JP2008514550A - Ｍｃｓｐの表面発現を証明する細胞の細胞傷害性媒介 - Google Patents

Abstract

本発明は、癌疾患の診断および治療、詳細には、腫瘍細胞の細胞傷害性の媒介、最も詳細には、細胞傷害応答の開始手段としての、任意選択的に、１つまたは複数の化学療法薬と組み合わせた癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の使用に関する。本発明は、さらに、本発明のＣＤＭＡＢを使用する結合アッセイに関する。
【選択図】図１２

Description

発明の分野
本発明は、癌疾患の診断および治療、詳細には、腫瘍細胞の細胞傷害性の媒介、最も詳細には、細胞傷害応答の開始手段としての、任意選択的に、１つまたは複数の化学療法薬と組み合わせた癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の使用に関する。本発明は、さらに、本発明のＣＤＭＡＢを使用する結合アッセイに関する。

発明の背景
黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）は、ヒト転移性黒色腫細胞株に対するモノクローナル抗体を開発した研究者によってそれぞれ独自に同定された。黒色腫細胞表面に会合する特異的抗原と反応する抗原がいくつか見出されている。これらの抗体は個別に産生されたので、標的抗原名によって複数の名称を有するが、その後、これら全てをＭＣＳＰとした。したがって、ＭＣＳＰはまた、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ヒト黒色腫プロテオグリカン（ＨＭＰ）、黒色腫関連プロテオグリカン抗原（ＭＰＧ）、および黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ｍｅｌ−ＣＳＰＧ）と呼ばれており、種々の特異的抗体の抗原として同定されており、そのいくつかを以下に記載している。ＭＣＳＰはまた、ラットプロテオグリカンＮＧ２と８０％を超えて相同であることが見出され、それにより、それにちなんだ名称もある。

ＭＣＳＰは、２５０ｋＤａのＮ結合糖タンパク質および４５０ｋＤａを超えるプロテオグリカン成分からなる糖タンパク質−プロテオグリカン複合体である。コア糖タンパク質は、遊離糖タンパク質として黒色腫細胞表面上に存在するか、コンドロイチン硫酸の付加によって修飾されている。ＭＣＳＰの分子クローニングにより、いくつかの構造の特徴が同定されている。全部で１０個のシステイン（５つのジスルフィド結合を形成する見込みがある）、１５個の可能なＮ結合グリコシル化部位、および１１個の潜在的なコンドロイチン硫酸結合部位を含む３つの細胞外ドメインが存在する。膜貫通セグメントは、１つのシステインを含むが、この残基の機能的意義は確立されていない。細胞質ドメインは、プロテインキナーゼＣによるリン酸化部位としての機能を果たし得る３つのトレオニン残基を有するにもかかわらず、ＭＣＳＰがリン酸化されることは依然として示されていない。

ＭＣＳＰが黒色腫の大部分で発現されることが示されており、当初は、正常な細胞および他の腫瘍型での分布は非常に限られていると考えられていた。この結論を導いた１つの初期の研究は、抗ＭＣＳＰ抗体Ｂ５を使用してＭＣＳＰの分布を決定するためにホルムアルデヒドまたはメタノールで固定した正常組織および腫瘍組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）を使用した。この研究では、抗体Ｂ５は、試験した２２種の黒色腫腫瘍のうちの１７種、試験した２種の星状細胞腫のうちの２種が反応し、試験した２３種の癌腫とは反応しないことが見出された。試験した２２種の正常組織のうち、Ｂ５は、皮膚角化細胞、肺胞上皮、および毛細管内皮のみと結合することが見出された。

別の研究は、凍結組織切片を使用した抗ＭＣＳＰ抗体９．２．２７によって定義されるＭＣＳＰの組織分布を試験した。また、反応性は、試験した全ての黒色腫組織および細胞株で見出されたが、試験した６つの種々の癌腫瘍（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｕｍｏｒ）のいずれにおいても反応性は示されなかった。試験した７種の胎児組織のうち、皮膚のみで反応性を示し、且つ大動脈でわずかに反応性を示す一方で、成体組織では、試験した１３種の組織のうち３種しか反応性を示さなかった。

その後の研究では、抗ＭＣＳＰ抗体Ｂ５、９．２．２７、２２５．２８Ｓ、およびＡ０１２２（その全てが、ＭＣＳＰの個別のエピトープを認識する）を使用したＭＣＳＰの分布を試験した。この研究は、凍結組織に対して行われた。全ての抗ＭＣＳＰ抗体が類似の染色パターンを有し、以前に、ＭＣＳＰ陰性と考えられていた神経、間葉、および上皮起源の正常および悪性腫瘍と反応することが見出された。詳細には、抗体Ｂ５は、試験した２４種の器官中で種々の上皮組織、結合組織、神経組織、および筋組織と反応し、試験した３４種の種々の腫瘍のうち２８種で反応した。著者は、その所見と以前の報告との間の相違は、固定液の選択が重要であることに留意した、改良されてより一貫性のあるＩＨＣ技術の使用に起因すると説明しており、恐らく、ＭＣＳＰ抗原の重要な特徴がＩＨＣに関与する処理工程に対するその感受性であると結論づけられている。

超微細構造レベルでのＭＣＳＰを局在化するためのさらなる研究を行った。電子顕微鏡法を使用した免疫局在化研究により、ＭＣＳＰがほとんど排他的に微小突起（細胞−細胞接触および細胞−下層接着で役割を果たし得る黒色腫細胞表面の微小ドメイン）に局在することが証明された。

１９９６年のＭＣＳＰの分子クローニングでは、ＭＣＳＰｃＤＮＡプローブを使用した腫瘍細胞株および正常なヒト組織におけるＭＣＳＰ発現のノーザンブロット分析が可能であった。試験した８種の種々の腫瘍細胞株のうち、黒色腫細胞株中でのみＭＣＳＰの発現が認められた。ＭＣＳＰ発現は、試験した１６種の正常な成人の組織および４種の正常な胎児組織のいずれにも認められなかった。ＭＣＳＰの異なる組織局在化研究で見出された矛盾は、この抗原の実際の発現パターンを解明するか、報告された相違を説明するためにさらなる研究が必要であり得ることを示す。

プロテオグリカンは細胞−細胞相互作用および細胞−細胞外基質（ＥＣＭ）相互作用を媒介することが公知であるので、この過程におけるＭＣＳＰの役割を調査した。ＭＣＳＰは、黒色腫細胞のα４β１−インテグリン媒介性接着および拡大を刺激することが示されており、ＭＣＳＰコアタンパク質を介したシグナル伝達が細胞の接着および運動性を調節して腫瘍の侵入および転移に寄与し得るｐ１３０^ｃａｓの動員およびチロシンリン酸化を誘導することも提案されている。これらの結果の組み合わせにより、ＭＣＳＰがインテグリンの活性化および細胞骨格を再編成させる経路の刺激の両方によって黒色腫細胞の接着が増強するように機能することができることが示された。

ＭＣＳＰはまた、おそらくＭＣＳＰのコンドロイチン硫酸成分によって、膜結合型３−マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ３−ＭＭＰ）と会合することも見出されている。ｉｎ ｖｉｖｏにおける黒色腫中でのＭＴ３−ＭＭＰ発現が成長中の腫の周辺でＥＣＭタンパク質の分解を促進し、それにより、腫瘍が拡大することができる空間を得ることができることが示唆されている。したがって、ＭＴ３−ＭＭＰとＭＣＳＰとの間の会合は、黒色腫侵入を促進するための活性化工程であり得る。

腫瘍の侵入および転移に結合する過程におけるＭＣＳＰの役割を試験するために、抗ＭＣＳＰ抗体を使用したいくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが行われている。足場非依存性増殖におけるＭＣＳＰの役割を、抗体９．２．２７を使用して評価した。９．２．２７を含む軟寒天中で培養した黒色腫細胞は、そのコロニー形成の６７〜７４％の特異的減少を示した。これらの所見により、ＭＣＳＰが細胞−細胞相互作用に関与し、足場非依存性増殖に寄与し得ることが示唆された。同著者はまた、ウシ大動脈内皮（ＢＡＥ）細胞の基底膜上のＭ１４黒色腫細胞の接着を測定するアッセイにおける９．２．２７を使用したＭＣＳＰの遮断効果を試験した。９．２．２７処置の効果を、コントロールモノクローナル抗体Ｗ６／３２（全クラスＩ組織適合抗原に指向する）での処置と比較した。Ｍ１４コントロール細胞および抗体で前処置したＭ１４細胞を、ＢＡＥ細胞の基底膜上にプレートした。９．２．２７で２７％の細胞接着の有意な阻害が認められたのに対して、Ｗ６／３２処置細胞では有意な効果は認められなかった。９．２．２７での細胞の前処置のより顕著な効果は、走査電子顕微鏡法を使用して超微細構造レベルで検証された細胞拡大の阻害であった。

黒色腫細胞に対して開発され、ＭＣＳＰを特異的に認識することが決定された多数の抗体を、その抗癌効果を決定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイの両方で試験した。

モノクローナル抗体９．２．２７は、ＭＣＳＰのコア糖タンパク質成分を認識し、腫瘍抑制性について調査された最初の抗体の１つであった。Ｂｕｍｏｌ ｅｔ ａｌ．は、ヌードマウスで成長した黒色腫の免疫療法のために、９．２．２７および９．２．２７のジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）抱合体を調査した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイを、［^３５Ｓ］メチオニンのタンパク質組み込みによって示されるＭ２１ヒト黒色腫細胞におけるタンパク質合成に対する９．２．２７および９．２．２７−ＤＴＡ抱合体の効果の測定によって最初に行った。９．２．２７−ＤＴＡ抱合体は、Ｍ２１黒色腫細胞におけるタンパク質合成を有意に阻害したが、非抱合ＤＴＡでより高い効果が認められた。９．２．２７のみでは最小の効果しか認められなかった。９．２．２７および９．２．２７−ＤＴＡ抱合体の両方を、ヒト黒色腫保有ヌードマウスにおける抗腫瘍効果について調査した。Ｍ２１腫瘍をマウスに皮下移植し、３日間成長させ、３日目、およびその後３日間隔で９．２．２７または９．２．２７−ＤＴＡ抱合体のいずれでマウスを処置した。処置したマウスの腫瘍体積を、非処置コントロールマウスの腫瘍体積と比較した。１８日目に（データを報告した最後の日）、非処置コントロールと比較して、９．２．２７処置マウスは、６４％の腫瘍成長阻害を示す一方で、９．２．２７−ＤＴＡ抱合体処置マウスは、５２％の腫瘍成長阻害を示した。この最初の研究では、著者は、９．２．２７および９．２．２７−ＤＴＡ抱合体はヌードマウスにおけるＭ２１黒色腫の腫瘍成長の抑制に対するその効果がほぼ等しいと結論づけている。この最初の研究は、９．２．２７での処置による腫瘍成長のｉｎ ｖｉｖｏ抑制を報告しており、いくつかのその後の研究（同一著者による研究が含まれる）では、未修飾の（ｎａｋｅｄ）９．２．２７はいかなるｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果も示さないことが証明されている。集合的に、以下に概説するように、ヒト腫瘍の治療のための９．２．２７の有用性を調査するために実施した実験により、癌細胞は９．２．２７によってターゲティングされるが、抗癌活性は未修飾の抗体での処置に起因しないことが証明されている。

９．２．２７免疫抱合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を使用したその後の治療研究を予想して大量の９．２．２７を投与するようにデザインされた第Ｉ相臨床試験を行った。フローサイトメトリーおよび／または免疫ペルオキシダーゼ染色によって９．２．２７と腫瘍が反応した８人の悪性黒色腫患者に、単回用量の抗体を静脈内投与し、１、１０、５０、１００、および２００ｍｇの漸増用量で１週間に２回投与した。患者は少しの副作用も経験せず、９．２．２７が転移黒色腫結節に局在したにもかかわらず、臨床反応は認められなかった。

その後の研究では、９．２．２７を治療薬ドキソルビシン（ＤＸＲ）と抱合し、抱合体をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの黒色腫の成長阻害について調査した。ＤＸＲ−９．２．２７抱合体で処置したＭ２１細胞の成長阻害を、［^３Ｈ］チミジン組み込みアッセイを使用して測定した。抱合体は、Ｍ２１標的細胞の特異的用量依存性成長阻害を示し、且つＭＣＳＰネガティブコントロール細胞株に効果がなかった。９．２．２７のみの効果を試験するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを行わなかった。ＤＸＲ−９．２．２７抱合体をｉｎ ｖｉｖｏで調査するために、Ｍ２１細胞を皮下注射し、８〜１０日間腫瘍を確立させた。１０日目に皮下注射し、その後３日間隔で３０日間皮下注射した。ＤＸＲ−９．２．２７抱合体で処置したマウスのみで有意な腫瘍成長抑制が認められた。ＤＸＲ治療のみおよび９．２．２７治療のみでは腫瘍成長を抑制することができず、９．２．２７とＤＸＲとの混合物は類似の負の効果を示した。

９．２．２７抱合体の効果を調査する別の研究を行った。Ｓｃｈｒａｐｐｅ ｅｔ ａｌ．は、化学療法薬４−デスアセチルビンブラスチン−３−カルボキシヒドラジド（ＤＡＶＬＢＨＹ）を９．２．２７と抱合し、ヒト神経膠腫に対するその効果を試験した。ヌードマウスにＵ８７ＭＧ（ヒト神経膠腫細胞株）細胞を皮下注射し、２、５、７、および９日目に動物を処置した。腫瘍体積は、９．２．２７−ＤＡＶＬＢＨＹによって最も有効に減少した。ＰＢＳのみまたは９．２．２７のみで処置したコントロール群は、腫瘍が急速に成長し、９．２．２７処置マウスの腫瘍体積はＰＢＳ処置マウスと比較して減少しなかった。

ヒトＭ２１黒色腫細胞株に対して抗体２２５．２８Ｓを作製し、高分子量黒色腫関連抗原に反応することが最初に記載されている。この分子は、ＭＣＳＰと同一の分子であることがその後に示された。初期の研究では、ヒト黒色腫細胞株に対する２２５．２８Ｓ（ＩｇＧ_２ａ）の細胞溶解能力を試験し、その能力を別の抗ＭＣＳＰ抗体（ＩｇＧ_１であるクローン６５３．４０Ｓ）と比較した。２２５．２８Ｓおよび６５３．４０Ｓは、ＭＣＳＰ上の同一または空間的に近い抗原決定基を認識すると判断された。いずれの抗体もｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで補体と組み合わせて黒色腫細胞を溶解することができないことが見出された。両抗体は、抗体依存性細胞媒介性（ＡＤＣＣ）細胞傷害性アッセイで標的黒色腫細胞の溶解を媒介することができ、２２５．２８Ｓは６５３．４０Ｓよりも高い溶解活性を示した。しかし、抗黒色腫抗原抗体を使用した他者の報告よりも有意に高いエフェクター細胞／標的細胞比で黒色腫細胞の溶解が認められただけであった。著者は、ヒト補体組み合わせたこれらの抗体の細胞溶解活性の欠如およびＡＤＣＣで溶解させるのに高いエフェクター細胞／標的細胞比が必要であることにより、黒色腫患者へのモノクローナル抗体の注射が腫瘍細胞を破壊しそうにないことが示唆されると結論づけた。著者は、これらの抗体の免疫治療での使用は放射性同位体、化学療法薬、または毒剤（ｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔ）のキャリアとしての試料に制限されると示唆していた。

