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JP2007524391A - Ｓａｒｓの免疫原を発現するベクター、そのようなベクター又はその発現産物を含有する組成物、並びにその作製及び使用の方法及びアッセイ - Google Patents

Ｓａｒｓの免疫原を発現するベクター、そのようなベクター又はその発現産物を含有する組成物、並びにその作製及び使用の方法及びアッセイ Download PDF

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Abstract

ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群ウイルス、コロナウイルス）の免疫原、抗原、若しくはエピトープと、そのような免疫原、抗原、若しくはエピトープをコードする核酸分子と；そのような核酸分子を含有するベクター、例えば、バキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、及び、ＤＮＡプラスミドベクターなどのＤＮＡベクター、例えば哺乳類細胞で核酸分子を発現するＤＮＡプラスミドと、活性成分である免疫原性組成物、免疫学的組成物、若しくはワクチン組成物としての、或いはモノクローナル抗体などの抗体を産生するための、そのような免疫原、抗原、若しくはエピトープ、及びベクターの使用と、免疫応答、免疫原性応答、ワクチン応答を誘発する方法におけるもの、及びアッセイ、又は診断用キット若しくは方法におけるものを含めた、そのような免疫原、抗原、若しくはエピトープ、ベクター、抗体の作製及び使用の方法とに関して論じ、プラスミド若しくはベクター中における、配列、例えば、リーダー配列、及び、タンパク質、エピトープ、又は免疫原若しくは抗原をコードする配列のシームレスな融合に関しても論じる。

Description

本発明は、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群ウイルス、コロナウイルス）の免疫原、抗原、若しくはエピトープと、そのような免疫原、抗原、若しくはエピトープをコードする核酸分子と、そのような核酸分子を含有するベクター、例えば、バキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、及びＤＮＡプラスミドベクターなどのＤＮＡベクター、例えば哺乳類細胞で核酸分子を発現するＤＮＡプラスミドと、活性成分である免疫原組成物、免疫学的組成物、若しくはワクチン組成物としての、或いはモノクローナル抗体などの抗体を産生するための、そのような免疫原、抗原、若しくはエピトープ、及びベクターの使用と、免疫応答、免疫原性応答、ワクチン応答を誘発する方法におけるもの、及びアッセイ、又は診断用キット若しくは方法におけるものを含めた、そのような免疫原、抗原、若しくはエピトープ、ベクター、抗体の作製及び使用の方法とに関する。本発明は、プラスミド又はベクター中での、配列、例えば、リーダー配列、及び、タンパク質、エピトープ、又は免疫原若しくは抗原をコードする配列のシームレスな融合にも関する。
（関連出願／参照による援用）
この出願は、２００３年６月２０日に出願された米国特許仮出願第６０／４８０１１８号、及び２００４年３月１９日に出願された第６０／５５４７４２号による優先権を主張する。上記の各出願を、それらに引用されている各文献、及びそれらに引用されている文献に引用又は参照されている文献のそれぞれと併せて、これによって参照により本明細書に援用する。加えて、この本文に引用されている各文献（「本出願に引用されている文献」）と、本出願に引用されている文献のそれぞれに引用又は援用されている各文献と、本明細書、又は本明細書に引用されている文献、又は本明細書に引用されている文献に引用されている文献で言及したいかなる製品に関する製造業者の仕様書、データシート、記述、製品文献、説明書、及び同様のもののいずれをも、これによって参照により本明細書に援用する。参照によりこの本文に援用するいかなる文献も、本発明に関する先行技術であることを認めるものではないが、参照によりこの本文に援用する文献は、本発明の実施に利用することができる。
ＳＡＲＳ、即ち重症急性呼吸器症候群は、呼吸器疾患である。主な症候には、発熱、乾性咳嗽、頭痛、息切れ、及び呼吸困難が含まれる。感染したものの多くは、ウイルス性肺炎を発症し、その結果、下部気道の感染が起こる。ＳＡＲＳは、感染力が強く、咳又はくしゃみによって生じた飛沫によって、或いは、糞便汚染などの他の方法を介して伝播する。ＷＨＯは、ＳＡＲＳの全症例の約１０〜１５％が致死的であると推算している。２００３年５月２８日の時点において、世界中で８２４０件の症例が同定されており、７４５人が死亡している（情報源：世界保健機構）。高齢者、特に６０歳以上の患者では、死亡率が４３％である（Stohr, 2003）。現在、ＳＡＲＳのための特定の治療法は存在せず、更に、信頼できる診断試験も今のところない。
最近、ＳＡＲＳコロナウイルスをＳＡＲＳ疾患に関連付けるためのコッホの原則が実証された（Fouchier, Kuiken et al. 2003）。Fouchierらは、カニクイザルの実験的な感染から、ＳＡＲＳ関連ウイルス（ＳＣＶ）が、本当にこの疾患の起因物質であるという証拠を示した。これより早く他のグループによって、疾患宿主からのＳＣＶの単離と、宿主細胞中でのＳＣＶの培養とが既に記載されていた（Drosten, Gunther et al. 2003; Ksiazek, Erdman et al. 2003）。
コロナウイルスによって、様々な家畜、家禽、及びコンパニオンアニマルが感染する。コロナウイルスは、直径が１６０〜１８０ｎｍの範囲にある球状のエンベロープウイルスであり、プラス鎖のＲＮＡゲノムを含有する。このウイルスは、約３万塩基のゲノムを有し、既知のＲＮＡウイルスでは、最大のものと考えられている。インフルエンザウイルスと同様に、それらはコロナウイルス科の他のメンバーと遺伝的組み換えをする可能性を有する。コロナウイルスは、通常の風邪の原因として知られている。
コロナウイルスの形態を図１０に示し、概要図を図１１に示す。
ＳＡＲＳはコロナウイルスによって引き起こされるが、このＳＡＲＳが問題となっている。これは、以下のことによって明示される。即ち、ＳＡＲＳは、ＶＥＲＯ（アフリカミドリザル腎）細胞中で増殖することが実証されており、且つ、哺乳類種、例えばオオジャコウネコ及びタヌキで見つけられており、そしてこれらの要因は、このウイルスが、将来、不特定の期間、活性のまま残留するであろうこと、そして病原性を増大させるかもしれないことを示す。
ＳＡＲＳの免疫原、抗原、若しくはエピトープ、そのような免疫原、抗原、若しくはエピトープをコードする核酸分子、そのような核酸分子を含有するベクター、活性成分である免疫原組成物、免疫学的組成物、若しくはワクチン組成物としての、或いはモノクローナル抗体などの抗体を産生するための、そのような免疫原、抗原、若しくはエピトープ、及びベクターの使用、並びに免疫応答、免疫原性応答、ワクチン応答を誘発する方法におけるもの、及びアッセイ、又は診断用キット若しくは方法におけるものを含めた、そのような免疫原、抗原、若しくはエピトープ、ベクター、抗体の作製及び使用の方法は、ＳＡＲＳの問題に取り組む上で有用であろう。
米国特許仮出願第６０／４８０１１８号 米国特許仮出願第６０／５５４７４２号 Stohr, 2003 Fouchier, Kuiken et al. 2003 Drosten, Gunther et al. 2003 Ksiazek, Erdman et al. 2003
本発明の目的は、Ｓ−タンパク質、例えばＳＡＲＳ Ｓタンパク質などのコロナウイルスタンパク質、例えばＳＡＲＳタンパク質のクローニング及び発現、精製、スケール拡大、特徴付け、並びに産生を、例えばバキュロウイルス発現ベクター系を用いて行うことでありうるが；その際、ＳＡＲＳ Ｓタンパク質など、これらのタンパク質が、免疫原性組成物、免疫学的組成物、又はワクチン組成物中で、或いは、キット、試験、方法、又はアッセイ（例えば診断）において有用なモノクローナル抗体を産生するために、有用なものであると有利である。Ｓタンパク質は、完全長のものでも、末端を欠失したものでも、融合体でもよい。また、本発明は、核酸分子のシームレスな結合を提供することも目的とすることができる。更に、本発明は、混合組成物、例えば、１つ又は複数のＳＡＲＳ抗原、エピトープ、又は免疫原と、インフルエンザ、例えばインフルエンザＨＡ及び／又はＮＡなど、別の病原体の１つ又は複数の抗原、エピトープ、又は免疫原とを含有及び／又は発現する組成物も提供する。本発明は、複数の単離体、例えば、３つ以上の単離体など、少なくとも２つの単離体、有利には３つの単離体に由来する１つ又は複数のＳＡＲＳ抗原、エピトープ、又は免疫原を含有及び／又は発現する組成物を更に想定する。この点に関しては、インフルエンザワクチンは、例えば、ＷＨＯによって選択されたものなど、異なった株に由来する３つのＨＡ及び／又はＮＡ抗原、エピトープ、又は免疫原など、１つ又は複数のＨＡ及び／又はＮＡ抗原、エピトープ、又は免疫原を混合組成物中に含有及び／又は発現するので、１つ又は複数のＨＡ及び／又はＮＡ抗原、エピトープ、又は免疫原を同様に含有及び／又は発現するのに有利であり；且つ、更に、少なくとも２つの単離体、例えば３つ以上の単離体、例えば３つの単離体など、複数の単離体に由来するＳＡＲＳタンパク質を、組成物が含有及び／又は発現するのにも有利となりうる。また、ＳＡＲＳ抗原、エピトープ、又は免疫原に関しては、本発明では、Ｓ、Ｓ１、Ｓ２、Ｍ、Ｎ、及びＥ、又はその部分の任意のもの又はすべてを想定するが、完全長のＳなど、Ｓが有利であると考えられている。
この開示において、「含む（comprises）」、「含まれる（comprised）」、「含んでいる（comprising）」、「含有する（contains）」、「含有している（containing）」、及び同様の用語は、米国特許法でそれらに割り当てられた意味を有することができ、例えば、それらは、「含む（includes）」、「含まれる（included）」、「含んでいる（including）」、及び同様のことを意味することができる。「本質的に〜から成っている（consisting essentially of）」及び「本質的に〜から成る（consists essentially of）」などの用語は、米国特許法でそれらに割り当てられた意味を有し、例えばそれらは、本発明の新規特性又は基本的特性を損なわない追加の成分又はステップの包含を許容し、即ち、それらは、本発明の新規特性又は基本的特性を損ねる、言及されていない追加の成分又はステップを排除し、且つ、それらは、本明細書に引用されているか、或いは本明細書に参照により援用されている当技術分野の文献など、先行技術の成分及びステップを排除するが、これは特に、特許性のある実施形態、例えば、先行技術に対して、例えば本明細書に引用されている文献又は本明細書に参照により援用されている文献に対して、新規のもの、自明でないもの、及び発明性のあるものを定義することを本明細書が目的としているからである。また、「から成る（consists of）」及び「から成っている（consisting of）」という用語は、米国特許法でそれらに割り当てられた意味を有し；即ち、これらの用語が排他的であることを意味する。
本発明の他の態様は、以下の開示に記載されているか、又は以下の開示から明白である（且つ本発明の範囲内にある）。
記述したいかなる特定の実施形態にも本発明を限定するものでなく、例として示した、以上の「本発明を実施するための最良の形態」は、参照により本明細書に援用される添付の図面と併せて理解することができる。
［本発明を実施するための最良の形態]
上で論じたように、この発明は、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群ウイルス、コロナウイルス）の免疫原、抗原、若しくはエピトープと、そのような免疫原、抗原、若しくはエピトープをコードする核酸分子と、そのような核酸分子を含有するベクター、例えば、バキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、及び、ＤＮＡプラスミドベクターなどのＤＮＡベクター、例えば哺乳類細胞で核酸分子を発現するＤＮＡプラスミドと、活性成分である免疫原組成物、免疫学的組成物、若しくはワクチン組成物としての、或いはモノクローナル抗体などの抗体を産生するための、そのような免疫原、抗原、若しくはエピトープ、及びベクターの使用と、免疫応答、免疫原性応答、ワクチン応答を誘発する方法におけるもの、及びアッセイ、又は診断用キット若しくは方法におけるものを含めた、そのような免疫原、抗原、若しくはエピトープ、ベクター、抗体の作製及び使用の方法とに関する。
図１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、及び３〜６Ｂは、ＳＡＲＳの免疫原、抗原、又はエピトープをコードする核酸配列と、そのような免疫原、抗原、又はエピトープのアミノ酸配列とを提供する。図７及び８は、ＳＡＲＳ Ｓ ＯＲＦをクローニングするためのプライマーと、ＳＡＲＳ Ｓ ＯＲＦの制限地図とを提供する。図１０及び１１は、ＳＡＲＳコロナウイルスに関する情報を提供する。図９は、ＳＡＲＳの免疫原、抗原、又はエピトープをコードする１つ又は複数の核酸分子を含有することができるＢＥＶＳ発現ベクターを調製するための該略図を提供し、図１２は、例えばＳＡＲＳ Ｓに関する、タンパク質精製ストラテジーを提供し；そして、図１３は配列アライメントを提供する。即ち、本明細書は、図を通して、本発明が関係するものを提示し、読者が本明細書の論考と併せて図を見ることを推奨する。
本発明者らは、ＣＤＣ（ＣＤＣ／ＮＣＩＤ／ＤＶＲＤ／ＲＥＶＢ、呼吸器ウイルス部門長代理のErdman博士）から、Trizol LS試薬中に入れた、継代＃３のＳＡＲＳ ＣｏＶ ３２００３００８４１を得た。このウイルスは、プラークアッセイで４ｌｏｇの力価を有していた培養バッチ８０９９４０から調製された。この培養からの溶解物を、TRIzol試薬に添加し、１ｍｌを本発明者らが得た。本発明者らは、この溶解物を、ＲＮＡを単離してｃＤＮＡを生成するのに用いた。このｃＤＮＡは、次に、組換え体発現ベクター、例えば、ウイルス発現ベクター、ＤＮＡプラスミド発現ベクター、有利には、昆虫細胞をバキュロウイルス転移プラスミドと、バキュロウイルスであるオートグラファ核多角体ウイルス（Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus）（ＡｃＮＰＶ）の親ベクターとで同時形質移入することによって遺伝子コンストラクトを構築するためのバキュロウイルス発現ベクターを調製するのに用いた。この過程中に、相同組換えを介して遺伝子がバキュロウイルスゲノム中に移行し、それによって、Ｓ−タンパク質が、強く発現されるＡｃＮＰＶポリヘドリンプロモーターの制御下に入る。組換えウイルスを、プラークアッセイによって同定、単離、及び精製する。クローニングは、正確なＳ−タンパク質アミノ酸配列を保存するような方法で行われている。タンパク質は、バキュロウイルスシグナルペプチドを伴って発現させることができる（例えば、米国特許第６２４５５３２号を参照、また、組換えバキュロウイルス中での発現に用いる一般的方法に関してもこれを参照のこと）。
組換え体ＡｃＮＰＶ−Ｓタンパク質のバキュロウイルスバンクは、無血清の昆虫細胞を感染させ（例えば、米国特許第６１０３５２６号を参照）、そして高力価の感染性バキュロウイルスを含有する上清培地を収集することによって調製する。バキュロウイルスなどの組換えウイルスに感染した細胞を含めた、細胞を高密度成長させるための装置及び方法に関しては、例えばＰＣＴ国際公開第ＷＯ００／４６３５４号を参照のこと。
組換え体Ｓ−タンパク質の発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クマシーブルー染色及びウェスタンブロット分析によって分析する。
ウイルスストックの力価を測定し、このウイルスストックを、１０Ｌ細胞ペレットを生成するのに用いる。このペレットは精製に用いることができる。
完全長のＳ−タンパク質は、昆虫細胞から分泌されて、細胞膜の表面に付着する場合がある。穏やかな界面活性剤条件を用いて、そのようなＳ−タンパク質を可溶化する。次に、混入しているタンパク質及び核酸を除去するために、カラムクロマトグラフィーを用いることによってタンパク質を精製する。
Ｎ末端の配列決定によって、それが正統的な完全長の抗原であることを確認する。加えて、マウスの赤血球を膠着させる能力に基づいてＳ−タンパク質の生物活性を評価することもできる。上述のように、単一のウイルスプラークに由来する組換えウイルスを、低い感染多重度で数代介継代させながら増殖させて、多量の種菌を産生させ、作業用ウイルスバンク（ＷＶＢ）として、液体窒素中にアリコートで保存する。ＷＶＢは、細菌、真菌、及び、野生型又は他の組換え体の混入バキュロウイルスを含めた、他の外来物質を含んでいないかどうか試験する。アイデンティティは、精製されたバキュロウイルスＤＮＡから得た挿入断片のサザンブロット分析によって、そして、感染昆虫細胞で産生された組換え体タンパク質のウェスタンブロット分析によって確認する。
末端を欠失したＳ−タンパク質に関しては、本発明者らの末端欠失型Ｓ−タンパク質は、Ｓ−タンパク質の細胞質及び膜貫通部分を欠失したもの、例えば、Ｓ１又はＳ２領域を含むか、本質的にそれから成るか、又はそれから成るものでよい。本発明者らのコンストラクトには、精製過程を促進するためのｈｉｓタグを含有するＳ−タンパク質をコードするコンストラクトが含まれる。Ｓ−タンパク質は、三量体として発現されているようである。更に、本発明によれば、Ｍ及び／若しくはＮ及び／若しくはＥタンパク質、又はその部分が発現される。
アイデンティティ試験には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及びウェスタンブロット分析、並びに、アミノ酸分析及びＮ末端配列決定が含まれる。これらによって、正統的な完全長の抗原が確認される。無菌性の試験は、２１ ＣＦＲ ６１０．１２にしたがって実施できる。純度の試験は、２１ ＣＦＲ ６１０．１３にしたがって実施でき、これはＳ−タンパク質抗原の純度を測定し、また、発熱物質の存在を測定する。原体物質中に存在するＳ−タンパク質抗原量の測定は、タンパク質の標準的な化学的定量法を用いて行い、最終の容器封入物に必要な希釈を計算するのに用いる。
Ｓ−タンパク質は、ウイルス中和（ＶＮ）抗体を誘導するので、コロナウイルスワクチンの候補抗原である。Ｓ−タンパク質（スパイク糖タンパク質、表面タンパク質）は、ＳＡＲＳの主抗原であると考えられ、ＡＣＥ２受容体結合を介した感染の鍵となるものである。これに加えて、ヘムアグルチニン−エステラーゼ（ＨＥ）タンパク質も、ＶＮ及びＨＥ抑制性抗体の産生を刺激することが記載されている（Saif 1993）が、ＳＣＶにはこのタンパク質が存在しない。また、Ｍタンパク質も、補体の存在下でウイルス中和抗体を誘導することが記載されている（Saif 1993）。ウイルス粒子の抗原特異性は、中和試験（Ｓ及びＨＥ）又は補体結合試験（Ｍ）で測定することができる。保護免疫は、補体非依存的な中和抗体の形態で誘導される。
伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）由来の様々な断片を含めたＳ−タンパク質をコードする完全長遺伝子がクローニングされ、バキュロウイルスベクターで発現された。組換えウイルスに感染した細胞を用いた子ブタの免疫化が行われ、４つの主要な抗原部位（Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ）すべてを含有する、Ｓ−タンパク質のアミノ末端側半分が、ＶＮ抗体価を誘導することが示された（Tuboly, Nagy et al. 1994）。バキュロウイルス発現ベクターを用いることによって、ヒトコロナウイルスＨＣｏＶ−２２９Ｅに由来する、末端を欠失した可溶性Ｓ−タンパク質を産生することができ、また、完全長遺伝子のＮ末端５４７アミノ酸の中にあるスパイク糖タンパク質の受容体結合ドメインを同定及び位置決めすることができる（Bonavia, Zelus et al. 2003）。
ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）の場合には、ワクチニアウイルスベクターでクローニング及び発現されたＳ−タンパク質を用いたワクチン接種が、抗体媒介性のウイルス感染の亢進に関連付けられている（Vennema, de Groot et al. 1990; Vennema, de Groot et a1. 1990; Klepfer, Reed et al. 1995）。加えて、不活化ＦＩＰウイルス又は生ＦＩＰウイルスを用いて、ネコをＦＩＶに対して免疫化させた後にも、同様の現象が報告された（Scott 1987）。この抗体依存性の亢進には、Ｓタンパク質における特定の抗原部位が関与していると報告された（Corapi, Darteil et al. 1995）。
