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JP2008189594A - 生体組織補填体の製造装置および製造方法 - Google Patents

生体組織補填体の製造装置および製造方法 Download PDF

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Abstract

【課題】簡単な操作で短時間のうちに、末梢血、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織のような細胞ソースを利用して生体組織補填体を効率的に製造する。
【解決手段】赤血球および血小板を捕捉せず血管新生に有効な有核細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタ2と、該細胞捕捉フィルタ2の入口2a側に、第1の切替弁7を介して接続され、細胞ソースAを収容した細胞ソース容器3および生体組織補填材Bを収容した回収容器4と、細胞捕捉フィルタ2の出口2b側に、第2の切替弁8を介して接続され、細胞捕捉フィルタ2を透過した赤血球および血小板を収容するドレインバッグ5および回収液Cを供給する回収液供給手段6とを備える生体組織補填体の製造装置1を提供する。
【選択図】 図1

Description

本発明は、生体組織補填体の製造装置および製造方法に関するものである。
従来、赤血球は実質的に捕捉しないが血管新生に有効な細胞は捕捉する細胞捕捉フィルタに血液を流して血管新生に有効な細胞を該細胞捕捉フィルタに捕捉させ、捕捉された細胞を回収する血管新生療法用細胞組成物の製造方法が知られている(例えば、特許文献1参照。)。
特開2005−82567号公報
しかしながら、回収した血管新生に有効な細胞を用いて生体組織補填体を製造する場合に、回収容器から取り出して生体組織補填材に播種する作業を行う必要があり、手続きが煩わしい上に、回収容器からの取り出し、生体組織補填材への播種に際して、細菌等が混入する可能性があり、そのような問題が発生しないように高度の注意を払う必要がある。また、血管新生に有効な細胞を除去した後の体液内にも生体組織補填体の製造に有効な物質が多く含まれており、これを患者の体内に単に戻すのではなく有効利用することも考えられる。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡単な操作で短時間のうちに、末梢血を利用して生体組織補填体を効率的に製造することができる生体組織補填体の製造装置および製造方法を提供することを目的としている。
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、赤血球および血小板を捕捉せず血管新生に有効な有核細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタと、
該細胞捕捉フィルタの入口側に、第1の切替弁を介して接続され、細胞ソースを収容した細胞ソース容器および生体組織補填材を収容した回収容器と、前記細胞捕捉フィルタの出口側に、第2の切替弁を介して接続され、前記細胞捕捉フィルタを透過した赤血球および血小板を収容するドレインバッグおよび回収液を供給する回収液供給手段を備える生体組織補填体の製造装置を提供する。
本発明によれば、細胞捕捉フィルタの入口側に接続された第1の切替弁を細胞ソースを収容した細胞ソース容器側に接続し、細胞捕捉フィルタの出口側に接続された第2の切替弁をドレインバッグ側に接続した状態で、重力その他の手段によって細胞ソースを細胞捕捉フィルタに流入させると、該細胞捕捉フィルタにより、血管新生に有効な有核細胞、例えば、単核球細胞が捕捉される。一方、赤血球および血小板は細胞捕捉フィルタにより捕捉されることなく通過して、ドレインバッグに流入させられる。
この後に、第1の切替弁を細胞ソース容器側から回収容器側に切り替え、第2の切替弁をドレインバッグ側から回収液供給手段側に切り替えるとともに、回収液供給手段の作動により、回収液を供給することによって、細胞捕捉フィルタを回収液により逆洗する。これにより、細胞捕捉フィルタに捕捉されていた血管新生に有効な有核細胞が回収液とともに回収容器に流入し、回収容器内に収容されている生体組織補填材に播種される。すなわち、細胞ソースから回収された血管新生に有効な有核細胞を外気に触れさせることなく、簡易な操作で無菌的に生体組織補填材に播種して生体組織補填体を効率的に製造することができる。