未修飾の抗体２２５．２８Ｓを、２人の末期黒色腫患者に１０ｍｇの用量で静脈内送達させる第Ｉ相試験でのその治療可能性について調査した。臨床的な副作用や大きな毒作用は認められず、これは抗体の投与に起因し得るが、正の治療応答も認められなかった。

抗体２２５．２８Ｓをピューロチオニン（ｐｕｒｏｔｈｉｏｎｉｎ）（分裂細胞に特異的に毒性を示す低分子量ポリペプチド）と抱合し、ヒト黒色腫細胞株Ｃｏｌｏ３８に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性について試験した。Ｃｏｌｏ３８細胞の２２５．２８Ｓ−ピューロチオニン抱合体との２４時間の培養によって^３Ｈ−チミジン取り込みが阻害されることが見出された。さらに、抱合体と７日間インキュベートした培養物でＣｏｌｏ３８細胞の生存度は劇的に減少した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性が認められたにもかかわらず、２２５．２８Ｓ−ピューロチオニン処置を生き残った黒色腫細胞が依然としてわずかに存在した。著者らは、悪性疾患の免疫療法は毒剤のキャリアとして異なる腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体のカクテルに依存しなければならず、２２５．２８Ｓ抱合体のみでは癌の治療に十分ではないと示唆した。２２５．２８Ｓ−ピューロチオニン抱合体の治療効果を、ヌードマウスにおけるヒト黒色腫の成長によって評価した。Ｃｏｌｏ３８細胞を、ヌードマウスに皮下または腹腔内に移植した。１、３、および５日目に腹腔内移植マウスを処置し、１、３、５、および２０日目に皮下移植マウスを処置した。全マウスの生存をモニタリングした。２２５．２８Ｓ−ピューロチオニン抱合体での処置した腹腔内移植マウスのみで統計的に有意な延命が認められた。２２５．２８Ｓのみ、ピューロチオニンのみ、または２２５．２８Ｓとピューロチオニンとの混合物では、腹腔内移植マウスまたは皮下移植マウスのいずれにおいても生存度は増加しなかった。皮下移植マウスの腫瘍体積も記録し、２２５．２８Ｓ−ピューロチオニン抱合体処置によって腫瘍体積が有意に減少することが見出された。２２５．２８Ｓのみでの処置では、腫瘍体積は減少しなかった。

２２５．２８Ｓを化学療法薬メトトレキセート（ＭＴＸ）とも抱合し、腫瘍成長に対するその効果をｉｎ ｖｉｖｏで調査した。ヌードマウスにＭ２１ヒト黒色腫細胞を皮下移植し、１、４、７、および１４日目に処置した。ＭＴＸ−２２５．２８Ｓ抱合体は、腫瘍成長を阻害した唯一の治療であった。２２５．２８Ｓのみ、ＭＴＸのみ、２２５．２８ＳとＭＴＸとの混合物では、腫瘍成長を阻害することができなかった。

２２５．２８Ｓを、異種性試薬の投与によるヒトにおける潜在的毒作用を調査するためにデザインした研究で使用した。８５人の転移性皮膚黒色腫患者に、^１３１Ｉ、^１２３Ｉ、^１１１Ｉｎ、^９９Ｔｃで標識したインタクトな２２５．２８ＳまたはＦ（ａｂ’）_２フラグメントのいずれかを投与した。抗体の注射量は、１４〜７５０μｇの範囲であった。いかなる患者においても臨床的に検出可能な副作用は認められなかった。臨床応答は報告されなかったが、必ずしもこの研究が毒物学的（ｔｏｘｏｌｏｇｉｃ）目的のためにデザインされていると期待されるわけではなかった。

２２５．２８Ｓを使用して、ＭＣＳＰの鏡像を有するマウス抗イディオタイプ抗体（抗体ＭＦ１１−３０が含まれる）を生成した。ＭＦ１１−３０は、同系および異種系の両方で抗ＭＣＳＰ抗体産生を誘導することが認められている。進行性悪性黒色腫患者における毒性および応答を試験するためにデザインされた漸増用量のＭＦ１１−３０を、２つの臨床試験で試験した。両研究では、抗体投与に起因する副作用はほとんど認められず、本治療法は十分に許容された。第２の試験では、少なくとも１：８の力価で抗−抗イディオタイプ抗体を産生し、且つ血清ＭＣＳＰレベルの顕著な変化が認められなかった７人の患者の平均生存度が５５週間（１６〜９５週間の範囲）であり、これは、その平均生存度が１９週間（８〜５７週間の範囲）の残りの１２人の患者（１：４の力価で抗−抗イディオタイプ抗体を産生するか、ＭＣＳＰの血清レベルが増加した患者）よりも有意に高かった。

黒色腫細胞に対する抗体７６３．７４も生成し、これは、ＭＣＳＰを認識する。抗体７６３．７４のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ抗癌効果を示すいかなる報告も存在していないが、この抗体を使用して、マウス抗イディオタイプモノクローナル抗体も生成されている。これらの抗体のうちの１つ（ＭＫ２−２３）は、抗ＭＣＳＰ抗体７６３．７４によって定義される決定基の内部イメージ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｉｍａｇｅ）を有する。前臨床試験では、ＭＫ２−２３での免疫化により、同系宿主（ＢＡＬＢ／ｃマウス）および異種宿主（ウサギ）の両方において抗ＭＣＳＰ抗体の産生が誘導されることが示された。ＭＫ２−２３の免疫原性は、キャリアタンパク質であるキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と抱合し、アジュバントと共に投与した場合に顕著に増強された。黒色腫患者におけるＭＫ２−２３によって誘導された体液性応答を特徴づけるための臨床試験を行った。０、７、および２８日目に２ｍｇのＫＬＨと抱合し、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）と混合したＭＫ２−２３の皮下注射を用いて、２５人のＩＶ期黒色腫患者を免疫化した。抗−抗イディオタイプ抗体の力価が低い場合、さらなる注射を行った。ＭＫ２−２３で免疫化した約６０％の患者が抗ＭＣＳＰ抗体を産生したが、抗ＭＣＳＰ抗体のレベルおよび親和性は低かった。ＭＫ２−２３での免疫化後に抗ＭＣＳＰ抗体を産生した患者の生存は産生してない患者よりも有意に長いことが見出された。抗ＭＣＳＰ抗体を産生した患者の生存度の中央値は５２週間（１９〜９３週間の範囲）である一方で、その血清中に検出可能な抗ＭＣＳＰ抗体を含まない９人の患者の生存度の中央値は１９週間（９〜４５週間の範囲）であった。抗ＭＣＳＰ抗体を産生した３人の患者は、その疾患の部分的寛解を経験した。この研究で有望な結果が達成されたにもかかわらず、ＭＫ２−２３で免疫化された４０％の患者は、検出可能な抗ＭＣＳＰ抗体と応答しなかった。さらに、部分的寛解を達成した３人の全患者が最終的に疾患の再発を経験した。いくつかの抑制細胞組の選択的不活化によって腫瘍関連抗原の細胞性応答および体液性応答を増強することが報告されている低容量のシクロホスファミド（ＣＴＸ）での患者の前処置によってＭＫ２−２３の免疫原性の増加が試みられた。しかし、ＭＫ２−２３の免疫原性に対するＣＴＸでの前処置の効果は検出されなかった。

モノクローナル抗体４８．７は、ヒト転移性黒色腫細胞株Ｍ１７３３に対して産生され、その後にＭＣＳＰであると決定された分子に対して反応することが報告された。第Ｉ相臨床試験で、４８．７を、ヒト黒色腫上に存在するトランスフェリン様細胞表面糖タンパク質ｐ９７に指向するマウスモノクローナル抗体９６．５と組み合わせて投与した。５人の患者に、それぞれ２ｍｇのｍＡｂ（９６．５および４８．７）を１日目に投与し、それぞれ１０ｍｇを２日目に投与し、それぞれ２５ｍｇを３〜１０日目に投与した。処置は十分に許容されたが、全患者で処置に対する臨床応答は存在せず、疾患が進行した。これらの２つの抗体を、黒色腫が中枢神経系に転移した３人の患者をこれらの抗体のうちの１つの放射性標識Ｆａｂフラグメントで処置する個別の臨床試験で調査した。２人の患者に、脳腫瘍への抗体の侵入を増強するための血液脳関門の浸透圧開放（ｏｓｍｏｔｉｃ ｏｐｅｎｉｎｇ）と併用して５ｍｇの４８．７の^１３１Ｉ標識Ｆａｂフラグメントを投与した。浸透圧ＢＢＢ修飾により、腫瘍保有半球および脊髄液へのＦａｂの送達が増加したが、腫瘍への抗体の明確な継続的局在化は認められなかった。著者は、局在化の欠如は抗体の不適切な投与に起因すると仮定した。

メリムン（Ｍｅｌｉｍｍｕｎｅ）は、ＭＣＳＰの個別のエピトープを模倣する２つのマウス抗イディオタイプ抗体（メリムン−１（Ｉ−Ｍｅｌ−１）およびメリムン−２（Ｉ−Ｍｅｌ−２））の二重調製物であった。Ｉ−Ｍｅｌ−１は、抗ＭＣＳＰ抗体２２５．２８に対して産生される抗イディオタイプ抗体ＭＦ１１−３０のサブクローンであった（前に考察）。Ｉ−Ｍｅｌ−１は、ウサギにおいて抗ＭＣＳＰ応答を誘導することが示された。Ｉ−Ｍｅｌ−２は、抗ＭＣＳＰ抗体ＭＥＭ１３６に対して産生される抗イディオタイプ抗体であり、ＭＣＳＰ上の２２５．２８と異なるエピトープと反応する。Ｉ−Ｍｅｌ−２はまた、ウサギにおいて抗ＭＣＳＰ応答を誘導することが示された。Ｉ−Ｍｅｌ−１およびＩ−Ｍｅｌ−２の１：１組成物を含むメリムン調製物を、転移性疾患の証拠のない黒色腫を切除した２１人の患者の第Ｉ相試験で使用した。１つの施設で参加したこれらの１２人の患者についての詳細な免疫応答分析を報告した。患者に、０．２〜４．０ｍｇ（Ｉ−Ｍｅｌ−１およびＩ−Ｍｅｌ−２をそれぞれ０．１〜２．０ｍｇ）の範囲の用量を使用した２つの治療スケジュールのうちの１つによってメリムンを投与した。全患者は、抗Ｉ−Ｍｅｌ−１抗体および抗Ｉ−Ｍｅｌ−２抗体の両方を産生し、１２人の患者のうちの１０人でＩ−Ｍｅｌ−２に対するピーク抗体応答がＩ−Ｍｅｌ−１よりも高かった。しかし、この研究では、患者の血清がＭＣＳＰ発現Ｍｅｌ−２１細胞への放射性標識２２５．２８の結合、Ｍｅｌ−２１細胞への放射性標識ＭＥＭ１３６の欠尾久のいずれも阻害することができなかったので、ＭＣＳＰに対する特異的抗体の誘導を証明することができなかった。直接細胞結合アッセイを使用して、患者の血清中の抗ＭＣＳＰ抗体の存在についてもアッセイしたが、ＦＡＣＳベースのアッセイにおいてＭ２１細胞への免疫後血清への結合と比較して、免疫前血清への結合に相違は認められなかった。

２６人の転移性黒色腫患者を、２ｍｇのＩ−Ｍｅｌ−２および１００μｇまたは２５０μｇのアジュバントＳＡＦ−ｍを２週間に１回４週間にわたって筋肉内送達させ、その後、疾患が進行するまで２ヶ月に１回筋肉内させて処置した個別の臨床試験でＩ−Ｍｅｌ−２を試験した。阻害放射免疫アッセイを使用して、２６人の患者のうちの５人で抗ＭＣＳＰ抗体が検出された。検出可能な抗ＭＣＳＰ抗体を５人の患者のうち、１人が完全な寛解を経験し、１人の疾患が安定化し、残りの３人の疾患が進行した。完全に寛解した患者の抗ＭＣＳＰ抗体の力価が最も高かった（１：１５００）。

先行特許
特許文献１（およびその関連特許：特許文献２、特許文献３）は、ＭＥＭ１３６に対する抗イディオタイプ抗体ＩＭｅｌｐｇ２（「ＩＭ３２」としても公知）、黒色腫に関連するヒトのプロテオグリカンに指向する抗体（「ＨＭＷ−ＭＡＡ」としても公知）を教示している。ＩＭｅｌｐｇ２抗体は、ＭＥＭ１３６に特異的に指向することが示され、細胞がＭＰＧエピトープを発現する疾患の診断および治療に役立つことが示唆された。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて決定したところ、腫瘍細胞侵入に対するＩＭｅｌｐｇ２の効果が認められたにもかかわらず、試験した抗体で最も有効というわけではなく、ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果も示さないが、Ａｂ３応答を示す。

特許文献４は、ＨＭＷ−ＭＡＡの定義していないエピトープに特異性を示すＭａｂ２２５．２８に対する抗イディオタイプ抗体を教示する。これらの抗体は、黒色腫の有効な免疫療法として有用である。ＭＦ１１−３０およびＩＭｅｌｐｇ１の両方ならびに２２５．２８に対するポリクローナル抗イディオタイプ抗体が報告されており、黒色腫患者において臨床試験を受けたＭＦ１１−３０を有する動物モデルで評価されているが、支持するデータは存在しなかった。ＭＦ１１−３０は、２２５．２８イディオタイプ抗体を誘導することができる。ＩＭｅｌｐｇ１細胞株は、ＢＭサイクリンでのＭＦ１１−３０細胞株の処置およびマイコプラズマ汚染の非存在についての試験に由来した。ＩＭｅｌｐｇ１に対する抗体をウサギ血清中で誘導することができ、Ｃｏｌｏ３８黒色腫細胞に結合することが示されているにもかかわらず、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいても殺腫瘍活性を示さなかった。

特許文献５は、不溶性免疫複合体からの抗体の産生を教示する。この場合、Ｍａｂ９．２．２７に対するラット抗イディオタイプ抗体（ＨＭＷ−ＭＡＡに指向する抗体）を、抗原用としてのプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅへの９．２．２７の固定によって生成した。黒色腫細胞に対する抗体を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに抱合した種々の細胞または細胞溶解物複合体を使用して産生した。黒色腫細胞に結合するが、正常なＴ細胞やＢ細胞に結合しないマウスモノクローナル抗体を、９．２．２７と比較した。以下の９．２．２７と類似の性質を有する抗体を、さらなる特徴付けのために選択した：ＮＲ−ＭＬ−０２、ＮＲ−ＭＬ−０３、ＮＲ−ＭＬ−０４、ＮＲ−ＭＬ− ０５、ＮＲ−ＭＬ−０６。これらの各抗体は、捕捉抗体としての９．２．２７および抗原供給源としての可溶化ＳＫ ＭＥＬ−２８黒色腫膜を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにおいて陽性であった。さらに、これらの抗体は、黒色腫腫瘍細胞を認識し、平滑筋細胞および内皮細胞とも反応すると特徴づけられた。１０種の抗体がＮＲ−ＭＬ−０２／ＮＲ−ＭＬ−０４と同一の決定基を認識し、３種の抗体がＮＲ−ＭＬ−０３またはＮＲ−ＭＬ−０５と同一の決定基を認識し、４５種が前記５種の抗体によって決定されるエピトープと同一のエピトープを認識しない、さらなる６１種の抗プロテオグリカン抗体が産生された。特許文献６では、これらの抗体を放射性標識し、黒色腫異種移植片を保有するヌードマウスにおける腫瘍取り込みについて９．２．２７と比較した。腫瘍取り込みは、ＮＲ−ＭＬ−０５およびＮＲ−ＭＬ−０２で最も高く、次いで９．２．２７が高く、次いでＮＲ−ＭＬ−０２が高かった。これらのいずれの発明においても、これらの抗体が癌疾患の全身腫瘍組織量を減少させることも、癌疾患を有する哺乳動物の生存度を増加させることも示されなかった。

