DK175114B1 - Rekombinant DNA-molekyle, værtscelle transformeret dermed og fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid ved anvendelse af det rekombinante DNA-molekyle - Google Patents

Description

i DK 175114 B1

Den foreliggende opfindelse angår et rekombinant DNA-molekyle, en værtscelle transformeret dermed og en fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid ved anvendelse af det rekombinante DNA-molekyle. Polypeptidet er anvendeligt

V

5 til vaccinering af dyr mod PRV, og det rekombinante DNA-molekyle er egnet til eksprimering af PRV-glycoproteinerne, som kodes deraf.

Pseudorabies-virus (PRV) er en sygdom, som angriber mange dyrearter over hele verden. PRV-infektioner 10 betegnes afvekslende paralysis bulbaris infectiosa,

Aujeszky's sygdom og "mad itch". Infektioner kendes hos 1 vigtige husdyr, såsom svin, kvæg, hunde, katte, får, rotter og mink. Værtsdyr-området er meget bredt og omfatter de fleste pattedyr og, i det mindste eksperimentelt, 15 mange fuglearter (vedrørende en detaljeret liste over værtsdyr, se D.P. Gustafson, "Pseudorabies", in Diseases of Swine, 5. udg., A.D. Leman et al.,eds., (1981)). For de fleste inficerede dyr er sygdomme dødelig. Voksne svin og muligvis rotter dør imidlertid ikke af sygdommen og er 20 derfor bærere.

Svinebesætninger er særlig udsatte for PRV. Selv om de voksne svin sjældent udviser symptomer eller dør af sygdommen, bliver smågrise akut ;syge, når de smittes, og de dør sædvanligvis i løbet af 24-48 timer, ofte uden spe-25 cifikke kliniske tegn (T.C. Jones og R.D. Hunt, Veterinary Pathology, 5. udg., Lea & Febiger (1983)).

PRV-vacciner er blevet fremstillet ved forskellige metoder, og vaccination i endemiske områder af Europa er blevet praktiseret i mere end 15 år. Tabene er blevet ned-30 sat ved vaccinationen, men vaccinationen har bibeholdt virusset i miljøet. Der er ikke blevet fremstillet nogen vaccine, som vil forhindre infektion. Vaccinerede dyr, som udsættes for virulent virus, overlever infektionen og udskiller derefter mere virulent virus. Vaccinerede dyr 35 kan derfor huse en latent infektion, som kan blusse op igen (se D.P. Gustafson, ovenfor).

2 DK 175114 B1

Levende svækkede og inaktiverede vacciner mod PRV er tilgængelige i handelen i USA og er blevet godkendt af USDA (Se C.E. Aronson, ed., Veterinary Pharmaceuticals & Biologicals, (1983)).

5 PRV er et herpesvirus. Herpesvira er generelt blandt de mest komplekse af dyre-vira. Deres genomer koder mindst 50 virus-specifikke proteiner og indeholder over 150.000 nucleotider. Blandt de mest immunologisk reaktive proteiner af herpesvira findes glycoproteinerne 10 blandt andet i virion-membraner og membranerne af inficerede celler. Litteraturen vedrørende PRV-glycoproteiner refererer til mindstfire virale glycoproteiner (T. Ben--Porat og A.S. Kaplan, Virology £1, 265-73 (1970); A.S. Kaplan og T. Ben-Porat, Proc. Natl. Acad. Sci.

15 USA 66, 799-806 (1970)).

M.W. Wathen og L.K. Wathen, J. Virol. 51, 57-62 (1984) refererer til et PRV, der indeholder en mutation i ét viralt glycoprotein (gp50), og en fremgangsmåde til selektering af mutanten under anvendelse 20 af neutraliserende monoclonalt antistof rettet mod gp50. Wathen og Wathen anfører også, at et monoclonalt antistof rettet mod gp50 er en stærk neutraliserende faktor for PRV, med eller uden hjælp af komplement, og at polyvalent immunserum er særdeles reaktivt mod gp50, 25 0g konkluderer derfor, at gp50 kan være et af de vigtige PRV-immunogener. På den anden side er det blevet rapporteret, at monoclonale antistoffer, som reagerer med kappe-glycoproteinet med en molekylvægt på 98.000, neutraliserer PRV-infektionsevnen, men at monoclonale an-30 tistoffer rettet mod nogle af de andre membran-glycoproteiner har meget lille neutraliserende aktivitet (H. Hampi et al., J. Virol. 52, 583-90 (1984); og T. Ben-Porat og A.S. Kaplan, "Molecular Biology of Pseudorabies Virus", i B. Roizman ed., The Herpesviruses, 35 3, s. 105-73 (1984)) .

3 DK 175114 B1 L.M.K. Wathen et al., Virus Research 4, 19-29 (1985 beskriver fremstilling og karakterisering af mono-clonale antistoffer rettet mod PRV-glycoproteiner identificeret som gp50 og gp83 og deres anvendelse til pas-5 siv immunisering af mus mod PRV-infektion.

A.K. Robbins et al., "Localization of a Pseudorabies Virus Glycoprotein Gene Using an E. coli Expression Plasmid Library", i Herpesvirus, s. 551-61 (1984) beskriver konstruktion af et bibliotek af 10 E. coli-plasmider indeholdende PRV-DNA. De beskriver også identifikation af et PRV-gen som koder glycoproteiner med en molekylvægt på 74.000 og 92.000. De beskriver ikke glycoproteinerne fremstsillet ifølge den foreliggende opfindelse.

15 A.K. Robbins et al., EP-patentansøgning nr.

85400704.4 (publikation nr. 162.738) beskriver isolering, cloning og eksprimering af PRV-glycoproteiner, der identificeres som gll og gill. De beskriver ikke PRV-glyco-proteinerne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse.

20 T.C. Mettenleiter et al., "Mapping of the Struc tural Gene of Pseudorabies Virus Glycoprotein A and Identification of Two Non-Glycosylated Precursor Polypeptides", J. Virol. 53, 52-57 (1985), beskriver kortlægning af det kodende område af glycoprotein gA 25 (som de ligestiller med gi) til BamHI-7-fragmentet af PRV-DNA. De anfører også, at BamHI-7-fragmentet koder for mindst tre andre virale proteiner med en molekylvægt på 65.000, 60.000 og 40.000. De beskriver eller antyder ikke DNA-sekvensen, som koder glycoproteinerne ifølge den fore-30 liggende opfindelse, eller fremstillingen af sådanne poly-peptider ved rekombiramte DNA-metoder.

B. Lomniczi et al., "Deletions in the Genomes of Pseudorabies Virus Vaccine Strains and Existence of Four Isomers of the Genomes", J. Virol. 4^, 970-79 5 (1984) beskriver PRV-vaccine-stammer, som har udeladelser i den særlige korte sekvens mellem 0,855 og 0,882 kort- 4 DK 175114 B1 -enheder. Dette er i nærheden af gi-genet. T.C. Metten-leiter et al., "Pseudorabies Virus Avirulent Strains Fail to Express a Major Glycoprotein", J. Virol. 56, 307-11 (1985), har demonstreret, at tre kommercielle PRV-5 -vaccine-stammer mangler glycoprotein gi. Det har også for nylig vist sig, at Bartha-vaccine-stammen indeholder en udeladelse af det meste af gp63-genet.

T.J. Rea et al., J. Virol. 5±, 21-29 (1985), beskriver kortlægning og sekvensbestemmelse af genet for 10 PRV-glycoproteinet, som akkumuleres i mediet af inficerede celler (gX). Blandt de flankerende sekvenser af gX-genet, som er vist deri, er en lille del af gp50-se-kvensen, der specifikt begynder ved base nummer 1682 i fig. 6 deri. Denne sekvens blev imidlertid ikke iden-15 tificeret som gp50-sekvensen. Endvidere er der fejl i sekvensen publiseret af Rea et al. Baserne 1586 og 1603 skal udelades. Baserne skal indføres mellem baserne 1708 og 1709, baserne 1737 og 1738, baserne 1743 og 1744 og baserne 1753 og 1754. Konsekvensen af disse fejl 2o i den publi serede delvise sekvens af gp50 er en læserammeforskydning. Translation af den åbne læseramme, der begynder ved AUG-startstedet, vil give en ukorrekt |_aminosyresekvens for gp50-glycoproteinet.

EP-patentpublikation nr. 133.200 beskriver en diag-25 nostisk antigen faktor, der skal anvendes sammen med visse lectin-bundne PRV-glycoprotein-underenheds-vacciner til at skelne mellem bærere af PRV og ikke-bærere af PRV.

