天然に存在するTORCが所有している、抗原エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力以外の機能を言う。そして、“免疫学的な”活性は、未処置の、または、天然に存在するTORCが所有している、抗原エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力を言う。
TORCたんぱく質およびポリペプチド
本発明のTORCたんぱく質は、配列が配列番号2、配列番号4、または配列番号6のいずれかで提供される、単離されたTORCたんぱく質を含む。本発明はまた、残基のいずれかが配列番号2、配列番号4、または配列番号6の相当する残基から変わり得るが、まだTORCたんぱく質様の活性および生理的機能を維持したたんぱく質をコードする、突然変異または変異体たんぱく質、もしくはその機能的断片を含む。例えば、本発明は上述した通り、変異体TORC核酸によってコードされたポリペプチドを含む。突然変異または変異体たんぱく質は、残基の20%までまたはそれ以上が変わり得る。
一般に、TORCたんぱく質様機能を保存しているTORCたんぱく質様変異体は、配列中の特定の位置の残基が他のアミノ酸に置換されているすべての変異体を含み、さらに、親たんぱく質の２残基間に１個または複数個の残基を挿入する可能性、および、親配列から１個またはそれ以上の残基を欠失する可能性を含む。すべてのアミノ酸置換、挿入または欠失は、本発明に包含される。好ましい状況では、置換は上述した通り、非必須置換かまたは保存的な置換である。さらに、本発明の範囲を限定するものではないが、突然変異体または変異体たんぱく質が１個またはそれ以上の置換を含み得るように、配列番号2、配列番号4、または配列番号6の任意の位置が置換されてよい。
本発明はまた、単離したTORCたんぱく質、および生物学的に活性なその部分、または誘導体、断片、アナログ、またはそのホモログを含む。また、抗TORC抗体を作製するために、免疫原として使用するのに適当なポリペプチド断片を提供する。ペプチドまたはオリゴペプチドのようなたんぱく質またはポリペプチドの断片は、長さが５アミノ酸残基であるかそれ以上であり、または６またはそれ以上、７またはそれ以上、８またはそれ以上、９またはそれ以上、１０またはそれ以上、１５またはそれ以上、２０またはそれ以上、２５またはそれ以上、３０またはそれ以上、５０またはそれ以上、１０またはそれ以上であり、全長配列より１残基短い長さまであってよい。１つの態様では、野生型TORCたんぱく質は、細胞または組織源から標準的なたんぱく質精製技術を使った適当な精製スキームによって、単離することができる。他の態様では、TORCたんぱく質は、リコンビナントDNA技術によって産生する。リコンビナント発現とは別に、TORCたんぱく質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を使って化学的に合成できる。たんぱく質およびポリペプチドの精製は、例えば、“Protein Purification, 3rd Ed.”, R. K. Scopes, Springer-Verlag, New York, 1994; “Protein Methods, 2nd Ed.,” D. M. Bollag, M. D. Rozycki, and S. J. Edelsterin, Wiley-Liss, New York, 1996;および“Guide to Protein Purification”, M. Deutscher, Academic Press, New York, 2001のようなテキストに記載されている。
TORCたんぱく質の生物学的に活性な部分は、TORCたんぱく質、例えば、配列番号2、配列番号4、または配列番号6で示されたアミノ酸配列で、全長のTORCたんぱく質よりは短いアミノ酸を含み、少なくとも１つのTORCたんぱく質活性を示すアミノ酸配列に、十分類似しているか、または由来するアミノ酸配列を含む。典型的には、生物学的に活性な部分は、少なくとも１つのTORCたんぱく質の活性を有するドメインまたはモチーフを含む。TORCたんぱく質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸であるポリペプチドである。
本発明のTORCたんぱく質の生物学的に活性な部分は、TORCファミリーたんぱく質の間で保存された、少なくとも１つの上記で同定したドメインを含み得る。さらに、たんぱく質の他の領域が欠失している、他の生物学的に活性な部分は、リコンビナント技術によって調製でき、未処置TORCたんぱく質の１またはそれ以上の機能的な活性を評価できる。
１つの態様では、TORCたんぱく質は、配列番号2、配列番号4、または配列番号6のいずれかで示されたアミノ酸配列を有する。他の態様では、TORCたんぱく質は、配列番号2、配列番号4、または配列番号6のいずれかに実質的に類似しており、配列番号2、配列番号4、または配列番号6のいずれかのたんぱく質の機能的な活性を保持するが、下記で詳細を記載するように、天然のアレル変異または突然変異誘発のためにアミノ酸配列が異なっている。従って、他の態様では、TORCたんぱく質は、配列番号2、配列番号4、または配列番号6のいずれかのアミノ酸配列に、少なくとも約４５％類似、およびより好ましくは約５５％またはそれ以上、６５％またはそれ以上、７０％またはそれ以上、７５％またはそれ以上、８０％またはそれ以上、８５％またはそれ以上、９０％またはそれ以上、９５％またはそれ以上、９８％またはそれ以上、９９％またはそれ以上類似しており、配列番号2、配列番号4、または配列番号6の配列を有する相当するポリペプチドのTORCたんぱく質の機能的活性を保持している。変異体ポリペプチド分子中で変化し得る特定のアミノ酸残基の非限定的例は、同種のまたは異種のポリペプチドとTORCXポリペプチドのアラインメントの結果として同定される。
キメラおよび融合たんぱく質
本発明はまた、TORCたんぱく質キメラまたは融合たんぱく質を提供する。本明細書中で使用するTORCたんぱく質“キメラたんぱく質”または“融合たんぱく質”は、非TORCポリペプチドに操作的に結合したTORCポリペプチドを含む。“TORCポリペプチド”は、TORCたんぱく質に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドを言い、一方、“非TORCポリペプチド”は、実質的にTORCたんぱく質に類似していないたんぱく質、例えばTORCたんぱく質とは異なり、同じまたは異なった生物種に由来するたんぱく質に相当する、アミノ酸配列を有するポリペプチドを言う。TORCたんぱく質を含む融合たんぱく質の中でTORCポリペプチドは、TORCたんぱく質のすべてまたは一部分に相当することができる。１つの態様では、TORCたんぱく質融合たんぱく質は、全長TORCたんぱく質またはTORCたんぱく質の少なくとも１つの生物学的な活性断片を含む。別の態様では、TORCたんぱく質融合たんぱく質は、それぞれが生物学的な活性を保持するTORCたんぱく質の、少なくとも２つの断片を含む。融合たんぱく質において“操作的に結合した”という用語は、TORCポリペプチドおよび非TORCポリペプチドが、お互いにインフレームで融合していることを示すことを意図する。非TORCポリペプチドは、TORCポリペプチドのN末端またはC末端で融合することができる。
別の態様では、融合たんぱく質は、TORCたんぱく質配列がGST(すなわち、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)配列のC末端に融合したGST-TORC融合たんぱく質である。そのような融合たんぱく質は、リコンビナントTORCたんぱく質の精製を促進することができる。さらなる融合の態様は、融合構築体の精製および検出のために役立つ、FLAG-タグ融合および蛍光たんぱく質融合を含む。
また別の態様では、融合たんぱく質は、N末端に異種のシグナル配列を含んだTORCたんぱく質である。例えば、天然のTORCたんぱく質シグナル配列を除去し、他のたんぱく質からのシグナル配列で置換することができる。ある宿主細胞(例えば、ほ乳類宿主細胞)では、TORCたんぱく質の発現および/または分泌は、異種シグナル配列の使用によって増やすことができる。
別の態様では、融合たんぱく質は、１個またはそれ以上のドメインを含んだTORCたんぱく質配列が免疫グロブリンたんぱく質ファミリーのメンバー由来の配列に融合する、TORCたんぱく質-免疫グロブリン融合たんぱく質である。本発明のTORCたんぱく質-免疫グロブリン融合たんぱく質は、細胞の表面上で、TORCたんぱく質リガンドおよびTORCたんぱく質間の相互作用を阻害し、その結果、インビボでのTORCたんぱく質仲介シグナル伝達を抑制するために、医薬組成物の中に組み込み、対象に投与することができる。
本発明のTORCたんぱく質キメラまたは融合たんぱく質は、標準的なリコンビナントDNA技術によって生み出すことができる。例えば、異なったポリペプチド配列をコードするDNA断片を、ライゲーションのための平滑または粘着末端、適当な末端を提供するための制限酵素消化、適当であれば結合末端の充填、望まない結合を避けるアルカリホスファターゼ処理、および酵素ライゲーションによる、慣用的な技術に従って、インフレームで一緒にライゲートする。別の態様では、融合遺伝子は、自動DNA合成機を含む慣用的な技術によって合成できる。あるいは、遺伝子断片のPCR増幅が、２つの連続した遺伝子断片間の相補的突出部(これはキメラ遺伝子配列を生み出すために、次にアニールし、再び増幅できる)を生じるアンカープライマーを用いて実行できる(例えば、Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (2003)参照)。さらに、融合部分(例えば、GSTポリペプチド)をすでにコードした多くの発現ベクターが市販されている。TORCたんぱく質をコードした核酸は、そのような発現ベクター内にクローン化され、その結果、融合部分をTORCたんぱく質にインフレームで結合することができる。
TORCのポリペプチドまたはTORCオリゴペプチドの“特異的な結合剤”は、特異的にTORCポリペプチドまたはオリゴペプチドに結合するが、他のポリペプチドおよびオリゴペプチドには弱くまたは全く結合しない、すべての物質である。非限定的例として、特異的結合剤は、抗体、TORCポリペプチドに対する特異的受容体、そのような抗体および受容体の結合ドメイン、アプタマー、インプリンティングポリマーなどを含む。
TORCアゴニストおよびアンタゴニスト
また、本発明は、TORCたんぱく質アゴニスト(模倣剤)もしくはTORCたんぱく質アンタゴニストとして機能する、TORCたんぱく質の断片または変異体を含む。TORCたんぱく質のアゴニストは、天然に存在するTORCたんぱく質の形態と、実質的に同じ、もしくは一部の生物学的活性を保持することができる。TORCたんぱく質のアンタゴニストは、例えば、競合的にTORCたんぱく質を含む細胞内シグナルカスケードの下流または上流のメンバーに結合することによって、天然に存在するTORCたんぱく質の形態の、１個またはそれ以上の活性を阻害することができる。
アゴニスト(模倣剤)またはアンタゴニストとして機能するTORCたんぱく質の変異体または断片は、TORCたんぱく質の突然変異体、例えば、切断突然変異体のコンビナトリアルライブラリーを、TORCたんぱく質のアゴニストまたはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることによって単離できる。１つの態様では、TORC変異体の多様なライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発によって作製することができ、多様な遺伝子ライブラリーでコードされている。TORC変異体の多様なライブラリーは、縮重した潜在的なTORC配列が、個々のポリペプチドとして発現できるか、あるいは、その中にTORC配列を含んだ巨大な融合たんぱく質(例えば、ファージディスプレイのための)として発現できるように、例えば、酵素学的に合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列にライゲートすることによって、生み出すことができる。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動DNA合成機で行うことができ、次いで合成遺伝子を適当な発現ベクターにライゲートすることができる。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当業者に既知である(例えば、Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu Rev Biochem 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucl Acid Res 11:477参照)。
TORC遺伝子ファミリーが、高度に保存された重要な領域を含んでいるので、TORCたんぱく質のペプチド模倣剤は、TORC調節剤として作用することが予測される。模倣剤の態様は、実施例に開示している。そのようなペプチドは、TORC機能を妨害するTORCファミリーたんぱく質に由来するかまたはそこから設計される。これらの模倣剤は、すべての高度に関連したTORCたんぱく質の機能を妨害することが期待される。TORCたんぱく質に対する適当なペプチド模倣剤は、TORC活性のために必要とされる、ポリペプチド内の領域の理解に基づいた慣用的な方法によって作製可能である。簡潔には、野生型たんぱく質の欠失または突然変異体解析のような慣用的な構造-機能研究、およびマルチシークエンスアラインメントによって、短いアミノ酸配列がたんぱく質内で同定される。ペプチド模倣剤のアミノ酸配列は、この領域の全体または一部分とマッチするアミノ酸からなってもよい。そのようなアミノ酸は、元々のアミノ酸に似てはいるが、高い阻害活性、安定性、半減期または生物利用性のような薬理学的によりよい特性を与える、他の化学構造で置換することができる。
ポリペプチドライブラリー
加えて、TORCたんぱく質コード配列の断片のライブラリーは、TORCたんぱく質の変異体のスクリーニングおよび続く選択のための機能的断片の多様な集団を産生するのに使用できる。
点突然変異または切断によって作製したコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、および、選択特性を有する遺伝子産物のためにcDNAライブラリーをスクリーニングするいくつかの技術は、当業者に既知である。そのような技術は、TORCたんぱく質のコンビナトリアル突然変異誘発によって作製した遺伝子ライブラリーの、迅速なスクリーニングに適応できる。ライブラリーの機能的突然変異の頻度を高める再帰的集団突然変異誘発(REM)を、TORC変異体を単離するスクリーニングアッセイと組み合わせて使用することができる(Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811 7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6:327 331)。
抗TORC抗体
本明細書で使用する“抗体”という用語は、免疫グロブリン分子および抗原に特異的に結合する(抗原と免疫的に反応する)抗原結合サイトを含む免疫グロブリン(Ig)分子の、免疫学的に活性な部分を言う。そのような抗体は、これに限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Fab、Fab’およびF(ab')2断片、ならびにFab発現ライブラリーを含む。一般にヒトから入手する抗体分子は、分子内に存在する重鎖の性質により互いに異なるIgG、IgM、IgA、IgEおよびIgDのいずれかのクラスに関する。あるクラスは、同様にIgG1、IgG2などのようなサブクラスを有する。さらにヒトでは、軽鎖はκ鎖またはλ鎖であってよい。本明細書に記載した抗体についての引用は、すべてのそのようなクラス、サブクラス、およびヒト抗体のクラスに対する引用を含んでいる。本明細書中で開示したすべての抗体は、同起源の抗原に“免疫特異的に”結合する。免疫特異的な結合は、特定の免疫原で宿主を攻撃することによって作られた抗体が、高い親和性で免疫原性を含む抗原のような分子には結合するが、非免疫原含有分子には弱い親和性でしか結合しないか、全く結合しないことを意味する。この定義で使用する、高親和性は、約1 x 10-6 M以下の解離定数を有することを意味し、低親和性は、約1 x 10-6 M以上の解離定数を有することを意味する。
抗原として使用することを意図した本発明の単離したたんぱく質、またはその部分もしくは断片は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製の標準的な技術を用いて、免疫特異的に抗原に結合する抗体を作製するための、免疫原として使用することができる。全長たんぱく質を使用でき、あるいは、本発明は、免疫原として使用するために、抗原の抗原性ペプチド断片を提供する。抗原性ペプチド断片は、全長たんぱく質のアミノ酸配列、例えば、配列番号2、配列番号4、または配列番号6で示されたアミノ酸配列の、少なくとも６アミノ酸残基を含み、ペプチドに対して作られた抗体が、エピトープを含む全長たんぱく質または何らかの断片と特異的な免疫複合体を形成するために、そのエピトープを包含する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも１５アミノ酸残基、少なくとも２０アミノ酸残基、少なくとも３０アミノ酸残基を含む。好ましくは、抗原性ペプチドに包含されるエピトープは、一般に、親水的な領域である表面に位置したたんぱく質の領域である。
当業者に既知の様々な技術を、本発明のたんぱく質に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体、または誘導体、断片、アナログ、ホモログ、もしくはそのオーソログを産生するのに使用してよい(例えば、引用により本明細書に包含するAntibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY参照)。これらの抗体のいくつかは、下記に論じる。
１. ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体を産生するために、様々な適当な宿主細胞(例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、または他のほ乳動物)を、天然たんぱく質、その合成変異体、または前述の誘導体を１回またはそれ以上の注射で免疫してよい。適当な免疫原性調製物は、例えば、天然に存在する免疫原性たんぱく質、免疫原性たんぱく質を表す化学的合成ポリペプチド、または、リコンビナント発現免疫原性たんぱく質を含むことができる。さらに、たんぱく質は、免疫されるほ乳動物に免疫原性があることが知られている、第２のたんぱく質に接合してもよい。そのような免疫原性たんぱく質の例は、これに限定するものではないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、および大豆トリプシン阻害剤を含む。
免疫原性たんぱく質に対するポリクローナル抗体分子は、ほ乳動物(例えば、血液から)から単離でき、さらに、第１に免疫血清のIgG画分を提供する、プロテインAまたはプロテインGを用いた親和性クロマトグラフィーのような既知の技術によって精製される。免疫グロブリンの精製は、例えば、D. Wilkinsonにより論じられている(The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28)。
２. モノクローナル抗体
“モノクローナル抗体(MAb)”または“モノクローナル抗体構成物”は、本明細書で使用するとき、固有の軽鎖遺伝子産物および固有の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の分子種１種のみを含む、抗体分子の集団を言う。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域(CDR)は、集団内のすべての分子で同一である。よって、MAbは、それに対する固有の結合親和性によって特徴づけられる、抗原の特定のエピトープと免疫反応ができる、抗原結合サイトを含む。
モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)によって記載された、ハイブリドーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター、または他の適当な宿主動物を、典型的には、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するまたは産生することができるリンパ球を誘導するために、免疫剤で免疫する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫できる。次いで、ハイブリドーマ細胞を形成するために、適当な融合剤、例えば、ポリエチレングリコールを用いて、リンパ球を不死化した細胞株と融合する[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]。不死化した細胞株は、通常、形質転換したほ乳類細胞、特に齧歯類、ウシおよびヒト起源のミエローマ細胞である。好ましくは、不死化した細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定的に高い発現レベルを支持し、HAT培地のような培地に感受性がある細胞である。より好ましくは、不死化した細胞株は、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California and the American Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから入手できるマウスミエローマ細胞株である。ヒトミエローマおよびマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株は、またヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている(Kozbor: J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al.: Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63)。次いで、ハイブリドーマ細胞が培養されている培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体が存在しているかを調べるために解析することができる。望むハイブリドーマ細胞を単離後、クローンを限界希釈法によりサブクローン化し、標準的な方法によって育てる(Goding、1986)。この目的のための適当な培養培地は、例えば、ダルベッコ修飾イーグル培地およびRPMI-1640培地を含む。その他には、ハイブリドーマ細胞を、ほ乳類の腹水としてインビボで生育させ得る。
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、培養培地または腹水から、慣用的な免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテイン-A-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーにより、単離または精製することができる。
モノクローナル抗体は、またリコンビナントDNA法、例えば、米国特許第4816567号に記載された方法によって作製することができる。
３. ヒト化抗体
本発明のたんぱく質抗原に対する抗体は、さらにヒト化抗体またはヒト抗体を含む。これらの抗体は、投与した免疫グロブリンに対して、ヒトによる免疫応答を引き起こすことなくヒトに投与するのに適当である。抗体のヒト化形態は、主にはヒト免疫グロブリンの配列からなり、非ヒト免疫グロブリンからの最小限の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片(例えば、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2または、抗体の他の抗原結合配列)である。ヒト化は、齧歯類CDRまたはCDR配列をヒト抗体の相当する配列に置換することによる、Winterおよび共同研究者の方法(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))の方法に従って、行うことができる。(米国特許第5225539号もまた参照)。ヒト化抗体は、最適には、また免疫グロブリン定常部(Fc)の少なくとも一部を含み、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれを含む(Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988;およびPresta (1992) Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596)。
４. ヒト抗体