上記発明においては、前記回収容器が減圧されていることとしてもよい。
このようにすることで、第1の切替弁を細胞ソース容器側から回収容器側に切り替えると、細胞捕捉フィルタに捕捉されていた有核細胞が回収液とともに回収容器内に吸引され易くなり、生体組織補填体をさらに効率的に製造することが可能となる。
また、上記発明においては、前記回収容器に、カルシウムイオンおよびサイトカイン用の注入口が設けられていることとしてもよい。
細胞捕捉フィルタにより捕捉され、回収容器に回収された血管新生に有効な有核細胞、特に、単核球細胞にカルシウムイオンを作用させることにより、単核球細胞から繊維芽様細胞に変化させることができる。繊維芽様細胞は間葉系幹細胞と同様の性質を有し、所定の条件下において分化し、患者の補填後に早期に生体組織を修復可能な生体組織補填体を製造することができる。また、サイトカインの作用により、繊維芽様細胞の成長を促進することができる。
この場合に、前記サイトカインがb−FGFであることとしてもよい。
また、前記細胞ソースが、末梢血、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織のいずれかであることとしてもよい。
また、本発明は、赤血球および血小板を捕捉せず血管新生に有効な有核細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタに細胞ソースを透過させるステップと、前記細胞捕捉フィルタを透過した赤血球にカルシウムイオンを供給するステップと、カルシウムイオンの供給により得られた液体を前記細胞捕捉フィルタに逆方向から透過させるステップと、該細胞透過フィルタを逆方向に透過した液体を回収するステップと、回収された液体を生体組織補填材に供給するステップとを備える生体組織補填体の製造方法を提供する。
本発明によれば、細胞捕捉フィルタに細胞ソースを透過させることにより、細胞ソース中に含まれる血管新生に有効な有核細胞が細胞捕捉フィルタに捕捉され、赤血球および血小板が透過させられる。細胞捕捉フィルタを透過した赤血球にカルシウムイオンを供給することにより、赤血球を溶血させて破壊し、内部に含有されている血漿を含む体液を得ることができる。そして、得られた体液を細胞捕捉フィルタに逆方向から透過させることにより、細胞捕捉フィルタに捕捉されていた血管新生に有効な有核細胞が体液によって逆洗され、回収される。そして、回収された体液を生体組織補填材に供給することにより、血管新生に有効な有核細胞を生体組織補填材に播種し、容易に生体組織補填体を得ることができる。
この場合において、赤血球にカルシウムイオンを供給することにより得られた血漿は、細胞の生着性を向上させる作用を有するので、生体組織補填体における細胞の成長を促進することができる。さらに、体液内に含まれるカルシウムイオンは、単核球細胞を繊維芽様細胞に変化させるので、生体への埋植後に、早期に生体組織を修復可能な生体組織補填体を製造することができる。
また、この場合に、前記細胞ソースが、末梢血、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織のいずれかであることとしてもよい。
本発明によれば、簡単な操作で短時間のうちに、末梢血、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織のような細胞ソースを利用して生体組織補填体を効率的に製造することができるという効果を奏する。
本発明に係る生体組織補填体の製造装置1および製造方法について、図1〜図4を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る生体組織補填体の製造装置1は、図1に示されるように、一方向に末梢血Aを流動させることにより、赤血球および血小板を捕捉せず血管新生に有効な細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタ2と、該細胞捕捉フィルタ2の入口側に接続される末梢血Aを収容した血液容器(細胞ソース容器)3および生体組織補填材Bを収容した回収容器4と、細胞捕捉フィルタ2の出口側に接続される細胞捕捉フィルタ2を透過した赤血球および血小板を収容するドレインバッグ5および回収液Cを供給するシリンジ6からなる回収液供給手段とを備えている。