しかし、米国特許第５８５８３７３号で、Paolettiは、ＦＩＰＶ抗原、例えば、Ｓ、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｍ、Ｎ、Ｍ＋Ｎを発現する弱毒ベクター、例えば、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣの有用性を報告している。したがって、主張されている、ウイルス感染の亢進という問題は、先の研究で用いられたベクターの性質によるものかもしれないし、或いはネコに特有のものかもしれないと考えられている。したがって、本発明は、Ｓ及び／又はＳ１及び／又はＳ２及び／又はＥ及び／又はＭ及び／又はＮなどの、１つ又は複数のＳＡＲＳタンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで発現するために、ＣＭＶプロモーター又はＳＶ４０プロモーターなどの哺乳類プロモーターを用いた、ＤＮＡプラスミド、ＭＶＡ、ＡＬＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ、又はバキュロウイルスなどの弱毒ベクター又は非増殖性ベクター（哺乳類細胞において）を想定する。そのようなベクターの構築及び使用には、本明細書に引用された文献を参考にすることができる。但し通常は、Paolettiの３７３号特許の教示を、ポックスウイルス、例えばＭＶＡ、ＡＬＶＡＣ、及びＮＹＶＡＣ ＳＡＲＳベクターの構築及び使用に用いることができ；また、Audonnetの米国特許第６２２８８４６号及び第６１５９４７７号の教示は、ＳＡＲＳタンパク質を含有して、且つｉｎ ｖｉｖｏで発現するＤＮＡプラスミドの構築及び使用に用いることができるＤＮＡプラスミドに関する教示に関して信頼することができる。通常、ワクチン組成物又は免疫学的組成物のためのプラスミドは、宿主細胞、例えば哺乳類細胞からの、抗原の発現又は発現及び分泌を制御する調節配列に作用可能に連結している抗原（例えば、ＳＡＲＳ Ｓ、Ｓ１、Ｓ２、Ｅ、Ｍ、Ｎ、又はこれらの組合せ）をコードするＤＮＡを含むことができ；例えば、上流から下流に向けて、哺乳類ウイルスプロモーター（例えば、ｈＣＭＶ又はｍＣＭＶプロモーターなどのＣＭＶプロモーター、例えば前期−中間期プロモーター、又はＳＶ４０プロモーター−有用なプロモーターに関しては、本明細書に引用又は援用されている文献を参照のこと）などのプロモーターのＤＮＡ、分泌用の真核細胞リーダーペプチド（例えば、組織プラスミノーゲンアクチベータのもの−有用なリーダーペプチドに関しては、本明細書に引用又は援用されている文献を参照のこと）のＤＮＡ、抗原（ＳＡＲＳ Ｓ及び／又はＳ１及び／又はＳ２及び／又はＥ及び／又はＭ）のＤＮＡ、及びターミネータ（例えば、ウシ成長ホルモンをコードする遺伝子からの３’ＵＴＲ転写ターミネータ、即ちｂＧＨポリＡ−本明細書に引用又は援用されている文献を参照のこと）をコードするＤＮＡを含むことができる。一組成物は、複数のプラスミド又はベクターを含有することができ、それによって、各ベクターは、異なったＳＡＲＳタンパク質、抗原、又はエピトープを含有し、且つ発現する。Wasmoenの米国特許第５８４９３０３号、及びDaleの米国特許第５８１１１０４号の本文も有用となりうるので、これらにも言及しておく。グループ１に属するコロナウイルスとは反対に、ＳＡＲＳ Ｓ−タンパク質は切断されないであろう。そのため、プラスミド、ベクター、又は組換えウイルス調製物によって発現されたものにせよ、サブユニット調製されたものにせよ、Ｓ１及びＳ２よりも、完全長のＳのほうがより有利かもしれない。
更に、本発明は、１つ又は複数の単離されたＳＡＲＳ抗原、免疫原、又はエピトープ、例えばＳ、Ｓ１、Ｓ２、Ｅ、Ｍ、及び、Ｎ１などのＮのうちの１つ又は複数、即ち、これらの組合せＳ若しくはＳ１及び／又はＳ＋Ｅ及び／又はＭ及び／又はＮ１などのＮなどを含有するか、本質的にそれから成るか、或いはそれから成る組成物、例えば、免疫原性組成物、免疫学的組成物、若しくはワクチン組成物も想定する。
更になお、本発明は、複数の単離体、例えば、３つの異なった単離体など、２つ以上の単離体に由来するＳＡＲＳタンパク質並びに／又はＳＡＲＳタンパク質を発現するベクター及び／若しくはプラスミドを含有する組成物を想定する。組成物は、３つの異なった単離体に由来するＳ−タンパク質若しくはその部分、例えばＳ１若しくはＳ２、又は３つの異なった単離体に由来するそのようなＳタンパク質若しくはその部分を発現するベクター若しくはプラスミドを含有すると有利である。単離体は、組成物に対する免疫原性応答を最大にするように選択するべきである。
様々な投与経路用の形態にある組成物が、本発明によって想定されている。投与の有効量及び経路は、年齢、性別、患者又は対象の体重、及び、既知であり、且つ過度の実験を必要としない他のスクリーニング方法など、既知の因子によって決定する。各活性薬（抗原、免疫原、又はエピトープ）の用量は、本明細書に引用されているか、又は参照により援用されている参考文献にある通りにすることができ、且つ／或いは、１若しくは数マイクログラムから数百若しくは数千マイクログラムまでの範囲、例えば１μｇから１ｍｇまでの範囲でありうる。組換え体又はベクターは、本明細書及び／又は本明細書に引用されている文献に記載の用量に相当するｉｎ ｖｉｖｏ発現を得るのに適した量で投与することができる。例えば、ウイルス懸濁液に適した範囲は、経験的に決定することができる。本発明におけるウイルスベクター又は組換え体は、用量あたり、例えば約２ｍｌの用量あたり、少なくとも約１０３ｐｆｕ、より好ましくは約１０４ｐｆｕから約１０１０ｐｆｕまで、例えば約１０５ｐｆｕから約１０９ｐｆｕまで、例えば約１０６ｐｆｕから約１０８ｐｆｕまでの量で対象又は患者に投与するか、或いは、感染又は形質移入によって細胞内に導入することができる。そして、複数の遺伝子産物を複数の組換え体に発現させる場合、各組換え体をこれらの量で投与することができ；或いは、組換え体の合計が併せてこれらの量となるように各組換え体を投与することができる。本発明で用いられるプラスミド組成物では、用量を、本明細書に引用されている文献に記載の通り、又は本明細書に記載の通りとすることができる。例えば、プラスミド組成物中における各プラスミドＤＮＡの適当な量は、１μｇから２ｍｇまで、好ましくは５０μｇから１ｍｇでありうる。本発明のＤＮＡプラスミドベクター組成物の他の適当な用量は、過度の実験をしないでも、本明細書に引用された、ＤＮＡプラスミドベクターに関する文献を当業者が調べることによって確かめることができる。しかし、適当な免疫原性応答を誘発する、組成物の用量、その中にある成分の濃度、及び組成物を投与するタイミングは、血清の抗体力価測定、例えばＥＬＩＳＡ、及び／又は血清中和アッセイ分析及び／又は試験動物におけるワクチン接種評価などの方法によって決定することができる。当業者の知識、この開示、及び本明細書に引用された文献に基づけば、そのような決定には、過度の実験を必要としない。そして、逐次投与の時間（本発明の組成物の逐次投与は、この開示によって想定されており、例えば、その場合、同一又は異なる組成物を、初回−ブースト投与法における場合のように、逐次投与し；例えば、ベクターを投与し、その後に単離されたタンパク質組成物を投与することができ、またその逆も同様である）も、過度の実験をしないでも、同様に、この開示及び当技術分野の知識から確認できる方法で確かめることができる。実際に、サブユニット調製物に関しては、それぞれ平均約５０μｇのＳＡＲＳタンパク質から成る２回の投与を与えるのが有利である。
加えて、本発明は、混合組成物又はカクテル組成物を想定するが、これらは、インフルエンザなど、他の病原体の抗原、エピトープ、又は免疫原、例えばインフルエンザＨＡ、ＮＡ、若しくはＭ２、又はその部分を含有し、且つ／或いは、インフルエンザなど、他の病原体の別の抗原、エピトープ、又は免疫原、例えばインフルエンザＨＡ、ＮＡ、若しくはＭ２を発現するベクター、プラスミド、又は組換え体を含有する組成物である。有利な組成物は、例えば、上で論じた通り、３つの異なった単離体など、異なった単離体に由来する、１つ又は複数のＳＡＲＳタンパク質、例えばＳ−タンパク質又はその部分、例えば、Ｓ１、Ｓ２、又はそのエピトープと、インフルエンザＨＡ及び／若しくはＮＡ、又はそのエピトープ部分、例えば３つの株（例えば、毎年の三価インフルエンザワクチン用にＷＨＯが毎年選択するように、ＷＨＯによって選択されたインフルエンザ株）に由来するものなど、１つ若しくは複数の株に由来するインフルエンザＨＡ若しくはその部分、及び／又は、３つの株に由来するものなど、１つ若しくは複数の株に由来するインフルエンザＮＡ若しくはその部分とを含有することができる。そのような混合組成物中のＨＡ及びＮＡの量は、本明細書に引用されている文献にある通りでよく、また、利用可能なインフルエンザワクチン調製物にある通りでもよい。同様に、ベクター、プラスミド、又は組換えウイルス組成物は、そのようなＳＡＲＳタンパク質及びインフルエンザタンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで発現することができる。特にＳＡＲＳがインフルエンザと同様に毎年の投与、免疫化、又はワクチン接種を必要とするかもしれないので、この方法で、ＳＡＲＳとインフルエンザとを同じ調製物で対処することができる。そして、当然ながら、発明の組成物は、例えば、３つ又は４つの異なった単離体など、異なった単離体に由来する、ＳＡＲＳのＭ、Ｓ、Ｎ、及びＥすべてを、本明細書に論じたように、単独で、又は、インフルエンザＨＡ及び／又はＮＡ及び／又はＭ２などの、他の病原体の他の抗原、エピトープ、又は免疫原と更に組み合わせて含有することができ、且つ／或いは、そのようなＳＡＲＳ及び／又は他の抗原、エピトープ、又は免疫原、例えばインフルエンザＨＡ及び／又はＮＡ及び／又はＭ２（１つ、又は２つ、又は３つ、又は４つ、又はそれより多くの異なった株に由来するものなど）をｉｎ ｖｉｖｏで発現するベクター、プラスミド、及び／又は組換えウイルスを含有することができる。更に、本発明のワクチンにプロテオソームを用いることができ、これには、Jonesらによって記載された方法が含まれる（Jones, Allard et al. 2003）。
そのような混合組成物は、抗インフルエンザ製剤に用いられている形態、例えば、注射、鼻腔内（粘膜）投与などによって、そして、本発明の組成物に関して本明細書に記載する通りに、そして、本明細書に引用又は参照により援用されている文献にある通りに投与することができる。
追加又は代替として、本発明の組成物中に存在するか、且つ／或いは本発明の組成物中のベクターによって発現される、追加の抗原、エピトープ、又は抗原は、ＰｓｐＡ、ＰｓｐＣ、又は抗肺炎製剤で通常使用される２３種の抗原又はエピトープのいずれかなど、肺炎菌（Pneumonia）例えば肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumonia）に由来するものでもよく；例えば、米国特許第６５００６１３号、第６２３２１１６号、第６２３１８７０号、第６０４２８３８号、第６０２７７３４号、第６００４８０２号、第５９９７８８２号、第５９８０９０９号、第５９６５４００号、第５９６５１４１号、第５９５５０８９号、第５８７１９４３号、第５８５６１７０号、第５８０４１９３号、第５７５３４６３号、第５４７６９２９号、及び、これらに引用されている文献を参照のこと。肺炎球菌の抗原、エピトープ、又は免疫原は、本明細書に引用されているか、又は参照により援用されている文献にある通りに、或いは既知の調製物にある通りに存在するもの又は発現されているものでよく；また、そのような混合組成物は、抗肺炎製剤に用いられる形態、例えば、注射、鼻腔内（粘膜）投与、及び経口投与などによって、そして、本発明の組成物に関して本明細書に記載する通りに、そして、本明細書に引用又は参照により援用されている文献にある通りに投与することができる。本発明の組成物は、非経口投与用又は粘膜投与用に、好ましくは皮内経路又は筋肉内経路で使用することができる。粘膜投与が用いられる場合、経口経路、鼻腔内経路、又は眼経路の使用が可能である。局所投与も、本発明によって想定されており、例えば、Tangの米国特許第６３４８５４０号及び米国特許出願第２００３００４５４９２号、並びに米国特許第５９１０３０６号及び第５９８０８９８号を参照のこと。これらの本文は、ベクター又はプラスミド組成物の局所投与に関して、また、免疫原、抗原、又はエピトープを含有する組成物に関して参考にすることができる。
そのような組成物中では、免疫原、抗原、若しくはエピトープ、又はベクター若しくはプラスミドが、滅菌水、生理食塩水、グルコース、又は同様のものなど、適当な担体、希釈剤、若しくは賦形剤、及び／又はアジュバントとの混合物中にあってよい。組成物は、凍結乾燥又は凍結されていてもよい。組成物は、投与経路及び所望の調製物に応じて、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、保存剤、粘膜経路用に使用される重合体賦形剤、及び同様のものなどの補助物質を含有することができる。適当な調製物を調製するには、過度の実験をしないでも、参照により本明細書に援用されている、「REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE」（Rowe, Sheskey et al. 2003）、及び「HAND BOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS」（Rowe, Sheskey et al. 2003）などの標準的な教科書を参考にすることができる。適当な用量は、この中の本文、及びこの中に引用されている文献に基づいたものでもよい。
アジュバントは、免疫原に対する免疫応答を亢進する物質である。
昆虫細胞又はその画分は、アジュバントとなりうる；例えば、米国特許第６２２４８８２号を参照のこと。したがって、９５％以上など、９０％以上の純度が望ましいが、昆虫細胞又はその画分を含有する「自己アジュバント」組成物も利用することができる。
アジュバントには、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム、サポニン、例えばQuil A、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、及び水中油中水型エマルジョンを含めることができる。エマルジョンは、詳細には、軽流動パラフィンオイル（ヨーロッパ薬局方型）；スクアラン又はスクワレンなどのイソプレノイドオイル；アルケンのオリゴマー形成の結果生じる油、詳細にはイソブテン又はデケン；酸、又は、直鎖状アルキル基を含有するアルコールのエステル、特に植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（カプリル酸／カプリン酸）、グリセリルトリ（カプリル酸／カプリン酸）、プロピレングリコールジオレイン酸；分岐を有する脂肪酸又はアルコールのエステル、詳細にはイソステアリン酸エステルをベースとすることができる。油は、乳化剤と組み合わせてエマルジョンを形成するのに用いる。乳化剤は、好ましくは、非イオン性界面活性剤、詳細には、任意選択でエトキシル化される、ソルビタン、マンナイド（例えば無水マンニトールオレイン酸）、グリセロール、ポリグリセロール、プロピレングリコール、オレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸、及びヒドロキシステアリン酸のエステル、並びにポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン共重合体ブロック、詳細にはプルロニック（登録商標）製品、特にＬ１２１（Hunter. 1995）である。例えば、（Powell, Newman et al. 1995）の１４７頁に記載されているＳＰＴエマルジョン、及び同書の１８３頁に記載されているエマルジョンＭＦ５９を用いることが可能である。例えば、アジュバントを含有する組成物は、以下の方法で調製する。即ち、乳化ターボミキサーの補助を用いて、免疫原を含む水相６７％ｖ／ｖを、無水マンニトールオレイン酸２．３％ｗ／ｖ、１１ＥＯ（酸化エチレン）でエトキシル化されたオレイン酸２．６％ｗ／v、及び軽流動パラフィンオイル（ヨーロッパ薬局方型）２８．１％ｖ／ｖの中に乳化させる。エマルジョンを調製する別法の１つは、高圧ホモジナイザー中に、スクアラン５％ｗ／ｖ、プルロニック（登録商標）Ｌ１２１ ２．５％ｗ／ｖ、２０ ＥＯでエトキシル化されたオレイン酸及び無水ソルビトールのエステル０．２％ｗ／ｖ、及び免疫原を含む水相９２．３％ｖ／ｖの混合物を通過させることによって乳化させるものである。
これは、合成重合体（例えば乳酸及びグリコール酸の同種重合体及び共重合体、これらは免疫原を内部に封入するミクロスフェア、例えば生分解性ミクロスフェアを生成するのに用いられる（Eldridge, Staas et al. 1991））を用いて、そして、ＩＬ−２及びＩＬ−１２などのサイトカイン（例えば、米国特許第５３３４３７９号参照）、並びにＧＭＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；中でも、全般的には米国特許第５６０２００７号、第４９９９２９１号、及び第５６４１６６３号を参照、また、Clark及びGrant（Clark and Kamen 1987; Grant and Heel 1992）も参照のこと）を用いて処方することも可能である。ある種のアジュバント、例えばサイトカインやＧＭＣＳＦは、免疫原及び／又はエピトープと共にｉｎ ｖｉｖｏで発現させることができる。
アジュバントの更に別の例は、アクリル又はメタクリル酸の重合体と、無水マレイン酸及びアルケニル誘導体の共重合体とから選択される化合物である。有利なアジュバント化合物は、架橋されているアクリル又はメタクリル酸の重合体、中でも糖又はポリアルコールのポリアルケニルエーテルで架橋されているものである。これらの化合物はカルボマーという用語で知られている（Pharmeuropa 1996）。当業者は、米国特許第２９０９４６２号（この開示を参照により本明細書に援用する）を参考にすることもできる。この開示は、少なくとも３つ、そして好ましくは８つ以下の水酸基を有し、且つこの少なくとも３つの水酸基の水素原子が少なくとも２つの炭素原子を有する不飽和脂肪族基で置換されているポリヒドロキシル化合物で架橋されたそのようなアクリル重合体について記載する。好ましい基は、２から４個の炭素原子を含有するもの、例えば、ビニル基、アリル基、及び他のエチレン系不飽和基である。不飽和基は、それら自体、メチルなどの他の置換基を含有することができる。カルボポール（BF Goodrich社製、Ohio、米国）という名で販売されている製品が特に適している。それらはアリルスクロース又はアリルペンタエリスリトールによって架橋されている。それらの中でも、カルボポール９７４Ｐ、９３４Ｐ、及び９７１Ｐが挙げられる。無水マレイン酸及びアルケニル誘導体の共重合体の中では、共重合体ＥＭＡ（Monsanto社製）が好ましいが、これらは、直鎖状又は架橋された無水マレイン酸及びエチレンの共重合体、例えばジビニルエーテルによって架橋されたそれらの共重合体である。参照により本明細書に援用されている（Regelson, Kuhar et al. 1960）を参考にすることができる。これらの重合体を水に溶解させると酸性溶液となり、アジュバント溶液を得るためには、これを、好ましくは生理的ｐＨに中和し、その中に、免疫原性組成物、免疫学的組成物、又はワクチン組成物それ自体を組み入れる。そうすると、重合体のカルボキシル基が部分的にＣＯＯ−形態となる。本発明によるアジュバントの溶液、特にカルボマーは、蒸留水中に、好ましくは塩化ナトリウムの存在下で調製して、その結果得られる溶液が酸性ｐＨであることが好ましい。この原液は、それを、ＮａＣｌを含む望ましい量、又はそのかなりの部分に（望ましい最終濃度を得るために）の水、好ましくは生理食塩水（ＮａＣｌ９ｇ／ｌ）、いくつかの部分をすべて一度に添加して、同時に或いは続いて、好ましくはＮａＯＨで中和（ｐＨ７．３から７．４）することによって希釈する。それはワクチンを混合するためのものなので、生理的ｐＨのこの溶液が使用され、凍結乾燥、液体、又は凍結の形態で特に保存することができる。最終ワクチン組成物中の重合体濃度は、０．０１％から２％ｗ／ｖであり、例えば０．０６から１％ｗ／ｖであり、０．１から０．６％ｗ／ｖなどである。
ＤＮＡ又はＤＮＡプラスミド調製物は、陽イオン性脂質と共に、或いはその中に処方することができ；陽イオン性脂質に関して、また、アジュバントに関しては、Loosmoreの米国特許出願第２００３／０１０４００８号にも言及しておく。
