JP2008516617A - Ｇｐｒ１７調節因子、そのスクリーニング方法、およびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＧＰＲ１７の活性化が関与する疾患または機能不全、特に虚血性脳損傷を診断および治療するための、ＧＰＲ１７調節因子、そのスクリーニング方法、およびその使用を提供する。

Description

本発明は、ＧＰＲ１７調節剤、特にＧＰＲ１７受容体活性を改変または遮断できる薬剤と、上記受容体に関与する疾患または機能不全の診断および治療におけるそれらの使用とに関する。

発明の背景
細胞外ヌクレオチドは、普遍的かつ系統学的に古くからあるシグナル伝達物質であり、特異的な膜受容体、すなわち７つのリガンド開口型Ｐ２Ｘチャネルおよび８つのＧタンパク質共役Ｐ２Ｙ受容体（Ｐ２Ｙ₁、2、4、6、11、₁₂、13、₁₄受容体サブタイプ）を介して作用する1、²。Ｐ２Ｙ受容体の内因性リガンドには、アデニンヌクレオチド（ＡＴＰ、ＡＤＰ）、ウラシルヌクレオチド（ＵＴＰ、ＵＤＰ）、およびさらに最近になって認識されるようになった糖ヌクレオチド（例えばＵＤＰ−グルコースおよびＵＤＰ−ガラクトース）が含まれる。逆に、システイニルロイコトリエン（ｃｙｓＬＴ）は、アラキドン酸の５リポキシゲナーゼの代謝によって生成されるペプチド結合脂質の介在物質であり、気管支喘息における確立した役割を有し、ＣｙｓＬＴ₁受容体およびＣｙｓＬＴ₂受容体を介して作用する³。Ｐ２Ｙ受容体およびＣｙｓＬＴ受容体は両方とも、ＧＰＣＲロドプシンファミリーのδグループ（プリン受容体クラスター）に属し、このファミリーには、トロンビン受容体およひ多数のオーファンＧＰＣＲが含まれる⁴。プリンクラスターの受容体の中では、ＧＰＲ１７⁴が、Ｐ２ＹおよびＣｙｓＬＴ受容体の双方に最も近い受容体のひとつであり、認識されている８つのＰ２Ｙ受容体と平均３１％のアミノ酸配列同一性、そして、ＣｙｓＬＴ₁およびＣｙｓＬＴ₂と３２および３５％のアミノ酸配列同一性を有する⁴。

最新技術
システイニルロイコトリエンＧＰＲ１７ヒト受容体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の同定が英国特許第２３６０５８６号明細書に報告されている。それには、ｃｙｓＬＴ受容体活性を調節するアゴニストまたはアンタゴニストを同定するのに使用できるスクリーニング法も提案されている。英国特許第２３６０５８６号明細書によれば、ｃｙｓＬＴ受容体活性を調節する薬剤を、いくつかの障害の治療および／または予防に用いることができる。

発明の説明
本発明は、ＧＰＲ１７が、相互に関連のないファミリーのシグナリング分子、すなわちヌクレオチドおよびｃｙｓＬＴに対して反応し、かつ特異的なＧタンパク質共役受容体を介して作用する二重受容体を代表するものであるという新知見に基づいている。動物虚血モデルで、ＧＰＲ１７をアンタゴニストリガンドまたはｉｎ ｖｉｖｏアンチセンス技術のいずれかによって阻害すると、脳損傷が著しく減少することも見出されている。これは、ＧＰＲ１７が、ヌクレオチドおよびｃｙｓＬＴの神経炎症作用を媒介する共通の分子標的に相当することを示すものである。

受容体が２つの異なったクラスのリガンドに応答するのを妨害することによって脳損傷を調節することが可能となれば、過度の受容体活性化が関与する疾患、特に心臓血管障害、神経変性障害、および腎臓虚血に対する治療方法を有意に改善しうる。ＧＰＲ１７のｃｙｓ−ＬＴ構成要素およびヌクレオチド構成要素の両方に作用できる新規化学物質は、特に、脳損傷を阻止するのに非常に有効であると判明し、それによって、完全に新規な治療戦略をもたらしうる。

第１の実施形態では、本発明は、以下のステップ、すなわち、
１）候補化合物、好ましくはｃｙｓＬＴ受容体と相互作用することができないヌクレオチド誘導体または類似体であるもの、とＧＰＲ１７をｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させるステップと、
２）上記受容体の反応を測定するステップと
を本質的に含む、ロイコトリエンまたはその類似体以外のＧＰＲ１７調節因子を同定する方法を提供する。

本明細書で使用される場合、「ＧＰＲ１７」は、区別なくヒト受容体またはラット受容体を示す。上記受容体に結合し、その活性を調節できる化合物は、さらにそれらの治療有効性に関して検査してもよい。

上記スクリーニング方法は、アゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト、または部分アゴニストを同定するのに適用してもよい。好ましい実施形態では、上記スクリーニング方法は、受容体アンタゴニスト活性を有する化合物を同定するのに適用される。この場合、ヌクレオチド認識部位またはロイコトリエン認識部位に結合することによって上記受容体を活性化できる参照化合物の存在下で、上記ステップ１を実行する。ＧＰＲ１７のヌクレオチド認識部位に結合する化合物の例には、ＵＤＰ、ＵＤＰグルコース、およびＵＤＰガラクトースが含まれる。上記アッセイは、細胞ベースのシステムで実施されるか、あるいは細胞調製物または細胞画分を用いて実施することができる。上記受容体の薬理学的特徴付けは、［³⁵ＧＴＰ］γＳ結合アッセイまたは機能的カルシウムイメージングアッセイを用いて実施するのが好ましい。

［³⁵ＧＴＰ］γＳアッセイでは、アゴニストが結合した際に、受容体の立体構造変化が起こり、それによって、シグナル伝達をもたらすＧタンパク質の活性化が誘導される。ＧＰＲ１７活性化は、外因的に添加されたリガンドが、精製された膜への［³⁵ＧＴＰ］γＳの結合を増大させる能力を試験することによって評価することができる。１３２１Ｎ１細胞（いかなるＰ２Ｙ受容体も、ＣｙｓＬＴ受容体も構成的に発現しない）では、異種ｈＧＰＲ１７の発現によって、ｃｙｓＬＴであるＬＴＤ₄およびＬＴＣ₄に対する特異的反応、ならびにウラシルヌクレオチドであるＵＤＰ、ＵＤＰグルコース、およびＵＤＰガラクトースに対する特異的反応の濃度依存的な出現が誘導された。ヒト受容体のリガンド特異性は、ＣＯＳ−７細胞およびＨＥＫ−２９３細胞でも確認された。ＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ（Ｐ２Ｙ₁₂およびＰ２Ｙ₁₃の選択的なアンタゴニストであると報告されている¹⁰、11、¹⁵）およびＰ２Ｙ₁受容体の選択的アンタゴニストであるＭＲＳ２１７９⁷は両方とも、ヒト受容体を発現する細胞の膜中にあるＵＤＰグルコースによって刺激された［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を濃度依存的に阻害した。逆に、ＣｙｓＬＴ₁アンタゴニストであるモンテルカストおよびプランルカスト3、¹³は、ＬＴＤ₄によって誘導されたヒトおよびラット受容体の活性化を濃度依存的に抑制した。２つのクラスのリガンド間における効力の相違（システイニルロイコトリエンにはナノモル濃度、そしてヌクレオチドにはマイクロモル濃度）は、特定の生理的条件および病理学的条件下でＧＰＲ１７が示差的活性化を実施できることを示す。詳細には、システイニルロイコトリエンによる受容体活性化は生理的条件で起こり、一方、ストレス状態および傷害状態では、ヌクレオチドの作用がより重要になると考えられている。後者の状態では、実際、低酸素細胞によるヌクレオチドの放出、ならびに死細胞中での核酸の加水分解によるヌクレオチドの産生の結果として、ヌクレオチド濃度が有意に増大する。