特許文献７は、非抱合遮断抗体での前処置による腫瘍関連抗原を保有する組織への抱合抗体送達を増強させる方法を教示している。ＨＭＷ−ＭＡＡ、９．２．２７、およびＮＲ−ＭＬ−０５に対する抗体を、テクネチウム（ｔｅｃｈｎｉｃｉｕｍ）９９（Ｔｃ−９９）と抱合し、非標識Ｍａｂ ＮＲ−２ＡＤ（たった１人の患者のＢ細胞リンパ種に特異的な抗イディオタイプ抗体）の投与前後に臨床目的で投与した。これらの研究をレポーター放射性同位体として細胞傷害性や放射性除去効果を示さないＴｃ−９９を使用してデザインしたので、抗腫瘍効果を示す証拠は存在しなかったが、この過程の使用によって抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体の取り込みが増加した。

特許文献８は、Ｍａｂ ９．２．２７をコードする抗体遺伝子を使用したキメラ抗体の構築を教示している。キメラ抗体を使用した癌疾患の診断または治療に関する開示は行われていなかった。

特許文献９および特許文献１０は、抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体７６３．７４に指向するマウス抗イディオタイプ抗体ＭＫ２−２３およびその抱合体を開示している。ＭＫ２−２３は７６３．７４に直接結合して、Ｃｏｌｏ３８黒色腫細胞への７６３．７４の結合を阻害することができる。さらに、ＭＫ２−２３によって誘発されたＡｂ３はＨＭＷ−ＭＡＡに直接結合して、Ｃｏｌｏ３８黒色腫細胞への７６３．７４結合を競合的に阻害することができる。ＩＶ期黒色腫患者における臨床試験において、ＭＫ２−２３を使用した有効な免疫療法を行った。８９％の患者の免疫化後血清がＣｏｌｏ３８黒色腫細胞と反応してＣｏｌｏ３８への７６３．７４の結合を阻害し、Ａｂ３抗体の誘導が示唆された。１５人の患者のうちの６人で、転移病変のサイズの減少が報告されているが、研究の詳細は示されていなかった。患者の血清における抗体の特異性が部分的に特徴づけられ、７６３．７４抗体が固有の抗腫瘍効果を示さなかったので、Ａｂ３抗体が存在する範囲で、Ａｂ３が認められた任意の臨床応答を担うかどうかは不明である。ＵＳ５８６６１２４は、ＭＫ２−２３由来の抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体７６３．７４に指向するキメラ抗イディオタイプ抗体ＭＫ２−ＣＨγ１およびその誘導体を教示している。

多数の発明（特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６など）は、ＨＭＷ−ＭＡＡに指向する抗体への化合物の抱合を教示しているが、癌疾患の治療におけるその有用性を開示できていない。重要なことに、これらの抗体は抗癌治療薬としてのみ有効であり、細胞傷害効果または細胞増殖抑制効果を付与するために抱合体は必要ないであろう。

これらの特許および特許出願は、ＭＣＳＰ抗原および関連抗体を同定しているが、本発明の単離モノクローナル抗体を開示せず、本発明の単離モノクローナル抗体の有用性を教示も示唆もしていない。
ＵＳ５２７０２０２ ＷＯ９２１６６４６Ａ１ ＥＰ０５７６５７０Ａ１ ＥＰ０３８０６０７Ｂ１ ＵＳ４８７９２２５ ＵＳ５０８４３９６ ＵＳ５０３４２２３ ＵＳ５５８０７７４ ＵＳ５４９３００９ ＵＳ５７８００２９ ＵＳ５０１７６９３ ＵＳ５７０７６０３ ＵＳ５８１７７７４ ＵＳ６２４８８７０ ＵＳ５１１２９５４ ＵＳ６２３８６６７

発明の要旨
本発明者らは、発明の名称が「個別の患者特異的抗癌抗体」の米国特許第６，１８０，３５７号を以前に付与されており、これは、癌疾患の治療に有用な個別にカスタマイズされた抗癌抗体の選択プロセスに関する。本明細書の目的のために、用語「抗体」および「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）を交換可能に使用することができ、これらの用語は、ハイブリドーマ（例えば、マウスまたはヒト）によって産生されたインタクトな免疫グロブリン、免疫抱合体、必要に応じて、免疫グロブリンフラグメントおよび免疫グロブリン由来の組換えタンパク質（キメラおよびヒト化免疫グロブリン、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）_２フラグメント、単鎖抗体、組換え免疫グロブリン可変領域（Ｆｖ）ｓ、融合タンパク質など）をいう。タンパク質の構造または機能に有意に影響を与えることなくポリペプチド中のいくつかのアミノ酸配列を変化させることができることが当該分野で十分に認識されている。抗体の分子再編成では、一般に、骨格領域の核酸配列またはアミノ酸配列の修飾を許容することができる。これらには、置換（保存的置換が好ましい）、欠失、または付加が含まれるが、これらに限定されない。さらに、標準的な化学療法手段（例えば、放射性核種）を本発明のＣＤＭＡＢと抱合することは本発明の範囲内であり、それにより、化学療法薬の使用が注目される。ＣＤＭＡＢを、毒素、細胞傷害性部分、酵素（例えば、ビオチン抱合酵素）、または造血細胞と抱合して、抗体抱合体を形成することもできる。

本出願は、癌疾患改変モノクローナル抗体をコードするハイブリドーマ細胞株を単離するための米国特許第６，１８０，３５７号に教示の患者特異的抗癌抗体の産生方法を使用する。これらの抗体を、１つの腫瘍のために特別に作製することができるので、癌治療のオーダーメイド（ｃｕｓｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ）が可能である。本出願の文脈の範囲内で、細胞死滅（細胞傷害）または細胞成長阻害（細胞増殖抑制）特性を有する抗癌抗体を、以後、細胞傷害性という。これらの抗体を、癌の病期分類および診断の補助で使用することができ、腫瘍転移の治療に使用することができる。

個別抗癌治療の見通しにより、患者が管理される方法が変化する。起こり得る臨床的シナリオは、腫瘍サンプルを提示（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）時に得て、積み重ねる（ｂａｎｋ）ことである。このサンプルから、腫瘍を既存の癌疾患改変抗体のパネルより分類することができる。患者を従来のように病期分類するが、利用可能な抗体は、患者のさらなる病期分類で役立ち得る。患者を直ちに既存の抗体で処置し、そして／または本明細書中に概説の方法または本明細書中に開示のスクリーニングと組み合わせたファージディスプレイライブラリーを使用して腫瘍に特異的な抗体パネルを産生することができる。他の腫瘍が処置されるエピトープと同一のいくつかのエピトープを保有する可能性があるので、生成された全抗体を抗癌抗体のライブラリーに添加する。本方法にしたがって産生された抗体は、これらの抗体に結合する癌を有するかなり多数の患者における癌疾患の治療に有用であり得る。

米国特許第６，１８０，３５７号および米国特許出願番号１０／３４８，２３１号に開示のプロセスを実質的に使用して、マウスモノクローナル抗体１１ＢＤ−２Ｅ１１−２を、患者の乳癌生検由来の細胞でのマウスの免疫化後に得た。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原は、異なる組織起源のいくつかのヒト細胞株の細胞表面上に発現した。乳癌細胞株ＭＣＦ−７および卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の細胞傷害効果に感受性を示した。

培養物中のＭＣＦ−７およびＯＶＣＡＲ−３細胞に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２細胞傷害性の結果を、マウスに移植した場合のこれらの癌細胞に対するその抗腫瘍活性によってさらに拡大した（米国特許出願番号１０／７６２，１２９号に開示）。前臨床異種移植片腫瘍モデルは、治療効率の有効な予測材料と見なされる。

ヒト乳癌の予防ｉｎ ｖｉｖｏモデルでは、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は腫瘍成長を予防し、全身腫瘍組織量を減少させた（米国特許出願番号１０／７６２，１２９号に開示）。５１日目に（最後の処置直後）、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置群の平均腫瘍体積は、アイソタイプコントロールの２０％であった。モニタリングを、処置後２８０日間継続した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２治療群の４０％が移植から７．５ヶ月後を超えて依然として生存していた。逆に、アイソタイプコントロール群は、処置から６．５ヶ月後に１００％死滅した。したがって、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、十分に確立されたヒト乳癌モデルにおいて、コントロール群と比較して生存度を上昇させ、全身腫瘍組織量を減少させた。

１１ＢＤ−２Ｅ１１−２が１つを超えるヒト乳癌モデルで有効であるかどうかを決定するために、確立された乳癌モデルにおけるＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＢ−４６８）に対するその抗腫瘍活性を決定した（米国特許出願番号１０／８１０，７４４号に開示）。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、緩衝液コントロールと比較して腫瘍成長が２５％減少させた。したがって、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、確立された乳癌異種移植片モデルおよび予防的乳癌異種移植片モデルでの腫瘍成長の予防に有効であった。さらに、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、少なくとも２つの異なる乳癌モデルで抗腫瘍活性を示した。

ヒト乳癌モデルにおける有利な効果に加えて、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置はまた、予防卵巣癌モデルにおいてＯＶＣＡＲ−３細胞に対する抗腫瘍活性を示した（米国特許出願番号１０／７６２，１２９号に開示）。このモデルでは、腫瘍進行の代理基準として体重を使用した。移植８０日後（処置終了から１６日後）、処置群のマウスは、コントロール群の平均体重の８７．６％であった（ｐ＝０．０１５）。したがって、十分に確立されたヒト卵巣癌モデルにおける緩衝液コントロール群と比較して腫瘍進行が遅延したので、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置は有効であった。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の抗腫瘍活性は、いくつかの異なる癌モデルにおいて、魅力的な抗癌治療薬となる。

１１ＢＤ−２Ｅ１１−２が１つを超えるヒト卵巣癌モデルで有効であるかどうかを決定するために、確立された卵巣癌モデルにおけるＥＳ−２＋ＳＥＡＰ細胞（ヒト胎盤分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）でトランスフェクトしたＥＳ−２卵巣癌細胞）に対するその抗腫瘍活性を決定した（米国特許出願番号１０／８１０，７４４号に開示）。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、緩衝液コントロールと比較して、治療群のマウスコホートでの生存が増加した。さらに、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置群内の１匹のマウスは、処置後の循環ＳＥＡＰレベルが非常に減少した。循環ＳＥＡＰレベルを、全身腫瘍組織量の指標として使用することができる。したがって、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、確立された卵巣癌異種移植片モデルおよび予防卵巣癌異種移植片モデルにおける腫瘍成長予防に有効であった。さらに、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、２つの異なるヒト卵巣癌モデルで抗腫瘍活性を示した。

生化学データは、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の抗原がＭＣＳＰであることを示し（米国特許出願番号１０／８１０，７４４号に開示）、以前の免疫組織化学分析および他の研究所で実施したｉｎ ｖｉｔｒｏ研究により、黒色腫細胞上のＭＣＳＰの発現が証明され、腫瘍の接着、侵入、および転移におけるＭＣＳＰの役割が示された。したがって、予防および確立されたヒト黒色腫モデルの両方における１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の有効性を決定した。予防黒色腫モデルでは、５５日目に（処置終了から５日後）、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置群の平均腫瘍体積は、緩衝液コントロール処置群の５８％であった（ｐ＝０．０４６）。確立されたモデルでは、抗体１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、処置期間後に緩衝液コントロール処置群と比較して、腫瘍成長が４９％抑制された。結果は、この実験における動物数が限られていたので有意に到達しなかったが（ｐ＝０．１２７２）、傾向は明らかであった。したがって、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、確立された黒色腫異種移植片モデルおよび予防黒色腫異種移植片モデルでの腫瘍成長の予防に有効であった。さらに、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、２つの異なるヒト乳癌モデルおよび卵巣癌モデルならびにヒト黒色腫モデルで抗腫瘍活性を示した。

薬物標的としての１１ＢＤ−２Ｅ１１−２エピトープを立証するために、凍結正常ヒト組織における１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原の発現を決定した（米国特許出願番号１０／８１０，７４４号に開示）。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２でのＩＨＣ染色により、大部分の組織（肝臓、腎臓、および心臓などの重要器官の細胞が含まれる）が１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原を発現することができなかった。それにもかかわらず、ほとんど全ての組織中の血管の平滑筋繊維が染色された。いくつかの組織の上皮も染色された。

乳癌患者内への１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原の局在化および有病率は、患者に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫療法の利点の評価および有効な臨床試験のデザインで重要である。癌患者由来の乳房腫瘍における１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原発現に取り組むために、８人（７つのさらなるサンプルは、マイクロアレイスライドから完全に剥がれているか、マイクロアレイスライド上の腫瘍を代表しなかった）の各乳癌患者由来の腫瘍組織サンプルを、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原の発現についてスクリーニングした（米国特許出願番号１０／８１０，７４４号に開示）。研究結果は、６２％の組織サンプルが１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原について陽性染色されたことを示した。染色が悪性疾患細胞に制限されるので、患者サンプル内での１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の発現は、癌細胞に特異的なようであった。さらに、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、乳癌患者由来の正常組織の３つのサンプルのうちの１つを染色した（２つのさらなるサンプルは、マイクロアレイスライドから完全に剥がれていた）。腫瘍をその病期または癌の進行度に基づいて分析した場合、結果から、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の正の発現が高いほど腫瘍の病期がより進行しているという傾向は示唆されなかった。しかし、結果は、サンプルサイズの小ささによって制限された。

１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の抗原がＭＣＳＰであり、他の研究所で行われた以前の免疫組織化学分析およびｉｎ ｖｉｔｒｏ研究によって黒色腫細胞上のＭＣＳＰの発現が証明されているので、乳癌患者内への１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原の局在化および有病率を決定した（米国特許出願番号１０／８１０，７４４号に開示）。これは、乳癌患者に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫療法の利点の評価および有効な臨床試験のデザインで重要である。癌患者由来の黒色腫における１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原発現に取り組むために、３３人の各黒色腫患者由来の腫瘍組織を、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原の発現について評価した。研究結果は、６７％の組織サンプルが１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原について陽性染色されたことを示した。染色が悪性疾患細胞に制限されるので、患者サンプル内での１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の発現は、癌細胞に特異的なようであった。さらに、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、黒色腫患者由来の６つの利用可能な正常組織サンプルのうちで染色されたサンプルは存在しなかった。

生化学データは、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって認識される抗原がＭＣＳＰであることを示す（米国特許出願番号１０／８１０，７４４号に開示）。これは、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降タンパク質がＭＣＳＰのラットホモログに対する抗体によって認識され、抗ＭＣＳＰ免疫沈降タンパク質が１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって認識されることを示す研究によって支持された。これらのＩＨＣおよび生化学的結果は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２がＭＣＳＰ抗原に結合することを証明する。したがって、多くの証拠により、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２がＭＣＳＰ上に存在する固有のエピトープのライゲーションによって抗癌効果を媒介することが示された。さらなる生化学データはまた、本明細書中で概説されるように、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって認識される抗原がＭＣＳＰであることを証明している。これらの抗体エピトープマッピングの結果は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２が２つの主要な結合部位を有する不連続なエピトープに結合することができえることを示した。