加えて、前述の通り、昆虫細胞又はその画分もアジュバントとなりうる；例えば米国特許第６２２４８８２号参照。したがって、９５％以上など、９０％以上の純度が望ましいが、昆虫細胞又はその画分を含有する「自己アジュバント」組成物も利用することができる。
この開示及び当技術分野の知識から、当業者は、必要に応じて、過度の実験をしないでも、適当なアジュバント、及び、本発明による免疫学的組成物、免疫原性組成物、又はワクチン組成物に用いるその量を選択することができる。
ＳＡＲＳタンパク質若しくはエピトープ、又はＳＡＲＳタンパク質を含有及び／若しくは発現するベクター、又はＳＡＲＳタンパク質若しくはそれらを発現するベクターを含有する組成物（単独、或いは他の抗原、又はそのエピトープ若しくは免疫原も含有若しくは発現するもの）の経口投与又は粘膜投与も本発明によって想定されている。そのような組成物は、米国特許第６５００６１３号、第６２３２１１６号、第６２３１８７０号、第６０４２８３８号、第６０２７７３４号、第６００４８０２号、及びこれらに引用されている文献の通りに処方することができる。一般的に、経口投与組成物は、薬学的に許容される香料などの香料を含有したり、例えば野生環境、動物、又は小さい子供に使用する場合には、食物又は餌の中に入れたりすることがある。粘膜投与は、鼻腔内、例えば嗅粘膜で実施するのが好ましく；したがって、組成物は、エアゾールを介して、例えばエアゾール噴霧器を介して投与することができる。鼻腔内投与は、肺感染に対する防御を宿主に提供することができ、更に肺感染として開始する感染に対する防御を宿主に提供することもできる。しかし、粘膜投与には、呼吸粘膜、歯肉粘膜、又は歯槽粘膜を用いることもできる。したがって、投与は、経舌若しくは舌下、又は口腔若しくは気道中に行うことができるが；鼻腔内投与が好ましい。本発明の組成物、特に経鼻投与用のものは、等張水溶液、懸濁液、又は粘性組成物として提供すると好都合であり、それは、選択されたｐＨに緩衝調整することもできる。粘性組成物は、ゲル、ローション、軟膏剤、クリーム、及び同様の形態をとることができ、通常は十分な量の増粘剤を含有し、それにより、粘着性が約２５００から６５００ｃｐｓとなっているであろう。但し、最大１００００ｃｐｓにさえ及ぶ、更に粘性の高い組成物を利用することもできる。粘性組成物は、２５００から５０００ｃｐｓの粘性を有するものが好ましく、それは、この範囲を超えると投与がより困難となるからである。液体スプレー及び液滴は、通常、ゲルや他の粘性組成物より調製が容易である。更にそれらは、投与、特に多用量投与する状況でいくらか一層好都合となっている。一方、粘性組成物は、適切な粘性の範囲内に処方して、鼻粘膜などの粘膜との接触時間がより長くなるようにすることができる。組成物の粘性は、薬学的に許容される増粘剤を用いて、選択されたレベルに維持することができる。メチルセルロースは、容易且つ経済的に利用可能であり、扱いが簡単なので、好ましい。他の適当な増粘剤には、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマー、及び同様のものが含まれる。増粘剤の好ましい濃度は、選択された薬剤によるであろう。重要な点は、選択された粘性を実現するであろう量を用いることである。通常、粘性組成物は、そのような増粘剤を添加することによって、溶液から調製する。本発明に包含される組成物は、粘膜の乾燥を抑制して、刺激作用を予防する湿潤剤を含有することができる。例えば、ソルビトール、プロピレングリコール、又はグリセロールを含めた、様々な薬学的に許容される湿潤剤のいずれのものも利用することができる。増粘剤に関しては、選択された薬剤に応じて、その濃度が異なるであろう。但し、これらの薬剤の存在若しくは不在、又はそれらの濃度は、本発明の本質的特性ではない。粘膜を通した吸収、特に鼻粘膜を通した吸収の亢進は、薬学的に許容される界面活性剤を用いて達成することができる。組成物に通常有用な界面活性剤には、ツウィーン８０、ステアリン酸ポリオキシル４０、ステアリン酸ポリオキシエチレン５０、及びオクトキシノールなど、無水ソルビトールの脂肪酸部分エステルのポリオキシエチレン誘導体が含まれる。普通の濃度は、全重量に基づいて１％から１０％である。組成物の貯蔵寿命を延長するには、薬学的に許容される保存剤を利用することができる。例えば、パラベン、チメロサール、クロロブタノール、又は塩化ベザルコニウムを含めた様々な保存剤も利用できるが、ベンジルアルコールが適当でありうる。保存剤の適当な濃度は、選択された薬剤に応じて、かなりの変動が存在しうるが、全重量に基づいて０．０２％から２％まであろう。ワクチンを含めた免疫原性組成物は、例えば、液体溶液又はエマルジョンなどとして、吸入剤、スプレー、及び同様のもの（例えば、鼻腔スプレー、エアゾールスプレー、又はポンプスプレー、及び同様のもの）として調製することができる。エアゾールスプレー製剤は、炭化水素噴霧剤などの適当な噴霧剤と共に加圧容器中に入れることができる。ポンプスプレーディスペンサーは、計量された用量、又は、特定の粒子サイズ若しくは液滴サイズを有する単回用量を投薬することができる。ポンプスプレーディスペンサーは、例えば、Valois of America, Inc.社（米国、Connecticut）から販売されている。鼻腔スプレーディスペンサーは、通常、プラスチックなどの可撓性材料から製造され、圧搾に反応してスプレーの投薬を引き起こす。「バンセリル（Vanceril）」などの抗炎症剤は、粘膜投与用の経口及び鼻腔エアゾール形態で販売されており；抗炎症剤の「バンセラーゼ（Vancerase）」は、鼻腔投与用のポンプスプレーディスペンサー中に入って販売されており；「ドリスタン」などの風邪薬は、鼻腔スプレー（圧搾）ディスペンサー中に入って販売されており（したがって、エアゾール、ポンプ、及び圧搾ディスペンサーが知られており、且つ利用可能であることを読者は認識している）；そして、抗インフルエンザワクチンでさえ、例えばエアゾール又はエアゾール噴霧器を介して、鼻腔投与用の形態で提供されており（Medlmume社）、そして、本発明の組成物を同様に投薬することができる。
末端を欠失したＳＡＲＳタンパク質又はＳＡＲＳタンパク質のエピトープを用いた発明に関しては、過度の実験をしないでも、本明細書における開示と、当技術分野における知識とから、末端を欠失したＳＡＲＳタンパク質又はエピトープの適当なものを決定することができるが、その際、更に以下のことを前提とする。即ち、一般に、免疫応答は以下の通り生成される：タンパク質がより小さいペプチドに切断され、別の細胞の表面に局在する「主要組織適合複合体」（ＭＨＣ）と呼ばれる複合体中に提示されたときにのみ、Ｔ細胞はそのタンパク質を認識するということである。ＭＨＣ複合体には２つのクラス−クラスＩ及びクラスＩＩがあり、各クラスは多数の異なったアレルから構成されている。異なる患者は、異なったタイプのＭＨＣ複合体アレルを有し；彼らは、「異なったＨＬＡタイプ」を有すると言われる。
ＭＨＣクラスＩ複合体は、事実上あらゆる細胞に存在しており、細胞内で生成されたタンパク質から生じるペプチドを提示する。したがって、クラスＩ ＭＨＣ複合体は、ウイルスに感染した細胞、又は発癌遺伝子の発現の結果として癌になった細胞を殺すのに有用である。表面にＣＤ４と呼ぶタンパク質を有するＴ細胞が、ＭＨＣクラスＩの細胞に結合して、リンフォカインを分泌する。リンフォカインは、反応を刺激し；細胞が到着して、ウイルスに感染した細胞を殺す。
クラスＩＩ ＭＨＣ複合体は、抗原提示細胞にのみ見出され、抗原提示細胞によってエンドサイトーシスされた、循環している病原体から生じるペプチドを提示するのに用いられる。ＣＤ８と呼ばれるタンパク質を有するＴ細胞が、ＭＨＣクラスＩＩの細胞に結合して、溶解性顆粒のエキソサイトーシスによって、その細胞を殺す。
Ｔ細胞応答を刺激する、注目しているエピトープを、あるタンパク質が含有しているかどうか判定する際のいくつかのガイドラインには、以下のものが含まれる：ペプチドの長さ−ＭＨＣクラスＩ複合体中に適合するには、そのペプチドは、長さが少なくとも８又は９アミノ酸であるべきであり、そして、クラスＩＩ ＭＣＨ複合体中に適合するには、長さが少なくとも１３〜２５アミノ酸であるべきである。この長さは、そのペプチドがＭＨＣ複合体に結合するための最小限のものである。発現されたペプチドは、細胞によって切断されうるので、ペプチドは、これらの長さより長いのが好ましい。ペプチドは、それが様々なクラスＩ分子又はクラスＩＩ分子に、免疫応答を生み出すのに十分に高い特異性で結合するのを可能にする適切なアンカーモチーフを含有するべきである（Engelhard 1994; Bocchia, Wentworth et al. 1995）。これは、過度の実験をしないでも、注目しているタンパク質の配列を、ＭＨＣ分子に結合するペプチドの公表されている構造と比較することによって行うことができる。Ｔ細胞受容体によって認識されるタンパク質エピトープは、タンパク質分子の酵素的分解によって生成されたペプチドであり、クラスＩ又はクラスＩＩ ＭＨＣ分子と結合して、細胞表面に提示される。
更に、当業者は、そのタンパク質の配列を、タンパク質データベースに記載された配列と比較することによって、注目しているエピトープの存在を確かめることができる。相同性を全く共有しないか、ほとんど共有しないタンパク質領域は、そのタンパク質のエピトープであるためには、より良い選択であり、したがって、ワクチン組成物又は免疫学的組成物において有用である。生存細胞に存在する広範に見出される配列と大きな相同性を共有する領域は避けるべきである。したがって、ＳＡＲＳのＳ、Ｓ１、Ｓ２、Ｅ、Ｎ、及びＭに関しては、当業者は、これらのタンパク質を、他のコロナウイルスの類似タンパク質と比較して、ＳＡＲＳタンパク質中の相違領域を、エピトープ領域として利用することができる。この件に関して、一例として、アライメントの１つを示す図１３を添付する。
なお更に、別の方法では、単純に、注目しているタンパク質の部分を生成又は発現させ、注目しているタンパク質のそれらの部分に対するモノクローナル抗体を産生させて、そして次に、このタンパク質が由来する病原体の成長をそれらの抗体がｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害するかどうか確かめる。当業者は、この開示及び当技術分野で記載されている、注目しているタンパク質の部分を生成又は発現させるための他のガイドラインを、それに対する抗体が成長をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害するかどうかに関する分析に用いることができる。
例えば、当業者は、注目しているタンパク質の部分の生成を、そのタンパク質における８から９アミノ酸又は１３から２５アミノ酸の長さの部分を選択することによって、或いは親水性領域を選択することによって、或いは抗原（完全長）−抗体複合体のエックス線データから結合することが示された部分を選択することによって、或いは他のタンパク質と配列が異なっている領域を選択することによって、或いは潜在的ＨＬＡアンカー結合モチーフを選択することによって、或いはこれらの方法又は当技術分野で知られている他の方法の任意の組合せによって行うことができる。
抗体によって認識されたエピトープは、タンパク質の表面で発現される。抗体反応を刺激する可能性の最も高いタンパク質の領域を判定するためには、当業者は、好ましくは、上述の一般的な方法又は当技術分野で知られている他のマッピング法を用いて、エピトープマッピングを行うことができる。
したがって、いかなる過度の実験も、ＳＡＲＳタンパク質のエピトープを決定するのに必要ではない。
完全長のＳＡＲＳタンパク質、又は、エピトープなど、ＳＡＲＳタンパク質の末端欠失部分は、融合タンパク質として発現することができる。通常、融合パートナー（エピトープ又は末端欠失型又は完全長のＳＡＲＳタンパク質に融合している、融合タンパク質の部分）は、分泌及び／又は免疫原性を亢進する。上述の通り、分泌を亢進するために、バキュロウイルスのシグナル配列を、ＳＡＲＳタンパク質に融合させることができる。所望のペプチドを得るための効率的な戦略を提供する融合タンパク質の化学的切断又は酵素による切断に関して、いくつかの方法が記載されている（例えば、米国特許第６１４３８７２号、及び第６４５１７６９号を参照）。頻繁に用いられている融合システムは、ＩｇＧ親和性を有し、短いペプチドに対する抗体の作製に用いられてきているブドウ球菌プロテインＡ融合システム及び合成ＺＺ変種、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合システム、βガラクトシダーゼ融合システム、並びにtrpE融合システムである。これらのシステムのうちいくつかは、ベクター、精製コンポーネント、及び詳細な指示を含むキットとして販売されている。簡潔には、短い特定のエピトープを得る方法では、所望の発現ベクターへの導入を容易にする適切な末端を有する、対応するオリゴデオキシヌクレオチドを、融合パートナーを有する翻訳枠で合成する。免疫原性を亢進させるためには、ＳＡＲＳタンパク質又はその末端欠失部分又はそのエピトープと融合している、ボレリアブルグドルフェリ（B. burgdorferi）ＯｓｐＡの脂質化を利用することができる。同様に、免疫原性を亢進するために、Ｔ細胞性エピトープをＳＡＲＳタンパク質又はその末端欠失部分又はそのエピトープに融合させることができる。融合タンパク質は、融合パートナーとして、Ｓ、Ｓ１、Ｓ２、若しくはＳタンパク質のエピトープ領域、又はＭ若しくはＥ、又はその部分など、ＳＡＲＳタンパク質のすべて又は一部、インフルエンザのヘマグルチニン若しくはノイラミニダーゼのすべて若しくは一部、又はＭ２若しくはそのエピトープ部分、或いは、米国特許第５８５８３６９号又は本明細書に引用されている他の特許に挙げられている融合パートナーを有することができる。
本発明の組成物は、免疫応答、免疫原性応答、又は防御免疫応答を誘発することができる。免疫原性（又は免疫学的）組成物は、局在性又は全身性の免疫応答を誘発する。ワクチン組成物は、局在性又は全身性の防御免疫応答を誘発する。「免疫学的組成物」及び「免疫原性組成物」という用語は、「ワクチン組成物」を包含する（前者２つの用語は、防御的な組成物でもありうるので）。免疫応答は、モノクローナル抗体を含めた、抗体を得るのに用いることができる。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞によって産生された免疫グロブリンである。モノクローナル抗体は、単一の抗原決定基と反応して、血清由来の従来の抗体より高い特異性を提供する。更に、多数のモノクローナル抗体をスクリーニングすることによって、望ましい特異性、結合活性、及びイソタイプを有する個々の抗体を選択することが可能となる。ハイブリドーマ細胞系は、化学的に同一な抗体の定常的且つ安価な供給源を提供し、そのような抗体の調製を容易に標準化することができる。モノクローナル抗体を産生させる方法は、当業者に周知であり、例えば、参照により本明細書に援用する、米国特許第４１９６２６５号である。モノクローナル抗体の使用は知られている。そのような使用の１つは、診断方法におけるものであり、例えば、参照により本明細書に援用する、米国特許第４３７６１１０号である。モノクローナル抗体は、免疫吸着法クロマトグラフィーによって物質を回収するのにも用いられており、例えば、参照により本明細書に援用する（Milstein 1980）がある。ＳＡＲＳタンパク質、例えば、Ｓ、Ｓ１、又はＳ２に対するモノクローナル抗体は、診断用のキット、試験、方法、又はアッセイにおいて、或いは、血清、体液、分泌物、又は排出物などの試料中におけるＳＡＲＳの存在又はその原因物質を測定するのに有用である。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて調製することができる（Kohler and Milstein 1975; Kohler, Howe et al. 1976; Kohler and Milstein 1976; Hammerling 1981）。通常、そのような操作法では、ＳＡＲＳ抗原、エピトープ、又は免疫原、例えば、Ｓタンパク質などのＳＡＲＳ Ｍ、Ｎ、Ｅ、Ｓで、或いは、より好ましくは、そのような抗原、エピトープ、又は免疫原を発現する細胞で、動物（好ましくはマウス）の免疫化を行う。適当な細胞は、ＳＡＲＳタンパク質に対する抗体に結合する、それらの能力によって認識することができる。そのような細胞は、適切ないかなる組織培養液中でも培養することができるが；１０％のウシ胎仔血清（約５６℃で不活性化されている）で補足され、約１０μｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補足されているアールの改変イーグル培地中で細胞を培養するのが望ましい。そのようなマウスの脾細胞を抽出して、適当な骨髄腫細胞系と融合させる。本発明によれば、いかなる適当な骨髄腫細胞系を利用してもよいが；ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）（米国、Manassas, Va）から入手可能な親骨髄腫細胞系（ＳＰ２Ｏ）を利用するのが望ましい。融合の後に、Wandsら（Wands and Zurawski 1981）よって記載の通り、この結果得られたハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地で選択的に維持し、その後、限界希釈によってクローン化する。その後、そのような選択を通して得られたハイブリドーマ細胞を、注目している抗原に結合できる抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイする。
別法では、ＳＡＲＳの抗原、エピトープ、又は免疫原、例えばＳＡＲＳ Ｓタンパク質に結合できる追加の抗体を、抗イディオタイプ抗体を使用して、２ステップ操作法によって産生させることができる。そのような方法では、抗体それ自体も抗原あって、したがって、第２の抗体に結合する抗体を得ることが可能であるという事実を利用する。この方法によれば、タンパク質特異的な抗体を、動物、好ましくはマウスを免疫化するのに用いる。その後、ハイブリドーマ細胞を生成するのに、そのような動物の脾細胞を用い、そして、その抗体がタンパク質特異的抗体に結合する能力を、タンパク質抗原が遮断できる抗体を産生するクローンを同定するためにハイブリドーマ細胞をスクリーニングする。そのような抗体は、特定の抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、更に別のタンパク質特異的抗体の形成を誘導する動物の免疫化に用いることができる。
本発明の抗体のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２、並びに及び他の断片も、本発明の抗体の方法で使用できることが理解されよう。
したがって、本発明は、試料中におけるＳＡＲＳの存在を判定する方法であって、試料を、ＳＡＲＳ Ｓ、Ｓ１、Ｓ２、Ｅ、Ｎ、又はＭなどのＳＡＲＳタンパク質、有利には、Ｓ、Ｓ１、又はＳ２、より有利にはＳに特異的なモノクローナル抗体と接触させること、及び、モノクローナル抗体に対する結合の存在を検出することを含む方法を含む。モノクローナルは、結合を検出するために標識することができる。
完全長Ｓ−タンパク質は、ＶＮ抗体を誘導するので、本発明の実施において有利であると考えられるが、先端欠失型のＳ−タンパク質は同様の性能を有するので、これが利用できることにも留意される。Ｓ−タンパク質の生成には、バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）が有利である（Tuboly, Nagy et al. 1994; Bonavia, Zelus et al. 2003）。
バキュロウイルスは、培養昆虫細胞で組み換え体タンパク質を生成するための、高能率的な真核細胞発現ベクターとして使用することができる（Summers and Smith 1987）。バキュロウイルスは、バキュロウイルス科のＤＮＡウイルスであり、主としてチョウ目種の昆虫（チョウ及び蛾）に限定された狭い宿主範囲を有する。バキュロウイルスのプロトタイプ株であるオートグラファ核多角体ウイルス（Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus）（ＡｃＮＰＶ）は、感染可能な培養昆虫細胞の中で効率的に複製される。ＡｃＮＰＶは約１３００００塩基対の閉環状二本鎖ＤＮＡゲノムを有し、宿主範囲、分子生物学、及び遺伝子学に関して詳細に特徴付けられている。