さらなる実施形態によれば、本発明は、ＧＰＲ１７の活性化が関与する疾患を治療する治療薬、詳細には神経保護剤、抗炎症剤、そして好ましくは、脳、心臓、および腎虚血を治療するための抗虚血剤を調製するための、ＧＰＲ１７受容体アンタゴニストの使用を提供する。上記アンタゴニストは、本発明による方法を用いて同定してもよいし、あるいは、プリン作動性受容体調節活性を有する化合物から選択できる。これらの後者に関する包括的総説は、参照により完全に本明細書に組み込まれている、Ｊａｃｏｂｓｏｎ Ｋ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｔ ｐｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（Ｐ２）ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４、第４巻、６７１〜６８６頁に見出すことができる。本発明によれば、上記アンタゴニスト、すなわちＭＲＳ２１７９（Ｎ６−メチル−アデノシン−３’，５’二リン酸、参考文献中の化合物番号４６）およびＡＲ−Ｃ６９９３１−ＭＸ（Ｎ６−メチルチオ−エチル−２−トリフルオロメチルエチルチオ−アデノシン−５’β−メチレン、γ−ジクロロメチレントリスリン酸、化合物番号５７）が特に好ましい。

本発明は、それぞれヌクレオチドおよびロイコトリエンの認識に関与するＧＰＲ１７受容体部位に作用する化合物の組合せの使用または結合された使用をさらに提供する。ロイコトリエンの認識に関与するＧＰＲ１７受容体部位に作用する化合物は、
− Ｊｏｎｅｓ ＴＲら（１９８９年）、「Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｌ−６６０、７１１（ＭＫ−５７１）：ａ ｎｏｖｅｌ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ Ｄ４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ」、Ｃａｎ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏ ６７：１７〜２８に記載の、ＭＫ−５７１すなわち３−（３（３−（２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル）フェニル）−（３−ジメチルアミノ−３−オキソ−プロピル）チオ）メチル）チオ）プロパン酸；
− Ｏｂａｔａ Ｔら（１９８５年）、「Ｎｅｗ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｏｆ ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ：ＯＮＯ−ＲＳ−４１１ ａｎｄ ＯＮＯ−ＲＳ−３４７」、Ａｄｖ Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ Ｌｅｕｋｏｔ Ｒｅｓ １５：２２９〜２３１に記載の、プランルカストＯＮＯ−１０７８；および、
− Ｄｕｐｒｅ ＤＪら（２００４年）、「Ｉｎｖｅｒｓｅ ａｇｏｎｉｓｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｌｉｇａｎｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ−ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １」、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３０９：１０２〜１０８に記載の、逆アゴニストＭＫ−５７１およびモンテルカスト
から選択されることが好ましい。

上記参考文献の引用を、参照により完全に本明細書に組み込む。

治療での使用には、ＧＰＲ１７アンタゴニストを、例えば単一の製薬剤形または調製物中で同時に投与することも、あるいは異なった投与形態および経路を用いて別々に投与することもできる。ＧＰＲ１７の活性化が関与する疾患の治療方法は、上記に示した合成化合物（または「小分子」）に加えて、
− 上記受容体タンパク質、その欠失体または変異体をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター、例えば、ベクターポリヌクレオチド配列の正しい発現に必要な調節配列（プロモーター、エンハンサー、開始配列および終止配列、ポリアデニル化配列、ならびに、任意選択で翻訳開始配列および終止配列）を含有するプラスミド、ウイルスまたはファージ；
− 合成オリゴペプチド、または上記ＧＰＲ１７受容体を認識し、結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含めた、上記受容体に結合親和性を有し、そのプリン作動性活性またはロイコトリエン活性を改変できるポリペプチド；
− 上記受容体をコードする配列に由来するポリヌクレオチドを含み、アンチセンスＲＮＡの合成を支配する発現ベクター；
− 治療薬としての合成アンチセンスポリヌクレオチド
に基づいたものでありうる。これらのポリヌクレオチドは、上記受容体と相互作用できる分子（アプタマー）、または核タンパク質に結合できるデコイ分子、またはゲノムＤＮＡ上での受容体発現を調節する調節配列を含有しうる。

確立されている恒久的虚血性損傷の動物モデル（ラットにおける単側部（ｍｏｎｏｌａｔｅｒａｌ）中脳動脈塞栓、ＭＣＡｏ）では、モンテルカストまたはＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ（ＧＰＲ１７アンタゴニスト）のいずれかが、磁気共鳴映像法によって測定した際の脳損傷の増大を著しく阻止した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを利用することによってＧＰＲ１７の発現をノックダウンした際にも同じ結果が観測された。ｒＧＰＲ１７ ｍＲＮＡの配列に関して設計された、いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドのうち、配列番号１および配列番号２（本明細書では、それぞれオリゴ６１６およびオリゴ２４１とも呼ばれる）が、ｒＧＰＲ１７のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を減少させることができ、ラットに脳室内注射した際には、破壊の行われた脳部位における梗塞面積の拡大を有意に減衰させることができた。

したがって、特に好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１および２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、虚血性の脳障害を治療する治療薬を調製するための、その使用とを提供する。

上記オリゴヌクレオチド配列は、それらの安定性、ｉｎ ｖｉｖｏで送達、および薬物動力学プロフィールを改善するために、化学的に修飾または結合させてもよい。例えば、２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ３）アルカリリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナート、ホスフィナート、ホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホン酸、またはホスホトリエステル基を含有するように、オリゴヌクレオチドバックボーンを修飾してもよい。他の修飾には、糖部分、ヌクレオチド間結合、プリンまたはピリミジン塩基が関与するもの、例えば、アルキル、ヒドロキシ、ハロアルキル、ハロゲン、ヒドロキシル、硫黄、アミノまたはアザ基による複素環上での様々な置換によってプリンおよびピリミジンを導入することによるものが含まれうる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、それらの活性、分布または細胞内取り込みを増強できる様々な化学基または官能基に結合することができる。そのような化学基または官能基には、脂質、脂肪族鎖、ポリエチレングリコール鎖、ポリアミン、およびリン脂質が含まれる。