完全なヒト抗体は、本質的に、CDRを含む軽鎖および重鎖両方の全体の配列がヒト遺伝子から生じている、抗体分子に関する。そのような抗体を、本明細書中では、“ヒト抗体”または“完全なヒト抗体”と呼ぶ。ヒトモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体を産生するトリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor, et al. (1983) Immunol Today 4: 72参照)、およびEBVハイブリドーマ技術(Cole, et al. (1985) In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96参照)によって調製できる。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施に際して利用してもよいし、ヒトハイブリドーマを使用するか(Cote, et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026 2030を見よ)、または、ヒトB細胞をインビトロでエプスタインバー・ウイルスによって形質転換することで、産生してもよい(Cole, et al. (1985) In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77 96参照)。
さらにヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含むさらなる技術を用いて産生することができる(Hoogenboom and Winter (1991) J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222:581)。同様にヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座をトランスジェニック動物、例えば、内在性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化しているマウスに、導入することによって作製される。攻撃により、遺伝子再配置、集合および抗体レパートリーを含むすべての点で、ヒトで見られるのに似ているヒト抗体産生が観察される。この方法は、例えば、米国特許第5545807号; 5545806号; 5569825号; 5625126号; 5633425号; 5661016号、および Marks et al. (1992) (Bio/Technology 10, 779-783); Lonberg et al. ((1994)Nature 368 856-859); Morrison ((1994) Nature 368, 812-13); Fishwild et al、( (1996) Nature Biotechnology 14, 845-51); Neuberger ((1996) Nature Biotechnology 14, 826); and Lonberg and Huszar ((1995) Intern. Rev. Immunol. 13 65-93)に記載されている。興味のある抗体、例えばヒト抗体を産生する方法は、また米国特許第5916771号に開示してある。
ヒト抗体はさらに、抗原に対する応答で、動物の内在性の抗体よりもむしろ十分なヒト抗体を産生するように修飾された、トランスジェニック非ヒト動物を用いて産生してもよい(国際公開第WO94/02602号参照)。非ヒト宿主で、重および軽免疫グロブリン鎖をコードする内在性の遺伝子を機能しないようにし、ヒト重および軽鎖免疫グロブリンをコードする活性遺伝子座を宿主ゲノム中に挿入する。ヒト遺伝子は、例えば、必須なヒトDNA断片を含む酵母人工染色体を用いて組み込まれる。次いで、すべての望む修飾を提供する動物を、修飾体の完全より少ない相補体を含む中間的トランスジェニック動物を交雑することによって、子孫として取得する。
５. F ab 断片および一本鎖抗体
本発明に従って、本発明の抗原たんぱく質に特異的な一本鎖抗体の産生のために、技術を適応させることができる(例えば、米国特許番号第4946778号参照)。さらに、たんぱく質、または誘導体、断片、アナログもしくはそのホモログに対して、望む特異性を有するモノクローナルFab断片の単離を迅速かつ効率的にするための、Fab発現ライブラリーの構築(例えば、Huse, et al., 1989 Science 246: 1275 1281参照)のために、方法を適応させることができる。たんぱく質抗原に対するイディオタイプを含む抗体断片は、これに限定するものではないが、(i)抗体分子のペプシン消化によって産生したF(ab')2断片、(ii)F(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することによって産生したFab断片、(iii)パパインおよび還元剤を用いた抗体分子の処理によって産生したFab断片、(iv)Fv断片を含む、当業者に既知の技術によって産生し得る。
６. 二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なった抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくは、ヒトまたはヒト化抗体である。本件においては、結合特異性の１つは、本発明の抗原たんぱく質である。２つ目の結合標的は、任意の他の抗原であり、有利には、細胞表面たんぱく質または受容体もしくは受容体サブユニットである。
二重特異性抗体を作製する方法は、当業者に既知である。古典的には、二重特異性抗体のリコンビナント産生は、２つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対(ここで２つの重鎖は、異なった特異性を有する)の共発現に基づく(Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の無作為な組み合わせのために、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は、10個の異なった抗体分子の潜在的な混合物を産生する可能性があり、その中の１個だけが正しい二重特異性抗体を有する。正しい分子の精製は、通常、親和性クロマトグラフィーステップで行う。類似の手順は、1993年5月13日公開のWO 93/08829およびTraunecker et al. (1991) EMBO J., 10:3655-3659に開示されている。二重特異性抗体産生のさらなる詳細のために、例えば、Suresh et al. (1986) Methods in Enzymology, 121:210を参照のこと。
７. 免疫抱合体
本発明は、また、化学療法剤、毒素(例えば、細菌、微生物、植物、または動物起源の酵素学的に活性な毒素、もしくはその断片)、または放射性同位体(すなわち放射能抱合体)のような細胞毒性剤に複合した抗体からなる、免疫複合体を含む。
そのような免疫複合体の産生で役立つ化学療法剤は、上述している。使用可能な酵素学的に活性な毒素およびその断片は、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A鎖(緑膿菌由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、アルライト・フォルディ(Aleurites fordii)たんぱく質、ジアンシン(dianthin)たんぱく質、フィトラカ・アメリカナ(Phytolaca americana)たんぱく質(PAPI、PAPIIおよびPAP S)、モモルディカ・チャランティア(momordica charantia)阻害剤、カーシン(curcin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、ウレストリクトシン(Urestrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)、およびトリコセシン(tricothecenes)を含む。さまざまな放射性核種を、放射能複合体の産生のために利用できる。例は、212Bi、131I、131In、90Y、および186Reを含んでいる。
抗体および細胞毒性の抱合体は、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオール)プロピオネート(SPDP)、イミノチオレン(IT)イミドエステルの二機能性誘導体(例えば、ジメチル アジピミデイト(adipimidate) HCL)、活性化エステル(例えば、ジスクシンイミジル スベリン酸塩)、アルデヒド(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えば、ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン(tolyene)2,6-ジイソシアネート)、およびビス-活性化フッ素 化合物 (例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)のような、様々な二機能性たんぱく質結合剤を用いて作られる。例えば、免疫毒性は、Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)に記載された通り、調製することができる。炭素-14-標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレン トリアミンペンタ酢酸(MX-DTPA)は、抗体へ放射性ヌクレオチドを複合させるための、典型的なキレート剤である。WO94/11026参照。
８. TORCたんぱく質に対する抗体の診断適用
本発明のたんぱく質に対する抗体は、たんぱく質の局在および/または定量に関して、当業者に既知の方法で使用され得る(例えば、適当な生理的試料内のたんぱく質レベルを測定するための使用、診断法での使用、たんぱく質の造影での使用など)。抗TORC抗体は、試料中のTORCたんぱく質抗原を検出または定量するために使用し得る。多くのそのような態様では、抗体を免疫吸着アッセイで使用する。
本発明のたんぱく質に特異的な抗体は、標準的な技術、例えば、免疫親和性クロマトグラフィーまたは免疫沈降によって、たんぱく質を単離するのに使用できる。そのような抗体は、細胞からの天然のたんぱく質抗原および宿主細胞でリコンビナントに発現させて産生した抗原の精製を促進できる。検出は、抗体を検出物質とカップリング(すなわち、物理的結合)させることによって促進できる。検出物質の例は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質を含む。適当な酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含み、適当な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンを含み、適当な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオルセイン、フルオルセインイソチアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオルセイン、ダンジルクロライドまたはフィコエリスリンを含み、発光物質の例は、ルミノールを含み、生物発光物質は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含み、適当な放射性物質は、125I、131I、35Sまたは3Hを含む。
９. 抗体の医薬組成物
本発明のたんぱく質および本明細書中に開示したスクリーニング法によって単離した他の分子に特異的に結合する抗体を、医薬組成物の形態で様々な疾患の処置のために投与することができる。そのような組成物の調製に関する原理および考察、ならびに成分選択の手引きは、例えば、Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa. : 1995; Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994;およびPeptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New Yorkに提供される。
活性成分をまた、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により製造されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、ミクロスフェアアルブミン、マイクロエマルジョン、ナノパーティクル、およびナノカプセル)にまたはマクロエマルジョンに取り込むことができる。
１０. 抗体治療
ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化および完全ヒト抗体を含む本発明の抗体は、治療剤として使用し得る。そのような薬剤は、一般に、対象の疾患または病理の処置または予防に使用する。抗体調製物、好ましくは、標的抗原に対して、高い特異性と高い親和性を有する抗体調製物を対象に投与し、一般に、その標的との結合によって効果を示す。そのような効果は、ある抗体分子と問題の標的抗原の間の、特異的な性質の相互作用に依存して、２種類のうちの１つであり得る。最初の例では、抗体の投与は、標的が天然で結合する内在性リガンドと標的との結合をなくすか、または阻害し得る。この場合、抗体は標的に結合し、天然に存在するリガンドの結合サイトを隠す(ここでは、リガンドはエフェクター分子の役割を果たす)。故に、受容体は、そのリガンドが責任を負うシグナル伝達を仲介する。
あるいは、効果は、抗体が標的分子のエフェクター結合サイトに結合することによって、生理的な結果を誘導するものであり得る。この場合、内在性のリガンドを有するが、疾患または病理の為、無くなるかもしくは欠損し得るリガンドを有する受容体である標的が、代理のエフェクターリガンドとして抗体に結合し、受容体による受容体に基づいたシグナル伝達を開始する。
投与すべき量は、さらに、特異的抗原への抗体の結合親和性に依存しており、また投与した抗体が、それを投与した自由な大きさの他の対象からなくなる速度に依存する。本発明の抗体または抗体断片の治療上有効量の通常の範囲は、非限定的例として、体重約0.1 mg/kgから約50 mg/kgであり得る。通常の投与頻度は、例えば、１日２回から１週間に１回の範囲であり得る。
TORCリコンビナントベクターおよび宿主細胞
本発明の他の局面は、TORCたんぱく質、または誘導体、断片、アナログまたはそのホモログをコードした核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターを含む。明細書中で使用するとき、“ベクター”という用語は、それが結合した他の核酸を運搬することができる、核酸分子を言う。１つの型のベクターは、環状二本鎖DNAループで、その中にさらなるDNA断片をライゲートすることができる、“プラスミド”である。他の型のベクターは、さらなるDNA断片をウイルスゲノム中にライゲートすることができる、ウイルスベクターである。あるベクターは、それらが導入された宿主細胞内で自律的に複製することができる(例えば、細菌複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソームのほ乳類ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソームほ乳類ベクター)は、宿主細胞に導入すると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと共に複製する。さらには、あるベクターは、それらが操作的に結合した遺伝子の発現を導く。このようなベクターは本明細書で“発現ベクター”と呼ぶ。一般に、DNAリコンビナント技術における発現ベクターの利用は、しばしばプラスミドの形態である。本明細書中では、プラスミドが最も普通のベクターの使用形態であるため、“プラスミド”および“ベクター”は、置き換え可能に使用できる。しかしながら、本発明は、発現ベクターのそのような他の形態、例えば、同等な機能を有するウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス)を含むことを意図している。
本発明のリコンビナント発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に適した形態で、本発明の核酸を含み、これは、リコンビナント発現ベクターが、発現のために用いられる宿主細胞に基づいて選択された、発現させる核酸配列に操作的に結合させた１個またはそれ以上の制御配列を含むことを意味する。リコンビナント発現ベクターの中で、“操作的に結合した”は、興味のあるヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方法で(例えば、インビトロ転写/翻訳系でまたはベクターが宿主細胞に導入されたとき宿主細胞で)、制御配列に結合することを意味することを意図する。“制御配列”という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むことを意図する。そのような制御配列は、例えば、Goeddel (1990) GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Califに記載されている。制御配列は、多くの宿主細胞型でヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの、および、ある宿主細胞でのみヌクレオチド配列の発現を誘導するものを含む(例えば、組織特異的な制御配列)。発現ベクターの設計は、形質転換する宿主細胞の選択、望むたんぱく質の発現レベルなどのような因子に依存していることを、当業者は理解している。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入し、それによって、本明細書に記載の核酸によってコードされた融合たんぱく質またはペプチドを含むたんぱく質またはペプチド(例えば、TORCたんぱく質、TORCたんぱく質の突然変異型、融合たんぱく質など)を産生することができる。
本発明のリコンビナント発現ベクターは、原核または真核細胞でのTORCたんぱく質の発現のために設計することができる。例えば、TORCたんぱく質は、大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを用いて)、酵母細胞またはほ乳類細胞で発現することができる。適当な宿主細胞は、さらに、Goeddel (1990)で論じられている。あるいは、リコンビナント発現ベクターは、例えば、T7プロモーター制御配列およびT7ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳することができる。
プロモーター領域は、プロモーター領域を欠いたレポーター転写単位(例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(“CAT”)またはルシフェラーゼ(LUC)転写単位)を、候補プロモーター断片(すなわちプロモーターを含み得る断片)を導入する１箇所もしくは複数箇所の制限酵素サイトの下流に含むベクターを用いて、任意の望まれる遺伝子から選択することができる。例えば、プロモーター含有断片をベクターにCATまたはLUCの制限サイト上流で導入すると、それぞれ、標準的なCATまたはLUCアッセイによって検出できる、CATまたはLUC活性の産生を誘導する。この目的に適したベクターは、よく知られており、容易に利用できる。２つのそのようなベクターは、pKK232-8およびpCM7である。よって、本発明のポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターは、よく知られた容易に利用できるプロモーターだけでなく、また、レポーター遺伝子を使用して、先行技術により容易に取得し得るプロモーターを含む。
原核生物のたんぱく質の発現は、融合または非融合たんぱく質の発現を誘導する、構成的または誘導性プロモーターを含むベクターを用いて、大腸菌で最も頻繁に行われる。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適した、既知の細菌プロモーターには、大腸菌lacI およびlacZ プロモーター、T3およびT7 プロモーター、T5 tac プロモーター、lambda PR, PL プロモーターおよび trp プロモーターがある。融合ベクターは、多くのアミノ酸をその中でコードされているたんぱく質に付加する(通常は、リコンビナントたんぱく質のアミノ末端に)。そのような融合ベクターは、典型的には、３つの目的を果たす：(1)リコンビナントたんぱく質の発現を増やす、(2)リコンビナントたんぱく質の溶解性を増やす、および(3)アフィニティー精製でリガンドとして作用することで、リコンビナントたんぱく質の精製を助ける。しばしば、融合発現ベクターでは、たんぱく質分解サイトを、融合部分とリコンビナントたんぱく質の結合部に導入し、融合たんぱく質の精製に続き、リコンビナントたんぱく質を融合部分から分離することを可能にする。そのような酵素およびそれらの同種認識配列は、Xa因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合たんぱく質ベクターは、標的リコンビナントたんぱく質に、それぞれ、グルタチオン S トランスフェラーゼ (GST)、マルトース E 結合たんぱく質、またはたんぱく質 Aを融合した、pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson (1988) Gene 67:31 40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.)および pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.)を含む。
適当な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例は、pTrc (Amrann et al., (1988) Gene 69:301 315)およびpET 11d (Studier et al. (1990) GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. 60 89)を含む。
他の態様では、TORC発現ベクターは酵母発現ベクターである。出芽酵母の発現ベクターの例は、pYepSec1 (Baldari, et al., (1987) EMBO J 6:229 234)、pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933 943)、pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113 123)、pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)、およびpicZ (InVitrogen Corp、 San Diego, Calif.)を含む。
あるいは、TORCたんぱく質は、バキュロウイルス発現ベクターを用いた昆虫細胞で発現することができる。培養昆虫細胞でのたんぱく質発現のために利用できるバキュロウイルスベクターは、pAcシリーズ(Smith et al. (1983) Mol Cell Biol 3:2156 2165)およびpVLシリーズ(Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31 39)を含む。
まだ他の態様では、本発明の核酸を、ほ乳類発現ベクターを使用してほ乳類細胞で発現させる。ほ乳類発現ベクターの例は、pCDM8 (Seed (1987) Nature 329:840)およびpMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J 6: 187 195)を含む。ほ乳類細胞で使用するとき、発現ベクターの制御機能は、しばしばウイルス制御エレメントによって提供される。例えば、通常使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス、およびシアミンウイルス40由来である。他の真核プロモーターは、CMV再初期応答プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期SV40プロモーター、ラウス肉腫(“RSV”)のようなレトロウイルスLTRのプロモーター、ならびにマウスメタロチオネイン-Iプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターを含む。
原核および真核細胞の両方での他の適当な発現系のために、例えば、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001を参照のこと。
他の態様では、リコンビナントほ乳類発現ベクターは、好ましくは、特定の細胞型での核酸の発現を誘導することができる。非限定的例として、適当な組織特異的なプロモーターは、アルブミンプロモーター(肝臓特異的; Pinkert et al. (1987) Genes Dev 1:268 277)、リンパ球特異的プロモーター(Calame and Eaton (1988) Adv Immunol 43:235 275)、特にT細胞受容体のプロモーター(Winoto and Baltimore (1989) EMBO J 8:729 733)および免疫グロブリン(Banerji et al. (1983) Cell 33:729 740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741 748)、神経特異的プロモーター(例えば、神経繊維プロモーター; Byrne and Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473 5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlund et al. (1985) Science 230:912 916)、および乳腺特異的プロモーター(例えば、乳漿プロモーター;米国特許第4873316号および欧州出願公開第264166号)を含む。例えば、マウスhoxプロモーター(Kessel and Gruss (1990) Science 249:374 379)およびα-フェトたんぱく質プロモーター(Campes and Tilghman (1989) Genes Dev 3:537 546)のような、発生制御プロモーターもまた包含される。