バキュロウイルスは、感染細胞の核内で巨大なタンパク質結晶閉鎖（protein crystalline occlusion）を形成する。ポリヘドリンと呼ばれる単一ペプチドが、これら閉鎖体（occlusion body）のタンパク質質量の約９５％に該当する。ポリヘドリンの遺伝子は、ＡｃＮＰＶウイルスゲノム中に単一コピーとして存在している。培養細胞におけるウイルス複製には、ポリヘドリン遺伝子が必須でないので、外来遺伝子を発現するために、容易にそれを改変することができる（Smith 1983）。外来遺伝子を発現する組換えバキュロウイルスは、バキュロウイルスゲノムＤＮＡと、注目している遺伝子配列を含有するキメラプラスミドとの間の相同組換えによって構築する。組換えウイルスは、それらの特徴的なプラーク形態によって検出すことができる。即ち、ポリヘドリン遺伝子を含有するウイルスから生じるプラークは、不透明な外観を有し、ポリヘドリン遺伝子が外来遺伝子によって置換されている組換えウイルスから生じるプラークは透明である。
外来タンパク質発現用の組換えバキュロウイルスを構築するための一般的なスキームを図９に示す。外来遺伝子に由来するコード配列を、バキュロウイルス転移プラスミドとして知られているプラスミドに、標準的なクローン技術を用いて挿入する。転移プラスミドは、多重クローニング部位の上流にポリヘドリンプロモーターを含有し、多重クローニング部位は、天然のＡｃＮＰＶにおいてポリヘドリン遺伝子座を挟み込んでいる配列によって仕切られている。転移プラスミドは、バキュロウイルスゲノムＤＮＡと併せて同時形質移入に用いるが、その際、ポリヘドリン遺伝子を除去し、且つポリヘドリン遺伝子座の下流にある必須遺伝子の一部を除去する酵素を用いて、バキュロウイルスゲノムＤＮＡを線状化し、これによって、ゲノムＤＮＡを非感染性にする。
転移プラスミドは、ゲノムＤＮＡの線状化によって除去された必須遺伝子の部分を含有し、したがって、転移プラスミドと線状化したゲノムＤＮＡとの間の相同組換えによってウイルスが救出される。非組換え体に対する組換えウイルスの回収効率は約１００％である。この過程によって、ほぼ均質なプラークが得られ、複数ラウンドのプラーク精製を行う必要がなくなる。線状化する前の元のバキュロウイルスゲノムＤＮＡはポリヘドリン遺伝子を含有しているので、非組換えウイルスプラーク（不透明）は、組換えウイルス（透明プラーク）によるプラークから識別することができる。
様々な理由から、バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）は、理想的なサブユニットワクチン組成物、免疫原性組成物、又は免疫学的組成物を開発する優れた方法を提供するものである。バキュロウイルスにおける組み換え体タンパク質の発現は、約８週間以内に行われる。これは汎発性流行の脅威がある期間中には特に重要である。バキュロウイルスは、それらの宿主範囲が狭く、分類学的に近縁である数種の昆虫種に限定されているので、安全である。それらの複製は、哺乳類細胞内では観測されていない（Hartig, Chapman et al. 1989; Hartig, Cardon et al. 1991）。更に、昆虫細胞と哺乳類細胞との両方で複製できる生物は、ごくわずかしか知られておらず、このことは、昆虫細胞培養物から精製されたタンパク質から調製されたワクチンのバッチに、外来物質が混入する可能性を低下させるものである。最後に、バキュロウイルスに感染する昆虫は刺さないので、通常、ヒトは、昆虫細胞タンパク質に対する既存の免疫をもたず、さもなくば、昆虫細胞タンパク質は、ワクチン製剤中における極めて微量の昆虫細胞タンパク質に対するアレルギー反応を引き起こすかもしれない。
バキュロウイルスで発現されたタンパク質は、タンパク質がかなり大きい場合でも、実質的にすべての事例で、正しく折り畳まれ、プロセシングされているようである。これは、原核細胞及び下等真核細胞のシステムで発現されたタンパク質には当てはまらないことである。更に、昆虫細胞では、グリコシル化、リン酸化、アシル化、及びアミド生成など、哺乳類細胞で起こる翻訳後修飾の多くが可能である。昆虫細胞でのグリコシル化は、哺乳類細胞で用いられたもの同様の機構を利用しているようであり、それぞれにおいて、特定のタンパク質における同じ残基が修飾されている。昆虫細胞でタンパク質に付加される糖部分は、哺乳類細胞で発現されたそれらの対応物のものほど複雑ではないようであるが、昆虫細胞で発現された糖タンパク質の免疫原性と、哺乳類細胞で発現された糖タンパク質の免疫原性は、同等のようである。最後に、バキュロウイルスで発現されたタンパク質は、通常、天然タンパク質によって通常想定されている高次構造に自己組織化する。
ＢＥＶＳ系の一要素は、ポリヘドリンプロモーターの非常に高い活性であるが、このポリヘドリンプロモーターは、下流に挿入された外来遺伝子の発現を駆動する（但し、哺乳類細胞での発現には、このプロモーターを、ＳＶ４０プロモーター、又はＣＭＶプロモーター、例えばｈＣＭＶ−ＥＩ若しくはｍＣＭＶ−ＥＩなどのＣＭＶ−ＥＩなど、哺乳類ウイルス由来のプロモーターで置換することができる、末端を欠失したＣＭＶプロモーターに関しては、米国特許第６１５６５６７号も参照のこと）。バキュロウイルス発現ベクターを用いて得られることが報告されている最高レベルは、全細胞タンパク質の２５％から５０％であり、これは昆虫細胞１リットルあたり約１１グラムのタンパク質に相当する。しかし、ＢＥＶＳ系における外来タンパク質の収率は、通常、１リットルあたり１０ｍｇ〜５００ｍｇである。異なる真核細胞発現系を比較した場合には、ＢＥＶＳ系は、通常、総合的なタンパク質生産において他の発現系より優れていた。哺乳類細胞で通常発現されるタンパク質は、完全にではないが、哺乳類系で生成した場合に、より正統的であると予測されているが、これらの系での発現レベルは、通常、バキュロウイルス系よりはるかに低い。したがって、ＢＥＶＳ系では、正統的な構造の主要な要素を維持しながら、タンパク質をかなり低い費用で生成することができる。
特に有利な実施形態では、認識される制限部位から距離をおいて切る制限酵素を用いて、ベクター、例えば、組換え体のポックスウイルス又はバキュロウイルスなどの組換えウイルスを生成するための転移ベクターを調製し；この技法は、ベクターの製造方法において一般的なものであり、この技法の一般的な使用は、本発明の追加の態様であるとみなす。例えば、相同組換えの技法では、ベクター、例えばプラスミドを調製する。このベクターは、生成するべき組換えウイルス中にある外来性の核酸分子を含有することができ、通常、適当なウイルスにも感染又は形質移入されている細胞に、形質移入によって使用され、それによって、その細胞の中で組み換え又は交差イベントを起こして、外来性の核酸分子を含有するウイルスを生成する。本発明は、ある制限部位を有するベクター、例えばプラスミドを調製すること；該ベクターを、該制限部位からある距離をおいて切断する酵素（距離をおいて切断する酵素）によってそのように切断して、それによって、該制限部位が該ベクターから切除され、且つ、該ベクターが特有の突出末端を有するようにすること；別の反応において、ポリメラーゼ連鎖反応又は他の増幅反応を実施して、それによって、該制限部位が該反応の増幅産物の一部となるようにすること；距離をおいて切る制限酵素（ＩＩ型）で該増幅産物を消化して、それによって、増幅産物が特有の突出末端を有するようにすること；及び、特有の突出末端を有するベクターと、特有の突出末端を有する増幅産物を連結させることを想定する。このようにして、異質の介在核酸分子を回避できる。例えば、この技法は、前述のバキュロウイルスリーダー配列をコードする配列など、リーダー配列をコードする核酸分子を、抗原、エピトープ、又は免疫原、例えば、ＳＡＲＳ Ｓ、Ｓ１、Ｓ２、Ｅ、Ｍ、Ｎ、これらの組合せ、又はそのエピトープをコードする核酸分子に連結するのに有用である。このような距離をおいて切る酵素のこのような使用は、これまでに、開示も、示唆もされていないと考える。そのような酵素の１つは、ＳａｐＩとして知られており、販売されている。ＳＡＲＳ Ｓタンパク質をコードする配列の場合では、本発明者は、ＰＣＲ増幅と、特定の問題に対する独特且つ非自明の解決法との両方を用いた。例えば、ＳＡＲＳ Ｓに関しては、ＳａｐＩ ＩＩ型制限酵素の利用が有用であった。これは、所望の配列を、１ヌクレオチドの付加もせずに、選択されたベクター（例えば、ｐＰＳＣ１２−Protein Sciences Corporation社から販売されているバキュロウイルス転移ベクター）にクローニングすることを可能にした。ほとんどのクローニング戦略は、制限部位の付加を行い、結果として得られるヌクレオチドは、所望の配列の５’末端及び３’末端に制限部位を作り出す。ＳａｐＩの使用はこれを回避する。加えて、望ましいＳＡＲＳ Ｓ ＤＮＡ配列は、それらの中に２箇所の天然存在のＳａｐＩ認識部位を含有している。したがって、最末端のＳａｐＩを用いるために、このＤＮＡ配列を、ＳａｐＩ部位を含有する部分断片（中央）と、含有しない部分断片（末端近傍）とに分割し、完全な望ましい配列に後で組み立てた。したがって、ＳＡＲＳ Ｓタンパク質におけるこの「シームレス」操作法の使用は、特に発明性が高い。
例として示す以下の実施例によって、本発明を更に記述するが、それから、本発明及びその多くの利点のより良い理解が得られるであろう。
ＳＡＲＳ Ｓタンパク質をコードする配列のバキュロウイルス転移プラスミド内クローニング
出願人は、Trizol LS試薬中のＳＡＲＳ ＣｏＶ３２００３００８４１の継代番号３を、ＣＤＣ／ＮＣＩＤ／ＤＶＲＤ／ＲＥＶＢの呼吸器ウイルスセクションのアクティングチーフであるErdman博士より得た。このウイルスは、プラークアッセイで力価４ｌｏｇ１０の、バッチ番号８０９９４０の培地から調製した。この培地から得た溶解物をTRIzol試薬に加え、そのうちの１ｍＬを受け取った。ＣＤＣから供給されたTRIzol説明書に従って、ＣＤＣより得た溶解物からＲＮＡを分離した。この調製ＲＮＡを使用して、Titanキット（Roche社製）を用い製造元の指示に従って、ｃＤＮＡを産生した。Ｓ−遺伝子の配列をＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ２７４１１９のｎｔ２１４９３〜２５２５９から得た。Ｓ−遺伝子のサイズが大きく、内部に特定の制限部位が存在するため、出願人はこのＳタンパク質を３部分に分けてクローニングすることにした。前方末端は、プライマー２１７９と２１６７を用いて直接バキュロウイルス転移ベクターｐＰＳＣ１２（Protein Sciences Corporationから調達した）にクローニングした（前方：ｎｔ４０から７５０）；図１及び７参照。中間後方部分（ｎｔ７５０から３７６８）は、プライマー２１６８と２１７１を用いて、大腸菌ｐＵＣ１８ベクターにクローニングした；図１及び７参照。具体的には、Ｓ ＯＲＦの５’部分を、プライマーＯ−２１７９とＯ−２１７１を用いてＰＣＲ増幅し、コンストラクトＤ３２１５を生じさせるためにｐＰＳＣ１２にクローニングした。Ｓ ＯＦＲのより長い３’部分（中間後方）を、プライマーＯ−２１６８とＯ−２１６７を用いてＰＣＲ増幅し、コンストラクトＤ３１５７を生じさせるためにｐＵＣ１８ベクターにクローニングした。これらのアイデンティティのシーケンシングの後、Ｄ３２１７を産生するため、Ｄ３１５７にあるＳ ＯＲＦの中間後方部分を、ＯＲＦ内のＰｓｔＩ制限部位とポリリンカーのＫｐｎＩ部位を使用して、Ｄ３２１５の前方部分の後ろにサブクローニングした。更に、全長Ｓ−遺伝子をバキュロウイルス転移ベクターにクローニングした。この３部分クローニング戦略により、完全長のＳ ＯＲＦを形成するため、その後様々な部分を合わせた。Ｓ−ＯＲＦの制限地図を図８に示し、クローニングに使用するプライマーを図７にまとめた。制限酵素パターンに基づいて正確な様々なクローンを配列分析にかけ、クローンＤ３２１５がＳ−ＯＲＦの正確な５’末端を含むことが確認された。クローンＤ３１５７はＳ−ＯＲＦの正しい中間後方配列を有していると同定された。
前方及び中間後方部分の集成：クローンＤ３２１５をＫｐｎＩとＰｓｔＩで消化し、ベクターとして用いた。クローン３１５７もＫｐｎＩとＰｓｔＩで消化し、挿入物として用いた。確立された正確なＤＮＡ配列を有する全長クローンを用いて、末端欠失のバージョン、即ちＳタンパク質の細胞質及び膜貫通部分を欠失したものを作製した。膜貫通ドメインはＯＲＦの３’末端に位置する。１つのコンストラクトでは、部位特異的突然変異誘発を用いた、膜貫通及び細胞質ドメインの正確な欠失を有する。末端欠失を有する別のコンストラクトは、Ｓ−ＯＲＦのＢｇｌＩの３’末端を欠失させて作製した。更に、このクローンを使用して、精製の開発を容易にするため、Ｓタンパク質のｈｉｓタグ付きバージョンを作製した。
他のコロナウイルスのＳタンパク質の免疫学的エピトープと受容体結合ドメインは、最初の６００アミノ酸に含まれていることが示されており、それらはすべて末端欠失したどちらのコンストラクトでもコードされている。末端欠失を有するコンストラクトはどちらも分泌され、Ｓタンパク質の非分泌性全長バージョンより高いレベルで発現する可能性がある。末端欠失した分子は正しく折り畳むことができる。
得られたキメラプラスミドは、ＡＴＧの開始シグナルが続くポリヘドリンプロモーター、６１ｋＤａのシグナル配列と完全長のＳタンパク質又は末端欠失のコード配列、ポリアデニレーション部位、並びに両側面にあるバキュロウイルス配列から成る。
得られたクローンＤ３２１６とＤ３２１７を、配列解析に供した。両配列とも、正しい完全長のＳタンパク質コード配列を有することを確認した。次のプロセシング用に、クローンＤ３２１７を選択した（細胞培養及び欠失のコンストラクトを作製するための部位特異的突然変異誘導、図１４に示す）。
部位特異的突然変異誘導を用いて、ＳΔ膜貫通及び細胞質（ＳΔＴＭ ＆ ｃｙｔｏ）コンストラクト及びＳタンパク質の他の末端欠失バージョン（ＳΔ後方）を、ＰＳＣ１２内に作製した。ＳΔ後方の２単離物とＳΔＴＭ ＆ ｃｙｔｏクローンの１単離物を配列解析に供した。
これら３個のＳＡＲＳコンストラクトすべてのクローニング及びシーケンシングが終了した。Ｓタンパク質の精製を容易にするため、部位特異的突然変異誘導を用いて、挿入物にＨｉｓ６の付加を可能とするｐＰＳＣ１２ベクターを構築した。
Ｓ−変異体の３個のコンストラクト（全長、ΔＴＭ／ｃｙｔｏ、Δ後方）は、これらのタンパク質のＮ末端にＨｉｓ６が付いたバージョンを大腸菌内で発現させるため、すべて更にｐＢＡＤ／ＨｉｓＢベクター（大腸菌発現ベクター）にクローニングした。精製したタグ付きタンパク質を、ＳＡＲＳ Ｓタンパク質のポリクローナル抗体作製に使用した。
非誘導時の漏れがほとんどないと報告されていることから、アラビノースのプロモーターシステムを選択した。このことは、ＳＡＲＳのＳタンパク質の潜在的毒性のため、重要である。このベクターのもう１つの利点は、Ｈｉｓ６タグ及び後のタグ除去のためのエンテロキナーゼ切断部位の下流にＳＡＲＳのＳ遺伝子が融合することである。３つのバージョンを含むクローンすべてを、シーケンシングによって同定し、確認した。
タンパク質発現
バキュロウイルス組換え体を作製し、分離し、増量するために用いる技術は、Protein Sciences Corporationにおいて過去１５年間にわたり磨かれてきており、１０００種以上の組換えウイルスを作製するために用いられてきた。例えば本願で引用される、Protein Sciences Corporationに付与された特許を参照のこと。直鎖化した母体の夜蛾（Augotgraphica californica）核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡとＳタンパク質をコードする遺伝子を含む転移プラスミドを混和して、塩化カルシウムによって共沈殿させ、Ｓｆ９昆虫細胞に、記載通り（Summers and Smith, 1987）感染させた。組換えウイルスを、それらのプラーク形態によって同定し、数個のプラークを精製し、Ｔフラスコ内の５ｍＬ培地中のＳｆ９細胞に感染させるために使用した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルとウェスタンブロットを用い、組換えタンパク質の発現の有無により、感染した細胞を選別した。第１継代の組換えウイルスを、無血清のexpresSF+（登録商標）細胞（Protein Sciences Corporationから入手可能な無血清培地で発育できる昆虫細胞）内で増幅し、この無血清細胞系において、その後の増幅及び産生すべてを行った。
精製用の細胞培養物質は２つのアプローチであるプラーク精製を省略する速攻手順又はプラーク精製を含む標準法のうちの１つを用いて開発した。速攻手順アプローチにより、転移ベクターを含む全長Ｓ−遺伝子のＤ３２１７を用いて、Ｐ３ウイルスストックを生成した。このＰ３ストックからの昆虫細胞は、十分感染していると一般に考えられた（顕微鏡観察及びＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づく。図１６参照）。別のＰ２もまたＤ３２１７から、標準法を用いて生成した。このＰ２の分析により、細胞が十分に感染したことを表すＰ１０バキュロウイルスタンパク質のバンドが明確に示された（図１５）。
発酵：培地規模の発酵液を用いて、一連の発現タイムコースを実施した。
高品質Ｓタンパク質の産生を最大にする回収時間を決定するために、これらの発酵液からのＳＤＳゲル及びウェスタンブロットを使用した。感染の末期には、細胞溶解が細胞性及びウイルス性プロテアーゼの蓄積を誘導する可能性がある。これは影響を受けやすいタンパク質を分解する結果となり得る。更に、感染多重度（ＭＯＩ）は、発現の反応速度に影響を与える可能性がある。一般に、欠陥や変異のあるバキュロウイルスの産生を避けるため、最低限のＭＯＩを使用することは有益である。最適な感染及び回収条件を定める際に、これらの要因をすべて計算に入れている。
５０ｍＬのスピナーを２８℃で用い、２種類の異なるＭＯＩ（１と３）をテストし、最適な回収時間（４８から１２０ｈｐｉ）を評価して、最適化実験を行った。図１７に示すように、クマシーブルーゲルの結果は感染が十分であったことを示唆し、それはＰ１０以下のバンドで確認された（レーン２から９参照）。２つのウェスタンブロットを準備し、急性期及び回復期の血清とインキュベートするため香港へ送った。そのウェスタンブロット（図１８−回復期血清）は、４８ｈｐｉサンプルでは１８８ＫＤ近くにバンドを示さなかったが、２８ＫＤ付近に典型的なバンドを示した。レーン４と８（それぞれ７２及び１２０ｈｐｉ）は、６２上より上のバンドと２８ＫＤのバンドに加え、約１６０に薄い二重のバンドを示した。これらの低いバンドは、陰性対照レーン（図１９、レーン１５のブロット参照）にも存在することから、特異的ではないと考えられた。同様の結果を、７２ｈｐｉで１０Ｌ回収し、可溶化したペレットのサンプルでも得た（レーン１１及び１２参照）。これらのサンプルは、図２０を参照すると、回復期血清を用いた最初のブロットでも陽性であった。急性期血清と反応させたタンパク質は、非特異的シグナルを示すようである。図１９、レーン１５のブロットを参照のこと。
ウイルスのストック（精製したウイルス）組換え体Ｄ３２１７．１ａの全長Ｓタンパク質を使用して、一般的手順（感染後７２時間（ｈｐｉ）回収）により、更に追加の発酵を行った。この発酵液のペレットを、その後の精製の開発に使用した。
ウイルスのｐ１０バンドの存在を、十分な感染を示す指標として用いて、２つの欠失のあるコンストラクトＤ３２２７（＝ＳＡＲＳ Ｓ Δ後方）とＤ３２５２（＝ＳＡＲＳ Ｓ ΔＴＭ／ｃｙｔｏ）の精製した組換えウイルスをＰ１、Ｐ２、及びＰ３に増幅した。２つの０．５Ｌ発酵液を、ロイペプチン（１ｕｇ／ｍＬ）の存在下で行い、７２ｈｐｉで回収した。
Ｈｉｓタグ付き末端欠失Ｓタンパク質Ｄ３５１９（ΔＴＭ／ｃｙｔｏ）とＨｉｓタグ付き末端欠失Ｓタンパク質Ｄ３５２７（Δ後方）を、両者ともＰ２まで増幅した。これらのｈｉｓタグ欠失コンストラクトを工程にかけることを決めた場合は、後にＰ３まで増幅する。
Ｄ３２５２コンストラクト（Ｓタンパク質の末端欠失クローン、ΔＴＭ／ｃｙｔｏ）は、安定した発現を示し、且つ分泌型であったため、２８℃で１０Ｌの発酵を行った。ロイペプチンを４８ｈｐｉで加えた。この発酵は７２ｈｐｉで回収した（図４５参照）。
Ｃ末端ｈｉｓタグ付きＳタンパク質（全長）の、配列決定し、構築されたクローンＤ３５４０を、ＤＮＡ配列が実際正しいことを示した後、Ｐ３まで増幅した。このＰ３を使用して、１０Ｌの発酵対象を感染させ、２８℃でインキュベートし、７２ｈｐｉで回収した。この細胞の生存率は５０％で、回収時に感染が完全であることの形態学的特徴が観察された。精製のため、ペレットと上清の両方を保存した。プロテアーゼ阻害剤とロイペプチンを４８ｈｐｉにおいて２μｇ／ｍＬの割合で、感染した培地に加えた（図４６参照）。
コンストラクトＤ３２５２（Ｓタンパク質の末端欠失クローン、ΔＴＭ／ｃｙｔｏ）の４５Ｌの発酵を行った。ロイペプチンを４８ｈｐｉで加え、７２ｈｐｉでそのバイオリアクターを回収した。
５００ｍＬの培地を、組換え体バキュロウイルスを含む全長のＳと、バキュロウイルスを含むＭ遺伝子で共感染させた。もう１つの５００ｍＬ培地は、組換え体バキュロウイルスを含む全長のＳと、バキュロウイルスを含むＥ遺伝子で共感染させた。３つ目の５００ｍＬ培地は、組換え体バキュロウイルスを含む全長のＳ、バキュロウイルスを含むＭ遺伝子、及びバキュロウイルスを含むＥ遺伝子で共感染させた。