治療での使用には、本発明による薬物、詳細には小分子、ペプチド、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを、生理的に許容できる賦形剤または担体と共に適切に処方することができる。適切な剤形は、特定の化合物または物質に応じて、そして投与経路に応じて変動しうる。活性成分の用量は、治療するべき疾患の重度に応じて、そして患者の全身状態に応じて、ケースバイケースで決定されるであろう。

適当な医薬組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第ＸＶＩＩＩ版Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社に提供されている指示に従って調製してもよい。

さらなる実施形態では、本発明は、ＧＰＲ１７受容体のプリン作動性部位と相互作用できる化合物、リガンド、ペプチド、抗体またはオリゴヌクレオチドを含有する診断用組成物、特に、生理条件下または疾患条件下における受容体機能の研究に有用な診断用組成物に関する。

本発明を、下記の実施例および添付図によってさらに例示する。
図面の説明
図１（ａ）ヒト、マウス、およびラットＧＰＲ１７アミノ酸配列の多重アラインメント。７つのＴＭドメインと、ＴＭ６中の保存されているＨ−Ｘ−Ｘ−Ｒモチーフとを強調表示した。（ｂ）脳、腎臓、心臓、ならびにヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）および乳房腺癌ＭＣＦ７細胞における、ヒト（１０８７ｂｐ）またはラット（１０７９ｂｐ）ｃＤＮＡ配列のＲＴ−ＰＣＲ増幅。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄Ｕ９３７、原発性肝細胞癌Ｈｅｐ−Ｇ２、子宮頚部癌（ＨｅＬａ）、および神経芽腫ＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞ではいかなるシグナルも見出されなかった。ハウスキーピング遺伝子であるβアクチンの平行発現を示す。（ｃ）Ｍｅｇａ２．１プログラムを用いて作成した進化系統樹。ＧＰＲ１７と、Ｐ２Ｙと、ＣｙｓＬＴ受容体との間の進化上の関係を示す。

図１．１ ｈＧＰＲ１７のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。クローニングされた配列は、公開データベース（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３３４４７）に報告されているものと９９％同一であり、位置７２１におけるＴからＣへのヌクレオチド置換が唯一の例外であった。この置換は、コードされているアミノ酸（Ｌｅｕ）に影響しなかった。黒塗りの三角形および円は、それぞれ、Ｎ結合型グリコシル化およびリン酸化の可能性がある部位を示す。これらの部位は、ＣＢＳ予測サーバ（ＮｅｔＰｈｏｓ２．０およびＮｅｔＮＧｌｙｃ１．０サーバ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ）を利用することによって同定した。示した、タンパク質配列の推定ＴＭドメインを決定するための構造分析はＴＭｐｒｅｄソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｅａｒｃｈｌａｕｎｃｈｅｒ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｓｅｑｓｅａｒｃｈ／ｓｔｒｕｃ−ｐｒｅｄｉｃｔ．ｈｔｍｌ）を用いて行った。

図２ ヒトおよびラット受容体を発現する細胞における［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合によるＧＰＲ１７アゴニストの特異性の決定。（ａ）１０８７ｂｐの特異的増幅産物の存在によって示された（ｂ）、ｈＧＰＲ１７を発現する１３２１Ｎ１細胞でのｃｙｓ−ＬＴおよびヌクレオチドに対するアゴニスト応答曲線。逆転写（ＲＴ）を行わなかった試料（−ＲＴと示す）でも、空のベクターを形質移入した細胞でも、産物は検出されなかった。（ｃ）および（ｄ）ｒＧＰＲ１７に関する、（ａ）および（ｂ）と同じ図。（ｅ）ｈＧＰＲ１７を発現するＣＯＳ７細胞におけるｃｙｓ−ＬＴに対する反応。（ｆ）ｈＧＰＲ１７を発現するＨＥＫ−２９３細胞におけるヌクレオチドに対する反応。各アゴニストについてのＥＣ₅₀値を報告した。グラフ中の各点は、４〜１０回の独立した実験から得られたトリプリケート測定の平均±ＳＤを表す。

図２．１ （ａ）ｈＧＰＲ１７と、ｈＰ２Ｙ1、2、3、4、6、₁₁、12、₁₃、1₄、ならびにＣｙｓＬＴ１およびＣｙｓＬＴ２受容体との配列多重アラインメント。配列はＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／）から入手した。推定オープンリーディングフレームの決定は、ＤＮＡ Ｓｔｒｉｄｅｒ １．２を用いて行った。ＢＬＡＳＴ検索は、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）サーバ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）を介して行った。アミノ酸配列のアラインメントはＣｌｕｓｔａｌＸｌ．８で行った。暗灰色および明灰色の陰影はそれぞれ、少なくとも５０％同一または相同な残基の存在を示す。推定のＴＭ１〜７を囲んで示す。知られているＰ２ＹおよびＣｙｓＬＴ受容体とｈＧＰＲ１７との（ｂ）アミノ酸配列同一性および（ｃ）類似性（すなわち相同アミノ酸の存在）。

図３ ［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合アッセイにおける、組換え体ＧＰＲ１７の活性化に対するＰ２ＹおよびＣｙｓＬＴ₁受容体アンタゴニストの作用。（ａ）ヒト受容体を発現する１３２１Ｎ１細胞における、記載のＰ２Ｙアンタゴニストによる、［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合のＵＤＰグルコース刺激への拮抗作用。（ｂ）ラット受容体を発現する１３２１Ｎ１細胞における、（ａ）と同じ拮抗作用。（ｃ）ヒト受容体を発現する１３２１Ｎ１細胞における、記載のＣｙｓＬＴ₁アンタゴニストによる、［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合のＬＴＤ₄刺激への拮抗作用。（ｄ）ラット受容体を発現する１３２１Ｎ１細胞における、（ｃ）と同じ拮抗作用。グラフ中の各点は、４〜７回の独立した実験から得られたトリプリケート測定の平均±ＳＤを表す。各アゴニストについてのＩＣ₅₀値が報告されている。

図３．１ Ｇｉタンパク質阻害剤であるＰＴＸで前処置された細胞の膜における、ヌクレオチドおよびｃｙｓ−ＬＴに対する反応の消滅。

ｈＧＰＲ１７を発現する１３２１Ｎ１細胞を、培養物中、媒体（空のカラム）または１００ｎｇ／ｍｌのＰＴＸ（黒いカラム）のいずれかに１８時間曝露した後、膜を調製した。その後、記載の通りに、ヌクレオチドまたはｃｙｓ−ＬＴの非存在下（基底レベル）または存在下で［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を測定した。データは、トリプリケートで行った３回の実験の平均である。ＰＴＸでプレインキュベートされた膜では、アゴニストによって誘導された反応（黒塗りの棒グラフ）が、未処置の細胞から得られた膜（白抜きの棒グラフ）において同じ化合物で検出された反応に比べて、すべての場合で有意に低下していた（Ｐ＜０．００１）。