本発明はさらに、本発明のDNA分子をアンチセンスの方向で発現ベクターにクローン化した、リコンビナント発現ベクターを提供する。すなわち、DNA分子は、TORC mRNAに対してアンチセンスであるRNA分子の発現を可能にする方法で(DNA分子の転写によって)、操作的に制御配列に結合させる。アンチセンス方向でクローン化した核酸に、操作的に結合した制御配列は、様々な細胞型でアンチセンスRNA分子の継続した発現を誘導する制御配列、例えば、ウイルスプロモーターおよび/またはエンハンサーか、もしくは、アンチセンスRNAの構成的、組織特異的または細胞特異的発現を誘導する制御配列から選択できる。アンチセンス遺伝子を使用した遺伝子発現の制御の議論に関しては、Weintraub et al., “Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis、” Reviews Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照のこと。
宿主細胞
本発明の他の局面は、本発明のリコンビナント発現ベクターを導入した宿主細胞を含む。“宿主細胞”および“リコンビナント宿主細胞”という用語は、本明細書中では、置き換え可能に使われる。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫も言うことは理解される。ある修飾が、突然変異または環境の影響により後生で起こるかもしれないので、実際は、そのような子孫は親細胞と同一ではない可能性があるが、まだ本明細書で使用するとき、用語の範囲内に含む。
宿主細胞は、全ての原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、TORCたんぱく質を、大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞、酵母またはほ乳類細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)またはCOS細胞)で発現することが可能である。他の適当な宿主細胞は、当業者に既知である。
さらに、挿入配列の発現を調節するか、または、望む特定の方法で遺伝子産物を修飾および処理する宿主細胞株を選び得る。そのようなたんぱく質産物の修飾(例えば、グリコシル化)および処理(例えば、開裂)は、たんぱく質の機能にとって重要であり得る。異なった宿主細胞は、たんぱく質の翻訳後プロセッシングおよび修飾のための、特徴的で特異的な機構を有する。適当な細胞株または宿主系を、発現した外来たんぱく質の正しい修飾およびプロセッシングを確実にするために、選ぶことができる。この目的のため、遺伝子産物の一次転写、グリコシル化およびリン酸化の適当なプロセッシングのための細胞内機構を有している、真核宿主細胞を使用してよい。そのようなほ乳類宿主細胞は、限定するものではないが、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、およびWI38を含む。
ベクターDNAを、慣用的な形質転換またはトランスフェクション技術によって、原核または真核細胞の中に導入することができる。本明細書で使用する“形質転換”および“トランスフェクション”という用語は、宿主細胞に外来核酸(例えば、DNA)を導入するための、当業者によって認識されている様々な技術を言うことを意図しており、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、DEAE-デキストラン仲介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適当な方法は、Sambrook, et al. (2001), Brent et al. (2003)および他の実験マニュアルで見つけることができる。
ほ乳類細胞の安定したトランスフェクションのために、安定した構成要素を同定し選択するために、選択マーカーをコードする遺伝子(例えば、抗生物質耐性)を、一般に、興味ある遺伝子と共に宿主細胞に導入する。様々な選択マーカーは、薬物、例えば、G418、ハイグロマイシン、およびメトトレキサートに対する耐性を与えるものを含む。
細胞培養
TORCを発現するための細胞培養を、標準的な培養条件を用いて増やす。トランスフェクションの24時間前におよそ80%の密集成長で、細胞をトリプシン処理し、抗生物質不含の新しい培地で1:5に希釈し(1-3 X 105細胞/ml)、24ウェルに移す(500 ml/ウェル)。トランスフェクションは、市販のリポフェクションキットまたはFuGENE6もしくはエレクトロポレーション、リン酸カルシウム粒子取り込み、または弾道粒子を用いて行い、TORC発現をポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを用いた標準的な技術によってモニターする。ポジティブコントロールは自然にTORCを発現する細胞であり、ネガティブコントロールはTORCを発現しない細胞である。
本発明の宿主細胞、例えば、培養中の原核または真核宿主細胞は、TORCたんぱく質を産生する(すなわち、発現する)ために使用することができる。したがって、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いてTORCたんぱく質を産生する方法を提供する。１つの態様では、方法は、本発明の宿主細胞(TORCたんぱく質をコードしたリコンビナント発現ベクターを、その中に導入してある)を、TORCたんぱく質を産生するのに適当な培養液で培養することを含む。他の態様では、方法はさらに、培養液または宿主細胞からTORCたんぱく質を単離することを含む。
トランスジェニック動物
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を産生するのに使用できる。例えば、１つの態様では、本発明の宿主細胞は、TORCたんぱく質コード配列が導入されている受精卵母細胞または胚性幹細胞である。そのような宿主細胞は、次いで、TORCたんぱく質配列がゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物、または内在性のTORCたんぱく質配列が変えられた相同リコンビナント動物を産生するのに使用できる。そのような動物は、TORCたんぱく質の機能および/または活性を研究するため、および、TORCたんぱく質活性のモジュレーターを単離および/または評価するために使用する。本明細書で使用する“トランスジェニック動物”は非ヒト動物であり、好ましくはほ乳類、より好ましくはラットまたはマウスのような齧歯類で、動物の細胞の１個またはそれ以上がトランスジーンを含む。トランスジェニック動物の他の例は、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などを含む。トランスジーンは、トランスジェニック動物が発生した細胞のゲノム中に組み込まれ、かつ成熟した成人のゲノム中に残り、そのため、トランスジェニック動物の１個またはそれ以上の細胞型または組織でコードした遺伝子の発現を誘導する外来性のDNAである。本明細書で使用する“相同リコンビナント動物”は、非ヒト動物であり、好ましくはほ乳類、より好ましくはマウスであり、ここで内在性のTORC遺伝子は、動物の発生前に内在性の遺伝子と動物細胞(例えば、動物の胚細胞)に導入された外来性のDNA分子間の相同リコンビナントによって変えられている。
本発明のトランスジェニック動物は、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって、TORCたんぱく質をコードした核酸を受精卵母細胞の雄性前核に導入し、卵母細胞が偽妊娠雌性里親動物(pseudopregnant female foster animal)になるのを可能にすることによって作製でき、特にマウスのような動物で、胚操作およびマイクロインジェクションによってトランスジェニック動物を作製する方法は、当業者には慣用的であり、例えば、米国特許第4736866号; 第4870009号; および第4873191号; ならびにHogan 1986, In: MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に、記載されている。その後、トランスジェニック樹立動物は、さらに、トランスジーンを有する動物と交雑するために使用できる。さらにTORCたんぱく質をコードしたトランスジーンをもつトランスジェニック動物は、他のトランスジーンをもつ動物と交雑できる。相同リコンビナントベクターの記述については、例えば、Thomas et al. (1987) Cell 51:503を参照のこと。ベクターを胚性幹細胞株に導入し(例えば、エレクトロポレーションによる)、その中で導入したTORCたんぱく質が、内在性のTORCたんぱく質遺伝子と相同的に組み換わった細胞を選択する(例えば、Li et al. (1992) Cell 69:915参照)。例えば、Bradley 1987, In: TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS: A PRACTICAL APPROACH, Robertson, ed. IRL, Oxford, pp. 113 152、および Bradley (1991) Curr Opin Biotechnol 2:823 829; PCT国際公開WO 90/1184号; WO 91/01140号; WO 92/0968号;および WO 93/04169号を参照のこと。
医薬組成物
本明細書中で開示した、異常なCRE依存的遺伝子発現またはケモカインの異常な活性化に関連する、病理的状態の予防、処置または改善のために役立つ医薬組成物を、治療上有効量で患者に投与することができる。治療上有効量とは、該状態の発症を実質的に阻害し、処置し、改善するのに十分な化合物量を言う。
１個またはそれ以上のさらなる治療剤と“組み合わせで”の投与は、一緒(同時)および任意の順序での連続した投与を含む。
本明細書中で使用する“担体”は、使用する投与量および濃度でそれに暴露される細胞、またはほ乳類に対して無毒である、薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。しばしば、生理学的に許容される担体は水性pH緩衝液である。生理学的に許容される担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸を含む、抗酸化剤；低分子ポリペプチド(約10残基以下)；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなたんぱく質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンのようなアミノ酸；単糖、二糖、および、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、他の炭化水素；EDTAのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；および/またはTWEENTM、ポリエチレングリコール(PEG)、およびPLURONICSTMのような非イオン界面活性剤を含む。
本発明のTORC核酸分子、TORCたんぱく質および抗TORCたんぱく質抗体、および誘導体、断片、アナログならびにそのホモログは、本明細書では、“活性化合物”または“治療薬”を指す。これらの治療薬は、対象への投与に適した医薬組成物の中に組み込むことができる。そのような組成物は、典型的には、核酸分子、たんぱく質、または抗体および薬学的に許容される担体を含む。
本明細書中で使用する“薬学的に許容される担体”は、医薬品投与に適合した、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含むことを意図する。適当な担体は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro AR (Ed.) 20th edition (2000) Williams & Wilkins PA, USA、およびWilson and Gisvold’s Textbook of Organic Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, by Delgado and Remers, Lippincott-Ravenのようなテキストに記載されており、引用により本明細書の一部とする。そのような担体または希釈剤で使用し得る、成分の好ましい例は、限定するものではないが、水、生理食塩水、リン酸塩、炭酸塩、アミノ酸溶液、リンガー溶液、デキストロース溶液、および5%ヒト血清アルブミンを含む。リポソームおよび固定油のような非水性媒体も、また使用し得る。
本発明の医薬組成物は、その意図した投与経路に適合するように製剤する。投与経路の例は、非経腸、例えば、静脈、皮内、皮下、経口(例えば、吸入)、経皮(局所)、経粘膜、および直腸投与を含む。非経腸、皮内、または皮下投与のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：注射水のような滅菌希釈剤、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸のようなキレート剤、酢酸、クエン酸、またはリン酸のような緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張性を調節する薬剤。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いて、調節できる。非経腸製剤は、ガラスまたはプラスチックで作られた、アンプル、使い捨て注射器、または複数回用量のバイアルに封入できる。
吸入による投与のために、例えば、二酸化炭素のようなガスのような適当な高圧ガスを含む、加圧容器またはディスペンサーからのエアロゾルスプレーまたはネブライザーの形態で、送達される。
全身投与は、また、経粘膜的または経皮的な方法で行うことができる。経粘膜的または経皮的な投与のためには、浸透すべき障壁に適した浸透剤を製剤に用いる。そのような浸透剤は、一般に当業者に既知であり、例えば、経粘膜的投与のためには、界面活性剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜的投与は、鼻腔用スプレーまたは座薬の使用を通して達成できる。経皮的な投与のためには、活性化化合物は一般に、当業者に既知のものとして、軟膏、外用軟膏、ジェル、またはクリームに製剤する。
化合物は、また、座薬(例えば、カカオバターおよびグリセリドのような、慣用的な座薬基剤を用いて)、または、直腸送達のために保留浣腸剤(retention enema)の形態で製造できる。
徐放製剤を製造できる。徐放製剤の適当な例は、抗体を含む固相疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含む(このマトリクスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの成型品である)。徐放製剤マトリクスの例は、ポリエステル、ハイドロジェル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレイト)、またはポリ(ビニルアルコール)、ポリサッカライド(米国特許第3773919号)、L-グルタミン酸およびγエチル-L-グルタミン酸の共ポリマー、非分解性酢酸エチル-ビニル、LUPRCN DEPOT TMのような、分解性乳酸-グリコール酸共ポリマー(乳酸-グリコール酸共ポリマーおよび酢酸ロイプロイドから成る、注入可能なミクロスフェア)、および、ポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸を含む。酢酸エチレンビニルおよび乳酸グリコール酸のようなポリマーは、100日を超えて、分子を放出することができるが、あるハイドロジェルはそれより短い期間にわたり医薬活性剤を放出する。
徐放製剤のためのリコンビナントたんぱく質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン (rhGH)、インターフェロン-(rhIFN-)、インターロイキン-2、およびMN rgp120で行われて成功している。Johnson et al., Nat Med. 2:795-799(1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland, “Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems”, in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York. 1995), pp. 439-462; 国際公開WO 97/03692、国際公開 WO 96/40072、国際公開 WO 96/7399;および米国特許第5654010号。
本発明の核酸分子をベクター中に挿入して、遺伝子治療ベクターとして使用できる。遺伝子治療ベクターは、マイクロRNA (miRNA)、修飾miRNA、低分子干渉RNA (si RNA)、および修飾siRNAを含む、アンチセンスポリヌクレオチドおよび阻害ポリヌクレオチドを含む(ここで、本発明で記載したように、修飾は、少なくとも分子の安定性を与えるように導入される)。遺伝子治療の１つの態様では、TORC核酸は、対象中でTORCたんぱく質または断片もしくはそのキメラたんぱく質を発現する、発現ベクターの一部である。特に、そのような核酸はTORCコード領域に、操作的に結合したプロモーターを有し、該プロモーターは誘導性か、または構成的であり、所望により組織特異的である。他の特定の態様では、TORCコード配列および任意の他の望む配列が、ゲノム中の望むサイトでの相同組み換えを促進する領域の側面にある核酸分子を使用し、その結果、TORC核酸の染色体内の発現を提供する(Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438)。
遺伝子治療ベクターは、例えば、米国特許第5703055号のような任意の多くの経路によって、それを適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、そしてそれが細胞内に入るように投与することによって、対象に送達することができる(例えば、欠失または弱毒レトロウイルスもしくは他のウイルスベクターを用いた感染(例えば、米国特許第4980286号および下記のその他参照)により、または、裸DNAの直接のインジェクションにより、もしくは、微粒子銃(例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont)の使用により、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション用試薬での被覆により、リポソーム、微粒子もしくはマイクロカプセルでの被覆により、核にはいることが既知であるペプチドと結合させて投与することにより、受容体を介したエンドサイトーシスを受けるリガンドと結合させて投与することにより(例えば、米国特許第5166320号; 第5728399号; 第5874297号;および第6030954号参照。そのすべてを引用により本明細書の一部とする)(それは、受容体を特異的に発現している細胞型を標的とするのに用いることができる)など)。故に、送達はまた、例えば、静脈注射、局所投与(米国特許第5328470号参照)または定位注射(例えば、Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054 3057参照)を含む。遺伝治療ベクターの医薬製剤は、許容される賦形剤に遺伝子治療ベクターを含むことができ、または、遺伝子送達媒体が埋め込まれた、徐放性マトリクスを含むことができる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターを、例えば、レトロウイルスベクターのようなリコンビナント細胞から無傷で産生することができるとき、医薬製剤は、遺伝子送達系を産生する1個またはそれ以上の細胞を含むことができる。
他の態様では、レトロウイルスベクターを使用することができる(例えば、米国特許第5219740号; 第5604090号;および第5834182号参照)。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主DNA細胞への統合のために必要ではない、レトロウイルス配列を欠失するように修飾されている。遺伝子治療で使用されるTORC核酸は、患者への遺伝子の送達を促進するベクター中へクローン化した。
アデノウイルスは、遺伝子治療で使用できる他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、呼吸上皮に遺伝子を運ぶ、特に魅力的な媒体である。アデノウイルスは、自然に呼吸上皮に感染し、軽い疾患を引き起こす。アデノウイルスに基づく送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは、分裂しない細胞に感染できるという利点を有している。アデノウイルスに基づく遺伝子治療を行う方法は、例えば、米国特許第5824544号; 第5868040号; 第5871722号; 第5880102号; 第5882877号; 第5885808号; 第5932210号; 第5981225号; 第5994106号; 第5994132号; 第5994134号; 第6001557号;および第60338843号に記載されており、そのすべては、その全体を引用により本明細書の一部とする。
アデノ随伴ウイルスは(AAV)、また遺伝子治療における使用が提案されている。AAVの産生および利用法は、例えば、米国特許第5173414号; 第5252479号; 第5552311号; 第5658785号; 第5763416号; 第5773289号; 第5843742号; 第5869040号; 第5942496号;および第5948675号に記載されており、そのすべては、その全体を引用により本明細書の一部とする。
遺伝子治療の他の方法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション、またはウイルス感染のような方法によって、遺伝子を組織培養の細胞に移送することを含む。通常、移送の方法は、細胞への選択マーカーの移送を含む。次いで、移送遺伝子を取り込み、かつ発現している細胞を単離するために細胞を選択する。このような細胞を、その後、患者に送達する。好ましい態様では、遺伝子治療のために使用する細胞は、患者自己である。
本発明の医薬組成物の用量および望む薬物濃度は、計画される特定の使用に依存して変わり得る。適当な用量または投与経路の決定は、通常の医師の技術範囲内である。動物実験は、ヒト治療の有効量を決定するための、信頼できる手引きを提供する。有効量の種間スケーリングは、Mordenti, J. and Chappell, W. “The use of interspecies scaling in toxicokinetics” In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96によって、規定された原理に従って行うことができる。
TORCポリペプチドまたはこのアゴニストもしくはアンタゴニストを、インビボで投与するとき、常用量は投与経路に依存して、１日につき、約10 ng/ほ乳類の体重kgから100 mg/ほ乳類の体重kg まで、好ましくは、約1 .mu.g/kg/日から10 mg/kg/日である。特定の用量および送達方法に関する手引きは、文献に提供されている：例えば、米国特許第4657760; 第5206344号;または第5225212号を参照のこと。異なった製剤は、異なった処置化合物および異なった疾患のために有効であること、および、例えば、１つの器官または組織を標的にした投与は、他の器官または組織とは異なった方法での運搬を必要とし得ることが予期されている。化合物およびそれらの生理学的に許容される塩ならびに溶媒和物を、吸入または吹送による投与(口または鼻のいずれかを介する)、もしくは、局所、経口、口腔、非経口もしくは直腸投与のために製剤し得る。
経口投与のために医薬組成物は、例えば、薬学的に許容される賦形剤、例えば、結合剤(例えば、前ゼラチン化トウモロコシデンプン(pregelatinized maize starch)、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピル メチルセルロース); 増量剤(例えば、ラクトース、ミクロクリスタリンセルロースまたはリン酸水素カルシウム); 滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ); 崩壊剤(例えば、ポテトデンプンまたはグリコール酸デンプンナトリウム(sodium starch glycolate));または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)と共に、慣用的な手段によって製造できる、錠剤またはカプセルの形態をとり得る。錠剤は、当業者によく知られた方法で被覆し得る。経口投与用液体製剤は、例えば、溶液、ドライシロップ剤または懸濁液の形態をとり得、もしくは、使用前に、水または他の適当な媒体と構成するための乾燥産物として提供し得る。そのような液体製剤は、薬学的に許容される添加物、例えば、懸濁化剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用油); 乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア); 非水性媒体(例えば、アーモンド油、エステル油、エチルアルコールまたは分画化した植物油); および防腐剤(例えば、メチルまたはプロピル-p-ヒドロキシ安息香酸もしくはソルビン酸)と共に、慣用的な手段によって製造し得る。本製剤はまた、適当な緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤を含んでいてもよい。