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes et rekombinant DNA-molekyle indeholdende en DNA-sekvens kodende 30 for et polypeptid, der udviser pseudorabiesvirus-(PRV)-glyco-protein-gp50-immunogenitet, hvor den nævnte DNA-sekvens er operativt forbundet med en ekspressionskontrolsekvens, hvorved DNA-sekvensen, der koder for polypeptidet, er valgt blandt sekvensen, der koder for gp50, og som er 35 5 DK 175114 B1

'AIG CTG CTC GCA GCG CIA TTG GCG GCG CTG GTC GCC CGG ACG ACG CTC OGT GCG

GAC CTG GAC GCC GIG CCC GCG· CCG ACC TTC CCC CCG CCC GCG TAC CCG TAC ACC

GAG TCG TGG CAG CTG ACG CTG ACG ACG GTC CCC TCG CCC TTC CTC GGC CCC GCG

GAC CTC TAC CAC ACG CGC CCG CTG GAG GAC CCG TGC GCG GTG CTG GCG CTG ATC

,TCC GAC CCG CAG GTG GAC CGG CTG CTG AAC GAG GCG GTG GCC CAC CGG CGG CCC

ACG TAC CGC GCC CAC CTG GCC TGG TAC CGC ATC GCG GAC GGG TGC GCA CAC CTG

CTG TAC TTT ATC GAG TAC GCC GAC TGC GAC CCC AGG CAG GTC TTT GGG CGC TGC

CGG CGC CGC ACC ACG CCG ATG TGG TGG ACC CCG TCC GCG GAC TAC ATG TTC CCC

1Q ACG GAG GAC GAG CTG GGG CTG CTC ATG CTG GCC CCG GGG CGG TTC AAC GAG GGC

CAG TAC CGG CGC CTG GTG TCC CTC GAC GGC CTG AAC ATC CTC ACC GAC TTC ATG

CTG GCG CTC CCC GAG GGG CAA GAG TGC CCG TTC GCC CGC GTG GAC CAG CAC CGC

ACG TAC AAG TTC GGC GCG TGC TGG AGC GAC GAC AGC TTC AAG CGG GGC CTG GAC

CTG ATG CGA TTC CTG ACG CCG TTC TAC CAG CAG CCC CCG CAC CGC GAG GTG CTG

15 AAC TAC TGG TAC CGC AAG AAC GGC CGG ACG CTC CCG CGG GCC CAC GCC GCC GCC ·

ACG CCG TAC GCC ATC GAC CCC GCG CGG CCC TCG GCG GGC TCC CCG ACG CCC CGC

CCC CGG CCC CCG CCC CGG CCC CGG CCG AAG CCC GAG CCC GCC CCG GCG ACG CCC

'GCG CCC CCC GAC OGC CTG CCC GAG CCG GCG ACG CGG GAC CAC GCC GCC GGG GGC

CGC CCC ACG CCG CGA CCC CCG AGC CCC GAG ACG CCG CAC OGC CCC TTC GCC CCG

2 0 CCG GCC GTC GTG CCC AGC GGG TGG CCG CAG CCC GCG GAG CCG TTC CAG CCG CGG

ACC CCC GCC GCG CCG GGC GTC TCG CGC CAC CGC TCG GTG ATC CTC GGC ACG CGC

ACC GCG ATG GGC GCG CTC CTG CTG GGC GTG TGC GTC TAC ATC TIC TTC CGC CTG

AGG GGG GCG AAG GGG TAT CGC CTC CTG GGC GCT CCC GCG GAC GCC GAC GAG CIA

AAA GCG CAG CCC GGT CCG TAG, 25 og fragmenter deraf, som koder for polypeptider, der udviser PRV-antigenitet.

Desuden tilvejebringes der ifølge den foreliggende opfindelse en værtscelle transformeret med et rekombinant DNA-molekyle ifølge opfindelsen.

30 Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid, der udviser PRV-gp50-antigenitet, omfattende: (a) fremstilling af et rekombinant DNA-molekyle, hvor molekylet indeholder en DNA-sekvens, der koder for et 35 polypeptid, som udviser PRV-gp50-antigenitet, hvor den nævnte DNA-sekvens er operativt forbundet med en ekspressionskon- 6 DK 175114 B1 trolsekvens, (b) transformering af en passende værtscelle med det nævnte rekombinante DNA-molekyle, (c) dyrkning af den nævnte værtscelle, og 5 (d) opsamling af polypeptidet, hvorved DNA-sekvensen er valgt blandt gp50-sekvensen, som er

10 ATG CTG CTC GCA GCG CTA TTC GCC GCC CTC CTC GCC CGC ACG ACG CTC GCT GCC

GAC GTG GAC GCC GTG CCC GCG CCG ACC TTC CCC CCG CCC GCG XAC CCG TAC ACC

GAG TCG TGC CAG CTG ACG CTG ACG ACG GTC CCC TCG CCC TTC GTC GGC CCC GCG

GAC GTC TAC CAC ACG CGC CCG CTG GAG GAC CCG TGC GCG GTG GTG GCG CTG AIC

TCC GAC CCG CAG GTG GAC CGG CTG CTG MC GAG GCG GTG GCC CAC CGC CCG CCC

15 ACG TAC CGC GCC CAC GTG GCC TCG TAC CGC AIC GCG GAC GGG TCC GCA CAC CTG

CTG TAC TIT AIC GAG TAC GCC GAC TGC GAC CCC ACG CAG GTC ITT GGG CGC TGC

CGG CGC CGC ACC ACG CCG ATG TGG TCG ACC CCG TCC GCG GAC TAC ATG TTC CCC

ACG GAG GAC GAG CTG GGG CTG CTC ATG GTG GCC CCG GGG CGG TTC AAC GAG GGC

CAG TAC CGG CGC CTG GTG TCC CTC GAC GGC CTG AAC AIC CTC ACC GAC TTC ATG

20 GTG CCG GTC CCC GAG GGG CAA GAG TGC CCG TTC GCC CGC GTG GAC CAG CAC CGC

ACG TAC AAG TTC GGC GCG TGC TGG AGC GAC GAC ACC TTC AAC CGG GGC GTG GAC

GTG ATG OGA TTC CTG ACG CCG TTC TAC CAG CAG CCC CCG CAC CGG GAG GTG GTG

AAC TAC TGG TAC CGC AAG AAC GGC CGG ACG CTC CCC CGG GCC CAC GCC GCC GCC

ACG CCG TAC GCC AIC GAC CCC GCG CGG CCC TCG GCG GGC TCG CCG AGG CCC CGG

25 CCC CGG CCC CGG CCC CGG CCC OGG CCG AAG CCC GAG CCC GCC CCG GCG ACG CCC

GCG CCC CCC GAC CGC CTG CCC GAG CCG GCG ACC CGG GAC CAC GCC GCC GGG GGC

CGC CCC ACG CCG CGA CCC CCG AGG CCC GAG ACG CCG CAC CGC CCC TTC GCC CCG

CCG GCC GTC GTG CCC AGC GGG TGG CCG CAG CCC GCG GAG CCG TTC CAG CCG CGG

30 ACC CCC GCC GCG CCG GGC GTC TCG CGC CAC CGC TCG GTG ATC GTC GGC ACG GGC

ACC GCG ATG CGC GCG CTC CTG CTG GGC GIG TCC GTC TAC ATC TTC TTC CGC CTG

AGG GGG GCG AAG GGG TAT CGC CTC CTG GGC GGT CCC GCG GAC GCC GAC GAG CTA

AAA GCG CAG CCC GGT CCG TAG, og fragmenter deraf, som koder for polypeptider, der udviser 35 pseudorabiesvirus-antigenitet.

7 DK 175114 B1 Nærmere bestemt tilvejebringes der ifølge den foreliggende opfindelse polypeptider med formlerne, der er anført på blad A, B og C, immunogene fragmenter deraf og immunologisk funktionelle ækvivalenter deraf.

:5 Polypeptiderne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse koder for pseudorabies-virus-glycoproteinet gp50 eller immunogene fragmenter og er anvendeligt til at beskytte dyr mod PRV-infektion ved vaccinering af disse med disse polypeptider.

10 Med det omhandlede rekombinante DNA-molekyle, den omhandlede værtscelle og den omhandlede fremgangsmåde muliggøres for første gang fremstilling ved rekombinant DNA-teknik af gp50-polypeptid og fragmenter deraf, som er nyttige til fremstilling af vacciner, og der opnås de muligheder og 15 fordele, som er omtalt senere i beskrivelsen (side 9).

Eksistensen og placeringen af genet, der koder for glycoproteinet gp50 af PRV er demonstreret af M.W. Wathen og L.M. Wathen, se ovenfor.

Glycoproteinet, som kodes af genet, er defineret 20 som et glycoprotein, der reagerer med et bestemt mono- clonalt antistof. Dette glycoprotein svarer ikke til nogen , af de hidtil kendte PRV-glycoproteiner. Wathen og Wa-then <har kortlagt en mutation, som er resistent mod det mono-clonale antistof, som på basis af fortilfælde i herpes 25 simplex-virus (f.eks. T.C. Holland et al., J. Virol 52, 566-74 (1984)), kortlægger placeringen af det strukturelle gen for gp50. Wathen og Wathen har kortlagt gp50--genet til det mindre Sall/BamHI-fragment inden i BamHI-7-fragmentet af PRV. Rea et al., se ovenfor, har 30 kortlagt PRV-glycoprotein-gX-genet til det samme område.

Som ovenfor nævnt placeres genet, der koder for gp50, i BamHI-7-fragmentet af PRV-DNA. BamHI-7-fragmentet af PRV kan afledes af plasmidet pPRXhl (også kendt som pUC1129), og fragmenter, der er bekvemme til DNA-sekvensanalyse, kan 35 fås ved standard-subcloningsprocedurer. Plasmidet pUC1129 kan fås fra E. coli HB101, NRRL B-15772. Denne kultur er 8 DK 175114 B1 tilgængelig fra den permanente samling hos Nothern Regional Research Center Fermentation Laboratory (NRRL), U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, U.S.A.

E. coli HB101 indeholdende pUC1129 kan dyrkes i 5 L-næringsmedium ved velkendte procedurer. Typisk dyrkes kulturer til en optisk tæthed på 0,6, hvorefter der tilsættes chloramphenicol, og kulturen henstilles under omrystning natten over. Kulturen lyseres derefter f.eks. ved anvendelse af SDS med høj saltkoncentration, og 10 den ovenstående væske underkastes en casiumchlorid/-ethidiumbromid-ligevægtsdensitetsgradientcentrifugering, hvorved plasmiderne fås.