図４ ｈＧＰＲ１７を発現する１３２１Ｎ１細胞またはＣＯＳ７細胞の単一細胞カルシウムイメージング。各トレースは、１つの単一細胞から記録された反応を示す。（ａ〜ｃ）ｈＧＰＲ１７を発現する１３２１Ｎ１細胞の約３０％がウラシルヌクレオチドに対して（ＵＤＰグルコースに対する平均カルシウム反応：ΔＦ３４０／３８０＝０．３４±０．１１、ｎ＝７）、あるいは（ｄ）ＬＴＤ₄に対して反応を示した。（ｅ〜ｈ）空のプラスミドを形質移入した細胞では、同じアゴニストによって反応が誘導されなかった。（ｉ）ｈＣｙｓＬＴ₁受容体を形質移入したＣＯＳ７細胞の約４５％がＬＴＤ₄に対して一過性カルシウム反応を示した（平均カルシウム反応；ΔＦ３４０／３８０＝０、３±０．０８、ｎ＝１７）。（ｊ）同様の反応が、ｈＧＰＲ１７を発現するＣＯＳ７細胞の約５０％から記録された（平均であるカルシウム反応：ΔＦ３４０／３８０＝０．１８±０．０３、ｎ＝２２）。（ｋ）空のプラスミドを形質移入した細胞では、ＬＴＤ₄に対するいかなる反応も記録されなかった。

図４．１ ｒＧＰＲ１７ ｍＲＮＡに関する合成アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的配列。（ａ）ラットのコード配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ１１２０６２）に基づいて様々なアンチセンス配列に命名した。黒い矢印は、コード配列の開始点および終止点を示す。「スクランブル」配列も含めたすべてのオリゴヌクレオチドを、「方法」で記載する通りに設計した。ｉｎ ｖｉｖｏ研究に利用するのに最も適当なオリゴヌクレオチドを選択するために、これらすべての配列を、ｒＧＰＲ１７を発現するＨＥＫ−２９３細胞で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。典型的な２つの実験を（ｂ）に示す。一方は、オリゴ６１６、オリゴ２４１、およびオリゴ９９のアッセイを目的とし、もう一方は、オリゴＳＴＡＲＴおよびオリゴＥＮＤのアッセイを目的とし、すべての実験は、並行して用いたスクランブルオリゴ配列と比較した。プレーティングの２日後に、ここでレポーター遺伝子として利用しているネオマイシン耐性遺伝子と共に、ｒＧＰＲ１７をコードしているコンストラクトを含有するｐｃＤＮＡ３．１を細胞に形質移入した。ｒＧＰＲ１７を形質移入した１６および４０時間後に、少量のＦｕｇｅｎｅ溶液中（１２５μｌ）にある、（ａ）で記載した様々なオリゴヌクレオチド（すべて最終濃度０．３μＭで使用している）を２回、細胞に添加した。最後のＦｕｇｅｎｅ添加をした２４時間後に、「方法」で記載する通りに細胞からＲＮＡを抽出し、ｒＧＰＲ１７およびネオマイシン耐性遺伝子の両方の転写産物を、記載通り、それぞれ１０７９ｂｐおよび３５７ｂｐの特異的ＲＴ−ＰＣＲ増幅産物として測定した。オリゴ６１６のみ、およびより少ない程度でオリゴ２４１が、ＨＥＫ−２９３細胞中でｒＧＰＲ１７ ｍＲＮＡを減衰させることができた。これに基づいて、これらの２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドのみをｉｎ ｖｉｖｏで試験した（図５を参照）。同様なデータが１１回の異なった実験で得られた。

図５ ＭＣＡｏの２、２４、４８時間後にＭＲＩによって測定された脳梗塞面積の拡大への、モンテルカスト（Ｍｔｋ）、ＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ（ＡＲ−Ｃ）、およびオリゴ６１６の作用。媒体（Ｃ１、ｎ＝５）もしくはＭｔｋ（ＭＣＡｏの１０分後、２ｍｇ／ｋｇを静脈内（ｉ．ｖ．）注射；ｎ＝６）；媒体（Ｃ２、ｎ＝５）もしくはＡＲ−Ｃ（４．５μｇ／動物脳室内（ｉ．ｃ．ｖ）、ＭＣＡｏの１０分後、ｎ＝５）；媒体（Ｃ３、ｎ＝５）またはオリゴ６１６もしくはスクランブルオリゴのいずれか（４００ｎｇ／動物、ｉ．ｃ．ｖ．、ＭＣＡｏの４８、２４時間、および１０分後、ｎ＝５）を投与されたラットにおけるＭＣＡｏの２４および４８時間後の梗塞面積容積の定量分析。データは、１００％とされるＭＣＡｏの２時間後と比較した、２４および４８時間後における梗塞容積のパーセンテージ変化として表す（２時間目の容積に対して、§ｐ＜０．０５、＃ｐ＜０．０１；同じ時点で評価された対応する対照に対して、^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１）
方法
細胞培養および処置。ヒト星状細胞腫細胞（ＡＤＦ細胞）、１３２１Ｎ１、ＣＯＳ−７、およびＨＥＫ−２９３細胞は以前の記載の通りに培養した¹¹、2⁴。［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳには、１０⁶の１３２１Ｎ１、ＣＯＳ−７またはＨＥＫ−２９３細胞を、７５ｃｍ²フラスコに播種し、以前の記載¹¹の通りにリン酸カルシウム沈殿法によって形質移入した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた実験には（下記も参照）、プレーティングの後に、Ｆｕｇｅｎｅ（商標）中にある様々なオリゴをＨＥＫ−２９３細胞に形質移入した。カルシウムイメージング検査には、１３２１Ｎ１細胞およびＣＯＳ７細胞を、直径２．４ｃｍのカバーガラス上に播種した（１００×１０³細胞）。選択的実験では、ＰＴＸ感受性のＧ_iタンパク質を阻害するために、細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＰＴＸ（Ｓｉｇｍａ社）に１８時間曝露した後、膜を調製した。オリゴヌクレオチドを用いて培養細胞の処置をするためには、１３×１０⁴のＨＥＫ−２９３細胞を９ｃｍ²の培養皿上に播種し、補足図４に記載の通りに処置した。

試薬。すべての培地および血清はＣｅｌｂｉｏ社から入手した。Ｆｕｇｅｎｅ（商標）を除いて、ＲＴ−ＰＣＲ、クローニング、および形質移入用のすべての試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手した。ＦｕｇｅｎｅはＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社から入手した。ＬＴＤ₄は、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（米国ミシガン州Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）から購入した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴ設計の一般的な判定規準に従って選択され、ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ社ＡＧによって合成された。詳細には、以前の適応²⁵に従って熱学的判定規準を設定し、内部ループ、６塩基対以上のパリンドローム、またはヌクレオチド反復（３塩基対超）を回避するように配慮し、可能な場合には、ＲＮＡｓｅ分解の対象となることが示されているＡＧＧＧコンセンサス配列が、設計するオリゴに含有されるようにした（補足図４のオリゴ６１６および２４１を参照）²⁶。ヘアピンのループ部分にマッピングされたオリゴを選択するために、オリゴアンチセンス配列を、ＧｅｎｅＢｅｅサービス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｂｅｅ．ｍｓｕ．ｓｕ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｒｎａ２＿ｒｅｄｕｃｅｄ．ｈｔｍｌ）を用いて予測されたＧＰＲ１７ＲＮＡの二次構造上にマッピングし、スクランブルオリゴヌクレオチドは、６１６オリゴに基づいてランダムに作製した。発明者らは、潜在的な毒性を回避するために、改変されていないオリゴヌクレオチドを使用するように選択したが、一方で、複数の送達実験設計が安定性の問題に直面していた（図５の記号一覧およびテキストを参照）。ラットゲノム中における多重標的配列の存在を排除するために、ＢＬＡＳＴＡプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を使用し、ラットＧｅｎｅｂａｎｋに対して各オリゴアンチセンス配列を検索した。他のすべての試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手した。