まとめると、このデータは、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原が癌関連抗原であり、ヒトで発現し、病理学的に関連する癌標的であることを証明する。さらに、このデータはまた、ヒト癌組織への１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体の結合を証明し、診断、治療の予測、または予後診断であり得るアッセイのために適切に使用することができる。さらに、細胞この抗原の細胞局在化は、ほとんどの非悪性細胞でこの抗原の発現を欠くので、細胞の癌の状態を示し、この所見により、この抗原、その遺伝子または誘導体、そのタンパク質もしくはその変異形を、診断、治療の予測、または予後診断であり得るアッセイに使用することができる。

多数の異なる抗ＭＣＳＰ抗体が産生され、多数のｉｎ ｖｉｔｒｏ系およびｉｎ ｖｉｖｏ系で試験されている。前臨床モデルでは、再現されなかった１つの研究を除き、未修飾のＭＣＳＰ抗体は、異なる黒色腫モデルおよび１つの神経膠腫モデルにおける腫瘍減少または生存度の増加に無効であることが示された。他の癌型は、抗ＭＣＳＰ抗体を使用して研究されなかった。ヒトにおける未修飾抗ＭＣＳＰ抗体の全試験により、いかなる正の臨床結果も得られなかった。未修飾の１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、ヒト乳癌のマウスモデルにおいて生存度を高め、全身腫瘍組織量を減少させることが示された。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２はまた、ヒト卵巣癌のマウスモデルにおいて腫瘍の進行を阻害し、生存度を高めた。抗ＭＣＳＰ抗体を多数の毒剤または化学療法薬と抱合し、これらの抱合体は、マウス黒色腫モデルで試験した場合、正のｉｎ ｖｉｖｏ結果を証明した。ヒトで試験した抗ＭＣＳＰ抱合体の報告は存在しなかったので、これらの抱合体の安全性は知られていない。しかし、モノクローナル抗体のみの送達は十分に許容され、これに関連する毒性は、あったとしてもほんの少しであった。したがって、未修飾の抗ＭＣＳＰ抗体での癌患者の治療によって正の臨床結果を得ることができる場合、有利であり、現在利用可能な治療より改良されているであろう。抗癌活性を示すための毒剤への抱合に１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は必要ないので、抗体−毒素抱合体の投与に関して特別な配慮は必要ない。多数の抗ＭＣＳＰ抗体を使用して抗イディオタイプ抗体も生成されており、これらは、動物およびヒトで試験されている。小規模の非盲検では、抗イディオタイプ抗体での患者の免疫化によって検出可能な抗ＭＣＳＰ免疫応答が得られた場合、特定の免疫応答が得られなかった患者と比較して、これらの患者の生存度の中央値は増加した。示した例では、抗イディオタイプ抗体の投与によってＭＣＳＰをターゲティングし、正の臨床応答を得ることができる。このアプローチに関する問題は、抗イディオタイプ抗体で免疫化した患者全員から抗ＭＣＳＰ応答が得られるわけではないことである。したがって、直接投与の際に正の臨床結果を得ることができる抗ＭＣＳＰ抗体を利用可能であり、これにより、臨床的な利益を得るために患者自身の免疫系に依存する問題が克服されるであろう。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、ＭＣＳＰを直接ターゲティングして前臨床異種移植片腫瘍モデルで抗癌効果を示すような抗体であり、治療効力の有益な予測材料と見なされる。

全体的に、本発明は、投与した場合に哺乳動物中で抗原を発現する癌の全身腫瘍組織量を減少させ（それにより、疾患の進行を遅延させる）、治療された哺乳動物を延命することもできることができる治療薬の標的としての１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原の使用を教示する。本発明はまた、哺乳動物中で抗原を発現する癌の全身腫瘍組織量を減少させ、この抗原を発現する腫瘍を保有する哺乳動物を延命するためにその抗原にターゲティングするためのＣＤＭＡＢ（１１ＢＤ−２Ｅ１１−２）の使用を教示する。さらに、本発明はまた、この抗原を発現する腫瘍を保有する哺乳動物の診断、治療の予測、または予後診断で有用であり得る癌細胞中の１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原の検出のための使用を教示する。

患者が初期治療が無効であるか、転移する場合、再治療のために腫瘍に特異的な抗体の生成プロセスを繰り返すことができる。さらに、抗癌抗体を、患者から得た赤血球に抱合し、転移治療のために再注入することができる。転移性癌に有効な治療はほとんど存在せず、転移は為に至る不幸な結果の前兆である。しかし、転移性癌は、通常、十分に脈管化しており、赤血球による抗癌抗体の送達は腫瘍部位への抗体の濃縮効果があり得る。転移前でさえ、ほとんどの癌細胞は、その生存のために宿主の血液供給に依存し、赤血球に抱合した抗癌抗体もｉｎ ｓｉｔｕで腫瘍に有効であり得る。あるいは、抗体を、他の造血細胞（例えば、リンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞など）に抱合することができる。

５つの抗体クラスが存在し、それぞれ、その重鎖によって付与される機能に関連する。一般に、未修飾抗体による癌細胞の死滅は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）のいずれによって媒介されると考えられている。例えば、マウスＩｇＭおよびＩｇＧ２ａ抗体は、補体系のＣ−１成分の結合およびそれによる補体活性化の古典経路の活性化によってヒト補体を活性化し、腫瘍を溶解することができる。ヒト抗体について、最も有効な補体活性化抗体は、一般に、ＩｇＭおよびＩｇＧ１である。ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３アイソタイプのマウス抗体は、Ｆｃ受容体を有する細胞傷害性細胞の動員に有効であり、単球、マクロファージ、顆粒球、および一定のリンパ球によって細胞を死滅させる。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプのヒト抗体は、ＡＤＣＣを媒介する。

別の可能な抗体媒介性癌死滅機構は、細胞膜およびその関連する糖タンパク質または糖脂質中の種々の化学結合の加水分解を触媒するように機能する抗体（いわゆる触媒抗体）の使用による。

より広く受け入れられている２つのさらなる抗体媒介性癌細胞死滅機構が存在する。第１の機構は、身体が癌細胞上に存在する推定抗原に対する免疫応答を生成するように誘導するワクチンとしての抗体の使用である。第２の機構は、成長受容体をターゲティングしてその機能を妨害するか、その機能が有効に喪失されるように成長受容体を下方制御するための抗体の使用である。

制癌剤の臨床的有用性は、患者に対する許容可能なリスクプロフィール下での薬物の利点に基づく。癌療法では、一般に、生存することが最も求められるが、延命に加えて、他の十分に認識された利点が多数存在する。治療が生存に悪影響を与えないこれらの他の利点には、症状の緩和、有害事象からの防御、再発までの期間または無疾患での生存の延長、および進行までの期間の延長が含まれる。これらの基準は一般に許容されており、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）などの規制機関は、これらの利点が得られる薬物を承認している（Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｇｙ ４２：１３７−１４３ ２００２）。これらの基準に加えて、これらの利点を予測することができる他の評価項目（ｅｎｄｐｏｏｉｎｔ）が存在することが十分に認識されている。部分的に、米国ＦＤＡによって付与された迅速承認プロセスでは、患者の利益が予想される可能性が高い代替法が存在することを認めている。２００３年現在、このプロセスで１６種の薬物が承認されており、これらのうちの４種が完全に承認されている（すなわち、追跡研究により、代理評価項目によって予想された直接的な患者の利点が証明されている）。固形腫瘍における薬物効果の決定のための１つの重要な評価項目は、治療に対する応答の測定による全身腫瘍組織量の評価である（Ｔｈｅｒａｓｓｅ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ９２（３）：２０５−２１６ ２０００）。このような評価のための臨床基準（ＲＥＣＩＳＴ基準）を、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（国際的癌専門機関）によって推奨されている。ＲＥＣＩＳＴ基準による客観的応答によって示される全身腫瘍組織量に対する効果を示す薬物は、適切なコントロール群と比較して、最終的に、患者に直接利点をもたらす傾向がある。前臨床目的では、全身腫瘍組織量は、一般に、評価および報告がより容易である。臨床目的に転換することができるこの前臨床研究では、前臨床モデルで延命する薬物は、最も期待される臨床的有用性を有する。臨床治療に対して正の応答を生成する薬物と同様に、前臨床目的全身腫瘍組織量を減少させる薬物はまた、疾患に対して有意な直接的影響を与え得る。延命は、制癌剤治療で最も求められる臨床転帰であるが、臨床的有用性を有する他の利点が存在し、疾患進行の遅延、延命、またはその両方に相関し得る全身腫瘍組織量の減少により、直接的利点を得ることができ、且つ臨床的影響も与えることができることが明白である（Ｅｃｋｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｓｕｃｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ｆａｉｌｕｒｅｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｄｅｓｉｇｎｓ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ；ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ，３９^ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，２００３，ｐａｇｅｓ ２０９−２１９）。

したがって、本発明の目的は、ハイブリドーマ細胞株ならびにハイブリドーマ細胞株がコードされる対応単離モノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントを単離するために、癌細胞に細胞傷害性を示すと同時に非癌細胞に比較的毒性のない特定の個体由来の細胞由来癌疾患修飾抗体を産生する方法を使用することである。

本発明のさらなる目的は、ＣＤＭＡＢおよびその抗原結合フラグメントを教示することである。
本発明のさらなる目的は、細胞傷害性がＡＤＣＣによって媒介されるＣＤＭＡＢを産生することである。
本発明のなおさらなる目的は、細胞傷害性がＣＤＣによって媒介されるＣＤＭＡＢを産生することである。
本発明のなおさらなる目的は、細胞傷害性が細胞化学結合の加水分解を触媒する能力があるＣＤＭＡＢを産生することである。
本発明のなおさらなる目的は、癌の診断、予後診断、およびモニタリングのための結合アッセイで有用なＣＤＭＡＢを産生することである。
本発明の他の目的および利点は、以下の説明から明らかであり、例として、本発明の一定の実施形態を記載する。

（図面の簡単な説明）
特許または出願は、カラーで作成した少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開公報の副本は、願書および必要な手数料の支払いによって特許庁から提供される。
図１は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２で探索したＭＤＡ−ＭＢ−２３１（レーン１）またはＯＶＣＡＲ−３（レーン２）膜のウェスタンブロットを示す図である。還元条件下で膜タンパク質を分離した。右側に分子量マーカーを示す。
図２は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜への１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の結合に対する脱グリコシル化の効果を示す図である。脱グリコシル化緩衝液のみ（レーン１）、ＰＮＧアーゼＦ、エンド−ｏ−グリコシダーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、およびグリコサミノダーゼの組み合わせ（レーン２）、ＰＮＧアーゼＦ、エンド−ｏ−グリコシダーゼ、およびシアリダーゼの組み合わせ（レーン３）、シアリダーゼのみ（レーン４）、エンド−ｏ−グリコシダーゼのみ（レーン５）、ならびにＰＮＧアーゼのみ（レーン６）でインキュベートしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜への１１ＢＤ−２Ｅ１１−２結合。
図３は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２で免疫沈降したＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）およびウェスタンブロット（パネルＢ）を示す図である。レーン１は分子量標準を示し、レーン２はＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質を示し、レーン３は１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降物質を示し、レーン４はアイソタイプコントロール免疫沈降物質を示す。
図４は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（パネルＡ）、ＩｇＧ１アイソタイプコントロール（クローン１０７．３、パネルＢ）、抗ラットＮＧ２（ポリクローナル、パネルＣ）、正常ウサギＩｇＧ（パネルＤ）、抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７、パネルＥ）、およびＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（クローンＧ１５５−２２８、パネルＦ）で探索したタンパク質のウェスタンブロットを示す図である。レーン１：１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降物、レーン２：ＩｇＧ１アイソタイプコントロール（クローン１０７．３）免疫沈降物、レーン３：抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）免疫沈降物、レーン４：ＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（クローンＧ１５５−２２８）免疫沈降物、レーン５：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜、およびレーン６：サンプル緩衝液のみ（ネガティブコントロール）。
図５は、ＭＣＳＰペプチドアレイへの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の結合強度（Ｎｏｅｈｒｉｎｇｅｒ光単位）を示す図である。
図６は、いくつかの癌細胞株および非癌細胞に指向する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２、アイソタイプコントロール、または抗ＥＧＦＲの代表的ＦＡＣＳヒストグラムを示す図である。
図７は、凍結した正常なヒト組織アレイ由来の心臓の組織切片に対して１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（Ａ）およびアイソタイプコントロール抗体（Ｂ）を使用して得た結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真を示す図である。心筋線維に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２染色は認められなかった。倍率は２００倍である。
図８は、凍結した正常なヒト組織アレイ由来の骨格筋の組織切片に対して１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（Ａ）、抗アクチン（Ｂ）、およびアイソタイプコントロール抗体（Ｃ）を使用して得た結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真を示す図である。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、骨格筋を染色しなかったが、血管の平滑筋は染色する（矢印）。倍率は２００倍である。
図９は、乳癌腫瘍（浸潤性腺管癌）への１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（Ａ）およびアイソタイプコントロール抗体（Ｂ）の結合の代表的な顕微鏡写真を示す図である。パネルＡ中の黒色の矢印は、腫瘍細胞を示す。倍率は２００倍である。
図１０は、凍結した正常なヒト組織アレイ由来の悪性黒色腫の組織切片に対して１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（Ａ）、ポジティブコントロール抗ＣＤ６３（ＮＫＩ−Ｃ３）（Ｂ）、およびネガティブアイソタイプコントロール抗体（Ｃ）を用いて得られた結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真を示す図である。倍率は２００倍である。
図１１は、凍結した黒色腫ヒト組織アレイ由来の悪性黒色腫（Ａ）および正常な皮膚（Ｂ）の組織切片に対して１１ＢＤ−２Ｅ１１−２を用いて得られた結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真を示す図である。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は悪性黒色腫を強く染色するが、正常な皮膚は染色しない。倍率は２００倍である。
図１２は、予防ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌モデルにおける腫瘍成長に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２または緩衝液コントロールの効果を示す図である。破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
図１３は、確立されたＥＳ−２異種移植片研究における１１ＢＤ−２Ｅ１１−２または緩衝液コントロール抗体での処置後の腫瘍保有マウスの生存を示す図である。
図１４は、確立されたＥＳ−２異種移植片研究における１１ＢＤ−２Ｅ１１−２または緩衝液コントロールでの処置前、処置中、および処置後の腫瘍保有マウスのＳＥＡＰレベルを示す図である。
図１５は、予防Ａ２０５８黒色腫モデルにおける腫瘍成長に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２または緩衝液コントロールの効果を示す図である。破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
図１６は、確立されたＡ２０５８黒色腫モデルにおける腫瘍成長に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２または緩衝液コントロールの効果を示す図である。破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。

ウェスタンブロッティングによる結合タンパク質の同定
抗体１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって認識される抗原を同定するために、この抗原を発現する細胞膜を、ゲル電気泳動に供し、ウェスタンブロッティングによって膜に移し、この抗体によって検出されたタンパク質を決定した（米国特許出願番号１０／８１０，７４４号に開示）。