経口投与のための製剤は、活性化合物の制御された放出を得るために適当に製剤してよい。
口腔投与のために組成物は、慣用的な方法で製剤した錠剤またはトローチの形態を取ってよい。
吸入による投与のためには、本発明に従って使用するための化合物は、適当な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適当なガスの使用と共に、加圧パックまたは噴霧器から押し出されるエアロゾルスプレーの形態で、便利に送達される。加圧エアロゾルの場合には、用量単位は、定量を送達するバルブを提供することによって、決定し得る。吸入器または吹き入れ器での使用のための、例えば、化合物およびラクトースまたはスターチのような適当な粉末基剤の粉末混合物を含むゼラチンのカプセルおよびカートリッジを製剤し得る。
化合物を、注射、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与のために製剤し得る。注射用製剤は、単位用量形、例えば、アンプルまたは複数回用量容器中に、添加した保存剤と共に、提供し得る。組成物は、懸濁液、油性もしくは水性媒体中の溶液またはエマルジョンの形態をとってもよく、懸濁化剤、安定化剤および/または分散剤のような製剤用の薬剤(formulatory agent)を含んでもよい。あるいは、活性成分は、使用前に適当な媒体、例えば、滅菌無発熱源水のような媒体と構成のために粉末状であってもよい。
化合物は、また、例えば、カカオバターおよび他のグリセリドのような、慣用的な座剤基剤を含む、座薬または保留浣腸剤のような、直腸組成物に製剤し得る。
先に記載した製剤に加えて、化合物はまた、デポ製剤として製剤し得る。そのような長期作用製剤は、移植(例えば、皮下または筋肉内)または筋肉注射により投与し得る。よって、例えば、化合物は、適当なポリマーまたは疎水性物質(例えば、許容される油中のエマルジョンとして)もしくはイオン交換樹脂、難溶性誘導体、例えば、難溶性塩と共に製剤し得る。
組成物は、望むならば、活性成分を含む1単位またはそれ以上の単位用量形を含む、容器、またはディスペンサー装置に提供し得る。容器は、例えば、金属またはブリスターパックのようなプラスチックホイルを含み得る。容器、またはディスペンサー装置は、投与の指示を伴い得る。
本発明の使用のために適当な医薬組成物は、活性成分が、意図する目的を達成するための有効量で含まれている、組成物を含む。有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
全ての化合物について、治療上有効量は、最初、例えば腫瘍細胞の細胞培養アッセイ、または通常はマウス、ウサギ、イヌ、もしくはブタである動物モデルにおいて概算できる。動物モデルはまた、適当な濃度範囲および投与経路を決定するのに使用し得る。用量は、IC50(すなわち、症状を最大の半分まで抑える試験化合物の濃度)を含む、循環している血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルで公式化し得る。そのような情報は、その後、ヒトでの投与のために有用な用量や投与経路を決定するのに使用することができる。
治療上有効量は、興味ある特定の病理的状態を、予防する、処置する、または改善するのに役立つ、活性成分の量を言う。治療上有効および毒性は、細胞培養または実験動物で、例えば、ED50(集団の50%で、治療上有効である用量)およびLD50(集団の50%で、致死的な用量)のような標準的な医薬手順によって決定し得る。毒性および治療効果の間の用量比は治療指数であり、比率LD50/ED50 として表すことができる。大きな治療指数を表す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から入手したデータは、ヒト使用のために用量の範囲を公式化するのに使用する。そのような組成物に含まれる用量は、好ましくは、毒性がほとんどないか、または全くない、ED50 を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、用いられる用量形態、患者の感受性、および投与経路に依存して、この範囲内で変わる。
正確な用量は、処置を必要とする対象に関する因子を考慮して、実施者によって決定される。用量および投与は、活性部分の十分なレベルを提供するか、または望む効果を維持するために調整する。考慮し得る因子は、疾患状態の重症度、対象の全体的な健康、年齢、体重、および対象の性、食事、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、および治療への耐性/応答を含む。長期作用医薬組成物は、特定の製剤の半減期および排泄速度に依存して、3から4日毎、1週間毎、または2週間毎に1回投与し得る。
通常の用量は、投与経路に依存して0.1から100,000マイクログラムないし総量約1 gまで変わり得る。特定の用量および送達方法に関する手引きは、文献で提供されており、一般に当分野の実施者に利用できる。当業者は、ヌクレオチドのためにたんぱく質またはそれらの阻害剤と異なった製剤を用いるであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、場所などに特異的である。たんぱく質の経口投与に適した医薬形成体は、例えば、米国特許第5008114号; 第5505962号; 第5641515号; 第5681811号; 第5700486号; 第5766633号; 第5792451号; 第5853748号; 第5972387号; 第5976569号;および第6051561号に記載している。
本発明のさらなる使用および方法
本明細書に記載の核酸分子、たんぱく質、たんぱく質ホモログ、および抗体は、下記方法の１個またはそれ以上で使用することができる：(a)スクリーニングアッセイ、(b)予測医学(例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、臨床試験のモニタリング、および薬理ゲノム学)、および(c)(例えば、治療および予防)処置法。
スクリーニングアッセイ
本発明は、TORCたんぱく質に結合するか、または、例えば、TORCたんぱく質発現もしくはTORCたんぱく質活性に対する刺激または阻害効果を有するモジュレーター、すなわち候補または試験化合物もしくは薬剤(例えば、たんぱく質、ポリペプチド、核酸またはポリヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣剤、アゴニストまたはアンタゴニストを含む小分子、または他の薬剤)を同定するための“スクリーニングアッセイ”を提供する。記載した全てのアッセイおよび薬理学、血液学、内科学、腫瘍学などの分野における当業者に既知の、さらなるアッセイは、治療薬としてのその特性に関して候補物質をスクリーニングするために使用し得る。記載の通り、本発明の治療薬は、たんぱく質、ポリペプチド、核酸またはポリヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣剤、アゴニストまたはアンタゴニストを含む小分子、または本明細書に記載の他の薬剤を含む。
１つの態様では、本発明は、TORCたんぱく質またはポリペプチドもしくはその生物学的に活性な部分に結合するか、またはその活性を調節する、候補または試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー；空間的接近可能固相または溶液相ライブラリー(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries)；デコンヴォルーションを必要とする合成ライブラリー法；1ビーズ1化合物ライブラリー法(“one bead one compound” library method)；および親和性クロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー法を含む当業者に既知のコンビナトリアルライブラリー法における多数の方法のいずれかを用いて取得することができる。生物学的ライブラリー法は、ペプチドライブラリーに限定され、一方、他の4つの方法は、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分子ライブラリーの化合物に適用できる(Lam (1997) Anticancer Drug Des 12:145)。
分子ライブラリーの合成法の例は、文献、例えば、DeWitt et al. (1993) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91:11422; Zuckermann et al. (1994) J Med Chem 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew Chem Int Ed Engl 33:2059; Carell et al. (1994) Angew Chem Int Ed Engl 33:2061; and Gallop et al. (1994) J Med Chem 37:1233に見ることができる。
化合物のライブラリーは、溶液中に(例えば、Houghten (1992) Biotechniques 13:412 421)、またはビーズ上に(Lam (1991) Nature 354:82 84)、チップ上に(Fodor (1993) Nature 364:555 556)、細菌に(Ladner U.S. Pat. No. 5、223、409)、胞子に(Ladner USP '409)、プラスミドに(Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865 1869)またはファージ上に(Scott and Smith (1990) Science 249:386 390; Devlin (1990) Science 249:404 406; Cwirla et al. (1990) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 87:6378 6382; Felici (1991) J Mol Biol 222:301 310; Ladner, 上記)提供し得る。
重要な態様では、細胞に基づいたアッセイは、異種のTORCポリヌクレオチドからタグ付きTORCたんぱく質を産生するトランスフェクションされた細胞を使用することを含む。候補活性剤の適用により、効率を試験することができ、標識されたTORCの細胞内分布を調べることによって評価される(実施例参照)。
他の態様では、アッセイは、細胞表面上にTORCたんぱく質の膜結合型、またはその生物学的に活性な部分を発現している細胞を試験化合物と接触させ、試験化合物がTORCたんぱく質に結合する能力を決定する細胞に基づいたアッセイである。例えば、細胞は、ほ乳類起源または酵母細胞である。試験化合物がTORCたんぱく質に結合する能力の決定は、例えば、TORCたんぱく質、またはその生物学的に活性な部分への試験化合物の結合を、複合体中の標識化合物を検出することによって決定し得るように、試験化合物を放射性同位体または酵素標識と結合させることにより達成できる。例えば、試験化合物は、125I、35S、14C、または3Hで、直接または間接的に標識することができ、そして、本放射性同位体は放射線放出の直接の計測か、またはシンチレーション計測によって検出される。あるいは、試験化合物は、例えば、酵素学的にホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、またはルシフェラーゼで標識することができ、そして、本酵素学的な標識は適当な基質の産物への変換を決定することにより検出する。
他の態様では、アッセイは、細胞表面上にTORCたんぱく質の膜結合型、またはその生物学的に活性な部分を発現している細胞を試験化合物と接触させ、試験化合物がTORCたんぱく質の活性、またはその生物学的に活性な部分を調節する(例えば、刺激するか、または阻害する)能力を決定することを含む、細胞に基づいたアッセイである。試験化合物がTORCたんぱく質の活性、またはその生物学的に活性な部分を調節する能力の決定は、例えば、TORCたんぱく質が、TORCたんぱく質標的分子と結合するかまたは相互作用する能力を決定することで達成できる。１つの態様では、TORCたんぱく質標的分子は、細胞膜を通るおよび細胞内への細胞外シグナル(例えば、化合物の膜結合TORCたんぱく質分子への結合により産生されるシグナル)の伝達を促進する、シグナル伝達経路の構成要素である。例えば、標的は、触媒活性を有する第二の細胞内たんぱく質、またはTORCたんぱく質とシグナル分子との結合を促進するたんぱく質である。
TORCたんぱく質が、TORCたんぱく質標的分子と結合するかまたは相互作用する能力の決定は、直接の結合の決定に関して上述した方法の１つによって達成できる。１つの態様では、TORCたんぱく質が、TORCたんぱく質標的分子と結合するかまたは相互作用する能力の決定は、標的分子の活性の決定によって、達成できる。例えば、標的分子の活性は、標的の細胞内セカンドメッセンジャー(すなわち細胞内Ca2+、ジアシルグリセロール、IP3など)の誘導を検出すること、標的の適当な基質に対する触媒/酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子(検出できるマーカー、例えば、ルシフェラーゼをコードしている核酸に、操作的に結合させた、TORC応答制御エレメントを含む)の誘導を検出すること、または、例えば、細胞生存、細胞分化、もしくは細胞増殖のような細胞応答を検出することによって決定できる。
また他の態様では、本発明のアッセイは、TORCたんぱく質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物に接触させ、試験化合物が、TORCたんぱく質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力を決定することを含む、無細胞系アッセイである。試験化合物のTORCたんぱく質への結合は、上述した通り、直接か、または間接的に決定することができる。１つの態様では、アッセイは、TORCたんぱく質またはその生物学的に活性な部分を、アッセイ複合体を形成するためにTORCたんぱく質に結合する既知化合物に接触させること、アッセイ複合体を試験化合物に接触させること、および試験化合物のTORCたんぱく質と相互作用する能力を決定することを含む(ここで、試験化合物のTORCたんぱく質と相互作用する能力を決定することは、試験化合物が既知の化合物と比較して、優先的にTORCたんぱく質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力を決定することを含む)。
他の態様では、アッセイは、TORCたんぱく質またはその生物学的に活性な部分を、試験化合物と接触させ、試験化合物がTORCたんぱく質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節する(例えば、刺激または阻害する)ことができるかを決定する、無細胞系アッセイである。TORCたんぱく質の活性を調節する試験化合物の能力を決定することは、例えば、直接の結合の決定に関して上述した方法の１つによって、TORCたんぱく質がTORCたんぱく質標的分子に結合する能力を決定することにより、達成できる。他の態様では、TORCたんぱく質の活性を調節する試験化合物の能力を決定することは、さらにTORCたんぱく質標的分子を調節する、TORCたんぱく質の能力を決定することによって達成できる。例えば、適当な基質に対する標的分子の触媒/酵素活性は、以前記載した通り決定することができる。
また他の態様では、無細胞系アッセイは、TORCたんぱく質またはその生物学的に活性な部分を、TORCたんぱく質に結合しアッセイ混合物を形成する既知の化合物と接触させ、アッセイ混合物を試験化合物と接触させ、そしてTORCたんぱく質と相互作用する試験化合物の能力を決定することを含み、ここで、TORCたんぱく質と相互作用する試験化合物の能力を決定することは、TORCたんぱく質が、優先的にTORCたんぱく質標的分子に結合するか、またはその活性を調節する能力を決定することを含む。
本発明の上記のアッセイ方法の態様の１つ以上では、TORCたんぱく質か、またはその標的分子を、一方または両方のたんぱく質の非複合体形態から複合体を分離するのを促進するため、および、アッセイの自動化に適応させるために、固定することが望まれる。試験化合物のTORCたんぱく質への結合か、または、候補化合物の存在および非存在下でのTORCたんぱく質の標的分子との相互作用は、反応物質を含むのに適した任意の容器で達成できる。そのような容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管を含む。１つの態様では、一方または両方のたんぱく質が、マトリックスに結合することを可能にするドメインを加える、融合たんぱく質を提供できる。
マトリックスにたんぱく質を固定する他の技術は、また、本発明のスクリーニングアッセイで使用できる。例えば、TORCたんぱく質またはその標的分子を、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して、固定できる。ビオチン化TORCたんぱく質または標的分子は、当業者によく知られた技術を用いて(例えば、ビオチン化キット, Pierce Chemicals, Rockford, Ill.)、ビオチン-NHS (N-ヒドロキシ-スクシンイミド)から調製でき、ストレプトアビジン被覆96ウェルプレートのウェルに固定できる(Pierce Chemical)。あるいは、TORCたんぱく質または標的分子と反応するが、TORCたんぱく質の標的分子への結合を妨害しない抗体を、プレートのウェルに誘導体化でき、非結合標的またはTORCたんぱく質を、抗体結合によりウェルに捕捉することができる。GST-固定複合体のために上述したものに加えて、そのような複合体を検出する方法は、TORCたんぱく質または標的分子と反応する抗体を用いた、および、TORCたんぱく質または標的分子と関連した酵素活性の検出に依存した酵素結合アッセイを用いた、複合体の免疫検出を含む。
他の局面では、CREB促進過程の調節剤を、細胞を候補化合物に接触させ、細胞内のTORC mRNAまたはたんぱく質の発現を決定する方法で同定する。候補化合物存在下でのTORC mRNAまたはたんぱく質の発現レベルは、候補化合物非存在下でのTORC mRNAまたはたんぱく質の発現レベルと比較する。候補化合物は、次いで、TORC発現の調節剤として、および/またはCREB促進過程の調節剤として同定できる。例えば、TORC mRNAまたはたんぱく質の発現レベルが、候補化合物の非存在下よりも存在下で大きいとき(統計的に有意に大きい)、候補化合物を、TORC mRNAまたはたんぱく質の発現の刺激剤として同定する。あるいは、TORC mRNAまたはたんぱく質の発現レベルが、候補化合物の非存在下よりも存在下で小さいとき(統計的に有意に小さい)、候補化合物を、TORC mRNAまたはたんぱく質の発現の阻害剤として同定する。細胞でのTORC mRNAまたはたんぱく質の発現のレベルは、CREB促進過程またはTORC mRNAもしくはたんぱく質の調節剤を検出するために、本明細書に記載した方法によって決定できる。
本発明のまた他の側面では、TORCたんぱく質に結合するか、または相互作用する他のたんぱく質(“TORCたんぱく質結合たんぱく質”または“TORCたんぱく質-bp”)、およびTORCたんぱく質活性を調節する他のたんぱく質を同定するために、TORCたんぱく質を、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイでの、“ベイトたんぱく質”として使用できる(例えば、米国特許第5283317号; Zervos et al. (1993) Cell 72:223 232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046 12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920 924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693 1696; and Brent WO 94/10300参照)。そのようなTORCたんぱく質結合たんぱく質は、また、例えば、TORCたんぱく質経路の上流または下流の要素として、TORCたんぱく質によるシグナルの伝達に関与している可能性がある。
ツーハイブリッドシステムは、分離可能なDNA結合および活性化ドメインからなる、ほとんどの転写因子のモジュラー特性に基づいている。簡潔には、アッセイは、２つの異なったDNA構築体を利用する。１つの構築体では、TORCたんぱく質をコードした遺伝子が、既知の転写因子(例えば、GAL 4)のDNA結合ドメインをコードした遺伝子に融合している。他の構築体では、同定されていないたんぱく質をコードする、DNA配列ライブラリーからのDNA配列が(“プレイ”または“試料”)、既知の転写因子の活性化ドメインをコードした遺伝子に融合している。“ベイト”および“プレイ”たんぱく質が、インビボでTORCたんぱく質依存性複合体を形成するように相互作用できるなら、転写因子のDNA結合および活性化ドメインは近接する。この近接により、転写因子に応答する転写制御サイトに操作的に結合した、レポーター遺伝子(例えば、LacZ)の転写を誘導する。レポーター遺伝子の発現を検出でき、機能的な転写因子を含んだ細胞コロニーを単離し、TORCたんぱく質と相互作用するたんぱく質をコードしたクローン遺伝子を取得するのに使用できる。
スクリーニングは、また、インビボで行うことができる。例えば、１つの態様では、本発明は、TORC関連疾患の増加した危険に対する試験動物に試験化合物を投与することによる、活性の調節剤、またはTORCたんぱく質関連疾患に対する潜在性もしくは素因の調節剤のスクリーニングを含む。ある態様では、試験動物は、リコンビナントにTORCポリペプチドを発現している。試験化合物投与後の試験動物でのポリペプチドの活性を測定し、試験動物におけるたんぱく質の活性を、該ポリペプチドを投与していないコントロール動物におけるポリペプチドの活性と比較する。コントロール動物と比較して該試験動物における該ポリペプチドの活性の変化は、化合物が、TORC関連疾患に対する、潜在性または素因の調節剤であることを示している。
ある態様では、試験動物は、試験たんぱく質トランスジーンを発現しているか、または、プロモーターの制御の下で、野生型試験動物に比べて増加したレベルでトランスジーンを発現している、リコンビナント試験動物である。好ましくは、プロモーターはトランスジーンの自然の遺伝子プロモーターではない。
本発明はさらに、上述したスクリーニングアッセイにより同定した新規薬剤、および本明細書中に記載した処置のためのそれらの使用を含む。
予測医学
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノム学、および臨床試験をモニターすることが、それによって予防的に個体を処置するための予後(予測)目的で使用する、予測医学の分野も含む。したがって、本発明の1つの局面は、生物試料(血液、血清、細胞、組織)で、CREB促進過程、またはTORCたんぱく質および/または核酸発現、ならびにTORCたんぱく質活性の調節剤を決定し、それによって、個体が、TORCたんぱく質、核酸発現または活性に関する、疾患または障害に罹患しているか、または疾患を発症する危険があるかを決定するための、診断アッセイに関する。本発明はまた、個人が、TORCたんぱく質、核酸発現または活性に関連した疾患を発症する危険があるかどうかを決定するための、予後(または予期)アッセイを提供する。例えば、TORC遺伝子の突然変異は、生物試料中で解析することができる。そのようなアッセイは、それによって、TORCたんぱく質、核酸発現または活性によって特徴づけられるか、または関連した疾患になる前に、予防的に個体を処置する、予後または予測目的のために使用できる。
診断アッセイ
配列番号1、配列番号3、または配列番号5のTORC核酸の任意の一部に相当する、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、相当するORF遺伝子を含むDNAを検出するか、または相当するTORC遺伝子またはTORCたんぱく質様遺伝子の発現を検出するために、用いることができる。例えば、特定の細胞または組織で発現するTORC核酸は、その特定の細胞型の存在を同定するのに用いる。
生物試料中に、CREB促進過程またはTORCの調節剤の存在を検出し、それを決定する、例示的方法は、試験対象から生物学的試料を取得し、TORCの存在が生物学的試料中で検出できるように、TORCたんぱく質またはTORCたんぱく質をコードする核酸(例えば、mRNA、ゲノムDNA)を検出できる化合物または薬剤に、生物学的試料を接触させることを含む。TORC mRNAまたはゲノムDNAを検出する薬剤は、TORC mRNAまたはゲノムDNAにハイブリダイズすることができる、標識された核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号1、配列番号3、または配列番号5の核酸のような、全長TORC核酸であるか、または、長さが少なくとも15、30、50、100、250、または500ヌクレオチドであり、上述した通りTORC mRNAまたはゲノムDNAにストリジエントな条件下で、特異的にハイブリダイズするのに十分であるオリゴヌクレオチドのような、その部分である。本発明の診断アッセイで使用できる他の適当なプローブは、本明細書中に記載している。