全ＲＮＡの単離およびＰＣＲ分析。全ＲＮＡの抽出は、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を製造業者の指示に従って使用して行った。ｃＤＮＡへの逆転写およびＰＣＲ反応は、以前の記載の通りに行った¹¹。

ヒトおよびラットＧＰＲ１７のクローニングおよび異種発現。以前に報告されているヒト受容体配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３３４４７）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の外部にある、以下の特異的なオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いて、ヒト星状細胞腫ＡＤＦ細胞から１０８７ｂｐの産物を増幅した。

Ｆｗ：５’−ＧＡＣ−ＴＣＣ−ＡＧＣ−ＣＡＡ−ＡＧＣ−ＡＴＧ−ＡＡ−３’
Ｒｗ：５’−ＧＧＧ−ＴＣＴ−ＧＣＴ−ＧＡＧ−ＴＣＣ−ＴＡＡ−ＡＣＡ−３’
増幅産物は、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ発現キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、イタリア国ミラノ）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターにクローニングした。ｈＧＰＲ１７のヌクレオチド配列を用いてラットＨＴＧＳデータベースを検索することによって、類似性の高い（８９％同一）配列が、１８番染色体スーパーコンティグに存在する（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＣ１１２０６２）ことが明らかになった。ラット配列における推定上の１０２０ｂｐＯＲＦの外部にある特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用することによって、発明者らは、ｒＧＰＲ１７をラット脳からクローニングした。コンストラクトは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＴｅｒｍｉｎａｔｏｒサイクル配列決定キットを用いた配列決定によって確認した。ＧＰＲ１７のマウスオーソログの部分配列がＧｅｎｂａｎｋ（ＡＹ２５５５４３）に報告されており、マウスＨＴＧＳデータベースでラット配列をプローブとして用いることによって、ＢＡＣクローン中に、上記ラット受容体に９８％同一な完全配列も見出した（ＡＣ１３１７６１）。

［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合アッセイ。１３２１Ｎ１細胞、ＣＯＳ−７細胞、およびＨＥＫ−２９３細胞（対照および形質移入細胞）を５ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４で均質化し、４℃、４８０００ｇで１５分間遠心を行った。その結果得られたペレット（原形質膜）は、５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、ｐＨ７．４で洗浄し、使用するまで−８０℃で保存した。ヒトまたはラットＧＰＲ１７受容体を発現する細胞の膜への、ヌクレオチド刺激［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の測定を以前の記載通りに行った⁹〜¹¹。

機能的カルシウムイメージングアッセイ。細胞内カルシウム濃度［Ｃａ²⁺］_i）の測定は以前の記載通りに行った²⁷。形質移入の４８時間後に、Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ液中の２μＭ Ｆｕｒａ−２ペントアセトキシメチルエステルを１３２１Ｎ１細胞およびＣＯＳ７細胞に添加し、細胞を洗浄し、カルシウムユニットを備えた倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ１００；Ｚｅｉｓｓ社、米国ニューヨーク州）の記録チャンバーに移した。光源には、Ｐｏｌｙｃｈｒｏｍｅ ＩＶ（ＴＩＬＬ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ社、独国）を用いた。Ｆｕｒａ−２およびＥＧＦＰ蛍光画像は、ＰＣＯ Ｓｕｐｅｒ ＶＧＡ ＳｅｎｓｉＣａｍ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、米国カリフォルニア州Ｆｏｒｅｓｔ Ｃｉｔｙ）で収集し、Ａｘｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ２．２ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて分析した。画像は、１〜４ ３４０／３８０比率／ｓで取得した。

ラットにおける局所性脳虚血の誘導。以前の記載の通り²⁸、2⁹、永久的な中大脳動脈閉塞（ＭＣＡｏ）をオスのＳＤラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社）で起こした。薬物療法は以下の通り、モンテルカスト（２ｍｇ／ｋｇ、静脈内（ｉ．ｖ．）、２００μｌの生理溶液中の単一ボーラス）、およびＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ（４．５μｇ／動物、脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）、５μｌ生理溶液中）を、ＭＣＡｏの１０分間後に投与した。ＡＲ−Ｃは、ここでは、脳虚血におけるＧＰＲ１７の関与を単純に試験するために用いた。ＡＲ−Ｃは、極めて極性の強い分子であり、血液脳関門での透過が極めて乏しい可能性が高く、ｉ．ｃ．ｖ．投与を行った。オリゴ６１６およびオリゴスクランブル（５μｌの生理溶液中に４００ｎｇ）は、ＭＣＡｏの４８時間前、２４時間前、および１０分間後の３回それぞれのラットにｉ．ｃ．ｖ．投与した。対照群には対応する媒体をｉ．ｃ．ｖ．投与した。

磁気共鳴映像分析。ＭＲＩ測定は、ＭＣＡｏの２、２４、および４８時間後に、マイクロイメージングアクセサリーを備えたＢｒｕｋｅｒ社ＡＭＸ３スペクトロメーターの４．７Ｔ垂直超大口径磁石を用いて行った。動物製剤、画像取得、トレースの拡散テルソルマッピング計算、虚血容積測定、および虚血性損傷の経時的進行は、以前に記載の通りであった³⁰。

統計的分析。［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合データは、非線形多目的曲線適合コンピュータプログラムであるＧｒａｐｈ−Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ社）によって、分析およびグラフ表示を行った。カルシウムイメージングでは、対照細胞で記録された平均Ｆ３４０／３８０増大に対して、データの正規化を行った。すべてのデータは、トリプリケートで行った４〜１８回の実験の平均±ＳＥＭとして表している。統計的分析は、スチューデントのｔ検定または一元配置分散分析（シェッフェ法）のいずれかによって行った。有意性は、Ｐ＜０．０５が得られた場合の結果を意味する。