細胞捕捉フィルタ2と血液容器3および回収容器4との間には、第1の三方弁(切替弁)7が配置され、該第1の三方弁7の切り替えにより、血液容器3または回収容器4のいずれかが、択一的に細胞捕捉フィルタ2に接続されるようになっている。図中、符号8はピンチバルブである。
また、前記細胞捕捉フィルタ2と、ドレインバッグ5およびシリンジ6との間には、第2の三方弁(切替弁)9が配置され、該第2の三方弁9の切り替えにより、ドレインバッグ5またはシリンジ6からなる回収液供給手段のいずれかが、択一的に細胞捕捉フィルタ2に接続されるようになっている。
前記細胞捕捉フィルタ2としては、ポリエステルあるいはポリプロピレンからなる平均繊維径約0.01〜10μmの不織布フィルタを積層したものが採用される。
また、前記血液容器3、回収容器4およびドレインバッグ5は、いずれも無菌的に細胞捕捉フィルタ2に接続されている。
回収容器4に収容されている生体組織補填材Bは、例えば、βリン酸三カルシウム(βTCP)により構成されている。また、回収容器4は内部が減圧状態にされている。
また、回収容器4には、シリンジ10(図4参照。)等の供給手段を無菌的に接続可能な接続部4aが設けられ、該接続部4aを介して、カルシウムイオンDあるいはb−FGFをシリンジ10により供給することができるようになっている。
また、シリンジ6には、回収液Cとして、血管新生に有効な細胞の変性が少ない、例えば、生理食塩水、ダルベッコリン酸塩緩衝液(D−PBS)、ハンクス液等の緩衝液、RPMI1640等の培地等が収容されている。
また、効率よく回収するために、一定の血液浸透圧を有する回収液Cを採用した方がよく、デキストラン等が添加されていてもよい。
また、細胞ソースとしては、末梢血の他、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織を使用してもよい。これらの中で粘性の高いものについては酵素処理などを行い、粘性を低下させて液状化させた後に使用することが望ましい。
このように構成された本実施形態に係る生体組織補填体の製造装置1の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る生体組織補填体の製造装置1を用いて生体組織補填体を製造するには、第1の三方弁7を血液容器3側に接続し、第2の三方弁9をドレインバッグ5側に接続し、血液容器3を細胞捕捉フィルタ2よりも高位に配置する。
これにより、図2に示されるように、血液容器3内に収容されている末梢血Aが、重力により配管内を下降する。末梢血Aとしては、例えば、40cc〜200ccを、20cc/minの滴下速度で下降させるのが好ましい。下降する末梢血Aは、第1の三方弁7を通過して細胞捕捉フィルタ2に入口2a側から供給される。そして、細胞捕捉フィルタ2内を流動する際に、末梢血A内に含有されている血管新生に有効な有核細胞、例えば、単核球細胞が捕捉される。一方、赤血球および血小板Eは細胞捕捉フィルタ2により捕捉されることなく通過して、第2の三方弁9を通過し、配管を介してドレインバッグ5に流入させられる。
そして、血液容器3内の末梢血Aが十分に細胞捕捉フィルタ2を通過した時点で、第1の三方弁7を回収容器4側に切り替えるとともに、第2の三方弁9をシリンジ6側に切り替えてシリンジ6を加圧する。これにより、シリンジ6内の回収液Cを細胞捕捉フィルタ2の出口2b側から供給する。
回収容器4内は減圧状態に設定されているので、第1の三方弁7を回収容器4側に切り替えることにより、図3に示されるように、配管を介して細胞捕捉フィルタ2内の液体Cが入口2a側に吸引される。
すなわち、シリンジ6の作動による出口2b側の加圧と回収容器4による入口2a側の減圧とにより、シリンジ6内の回収液Cが細胞捕捉フィルタ2内に出口2b側からスムーズに流入し、細胞捕捉フィルタ2を出口2b側から入口2a側に向かって流動する。これにより、細胞捕捉フィルタ2は逆洗され、細胞捕捉フィルタ2に捕捉されていた血管新生に有効な有核細胞Fが入口2a側から第1の三方弁7を介して回収容器4内に回収液Cとともに流入する。
回収容器4内には、生体組織補填材Bが収容されているので、流入してきた血管新生に有効な有核細胞Fが生体組織補填材Bに播種されて付着する。これにより、生体組織補填体が製造されることになる。