Ｃ末端ｈｉｓタグ付きＳタンパク質（全長）のＤ３４４５、Ｓタンパク質（ΔＴＭ／ｃｙｔｏ）のＤ３４５６、Ｄ３４５７、及びＤ３４６１、並びに末端欠失のＳタンパク質（Δ後方）のＤ３４６８、Ｄ３４７７、及びＤ３４８１の構築クローンを形質移入し、配列解析の結果を受け取った後、精製した組換えウイルスをすべて増幅した。
精製した全長Ｓタンパク質Ｄ３２１７．１ａのウイルスストックで昆虫細胞培地を感染させた後、凝集した発現タンパク質の形成を避けるため、発酵の温度を室温（約２３℃）まで下げた。感染の進行と感染した細胞の生存を、発酵の全時間にわたって観察した。感染後９６時間で、細胞が感染されたことを顕微鏡的観察により確認した：しかしながら感染は十分ではなかった（生存率測定は約９０％であった）。精製の開発のため、２リットルを回収しストックした。７日目の最後（１６８ｈｐｉ）に、培地を回収し、この発酵液のペレットを用いて更に精製を行った。培地の感染と生存は９６ｈｐｉで回収したときとあまり大きな進展はなかった。結果を図２１に示す（それぞれＩＭＧ−５４１及び５４２ＳＡＲＳスパイク抗体を使用）。全長Ｓタンパク質は確かに２３℃で産生されると結論づけられた。最適な回収時間と温度は精製結果に基づき選択した。
Ｃ−末端ｈｉｓタグ付きＳタンパク質（全長）のＤ３５４０、Ｓタンパク質（ΔＴＭ／ｃｙｔｏ）のＤ３５１９、並びに末端欠失のＳタンパク質（Δ後方）のＤ３５２７の、配列の正しい構築クローンを、すべて形質移入した。末端欠失されたコンストラクトと、全長Ｓタンパク質でｈｉｓタグ付きコンストラクトのＤ３５４０の両方について、精製した組換えウイルスをＰ１まで増幅した。
２つの欠失コンストラクト、Ｄ３２２７．１ａ（ＳＡＲＳ ＳΔ後方）とＤ３２５２．２ａ（ＳＡＲＳ ΔＴＭ／ｃｙｔｏ）の、２８℃の進行、７２ｈｐｉで回収したＰ３マスターウイルスバンクについて、抗体ＩＭＧ−５４１及び５４２を用いてウェスタンブロットを行った（それぞれ図２２のブロット番号１００７０３＿ｄ６及び１００７０３＿ｄ７のレーン７、８、９、及び１０を参照）。各クローンについて０．５Ｌの発酵を行い、この発酵液の上清を用いて更に精製の開発を行った。レーン３−６は、多様な条件の下で調製した、全長Ｓタンパク質ウイルスストック（Ｄ３２１７．１ａ）のサンプルを含む。欠失コンストラクトはどちらも発現を示した。どちらの場合もそのタンパク質は部分的に分泌されていることを示した。
全長Ｓタンパク質バキュロウイルスコンストラクト（Ｄ３２１７．１ａ）のサンプルはすべて、２８℃で、且つ様々な時間で行われた１０及び２Ｌの発酵で使用された。結果をゲル／ブロット番号１０１００３＿ｄ３（図２３）で検討した。発現レベルは様々な時間ポイントで同程度で、１２０ｈｐｉでの発現が最適であると結論づけられた。
さらなるタイムコース検証をΔＴＭ Ｄ３２５２．２Ａで行った。この実験は、最初の細胞密度２．５ｘ１０６細胞／ｍＬ及び９８％生存で、２Ｌ発酵で行った。細胞培地を組換えウイルスＭＯＩ１．０で感染させた。プロテアーゼ阻害剤（ロイペプチン）を４８ｈｐｉで加えた。４８、５４、６０、及び７２ｈｐｉの異なる時間ポイントで、サンプルを採取した。取り出されたサンプルの生存率を図６３のテーブルに示す。すべてのサンプルについて、同様に図６３に示すように、ＳＤＳ−Ｐａｇｅとウェスタンブロットを行った。
発酵全般において分解産物が存在することが判明した。最も適当な回収時間がいつであるかを決定するには、より定量的な方法が必要であった。現行の試験は、感染後６０時間で培地を回収するのがより適当であることを示唆している。
精製：図１２Ａ〜Ｅに表された図表により精製開発アプローチを示す
ＳＡＲＳ全長Ｓタンパク質
Ｓタンパク質産生工程の概略図：
上流の工程。この作業は細胞ペレット又は培地上清が大規模（０．５から１０Ｌ）発酵より入手次第早急に開始する。Ｓタンパク質は膜貫通ドメインを含むため、全長のタンパク質は細胞に付着していると予想される。即ち、このＳタンパク質は粒子を形成する。不要な混入物質を除去するため、細胞ペレットを洗浄し、Ｓタンパク質を可溶化するため、穏やかな洗剤条件を適用する。末端欠失されたＳタンパク質は分泌するので、それらの精製においては、ペレット洗浄と可溶化のステップは省略する。更に平行流ろ過を用いて、大と小の混入物質を除去する。
最初のカラムクロマトグラフィー。このステップの目的は、ＤＮＡの除去と可溶性Ｓタンパク質の部分的精製である。これは、このタンパク質をＣＭカラムに結合させるか、或いはそれをＤＥＡＥカラムに流すかのいずれかによってなされる。出願人は、このステップではＳタンパク質の比較的低いｐＩ（理論的ｐＩ＝５．５６）をうまく利用している。例えば中性ｐＨの緩衝液を使用した場合に、このタンパク質はＤＥＡＥに結合すると思われる。理想的にはこの組換えＳタンパク質は工程の次のステップに使用できる緩衝液内にあることが望ましい。
精製。このＳタンパク質は膜貫通ドメインを含み、そしてその特性により、疎水性相互作用のカラムクロマトグラフィーにより精製する。このＳタンパク質は大きなタンパク質（１３０から１４０ｋＤａ）で、したがって９５％を超える純度を得るために、サイズクロマトグラフィーを適用できる。最後に、このＳタンパク質は多くのグリコシル化部位を含み、それ故レンチルレクチンを用いて、同様に顕著な精製（９５％又は９５＋％）を得ることができる。
バキュロウイルス発現ベクターシステム（ＢＥＶＳ）では、ＳＡＲＳのＳタンパク質は分泌される。可溶性分泌型Ｓタンパク質の分子量は１４０，０００で、これは１００，０００以下と３００，０００以上のタンパク質をすべて効果的に除去する二元的ろ過システムの使用に利用する。いずれかのクロマトグラフィーを行う前に、タンパク質が混入した７５％純度を得る。
最終クロマトグラフィーステップ。もし前段階のカラムで、要求される純度レベルに達するために必要な溶出バッファーが、定型的及び／又は主要な使用に適さない場合は、最終的な仕上げのカラムを行う。このステップは、望ましくないあらゆる試薬を除き、試薬処方として適切な中性の塩緩衝液中にタンパク質を移す。
Ｓタンパク質のｐＩは５．５６であり、それ故Ｓタンパク質を結合し溶出するために、中性ｐＨでアニオン交換カラムを使用する。Ｓタンパク質の高度に疎水性であるＣ−末端を利用する、最終仕上げの疎水性相互作用カラムにより最終純度が達成される。
このＳタンパク質をＰＢＳに入れて透析し、最終純度＞９５％を得る。重要なことは、高度に純粋なＳタンパク質はその免疫原性と、それ故有用性を備えるということである。
レンチルレクチンカラムによる精製
陰性対照ペレット（異なる組換え体バキュロウイルスの発酵に由来する）を用いて同時並行精製を行った。そのｐＩと疎水性Ｃ末端に基づき、中性ｐＨと１％の洗剤ではそのタンパク質は抽出され、アニオン交換カラムには結合すると予想した。図２４のゲルは、１Ｌ、７２ｈｐｉペレットの１％Tergitol、ｐＨ７．０の２０ｍＭ ＰＯ４による、この最初の抽出と、２５ｍＬのＱカラムへの適用を示す。
０．３、０．５、１Mの溶出液をプールし、１０ｍＬのレンチルレクチンカラムにかけた。１８の推定上のグリコシル化のため、Ｓタンパク質は結合すると予想した。加えて、Ｑカラム溶出後、Ｑカラムからのフロースルー（ｆｔ）もまた同じＬＬカラムにかけた。カラムを０．５Ｍのメチルピラノシドの２０ｍＭ ＰＯ４で溶出した（図２５）。溶出画分５、６、７、及び１０、１１、１２、を別々にAmicon centricon spin濃縮装置で６ｍＬから２００ｕＬに濃縮した（図２６）。
これらの高めのタンパク質バンドは、陰性対照サンプルでは観察されず、したがって全長のＳタンパク質を含むと考えられた。レーン２に示す生成物はヒト抗−ＳＡＲＳ血清をプローブとしたブロットを含む。しかしながら、このタンパク質は、回復期血清とは反応しなかったため、Ｓタンパク質であるとは考えられなかった（図２０参照）。
したがって、タンパク質を精製するために、使用するタンパク質のサイズと、タンパク質が非常に多くグリコシル化すると考えられる特徴を決定した。加えて、可溶化の戦略を変えた。ＢＭＥと０．５ＭのＮａＣｌの添加は、イオンの相互作用を削減しシステイン同士の凝集を壊すことを意図した。また、ＢＭＥの使用は、Ｓタンパク質の可溶性を増加するはずであり、一方、MiliporeのＴＦＦ（平行流ろ過）の使用は最初のカラムにかける全タンパク質の量を減少させる。
７２ＨＰＩ細胞の２Ｌペレットを、１％Tergitol、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％Ｂ−ＭＥ、ｐＨ７．０の２０ｍＭ ＰＯ４、２Ｌ中で可溶化した。これをpolytronミキサーにかけて遠心分離した。２Ｌの上清を１００ｋＤａ分子量カットオフＴＦＦフィルターを用いて減量し、洗剤の総量を減らすために、同じ緩衝液からtergitolを抜いたものを使用してdaifilterでろ過した。最後に得た４００ｍＬの残留成分を４０ｍＬ ＬＬカラムにかけ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０の２０ｍＭ ＰＯ４で平衡させた。このカラムを同じ緩衝液及び１Ｍメチルピラノシドで溶出した（図２７）。
ＬＬ画分をプールして６ｍＬまで濃縮し、５００ｍＬＳ２００ＳＥＣにのせた。このカラムをＰＢＳ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４の２０ｍＭ ＰＯ４）で平衡させ、この６ｍＬ画分をのせた。
このゲルを、香港からの抗ＳＡＲＳ血清で、還元型条件を使用して、ブロットしてテストした（図２８）。これらの条件を使用して、Ｓタンパク質が可溶化するかどうかを決定するために、このブロットには可溶化ペレット（レーン１３）と再溶出した最初のペレット（レーン１４）を含めた。バキュロウイルスに感染した昆虫細胞のバックグラウンドの程度を決めるため、陰性対照も含めた（レーン１５）。カラムを以前とは対照的に２０ｍＭ ＰＯ４＋１Ｍ ＮａＣｌのＰＢＳで流した。
ウェスタンブロットのレーン８、９、１０（図１９）は、回復期の血清と反応させると、期待したサイズに陽性のシグナルを示す。このタンパク質は急性期の血清とは反応しないが、タンパク質は上述の条件を用いて可溶化すると思われる。
レンチルレクチンカラムからＳタンパク質と共に溶出してくる主要な混入物質と混在するこの生成物の純度を２０％と推定した。これらの２つのタンパク質を分離するため、還元型条件及び高イオン強度の下でのサイズ排除クロマトグラフィーを試したが、分離はできなかった。Ｓタンパク質とこの主要混入物質は凝集塊として挙動した。
対象のタンパク質を精製し、アニオン、カチオン、及びｈｉｃ（hydrophobic interaction column）クロマトグラフィーに十分な原料を産生する規模で、まず、上流の精製方法（１％tergitolを用いた、材料の可溶化とそれに続くＬＬカラムからの溶出）を使った。いろいろなカラムクロマトグラフィー方法を、異なるｐＨで使えば、この凝集した相手からＳタンパク質を分離する方法を見出せる可能性がある。図２９は１Ｌの細胞ペレットの工程を表す。
Ｓタンパク質は、Tergitol溶出後もまだ一部が残っていることから、潜在的に回収率を増加させるため、Tergitol抽出された原料からの細胞ペレットを８Ｍ尿素でも再溶出した。
このペレットを８Ｍ尿素、ｐＨ８．５の５０ｍＭトリス中で溶解した。原料がすべて溶解した後、最終尿素濃度を２Ｍとなるように、この溶出物を４倍に薄めた。この原料をＬＬカラムにかけた（図３０参照）。ペレットを再溶出した場合、６２ｋＤａの混入物のバンドが溶出画分中で優勢度が減少したように見える。レクチンもまたカラムから溶出されているのが興味深い（２１ｋＤａのタンパク質バンドを参照）。
Ｓタンパク質とこの６２ｋＤａの混入物、それはｇｐ６４、つまりバキュロウイルスエンベロープの主要タンパク質であると信じられているが、これらの凝集塊を壊すため、BondosとBicknellに由来するいろいろな添加物（Bondos and Bicknell 2003）を使用した。各カテゴリーの代表的な試薬をテストした。以下の成分：０．２Ｍ ＭｇＳＯ４、０．１Ｍ ＣａＣｌ２、０．１Ｍ ＭｇＣｌ２、１％グリシン、及び１Ｍ サッカロースそれぞれをＬＬプールに加え、Miliporeの１００ｋＤａ分子量カットオフcentriconカラムを使用して最少量まで濃縮した。残留成分（細胞膜に保持されている）とろ液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ろ液中の６２ｋＤａタンパク質の存在を、抗凝集効果の可能性を決定するものとして用いた。陰性対照（添加なし）を図３１のレーン４と５に示す。陰性対照と比較すると、添加物すべてがなんらかの抗凝集作用を表し、グリシンが最も優れていた。このため、その後の開発においては、０．１Ｍグリシンを緩衝液に組み入れた。
図４７に示すように、全長Ｓタンパク質がｇｐ６４と共に存在している。ＣＤＣとＩＭＧ−５４２抗体に強く反応していることが示されている。
この凝集塊を壊すため、５０ｍＭのＤＴＴと６Ｍ尿素を使用して、もう１つ試みを行った。上記で得た画分２を、centriconとdiafilterを使用して、６Ｍ尿素を含む緩衝液中に混和した。セファクリルＳ−５００高分離能カラムを詰めて、そこにのせた（ゲルとブロットは図４８）。図４８はこの２つの分子の凝集塊が、高尿素及びＤＴＴ濃度下においてすら、いまだそのままであることを示す。
代わりの精製工程も使用され、そこでは細胞ペレットを１％トライトンＸ−１００を用いて可溶化した。この可溶化された物質を、引き続きＮｉ−カラムにかけた。溶出された物質は約７０％の純度で、これを更にレンチルレクチンカラムにかけ、溶出した物質は９０％以上の純度を有する。概算した生産率は約２ｍｇ／Ｌである。レンチルレクチルカラムに代えて、我々は現在ＤＥＡＥ ＩＥＸカラムをテストしている。そのカラムはデルタＴＭＳタンパク質精製において成功を示してきた。図４９は全長のｈｉｓタグ付きＳタンパク質のゲルを表す。
最近２つのペプチド抗体がImgenexより入手可能となった。５４２抗体はアミノ酸２８８から３０３に対し、５４１抗体はアミノ酸１９から３５に対して作成された。香港からの回復期血清を用いたブロットが陽性になった、ＳＥＣ画分１７（Ｓ１７）
をこれらの血清のテストに使用した。還元型と非還元型のフォーマットで、Ｓ１７を流し、ブロットした（図３２及び３５）。非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥは６２ｋＤａ混入物の証拠を示さない。５４２抗体は、非還元型Ｓ１７と、たとえあったとしても、弱く反応する。
抗体ＩＭＧ５４１、ＩＭＧ５４２及びＣＤＣの反応性を比較するため、タンパク質サンプル（５８６４Ｃ）を用いて更なる分析を行った。このタンパク質サンプルは以下のように調製した：ペレットを、ＢＭＥ非存在下で１％tergitolを用いて溶解し、続いてカラム溶出に先立って、レンチルレクチンクロマトグラフィー及び厳しいカラム洗浄を行った。更に続いてこの物質をヒドロキシアパタイトに結合させ、溶出した。非還元型緩衝液及び一般的サンプルローディング緩衝液を用いてサンプルをのせた。３つのブロットを調製し、各ブロットを抗体とインキュベートした。結果を図４１から４４に示す。
非グリコシル化ＳＡＲＳ全長Ｓタンパク質は、分子量約１３９ｋＤａと予想されている。グリコシル化全長Ｓタンパク質の予想分子量は約１６０ｋＤａであると期待されている。ヒトのＳＡＲＳに対して生成したＣＤＣ抗体を用いて現れるバンドは、どれも上記に記載した分子量の範囲に位置しなかった。最も多量のバンドは、ｇｐ６４バキュロウイルスタンパク質であり、これは非還元型条件下では１８０ｋＤａ付近に、還元型条件では６０ｋＤａ付近に流れる。ＩＭＧ抗体５４１はｇｐ６４タンパク質と非常に強く交差反応し、したがって、この抗体をこれ以降はウェスタンブロット解析に使用しない。
２つのタンパク質サンプルを、Ｎ末端解析のため、エール大学のKeck施設へ提出した。当初は香港の抗血清と、後にはImgenexの抗体と免疫反応性であると見られた、Ｓ１７タンパク質サンプルを提出した（図３４のゲル／ブロット０９０３０３＿ｄ２のレーン６と１１参照）。非還元型条件下で解析された場合、特徴的な２つのバンドが消えて、新たなより高分子量のバンドが作られ（図３４参照）、Ｓタンパク質がジスルフォイド架橋によって結合した２つのフラグメントから構成されることが示唆される。Ｎ末端解析に提出した２番目のサンプルは、もともと非還元型ゲル上で、Imgenex抗体（ＩＭＧ−５４２）とは免疫反応性ではない６０ｋＤバンドから主に成る（図３４のゲル／ブロット０９０３０３＿ｄ２のレーン１３参照）。このタンパク種は、バキュロウイルス又は昆虫細胞由来の、レンチルレクチンレジンにも結合する、共移動性混入物の疑いがある。このサンプルもまた、抗体と高度に反応するマイナーなゲルバンドを含む。レンチルレクチンクロマトグラフィーを使用して、Ｓタンパク質とその分解産物を、この提唱されている６０ｋＤａ混入物から完全に分離することはできなかった。主要な寄与因子に関する結果を得るため、どちらのサンプルもアセトン洗浄された沈殿物として、期待された解析と共に提出した。
全長Ｓタンパク質が還元型条件下で、６０と１５０ｋＤａの、サイズの異なる２つのフラグメントに分離するという発見に続いて、もしβ−ＭＥが工程から除外されたら何が起こるかを見つけるための実験を行った。
２３℃で実施し、１６８ＨＰＩで回収した２Ｌの発酵液を１％Tergitolの２０ｍＭ ＰＯ４中で可溶化した。サンプルを２分間polytronミキサーにかけ、４．５ｋで３０分間遠心分離した。１００ｋＤａ分子量カットオフフィルターによるＴＦＦを用いて上清を濃縮し、２０ｍＭリン酸緩衝液とdiafilterでろ過した。最終量３５０ｍＬを事前に平衡させた４０ｍＬのＬＬカラムにかけ、５０％エチレングリコール、０．５Ｍメチルピラノシドの１０ｍＭ ＰＯ４で溶出した（図３５参照）。
還元型条件を用いて抽出したＬＬカラムに比較すると、収率は増加した。１８０にあるバンドも、より高分子量のものと共に、５４１抗体に反応した。
画分４から１４を、１２０ｍＬから６ｍＬに濃縮し、６００ｍＬ Ｓ２００ＳＥＣカラムにかけた（図３６参照）。
全長Ｓタンパク質はＳＥＣカラムからの最初のピークに存在した。このタンパク質は、より低分子量の生成物と共に溶出した。これらのうちのいくつかはブロットで反応し、Ｓの分解産物である可能性が考えられた。泳動したサンプル中で、６０から６２ｋＤａ（レーン３、４）に現れた大きな他のバンドは、メインピークから１５本離れて溶出した。やはりこれも、Ｓ分解産物と、同じ分子量のウイルスタンパク質が混和したものであろう。レーン３と比較した場合レーン４のブロットが増加しているのは興味深い；明らかに濃縮によって反応性６２ｋＤａタンパク質が増加した。
実験を繰り返し、全く同様の結果を得た。主要なＳ画分をプールして還元型及び非還元型フォーマットで解析した（図３７）。抽出からβ−ＭＥを省いた場合、最終工程収率はより高いと考えられる。
ＳＡＲＳ ΔＴＭ Ｓタンパク質の精製
部分的に精製されたＳＡＲＳ ΔＴＭ Ｓタンパク質のＮ末端配列決定
ΔＴＭ Ｓタンパク質サンプルを以下のように調製した。１０Ｌ発酵液（１０２１０３、７２ｈｐｉ、２８℃）からの１Ｌ上清を、ｐＨ７．４で直接レンチルレクチンカラムにかけた。ΔＴＭ Ｓタンパク質をレンチルレクチンから溶出し、それからｐＨ７．４でカチオン交換カラム（ＣＭ）に流した。ＣＭのフロースルーをｐＨ７．４でＤＥＡＥアニオン交換カラムにかけた。ΔＴＭ Ｓはこのカラムに結合し、２５０ｍＭ ＮａＣｌまでの２０ＣＶ直線勾配の中間で溶出した。Ｑ画分中の約１５０ｋＤのバンドがＣＤＣ抗体とＩＭＧ５４２抗体と反応性である（図５０のゲル／ブロット、レーン９から１３参照）。このＱ画分１２番（図５０のゲル／ブロット、レーン９参照）をＮ末端解析のためＰＶＤＦメンブレンに移した。
Ｎ末端配列決定により、以下のような仮の指定があった：
配列は、Ｘ１−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｒ−Ｘ２−Ｘ３−Ｔ−Ｘ４−Ｄで、Ｘ１はおそらくＳ、Ｘ２はおそらくサイレントレジデュー（例えばシステイン又はグリコシル化／リン酸化のＳ／Ｔ）又はＬ、Ｘ３はおそらくＴでＸ４はＦであろう。より強いシグナルによる指定が、より不確実な指定も同様に、ＰＳＣキチナーゼシグナル配列（ＳＤＬＤＲＣＴＴＦＤＤＶ）の後が切断された成熟Ｓタンパク質のＮ−末端に、期待通り一致する。
発酵液上清（Ｄ３２５２．２ａ、７２ｈｐｉ、２８℃）からのΔＴＭ Ｓタンパク質の精製
０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．７の２０ｍＭトリスで平衡化したレンチルレクチンカラムに直接上清をのせた（１リットル／４０ｍＬ）。０．５Ｍ ＮａＣｌを使用して非特異的結合した混入物質を除去した。同じ緩衝液でベースラインまで洗浄した後、伝導率を下げるためカラムを２０ｍＭトリスｐＨ７．５で洗い、それから１Ｍ Ｎ−メチル−α−Ｄマノピラノシドの２０ｍＭトリスｐＨ７．５で溶出した。Ｓタンパク質がいくらかカラムから流れ出る（図５１、ゲル／ブロットのレーン３参照）。同じこのカラムを同じ１Ｌ原料に使い、同様の条件の下で進行させても、フロースルーは見られなかった。サンプルのフロースルーは、最初ＴＥＫでは実施されなかったＮａＣｌ洗浄を含めたことに起因するか、又は特にこのカラムを繰り返し使用したためかもしれない。少なくともこの物質の半分は結合し、６から２５ｍＬの画分に溶出した（（図５１、ゲル／ブロットのレーン６から１０参照）。これらの画分をプールしてアニオン交換Ｑカラム処理を行った。