１．膜の調製
以前の研究により、ＦＡＣＳによって乳癌株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）への１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の結合が証明されている。以前の研究により、卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−３に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の有効性も証明されている。したがって、これら２つの細胞株由来の膜調製物を、抗原同定のために使用した。さらなるウェスタンブロッティングおよび免疫沈降研究により、Ａ２０５８膜調製物への１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の類似の結合パターンも証明された。

全ての細胞膜を、ＭＢ−２３１乳癌細胞またはＯＶＣＡＲ−３卵巣細胞の密集培養物から調製した。細胞蓄積物（ｃｅｌｌ ｓｔａｃｋ）から培地を除去し、リン酸緩衝化生理食塩水を使用して細胞を洗浄した。細胞を、プラットフォームシェーカー上で分離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中にて３７℃で２０分間分離した。細胞を回収し、９００ｇにて４℃で１０分間遠心分離した。遠心分離後、細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁し、９００ｇにて４℃で１０分間再度遠心分離して洗浄した。ペレットを、−８０℃で保存した。細胞ペレットを、１ｇの細胞あたり３ｍＬの緩衝液の比率で、５０ｍＬの完全プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ，ＬａｖａｌＱＣ）あたり１錠を含む均質化緩衝液に再懸濁した。細胞懸濁液を、氷上でｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーを使用した均質化に供し、細胞を溶解した。細胞ホモジネートを、１５，０００ｇにて４℃で１０分間遠心分離して、核粒子を除去した。上清を採取し、チューブに分注し、７５，６００ｇにて４℃で９０分間遠心分離した。チューブから上清を慎重に除去し、各膜ペレットを、約５ｍＬの均質化緩衝液に再懸濁した。全チューブ由来の再懸濁ペレットを１つのチューブに合わせ、７５，６００ｇにて４℃で９０分間遠心分離した。チューブから上清を慎重に除去し、ペレットを秤量した。１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む可溶化緩衝液を、１ｇの膜ペレットあたり３ｍＬの緩衝液の比率でペレットに添加した。氷上での３００ｒｐｍで１時間のプラットフォームシェーカーでの震盪によって膜を溶解した。膜溶液を、７５，６００ｇで遠心分離して不溶性物質をペレット化した。チューブから可溶化膜タンパク質を含む上清を慎重に取り出し、タンパク質含有量についてアッセイし、−８０℃で保存した。

２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって膜タンパク質を分離した。２０μｇの膜タンパク質を、１００ｍＭ ＤＴＴを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液と混合し、８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーンにローディングした。予め染色した分子量マーカーサンプル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を、基準レーンで泳動した。１００Ｖで１０分間、その後に１５０Ｖで、予め染色した分子量マーカーが十分に分離するまで電気泳動を行った。４０Ｖで１６時間のエレクトロブロッティングによって、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に移した。予め染色したマーカーのゲルから膜への完全な移動に注目することによって移動を評価した。移動後、膜を、５％脱脂粉乳を含む０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）含有Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水で２時間ブロッキングした。膜をＴＢＳＴで１回洗浄し、その後、３％脱脂粉乳を含むＴＢＳＴで希釈した５μｇ／ｍＬの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２と２時間インキュベートした。ＴＢＳＴでの３回の洗浄後、膜を、Ｊｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ ＰＡ）の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と抱合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）とインキュベートした。このインキュベーション後、ＴＢＳＴで３回洗浄し、その後、ＨＲＰ基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ ＯＮの基質キット）とインキュベートした。

図１では、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、分離したＭＢ−２３１（レーン１）およびＯＶＣＡＲ−３（レーン２）膜タンパク質の３分子量領域に明確に結合する。分子量（ＭＷ）標準との比較により、抗体は、分子量が約１５０、２４０、および２８０ｋＤａのタンパク質に結合する。この細胞株を使用してより強い反応性が認められたので、ＭＢ−２３１膜を使用して全てのさらなる研究を行った。

１１ＢＤ−２Ｅ１１−２に結合した抗原のグリコシル化の決定
抗体１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって認識される抗原が糖タンパク質であるかどうかを決定するために、ＭＢ−２３１膜を、ＰＮＧアーゼＦ、エンド−ｏ−グリコシダーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、およびグルコサミニダーゼの異なる組み合わせとインキュベートした。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２で記載のように、膜を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、その後、ウェスタンを行った。図２は、脱グリコシル化緩衝液のみ（レーン１）、ＰＮＧアーゼＦ、エンド−ｏ−グリコシダーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、およびグリコサミノダーゼの組み合わせ（レーン２）、ＰＮＧアーゼＦ、エンド−ｏ−グリコシダーゼ、およびシアリダーゼの組み合わせ（レーン３）、シアリダーゼのみ（レーン４）、エンド−ｏ−グリコシダーゼのみ（レーン５）、ならびにＰＮＧアーゼのみ（レーン６）でインキュベートしたＭＢ−２３１膜への１１ＢＤ−２Ｅ１１−２結合の結果を証明する。グリコシダーゼでのＭＢ−２３１膜の処置では１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の結合は消失しないが、全レーンでタンパク質の分子量シフトが認められ、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって認められた抗原が糖タンパク質であることを示す。

１１ＢＤ−２Ｅ１１−２に結合した抗原の同定
１．免疫沈降
可溶化膜糖タンパク質の抗体での免疫沈降による同族リガンドの単離によって１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の抗原の同定を行った。１００μＬのプロテインＧＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ ＮＹ）を、１ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で３回洗浄した。１００μｇの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２を含む全体積が１００μＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を、洗浄したビーズに添加した。混合物を、回転混合しながら１時間インキュベートした。非結合抗体を除去し、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２コーティングビーズを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含む０．５ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２コーティングビーズを、１ｍＬ ０．２Ｍトリエタノールアミン（ｐＨ８．２）で２回洗浄した。１ｍＬの０．０２Ｍジメチルピメリミデートを含む０．２Ｍトリエタノールアミン（ｐＨ８．２）の添加および回転混合しながら３０分間インキュベートすることによって１１ＢＤ−２Ｅ１１−２をビーズに化学架橋した。１ｍＬの０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）とビーズを回転混合しながらインキュベートすることによって、反応を停止させた。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２架橋ビーズを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１ｍＬの１ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ（ＰＢＳ）で３回洗浄した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２架橋ビーズを、０．１Ｍクエン酸塩（ｐＨ３．０）とのインキュベーションによって予め溶離し、その後に、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含む０．１Ｍ ＰＢＳで３回洗浄した。第２の抗体架橋ビーズ組を、記載の同一様式で、トリニトロフェノール（無関係の分子）に対するマウスＩｇＧ_１抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ ＯＮ由来のクローン１０７．３）を使用して調製し、ネガティブＩｇＧ１アイソタイプコントロールとして使用した。

１１ＢＤ−２Ｅ１１−２架橋ビーズを、１％ＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中で回転混合しながら４℃で３０分間インキュベートすることによってブロッキングした。ビーズを、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。５００μｇのＭＢ−２３１細胞由来の全膜調製物を、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２架橋ビーズと回転混合しながら４℃で２．５時間インキュベートした。免疫複合体結合ビーズを、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む１ｍＬの１ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２８７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌで３回洗浄した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２タンパク質を、穏やかに混合しながら３０μＬの０．１Ｍクエン酸塩（ｐＨ３．０）と３分間インキュベートすることによって溶離した。溶離タンパク質を、９μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）の添加によって中性ｐＨにした。中和した溶離タンパク質を、−８０℃で保存した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２架橋ビーズを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含む３ｍＬ ＰＢＳで洗浄した。ＩｇＧ_１アイソタイプコントロール（クローン１０７．３）架橋ビーズを、ＭＢ−２３１膜タンパク質とインキュベートし、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２ビーズと同一の様式で処理した。

ＭＢ−２３１膜タンパク質由来の１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降タンパク質の２つのバッチを記載のように産生し、合わせた。ＩｇＧ１（クローン１０７．３）アイソタイプコントロールビーズについても実施した。６２％のこの免疫沈降混合物（６２０μｇのＭＢ−２３１膜タンパク質から免疫沈降したタンパク質量に相当する）を、４〜２０％の勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの１つのレーンにロードした。１０７．３架橋ビーズから産生した同量の材料（２０μｇのＭＢ−２３１膜タンパク質であった）を、隣のレーンにロードした。非染色分子量マーカーのサンプル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ ＯＮ）または予め染色された分子量マーカーのサンプルを、基準レーンで泳動した。サンプルを、１００Ｖで１０分間、その後に１５０Ｖで６０分間の電気泳動によって分離した。ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ（商標）（ＢｉｏＲａｄ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）中でのゲルのインキュベーションによってタンパク質を染色した。並行ウェスタンブロットでは、１８０μｇのＭＢ−２３１膜タンパク質から免疫沈降タンパク質量に相当する１８％の免疫沈降混合物およびＩｇＧ１アイソタイプコントロール（クローン１０７．３）から産生した同量の材料を、電気泳動によって分離した。４０Ｖで１６時間のエレクトロブロッティングによって、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に移した。移動後、膜を、５％脱脂粉乳を含むＴＢＳＴで２時間ブロッキングした。膜を、３％脱脂粉乳を含むＴＢＳＴで希釈した５μｇ／ｍＬの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２で２時間探索した。ＴＢＳＴでの３回の洗浄後、膜を、ＨＲＰと抱合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）とインキュベートした。このインキュベーション後、ＴＢＳＴで３回洗浄し、その後、ＨＲＰ基質であるＴＭＢとインキュベートした。

図３は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって免疫沈降したタンパク質から得たゲルおよびウェスタンブロットを示す。ゲル（パネルＡ）上のレーン１は、分子量標準を示し、レーン２はＭＢ−２３１膜タンパク質を示す。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降材料を含むレーン（レーン３）に分子量２４０ｋＤａおよび２８０ｋＤａの２つの異なるバンドが存在したが、１０７．３免疫沈降材料を含むレーン（レーン４）には存在しなかった。対応するウェスタンブロット（パネルＢ）では、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、分子量２４０ｋＤａおよび２８０ｋＤａの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降タンパク質と強く反応した（レーン３）。ウェスタンブロットでは、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、１５０ｋＤａの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降タンパク質中のさらなるバンドとも強く反応し、このバンドは、染色したゲルで検出不可能であった。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降タンパク質に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の反応性プロフィールは、ＭＢ−２３１の全膜で認められたプロフィールと類似していた（レーン２）。ＩｇＧ１アイソタイプコントロール（クローン１０７．３、レーン４）によって免疫沈降したタンパク質に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の反応性は認められず、免疫沈降タンパク質への１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の結合が特異的であり、タンパク質の汚染に起因しないことを示した。

２．質量分析法
１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって免疫沈降した２４０ｋＤａおよび２８０ｋＤａのタンパク質に対応するゲル領域（図３、パネルＡ、レーン３）を、滅菌外科用メスを使用して切り出した。次いで、これらのゲルスライスを、ＭＡＬＤＩ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用した質量分析法によるタンパク質の同定に使用した。

サンプルを、ＰＲＯＧＥＳＴワークステーションにてトリプシンを使用したタンパク質分解消化に供し、得られた消化物の上清の一部を、ＭＡＬＤＩ／ＭＳ分析に使用した。ＺｉｐＴｉｐｓを使用して、ロボット（ＰｒｏＭＳ）によってスポッティングを行い、６０％アセトニトリル，０．２％ＴＦＡ中に調製したマトリックス（α−シアノ４−ヒドロキシ桂皮酸）を含むＣ１８材料からペプチドを溶離した。ＶｏｙａｇｅｒＤＥ−ＳＴＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ ＣＡ）によってＭＡＬＤＩ／ＭＳデータを収集し、ペプチド質量検索のために、認められたｍ／ｚ値をＰｒｏＦｏｕｎｄ（Ｐｒｏｔｅｏｍｅｔｒｉｃｓソフトウェアパッケージ）に供した。ＰｒｏＦｏｕｎｄは、ＮＣＢＩｎｒデータベースのローカルに保存されたコピーに問い合わせた。消化物の上清のさらなる部分を、２００ｎＬ／分の流速で７５μｍのＣ１８カラムを使用したＭｉｃｒｏｍａｓｓＱ−Ｔｏｆ２によるナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。ＭＡＳＣＯＴのローカルコピーを使用してＭＳ／ＭＳデータを検索した。
ＭＡＬＤＩ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって同定されたタンパク質を、表１に示す。
表１．ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜の１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降によって同定されたタンパク質

両サンプルを、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）と同定した。

３．確認
既知の抗ＭＣＳＰ抗体が１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって免疫沈降されたタンパク質と反応するのかどうかまたはその逆の決定によって推定抗原を確認した。ネガティブＩｇＧ２ａアイソタイプコントロールとして使用したトリニトロフェノール（非関連分子）へのマウス抗ＭＣＳＰモノクローナル抗体９．２．２７（ＩｇＧ２ａ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ ＣＡ）およびマウスＩｇＧ２ａ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｏａｋｖｉｌｌｅ ＯＮのクローンＧ１５５−１７８）の添加以外は前記と同一の様式で免疫沈降物を調製した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降物、ＩｇＧ１アイソタイプコントロール（クローン１０７．３）免疫沈降物、抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）免疫沈降物、ＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（クローンＧ１５５−２２８）免疫沈降物、およびＭＢ−２３１膜を、６つの同型の１０％ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。電気泳動およびウェスタンブロッティングを、上記のように行った。膜を、３％脱脂粉乳を含むＴＢＳＴで希釈した５μｇ／ｍＬの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２、ＩｇＧ１アイソタイプコントロール（クローン１０７．３）、抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）、ＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（クローンＧ１５５−２２８）、ウサギポリクローナル抗ラットＮＧ２抗体（ＭＣＳＰは、ラットＮＧ２のヒトホモログである、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ ＣＡ）、および正常なウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）と２．５時間インキュベートした。図４は、記載のウェスタンブロッティングの結果を証明する。図４（パネルＡ）は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降物（レーン１）、ＩｇＧ１アイソタイプコントロール（クローン１０７．３）免疫沈降物（レーン２）、抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）免疫沈降物（レーン３）、ＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（クローンＧ１５５−２２８）免疫沈降物（レーン４）、ＭＢ−２３１膜（レーン５）、およびサンプル緩衝液のみ（ネガティブコントロール）（レーン６）への１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の結合を示す。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、ＭＢ−２３１膜および１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降物中の約１５０、２４０、および２８０ｋＤａの同一の３つのバンドを認識した。上の２８０ｋＤａバンドのみは、抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）免疫沈降物レーン中で認められた。いずれかのアイソタイプコントロール沈降物レーンで反応は認められず、免疫沈降物に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の反応性は、タンパク質が１１ＢＤ−２Ｅ１１−２および９．２．２７の両方に特異的に結合し、免疫沈降することに起因することを示す。ＩｇＧ１アイソタイプコントロール（クローン１０７．３）で探索した並行ブロット（パネルＢ）では、いかなるレーンにおいても反応性は認められず、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２で探索したブロット中に認められる反応性が特異的であることを示した。パネルＣは、並行ブロットへのウサギポリクローナル抗ラットＮＧ２抗体の結合を示す。抗ＮＧ２は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降物中の約１５０ｋＤａおよび２４０ｋＤａの２つのバンドに結合する一方で（レーン１）、いかなる他のレーン中のこの分子量範囲のタンパク質とも結合しない。並行ブロットでは（パネルＤ）、正常なウサギＩｇＧは、ＩｇＧ２ａ免疫沈降物（レーン４）およびＭＢ−２３１膜（レーン５）中のタンパク質に対するわずかな非特異的反応性を示す。したがって、パネルＣのこれらのレーン（ウサギ抗ＮＧ２で探索）中の同一の反応性は、非特異的と見なさなければならない。並行ブロット（パネルＥ）では、抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）は、抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）免疫沈降レーン中の１つのバンドへの非常にわずかな結合のみを示し（レーン３、矢印で示す）、このバンドはＭＢ−２３１膜（レーン５）では認められず、９．２．２７のこの抗原に対する親和性は低く、濃縮サンプル中などの濃縮形態で存在する場合のみに反応性を示すことを示す。ＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（クローンＧ１５５−２２８）で探索した最後の並行ブロット（パネルＦ）では、いかなるレーンにも反応性は認められず、抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）で探索したブロット中で認められた反応性は特異的であることを示した。これらの結果は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降タンパク質がＭＣＳＰのラットホモログによって認識され、抗ＭＣＳＰ免疫沈降タンパク質が１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって認識されることを証明する。