この場合において、本実施形態に係る製造装置1によれば、2つの三方弁7,9を切り替えて、回収液供給手段としてのシリンジ6を操作するだけで、生体組織補填体を製造できる。したがって、きわめて簡易に生体組織補填体を製造することができる。さらに、製造工程において末梢血Aおよび生体組織補填材Bが、全て外気に触れることなく容器3,4および配管内に維持されるので、感染のおそれがなく、無菌的に生体組織補填体を製造することができるという利点がある。
また、このようにして製造された生体組織補填体に対し、回収容器4に設けられた接続部4aにシリンジ10を刺して、カルシウムイオンDおよびb−FGFを供給することにより、生体組織補填体に付着した血管新生に有効な有核細胞F、特に、単核球細胞を繊維芽用細胞に変化させることができる。繊維芽用細胞は、間葉系幹細胞と同様の性質を有するので、生体組織補填材Bに生着して成長し、骨芽細胞のような生体組織前駆細胞に分化することができ、生体に埋植された後に早期に生体組織の欠損部を修復可能な生体組織補填体を製造することができる。
次に、本発明の第2の実施形態に係る生体組織補填体の製造方法について、図5〜図9を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る生体組織補填体の製造方法は、図1に示された第1の実施形態に係る生体組織補填体の製造装置1と同様の製造装置20を用いて行われるので、構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。なお、第1の実施形態に係る製造装置1における第2の三方弁9および回収液供給手段としてのシリンジ6は不要である。
本実施形態に係る製造方法は、血液容器3に収容した末梢血Aを第1の三方弁7を開いて細胞捕捉フィルタ2に供給し、血管新生に有効な有核細胞Fを細胞捕捉フィルタ2に捕捉させるステップS1と、細胞捕捉フィルタ2を通過してドレインバッグ5に収容された赤血球EにカルシウムイオンGまたは0.3〜0.5%生理食塩水を供給するステップS2と、第1の三方弁7を切り替えて、ドレインバッグ5内の液体Hを細胞捕捉フィルタ2の出口2b側から逆方向に細胞捕捉フィルタ2に透過させるステップS3と、細胞捕捉フィルタ2を逆方向に透過した液体F,Hを回収容器4の方向に回収するステップS4と、回収された液体F,Hを回収容器4内の生体組織補填材Bに供給するステップS5とを備えている。
ステップS1において血管新生に有効な有核細胞Fを分離された残りの赤血球Eを多く含む末梢血に、ステップS2においてカルシウムイオンGを供給すると、赤血球Eが破壊されて内部の血漿成分Hがドレインバッグ5内に残る。そして、ステップS3においては、ドレインバッグ5内を加圧して、抽出された血漿成分Hを含む体液を細胞捕捉フィルタ2側に向けて逆流させる。
あるいは、ドレインバッグ5を細胞捕捉フィルタ2よりも高位に配置して、重力により血漿成分Hを含む体液を細胞捕捉フィルタ2の出口2b側から入口2a側に向かって流動させる。これにより、血漿成分Hを含む体液の流動により、細胞捕捉フィルタ2に捕捉されていた血管新生に有効な有核細胞Fが細胞捕捉フィルタ2から剥離され、血漿成分Hを含む体液とともに入口2a側から流出する。第1の三方弁7は、回収容器4側に接続するように切り替えられているので、ステップS4により、血漿成分Hと血管新生に有効な有核細胞Fとを含む体液が回収容器4内に回収される。
回収容器4内には生体組織補填材Bが収容されているので、血管新生に有効な有核細胞Fが血漿成分Hとともに生体組織補填材Bに播種される。血漿成分Hは、有核細胞Fの生着性を向上するので、生体組織補填材B上における有核細胞Fの成長が促進される。また、ドレインバッグ5に加えるカルシウムイオンGの濃度を、回収容器4内に流入した液体F,H内にカルシウムイオンGが残存するように設定しておくことにより、カルシウムイオンGを単核球細胞に作用させて繊維芽様細胞に変化させることができる。
なお、本実施形態に係る生体組織補填体の製造方法によれば、血漿成分Hを含む液体で細胞捕捉フィルタ2を逆洗することとしたが、これに代えて、ドレインバッグ5内に得られた血漿成分Hを多く含む液体を遠心分離して、多血小板血漿(PRP)あるいは貧血小板血漿(PPP)を得、これを細胞Fに添加することにしてもよい。
なお、本実施形態においては、血管新生に有効な単核球細胞等の細胞Fを細胞捕獲フィルタ2により捕獲した後、逆洗により剥離させ、生体組織補填材Bに播種することとしたが、単核球細胞Fの用途は、骨や軟骨の治療の他、樹状細胞を用いた癌治療にも用いられる。