TORCたんぱく質を検出するための薬剤は、TORCたんぱく質に結合できる抗体であり、好ましくは、検出標識を有する抗体である。抗体はポリクローナル抗体、より好ましくは、モノクローナル抗体であり得る。無傷の抗体、またはその断片(例えば、FabまたはF(ab')2)を使用できる。プローブまたは抗体に関して、“標識した”という用語は、検出物質をプローブまたは抗体にカップリング(すなわち、物理的結合)させることによる直接標識、および、直接標識された他の試薬と反応することによる、プローブまたは抗体の間接標識を包含することを意図する。間接標識の例は、蛍光標識した二次抗体、および蛍光標識したストレプトアビジンで検出できるようにビオチンを有するDNAプローブの末端標識を使った、一次抗体の検出を含む。“生物学的試料”という用語は、対象から単離された組織、細胞および生物学的液体、および、対象内に存在する組織、細胞および生物学的液体を含むことを意図する。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロおよびインビボで、生物学的試料中のTORC mRNA、たんぱく質、またはゲノムDNAを検出するのに利用できる。例えば、TORC mRNAの検出のためのインビトロ技術は、ノザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイセーションを含む。TORCたんぱく質の検出のためのインビトロ技術は、酵素免疫測定法(ELISA)、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を含む。TORCゲノムDNAの検出のためのインビトロ技術は、サザンハイブリダイゼーションを含む。さらに、TORCたんぱく質の検出のためのインビボ技術は、標識抗TORCたんぱく質抗体を対象に導入することを含む。例えば、抗体を放射活性マーカーで標識でき、対象内でのその存在および場所は、標準的なイメージング技術によって検出できる。
本発明はまた、生物試料中のCREB促進過程の決定した調節剤またはTORCの存在を検出するキットを包含する。例えば、キットは次のものを含む：生物試料中のCREB促進過程の検出した調節剤、TORCたんぱく質またはmRNAを検出することができる標識化合物または薬剤；試料中のTORCの量を決定するための手段；および、標準と試料中のTORCの量を比較するための手段。化合物または薬剤は、適当な容器に包装できる。キットはさらに、TORCたんぱく質または核酸を検出するために、キットを使用するための指示書を含む。
予後アッセイ
本明細書中に記載の診断法は、さらに、異常なTORC発現または活性に関連した疾患もしくは障害を有するか、または発症する危険を有する対象を同定するのに利用できる。前診断アッセイまたは後アッセイのような、本明細書中に記載のアッセイは、TORCたんぱく質に関連した障害を有するか、または発症する危険を有する対象を同定するのに利用できる。
さらに、本明細書中に記載の予後アッセイは、異常なTORC発現または活性に関連した疾患もしくは障害を処置するために、対象に薬剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣剤、核酸、小分子、または他の薬剤候補)を投与できるかどうかを決定するのに使用できる。例えば、そのような方法を、増殖性障害、分化性障害、グリア関連障害などのような障害のための薬剤で、対象が効率的に治療されるかどうかを決定するのに使用することができる。よって、本発明は、試験試料を入手し、TORCたんぱく質または核酸を検出する、異常なTORC発現または活性に関連した障害のための薬剤で、対象が効率的に治療されるかどうかを決定する方法を提供する(例えば、ここでTORCたんぱく質または核酸の存在は、異常なTORC発現または活性に関連した障害を処置するために薬剤を投与することができる対象のための診断である。)。
本発明はまた、TORC遺伝子またはTORCの発現および活性を調節する遺伝子の遺伝的損傷を検出し、それによって損傷した遺伝子を有する対象が、増殖性障害、分化性障害、グリア関連障害などの危険があるか、または患っているかどうかを決定するのに使用できる。様々な態様では、方法は、対象からの細胞試料で、TORCたんぱく質をコードする遺伝子の完全性に影響する少なくとも１つの変更またはTORC遺伝子の誤発現によって特徴づけられる、遺伝的損傷の存在または不存在を検出することを含む。
臨床効果のモニタリング
TORCの発現または活性に対する薬剤(例えば、薬、化合物)の効果のモニタリングは、臨床試験に適用できる。例えば、本明細書中に記載したスクリーニングアッセイによってTORC遺伝子発現、たんぱく質レベルを増やすか、またはTORCの生物学的な機能を促進すると決定された薬剤の効果は、減少したTORC遺伝子発現、たんぱく質レベル、または下方制御されたTORC活性を示す対象の臨床試験においてモニターできる。あるいは、本明細書中に記載したスクリーニングアッセイによってTORC遺伝子発現、たんぱく質レベルを減らすか、またはTORCの生物学的な機能を阻害と決定された薬剤の効果は、増加したTORC遺伝子発現、たんぱく質レベル、または上方制御されたTORC活性を示す対象の臨床試験でモニターできる。そのような臨床試験では、TORC、および、好ましくは、例えば、増殖または神経疾患に関与している他の遺伝子の発現または活性は、“読み出し”または特定の細胞の応答性のマーカーとして使用できる。そのような方法は、TORC細胞内分布を評価するか、またはTORCのCREB共活性化を解析することを含む。
処置の方法
本発明は、異常なTORC発現または活性に関連した障害の危険があるか、またはそのような疾患を有する対象を処置する予防および治療法の両方を提供する。
増加したレベル(疾患または障害を患っていない対象と比較して)または生物学的活性によって特徴づけられる疾患および障害は、活性に拮抗(すなわち、減少または阻害)する治療薬で処置し得る。活性に拮抗する治療薬は、治療的または予防的方法で投与し得る。利用できる治療薬は、限定するものではないが、(i)TORCペプチド、またはアナログ、誘導体、断片またはそのホモログ；(ii)TORCペプチドに対する抗体；(iii)TORCペプチドをコードする核酸；(iv)アンチセンスもしくはsiRNA TORC核酸の投与；または(v)TORCペプチドとその結合パートナーとの相互作用を変えるモジュレーター(すなわち、本発明のさらなるペプチド模倣体または本発明のペプチドに特異的な抗体を含む、阻害剤、アゴニストおよびアンタゴニスト)を含む。
減少したレベル(疾患または障害を患っていない対象と比較して)または生物学的活性によって特徴づけられる疾患および障害は、活性を増加させる(すなわち、アゴニストである)治療薬で処置し得る。活性を上昇させる治療薬は、治療的または予防的方法で投与し得る。利用できる治療薬は、限定するものではないが、TORCペプチド、またはアナログ、誘導体、断片またはそのホモログ；もしくは生体利用効率を増加させるアゴニストを含む。
１つの局面では、本発明は、ある対象で異常なTORC発現または活性に関連した疾患または状態を、TORC発現または少なくとも１つのTORC活性を調節する薬剤を対象に投与することによって、予防する方法を提供する。異常なTORC発現または活性が原因のまたはそれが関与する疾患の危険がある対象は、例えば、本明細書中に記載した通りの任意のまたは１つの診断また予後アッセイの組み合わせによって同定できる。予防剤の投与は、TORC異常に特徴的な症状が出る前に行うことができ、その結果、疾患または障害は予防され、あるいは、その進行を遅らせる。TORC異常の型に依存して、例えば、TORCアゴニストまたはTORCアンタゴニスト剤を対象を処置するために使用できる。適当な薬剤は、本明細書に記載したスクリーニングアッセイに基づいて決定することができる。
本発明の他の局面は、治療目的で、TORC発現または活性を調節する方法を含む。本発明の調節方法は、細胞を、その細胞と関連した１個またはそれ以上のTORCたんぱく質活性を調節する薬剤に接触させることを含む。TORCたんぱく質活性を調節する薬剤は、核酸またはたんぱく質、天然に存在するTORCたんぱく質の同種のリガンド、ペプチド、TORCペプチド模倣体、もしくは他の小分子のような本明細書中に記載の薬剤であり得る。
TORCポリヌクレオチドおよびポリペプチド
本発明は、TORCポリヌクレオチドおよびそれらによってコードされたポリペプチドを開示している。TORCポリヌクレオチドは、Iourgenko e al. (2003)および仮米国特許出願番号xx/xxxxxx(月、日、年)に記載したように、単離、特徴付けおよび調製し得る。ヒトTORC1をコードしたポリヌクレオチド(GenBank Acc. No. AY360171)は、表１で示している。
表1
Figure 2008517627
Figure 2008517627
 (配列番号1)
表１で示した配列で、コード配列は26番目から1978番目である。
表１のヌクレオチド配列に基づいてTORC1たんぱく質の予想されるポリペプチド配列を、表2に示す(GenBank Acc. No. AAQ98856.1)。
表2
Figure 2008517627
 (配列番号2)
ヒトTORC2をコードしたポリヌクレオチド(GenBank Acc. No. AY360172)を、表3に示す。
表３
Figure 2008517627
Figure 2008517627
 (配列番号3)
表3で示した配列で、コード配列は131番目から2212番目である。
表2のヌクレオチド配列に基づいてTORC2たんぱく質の予想されるポリペプチド配列を、表4に示す(GenBank Acc. No. AAQ98857.1)。
Figure 2008517627
 (配列番号4)
ヒトTORC3をコードしたポリヌクレオチド(GenBank Acc. No. AY360173)を、表5に示す。
表５
Figure 2008517627
Figure 2008517627
 (配列番号5)
表5で示した配列で、コード配列は8番目から1867番目である。
表3のヌクレオチド配列に基づいてTORC3たんぱく質の予想されるポリペプチド配列を、表6に示す(GenBank Acc. No. AAQ98858.1)。
Figure 2008517627
 (配列番号6)
本明細書中および請求項で使用する“TORCポリヌクレオチド”、“TORCXポリヌクレオチド”(“X”は1、2または3の値である)という用語、および類似語ならびに句は、一般に、表1、3、および5で示されたヌクレオチド配列か、またはそれらの相補体、および、アミノ酸配列が、表2、4、または6に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一、または少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、少なくとも97%同一、少なくとも99%同一であるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；または、この段落で記載した任意のヌクレオチド配列の断片；または、この段落で記載した任意のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列に関する。さらに、TORCポリヌクレオチドは、この段落で上述したポリヌクレオチドを言い、ここで前述の該断片は、ポリペプチドの成熟型をコードしている。TORCポリヌクレオチドはさらに、この段落で上述したポリヌクレオチド、またはその相補体に関し、ここで、コードされたポリペプチドの変異型アミノ酸残基は、非必須か、または保存的置換である。TORCポリヌクレオチドはさらに、融合たんぱく質をコードしたポリヌクレオチドに関し、ここで、ポリヌクレオチドは、この段落で上述した第1のTORCポリヌクレオチド、および、第1のポリヌクレオチドの5’末端または3’末端に融合した第2のポリヌクレオチドを含む。
本明細書中および請求項で使用する“TORCポリペプチド”、“TORCXポリペプチド”(“X”は1、2または3の値である)という用語、および類似語ならびに句は、一般に、表2、4、および6で示されたアミノ酸配列、および、アミノ酸配列が、表2、4、または6で示すアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一、または少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、少なくとも97%同一、少なくとも99%同一であるポリペプチド；または、アミノ酸配列が、この段落で記載した任意のアミノ酸配列の断片であるポリペプチドに関する。さらに、TORCポリペプチドは、この段落で上述したポリペプチドを言い、ここで、前述の該断片は、ポリペプチドの成熟型をコードしている。TORCポリペプチドはさらに、この段落で上述したポリペプチドに関し、ここで、コードされたポリペプチドの変異型アミノ酸残基は、非置換か、または保存的置換である。TORCポリペプチドはさらに、融合たんぱく質をコードしたポリペプチドに関し、ここで、ポリペプチドは、この段落で上述した第1のTORCポリペプチド、および、第1のポリペプチドの5’末端または3’末端に融合した第2のポリペプチドを含む。
材料および方法
下記の材料及び方法は、下記に記載の実施例で使用する。
試薬、装置および培養条件
すべての細胞株を、10%ウシ胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen #15140-122)、MEM-非必須アミノ酸(Invitrogen# 11140-050)を添加したダルベッコ修飾イーグル培地(Invitrogen, Carlsbad, CA # 11995-065)中、5% CO2の加湿インキュベーターで37℃で育てる。レプトマイシンB、イオノマイシン、ラパマイシンおよびシクロスポリンAは、San Diego CAのEMD Biosciences Inc.から入手する。ホルボール 12-ミリステイト13-アセテイト (PMA; Sigma#P3766))、シクロピアゾン酸 (Sigma#C1530)、フォルスコリン(Sigma#F3917)、3-イソブチル-1-メチルキサンチン (IBMX)、ジブチリル サイクリック-AMP (db-cAMP) は、Sigma, St. Louis, MOから入手する。イソプロテレノール (cat#195263)は、MP Biomedicals, Inc., Irvine, CAから入手する。FK506は、Novartis (CGP048123-NX1, Novartis-Basel 81402076)から入手する。DNAトランスフェクションは、Fugene6 transfection reagent (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)を用いて行い、siRNAトランスフェクションは、Oligofectamine (Invitrogen #12252-011)を用いて行う(それぞれの、製造プロトコールに従って)。細胞を、UV Stratalinker 2400 (Stratagene, La Jolla, CA)で、1ジュール/cm2の254nm UV光に曝す。ルシフェラーゼレポーターpCRE-Luc、pNFAT-TA-LucおよびpNFKB-Lucは、BD Biosciences, Inc., San Jose, CAから入手する。トランスロケーションスクリーンで使用されるcDNA集団は、Mammalian Genome Collection (MGC), Genomics Institute of the Novartis Research Foundation (available from the American Type Culture Collection, Manassas, VA)から入手した、およそ7000の全長ヒトおよびマウスcDNAを含む。
TORC cDNAのヌクレオチド配列
TORCたんぱく質をコードしたヌクレオチド配列は、GenBank accession nos. AY360171 (hTORC1), AY360172 (hTORC2)、およびAY360173 (hTORC3)で利用できる。
プラスミド構築およびウイルス産生
FLAG-TORC1発現プラスミドであるpCMV-FLAG-TORC1は、プライマー
5’-GTA AAG CTT ATG GCG ACT TCG AAC AAT CCG-3’ (配列番号7)、および
5’-CGT GGA TCC TCA GTC CAT CCG GAA GGT GTC CTC-3’ (配列番号8)
を用いるヒトTORC1コード領域のPCR増幅によって作製し、この産物をpFlag-CMV4(Sigma)のHinDIIIおよびBamHIサイト中にクローニングする。
TORC1-eGFP発現プラスミドであるpCMV-TORC1-eGFPは、プライマー
5’-CGC GAG ATC TAT GGC GAC TTC GAA CAA TCCG-3’ (配列番号9)、および
5’-ATA GGA TCC GTC CAT CCG GAA GGT GTC CTC-3’ (配列番号10)
を用いたヒトTORC1コード領域のPCR増幅によって作製し、この産物をpEGFP-N1(BD Biosciences)のBglIIおよびBamHIサイト中にクローニングする。TORC2-eGFP発現プラスミドであるpCMV-TORC2-eGFPは、プライマー
5' TTC TTT CGC TAG CGA GGC GAC GTC GGG GGC GAA CGG GCCT 3’ (配列番号11)、および
5' GAA CTG CAG AAT TCG TTG GAG CCG GTC ACT GCG GAA TGA 3’ (配列番号12)
を用いたヒトTORC2コード領域のPCR増幅によって作製し、得られる産物をpEGFP-N1(U-4153 p35-55)のNheIおよびEcoRIサイト中にクローニングする。TORC3-eGFP発現プラスミドであるpCMV-TORC3-eGFPは、プライマー
5' TTC TTT CGC TAG CGA TGG CCG CCT CGC CGG GCT CGG GCA 3’ (配列番号13)、および
5' GAA CTG CAG AAT TCG CAG TCT GTC AGC TCG AAA CGT CTC 3’ (配列番号14)
を用いたヒトTORC3コード領域のPCR増幅によって作製し、得られる産物をpEGFP-N1(U-4153 p35-55)のNheIおよびEcoRIサイト中にクローニングする。ドミナントネガティブTORC1発現ベクターであるpTORC1(1-44)-eGFPは、プライマー
5' TCC CTT GCT AGC GCC ACC ATG GCG ACT TCG AAC AAT CCG CGG AAA 3’ (配列番号15)
、および
5' CTT TCT CAG AAT TCG CTG GAG CCG CGC GGC CCG CGT CAG GCT 3’ (配列番号16)
を用いて、最初の44アミノ酸をコードした、TORC1コード領域のPCR増幅によって作製し、得られる産物をpEGFP-N1(U-4153 p116-117)のNheIおよびEcoRIサイト中にクローニングする。構成的活性化カルシニューリン発現構築体、pCI-neo-CnA*-HA (Molkentin et al., 1998)は、Eric Olson, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas TXから入手する。
cDNAスクリーン
HeLa細胞を、トランスフェクション24時間前に、384ウェルプレートで30ul培地中に、1200細胞/ウェルで播種する。384ウェルプレートの7個のバッチのそれぞれに、35 ug pCMV-TORC1-eGFPを10 ml OPTI-MEMで希釈し、その後、562 ul Fugene6を加える。この混合物の3 ulに、OPTI-MEMで約7.5 ng/ul cDNA発現プラスミドを4ul含む、cDNAスタンプを加え、最終的に、全体の混合物をHeLa細胞に加える。48時間後、培地をプレートから除去し、プレートを、100% メタノールに-20℃で20分間浸し、メタノールを除去し、プレートを室温で乾燥させる。核を、1ウェルあたり25 ulのPBS 中5ug/ml Hoechst stainで、15分間染色し、その後PBSで3回洗浄する。それぞれのウェルの細胞イメージを、Cellomics ArrayScan IIを用いて取得し、細胞質および核のTORC1-GFPの量を、細胞質-核移行アルゴリズムを用いて決定する。
安定したTORC-eGFP細胞株の産生
HeLa細胞にpCMV-TORC1-eGFPをトランスフェクションし、安定した統合体を、700 ug/mlゲネシチンで選択する。TORC1-eGFPを発現している単一コロニーを、単離し、増殖する(HhTORC1eGFP細胞)。
HEK293に、AseI制限エンドヌクレアーゼで直線化した、pCMV-TORC1-eGFP、pCMV-TORC2-eGFPまたはpCMV-TORC3-eGFPをトランスフェクションし、TORC-eGFPを発現している細胞の集団を産生する安定した統合体を700 ug/mlゲネシチンで選択する。これらを、それぞれ、293hTORC1、293hTORC2、または293hTORC3細胞と呼ぶ。非蛍光細胞を除去するために、安定なTORC-eGFP細胞株のすべてを、蛍光活性化細胞選別にかける。
共焦点顕微鏡
HhTORC1eGFP細胞を播種した4ウェルガラススライドに、0.38 ug pCMV-SPORT6か、または、それぞれのcDNAプラスミドを、トランスフェクションコントロールとして、0.13 ug p3x-FLAG-CMV-7-BAP (Sigma#C-7472)と共に導入する。培地を24時間後に取り替え、48時間後に細胞を4%ホルムアルデヒド入りPBSで10分間、室温で固定し、0.2% Triton X-100入りPBSで2分間、透過させる。細胞を、3% BSA入りPBSで1時間、ブロッキングし、抗-FLAG モノクローナル 抗体 (Sigma# F-3165)でインキュベートした後、抗マウスAlexaFluor 647 抗体 (Mole-cular Probes, Eugene OR, Cat. #A-21463)および Hoechst 33342 stain (Molecular Probes #H3570)で染色する。
TORC抗体
ペプチド抗原を作製し、ウサギを免疫するために使用し、ポリクローナル抗体を産生させ、それを次いで元のペプチドに対して親和性精製する。それぞれの抗体のために使用される抗原は、下記のものである。
抗TORC1-PAS2769-2770: CSPHRRPLSVDKHGR (配列番号17);
抗TORC1-1B: ENPGQPSMGIDIASC (配列番号18);
抗TORC1-2A: CPATEDTFRMDRL (配列番号19);
抗TORC1-EPO31350: KQAWDTKKTGSRPKSC (配列番号20);および
抗TORC2-1cKSCN: CDPAVEESFRSDRLQ (配列番号21)。
抗-TORC1-EPO31350を、Eurogentec North America Inc., San Diego, CAによって作製し、抗-TORC1-PAS2769-2770を、ProSci Inc., Poway CAによって作製し、そして残りの抗体を、Zymed Laboratories, Inc., San Francisco CAによって作製する。
免疫組織化学
HEK293由来の細胞を、DMSOまたは50uMフォルスコリンで90分間処理し、100% メタノールで、-20℃、20分間固定し、その後乾燥させ、5% BSA/10% ヤギ血清/0.1% Tween-20の入ったPBSで、室温で３時間ブロッキングする。細胞を、抗-TORC2 抗体 1cKSCNの 1:4000希釈でインキュベートする。次いで細胞を、顕微鏡で観察する前に、抗ウサギAlexa-Fluor 488 (Molecular Probes #A21441)、およびヘキスト染色する。
siRNAトランスフェクション
6000のHeLa細胞を、同時に播種し、96-ウェルプレートで１ウェルにつき0.3 μl Fugene6と共に、90ng pCRE-luc または pNFKB-luc および 10ng ウミシイタケルシフェラーゼプラスミドを導入する。siRNA導入は、抗生物質を欠いた培地にsiRNAの最終濃度が20 nM で、オリゴフェクタミントランスフェクション試薬(Invitrogen)を用いて、24時間後に行い、培地は、siRNAトランスフェクションの24時間後に抗生物質を含んだ培地に交換する。様々な化合物を含んだ培地は、siRNAトランスフェクションの48時間後に交換し、ルシフェラーゼ活性は、化合物を用いた一晩のインキュベーション後、決定する。使用したsiRNAは、以下のものである。

非特異的コントロール: 5'-UAG CGA CUA AAC ACA UCA AUU-3' (配列番号22; Dharmacon, Dallas TX, #D-001210-01-05);
GL3 ルシフェラーゼ 5'-CTT ACG CTG AGT ACT TCG A-3' (配列番号23; Dharmacon #D-001400-01-05);
TORC1 5'-CCG GCA ACC UCG CGG CCA AUU-3' (配列番号24; Dharmacon #D-014026-03);
TORC2 5'-CGA CUA CCA UCU GCA CUU AUU-3' (配列番号25; Dharmacon #D-018947-02);および
TORC3 5'-CAA CGC AUC UGC UCU UCA CUU-3' (配列番号26; Dharmacon #D-014210-04).