既知の市販の抗体を使用した確認と組み合わせた質量分析による同定は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の抗原がＭＣＳＰであることを証明する。これは、ＭＣＳＰのコアタンパク質が糖タンパク質であるという実施例２の脱グリコシル化実験とも一致する。

抗体エピトープマッピング
１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって認識されるＭＣＳＰ分子領域を決定するために、抗体エピトープマッピング実験を行った。ＭＣＳＰのアミノ酸配列に基づいた重複ペプチドアレイを合成し、段階的様式で細胞膜に共有結合し、所定の配置を得た。各ペプチドは１８アミノ酸長であり、９アミノ酸が重複していた。ペプチドアレイを、ブロッキング緩衝液と数時間インキュベートした。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２を、Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ｎａｋａｎｅの方法にしたがった修正過ヨウ素酸塩法を使用して、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に抱合した。ブロッキング後、ブロッキング緩衝液中で、ペプチドアレイを１μｇ／ｍＬ １１ＢＤ−２Ｅ１１−２−ＨＲＰとインキュベートした。別の実験では、ペプチドアレイを、ネガティブコントロールとしてのヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰとインキュベートした。ペプチドアレイを、ＴＢＳＴで洗浄し、化学発光基質とインキュベートした。電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラを使用して化学発光反応時のペプチドアレイ上の各スポットの発光を定量し、各ペプチドのシグナル強度値を得た（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ光単位；ＢＬＵ）。この実験について、７５００ＢＬＵ未満の全シグナルをバックグラウンドと見なした。ペプチドアレイの結合データを、表２に列挙する。

図５は、結合データのグラフを示す。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、ペプチド番号２６（配列番号１）および番号７１（配列番号２）に最も強く結合した。より弱い結合（バックグラウンドよりも強い）を、ペプチド番号３（配列番号３）、番号６６（配列番号４）、番号１７０（配列番号５）、番号２５１（配列番号６）、番号２５２（配列番号７）、および番号２５６（配列番号８）で認識することができた。これらの結果は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２が２つの主な結合部位（ペプチド番号２６および番号７１）を有する不連続なエピトープおよび多数の他の部位に結合することができることを示した。

米国特許出願番号１０／７４３，４５１号で概説されるように、ハイブリドーマ細胞株１１ＢＤ−２Ｅ１１−２を、ブダペスト条約に基づき、１１月１１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９にアクセッション番号ＰＴＡ−５６４３で寄託した。ＣＦＲ １．８０８に基づいて、寄託機関は、寄託物の公的利用に課された全ての制限事項を特許付与時に変更せずに解除することを保証する。

抗体産生：
１１ＢＤ−２Ｅ１１−２モノクローナル抗体を、ＣＬ−１０００フラスコ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）中でのハイブリドーマ（ＰＴＡ−５６４３）の培養ならびに１週間に２回の回収および再播種によって産生した。プロテインＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｉｅ ｄ’Ｕｒｆｅ，ＱＣ）を使用した標準的な抗体精製手順にしたがって、抗体を精製した。

以前に米国特許出願番号１０／３４８，２３１に記載するように、細胞傷害性アッセイにおいて、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２を、ポジティブコントロール（抗Ｆａｓ（ＥＯＳ９．１，ＩｇＭ，ｋａｐｐａ，２０μｇ／ｍＬ，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＩｇＧｌ，ｋａｐｐａ，１０μｇ／ｍＬ，Ｉｎｔｅｒ Ｍｅｄｉｃｏ，Ｍａｒｋｈａｍ，ＯＮ）、抗ＥＧＦＲ（Ｃ２２５，ＩｇＧｌ，ｋａｐｐａ，５μｇ／ｍＬ，Ｃｅｄａｒｌａｎｅ，Ｈｏｒｎｂｙ，ＯＮ）、シクロヘキシミド（１００μｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）、ＮａＮ_３（０．１%，Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ））およびネガティブコントロール（１０７．３（抗ＴＮＰ，ＩｇＧｌ，ｋａｐｐａ，２０μｇ／ｍＬ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）、Ｇｌ １５５−１７８（抗ＴＮＰ，ＩｇＧ２ａ，ｋａｐｐａ，２０μｇ／ｍＬ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）、ＭＰＣ−Ｉｌ（未知の抗原特異性、ＩｇＧ２ｂ，ｋａｐｐａ，２０μｇ／ｍＬ）、Ｊ６０６（抗フルクトサン、ＩｇＧ３，ｋａｐｐａ，２０μｇ／ｍＬ）、ＩｇＧ緩衝液（２％））と比較した（表２）。乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＢ−４６８）、ＭＣＦ−７）、結腸癌細胞株（ＨＴ−２９，ＳＷｌ １１６，ＳＷ６２０）、肺癌細胞株（ＮＣＩ Ｈ４６０）、卵巣癌細胞株（ＯＶＣＡＲ−３（ＯＶＣＡＲ））、前立腺癌細胞株（ＰＣ−３）、および非癌細胞株（ＣＣＤ ２７ｓｋ，Ｈｓ８８８ Ｌｕ）を試験した（全てＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ由来）。生／死細胞傷害性アッセイを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から入手した。以下に概説のように変更して、製造者の説明書にしたがってアッセイを行った。細胞をプレートし、その後に所定の適切な密度でアッセイを行った。２日後、精製した抗体またはコントロールを培地で希釈し、１００μｌを細胞プレートに移し、５％ＣＯ_２インキュベーター中で５日間インキュベートした。次いで、逆にしてプレートを空にし、ブロットを乾燥させた。ＭｇＣｌ_２およびＣａＣｌ_２を含む室温のＤＰＢＳを、多チャネルスクイーズボトルから各ウェルに分注し、３回軽くたたき、逆にすることによって空にし、ブロットを乾燥させた。ＭｇＣｌ_２およびＣａＣｌ_２を含むＤＰＢＳで希釈した５０μｌの蛍光カルセイン色素を各ウェルに添加し、５％ＣＯ_２インキュベーター中にて３７℃で３０分間インキュベートした。プレートを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＨＴＳ７０００蛍光プレートリーダーで読み取り、データをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで分析し、表３に結果を集計した。データは、３連で試験した４回の実験の平均を示し、且つ以下の様式で定性的に示した：４／４の実験が閾値細胞傷害性を超える（＋＋＋）、３／４の実験が閾値細胞傷害性を超える（＋＋）、２／４の実験が閾値細胞傷害性を超える（＋）。表１中の印のない細胞は、矛盾しているか閾値細胞傷害性未満の効果を示す。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、乳癌細胞および卵巣癌細胞で特異的に細胞傷害性を示し、正常な細胞に影響を与えなかった。化学的細胞傷害薬は、その期待する細胞傷害性を誘導する一方で、比較のために含まれる多数の他の抗体も予想通り生物学的細胞アッセイがいくらか制限された。全体として、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体は２つの癌細胞型に対して細胞傷害活性を有することが示された。全ての癌細胞型が感受性を示さなかったので、抗体は、その活性に選択性を示した。さらに、抗体は非癌細胞型に対して細胞傷害性を示さなかったので、抗体の機能的特異性が証明され、これは治療状況において重要な要因である。

米国特許出願番号１０／３４８、２３１号および同第１０／８１０、７４４号に以前に記載のように、癌細胞株および正常細胞株の上記パネルならびに以下のさらなる卵巣癌細胞株（Ａ２７８０−ｃｐ、Ａ２７８０−Ｓ、Ｃ−１４、ＯＶ２００８、Ｈｅｙ、ＯＣＣ−Ｉ、ＯＶＣＡ−４２９、およびＥＳ−２+ＳＥＡＰ）への１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の結合を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって評価した。ＤＰＢＳ（Ｃａ^＋＋およびＭｇ^＋＋を含まない）での細胞単層の最初の洗浄によって、ＦＡＣＳ用の細胞を調製した。次いで、細胞分離緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を使用して、３７℃でその細胞培養プレートから細胞を除去した。遠心分離および回収後、細胞を、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、２％または２５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む４℃のＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝化生理食塩水（洗浄培地）に再懸濁し、計数し、適切な細胞密度に等分し、スピンしてペレットにし、２０μｇ／ｍＬで１１ＢＤ−２Ｅ１１−２またはコントロール抗体（アイソタイプコントロールまたは抗ＦＢＳ）を含む染色培地（ＭｇＣｌ_２およびＣａＣｌ_２＋／−２％ＦＢＳを含むＤＰＢＳ）に氷上で３０分間再懸濁した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抱合二次抗体の添加前に、細胞を洗浄培地で１回洗浄した。次いで、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抱合二次抗体を含む染色培地を、２０〜３０分間添加した。次いで、細胞を最後の洗浄に供し、１μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウムまたは１．５％パラホルムアルデヒドを含む染色培地に再懸濁した。フローサイトメトリーにおける捕捉細胞を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）を使用してＦＡＣＳｃａｎにおけるサンプルを流すことによって評価した。細胞の前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）を、ＦＳＣおよびＳＳＣ検出器の電圧および振幅の増加の調整によって設定した。３つの蛍光チャネル（ＦＬｌ、ＦＬ２、およびおＦＬ３）の検出器を、細胞が約１〜５単位の蛍光強度の中央値を有する均一なピークを有するように、精製されたアイソタイプコントロール抗体およびその後にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抱合二次抗体で染色した細胞を流すことによって調整した。ＦＳＣおよびヨウ化プロピジウム（使用した場合）を排除するためのゲーティングによって生細胞を捕捉した。各サンプルについて、分析のために約１０，０００個の生細胞を捕捉し、結果を表４および５に示す。表４および５は、アイソタイプコントロールに対する平均蛍光強度の増加倍率を集計し、以下のように定性的に示す：５未満（−）、５〜５０（＋）、５０〜１００（＋＋）、１００超（＋＋＋）。括弧内に細胞染色率を示す。

１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体の代表的なヒストグラムを、図６に示した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、乳房腫瘍細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（表４）およびいくつかの卵巣腫瘍細胞株（ＥＳ−２＋ＳＥＡＰが含まれる）への特異的腫瘍結合を示した（図５）。非癌細胞への１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の結合も認められたが、結合は細胞傷害性を示さなかった。これは、結合が必ずしもその同族抗原の抗体ライゲーションの結果を予測するものではなく、自明でない所見であることのさらなる証拠であった。これにより、異なる細胞における抗体ライゲーションの状況が単なる抗体結合よりもむしろ細胞傷害性の決定要因であることが示唆された。

正常ヒト組織の染色
ヒトにおける１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原の分布を特徴づけるためにＩＨＣ研究を行った。さらなる実験条件を決定するためにＩＨＣ至適化研究予め行った。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２モノクローナル抗体を産生し、上記のように精製した。

米国特許出願番号１０／８１０，７４４号に開示されているように、凍結ヒト正常器官組織アレイ（Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓ，Ｗａｔｅｒｖｌｉｅｔ，ＮＹ）を使用して、抗体を２０種の正常なヒト組織に抗体に結合させた。冷（−２０℃）アセトン中でスライドを１０分間後固定し、その後に室温にした。スライドを、４℃の冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）にて２分間で３回リンスし、その後、それぞれを３％過酸化水素での１０分間の洗浄によって内因性のペルオキシダーゼ活性を遮断した。次いで、スライドを、ＰＢＳにて５分間で３回リンスし、その後、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌブロッキング液（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）中にて室温で５分間インキュベートした。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２、抗ヒト筋肉アクチン（クローンＨＨＦ３５，Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）、またはアイソタイプコントロール抗体（クロカビのグルコースオキシダーゼ（哺乳動物組織中に存在せず、且つ誘導することもできない酵素）に指向する；Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を、抗体希釈緩衝液（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）で作業濃度（各抗体で５μｇ／ｍＬ（抗アクチンの２μｇ／ｍＬを除く）に希釈し、室温で一晩または（ｆｏｒ）１時間インキュベートした。スライドを、ＰＢＳで３回、それぞれ２分間洗浄した。一次抗体の免疫反応性を、市販のＨＲＰ抱合二次抗体（Ｄａｋｏ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）で室温で３０分間検出／視覚化した。この工程後、スライドを、ＰＢＳで３回、それぞれ２分間洗浄し、免疫ペルオキシダーゼ染色のためのＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩、Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）色原体基質溶液の室温で１０分間の添加によって発色させた。水道水でのスライドの洗浄によって、発色反応を停止させた。Ｍｅｙｅｒヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）で対比染色後、スライドをエタノール（９５〜１００％）で段階的に脱水し、キシレンで浄化した。封入剤（Ｄａｋｏ Ｆａｒａｍｏｕｎｔ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を使用して、スライドにカバーガラスをのせた。スライドを、Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００（Ｚｅｉｓｓ Ｃａｎａｄａ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）を使用して顕微鏡試験を行い、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用してデジタル画像を取り込み、保存した。結果を読み取り、スコアリングし、病理学者が解釈した。

表６は、正常なヒト組織のアレイの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２染色の結果のまとめを示す。表から、組織染色についての２つの主なカテゴリーが存在した。組織群は、完全に負であった。これらの組織は、甲状腺、気管支、および左心室の心筋を含んでいた（図７）。第２の組織群は、組織切片中で陽性染色された組織を含んでいたが、血管の平滑筋線維および／または上皮に限られていた（図８）。これらの結果により、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の抗原が正常組織上に広範に発現されず、抗体はヒトの少数の組織にのみ結合することが示唆された。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２による正常なヒト組織の染色は、抗ＭＣＳＰ抗体（Ｂ５）について以前に報告された染色と類似する。Ｂ５は、皮膚ケラチノサイト、肺胞上皮、および毛細管内皮に結合することが以前に示された。

表６：凍結したヒト正常組織上の１１ＢＤ−２Ｅ１１−２
略語：ＳＭＦ：平滑筋線維、Ｂｇ：バックグラウンド染色、ＰＤ：部分的剥離、Ｆ：折り畳み（ｆｏｌｄｅｄ）、ＣＤ：完全に剥離。