• Tilgængeligheden af denne gensekvens muliggør direkte manipulering af genet og gensekvensen, hvilket tillader 15 modifikationer af reguleringen af ekspressionen og/eller strukturen af proteinet kodet af genet eller et fragment deraf. Kendskabet til denne gensekvens gør det også muligt at clone det tilsvarende gen eller fragment deraf fra enhver stamme af PRV under anvendelse af den kendte sekvens som 20 hybridiseringssonde og at eksprimere hele proteinet eller et fragment deraf ved rekombinante metoder, der er almindeligt kendte.

Kendskabet til denne gensekvens har gjort det muligt at udlede aminosyresekvensen af det tilsvarende polypeptid 25 (kort A). Som resultat heraf kan fragmenter af disse poly- peptider med PRV-imunogenitet fremstilles ved standardmetoder til proteinsyntese eller rekombinante DNA-metoder. Som anvendt i den foreliggende beskrivelse anvendes udtrykkene immunogenitet og antigenitet afvekslende om evnen til at 30 stimulere enhver type af adaptiv immunreaktion, dvs. udtrykkene antigen og antigenitet er ikke i betydning begrænset til stoffer, der stimulerer produktionen af antistoffer.

Den primære struktur (sekvens) af genet, der koder for gp50, er også anført i kort A.

35 Genet eller fragmenterne deraf kan udvindes fra pUC1129 ved nedbrydning af plasmid-DNA'et fra en kultur af 9 DK 175114 B1 NRRL B-15772 med passende endonuclease-restriktionsenzymer.

F.eks. kan BamHI-7-fragmentet isoleres ved nedbrydning af et præparat af pUC1129 med BamHI og isoleres ved gelelektro-forese.

5 . Alle restriktions-endonucleaserne, som er omtalt i den foreliggende beskrivelse, er kommercielt tilgængelig, og deres anvendelse er velkendt. Brugsanvisninger gives i almindelighed af de kommercielle leverandører af restriktionsenzymerne.

10 Det udskårne gen eller fragmenter deraf kan li geres til forskellige cloningsbærere eller vektorer til , anvendelse ved transformering af en værtscelle. Vekto- rerne indeholder fortrinsvis DNA-sekvenser til at starte, kontrollere og afslutte transcription og translation 15 (som tilsammen udgør ekspression) af PRV-glycoprotein--generne og er derfor operativt forbundet dermed. Disse "ekspressionskontrolsekvenser" er fortrinsvis forenelige med værtscellen, der skal transformeres. Når værtcellen er en celle af et højere dyr, f.eks. en pattedyrcelle, 20 kan de naturligt forekommende ekspressionskontrolsekvenser af glycoprotein-generne anvendes alene eller sammen med heterologe ekspressionskontrolsekvenser. Heterologe sekvenser kan også anvendes alene. Vektorerne indeholder yderligere fortrinsvis et markørgen (f.eks. antibioti-25 kumresistens), således at der fås et fænotypisk træk til selektion af transformerede værtsceller. Desuden vil en replikerende vektor indeholde et replicon.

Typiske vektorer er plasmider, fager og vira, der inficerer dyreceller. Der kan i det væsentlige an-30 vendes enhver DNA-sekvens, som er i stand til at transformere en værtscelle.

Ved udtrykket "værtscelle" som anvendt i den foreliggende beskrivelse menes en celle, der er i stand til at blive transformeret med DNA-sekvensen, der koder for et 35 polypeptid, som udviser PRV-glycoprotein-antigenitet.

Fortrinsvis er værtscellen i stand til at eksprimere PRV-polypeptidet eller fragmenter deraf. Værtscellen kan være prokaryotisk eller eukaryotisk. Illustrerende pro-

DK 175114 B1 I

io I

karyotiske celler er bakterier, såsom E. coli, B. sub- I

tilis, pseudomonas og B. stearothermofilus. Illustre- I

rende eukaryotiske celler er gærceller eller celler af I

højere dyr, såsom celler fra insekter, planter eller pat- I

5 tedyr. Pattedyr-cellesystemer vil ofte foreligge i form I

af monolag af celler, selv om pattedyrcelle-suspensioner I

også kan anvendes. Pattedyr-cellelinier omfatter f.eks. I

I Vero og HeLa-celler, kinesisk hamster-ovarie-cellelinier I

I (ChO-cellelinier), WI38-, BHK-, C0S-7- eller MDCK- I

I 10 -cellelinier. Insekt-cellelinier omfatter Sf9-linien af I

I Spodoptera frugiperda (ATCC CRL1711). En sammenfatning I

I af nogle tilgængelige eukaryotiske plasmider, værts- I

I celler og metoder til anvendelse af disse til cloning I

I og ekspression af PRV-glycoproteiner kan findes i I

I 15 K. Esser et al., Plasmids of Eukaryotes (Fundamentals I

I and Applications), Springer-Verlag (1986) . I

I Som ovenfor anført indeholder vektoren, f.eks. I

I et plasmid, som anvendes til at transformere værtscellen, I

I fortrinsvis forenelige ekspressionskontrolsekvenser til I

I 20 I

I ekspression af PRV-glycoprotein-genet eller fragmenter der- I

I af. Ekspressionskontrolsekvenserne er derfor operativt I

I forbundet med genet eller fragmentet. Når værtscellerne I

I er bakterier, omfatter illustrerende anvendelige eks- I

I pressionskontrolsekvenser trp-promotoren og -operatoren I

I (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8, 4057 (1980)); lac- I

I -promotor og -operator (Chang et al., Nature 275, 615 I

I (1978)) ; ydre membran protein promotor (EMBO J. 1, I

I 771-775 (1982)); bakteriofag /1 -promotorer og -ope- I

I ratorer (Nucl. Acids Res. 11, 4677-4688 (1983)); α-amy- I

I 2 0 I

I lase (B. subtilis) promotor og -operator. Terminerings- I

I sekvenser og andre ekspressionsfremmende og -kontrolle- I

I rende sekvenser, som er forenelige med den valgte værts- I

I celle. Når værtscellen er gær, omfatter illustrerende I

I anvendelige ekspressionskontrolsekvenser f.eks. α-mating I

I 35 I

11 DK 175114 B1 faktor. Til insektceller kan polyhedrin-promotoren af baculovira anvendes (Mol. Cell. Biol. 3^, s. 2156-65 (1983)) . Når værtscellen stammer fra insekter eller pattedyr, omfatter illustrerende anvendelige ekspres-5 sionskontrolsekvenser f.eks. SV-40 promotor (Science 222, 524-527 (1983)) eller f.eks. metallothionein--promotor (Nature 296, 39-42 (1982)) eller en varme-chok-promotor (Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 8_2, s. 4949-53 (1985)). Som ovenfor anført kan man, 10 når værtscellen er en pattedyrcelle, anvende ekspressionskontrolsekvenserne for PRV-glycoprotein-genet, men fortrinsvis i kombination med heterologe ekspressionskontrolsekvenser .

Plasmidet eller replikerende eller integrerende 15 DNA-materiale indeholdende ekspressionskontrolsekvenserne spaltes under anvendelse af restriktionsenzymer, størrelses-justeres i nødvendigt eller ønskeligt omfang og ligeres med PRV-glycoprotein-genet eller fragmenter deraf ved velkendte metoder. Når der anvendes gær-værtsceller 20 eller værtsceller af højere dyr, kan polyadenylerings- eller terminatorsekvenser fra kendte gær- eller pattedyrgener inkorporeres i vektoren. Der kan f.eks. anvendes kvæg-væksthormon-polyadenyleringssekvensen som anført i EP-patentpublikation nr. 93.619. Desuden kan gensekven-25 ser til kontrol af replikationen af værtscellen inkorporeres i vektoren.

Værtscellerne er kompetente eller gøres kompetente til transformation på forskellig måde. Når bakterieceller er værtsceller, kan de gøres kompetente ved 20 behandling med salte, typisk et calciumsalt, som generelt beskrevet af Cohen, PNAS, 69, 2110 (1972). En gær--værtscelle gøres i almindelighed kompetent ved fjernelse af dens cellevæg eller på anden måde, f.eks. ved ionisk behandling (J. Bacteriol. 153, 163-168 (1983)).

35 12 DK 175114 B1

Der findes flere velkendte metoder til indføring af DNA i dyreceller, herunder f.eks. calciumphosphat-præci-pitation, fusion af de modtagende celler med bakterie--protoplaster indeholdende DNA'et, behandling af de 5 modtaqende celler med liposomer indeholdende DNA'et og mikroinjektion af DNA'et direkte i cellerne.

De transformerede celler opformeres ved velkendte metoder (Molecular Cloning, T. Maniatis et al.,

Cold Spring Harbor Laboratory, (1982); Biochemical 10 Methods In Cell Culture And Virology, R.J. Kuchler,

Dowden, Hutchinson og Ross, Inc., (1977); Methods In Yeast Genetics, F. Sherman et al., Cold Spring Harbor Laboratory, (1982)) og det eksprimerende PRV-glyco-protein eller fragmentet deraf høstes fra cellemediet 15 i de systemer, hvor proteinet udskilles fra værtscellerne, eller fra cellesuspensionen efter brydning af værtscellesystemet ved f.eks. velkendte mekaniske eller enzymatiske metoder.

Som ovenfor anført er aminosyresekvensen af PRV-glyco-20 proteinet som afledt af genstrukturen anført i kort A. Poly-peptider, som udviser PRV-glycoprotein-antigenitet, omfatter sekvensen anført i kort A og enhver del af polypeptidsekven-sen, som er i stand til at fremkalde en immunreaktion hos et dyr, f.eks. et pattedyr, som har modtaget en injektion 25 af polypeptidsekvensen.