結果
ＧＰＲ１７：Ｐ２ＹおよびＣｙｓＬＴ受容体の双方に近縁
ＧＰＲ１７の天然リガンドを求めて、発明者らは、最初にヒトおよびラット受容体のコード配列をクローニングし、分析した。それ以前に同定されていなかったラットオーソログは、ヒト配列と８９％のアミノ酸同一性を示した（図１ａ；図１．１）。推定タンパク質の疎水性親水性プロフィールは、ＧＰＣＲの典型的な７回膜貫通（７ＴＭ）構造と一致していた（同上）。ラット、マウス、およびヒトタンパク質の多重アラインメントは、ＴＭ３、ＴＭ６、およびＴＭ７のほとんど完全なオーバーラップ、ならびにＴＭ６の典型的なアミノ酸モチーフ（Ｈ−Ｘ−Ｘ−Ｒ）が保存されていることを示した。このアミノ酸モチーフは、すべての知られているＰ２ＹおよびＣｙｓＬＴ受容体にも存在しており、内因性のリガンドの結合に（少なくともヌクレオチド受容体には）必須であると提案されている⁵〜⁷（図１ａ）。以前の組織分布データと一致して⁸、ヒトおよびラットＧＰＲ１７は両方とも、脳で最も高い発現レベルを示し、それに腎臓および心臓が続き、肝臓および肺では有意な発現がなかった（図１ｂ）。ｈＧＰＲ１７ ｍＲＮＡは、試験したいくつかの細胞系でも見出された（図１の記号一覧を参照）。既知のＰ２ＹおよびＣｙｓＬＴ受容体に対するｈＧＰＲ１７の同一性および類似性を図２．１に示す。Ｐ２Ｙ₁（５６％）との類似性が最も高く、それに続いて、ＣｙｓＬＴ₂（５４％）、ＣｙｓＬＴ₁（５３％）、Ｐ２Ｙ₄（５３％）、Ｐ２Ｙ₂（５２％）、Ｐ２Ｙ₁₁（５０％）、Ｐ２Ｙ₁₃（４９％）、Ｐ２Ｙ₁₄（４８％）、Ｐ２Ｙ₁₂（４７％）、Ｐ２Ｙ₆（４５％）であった。これらの受容体との間にある系統関係を図１ｃに示す。予測された通り、ＣｙｓＬＴ₁およびＣｙｓＬＴ₂受容体は、同じクラスターに属し、一方、Ｐ２Ｙ受容体は、系統的に異なる２つの部分集団でクラスター形成をする。これらの一方は、Ｐ２Ｙ1、2、4、6、₁₁を包含し、もう一方は、Ｐ２Ｙ₁₂、13、₁₄ ²を包含する。ＧＰＲ１７は、Ｐ２Ｙ₁₂、13、₁₄部分集団と、ＣｙｓＬＴ₁およびＣｙｓＬＴ₂群との間の中間的位置にある。したがって、リガンド特異性は、系統的位置に基づいて単純に予測することができず、未知のままである（図１ｃ）。