ショウジョウバエの方法
Gal4応答構築体、UAS-GFP-TORCは、pEGFP-N1ベクター(Clontech # 6085-1)からのeGFP遺伝子、および、ショウジョウバエゲノムDNAからのdTORC遺伝子を、pUASTベクター(Bra-nd and Perrimon, 1993)にクローニングすることによって作製する。この構築体を、トランスジェニック株を作製するために、P-エレメント生殖細胞形質転換により、ショウジョウバエ胚に注入する(Rubin and Spradling, 1982)。融合たんぱく質の発現を誘導するために、UAS-GFP-TORCを含むハエを、Bloomington Stock Center, University of Indiana, Bloomington, IN から入手した、HS-Gal4構築体を含むハエと交雑する。幼虫を25℃で熱ショックを与え、後期３齢幼虫からの唾液腺をPBS中で切り取り、96ウェルプレート中の様々な化学処理を含む、Sang M3培地(Sigma #S3652)に置く。腺は、Nikon Eclipse TE2000-E蛍光顕微鏡で視覚化する。イメージは、100X倍率で撮像する。
実施例１ TORC1たんぱく質の細胞内局在
HeLa細胞に、FLAG-TORC1(図1、パネルAおよびB)またはTORC1-eGFP(パネルCおよびD)をトランスフェクションする。細胞を、未処理か(パネルAおよびC)、または、たんぱく質のCRM1仲介核移出の真菌阻害剤である、10 nM レプトマイシン-B(LMB)で90分間処理する(パネルBおよびD)。FLAG-タグ付きたんぱく質は、免疫蛍光によって視角化し、一方、eGFP-タグ付きたんぱく質は、蛍光によって直接視角化する。TORCたんぱく質はCREB1コアクチベーターであることが知られていたが(Iourgenko et al., 2003)、FLAGエピトープを用いたたんぱく質免疫蛍光によって、HeLa細胞質に優勢に存在することが明らかとなる(図1、パネルA)。また同様の結果が、TORC1-eGFP融合たんぱく質(TORC1-eGFP;図1、パネルC)を用いたeGFPの直接蛍光でも得られる。様々なシグナル伝達たんぱく質が、核移出または刺激誘導移入によって制御されているので、LMBで処理後のTORC1の局在を試験する。LMB暴露90分後、TORC1融合たんぱく質は、核に優勢に存在することが明らかとなる(それぞれ、図1、パネルBおよびD)。それぞれのタグ付き構築体は、タグなしTORC構築体と同様に、CRE依存性転写を活性化する能力を保持しているように見える(データは示さない)。
実施例2 TORC2およびTORC3たんぱく質の細胞内局在
ヒトTORC2およびTORC3たんぱく質の局在もまた試験する。HeLa細胞およびHEK293細胞の両方に、pCMV-TORC2-eGFPまたはpCMV-TORC3-eGFPをトランスフェクションする。eGFP融合として発現させるとTORC2およびTORC3は、HeLa細胞で構成的に核に発生する(図2)。しかしながら、HEK293細胞で発現させると、TORC2およびTORC3-eGFP融合たんぱく質は、排他的ではないが大部分細胞質に存在する(それぞれ、図1、パネルEおよびGで、主に核の外側に蛍光を示す)。HeLa細胞でのTORC1と同様(実施例1)、LMB処理は両方のたんぱく質の細胞核への蓄積(蛍光で明るく見えている部分)を誘導する(それぞれ、図1、パネルFおよびH)。３種のヒトTORCの細胞内局在は、核移出によって制御されていると結論づけることができる(実施例1および2のTORCたんぱく質の局在は、導入または標識によって人工品であるようには見えない。第１に、TORC1たんぱく質がN末端FLAGエピトープタグと共に発現しているか、またはC末端eGFPラベルと共に発現しているかに関係なく、トランスロケーションおよび移出は同様である。第2に、eGFPのみをトランスフェクションした後、トランスロケーションは見られない(データは示さない)。最後に、下記の通り、処理により細胞質アルカリフォスファターゼ遺伝子の細胞質への転座の出現はもたらさない(実施例4および7)。)。
実施例3 TORC1核蓄積を誘導するcDNAを単離すること
TORCトランスロケーションを制御をする細胞内シグナルを単離するために、高複雑度スクリーン(high-complexity screen)を、TORC1-eGFPが核への蓄積を引き起こす遺伝子を同定するために開発する。HeLa細胞に、MGC全長コレクション(Strausberg et al., 2002)から、およそ7000の個々のcDNA発現構築体を組み合わせて、TORC1-eGFPをコトランスフェクションする。トランスフェクション48時間後細胞を固定し、細胞質および核のeGFP蛍光の相対的な量を、Cellomics Array-Scan II自動顕微鏡(automated microscope)を用いて決定する。TORC1-eGFPのポジティブコントロールを提供するために、それぞれの384ウェル細胞培養プレートの１つのウェルは、固定前にLMBで処理する。トランスロケーションは、核-細胞質蛍光差異をプロットすることによって観察する。LMBによるトランスロケーションは、実質的に、すべてのコントロールウェルで検出される(図３“X”)。活性の可能性のあるcDNAは、高い核-細胞質蛍光差異のクローンから回収し、二次アッセイにより再試験する。このスクリーンからの、最も高い再現性のある得点は、マウス一過性受容体潜在的陽イオンチャンネル-サブファミリーV-メンバー6(murine transient receptor potential cation channel, subfamily V, member 6)(TRPV6: cDNA clone MGC:27673 IMAGE:4911355)およびマウスcAMP依存性プロテインキナーゼ触媒αサブユニット(murine cAMP dependent protein kinase, catalytic, alpha subunit)(PKA: cDNA clone MGC:6169 IMAGE:3497908)をコードするプラスミドである。いくつかの他のcDNAもまた、タグ付きTORC1たんぱく質の移行を誘導する能力について確認することに留意すべきである。
実施例4 TRPV6およびPKAの役割の確認
TRPV6およびPKAがTORC1-eGFPトランスロケーションを誘導することを確認するために(実施例3)、TORC1-eGFPを安定的に発現しているHeLa細胞に、空の発現ベクターpCMV-SPORT6(図４、パネルA)、またはTRPV6(パネルB)もしくはPKA(パネルC)を含む発現ベクターをトランスフェクションする。共焦点顕微鏡を行う；元のカラーの顕微鏡写真では、アルカリフォスファターゼ染色(ピンク色)はトランスフェクションされた細胞を表し、核DNA染色は青色で、TORC1-eGFP蛍光は緑色である。図4では、空ベクターを用いたコントロールは(パネルA)、ピンク色の細胞質を有する１つの細胞を示しており(下右)、これは、トランスフェクションが成功したことを意味する。この細胞は、青色核染色ならびに核か、またはその隣接した領域にわずかな緑色の染色を有する(下の右部分)。パネルBでは(TRPV6)、右の3つの細胞は、細胞質にピンク色の染色を有し、これらの中で、上の2つははっきりした緑色の核を有し、下の細胞は、青緑色の核を有する。パネルCでは(PKA)、中央の大きい細胞は、ピンク色の細胞質および緑色の核を有する。これらの結果は、これらのcDNAクローン両方の遺伝子産物が、TORC1-eGFPの核蓄積を誘導することを示している。TRPV6は、すべてのTORC1-eGFPを実質的に核に移行させるが、一方で、PKAは、TORC1-eGFPの核への部分的な蓄積のみを誘導する。これらの観察は、TORC1の核へのトランスロケーションは制御されたイベントであることを証明しており、TORC活性は、cAMPおよびカルシウムシグナル伝達経路によって誘導され得ることを示唆する。
TRPV6およびPKAの両方が、また、HEK293細胞でのTORC2およびTORC3のトランスロケーションを誘導するが、PKAのみが、LMBでの核移出を同時に妨害することなく、TORC2およびTORC3の核蓄積を誘導するのに、十分には活性である(実施例5)。
実施例5 TORCたんぱく質移行のcAMPへの依存
PKAによるTORC1トランスロケーションの誘導は、cAMPがリン酸化によりCREBを、核移行によりTORCを、協調的に活性化することを示唆する。この可能性を評価するために、TORC1-eGFPを安定的に発現しているHeLa細胞を、２時間、非処理(図５、パネルA)、50 μMフォルスコリンおよび100uM IBMX (パネルB)、または1mM db-cAMP (パネルC)に曝す。これらの処理により、細胞内cAMP濃度を増加させた結果、eGFP蛍光が核で著しく出現し(パネルBおよびC)、細胞質蛍光だけを示す非処理コントロールと比較して(図５、パネルA)、HeLa細胞でのTORC1-eGFPの部分的トランスロケーションを示す。同様に、TORC2-eGFP(図５、パネルDおよびE)またはTORC3-eGFP(パネルFおよびG)を安定的に発現しているHEK293細胞は、未処理か(パネルDおよびF)、または25 μMフォルスコリンで１時間処理する(パネルEおよびG)。蛍光顕微鏡による観察によって、パネルEおよびGで、安定的に導入したHEK293細胞では、TORC2-eGFPおよびTORC3-eGFPがフォルスコリン単独の処理によって核へトランスロケーションする。
さらに、TORC2-eGFP(データは示さない)およびTORC3-eGFP(図５、パネルH)の両方とも、PKAとコトランスフェクションした安定にトランスフェクションされたHEK293細胞で、核に蓄積する。
内在性のTORC2の局在は、フォルスコリン暴露後の免疫抗体染色によって、野生型HEK293細胞で試験する。HEK293細胞は、未処理か(図６、パネルAおよびB)、または50 μMフォルスコリン(パネルCおよびD)で、90分間処理する。抗-TORC2染色はパネルAおよびCで示され、相当する核ヘキスト染色はパネルBおよびDに示す。未処理細胞は細胞内に拡散した染色を示し、一方、フォルスコリンに暴露した細胞は、核をヘキストで染色したときに見られるものと区別がつかないほど、優勢に、核免疫抗体染色を示す。よって、すべてのTORCの細胞内局在は、細胞内cAMPレベルによって制御されているように見える。
内在性のTORCたんぱく質のトランスロケーションを評価することは、たんぱく質の低い発現レベルおよび利用できる抗体試薬の特性のため、難しいことを、留意すべきである。今日までに産生された抗体は、過剰発現した抗体を容易に認識するが、TORC1抗体は、低い感度でしか内在性のたんぱく質を認識することができず、TORC3抗血清は、内在性のたんぱく質を検出することができない。
実施例6 G-たんぱく質結合受容体によるTORCのトランスロケーションの刺激
TORCの移行が、内在性のG-たんぱく質結合受容体(GPCR)によって誘導できるかを評価するために、様々なTORC-eGFP融合体を安定的に発現しているHEK293細胞を、β2-アドレナリン受容体アゴニストであるイソプロテレノールで１時間処理する。図７で示した通り、TORC1-eGFPを安定的に発現している未処理HEK293細胞(パネルA)、および10 nM LMBのみで処理した細胞(パネルB)、または160 nM イソプロテレノールのみで処理した細胞(パネルC)は、細胞質から生じるeGFP蛍光を示す。イソプロテレノールプラスLMBでの処理のみが(パネルD)、主に核からの蛍光を示す。
TORC2-eGFPまたはTORC3-eGFPを安定的に発現しているHEK293細胞の場合には、核からの蛍光は、未処理細胞(それぞれ図７、パネルFおよびH)での細胞質蛍光と比較して、160 nMイソプロテレノールによる処理(それぞれ、パネルEおよびG)のみで起こる。よって、イソプロテレノール処理への応答で、TORC1-eGFPの核へのトランスロケーションは、LMBが存在するときのみに起き、一方、イソプロテレノール単独は、TORC2-eGFPおよびTORC3-eGFPの核トランスロケーションには、十分である。
HeLa細胞とは対照的に、TORC1-eGFPの移入は、安定的に導入したHEK293細胞ではゆっくり起こり、LMBおよびフォルスコリンの両方、およびIBMXか、またはイソプロテレノール処理を必要とし(データは示していない)、移入シグナルおよび移出の妨害の両方のために必要であることを示唆する。
実施例7 TORCは、カルシニューリンに依存した方法でカルシウムに応答して移行する
TRPV6は、容量性カルシウム移入(CCE)、およびカルシウムシグナリングに関係した、蓄積作動性カルシウムチャンネルであると考えられてはいるが、証明されていない、カルシウムチャンネルである(Cui et al., 2002)。CCEが、他の転写因子である活性化T細胞の核因子(NF-AT; レビューについてはHogan et al., 2003参照)を活性化し、核トランスロケーションを誘導するのに必要であることは、興味深い。NF-ATは、核局在シグナルを含み、リン酸化によって不活性化される；NF-ATの核移入は、カルシウム依存性ホスファターゼである、カルシニューリンによる脱リン酸化を必要とする。NF-ATはまた、カルシニューリン制御核移出配列(NES)を含む(Zhu and Mckeon 1999)。カルシニューリンは、免疫抑制剤シクロスポリンA(CsA)およびFK506の標的であり、刺激依存的なNF-ATの核への輸送を、強く妨害する。
TORCのトランスロケーションがまた、細胞内のカルシウムレベルによって制御されるか否かを決定するために、カルシウムイオノフォアイオノマイシン、または筋小胞体-小胞体カルシウムATPaseシクロピアゾン酸(CPA)に対する応答で、TORCたんぱく質の局在を試験する(図８)。TORC1-eGFPを安定的に発現しているHeLa細胞を、DMSOキャリア(パネルA)、1 μM イオノマイシン(パネルB)、または10 μM CPA (パネルC)に、１時間暴露する。イオノマイシンおよびCPAの両方は、GFP蛍光で見て、DMSOだけで見られた細胞内蛍光と比較して、強くTORC1-eGFPの核への蓄積を誘導する。
パネルD、E、およびFは、また、1uMイオノマイシンを用いた処理を示している。6.4 nM FK506 (パネル D)または5 μM CsA (パネルE)による１時間の前暴露で、eGFP蛍光は細胞質に存在したままであり、イオノマイシンに対する応答でのトランスロケーションは、この薬剤によって完全に妨害されたことを示す。カルシニューリンを阻害しないイムノフィリン結合化合物である、2 μMラパマイシンを使った処理は(パネルF)、強い核蛍光により見られる通り、トランスロケーションを妨害しない。イオノマイシンに対する応答でのトランスロケーションが、ラパマイシンによってではなく、CsAおよびFK506の両方によって、完全に妨害されるという事実は、カルシニューリンが、カルシウム誘導トランスロケーションに関与していることを示している。
TORC移行でのカルシニューリンの役割は、さらに、カルシニューリンの活性型を導入後の、TORC1-eGFPの局在を調べることによって試験する(図９)。TORC1-eGFPを安定的に発現しているHeLa細胞に、一時的に空の発現ベクターか(パネルA)、またはカルシニューリンの構成的活性型を発現しているプラスミド(パネルB)をトランスフェクションする。パネルAでは、４つの下の細胞は、青色核およびピンク色(アルカリフォスファターゼ導入コントロールのための染色)がかった緑色の細胞質を示す。パネルBのすべての細胞は、細胞質にわずかなピンク色、および核に青色の核染色を圧倒する強い緑色の蛍光を示す。よって、活性化カルシニューリンの発現は、核へのTORC1-eGFPの蓄積を誘導し、TRPV6またはイオノマイシンの効果を模倣する。HEK293細胞での、活性型カルシニューリンのコトランスフェクションは、またTORC2およびTORC3の両方のトランスロケーションを誘導することが判明する(データは示していない)。
実施例8 TRPV6はTORCの移行を制御する
TRPV6発現が、NF-ATシグナリングを活性化するのに十分であるか否かを決定するために、HEK293細胞に、NF-AT依存性ルシフェラーゼレポーターと組み合わせて、一時的に、空ベクターか、またはTRPV6発現ベクターをトランスフェクションする。3 μM CsAを、レポーターアッセイの18時間前に添加する。ルシフェラーゼによって確認される通り、TRPV6はNF-ATを活性化することが判明する(図10)。この活性は、CsAにより阻害され、TRPV6がカルシニューリンの活性化によりNF-ATを活性化する、という仮説と一致する。よって、TORCトランスロケーションは、NF-ATに類似した方法で制御され、カルシニューリンの新規標的およびイムノフィリン結合免疫抑制剤を提供しているように思われる。TRPV6発現は、カルシニューリンを活性化するのに十分で、よってT細胞活性化に役割を果たし得ることを証明したのは、これが最初だと考える。
実施例9 TORC移行のカルシウム依存性活性化
３つのヒトTORC-eGFP融合たんぱく質の、核トランスロケーションに対するカルシウムシグナルの効果は、安定的に発現しているHEK293細胞で試験する。LMB暴露に対する応答で、TORC2-eGFPおよびTORC3-eGFPは核に蓄積するが、HeLa細胞よりずっと遅い速度で起こる。TORC3-eGFPは、LMB暴露のおよそ90分後、核に優勢になり、TORC2-eGFPは、LMB暴露のおよそ120分後、核に優勢になる。一方、HeLa細胞では、TORC1は30分以内にほぼ完全にトランスロケーションする(データは示していない)。
TORC1-eGFP、TORC2-eGFP、またはTORC3-eGFPを安定的に発現しているHEK293細胞を、10 nM LMB、10 μMイオノマイシン、10 nM LMBおよび10uMイオノマイシン、または10 nM LMB、10 μMイオノマイシン、ならびに5 μM CsAに曝す(図11)。処理は45分間で、CsA処理は、1 μM CsAへの15分間の前暴露を含む。eGFPの蛍光顕微鏡によって示される通り、細胞を45分間、イオノマイシンまたはLMBにのみ曝したとき、３つのTORCのそれぞれは、HEK293細胞で弱い核へのトランスロケーションを示すか、または全くトランスロケーションを示さない。しかし、イオノマイシンおよびLMBの両方の組み合わせは、３つすべてのTORC-eGFP融合たんぱく質の、核への効率的なトランスロケーションを示す(図11)。従って、HEK293細胞でカルシウムによって誘導される核トランスロケーションは、ポジティブシグナルおよび核移出の阻害の両方を必要としているように思われる。興味深いことに、３つのTORCは、CsAに対する感受性が異なっている。TORC1-eGFPの核蓄積は、CsAによって完全に妨害されるが、TORC2-およびTORC3-eGFPたんぱく質は、それぞれCsAにより、部分的に影響を受けるか、または影響を受けない(図11)。よって、３つすべてのTORCは、カルシウムシグナルに応答してトランスロケーションするが、TORC2およびTORC3のトランスロケーションを制御するメカニズムは、少なくともHEK293細胞では、TORC1のそれとは異なり得る。核移入および移出の動力学は、核へ異なったTORCを蓄積するために、誘導剤およびLMBの異なった組み合わせが必要であることを、説明し得ることに留意すべきである。
実施例10 他の刺激に対するTORC移行の依存性
CREBリン酸化およびCRE依存性転写を誘導する数種の他の刺激の効果は、また、TORCトランスロケーションの協調した誘導を引き起こす。TORC1-eGFPを安定的に発現しているHeLa細胞を、未処理か、またはUVのみ(パネルB)、もしくは10 μM CsA の存在下でのUV(パネルC)、10 μM PMA(パネルE)、または10 μM PMAおよび5 μM CsA (パネルF)に暴露する。イメージを、UV暴露10分後か、またはPMA暴露１時間後に取得する。細胞のUV放射(図12、パネルAと比較したパネルB)およびプロテインキナーゼC(PKC)アゴニストホルボール12-ミリステイト-13アセテート(PMA)は、TORC1-eGFPの核への蓄積を誘導した(パネルDと比較したパネルE)。UVおよびPMAの両方によるトランスロケーションは、CsA処理により妨害され(それぞれ、パネルCおよびF)、これらの応答の両方で、カルシニューリンが必要であることを証明する。cAMPに対する応答で、TORCトランスロケーションは、CsAに非感受性であり(データは示していない)、少なくとも２つの独立した経路が、TORCたんぱく質の細胞内局在を調節することを明らかにする。