Som ovenfor anført kan hele genet, der koder for PRV-glycoproteinet, anvendes til at konstruere vektorerne og transformere værtscellerne til ekspression af PRV-glycoproteinet, eller der kan anvendes fragmenter 30 af genet, som koder for PRV-glycoproteinet, hvorved den resulterende værtscelle vil eksprimere polypeptider, der udviser PRV-antigenitet. Ethvert fragment af PRV-glyco- 35 13 DK 175114 B1 protein-genet kan anvendes, hvilket resulterer i ekspression af et polypeptid, som er et immunogent fragment af PRV-glycoproteinet eller en analog deraf. Som dfet er velkendt, muliggør degenerationen af den genetiske kode let 5 substitution af basepar til dannelse af funktionelt ækvivalente gener eller fragmenter deraf, som koder polypeptider , der udviser PRV-glycoprotein-antigenitet. Disse funktionelle ækvivalenter er også omfattet af opfindelsen.

Kort D-L er anført for at illustrere konstruk- 10 tionerne ifølge eksemplerne. Der anvendes bestemte konventioner til illustrering af plasmider og DNA-fragmenter på følgende måde: (1) Figurerne med en enkelt linie viser både cirkulært og lineært dobbeltstrenget DNA.

15 (2) Stjerner viser, at det viste molekyle er cirkulært.

Hvis der ikke er anført en stjerne, er molekylet lineært.

(3) Endonuclease-restriktionssteder af interesse er anført over linien.

(4) Gener er anført under linien.

20 (5) Afstandene mellem gener og restriktionssteder er ikke i korrekt målestok. Figurerne viser kun de relative positioner, medmindre andet er anført.

De fleste af de rekombinante DNA-metoder, der anvendes ved udøvelsen af den foreliggende opfindelse, er 25 standardprocedurer, der er velkendte af fagmanden og f.eks. beskrevet detaljeret i Molecular Cloning, T.

Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, (1982) og B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning,

John Wiley & Sons (1984).

30 35 DK 175114 B1

Eksempel 1

O

14 I dette eksempel beskrives sekvensbestemmeIsen, cloningen og ekspressionen af PRV-glycoproteinet gp50.

5 1. Sekvensbestemmelse af gp50-genet.

BamHI-7-fragmentet af PRV-Rice-stamme-DNA (kort D), som koder gp50-genet, isoleres fra pPRXhl (NRRL B-15772), ovenfor, og subclones i BamHI-stedet af plasmid pBR322 (Maniatis et al., ovenfor).

10 Idet der henvises til kort E, subclones frag mentet yderligere under anvendelse af standardprocedurer ved nedbrydning af BamHI-7 med PvuII, isolering af de to BamHI/PvuII-fragmenter (1,5 og 4,9 kb) og subcloning af disse mellem BamHl- og PvuII-stederne af pBR322 til 15 dannelse af plasmiderne pPR28-4 og pPR28-l, der henholdsvis indeholder 1/5 kb og 4,9 kb fragmenterne (se også Rea et al., ovenfor). Disse subcloner anvendes som kilder til DNA til DNA-sekvensbestemmelsesforsøg.

Kort F viser forskellige restriktionsenzym-spalt-20 ningssteder, som er placeret i gp50-genet og de flankerende områder. De ovenfor subclonede fragmenter på 1,5 og 4,9 kb nedbrydes nted disse restriktionsenzymer. Hver af enderne dannet af restriktionsenzymerne mærkes med 32 J- · P-ATP under anvendelse af polynucleotid-kinase 25 og underkastes sekvensbestemmelse ved metoden ifølge

Maxam og Gilbert, Methods Enzymol. 65^ 499-560 (1980).

Hele genet sekvensbestemmes mindst to gange på begge strenge. DNA-sekvensen af gp50 er anført i kort A. Dette DNA kan anvendes til påvisning af dyr, der er aktivt 30 inficeret med PRV. Man kan f.eks. tage en næse- eller hals-podepind og derefter gennemføre DNA/DNA-hybri-dis'ering ved standardmetoder til påvisning af tilstedeværelsen af PRV.

35

O

15 DK 175114 B1 2. Ekspression af gp50.

Idet der henvises til kort G, er et Narl-spalt-ningssted placeret 35 basepar ovenfor gp50-gen-startcoctonet.

Det første trin af ekspressionen er indføring af det be-5 kvemme BamHI-spaltningssted på stedet for NarI-spaltningsstedet. Plasmidet pPR28-4 ovenfor nedbrydes med restriktionsendonucleasen Narl til dannelse af DNA-frag-ment 3 indeholdende den N-terminus-kodende ende af gp50-genet og en del af gX-genet. BamHI-linkere tilføjes 10 til fragmentet 3, og fragmentet nedbrydes med BamHI

til fjernelse af gX-sekvensen, hvorved der fås fragment 4. BamHI-enderne ligeres derefter til dannelse af plasmidet pPR28-4 Nar2.

I kort H er der vist samlingen af det komplette 15 gp50-gen. pPR28-4 Nar2 nedbrydes med BamHI og PvuII til dannelse af fragment 5 (160 bp) indeholdende den N-terminale kodende del af gp50-genet. Plasmidet pPR28-l ovenfor nedbrydes også med PvuII og BamHI til dannelse af et 4,9 kb-fragment indeholdende den C-terminale kodende del 20 af gp50-genet (fragment 6). Plasmidet pPGXl (konstrueret som anført i US-patentansøgning nr. 760.130) eller, alternativt, plasmidet pBR322 nedbrydes med BamHI, behandles med bakteriel basisk phosphatase (BAP) og ligeres derefter med fragmenterne 5 og 6 til dannelse af 25 plasmidet pBGP50-23, som indeholder det komplette gp50- -gen.

I kort I er der vist fremstillingen af plasmidet pD50. Plasmidet pBG50-23 spaltes med restriktionsenzymet Maelll (K. Schmid et al., Nucl. Acids Res., 12, 30 2619 (1984) til dannelse af en blanding af fragmenter.

Maelll-enderne gøres stumpe med T4-DNA-polymerase, og der tilføjes EcoRI-linkere til de stumpe ender og gennemføres derefter en EcoRI-nedbrydning. De resulterende fragmenter spaltes med BamHI, og et 1,3 kb BamHI/EcoRI-frag-35

O

16 DK 175114 B1 ment indeholdende gp50-genet (fragment 7) isoleres. Plas-midet pSV2dhfr (fra American Type Culture Collection,

Bethesda Research Laboratories, eller syntetiseret ved metoden ifølge S, Subramani et al., Mol. Cell. Biol.

5 2, s. 854-64 (1981)) nedbrydes med BamHI og EcoRI, og det store fragment (5,0 kb) isoleres til dannelse af fragment 8 indeholdende dihydrofolat-reductase-markøren (dhfr) . Fragmenterne 7 og 8 ligeres derefter til dannelse af plasmidet pD50 indeholdende gp50-genet og dhfr-10 -markøren.

Idet der henvises til kort J, tilføjes den umiddelbare tidlige promotor fra humant cytomegalovirus, Towne-stamme, ovenfor gp50-genet. pD50 nedbrydes med BamHI og behandles med bakteriel basisk phosphatase 15 til dannelse af fragment 9. Et 760 bp Sau3A-fragment indeholdende den umiddelbare tidlige promotor af humant cytomegalovirus (Towne) isoleres ved proceduren anført i US-patentansøgning nr. 758.517 til dannelse af fragmentet 10 (se også D.R. Thomsen et al., Proc. Natl.

20 Acad. Sci. USA 83., s. 659-63 (1984)). Disse fragmenter ligeres derefter ved en BamHI/Sau3A-fusion til dannelse af plasmidet pDIE50. For at bekræfte, at promotoren er i korrekt orientering til transkriberinq af gp50-genet, nedbrydes plasmidet med SacI og PvuII, og der dannes et 25 185 bp fragment.

Idet der henvises til kort K, isoleres 0,6 kb PvuII/EcoRI-f ragmente t indeholdende kvæg-vask s thormon --polyadenyleringssignalet fra plasmidet pGH2R2 (R.P.

Woychik et al., Nucl. Acids Res. .10, s. 7197-7210 30 (1982) ved nedbrydning med PvuII og EcoRI eller fra pSVCOW7 (se ovenfor) til dannelse af fragment 11.

Fragment 11 dones mellem EcoRI- og Smal-spalt- ningsstederne af pUC9 (fra Pharmacia/PL eller ATCC) til dannelse af pCOWTl. pCOWTl spaltes med Sall, enderne 35 17 DK 175114 B1 o gøres stumpe med T4-DNA-polymerase, der tilføjes EcoRI-linkere, DNA'et spaltes med EcoRI, og 0,6 kb fragmentet (fragment 12) isoleres. Dette er det samme som fragment 11, bortset fra at det har to EcoRI-ender og en 5 polylinker-sekvens ved en ende.

Plasmid pDIE50 spaltes med EcoRI, og fragment 12 klones deri til dannelse af plasmid pDlB50PA. Nedbrydning med BamHI og PvuII giver et fragment på 1,1 kb, når polyadenylerings-signalet har korrekt orientering.

10 Plasmidet kan også konstrueres ved kloning i polyade-nyleringssekvensen før promotoren.

Plasmidet pDIE50PA anvendes til transfektion af ChO dhfr -celler (DXB-11, G. Urlaub og L.A. Chasin,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA TJ_, s. 4216-20 (1980)) ved 15 calciumphosphat-co-præcipitation med laksemælk-bærer- -DNA (F.L. Graham og A.J. Van Der Eb, Virol. 52, s. 456-67 (1973)). De dihydrofolat-reduktase-positive (dhfr+) transficerede celler selekteres i Dulbecco's modificerede Eagle's medium plus Eagle's ikke-essen-20 tielle aminosyrer plus 10% kalvefosterserum. Selekterede dhfr+-CHO-celler danner gp50 som påvist ved im- munofluorescens med- anti-gp50-monoklonalt antistof 14 3A-4 eller ved mærkning med C-glucosamin og immuno-præcipitation med 3A-4. Det monoklonale antistof 3A-4 25 fremstilles som beskrevet i U&—patentansøgning nr.