ヒト乳房腫瘍組織染色
１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原のヒト乳癌との癌関連（ｃａｎｃｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を決定するためにＩＨＣ研究に着手した（米国特許出願番号１０／８１０，７４４号に開示）。アクチン（ポジティブコントロール）およびクロカビのグルコースオキシダーゼ（哺乳動物組織中に存在せず、且つ誘導することもできない酵素）に指向する抗体（ネガティブコントロール）と比較した。１５人の乳癌患者由来の乳癌組織アレイおよび乳癌患者中の非新生物乳房組織由来の５サンプルを使用した（Ｃｌｉｎｏｍｍｉｃｓ，Ｗａｔｅｒｖｌｉｅｔ，ＮＹ）。以下の各患者についての情報を提供した：年齢、性別、および診断。実施例６のＩＨＣの手順に従った。

表７は、乳癌組織アレイの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体染色の結合のまとめを提供する。各アレイは、１５人の各患者由来の腫瘍サンプルを含んでいた。全体として、試験した８人の患者のうちの６２％（７つの組織サンプルは完全に剥がれているか、代表しなかった）は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原に陽性であった。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２についても、乳癌患者由来の３つの正常な乳房組織サンプル（同様に、組織サンプルのうちの２つは完全に剥がれている）のうちで陽性のものはなかった（図９）。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原については、陽性発現が高いほど腫瘍の病期が進行するという傾向はないようであった。しかし、この結果は、サンプルサイズの小ささによって制限された。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２染色は、癌細胞に特異的であった（図９）。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２由来の染色パターンは、患者サンプルにおいて、抗体が悪性疾患細胞に高度に特異的であるので、魅力的な薬物にできる標的となることを示した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の乳房腫瘍組織染色は、抗ＭＣＳＰ抗体（Ｂ５）について以前に報告された染色と類似する。Ｂ５は、６０％の乳癌腫瘍組織に結合することが以前に示されていた。
表７：凍結ヒト正常組織および乳房腫瘍組織に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２ ＩＨＣ

略語：ＳＭＦ：平滑筋線維、ＰＤ：部分的剥離、Ｆ：折り畳み（ｆｏｌｄｅｄ）、ＣＤ：完全に剥離。

１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原のヒト黒色腫との癌関連を決定するためにＩＨＣ研究に着手した。抗ＣＤ６３抗体（ＮＩＫ−Ｃ３；ＭＥＤＩＣＯＲＰ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ ＱＣ；ポジティブコントロール）およびクロカビのグルコースオキシダーゼ（哺乳動物組織中に存在せず、且つ誘導することもできない酵素）に指向する抗体（ネガティブコントロール）と比較した。３５人の黒色腫患者由来の黒色腫癌組織アレイおよび黒色腫癌患者中の正常な皮膚組織由来の１０サンプルを使用した（ＴｒｉＳｔａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ，ＬＬＣ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）。以下の修正以外は実施例６由来のＩＨＣの手順に従った。免疫ペルオキシダーゼ染色のためのＡＥＣ（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）色原体基質溶液の室温で１０分間の添加によって発色させた。水道水でのスライドの洗浄によって、発色反応を停止させた。Ｍｅｙｅｒヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）で対比染色後、スライドを蒸留水で浄化した。

表８は、黒色腫癌組織アレイの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体染色の結果のまとめを示す。各アレイは、３５人の各患者由来の腫瘍サンプルおよび１０人の患者由来の正常な皮膚を含んでいた。全体として、試験した３３人の患者のうちの６７％（２つの組織サンプルは完全に剥がれている）は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原に陽性であった（図１０）。さらに、黒色腫癌患者由来の６つの正常な皮膚組織サンプル（組織サンプルのうちの４つは代表しないか利用可能ではなかった）のうちで陽性のものはなかった（図１１）。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２染色は、癌細胞に特異的であった（図１１）。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２由来の染色パターンは、患者サンプルにおいて、抗体が悪性疾患細胞に高度に特異的であるので、魅力的な薬物にできる標的となることを示し、潜在的な薬物としての１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の有用性が示される。
表８：凍結ヒト正常皮膚組織および黒色腫組織に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２ＩＨＣ

略語：ｍｅｔａ：転移、ＮＲ：切片が代表的ではない、ｃｄ：切片が完全に剥がれている、ＮＡ：切片が利用可能ではない。

ｉｎ ｖｉｖｏＭＤＡ−ＭＢ−４６８確立腫瘍実験
米国特許出願番号１０／８１０，７４４号に開示され、且つ図１２を参照して、６〜８週齢のメスＳＣＩＤマウスに、２００万個のＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳癌細胞を含む１００μｌの生理食塩水を頸部に皮下注射することによって移植した。腫瘍成長を、カルパスを使用して毎週測定した。コホートの大部分の腫瘍体積が１００ｍｍ^３に到達した場合、５〜６匹のマウスを、２つの各治療群に無作為に分類した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２または緩衝液コントロールを、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４を含む希釈剤でのストック濃度からの希釈後に１０ｍｇ／ｋｇ／投与にて３００μｌの体積で腹腔内投与した。次いで、抗体を、同一の様式で移植６６日後まで１週間に３回ずつ全部で１０回投与した。およそ７日毎にカリパスを使用して、研究期間または各動物がＣＣＡＣ終点に到達するまで腫瘍成長を測定した。研究中に動物の体重を記録した。研究終了時、ＣＣＡＣガイドラインに従って、全動物を安楽死させた。

無作為分類時、各群の平均腫瘍体積および標準偏差は類似していた。統計的に、群間で体重の増加は認められなかった。これは、真の無作為化が起こったことを示した。図１２に示すように、抗体１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、３週間の治療終了時に、緩衝液コントロールと比較して、腫瘍成長を２５％抑制した（ｐ＝０．５２）。これは有意差ではなかったが、研究を通して、緩衝液コントロールと比較して、腫瘍体積が減少する傾向が認められた。したがって、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、確立された乳癌モデルで有効性を示した。

ｉｎ ｖｉｖｏＥＳ−２＋ＳＥＡＰ確立腫瘍実験
米国特許出願番号１０／８１０，７４４号に開示され、且つ図１３および１４を参照して、６〜８週齢のメス胸腺欠損ヌードマウスに、ヒト胎盤分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現するように安定にトランスフェクトした１０００万個のＥＳ−２＋ＳＥＡＰヒト卵巣癌細胞を腹腔内移植した。１０００万個の卵巣癌細胞を、５００μｌの無血清α−ＭＥＭに再懸濁した。７日目に、３匹のマウスの腫瘍成長を確認した。７日目の腫瘍成長の確認後、８匹のマウスを２つの各治療群に無作為に分類した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２または緩衝液コントロールを、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４を含む希釈剤でのストック濃度からの希釈後に１０ｍｇ／ｋｇ／投与にて２５０μｌの体積で腹腔内投与した。次いで、抗体を、１日１回ずつを５回、その後に１日おきに１回ずつをさらに５回、合計で１０回投与した。全身腫瘍組織量を、循環ＳＥＡＰレベルの測定によって予想し、研究期間または各動物がＣＣＡＣ終点に到達するまで剖検にて視覚的に評価した。研究中に動物の体重を記録した。研究終了時、ＣＣＡＣガイドラインに従って、全動物を安楽死させた。

無作為分類時、循環血漿ＳＥＡＰレベル（全身腫瘍組織量を示す）を分析した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２群および緩衝液コントロール群との間の平均ＳＥＡＰレベルの有意差は認められなかった。しかし、群内で、有益な腫瘍取り込み率（ｔａｋｅ−ｒａｔｅ）は認められなかった。図１３に示すように、抗体１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、治療群のコホートの生存が改善される傾向が示された。図１４に示すように、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置を受けた１匹の動物は、ＳＥＡＰの循環量がほぼ無視できるレベルに減少した。ＳＥＡＰの低循環レベルは、移植から約６０日後まで継続した。

ｉｎ ｖｉｖｏＡ２０５８ヒト黒色腫予防腫瘍実験
図１５を参照して、４〜８週齢のメスＳＣＩＤマウスに、７５万個のＡ２０５８ヒト黒色腫癌細胞を含む１００μｌの生理食塩水を頸部に皮下注射することによって移植した。マウスを２つの治療群に５匹ずつ無作為に分類した。移植後、２０ｍｇ／ｋｇの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２試験抗体または緩衝液コントロールを、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４を含む希釈剤でのストック濃度からの希釈後に３００μｌの体積で腹腔内投与した。次いで、抗体または緩衝液コントロールを、同一の様式で、１日１回ずつ７週間投与した。

およそ７日毎にカリパスを使用して、１０週間または各動物がＣａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＣＣＡＣ）終点に到達するまで腫瘍成長を測定した。研究中に動物の体重を記録した。研究終了時、ＣＣＡＣガイドラインに従って、全動物を安楽死させた。

図１５に示すように、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置により、緩衝液コントロールでの処置と比較して腫瘍成長が減少した。５５日目に（処置終了から５日後）、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置群の平均腫瘍体積は、緩衝液コントロール処置群の５８％であった（ｐ＝０．０４６、対応のないｔ検定）。したがって、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、同一の癌におけるコントロールと比較して、ヒト癌の乳癌、卵巣癌、および黒色腫ｉｎ ｖｉｖｏモデルで有効性を示し、全身腫瘍組織量が減少した。

ｉｎ ｖｉｖｏＡ２０５８ヒト黒色腫確立腫瘍実験
図１６を参照して、６〜８週齢のメスＳＣＩＤマウスに、５０万個のＡ２０５８ヒト黒色腫癌細胞を含む１００μｌの生理食塩水を頸部に皮下注射することによって移植した。腫瘍成長を、カルパスを使用して毎週測定した。コホートの大部分の腫瘍体積が１００ｍｍ^３に到達した場合、５匹のマウスを、２つの各治療群に無作為に分類した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２または緩衝液コントロールを、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４を含む希釈剤でのストック濃度からの希釈後に２０ｍｇ／ｋｇ／投与にて３００μｌの体積で腹腔内投与した。次いで、抗体を、同一の様式で移植４４日後まで１週間に３回ずつ全部で１０回投与した。およそ７日毎にカリパスを使用して、研究期間または各動物がＣＣＡＣ終点に到達するまで腫瘍成長を測定した。研究中に動物の体重を記録した。研究終了時、ＣＣＡＣガイドラインに従って、全動物を安楽死させた。

無作為分類時、各群の平均腫瘍体積および標準偏差は類似していた。統計的に、群間で体重の増加は認められなかった。これは、真の無作為化が起こったことを示した。図１３に示すように、抗体１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、治療終了時に、緩衝液コントロールと比較して、腫瘍成長を４９％抑制した（ｐ＝０．１２７２、対応のないｔ検定）。これは有意差ではなかったが、研究を通して、緩衝液コントロールと比較して、腫瘍体積が減少する傾向が認められた。したがって、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、確立された乳癌モデル、卵巣癌モデル、および黒色腫癌モデルで有効性を示した。全体的に、複数のヒト癌モデルで１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって利点（コントロール処置と比較した生存度の改善および／または全身腫瘍組織量の増加）が得られるこれらの結果により、哺乳動物（ヒトが含まれる）における癌治療についてのこの抗体の薬理学的利点および薬学的利点が示唆される。

非常に多数の証拠により、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２がＭＳＣＰ上に存在するエピトープのライゲーションによって抗癌効果を媒介することが示される。本発明の目的のために、このエピトープを、ハイブリドーマ細胞株１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によってコードされたモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメント、またはその抗体抱合体に結合する能力によって特徴づけられる「ＭＳＣＰ抗原部分」と定義する。実施例３では、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体を使用して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞などの発現細胞から同族抗原を免疫沈殿させることができることが示されている。さらに、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体を、例示の技術（ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、またはＩＨＣであるが、これらに限定されない）を使用して、特異的に結合するＭＳＣＰ抗原部分を発現する細胞および／または組織の検出で使用することができることを示し得る。

したがって、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、またはＩＨＣアッセイを使用して、免疫沈降１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原がこのような細胞または組織への１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の結合を阻害することができると示し得る。さらに、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体のように、他の抗体ＭＳＣＰ抗体を使用して、他のＭＳＣＰ抗原形態を免疫沈降および単離することができ、抗原を使用して、同一のアッセイ型によって、抗原を発現する細胞または組織への抗体の結合を阻害することもできる。

本明細書中に記載の全ての特許および刊行物は、本発明が関連する分野の当業者のレベルを示す。全ての特許および刊行物は、各刊行物が具体的且つ個別に参考として援用されるものと同一の範囲で本明細書中に参考として援用される。

本発明の一定の形態を例示しているが、本明細書中に記載され、且つ示されている部分の特定の形態または配置に制限されないと理解すべきである。本発明の範囲を逸脱することなく種々の変更形態を実施することができ、本発明が、明細書中の表示および記載に制限されると見なされることを意図しないことが当業者に明らかである。当業者は、本発明を、目的を実施し、記載の目的および利点、ならびにその固有物（ｉｎｈｅｒｅｎｔ）を得るために十分に適合されることを容易に認識する。本明細書中に記載の任意のオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生体関連化合物、方法、手順、および技術は、現在、好ましい実施形態の代表であり、例示であることを意図し、本発明の範囲を制限することを意図しない。当業者は、本明細書中の用途および他の用途を変更し、この変更は、本発明の精神の範囲内に含まれ、且つ添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される。本発明を特定の好ましい実施形態と共に記載しているが、特許請求の範囲に記載の本発明がこのような特定の実施形態に過度に制限すべきではないと理解すべきである。実際、当業者に明らかな本発明を実施するために記載した様式の種々の修正形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内であると見なされる。