実施例11 TORC核トランスロケーションは、CRE-仲介遺伝子発現の誘導のために十分である
TORC1過剰発現の効果および遺伝子発現での局在を決定するために、CRE-依存性転写を、非トランスフェクトHeLa細胞と、CRE-依存性プロモーターを含むルシフェラーゼレポーターを使用してTORC1-eGFPを安定的に発現しているHeLa細胞で比較する。HeLa細胞およびTORC1-eGFPを安定的に発現しているHeLa細胞を、10 nM LMB、10 μM CsA、5 μM イオノマイシン、10 μM PMA、または示された組み合わせで、18時間、刺激する(図13)。ウエスタン解析および実時間PCR解析の両方とも、HeLa細胞はTORC1を極端に低いレベルで発現しているが、TORC1-eGFP安定細胞株は、顕著により多くのTORC1たんぱく質を産生することを示す(データは示していない)。図13で示している通り、未処理野生型HeLa細胞およびトランスフェクトHeLa::TORC1-eGFP細胞は、CRE駆動ルシフェラーゼの類似したレベルを示すが、LMB処理により、HeLa::TORC1-eGFP細胞でのみ顕著な誘導が起こる。これは、TORC1-eGFPの核への移行が、CRE駆動遺伝子発現を活性化するのに十分であることを示唆した。さらに、イオノマイシンおよびPMAは、未処置の天然HeLa細胞で中程度のレベルの活性化を誘導したが、一方で、これらの薬剤は、HeLa::TORC1-eGFP細胞で10倍以上のCRE-ルシフェラーゼ誘導の増加を示した。さらに、イオノマイシンによる誘導は、CsAにより完全に妨害される。PMAによる活性化は、部分的にCsAにより妨害され(データは示していない)、PMAは、カルシニューリン依存性および独立したメカニズムの両方で、TORC活性を誘導し得ることを示唆した。よって、TORC1の過剰発現は、強く、CRE駆動遺伝子発現の活性を高め、LMBによる外来性TORC1の核への移行が、CRE駆動遺伝子発現を誘導するのに十分である。よって、TORC1の過剰発現は、カルシニューリンに依存した方法で、強く、CRE駆動遺伝子発現の活性を高める。これらの観察は、CsAおよびFK506が、一連のCREB応答遺伝子の発現を阻害する(Siemann et al. 1999)という以前の知見を、説明するメカニズムを提供すると考える。
実施例12 siRNAを用いたTORCのノックダウン
TORC機能が、カルシウムシグナルを介した活性化のために重要であるか否かを決定するために、TORC1およびTORC2の発現をsiRNAにより阻害する。ヒトTORC1およびTORC2たんぱく質の発現を著しく妨害するsiRNAを、TORC1およびTORC2特異的抗体を用いたウエスタンブロット解析により同定する(データは示していない)。HeLa細胞に、ルシフェラーゼ (GL3)、TORC1 (T1)、TORC2 (T2) か、またはTORC1およびTORC2 (T1/T2)の両方の組み合わせに特異的な、20 nM siRNA 対 コントロール非特異的 siRNAをトランスフェクションする前に、一過的に、CRE-か、またはNFKB-ルシフェラーゼプラスミドをトランスフェクションする。それぞれのコトランスフェクションした細胞調製物は、siRNAのトランスフェクション48 時間後、DMSO、50 μM フォルスコリンおよび 100 μM IBMX、10 μM イオノマイシンか、または、10uM PMA と共に10 μM イオノマイシンで処理する(図14)。抗-pGL3 siRNAsを、siRNAトランスフェクションおよび効率の、ポジティブコントロールとして使用する。
TORC1またはTORC2いずれか単独のノックダウンが、イオノマイシンを介するCRE活性の減少に十分である。TORC1単独に対するsiRNAが、PMAおよびイオノマイシンによる誘導を阻害し、一方で、TORC2 siRNAは、ほとんど効果を示さない。TORC1およびTORC2の両方のsiRNAをトランスフェクションしたとき、最大阻害効果が、すべての刺激に対して観察される。これらの効果は、TORC siRNAが、イオノマイシンおよびPMAによるNF-kappaB依存性ルシフェラーゼレポーターの誘導に対してほとんど効果がなく(図14)、また、SV40駆動ウミシイタケルシフェラーゼレポーターの基底発現に対して効果がないため(データは示していない)、特異的である。
HeLa細胞に、DMSO、イオノマイシン、またはフォルスコリン、およびIBMXで20分間誘導し、その後抗GFP特異的siRNAまたはTORC1およびTORC2の両方に特異的なsiRNAをトランスフェクションし、続いて融解する。ウエスタンブロット解析により、siRNAが、TORC1およびTORC2たんぱく質産生を妨害することが示される(図15)。フォルスコリン/IBMXによるCRE-発現の誘導は、TORC1およびTORC2siRNAによって適度に妨害されるのみであることは留意すべきである。フォルスコリン/IBMX誘導の弱い阻害は、siRNAによる不十分な妨害のためか、または、HeLa細胞で３つすべてのTORCたんぱく質が発現しているためであるはずである。より完全なCRE-活性化の阻害は、TORC3に対するsiRNAがまた誘導されたときに、観察される(データは示していない)。これらの実験で、十分な品質の抗体の欠如のため、TORC3たんぱく質発現の阻害を確認することができなかった。TORC1およびTORC2発現の妨害は、イオノマイシンか、またはフォルスコリン/IBMXによるCREB1のリン酸化に影響せず(図15)、TORCが、CREBのリン酸化とは独立してCRE駆動発現を活性化したという、以前のデータと一致している。
この実施例で報告した実験は、TORCが、カルシウム誘導性CRE駆動転写にとって重要であることを示している。
実施例13 TORCのドミナントネガティブ変異体
siRNAの結果は(実施例12)、種々のsiRNAを使用したり、種々のTORCを妨害したりする必要があるため、複雑である。より簡単に、すべてのTORCたんぱく質の活性を効率的に妨害するために、高度に保存されたTORC1の44アミノ酸CREB結合ドメインを、eGFPに融合させた、ドミナント干渉TORCたんぱく質を設計する(T1-44eGFP)。すべてのTORCたんぱく質の活性を効率的に妨害するために、CREB1に相互作用するすべてのTORCの能力を、特異的に妨害するはずであるドミナント干渉たんぱく質を設計する。TORCたんぱく質のCREB1相互作用ドメインは、TORC1の最初の44アミノ酸に存在している。TORC1遺伝子の最初のエキソンを表している、N末端の44アミノ酸は、実質的にすべてのほ乳類、線虫およびショウジョウバエTORCたんぱく質で、ほぼ100%保存されているが、他のどのたんぱく質とも、実質的に、相同性または類似性を有さない(Iourgenko et al., 2003)。これらの44アミノ酸が、eGFPと融合たんぱく質として発現しているとき(T1(1-44)eGFP)、HhTORC1細胞で高められたCRE応答は効率的に妨害され、CRE活性に関する３つすべてのTORCの活性は阻害される(データは示していない)。HeLa細胞にCRE-ルシフェラーゼ(図16、パネルA)か、またはNFKB-ルシフェラーゼ(パネルB)と共に、eGFPコントロールまたはTORC1(1-44)-eGFPをトランスフェクションし、その後50 μMフォルスコリン/100 μM IBMXまたは5 μMイオノマイシンで刺激する。パネルCでは、HEK293細胞に、空のCMVベクター、eGFPまたはTORC1(1-44)-eGFP融合体のいずれかとの組み合わせで、CRE-ルシフェラーゼおよびβ2-アドレナリン受容体(β2AR)を一時的にトランスフェクションして、18時間、イソプロテレノールに曝す。ドミナントネガティブT1(1-44)eGFPは、また、フォルスコリン/IBMXまたはイオノマイシンおよびPMAを介して、強く、CRE活性を妨害する(図16、パネルB)。eGFPのみの発現およびT1(1-44)eGFPの発現は、イオノマイシンおよびPMAによるNF-kappaBの活性化に影響しないため、この活性は特異的である(図16、パネルB)。図16、パネルCで示す通り、eGFPではなくT1(1-44)eGFPは、強く、β2-アドレナリン受容体(β2AR)およびイソプロテレノールによる、CRE-ルシフェラーゼ誘導を阻害する。よって、TORC機能の妨害は、また、イソプロテレノールを使用して、Gs結合GPCRを介するCRE活性化を妨げる。このことは、TORC機能が、CRE応答の活性化のために十分であり、重要であることを証明していると結論づけられ得る。
実施例14 TORC移行は進化的に保存された制御メカニズムである
eGFPとショウジョウバエTORC(dTORC)たんぱく質の融合体を作製する。dTORC-eGFPを発現している、ショウジョウバエ幼虫唾液腺に、次の処理を行った：未処理で１時間(図17、パネルA)、5 μMイオノマイシンに１時間暴露(パネルB)、10 μM CsAと共に5 μM イオノマイシンに１時間(パネルC)、未処理で４時間(パネルD)、100 μM db-cAMPに４時間(パネルE)。dTORC融合たんぱく質を発現しているトランスジェニック幼虫から切開した唾液腺を、顕微鏡によって試験する。dTORC-eGFPは、腺のすべての細胞で、細胞質に局在する(図17、パネルAおよびD)。トランスジェニック幼虫唾液腺へのイオノマイシンまたはdb-cAMPの暴露は、dTORC-eGFPの核へのトランスロケーションを誘導した(それぞれ、パネルBおよびE)。イオノマイシンによって誘導されるトランスロケーションは、CsAによって妨害される(パネルC)。よって、ショウジョウバエでのTORCの局在は、ヒト細胞と同様に、cAMPおよびカルシウムによって制御されている。故に、細胞内のTORC細胞内局在のこの制御は、CREBシグナリングを修飾する、高度に保存されたメカニズムである。
実施例15 神経細胞でのTORCたんぱく質の細胞内局在
神経成長因子によって神経表現型を示すように誘導された、HCN-1A(皮質ニューロン)、HCN-2(皮質ニューロン)、DBTRG-05MG(グリア細胞; 膠芽細胞腫)もしくはラットPC-12細胞(すべてATCCから利用可能)またはマウス初代後根神経節移植ニューロン(Araki et al. (2004) Science 305:1010-1013)から選ばれた、ヒト脳細胞株の培養を設立する。細胞に、pCMV-TORC1-eGFP、pCMV-TORC2-eGFPか、またはpCMV-TORC3-eGFPをトランスフェクトする。24-48時間後、eGFP局在を蛍光顕微鏡を用いて試験する。結果を、LMBの存在下で再試験する。これらの結果は、神経細胞でのTORCたんぱく質の細胞内局在を特徴づける。
実施例16 脳細胞でのTORC関連過程の活性を調節する薬剤の同定
神経細胞または表現型の神経細胞(phenotypic neuronal cell)(実施例15)は、培養で設立し、pCMV-TORC1-eGFP、pCMV-TORC2-eGFPまたはpCMV-TORC3-eGFPのいずれかをトランスフェクションする。培養を2つの部分に分割し、その1つの部分のみ候補のTORC影響剤で処理する。典型的には、例えば、コンビナトリアルライブラリーのような、候補物のライブラリーが存在する。多ウェルプレート(multiwell plates)では、導入した神経培養細胞の部分を、様々なライブラリーのメンバーで処理する。最も有力に活性を調節する薬剤を選択するために、培養は、TORCたんぱく質の細胞質への蓄積を促進する既知の物質か、またはTORCたんぱく質の核への蓄積を促進する既知の物質で前処理してよい。物質の濃度は、それがその効果を促進する効果のちょうど中間点かまたは中間点近くになるように調節し得る。TORCたんぱく質-eGFP融合体の細胞内局在を、蛍光顕微鏡を用いて試験し、また、候補薬剤ではない物質で処理したもともとの培養の部分と比較する。培養の未処理部分と比較して有意な効果を誘導する候補薬剤を、このアッセイに従って生物学的に有効な薬剤として同定する。
一般的な方法
以下の方法および物質は、実施例17から23に記載の実験で使用した。
細胞培養
初代筋肉細胞を、2〜3週齢のFMV雄性マウスから単離した。筋芽細胞は、20% 熱不活性化FBS (Hyclone, cat# 30070.03)、100 U/ml ペニシリン-100 μg/ml ストレプトマイシン (Gibco, cat# 15140-122)、1X Normocin (Invivogen, cat# ant-nr-1)および2.5 ng/ml bFGF (Invitrogen, cat# 13256-029)を含む、Ham’s F10 (Gibco, cat# 11550-043)で培養した。80%の密集度になったとき、それらを5%ウマ血清 (Hyclone, cat# SH30074)を含む、DMEM (Gibco, cat# 11965-092)に変更することによって、分化するように誘導した。
トランスフェクションおよびルシフェラーゼ活性測定
HeLa細胞を、10% FBSを含むDMEMで培養した。それらを、９６ウェルプレートに、ウェルあたり7000細胞を播種し、Fugene 6 トランスフェクション試薬(Roche, Cat# NC916732)を用いて、６時間後にトランスフェクションを行った。導入のために使用したDNAおよびFugene 6の量は、それぞれ、163 ngおよび0.325 μlであった。トランスフェクション後、細胞を48時間と72時間で融解し、製造者の指示に従い、Dual-Glo luciferase assay system (Promega, Cat# PRE2943-0)を用いてルシフェラーゼ活性測定にかけた。
レンチウイルスまたはアデノウイルス導入
HeLa細胞を、6ウェルプレートに、ウェルあたり1.3X105で播種した。0.5 ml TORC1または停止(コントロール) レンチウイルス、8 mg/ml ポリブレン (Sigma, Cat# H9268) および10 mM Hepesを含んだ2 mlの培地を、それぞれのウェルに加え、導入効率を上げるために1000gで30分間、遠心した。24時間後に培地を取り除き、10% FBSのDMEMに変えた。導入後、24、48、または72時間で細胞を収穫した。初代筋肉細胞(分化１日後)に、TORC2、TORC3 またはGFP (コントロール)のアデノウイルスを感染させた(6ウェルで、ウェルあたり4 X108粒子)。培地は、毎日変えた。導入後、24、48時間で細胞を収穫した。
RNA抽出および遺伝子発現の実時間PCR解析
総RNAを、Trizol (Invitrogen, Cat# 15596-026)を用いて細胞から抽出した。総RNAの1 mgを、Superscript II RNase H Reverse Transcriptase (Invitrogen, Cat# 18064-022)を用いて行うcDNA合成に使用した。標的遺伝子の相対的な発現を、標的遺伝子に特異的なプライマー/プローブセットを用いて合成したcDNAを使って、即時PCRにより決定した。相対的なmRNA発現レベルを、標的遺伝子/18S rRNAを比較して計算した。シトクロームオキシダーゼサブユニットII(CoxII)のTaqmanプローブ配列は、5’-TCAAGCAACAGTAA-CATCAAACCGACCA-3’(配列番号 XX)である。CoxIIのTaqmanプライマー配列は、5’-CCATCCCAGGCCGACTAA-3’(配列番号 XX)(前方)および5’-CAGAGCATTGGCCATAGAATA-ACC-3’ (配列番号 XX)(逆)である。CoxIIのプローブおよびプライマーは、それぞれ、Sigma Genosys、および、Applied Biosystemsから取得する。他の遺伝子のTaqmanプライマー/プローブセットは、Applied Biosystems (以下に、一覧表を示した)から取得した：
ヒトおよびマウス、シトクロームc (Hs01588973_m1; Mm01621048_s1)
ヒトおよびマウス、PGC-1α (Hs00173304_m1; Mm00447183_m1)
マウス、ERRα (Mm00433143_m1)
マウス、イソクエン酸脱水素酵素(Mm00499674_m1)
18S (Cat# 4310893E)
たんぱく質抽出およびウエスタンブロッティング
細胞を、Complete Mini protease inhibitor cocktail (Roche, Cat# DCTC0)を加えた、Cell extraction buffer (Biosurce, Cat# FNN0011)を用いて融解した。50 μgの細胞ライセートをウエスタンブロット解析のために使用した。TORC1抗体は、Mark Labow (FGA)から入手して、1:2000希釈で使用した。チューブリン (Abcam, Cat# ab3194)およびV5(Invitrogen, Cat# 960-25)に対する抗体は、それぞれ、1:3000および1:5000で使用した。2次抗体である、ヤギ抗ウサギIgG (Cat#31460)およびヤギ抗マウスIgG (Cat# 31430)は、Pierceから購入し、1:10000希釈で使用した。
脂肪酸酸化
細胞を、114 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.2 mM KH2PO4、1.2 mM MgSO4、および0.5% 肪酸酸-不含BSA を含む非炭酸塩緩衝液中の、36 μM 14C-パルミテート (ARC, Cat# ARC-172A)で2時間、標識した。細胞によって産生された14CO2を定量し、脂肪酸酸化速度の指標として用いた。
細胞呼吸
細胞をトリプシン処理し、25 mMグルコースおよび1 mM ピルビン酸ならびに2% 脂肪酸 不含BSAを含んだ、PBSに再懸濁した。細胞呼吸を、クラーク電極(Clark electrode)を用いて、オリゴマイシンおよびCCCPの処理なしと処理ありで測定した。300万のHeLa細胞か、または50万の初代筋肉細胞を、それぞれの測定のために使用した。オリゴマイシンの濃度は2 μg/mlで、CCCPの濃度は、HeLa細胞と初代筋肉細胞のそれぞれで、2 μMおよび2-5 μMであった。
実施例17
TORC1の異所性の発現が、HeLa細胞での、ミトコンドリア遺伝子発現およびミトコンドリア酸化容量(oxidative capacity)を増やす。図18は、HeLa細胞が、示された様々なcDNA構築体と共に、pGL3-basic-2kb-PGC1α-Luc、phRL-SV40(トランスフェクション効率のコントロールとして)を導入したときの結果を示している。細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を、導入後、48時間で決定した。ウミシイタケ発光(RL)を超えたホタル発光(ff)の比率を計算し(平均 ± SEM)、標準化ルシフェラーゼ活性として表現し、PGC-1α遺伝子転写の指標として使用した。TORC1は、レポーターたんぱく質発現によって証明される通り、PGC-1αプロモーターの転写を誘導する。CREBのドミナントネガティブ阻害剤であるACREBの存在は、TORC1の効果を減らしたことから、TORC1はCREBメカニズムを介して作用していることを示している。
実施例18
図19は、TORC1の異所性の発現が、ミトコンドリアの生合成を誘導することを示唆する、PGC-1αおよびシトクロームcの発現を増やすことを証明している。シトクロームcは、ミトコンドリアレベルの許容されるバイオマーカーである。HeLa細胞に、コントロールレンチウイルス(停止またはGFP)か、またはTORC1レンチウイルスを導入した。A.総たんぱく質を、導入の72時間後に細胞から抽出し、ウエスタンブロット解析にかけ、PGC-1αたんぱく質の発現を決定した。B.総RNAを、導入の24、48、および72時間後に細胞から抽出し、qPCR解析に付し、内在性のPGC-1α(B)およびシトクロームc(C)のmRNAの発現レベルを決定した。
実施例19
図20は、TORC1の異所性の発現が、HeLa細胞の細胞呼吸を増やすことを証明している。HeLa細胞は、コントロール(停止)か、または、TORC1レンチウイルスで導入した。細胞呼吸は、クラーク電極を用いて、導入後72時間で決定した。オリゴマイシン(MP Biomedicals; ATP合成阻害剤)およびCCCP (Sigma;電子輸送鎖脱共役剤)の濃度は、それぞれ、2 μg/mlおよび2 μMである。増加した細胞内呼吸は、TORC1発現後、観察している。
実施例20