817.429 (indleveret 9. januar 1985). Immunopræcipita-tionsreaktionerne gennemføres som tidligere beskrevet (T.J. Rea et al., ovenfor), bortset fra følgende:

Ekstrakterne inkuberes først med normalt museserum, 30 efterfulgt af vaskede staphylococcus aureiis-celler, og centrifugeres i 30 minutter i en Beckman SW50.1--rotor med 40.000 o/W Efter at ekstrakterne er inkuberet med monoklonalt eller polyklonalt antiserum plus S. aureus-celler, vaskes cellerne tre gange i 10 mM 35 18 DK 175114 B1

O

Tris-HCl, pH-værdi 7,0, 1 mM EDTA, 0,1 M NaCl, 1% NP40 og 0,5% deoxycholat. Analysen af proteinerne gennemføres på 11%'s SDS-polyacrylamidgeler (L. Morse et al., J. ViroL 26.» s· 389-410 (1984)). Ved indledende immuno- 5 fluorescensbestemmelser viser det sig, at 3A-4 reagerer med de pDIE50PA-transficerede CHO-celler, men ikke med ikke-transficerede CHO-celler. Når de transficerede CHO- 14 -celler mærkes med C-glucosamin, immunopræcipiterer 3A-4 et mærket protein fra celler indeholdende pDIE50PA, 10 men ikke fra kontrolceller, der danner humant renin.

Det udfældede protein vandrer på SDS-polyacrylamid-geler sammen med proteinet udfældet af 3A-4 fra PRV--inficerede celler.

En klon af disse transficerede CHO-celler, der 15 producerer gp50, kan dyrkes i rullekolber, høstes i phosphatpufret saltvand plus 1 mM EDTA og blandes med komplet Freund's adjuvans til anvendelse som vaccine.

gp5O-Genet kan også eksprimeres i en Vaccinia--vektor. Ved denne udførelsesform, efter at pBG50-23 20 er nedbrudt med Maelll, og enderne er gjort stumpe med T4-DNA-polymerase, nedbrydes DNA'et med BamHI.

Det stumpendede BamHI-fragment på 1,3 kp indeholdende gp50-genet isoleres. Plasmidet pGS20 (Mackett et al., J. Virol £9, s. 857-64 (1984)) spaltes med BamHI og 25 Smal, og det større 6,5 kb fragment isoleres ved gel- elektroforese. Disse to fragmenter ligeres til dannelse af pW50. Plasmidet pW50 transficeres i CV-l-celler (ATCC CCL 70) inficeret med WR-stammen af Vaccinia--virus (ATCC VR-119) og selekteres for thymidinkinase-30 -negative rekombinanter ved udpladning på 143 celler (ATCC CRL 8303) i 5-bromdeoxyuridin (BUdR) ved metoderne beskrevet af Mackett et al. i DNA Cloning, Volume II: A Practical Approach, D.M. Glover, ed., IRL Press,

Oxford (1985). Det resulterende virus, vaccinia-gp50, 35 19 DK 175114 B1

O

eksprimerer gp50 i inficerede celler som bestemt ved mærkning af proteinerne af den inficerede celle med 14 C-glucosamin og immunopræcipitation med monoklonalt antistof 3A-4.

5

Eksempel 2 I dette eksempel beskrives beskyttelse af mus og svin mod udsættelse for PRV ved anvendelse af gp50 ifølge 10 eksempel 1 som immunogent middel.

I tabel I-III nedenfor gennemføres mikroneutra-lisationsbestemmelsen på følgende måde: Serielle to ganges fortyndinger af serumprøver foretages i mikrotiterplader (Costar) under anvendelse af basalt Eagle-medium (BME) 15 suppleret med 3% kalvefosterserum og antibiotika. Ca.

1000 pfu (50^ul) af PRV sættes til 50^.ul af hver fortynding. Kanin-komplement inkluderes i virusportionen i en fortynding på 1:5 for museserum-bestemmelserne, men ikke i svineserum-bestemmelserne. Prøverne inkuberes i enten 20 1 time (svineserum) eller 3 timer {museserum) ved 37°C.

Efter inkuberingsperioden sættes en portion (50^ul) af svinenyre-15-celler (PK-15) (300.000 celler/ml) i Eagle's minimale essentielle medium til hvert serum pr. PRV--prøve. Prøverne inkuberes derefter ved 37°C i 2 dage.

25 De neutraliserende titere repræsenterer de reciprokke værdier af de højeste fortyndinger, der beskytter 50% af cellerne mod cytopatiske effekter.

Tabel I viser beskyttelsen af mus mod udsættelse for virulent PRV ved immunisering med gp50 produceret 30 i Vaccinia-virus. Musene immuniseres ved hale-ridsning med 25^ul eller ved indgivelse via trædepuderne med 50^ul. Musene immuniseres 28 dage før udsættelsen for virus (idet mus, som har modtaget PR-Vac, immuniseres 14 dage før udsættelsen for virus).

35

Tabel I

20 DK 175114 B1

O

Immunise- Indgi- Neutrali- rende Dosis velsesvej serende % middel (PFU) _ titera) Overlevelse0 5 gp50 3fOxlO7 hale 1024 93 gp50 6,OxlO7 trædepude 1024 100 gp50 7,5xl06 hale 512 93 vacci- 7,5xl06 hale <8 27 nia°) 10 BMEd) - hale <8 20

Pr-Vace^ - trædepude 512 90

Neutraliserende titer mod PRV på dagen på udsættelsen (+ komplement).

15 b) Udsat for 10 x LD^q af PRV-Rice-stamme indgivet intra- peritonealt.

c) Kontrolvirus.

d) Basalt Eagle-medium, negativ kontrol.

e) Norden Laboratories, Lincoln, NE, vaccine af inakti- 2Q veret PRV, positiv kontrol.

Tabel II viser beskyttelsen af mus mod udsættelse for virulent PRV ved immunisering med gp50 produceret i CHO-celler. Musene immuniseres 28 dage, 18 dage og 7 dage 25 før udsættelsen for virus. Musene modtager præparater med adjuvanser subcutant ved første dosis og præparater i saltvand intraperitonealt ved anden og tredje dosis. Hver mus modtager 10^ brudte celler/dosis.

30 35 21 DK 175114 B1

O

Tabel II

Immuniserende Neutraliserende % . .

middel/adjuvans titera)_ overlevelsePJ

gp50/CFAc) 512 100 (10/10) 5 gp50/CFA (2 doser) ikke bestemt 80 (4/5) gp50/IFAd) 1024 90 (9/10) gp50/saltvand 256 100 (3/3) CHO-renine)/CFA <8 10 (1/10)

Ikke behandlet <8 0 (0/10) PR-Vacf) 4096 90 (9/10) a) Neutraliserende titer mod PRV på dagen for udsættelse for virus (+ komplement).

b) Udsat for 30 gange LDcn af PRV-Rice-stamme ved ind- 15 50 givelse via trædepuden.

c) Komplet Freund's adjuvans.

d) Ukomplet Freund's adjuvans.

e) Kontrolceller, som éksprimerer renin.

f) Norden Laboratories, Lincoln, NE, vaccine af inakti- 20 veret PRV, positiv kontrol.

Tabel III viser beskyttelsen af svin mod udsættelse for virulent PRV ved immunisering med gp50 produceret i CHO-celler. Svin immuniseres 21 og 7 dage før udsættelsen 25 η for virus. Svinene modtager 2 x 10 brudte celler pr. dosis.

Den første dosis blandes med komplet Freund's adjuvans, medens den anden dosis suspenderes i saltvand. Begge doser indgives intramuskulært.

30 35

Tabel III

22 DK 175114 B1

O

Immuniserende Geometrisk middelværdi % . x middel/ad j uvans titer'_ overlevelse 5 gp50/CFA 25 100 CHO-renin/CFA <8 0 a) Neutraliserende titer mod PRV på dagen for udsættelse for virus.

10 b) Udsættelse for PRV-Rice-stamme, 1 x 10^ pfu/svin ved intranasal indgivelse.

Disse tre tabeller viser, at gp50 kan fremkalde neutraliserende antistoffer og beskytte mus og svin mod udsættelse for en dødelig dosis PRV.

15 I et andet aspekt af den foreliggende opfindelse fremstilles et fragment af glycoprotein gp50 ved at fjerne DNA, som koder for den C-terminale ende af gp50.

Det resulterende polypeptid har en udeladelse for amino-syresekvensen, der er·nødvendig for at forankre gp50 i 20 cellemembranen. Når det eksprimeres i pattedyrceller, ud skilles dette gp50-derivat i mediet. Rensningen af dette gp50-derivat fra mediet til anvendelse som en underenheds--vaccine er meget mere simpel end fraktionering af hele celler. Fjernelsen af forankringssekvensen til omdannelse 25 af et membranprotein til et udskilt protein blev først demonstreret for influenza-haanagglutinin-genet (M.J.

Gething og J. Sambrook, Nature 300. s. 598-603 (1982)).