２０ｍＭトリスｐＨ７．５で平衡化した３０ｍＬ Ｑカラムに、プールしたレンチルレクチン溶出液をのせ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、５００ｍＭのＮａＣｌでステップ溶出した。物質はカラムに結合し、フロースルー又は洗浄液にΔＴＭ／Ｓタンパク質の痕跡はなかった（（図５２、ゲル／ブロットのレーン２から４参照）。Ｓの分解産物を７５ｍＭ ＮａＣｌ（レーン８から９）及び１００ｍＭ ＮａＣｌ（レーン１０から１１）で除いた。ΔＴＭ Ｓタンパク質の大部分は１５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出した（図５２のゲル、レーン１２から１４参照）。追加のΔＴＭ Ｓタンパク質とより低いＭＷのタンパク質は、５００ｍＭのＮａＣｌで溶出した（図５３のゲル、レーン９と１１参照）。１５０ｍＭ ＮａＣｌでの大部分の溶出をプールし（図５３のゲル、レーン１３参照）、１０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．４に入れて透析した。この物質を追加の流出による生成物と混合した。希釈されたタンパク質サンプルの濃縮を小型のＱカラムを用いて試み、続いて比較的小さな分子量の混入物質を取り除くため、サイズ排除クロマトグラフィーを行った。ＢＣＡアッセイから概算した収率は０．５ｍｇ／Ｌである。もしレンチルレクチンカラムでのフロースルーの損失を回避していたら、約１ｍｇ／Ｌの収率が期待される。
代わりの精製案では、ΔＴＭ Ｓタンパク質を１０Ｌ発酵液から精製した。この工程の図式的概観を図１２Ｃに示す。結果の精製タンパク質を図５４に示す。得られた生成物をマウスの免疫原性の試験に提供した。
４５Ｌ発酵液からのΔＴＭ Ｓタンパク質の精製が行われてきた。手短に言うと、原料を遠心分離して、その上清をｐＨ８にｐＨ調製し、続いてもう一度遠心分離した（このステップは非タンパク質物質及びある種のタンパク質混入物を取り除く）。その次に、その物質を−２０℃で保存する前に、８倍に濃縮した。それからこの濃縮物質３Ｌを７５０ｍＬのカチオン（UnoshereS）カラムにかけた。ΔＴＭ Ｓタンパク質はこのカラムを素通りした（ＦＴ）。このＦＴを２５０ｍＬのアニオン（Ｑ）カラムにかけ、１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて溶出した。ＤＥＡＥカラムは、物質の約６５％がカラムを素通りしたため、小さすぎた。
４５Ｌの発酵液から精製したタンパク質の総量は約１０ｍｇであった。この生成物は濃縮後の分解を示し、高いレベルのエンドトキシンを含んでいた。エンドトキシンを除外するため、Ｌｉｕら（Liu, Tobias et. al. 1997）の記載に従って、ＴＸ−１１４相分離及びイオン交換クロマトグラフィーに基づく手法を使用したが、これは大きな損失結果となった。
このＴＦＦ濃縮ステップは大きな損失結果となり、したがってそれ以降の１０Ｌ精製ではこのステップを省略した。この工程変化の結果として、このタンパク質はもはやＱカラムに結合しなかった。この工程変化の図式的概観を図１２Ｄに示す。
回収したこのデルタＴＭを、１Ｍトリス、ｐＨ＝８．０を用いてｐＨ７．４に調整した。それからこの上清を４５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。続いてこの上清を５００ｍＬのＳカラムにかけ、５００ｍＬのＱカラムにつないだ。ほとんどのデルタＴＭタンパク質は、期待に反してどちらのカラムも素通りした。
このフロースルーを５０ｍＬのＬＬカラムにかけた。このＬＬ溶出画分は良好な様子で、stirred cellにより各１００ｍＬまで濃縮した。濃縮中に沈殿の問題が起き、この生成物をＰＢＳ１００ｍｌに対して透析した。
この１０Ｌ発酵液のＦＴからの生成物収率は、大体１０〜１２ｍｇであった。最終生成物内のエンドトキシン含有量は高かった。エンドトキシンをトライトン−Ｘ処理により取り除いた。
Ｑカラムに結合し、１００ｍＭのＮａＣｌで溶出し、更にＬＬで処理したデルタＴＭの２〜３ｍｇも、やはりエンドトキシンを多く含んでいた。
後の精製でデルタＴＭを回収し、１ＭトリスｐＨ＝８．０を用いてｐＨを７．４に調整した。それからこの上清を４５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。続いてこの上清を５００ｍＬのＳカラムにかけ、５００ｍＬのＤＥＡＥカラムにつないだ。再びデルタＴＭタンパク質のほとんどはどちらのカラムも素通りした。
このフロースルーを５０ｍＬのＬＬカラムにかけた。ＬＬ溶出画分は良好な様子で、stirred cellで１００ｍＬにまで濃縮する前に、ＰＢＳに入れて透析した。
このＦＴからの生成物収率は今や１５〜２０ｍｇで、ＤＥＡＥカラムからの１００ｍＭ又は１５０ｍＭ溶出にはデルタＴＭは見られなかった。エンドトキシン含有量はなお高値であったが、以前の精製工程よりは低値であった。この物質を使用してマウスの免疫原性試験用の原料計画を立てた（実施例１０参照）。
工程の最適化
最初の３Ｌ濃度から得た材料を使用して、上記工程を更に最適化した。ΔＴＭ Ｓタンパク質の一部は、予測通りＱカラムに結合しなかった。したがって、同様な溶出条件を用い（ｆｐｌｃ５８８８）、このフロースルー（１及び２と呼ぶ）をより大きなＱで処理し、それから再び同様な溶出条件を用い（ｆｐｌｃ５８８９）、この溶出液を更にＬＬで処理した。ΔＴＭ Ｓタンパク質を含む画分をプールし、濃縮し、ＳＥＣカラムで処理した（ｆｐｌｃ５８９０）。その結果を下の図５５に示す。
画分３１から３５は純度約７０〜８０％を有する。
続いてフロースルー３を同じＱカラム（ｆｐｌｃ５８９１）を用いて処理したが、しかし今度はカラム溶出を、０．１５ＭのＮａＣｌから５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ（各モル濃度につき１カラムボリューム）のステップ溶出の使用に変えた。その結果を図５６に示す。
その１００ｍＭ溶出画分はＳａｒｓ抗体と反応せず、一方その１５０ｍＭ画分は抗体と反応する（図５６、ブロットはゲルと反対であることに注意）。
それからこの１５０ｍＭ画分をプールして同じＬＬにのせた（ｆｐｌｃ流出５８９２）。この溶出は、今度は０．５Ｍの糖から０．１Ｍ（画分１から５）、０．２Ｍ（画分６から１０）、０．３Ｍ（画分１１から１５）、０．４Ｍ（画分１６から２０）、０．５Ｍ（画分２１から２４）の糖に代えて、各モル濃度につき２カラムボリュームを使った。この結果を図５７に示す。
画分１０から２４はＳａｒｓ抗体と反応したが、一方画分１から９は反応しなかった（０１１４０４〜ｄ５ブロット）。画分１２から２４をプールし、アミコンシステムを使用して濃縮と透析を行い、容量を８ｍＬとした。この物質のゲル／ブロットを図５８に示す。この物質は純度９０％以上で、ゲルで観察されるすべてのバンドがＳａｒｓ抗体と反応し、工程からＳＥＣステップを省略できることを示唆した。
ｐＨ調整を加えて又は加えないで行う、ろ過のステップを精製に導入して、最適化の試験を続行した。新しい上清２Ｌを０．２ｕｍフィルターでろ過した。このｐＨを調整せず、上清を結合したＵＮＯ−ＳとＤＥＡＥカラムにかけた。５９０７からのフロースルーを５０ｍＬの新しいＬＬカラムにかけた。ＬＬは過去の実験と同じものを溶出した。画分をプールし、ＰＢＳ中で一晩透析した。それからstirred cellでこの物質を３０ｍＬまで濃縮した。プールした液にはいくらかの周辺画分を含んでいたため、この物質は、マウスの試験に用いたものと比べ、より多くの断片を含んでいた。図６４を参照のこと。バンドはすべて抗体によって認識される。カラムに０．５ｕｇのタンパク質をのせたところ、７０％は無傷のままで、残りは断片から成る部分として得た。
このろ過によって産生された総タンパク質濃度は２７１ｕｇ／ｍＬで、リットルあたりの収率は約４ｍｇであった。この物質のエンドトキシンレベルは８０ＥＵ／ｍＬであった。
この試験は、ろ過のステップの導入と新しいレジンの使用は、エンドトキシン含有率を改善することを示した。ｐＨ調整と濃縮ステップの省略は、工程全体の収率の向上となった。
実験を繰り返し、少なくとも無傷と断片の割合についてはマウスの試験において用いた物質と同じものを、２度目の流出に提供した（結果を図６５に示す）。２度目の流出は、４９４ｕｇ／ｍＬのタンパク質濃度及びリットルあたり約３．５ｍｇ／Ｌの収率であった。このサンプルでは低値のエンドトキシンレベルが観察された。この２回の流出における同様な結果は、これらの結果は再現性があることを示す。
非ｐＨ調整の上清を用いた３番目の流出を、手順通りに行った。純度と収率の結果は、以前の２回の流出と大体同じであった。今回のプールは分割してＱセファロースカラムに通したため、最終的な収率の数字を比較するのは難しい。得られた物質のゲルとブロットを図６６に示す。エンドトキシンの数字は、濃縮前で４０以下、濃縮後では３２０以下であった。これらの結果は、Ｑカラムがstirred cellによる濃縮の代替となり得ることを示す。
大規模な製造のための工程を準備し、必要なカラムサイズを決定するために、減少したカラムサイズを用いて精製手法を変えることにより、更なる最適化試験を実施した。ＵＮＯ ＳとＤＥＡＥカラムを５００ｍＬから１００ｍＬにスケールダウンした。ＬＬカラムを５０ｍＬから７．５ｍＬに減少させ、stirred cell濃縮に代えて５ｍＬのＱセファロースカラムを使用した。得られた物質のゲルとブロットを図６７に示す。この結果は、最終生成物の純度を維持しながら、カラムサイズを下げることが可能であることを示した。この結果は、stirred cell濃縮に代えてＱセファロースカラムを使用すると、断片がより少なく出現することを示す。この工程のフローチャートを図１２Ｅに示す。
更なる解析では、１Ｌの開始濃度を用いたこの改変した工程の繰り返しも行う。工程にはステップ溶出（１００ｍＭ／１５０ｍＭ溶出）を用いる、より大きなＳ／Ｑカラムの使用を含む。溶出液は、ＬＬにのせて、様々な（０．１、０．２、０．３、０．４、０．５Ｍ）糖による溶出を行うであろう。
抽出の試験
Ｓタンパク質の昆虫細胞からの抽出を改良するために実験が行われた。以前の実験では０．１％tergitolが、相当なレベルで混入するタンパク質を除去し、Ｓタンパク質を細胞のペレットに付随したまま残すことが示されている。加えて、ベタインやグリセロールのような添加物はtergitolの抽出効率を０．１から１．０％増加させる可能性がある。２３℃で生育し、１６８ｈｐｉで回収した発酵培地（ロット番号１００３０３）を用いて、一連の抽出実験を行った。ペレットを最初に０．１％Tergitolを含む２０ｍＭトリス、ｐＨ８．４７で洗浄し、それから均等なアリコートに分けた。このアリコートを遠心分離し、０．１％Tergiol上清をプールした。得られたアリコート／ペレットを、添加物（１０％グリセロール、０．４Ｍベタイン、０．５Ｍ ＮａＣｌ）を加えて、又は加えないで、１．０％Tergitolで再抽出した。ゲルとブロット（図３８参照）によると、０．１％tergitolを用いた最初洗浄ステップで、ペレットからのタンパク質の完全な抽出が成功した（レーン１、１８８ＳＮ１）。この結果は、最近のこの発酵の異なる条件（より低温で、遅く回収）に起因するのかもしれない。この細胞ペレット重量の再懸濁量に対する高比率（５０Ｘ）もまた、比較的少量の洗剤を用いたときの抽出効率を改善しているのかもしれない。
アッセイの開発
Ｓタンパク質は赤血球凝集能を有することが述べられてきた（Schultze, Gross et.al. 1991）。Protein Sciences社は、そのインフルエンザプログラムにおいて赤血球凝集アッセイを開発してきており、適切な生物活性は正しい折り畳みを示すため、出願人はＳタンパク質の生物活性を測定するためこの方法を改変した。
様々なコロナウイルスのＳタンパク質は、ウイルス上にあるＳタンパク質が細胞表面にあるシアル酸と相互作用することにより、赤血球を凝集できることが以前から示されてきた。赤血球凝集アッセイは、原則的にRosen（Rosen 1968）によって記述されたように行われる。新鮮なニワトリＲＢＣをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中に０．５％溶液として懸濁した。洗浄済みＲＢＣ５０μＬを、Ｕ型底の９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。サンプルを系列的にＰＢＳで希釈し、それぞれの希釈液５０μＬを各ウェルに加えた。このプレートにふたをして室温で３０分間インキュベートし、それから凝集のスコアを記録した。１ＨＡ単位は細胞の５０％を凝集する希釈度として定義される。このアッセイはニワトリ及びマウスの赤血球両方を用いて実施する。
製造
作業用ウイルスバンク（ＷＶＢ）の調製。Ｓタンパク質の産生に使用するウイルスの接種材料を、分離した作業用ウイルスバンク（ＷＶＢ）から転用した。上述の通り、多量の接種材料を産生するため、１個のウイルスプラークからの組換えウイルスを、低多重度の感染によって、いくつかの経路を経て増殖し、ＷＶＢとして液体窒素中にアリコートを貯蔵した。
この作業用ウイルスバンクに、細菌、カビ、及び、混在する野生型又は他の組換え体バキュロウイルスを含む他の外来性物質が含まれていないことをテストした。アイデンティティを、精製したバキュロウイルスＤＮＡの挿入物のサザンブロット解析によって、また、感染した昆虫細胞内に生成される組換え体タンパク質のウェスタンブロット分析によって確認した。タンパク質製造に使用される組換え体バキュロウイルスの遺伝的安定性を維持するため、作業用ウイルスバンク（ＷＶＢ）を、１アリコートを解凍し、それを低多重度感染（１プラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞又はそれ以下）によって、限定した経路数で増殖して調製した。
ＭＶＢを調製するため、培地を低いＭＯＩ（一般には０．１）で感染し、この培地を７２ｈｐｉで回収した。このＷＶＢ Ｐ３を凍結し、製造地域に貯蔵して将来の工程開発と製造的使用に用いた。ＦＬ Ｓタンパク質（Ｄ３２１７．１ａ）のブロットは、期待に反して上清中に全長Ｓタンパク質が存在することを示した（図３９）。
ウイルスバンクの上清に全長Ｓタンパク質が存在するため、追加的な２Ｌ発酵を実施した。７２ｈｐｉの全発酵時間にわたり、感染の進行、感染した細胞の生存率、ＦＬ Ｓタンパク質Ｄ３２１７．１ａの発現、及び（ロイペプチンを高濃度で２回以上加えた結果として）産生されるタンパク質の安定性を、モニター及び測定した。この発酵は２Ｌのバイオリアクター内で実施した。感染後２４時間でロイペプチンを２μｇ／ｍＬ（＝以前使用した濃度の２倍）の濃度になるよう培地に加えた。４８ｈｐｉでサンプルを採取し、生存率を測定し（８２％）、０．５Ｌを回収して精製のためペレットと上清の両方を−２０℃で保存した。４８ｈｐｉでプロテアーゼ阻害剤であるロイペプチンを２μｇ／ｍＬの割合で再び添加した。感染後７０時間（ｈｐｉ）で、培地を回収した。回収時の細胞生存率は５５％であった。顕微鏡的観察で細胞が十分感染していることを確認した。図４０は発現の進行を示す。
作業用ウイルスバンクの品質評価
力価と無菌性についてテストすることによりＷＶＢを品質評価する。発酵に使用する細胞系の無菌性を継続的にチェックする。加えて、発酵液を感染時と回収時に、並びに原サンプル（細胞内及び分泌したタンパク質のサンプルで、それぞれ感染した細胞又は使用された培養液のどちらかである）について、無菌かどうかをチェックする。回収工程が期待通り行われていることを確認するため、この精製方法の様々なステップにある工程中のサンプルの中間体及び大量生成物の一部採取を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルとウェスタンブロットで解析した。
最終バルクロット検査
２１Ｃ．Ｆ．Ｒ．セクション６１０．１２及びそこにリストされているＵＳＰセクションに記載されている方法に従って実施した総タンパク質量、アイデンティティのアッセイを含む試験を抗原バッチの各バルクについて実施した。
Figure 2007524391
品質管理
異なる２種類の温度（−２０℃と２から８℃）における濃縮及び非濃縮物質の安定性を確立するための試験プロトコールを使用して試験を実施している。現在のこの試験の結果は、濃縮物質は−２０℃で保存した場合に、より安定的であるらしいことを示している。非濃縮物質では、保存温度に無関係に同様であるらしい。
ＳＡＲＳ ΔＴＭ培地上清の最適な保存時間を確立するため、更なる安定性試験を実施した。ＳＡＲＳ ΔＴＭ培地上清のサンプルをＴＦＦ濃縮又は非濃縮のいずれかで、４℃又は−２０℃で保存した。培地を回収しサンプルをテストした。そのデータは現在デンシトメーターで評価中である。
同じ抗体（ＩＭＧ５４２）を使用して、ブロットすべてを処理した。品質的に、非濃縮のＳＡＲＳ ΔＴＭ培地上清は４℃又は−２０℃のいずれにおいても２カ月間は安定であると結論づけることができる（図６８参照）。図６８は、非濃縮のＳＡＲＳ ΔＴＭ培地上清の時間ポイントを、４℃対−２０℃保存で示す。非濃縮のＳＡＲＳ ΔＴＭ培地上清のウェスタンブロットも、４℃対−２０℃保存で実施した。品質的に、Ｔ＝０のサンプルと比較して分解又はバンドシグナルの変化は保存２カ月以内では検出されなかった。２カ月を超える保存では、タンパク質バンドの強度の衰弱を観察した。
濃縮したＳＡＲＳ ΔＴＭ培地上清は、１週間まで４℃で安定であったが（図６９参照）、テストした最初のタイムポイントでブロットの約１００ｋＤのところに更にバンドが現れている（図６９のバンド参照）。しかし４℃で保存した濃縮の培地上清は試験中に汚染してしまったことを特記しなければならない。この汚染が４℃での早急な分解を導いた可能性がある。図６９は４℃で保存した濃縮ＳＡＲＳ ΔＴＭの培地上清のタイムポイントを示す。４℃で保存した濃縮ＳＡＲＳ ΔＴＭ培地上清について、ウェスタンブロットも実施した。４℃で１週間まで保存した濃縮した培地上清において、追加の約１００ｋＤバンドの出現以外は、品質的にこのタンパク質はかなり安定であった。この時間を超えるとこのタンパク質は、ほとんど完全に分解した。
濃縮したＳＡＲＳ ΔＴＭの培地上清は−２０℃で２カ月まで安定であった（図７０参照）。図７０は−２０℃で保存した濃縮ＳＡＲＳ ΔＴＭの培地上清のタイムポイントを示す。−２０℃で保存した濃縮ＳＡＲＳ ΔＴＭ培地上清について、ウェスタンブロットも実施した。品質的に、Ｔ＝０のサンプルと比較して分解又はバンドシグナルの変化は保存２カ月以内では検出されなかった。約１００ｋＤのバンドは出現し始めているか、或いはブロットでは一貫性のない転移により変化している可能性もある。
ＳＡＲＳ Ｓタンパク質のポリクローナル血清の製造
細菌性発現システムｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（インビトロジェン）と大腸菌株ＬＭＧ１９４を使用して、ΔＴＭ Ｓタンパク質を産生した。標的タンパク質を細胞ペレットから抽出して、Ｎｉキレートカラムで精製した。顕著なレベルのタンパク質分解が報告された。加えて、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐを使った最終生成物の濃縮で顕著な損失に遭遇した。
ポリクローナル抗体の業務には、抗体製造のため、特異的な病原体フリーのウサギ（動物＃V６１０）１羽を購入することを含んだ。免疫前の採血を実施した。これまで２回の免疫原投与を行い、免疫後の少量の血液を２回ＰＳＣで受け取った（下記表参照）。更に４回の免疫原投与を計画している。更に２回の少量の採血と最終的な血液プール（４０から７０ｍＬ）を予定している。
２回目の免疫後血液を４５ＬΔＴＭ Ｓタンパク質精製工程のウェスタンブロットのプローブとして使用した。一次抗体を使用して、１：１０００と１：１０，０００の希釈で、それぞれ２時間及び４５分でウェスタンブロットを実施した。二次抗体（ウサギＩｇＧ）を１：１０００で１時間使用した（図５９のゲルとブロット参照）。２回目の免疫後血液の１：１０，０００希釈は、それなりのブロットシグナルを呈した。シグナルを改善するために、ブロットのインキュベーション時間を１から２時間に延長したほうがいいかもしれない。１：１０，０００希釈を用いた場合、この２回目の免疫後血液は少なくとも１０００回分のブロットに十分な材料を提供するはずである。
ΔＴＭ Ｓタンパク質を３ｍｇマウス免疫原性試験に供給した。予備的な報告データでは、ミョウバンと共にＩＭルートによってネズミを免疫した場合、良好な血清ＥＬＩＳＡ力価とウイルスの中和力価が得られたことを示す。この試験では、投与は２回行われた。