TORC2およびTORC3の異所性の発現は、マウス初代筋肉細胞で、ミトコンドリア遺伝子発現およびミトコンドリア酸化容量を増やす。図21は、TORC1、TORC2およびTORC3のそれぞれは、PGC-1α遺伝子の転写を活性化することを証明している。HeLa細胞に、示された様々なcDNA構築体と共に、pGL3-basic-2kb-PGC1α-Luc、phRL-SV40(トランスフェクション効率のコントロールとして)をトランスフェクションした。細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を、導入後、48時間で決定した。ウミシイタケ発光を超えたホタル発光の比率を計算し、標準化ルシフェラーゼ活性として表現し、PGC-1α遺伝子転写の指標として使用した。N=6, * P<0.05(TORC1、2、3対ベクターのために)
実施例21
図22では、TORC2またはTORC3の異所性の発現は、初代筋肉細胞でPGC-1αの発現およびミトコンドリアマーカーを増やすことを示した。初代筋肉細胞は、TORC2、TORC3か、またはGFPアデノウイルスを導入した(transduced)。A、総たんぱく質を、導入後48時間の細胞から抽出し、ウエスタンブロット解析にかけ、異所性のTORC2およびTORC3たんぱく質の発現を決定した。異所性のTORC2およびTORC3たんぱく質を検出する一次および二次抗体は、それぞれ、V5およびヤギ抗ウサギIgGであった。B-C、総RNAを、導入後24時間および48時間の細胞から抽出し、qPCR解析にかけ、内在性のPGC-1α(B)、および、ERRαおよびミトコンドリアマーカー、シトクロームC(CytC)、シトクロームオキシダーゼサブユニットII(CoxII)、イソクエン酸脱水素酵素(IDH)を含む、PGC-1α標的遺伝子(C)の発現レベルを決定した。N=3, *P<0.05 (TORC2またはTORC3対GFP)
実施例22
図23は、TORC2またはTORC3の異所性の発現が、マウス初代筋肉細胞の脂肪酸酸化を増やすことを示している。初代筋肉細胞は、TORC2、TORC3か、またはGFPアデノウイルスを導入した。14C-パルミチン酸化は、導入後、48時間で行った。N=3, *P<0.05。この機能的アッセイは、さらに、ミトコンドリア生合成における、TORCたんぱく質の役割を確認している。
実施例23
図24では、マウス初代筋肉細胞は、TORC2またはTORC3の異所性の発現で細胞呼吸を増やすことを示している。初代筋肉細胞は、TORC2、TORC3か、またはGFPアデノウイルスを48時間導入した。細胞呼吸を、処理なし(基底)、またはオリゴマイシンもしくはCCCP処理で測定した。N=3、*p<0.05 TORC対GFP。
実施例1-14で提供するデータは、TORC活性、発現または核トランスロケーションのアゴニストがそれ自身によって、神経でのCREB仲介過程を誘導または促進できることを示唆している。cAMPおよびCREBによって仲介される応答は、多くの病的および生理的過程と関連しているので、TORC活性の修飾は、様々な適用を有する。TORCアゴニストは、記憶増強、鬱病、気分障害、または統合失調症の処置に利用できる。CREB機能の欠損は神経変性に関連し、CREB機能の妨害は神経細胞死およびアポトーシスという結果になる。さらにハンチントン病では、沈殿核内封入体が、CBPを隔離すると考えられており、よってCREB活性もまた妨害する(Sugars et al., 2003; Kazantsev 1999)。TORCアゴニストによるCREB誘導遺伝子発現の回復は、また、この設定で治療上利用できる。
実施例はまた、カルシニューリン依存性NF-AT駆動遺伝子発現を強く誘導する、TRPV6の能力を同定した。上記で論じた通り、TRPV6は細胞内のカルシウム濃度の一過的な上昇に応答して、カルシニューリンの活性に重要な貯蔵量誘発性カルシウムチャンネルを構成するか、またはその一部分であると考えられる。TRPV6が、CsAに感受性のある方法で、TORCおよびNF-AT駆動遺伝子発現のトランスロケーションを誘導するという観察は、心肥大およびT細胞活性化のようなNF-AT駆動過程におけるTRPV6の役割を強く支持する。
TORCの核への移行は、cAMPまたはカルシウム仲介シグナル伝達イベントの活性化剤または阻害剤を同定する、効率的な安価な一般手段を提供する。様々なアッセイは、細胞培養でのcAMPのレベル、またはカルシウム仲介シグナルの活性化を研究するのに利用できる。しかしながら、レポーター遺伝子またはELISA型測定を利用するこれらの方法の多くは高価であり、時間もかかることから、ハイスループット様式で個々の細胞に適用するのは困難である。TORCトランスロケーションの視覚化は、ハイスループットで、個々の細胞から、cAMPおよびカルシウムシグナリングの修飾因子を同定するのを可能にする。
最終的に、TORC1のトランスロケーションは、CREB-仲介発現を誘導し、高めるのに十分であることが示されたので、TORC核トランスロケーションを誘導する化合物は、記憶増強または神経保護剤として有益であり、一方で、TORC核トランスロケーションの妨害は、動脈硬化の処置に応用できる。
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蛍光顕微鏡を用いた一過的にトランスフェクションされた蛍光TORCたんぱく質の細胞内局在の表示。パネルA-DはHeLa細胞。パネルE-HはHEK293細胞。 蛍光顕微鏡で視覚化した、トランスフェクションされたHeLa細胞でのTORC2-eGFP(パネルA)およびTORC3-eGFP(パネルB)の細胞内局在の表示。 HeLa細胞中のTORC１トランスロケーションスクリーンの結果の表示。核−細胞質蛍光差異をMCG全長cDNAコレクションの各クローンについてプロットする(菱形)。レプトマイシンBを、TORCトランスロケーションのポジティブコントロールとして、それぞれのプレートに包含した(×印)。TRPV6およびPKAを担持するポジティブクローンを同定する。 空発現ベクターpCMV-SPORT6(パネルA)またはTRPV6を含んだ発現ベクター(パネルB)もしくはPKAを含んだ発現ベクター(パネルC)でトランスフェクションした細胞中の、顕微鏡により撮像したTORC1-eGFPの局在の表示。出願当初のパネルA〜Cの上のセットは、色つきである。パネルA〜Cの下のセットは、コンピューターのよって色つきパネルをグレースケールイメージに変換することによって調整した。 蛍光顕微鏡によって取得した、HeLa細胞のcAMPシグナルに応答した蛍光TORC融合たんぱく質のトランスロケーションの表示。 蛍光免疫染色(IHC)によって取得したHEK293細胞中の内在性TORC2トランスロケーションおよび顕微鏡写真法によって取得した核染色(ヘキスト)の表示。 蛍光顕微鏡を用いた、HEK293細胞での、GPCRアゴニストイソプロテレノールに応答した、蛍光TORC融合たんぱく質のトランスロケーションの表示。 蛍光顕微鏡を用いた、TORC1-eGFPを安定的に発現しているHeLa細胞での、カルシニューリン活性化によるカルシウムシグナルに応答した、TORC1-eGFP融合たんぱく質のトランスロケーションの表示。 蛍光顕微鏡および顕微鏡撮影を用いた、TORC1-eGFPを安定的に発現しているHeLa細胞での、活性化カルシニューリンによって誘導されるTORC1-eGFPのトランスロケーションの表示。出願当初のパネルAおよびBの上のセットは、カラーである。パネルAおよびBの下のセットは、コンピューターによってカラーのパネルをグレースケールイメージに変換することによって調製した。 TRPV6によるNF-AT依存性ルシフェラーゼレポーターの活性化の表示。 蛍光顕微鏡を用いて取得した、HEK293細胞中の、いくつかの外来性の因子を用いた処理に応答した、TORC融合たんぱく質の局在の表示。 蛍光顕微鏡を用いて取得した、HeLa細胞中の、UV照射およびPMA投与に応答した、TORC1-eGFPのトランスロケーションの表示。 HeLa細胞中の、刺激依存性CRE誘導転写に対するTORC1過剰発現の効果の表示。 HeLa細胞中の、カルシウム誘導CRE-駆動転写またはNFκB駆動転写のための、TORCたんぱく質の必要性の表示。 様々な薬剤で誘導する前に、HeLa細胞に、抗GFP特異的siRNAか、またはTORC1およびTORC2特異的siRNAの両方でトランスフェクションし、処理後取得したウエスタンブロットの表示。 プロモーター駆動遺伝子発現に対するTORC1(1-44)-eGFP融合たんぱく質の効果の表示。 蛍光顕微鏡によって撮像した、ショウジョウバエ唾液腺細胞中のcAMPおよびカルシウムに応答した蛍光ショウジョウバエTORC融合たんぱく質のトランスロケーションの表示。出願当初のパネルAからEの上のセットは、カラーである。パネルAおよびEの下のセットは、コンピューターによってカラーのパネルをグレースケールイメージに変換することによって調製した。 TORC1は、CREBを介してPGC-1αの転写を活性化する。HeLa細胞に、pGL3-basic-2kb-PGC1α-Luc、phRL-SV40(トランスフェクション効率のコントロールとして)を、示された様々なcDNA構築体と共にトランスフェクションした。細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクション後、48時間で決定した。ウミシイタケ(Renilla)発光(RL)を超えるホタル発光(ff)の比率を計算し(平均 ± SEM)、標準化ルシフェラーゼ活性として示し、PGC-1α遺伝子転写の指標として使用した。 TORC1の異所性の発現は、PGC-1αおよびシトクロームcの発現を増やし、このことは、TORC1がミトコンドリア生合成を誘導することを示している。HeLa細胞に、コントロールレンチウイルス(停止またはGFP)か、またはTORC1レンチウイルスを導入した。A.総たんぱく質を、導入の72時間後に細胞から抽出し、ウエスタンブロット解析にかけ、PGC-1αたんぱく質の発現を決定した。B.総RNAを、導入の24、48、および72時間後に細胞から抽出し、qPCR解析にかけ、内在性のPGC-1α(B)およびシトクロームc(C)のmRNAの発現レベルを決定した。 TORC1の異所性の発現は、HeLa細胞で細胞呼吸を増やす。HeLa細胞に、コントロール(停止)か、またはTORC1レンチウイルスを導入した。細胞呼吸は、クラーク電極(Clark electrode)を用いて、導入後72時間で決定した。オリゴマイシンおよびCCCPの濃度は、それぞれ、2 μg/mlおよび2 μMである。 TORC1、2および3は、PGC1-αの転写を活性化する。HeLa細胞に、pGL3-basic-2kb-PGC1α-Luc、phRL-SV40(トランスフェクション効率のコントロールとして)を、示された様々なcDNA構築体と共にトランスフェクションした。細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクション後、48時間で決定した。ウミシイタケ発光を超えるホタル発光の比率を計算し、標準化ルシフェラーゼ活性として示し、PGC-1α遺伝子転写の指標として使用した。N=6、* P<0.05(TORC1、2、3対ベクターに関して)。 TORC2またはTORC3の異所性の発現は、PGC1-αおよびミトコンドリアマーカーの発現を増やす。初代筋肉細胞に、TORC2、TORC3またはGFPアデノウイルスを導入した。A、総たんぱく質を、導入後48時間の細胞から抽出し、異所性のTORC2およびTORC3たんぱく質の発現を決定するために、ウエスタンブロット解析を行った。異所性のTORC2およびTORC3たんぱく質を検出する一次および二次抗体は、それぞれ、V5およびヤギ-抗-ウサギIgGであった。B-C、全RNAを、導入後24および48時間の細胞から抽出し、内在性のPGC1-α(B)およびPGC1-α標的遺伝子(C)(ERRαおよびミトコンドリアマーカー、シトクロームC (CytC)、シトクロームオキシダーゼサブユニットII(CoxII)、イソクエン酸脱水素酵素(IDH)を含む)の発現レベルを決定するために、qPCR解析を行った。N=3, *P<0.05 (TO-RC2またはTORC3対GFP) TORC2またはTORC3の異所性の発現は、マウス初代筋肉細胞の脂肪酸酸化を増やす。初代筋肉細胞に、TORC2、TORC3またはGFPアデノウイルスを導入した。14C-パルミテート酸化は、導入後48時間で行われた。N=3、*P<0.05。 TORC2またはTORC3の異所性の発現は、マウス初代筋肉細胞の細胞呼吸を増やす。初代筋肉細胞に、48時間、TORC、TORC3またはGFPアデノウイルスを導入した。細胞呼吸は、処理なし(基底)、またはオリゴマイシンもしくはCCCP処理で測定した。N=3、*p< 0.05 TORC対GFP。

Claims (28)

  1. 細胞を細胞内コンパートメントのTORCポリペプチドの蓄積を調節する物質と接触させることを含む、細胞におけるCREB促進過程の調節剤を同定する方法。
  2. 物質がイオノフォア、細胞内環状AMP濃縮の刺激剤、細胞内カルシウム濃縮の刺激剤またはプロテインキナーゼ活性の刺激剤である請求項１記載の方法。
  3. 細胞を細胞内区画のTORCポリペプチドの蓄積を促進する物質と接触させることを含む、細胞におけるTORC関連過程を修飾する方法。
  4. 物質がイムノフィリン結合剤である請求項３記載の方法。
  5. 細胞をTORCポリペプチドの発現を調節する物質と接触させることを含む、細胞におけるCREB促進過程を調節する方法。
  6. 物質がアンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉オリゴヌクレオチド、マイクロオリゴヌクレオチド、三重らせん核酸、リボザイム、RNAアプタマー、２本鎖または１本鎖RNA、ペプチド模倣薬、ペプチド模倣薬をコードする配列を含むポリヌクレオチド、またはそれらの任意の２個もしくはそれ以上の混合物を含む、請求項５記載の方法。
  7. 対象における細胞のCREB促進過程の異常なレベルに関連する疾患または病理的状態の発症を実質的に阻害する、処置する、または改善する方法であり、対象に細胞内領域のTORCポリペプチドの蓄積を調節する物質の１個またはそれ以上の治療上有効量を投与することを含む方法。
  8. 物質がイムノフィリン結合剤である請求項７記載の方法。
  9. 物質がイオノフォア、細胞内環状AMP濃縮の刺激剤、細胞内カルシウム濃縮の刺激剤またはプロテインキナーゼ活性の刺激剤である請求項７記載の方法。
  10. 該TORC調節剤が１個またはそれ以上のTORCたんぱく質に対する抗体またはその断片を含み、該抗体またはその断片が該TORCたんぱく質の活性を阻害する請求項７記載の方法。
  11. 該TORC調節剤がTORCたんぱく質に対する１またはそれ以上のペプチド模倣剤を含み、該ペプチド模倣が該TORCたんぱく質の活性を阻害する請求項７記載の方法。
  12. 対象における細胞のTORC活性化およびCREB促進過程の異常なレベルに関連する疾患または病理的状態の発症を実質的に阻害する、処置する、または改善する方法であり、対象に細胞でのTORCポリペプチドの発現を調節する物質の１個またはそれ以上の治療上有効量を投与することを含む方法。
  13. 該調節剤がアンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉オリゴヌクレオチド、マイクロオリゴヌクレオチド、三重らせん核酸、リボザイム、RNAアプタマー、２本鎖または１本鎖RNA、ペプチド模倣薬、ペプチド模倣薬をコードする配列を含むポリヌクレオチド、またはそれらの任意の２個もしくはそれ以上の混合物を含む、請求項１２記載の方法。
  14. (a)TORCポリペプチドを第一の細胞および対照細胞に導入し、
    (b)第一の細胞を薬剤に接触させ；そして
    (c)第一の細胞のTORCポリペプチドの生物学的機能が薬剤と接触していない対照細胞のTORCポリペプチドの生物学的機能と比較して調節されているか否かを決定する；
    ことを含み、ここで機能的調節が起こっていたならば調節剤が同定される、細胞のCREB促進過程の活性を調節する薬剤を同定する方法。
  15. 生物学的機能が多くの細胞内コンパーメントの中でTORCポリペプチドの分布を調節することを含む請求項１４記載の方法。
  16. (a)TORCポリペプチドを含んでいることが疑われる試料を提供し、
    (b)該ポリペプチドをTORCポリペプチドが特異的結合剤に結合するのが確実な条件下で、TORCに結合する特異的結合剤に接触させ；そして
    (c)TORCポリペプチドに結合する特異的結合剤の存在を検出するかまたは定量すること、
    を含む、試料内のTORCポリペプチドの存在を検出するかまたは定量する方法。
  17. 試料が細胞内区画由来である請求項１６記載の方法。
  18. 試料中のTORCポリペプチドの量が対照のTORCポリペプチドの量と異なるか否かを決定する方法であって、
    (a)TORCポリペプチドを含んでいることが疑われる試料を提供し、
    (b)該ポリペプチドをTORCポリペプチドが特異的結合剤に結合するのが確実な条件下で、TORCに結合する特異的結合剤に接触させ、そして
    (c)試料に結合する特異的結合剤の量が、段階(b)で使用されたのと同じ条件下で対照に結合する特異的結合剤の量と異なっているか否かを決定すること(ここで対照は標準または対照のTORCポリペプチド量を含んでいる)、
    を含む、方法。
  19. 試料が細胞内区画由来である請求項１８記載の方法。
  20. 第一の対象の疾患または病理の診断または予後診断に貢献する方法であって、ここで該病理のTORCポリペプチドの細胞内局在は非病理的状態のTORCポリペプチドの細胞内局在とは異なっており、そして
    (a)TORCポリペプチドを含んでいることが疑われる第一の対象から試料を提供し、
    (b)試料をTORCポリペプチドが特異的結合剤に結合するのが確実な条件下で、請求項１６に記載したポリペプチドに結合する特異的結合剤に接触させ、
    (c)試料に結合する特異的結合剤の量が、段階(b)で使用されたのと同じ条件下で対照に結合する特異的結合剤の量と異なっていることか否かを決定することを含み(ここで対照は病理を有しないことが知られている第二の対象から提供される)、
    これにより、病理の診断または予後診断もしくは治療戦略を開発するのに貢献する、方法。
  21. 試料が細胞内区画由来である請求項２０記載の方法。
  22. (a)第一の細胞を薬剤に接触させ、
    (b)対照細胞を対照薬剤に接触させ；そして
    (c)TORCポリペプチドの細胞内局在変化が対照細胞に比較して第一の細胞で起こっているか否かを決定する；
    ことを含み、ここで、該対照細胞に比較して該第一の細胞でTORCポリペプチドの細胞内局在変化を誘導する薬剤は、細胞内でTORCポリペプチド活性を調節する薬剤である、細胞内でTORCポリペプチド活性を調節する薬剤を同定する方法。
  23. 該TORCポリペプチドが、TORC１、TORC２、およびTORC３から選択される請求項２２記載の方法。
  24. 該細胞内局在の変化が核移行である請求項２２記載の方法。
  25. 該第一の細胞および該対照細胞のそれぞれがリコンビナントTORCポリペプチドを含む請求項２２記載の方法。
  26. 鬱病、気分障害、統合失調症、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病から選択される疾患の処置のためにTORCポリペプチド活性を調節する薬剤として、または神経保護薬として、もしくは記憶力向上のために請求項２２の方法で初めて同定された化合物の使用。
  27. 動脈硬化症、骨関節症、乾癬、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、リウマチ性関節炎、癌、病的血管形成、糖尿病、高血圧、慢性疼痛、炎症性疾患および自己免疫性疾患から選択される、疾患の処置のためにTORCポリペプチドの活性を調節する薬剤として請求項２２の方法で初めて同定された化合物の使用。
  28. 鬱病、気分障害、統合失調症、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病、動脈硬化症、骨関節症、乾癬、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、リウマチ性関節炎、癌、病的血管形成、糖尿病、高血圧、慢性疼痛、炎症性疾患および自己免疫性疾患から選択される疾患の処置のため、または神経保護薬として使用するためもしくは記憶力向上のための薬剤の製造における、TORCポリペプチドの活性を調節する薬剤として請求項２２の方法で初めて同定された化合物の使用。
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