末梢血から得られた単核球細胞を、貪食白血球機能の亢進作用を持つサイトカインであるGM−CSFおよびIL−4を添加した培地中で培養すると、樹状細胞に分化させることができる。これに癌細胞から抽出したタンパク質を貪食させると、取り込まれた癌抗原タンパク質が細胞内で分断されて異常ペプチドを生じ、抗原として樹状細胞表面に提示される。
この樹状細胞を患者に戻すことにより、体内で癌細胞に対する特異的なCTL(細胞傷害性Tリンパ球)が誘導され治療効果が得られる。
このことを応用し、回収容器4には生体組織補填材Bではなく、GM−CSFおよびIL−4を添加した培地を入れておき、細胞捕捉フィルタ2で捕捉した有核細胞Fを流入させる。これを培養することで樹状細胞を無菌的に得ることができ、患者に戻して癌治療を行うことが可能となる。
本発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造装置を示す全体構成図である。 図1の製造装置の作用を説明する図であり、細胞捕捉フィルタに有核細胞を捕捉させるステップを示す図である。 図1の製造装置の作用を説明する図であり、細胞捕捉フィルタに捕捉された有核細胞を回収容器内の生体組織補填材に播種するステップを説明する図である。 図1の製造装置の作用を説明する図であり、回収容器内の生体組織補填材にカルシウムイオンおよびサイトカインを供給するステップを説明する図である 本発明の第2の実施形態に係る生体組織補填体の製造方法を示すフローチャートである。 図5の製造方法において、細胞捕捉フィルタに有核細胞を捕捉させるステップを示す図である。 図5の製造方法において、ドレインバッグに収容された赤血球を多く含む体液にカルシウムイオンを添加するステップを示す図である。 図7のドレインバッグを加圧して、体液を細胞捕捉フィルタに逆流させるステップを示す図である。 図8の細胞捕捉フィルタを逆流した細胞および体液を生体組織補填材に供給するステップを示す図である。
符号の説明
A 末梢血
B 生体組織補填材
C 回収液
1,20 製造装置
2 細胞捕捉フィルタ
3 血液容器
4 回収容器
5 ドレインバッグ
6 シリンジ(回収液供給手段)
7 第1の切替弁
8 第2の切替弁

Claims (7)

  1. 赤血球および血小板を捕捉せず血管新生に有効な有核細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタと、
    該細胞捕捉フィルタの入口側に、第1の切替弁を介して接続され、細胞ソースを収容した細胞ソース容器および生体組織補填材を収容した回収容器と、
    前記細胞捕捉フィルタの出口側に、第2の切替弁を介して接続され、前記細胞捕捉フィルタを透過した赤血球および血小板を収容するドレインバッグおよび回収液を供給する回収液供給手段とを備える生体組織補填体の製造装置。
  2. 前記回収容器が減圧されている請求項1に記載の生体組織補填体の製造装置。
  3. 前記回収容器に、カルシウムイオンおよびサイトカイン用の注入口が設けられている請求項1に記載の生体組織補填体の製造装置。
  4. 前記サイトカインがb−FGFである請求項3に記載の生体組織補填体の製造装置。
  5. 前記細胞ソースが、末梢血、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織のいずれかである請求項1から請求項4のいずれかに記載の生体組織補填体の製造装置。
  6. 赤血球および血小板を捕捉せず血管新生に有効な有核細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタに細胞ソースを透過させるステップと、
    前記細胞捕捉フィルタを透過した赤血球にカルシウムイオンを供給するステップと、
    カルシウムイオンの供給により得られた液体を前記細胞捕捉フィルタに逆方向から透過させるステップと、
    該細胞透過フィルタを逆方向に透過した液体を回収するステップと、
    回収された液体を生体組織補填材に供給するステップとを備える生体組織補填体の製造方法。
  7. 前記細胞ソースが、末梢血、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織のいずれかである請求項6に記載の生体組織補填体の製造方法。
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