機能的特性分析はＧＰＲ１７の薬学的二元性を示す。

ＧＰＲ１７の内因性リガンドを同定するために、ヒトおよびラットＧＰＲ１７のｃＤＮＡをほ乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にクローニングし、機能的特性分析を行うために、１３２１Ｎ１、ＣＯＳ−７、およびＨＥＫ−２９３細胞に形質移入した。ＧＰＲ１７活性化を、外因的に添加されたリガンドが、形質移入細胞から得られた精製膜への［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を増強する能力を試験することによって評価した⁹〜¹¹。１３２１Ｎ１細胞（この細胞は、機能的なＰ２Ｙ受容体もＣｙｓＬＴ受容体も構成的に発現しない¹²（Ｒｏｖａｔｉ ＧＥおよびＡｂｂｒａｃｃｈｉｏ ＭＰ、未発表の観察））では、異種ｈＧＰＲ１７発現（図２ｂ）によって、特異的かつ濃度依存的な、ｃｙｓＬＴであるＬＴＤ₄およびＬＴＣ₄に対する反応（効力の順位はＬＴＣ₄＞＞ＬＴＤ₄であった）、ならびにウラシルヌクレオチドであるＵＤＰ、ＵＤＰグルコース、およびＵＤＰガラクトースに対する反応（効力の順位はＵＤＰガラクトース＝ＵＤＰ＞ＵＤＰグルコースであった）（図２ａ）の出現が誘導された。他のヌクレオチドまたはヌクレオシド（すなわち、ＡＴＰ、ＡＤＰ、２−メチル−チオ−ＡＤＰ、ＵＴＰ、α，βメチレンＡＴＰ、およびグアノシン；これらはすべて１０および５０μＭの濃度で試験された）には、いかなる効果もなかった。したがって、ｃｙｓＬＴに対するＧＰＲ１７のアゴニスト反応プロフィールは、ＣｙｓＬＴ₁およびＣｙｓＬＴ₂3、¹³の両方に対するものとは異なっており、ヌクレオチドに関しては、Ｐ２Ｙ₆受容体と、Ｐ２Ｙ₁₄受容体1、²との間の中間にある。興味深いことに、ＧＰＲ１７のアゴニスト刺激の最大半量反応（ＥＣ₅₀）を与える濃度は、既知のＣｙｓＬＴおよびＰ２Ｙ受容体1、3、¹³の特徴に一致している。すなわち、ｃｙｓ−ＬＴではナノモル濃度（ｎＭ）の範囲にあり、ウラシルヌクレオチドでは、μモル濃度（μＭ）の範囲にある（図２；表１も参照）。これは、特定の病態生理学的状態を反映したリガンド濃度の相違に応じて、ＧＰＲ１７がｃｙｓ−ＬＴのみに反応することも、あるいはｃｙｓ−ＬＴおよびヌクレオチドの両方に反応することもできることを示唆している（下記も参照）。同様にして、新たにクローニングされたラット受容体を１３２１Ｎ１細胞に形質移入したところ、ｒＧＰＲ１７発現（図２ｄ）、ｎＭのＬＴＤ₄およびＬＴＣ₄に対する特異的反応、ならびにμＭのＵＤＰおよびＵＤＰグルコースに対する特異的反応の出現（図２ｃ）がもたらされた。しかし、興味深い相違が、ヒト受容体とラット受容体との薬理学的反応プロフィールを比較することによって、検出された。ヒト受容体とは異なり、ラット受容体では、ＵＤＰよりＵＤＰグルコースが有効であり、ＵＤＰガラクトースはいかなる効果も誘導しなかった。さらに、ラット受容体では、ｃｙｓ−ＬＴ相互の相対力価が逆であり、ＬＴＤ₄はＬＴＣ₄より約１０倍有効であった（図２および表１）。ヒト受容体のリガンド特異性は、ＣＯＳ−７細胞およびＨＥＫ−２９３細胞でも確認された。ＣＯＳ−７細胞（この細胞はｃｙｓ−ＬＴ¹³に対して構成的に反応しない）への形質移入は、ＬＴＤ₄およびＬＴＣ₄に対する反応を誘導した（図２ｅ）。ＣＯＳ−７細胞は、いくつかのＰ２Ｙ受容体¹⁴を発現し（Ｆｕｍａｇａｌｌｉ Ｍ、Ｖｅｒｄｅｒｉｏ Ｃ、およびＡｂｂｒａｃｃｈｉｏ ＭＰ、未発表の観察）、したがって、これらの細胞ではＧＰＲ１７の「プリン作動性」の構成要素を研究することができなかった。ＨＥＫ−２９３細胞へのｈＧＰＲ１７の形質移入も、１３２１Ｎ１細胞で観測されたものと同様な効力の順位およびＥＣ₅₀値で、ＵＤＰ、ＵＤＰグルコース、およびＵＤＰガラクトースに対する反応を誘導した（図２ｆ；表１）。いずれの細胞システムでも、対応する空のベクターを形質移入した細胞では、いかなる反応もこれまで観測されなかった（データは示されていない）。ヒトまたはラット受容体を発現する１３２１Ｎ１細胞において、ヌクレオチドおよびｃｙｓ−ＬＴによって誘起された［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の増大を相殺する、いくつかのプリン作動性受容体アンタゴニストおよびロイコトリエン受容体アンタゴニストの能力を評価することによって、ＧＰＲ１７反応の特異性も検証した。ＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ（Ｐ２Ｙ₁₂およびＰ２Ｙ₁₃の選択的アゴニストであると報告されている¹⁰、11、¹⁵）およびＰ２Ｙ₁受容体の選択的アンタゴニストであるＭＲＳ２１７９⁷は両方とも、ヒト受容体を発現する細胞の膜において、最大半量抑制（ＩＣ₅₀）を与える濃度がｎＭ範囲で、５０μＭ ＵＤＰグルコースによって刺激された［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を濃度依存的に阻害した（図３ａ；表１）。これらの同じアンタゴニストが、５０μＭ ＵＤＰグルコースによって誘導された、ラット受容体に対する作用も抑制した（図３ｂ；表１）。しかし、ｐモル濃度（ｐＭ）の範囲のＩＣ₅₀値によって示された通り（図３ｂ）、両アンタゴニストとも、ＵＤＰグルコースによって誘導されたラット受容体の活性化を抑制する方が有意に、より効果的であった（図３ｂ；表１）。さらに、ヒト受容体とは異なり、ｒＧＰＲ１７に対しては、ＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸよりＭＲＳ２１７９の方が有効であった（同上）。ＧＰＲ１７の病態生理学的機能の選択的な調節因子を同定することを目的として、齧歯動物を前臨床研究のためのモデルとして用いる場合には、ヒトおよびラットＧＰＲ１７に関して上記に報告されているアゴニスト反応プロフィールにおける相違（図２）と共に、これらの生物種による相違を考慮に入れなければならない。逆に、ＣｙｓＬＴ₁アンタゴニストであるモンテルカストおよびプランルカスト3、¹³は、ｎＭ範囲のＩＣ₅₀値および同様な相対効力（図３ｄ；表１も参照）で、１００ｎＭのＬＴＤ₄によって誘導されたヒトおよびラット受容体の活性化を濃度依存的に阻害した（図３ｃ）。一部のＰ２ＹまたはＣｙｓＬＴ受容体サブタイプのみに選択的アンタゴニストとして作用することが知られているリガンドに、ＧＰＲ１７が結合できることが実証されたことは、「プリンクラスター」のより最近のメンバーに対する、ＧＰＲ１７の系統学的な位置と一致している。これらのリガンドに結合する能力は、系統学的により最近の受容体の方向に進化が進むのと平行して徐々に失われてきたものなのかもしれない。Ｐ２Ｙ2、¹¹、1²およびＣｙｓＬＴ受容体3、¹³は両方ともＧ_iサブファミリーのＧタンパク質と結合できるので、このクラスのＧタンパク質の関与を評価するために、膜の調製および［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の前に、発明者らは、ｈＧＰＲ１７を発現する１３２１Ｎ１細胞を、Ｇ_iタンパク質を不活性化する百日咳毒素（ＰＴＸ）とプレインキュベートした。ＰＴＸは、ＵＤＰ、ＵＤＰガラクトース、ＵＤＰグルコース、またはＬＴＤ₄によって刺激された［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を強く抑制し、それによって、このタイプのＧタンパク質がＧＰＲ１７反応にとって必須である役割を果たしていることを確立した（図３．１）。最後に、Ｐ２ＹおよびＣｙｓＬＴ受容体は両方ともホスホリパーゼＣにも結合でき、細胞内カルシウム［Ｃａ²⁺］_I2、3、¹³を増大させることを実証するデータに基づいて、ＧＰＲ１７のアゴニスト反応特異性も、単一細胞カルシウムイメージングによって調査した。１３２１Ｎ１細胞でｈＧＰＲ１７を発現させたところ、ＵＤＰグルコース（図４ａ）、ＵＤＰ（図４ｂ）、ＵＤＰガラクトース（図４ｃ）、またはＬＴＤ₄（図４ｄ）を添加した際に、全細胞の約３０％のみであるが、［Ｃａ²⁺］_iの上昇が誘導された。空のベクター（図４ｅ〜ｈ）を形質移入した細胞ではいかなる反応も観測されなかった。ＣＯＳ−７細胞におけるｈＧＰＲ１７の発現は、約５０％の細胞（図４ｊ）で、ＬＴＤ₄に対する［Ｃａ²⁺］_iの一時的反応を誘導した。これらの反応は、陽性対照として使用されたｈＣｙｓＬＴ₁受容体を形質移入した約４５％の細胞で観測された反応と同じものであった（図４ｉ）。空のプラスミド（図４ｋ）を形質移入したＣＯＳ−７細胞ではいかなる反応も観測されなかった。