Idet der henvises til kort L, nedbrydes plasmidet pDIE50 ovenfor med Sall og EcoRI. Fragmenterne på 5,0 30 og 0,7 kb isoleres. 0,7 kb fragmentet, der koder en del af gp50, nedbrydes med Sau3A, og der isoleres et 0,5 kb SalI/Sau3A-fragment. Til indføring af et stoocodon efter det afstumpede gp50-gen syntetiseres følgende oligonucleotider: 35 23 DK 175114 B1 5' GATCGTCGGCTAGTGAGTAGGTAGG 3' 3' CAGCCGATCACTCATCCATCCTTAA 5' 5,0 kb EcoRI/SaII-fragmentet, 0,5 kb SalI/Sau3A-5 -fragmentet og de kondenserede oligonucleotider ligeres til dannelse af plasmidet pDIE50T. Nedbrydning med EcoRI og Sall giver et 580 bp-fragment. pDIE50T spaltes med EcoRI, og 0,6 kb EcoRI-fragmentet indeholdende bGH-polyA-stedet (fraoment 12) indklones til dannelse af 10 plasmidet pDIE50TPA. Nedbrydning af pDIE50TPA med BamHI og PvuII giver et 970 bp fragment med polyadenylerings-signalet med den rette orientering.

pDIE50TPA anvendes til transfektion af CHO- -dhfr -celler. Selekterede dhfr+-CHO-celler producerer 15 en afstumpet form af gp50, som udskilles i mediet som 35 påvist ved mærkning med S-methionin og immunopræcipi-tation.

Polypeptiderne ifølge den foreliggende opfindelse kan også eksprimeres i insektceller på følgende måde: Ved 20 anbringelse af en BamHI-linker på EcoRI-stedet af pD50 og nedbrydning med BamHI fås BaHI-fragmenter indeholdende gp50-gener. Disse BamHI-fragmenter kan dones i et BamHI-sted nedenfor en polyhedrin-promotor i pAC373 (Mol. Cell. Biol.

5, s. 2860-65 (1985)). De således fremstillede plasmider 25 kan sammen med DNA fra baculovirus Autographa californica co-transficeres i Sf9-celler, og rekombinante vira kan isoleres ved metoderne anført i den nævnte artikel. Disse rekombinante vira producerer gp50 efter inficering af Sf9-celler.

30 En vaccine fremstillet under anvendelse af et glycoprotein ifølge den foreliggende opfindelse eller et immunogent fragment deraf kan bestå af fikserede værtsceller, en værtcelleekstrakt eller ét delvis eller fuldstændig renset PRV-glycoproteinpræpa-35 rat fra værtscellerne eller produceret ved kemisk 24 DK 175114 B1 syntese. PRV-glycoprotein-immunogenet fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse er fortrinsvis frit for PRV-virus. Vaccine-immunogenet ifølge opfindelsen er således i det væsentlige udelukkende sammensat af 5 det ønskede immunogene PRV-polypeptid og/eller andre PRV-polypeptider, som udviser PRV-antigenitet.

Immunogenet kan fremstilles i vaccinedosisform ved velkendte procedurer. Vaccinen kan indgives intra-muskulært, subcutant eller intranasalt. Til parenteral 10 indgivelse, såsom intramuskulær injektion, kan immunogenet kombineres med en egnet bærer. Det kan f.eks. indgives i vand, saltvand eller pufrede bærestoffer med eller uden forskellige hjælpestoffer eller immunomodulerende midler, herunder aluminiumhydroxid, 15 aluminiumphosphat, aluminiumkaliumsulfat (alun), berylliumsulfat, siliciumdioxid, kaolin, carbon, vand-i-olie-emulsioner, olie-i-vand-emulsioner, muramyl-dipeptid, bakterielt endotoxin, lipid X, Corynebacterium parvum (Propionobacterium aenes), Bordetella pertussis, 20 polyribonucleotider, natriumalginat, lanolin, lysoleci-thin, vitamin A, saponin, liposomer, levamisol, DEAE--dextran, blokerede copolymere eller andre syntetiske hjælpestoffer. Sådanne hjælpestoffer er tilgængelige kommercielt fra forskellige kilder, f.eks.

25 "Merck Adjuvant 65" (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.).

Et andet egnet hjælpestof er Freund's ukomplette adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, Michigan).

Forholdet mellem immunogen og adjuvans kan varieres indenfor et stort område, sålænge begge er 30 til stede i effektive mængder. F.eks. kan aluminiumhydroxid være til stede i en mængde på ca. 0,5% af vaccineblandingen (beregnet på aluminiumoxid). På enkelt-dosisbasis kan koncentrationen af immunogenet være fra ca. 1,0 Mg til ca. 100 mg pr. svin. Et foretrukket område 35 er fra ca. 100 Mg til ca. 3,0 mg pr. svin. En pas- 25 DK 175114 B1 sende dosisstørrelse er ca. 1-10 ml, fortrinsvis ca.

1.0 ml. I overensstemmelse hermed vil en dosis til intra-muskulær injektion f.eks. omfatte 1 ml indeholdende 1.0 mg immunogen i blanding med 0,5% aluminiumoxid.

5 Sammenlignelige dosisformer kan også fremstilles til parenteral indgivelse til smågrise, men mængden af immunogen pr. dosis vil være mindre, f.eks. ca. 0,25 til ca. 1,0 mg pr. dosis.

Til vaccinering af søer kan der anvendes et 10 system med to doser. Den første dosis kan gives fra flere måneder til ca. 5-7 uger før søerne får grise.

Den anden dosis af vaccinen bør derefter indgives nogle uger efter den første dosis, f.eks. ca.

2 til 4 uger senere, og vaccinen kan derefter ind-15 gives op til, men før søerne får grise. Alternativt kan vaccinen indgives som f.eks. en enkelt 2 ml's dosis ca. 5 til 7 uger før søerne får grise. Imidlertid anses et system med to doser at være at foretrække til den mest effektive immunisering af smågrisene. Halvårlig 20 revaccinering anbefales til avlsdyr. Orner kan revaccineres på ethvert tidspunkt. Desuden kan søer revaccineres før avl. Smågrise født af ikke-vaccinerede søer kan vaccineres når de er ca. 3-10 dage gamle, igen når de er 4-6 måneder gamle og derefter årligt eller fortrinsvis 25 halvårligt.

Vaccinen kan også kombineres med andre vacciner mod andre sygdomme, således at der fås kombinationsvacciner. Den kan også kombineres med andre lægemidler, f.eks. antibiotika. En farmaceutisk effektiv 20 mængde af vaccinen kan anvendes sammen med et farmaceutisk acceptabelt bærestof eller fortyndingsmiddel til vaccinering af dyr, såsom svin, kvæg, får, geder og andre pattedyr.

Andre vacciner kan fremstilles ifølge metoder, der 25 er velkendte af fagmanden og f.eks. er beskrevet i 1. Tizard, An Introduction to Veterinary Immunology, 2. ed. (1982).

26 DK 175114 B1

O

SKEMA A

27 54 ATG CTG CTC GCA GCG CIA TTG GCG GCG CTG GTC GCC OGG ACG ACG CTC GGT GCG 5 Me C Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Leu Val Ala Arg Thr Thr Leu Gly Ala 81 108 GAC GTG GAC GCC CTG GCC GGG GCG ACC TTC GCC GCG CCC GCG TAC GOG IAC ACC Asp Val Asp Ala Val Pro Ala Pro Thr Rie Pro Pro Pro Ala Tyr Pro Tyr Thr 135 162 10 GAG TCG TGG CAG CTG ACG CTG ACG AGG GTC CCC TCG CCC TTC GTC GGC CCC GCG Glu Ser Trp Gin Leu Thr Leu Thr Thr Val Pro Ser Pro Rie Val Gly Pro Ala 189 216 GAC GTC TAC CAC ACG CGC CCG CTG GAG GAC CCG TGC GCG GTG GTG GCG CTG AIC Asp Val Tyr His Thr Arg Pro Leu Glu Asp Pro Cys Gly Val Val Ala Leu Ile 15 243 270 TCC GAC CCG CAG GTG GAC OGG CTG CTG AAC GAG GCG GTG GCC CAC CGG CGG CCC Ser Asp Pro Gin Val Asp Arg Leu Leu Asn Glu Ala Val Ala His Arg Arg Pro 297 324

ACG TAC OGC GCC CAC GTG GCC TGG TAC OGC ATC GCG GAC GGG TGC GCA CAC CTG

20

Thr Tyr Arg Ala His Val Ala Trp Tyr Arg Ile Ala Asp Gly Cys Ala His Leu 351 378 CTG TAC ITT ATC GAG TAC GCC GAC TGC GAC CCC AGG CAG GTC ΤΓΤ GGG CGC TGC Leu Tyr Rie Ile Glu Tyr Ala Asp Cys Asp Pro Arg Gin Val Rie Gly Arg Cys 405 432 25 CGG CGC CGC ACC ACG CCG ATG TGG TGG ACC CCG TCC GCG GAC TAC ATG TTC CCC Arg Arg Arg Thr Thr Pro Met Trp Trp Thr Pro Ser Ala Asp Tyr Met Rie Pro 459 486

ACG GAG GAC GAG CTG GGG CFG CTC ATG GTG GCC CCG GGG OGG TTC AAC GAG GGC

Thr Glu Asp Glu Leu Gly Leu Leu Met Val Ala Pro Gly Arg Rie Asn Glu Gly 30 513 540 CAG TAC OGG CGC CTG GTG TCC GTC GAC GGC GTG AAC ATC CTC ACC GAC TTC ATG Gin Tyr Arg Arg Leu Val Ser Val Asp Gly Val Asn Ile Leu Thr Asp Rie Met 567 594