動物試験
この試験はCenter for Disease Controlによって、ブラインドとした。
この試験のテスト材料は、末端を欠失したＳタンパク質（デルタＴＭ）とｈｉｓタグ付き全長Ｓタンパク質（ｈｉｓｔａｇ）である。ルーチンの安全対策措置を取り、必要に応じて追加の安全対策措置を行った。
テスト材料は凍結保存した（≦−２０℃）。材料すべてを、供給者によって特定された状態で保存し、記録した。
分注したテスト材料の全量を記録した。テスト材料の投与量の製剤を調製し、免疫のタイムポイント１回につき、１投与レベルで、１バイアルとして、分離したバイアルに入れて送付した
この試験のため、ＣＤ１、ＶＡＦ／プラスのマウスのオスとメス（未経産で、非妊娠の）をCharles River Laboratoriesから購入した。動物たちの体重は約１６から１８グラム（特定の購入体重範囲）で、到着時に約４週齢であった。特に高感度の反応性と背景データが豊富に入手できることが、マウスをこの試験の適当な候補としており、マウスを頻繁に免疫学的試験に用いた。これらのマウスを、プラスチックの固形底のケージに木屑チップを敷いて、１ケージにつき６匹まで収容した。動物室とケージはこの試験の開始に先立って消毒・清潔化を行い、その後も必要に応じてケージを交換した。これは一般に認められた動物飼育手順に従って行われた。
動物室を蛍光灯で照らし、１２時間の明／暗サイクルを維持した。National Research Councilの「実験動物の世話と使用のガイド」１９９６に従って、可能な限りの範囲で、室温を約１８から２６℃に、相対湿度を約３０から７０％に、維持した。室温と相対湿度の値を毎日記録した。
Certified Rodent Diet（例えば、Purina Rodent Diet 5002（PMI Nutrition International、ブレントウッド、ミズーリ州））は無制限に入手できた。各食料ロットの解析は、製造元から提供され、施設の記録に残した。この食餌には、この試験の完全性に悪影響を及ぼすかもしれない混入物で、これまで知られているものは存在しなかった。シカゴ市の水道水を、飲料水自動配布システムか又は飲料水ビンに入れて、無制限に供給した。新鮮な水（ビン）を少なくとも週に２回供給した。水の解析報告は保存されている。
試験のために選択された動物は、耳へのマーク又はパンチによって、不変の識別番号を受けた。個々のケージカードも、動物番号及び試験グループによって、試験動物を識別した。割り当てられた識別番号は、この試験内においては、唯一のものであった。
下記に示す試験デザインに従って、試験物質をＩＭ注射によりマウスに投与した。動物を体重測定し、例えば試験を受けるグループすべてが事前の体重テストにおいて匹敵し得るもので、使った動物それぞれの体重値の偏差が平均体重の上下２０％を超えないというような、強制的なランダム処理を用いて、処理グループに割り当てた。これらの動物に、試験物質を増減した投与量を含む、５０μＬ処方量を投与した。特定の日に動物たちを安楽死させ、血清を集めた。血清はＥＬＩＳＡによる解析と血清中和アッセイのため輸送した。
Figure 2007524391
 この試験で使用するため購入した動物は、少なくとも１週間隔離した。隔離の間、少なくとも１日に１回は動物を観察した。隔離の最後に、試験のための使用に先立って、スタッフの獣医がこの動物たちの健康状態を調べた。
動物たちは毎週体重を測定し、毒性の兆候と生存を毎日観察した。すべての行動の変化の兆候、毛皮の状態の変化、通常ではない体液の排出、外傷、又は他の関連する観察を記録した。死亡が見つかった動物を記載し、徹底的な剖検はせずに廃棄した。死亡を見つけた又は瀕死の状態にいて死亡させた動物について、剖検は行わなかった。動物の最後において、組織の保存は行わなかった。
動物たちは、試験物質を含む５０μＬ ＩＭ注射を、全部で１回、２回、３回、又は４回受けた。動物たちを試験の１日目、１５日目、３０日目、４５日目に免疫した。０．５ｃｃのプラスチック使い捨て滅菌シリンジと２７ｇｘ１／２インチ（１．２７ｃｍ）針を使い、投与処方量を注射した。対照動物には投与はしなかった。
採血に先立って、マウスを徹底して麻酔し、眼窩後方洞又は腹部大動脈から、或いは心臓穿刺を介して全血を集めた。血液を凝固させ、１３００ｘｇで２０分間遠心分離し、血清を適切にラベルした試験管に血清を移して、血清サンプルを集めた。この血清を、３０日目と７５日目の採血後の輸送まで、約−２０℃で保存した。試験動物を、ペントバルビタールナトリウム又はＣＯ２窒息と共に、腹部大動脈からの放血により安楽死させた。
体重及び毎週の体重増加を、各時間ポイントにおいて、被検グループの平均値及び標準偏差値として表した。処置グループ間の相違を見るために、変数解析（ＡＮＯＶＡ）と、適当であればＤｕｎｎｅｔｔ法又はＴｕｋｅｙのＨＳＤテストにより、長期間変遷するデータを統計学的に解析した。ＡＰ値≦０．０５は顕著な相違とみなされた。臨床的観察を出来事別にまとめた。
マウス血清中の抗体レベル測定用ＥＬＩＳＡアッセイ
マウス血清中の抗体レベルを測定するために、プレート上の元抗原として用いる精製したＴＭ、ｈｒｐ結合二次抗体であるポリクローナルのウサギ抗体、及びPierce社のPico CLW ELISA検出キットを使用してＥＬＩＳＡを開発した。パーキンエルマーのfuluorimeterを、励起ランプを消した状態で使用した。
図６０と６１は、ポリクローナルのウサギ血清を使用したシステムを表したエクセルのグラフである。図６０では、一次抗体と二次抗体を一定した濃度（１：５００希釈）で使用して、色々な量の抗原をプレートにのせた。図６１は、１ウェルあたり１００ｎｇのＴＭと１：１０００希釈の二次抗体を用いた、ウサギのポリクローナルの力価を示す。希釈は１：１０００から開始して２倍である。
下記の表に記載されているように、二重盲検法において、マウスの６グループ（５実験グループと１対照グループ）を様々な投与量のＳＡＲＳ ＳデルタＴＭ及びＨｉｓタグ付き全長Ｓタンパク質で免疫化した。マウスから１日目、１５日目、３０日目、４５日目、６０日目、７５日目に採血した。
作業用血清希釈度を、準備実験に基づき、１：１００希釈に決定した。抗ＳΔＴＭ抗体力価を、９６穴プレートの各ウェルにＳΔＴＭを１００ｎｇコートしたキャプチャー免疫アッセイで、各サンプルについて決定した。抗ＳΔＴＭ抗体がＳΔＴＭに結合した後、ＨＲＰ結合の、抗マウスヒツジ抗体を使い特異的シグナルを産生させた（ＥＣＬ）。図７１に報告した結果はオス、メス両対象の平均値である。対照１は第１日目（赤）と第３０日目（青）の採血日に得られた血清を含み、対照２はアッセイ対照で、陰性（ＰＢＳ、赤）及び陽性（ウサギ抗ＳΔＴＭ）を含む。アッセイをすべて２枚のプレート上で二重測定により実施した。試験は、アッセイがすべて完了しデータが集められるまで非融合ではなかった。
図７１のグラフは明らかに、抗ＳＡＲＳ ＳのΔＴＭ又はＨｉｓタグ付き全長の抗体を、投与量に依存して、且つ免疫増幅が効果的な態様で、誘発することができることを示した。この結果は二重測定のプレートで産生可能であった。更に、図７５のグラフは明らかに抗体力価が全期間において上昇していることを示す。
この試験において使用したＨｉｓタグ付きＳタンパク質（９ｕｇ投与量）を、濃縮のために再測定した。このタンパク質の調製において、この９ｕｇは干渉物のせいで過剰に推定しており、実際の投与量は、より正確に推定すると約２ｕｇであった。この新たな測定値は現行の試験では適正化されている。Ｈｉｓタグ付き全長Ｓタンパク質を投与されたマウスから得られた値は、３ｕｇ投与レベルのマウスのものより低く、実際の投与量は３ｕｇ未満であるらしいことを示唆している。
マウス試験において使用されるキャプチャー免疫アッセイの有効性証明のため、追加の実験を実施した。
マウスにおけるＳＡＲＳ Ｓ免疫原性調査（上記）の最初の部分で、最適なコーティング条件、即ち１ｕｇ／ｍＬのＳＡＲＳ ＳΔＴＭ１００ｕＬを、ウサギ抗Ｈｉｓタグ付きＳＡＲＳΔＴＭを用いて決定した。一次抗体（マウス血清）の作業用希釈度である１：１００は、以前の準備実験に基づいており、その準備実験では選択したマウス血清を系列的に希釈し、ＳＡＲＳΔＴＭ結合をテストした。２つの血清サンプルを現行の試験に選択した。１つは特異的シグナルの最低値を代表的する＃１１１（３ｕｇ投与量、１５日目採血）であった。もう１つは最高値の＃１９６（５０ｕｇ投与量、３０日目採血、マウス試験で最強のシグナルを示す）であった。血清を、１：１００希釈から開始して系列的に希釈し、アッセイを、２種類のコーティング条件、１ｕｇ／ｍＬと２ｕｇ／ｍＬ ＳＡＲＳ ＳΔＴＭのプレート上で、二重測定により実施した。
＃１１１では、シグナルは弱いが検出可能であった。希釈によるシグナルは直線的であったがアッセイの直線性範囲の低値端であった。１：１００の希釈は見た目としてはこのサンプルとして最善の選択で、更に希釈することはアッセイの質を危うくする。一方、＃１９６は、希釈系列に従って、特異的シグナルの直線的減少を示した。１：１００の希釈は、かわって力価の高値端に位置した。この希釈度は、特異的シグナルの弱いものと強いものの両方に妥協するものである。したがって、現行の調査は、マウスにおける免疫原性試験で使用されるアッセイ条件の有効性を証明した。
コーティング濃度を２ｕｇ／ｍＬまで増加すると低めの力価の検出を改善したが、力価が高めの血清は、直線的検出範囲にとどまるため更に希釈しなければならない。
２つの同一血清サンプルを異なる日にテストすることにより、このキャプチャー免疫アッセイの再現性を評価した（図７３参照）。２つのアッセイの結果は再現性を示した。ＣＶ（標準偏差／平均値）は１日目は２枚のプレートの平均結果（プレート間ＣＶとも呼ばれる）により約１０％で、一方、２日目のＣＶは同じプレートからの平均値（プレート内ＣＶ）による利益を受けて１０％より低い。＃１１１は弱いシグナルを呈し、アッセイ範囲の低値端に位置した。
試験のパートＩＩは４５日目、６０日目、７５日目の採取血液を含んだ。４５日、６０日、７５日における採取血液からのものも含め、得られた血清総サンプル数を、以下の表に示す。
Figure 2007524391
 すべてのマウス抗ＳＡＲＳ Ｓタンパク質血清を、ウイルス中和調査のためにカナダのＣＤＣに送った。マウス血清のウイルス中和テストはＳＯＰに従って実施された。血清を連続して２倍ずつ希釈した。それぞれの希釈液に、ウイルス１００感染単位を加えた。インキュベーションの間にウイルスの中和が起こった。この混合液を使用してＶｅｒｏ−Ｅ６細胞に接種し、細胞変性効果（ＣＰＥ）をモニターした。非加熱（タイター１）と加熱（５６℃で３０分間、タイター２）血清を以下の表にまとめた。
Figure 2007524391
Figure 2007524391
 この試験の結果は、２回投与を受けたマウスはすべてＳＡＲＳ−ＣｏＶを中和した血清を有し、一方１回の投与を受けたマウスのほとんどが中和血清を産生したことを示した。この中和能は明らかに免疫増幅による上昇効果があった。結果は更に投与量依存の一般的傾向を示したが、９ｕｇを超える投与レベルでは頭打ちの状態であった。
データの一部について、更に相関関係の解析を行った。ＭＦＩ値は、マウス血清の免疫原性試験（実施例１１参照）から、マウス血清すべてを１００倍希釈して得られたため、それらの相関を見るため、両セットのデータを同じグラフ内にプロットすることが可能であった。図７４ではＹ軸はウイルス中和のタイター１を、一方Ｘ軸は同じ血清のＭＦＩ値を表す。マイナス値（タイター１＜１０）すべてと直線性からはずれた1個（動物ＩＤ＃２５）は除外した。
サンプルサイズ１６で、グラフはＲ２値０．９０を示し、２つの試験間に相関性があることを示した（図７４参照）。
ＳＡＲＳ ＳデルタＴＭの生物活性
ＡＣＥ２／ＳデルタＴＭ／ウサギαによって、一次抗血清を１：５０希釈に固定して、多様なＳＡＲＳ ＳデルタＴＭ濃度に対するＭＦＩ値を得た。結果を図７６に示すが、これはＭＦＩ値が、Ｒ２値０．９９と、サンプル濃度とよく相関することを表す。この結果はＳＡＲＳ ＳデルタＴＭの機能的活性を表し、精製した組換え体が正しく折り畳まれていることを示す。これはまたＳＡＲＳ ＳデルタＴＭがワクチンの適切な抗原であることを表す。
まとめとして、これらの試験は、組換え体ＳＡＲＳ Ｓタンパク質は、投与量依存的及び免疫増幅が効果的な態様で、マウスのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−中和血清を誘発することを示した。更にまた、このワクチンはこの試験の間十分な耐性を有することが推定された。
alhydrogelによるＳＡＲＳ Ｓ ΔＴＭの処方
ＳＡＲＳ ＳデルタＴＭを、アジュバントのalhydrogelに結合するかどうかテストした。最終的にＡｌ（ＯＨ）３の濃度０．０５％、０．１％、０．１５％、０．２％を作製するため、固定した量の精製ＳＡＲＳ ＳデルタＴＭ（４カラム後）を多様な量のaldehydrogelと混合した。この混合物を、１０，０００ＲＰＭ、ＲＴで１０分間遠心分離する前に、実験台に１時間静置した。得られた上清をＳＡＲＳ ＳデルタＴＭ濃度について分析した。
上清のタンパク質濃度に基づき、ペレット内のＳＡＲＳ ＳデルタＴＭ（おそらくalhydrogelに結合している）の量を計算した。Ａｌ（ＯＨ）３が０．０５％、０．１％、０．１５％、０．２％において、Ａｌ（ＯＨ）３１ｍｇに対し、９６ｕｇ、６１ｕｇ、４６ｕｇ、３８ｕｇのＳＡＲＳ ＳデルタＴＭが結合した。
例えばリン酸グループのような２価のアニオンは、Ａｌ（ＯＨ）３と粒子を形成することが知られている。どのように緩衝液が粒子形成に関わるかを分析する多くの試験が実施されてきた。視覚的な観察によると、干渉の順番は、強いものから弱いものまで以下の通りである：
ＰＢＳ＞ＴＢＳ／トリス＞ＭＥＳ＞１％酢酸＝Ｈ２Ｏ
ＰＢＳは２０倍に希釈してもその効果を保った。しかしながら、このレベルでは、トリス／塩酸は効果が減少したように見えた。
これらの観察を、更にＢＳＡが溶解したＨ２Ｏ、ＰＢＳ、ＴＢＳ、１００ｍＭ、５０ｍＭ、２０ｍＭ、及び１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．３について調査した。ＢＣＡとの干渉により、１００ｍＭと５０ｍＭのトリス中のＢＳＡの効果は評価できなかった（ＢＳＡ標準液は１００ｍＭ又は５０ｍＭトリスのいずれでも調製しなかった）。ＰＢＳ、２０ｍＭトリス、１０ｍＭトリス、及びＨ２Ｏで希釈された場合、０．１％のalhydrogel（０．１５％のＡｌ（ＯＨ）３と等価）において、Ａｌ（ＯＨ）３１ｍｇに対し、それぞれ１５６ｕｇ、３２５ｕｇ、３２３ｕｇ、３２６ｕｇのＢＳＡが結合した。ＢＳＡ／ＰＢＳを除き、トリス又はＨ２Ｏ中のＡｌ（ＯＨ）３にこのＢＳＡのほとんどすべて（飽和）が結合した。実際のＢＳＡ結合容量はもっと高いと思われる。Ａｌ（ＯＨ）３が飽和した別の実験では、Ｈ２Ｏで希釈した場合、Ａｌ（ＯＨ）３１ｍｇに対し５００ｕｇものＢＳＡが結合した。
これらの結果は、ＰＢＳ中のＳＡＲＳ ＳデルタＴＭはＡｌ（ＯＨ）３と粒子形成するかもしれないが、リン酸アニオンの干渉により、より非効率的な態様であることを示す。もしＳＡＲＳ ＳデルタＴＭが、Ａｌ（ＯＨ）３と粒子形成することを希望するなら、ＳＡＲＳ ＳデルタＴＭをＨ２Ｏか又は１０／２０ｍＭのトリス中に置くほうが良いようである。
以下の番号付きパラグラフによって、本発明を更に記述する。
１．単離されたＳＡＲＳタンパク質、又はそのようなタンパク質をｉｎ ｖｉｖｏ及び／若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏで発現するベクター、例えば、プラスミド、及び組換えバキュロウイルスなどの組換えウイルス。
２．組換えにより発現されたパラグラフ１に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質。
３．組換えウイルスによって発現されたパラグラフ２に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質、又は組換えウイルスであるパラグラフ１のベクター。
４．ＤＮＡプラスミド、又はＤＮＡプラスミドであるパラグラフ１に記載のベクターによって発現された、パラグラフ２の単離されたＳＡＲＳタンパク質。
５．組換えバキュロウイルスによって発現されたパラグラフ３に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質、又は組換えバキュロウイルスであるパラグラフ３に記載のウイルス。
６．先行パラグラフのいずれかに記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクターであって、該タンパク質が、Ｓ、Ｍ、Ｅ、若しくはＮ、又はそのエピトープ断片、或いはそれらの組合せである、単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
７．Ｓタンパク質である、パラグラフ６に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
８．Ｓ１である、パラグラフ６に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
９．Ｓ２である、パラグラフ６に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
１０．Ｓの免疫原性断片である、パラグラフ６に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
１１．Ｓのエピトープである、パラグラフ１０に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
１２．Ｍタンパク質である、パラグラフ６に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
１３．Ｍの免疫原性断片である、パラグラフ６に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
１４．Ｍのエピトープである、パラグラフ１３に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
１５．Ｎタンパク質である、パラグラフ６に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
１６．Ｎの免疫原性断片である、パラグラフ６に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
１７．Ｎのエピトープである、パラグラフ１０に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
１８．Ｅタンパク質である、パラグラフ６に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
１９．Ｅの免疫原性断片である、パラグラフ６に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
２０．Ｅのエピトープである、パラグラフ１０に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
２１．先行パラグラフのいずれかに記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又は該タンパク質を発現するベクターであって、該タンパク質は、第１のベクター中に存在するべき外来性の核酸分子を含有する第２の転移ベクター例えばプラスミドを用いた相同組換えの方法を介して調製されたバキュロウイルスなどの、第１のベクターからの発現によって産生され、該転移ベクター例えばプラスミドは、ある制限部位を有する状態で調製され；該転移ベクターの調製は、該転移ベクターを、該制限部位からある距離をおいて切断する酵素（距離をおいて切断する酵素）によって切断して、それによって、該制限部位が該転移ベクターから切除され、且つ、該転移ベクターが特有の突出末端を有するようにすること；別の反応において、ポリメラーゼ連鎖反応又は他の増幅反応を実施してそれによって、該制限部位が該反応の増幅産物の一部となるようにすること；該距離をおいて切断する酵素によって増幅産物を切断して、それによって、増幅産物が特有の突出末端を有するようにすること；及び、介在性の核酸分子が除外されるように、特有の突出末端を有する転移ベクターと、特有の突出末端を有する増幅産物を連結させることを含む、単離されたＳＡＲＳタンパク質又は該タンパク質を発現するベクター。
２１．少なくとも９０％若しくは９０％超、又は少なくとも９５％若しくは９５％超に精製された、先行パラグラフのいずれかに記載のＳＡＲＳタンパク質。
２２．先行パラグラフのいずれかに記載のＳＡＲＳタンパク質又は該ＳＡＲＳタンパク質を発現するベクターを含有するか、それから本質的には成るか、又はそれから成る免疫原性組成物、免疫学的組成物、又はワクチン組成物。