１１ＢＤ−２Ｅ１１−２で探索したＭＤＡ−ＭＢ−２３１（レーン１）またはＯＶＣＡＲ−３（レーン２）膜のウェスタンブロットを示す図である。還元条件下で膜タンパク質を分離した。右側に分子量マーカーを示す。 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜への１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の結合に対する脱グリコシル化の効果を示す図である。脱グリコシル化緩衝液のみ（レーン１）、ＰＮＧアーゼＦ、エンド−ｏ−グリコシダーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、およびグリコサミノダーゼの組み合わせ（レーン２）、ＰＮＧアーゼＦ、エンド−ｏ−グリコシダーゼ、およびシアリダーゼの組み合わせ（レーン３）、シアリダーゼのみ（レーン４）、エンド−ｏ−グリコシダーゼのみ（レーン５）、ならびにＰＮＧアーゼのみ（レーン６）でインキュベートしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜への１１ＢＤ−２Ｅ１１−２結合。 １１ＢＤ−２Ｅ１１−２で免疫沈降したＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）およびウェスタンブロット（パネルＢ）を示す図である。レーン１は分子量標準を示し、レーン２はＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質を示し、レーン３は１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降物質を示し、レーン４はアイソタイプコントロール免疫沈降物質を示す。 １１ＢＤ−２Ｅ１１−２（パネルＡ）、ＩｇＧ１アイソタイプコントロール（クローン１０７．３、パネルＢ）、抗ラットＮＧ２（ポリクローナル、パネルＣ）、正常ウサギＩｇＧ（パネルＤ）、抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７、パネルＥ）、およびＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（クローンＧ１５５−２２８、パネルＦ）で探索したタンパク質のウェスタンブロットを示す図である。レーン１：１１ＢＤ−２Ｅ１１−２免疫沈降物、レーン２：ＩｇＧ１アイソタイプコントロール（クローン１０７．３）免疫沈降物、レーン３：抗ＭＣＳＰ（クローン９．２．２７）免疫沈降物、レーン４：ＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（クローンＧ１５５−２２８）免疫沈降物、レーン５：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜、およびレーン６：サンプル緩衝液のみ（ネガティブコントロール）。 ＭＣＳＰペプチドアレイへの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の結合強度（Ｎｏｅｈｒｉｎｇｅｒ光単位）を示す図である。 いくつかの癌細胞株および非癌細胞に指向する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２、アイソタイプコントロール、または抗ＥＧＦＲの代表的ＦＡＣＳヒストグラムを示す図である。 凍結した正常なヒト組織アレイ由来の心臓の組織切片に対して１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（Ａ）およびアイソタイプコントロール抗体（Ｂ）を使用して得た結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真を示す図である。心筋線維に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２染色は認められなかった。倍率は２００倍である。 凍結した正常なヒト組織アレイ由来の骨格筋の組織切片に対して１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（Ａ）、抗アクチン（Ｂ）、およびアイソタイプコントロール抗体（Ｃ）を使用して得た結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真を示す図である。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、骨格筋を染色しなかったが、血管の平滑筋は染色する（矢印）。倍率は２００倍である。 乳癌腫瘍（浸潤性腺管癌）への１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（Ａ）およびアイソタイプコントロール抗体（Ｂ）の結合の代表的な顕微鏡写真を示す図である。パネルＡ中の黒色の矢印は、腫瘍細胞を示す。倍率は２００倍である。 凍結した正常なヒト組織アレイ由来の悪性黒色腫の組織切片に対して１１ＢＤ−２Ｅ１１−２（Ａ）、ポジティブコントロール抗ＣＤ６３（ＮＫＩ−Ｃ３）（Ｂ）、およびネガティブアイソタイプコントロール抗体（Ｃ）を用いて得られた結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真を示す図である。倍率は２００倍である。 凍結した黒色腫ヒト組織アレイ由来の悪性黒色腫（Ａ）および正常な皮膚（Ｂ）の組織切片に対して１１ＢＤ−２Ｅ１１−２を用いて得られた結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真を示す図である。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は悪性黒色腫を強く染色するが、正常な皮膚は染色しない。倍率は２００倍である。 予防ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌モデルにおける腫瘍成長に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２または緩衝液コントロールの効果を示す図である。破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。 確立されたＥＳ−２異種移植片研究における１１ＢＤ−２Ｅ１１−２または緩衝液コントロール抗体での処置後の腫瘍保有マウスの生存を示す図である。 確立されたＥＳ−２異種移植片研究における１１ＢＤ−２Ｅ１１−２または緩衝液コントロールでの処置前、処置中、および処置後の腫瘍保有マウスのＳＥＡＰレベルを示す図である。 予防Ａ２０５８黒色腫モデルにおける腫瘍成長に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２または緩衝液コントロールの効果を示す図である。破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。 確立されたＡ２０５８黒色腫モデルにおける腫瘍成長に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２または緩衝液コントロールの効果を示す図である。破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。

Claims (49)

1. 癌疾患を罹患した患者の治療方法であって、
   前記患者に癌疾患の治療に有用な抗癌抗体の産生方法にしたがって産生した抗癌抗体またはそのフラグメントを投与する工程と、前記抗体またはそのフラグメントが、癌組織の細胞に対して細胞傷害性を示し、本質的に、非癌細胞に対して良性であることを特徴とすることと、
   ここで、前記抗体またはそのフラグメントを薬学的に許容可能なアジュバントを含む混合薬中に含め、前記癌疾患治療の媒介に有効な量を投与することと、
   前記抗体が、前記癌組織によって発現される抗原部分に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、前記抗原部分がＡＴＣＣにＰＴＡ−５６４３として寄託されているクローンによってコードされるモノクローナル抗体の識別可能な特徴（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）を有する抗体に結合することを特徴とすることを含む、方法。
2. 前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが、ヒト化またはキメラ化されている、請求項１に記載の癌疾患を罹患した患者の治療方法。
3. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントを、毒素、酵素、放射性化合物、および造血細胞からなる群から選択されるメンバーと抱合し、それにより、抗体抱合体を形成する工程と、
   前記抗体抱合体またはその抱合フラグメントを前記患者に投与する工程と、
   ここで、前記抗体抱合体または抱合フラグメントを薬学的に許容可能なアジュバントを含む混合薬中に含め、前記癌疾患治療の媒介に有効な量を投与することを含む請求項１に記載の癌疾患を罹患した患者の治療方法。
4. 前記抗体またはそのフラグメントが、ヒト化またはキメラ化されている請求項３に記載の方法。
5. 前記抗体またはそのフラグメントの細胞傷害性が、抗体依存性細胞毒性によって媒介される請求項１に記載の癌疾患を罹患した患者の治療方法。
6. 前記抗体またはそのフラグメントの細胞傷害性が、補体依存性細胞毒性によって媒介される請求項１に記載の癌疾患を罹患した患者の治療方法。
7. 前記抗体またはそのフラグメントの細胞傷害性が、細胞化学結合の加水分解の触媒によって媒介される請求項１に記載の癌疾患を罹患した患者の治療方法。
8. 前記抗体またはそのフラグメントの細胞傷害性が、腫瘍細胞に対して惹起する推定癌抗原に対する免疫応答の生成によって媒介される請求項１に記載の癌疾患を罹患した患者の治療方法。
9. 前記抗体またはそのフラグメントの細胞傷害性が、その機能を妨害するための細胞膜タンパク質のターゲティングによって媒介される請求項１に記載の癌疾患を罹患した患者の治療方法。
10. 前記抗体またはそのフラグメントの細胞傷害性が、細胞死滅の開始シグナルを生成するのに有効な細胞タンパク質の高次構造の変化によって媒介される請求項１に記載の癌疾患を罹患した患者の治療方法。
11. 前記生成方法が、特定の個体から得た癌細胞および非癌細胞を含む組織サンプルを使用する請求項１に記載の癌疾患を罹患した患者の治療方法。
12. 癌疾患を罹患した患者の治療方法であって、
    前記患者に癌疾患の治療に有用な抗癌抗体の産生方法にしたがって産生した抗体またはその抗原結合フラグメントを投与する工程と、前記抗体が、癌組織の細胞に対して細胞傷害性を示し、本質的に、非癌細胞に対して良性であることと、
    ここで、前記抗体が、ＡＴＣＣにＰＴＡ−５６４３として寄託されているクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、前記抗体を薬学的に許容可能なアジュバントを含む混合薬中に含め、前記癌疾患治療の媒介に有効な量を投与することを含む方法。
13. 前記抗体またはそのフラグメントが、ヒト化またはキメラ化されている請求項１２に記載の癌疾患を罹患した患者の治療方法。
14. 前記抗体またはそのフラグメントを、毒素、酵素、放射性化合物、および造血細胞からなる群から選択されるメンバーと抱合し、それにより、抗体抱合体を形成する工程と、
    前記抗体抱合体またはそのフラグメントを前記患者に投与する工程と、
    ここで、前記抱合抗体を薬学的に許容可能なアジュバントを含む混合薬中に含め、前記癌疾患治療の媒介に有効な量を投与することを含む請求項１２に記載の癌疾患を罹患した患者の治療方法。
15. 前記抗体またはそのフラグメントが、ヒト化またはキメラ化されている請求項１４に記載の方法。
16. 前記抗体またはそのフラグメントの細胞傷害性が、抗体依存性細胞毒性によって媒介される請求項１２に記載の癌疾患を罹患した患者の治療方法。
17. 前記抗体またはそのフラグメントの細胞傷害性が、補体依存性細胞毒性によって媒介される請求項１２に記載の癌疾患を罹患した患者の治療方法。
18. 前記抗体またはそのフラグメントの細胞傷害性が、細胞化学結合の加水分解の触媒によって媒介される請求項１２に記載の癌疾患を罹患した患者の治療方法。
19. 前記抗体またはそのフラグメントの細胞傷害性が、腫瘍細胞に対して惹起する推定癌抗原に対する免疫応答の生成によって媒介される請求項１２に記載の癌疾患を罹患した患者の治療方法。
20. 前記抗体またはそのフラグメントの細胞傷害性が、その機能を妨害するための細胞膜タンパク質のターゲティングによって媒介される請求項１２に記載の癌疾患を罹患した患者の治療方法。
21. 前記抗体またはそのフラグメントの細胞傷害性が、細胞死滅の開始シグナルを生成するのに有効な細胞タンパク質の高次構造の変化によって媒介される請求項１２に記載の癌疾患を罹患した患者の治療方法。
22. 前記生成方法が、特定の個体から得た癌細胞および非癌細胞を含む組織サンプルを使用する請求項１２に記載の癌疾患を罹患した患者の治療方法。
23. 細胞表面上のＭＣＳＰ抗原部分を発現するヒト腫瘍細胞の細胞傷害性を媒介するプロセスであって、
    前記腫瘍細胞を単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程と、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが発現ＭＣＳＰ抗原部分に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであることと、前記抗原部分がＡＴＣＣにＰＴＡ−５６４３として寄託されているクローンによってコードされるモノクローナル抗体の識別可能な特徴を有する抗体に結合することを特徴とすることと
    それにより、前記結合の結果として細胞傷害性が起こることを含むプロセス。
24. 前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントが、ヒト化またはキメラ化されている請求項２３に記載のプロセス。
25. 前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントを、細胞傷害性部分、酵素、放射性化合物、および造血細胞からなる群から選択されるメンバーと抱合し、それにより、抗体抱合体が形成される請求項２３に記載のプロセス。
26. 前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントが、ヒト化またはキメラ化されている請求項２５に記載のプロセス。
27. 前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントがマウスである請求項２３に記載のプロセス。
28. 前記ヒト腫瘍組織サンプルを、乳房、卵巣、または黒色腫組織からなる群から選択される組織を起源とする腫瘍から得る請求項２３に記載のプロセス。
29. ＡＴＣＣにＰＴＡ−５６４３として寄託されているクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合するＭＣＳＰ抗原部分を発現する細胞の存在を決定するための結合アッセイであって、
    細胞サンプルを準備する工程と、
    単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを準備する工程と、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、前記発現ＭＣＳＰ抗原部分に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであることと、前記抗原部分がＡＴＣＣにＰＴＡ−５６４３として寄託されているクローンによってコードされるモノクローナル抗体の識別可能な特徴を有する抗体に結合することを特徴とすることと、
    前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを前記細胞サンプルと接触させる工程と、
    前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの前記細胞サンプルへの結合を決定する工程と、
    それにより、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合するＭＣＳＰ抗原部分を発現する細胞の存在を決定することを含む、結合アッセイ。
30. 前記細胞サンプルを、乳房、卵巣、または黒色腫組織からなる群から選択される組織を起源とする腫瘍から得る請求項２９に記載の結合アッセイ。
31. 単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合するＭＣＳＰ抗原部分を発現するサンプル中の細胞を単離またはスクリーニングするプロセスであって、前記抗原部分がＡＴＣＣにＰＴＡ−５６４３として寄託されているクローンによってコードされるモノクローナル抗体の識別可能な特徴を有する抗体に結合することを特徴とすることと、
    細胞サンプルを準備する工程と、
    単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを準備する工程と、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、前記発現ＭＣＳＰ抗原部分に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであることと、前記抗原部分がＡＴＣＣにＰＴＡ−５６４３として寄託されているクローンによってコードされるモノクローナル抗体の識別可能な特徴を有する抗体に結合することを特徴とすることと、
    前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを前記細胞サンプルと接触させる工程と、
    前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの前記細胞サンプルへの結合を決定する工程と、
    それにより、ＡＴＣＣにＰＴＡ−５６４３として寄託されているクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合するＭＣＳＰ抗原部分を発現する前記細胞が前記結合によって単離され、前記細胞サンプル中のその存在が確認されることを含むプロセス。
32. 前記細胞サンプルを、乳房、卵巣、または黒色腫組織からなる群から選択される組織を起源とする腫瘍から得る請求項３１に記載のプロセス。
33. 哺乳動物におけるヒト腫瘍の治療によって延命し、そして／または疾患の進行を遅延させる方法であって、
    前記腫瘍が、ＡＴＣＣにアクセッション番号ＰＴＡ−５６４３として寄託されているクローンによってコードされるモノクローナル抗体の識別可能な特徴を有するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合する抗原を発現することと、前記哺乳動物に、前記哺乳動物の全身腫瘍組織量を減少さるのに有効な量のモノクローナル抗体を投与する工程と、それにより、疾患の進行が遅延し、そして／または延命されることを含む方法。
34. 前記抗体を細胞傷害性部分と抱合する請求項３３に記載の方法。
35. 前記細胞傷害性部分が、放射性同位体である請求項３３に記載の方法。
36. 前記抗体が補体を活性化する請求項３３に記載の方法。
37. 前記抗体が、抗体依存性細胞毒性を媒介する請求項３３に記載の方法。
38. 前記抗体が、マウス抗体である請求項３３に記載の方法。
39. 前記抗体が、ヒト化抗体である請求項３３に記載の方法。
40. 前記抗体がキメラ抗体である請求項３３に記載の方法。
41. 発現ＭＣＳＰ抗原部分に特異的に結合する、ＡＴＣＣにＰＴＡ−５６４３として寄託されているクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの識別可能な特徴を有するモノクローナル抗体に特異的に結合する発現ＭＣＳＰ抗原部分を含むＭＣＳＰのエピトープ。
42. 前記ＭＣＳＰのエピトープに特異的に結合する、ＡＴＣＣにＰＴＡ−５６４３として寄託されているクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの識別可能な特徴を有するモノクローナル抗体に結合する請求項４１に記載のＭＣＳＰエピトープを含む抗体−抗原複合体。
43. 前記抗体がキメラ抗体である請求項４２に記載の抗体−抗原複合体。
44. 前記抗体がヒト化抗体である請求項４２に記載の抗体−抗原複合体。
45. 前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントを、細胞傷害性部分、酵素、放射性化合物、および造血細胞からなる群から選択されるメンバーと抱合し、それにより、抗体抱合体が形成される請求項４２に記載の抗体−抗原複合体。
46. ペプチド配列ＬＥＦＴＬＴＴＱＳＲＱＡＰＬＡＦＱＡ（配列番号１）が特異的に結合する請求項４１に記載のエピトープ。
47. ペプチド配列ＣＧＧＰＡＱＤＬＴＦＲＶＳＤＧＬＱＡ（配列番号２）が特異的に結合する請求項４１に記載のエピトープ。
48. ペプチド配列ＬＥＦＴＬＴＴＱＳＲＱＡＰＬＡＦＱＡ（配列番号１）およびＣＧＧＰＡＱＤＬＴＦＲＶＳＤＧＬＱＡ（配列番号２）が特異的に結合する請求項４１に記載のエピトープ。
49. ＴＬＴＭＬＡＲＬＡＳＡＡＳＦＦＧＥＮ（配列番号３）、ＡＣＥＧＬＴＦＱＶＬＧＴＳＳＧＬＰＶ（配列番号４）、ＶＬＲＧＡＰＧＴＥＶＲＳＦＴＱＡＱＬ（配列番号５）、ＫＴＧＫＨＤＶＱＶＬＴＡＫＰＲＮＧＬ（配列番号６）、ＬＴＡＫＰＲＮＧＬＡＧＤＴＥＴＦＲＫ（配列番号７）、およびＰＧＧＱＰＤＰＥＬＬＱＦＣＲＴＰＮＰ（配列番号８）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチド配列にさらに結合する請求項４８に記載のエピトープ。

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