35 GTG GCG CTC 0CC GAG GGG GAA GAG TCC CGG TTC GCC OGC GTG GAC CAG CAC CGC

Val Ala Leu Pro Glu Gly Gin Glu Cys Pro Rie Ala Arg Val Asp Gin His Arg 621 648 ACG TAC AAG TTC GGC GCG TGC TGG AGC GAC GAC AGC TTC AAG CGG GGC GIG GAC Thr Tyr Lys Rie Gly Ala Cys Trp Ser Asp Asp Ser Rie Lys Arg Gly Val Asp

O

27 DK 175114 B1 SKEMA A (fortsat) 675 702 GTG ATG OGA TIC CTG ACG CCG TIC TAC CAG CAG CCC CCG CAC OGG GAG GTG GTG 5 Val Met Arg Rie Leu Thr Pro Rie Tyr Gin Gin Pro Pro His Arg Glu Val Val 729 756

AAC TAC TGG TAC OGC AAG AAC GGC OGG ACG CTC CCG CGG GCC CAC GCC GCC GCC

Asn Tyr Trp Tyr Arg Lys Asn Gly Arg Thr Leu Pro Arg Ala His Ala Ala Ala 783 810 10

ACG CCG TAC GCC ATC GAC CCC GCG CGG CCC TCG GCG GGC TCG CCG AGG CCC CGG

Thr Pro Tyr Ala Ile Asp Pro' Ala Arg Pro Ser Ala Gly Ser Pro Arg Pro Arg . 837 864

CCC CGG CCC CGG CCC CGG CCC CGG OCG AAG CCC GAG CCC GCC CCG GCG ACG CCC

Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Lys Pro Glu Pro Ala Pro Ala Thr Pro 15 891 918

GCG CCC CCC GAC CGC CTG CCC GAG CCG GCG ACG CGG GAC CAC GCC CCC GCG GGC

Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Pro Ala Thr Arg Asp His Ala Ala Gly Gly 945 972

20 OGC CCC ACG CCG OGA CCC CCG AGG OCC GAG ACG CCG CAC OGC CCC TTC GCC CCG

Arg Pro Thr Pro Arg Pro Pro Arg Pro Glu Thr Pro His Arg Pro Rie Ala Pro 999 1026

CCG GCC GTC GTG CCC AGC GGG TGG CCG CAG CCC GCG GAG CCG TTC CAG CCG CGG

Pro Ala Val Val Pro Ser Gly Trp Pro Gin Pro Ala Glu Pro Rie Gin Pro Arg 25 1053 1080

ACC CCC GCC GCG CCG GGC GTC TCG CGC CAC CGC TCG CTG ATC GTC GGC ACG GGC

Thr Pro Ala Ala Pro Gly Val Ser Arg His Arg Ser Val Ile Val Gly Thr Gly 1107 1134 ACC GCG ATG GGC GCG CTC CTG GTG GGC GTG TGC GTC TAC ATC TTC TTC CGC CTG 30 Thr Ala Met Gly Ala Leu Leu Val Gly Val Cys Val Tyr Ile Rie Phe Arg Leu 1161 1188

AGG GGG GCG AAG GGG TAT CGC CTC CTG GGC GGT CCC GCG GAC GCC GAC GAG CTA

Arg Gly Ala Lys Gly Tyr Arg Leu Leu Gly Gly Pro Ala Asp Ala Asp Glu Leu 1215

35 AAA GCG CAG CCC GGT CCG TAG

Lys Ala Gin Pro Gly Pro DK 175114 B1

O

28

SKEMA D BamHI-7-Fragment af PRV BanHI BstEII PvuII Kpnl Sall Kpnl Stu Dral BstElI Sphl Bsml BanHI

J_I_I_l—I_I_I_I_I_I_I_L

5 XXXXXXXXX 5050505050505050 63636363636363 IIIIIIIIIIIIIIIII

X - glycoprotein X (gX) 50 - glycoprotein 50 (gp50) 63 - glycoprotein 63 (gp63) ΊΟ I - glycoprotein I (gi) 15 20 25 30 35 SKEMA E. Konstruktion af pPR28-4 og pPR28-l.

O

29 DK 175114 B1 (a) BamHl-7 nedbrydes med BamHI og PvuII til dannelse af fragment 1 (1,5 kb) og 2 (4,9 kb).

5

BamHI PvuII

J_l XXXXXXXXXX 5050 -fragment 1 10

PvuII Sall BamHI

J_I_:_i 50505050505050 fragment 2 15 (b) Fragmenterne 1 og 2 indføjes separat mellem BamHI-og PvuII-stederne af pBR322 til dannelse af

20 BamHI Narl Narl Narl PvuII

* -1-1_!_I . I_ * XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 5050 pPR28-4

25 PvuII Sall Mae III BamHI

* -1-1_1_I_ * 50505050505050 pPR28-l 1 35

O

30 DK 175114 B1 SKEMA F. Restriktionsenzym-spaltningssteder anvendt til pg50-sekvensbestemmelse.

5

Ndel Narl PvuII Kpnl Sall Kpnl Sau3A Maelll J-1-1_I_I_I_I_l 50505050505050505050505050305050505050505050505050505050 10 gp50-gen 15 20 25 30 35 SKEMA G. Konstruktion af pPR28-4 Nar2.

O

31 DK 175114 B1 (a) pPR28-4 nedbrydes med Narl til dannelse af fragment 3.

5 Narl PvuII BanHI Narl

J_1-1--L

soso xxxxxmxxx · (b) BamHl-linkere tilføjes til fragmentet, og det behandles 10 derefter med BamHI til dannelse af fragment 4.

BanHI PvuII BamHI

•i-1-1 5050 15 (c) Fragment 4 cirkulariseres med DNA-ligase til dannelse af pPR28-4 Nar2.

BamHI PvuII

20 *_I_I__* 5050 25 1 35 SKEMA H. Samling af det komplette gp50-gen.

O

32 DK 175114 B1 (a) pPR28-4-Nar2 nedbrydes med BamHI og PvuRII til dannelse af fragment 5 {160 bp).

5

Banttl PvuII

J-L

5050 10 (b) pPR28-l nedbrydes med BamHi og PvuII til dannelse af fragment 6 (4,9 kb).

PvuII Maelll BanHI

15 J-!-L

50505050505050 (c) pPGXl nedbrydes med BamHi, behandles med BAP og 20 ligeres derefter med fragment 5 og 6 til dannelse af PBGP50-23.

BamHi PvuII Maelll BamHi 25 *-1-1-1-’' 505050505050505050 1 35 SKEMA I. Fremstilling af plasmidet pD50.

O

33 DK 175114 B1 (a) pBGP50-23 spaltes med Maelll, forsynes med stumpe ender med T4-DNA-polymerase, der tilføjes EcoRI-linkere 5 0g nedbrydes med EcoRI og spaltes derefter med BamHI til dannelse af fragment 7 (1,3 kb).

BamHI PvuII EcoRI

j__1-1 10 50505050505050505050 (b) Plasmidet pSV2dhfr spaltes med BamHI og EcoRI til dannelse af fragment 8 (5,0 kb).

15 BamHI Hindi 11 PvuII EcoRI

I -1-1-;-1

1 1 1 R

dhfr SV40 AmpK

Ori 20 (c) Plasmidet pD50 fremstilles ved at ligere fragmenterne 7 og 8.

BamHI Hindi 11 PvuII EcoRI ' PvuII

*_J_I_I_1_i_*

25 III

dhfr SV40 AmpR 50505050505050

Ori dhfr = dihydrofolatreduktase-gen.

30 SV40 Ori = SV40-promotor og -replikationsstart.

β

Amp = Ampicillinresistens-gen.

35 SKEMA J. Fremstilling af plasmidet pDIE50.

O

34 DK 175114 B1 (a) pD50 nedbrydes med BamHI og behandles med BAP til dannelse af fragment 9.

5

BamHI Hindi 11 PvuII EcoRI PvuII BamHI

I -J_!_!-1—l

III

dhfr SVAO AnrpR 5050505050505050 10 (b) Fragment 10 (760bp) indeholdende den umiddelbare tidlige promotor af humant cytomegalovirus (Towne) isoleres.

15

Sau3A SacI Sau3A

J_L__L

PPPPPPPPPPPPPPPP

20 (c) Fragmenterne 9 og 10 ligeres til dannelse af plasmidet pDIE50.

Hindlll PvuII EcoRI Sau3A Sall Sau3A Sau3A

„ *-1_I_I_I_I_I_I—*

25 III

dhfr SVAO Amp11 50505050505050PPPPPPPPP

Ori 30 35 SKEMA K. Fremstilling af plasmid pDIE50PA.

O

35 DK 175114 B1 (a) Plasmidet pSVCOW7 spaltes med PvuII og EcoRI til dannelse af fragment 11.

5 pSVC0W7

EcoRI PvuII PstI BamHI Hindlll PvuII

*_I_!_!_I_I_t *

I I I

AAAAGOGOGGGGGGGGGGG dhfr SV40 Amp* 10 - .

Ori

fragment 11 EcoRI PvuII

J_L

AAAAG

15 (b) Fragment 11 klones i pUC9 til dannelse af plasmidet pCOWTl.

EcoRI PvuII/Sma fusion BamHI Sall * I_!_I_I_*

2Q AAAAG

(c) pCOWTl spaltes med Sall, forsynes med stumpe ender ved hjælp af T4-DNA-polymerase, og der tilføjes EcoRI-linkere og nedbrydes derefter med EcoRI til dannelse af fragment 12 (0,6 kb).

25 , , ·

EcoRI BamHI EcoRI (på udfyldt Sall-sted)

i--LI

AAAAG

(d) Plasmidet pDIE50 spaltes med EcoRI, og fragmentet 12 30 klones deri til dannelse af plasmidet pDIE50PA.