２３．ＳＡＲＳタンパク質が少なくとも９０％若しくは９０％超、又は少なくとも９５％若しくは９５％超に精製されている、パラグラフ２２に記載の組成物。
２４．担体、又は希釈剤及び／若しくはアジュバントを含んでいる、パラグラフ２２又は２３に記載の組成物。
２５．感染にかかりやすい宿主において、ＳＡＲＳに対する免疫応答をそれによって引き起こす方法であって、パラグラフ２２の組成物、又は先行パラグラフのいずれかに記載のタンパク質若しくはベクターを該宿主に投与することを含む方法。
２６．投与が注射による投与、経口投与、粘膜投与、又は局所投与である、パラグラフ２５に記載の方法。
２７．先行パラグラフのいずれかに記載のタンパク質又はベクターによって誘導される抗ＳＡＲＳタンパク質抗体。
２８．Ｓタンパク質に特異的な、パラグラフ２７に記載の抗体。
２９．モノクローナル抗体である、パラグラフ２７又は２８の抗体。
３０．パラグラフ２９のモノクローナル抗体、又は先行パラグラフのいずれかに記載のタンパク質を含む診断キット又はアッセイ。
３１．ＳＡＲＳを検出する方法であって、抗原による、パラグラフ２９に記載のモノクローナル抗体に対する結合を試料中で検出すること、又は、先行パラグラフのいずれかに記載のタンパク質に対する抗体の結合を試料中で検出することを含む方法。
３２．抗インフルエンザワクチンにおいて、それが先行パラグラフのいずれかに記載のＳＡＲＳタンパク質、又は先行パラグラフのいずれかに記載のベクターを含有又は発現することを改良に含む抗インフルエンザワクチン。
３３．抗肺炎ワクチンにおいて、それが先行パラグラフのいずれかに記載のＳＡＲＳタンパク質、又は先行パラグラフのいずれかに記載のベクターを含有又は発現することを改良に含む抗肺炎ワクチン。
３４．抗インフルエンザワクチンにおいて、それが先行パラグラフのいずれかに記載のＳＡＲＳタンパク質、又は先行パラグラフのいずれかに記載のベクターを含有又は発現し、且つ、肺炎球菌タンパク質を更に含有又は発現することを改良に含む抗インフルエンザワクチン。
３５．抗肺炎球菌ワクチンにおいて、それが先行パラグラフのいずれかに記載のＳＡＲＳタンパク質、又は先行パラグラフのいずれかに記載のベクターを含有又は発現し、且つ、インフルエンザタンパク質を更に含有又は発現することを改良に含む抗肺炎球菌ワクチン。
３６．エアゾール噴霧器中、又はエアゾール形態、若しくはポンプスプレーディスペンサー中にある、先行パラグラフのいずれかに記載の組成物であって、それらのエアゾール噴霧器、又はエアゾール形態、若しくはポンプスプレーディスペンサーが鼻腔内投与用に意図されている組成物。
３７．存在しているか、又は発現されているＳＡＲＳタンパク質が、３つの単離体など、複数の単離体、例えば少なくとも２つ又は３つの単離体に由来する、先行パラグラフのいずれかに記載の組成物。
３８．存在しているか、又は発現されているインフルエンザタンパク質が、ＨＡ及び／又はＮＡ及び／又はＭ２である、先行パラグラフのいずれかに記載の組成物。
３９．存在しているか、又は発現されているインフルエンザタンパク質が、２株又は３株、例えば３株の別のインフルエンザ株など、１株又は複数の別のインフルエンザ株に由来する、先行パラグラフのいずれかに記載の組成物。
４０．（ａ）１つ又は複数の容器の中にあるＳＡＲＳタンパク質又はＳＡＲＳタンパク質を発現するベクター、及び／又は、（ｂ）１つ又は複数の容器の中にあるインフルエンザタンパク質又はインフルエンザタンパク質を発現するベクター、及び／又は、（ｃ）１つ又は複数の容器の中にある肺炎タンパク質又は肺炎タンパク質を発現するベクターを含む、先行パラグラフのいずれかに記載の組成物を調製するためのキットであって、該キットが組成物、及び／又は成分の混合物を投与するための説明書を任意選択で含有し、且つ、該容器が任意選択で同一の包装の中にある、キット。
４１．第１のベクターの中に存在するべき外来性の核酸分子を含有する第２の転移ベクター例えばプラスミドを用いた相同組換えの方法を介して調製された、バキュロウイルスなどの第１のベクターを調製する方法であって、該転移ベクター例えばプラスミドは、ある制限部位を有する状態で調製され；該転移ベクターの調製は、該転移ベクターを、該制限部位からある距離をおいて切断する酵素（距離をおいて切断する酵素）によって切断して、それによって、該制限部位が該転移ベクターから切除され、且つ、該転移ベクターが特有の突出末端を有するようにすること；別の反応において、ポリメラーゼ連鎖反応又は他の増幅反応を実施してそれによって、該制限部位が該反応の増幅産物の一部となるようにすること；該距離をおいて切断する酵素によって増幅産物を切断して、それによって、増幅産物が特有の突出末端を有するようにすること；及び、介在性の核酸分子が除外されるように、特有の突出末端を有する転移ベクターと、特有の突出末端を有する増幅産物を連結させることを含む、第１のベクターを調製する方法。
４２．注目しているタンパク質をコードする核酸分子に、リーダー配列用の核酸分子を連結するための方法である、パラグラフ４１の方法。
４３．酵素がＳａｐＩである、いずれかのパラグラフに記載の方法。
４４．単離されたタンパク質又は該タンパク質を発現するベクターであって、該タンパク質は、第１のベクターの中に存在するべき外来性の核酸分子を含有する第２の転移ベクター例えばプラスミドを用いた相同組換えの方法を介して調製されたバキュロウイルスなどの、第１のベクターからの発現によって産生され、該転移ベクター例えばプラスミドは、ある制限部位を有する状態で調製され；該転移ベクターの調製は、該転移ベクターを、該制限部位からある距離をおいて切断する酵素（距離をおいて切断する酵素）によって切断して、それによって、該制限部位が該転移ベクターから切除され、且つ、該転移ベクターが特有の突出末端を有するようにすること；別の反応において、ポリメラーゼ連鎖反応又は他の増幅反応を実施してそれによって、該制限部位が該反応の増幅産物の一部となるようにすること；該距離をおいて切断する酵素によって増幅産物を切断して、それによって、増幅産物が特有の突出末端を有するようにすること；及び、介在性の核酸分子が除外されるように、特有の突出末端を有する転移ベクターと、特有の突出末端を有する増幅産物を連結させることを含む、単離されたタンパク質又は該タンパク質を発現するベクター。
以上、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明してきたが、添付の請求の範囲により規定される本発明は、上記説明において示した特定の細部により限定されるものでなく、本発明の精神又は範囲を逸脱することなく多くの明らかな変更が可能であることを理解すべきである。
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ＳＡＲＳ Ｓタンパク質のアミノ酸配列及びＳＡＲＳ Ｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列を制限部位及びクローニング用のプライマーと共に示す図である（図７も参照）。 ＳＡＲＳ Ｓ ＯＲＦをコードするはヌクレオチド配列を示す図である。ＡＴＧ、ＡＧＴ、及びＴＡＡを太字で示す。 ＳＡＲＳ Ｅタンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す図である。 ＳＡＲＳ Ｅタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。 ＳＡＲＳ Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す図である。 ＳＡＲＳ Ｍタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。 ＳＡＲＳ Ｎタンパク質をコードする核酸配列を示す図である。 ＳＡＲＳ Ｎタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。 ＳＡＲＳ Ｓ ＯＲＦのクローニング用のプライマーを示す図である（図１も参照）。 ＳＡＲＳ Ｓ ＯＲＦの制限地図を示す図である。 バキュロウイルス（ＢＥＶＳ又はＢＶ）発現ベクターを調製するための模式的戦略を示す図である。 コロナウイルス粒子を示す図である。 ＳＡＲＳコロナウイルスの模式図である。 Ｓ−タンパク質生成過程の図式的概観を示す図である。 配列アライメントを示す図である。 生成された３つのコンストラクトの概要を示す図である。 ゲルの写真である。 ゲルの写真である。 ゲルの写真である。 ウェスタンブロットの写真である。 ウェスタンブロットの写真である。 ウェスタンブロットの写真である。 ２枚のウェスタンブロットの写真である。 ２枚のウェスタンブロットの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ゲルの写真である。 ゲルの写真である。 ゲルの写真である。 ゲルの写真である。 ゲルの写真である。 ゲルの写真である。 ゲルの写真である。 ゲルの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ウェスタンブロットの写真である。 ウェスタンブロットの写真である。 ウェスタンブロットの写真である。 ウェスタンブロットの写真である。 ウェスタンブロットの写真である。 ゲルの写真である。 ウェスタンブロットの写真である。 ウェスタンブロットの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ゲルの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ゲルの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 棒グラフである。 棒グラフである。 ゲルの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ゲルとウェスタンブロットの写真である。 ２枚のゲルの写真である。 ２枚のゲルの写真である。 ゲルの写真である。 棒グラフである。 折れ線グラフである。 棒グラフである。 折れ線グラフである。 棒グラフである。 折れ線グラフである。

Claims (56)

  1. 単離されたＳＡＲＳタンパク質、又はそのようなタンパク質をｉｎ ｖｉｖｏ及び／若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏで発現するベクター、例えば、プラスミド、組換えバキュロウイルスなどの組換えウイルス。
  2. 組換えにより発現された請求項１に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質。
  3. 組換えウイルスによって発現された請求項２に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質。
  4. 組換えウイルスである請求項１に記載のベクター。
  5. ＤＮＡプラスミド、又はＤＮＡプラスミドである請求項１に記載のベクターによって発現された、請求項２に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質。
  6. 組換えバキュロウイルスによって発現された請求項３に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質、又は組換えバキュロウイルスである請求項３に記載のウイルス。
  7. 請求項１に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクターであって、該タンパク質が、Ｓ、Ｍ、Ｅ、若しくはＮ、又はそのエピトープ断片、或いはそれらの組合せである単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
  8. Ｓタンパク質である、請求項７に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
  9. Ｓ１である、請求項７に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
  10. Ｓ２である、請求項７に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
  11. Ｓの免疫原性断片である、請求項７に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
  12. Ｓのエピトープである、請求項１１に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
  13. Ｍタンパク質である、請求項７に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
  14. Ｍの免疫原性断片である、請求項７に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
  15. Ｍのエピトープである、請求項１４に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
  16. Ｎタンパク質である、請求項７に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
  17. Ｎの免疫原性断片である、請求項７に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
  18. Ｎのエピトープである、請求項１１に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
  19. Ｅタンパク質である、請求項７に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
  20. Ｅの免疫原性断片である、請求項７に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
  21. Ｅのエピトープである、請求項１１に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又はそれを発現するベクター。
  22. 請求項１に記載の単離されたＳＡＲＳタンパク質又は該タンパク質を発現するベクターであって、該タンパク質は、第１のベクターの中に存在するべき外来性の核酸分子を含有する第２の転移ベクター例えばプラスミドを用いた相同組換えの方法を介して調製されたバキュロウイルスなどの、第１のベクターからの発現によって産生され、該転移ベクター例えばプラスミドは、ある制限部位を有する状態で調製され；該転移ベクターの調製は、該転移ベクターを、該制限部位からある距離をおいて切断する酵素（距離をおいて切断する酵素）によって切断して、それによって、該制限部位が該転移ベクターから切除され、且つ、該転移ベクターが特有の突出末端を有するようにすること；別の反応において、ポリメラーゼ連鎖反応又は他の増幅反応を実施して、それによって、該制限部位が該反応の増幅産物の一部となるようにすること；該距離をおいて切断する酵素によって増幅産物を切断して、それによって、増幅産物が特有の突出末端を有するようにすること；及び、介在性の核酸分子が除外されるように、特有の突出末端を有する転移ベクターと、特有の突出末端を有する増幅産物とを連結させることを含む、単離されたＳＡＲＳタンパク質又は該タンパク質を発現するベクター。
  23. 少なくとも９０％に精製された、請求項１に記載のＳＡＲＳタンパク質。
  24. 少なくとも９５％に精製された、請求項１に記載のＳＡＲＳタンパク質。
  25. 請求項１に記載のＳＡＲＳタンパク質又は該ＳＡＲＳタンパク質を発現するベクターを含有するか、それから本質的に成るか、又はそれから成る、免疫原性組成物、免疫学的組成物、又はワクチン組成物。
  26. ＳＡＲＳタンパク質が少なくとも９０％に精製されている、請求項２５に記載の組成物。
  27. ＳＡＲＳタンパク質が少なくとも９５％に精製されている、請求項２６に記載の組成物。
  28. 担体、又は希釈剤及び／若しくはアジュバントを含んでいる、請求項２５に記載の組成物。
  29. 感染にかかりやすい宿主において、ＳＡＲＳに対する免疫応答をそれによって誘発する方法であって、該宿主に請求項２５に記載の組成物を投与することを含む方法。
  30. 感染にかかりやすい宿主において、ＳＡＲＳに対する免疫応答をそれによって誘発する方法であって、該宿主に請求項１に記載のタンパク質又はベクターを投与することを含む方法。
  31. 投与が注射による投与、経口投与、粘膜投与、又は局所投与である、請求項３０に記載の方法。
  32. 投与が注射による投与、経口投与、粘膜投与、又は局所投与である、請求項３０に記載の方法。
  33. 請求項１に記載のタンパク質又はベクターによって誘発された抗ＳＡＲＳタンパク質抗体。
  34. Ｓタンパク質に特異的な、パラグラフ３３に記載の抗体。
  35. モノクローナル抗体である、請求項３３に記載の抗体。
  36. 請求項３５のモノクローナル抗体を含む診断キット又はアッセイ。
  37. 請求項１に記載のタンパク質を含む診断キット又はアッセイ。
  38. ＳＡＲＳを検出する方法であって、抗原による、請求項３５に記載のモノクローナル抗体に対する結合を試料中で検出することを含む方法。
  39. ＳＡＲＳを検出する方法であって、請求項１に記載のタンパク質に対する、試料中の抗体の結合を試料中で検出することを含む方法。
  40. 請求項１に記載のＳＡＲＳタンパク質、又は請求項１に記載のベクターを含有又は発現することを改良に含む抗インフルエンザワクチン。
  41. 請求項１に記載のＳＡＲＳタンパク質、又は請求項１に記載のベクターを含有又は発現することを改良に含む抗肺炎ワクチン。
  42. 請求項１に記載のＳＡＲＳタンパク質、又は請求項１に記載のベクターを含有又は発現し、且つ、肺炎球菌タンパク質を更に含有又は発現することを改良に含む抗インフルエンザワクチン。
  43. 請求項１に記載のＳＡＲＳタンパク質、又は請求項１に記載のベクターを含有又は発現し、且つ、インフルエンザタンパク質を更に含有又は発現することを改良に含む抗肺炎球菌ワクチン。
  44. エアゾール噴霧器中、又はエアゾール形態、若しくはポンプスプレーディスペンサー中にある請求項２２に記載の組成物であって、それらエアゾール噴霧器、又はエアゾール形態、若しくはポンプスプレーディスペンサーが鼻腔内投与用に意図されている組成物。
  45. 存在しているか、又は発現されているＳＡＲＳタンパク質が複数の単離体に由来する、請求項２２に記載の組成物。
  46. 存在しているか、又は発現されているＳＡＲＳタンパク質が少なくとも２つの単離体に由来する、請求項４５に記載の組成物。
  47. 存在しているか、又は発現されているＳＡＲＳタンパク質が少なくとも３つの単離体に由来する、請求項４６に記載の組成物。
  48. 存在しているか、又は発現されているインフルエンザタンパク質が、ＨＡ及び／又はＮＡ及び／又はＭ２である、請求項４０に記載のワクチン。
  49. 存在しているか、又は発現されているインフルエンザタンパク質が、ＨＡ及び／又はＮＡ及び／又はＭ２である、請求項４２に記載のワクチン。
  50. 存在しているか、又は発現されているインフルエンザタンパク質が、１つ又は複数の異なったインフルエンザ株に由来する、請求項４８に記載のワクチン。
  51. 存在しているか、又は発現されているインフルエンザタンパク質が、少なくとも２つの異なったインフルエンザ株に由来する、請求項５０に記載のワクチン。
  52. 存在しているか、又は発現されているインフルエンザタンパク質が、少なくとも３つの異なったインフルエンザ株に由来する、請求項５１に記載のワクチン。
  53. 存在しているか、又は発現されているインフルエンザタンパク質が、１つ又は複数の異なったインフルエンザ株に由来する、請求項４９に記載のワクチン。
  54. 存在しているか、又は発現されているインフルエンザタンパク質が、少なくとも２つの異なったインフルエンザ株に由来する、請求項５３に記載のワクチン。
  55. 存在しているか、又は発現されているインフルエンザタンパク質が、少なくとも３つの異なったインフルエンザ株に由来する、請求項５４に記載のワクチン。
  56. （ａ）１つ又は複数の容器の中にあるＳＡＲＳタンパク質又はＳＡＲＳタンパク質を発現するベクター、及び／又は、（ｂ）１つ又は複数の容器の中にあるインフルエンザタンパク質又はインフルエンザタンパク質を発現するベクター、及び／又は、（ｃ）１つ又は複数の容器の中にある肺炎タンパク質又は肺炎タンパク質を発現するベクターを含む、請求項２２に記載の組成物を調製するためのキットであって、該キットが組成物、及び／又は成分の混合物を投与するための説明書を任意選択で含有し、且つ、該容器が任意選択で同一の包装の中にあるキット。
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