ＧＰＲ１７の阻害は虚血性脳損傷の拡大を防止する
ＧＰＲ１７の病態生理学的役割を特徴付けるために、外傷性組織および虚血組織でｃｙｓ−ＬＴおよびヌクレオチドの両方の大規模な蓄積があることを示すデータ（Ｂｕｒｎｓｔｏｃｋ ＆ Ｋｎｉｇｈｔ、２００４年；Ｃｉｃｅｒｉら、２００１年；Ｏｈｔｓｕｋｉら、１９９５年）に基づいて、そして、虚血性損傷が起こる典型的な臓器で限定的な受容体発現があることを実証する発明者らの以前の結果（図１ｂ）に基づいて、恒久的な虚血性損傷が確立されている動物モデル（ラットの単側部中脳動脈塞栓、ＭＣＡｏ）を利用することによって、脳虚血におけるＧＰＲ１７の関与を試験した。予測された通り、ＭＣＡｏの２、２４、および４８時間後に、生きている同一の動物で行った、進行中の損傷の磁気共鳴映像（ＭＲＩ）は、対照（媒体で処理された）ラットでは、反対側の非病変側と比較して、２時間後と４８時間後との間で、病変半球における脳梗塞容積が劇的に増大したことを示した（図５でＣ１、Ｃ２、およびＣ３と指示されている対照動物を参照のこと）。ＭＣＡｏの１０分後に行った、モンテルカストまたはＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ異種発現系においてＧＰＲ１７の有効なアンタゴニストであることが立証されている、図３を参照）のいずれかを用いた、虚血動物のｉｎ ｖｉｖｏ治療（詳細には記号一覧を参照）によって、２時間後と比較して損傷の拡大が顕著に防止された（図５）。これは、ＧＰＲ１７が虚血性損傷の拡大に寄与していることを示す。しかし、モンテルカストおよびＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸは、それぞれＣｙｓＬＴ₁およびＰ２Ｙ₁₂、1₃受容体3、¹⁰、11、¹⁵の強力なアンタゴニストでもあり、さらに、これらの受容体の一部はラット脳で発現されているので（同上）、脳損傷の防止にＧＰＲ１７が特異的に関与していることを立証するために、発明者らは、アンチセンスオリゴヌクレオチド戦略¹⁸を利用することによって、ＧＰＲ１７の発現をｉｎ ｖｉｖｏで選択的にノックダウンした。アンチセンスオリゴヌクレオチド戦略は、脳内で極めて効率的かつ特異的にいくつかの他のＧＰＣＲの発現を下方調節することが立証されている¹⁹、2⁰。これを実行するため、ｒＧＰＲ１７ ｍＲＮＡの配列を基にして、いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチド（図４．１ではオリゴＳＴＡＲＴ、オリゴ９９、オリゴ２４１、オリゴ−６１６、およびオリゴＥＮＤとして示されている）を設計し、ＨＥＫ−２９３細胞で異種的にｉｎ ｖｉｔｒｏ発現させたｒＧＰＲ１７のｍＲＮＡを下方調節するそれらの能力を試験した。平行して、ランダムに生成させた「スクランブル」オリゴヌクレオチド配列を内部対照として用いた。これらすべてのアンチセンスオリゴヌクレオチドのうち、オリゴ６１６、およびより少ない程度でオリゴ２４１のみが、ＨＥＫ−２９３細胞中でｒＧＰＲ１７のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を低減することができた（図４．１を参照）。そのため、それらをｉｎ ｖｉｖｏでのＭＣＡｏ研究用に選択した。多重送達実験プロトコールを利用することによって、これらのオリゴヌクレオチドをｉｎ ｖｉｖｏ投与した。モンテルカストおよびＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸと同様にして、ＭＣＡｏの４８および２４時間前、ならびに１０分後に、オリゴ６１６を虚血性ラットに繰り返し脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）注射（４００ｎｇ／動物）することによって、病変半球内の梗塞サイズの拡大が顕著かつ有意に減弱された（図５）。これより小さい防御効果がオリゴ２４１で観測された（データは示されていない）。非特異的な「スクランブル」オリゴヌクレオチドを注射された動物では、虚血性損傷の程度にいかなる効果も観測されなかった（図５）。それに続く実験では、ＭＣＡｏの１０分後のみに行ったオリゴ６１６の単回累積（１２００ｎｇ／ｍｌ）ｉ．ｃ．ｖ．投与も、脳損傷に対する同様な防御をもたらした（データは示されていない）。これらのデータは、アンタゴニストリガンドまたは受容体のノックダウンによるＧＰＲ１７の阻害が、虚血性脳損傷に対する防御をもたらすことを示唆し、それによって、損傷の進行におけるこの受容体の決定的役割を確認するものである。虚血が誘導（される前ではなく）された後に、受容体阻害またはノックダウンが実現した場合でさえ、この防御を獲得することができる。したがって、この受容体は、卒中治療の新規治療方法を開発するための極めて重要な生物学的標的となる。

ＧＰＲ１７の配列、発現および進化系統樹を示す図である。 ｈＧＰＲ１７のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列である。 ヒトおよびラット受容体を発現する細胞における［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合によるＧＰＲ１７アゴニストの特異性を示すグラフである。 ＧＰＲ１７と、ｈＰ２Ｙ1、2、3、4、6、₁₁、12、₁₃、1₄、ならびにＣｙｓＬＴ１およびＣｙｓＬＴ２受容体の配列多重アラインメントを示す図である。 ［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合アッセイにおける、組換え体ＧＰＲ１７の活性化に対するＰ２ＹおよびＣｙｓＬＴ₁受容体アンタゴニストの作用を示すグラフである。 Ｇｉタンパク質阻害剤であるＰＴＸで前処置された細胞の膜における、ヌクレオチドおよびｃｙｓ−ＬＴに対する反応の消滅を示すグラフである。 ｈＧＰＲ１７を発現する１３２１Ｎ１細胞またはＣＯＳ７細胞の単一細胞カルシウムイメージングの結果を示すグラフである。 ｒＧＰＲ１７ ｍＲＮＡに関する合成アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的配列を示す。 ＭＣＡｏの２、２４、４８時間後にＭＲＩによって測定された脳梗塞面積の拡大への、モンテルカスト（Ｍｔｋ）、ＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ（ＡＲ−Ｃ）、およびオリゴ６１６の作用を示すグラフである。

Claims (17)

1. ＧＰＲ１７調節因子を同定する方法であって、
   ａ）システイニルロイコトリエン受容体と相互作用できないヌクレオチド誘導体または類似体である候補化合物に、ＧＰＲ１７を接触させるステップと、
   ｂ）前記受容体の反応を決定するステップと、
   を本質的に含む方法。
2. 細胞ベースのシステムで実施されるか、あるいは細胞調製物または細胞画分を用いて実施される、請求項１に記載の方法。
3. 前記受容体の反応が［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合アッセイによって決定される、請求項１に記載の方法。
4. 受容体アンタゴニストを同定するための、請求項１に記載の方法。
5. ステップ（ａ）が、ＧＰＲ１７のヌクレオチド認識部位に結合できる化合物の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
6. 前記化合物が、ＵＤＰ、ＵＤＰ−グルコース、およびＵＤＰ−ガラクトースから選択される、請求項５に記載の方法。
7. 配列番号１および配列番号２から選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその機能的類似体。
8. ＧＰＲ１７の活性化が関与する障害を治療する治療薬を調製するための、受容体ヌクレオチド結合部位と相互作用するＧＰＲ１７アンタゴニストの使用。
9. Ｎ６−メチル−アデノシン−３’，５’−二リン酸、およびＮ６−メチルチオ−エチル−２−トリフルオロメチルエチルチオ−アデノシン−５’−β−メチレンγ−ジクロロメチレン三リン酸から選択された化合物の、請求項７に記載の使用。
10. ＧＰＲ１７の活性化が関与する障害を治療する治療薬を調製するための、ヌクレオチドおよびロイコトリエン受容体結合部位それぞれに作用するＧＰＲ１７アンタゴニストの組合せの使用。
11. モンテルカスト、プランルカスト、および３（３（３（２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル）フェニル）−（３−ジメチルアミノ−３−オキソプロピル）チオ）メチル）チオ）プロパン酸から選択された化合物と組み合わせた、Ｎ６−メチル−アデノシン−３’，５’−二リン酸、およびＮ６−メチルチオ−エチル−２−トリフルオロメチルエチルチオ−アデノシン−５’−β−メチレンγ−ジクロロメチレン三リン酸から選択された化合物の、請求項９に記載の使用。
12. 診断用組成物を調製するための、ＧＰＲ１７ヌクレオチド結合部位と相互作用する化合物の使用。
13. 神経保護剤、抗炎症剤、および抗虚血剤を調製するための、請求項７から１０に記載の使用。
14. 脳、心臓、および腎の虚血を治療するのに有用な治療薬を調製するための、請求項１２に記載の使用。
15. 配列番号１および配列番号２から選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの、請求項１３に記載の使用。
16. 虚血性脳損傷を治療するための、配列番号１および配列番号２から選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
17. 虚血性の脳障害、心臓障害、および腎障害を治療する治療薬を調製するための、配列番号１および配列番号２に対して作られた低分子干渉ＲＮＡの使用。

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