Hindlll PvuII EcoRI Banffi EcoRI Sau3A Sau3A

* 1_I_I_U_I i_*

III

dhfr SV40 Amp* AAAAAG 5050505050PPPPPP

35 Ori A = Kvæg-væksthormon-polyadenyleringssignal.

G = Genomisk kvæg-væksthormon.

P = Umiddelbar tidlig promotor af humant cytomegalovirus (Towne).

SKEMA L. Fremstilling af plasmid pDIE50T.

O

36 DK 175114 B1 (a) Plasmid pDIE50 nedbrydes med Sall og EcoRI til dannelse af et 5,0 kb fragment.

5

Sall Sau3A Sau3A HindiII PvuII EcoRI

J-1-1_I_I_L

III

5050505050PPPPPPPP dhfr SV40 AmpR

10 og et 0,7 kb fragment.

EcoRI Sau3A Sall

J_I_L

505050505050 15 (b) 0,7 kb fragmentet nedbrydes med Sau3AI, og der isoleres et 0,5 kb SalI/Sau3AI-fragment.

SauSA Sall

J_L

20 5050505050 (c) 5,0 kb EcoRI/Sall-fragmentet, 0,5 kb Sall/Sau3Al-fragmentet og de kondenserede oligonucleotider (se teksten) ligeres til dannelse af plasmidet pDIE50T.

25

Sau3A Sall Sau3A Sau3A Hindi II PvuII EcoRI

*_!_I_I_:_I_I_I_!_*

I I I

T505050505050505050PPPPPPPP dhfr SV40 Amp* 30 r

Ori T = stop-kodon.

35

Claims (11)

1. Rekombinant DNA-molekyle indeholdende en DNA-sekvens kodende for et polypeptid, der udviser pseudorabies-virus-(PRV)-glycoprotein-gp50-immunogenitet, hvor den nævnte 5 DNA-sekvens er operativt forbundet med en ekspressionskontrolsekvens, hvorved DNA-sekvensen, der koder for polypep-tidet, er valgt blandt sekvensen, der koder for gp50, og som er ATG CTC CTC GCA GCG CIA TTG GCG GCG CTG GTC GCC CGG ACG ACG CTC GGT GCG

2. Værtscelle, transformeret med et rekombinant DNA-35 -molekyle ifølge krav 1. DK 175114 B1

2. ACG TAC AAC TTC CGC GCG TGC TGG ACC GAC GAC AGC TTC AAG CGG GGC GTG GAC GTG ATG CGA TTC CTG ACG CCG TTC TAC CAG CAG CCC CCG CAC CGC GAG GTG GTG AAC TAC TGG TAC CGC AAG AAC GGC CGG ACG CTC CCG CGG GCC CAC GCC GCC GCC ACG CCG TAC GCC ATC GAC CCC GCG CGG CCC TCG GCG GGC TCG CCG AGG CCC CGG CCC CGG CCC CGG CCC CGG CCC CGG CCG AAG CCC GAG CCC GCC CCG GCG ACG CCG

25 GCG CCC CCC GAC CGC CTG CCC GAG CCG GCG ACG CGG GAC CAC GCC GCC GGG GGC CGC CCC ACG CCG CGA CCC CCG AGG CCC GAG ACG CCG CAC CGC CCC TTC GCC CCG CCG GCC GTC GTG CCC AGC GGG TGG CCG CAG CCC GCG GAG CCG TTC CAG CCG CGG ACC CCC GCC GCG CCG GGC GTC TCG CGC CAC CGC TCG GTG ATC GTC GGC ACG GGC ACC GCG ATG GGC GCG CTC CTG GTG GGC CTG TGC GTC TAC ATC TTC TTC CGC CTG

30 AGG GGG GCG AAG GGG TAT CGC CTC CTG GGC GGT GCC GCG GAC GCC GAC GAG CTA AAA GCG CAG CCC GGT CCG TAG, og fragmenter deraf, som koder for polypeptider, der udviser PRV-antigenitet.

3. Værtscelle ifølge krav 2, som hidrører fra bakterier, fungi, planter eller dyr.

4. Værtscelle ifølge krav 3, som er E. coli.

5. Værtscelle ifølge krav 3, som er en gærcelle. 5

6. Værtscelle ifølge krav 3, som er en ovariecelle af kinesisk hamster (CHO-celle).

7. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid, der udviser PRV-gp50-antigenitet, omfattende: (a) fremstilling af et rekombinant DNA-molekyle, 10 hvor molekylet indeholder en DNA-sekvens, der koder for et polypeptid, som udviser PRV-gp50-antigenitet, hvor den nævnte DNA-sekvens er operativt forbundet med en ekspressionskontrolsekvens, (b) transformering af en passende værtscelle med det 15 nævnte rekombinante DNA-molekyle, (c) dyrkning af den nævnte værtscelle, og (d) opsamling af polypeptidet, hvorved DNA-sekvensen er valgt blandt gp50-sekvensen, som er

20 AJC CIC CTC GCA CCG CIA TIC GCC GCG CTG CTC GCC CGC ACG ACG CTC GCT GCG GAC GIG GAC GCC CIG CCC GCG CCG ACC TTC CCC CCG CCC GCG TAC CCC TAC ACC GAG TCG TGC CAG CTG ACG CTG ACG ACG GTC CCC TCG CCC TTC CTC GGC CCC GCG GAC GTC TAC CAC ACG CGC CCG CTG GAG GAC CCG TGC GCG GIG CTG GCG CTG ATC ICC GAC CCG CAG GTG GAC CGG CIG CIG AAC GAG GCG CTG GCC CAC CGG CGG CCC

25 ACG TAC CGC GCC CAC GTG GCC TGG TAC CGC AIC GCG GAC GGG TGC GCA CAC CTG CIG TAC TIT ATC GAG TAC GCC GAC TGC GAC CCC AGG CAG CTC ΤΓΓ GGG CGC TGC OGG CGC CGC ACC ACG CCG AIC TGG TGG ACC CCG ICC GCG GAC TAC AIG TTC CCC ACG GAG GAC GAG CIG GGG CIG CTC A1G GTG GCC CCG GGG CGG TTC AAC GAG GGC CAG TAC GGG CGC CTG GIG TCC GTC GAC GGC GTG AAC AIC CTC ACC GAC TTC AIG

30 GTG GCG GTC CCC GAG GGG CAA GAG TGC CCG TIC GCC CGC GIG GAC CAG CAC CGC ACG TAC AAG TTC GGC GCG TGC TGG AGC GAC GAC AGC TTC AAG CGG GGC GTG GAC GTG ATG CGA TTC CTG ACG CCG TTC TAC CAG CAG CCC CCG CAC CGG GAG GTG GTG AAC TAC TGG TAC CGC AAG AAC GGC CGG ACG CIC CCG CGG GCC CAC GCC GCC GCC ACG CCG TAC GCC AIC GAC CCC GCG CGG CCC TCG GCG GGC TCG CCG ACG CCC CGG CCC CGG CCC OGG CCC CGG CCC OGG CCG AAG CCC GAG CCC GCC CCG GCG ACG CCC GCG CCC CCC GAC OGC CTG CCC GAG CCG GCG ACG OGG GAC CAC GCC GCC GGG GGC 35 DK 175114 B1 CGC CCC ACG CCG CGA CKCO^AGGCCCGAGACGCCGCACOGCCCCTTCGCCCCG 5 CCG GCC CTC GIG CCC AGC GGG TGG CCG CAG CCC CCC GAG CCG TTC CAG CCG GGG ACCCCCGCCGCCCCGGGCCrCTCGCGCCACCGCTCGGTGATCCTCGGCACGGGC ACC GCC AIC GCC GCC CTC CIG CTC CGC CTC ICC CTC TAC ATC TTC TTC CGC CTG AGG GGG GCG AAG GGCIATOGCCTCCICGGCGGTCCCGCGGACGCCGAC GAG CIA AAA GCG CAG CCC GGT CCG TAG, 10 og fragmenter deraf, som koder for polypeptider, der udviser pseudorabiesvirus-antigenitet.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, hvorved værtscellen er valgt blandt bakterier, fungi, planteceller og dyreceller.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, hvorved værtscellen 15 er E. coli.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 7, hvorved værtscellen er gær.

10 GAC GTC GAC GCC GTG CCC GCG CCC ACC TTC CCC CCG CCC GCG TAC CCG TAC ACC GAG TCG TGG CAG CTG ACG CTG ACG ACG GTC CCC TCG CCC TTC GTC CGC CCC GCG GAC GTC TAC CAC ACG CGC CCG CTG GAG GAC CCG TGC GCG GTG GTG GCG CTG ATC TCC GAC CCG CAG GTG GAC CGG CTG CTG AAC GAG GCG GTG GCC CAC CGG CGG CCC ACG TAC CGC GCC CAC GTG GCC TGG TAC CGC ATC GCG GAC GGG TGC GCA CAC CTG

15 CTG TAC ITT ATC GAG TAC GCC GAC TGC GAC CCC AGG CAG GTC ΤΠ GGG CGC TGC CGG CGC CGC ACC ACG CCG ATG TGG TGG ACC CCG TCC GCG GAC TAC ATG TTC CCC ACG GAG GAC GAG CTG GGG CTG CTC ATG GTG GCC CCG GGG CGG TTC AAC GAG GGC CAG TAC CGG CGC CTG GTG TCC GTC GAC GGC GTG AAC ATC CTC ACC GAC TTC ATG CTG GCG CTC CCC GAG GGG CAA GAG TGC CCG TTC GCC CGC GTG GAC CAG CAC CGC

11. Fremgangsmåde ifølge krav 7, hvorved værtscellen er CHO.